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ES2254493T3 - Produccion heterologa de policetidos. - Google Patents

Produccion heterologa de policetidos.

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ES2254493T3
ES2254493T3 ES01973782T ES01973782T ES2254493T3 ES 2254493 T3 ES2254493 T3 ES 2254493T3 ES 01973782 T ES01973782 T ES 01973782T ES 01973782 T ES01973782 T ES 01973782T ES 2254493 T3 ES2254493 T3 ES 2254493T3
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ES
Spain
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epothilon
liter
production
pks
epothilones
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES01973782T
Other languages
English (en)
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Robert L. Arslanian
Gary Ashley
Scott Frykman
Bryan Julien
Leonard Katz
Chaitan Khosla
Janice Lau
Peter J. Licari
Rika Regentin
Daniel Santi
Li Tang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kosan Biosciences Inc
Original Assignee
Kosan Biosciences Inc
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Publication date
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Priority claimed from US09/825,856 external-priority patent/US6489314B1/en
Priority claimed from US09/825,876 external-priority patent/US6589968B2/en
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Abstract

Una célula huésped recombinante del suborden Cystobacterineae que contiene un vector de expresión recombinante que codifica un gen de la policétido sintasa (PKS) de epotilon y produce un policétido sintetizado por una enzima PKS codificada en dicho vector, donde dicha células es Myxococcus xanthus K111-40.1, depositada en la ATCC con el Número de Acceso de PTA-2712, Myxococcus

Description

Producción heteróloga de policétidos.
Campo de la invención
La presente invención proporciona métodos recombinantes y materiales para producir policétidos en células huésped recombinantes.
Antecedentes de la invención
Los policétidos constituyen una clase de compuestos estructuralmente diversos sintetizados, al menos en parte, a partir de compuestos de bloques de construcción de dos unidades carbonadas a través de una serie de condensaciones de tipo Claissen y posteriores modificaciones. Entre los policétidos se incluyen antibióticos tales como la tetraciclina y la eritromicina, agentes anticancerosos tales como los epotilones y la daunomicina, e inmunosupresores tales como FK506, FK520, y la rapamicina. Los policétidos se encuentran naturalmente en muchos tipos de organismos, incluyendo hongos y bacterias miceliales. Los policétidos son sintetizados in vivo por las enzimas policétido sintasas referidas comúnmente como enzimas PKS. Se conocen dos tipos principales de PKS que difieren en su estructura y en la manera en la cual sintetizan los policétidos. Estos dos tipos son referidos comúnmente como enzimas PKS de Tipo I o modular y de Tipo II o iterativo (aromático).
La presente invención proporciona métodos y vectores de expresión recombinantes y células huésped para la producción de enzimas PKS modulares e iterativas y los policétidos producidos por esas enzimas. Las enzimas PKS modulares son típicamente complejos multi-proteicos en los cuales cada proteína contiene múltiples sitios activos, cada uno de los cuales se utiliza solamente una vez durante el ensamblaje y la modificación de la cadena carbonada. Las enzimas PKS iterativas son típicamente complejos multi-proteicos en los cuales cada proteína contiene sólo uno o a lo sumo dos sitios activos, cada uno de los cuales se utiliza múltiples veces durante el ensamblaje y la modificación de la cadena carbonada. Como se describe con más detalle más abajo, han sido clonados un gran número de los genes de las enzimas PKS tanto modulares como aromáticas.
Los genes de las PKS modulares están compuestos por secuencias codificadoras organizadas para codificar un módulo de carga, numerosos módulos prolongadores, y un dominio de liberación. Como se describe más completamente más abajo, cada uno de estos dominios y módulos corresponde a un polipéptido con una o más funciones específicas. Generalmente, el módulo de carga es responsable de la unión del primer bloque de construcción utilizado para sintetizar el policétido y transferirlo al primer módulo prolongador. Los bloques de construcción utilizados para formar policétidos complejos son típicamente aciltioésteres, muy comúnmente acetil, propionil, malonil, metilmalonil, hidroximalonil, metoximalonil, y etilmalonil CoA. Entre otros bloques de construcción se incluyen aminoácidos y aciltioésteres similares a aminoácidos. Las PKS catalizan la biosíntesis de policétidos por medio de condensaciones de Claissen descarboxilantes repetidas entre los bloques de construcción de aciltioéster. Cada módulo es responsable de la unión de un bloque de construcción, realizando una o más funciones en ese bloque de construcción, y transfiriendo el compuesto resultante al siguiente módulo. El siguiente módulo, a su vez, es responsable de anclar el siguiente bloque de construcción y transferir el compuesto en crecimiento al siguiente módulo hasta que la síntesis se completa. En ese punto, el dominio de liberación, a menudo una actividad tioesterasa (TE) enzimática, escinde el policétido de la PKS.
El policétido conocido como 6-desoxieritronólido B (6-dEB) es sintetizado por una enzima PKS modular prototípica. Los genes, conocidos como eryAI, eryAII, y eryAIII, que codifican la proteína de múltiples subunidades conocida como desoxieritronólido B sintasa (DEBS) (cada subunidad es conocida como DEBS1, DEBS2, o DEBS3) que sintetiza 6-dEB se describen en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.672.491, 5.712.146 y 5.824.513.
El módulo de carga de la PKS DEBS consta de una aciltransferasa (AT) y una proteína portadora de acilo (ACP). La AT del módulo de carga de la DEBS reconoce la propionil CoA (otro módulo de carga AT puede reconocer otros acil-CoA, tales como acetil, malonil, metilmalonil, o butiril CoA) y lo transfiere en forma de tioéster a la ACP del módulo de carga. Concurrentemente, la AT de cada uno de los seis módulos prolongadores de la DEBS reconoce un metilmalonil CoA (otro módulo prolongador ATs puede reconocer otros CoA, tales como malonil o malonil alfa-sustituido CoA, es decir, malonil, etilmalonil, y 2-hidroximalonil CoA) y lo transfiere a la ACP de ese módulo para formar un tioéster. Una vez que la DEBS es cebada con propionil- y metilmalonil-ACP, el grupo acilo del módulo de carga migra para formar un tioéster (trans-esterificación) en la KS del primer módulo prolongador; en esta fase, el módulo uno posee una acil-KS adyacente a una metilmalonil ACP. El grupo acilo derivado del módulo de carga de la DEBS es anclado después covalentemente al carbono alfa del grupo prolongador para formar un enlace carbono-carbono, conducido por una descarboxilación concomitante, y generando una nueva acil-ACP que tiene un esqueleto dos carbono más largo que la unidad de carga (elongación o prolongación). La cadena del policétido en crecimiento es transferida de la ACP a la KS del siguiente módulo de la DEBS, y el procedimiento continúa.
La cadena del policétido, que crece en dos carbonos para cada módulo de la DEBS, se hace pasar sucesivamente como un tioéster unido covalentemente de módulo a módulo, en un procedimiento de ensamblaje en cadena. La cadena carbonada producida mediante este procedimiento solo poseería una cetona en cada átomo de carbono diferente, produciendo una policetona, de la cual deriva el nombre policétido. Comúnmente, sin embargo, las actividades enzimáticas adicionales modifican el grupo ceto beta de la cadena del policétido a la cual se ha añadido la unidad de dos carbonos antes de que la cadena sea transferida al siguiente módulo. Así, además del módulo mínimo que contiene KS, AT, y ACP necesarios para formar el enlace carbono-carbono, los módulos pueden contener una ceto-reductasa (KR) que reduzca el grupo beta-ceto a un alcohol. Los módulos también pueden contener una KR más una deshidratasa (DH) que deshidrate el alcohol a un doble enlace. Los módulos también pueden contener una KR, una DH, y una enoil-reductasa (ER) que convierta el doble enlace en un enlace sencillo saturado utilizando el carbono beta como función metileno. Entre los módulos de la DEBS se incluyen aquellos con un solo dominio KR, un solo un dominio KR inactivo, y con los tres dominios KR, DH, y ER.
Una vez que la cadena de policétido atraviesa el módulo final de una PKS, encuentra el dominio de liberación, típicamente una tioesterasa, encontrada en el extremo carboxilo de la mayor parte de las enzimas PKS modulares. Aquí, el policétido es escindido de la enzima y, para muchos pero no para todos los policétidos, ciclado. El policétido puede ser modificado adicionalmente mediante ajuste o modificación de las enzimas; estas enzimas añaden grupos carbohidrato o grupos metilo, o realizan otras modificaciones, es decir, oxidación o reducción, en la molécula núcleo del policétido y/o los sustituyentes del mismo. Por ejemplo, 6-dEB es hidroxilada y glicosilada (glicosidada), y uno de los sustituyentes glicosilo es metilado para rendir el antibiótico bien conocido eritromicina A en las células de Saccharopoyspora erythraea en las cuales es producido naturalmente.
Si bien la descripción anterior se aplica generalmente a enzimas PKS modulares y específicamente a DEBS, hay numerosas variaciones que existen en la naturaleza. Por ejemplo, muchas enzimas PKS comprenden módulos de carga que, a diferencia del módulo de carga de la DEBS, comprenden un dominio KS "inactivo" que funciona como descarboxilasa. Esta KS inactiva es denominada en la mayoría de los casos KS^{Q}, donde el superíndice es la abreviatura de una sola letra para el aminoácido (glutamina) que está presente en lugar de la cisteína del sitio activo requerida para la actividad cetosintasa. El módulo de carga de la PKS del epotilon contiene un dominio KS^{Y} en el cual está presenta la tirosina en lugar de la cisteína del sitio activo. Por otra parte, la síntesis de otros policétidos empieza con unidades de arranque que son diferentes de las unidas por los módulos de carga de la DEBS o el epotilon. Entre las enzimas que se unen a semejantes unidades de arranque se pueden incluir, por ejemplo, una AMP ligasa tal como la empleada en la biosíntesis de FK520, FK506, y rapamicina, una péptido sintasa no ribosómica (NRPS) tal como la empleada en la biosíntesis de leinamicina, o una CoA ligasa soluble.
Otras variaciones importantes en la enzima PKS hacen referencia a los tipos de bloques de construcción incorporados como unidades prolongadoras. En cuanto a las unidades de arranque, algunas enzimas PKS incorporan bloques de construcción de aciltioéster similares a aminoácidos utilizando uno o más módulos NRPS como módulos de prolongación. La PKS del epotilon, por ejemplo, contiene un módulo NRPS. Otra de tales variaciones se encuentra en las enzimas PKS de FK506, FK520, y rapamicina, que contienen un NRPS que incorpora un resto pipecolato y también sirve como dominio de liberación de la PKS. Otra variación más hace referencia actividades adicionales en el módulo prolongador. Por ejemplo, un módulo de la PKS del epotilon contiene un dominio metiltranferasa (MT), que incorpora un grupo metilo al policétido.
Los métodos recombinantes para manipular los genes de PKS modulares e iterativos se describen en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.962.290; 5.672.491; 5.712.146; 5.830.750 y 5.843.718; y en las publicaciones de patentes PCT Núms. 98/49315 y 97/02358. En estas y otras patentes se describen vectores de expresión recombinantes para la producción heteróloga de policétidos así como genes de PKS recombinantes ensamblados para combinar partes de dos o más genes de PKS diferentes o agrupaciones de genes que producen policétidos novedosos. Hasta la fecha, tales métodos han sido utilizados para producir policétidos conocidos o novedosos en organismos tales como Streptomyces, que producen naturalmente policétidos, y E. coli y levadura, que no producen naturalmente policétidos (ver la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.033.883, incorporada aquí como referencia). En los últimos huéspedes, la producción de policétidos depende de la expresión heteróloga de una fosfopanteteinil transferasa, que activa los dominios de la ACP de la PKS (ver la Publicación PCT Núm. 97/13845).
Si bien tales métodos son valiosos y muy útiles, ciertos policétidos son expresados solamente a niveles muy bajos, o son tóxicos, para la célula huésped heteróloga empleada. Como ejemplo, los agentes anticancerosos epotilones A, B, C, y D fueron producidos en Streptomyces mediante la expresión heteróloga en los genes de la PKS de los epotilones (Tang y col., 28 de Enero, 2000, Cloning and heterologous expression of the epothilone gene cluster, Science, 287:640-642, y Pub. PCT Núm. 00/031247. Los epotilones A y B fueron producidos a menos de aproximadamente 50 a 100 \mug/litro y parecían tener efectos deletéreos sobre las células productoras.
Los epotilones A y B fueron identificados primero como una actividad antifúngica extraída de la mixobacteria Sorangium cellulosum (ver Gerth y col., 1996, J. Antibiotics 49:560-563 y patente Alemana Núm. DE 41 38 042), y más tarde se encontró que tenían actividad en un análisis de polimerización de tubulina (ver Bollag y col., 1995, Cancer Res. 55:2325-2333). Los epotilones A y B y ciertos derivados naturales y sintéticos han sido estudiados extensamente desde entonces como potenciales agentes antitumorales para el tratamiento del cáncer. Las estructuras químicas de los epotilones producidos por Sorangium cellulosum cepa So ce 90 fueron descritas en Hofle y col., 1996, Epothilone A and B - novel 16-membered macrolides with cytotoxic activity: isolation, crystal structure, and conformation in solution, Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 35(13/14): 1567-1569. Los epotilones A (R=H) y B (R=CH_{3}) tienen la estructura mostrada más abajo y muestran una amplia actividad citotóxica frente a células eucariotas y una notable actividad y selectividad frente a líneas celulares tumorales de mama y colon.
1
Las contrapartes didesoxi de los epotilones A y B, también conocidas como epotilones C (R=H) y D (R=CH_{3}), han sido sintetizadas químicamente de novo pero también están presentes como productos minoritarios en fermentaciones de S. cellulosum. Los epotilones C y D son menos citotóxicos que los epotilones A y B; sus estructuras se muestran más abajo.
2
Se han descrito otros epotilones de origen natural. Entre estos se incluyen los epotilones E y F, en los cuales la cadena lateral metilada del radical tiazol de los epotilones A y B ha sido hidrolizada para rendir los epotilones E y F, respectivamente, así como muchos otros compuestos epotilónicos (ver Pub. PCT Núm. 99/65913).
Debido al potencial de uso de los epotilones como agentes anticancerosos, y debido a los bajos niveles de epotilon producidos por la cepa So ce 90 natural, numerosos equipos de investigación acometieron el esfuerzo de sintetizar los epotilones. Como se ha observado antes, este esfuerzo ha tenido éxito (ver Balog y col., 1996, Total synthesis of (-)-epothilone A, Angew Chem. Int. Ed. Engl. 35(23/24);2801-2803; Su y col., 1997, Total synthesis of (-)-epothilone B: an extension of the Suzuki coupling method and insights into structure-activity relationships of the epothilones, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36(7):757-759; Meng y col., 1997, Total syntheses of epothilones A and B, JACS 119(42):10073-10092; y Balog y col., 1998, A novel aldol condensation with 2-metil-4-pentenal and its application to an improved total synthesis of epothilone B, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 37(19):2675-2678). A pesar del éxito de estos esfuerzos, la síntesis química de los epotilones es tediosa, consume tiempo, y es costosa. En efecto, los métodos han sido caracterizados como poco prácticos para el desarrollo farmacéutico a gran escala de cualquier epotilon como agente anticanceroso.
Numerosos derivados de epotilon, así como los epotilones A - D, han sido estudiados in vitro e in vivo (ver Su y col., 1997, Structure-activity relationships of the epothilones and the first in vivo comparison with paclitaxel, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36(19):2093-2096; y Chou y col., Agosto de 1998, Desoxyepothilone B: an efficacious microtubule-targeted antitumor agent with a promising in vitro profile relative to epothilone B, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 9642-9647). Se describen derivados de epotilon adicionales y métodos para sintetizar epotilones y derivados de epotilon en las Pubs. PCT Núms. 00/23452, 00/00485, 99/67253, 99/67252, 99/65913, 99/54330, 99/54319, 99/54318, 99/43653, 99/43320, 99/42602, 99/40047, 99/27890, 99/07692, 99/02514, 99/01124, 98/25929, 98/22461, 98/08849, y 97/19086; en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.969.145; y en la publicación de la patente Alemana Núm. DE 41 38 042. En WO 00/22139 se describe una agrupación de ADN biosintético de la policétido sintasa (PKS) de Sorangium cellulosum clonado.
Sigue existiendo la necesidad de medios económicos para producir no solo los epotilones de origen natural o los precursores de los mismos, así como nuevos derivados de epotilon con propiedades mejoradas. Sigue existiendo la necesidad de una célula huésped que produzca epotilones o derivados de epotilon que sean más fáciles de manipular y fermentar que el productor natural Sorangium cellulosum y que produzca más policétido producto deseado. La presente invención satisface estas necesidades proporcionando células huésped que producen policétidos a elevados niveles y son útiles en la producción no sólo de los epotilones, incluyendo nuevos derivados de epotilon descritos antes, sino también de otros policétidos.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona células huésped recombinantes del suborden de las Cystobacterineae que contienen vectores de expresión que codifican genes de PKS heterólogos y producen policétidos sintetizados por las enzimas PKS codificadas por los genes de estos vectores.
En un aspecto de la presente invención, se proporciona una célula huésped recombinante del suborden Cystobacterineae que contiene un vector de expresión recombinante que codifica un gen de la policétido sintasa de epotilon (PKS) y produce un policétido sintetizado por una enzima PKS codificada en dicho vector, donde dicha célula es Myxococcus xanthus K111-40.1 (número de acceso ATCC PTA-2712), Myxococcus xanthus K111-72.4.4 (núm. de acceso ATCC PTA-2713) o Mixococcus xanthus cepa K90-132.1.1.2 (núm. de acceso ATCC PTA-2715).
Los autores de la presente invención también describen una célula huésped recombinante del suborden Cystobacterineae que contiene un vector de expresión recombinante que codifica un gen de la policétido sintasa de epotilon (PKS) heterólogo y produce un policétido sintetizado por una enzima PKS codificada en dicho vector y adicionalmente comprende un gen heterólogo que codifica MtA, MatB o MatC.
Asimismo los autores de la presente invención describen vectores de ADN recombinante susceptibles de integración cromosómica o replicación extracromosómica en las células huésped de la invención. Estos vectores pueden comprender al menos una porción o una secuencia codificadora de PKS y son capaces de dirigir la expresión de una enzima PKS funcional en las células huésped de la invención. En una realización relacionada, los autores de la presente invención también describen vectores y células huésped que comprenden los genes y productos génicos requeridos para producir un sustrato para la biosíntesis de policétidos que o bien no es producido o bien es producido poco abundantemente en una célula huésped de la invención. En una realización, los genes y productos génicos catalizan la síntesis de etilmalonil CoA. En otra realización, los genes y productos génicos catalizan la síntesis de butiril
CoA.
Asimismo los autores de la presente invención describen un método para producir un policétido en una célula huésped del suborden Cystobacterineae, cuyo policétido no es producido naturalmente en dicha célula huésped, comprendiendo dicho método cultivar la célula huésped transformada con un vector de ADN recombinante de la invención en condiciones tales que se exprese un gen de PKS codificado en el vector y se produzca un policétido. Las células huésped de la invención pueden ser fermentadas para producir policétidos con un elevado rendimiento.
En una realización preferida, la célula huésped recombinante de la invención produce un epotilon o un derivado de epotilon. Así, la presente invención proporciona células huésped recombinantes que producen un epotilon o derivado de epotilon deseado. En una realización preferida, la célula huésped produce uno o más epotilones a 10 mg/litro o más. En una realización, la invención proporciona células huésped que producen uno o más epotilones a niveles superiores a los niveles producidos en un organismo de origen natural que produzca epotilones. En otra realización, la invención proporciona células huésped que producen mezclas de epotilones que son menos complejas que las mezclas producidas por una célula huésped de origen natural que produce epotilones. Las células huésped recombinantes de la invención también incluyen células huésped que producen sólo un epotilon o un derivado de epotilon deseado como producto principal.
Los autores de la presente invención describen vectores de expresión de ADN recombinante que codifican todo o una porción de la PKS del epotilon. Así, la presente invención proporciona vectores de expresión de ADN recombinante que codifican las proteínas requeridas para producir los epotilones A, B, C, y D en las células huésped de la invención. La presente invención también proporciona vectores de expresión de ADN recombinante que codifican porciones de estas proteínas. También se describen compuestos de ADN recombinante que codifican una proteína híbrida, cuya proteína híbrida incluye toda o una porción de una proteína implicada en la biosíntesis del epotilon y toda o una porción de una proteína implicada en la biosíntesis de otro policétido o péptido derivado no
liposomal.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra varios compuestos precursores para los derivados tioéster de N-acetil cisteamina que pueden ser suministrados a una PKS de un epotilon de la invención en la cual el módulo de tipo NRPS uno o el dominio KS del módulo dos ha sido inactivado para producir un derivado de epotilon novedoso. Asimismo se muestra un procedimiento sintético general para elaborar semejantes compuestos.
La Figura 2 muestra los mapas del sitio de restricción y la función de los plásmidos pKOS35-82.1 y pKOS35-82.2.
La Figura 3 muestra los mapas del sitio de restricción y la función de los plásmidos pKOS35-154 y pKOS90-22.
La Figura 4 muestra un esquema del protocolo para introducir los genes de la PKS del epotilon y de la enzima de modificación en el cromosoma de una célula huésped de Myxococcus xanthus como se describe en el Ejemplo 2.
La Figura 5 muestra un mapa de pBeloBACII como se describe en el Ejemplo 2.
La Figura 6 muestra el funcionamiento en la línea base de Myxococcus xanthus cepa K111-40-1 en un medio de producción simple que consta sólo de 5 g/litro de casitona (un producto digerido de caseína pancreática) y 2 g/litro de sulfato de magnesio. Leyenda: perfiles de crecimiento (\medbullet), producción (\blacksquare), y generación de amoníaco (\ding{115}) para el medio CTS basal en un procedimiento por lotes; las condiciones de cultivo fueron las descritas en Materiales y Métodos del Ejemplo 3.
La Figura 7 muestra el efecto de la resina XAD-16 sobre el funcionamiento de la fermentación de Myxococcus xanthus cepa K111-40-1 en el medio de producción CTS. Leyenda: perfiles de crecimiento (\medbullet), producción (\blacksquare) con la incorporación de 20 g/litro de resina XAD-16 al medio de producción CTS en un procedimiento por lotes.
La Figura 8 muestra la influencia de la casitona sobre el crecimiento y el rendimiento de producto. Leyenda: Efecto de la concentración de casitona sobre el crecimiento (\medbullet), la producción (\blacksquare), y la productividad específica (\ding{115}).
La Figura 9 muestra la influencia de los elementos vestigiales y las concentraciones de oleato de metilo superiores sobre el crecimiento y el rendimiento de producto. Leyenda: Efecto del oleato de metilo (\medbullet) y los elementos vestigiales (\blacksquare) sobre la producción.
La Figura 10A muestra el crecimiento y la producción de la cepa de M. xanthus en presencia de concentraciones óptimas de oleato de metilo y elementos vestigiales en un procedimiento de fermentación por lotes. El crecimiento exponencial ocurría durante los dos primeros días después de la inoculación. La producción de epotilon D empezaba al comienzo de la fase estacionaria y cesaba cuando se producía la lisis celular con el agotamiento de oleato de metilo el día 5. La Figura 10B muestra el transcurso de tiempo correspondiente al consumo de oleato de metilo y la generación de amoníaco durante el crecimiento y la producción de la cepa de M. xanthus en presencia de concentraciones óptimas de oleato de metilo y elementos vestigiales en un procedimiento de fermentación por lotes. Leyenda: A) Perfiles de crecimiento (\medbullet) y producción (\blacksquare) con la adición de concentraciones óptimas de oleato de metilo (7 ml/litro) y elementos vestigiales (4 ml/litro) al medio de producción de CTS en un procedimiento por lotes. B) Transcurso del tiempo correspondiente al consumo de oleato de etilo (\medbullet) y la generación de amoníaco (\blacksquare).
La Figura 11A muestra la influencia del procedimiento por lotes de alimentación intermitente sobre el crecimiento y la producción de la cepa de M. xanthus. Leyenda: Perfiles de crecimiento (\medbullet) y producción (\blacksquare) para el procedimiento por lotes de alimentación intermitente en matraces con sacudimiento. Las velocidades de alimentación de casitona y oleato de metilo eran de 2 g/litro/día y 3 ml/litro/día, respectivamente. La Figura 11B muestra las velocidades constantes de consumo de oleato de metilo y generación de amoníaco durante el transcurso de la fermentación. Leyenda: Transcurso de tiempo correspondiente a la adición total de oleato de metilo a los cultivos (\medbullet), al consumo total de oleato de metilo (\blacksquare), y a la generación de amoníaco (\ding{115}).
La Figura 12 muestra el perfil de producción para el procedimiento por lotes de alimentación intermitente en un biorreactor de 5 litros. Las velocidades de alimentación de casitona y oleato de metilo eran de 2 g/litro/día y 3 ml/litro/día, respectivamente.
La Figura 13A muestra el impacto de alimentaciones continuas sobre el crecimiento y la producción. Leyenda: Perfiles de crecimiento (\medbullet) y producción (\blacksquare) para el procedimiento por lotes de alimentación continua en un biorreactor de 5 litros. Las velocidades de alimentación de casitona y oleato de metilo fueron de 2 g/litro/día y 3 ml/litro/día, respectivamente. La Figura 13B muestra el transcurso del tiempo de la adición y el consumo de oleato de etilo así como la generación de amoníaco durante el procedimiento por lotes de alimentación continua. Leyenda: Transcurso de tiempo correspondiente a la adición total de oleato de metilo a los cultivos (\medbullet), consumo total de oleato de metilo (\blacksquare), y generación de amoníaco (\ding{115}); las condiciones de cultivo fueron las descritas en Materiales y Métodos.
Descripción detallada de la invención
Las afirmaciones referentes al alcance de la presente invención y las definiciones de los términos utilizados aquí se enumeran más abajo. Las definiciones se aplican a los términos utilizados en toda esta memoria, a menos que se limite de otro modo en casos específicos, ya sea individualmente o como parte de un grupo más grande.
El término "aislado" según se utiliza aquí para hacer referencia a un compuesto de la presente invención, representa alterado ``por la intervención humana de su estado natural. Por ejemplo, si el compuesto se encuentra en la naturaleza, éste ha sido cambiado o separado de su entorno original, o ambos. En otras palabras, un compuesto presente naturalmente en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo compuesto separado de las sustancias coexistente de su estado natural está "aislado", según se emplea el término aquí. El término "aislado" también puede representar un compuesto que es una preparación que está sustancialmente libre de sustancias contaminantes o no deseadas. Con respecto a los compuestos encontrados en la naturaleza, sustancialmente libres de las sustancias con las cuales el compuesto o la composición están asociados en su estado natural.
El término "purificado" referido a un compuesto significa que el compuesto está en una preparación en la cual el compuesto forma un componente principal de la preparación, de manera que constituye aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95% o más en peso de los componentes de la preparación.
Aquí se describen métodos recombinantes y materiales para producir policétidos en células huésped recombinantes; células huésped recombinantes que producen policétidos; policétidos novedosos afines en estructura a los epotilones; métodos para purificar epotilones; y formas cristalinas de epotilon D.
En una realización, la presente invención proporciona células huésped recombinantes del suborden Cystobacterineae que contienen vectores de expresión recombinantes que codifican los genes de la PKS heteróloga y producen policétidos sintetizados por las enzimas PKS codificadas en esos vectores. Según se utiliza aquí, el término recombinante hace referencia a una célula, compuesto, o composición producido mediante la intervención humana, típicamente mediante manipulación específica y dirigida de un gen o una porción del mismo. El suborden Cystobacterineae es uno de los dos (el otro es Sorangineae, que incluye el productor de epotilon Sorangium Cellulosum) del orden Myxococcales. El suborden Cystobacterineae incluye la familia Myxococcaceae y la familia Cystobacteraceae. La familia Myxococcaceae incluye el género Angiococcus (es decir, A. disciformis), el género Myxococcus, y el género Corallococcus (es decir, C. macrosporus, C. corralloides, y C. exiguus). La familia Cystobacteraceae incluye el género Cystobacter (es decir, C. fuscus, C. ferrugineus, C. minor, C. velatus, y C. violaceous), el género Melittangium (es decir, M. boletus y M. lichenicola), el género Stigmatella (es decir, S. erecta y S. aurantiaca), y el género Archangium (es decir, A. gephyra). Las células huésped especialmente preferidas de la invención son aquellas que producen un policétido de 10 a 20 mg/litro, o más, más preferiblemente de 100 a 200 mg/litro o más, y muy preferiblemente de 1 a 2 g/litro o más.
Aquí se describen células huésped del género Myxococcus o el género Stigmatella, tales como las células huésped seleccionadas del grupo formado por M. stipitatus, M. fulvus, M. xanthus, M. virescens, S. erecta, y S. aurantiaca. Las células huésped de Myxococcus especialmente preferidas de la invención son aquellas que producen de 10 a 20 mg/litro de policétido o más, más preferiblemente de 100 a 200 mg/litro o más, y muy preferiblemente de 1 a 2 g/litro o más. Son especialmente preferidas las células huésped de M. xanthus que producen a estos niveles. Entre las células huésped de M. xanthus descritas aquí se incluyen la línea celular DZ1 (Campos y col., 1978, J. Mol. Biol. 119:167-178), la línea celular productora de TA ATCC 31046, la línea celular DK1219 (Hodgkin y Kaiser, 1979, Mol. Gen. Genet. 171:177-191, y la línea celular DK1622 (Kaiser, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5952-5956. Las células huésped de la invención son las células de M. xanthus de las cepas K111-40.1, K111-72.4.4 y K90-132.1.1.2.
Las células huésped de la invención comprenden un vector de expresión de ADN recombinante. Los vectores de ADN recombinante pueden ser susceptibles de integración cromosómica o de replicación extracromosómica en estas células huésped. Tales vectores pueden comprender al menos una porción de una secuencia codificadora de PKS y pueden ser capaces de dirigir la expresión de una enzima PKS funcional en las células huésped de la invención. Según se utiliza aquí, el término vector de expresión hace referencia a cualquier ácido nucleico que pueda ser introducido en una célula huésped. Un vector de expresión puede ser mantenido establemente o transitoriamente en una célula, ya sea como parte del ADN cromosómico u otro ADN en la célula ya sea en cualquier compartimento celular, tal como un replicante en el citoplasma. Un vector de expresión también comprende un gen que sirve para dirigir la síntesis del ARN que es traducido a un polipéptido en la célula o extracto celular. Así, el vector o bien incluye un promotor para intensificar la expresión génica o bien es integrado en un sitio en el cromosoma de manera que se obtenga la expresión génica. Además, los vectores de expresión contienen típicamente elementos funcionales adicionales, tales como genes que confieren resistencia para actuar como marcadores seleccionables y genes reguladores para intensificar la actividad del promotor.
Los vectores de expresión pueden ser utilizados en la preparación de vectores de expresión de Myxococcus xanthus recombinante y de las células huésped de la invención. Estos vectores, denominados plásmidos pKOS35-82.1 y pKOS35-82.2 (Figura 2), son capaces de replicar en células huésped de E. coli así como integrarse en el ADN cromosómico de M. xanthus. Los vectores comprende los genes de anclaje e integración Mx8 así como el promotor pilA con los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción colocados convenientemente aguas abajo. Los dos vectores difieren entre sí meramente en la orientación del promotor pilA en el vector y pueden ser fácilmente modificados para incluir los genes de la PKS del epotilon y de la enzima de modificación u otros genes de PKS y enzimas de modificación. La construcción de los vectores se describe en el Ejemplo 1.
Las células huésped de la invención pueden ser utilizadas no solamente para producir un policétido encontrado en la naturaleza sino también para producir policétidos producidos por los genes de PKS recombinante y las enzimas de modificación. Se pueden utilizar vectores de expresión de ADN recombinante que comprendan una PKS híbrida. Para los fines de la presente invención una PKS híbrida es una PKS recombinante que comprende todas o parte de uno o más módulos prolongadores, módulo de carga, y dominio tioesterasa/ciclasa de una primera PKS y todas o parte de uno o más módulos prolongadores, módulo de carga, y dominio tioesterasa/ciclasa de una segunda PKS.
Los expertos en la técnica reconocerán que todo o parte de la primera o la segunda PKS en una PKS híbrida no necesita estar aislada de una fuente de origen natural. Por ejemplo, sólo una pequeña porción de un dominio AT determina su especificidad. Ver Pub. PCT Núm. 00/001838. El estado de la técnica en la síntesis de ADN permite al artesano construir compuestos de ADN de novo de tamaño suficiente para construir una porción útil de un módulo o dominio de PKS. Para los fines de la presente invención, se cree que semejantes compuestos de ADN sintético son una porción de PKS.
Existe una amplia variedad de genes de PKS que sirven como fuentes fácilmente asequibles de ADN e información para la secuencia para su uso en la construcción de compuestos de ADN codificadores de PKS híbridas. Los métodos para construir compuestos de ADN que codifican PKS híbridas se describen en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.022.731; 5.962.290; 5.672,491; y 5.712.146 y en las Publicaciones PCT Núms. 98/49315; 99/61599; y 00/047724. Los compuestos de ADN que codifican las PKS híbridas pueden ser híbridos de más de dos genes de PKS. Incluso cuando sólo se utilizan dos genes, a menudo hay dos o más módulos en el gen híbrido en los cuales todo o parte del módulo deriva de un segundo gen de PKS. Los expertos en la técnica apreciarán que una PKS híbrida incluye, pero no está limitada a, una PKS de cualquiera de los siguientes tipos: (i) una PKS que contiene un módulo en el cual al menos uno de los dominios es de un módulo heterólogo; (ii) una PKS que contiene un módulo de una PKS heteróloga; (iii) una PKS que contiene una proteína de una PKS heteróloga; y (iv) combinaciones de las
anteriores.
Las enzimas PKS híbridas se construyen a menudo remplazando las secuencias codificadoras de uno o más dominios de un módulo de una primera PKS por las secuencias codificadoras de uno o más dominios de un módulo de una segunda PKS para construir una secuencia codificadora recombinante. Generalmente, aquí cualquier referencia para insertar o remplazar un dominio KR, DH, y/o ER incluye la reposición de los dominios KR, DH, o ER asociados en ese módulo, típicamente por los correspondientes dominios del módulo del cual se obtiene el dominio insertado o de reposición. Si se desea o resulta beneficioso, también se puede remplazar la KS y/o la ACP de cualquier módulo, por otra KS y/o ACP. Por ejemplo, si la producción de un compuesto derivado de epotilon es baja debido a una alteración de un módulo, se puede mejorar la producción alterando los dominios KS y/o ACP de la molécula subsiguiente. En cada una de estas reposiciones o inserciones, la secuencia codificadora de KS, AT, DH, KR, ER, o ACP heteróloga se puede originar a partir de una secuencia codificadora de otro módulo de la misma o diferente PKS o a partir de la síntesis química para obtener la secuencia codificadora de PKS híbrida.
Si bien se pueden utilizar genes de PKS híbridos, también se pueden utilizar genes de PKS recombinantes en los cuales no haya una secuencia de un segundo gen de PKS sino que difieran de un gen de PKS de origen natural en una o más mutaciones y/o deleciones. Las deleciones pueden abarcar uno o más módulos o dominios y/o pueden estar limitadas a una deleción en uno o más módulos o dominios. Cuando una deleción abarca un módulo prolongador completo (distinto de un módulo NRPS), el derivado policétido resultante es al menos dos carbonos más corto que el compuesto producido a partir de la PKS de la cual derivaba la versión suprimida. La deleción también puede abarcar un módulo NRPS y/o un módulo de carga. Cuando una deleción está dentro de un módulo, la deleción puede abarcar sólo un único dominio, típicamente un dominio KR, DH, o ER, o más de un dominio, de manera que ambos dominios DH y ER, o ambos dominios KR y DH, o los tres dominios KR, DH, y ER. También puede ser "suprimido" un dominio de PKS funcionalmente mediante mutación, por ejemplo mediante mutagénesis al azar o de sitio específico. Así, como se ejemplifica aquí, un dominio KR puede ser transformado en no funcional o menos de totalmente funcional mediante mutación. Por otra parte, la especificidad de un dominio AT también puede ser alterada por una mutación, por ejemplo mediante mutagénesis al azar o de sitio específico.
En una realización preferida e ilustrativa, la célula huésped recombinante de la invención produce un epotilon o derivado de epotilon. Los epotilones de origen natural (incluyendo el epotilon A, B, C, D, E, y F) y los compuestos de origen no natural estructuralmente relacionados con ellos (derivados o análogos de epotilon) son potentes agentes citotóxicos específicos para las células eucarióticas. Estos compuestos tienen una aplicación como antifúngicos, agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, e inmunosupresores, y generalmente para el tratamiento de la inflamación o cualquier enfermedad hiperproliferativa, tal como la psoriasis, la esclerosis múltiple, la aterosclerosis, y el bloqueo de stents. Los epotilones son producidos a niveles muy bajos en las células de Sorangium cellulosum de origen natural en las cuales han sido identificados. Por otra parte, S. cellulosum tiene un crecimiento muy lento, y la fermentación de las cepas de S. cellulosum es difícil y lleva mucho tiempo. Un importante beneficio conferido por la presente invención es la simple capacidad de producir un epotilon o derivado de epotilon en una célula huésped diferente de S. cellulosum. Otra ventaja de la presente invención es la capacidad para producir los epotilones a niveles superiores y en mayores cantidades en las células huésped recombinantes proporcionadas por la invención de lo que es posible en las células productoras de epotilon de origen natural. Otra ventaja más es la capacidad de producir un derivado de epotilon en una célula huésped recombinante. Así, la presente invención proporciona células huésped recombinantes que producen un epotilon o derivado de epotilon deseado. En una realización preferida, la célula huésped produce el epotilon o derivado de epotilon a 10 mg/litro o más. En una realización, la invención proporciona células huésped que producen uno o más epotilones o derivados de epotilones a niveles superiores a los producidos en los organismos de origen natural que producen epotilones. Las células huésped pueden producir mezclas de epotilones que son menos complejas que las mezclas producidas por las células de origen natural que producen epotilones.
Los genes de la PKS del epotilon y la enzima de modificación fueron clonados a partir de la cepa productora de epotilon, Sorangium cellulosum SMP44. El ADN total fue preparado a partir de esta cepa utilizando el procedimiento descrito por Jaoua y col., 1992, Plasmid 28:157-165. Se preparó un banco de cósmidos de ADN genómico de S. cellulosum en nSupercos (Stratagene). Se aisló la agrupación completa del gen de la PKS y la enzima de modificación en cuatro clones cosmídicos solapantes (depositados en 17 de Febrero de 1999, bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110-2209 USA, y se le asignaron los números de acceso de la ATCC: pKOS35-70.1A2 (ATCC 203782), pKOS35-70.4 (ATCC 203781), pKOS35-70.8A3 (ATCC 203783), y pKOS35-79.85 (ATCC 203780)) y se determinó su secuencia de ADN, como se describe en la Publicación PCT Núm. 00/031237. El análisis de la secuencia de ADN reveló una agrupación génica de PKS con un módulo de carga y nueve módulos prolongadores. Aguas abajo de la secuencia de PKS hay un marco de lectura abierto (ORF), denominado epoK, que muestra une fuerte homología con los genes de la citocromo P450 oxidasa y codifica la enzima de modificación epotilon epoxidasa.
Los genes de PKS están organizados en 6 ORF. A nivel polipeptídico, el módulo de carga y los módulos prolongadores 1 (una NRPS), 2, y 9 aparecen en polipéptidos individuales; sus correspondientes genes son denominados epoA, epoB, epoC, y epoF respectivamente. Los módulos 3, 4, 5, y 6 están contenidos en un único polipéptido cuyo gen es denominado epoD, y los módulos 7 y 8 están en otro polipéptido cuyo gen se denomina epoE. La separación entre las ORF sugiere que epoC, epoD, epoE y epoF constituyen un operón. El gen epoA, epoB, y epoK también pueden ser parte de este gran operón, pero existen espacios de aproximadamente 100 pb entre epoB y epoC y de 115 pb entre epoF y epoK que podrían contener un promotor. La agrupación génica de la PKS del epotilon se muestra esquemáticamente en el Esquema 1.
Esquema 1
3
Inmediatamente aguas abajo de epoK, el gen epoxidasa P450, está la ORF1, que codifica un polipéptido que parece incluir dominios que abarcan la membrana y puede estar implicado en el transporte del epotilon. Esta ORF está seguida de numerosas ORF que incluyen genes que pueden codificar proteínas implicadas en el transporte y la regulación.
Un examen detallado de los módulos muestra una organización y una composición coherentes con la biosíntesis del epotilon. La siguiente descripción es a nivel polipeptídico. La secuencia del dominio AT en el módulo de carga y en los módulos prolongadores 3, 4, 5, y 9 muestra similitud con la secuencia consenso para los módulos de carga de malonilo, coherente con la presencia de una cadena lateral H en C-14, C-12 (epotilones A y C), C-10, y C-2, respectivamente, así como el módulo de carga. Los dominios AT de los módulos 2, 6, 7, y 8 se asemejan a la secuencia consenso para los dominios AT específicos de metilmalonilo, de nuevo coherente con la presencia de cadenas laterales de metilo en C-16, C-8, C-6, y C-4 respectivamente.
El módulo de carga contiene un dominio KS en el cual el resto cisteína normalmente presente en el sitio activo es una tirosina. Este dominio se denomina KS^{y} y sirve como descarboxilasa, que es parte de su función normal, pero no puede funcionar como enzima condensante. Así, se espera que el módulo de carga cargue el malonil CoA, lo mueva hacia la ACP, y lo descarboxile para rendir el resto acetilo requerido para la condensación con cisteína. El módulo prolongador 1 es la péptido sintasa no ribosomal que activa la cisteína y cataliza la condensación con acetato en el módulo de carga. La secuencia contiene segmentos muy similares a los dominios de la ATPasa y de unión al ATP, requeridos para la activación de los aminoácidos, un sitio de fosfopanteteinilación, un dominio de oxidación, un dominio de ciclación, y un dominio de elongación. El módulo prolongador 2 determina la estructura del epotilon en C-15-C-17. La presencia del dominio DH en el módulo 2 rinde el radical deshidro de C-16-17 de la molécula. Los dominios del módulo 3 son coherentes con la estructura del epotilon en C-14 y C-15; el OH que procede de la acción de la KR es empleado en la lactonización de la molécula. El módulo prolongador 4 controla la estructura en C-12 y C-13 donde se encuentra un doble enlace en los epotilones C y D. Aunque la secuencia del dominio AT parece asemejarse a las que especifican la carga de malonato, también puede cargar metilmalonato, justificando de ese modo en parte la mezcla de epotilones encontrada en los caldos de fermentación de los organismos de origen
natural.
Se encontró una novedad significativa en la disposición esperada de las funciones en el módulo prolongador 4. Se esperaba que este módulo contuviera un dominio DH, dirigiendo de ese modo la síntesis de los epotilones C y D como productos de la PKS. El análisis reveló que el espacio entre los dominios AT y KR del módulo 4 no era lo suficientemente grande para acomodar el dominio DH funcional. Así, el grado de reducción del módulo 4 parece no continuar más allá de la ceto-reducción del beta-ceto formado tras la condensación dirigida por el módulo prolongador 4. Como se muestra aquí, los genes de la PKS del epotilón solos son suficientes para conferir la capacidad de producir epotilones C y D a las células huésped de la invención. La producción heteróloga de los epotilones C y D demuestra que debe haber una función deshidratasa que introduzca el doble enlace. Basándose en la expresión heteróloga de los genes de la PKS de los epotilones y en los productos producidos por los genes de PKS de epotilones alterados, se cree que la reacción de deshidratación que forma este doble enlace está mediada por el dominio DH del módulo prolongador 5 de la PKS del epotilon y la generación de un precursor de dieno conjugado antes de la reducción por el dominio ER del módulo 5.
Los módulos prolongadores 5 y 6 tienen cada uno el grupo completo de dominios de reducción (KR, DH y ER) para rendir las funciones metileno en C-11 y C-9. Los módulos prolongadores 7 y 9 tienen dominios KR para rendir los hidroxilos en C-7 y C-3, y el módulo prolongador 8 no tiene un dominio KR funcional, coherente con la presencia del grupo ceto en C-5. El módulo prolongador 8 también contiene un dominio metiltransferasa (MT) que da como resultado la presencia de la función dimetilo geminal en C-4. El módulo prolongador 9 también tiene un dominio tioesterasa que termina la síntesis del policétido y cataliza el cierre del anillo.
Los genes, proteínas, módulos, y dominios de las PKS de los epotilones se resumen en la siguiente Tabla 2.
TABLA 2
Gen Proteína Módulos Dominios Presentes
epoA EpoA Carga KS^{y} mAT ER ACP
epoB EpoB 1 NRPS, condensación, heterociclación
adenilación, tiolación, PCP
epoC EpoC 2 KS mmAT DH KR ACP
epoD EpoD 3-6 KS mAT KR ACP; KS mAT KR ACP; KS
mAT DH ER KR ACP; KS mmAT DH ER
KR ACP
epoE EpoE 7-8 KS mmAT KR ACP; KS mmAT MT DH^{\text*} KR^{\text*} AC
epoF EpoF 9 KS mAT KR DH^{\text*} ER^{\text*} ACP TE
\begin{minipage}[t]{145mm} NRPS - péptido sintasa no ribosomal; KS - cetosintasa; mAT - aciltransferasa específica de malonil CoA; mmAT - aciltransferasa específica de metilmalonil CoA; DH - deshidratasa; ER - enoilreductasa; KR - ceto-reductasa; MT - metiltransferasa; TE - tioesterasa; ^{\text*} - dominio inactivo. \end{minipage}
La inspección de la secuencia ha revelado el acoplamiento transcripcional entre epoA y epoB (módulo de carga y módulo propagador 1 NRPS) y entre epoC epoD. Se observan espacios muy pequeños entre epoD y epoE y epoE y epoF pero se encuentran espacios que exceden de 100 pb entre epoB y epoC y epoF y epoK. Estas regiones intergénicas pueden contener promotores.
Así, la PKS del epotilon es un complejo multiproteico compuesto por los productos génicos de los genes epoA, epoB, epoC, epoD, epoE, y epoF. Para conferir la capacidad de producir epotilones a una célula huésped, se provee a la célula huésped de genes epoA, epoB, epoC, epoD, epoE, y epoF recombinantes de la presente invención, y opcionalmente otros genes, tales como epoK, susceptibles de expresión en esa célula huésped. Los expertos en la técnica apreciarán que, si bien el epotilon y otras enzimas PKS pueden ser referidas como una única entidad aquí, estas enzimas son típicamente proteínas de múltiples subunidades. De este modo, se puede elaborar una PKS derivada (una PKS que difiere de una PKS de origen natural por deleción o mutación) o una PKS híbrida (una PKS que está compuesta por porciones de dos enzimas PKS diferentes) alterando uno o más genes que codifican una o más de las múltiples proteínas que constituyen la PKS.
La modificación post-PKS o el ajuste del epotilon incluye múltiples etapas mediadas por múltiples enzimas. Estas enzimas son referidas aquí como enzimas de ajuste o modificación. La expresión de los genes de la PKS del epotilon epoA, epoB, epoC, epoD, epoE, y epoF en células huésped de la invención que no expresen epoK conduce a la producción de los epotilones C y D como productos principales, que carecen del epóxido C-12-C-13 de los epotilones A y B, que tienen en su lugar un doble enlace C-12-C-13. De este modo, los epotilones C y D son convertidos en los epotilones A y B por una epoxidasa codificada por el gen epoK. Los epotilones A y B pueden ser convertidos en los epotilones E y F mediante un gen de la hidroxilasa, que puede estar codificado por un gen asociado con una agrupación génica de PKS de epotilon o por otro gen endógeno de Sorangium cellulosum. Alternativamente, estos compuestos pueden ser formados por el módulo de carga que se une a una unidad de arranque distinta de malonil CoA (tal como hidroximalonil CoA). Así, se puede producir un epotilon o derivado de epotilon modificado según se desee en una célula huésped proporcionando a esa célula huésped uno o más genes de enzimas de modificación recombinantes o utilizando una célula huésped que exprese naturalmente (o no exprese) la enzima de modificación y/o proporcionando unidades de arranque distintas de malonil CoA.
De este modo, se puede proporcionar una amplia variedad de compuestos de ADN recombinante y células huésped para expresar los epotilones de origen natural A, B, C, y D y los derivados de los mismos. Las células huésped recombinantes también pueden producir derivados de epotilon modificados de una manera similar a los epotilones E y F. Por otra parte, cualquier epotilon o derivado de epotilon descrito aquí puede ser convertido en el correspondiente derivado de epotilon E o F según los métodos descritos en la Publicación de la Patente PCT Núm. 00/039276.
Asimismo se puede proporcionar una amplia variedad de compuestos de ADN recombinante y células huésped que elaboran los derivados de epotilones. Según se utiliza aquí, la frase derivado de epotilon hace referencia a un compuesto que es producido por una PKS de epotilon recombinante en la cual se ha insertado al menos un dominio o en la cual un dominio se ha vuelto inactivo por deleción o mutación, se ha mutado para alterar su función catalítica, o se ha remplazado por un dominio con una función diferente. En cualquier caso, la PKS derivada de epotilon así producida funciona produciendo un compuesto que difiere en estructura de un epotilon de origen natural seleccionado del grupo formado por los epotilones A, B, C, D, E, y F.
Las células huésped de la invención se pueden hacer crecer y fermentar en condiciones conocidas en la técnica para otros fines para producir compuestos. Asimismo se describen aquí métodos novedosos para fermentar las células huésped de la invención. Los compuestos pueden ser aislados de los caldos de fermentación de estas células cultivadas y purificados mediante métodos tales como los del Ejemplo 3, más abajo.
Aquí se describen numerosos métodos relativos a la fermentación de cepas de Myxococcus para la producción de policétidos y otros productos. Antes de la presente invención, no se había llevado a cabo la fermentación de Myxococcus con fines productivos para cualquier policétido diferente de TA y saframicina, que son producidas naturalmente por ciertas cepas de Myxococcus. Así, en un aspecto, la presente invención permite el uso de Myxococcus como huésped de producción para la producción mediante fermentación de compuestos bioactivos útiles, incluyendo, pero no limitados a, policétidos, péptidos no ribosomales, epotilones, lipasas, proteasas, otras proteínas, lípidos, glicolípidos, ramnolípidos, y polihidroxialcanoatos.
Entre los métodos descritos aquí se encuentran los métodos para preparar y almacenar bancos de células y los métodos para adaptar una cepa de Myxococcus a un medio de fermentación. Estos métodos son importantes, debido a que antes de la presente invención, no se habían elaborado bancos de células congeladas de cepas de Myxococcus adaptados para la producción en un medio con una base oleosa, y en ausencia de la adaptación las cepas de Myxococcus frecuentemente mueren, especialmente en medios de fermentación con una base oleosa.
Asimismo se describe aquí un método de fermentación para hacer crecer Myxococcus y un medio de fermentación útil en el método. Sorprendentemente, Myxococcus xanthus y otras cepas de Myxococcus no pueden utilizar carbohidratos, glicerol, o intermedios del ciclo de TCA como fuente de carbono. Antes de la presente invención, las fermentaciones de Myxococcus xanthus se llevaban a cabo en un medio basado de proteínas. No obstante, NH_{4} aumenta hasta niveles tóxicos para el crecimiento en los medios basados de proteínas y por tanto limita la fermentación. Según la presente invención, las cepas de Myxococcus pueden ser fermentadas en un medio que contiene aceite y/o ácidos grasos como fuente de carbono.
Entre los aceites y los ácidos grasos ilustrativos útiles en el método se incluyen, pero no están limitados a, oleato de metilo; aceites derivados de coco, manteca, colza, sésamo, soja, y girasol; aceite para ensaladas; aceites autoemulsionantes tales como Agrimul CoS2, R5O5, R5O3; oleato de glicerilo, incluyendo monooleato de glicerol y trioleato de glicerol; ésteres de cadena impar tales como heptadecanoato de metilo, nonadecanoato de metilo, y pelargonato de metilo; cadenas de ésteres tales como oleato de propilo y oleato de etilo; oleato de metilo vegetal; estearato de metilo; linoleato de metilo; ácido oleico; y fosfatidilcolina, ya sea pura o derivada de soja y yema de huevo. Así, cualquier aceite vegetal o derivado de grano, tal como aceite de girasol o de soja, cualquier aceite derivado de animal, tal como manteca, ácidos grasos libres o esterificados de cualquier longitud de cadena tanto saturado como insaturado, mezclas de ácidos grasos naturales y sintéticos tales como fosfatidil colina o pelargonato de metilo, respectivamente, y aceites de fermentación industrial, tales como la serie Cognis Corporation's Agrimul, pueden ser empleados en el método. El medio de fermentación puede utilizar oleato de metilo como fuente de carbono. Generalmente, los aceites que son líquidos a la temperatura ambiente son más preferidos que los aceites sólidos, debido principalmente a la facilidad de dispersión. Entre otros componentes importantes del medio de fermentación se incluyen metales vestigiales tales como Fe y Cu, que mejoran el crecimiento y la producción en medios complejos y definidos y en procedimientos por lotes y alimentados por lotes. Se prefiere un medio que contiene oleato de etilo y metales vestigiales para la producción de epotilones.
Aquí se describe un medio de fermentación para células huésped de la invención que contiene cantidades reducidas de sustancias derivadas de animales o no contiene ninguna cantidad. Debido al potencial de contaminación por agentes infecciosos, tales como virus y priones, el uso de sub-productos animales en los procedimientos de fermentación para la producción de compuestos que van a ser administrados a humanos o animales, se prefiere utilizar un medio de fermentación que contenga cantidades reducidas o nulas de sustancias derivadas de animales. Tal medio se proporciona para el uso en los métodos de la invención. Los aceites o ácidos grasos contenidos en el medio de fermentación pueden ser derivados de una fuente no animal, tal como una planta. Por ejemplo, se puede obtener oleato de metilo derivado de vegetal comercialmente. Por otra parte, se puede remplazar un material derivado de animal por un material no idéntico pero equivalente derivado de una fuente no animal. Por ejemplo, la casitona, que es un producto de la digestión pancreática de caseína, una proteína láctea, puede ser remplazada por un producto hidrolizado de una proteína de origen no animal, incluyendo pero no limitado a una planta, tal como un producto hidrolizado de proteína derivado de vegetal.
Generalmente, se prefieren los procedimientos de alimentación por lotes. Las alimentaciones fuerzan a las células a utilizar los nutrientes eficazmente (por ejemplo, las células metabolizan el carbono a CO_{2} y H_{2}O en lugar de generar ácidos orgánicos tóxicos). Los niveles elevados de nutrientes pueden reprimir el metabolismo secundario, y si la fermentación introduce nutrientes a una velocidad por debajo del umbral de inhibición, la producción puede ser superior.
Los métodos de fermentación descritos aquí también incluyen métodos relacionados específicamente con la producción de epotilones y los medios de fermentación útiles en esos métodos. Como ejemplo, se pueden utilizar propionato y acetato para influir en la proporción de epotilon D:C (o B:A) y en los títulos de epotilones obtenidos. Si bien este efecto es mínimo en el medio de fermentación de oleato de metilo/metales vestigiales preferido, el efecto puede ser un efecto bastante significativo en otros medios, tales como el medio CTS. Las cantidades crecientes de acetato en el medio de fermentación pueden incrementar el crecimiento de Myxococcus y la producción de epotilon. El acetato solo incrementa los títulos de epotilon C (o epotilon A) espectacularmente, y reduce los títulos de epotilon D (o epotilon A). El propionato solo no incrementa los títulos de epotilon y a elevadas concentraciones puede reducir los títulos. No obstante, el propionato y el acetato juntos pueden desplazar la producción de epotilon C (o epotilon A) a epotilon D (o epotilon B). Un medio preferido para la producción de epotilon D contiene casitona, acetato 10 mM, y propionato 30 mM. Los medios que contienen ácidos grasos de cadena impar pueden reducir la producción de epotilon C en las fermentaciones de células de Myxococcus xanthus que producen epotilones C y D. Los metales vestigiales también pueden intensificar la producción de epotilon D e incrementar las proporciones de epotilon D:C en presencia de acetato y sin ningún aceite en los medios de fermentación.
Aquí se describen los métodos para purificar epotilones de los medios de fermentación y para preparar formas cristalinas de epotilon. En general, el método de producción implica la captura del epotilon sobre la resina XAD durante la fermentación, la elución de la resina, la extracción en fase sólida, la cromatografía, y la cristalización. El método se describe con detalle en el Ejemplo 3, y si bien se prefiere y se ejemplifica el método para el epotilon D, se puede utilizar el método para preparar epotilones cristalinos generalmente, incluyendo pero no limitados a otros epotilones de origen natural, y los análogos de epotilones producidos por las células huésped de la invención.
Aquí se describen compuestos derivados de epotilon novedosos en forma aislada y purificada útiles en agricultura, en la práctica veterinaria, y en medicina. Los compuestos pueden ser útiles como fungicidas, en la quimioterapia contra el cáncer, o para la prevención del crecimiento no deseado de células, incluyendo pero no limitado al tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tales como la inflamación, las enfermedades autoinmunes, y la psoriasis, y a la prevención de crecimiento celular en los stents. El compuesto puede ser un derivado de epotilon que sea al menos tan potente contra las células tumorales como el epotilon B o D. Los compuestos pueden ser útiles como inmunosupresores. Los compuestos pueden ser útiles en la fabricación de otros compuestos. Los compuestos pueden ser formulados en una mezcla o solución para la administración a un humano o animal.
Los análogos de epotilon novedosos descritos aquí, así como los epotilones producidos por las células huésped de la invención, pueden estar derivados y ser formulados como se describe en las publicaciones de patentes PCT Núms. 93/10121, 97/19086, 98/08849, 98/22461, 98/25929, 99/01124, 99/02514, 99/07692, 99/27890, 99/39694, 99/40047, 99/42602, 99/43320, 99/43653, 99/54318, 99/54319, 99/54330, 99/65913, 99/67252, 99/67253, y 00/00485, y en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.969.145.
Habiéndose proporcionado una descripción detallada de la invención más arriba, se citan los siguientes ejemplos con el fin de ilustrar la presente invención y no deberán ser considerados una limitación del alcance de la invención o de las reivindicaciones.
Ejemplo 1 Construcción de un Vector de Expresión de Myxococcus xanthus
El ADN que proporcionaba la función de integración y anclaje del fago Mx8 fue insertado en pACYC184 (New England Biolabs) asequible comercialmente. Un MfeI-SmaI de \sim2360 pb del plásmido pPLH343, descrito en Salmi y col., Febrero de 1998, J. Bact. 180(3):614-621, fue aislado y ligado al fragmento de restricción EcoRI-XmnI grande del plásmido pACYC184. El ADN circular así formado tenía un tamaño de \sim6 kb y se denominó plásmido pKOS35-77.
El plásmido pKOS35-77 sirve como plásmido conveniente para expresar los genes de PKS recombinante de la invención bajo el control del promotor del gen de la PKS del epotilon. En una realización ilustrativa, el gen de la PKS del epotilon completo con su promotor homólogo es insertado en uno o más fragmentos en el plásmido para rendir un vector de expresión de la invención.
Se pueden proporcionar vectores de expresión en los cuales los genes de PKS recombinante están bajo el control de un promotor de Myxococcus xanthus. Para construir un vector ilustrativo, se aisló el promotor del gen pilA de M. xanthus en forma de un producto de amplificación de PCR. El plásmido pSWU357, que comprende el promotor del gen pilA y se describe en WU y Kaiser, Diciembre 1997, J. Bact. 179(24):7748-7758, fue mezclado con los cebadores de la PCR cebadores Sec1 y Mxpil1:
Sec1: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGC-3'; y
Mxpil1: 5'-TTAATTAAGAGAAGGTTGCAACGGGGGGC-3',
y amplificados utilizando las condiciones de PCR normalizadas para rendir un fragmento de \sim800 pb. Este fragmento fue escindido con la enzima de restricción KpnI y ligado al fragmento KpnI-EcoRV grande de plásmido asequible comercialmente pLitmus 28 (New England Biolabs). El ADN circular resultante fue denominado pKOS35-71B.
El promotor del gen pilA del plásmido pKOS35-71B fue aislado en forma de un fragmento de restricción EcoRV-SnaBI de \sim800 pb y ligado con el fragmento de restricción MscI grande del plásmido pKOS35-77 para rendir un ADN circular con un tamaño de \sim6,8 kb. Debido a que el fragmento de \sim800 pb podía ser insertado en cualquiera de las dos orientaciones, la ligadura producía dos plásmidos del mismo tamaño, que fueron denominados plásmidos pKOS35-82.1 y pKOS35-82.2. Los mapas de los sitios de restricción y la función de estos plásmidos se presentan en la Figura 2.
Los plásmidos pKOS35-82.1 y pKOS35-82.2 sirven como materiales de partida convenientes para los vectores en los cuales un gen de PKS recombinante está situado bajo el control del promotor del gen pilA de Myxococcus xanthus. Estos plásmidos comprenden una única secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción PacI situado inmediatamente aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción del promotor. En una realización ilustrativa, el gen de PKS completo del epotilon sin su promotor homólogo es insertado en uno o más fragmentos en los plásmidos en el sitio PacI para rendir los vectores de expresión.
La secuencia del promotor pilA en estos plásmidos se muestra más abajo.
4
Para elaborar células huésped de Myxococcus xanthus recombinante, se hicieron crecer células de M. xanthus en medio CYE (Campos y Zusman, 1975, Regulation of development in Myxococcus xanthus: effect of 3':5'-cyclic AMP, ADP, and nutrition, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:518-522) a un Klett de 100 a 30ºC a 300 rpm. El resto del protocolo se lleva a cabo a 25ºC a menos que se indique de otro modo. Las células fueron sedimentadas después mediante centrifugación (8.000 rpm durante 10 minutos en un rotor SS34 o SA600) y resuspendidas en agua desionizada. Las células son sedimentadas de nuevo y resuspendidas en 1/100 del volumen original.
Se sometió a electroporación ADN (uno a dos \mul) en las células en una cubeta de 0,1 cm a la temperatura ambiente a 400 ohmios, 25 \muFD, 0,65 V con una constante de tiempo en el intervalo de 8,8 a 9,4. El ADN está libre de sales y es resuspendido en agua destilada y desionizada o sometido a diálisis sobre una membrana de 0,025 \mum Tipo VS (Millipore). Para las electroporaciones de baja eficacia, el ADN es sometido a diálisis en el sitio, y el sobrecrecimiento es en CYE. Inmediatamente después de la electroporación, se añade 1 ml de CYE, y las células de la cubeta se reúnen con 1,5 ml adicionales de CYE añadido antes a un matraz Erlenmeyer de 50 ml (volumen total 2,5 ml). Las células se hacen crecer durante cuatro a ocho horas (o durante la noche) a 30-32ºC a 300 rpm para permitir la expresión del marcador seleccionable. Después, las células son cultivadas en placa en agar blando CYE sobre las placas con selección. Con kanamicina como marcador seleccionable, los rendimientos típicos son de 10^{3} a 10^{5} por \mug de ADN. Con estreptomicina como marcador seleccionable, ésta está incluida en el agar superior, debido a que se une al
agar.
Con este procedimiento, los vectores de expresión de ADN recombinante son sometidos a electroporación en células huésped de Myxococcus que expresan las PKS recombinantes y producen el epotilon, los derivados de epotilon, y otros policétidos novedosos codificados por ellas.
Ejemplo 2 Integración Cromosómica y Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) para la Expresión de Epotilon en Myxococcus xanthus
Para expresar los genes de la PKS del epotilon y la enzima de modificación en un huésped heterólogo para producir epotilones mediante fermentación, se emplea Myxococcus xanthus, que está íntimamente relacionado con Sorangium cellulosum y para el cual se encuentran disponibles numerosos vectores de clonación, según los métodos descritos aquí. M. xanthus y S. cellulosum son myxobacterias y por tanto pueden compartir elementos de expresión génica, control traduccional, y modificación post-traduccional. M. xanthus ha sido desarrollado para la clonación y la expresión génicas: el ADN puede ser introducido mediante electroporación, y se encuentran disponibles numerosos vectores y marcadores genéticos para la introducción de ADN foráneo, incluyendo aquellos que permiten su inserción estable en el cromosoma. M. xanthus se puede hacer crecer con relativa facilidad en medios complejos en fermentadores y puede ser sometido a manipulaciones para incrementar la expresión génica, si se requiere.
Para introducir la agrupación génica del epotilon en Myxococcus xanthus, se puede construir la agrupación del epotilon en el cromosoma utilizando la recombinación homóloga para ensamblar la agrupación génica completa. Alternativamente, la agrupación génica del epotilon completa puede ser clonada en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) y después trasladado a M. xanthus para la integración en el cromosoma.
Para ensamblar la agrupación génica a partir de los cósmidos pKOS35-70.1A2, pKOS35-79,85, regiones pequeñas (\sim2 kb o más grande) de homología de estos cósmidos son introducidas en Myxococcus xanthus para proporcionar sitios de recombinación para piezas más grandes de la agrupación génica. Como se muestra en la Figura 3, los plásmidos pKOS35-154 y pKOS90-22 son creados para introducir estos sitios de recombinación. La estrategia para el ensamblaje de la agrupación génica del epotilon en el cromosoma de M. xanthus se muestra en la Figura 4. Inicialmente, se elige un sitio neutro en el cromosoma bacteriano que no interrumpa ninguno de los genes o unidades transcripcionales. Una de tales regiones se encuentra aguas abajo del gen devS, que se ha demostrado que no afecta al crecimiento o desarrollo de M. xanthus. El primer plásmido, pKOS35-154, es linealizado con DraI y sometido a electroporación en M. xanthus. Este plásmido contiene dos regiones del locus dev que flanquea dos fragmentos de la agrupación génica del epotilon. Insertada entre las regiones del gen epo está una casete compuesta por un marcador de resistencia a la kanamicina y el gen galK de E. coli. Ver Ueki y col., 1996, Gene 183:153-157. La resistencia a la kanamicina surge en las colonias si el ADN se recombina en la región dev por medio de una doble recombinación utilizando la secuencia dev como regiones de homología.
Esta cepa, K35-159, contiene pequeñas regiones (\sim2,5 kb) de la agrupación génica del epotilon que permitirá la recombinación de pKOS35-79.85. Debido a que los marcadores de resistencia de pKOS35-79.85 son los mismos que los de K35-159, fue transpuesto un transposón de tetraciclina en el cósmido, y los cósmidos que contenían el transposón insertado en el marcador de kanamicina fueron seleccionados. Este cósmido, pKOS90-23, fue sometido a electroporación en K35-159, y las colonias resistentes a oxitetraciclina fueron seleccionadas para crear la cepa K35-174. Para eliminar las regiones no deseadas del cósmido y dejar sólo los genes del epotilon, las células fueron cultivadas en placa sobre placas de CYE conteniendo galactosa al 1%. La presencia del gen galK hace a las células sensibles a la galactosa al 1%. Las colonias resistentes a la galactosa de K35-174 representan células que han perdido el marcador galK por recombinación o por mutación en el gen galK. Si el evento de recombinación se produce, la cepa resistente a la galatosa es sensible a la kanamicina y a la oxitetraciclina. Las cepas sensibles a ambos antibióticos son verificadas mediante análisis de transferencia Southern. La cepa correcta es identificada y designada K35-175 y contiene la agrupación génica del epotilon del módulo 7 a 4680 pb aguas abajo del codón de parada
de epoK.
Para introducir los módulos 1 a 7, se repite el procedimiento anterior una vez más. El plásmido pKOS90-22 es linealizado con DraI y sometido a electroporación en K35-175 para crear K111-13.2. Esta cepa es sometida a electroporación con la versión resistente a la tetraciclina de pKOS35-70.1A2, pKOS90-38, y las colonias resistentes a la oxitetraciclina son seleccionadas. Esto crea la cepa K111-13.23. Los recombinantes que tienen ahora la agrupación génica completa del epotilon se seleccionan mediante la resistencia a la galactosa al 1%. Esto produce clones K111-32.25, K111-32.26, y K111-32.35. La cepa K111-32.25 fue depositada el 14 de Abril de 2000, en la American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209, USA, en cumplimiento del Tratado de Budapest y es asequible con el Número de acceso PTA-1700. Esta cepa contiene todos los genes del epotilon y su promotor o promotores.
\newpage
La fermentación se realizó inoculando las cepas en 5 ml de CYE (10 g de casitona, 5 g de extracto de levadura, y 1 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O por litro) en un matraz de 50 ml y haciendo crecer durante la noche hasta que el cultivo llegó a la fase de crecimiento semilogarítmica. Una alícuota de 100 ml se diseminó sobre una placa de agar CTS, y la placa se incubó a 32ºC durante 4 a 5 días. Para extrae los epotilones, se maceraron el agar y las células de la placa, se pusieron en un tubo cónico de 50 ml, y se añadió acetona hasta llenar el tubo. La solución se incubó con balanceo durante 4 a 5 horas, la acetona se evaporó, y el líquido restante se extrajo dos veces con un volumen igual de acetato de etilo. El agua se separó del extracto de acetato de etilo añadiendo sulfato de magnesio. El sulfato de magnesio se filtró, y el líquido se evaporó hasta sequedad. Los epotilones se resuspendieron en 200 \mul de acetonitrilo y se analizaron mediante LC/MS. El análisis demostró que la cepa producía los epotilones A y B, con el epotilon B presente a aproximadamente 0,1 mg/litro en el cultivo, y el epotilon A a niveles 5 a 10 veces inferiores.
Esta cepa también puede ser utilizada para producir epotilones en cultivo líquido. Se inocula un matraz conteniendo CYE con una cepa productora de epotilones. Al día siguiente, mientras las células están en fase de crecimiento semilogarítmica, se añade un inóculo del 5% a un matraz conteniendo CMM al 0,5% (casitona al 0,5%, MgSO_{4} al 0,2%\cdot7H_{2}O, MOPS 10 mM pH 7,6) junto con un 1 mg/ml de serina, alanina, y glicina y piruvato de sodio al 0,1%. El piruvato de sodio puede ser añadido a un 0,5% para incrementar la producción de epotilon B pero ocasiona un descenso de la razón de epotilon B a epotilon A. El cultivo se hace crecer a 30ºC durante 60-72 horas. Las incubaciones más largas producen un descenso de los títulos de epotilones. Para recuperar los epotilones, los cultivos se centrifugan a 10.000 rpm durante 10 minutos en un rotor SS34. Los sobrenadantes se extraen dos veces con acetato de etilo y se someten a evaporación rotatoria ("rotavapor") hasta sequedad. Los cultivos líquidos producían de 2 a 3 mg/litro de epotilones A y B, con razones similares a la observada con los cultivos en placa. Si se añadía XAD (0,5-2%) al cultivo, se observaron los epotilones C y D, con el epotilon D presente a 0,1 mg/litro y el epotilon C presente a niveles 5 a 10 veces inferiores.
Para clonar la agrupación génica completa en forma de un fragmento, se construye un banco cromosómico artificial bacteriano (BAC). Primero, se embeben células SMP44 en agarosa y se someten a lisis según el estuche Genomic DNA Plug de BIO-RAD. Los tapones de ADN son parcialmente digeridos con enzima de restricción, tal como Sau3AI o HindIII, y se someten a electroforesis en un gel FIGE o CHEF. Los fragmentos de ADN son aislados mediante electroelución del ADN a partir de agarosa o utilizando gelasa para degradar la agarosa. El método de elección para aislar los fragmentos es la electroelución, como describen Strong y col., 1997, en Nucleic Acids Res. 19:3959-3961. El ADN es ligado en el BAC (pBeloBACII) escindido con la enzima apropiada. En la Figura 5 se muestra un mapa de BeloBACII.
El ADN es sometido a electroporación en células DH10B mediante el método de Sheng y col., 1995, Nucleic Acids Res. 23:1990-1996, para crear una banco genómico de Sorangium cellulosum. Las colonias son rastreadas utilizando una sonda de la región NRSP de la agrupación del epotilon. Los clones positivos son seleccionados y el ADN es aislado para el análisis de restricción para confirmar la presencia de la agrupación génica completa. El clon positivo es denominado pKOS35-178.
Para crear una cepa que pueda ser utilizada para introducir pKOS35-178, se construye un plásmido pKOS164, que contiene regiones de homología que están aguas arriba y aguas abajo de la agrupación génica del epotilon flanqueadas por el locus dev y conteniendo la casete galK de resistencia a la kanamicina, análogo a los plásmidos pKOS90-22 y pKOS35-154. Este plásmido es linealizado con DraI y sometido a electroporación en Myxococcus xanthus, según el método de Kafeshi y col., 1995, Mol. Microbiol. 15:483-494, para crear K35-183. El plásmido pKOS35-178 puede ser introducido en K35-183 mediante electroporación o mediante transducción con el bacteriófago P1, y se seleccionan las colonias resistentes al cloramfenicol. Alternativamente, se puede construir una versión de pKOS35-178 que contiene el origen de trasferencia conjugativo de pRP4 para transferir ADN de E. coli a K35-183. Este plásmido es elaborado construyendo primero un transposón que contiene la región oriT de RP4 y el marcador de resistencia a la tetraciclina de pACYC184 y después sometiendo a transposición el transposón in vitro o in vivo sobre pKOS35-178. Este plásmido es transformado en S17-1 y conjugado en M. xanthus. Esta cepa, K35-190, se hace crecer en presencia de galactosa al 1% para la selección en cuanto al segundo evento de recombinación. Esta cepa contiene todos los genes del epotilon así como todos los promotores potenciales. Esta cepa es fermentada y sometida a ensayo para la producción de los epotilones A y B.
Alternativamente, el transposón puede ser recombinado en el BAC utilizando un plásmido pMAK705 sensible a la temperatura o pKO3 mediante la transposición del transposón a pMAK705 o pKO3, seleccionando los plásmido tetR y camS; la recombinación se completa como describen Hamilton y col., Sep. 1989, en J. Bact. 171(9):4617-4622 y Link y col., Oct. 1997, J. Bact. 179(20):6228-6237.
Además de integrar pKOS35-178 en el locus dev, éste también puede ser integrado en un sitio de anclaje de un fago utilizando las funciones de integración de los myioxifagos Mx8 o Mx9. Se construye un transposón que contiene los genes de integración y el sitio att de Mx8 o Mx9 junto con el gen de la tetraciclina de pACYC184. Las versiones alternativas de este transposón pueden tener solamente el sitio de anclaje. En esta versión, los genes de integración son suministrados después en trans mediante electroporación simultánea de un plásmido que contenga el gen de la integrasa o que tenga la proteína integrasa expresada en la cepa electroporada de cualquier promotor constitutivo, tal como el promotor mgl (ver Magrini y col., Jul. 1999, J. Bact. 181(13):4062-4070, incorporada aquí como referencia). Una vez que se ha construido el transposón, éste es sometido a transposición sobre pKOS35-178 para crear pKOS35-191. Este plásmido es introducido en Myxococcus xanthus como se ha descrito antes. Esta cepa contiene todos los genes de epotilon así como todos los promotores potenciales. Esta cepa es fermentada y sometida a ensayo para la producción de los epotilones A y B. Alternativamente, se puede someter a transposición una cepa que contiene el sitio att y la región oriT sobre el BAC y conjugar el BAC resultante en M. xanthus.
Una vez que los genes del epotilon han sido establecidos en una cepa de Myxococcus xanthus, se puede realizar la manipulación de cualquier parte de la agrupación génica, por ejemplo cambiando los promotores o canjeando los módulos, utilizando la casete de resistencia a la kanamicina y galK, como se describe más abajo. Se hacen crecer los cultivos de Myxococcus xanthus que contienen los genes epo en numerosos medios y se examina la producción de epotilones. Si los niveles de producción de epotilones (en particular B o D) son bajos, se someten los clones productores de M. xanthus a desarrollo del medio y mejora basada en la mutación, como se describe en el siguiente ejemplo.
Ejemplo 3 Procedimientos para la Producción y Purificación de Epotilones A. Optimización de la Producción Heteróloga de Epotilon D en Myxococcus xanthus
La producción heteróloga de epotilon D en Myxococcus xanthus fue mejorada en 140 veces a partir de un título inicial de 0,16 mg/litro con la incorporación de una resina adsorbente, la identificación de una fuente de carbono adecuada, y la implementación de un procedimiento de alimentación por lotes.
Para reducir la degradación del epotilon D en el medio basal, se añadió XAD-16 (20 g/litro) para estabilizar el producto extracelular. Esto facilitaba enormemente su recuperación e intensificaba el rendimiento al triple. El uso de aceites como fuente de carbono para el crecimiento celular y la formación de producto también fue evaluado. A partir de un rastreo de diferentes aceites, se mostró que el oleato de metilo tenía el mayor impacto. A una concentración óptima de 7 ml/litro en un procedimiento por lotes, la densidad celular máxima se incrementaba de 0,4 g de peso celular seco (PCS)/litro a 2 g PCS/litro. El rendimiento de producto dependía de la presencia de elementos vestigiales en el medio de producción. Con un suplemento exógeno de metales vestigiales al medio basal, el pico del epotilon D se intensificaba 8 veces, demostrando el papel significativo de los iones metálicos en el metabolismo celular y en la biosíntesis del epotilon. Para incrementar el rendimiento de producto adicionalmente, se empleó un procedimiento de alimentación por lotes continuo para promover una mayor densidad celular y para mantener un período de producción prolongado. Los cultivos de alimentación por lotes optimizados rendían constantemente una densidad celular de 7 g PCS/litro y un título de producción media de 23 mg/litro.
Los epotilones son metabolitos secundarios que son naturalmente producidos por diversas cepas de la myxobacteria Sorangium cellulosum (Gerth y col., 1996; Gerth y col., 2001; referencias citadas en este ejemplo se enumeran al final de esta sección. Son potentes inhibidores de la despolimerización de los microtúbulos, con un mecanismo de acción similar al del fármaco anti-canceroso Taxol (Bollag y col., 1995). Su efecto citotóxico contra las líneas celulares tumorales resistentes a múltiples fármacos que expresan la glicoproteína P los hace compuestos potencialmente terapéuticos con un gran valor comercial (Su y col., 1997; Kowalski y col., 1997). Su solubilidad comparativamente elevada en agua también facilita su formulación para la evaluación clínica.
Los epotilones A y B son los principales productos de fermentación del huésped natural (Gerth y col., 1996). El núcleo macrocíclico de estas moléculas de policétidos se forma por medio de sucesivas condensaciones descarboxilativas de unidades acetato y propionato (Gerth y col., 2000). Los epotilones A y B difieren en un único grupo metilo en la posición C-12 de su esqueleto carbonado. Esta variación estructural resulta de la incorporación de un acetato en el ensamblaje del epotilon A y de un propionato en el del epotilon B. Los epotilones C y D son intermedios en la ruta biosintética de los epotilones A y B, respectivamente (Tang y col., 2000; Molnár y col., 2000). Son secretados como productos minoritarios durante el procedimiento de fermentación, con un rendimiento combinado de aproximadamente 0,4 mg/litro. Debido a que estudios preliminares in vivo revelaron que el epotilon D era el más prometedor de los cuatro compuestos como fármaco antitumoral (Chou y col., 1998), es de considerable interés producir esta molécula a gran escala.
La agrupación génica responsable de la biosíntesis de los epotilones ha sido secuenciada (Tang y col., 2000; Molnár y col., 2000) y utilizada para producir estos compuestos en Myxococcus xanthus, un huésped microbiano íntimamente relacionado con S. cellulosum pero más susceptible de manipulación genética. Para promover la producción de epotilon D, se construyó un mutante por deleción de esta cepa recombinante (descrita en el Ejemplo 4, más abajo) para inactivar la epoxidasa P450 que cataliza la conversión de los epotilones C y D en epotilones A y B, respectivamente (Tang y col., 2000). Esta alteración genética promovía eficazmente la secreción de los epotilones C y D como únicos productos de la fermentación de M. xanthus, con una proporción de epotilon D a C de 4 a 1. El mutante resultante ofrece una clara ventaja sobre el huésped natural en la recuperación y purificación del producto deseado. En este ejemplo, se describen mejoras en la composición de los medios y la estrategia de fermentación que producen un incremento de 140 veces en la producción de epotilon D en M. xanthus.
Se han utilizado resinas absorbentes en las fermentaciones de myxobacterias para la captura continua de moléculas biológicamente activas producidas a cantidades bajas (Reichenbach y Höfle, 1993). Para facilitar el aislamiento del epotilon D, se añadió la resina XAD-16 al medio de cultivo. Debido a que el producto unido puede ser eluido fácilmente de la resina con un disolvente apropiado, la recuperación resultaba enormemente simplificada. Por otra parte, el uso de XAD-16 minimizaba la degradación del epotilon por medio de la estabilización del producto.
Myxococcus xanthus ha sido cultivado tradicionalmente en medios que constaban principalmente de productos hidrolizados enzimáticos de caseína, tales como peptona y casitona, contando con aminoácidos como única fuente de carbono y nitrógeno (Reichenbach y Dworkin, 1991). Por consiguiente, el amoníaco se acumula en el caldo de fermentación como resultado de la degradación de los aminoácidos. Gerth y col., (1986) demostraron que una concentración de amoníaco extracelular de 35-42 mM en un cultivo de Myxococcus virescens correspondía a una concentración sorprendentemente elevada de amoníaco de 80-140 mM dentro de las células. Muy importantemente, se demostró que eliminando continuamente el amoníaco en exceso hasta menos de 8 mM con un procedimiento de membrana in situ, tanto la masa celular como la producción de metabolito secundario aumentaban notablemente (Hecht, y col., 1990). Debido a que se especulaba que la generación de elevados niveles de amoníaco era inhibidora del crecimiento de M. xanthus y de la producción de epotilon D, era deseable una fuente de carbono alternativa para reducir el consumo de aminoácidos.
Aunque se requería un procedimiento de adaptación, se identificó el oleato de metilo a partir de un rastreo de diferentes aceites como sustrato que podía ser metabolizado por M. xanthus. Con la adición de una solución de elementos vestigiales exógena al medio de crecimiento, la producción de epotilon D se intensificaba 8 veces, con un rendimiento de 3,3 mg/litro en una fermentación de un sólo lote. Para optimizar el procedimiento adicionalmente, se adoptó un enfoque de alimentación por lotes utilizando alimentaciones intermitentes o continuas de casitona y oleato de metilo para prolongar la fase de producción de las células. En este ejemplo se informa sobre una comparación de los resultados obtenidos con las dos estrategias de alimentación diferentes.
Materiales y métodos Preparación de Inóculo
Para la producción de epotilon D en medios de cultivo sin oleato de metilo, se inoculó 1 ml de células congeladas de Myxococcus xanthus cepa K111-40.1 en glicerol al 20% (v/v) en 3 ml de medio CYE que constaba de 10 g/litro de casitona (Difco), 5 g/litro de extracto de levadura (Difco), 1 g/litro de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, y HEPES 50 mM, pH 7,6, en un tubo de cultivo de vidrio de 50 ml. La solución de tampón HEPES se tituló a pH 7,6 con hidróxido de potasio. Las células fueron inoculadas 30ºC y 175 rpm en un sacudidor rotatorio durante 3 días. Después se transfirieron a un matraz Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 50 ml de medio CYE y se hicieron crecer durante dos días en las mismas condiciones. El cultivo de siembra resultante se utilizó para inocular matraces de producción de 50 ml a un tamaño de inóculo del 5% (v/v).
Para el cultivo de M. xanthus en medios que contienen oleato de metilo, las células tenían que ser adaptadas al crecimiento en presencia del aceite. Se inoculó un vial de siembra de células congeladas en 3 ml de medio CYE que estaba suplementado con 3 \mul de oleato de metilo (Emerest 2301) (Cognis Corp.). Las células se hicieron crecer en un tubo de cultivo de vidrio durante 2-6 días a 30ºC y 175 rpm hasta que el cultivo fue lo suficientemente denso al microscopio. Después fueron transferidas a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 50 ml de medio CYE-MOM que constaba de 10 g/litro de casitona (Difco), 5 g/l de extracto de levadura (Difco), 1 g/litro MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 ml/litro de oleato de metilo, y HEPES 50 mM, pH 7,6. Al cabo de 2 días de crecimiento, las células fueron congeladas y almacenadas a -80ºC en forma de alícuotas de 1 ml en glicerol al 20% (v/v).
Para la producción de epotilon D en medio conteniendo oleato de metilo, se inoculó 1 ml de células adaptadas al aceite congeladas en 3 ml de medio CYE-MOM en un tubo de cultivo de vidrio. Las células fueron incubadas a 30ºC y 175 rpm durante 2 días y transferidas a un matraz Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 50 ml de medio CYE-MOM. El cultivo de siembra resultante se hizo crecer durante 2 días en las mismas condiciones y se utilizó para inocular matraces de producción de 50 ml a un tamaño de inóculo del 5% (v/v).
Al preparar el inóculo para las fermentaciones de 5 litros, se transfirieron 25 ml del cultivo de siembra adaptado al aceite a un matraz Fernbach de 2,8 litros conteniendo 475 ml de medio CYE-MOM. Las células se hicieron crecer a 30ºC y 175 rpm durante 2 días. Con posterioridad, se inocularon 250 ml de este segundo cultivo de siembra en fermentadores de 5 litros conteniendo 4,75 litros de medio de producción para rendir una concentración de inóculo final del 5% (v/v).
Producción en Matraz con Sacudimiento
Se prepararon cultivos por lotes de M. xanthus K111-40-1 en ausencia de oleato de metilo como sigue. Se sometió a autoclave un gramo de resina XAD-16 (Rohm and Haas) a 121ºC durante 30 minutos en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con 5 ml de agua desionizada. El agua en exceso fue separada después del matraz, y se añadieron 50 ml de medio CTS que constaba de 5 g/litro de casitona, 2 g/litro de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, y HEPES 50 mM, pH 7,6. Debido a que el proceso de autoclave de la resina adsorbente en presencia del medio de producción conducía a la unión de nutrientes esenciales requeridos por las células, la resina y los componentes del medio se esterilizaron por separado. Los matraces de producción fueron inoculados con 2,5 ml de cultivo de siembra e incubados a 30ºC y 175 rpm durante 6 días.
Los cultivos por lotes en presencia de oleato de metilo se prepararon como se ha descrito antes. Además, el medio de producción fue suplementado con 7 ml/litro de oleato de metilo y 4 ml/litro de una solución de elementos vestigiales esterilizada por filtración que estaba compuesta por 10 ml/litro de H_{2}SO_{4} concentrado, 14,6 g/litro de FeCl_{3}\cdot6H_{2}O, 2,0 g/litro de ZnCl_{3}, 1,0 g/litro de MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 0,43 g/litro de CuCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,31 g/litro de H_{3}BO_{3}, 0,24 g/litro de CaCl_{2}\cdot6H_{2}O, y 0,24 g/litro de Na_{2}MO_{4}\cdot2H_{2}O. Los matraces de producción fueron inoculados después con 2,5 ml del cultivo de siembra adaptado al aceite y se hizo crecer a 30ºC y 175 rpm durante 5 días.
Se prepararon cultivos de alimentación por lotes con alimentaciones intermitentes de casitona y oleato de metilo como sigue. Se sometió a autoclave un gramo de resina XAD-16 a 121ºC durante 30 minutos en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con 5 ml de agua desionizada. Tras la esterilización, el exceso de agua se separó del matraz, y se añadieron 50 ml de medio CTS suplementado con 2 ml/litro de oleato de metilo, 4 ml/litro de solución de elementos vestigiales, y HEPES 50 mM, pH 7,6. Los matraces de producción fueron inoculados con 2,5 ml de cultivo de siembra adaptado al aceite e incubados a 30ºC y 175 rpm. Dos días después de la inoculación, se añadieron 2 g/litro de casitona y 3 ml/litro de oleato de metilo al medio de cultivo a intervalos de 24 horas. La alimentación de la casitona se preparó en forma de una solución de 100 g/litro concentrada. Los cultivos se hicieron crecer durante 10-12 días hasta que se observó una lisis sustancial de las células.
Todos los cultivos de producción se pueden hacer crecer a una escala de 500 ml en matraces Fernbach de 2,8 litros en las mismas condiciones de crecimiento.
Producción del Fermentador
Se prepararon fermentaciones de alimentación por lotes a una escala de 5 litros con alimentaciones intermitentes y continuas de casitona y oleato de metilo como sigue. Se sometieron a autoclave 20 g/litro de XAD-16 y 2 g/litro de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O a 121ºC durante 30 minutos en un fermentador de 5 litros (B. Braun) con 4,75 litros de agua desionizada. Tras la esterilización, se añadieron una solución de casitona concentrada (150 g/litro), oleato de metilo, y elementos vestigiales al biorreactor asépticamente para lograr una concentración final de casitona, oleato de metilo, y elementos vestigiales de 5 g/litro, 2 ml/litro y 4 ml/litro, respectivamente. El medio fue inoculado después con 250 ml de cultivo de siembra adaptado a aceite. La fermentación se realizó a 30ºC con una tasa de aireación de 0,4-0,5 v/v/m y una agitación inicial de 400 rpm. El oxígeno disuelto se controló al 50% de saturación mediante una cascada de agitación entre 400-700 rpm. El pH de cultivo se mantuvo a 7,4 mediante la adición automatizada de KOH 2,5 N y H_{2}SO_{4} 2,5 M. Veinticuatro horas después de la inoculación, se añadieron casitona (150 g/litro) y oleato de metilo al medio de producción a una velocidad de alimentación de 2 g/litro/día de casitona y 3 ml/litro/día de oleato de metilo. Las alimentaciones fueron liberadas o bien en forma de bolo individual cada 24 horas o continuamente con bombas peristálticas (W. Marlow). Las células se dejaron crecer durante 10-12 días hasta que se observó una lisis celular considerable.
Cuantificación del Epotilon
Antes del uso de la resina XAD-16 en las fermentaciones, se tomaron muestras de 1 ml de caldo de cultivo de los matraces de producción o biorreactores y se centrifugaron a 13.000 g durante 10 minutos. La cuantificación de los productos de epotilon en el sobrenadante se llevó a cabo utilizando Hewlett Packard 1090 HPLC con detección de UV a 250 nm. Se inyectaron 500 microlitros del sobrenadante a través de una columna de guardia (Inertsil, ODS-3,5 \mum). Después se realizó una extracción en línea a una velocidad de flujo de 1 ml/min con un lavado con agua del 100% durante 0,5 minutos, seguido de un gradiente a acetonitrilo al 50% a lo largo de 1,5 minutos. El eluyente se desvió hacia el sobrante durante los dos primeros minutos y se hizo pasar sobre una columna de separación más larga (4,6 x 150 mm, Inertsil, ODS-3,5 \mum) después de eso. La separación de los epotilones C y D se realizó con un gradiente del 50% al 100% de acetonitrilo a lo largo de 8 minutos, seguido de un lavado con acetonitrilo al 100% durante 3 minutos. En estas condiciones, el epotilon C eluía a los 9,4 minutos y el epotilon D eluía a los 9,8 minutos.
Mediante el uso de la resina XAD-16, se tomaron muestras de 5-50 ml del caldo de cultivo y la resina bien mezclados de los matraces de producción o de los biorreactores. Una vez sellada la resina por gravedad, se decantó el caldo de cultivo. La resina se lavó con 5-50 ml de agua y se dejó sedimentar por gravedad de nuevo. La mezcla acuosa se eliminó completamente, y los productos de epotilon se extrajeron de la resina con metanol al 100%. La cantidad de disolvente utilizada era equivalente al 50% del volumen de la muestra. La cuantificación de los epotilones C y D se llevó a cabo mediante análisis de HPLC con detección de UV a 250 nm. Se inyectaron cincuenta microlitros del extracto de metanol a través de dos columnas de guardia de 4,6 x 10 mm (Inertsil, ODS-3,5 \mum) y una columna de 4,6 x 150 mm más larga (Inertsil, ODS-3,5 \mum). El método de análisis era isocrático, eluyendo con acetonitrilo al 60% y agua al 40% durante 18 minutos a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. En estas condiciones, se detectó el epotilon C a los 10,3 minutos y el epotilon D se detectó a los 13,0 minutos. Los patrones fueron preparados utilizando epotilon D purificado.
Determinación del Crecimiento Celular
Se controló el crecimiento celular en ausencia de oleato de metilo midiendo la densidad óptica (DO) a 600 nm. Las muestras fueron diluidas con agua hasta que los valores finales de DO fueron menores de 0,4. Debido a que la adición de oleato de metilo al medio de cultivo produce la formación de una emulsión que tiene una fuerte absorbancia a 600 nm, se determinó el crecimiento celular en presencia de oleato de metilo mediante el peso celular seco (PCS). Se centrifugaron cuarenta mililitros de caldo de cultivo a 4.200 g durante 20 minutos en tubos de ensayo pesados previamente. Los sedimentos fueron lavados después con 40 ml de agua y se secaron durante 2 días a 80ºC antes de pesarlos.
Determinación del Amoníaco
Se clarificó un mililitro de caldo de fermentación mediante centrifugación a 13.000 g durante 5 minutos. El sobrenadante fue utilizado para el análisis del amoníaco con un estuche para el análisis de amoníaco (Sigma). Las muestras fueron diluidas 20-100 veces con agua hasta que las concentraciones finales fueron menores de 880 \muM.
Determinación del Oleato de Metilo
Se extrajo el oleato de metilo residual en 1 ml de caldo de fermentación con 5 ml de acetonitrilo. La mezcla se sometió a vórtice y se clarificó mediante centrifugación a 4.200 g durante 20 minutos. La cuantificación del oleato de metilo se llevó a cabo mediante análisis HPLC con detección de UV a 210 nm. Se inyectaron cincuenta microlitros del sobrenadante a través de columnas de guardia de 4,6 x 10 mm (Inertsil, ODS-3,5 \mum) y una columna de 4,6 x 150 mm más larga (Inertsil, ODS-3,5 \mumm). La columna se lavó con acetonitrilo-agua (1:1) durante 2 minutos a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Después se hizo eluir a un gradiente de acetonitrilo del 50% al 100% a lo largo de 24 minutos, seguido de un lavado con acetonitrilo al 100% durante 5 minutos. Debido a la heterogeneidad de las longitudes de las cadenas carbonadas del oleato de metilo comercial, este compuesto se hizo eluir en forma de dos picos principales que fueron detectados a 25,3 minutos y 27,1 minutos. El oleato de metilo unido a la resina XAD-16 fue cuantificado a partir del extracto de metanol utilizando el mismo método de HPLC. Los patrones de oleato de metilo fueron preparados en acetonitrilo al 83,3%. El consumo de oleato de metilo por las células fue calculado como: (oleato de metilo total añadido) - (oleato de metilo residual en el medio) - (oleato de metilo unido a la resina).
Resultados
La cepa K111-40-1 de Myxococcus xanthus fue cultivada inicialmente en un procedimiento de fermentación por lotes con un medio de producción simple que constaba solamente de 5 g/litro de casitona (un producto de digestión de la caseína pancreática) y 2 g/litro de sulfato de magnesio. El funcionamiento de la línea base de las células se muestra en la Figura 6.
La densidad celular máxima y la producción del epotilon D fueron alcanzadas tres días después de la inoculación a una DO_{600} de 1,6 y un título correspondiente de 0,16 mg/litro. Tanto la densidad celular como el rendimiento de producto disminuían sustancialmente después de eso. Con el consumo de casitona por las células, también se detectaba una acumulación gradual de amonio en el medio de producción. La concentración de amoníaco final se aproximaba a 20 mM al final del día 5 después de la fermentación.
Efecto de XAD-16 sobre la estabilidad del producto
Para evitar la rápida degradación del epotilon D, la resina adsorbente hidrófoba, XAD-16, se añadió al medio de producción para que se uniera y estabilizara el producto excretado. La XAD-16 es una resina poliaromática que había sido utilizada previamente por Gerth y col. (1996) para el aislamiento de los epotilones A y B de las fermentaciones del productor microbiano, Sorangium cellulosum So ce90. Como se muestra en la Figura 7, la presencia de resina adsorbente no afectaba al crecimiento de las células. Sin embargo, reducía eficazmente la pérdida de epotilon D en el caldo de fermentación, que conducía a un aumento al triple en la recuperación de este producto.
Desarrollo del Medio
En un esfuerzo por desarrollar un medio que pueda soportar una densidad celular y una producción de epotilon mayores, se evaluó la influencia de la casitona sobre el crecimiento y el rendimiento de producto variando su concentración de 1 g/litro a 40 g/litro en el medio de producción. Aunque el crecimiento celular era estimulado con concentraciones crecientes de casitona, la productividad específica de las células declinaba significativamente, como se muestra en la Figura 8. La concentración óptima de casitona para la producción de epotilon D se alcanzó a 5 g/litro, con concentraciones superiores que dan como resultado títulos más bajos.
Debido a que las mejoras del medio estaban limitadas con el uso de la casitona, se evaluaron sustratos alternativos como suplementos para el medio de producción basal. A partir del rastreo detallado de diferentes aceites, se identificó el oleato de metilo como la fuente de carbono que promovía el mayor incremento en la producción de epotilon D, como se resume en la Tabla 3.
TABLA 3
Aceite (ml/litro) Producción de Epotilon D relativa al control sin
suplemento de aceite (%)
Oleato de Metilo 780
Oleato de Etilo 740
Aceite de Coco 610
Manteca 470
Oleato de Propilo 420
Aceite de Sésamo 380
Tri-oleato de Glicerol 370
Aceite de Ensalada 360
Aceite de Girasol 330
Aceite de Soja 290
Heptadecanoato de Metilo 190
Sin Aceite (Control) 100
Nonadecanoato de Metilo 96
Pelargonato de Metilo 40
Aceite de Colza 40
Sin embargo, la adición directa de oleato de metilo al medio de producción dio como resultado una lisis celular prematura. Por lo tanto, los cultivos de siembra se hicieron crecer en presencia de oleato de metilo antes de las fermentaciones de producción. Interesantemente, este procedimiento de adaptación volvía a las células menos susceptibles a la lisis. Como se muestra en la Tabla 4 (Mejoras en el Crecimiento y Producción en Comparación con el Funcionamiento en la Línea Base en Medio CTS en la Fermentación por Lotes), se lograron una concentración de biomasa pico de 2,1 g/litro y un título de epotilon D de 3,3 mg/litro con una concentración de oleato de metilo de 7 ml/litro y una concentración de elementos vestigiales de 4 ml/litro.
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TABLA 4
Condiciones de Fermentación Densidad Celular Máxima Producción de Epotilon D
(g PCS/litro) Máxima (mg/litro)
Medio CTS sin XAD-16 en un procedimiento por lotes 0,44\pm0,04 0,16\pm0,03
Medio CTS con XAD-16 en un procedimiento por lotes 0,44\pm0,04 0,45\pm0,09
Medio CTS con 7 ml/litro de oleato de metilo en un 1,2\pm0,1 0,12\pm0,02
procedimiento por lotes
Medio CTS con 7 ml/litro de oleato de metilo y 4 ml/litro 2,1\pm0,2 3,3\pm0,7
de elementos vestigiales en un procedimiento por lotes
Procedimiento de alimentación por lotes intermitente 6,3\pm0,6 9,8\pm2,0
Procedimiento de alimentación por lotes continuo 7,3\pm0,7 23\pm4,6
No se observaron mejoras del título adicionales a concentraciones de oleato de metilo superiores, como se muestra en la Figura 9.
Además de demostrar el significado del oleato de metilo sobre el crecimiento celular y la producción, el gráfico anterior también enfatiza la importancia de los elementos vestigiales en el medio de producción. Como anticipo de que los nutrientes suministrados por la casitona pueden no ser suficientes para el crecimiento vigoroso, se realizó una adición exógena de metales vestigiales junto con el oleato de metilo. Sorprendentemente, se encontró que este suplemento era esencial para el aumento tanto del crecimiento como de la producción. En su ausencia, la concentración de biomasa máxima y el título de epotilon D eran solamente de 1,2 g/litro y 0,12 mg/litro, respectivamente. Este título bajo era comparable con el obtenido con el medio basal.
Desarrollo de la Alimentación por Lotes
En presencia de concentraciones óptimas de oleato de metilo y elementos vestigiales en un procedimiento de fermentación por lotes, se producía el crecimiento exponencial de la cepa de M. xanthus durante los dos primeros días tras la inoculación. La producción de epotilon D se iniciaba al comienzo de la fase estacionaria y cesaba cuando se producía la lisis celular con el agotamiento del oleato de metilo el día 5, como se muestra en las Figuras 10A y 10B. También se muestra el transcurso de tiempo para el consumo de oleato de metilo y la generación de amoníaco. La concentración de amoníaco en el medio de producción era < 4 mM a lo largo del curso de la fermentación.
Para prolongar el período de producción de las células en los cultivos en matraz, se añadieron casitona y oleato de metilo al medio una vez al día a una velocidad de 2 g/litro/día y 3 ml/día, respectivamente. Las alimentaciones de sustrato fueron iniciadas 48 días después de la inoculación, y las células crecieron exponencialmente durante 3 días después de eso. Como se muestra en la Figura 11A, la concentración de biomasa comenzó a formar meseta el día 5 y alcanzó un máximo a 6,3 g/litro el día 10. De nuevo, la producción de epotilon D coincidió con la fase de crecimiento estacionario, y se logró un rendimiento final de 9,8 mg/litro al final del día 12. Como se muestra en la Figura 11B, tanto el consumo de oleato de etilo como la generación de amoníaco aumentaban a ritmos constantes a lo largo del curso de la fermentación.
El oleato de metilo se agotaba a la misma velocidad a la que se introducía en el reactor, y el amoníaco se acumulaba a una velocidad de 3,2 mM/día. Las velocidades de alimentación más bajas de casitona u oleato de metilo reducían enormemente el título de epotilon D, mientras las velocidades de alimentación más altas conducían a una lisis prematura de las células antes de lograr una producción significativa.
Para someter a ensayo la eficacia del procedimiento de alimentación por lotes a una escala mayor, se añadieron intermitentemente casitona y oleato de metilo a intervalos de 24 horas a una fermentación de 5 litros en un biorreactor. Como se muestra en la Figura 12, la curva de producción resultante se asemejaba mucho a la de los cultivos en matraz. Las alimentaciones de sustrato se iniciaron 24 horas después de la inoculación, y la producción de epotilon comenzó el día 4. Se obtuvo un título de epotilon D pico de 9,2 mg/litro diez días después de la inoculación.
Para evaluar el impacto de una estrategia de alimentación más refinada sobre el crecimiento y la producción, se liberaron dos alimentaciones duales continuamente en el reactor. Como se ilustra en la Figura 13A, la implementación de las alimentaciones continuas no afectaba al crecimiento de las células, pero incrementaba su productividad a casi el triple. Se logró un título de epotilon D final de 27 mg/litro 10 días después de la inoculación. Como se muestra en la Figura 13B, el oleato de metilo se consumía a la misma velocidad que se añadía al medio de producción, y el amoníaco se liberaba a una velocidad estacionaria de 6,4 mM/día a lo largo del curso de la fermentación.
Estudio
Aunque la síntesis química del epotilon D ha sido lograda recientemente (Harris y col., 1999; Meng y col., 1998; Sinha y col., 1998), el complejo método de 20 etapas no es un método económicamente viable para la producción a gran escala del compuesto. Si bien el rendimiento de producción inicial para el epotilon D en Myxococcus xanthus era de 0,16 mg/litro, los procedimientos de fermentación mejorados descritos aquí aumentaban sustancialmente el nivel de producción a 23 mg/litro.
Una de las principales barreras para lograr un título de epotilon D más elevado era la rápida degradación del producto en el caldo de fermentación. Este problema fue aliviado con la incorporación de una resina adsorbente al medio de cultivo. La adición de XAD-16 no afectaba al crecimiento de las células pero minimizaba la pérdida del producto excretado y aumentaba su recuperación al triple.
Otro obstáculo para intensificar el rendimiento de producción es la mejora limitada del título mediante el uso de casitona como fuente de carbono y nitrógeno primaria. Aunque el crecimiento de la cepa de M. xanthus era estimulado con concentraciones crecientes de casitona, una concentración que excediera de 5 g/litro producía un descenso espectacular en el título. Este efecto inhibidor de la producción del metabolito secundario a elevadas concentraciones de peptona o casitona ha sido demostrado previamente en otras diversas fermentaciones de myxobacterias y a sido atribuido a la acumulación de amoníaco en el medio de cultivo.
Debido a que M. xanthus es incapaz de metabolizar polisacáridos y azúcares (Reinchenbach y Dworkin, 1991), se examinó su capacidad para utilizar aceites como fuente de carbono. Los aceites son sustratos carbonados atractivos, debido a que la oxidación de ácidos grasos puede servir no solamente como fuente de energía para las células, sino que la formación de Acetil CoA como producto de degradación puede proporcionar también precursores para la biosíntesis de epotilon. Se ha demostrado que la adición de aceites a la fermentación de Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces fradine, y Streptomyces hygroscopicus intensifica la producción de moléculas de policétidos, tales como eritromicina, tilosina, y el inmunorregulador L-683590, respectivamente (Mirjalili y col., 1999; Choi y col., 1998; Junker y col., 1998).
A partir de un rastreo de diferentes aceites, se identificó el oleato de metilo como el candidato destacado para promover el crecimiento celular y la producción de epotilon D. Estas mejoras, no obstante, fueron observadas solamente con la adición simultánea de metales vestigiales al medio de producción. La única adición de oleato de metilo a 7 ml/litro incrementaba la densidad celular máxima de 0,4 g PCS/litro a 1,2 g PCS/litro, pero la producción permanecía en el nivel de la línea base. Con el suplemento exógeno de 4 ml/litro de elementos vestigiales, la concentración de biomasa pico aumentaba 2,1 g PCS/litro, y el título de epotilon D se reforzaba de 0,45 mg/litro a 3,3 mg/litro. Estos descubrimientos indican que los componentes nutricionales deficientes en casitona pueden ser importantes para el crecimiento de M. xanthus y la formación de epotilones.
Con el establecimiento de las concentraciones óptimas de oleato de metilo y elementos vestigiales para un procedimiento por lotes, se realizaron esfuerzos para desarrollar una estrategia de alimentación para mantener un crecimiento celular vigoroso y para prolongar el período de producción. Se evaluaron las alimentaciones intermitente y continua de casitona y oleato de metilo a velocidades constantes, y ambos métodos dieron como resultado mejoras similares en los perfiles de crecimiento. Con alimentaciones óptimas de los dos sustratos, se obtuvieron densidades celulares máximas de aproximadamente 6,8 g PCS/litro. En ambos casos, el oleato de metilo se agotaba a medida que era añadido al medio de fermentación.
En contraste con el crecimiento celular y el consumo de oleato de metilo, la producción de epotilon y la generación de amoníaco estaban muy influenciadas por la elección de la estrategia de alimentación. En el cultivo de alimentación por lotes continua, se obtenía un título de epotilon D pico de 23 mg/litro. Esto era casi 25 veces el título obtenido para el cultivo de alimentación por lotes intermitente. Con las alimentaciones continuas, la velocidad a la cual el amoníaco era liberado por las células era también dos veces más alta, sugiriendo una velocidad de consumo de casitona más elevada. Juntos, estos resultados indican que los título más bajos asociados con el procedimiento de alimentación por lotes intermitente pueden haber estado causados por la represión del catabolito y no por la acumulación de amoníaco. Por otra parte, sugieren que la productividad de la cepa de M. xanthus es sensible a la cantidad de sustratos presentes en el medio de cultivo y puede ser máxima en condiciones limitantes de sustrato. Esto también es coherente con la observación de que una concentración creciente de casitona en el medio de producción da como resultado densidades celulares más elevadas pero títulos más bajos.
En comparación con los cultivos por lotes con el medio basal, los cultivos de alimentación por lotes continua rendían un incremento de 17 veces en la densidad celular y un incremento de 140 veces en el título. Este procedimiento ha sido aumentado a escala de 5 litros a 1.000 litros y se ha demostrado que funciona equivalentemente. Los resultados mostrados para producir el epotilon D a escala industrial demuestran que se puede utilizar M. xanthus como huésped para la producción de otras moléculas biológicamente activas de myxobacterias.
Referencias
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B. Producción de Epotilon B Matraces
Se descongela un vial de 1 ml de la cepa K111-32-35 y el contenido es transferido a 3 ml de medio de siembra CYE en un tubo de vidrio. Este cultivo es incubado durante 72\pm12 horas a 30ºC, seguido de subcultivo de 3 ml de este tubo de cultivo en 50 ml de medio CYE en un matraz Erlenmeyer con pantalla. Este matraz con CYE es incubado durante 24\pm8 horas a 30ºC, y 2,5 ml de esta siembra (5% v/v) son utilizados para inocular los matraces de producción de epotilon (50 ml de medio CTS-TA en un matraz Erlenmeyer con pantalla de 250 ml). Estos matraces son incubados después a 30ºC durante 48\pm12 horas, con un pH del medio al principio de 7,4.
Fermentadores
Se utiliza una expansión del inóculo similar de K11-32-25 como se ha descrito antes, con la etapa adicional de que 25 ml de la siembra de 50 ml de CYE se subcultivan en 500 ml de CYE. Esta siembra secundaria se utiliza para inocular un fermentador de 10 litros que contiene 9,5 litros de CTS-TA, y 1 g/litro de piruvato de sodio. Los puntos de ajuste de los parámetros del procedimiento para esta fermentación son: pH - 7,4; agitación - 400 rpm; velocidad de rociado - 0,15 vvm. Estos parámetros eran suficientes para mantener la DO a más del 80% de saturación. El control del pH es proporcionado por la adición de ácido sulfúrico 2,5 N e hidróxido de sodio a los cultivos. Los títulos pico de epotilon se logran a las 48\pm8 horas.
C. Producción de Epotilon D Matraces
Un vial de 1 ml de la cepa K111-40-1 (descrito en el Ejemplo 4) se descongela y los contenidos se transfieren a un medio de siembra CYE de 3 ml en un tubo de vidrio. Este cultivo se incuba durante 72\pm12 horas a 30ºC, seguido de subcultivo de 3 ml de este cultivo en tubo en 50 ml de medio CYE en un matraz Erlenmeyer con pantalla de 250 ml. Este matraz CYE es incubado durante 48\pm8 horas a 30ºC, y se utilizan 2,5 ml de esta siembra (5% v/v) para inocular los matraces de producción de epotilon (50 ml de 1 x medio de gluten de trigo en un matraz Erlenmeyer con pantalla de 250 ml). Estos matraces son incubados después a 30ºC durante 48\pm12 horas, con un pH del medio al principio de 7,4.
Fermentadores
Se utiliza una expansión del inóculo similar de K11-40-1 como se ha descrito antes, con la etapa adicional de que 25 ml de la siembra de 50 ml de CYE se subcultivan en 500 ml de CYE. Se utilizan 250 ml de esta siembra secundaria para inocular un fermentador de 5 litros que contiene 4,5 litros de CTS-TA, con una alimentación diaria de 1 g/litro de piruvato de sodio. Los puntos de ajuste de los parámetros del procedimiento para esta fermentación son: pH - 7,4; agitación - 400 rpm; velocidad de rociado - 0,15 vvm. Estos parámetros eran suficientes para mantener la DO a más del 80% de saturación. El control del pH es proporcionado por la adición de ácido sulfúrico 2,5 N e hidróxido de sodio a los cultivos. Los títulos pico de epotilon se logran a las 36\pm8 horas. El título pico de epotilon C es de 0,5 mg/litro, y el título pico de epotilon D es de 1,6 mg/litro.
La Tabla 5 es un resumen de los medios que se utilizaron y sus respectivos componentes.
TABLA 5
Medio de Siembra CYE Componente Concentración
Casitona (Difco) 10 g/litro
Extracto de Levadura (Difco) 5 g/litro
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (EM Science) 1 g/litro
Tampón HEPES 50 mM
Medio de Producción CTS-TA Componente Concentración
Casitona (Difco) 5 g/litro
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (EM Science) 2 g/litro
L-alanina, L-serina, Glicina 1 mg/litro
Tampón HEPES 50 mM
Medio de Producción 1x Gluten de Trigo Componente Concentración
Gluten de Trigo (Sigma) 5 g/litro
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (EM Science) 2 g/litro
Tampón HEPES 50 mM
Los medios de siembra CYE y los medios de producción CTS-TA son esterilizados sometiéndolos a autoclave autoesterilizado durante 30 minutos a 121ºC. El medio de producción de gluten de trigo es esterilizado sometiéndolo a autoclave durante 45 minutos a 121ºC.
D. Producción de Epotilon C y D a partir de Myxococcus xanthus
En un aspecto, se puede proporcionar un procedimiento de fermentación mejorado para cepas de Myxococcus, incluyendo pero no limitadas a M. xanthus K111-40-1, en el cual el medio de fermentación proporciona fuentes de carbono que se pueden utilizar sin generación de amoníaco. La fuente de carbono puede ser un aceite, tal como oleato de metilo o un aceite similar. En los ensayos de matraces en sacudimientos con una variedad de proporciones de alimentación, estos métodos dan como resultado la producción de los epotilones C y D, predominantemente epotilon D, a niveles que oscilan de 15 a 25 mg/litro, como se describe más abajo.
Cultivo de Siembra
Se utilizó un vial de 1 ml congelado de M. xanthus K111-40-1 que se había hecho crecer en 50 ml de medio CYE con 2 ml/litro de oleato de metilo para inocular 3 ml de medio CYE de nueva aportación con 1 ml/litro de oleato de metilo en un tubo de vidrio estéril. El tubo fue incubado a 30ºC en un sacudidor a 250 RPM durante 24 horas. El inóculo del tubo de vidrio fue transferido después a un matraz sin pantalla de 250 ml que contenía 50 ml de medio CYE de nueva aportación con 2 ml/litro de oleato de metilo. El matraz fue incubado a 30ºC en un sacudidor a 250 RPM durante 48 horas.
Matraz de Producción
Se esterilizó 1 g de Amberlite XAD-16 en un matraz de 250 ml sin pantalla sometiéndolo a autoclave a 121ºC durante 30 minutos. Después se añadieron 50 ml de medio de producción estéril al matraz. El matraz fue inoculado con 5% (v/v) de cultivo de siembra y colocado en un sacudidor de incubadora que funcionaba a 250 RPM y 30ºC. Se inició una alimentación de 3 ml/litro/día de oleato de metilo estéril dos días después del momento de la inoculación, y se inició una alimentación de 2 g/litro/día de casitona un día después del momento de la inoculación.
Extracción del Producto
Al cabo de 14 días, la resina XAD del matraz de producción fue transferida a un tubo de centrífuga de 50 ml. El exceso de medio del tubo fue decantado sin eliminar nada de la resina. La resina XAD se lavó después con 25 ml de agua y se dejó sedimentar. El agua del tubo se decantó sin eliminar nada de la resina, y se añadieron al tubo 20 ml de metanol. El tubo de centrífuga se colocó en un sacudidor a 175 RPM durante 20-30 minutos para extraer los productos de epotilon de la resina. El extracto de metanol se transfirió a un nuevo tubo de centrífuga para el almacenamiento y el análisis LC/MS.
La Tabla 6 es un resumen de los medios que se utilizaron y de sus respectivos componentes.
TABLA 6
Medio CYE Componente Concentración
Casitona (Difco) 10 g/litro
Extracto de Levadura (Difco) 5 g/litro
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (EM Science) 1 g/litro
Medio de Producción Componente Concentración
Casitona (Difco) 5 g/litro
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (EM Science) 2 g/litro
Añadido al Medio tras Someter a Autoclave
1000x Elemento Vestigial 4 ml/litro
Oleato de metilo 2 ml/litro
El medio CYE y el medio de producción son esterilizados sometiéndolos a un autoclave autoesterilizado durante 30 minutos a 121ºC. La solución de elementos vestigiales es esterilizada por filtración; el oleato de metilo es sometido a autoclave por separado.
La solución de elementos vestigiales se elabora combinando todos los componentes de la Tabla 7, añadiendo 10 ml/litro de H_{2}SO_{4} concentrado a la solución y llevando el volumen final a 1 litro.
TABLA 7
Solución de Elementos Vestigiales 1000x Componente Concentración
FeCl_{3} 8,6 g/litro
ZnCl_{2} 2,0 g/litro
MnCl_{2}\cdot4H_{2}O 1,0 g/litro
CuCl_{2}\cdot2H_{2}O 0,43 g/litro
H_{3}BO_{3} 0,31 g/litro
CaCl_{2}\cdot6H_{2}O 0,24 g/litro
Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O 0,24 g/litro
La solución resultante se esteriliza por filtración.
E. Fermentación, Producción, y Purificación de Epotilones a partir de Myxococcus xanthus Descripción de cepas de M. xanthus
La cepa K111-25-1 es la cepa productora de epotilon B, que también produce epotilon A. La cepa K111-40-1 es la cepa productora de epotilon D, que también produce epotilon C.
Mantenimiento de M. xanthus en placas
Las cepas de M. xanthus son mantenidas en placas de agar CYE (ver la Tabla 8 para la composición de la placa). Las colonias aparecen aproximadamente 3 días después del rayado de la placa. Las placas son incubadas a 32ºC para un nivel deseado de crecimiento y después almacenadas a la temperatura ambiente hasta durante 3 semanas (el almacenamiento a 4ºC en placas puede destruir las células).
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TABLA 8
Placas Agar CYE^{\text*} Componente Concentración
Caseína hidrolizada (producto digestión 10 g/litro
pancreática)
Extracto de Levadura 5 g/litro
Agar 15 g/litro
MgSO_{4} 1 g/litro
Solución tampón MOPS 1 M (pH 7,6) 10 ml/litro
^{\text*} \begin{minipage}[t]{150mm} Los lotes de medios de agar de 1 litro son sometidos a autoclave durante 45 minutos, después vertidos en placas Petri. \end{minipage}
Adaptación al aceite de M. xanthus para Bancos Celulares
Transferir una colonia no adaptada al aceite de una placa CYE o un vial congelado de células a un tubo de cultivo de vidrio de 50 ml conteniendo 3 ml de medio de siembra y 1 gota de oleato de metilo de una pipeta de 100 \mul. Permitir que las células crezcan durante 2-6 días (30ºC, 175 rpm) hasta que el cultivo aparezca denso al microscopio. Iniciar varios (5-7) tubos en paralelo, ya que estas células no siempre se adaptan bien al aceite.
Procedimiento de Constitución del Banco Celular (Banco Celular Maestro)
Iniciar un cultivo en tubo adaptado al aceite como se ha descrito antes. Cuando el tubo de cultivo es suficientemente denso (DO = 5+/-1), transferir todo el contenido del tubo a un matraz con sacudimiento de 250 ml estéril conteniendo 50 ml de medio de siembra CYE-MOM (ver la tabla de más abajo para la composición del medio). Al cabo de 48 \pm^{} 12 horas de crecimiento en una incubadora con sacudimiento (30ºC, 175 rpm), transferir 5 ml de este cultivo de siembra a 100 ml de CYE-MOM en un matraz con sacudimiento de 500 ml. Permitir que este cultivo se desarrolle durante 1 día en una incubadora con sacudimiento (30ºC, 175 rpm). Verificar microscópicamente el cultivo en cuanto a un crecimiento apropiado y a la carencia de contaminación.
Combinar 80 ml de este cultivo de siembra y 24 ml de glicerol al 90% estéril en un matraz con sacudimiento de 250 ml estéril. Someter a torbellino hasta mezclar completamente, y formar alícuotas de 1 ml de esta mezcla en 100 crioviales premarcados, estériles. Congelar lentamente los viales colocándolos en un congelador a -80ºC.
Procedimiento de Constitución del Banco Celular (Banco Celular de Trabajo)
Iniciar un cultivo en tubo descongelando uno de los viales del banco celular maestro producido como se ha descrito antes a la temperatura ambiente, depositando después todo su contenido en un tubo de vidrio conteniendo 3 ml de medio de siembra CYE-MOM. Cuando este tubo de cultivo esté suficientemente denso (DO = 5+/-1), transferir todo el contenido del tubo a un matraz con sacudimiento de 250 ml estéril conteniendo 50 ml de medio de siembra CYE-MOM. Al cabo de 48 \pm 12 horas de crecimiento (a 30ºC, 175 rpm), transferir 5 ml de este cultivo de siembra a 100 ml de CYE-MOM en un matraz con sacudimiento de 500 ml. Permitir que esto se desarrolle durante 1 día (30ºC, 175 rpm). Verificar microscópicamente el crecimiento y la contaminación.
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Combinar 80 ml de este cultivo de siembra y 24 ml de glicerol al 90% estéril en un matraz con sacudimiento de 250 ml estéril. Someter a torbellino hasta mezclar completamente, y formar alícuotas de 1 ml de esta mezcla en 100 crioviales premarcados, estériles. Congelar lentamente los viales colocándolos en un congelador a -80ºC.
Composición de los Medios de Siembra
Se utiliza el mismo medio de siembra descrito en la Tabla 9 para la constitución del banco celular y la expansión de los viales del banco celular hasta cualquier volumen requerido.
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TABLA 9
Medio de Siembra CYE-MOM^{*} Componente Concentración
Caseína hidrolizada (producto de digestión 10 g/litro
pancreática)
Extracto de Levadura - Difco 5 g/litro
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O - EM Science 1 g/litro
Oleato de Metilo - Cognis 2 ml/litro
^{\text*} \begin{minipage}[t]{150mm} Nota: el oleato de metilo se añade después de los otros ingredientes, ya que forma una emulsión en la casitona y no se mezcla completamente con los otros componentes. \end{minipage} 
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Aumento a Escala del Inóculo para el Matraz con Sacudimiento, y Fermentaciones de 5 litros, y 1.000 litros
Descongelar un vial del banco celular de trabajo de las células adaptadas al oleato de metilo. Transferir todo el contenido del vial a un tubo de vidrio de 50 ml, conteniendo 3 ml del medio de siembra CYE-MOM. Colocar el tubo en un aparato de sacudimiento (30ºC, 175 rpm), y hacer crecer durante 48 \pm 24 horas. Transferir todo el contenido del tubo de cultivo a un matraz de 250 ml con sacudimiento conteniendo 50 ml de medio de siembra CYE-MOM. Colocar el matraz en un aparato de sacudimiento (30ºC, 175 rpm) y hacer crecer durante 48 \pm 24 horas. Para el uso en los experimentos con matraces con sacudimiento, expandir esta siembra subcultivando 10 ml de este cultivo en 40 ml de CYE-MOM de nueva aportación en 5 matraces de siembra nuevos. Incubar las matraces de siembra en un aparato de sacudimiento (30ºC, 175 rpm) durante 24 \pm 12 horas para su uso como inóculo para cultivos de producción del volumen de un matraz (30 - 100 ml). Inocular los matraces de producción al 4,5% del volumen inicial combinado (medios de siembra y producción).
Para preparar siembras para fermentaciones a pequeña escala (5 - 10 litros), subcultivar todo el contenido de uno de estos matraces de 50 ml en un matraz Fernbach de 2,8 litros estéril conteniendo 500 ml de CYE-MOM. Incubar este matraz Fernbach en un aparato de sacudimiento (30ºC, 175 rpm) durante 48 \pm 24 horas para su uso como inóculo fermentador. Inocular la fermentación de producción a aproximadamente el 5% del volumen inicial
combinado.
Se requiere una expansión de siembra adicional para las fermentaciones a gran escala (1.000 litros). Aquí, se utiliza 1 litro de siembra del matraz Fernbach para inocular (5% en volumen) un fermentador de siembra de 10 litros conteniendo 9 litros de CYE-MOM. El pH del fermentador está controlado a 7,4 mediante la adición de hidróxido de potasio 2,5 N y ácido sulfúrico 2,5 N. La temperatura se ajusta a 30ºC. El oxígeno disuelto se mantiene al 50% o más de saturación mediante el ajuste en cascada de la velocidad de agitación entre 400 - 700 rpm. La velocidad de agitación inicial se ajusta a 400 rpm, y la velocidad de pulverización se mantuvo a 0,1 v/v/m. Al cabo de 24 \pm 12 horas de crecimiento en un fermentador de 10 litros, todo el cultivo es transferido a un fermentador de 150 litros conteniendo 90 litros de CYE-MOM. El pH es controlado una vez más a 7,4 con hidróxido de potasio 2,5 N y ácido sulfúrico 2,5 N. La temperatura se ajusta a 30ºC. El oxígeno disuelto se mantiene al 50% o más de saturación mediante el ajuste en cascada de la velocidad de agitación entre 400 - 700 rpm. La velocidad de agitación inicial se ajusta a 400 rpm, y la velocidad de pulverización se mantiene a 0,1 v/v/m.
Ejemplo 4 Construcción de una cepa de Myxococcus con un Gen epoK No funcional
Se construyó la cepa K111-40-1 a partir de la cepa K111-32-25 mediante inactivación por inserción del gen epoK. Para construir este mutante del gen epoK, se insertó una casete de resistencia a la kanamicina en el gen epoK. Esto se realizó aislando el fragmento de 4.879 pb de pKOS35-79.85, que contiene epoK, y ligándolo en el sitio NotI de pBluescriptSKII+. Este plásmido, pKOS35-83.5, fue parcialmente escindido con ScaI, y el fragmento de 7,4 kb fue ligado con el fragmento EcoRI-BamHI de 1,5 kb conteniendo el gen de resistencia a la kanamicina de pBJ180-2, cuyos extremos de ADN se habían vuelto romos con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, para rendir el plásmido pKOS90-55. Finalmente, el fragmento RP4 oriT de \sim 400 pb de PBJ183 fue ligado en los sitios XbaI y EcoRI para crear pKOS90-63. Este plásmido fue linealizado con DraI y sometido a electroporación en la cepa K111-32.25 de Myxococcus xanthus, y los transformantes fueron seleccionados para proporcionar la cepa K111-40.1. La cepa K111-40.1 fue depositada en cumplimiento del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209, USA el 21 de Noviembre de 2000, y es asequible con el Número de Acceso
PTA-2712.
Para crear una mutación epoK sin marcador, se escindió pKOS35-83.5 con ScaI y los fragmentos de 2,9 kb y 4,3 kb se ligaron entre sí. Este plásmido, pKOS90-101, tiene una deleción en marco en epoK. A continuación, el fragmento BamHI y NdeI de KG2 de 3 kb, cuyos extremos de ADN se habían vuelto romos con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I y que contiene los genes de resistencia a la kanamicina y galK, se ligó en el sitio DraI de pKOS90-101 para crear pKOS90-105. Este plásmido fue sometido a electroporación en K111-32.25 y se seleccionaron los electroporantes resistentes a la kanamicina. Para remplazar la copia de tipo salvaje de epoK por la deleción, se seleccionó el segundo evento de recombinación mediante crecimiento en placas de galactosa. Estas colonias resistentes a la galactosa se someten a ensayo en cuanto a la producción de epotilon C y D, y la cepa productora se designa K111-72.4.4 y se deposita en cumplimiento del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209, USA el 21 de Noviembre de 2000, y es asequible con el Número de Acceso
PTA-2713.
Ejemplo 5 Adición de matBC
Los genes matBC codifican una malonil-CoA sintetasa y una proteína portadora de dicarboxilato, respectivamente. Ver An y Kim, 1998, Eur. J. Biochem. 257:395-402. Estas dos proteínas son responsables de la conversión del malonato exógeno en malonil CoA en el interior de la célula. Los productos de los dos genes pueden transportar ácidos dicarboxílicos y convertirlos en derivados de CoA (ver la solicitud de patente PCT Núm. US00/28573). Estos dos genes pueden ser insertados en el cromosoma de Myxococcus xanthus para incrementar las concentraciones celulares de malonil-CoA y metilmalonil-CoA para incrementar la producción de policétidos. Esto se logra escindiendo pMATOP-2 con BglII y SpeI y ligándolo en los sitios BglII y SpeI de pKOS35-82.1, que contiene el gen que confiere resistencia a la tetraciclina, el sitio att de Mx8 y el promotor pilA de M. xanthus para conducir la expresión de matBC. Este plásmido puede ser sometido a electroporación en M. xanthus. Debido a que el promotor pilA es altamente transcrito, puede ser necesario insertar un promotor más débil en el evento ya que demasiado MatB y MatC afectan al crecimiento celular. Entre los promotores alternativos se incluye el promotor del gen que confiere resistencia a la kanamicina.
Ejemplo 6 Producción de Análogos de Epotilon A. Producción de Análogos de 13-ceto-epotilon
La inactivación del dominio KR en un módulo propagador 4 de la PKS del epotilon produce una PKS híbrida de la invención útil en la producción de 13-ceto-epotilones. El dominio KR del módulo propagador 4 fue modificado remplazando el gen de tipo salvaje por diversas versiones con supresiones como se describe más abajo. Primero, los fragmentos fueron amplificados utilizando el plásmido pKOS39-118B (un subclon del gen epoD del cósmido pKOS35-70.4) como molde. Los cebadores oligonucleotídicos para formar el lado izquierdo de la deleción eran TL3 y TL4, mostrados más abajo:
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TL3: 5'-ATGAATTCATGATGGCCCGAGCAGCG; y
TL4: 5'-ATCTGCAGCCAGTACCGCTGCCGCTGCCA.
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Los cebadores oligonucleotídicos para formar el lado derecho de la deleción eran TL5 y TL6, mostrados más abajo:
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TL5: 5'-GCTCTAGAACCCGGAACTGGCGTGGCCTGT; y
TL6: 5'-GCAGATCTACCGCGTGAGGACACGGCCTT.
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Los fragmentos de la PCR fueron clonados en el vector Litmus 39 y secuenciados para verificar que se habían obtenido los fragmentos deseados. Después, el clon que contenía el fragmento TL3/TL4 fue digerido con las enzimas de restricción PstI y BamHI, y el fragmento de \sim4,6 kb fue aislado. El fragmento de la PCR de 2,0 kb obtenido utilizando los cebadores TL5/TL6 fue tratado con las enzimas de restricción BglII y XbaI y después ligado o bien a (i) cualquiera de los conectores KR "cortos" TL23 y TL24 (que son recocidos juntos para formar un conector de doble hebra con salientes de hebra sencilla) para rendir pKOS122-29; o (ii) el conector "largo" (epoDH3^{\text*}), obtenido mediante PCR utilizando los cebadores TL33+TL34 y después tratamiento con las enzimas de restricción NsiI y SpeI, para rendir el plásmido pKOS122-30. Las secuencias de estos conectores oligonucleotídicos y cebadores se muestran más abajo:
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TL23: 5'-GGCGCCGGCCAAGAGCGCCGCGCCGGTCGGCGGGCCAGCCGGGGACGGGT;
TL24: 5'-CTAGACCCGTCCCCGGCTGGCCCGCCGACCGGCGCGGCGCTCTTGGCCGGCGCCTGCA;
TL33: 5'-GGATGCATGCGCCGGCCGAAGGGCTCGGA; y
TL34: 5'-TCACTAGTCAGCGACACCGGCGCTGCGTTT.
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Los plásmidos que contienen la sustitución deseada fueron confirmados mediante secuenciación y después digeridos con la enzima de restricción DraI. Después, el fragmento grande de cada clon fue ligado con la casete del gen de resistencia a la kanamicina y galK (KG o kan-gal) para proporcionar los plásmidos de liberación. Los plásmidos de liberación fueron transformados en Myxococcus xanthus K11-32.25 productor de epotilon B mediante electroporación. Los transformantes fueron rastreados y los supervivientes sensibles a la kanamicina, resistentes a la galactosa fueron seleccionados para identificar los clones que tenían los genes KG suprimidos. La confirmación de la eliminación de KG y la reposición del gen deseado para las cepas recombinantes fue realizada mediante PCR. Las cepas recombinantes fueron fermentadas en matraces con 50 ml de medio CTS y XAD-16 al 2% durante 5 días, y los análogos de epotilon se hicieron eluir de XAD con 10 ml de metanol. La determinación de la estructura se basó en el espectro LC/MS y en la RMN. Una de tales cepas, denominada K122-56, fue depositada en la American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209, USA el 21 de Noviembre de 2000, bajo los términos del Tratado de Budapest y es asequible con el Número de Acceso PTA-2714. La cepa K122-56 (derivada del plásmido pKOS122-29) produce 13-ceto-11,12-deshidro-epotilon D como producto principal cuya estructura se muestra más abajo
5
La cepa K122-56 también produce 13-ceto-epotilones C y D como productos minoritarios cuyas respectivas estructuras se muestran más abajo
6
Se obtuvieron resultados similares a partir de la cepa K122-30, derivada del plásmido pKOS122-30. Estos compuestos y las cepas y enzimas PKS que las producen son compuestos, cepas, y enzimas PKS novedosos.
Entre otras cepas que producen los 13-ceto-11,12-deshidroepotilones se incluyen aquellos en los cuales el dominio KR se vuelve inactivo mediante una o más mutaciones puntuales. Por ejemplo, la mutación del resto tirosina del dominio KR a fenilalanina produce un descenso de aproximadamente el 10% en la actividad de la KR y da como resultado cierta producción de 13-ceto-epotilones. Las mutaciones adicionales del dominio KR pueden eliminar más o toda la actividad KR pero también pueden conducir a un descenso de la producción de epotilon.
B. Producción de Análogos de 13-hidroxi-epotilon
La reposición de los dominios KR, DH, y ER del módulo propagador 5 de la PKS del epotilon por un dominio KR heterólogo, tal como el dominio KR del módulo propagador 2 de la PKS de rapamicina o el módulo propagador 3 de la PKS de FK520, produce una PKS híbrida útil en la producción de 13-hidroxi-epotilones. Esta construcción se lleva a cabo de una manera similar a la descrita en la parte A de este ejemplo. Los cebadores oligonucleotídicos para amplificar las porciones deseadas del gen epoD, utilizando el plásmido pKOS39-118B como molde, fueron:
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TL7: 5'-GCGCTCGAGAGCGCGGGTATCGCT;
TL8: 5'-GAGATGCATCCAATGGCGCTCACGCT;
TL9: 5'-GCTCTAGAGCCGCGCGCCTTGGGGCGCT; y
TL10: 5'-GCAGATCTTGGGGCGCTGCCTGTGGAA.
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El fragmento de la PCR generado a partir de los cebadores TL7/TL8 fue clonado en el vector LITMUS 28, y el clon resultante fue digerido con las enzimas de restricción NsiI y BglII, y el fragmento de 5,1 kb fue aislado y ligado con el fragmento de la PCR de 2,2 kb generado a partir de TL9/TL10 tratado con las enzimas de restricción BglII y XbaI y ligado a las casetes de KR. La casete de KR de la PKS de FK520 fue generada mediante PCR utilizando los cebadores TL31 y TL32 y después digestión con las enzimas de restricción XbaI y PstI. Estos cebadores se muestran más abajo:
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TL31: 5'-GGCTGCAGACCCAGACCGCGGGCGACGC; y
TL32: 5'-GCTCTAGAGGTGGCGCCGGCCGCCCGGCG.
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El resto de la construcción de la cepa continuaba de una manera análoga a la descrita en la parte A de este Ejemplo, excepto que se utilizó como receptor Myxococcus xanthus K111-72.4.4. La cepa en la cual el dominio KR del módulo propagador 3 de la PKS de FK520 remplazaba los dominios KR, DH, y ER del módulo propagador 5 de la PKS del epotilon fue denominada K122-148 y depositada en la American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209, USA el 21 de Noviembre de 2000, bajo los términos del Tratado de Budapest y es asequible con el Número de Acceso PTA-2711. La cepa K122-148 produce 13-hidroxi-10,11-deshidro-epotilon D como producto principal y el derivado C como producto minoritario cuyas estructuras se muestran más abajo
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7 
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Una cepa similar, denominada K122-52, en la cual se utilizaba el dominio KR del módulo propagador 2 de la PKS de la rapamicina para la reposición, producía los mismos compuestos. Estos compuestos y las cepas y enzimas de PKS que los producen son compuestos, cepas, y enzimas de PKS novedosos de la invención.
I. Producción de Epotilones de Contienen Oxazol por Fermentación
Se puede proporcionar un método para obtener los epotilones que contienen oxazol (en los cuales el radical tiazol del epotilon correspondiente es remplazado por oxazol) fermentando una cepa productora de epotilon, tal como Sorangium cellulosum o una cepa de Myxococcus descrita aquí, en medio suplementado con L-serina.
Para ilustrar este aspecto, se fermenta un cultivo de Myxococcus xanthus cepa K111-40.1 o K111-72.4.4 según los métodos del Ejemplo 3, excepto que la L-serina está presente a 11x, 51x, 101x, y 201x la concentración de serina basal en el medio por lotes (2,3 mM). Los cultivos de 50 ml que contienen el medio por lotes contienen por tanto: 20 g/litro de XAD-16; 5 g/litro de casitona; 2 g/litro de MgSO_{4}; 7 ml/litro de oleato de metilo; y 4 ml/litro de solución de metales vestigiales, y se añade una concentración apropiada de solución 1,25 M esterilizada por filtración de L-serina. Los títulos por lote observados en el medio basal eran: Epo C: 0,4 mg/litro, Epo D: 2 mg/litro, Epo H1 (el análogo C del oxazol): No detectable, y Epo H2 (el análogo D del oxazol): 0,02 mg/litro. Aumentando la concentración de serina disminuían las concentraciones de epoC y epoD (casi hasta niveles no detectables con un suplemento de 51x). En ese caso, los títulos por lotes con un suplemento del 51x de L-serina en medio basal eran: Epo C: 0,03 mg/litro, Epo D: 0,05 mg/litro, Epo H1: 0,12 mg/litro, y Epo H2: 0,13 mg/litro. Un protocolo de alimentación por lotes podría incrementar los títulos observados aproximadamente 10 veces.
J. Construcción de Análogos de Epotilon
Los epotilones y derivados de epotilones pueden ser producidos mediante enzimas PKS de epotilones recombinantes en las cuales (i) la especificidad del módulo propagador 1 NRPS ha sido cambiada de cisteína a otro aminoácido; (ii) el dominio de carga ha sido cambiado a NRPS o CoA ligasa; o (iii) tanto (i) como (ii). En este ejemplo se describe cómo se construyen semejantes enzimas PKS de epotilones recombinantes; las referencias citadas en este ejemplo se enumeran al final de este ejemplo y son referidas en el texto por un número de cita.
Los epotilones contienen el aminoácido cisteína que ha sido ciclado y oxidado para formar el tiazol. Otros dos aminoácidos, serina y treonina, pueden experimentar una ciclación y oxidación similares para rendir un oxazol y un metiloxazol, respectivamente. Por ejemplo, los derivados oxazol y metiloxazol del epotilon D se muestran más abajo
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Para construir análogos de epotilones con el oxazol o el metiloxazol, se puede realizar el diseño del módulo propagador 1, el módulo NRPS. Los módulos NRPS que prolongan una molécula en crecimiento están compuestos mínimamente por un dominio que activa el aminoácido, el dominio de adenilación, un dominio PCP o de proteína portadora de peptidilo, que traba el aminoácido al NRPS, y un dominio de condensación, que condensa el aminoácido con un grupo carboxilo de la molécula en crecimiento para formar un enlace peptídico (5,7). La secuencia de reconocimiento para determinar la especificidad del aminoácido se encuentra dentro del dominio de adenilación, específicamente entre la secuencia consenso A4 y A5 (4). El análisis de la región ha demostrado que se pueden predecir aminoácidos clave en esta región de la proteína cuyo aminoácido será utilizado por la NRPS (2,8). Se han realizado experimentos que intercambian la región de adenilación NRPS completa por la de otra, lo que produce una NRPS híbrida que tiene la especificidad del aminoácido del nuevo dominio de adenilación (6,9). No se ha informado sobre experimentos en los que se utilizan regiones más pequeñas de la región de adenilación, por ejemplo una entre la secuencia consenso A4 y A5. En una realización, se construye una PKS híbrida de la invención remplazando la región entre la región consenso A4 y A5 del dominio de adenilación de epoB por aquellas de vibF y blmVII, que utiliza treonina, y por una región NRPS-4 de blmVI de la agrupación génica de la bleomicina, que utiliza serina (3).
Experimentos recientes sugieren que el dominio de condensación puede ser capaz de detectar si se ha anclado un aminoácido incorrecto a PCP (1). Una vez que se ha detectado un aminoácido incorrecto la eficacia de la reacción de condensación se reduce. Para evitar esto, además de intercambiar el dominio de adenilación, también se puede conseguir el dominio de condensación afín para cambiar la especificidad del dominio de adenilación y diseñar una NRPS totalmente activa.
Se pueden proporcionar enzimas PKS de epotilones recombinantes que producen los 16 derivados desmetilados de las formas oxazol y metiloxazol del epotilon. Tales enzimas son construidas cambiando el dominio AT del módulo propagador 2, epoC, de específico de metilmalonilo a específico de malonilo. Entre los dominios AT que pueden ser utilizados para realizar los constructos se incluyen aquellos del módulo propagador 5 y 9 de la agrupación del epotilon y de los módulos propagadores 2 y 4 de la agrupación génica del sorafeno.
Se pueden proporcionar enzimas PKS recombinantes en las cuales la proteína EpoA ha sido remplazada por una NRPS. Se pueden producir epotilones novedosos por medio de tales enzimas. La biosíntesis del epotilon comienza mediante la carga del malonato en la ACP del módulo de carga, EpoA. Este malonato es descarboxilado con posterioridad por el dominio KS y después transferido en forma de un radical acetilo a EpoB, el módulo NRPS. Una vez que la molécula se ha hecho actuar por medio de EpoB, el compuesto resultante es 2-metiltiazol.
Para elaborar análogos que tengan un aminoácido anclado a la posición 2 del tiazol, son necesarias la deleción de epoA y la inserción de un módulo NRPS. Se puede utilizar cualquier módulo NRPS; sin embargo, para realizar el cambio más conservativo, se puede emplear un módulo NRPS para remplazar epoA que comunica naturalmente con un módulo NRPS aguas abajo. Por otra parte, debido a que la NRPS que remplaza epoA es el módulo de carga, éste no necesita un dominio de condensación. Esto se puede realizar tomando un módulo NRPS propagador y eliminando el dominio de condensación o utilizando una NRPS que sea naturalmente un módulo de carga y de ese modo carezca del dominio de condensación. Un módulo de carga NRPS ilustrativo es uno de safB, que utiliza alanina y es de M. xanthus.
Al construir cepas de M. xanthus que contienen el módulo de carga safB en lugar de epoA, se pueden determinar los límites óptimos para el nuevo módulo de carga y epoB. La región conectora entre las proteínas de PKS a menudo es crítica para la "comunicación" entre esas proteínas. Se pueden construir tres cepas diferentes para examinar el conector óptimo. En el primero, el dominio ACP de epoA es fusionado al dominio de adenilación del dominio de carga de safB. Este constructo requiere que la ACP de EpoA funcione como un PCP. Aunque los dominios PCP y ACP son funcionalmente similares, no muestran una elevada identidad de secuencia y de ese modo pueden estar restringidos en función de lo que pueden reconocer y unir. El segundo constructo se fusiona a los últimos aminoácidos de EpoA aguas abajo del dominio PCP del módulo de carga SafB, proporcionando de ese modo la región conectora necesaria para que el módulo de carga del híbrido se "comunique" con EpoB. Finalmente, se construirá un módulo de carga de SafB con EpoB. Debido a que SafB está compuesto por dos módulos, es posible tomar todo el módulo de carga de SafB y fusionarlo directamente a EpoB para dar una proteína de fusión, que deberá ser óptimo para la comunicación entre el módulo de carga SafB y EpoB.
Una vez que SafB o cualquier otro dominio NRPS de carga ha sido utilizado para remplazar el 2-metilo del tiazol del epotilon por un aminoácido, se pueden realizar cambios en el nuevo módulo NRPS de carga de manera que cualquier aminoácido pueda ser utilizado para iniciar la síntesis de los análogos de epotilon. Challis y col., (2) proporcionan una lista completa de los aminoácidos potenciales y sus correspondientes módulos NRPS que podrían ser utilizados para estos intercambios.
Todas las reposiciones pueden ser realizadas en K111-32.25, la cepa de M. xanthus que contiene los genes del epotilon, o K111-40-1, la cepa de M. xanthus que contiene los genes de los epotilones y en la cual el gen epoK no produce un producto funcional, o cualquier otra cepa productora de epotilon de la invención o en Sorangium cellulosum. En Myxococcus, se pueden elaborar los constructos apropiados sobre plásmidos, y, utilizando la selección galK y de kanamicina, usarlos para remplazar los genes de tipo salvaje por los diseñados genéticamente. Por ejemplo, se espera que una reposición de NRPS en K111-40-1 con una NRPS específica para serina constituya el derivado 2-metil-oxazol del epotilon D y el derivado 2-metiloxazol del epotilon C como productos principal y minoritario respectivamente. La estructura de estos compuestos se muestra más abajo.
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Se espera que la reposición de la NRPS en K111-40-1 con una NRPS específica para treonina constituya los siguientes compuestos y los productos principal y minoritario respectivamente
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Se espera que la reposición de NRPS en K111-40-1 con una NRPS específica para glicina, alanina, ácido glutámico, ácido aspártico, fenilalanina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, asparragina, glutamina, arginina, valina, y tirosina constituyan los siguientes compuestos como productos principales y minoritarios respectivamente
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donde R' corresponde a la cadena lateral específica del aminoácido (por ejemplo, R' es H en la fórmula general del aminoácido NH_{2}-CHR'COOH para glicina y es metilo para la alanina y así sucesivamente).
Se espera que la reposición de la NRPS en K111-40-1 por una NRPS específica para prolina constituya los siguientes compuestos como productos principal y minoritario respectivamente
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Las referencias citadas en esta subsección son las siguientes:
1. Belshaw y col. 1999. Aminoacyl CoAs as probes of condensation domain selectivity in nonribosomal peptide synthesis Science. 284:486-9.
2. Challis y col. 2000. Predictive, structure-based model of amino acid recognition by nonribosomal peptide synthetase adenylation domains Chem Biol. 7:211-24.
3. Du y col. 2000. The biosynthetic gene cluster for the antitumor drug bleomycin from Streptomyces verticillus ATCC15003 supporting functional interactions between nonribosomal peptide sinthetases and a polyketide synthase Chem Biol. 7:623-42.
4. Konz y col. 1999. How do peptide synthetases generate structural diversity? Chem Biol. 6:R39-43.
5. Marahiei y col. 1997. Modular peptide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis Chem. Rev. 97:2651-2673.
6. Schneider y col. 1998. Targeted alteration of the substrate specificity of peptide synthetases by rational module swapping Mol Gen Genet. 257:308-18.
7. Stachelhaus y col. 1995. Modular structure of peptide synthetases revealed by dissection of the multifunctional enzyme GrsA J Biol Chem: 270:6163-9.
8. Stachelhaus y col. 1999. The specificity-conferring code of adenylation domains in nonribosomal peptide synthetases Chem Biol. 6:493-505.
9. Stachelhaus y col. 1995. Rational design of peptide antibiotics by targeted replacement of bacterial and fungal domains Science. 269:69-72.
Ejemplo 7 Derivados de Oxazol
En este ejemplo se describe la modulación de los tipos de compuestos de epotilon producidos por las células huésped utilizando las condiciones de fermentación. Suplementando las células huésped con serina en exceso, los compuestos producidos normalmente por las células huésped son modulados de tal manera que favorezcan la producción de las contrapartes de oxazol. Por ejemplo, se puede hacer que las células que producen predominantemente un compuesto o compuestos de fórmula V favorezcan la producción de las contrapartes de oxazol correspondientes a los compuestos de fórmula VI.
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donde:
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{5}, R^{11}, y R^{12} son cada uno independientemente hidrógeno, metilo o etilo;
R^{4}, R^{6} y R^{9} son cada uno independientemente hidrógeno, hidroxilo, o oxo; alternativamente
R^{5} y R^{6} forman juntos un doble enlace carbono-carbono;
R^{7} es hidrógeno, metilo, o etilo;
R^{8} y R^{10} son ambos hidrógeno o forman juntos un doble enlace carbono-carbono o un epóxido;
Ar es arilo; y,
W es O o NR^{13} donde R^{13} es hidrógeno, alifático C_{1}-C_{10}, arilo o alquilarilo. En otra realización, se proporcionan compuestos de fórmula I donde R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8}, R^{9}, R^{10}, R^{11}, R^{12}, R^{13}, Ar y W se describen como antes siempre que al menos uno de R^{1}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, R^{9} y R^{11} no sea hidrógeno.
En una realización, M. xanthus cepa K11-40-1, se constituye una cepa que elabora predominantemente los epotilones C y D para incrementar significativamente la producción de los epotilones H_{1} y H_{2}, las contrapartes de oxazol para los epotilones C y D. La cepa K111-40-1 (PTA-2712) fue depositada en la American Type Culture Collection "ATCC"), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110.2209 USA el 21 de Noviembre de 2000. La cepa K111-40-1 se hizo crecer en medio que se había suplementado o no se había suplementado con serina adicional. Las concentraciones de los componentes en el medio no suplementado eran: caseína hidrolizada (producto de la digestión pancreática, adquirido de Difco bajo el nombre comercial Casitona), 5 g/litro; MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 g/litro; XAD-16, 20 g/litro; solución de elementos vestigiales 4 ml/litro; oleato de metilo 7 ml/litro; y tampón HEPES, 40 mM (titulado a pH 7,6 con KOH). La solución de elementos vestigiales comprende: H_{2}SO_{4}, 10 ml/litro; FeCl_{3}\cdot6H_{2}O, 14,6 g/litro; ZnCl_{2}, 2,0 g/litro; MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 1,0 g/litro; CuCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,42 g/litro; H_{3}BO_{3}, 0,31 g/litro; CaCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,24 g/litro; y Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 0,24 g/litro. El nivel basal de serina fue tomado con el 4,82% p/p, el valor determinado por el análisis de aminoácidos de Difco del lote concreto de Casitona. Por consiguiente, la concentración de serina basal era de 2,3 mM, un valor calculado a partir de la concentración final de 5 g/litro de Casitona en el medio. El medio suplementado con serina contenía una concentración cincuenta veces mayor de serina, 117 mM.
Las células se hicieron crecer en matraces a 30ºC durante 120 horas en un sacudidor de cajón a 250 rpm. Los compuestos producidos por las cepas durante la fermentación fueron extraídos capturando la resina, lavando la resina una vez en agua, y extrayendo los compuestos de la resina durante 30 minutos en 20 ml de metanol. Las muestras fueron analizadas mediante HPLC y mediante espectrometría de masas.
El análisis de los compuestos producidos por las células mostraba que un incremento de cincuenta veces en los niveles de serina daba como resultado un incremento de 30 veces en la producción de epotilon H_{1} (0,12 mg/litro) y un incremento de 5 veces en la producción de epotilon H_{2} (0,12 mg/litro) sobre el producido por las células desarrolladas en medio que no estaba suplementado con serina. Notablemente, las células producían cantidades casi indetectables de epotilones C y D (< 50 \mug/litro).
El incremento concomitante en los compuestos que contienen oxazol y el descenso de los compuestos que contienen tiazol a partir de la alimentación de serina proporciona un modo de obtener los compuestos de oxazol a partir de las células huésped que normalmente constituirían las contrapartes que contienen tiazol. Por ejemplo, el constructo recombinante para elaborar el 9-oxo-epotilon D se puede hacer crecer en condiciones similares a las descritas antes para elaborar 17-des(2-metil-4-tiazolil)-17-(2-metil-4-oxazolil)-9-oxo-epotilon D, la contraparte de oxazol del 9-oxo-epotilon D. De un modo similar, se pueden hacer crecer otros constructos recombinantes de la invención incluyendo aquellos descritos por el Ejemplo 6 con serina en exceso para proporcionar los correspondientes compuestos de oxazol.

Claims (6)

1. Una célula huésped recombinante del suborden Cystobacterineae que contiene un vector de expresión recombinante que codifica un gen de la policétido sintasa (PKS) de epotilon y produce un policétido sintetizado por una enzima PKS codificada en dicho vector, donde dicha células es Myxococcus xanthus K111-40.1, depositada en la ATCC con el Número de Acceso de PTA-2712, Myxococcus xanthus K111-72.4.4, depositada en la ATCC con el Número de Acceso de PTA-2713, o Myxococcus xanthus cepa K90-132.1.1.2, depositada en la ATCC con el Número de Acceso de PTA-2715.
2. La célula de la reivindicación 1, que es Myxococcus xanthus K111-40.1, depositada en la ATCC con el Número de Acceso de PTA-2712.
3. La célula de la reivindicación 1, que es Myxococcus xanthus K111-72.4.4, depositada en la ATCC con el Número de Acceso de PTA-2713.
4. La célula de la reivindicación 1, que es Myxococcus xanthus cepa K90-132.1.1.1, depositada en la ATCC con el Número de Acceso de PTA-2715.
5. Un método para producir un epotilon que comprende cultivar una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en condiciones tales que se expresa dicho gen de la PKS del epotilon codificado en dicho vector y se produce un epotilon.
6. El método de la reivindicación 5, donde se produce el epotilon D.
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