Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

HU231463B1 - Módszer rekombináns proteinek galaktóz tartalmának növelésére - Google Patents

Módszer rekombináns proteinek galaktóz tartalmának növelésére Download PDF

Info

Publication number
HU231463B1
HU231463B1 HUP1500363A HUP1500363A HU231463B1 HU 231463 B1 HU231463 B1 HU 231463B1 HU P1500363 A HUP1500363 A HU P1500363A HU P1500363 A HUP1500363 A HU P1500363A HU 231463 B1 HU231463 B1 HU 231463B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
cells
cell culture
galactose
nutrient solution
Prior art date
Application number
HUP1500363A
Other languages
English (en)
Inventor
László 25% Párta
Áron 25% Schleicher
Gáspár 20% Nagy
Ákos dr. 15% Putics
Dénes Zsolt 15% Zalai
Original Assignee
Richter Gedeon Nyrt.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Richter Gedeon Nyrt. filed Critical Richter Gedeon Nyrt.
Priority to HUP1500363A priority Critical patent/HU231463B1/hu
Priority to CN201680058299.3A priority patent/CN108350075B/zh
Priority to CA2994611A priority patent/CA2994611C/en
Priority to KR1020187006240A priority patent/KR102301702B1/ko
Priority to EP16750431.5A priority patent/EP3331911A1/en
Priority to JP2018505597A priority patent/JP6971221B2/ja
Priority to US15/749,978 priority patent/US20180230228A1/en
Priority to PCT/EP2016/068651 priority patent/WO2017021493A1/en
Publication of HUP1500363A2 publication Critical patent/HUP1500363A2/hu
Priority to US17/749,499 priority patent/US20220372157A1/en
Publication of HU231463B1 publication Critical patent/HU231463B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides or bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

MÓDSZER REKOMBINÁNS PROTEINEK GALAKTÓZ TARTALMÁNAK NÖVELÉSÉRE
A TALÁLMÁNY TÁRGYA
A jelen találmány tárgyát emlős sejtekben termelt rekombináns protein galaktóz tartalmának növelésére szolgáló módszer képezi, amelyben az adott sejtek tenyésztése során a sejtkultúra pH-ját változtatjuk és valamely nukleozidokból, átmeneti fém sókból és/vagy cukrokból álló keveréket táplálunk be.
A TALÁLMÁNY HÁTTERE
Az elmúlt 20 év során a terápiás antitestek használata különböző betegségek, úgymint gyulladásos és daganatos megbetegedések, kezelésére egyre fontosabbá vált és az első bioszimiláris antitest termékek már a piacon vannak.
Az emlős szérumból származó természetesen előforduló antitestek a konstansrégióban glikoziláltak és ez a glikoziláltság fontos az antitestek ceffektor funkcióihoz, mint az antitestfüggő sejt-mediált citotoxicitás (ADCC) és a komplement-függő citotoxicitás (CDC). Az eukarióta sejtekben termelt rekombináns monoklonális antitestek ugyancsak specifikus glikoziláltsági mintázatot mutatnak. A bioszimiláris terápiás antitestek fejlesztése során figyelembe kell venni, hogy a bioszimiláris antitest glikoziláltság tekintetében az originátor készítményéhez a lehető leginkább hasonló legyen.
Számos vizsgálatban kimutatták, hogy valamely rekombináns antitest galaktóz tartalma befolyásolja az adott antitest biológiai aktivitását, amit komplement-függő citotoxicitás (CDC) tesztben mutattak ki (Gazzano-Santoro et al. (1997) J. Immunol. Meth. 202: 163; Boyd et al. (1995) Mól. Immunoi. 32: 1311-1318; Jefferis (2009) Nature Reviews Drug Discovery 8: 226-234). A galaktoziláltságnak a glikoproteinek aktivitására és hatékonyságára játszott szerepének szempontjából a galaktoziláltság szintjének ellenőrzése és szabályozása a glikoprotein készítményben kritikus.
Az irodalom számos módszert ismertet a galaktoziláltsági profil módosítására valamely glikoprotein készítményben.
Gramer et al. (2011) Biotechnoi. Bioeng. 108 (7): 1591-1602 közleményében leírja, hogy az antitest galaktoziláltsága befolyásolható, ha az adott antitestet előállító sejteket uridinnel, mangán-kloriddal és galaktózzal táplálják. Hasonlóan a WO2012/149197 A2 bejelentés a galaktoziláltság kontrolálására egy olyan módszert ad meg, amelyben mangánt és/vagy galaktózt tartalmazó sejt kultúra tápoldatot alkalmaznak.
Továbbá, az EP 2 511 293 Al bejelentés leír egy módszert a galaktoziláltság kontrolálására pCO2 szabályozással.
Ivarsson et al. (2014) J. Biotechnoi. 188: 88-96 közleményében egyedi és kombinált kémiai és mechanikai stressz paramétereknek, mint a pH-nak és az oldott oxigén tenziójának, hatását vizsgálta a glikoziláltságra.
A WO 2014/170866 A2 bejelentés a rekombináns protein galaktóz tartalmának növelésére egy olyan módszert ír le, mely a sejttenyésztés során csökkenti a hőmérsékletet és bizonyos határérték tartományban tartja a pCO2 szintet.
McCracken et al. (2014) Biotechnoi. Prog. 30 (3): 547-553 közleményében az aszparagin és az ammonium sejtkultúrában lévő koncentrációjának a rekombináns proteinek galaktoziláltságára gyakorolt befolyásoló hatásáról számol be.
Mindazonáltal még mindig szükséges egy olyan sejttenyésztési eljárás, mely lehetővé teszi a protein galaktoziláltságának pontos szabályozását, különösen a bioszimiláris termékek fejlesztése során, ahol a bioszimiláris termék galaktóz szintjének hasonlónak kell lennie a referencia termékéhez.
A TALÁLMÁNY ÖSSZEFOGLALÁSA
A jelen találmány feltalálói azt találták, hogy a pH csökkentésének és az emlős sejtek uridinnel, mangán-kloriddal és galaktózzal történő táplálásának kombinációja jobban emeli a rekombinánsan termelt antitest galaktoziláltságát, mint az uridinnel, mangán-kloriddal és galaktózzal történő táplálás pH csökkentés nélkül.
Ennek megfelelően a jelen találmány tárgyát emlős sejtekben termelt rekombináns protein galaktóz tartalmának növelésére szolgáló módszer képezi, mely módszer a következőkből áll: a) az emlős sejteket, melyekbe legalább egy, a rekombináns proteint kódoló nukleinsav molekulát transzformáltak, az első időszakban egy első pH-jú sejtkultúra közegben tenyésztjük;
b) az adott emlős sejteket a második időszakban az adott sejtkultúra közegben egy második pH-η tenyésztjük, mely különbözik az első pH-tól; és
c) betáplálunk egy olyan elegyet, mely legalább két komponenst tartalmaz a következők közül:
(i) egy vagy több nukleozid;
(ii) egy vagy több átmenetifém sót; és (iii) egy vagy több cukrot; a b) kultúrához.
A jelen találmány egy másik megvalósítása szerint az emlős sejtekben termelt rekombináns protein előállítására szolgáló módszer a következőkből áll:
a) az emlős sejteket, melyek legalább egy, a rekombináns proteint kódoló nukleinsav molekulával transzformáltak, az első időszakban egy első pH-jú sejtkultúra közegben tenyésztjük;
b) az adott emlős sejteket a második időszakban az adott sejtkultúra közegben egy második pH-η tenyésztjük, mely különbözik az első pH-tól; és
c) betáplálunk egy olyan elegyet, mely legalább két komponenst tartalmaz a következők közül:
(i) egy vagy több nukleozid;
(ii) egy vagy több átmenetifém sót; és (iii) egy vagy több cukrot;
a b) kultúrához.
d) feldolgozzuk a rekombináns proteint tartalmazó sejtkultúra folyadékot; és
e) kinyerjük a rekombináns proteint.
Előnyösen a rekombináns protein termelése nagy mennyiségben történjék..
Előnyösen az emlős sejtek lehetőleg kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek legyenek.
Egy előnyös megvalósítás szerint a rekombináns protein egy Fc domént is tartalmazó protein.
Előnyös, ha a második pH alacsonyabb az első pH-nál, és még előnyösebb, ha a második pH 0,05-től 0,3 pH egységgel alacsonyabb, mint az első pH.
Előnyösen a nukleozid uridin és még előnyösebben az uridin koncentrációja az elegyben 1 -töl 20 mM.
Előnyösen az átmenetifém só mangán(II)-klorid és még előnyösebben a mangán(II)-klorid koncentrációja az elegyben 0,002 mM-tól 0,1 mM.
Előnyösen a cukor galaktóz és még előnyösebben a galaktóz koncentrációja az elegyben 5 mM-tól 100 mM.
A jelen találmány további tárgyát rituximab bioszimiláris antitest CHO sejtekben történő előállítására szolgáló módszer képezi, mely a következőkből áll:
a) aCHO sejteket, melyeket az antitest könnyű és nehéz láncát kódoló egy vagy több rekombináns nukleinsav molekulával transzformáltak, az első időszakban 7,15-ös pH-jú tápoldatban tenyésztjük;
b) az adott CHO sejteket a második időszakban 7,00 pH-jú tápoldatban tenyésztjük;
c) betáplálunk egy olyan elegyet, mely a következő komponenseket tartalmazza:
(i) 1-től 20 mM uridin;
(ii) 0,002 mM-tól 0,1 mM mangán(II)-klorid; és (ifi) 5 mM-tól 100 mM galaktóz;
a b) kultúrához.
d) feldolgozzuk a rituximabot tartalmazó sejtkultúra folyadékot; és
e) kinyerjük a rituximabot.
Egy további megvalósításban a jelen találmány tárgyát CHO sejtek által termelt terápiás antitest bioszimilaritásának a referencia antitestéhez történő növelésére szolgáló módszer képezi, mely módszer a következő lépésekből áll:
a) a CHO sejteket, melyeket egy terápiás antitest könnyű és nehéz láncát kódoló egy vagy több rekombináns nukleinsav molekulával transzformáltak, az első időszakban 7,15-ös pH-jú tápoldatban tenyésztjük;
b) az adott CHO sejteket a második időszakban 7,00 pH-jú tápoldatbantenyésztjük; és c) betáplálunk egy olyan elegyet, mely a következő komponenseket tartalmazza:
(i) uridin;
(ii) mangán(II)-klorid; és (ifi) galaktóz;
a b) kultúrához.
Egy előnyös megvalósítás szerint a sejteket az első pH-η addig tenyésztjük, amíg az élő sejt koncentráció a 4,5-6,0 x 106 sejt/ml-t el nem éri.
Egy másik előnyös megvalósítás szerint a sejteket a második pH-n 6-7 napig tenyésztjük.
Előnyösen a hőmérsékletet állandó értéken tartjuk az (a), (b) és (c) lépések során.
Szintén előnyösen az elegy tartalmaz továbbá legalább egy aminosavat, melyet a következő csoportból választunk: L-valin, L-cisztein, L-fenilalanin és L-szerin.
Előnyösen a (c) lépésbeli betáplálást legalább kétszer hajtjuk végre.
Előnyösen továbbá a (c) betáplálás! lépést megelőzi egy olyan betáplálás! lépés, melyben a betáplált elegyhez még nem adtuk hozzá az (i) és (iii) komponenseket.
Előnyösen az (a) és (b) lépések során a tápoldat nem tartalmaz uridint és galaktózt.
Szintén előnyösen a (c) lépés során a betáplált elegy nem tartalmaz egy vagy több komponenst a következők közül: timidin, fruktóz, mannóz, szacharóz és N-acetilmannózamin.
Előnyösen az (a), (b) és (c) tenyésztő lépések során a tenyészet ozmolalitása kisebb, mint 400 mOsm/kg.
A SZABADALOM RÉSZLETES LEÍRÁSA
Habár a jelen találmányt egyedi megvalósításokra vonatkozóan mutatjuk be, ez a leírás nem tekintendő az oltalmi kör korlátozásának.
Mielőtt a jelen találmány példaszerű megvalósításait részletesen tárgyalnánk, a jelen találmány megértéséhez szükséges definíciókat adjuk meg. A jelen leírásban és a csatolt igénypontokban használt értelemben az egyes számú „valamely” és „valamelyik” kifejezések a megfelelő többes számú formákat is jelentik, hacsak a szövegösszefüggés másként nem diktálja. A jelen találmány szövegösszefüggésében a „körülbelül” és a „megközelítőleg” kifejezések egy olyan pontosságú intervallumot adnak meg, hogy általában egy szakértő számára a kérdéses tulajdonság technikai hatását még inkább érthetővé tegyék. A kifejezés jellemzően ±20%, előnyösen ±15%, még előnyösebben ±10%, legelőnyösebben ±5% eltérést jelent a megadott számszerű értéktől. Magától értetődő, hogy a „tartalmaz” kifejezés nem limitáló. A jelen találmány során az „áll valamiből” kifejezés úgy tekintendő, mint a „tartalmaz” kifejezés előnyös megvalósítása. Ha innentől fogva egy csoportot úgy adunk meg, hogy a megvalósítások legalább bizonyos számát tartalmazza, ez azt is jelenti, hogy magába foglal egy olyan csoportot, mely előnyösen csak ezekből a megvalósításokból áll. Továbbá az „első”, „második”, „harmadik” vagy „(a)”, „(b)”, „(c)”, „(d)” stb. és ehhez hasonló kifejezések a leírásban és az igénypontokban a hasonló elemek közötti különbségtételre használatosak és nem szükségszerűen egymás utáni vagy időrendi sorrendet adnak meg. Magától értetődő, hogy az így használt kifejezések megfelelő körülmények között felcserélhetők és hogy a találmány itt leírt megvalósításai az itt leírttól vagy bemutatottól eltérő sorrendben is képesek működni. Abban az esetben, ha az „első”, „második”, „harmadik” vagy „(a)”, „(b)”, „(c)”, „(d)”, „i”, „ii” stb. kifejezések egy módszer vagy használat vagy vizsgálat lépéseit jelentik, nincs idő vagy idő intervallum összefüggés a lépések között, vagyis a lépéseket végrehajthatjuk egyidejűleg vagy lehetnek az ilyen lépések között idő intervallumok: másodpercek, percek, órák, napok, hetek vagy még évek is, hacsak másként nincs a találmányban jelezve, ahogy itt korábban vagy a következőkben közzétettük.
Magától értetődő, hogy a jelen találmány nem korlátozódik csupán arra a bizonyos metodikára, protokollokra, reagensekre stb., amit itt megadtunk, mivel ezek változhatnak. Az is magától értetődő, hogy az itt használt terminológia célja csupán a megvalósítások részletes leírása és a jelen találmány oltalmi körét nem szándékozik korlátozni, azt csak a mellékelt igénypontok korlátozzák. Amennyiben másként nincs definiálva, minden a jelen találmányban használt technikai és tudományos kifejezés ugyanazzal a jelentéssel bír, mint amit egy átlagos szakértő általában ismer.
Ahogy azt előzőekben bemutattuk a jelen találmány azon a felismerésen alapul, hogy a sejtkultúra pH-jának változtatása, előnyösen csökkentése és egy olyan elegy betáplálása a sejtkultúrába, mely nukleozidokat, átmeneti fém sókat és cukrokat, előnyösen uridint, mangán(II)-kloridot és galaktózt tartalmaz, megnöveli a rekombináns protein, előnyösen a rekombináns antitest galaktóz tartalmát.
A „galaktóz tartalom növekedés” kifejezés azt jelenti, hogy a rekombináns proteinben a GIF, Gl’F és G2F galaktozilált izoformák egyikének vagy mindegyikének aránya magasabb, amikor a sejtkultúra pH-ját változtatjuk, előnyösen csökkentjük, és egy olyan elegyet táplálunk be a sejtkultúrába, mely nukleozidokat, átmeneti fém sókat és cukrokat, előnyösen uridint, mangán-kloridot és galaktózt tartalmaz, ugyanezen izoformák arányához viszonyítva ugyanebben a rekombináns proteinben, amit úgy kapunk, hogy a sejtkultúra pH-ját állandó értéken tartjuk és amelyhez a fenti elegyet nem adjuk hozzá. A GIF, Gl’F és G2F izoformák arányának növekedése együtt jár a nem-galaktozilált glikoformák, mint a GO és GOF, arányának csökkenésével.
A GOF, GIF, Gl’F és G2F glikoformák szerkezete a következő:
Fuc
G2F
Gal-Gn-M
Gal-Gn-M
Fuc
GIF
Gal-Gn-M x. I
M-Gn-GnGn-M /
Fuc
G1‘F
Gn-Μκ I
M-Gn-GnGal-Gn-M^
Fuc
GOF
Gn-M
M-Gn-GnGn-Mahol a Gn az N-acetil-glükózamint, Fuc a fukózt, M a mannózt és a Gal a galaktózt jelöli. Ezek a glikán szerkezetek egy N-glikozilációs helyhez kapcsolódnak, mely az IgGl rekombináns antitestek esetében az Fc régió Cy2-es doménjének 301-es aszparaginjánál található.
A galaktóz tartalom megnövekedett, ha a GIF, Gl’F és G2F izoformák aránya a rekombináns proteinben, melyet a jelen találmány módszere szerint állítottunk elő, legalább 1%-al, 2%-al vagy 3%-al, előnyösen legalább 4%-al, 5%-al, 6%-al vagy 7%-al, még előnyösebben legalább 8%-al, 9%-al vagy 10%-al és legelőnyösebben legalább 11%-al vagy 12%-al növekedett meg a GIF, Gl’F és G2F izoformák össz-arányához viszonyítva ugyanebben a rekombináns proteinben, amit úgy kapunk, hogy a sejtkultúra pH-ját állandó értéken tartjuk és amelyhez a fent definiált elegyet nem adjuk hozzá.
A galaktóz tartalom akkor is megnövekedett, ha a GOF izoforma aránya a rekombináns proteinben, melyet a jelen találmány módszere szerint állítottunk elő, legalább 1%-al, 2%-al vagy 3%-al, előnyösen legalább 4%-al, 5%-al vagy 6%-al, még előnyösebben legalább 7%-al, 8%-al vagy 9%-al és legelőnyösebben legalább 10%-al csökkent a GOF izoforma arányához viszonyítva ugyanebben a rekombináns proteinben, amit úgy kapunk, hogy a sejtkultúra pHját állandó értéken tartjuk és amelyhez a fent definiált elegyet nem adjuk hozzá.
A galaktóz tartalmat 8-14 nappal azután határozzuk meg, hogy a tápoldatot a sejtekkel beoltottuk. Egy előnyös megvalósítás szerint a galaktóz tartalmat 9-10 nappal azután határozzuk meg, hogy a tápoldatot a sejtekkel beoltottuk.
A rekombináns protein különböző glikán izoformáinak relatív arányát, különösen a galaktozilált GIF, Gl’F és G2F izoformákét és következésképpen a galaktóz tartalmat az irodalomból ismert bármely módszenei meghatározhatjuk. Előnyösen kapilláris elektroforézist használunk lézer indukált fluoreszcens detektálással (CE-LIF), miután a glikán oldalláncokat a rekombináns proteinről lehasítottuk és valamely fluoreszcens származékképzövel kezeltük. A glikán izoformák mindegyikének relatív mennyiségét fluoreszcens detektálással határoztuk meg és a megfelelő csúcsok terület % értékeit számoltuk. Egy példaszerű módszert írunk le a Példák között a későbbiekben.
A „sejtek beoltása a tápoldatba” kifejezés azt a lépést jelenti, amikor a sejteket kapcsolatba hozzuk a tápoldattal olyan feltételek mellett, amelyek alkalmasak a sejtek növekedéséhez és proliferációjához.
A „rekombináns protein” kifejezés bármely olyan proteint jelenthet, melyet emlős sejtkultúrával lehet előállítani az adott rekombináns proteint kódoló gén transzkripciójának és transzlációjának eredményeként, amely gént azon rekombináns nukleinsav molekula hordozza, melyet az emlős gazdasejtbe transzformáltak. A rekombináns protein nem képződik természetes módon az alkalmazott emlős sejtekben vagy a rekombináns protein természetes módon is képződik az alkalmazott emlős sejtekben, de alacsonyabb szinten. Előnyösen a rekombináns protein nem az emlős gazdasejtekben természetes módon is képződő protein.
A „rekombináns protein” kifejezés pedig olyan terápiás proteineket takar, mint például a citokinek, növekedési faktorok, alvadási faktorok és antitestek, melyekben a galaktóz tartalom befolyásolja a protein biológiai funkcióját. Előnyösen a rekombináns protein valamely Fc domént is tartalmazó protein, mint például valamely antitest vagy valamely fúziós protein mely egy IgG antitest Fc doménjéből és valamely más proteinből(ek)-ből vagy protein alegység(ek)-böl épül fel.
A fúziós proteinre, mely egy IgG antitest Fc doménjéből és valamely más protein(ek)-ből vagy protein alegység(ek)-ből épül fel, példaként említhető az etanercept (fúzió a TNF receptorral), aflibercept (fúzió a VEGF 1 és 2 receptorok extracelluláris doménjével), abatacept (fúzió a CTLA-4 extracelluláris doménjével) és a belatacept (fúzió a CTLA-4 extracelluláris doménjével).
Előnyösebben, a rekombináns protein valamely rekombináns antitest. A „rekombináns antitest” kifejezés olyan antitestet jelent, melyet emlős gazdasejt kultúrával lehet előállítani az adott rekombináns antitestet kódoló gén transzkripciójának és transzlációjának eredményeként, ezt a gént a rekombináns nukleinsav molekula hordozza, melyet az emlős gazdasejtbe illesztettek. A rekombináns antitest nem képződik természetes módon az alkalmazott emlős sejtekben vagy a rekombináns antitest természetes módon is képződik az alkalmazott emlős sejtekben, de alacsonyabb szinten. Előnyösen a rekombináns antitest nem termelődik természetes módon az emlős gazdasejtekben.
Az „immunoglobulin” és az „antitest” kifejezéseket felcserélhető módon használjuk a jelen találmányban. Az immunoglobulin lehet monoklonális antitest, multispecifikus antitest (pl. bispecifíkus antitest) vagy azok fragmensei, melyek a kívánt antigén kötőaktivitásával rendelkeznek. A természetesen előforduló antitestek különböző szerkezetekkel rendelkező molekulák. Például a természetes IgG antitestek körülbelül 150000 Daltonos heterotetramer glikoproteinek, melyek két azonos könnyű láncból és két azonos nehéz láncból állnak, melyeket diszulfíd kötések kapcsolnak össze. Az N-terminálistól a C-terminálisig minden nehéz láncnak van egy variábilis doménje (VH), melyet variábilis nehéz doménnek vagy nehéz lánc variábilis doménnek is neveznek, és amelyet három vagy négy konstans dómén (CHI, CH2, CH3 és tetszőlegesen CH4) követ. Hasonlóan, az N-terminálistól a Cterminálisig minden könnyű láncnak van egy variábilis doménje (VL), melyet variábilis könnyű doménnek vagy könnyű lánc variábilis doménnek is neveznek, és amelyet egy konstans könnyű lánc dómén (CL) követ. Az antitest könnyű lánca két típus valamelyikébe sorolható, melyeket kappának (k) és lambdának (λ) neveznek a könnyű lánc konstans doménjének aminosav sorrendje alapján.
Az „antitest fragmensek” a teljes hosszúságú antitest valamely részéből állnak, általában annak az antigén kötő vagy a variábilis részéből. Antitest fragmensek például a Fab, Fab', F(ab')2, és Fv fragmensek; ’’single-chain” antitest molekulák; diatestek; egyenes antitestek; és antitest fragmensekböl kialakított multispecifikus antitestek.
Előnyösen az immunoglobulin valamely monoklonális antitest. A „monoklonális antitest” kifejezés a találmány szerinti értelemben olyan antitestet jelent, melyet alapvetően homogén antitestek populációjából kaptunk, vagyis a populációt képező egyes antitestek azonosak, kivéve az esetlegesen természetesen megjelenő mutációkat, melyek kis mennyiségben jelen lehetnek. A konvencionális (poliklonális) antitest készítményekkel ellentétben, melyek általában különböző determinánsok (epitópok) ellen irányuló különböző antitesteket foglalnak magukba, minden monoklonális antitest az antigén egyetlen determinánsa (epitóp) ellen irányul. A „monoklonális” jelző az antitest karakterét mutatja, vagyis hogy azt alapvetően homogén antitestek populációjából kaptuk, és nem értelmezendő úgy, mint az antitest valamely körülményes módszerrel történő elvárt előállítása.
Az immunoglobulin tartozhat rágcsáló osztályokba: IgGl, IgG2a, IgG2b, IgM, IgA, IgD vagy IgE, humán osztályokba: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD vagy IgE, vagy azok keverékeibe vagy fragmenseibe.
Az immunoglobulin felismerhet egy bizonyos proteint vagy azok kombinációját a következő antigének közül, de nem korlátozódik csak azokra: CD2, CD3, CD4, CD8, CDI la, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, CD152, IL-la, IL-1B, IL-1, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-23, IL2 receptor, IL-4 receptor, IL-6 receptor, IL-12 receptor, IL-13 receptor, IL-18 receptor alegységek, PDGF-β, és annak analógjai, PLGF, VEGF, TGF, TGF-P2, TGF-pl, EGF receptor, PLGF receptor, VEGF receptor, vérlemezke receptor gpIIb/IIIa, thrombopoietin receptor, apoptózis receptor PD-1, hepatocita növekedési faktor, osteoprotegerin ligandum, interferon gamma, B limfocita stimulátor BLyS, T-cell aktiválás regulátor CTLA-4, C5 komplement, IgE, tumor antigén CA125, tumor antigén MUCI, PEM antigén, ErbB2/HER-2, tumor-asszociált epitópok, melyek megemelkedett szinten vannak jelen a betegek szérumában, tumor-asszociált epitópok vagy proteinek, melyek a mellben, vastagbélben, pikkelyes sejteken, prosztatában, hasnyálmirigyben, tüdőben és/vagy vesében kifejeződő rákos sejtek és/vagy melanómák, gliomák, vagy neuroblastoma sejtek, a tumor elhalt magja, integrin alfa 4 béta 7, integrin VLA-4, B2 integrinek, α4βί és α4β7 integrin, TRAIL receptorok 1,2,3, és 4, RANK, a RANK ligand (RANKL), TNF-α, az adhéziós molekula VAP-1, hámsejt adhéziós molekula (EpCAM), intercelluláris adhéziós molekula-3 (ICAM-3), leukointegrin adhesin, vérlemezke glikoprotein gp Ilb/IIIa, szív miozin nehéz lánc, parathyroid hormon, sclerostin, MHC I, karcinoembrionális antigén (CEA), alfa-fetoprotein (AFP), tumor nekrózis faktor (TNF), Fc-y-1 receptor, HLA-DR 10 béta, HLA-DR antigén, Lszelektin, és IFN-γ.
Az immunoglobulin lehet például afelimomab, abciximab, adalimumab, alemtuzumab, arcitumomab, belimumab, canakinumab, cetuximab, denosumab, trastuzumab, imciromab, capromab, infliximab, ipilimumab, abciximab, rituximab, basiliximab, palivizumab, natalizumab, nivolumab, nofetumomab, omalizumab, daclizumab, ibritumomab, muromonabCD3, edrecolomab, gemtuzumab, golimumab, certolizumab, eculizumab, ustekinumab, ocrelizumab, ofatumumab, obinutuzumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, romosozumab, tocilizumab, tositumomab, clenoliximab, keliximab, galiximab, foravirumab, lexatumumab, bevacizumab, és vedolizumab.
A jelen találmány szerinti immunoglobulin előnyösen egy IgG molekula, mint például IgGl, IgG2, IgG3, vagy IgG4 molekula. Előnyösebben, az immunoglobulin IgGl. Még előnyösebben az immunoglobulin IgGl, ahol legalább az Fc rész humán. Az immunoglobulin lehet rágcsáló-humán kiméra IgGl, ahol az IgGl Fc része humán és a variábilis rész egér eredetű. Legelőnyösebben a kiméra immunoglobulin rituximab vagy infliximab.
A rituximab egy kiméra anti-CD20 antitest, melyet részletesen tárgyal például a WO94/11026 szabadalmi bejelentés.
Az infliximab egy kiméra anti-TNFa antitest, melyet részletesen tárgyal például a WO92/16553 szabadalmi bejelentés.
Az immunoglobulin lehet valamely rágcsáló progenitor humanizált IgGl formája, melyben a variábilis dómén CDR-jei egérből származnak és a variábilis dómén keret részei humán eredetűek. Legelőnyösebben a humanizált antitest trastuzumab vagy bevacizumab.
A trastuzumab egy humanizált anti-HER2 antitest, melyet részletesen tárgyal például a WO92/22653 szabadalmi bejelentés.
A bevacizumab egy humanizált anti-VEGF antitest, melyet részletesen tárgyal például a WO98/45331 szabadalmi bejelentés.
Az immunoglobulin lehet teljesen humán IgGl antitest, vagyis egy olyan antitest, melynek minden része humán eredetű. Legelőnyösebben a humán antitest adalimumab vagy denosumab.
Az adalimumab egy humán anti-TNFa antitest, melyet részletesen tárgyal például a WO97/29131 szabadalmi bejelentés.
A denosumab egy humán anti-RANKL antitest, melyet részletesen tárgyal például a W003/002713 szabadalmi bejelentés.
Egy előnyös megvalósítás szerint az antitest rituximab vagy bevacizumab lehet.
A monoklonális antitestek a jelen találmányban speciálisan magukba foglalják a „kiméra” antitesteket (immunoglobulinokat), melyekben a nehéz és/vagy könnyű láncok aránya azonos vagy homológ a valamely konkrét fajból nyert, vagy valamely konkrét antitest osztályhoz vagy alosztályhoz tartozó antitestekben lévő megfelelő szekvenciákkal, míg a lánc(ok) további része azonos vagy homológ a valamely más fajból nyert, vagy valamely más antitest osztályhoz vagy alosztályhoz tartozó antitestekben lévő megfelelő szekvenciákkal, valamint az ilyen antitestek fragmenseit, amennyiben rendelkeznek a kívánt biológiai aktivitással.
Továbbá, a monoklonális antitestek a jelen találmányban magukba foglalják a „humanizált” antitesteket is. Az ilyen antitestek nem-humán (például rágcsáló) antitestek „humanizálásával” állíthatók elő, és csak minimális olyan szekvenciát tartalmaznak, mely az állat immunoglobulinjából származik. A molekula túlnyomó része humán aminosav szekvenciát tartalmaz. A humán recipiens antitest hipervariábilis régiójából származó részeket a kívánt kötődési tulajdonságokkal rendelkező nem-humán donor antitest hipervariábilis régiójából származó részekkel helyettesítikk.
Végül, a monoklonális antitestek a jelen találmányban magukba foglalják a teljesen humán antitesteket is, melyeket valamely humán antitest könyvtár szűrésével kaphatunk.
A jelen találmány módszerében a rekombináns proteint emlős sejtekben állítjuk elő. A rekombináns antitestek kifejezésére alkalmas emlős gazdasejtek a jelen találmány szerint lehetnek kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek (beleértve a dhfr negatív CHO sejteket is, melyeket DHFR szelektáló markerrel használunk), NSO mieloma sejtek, COS sejtek, SP2 sejtek, majom vese CV1, humán embrionális vese 293-as vonal; bébi hörcsög vese sejtek (BHK), egér Sertoli sejtek (TM4), afrikai zöld majom vese sejtek (VERO-76), humán nyaki karcinóma sejtek (HELA), kutya vese sejtek (MDC), buffalo patkány máj sejtek (BRL 3 A), humán tüdő sejtek (W138), humán máj sejtek (Hep G2), egér emlő tumor sejtek (MMT 060562), TRI sejtek, MRC 5 sejtek és FS4 sejtek. Előnyösen a gazdasejteket valamely rágcsálóból származtatjuk. Még előnyösebben, az emlős sejtek kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek, még előnyösebben a sejtek CHO-K1 sejtek, és legelőnyösebben CHO-K1 sejtek, melyeket szérum-mentes közegben való növesztéshez adaptáltak (CHO-S) és/vagy az Invitrogen-től (katalógus szám: R-800-07) beszerezhetők.
Az emlős sejtek legalább egy rekombináns nukleinsav molekulával transzformáltak, vagyis genetikailag módosítottak, például egy expressziós vektorral, mely lehetővé teszi a rekombináns protein stabil előállítását az emlős gazdasejtekben.
A rekombináns antitestek előállításához használt emlős sejteket vagy egy rekombináns nukleinsav molekulával transzformálták, mely az antitest nehéz és könnyű láncát egyaránt kódolja, vagy két rekombináns molekulával transzformáltak, melyek közül az egyik az antitest könnyű láncát, míg a másik az antitest nehéz láncát kódolja. Egy előnyös megvalósítás szerint a rekombináns antitestet egy rekombináns nukleinsav molekulával expresszáljuk, mely az antitest nehéz és könnyű láncát egyaránt kódolja. Egy még előnyösebb megvalósítás szerint a rekombináns antitestet egy rekombináns nukleinsav molekuláról expresszáljuk, amelybena nehéz és könnyű lánc expresszióját külön promoterek kontrollálják, melyek lehetnek azonosak vagy különbözőek. A legelőnyösebb megvalósítás szerint a rekombináns antitestet egy rekombináns nukleinsav molekuláról expresszáljuk, amelyben a nehéz és könnyű lánc expresszióját különálló, de egymással megegyező promoterek kontrollálják.
A „közeg”, „sejtkultúra közeg”, „kultúra közeg” és „tápoldat” kifejezések a jelen találmány szerinti értelemben felcserélhetőek és azt az oldatot jelentik, mely az emlős sejtek növekedéséhez szükséges tápanyagokat tartalmazza. Tipikusan a tápoldat esszenciális és nemesszenciális aminosavakat, vitaminokat, energiaforrásokat, lipideket és nyomelemeket tartalmaz, melyek a sejt minimális növekedéséhez és/vagy túléléséhez szükségesek. Előnyösen a tápoldat kémiailag definiált abban az értelemben, hogy annak minden összetevője és azok koncentrációja ismert. Szintén előnyösen a tápoldat szérummentes és hidrolizátum-mentes és nem tartalmaz semmilyen állati eredetű komponenst. Egy előnyösebb megvalósítás szerint a közeg szérummentes és hidrolizátum-mentes és nem tartalmaz semmilyen állati eredetű komponenst, de tartalmaz HEPES-t és Pluronic® F-68-at. Egy különösen előnyös megvalósítás szerint a jelen találmány szerinti módszer (a) és (b) lépéseiben használt tápoldat, vagyis a betáplálás előtti lépéseké, PowerCHO-2 CD (beszerezhető:, katalógus szám: BE12-771Q), mely rekombináns inzulinnal, lipidekkel, vascitráttal és PEG2000-el van kiegészítve. A legelőnyösebb megvalósítás szerint a PowerCHO2 CD médium nemcsak rekombináns inzulinnal, lipidekkel, vas-citráttal és PEG2000-el van kiegészítve, hanem extra mennyiségű L-tirozinnal, L-fenilalaninnal és L-glutaminnal is. Az extra mennyiségű L-tirozin, L-fenilalanin és L-glutamin 8 mM L-glutamin, 1,2 mM L-tirozin és 2 mM L-fenilalanin.
Előnyösen, további uridin, mangán-klorid és galaktóz mennyiséget nem adtunk a tápoldathoz, de egy vagy több ezek közül a komponensek közül jelen lehet az alap tápoldatban.
Mindazonáltal a tápoldat tartalmazhatja ezen vegyületek bármelyikét vagy mindegyiket, ha jelen vannak a kémiailag definiált alkalmazott tápoldatban. Még előnyösebben, ha a tápoldat nem tartalmaz galaktózt.
A tápoldatot előnyösen sterilre szűrjük, még előnyösebben a steril szűrést 0,1 mikron pórus méretű szűrőn hajtjuk végre.
A jelen találmány módszerének a) lépésében a tápoldat pH-ját, melyet az „első pH-nak” is nevezünk, 7,15 és 7,25 közötti tartományban tartjuk, előnyösen Na2CO3 vagy H3PO4 hozzáadásával, az első időtartam alatt. Az első időtartam 60-tól 80 óra, előnyösen 63-tól 79 óra, még előnyösebben 66-tól 78 óra és legelőnyösebben 70 óra a tápoldat emlős sejtekkel történő inokulálását követően.
Az első időtartam után a tenyészet pH-ját megváltoztatjuk, előnyösen csökkentjük, egy második pH-ra. Még előnyösebben a második pH 0,05-től 0,3 pH egységgel alacsonyabb, mint az első pH és még előnyösebben a második pH 0,15-től 0,25 pH egységgel alacsonyabb, mint az első pH. Legelőnyösebben a második pH 7,00. A pH-t csökkenthetjük megfelelő sav vagy CO2 gáz hozzáadásával, előnyösen H3PO4 hozzáadásával. A pH-t akkor csökkentjük, amikor az élő sejt koncentrációja a 4,0-töl 7,0 x 106 értéket elérte. A második időtartam, melyben a sejteket egy második pH-η tenyésztjük, 6-tól 11 nap, vagy 6-tól 8 nap, előnyösen körülbelül 7 nap. Ennek megfelelően a teljes tenyésztési periódus a jelen találmány szerinti módszerben 8-tól 14 nap, a tápoldat emlős sejtekkel történő inokulálását követően. Előnyösen a teljes tenyésztési periódus a jelen találmány szerinti módszerben 9-töl 10 nap, a tápoldat emlős sejtekkel történő inokulálását követően.
A jelen találmány szerinti módszerben a sejteket a (c) lépésben egy olyan összetételű eleggyel tápláljuk, melynek legalább két összetevője a következő: (i) egy vagy több nukleozid, (ii) egy vagy több átmeneti fém só és (iii) egy vagy több cukor (a továbbiakban (i)-től (iii) komponenseknek is nevezzük), különösen egy olyan eleggyel, mely uridint, mangán-kloridot és galaktózt tartalmaz.
A „táplálás” illetve a „rátáplálás” kifejezés azt jelenti, hogy az elegyet az (a) vagy (b) lépés sejtkultúrájához adjuk és sem tápoldatot sem sejteket nem vonunk ki a rátáplálás alatt. A rátáplálás tipikusan nem folyamatosan történik, hanem egy bizonyos időpontban. A jelen találmány szerinti módszerben az elegyet meghatározott időpontokban tápláljuk be, ahogy azt a következőkben részletesen tárgyaljuk.
A rátáplált elegy összetevődhet csak az (i)-től (iii) komponensekből, például vízben vagy megfelelő pufferben oldva, vagy alapulhat olyan tápoldaton, mely az (i)-től (iii) komponenseken kívül egyéb összetevőket is tartalmaz. Előnyösen a (c) lépésben rátáplált elegy olyan tápoldaton alapul, mely az (i)-töl (iii) komponenseken kívül egyéb összetevőket is tartalmaz. Ez a tápoldat lehet azonos azzal a tápoldattal, melyet a sejtek kezdeti tenyésztéséhez használunk, vagyis az inokulálás után és a rátáplálás előtt ((a) és (b) lépések), vagy különbözhet attól. Előnyösen a rátápláláshoz használt tápoldat különbözik a sejtek kezdeti tenyésztéséhez használttól (vagyis az (a) és (b) lépésekétől). Még előnyösebben a tápláláshoz használt tápoldat ExCell® a Sigma Aldrich-tól. Egy másik előnyös megvalósítás szerint a tápláláshoz használt tápoldat só-mentes (SF) ExCell® a Sigma Aldrich-tól.
Az (i)-töl (iii) komponenseken kívül a rátápláláshoz használt tápoldat egyéb összetevőket is tartalmazhat, mint például aminosavakat és más kiegészítőket. Előnyösen a rátápláláshoz használt tápoldat tartalmazhat továbbá egy vagy több komponenst a következőkből: L-valin, L-cisztein, L-fenilalanin, L-szerin és valamely kémiailag meghatározott kiegészítőt, mint például BD Recharge. Még előnyösebben a rátápláláshoz használt tápoldat tartalmaz L-valint, L-ciszteint, L-fenilalanint, L-szerint és valamely kémiailag meghatározott kiegészítőt az (i)től (iii) komponenseken kívül. Legelőnyösebben a rátápláláshoz használt tápoldat ExCell® vagy só-mentes SF ExCell® és tartalmaz L-valint, L-ciszteint, L-fenilalanint, L-szerint és valamely kémiailag meghatározott kiegészítőt az (i)-től (iii) komponenseken kívül. Az Lvalin koncentrációja a táplálásra használt sejtkultúra közegben 34 mM, az L-cisztein koncentrációja a táplálásra használt sejtkultúra közegben 8,3 mM, az L-fenilalanin koncentrációja a táplálásra használt sejtkultúra közegben 4,5 mM, és az L-szerin koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 38 mM.
A rátápláláshoz használt tápoldatot előnyösen sterilre szűrjük, még előnyösebben a steril szűrést 0,2 vagy 0,1 mikron pórus méretű szűrön hajtjuk végre.
Egy másik megvalósítás szerint a rátápláláshoz használt tápoldat nem tartalmaz timidint, fruktózt, mannózt, szacharózt és N-acetil-mannózamint.
A rátápláláshoz használt tápoldat egy vagy több nukleozidot tartalmaz. A nukleozidok valamely nitrogént tartalmazó bázisból és valamely öt szénatomos cukorból, mint például ribóz vagy dezoxiribóz, tevődnek össze. A nukleozidokra példaként említhetjük a következőket: citidin, uridin, adenozin, guanozin, timidin és inozin. Előnyösen a nukleozid uridin.
Az egy vagy több nukleozid koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 1-től 20 mM, előnyösen 1,5-töl 15 mM, még előnyösebben 2-től 12 mM, még előnyösebben 2,5-től 10 mM, és legelőnyösebben 3 mM. Az uridin koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 1 -töl 20 mM, előnyösen 1,5-től 15 mM, még előnyösebben 2-töl 12 mM, még előnyösebben 2,5-től 10 mM, és legelőnyösebben 3 mM.
A rátápláláshoz használt tápoldat egy vagy több átmeneti fém sót tartalmaz. Az átmeneti fém sók olyan sók, melyek valamely átmenti fém valamely ellen-ionnal képzett sói. Átmeneti fémek közé tartozik a Fe, Co, Cr, Mn, Mo, Ni, Cu, Zn.A megfelelő ellen-ionok például a klorid (Cl’), szulfát (SO42·) és foszfát (PO43·) lehet. Előnyösen az átmeneti fém só mangán só, legelőnyösebben mangán(II)-klorid.
Az egy vagy több átmeneti fém só koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 0,002től 0,1 mM, előnyösen 0,005-től 0,09 mM, még előnyösebben 0,008-tól 0,08 mM, még előnyösebben 0,01-töl 0,07 mM, és legelőnyösebben 0,06 mM. A mangán(II)-klorid koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 0,002-től 0,1 mM, előnyösen 0,005-től 0,09 mM, még előnyösebben 0,008-tól 0,08 mM, még előnyösebben 0,01-től 0,07 mM, és legelőnyösebben 0,06 mM.
A rátápláláshoz használt tápoldat legalább egy vagy több különböző fajta cukrot tartalmaz. A cukrok rövid láncú szénhidrátok, többek között glükóz, fruktóz, szacharóz, galaktóz, maltóz és laktóz. Előnyösen az egyik cukor galaktóz.
Az egy vagy több cukor koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 5-től 100 mM, előnyösen 7,5-töl 75 mM, még előnyösebben 10-től 60 mM, még előnyösebben 12,5-től 50 mM, és legelőnyösebben 15 mM. A galaktóz koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 5-től 100 mM, előnyösen 7,5-től 75 mM, még előnyösebben 10-töl 60 mM, még előnyösebben 12,5-től 50 mM, és legelőnyösebben 15 mM.
Egy előnyös megvalósítás szerint az egy vagy több nukleozid koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 1-től 20 mM, az egy vagy több átmeneti fém só koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 0,002-töl 0,1 mM, és az egy vagy több cukor koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 5-töl 100 mM. Egy előnyös megvalósítás szerint az egy vagy több nukleozid koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 3 mM, az egy vagy több átmeneti fém só koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 0,06 mM, és az egy vagy több cukor koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 15 mM.
Egy előnyös megvalósítás szerint az uridin koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 1-től 20 mM, a mangán(II)-klorid koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 0,002-től 0,1 mM, és a galaktóz koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 5-töl 100 mM. Egy előnyös megvalósítás szerint az uridin koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 3 mM, a mangán(II)-klorid koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 0,06 mM, és a galaktóz koncentrációja a rátápláláshoz használt tápoldatban 15 mM.
A sejtkultúrát az (i)-től (iii) komponenseket tartalmazó rátápláló oldattal legalább egyszer tápláljuk, előnyösen legalább kétszer, még előnyösebben kétszer. Az (i)-töl (iii) komponenseket tartalmazó rátápláló oldattal történő táplálás előnyösen négytől hat nappal az alap tápoldat emlős sejtekkel történő inoklulálását követően történik. Ha az (i)-től (iii) komponenseket tartalmazó rátápláló oldattal történő táplálást kétszer hajtjuk végre, az első (i)től (iii) komponenseket tartalmazó rátápláló oldattal történő táplálás négytől hat nappal, előnyösen öt nappal az emlős sejtekkel történő sejtkultúra beoltást követően történik és a második (i)-től (iii) komponenseket tartalmazó rátápláló oldattal történő táplálás hattól nyolc nappal, előnyösen hét nappal az emlős sejtekkel történő inokulálást követően történik. Még előnyösebben az első (i)-től (iii) komponenseket tartalmazó rátápláló oldattal történő táplálás öt nappal az emlős sejtekkel történő inokulálást követően történik és a második (i)-töl (iii) komponenseket tartalmazó rátápláló oldattal történő táplálás hét nappal az emlős sejtekkel történő inokulálást követően történik.
Az első rátáplálási lépésben (i)-töl (iii) komponenseket tartalmazó elegyet egy 8,5-től 10,5-ös faktorral hígítjuk, előnyösen egy 9,0-töl 10,0-ös faktorral és legelőnyösebben 9,3-as faktorral. A második rátáplálási lépésben (i)-től (iii) komponenseket tartalmazó elegyet egy 9,5-től 11,5-ös faktorral hígítjuk, előnyösen egy 10,0-től 11,0-es faktorral és legelőnyösebben 10,3-as faktorral.
Előnyösen az (i)-től (iii) komponenseket tartalmazó eleggyel történő egy vagy több rátáplálási lépést megelőzi egy rátáplálási lépés egy olyan eleggyel, melyhez az (i)-től (iii) komponenseket nem adtuk hozzá, de amely egyébként azonos az (i)-töl (iii) komponenseket tartalmazó eleggyel. A rátáplálási lépés egy olyan eleggyel, melyhez az (i)-töl (iii) komponenseket nem adtuk hozzá, de amely egyébként azonos az (i)-től (iii) komponenseket tartalmazó eleggyel, kettőtől négy nappal, előnyösen három nappal az alap tápoldat emlős sejtekkel történő inokulálását követően történik.
Ennek megfelelően a jelen találmány szerinti módszer előnyösen a következő rátáplálási lépésekből áll:
cl) rátáplálás egy olyan eleggyel, melyhez az (i)-től (iii) komponenseket nem adtuk hozzá három nappal az alap tápoldat emlős sejtekkel történő inokulálását követően;
c2) rátáplálás egy olyan eleggyel, melyhez az (i)-töl (iii) komponenseket hozzáadtuk öt nappal az alap tápoldat emlős sejtekkel történő inokulálását követően;
c3) rátáplálás egy olyan eleggyel, melyhez az (i)-től (iii) komponenseket hozzáadtuk hét nappal az alap tápoldat emlős sejtekkel történő inokulálását követően.
A jelen találmány szerinti módszerben a sejtkultúra, vagyis az emlős sejteket tartalmazó tápoldat hőmérsékletét előnyösen állandó értéken tartjuk az egész tenyésztési eljárás alatt, mely azt jelenti, hogy a hőmérsékletet az eljárásban aktívan nem szabályozzuk magasabb vagy alacsonyabb hőmérsékletre, és hogy mindig ugyanazt az előre beállított hőmérsékletet alkalmazzuk. Ennek ellenére kisebb hőmérsékleti eltérések felléphetnek a tenyésztési eljárás során. Előnyösen a tenyésztési eljárás során a hőmérsékletet 36°C és 38°C közé, még előnyösebben 37°C-ra állítjuk be.
A jelen találmány szerinti módszerben az ozmolalitás előnyösen alacsonyabb, mint 400 mOsm/kg az egész eljárás során, vagyis az (a)-tól (c) lépéseken keresztül, ahogy az igénypontokban megadjuk. Előnyösen az ozmolalitás 250-töl 400 mOsm/kg tartományba esik, még előnyösebben 300-tól 380 mOsm/kg tartományba, és legelőnyösebben 330-tól 370 mOsm/kg tartományba. Az „ozmolalitás” kifejezés jelen találmány szerinti jelentése a tápoldatban lévő összes oldott anyag (mely magába foglalhat ionizált és nem-ionizált molekulákat) miatt fellépő ozmózisnyomás egy kilogramm oldószerre vonatkoztatva. Alacsony ozmolalitást, vagyis 400 mOsm/kg alatti ozmolalitást, alacsony só koncentrációjú tápoldat használatával lehet fenntartani. Különösen a rátápláláshoz használt elegy sókoncentrációja alacsony vagy egyáltalán nem tartalmaz sót a rátáplálás c) lépésében alkalmazott átmeneti fém són kívül.
A jelen találmány szerinti módszerben a sejteket aerob körülmények között tenyésztjük, vagyis az oldott oxigén szintje 50 ± 40%. A szén-dioxid szintjét 0 és 90 mmHg közötti tartományban tartjuk, tetszőlegesen a keverési sebesség vagy a levegőztetés intenzitásának beállításával.
A jelen találmány szerinti eljárást glükóz limitáció elkerülésével hajtjuk végre. Ennek megfelelően a sejtkultúrához annyi glükózt adunk, hogy a glükóz szintet 5-től 35 mM tartományban tartsuk, előnyösen 10-től 25 mM tartományban.
A sejtkultúra habzása esetén a jelen találmány eljárása során bármikor adhatunk habzásgátló anyagot a kultúrához.
Miután a jelen találmány szerinti módszerrel a rekombináns proteint előállítottuk, a terméket kinyerjük a sejttenyészetből. Mivel az emlős sejtekben expresszált rekombináns proteinek, különösen az antitestek, tipikusan a tápoldatba választódnak ki a tenyésztési eljárás során, a tenyésztési eljárás végén a termék kinyerése a rekombináns proteint tartalmazó tápoldat és a sejtek szétválasztásával történik. A sejtelválasztási módszernek kíméletesnek kell lennie, hogy a sejtek sérülését minimalizáljuk, elkerüljük a sejt törmelék felhalmozódását és a proteázok és egyéb molekulák felszabadulását, melyek befolyásolhatják az immunoglobulin termék minőségét. Általában a rekombináns proteint tartalmazó sejttenyészet feldolgozása centrifugálásból és/vagy szűrésből áll, ahol a rekombináns protein a felülúszóban, illetve a szürletben található. Az „expanded bed” adszorpciós kromatográfia egy alternatív eljárás lehet, hogy elkerüljük a centrifugálási/szürési módszert.
Miután a rekombináns proteint tartalmazó sejttenyészetet feldolgoztuk, a rekombináns proteint a tápoldattól is meg kell tisztítani. A rekombináns proteinek és különösen a rekombináns antitestek tisztítását kromatográfiás lépések sorozatával hajtjuk végre, úgy mint anion cserélő kromatográfia, kation cserélő kromatográfia, affinitás kromatográfia, hidrofób kölcsönhatás kromatográfia, hidroxiapatit kromatográfia és méret kizárásos kromatográfia. Továbbá a tisztítási eljárás tartalmazhat egy vagy több ultra-, nano- vagy diaszürési lépést is. Egy különösen alkalmas módszer, melyet a PCT/EP2015/054862 bejelentésben írnak le, mely a következő lépésekből áll: anion cserélő kromatográfia átfolyó módban, affinitás kromatográfia protein A gyantán és kation cserélő kromatográfia kötő- és eluáló módban.
A jelen találmány szerinti eljárások alkalmasak nagy mennyiségű rekombináns protein előállítására, ami azt jelenti, hogy legalább 500 vagy 1000 liter kultúra térfogatban, előnyösen legalább 5000 vagy 8000 liter térfogatban, legelőnyösebben 10000 vagy 20000 liter térfogatban.
A jelen találmány szerinti eljárás a bioszimiláris terápiás antitest tulajdonságainak a referencia termékhez, vagyis a forgalomban levő terápiás antitesthez viszonyított hasonlóságát, bioszimilaritását növeli. A bioszimiláris terápiás antitest egy olyan terápiás antitest, melyet azután hoznak forgalomba, hogy az eredeti termék szabadalmi oltalma lejárt, és amely az eredeti termékkel azonos aminosav sorrenddel rendelkezik, de kisebb mértékben eltérhet a poszt-transzlációs változások következtében. Mindazonáltal ugyanazokra a fiziológiás hatásokra képes, mint az eredeti termék. Amikor egy forgalomban lévő antitest bioszimilárisának forgalmazási engedélyére vonatkozó kérelmet nyújtunk be, be kell mutatni, hogy a bioszimiláris antitest szerkezete összehasonlítható a referencia termékével. Egy fontos paraméter a glikozilált proteinek bioszimilaritásának meghatározásában a glikozilációs mintázat, mely befolyásolhatja az antitest effektor funkcióit.
A jelen találmány szerinti módszer alkalmazásával a glikozilációs mintázat és különösen a bioszimiláris antitest galaktozilációja összehasonlítható a referencia termékével, így megnövelve a bioszimilaritását egy olyan terápiás antitest glikozilációs mintázatához és bioszimilaritásához viszonyítva, melyet pH csökkentés nélkül állítottak elő, és nem táplálták egy olyan rátápláló tápoldattal, mely uridint, mangán(II)-kloridot és galaktózt tartalmaz.
A következő példák és ábrák a jelen találmány illusztrálására szolgálnak. Nyilvánvaló, hogy ezek a példák és ábrák nem korlátozzák a jelen találmány oltalmi körét. Egy átlagos szakértő az itt leírt törvényszerűségek alapján egyértelműen képes lehet további módosítások elképzelésére.
PÉLDÁK
A jelen találmány módszerének alátámasztására és illusztrálására a következő példákat adjuk meg. Hangsúlyozni kell azonban, hogy ezek a példák semmi esetre sem korlátozzák a találmány oltalmi körét.
A következő táblázatokban bemutatott kiválasztott kísérleteket rituximabbal hajtottuk végre, ami egy egér-humán kiméra, anti-CD20, IgGl antitest, melyet rekombinánsan expresszáltunk különböző méretű „fed-batch” kultúrákban tenyésztett CHO sejtekben. A példákban ezt az antitestet modell antitestnek is nevezzük.
Azonban a feltalált módszerek nem függnek sem speciális antitestektől, sem speciálisan az immunoglobulin expressziójára használt gazdasejtektöl. Ugyanez igaz az expresszió módjára és a kiválasztott tenyésztési körülményekre, amelyeket a protein galaktoziláltsági mintázat és a tenyésztés végén elérhető maximális kitermelés tekintetében optimalizáltunk.
1. Módszerek
1.1 Sejtkultúra
Sejtek
A kínai hörcsög petefészek S vonal (CHO-S) sejtet, mely eredetét tekintve a kereskedelmi forgalomban lévő közönséges CHO KI sejtvonal szuszpenzióban tenyészthető szubklónjából származik, szérum-mentes közegben történő tenyésztéshez adaptáltak és eredetileg kiváló növekedése (beleértve a kisebb mértékű aggregációt a kevertetett kultúrában) és transzfekciós hatékonysága miatt választottak, az Invitrogen-től szereztük be (katalógus szám: R-800-07, Lot. 1335750). A CHO-S sejteket szérum-mentes, kémiailag definiált PowerCHO-2 közegben (Lonza Inc. US) történő tenyésztéshez adaptáltak.
„Fed-batch” kultúra
A modell antitest expresszálására genetikailag módosított CHO sejteket eredetileg az alap PowerCHO-2 közegben (Lonza) tenyésztettük. A tenyésztés harmadik napjától kezdődően (inokulálás után) minden második napon a kezdeti munka térfogat (az alap tápoldat plusz az inokulum térfogata) 15%-ának arányában háromszor (3x) koncentrált ExCell tápoldatot (37g/L; SAFC) adunk a tenyészethez egy adagban.
A példákban használt tápoldat és a további adalékok beszállítóit és a katalógus számokat a következőkben foglaljuk össze:
PowerCHO-2 CD ExCell®CD CHO Fusion SF ExCell® CD CHO Fusion L-glutamin
L-prolin (Pro; L-Pro) L-valin (Val; L-Val) L-cisztein (Cys; L-Cys) L-fenilalanin (Phe; L-Phe) L-tirozin (Tyr; L-Tyr) L-szerin (Ser; L-Ser) BD Recharge™ Supplement Uridin
Lonza, Cat. No.: BE 12-77IQ
SAFC, Cat. No.: 24365C
SAFC, customized
Gibco, Cat. No.: 25030
Sigma-Aldrich, Cat No.: G5792
Sigma-Aldrich, Cat No.: P8865
Sigma-Aldrich, Cat No.: V4638
Sigma-Aldrich, Cat No.: C5360
Sigma-Aldrich, Cat No.: P8740
Sigma-Aldrich, Cat No.: T4321
Sigma-Aldrich, Cat No.: S1315
Becton-Dickinson Biosciences, Cat. No.: 670002
Sigma-Aldrich, Cat. No.: U3OO3
Mangán(II)-klorid oldat β-D-Galaktóz
Sigma-Aldrich, Cat. No.: Ml787
Sigma-Aldrich, Cat. No.: G5388
A tenyésztési hőmérsékletet 37°C-on tartottuk. A pH-t 7,05 és 7,15 közötti tartományban tartottuk 0,5 M-os NaaCCh vagy H3PO4 hozzáadásával. Az oldott oxigén (DO) beállított értéke 40% volt. A lényeges metabolitokat minden nap mértük. A glükóz szintjét körülbelül 20 mM-os szinten tartottuk. A sejtkultúrát 9-től 10 napig tenyésztettük.
A kísérleteket főleg 1, 5, 10 vagy 100 L-es laboratóriumi méretben előállított és feldolgozott tenyészetekkel hajtottuk végre. A példákban az alkalmazott gyártási méret és a maximális tenyésztő térfogat 1000 L volt. Amennyiben azt másként nem jelezzük, a méret mindig a tenyésztő térfogatot jelenti.
1.2 Tisztítás
Protein A kromatográfia
Kvalitatív analízis céljára a kapott modell antitestet a fermentációs tápoldatból Protein A kromatográfia alkalmazásával tisztítottuk. Ez a „capture” módszer kiváló szelektivitást nyújt az Fc doménnel rendelkező molekulák esetén, így több mint 99,5% szennyeződést eltávolít egy lépésben.
1.3 Analitika
Elő sejt koncentráció és életképesség
Az élő sejtkoncentrációt és életképességet Countess™ Automated Cell Counter (Invitrogen Carlsbad, CA, 2008) segítségével Trypan blue festési módszer alkalmazásával határoztuk meg.
Glükóz
A glükóz koncentrációt Accu-Chek vércukor mérővel (Roche, Mannheim, Németország) mértük.
pCOg
Az oldott szén-dioxid mennyiségét (PCO2) ABL80 vér gáz analizátorral (Radiometer, Bronshoj, Dánia) határoztuk meg.
pH mérés
Az in situ pH mérő rekalibrációjához az „at-line” pH mérést S47 SevenMulti pH mérővel (Mettler Toledo, Zürich, Svájc) hajtottuk végre.
Ozmolalitás
A minták ozmolalitását Advanced Model 2020 multi-sample ozmométer (Advanced Instruments, Norwood, MA) segítségével állapítottuk meg.
Titer
A minták protein titerét (az eljárás során) Protein A affinitás HPLC-vel határoztuk meg.
Glikoziláltsági profil
Az egyes glikoformák relatív arányának meghatározását, melyet a különböző retenciós időknél kapott glikán formák korrigált terület %-ában fejezünk ki, kapilláris elektroforézissel hajtottuk végre, lézer-indukált fluoreszcens detektálás (CE-LIF) alkalmazásával. A protein mintákban a glikánok lehasítását (220pg) PNGase-F-el történő inkubálással végeztük 37°Con 3 órán keresztül. A proteinek kicsapását hideg alkohollal végeztük, melyet szárítás követett. A reduktív aminálást követően, melyet fluoreszcens származékképző anyaggal, 9aminopirén-l,4,6-triszulfonsavval (APTS) és nátrium-cianoborohidriddel hajtottunk végre, a mintákat 55°C-on inkubáltuk 90 percen keresztül. A reakció leállítása után a mintákat elektroforézisnek vetettük alá, amelyhez 488 nm-es lézerrel felszerelt CE-LIF rendszert használtunk. A glikánok relatív mennyiségét fluoreszcens detektálással határoztuk meg. A felszabadult glikánok mennyiségét a megfelelő csúcsok terület % értékének számításával határoztuk meg. A modell antitest négy fő glikoformáját (G0F, GIF, Gl’F, G2F) hatóanyag felszabadítási és stabilitási tesztekbenre értékeltük ki. Az elfogadási értékek a következők voltak: GOF: 40-56 terület%; GIF: 28-38 terület%; Gl'F: 9-13 terület% és G2F: 5-12 terület%.
Elválasztási paraméterek a következők:
Kapilláris átmérő 50 μΜ I.D.
Kapilláris hossza: teljes hossz (Lt) = 50,2 cm
Hosszúság a detektorig (Ld) = 40,2 cm
Semleges kapilláris • PEO Gél perc futási idő
Kapilláris hőmérséklete 20°C
Minta tárolási hőmérséklete 10°C
Bioaktivitás
A modell antitest bioaktivitását komplement-függő citotoxicitás (CDC) vizsgálattal határoztuk meg. A CDC módszer alapja, hogy a modell antitest specifikus módon kötődik a cél sejtek felületén expresszálódó antigénjéhez.Az így képződött antigén-antitest komplex aktiválja a komplement rendszert, melynek eredményeképpen a sejtek dózis-függő módon elhalnak. A túlélő sejteket AlamarBlue® reagens hozzáadásával detektáljuk. A CDC vizsgálat kiértékelése a szigmoid dózis-hatás görbék összehasonlításán alapul, melyeket mind a minta, mind a referencia hígítási soraira meghatároztunk.
2. Eredmények
2.1 Az ozmolalitás optimalizálása
A rátápláló elegy összetételének optimalizálásása céljából, amit a sejtek tápanyag szükséglete határoz meg, analizáltuk a rátápláló elegy ozmolalitásának hatását a CHO sejtek által termelt modell antitest protein glikoformáira/galaktoziláltságára IL-es „fed-batch” fermentációs kísérletekben.
A modell antitest expresszálásához a genetikailag módosított CHO sejteket először egy alap tápoldatban (PowerCHO-2, Lonza Inc US) növesztettük. A harmadik naptól (az inokulálás után) kezdődően minden második napon 15% háromszor koncentrált ExCell tápoldatot (37g/L; SAFC) adtunk a tenyészethez egy adagban.
Az 1. Táblázat mutatja be a tápoldatok kiegészítését a kísérletek során.
1. Táblázat: A „fed-batch” fermentáció során alkalmazott rátáplálási stratégia, A és B kísérleti futás során
Kísérlet Rátáplálási stratégia Alap tápoldat + rátáplálás
A Alap tápoldat + 1 aminosav; 15% (3x) ExCell tápoldat + 4 aminosav Alap tápoldat: PowerCHO-2 CD + 8mM Gin
Alap rátáplálás: 15% (37 g/L) 3x ExCell CD a 3,5,7,9 napokon
Kiegészítés: Pro, Cys, Vai, Phe a 3,5,7,9 napokon
B Alap tápoldat + 2 aminosav; 15% (3x) SF ExCell tápoldat + 6 aminosav Alap tápoldat: PowerCHO-2 CD + 8mM Gin + Tyr + Phe
Alap rátáplálás: 15% (37 g/L) 3x SF ExCell CD a 3,5,7,9 napokon
Kiegészítés: Pro, Cys, Val, Phe, Ser a 3,5,7,9 napokon; Tyr (3x cc.) csak az 5. napon
A tenyésztési hőmérsékletet 37°C-on tartottuk. A pH-t 7,05 és 7,15 közötti tartományban tartottuk 0,5 M-os Na2CC>3 vagy H3PO4 hozzáadásával. Az oldott oxigén (DO) beállított értéke 40% volt. A főbb metabolitokat minden nap mértük. A glükóz szintjét körülbelül 20 mM-os szinten tartottuk. A sejtkultúrát 9-10 napig tenyésztettük.
A glikozilációs mintázatot a fermentációs elegyből vett mintákból naponta analizáltuk a tenyésztés harmadik napját (inokulálás után) követően. A kvalitatív analízis céljára az antitestet affinitás kromatográfiával tisztítottuk a fermentációs elegyből protein A használatával. A sejtek életképességét, titert és ozmolalitást naponta meghatároztuk a tenyésztés harmadik napját (inokulálás után) követően.
A kapott antitest bioaktivitását komplement-függő cititoxicitás (CDC) méréssel határoztuk meg.
Miközben a metabolitokat monitoroztuk, biztosítottuk a szükséges tápanyag szintet, állandó pH, DO, keverési sebesség és hőmérséklet mellett, az ozmolalitás folyamatosan növekedett a tenyésztés során, a tenyésztés későbbi fázisaiban elérte a 650 mOsm/kg értéket, miközben az életképes sejt koncentráció folyamatosan csökkent.
A 2. táblázat a „fed-batch” kísérletekből származó minták számos eredménye alapján azt mutatja, hogy a növekvő ozmolalitás jelentősen gyengébb glikozilációs mintázatot eredményezett, ami arra utal, hogy a 400 mOsm/kg-nál magasabb ozmolalitás negatív hatással lehet a protein glikozilációjára. A só felhalmozódás következtében a nemgalaktozilált formák (G0F) mennyisége a tenyészetben megnövekedett, miközben a galaktozilált formák mennyisége csökkent. Hasonlóan az egyes antitest minták bioaktivitása a CDC mérés szerint a fermentációs elegy növekvő ozmolalitásával csökkent.
2. Táblázat: Az ozmolalitás fermentációs paraméter hatása a galaktoziláltságra
Végső Ozmolalitás [mOsm/kg] G0F [%] GIF [%1 Gl’F [%] G2F l%] CDC Rel. Pót.
Referencia* — 40-56 28-38 9-13 5-12 1,0
350 40,7 39,5 11,4 8,5 1,1
369 49,0 33,8 10,0 7,1 0,9
405 47,6 34,5 10,6 7,3 1,1
430 50,8 32,5 9,7 7,0 1,0
439 51,0 31,8 9,9 7,2 0,9
570 51,2 32,2 10,1 6,5 0,8
618 56,6 29,2 9,4 4,6 0,7
* 13 kereskedelmi forgalomban lévő antitest sarzs glikoziláltsági mintázatának átlagából és standard deviációjából számított értékek
Mivel a sejtkultúra magas ozmolalitása a háromszorosan koncentrált ExCell tápoldat sótartalmának is tulajdonítható, az eredeti ExCell tápoldat összetételét módosítottuk, így 66%-al kevesebb nátrium-foszfátot tartalmazott az eredeti tápoldathoz képest.
A „fed-batch” fermentációkból, A és B futások, származó antitest glikozilációs mintázata 10 napos (inokulálás után) tenyésztést követően a 3. táblázatban látható.
3. Táblázat: Az ozmolalitás fermentációs paraméter hatása a galaktoziláltságra
Kísérlet Ozmolalitás [mOsm/kg] G0F [%] GIF [%] Gl’F [%1 G2F [%] CDC Rel. Pót.
Referencia* 40-56 28-38 9-13 5-12 1,0
A 618 56,6 29,2 9,4 4,6 0,7
B 369 49,0 33,8 10,0 7,1 0,9
* 13 kereskedelmi forgalomban lévő antitest sarzs glikoziláltsági mintázatának átlagából és standard deviációjából számított értékek
A módosított, só-mentes ExCell tápoldatnak köszönhető 400 mOsm/kg alatti ozmolalitás, melyet a „fed-batch” fermentáció B futásában használtunk, pozitív hatással volt a glikozilációs mintázatra, például a nem-galaktozilált glikoformák mennyisége csökkent és a galaktozilált glikoformák, valamint a CDC aktivitás megnőtt a „fed-batch” fermentáció A futásához viszonyítva, melyet a nem módosított só tartalmú ExCell tápoldattal végeztünk.
2.2 Galaktoziláltság optimalizálása a tápoldat UMG-vel történő kiegészítésén keresztül, amelyet a tenyésztési pH változtatásával kombináltunk
A kapott antitest galaktoziláltsági mintázatát UMG betáplálás és kis mértékű pH változtatás után a pH változtatás alkalmazásának különböző időpontjaiban határoztuk meg. AMBR (Advanced Microscale Bioreactor) rendszert használtunk (TAP Biosystems, UK), mely egy nagy áteresztő képességű „down-scale” fermentációs platform, ami a „bench-top” bioreaktorok jellegzetességeit biztosítja kis térfogatban.
Módszerek
A modell antitest expresszálására a genetikailag módosított CHO sejteket 9 napig az alap PowerCHO-2 tápoldatban (Lonza Inc US) tenyésztettük. A tenyésztés harmadik napjától kezdődően (inokulálás után) minden második napon 15% (3x) SF ExCell rátápláló tápoldatot (37g/L; SAFC), melyet a B Kísérlet (2.1-es példa, 1. Táblázat, prolin kivételével) szerint kiegészítettünk, adtunk a tenyészethez egy adagban. UMG kiegészítést (3 mM uridin, 0,06 mM mangán(II)-klorid és 15 mM galaktóz) adtunk a tenyésztés 5. és a 7. napján (beoltás után) a módosított SF ExCell rátápláló tápoldattal együtt.
A tenyésztés pH-ját 7,15 értéken tartottuk 0,5 M-os Na2CC>3 vagy H3PO4 hozzáadásával a tenyésztés harmadik napjáig (inokulálás után). A pH változtatását 7,00-re különböző időpontokban hajtottuk végre az inokulálás utáni 65. és 78. óra között, 4,0-7,0 x 106 sejt/mL közötti élősejt koncentrációnál H3PO4 hozzáadásával.
Az előállított antitest galaktozilációs mintázatát kapilláris elektroforézissel határoztuk meg a Protein A-val tisztított (1.2. pont, tisztítás) proteinből.
A tenyésztési pH hatását a kapott antitest minták galaktozilációs mintázatára a 4. Táblázatban foglaljuk össze.
4. Táblázat: Antitest galaktoziláltság a tenyésztési pH függvényében
PH Kezdeti Ozmolalitás [mOsm/kg] Ozmolalitás szabályozás Galaktoziláltság [%]
3. napig 3. naptól G0F GIF Gl'F G2F
Referencia* 40-56 28-38 9-13 5-12
7,15 7,15 355 nem 52,0 31,0 10,8 6,3
7,15 7,00 355 nem 47,0 34,1 11,3 7,6
7,15 7,15 409 NaCl 57,7 27,9 9,8 4,7
7,15 7,00 409 NaCl 52,7 30,9 10,5 5,9
* 13 kereskedelmi forgalomban lévő antitest sarzs glikoziláltsági mintázatának átlagából és standard deviációjából számított értékek
A pH 7,15-röl pH 7-re történő enyhe változtatása a tenyésztés harmadik napján (inokulálás után) már befolyásolta az antitest glikozilációját a kontrolihoz képest, ahol a pH-t a tenyésztés során állandó 7,15 értéken tartottuk. A nem-galaktozilált glikoformák (G0F) aránya csökkenthető és a galaktozilált glikoformák (GIF, Gl’F és G2F) aránya megnövekedett a pH változtatást követően. A pH enyhe változtatásának ez a pozitív hatása az antitest galaktozilációjára még 400 mOsm/kg ozmolalitás felett is megfigyelhető. A megfelelő minták ozmolalitását NaCl kiegészítéssel szabályoztunk. Ennek ellenére a 400 mOsm/kg feletti ozmolalitás az antitest határozottan alacsonyabb galaktozilációját eredményezte.
Az 5. táblázat a kapott antitest minták GOF, GIF, Gl’F és G2F galaktozilált formáinak százalékos megoszlását mutatja a tenyésztés (inokulálás után) 8. illetve 9. napján, a pH változtatásának egyes időpontjai szerint lebontva.
5. Táblázat: Antitest galaktozilációs mintázata az UMG rátáplálás és pH változtatás kombinációját követően a pH változtatás különböző időpontjaiban
Glikoziláltság [%]
GOF GIF Gl’F G2F
8. nap 9. nap 8. nap 9. nap 8. nap 9. nap 8. nap 9. nap
kontroll pH 7,15 43,4 5 44,6 6 31,4 3 30,1 3 10,5 7 10,1 6 6,96 6,48
pH-változtatás (66 óra) 39,8 3 42,1 2 33,2 9 31,0 4 10,8 0 10,1 5 7,94 7,03
pH-változtatás (70 óra) 38,7 5 42,2 4 34,1 2 31,2 7 11,1 0 10,2 7 8,35 7,10
pH-változtatás (74 óra) 41,3 1 41,9 4 32,5 4 31,5 1 10,6 2 10,3 3 7,61 7,19
pH-változtatás (78 óra) 42,1 8 42,9 2 32,0 5 31,0 0 10,6 0 10,2 4 7,38 6,92
A galaktozilációs mintázat analízise a tenyésztés 8. napján a nem-galaktozilált glikoforma GOF százalékos mennyiségének csökkenését mutatja a kontroll mintához viszonyítva, ahol a fermentáció alatt a pH-t végig 7,15 értéken tartottuk. A pH változtatás és UMG rátáplálás kombinációja a galaktozilált glikoformák (GIF, Gl’F és G2F) százalékos mennyiségének növekedését eredményezte a termelt antitestben.
Ahogy azt a 6. táblázatban látni lehet az UMG rátáplálás önmagában pozitív hatással volt az antitest galaktozilációjára a tenyésztés 7. napján (inokulálás után) az UMG hozzáadás nélküli kontrolihoz viszonyítva. Azonban a kapott antitestben szignifikáns csökkenés a nem galaktozilált glikoforma százalékos mennyiségében és szignifikáns növekedés a galaktozilált glikoformák százalékos mennyiségében csak akkor lehetett elérni, ha a két hatást (enyhe pH változtatás + rátáplálás kiegészítés UMG-vel) kombináltuk.
6. Táblázat: A pH változtatás és az UMG táplálás kombinációjának hatása az antitest galaktoziláltságára
Elrendezés Eljárási idő [óra] G0F [%] GIF [%] Gl'F [%] G2F [%]
Referencia* 40-56 28-38 9-13 5-12
pH 7,15 w/o UMG 168,00 55,31 29,04 10,12 5,53
pH 7,15 +UMG 168,00 50,41 32,12 10,99 6,48
Változtatás: pH 7,15-ről pH 7,0 + UMG 168,00 47,41 33,95 11,31 7,34
* 13 kereskedelmi forgalomban lévő antitest sarzs glikoziláltsági mintázatának átlagából és standard deviációjából számított értékek
Mindent összevetve, a kapott antitest glikozilációs mintázatának analízise azt mutatta, hogy a kifejlesztett rátáplálási stratégia mely a következő kombinációból áll: a tenyésztés 5. és 7. napján (inokulálás után) UMG kiegészítésből és enyhe pH változtatásból pH 7,15-ről pH 7,0re, az antitest galaktozilációjának növekedését eredményezte.

Claims (14)

1. Eljárás emlős sejtekben termelt rekombináns antitest galaktóz tartalmának növelésére, mely eljárás tartalmazza a következőket:
a) legalább egy a rekombináns antitestet kódoló rekombináns nukleinsav molekulával transzformált emlős sejteket tenyésztünk sejttenyésztő tápoldatban 7,15 pH-η egy első időtartamon át, ahol a sejttenyésztő tápoldat nem tartalmaz galaktózt;
b) az adott emlős sejteket tenyésztjük az adott sejttenyésztő tápoldatban 7,00 pH-η egy második időtartamon át; és
c) rátáplálunk olyan elegyet, mely legalább két komponenst tartalmaz a következők közül:
(i) egy vagy több nukleozid, ahol az egyik nukleozid egy uridin;
(ii) egy vagy több átmenetifém só; és (iii) egy vagy több cukor, ahol az egyik cukor egy galaktóz;
a b) kultúrához, ahol a galaktóztartalom növelése azt jelenti, hogy a rekombináns antitestben a GIF, Gl’F és G2F izoformák össz-aránya legalább 10%-kal növekszik meg a GIF, Gl’F és G2F izoformák olyan össz-arányához viszonyítva ugyanebben a rekombináns antitestben, amit úgy kapunk, hogy a sejtkultúra pH-ját állandó értéken tartjuk és amelyhez a c) pont szerinti elegyet nem adjuk hozzá.
2. Eljárás emlős sejtekben termelt rekombináns antitest előállítására, mely eljárás tartalmazza a következőket:
a) legalább egy a rekombináns antitestet kódoló rekombináns nukleinsav molekulával transzformált emlős sejteket tenyésztünk sejttenyésztő tápoldatban 7,15 pH-η egy első időtartamon át, ahol a sejttenyésztő tápoldat nem tartalmaz galaktózt;
b) az adott emlős sejteket tenyésztjük az adott sejttenyésztö tápoldatban 7,00 pH-η egy második időtartamon át; és
c) rátáplálunk olyan elegyet, mely legalább két komponenst tartalmaz a következők közül: (i) egy vagy több nukleozid, ahol egyik nukleozid egy uridin;
(ii) egy vagy több átmenetifém só; és (iii) egy vagy több cukor, ahol az egyik cukor egy galaktóz;
a b) kultúrához;
UIIIIMIIHIII
SZTNH-100381602
2 31214©·
d) feldolgozzuk a rekombináns antitestet tartalmazó sejttenyésztő folyadékot; és e) kinyerjük a rekombináns antitestet.
3. Az 1 vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az emlős sejtek kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a rekombináns antitest Fc domént tartalmazó antitest.
5. A 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az uridin koncentrációja az elegyben 1-20 mM.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az átmeneti fém só mangán(II)-klorid és előnyösen a mangán(II)-klorid koncentrációja az elegyben 0,002-0,1 mM.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a cukor galaktóz és előnyösen a galaktóz koncentrációja az elegyben 5-100 mM.
8. Eljárás rituximab bioszimiláris antitest CHO sejtekben történő előállítására, mely eljárás tartalmazza a következőket:
a) az antitest könnyű és nehéz láncát kódoló egy vagy több rekombináns nukleinsav molekulával transzformált CHO sejteket tenyésztünk sejttenyésztő tápoldatban 7,15 pH-η egy első időtartamon át;
b) az adott CHO sejteket tenyésztjük az adott sejttenyésztő tápoldatban 7,00 pH-η egy második időtartamon át;
c) rátáplálunk olyan elegyet, mely a következő komponenseket tartalmazza:
(i) 1- 20 mM uridin;
(ii) 0,002 mM - 0,1 mM mangán(II)-klorid; és (iii) 5 mM -100 mM galaktóz;
a b) kultúrához.
d) feldolgozzuk a rituximabot tartalmazó sejttenyésztő folyadékot; és e) kinyerjük a rituximabot.
9. Eljárás CHO sejtek által termelt rituximab antitest bioszimilaritásának a referencia antitestéhez képest történő növelésére, mely eljárás tartalmazza a következő lépéseket:
a) a rituximab antitest könnyű és nehéz láncát kódoló egy vagy több rekombináns nukleinsav molekulával transzformált CHO sejteket tenyésztünk sejttenyésztő tápoldatban 7,15 pH-η egy első időtartamon át;
b) az adott CHO sejteket tenyésztjük az adott sejttenyésztő tápoldatban 7,00 pH-η egy második időtartamon át; és
c) rátáplálunk egy olyan elegyet, mely a következő komponenseket tartalmazza:
(i) uridin;
(ii) mangán(II)-klorid; és (iii) galaktóz;
a b) kultúrához.
10. Az 1 -9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a sejteket 7,15 pH-η addig tenyésztjük, míg az életképes sejt koncentráció 4,5 - 6,0 x 106 sejt/ml-t el nem éri és/vagy ahol a sejteket 7,00 pH-n 6-7 napig tenyésztjük.
11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a hőmérsékletet az (a), (b) és (c) lépések során állandó értéken tartjuk.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a (c) lépésben leírt rátáplálást legalább kétszer hajtjuk végre.
13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a (c) lépésben leírt rátáplálási lépést megelőzi egy olyan eleggyel történő rátáplálási lépés, amelyhez nem adtuk hozzá az (i) és (iii) komponenseket.
14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az (a), (b) és (c) tenyészet ozmolalitása alacsonyabb, mint 400 mOsm/kg.
HUP1500363A 2015-08-04 2015-08-04 Módszer rekombináns proteinek galaktóz tartalmának növelésére HU231463B1 (hu)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HUP1500363A HU231463B1 (hu) 2015-08-04 2015-08-04 Módszer rekombináns proteinek galaktóz tartalmának növelésére
CN201680058299.3A CN108350075B (zh) 2015-08-04 2016-08-04 提高重组蛋白的半乳糖含量的方法
CA2994611A CA2994611C (en) 2015-08-04 2016-08-04 Method for increasing the galactose content of recombinant proteins
KR1020187006240A KR102301702B1 (ko) 2015-08-04 2016-08-04 재조합 단백질의 갈락토오스 함량을 증가시키는 방법
EP16750431.5A EP3331911A1 (en) 2015-08-04 2016-08-04 Method for increasing the galactose content of recombinant proteins
JP2018505597A JP6971221B2 (ja) 2015-08-04 2016-08-04 組換えタンパク質のガラクトース含有量を増加させる方法
US15/749,978 US20180230228A1 (en) 2015-08-04 2016-08-04 Method for increasing the galactose content of recombinant proteins
PCT/EP2016/068651 WO2017021493A1 (en) 2015-08-04 2016-08-04 Method for increasing the galactose content of recombinant proteins
US17/749,499 US20220372157A1 (en) 2015-08-04 2022-05-20 Method for increasing the galactose content of recombinant proteins

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HUP1500363A HU231463B1 (hu) 2015-08-04 2015-08-04 Módszer rekombináns proteinek galaktóz tartalmának növelésére

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP1500363A2 HUP1500363A2 (en) 2017-02-28
HU231463B1 true HU231463B1 (hu) 2024-01-28

Family

ID=89658303

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUP1500363A HU231463B1 (hu) 2015-08-04 2015-08-04 Módszer rekombináns proteinek galaktóz tartalmának növelésére

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20180230228A1 (hu)
EP (1) EP3331911A1 (hu)
JP (1) JP6971221B2 (hu)
KR (1) KR102301702B1 (hu)
CN (1) CN108350075B (hu)
CA (1) CA2994611C (hu)
HU (1) HU231463B1 (hu)
WO (1) WO2017021493A1 (hu)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3107038A1 (en) * 2018-08-10 2020-02-13 Genentech, Inc. Cell culture strategies for modulating protein glycosylation
HU231514B1 (hu) * 2018-11-07 2024-07-28 Richter Gedeon Nyrt. Sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer
CN111321188B (zh) * 2018-12-17 2024-10-29 嘉和生物药业有限公司 一种抗体糖型改造的配方、细胞培养方法以及在工业化生产中的应用
WO2020201296A1 (en) * 2019-04-01 2020-10-08 The Automation Partnership (Cambridge) Ltd. Operation process for a cell cultivation system
BR112021024852A2 (pt) * 2019-06-10 2022-02-15 Takeda Pharmaceuticals Co Métodos de cultura de célula e composições para produção de anticorpo
WO2021066772A1 (en) * 2019-10-01 2021-04-08 Arven Ilac Sanayi Ve Ticaret Anonim Sirketi Cell culture medium for reducing fucosylation and basic variants in the production of antibodies
CN113403281B (zh) * 2020-03-16 2024-02-27 夏尔巴生物技术(苏州)有限公司 一种提高抗体半乳糖基化水平的细胞培养方法
KR20230045615A (ko) * 2020-08-14 2023-04-04 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 단백질을 제조하는 방법
WO2024201501A1 (en) * 2023-03-24 2024-10-03 Dr. Reddy’S Laboratories Limited A process to produce a pharmaceutical composition

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0610201T4 (da) 1991-03-18 2008-02-04 Centocor Inc Monoklonale og kimære antistoffer, der er specifikke for human tumornekrosefaktor
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
DE69721548T2 (de) 1996-02-09 2004-04-01 Abbott Laboratories(Bermuda)Ltd. HUMANE ANTIKÖRPER WELCHE AN HUMANEN TNFalpha BINDEN
EP1787999B1 (en) 1997-04-07 2010-08-04 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
ES2907826T3 (es) 2001-06-26 2022-04-26 Amgen Inc Anticuerpos para OPGL
AR059065A1 (es) * 2006-01-23 2008-03-12 Amgen Inc Metodos para modular el contenido de manosa de las proteinas recombinantes
KR20110060911A (ko) * 2008-09-26 2011-06-08 쉐링 코포레이션 고 역가 항체 생산
EP2563906B1 (en) * 2010-04-26 2017-11-08 Novartis AG Process for cultivation of cho cells
EP2511293A1 (en) 2011-04-13 2012-10-17 LEK Pharmaceuticals d.d. A method for controlling the main complex N-glycan structures and the acidic variants and variability in bioprocesses producing recombinant proteins
EP2702077A2 (en) * 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
WO2014170866A2 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process of obtaining glycoprotein composition with increased galactosylation content

Also Published As

Publication number Publication date
CA2994611A1 (en) 2017-02-09
HUP1500363A2 (en) 2017-02-28
CA2994611C (en) 2024-06-18
WO2017021493A1 (en) 2017-02-09
JP6971221B2 (ja) 2021-11-24
KR20180070553A (ko) 2018-06-26
KR102301702B1 (ko) 2021-09-15
CN108350075B (zh) 2022-03-25
EP3331911A1 (en) 2018-06-13
CN108350075A (zh) 2018-07-31
US20180230228A1 (en) 2018-08-16
US20220372157A1 (en) 2022-11-24
JP2018521676A (ja) 2018-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2994611C (en) Method for increasing the galactose content of recombinant proteins
US20190010532A1 (en) Overexpression of n-glycosylation pathway regulators to modulate glycosylation of recombinant proteins
US11299760B2 (en) Use of monensin to regulate glycosylation of recombinant proteins
US12043845B2 (en) Methods of cell culture
CN111954719A (zh) 细胞培养物中产生的抗体的总去岩藻糖基化糖型
AU2021258023B2 (en) Methods for modulating protein galactosylation profiles of recombinant proteins using peracetyl galactose
JP2024112833A (ja) 細胞培養で生産される組換え糖タンパク質のグリコシル化プロファイルを変更する方法
JP2022500371A (ja) 抗体依存性細胞介在性細胞傷害の調節方法
KR20230109674A (ko) Fab 고 만노스 당형
WO2016162514A1 (en) Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant proteins