ES2295574T3 - Modulacion de la distribucion de congeneres de metabolitos secundarios. - Google Patents
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Abstract
Un método para modular la proporción de la producción de la distribución de los congéneres policetídicos en una célula hospedadora mixobacteriana, que comprende una enzima a medida activa dependiente de oxígeno, comprendiendo el método las etapas de cultivar dicha célula hospedadora en un cultivo con agotamiento de oxígeno en el medio de crecimiento en condiciones que conducen a la producción de policétidos, en el que la proporción de la producción de los congéneres policetídicos se desplaza de las epotilonas A y B a las epotilonas C y D.
Description
Modulación de la distribución de congéneres de
metabolitos secundarios.
La presente invención proporciona métodos y
materiales recombinantes para producir policétidos mediante la
tecnología del ADN recombinante, y métodos para modular la
distribución de los congéneres de los policétidos mediante la
modulación de la tensión de oxígeno. La invención se refiere a los
ámbitos de agricultura, cría de animales, química, química médica,
medicina, biología molecular, farmacología y tecnología
veterinaria.
Los policétidos constituyen una gran familia de
compuestos diferentes sintetizados a partir de 2 unidades de
carbono mediante una serie de condensaciones y de modificaciones
posteriores. Los policétidos se producen en muchos tipos de
organismos, incluidos los hongos y las bacterias que forman
micelios, en particular, los actinomicetos. Hay una gran variedad
de estructuras policetídicas, y la clase de policétidos abarca
muchos compuestos con actividades distintas. Eritromicina,
FK-506, FK-520, megalomicina,
narbomicina, oleandomicina, picromicina, rapamicina, espinocina y
tilosina son ejemplos de tales compuestos. Dada la dificultad para
producir compuestos policetídicos mediante la metodología química
tradicional, y la baja producción típica de policétidos de las
células de tipo salvaje, ha existido un interés considerable por
encontrar los modos mejorados o alternativos de producir compuestos
policetídicos. Véanse las patentes internacionales PCT n.º WO
93/13663; WO 95/08548; WO 96/40968; 97/02358; y 98/27203; las
patentes de los Estados Unidos n.º 4.874.748; 5.063.155; 5.098.837;
5.149.639; 5.672.491; 5.712.146; y 5.962.290; y Fu et al.,
1994, Biochemistry 33; 9321-9326; McDaniel
et al., 1993, Science 262: 1546-1550;
y Rohr, 1995, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34 (8):
881-888.
Los policétidos se sintetizan de forma natural
mediante las enzimas policétido sintasa (PKS). Estas enzimas, que
son complejos de muchas proteínas grandes, son similares a las
sintasas que catalizan la condensación de 2 unidades de carbono en
la biosíntesis de los ácidos grasos. Las enzimas PKS están
codificadas por genes PKS que normalmente consisten en tres
o más marcos de lectura abiertos (ORF, por su nombre en inglés). Se
conocen dos tipos principales de enzimas PKS; éstas difieren en su
composición y modo de síntesis. Estos dos tipos principales de
enzimas PKS normalmente se denominan enzimas PKS "modulares" o
de tipo I e "iterativas" o de tipo II. Un tercer tipo de PKS
encontrado principalmente en las células fúngicas tiene
características de enzimas de tipo I y tipo II y se denominan
enzimas PKS "fúngicas".
Las PKS modulares son las responsables de la
producción de un gran número de fármacos macrólidos de 12, 14 y 16
miembros, que incluyen la eritromicina, la megalomicina, la
metimicina, la narbomicina, la oleandomicina, la picromicina y la
tilosina. Cada ORF de una PKS modular puede comprender uno, dos o
más "módulos" de actividad cetosintasa, consistiendo cada
módulo de ésta en al menos dos (si se trata de un módulo de carga)
y más generalmente tres (para el módulo extensor más simple) o más
actividades enzimáticas o "dominios". Estas enzimas
multifuncionales grandes (>300.000 kDa) catalizan la biosíntesis
de las macrolactonas policetídicas a través de vías con varias
etapas que implican condensaciones descarboxilativas entre
acil-tioésteres seguidas de ciclos de diferentes
actividades de procesamiento de los carbonos \beta (véase O'Hagan,
D. The polyketide metabolites; E. Horwood: Nueva York,
1991).
Durante los últimos cinco años, se ha facilitado
enormemente el estudio de la función y la especificidad de la PKS
modular mediante el sistema de expresión con plásmidos en
Streptomyces coelicolor desarrollado con genes de la
6-desoxieritronolido B (6-dEB)
sintasa (DEBS) (véase Kao et al., 1994, Science, 265:
509-512; McDaniel et al., 1993,
Science 262: 1546-1557; y las patentes de los
Estados Unidos n.º 5.672.491 y 5.712.146). Las ventajas de este
sistema genético basado en plásmidos para la DEBS son que supera las
técnicas tediosas y limitadas de manipulación del organismo
hospedador de la DEBS natural, Saccharopolyspora erythraea,
que permite la construcción más fácil de las PKS recombinantes, y
reduce la complejidad del análisis de la PKS al proporcionar un
contexto genético hospedador "limpio". Este sistema también
aceleró la construcción de la primera colección de policétidos
modulares combinatorios en Streptomyces (véanse las patentes
internacionales de publicación PCT n.º WO 98/49315 Y 00/024907).
La capacidad de controlar aspectos de la
biosíntesis de los policétidos, tales como la selección de los
monómeros y el grado de procesamiento del carbono \beta, mediante
manipulación genética de las PKS, ha estimulado enormemente el
interés por la ingeniería combinatoria de nuevos antibióticos
(véanse, Hutchinson, 1998, Curr. Opin. Microbiol. 1:
319-329; Carreras y Santi, 1998, Curr. Opin.
Biotech. 9 403-411; y la patente de los Estados
Unidos n.º 5.712.146 y 5.672.491). Este interés ha dado lugar a la
clonación, análisis y manipulación, mediante la tecnología del ADN
recombinante, de genes que codifican las enzimas PKS. La tecnología
resultante permite manipular un grupo de genes conocido de PKS bien
para producir el policétido sintetizado por esa PKS en mayor
cantidad que la que se produce de forma natural, o bien en huéspedes
que de otro modo no producen el policétido. La tecnología también
permite producir moléculas que están relacionadas estructuralmente
con los policétidos producidos a partir de grupos de genes de la
PKS conocidos, pero que no son estos policétidos.
Ha existido mucho interés por expresar los
policétidos producidos por las enzimas PKS de tipo I y tipo II en
las células hospedadoras que normalmente no expresan tales enzimas.
Por ejemplo, se ha descrito la producción del policétido fúngico
ácido 6-metilsalicílico (6-MSA) de
forma heteróloga en E. coli, levadura y células vegetales.
Véase Kealey et al., Jan, 1998, "Production of a
polyketide natural product in
nonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic
host", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:
505-9, patente de los Estados Unidos n.º 6.033.883
y publicaciones de patentes PCT n.º 98/27203 y 99/02669. La
producción heteróloga de 6-MSA requirió la
coexpresión, o se aumentó considerablemente gracias a ella, de una
sintasa de la proteína transportadora de acilos (ACPS) heteróloga y
que, para E. coli, los complementos de los medios fueran
útiles para aumentar la cantidad de sustrato del
malonil-CoA utilizado en la biosíntesis del
6-MSA. Véase, también, la publicación de patente
PCT n.º 97/13845.
La biosíntesis de otros policétidos requiere
sustratos diferentes o adicionales al malonil-CoA.
Tales sustratos incluyen, por ejemplo,
propionil-CoA,
2-metilmalonil-CoA,
2-hidroximalonil-CoA y
2-etilmalonil-CoA. De los miles de
células hospedadoras que se pueden utilizar como huéspedes
productores de policétidos, muchas no producen tales sustratos de
forma natural. Además, para la manipulación de los sustratos
iniciales y las moléculas extensoras, existen manipulaciones de
enzimas a medida en distintos hospedadores para conseguir diversos
productos de policétidos. Además, el hospedador juega un papel
importante en la producción de congéneres de los policétidos.
Las bacterias se clasifican como aerobias
estrictas (necesitan oxígeno para crecer), anaerobias facultativas
(no es necesario el oxígeno, pero tiene como consecuencia un
crecimiento más rápido), anaerobias aerotolerantes (el oxígeno no
tiene ningún efecto sobre el crecimiento), anaerobias estrictas (el
oxígeno impide el crecimiento) o como microaerófilas (necesitan
concentraciones bajas de oxígeno para crecer). Los procesos
intracelulares dependientes del oxígeno en las bacterias aerobias
están mediados por las enzimas oxidasas y oxigenasas. La mayoría de
la mixobacterias y actinomicetos son ejemplos de aerobios estrictos.
El crecimiento de las bacterias aerobias en condiciones
microaerobias (poco oxígeno) es de interés, ya que el comportamiento
del crecimiento del cultivo y la producción de los metabolitos
primarios y secundarios son a menudo diferentes a los observados
por lo general en condiciones de oxigenación en exceso (Winkelheusen
et al., 1996; Schneider et al., 1999; Jensen et
al., 2001; Liefke et al., 1990; Kaiser et al.,
1994; Dick et al., 1994). Más abajo, las referencias citadas
se ofrecen en forma de cita completa por autor y año de
publicación.
Muchos metabolitos secundarios producidos por
miembros de los Actinomycetales y Myxococcales
muestran unas actividades biológicas potentes y variadas. Los
policétidos son una clase de estos productos naturales producidos
por enzimas multifuncionales grandes llamadas policétido sintasas
(PKS), a menudo seguidas por la modificación mediante una vía
enzimática posterior (Carreras et al., 2000). Las acciones de
estas enzimas a medida de las vías pueden incluir glucosilaciones,
hidroxilaciones, metilaciones, epoxidaciones o una serie de cambios
en la estructura básica de la molécula.
Los compuestos intermediarios a lo largo de
estas vías a medida a menudo poseen unas posibilidades biológicas
diferentes a las del compuesto final. Ejemplos de esto son los
compuestos antibacterianos eritromicinas B, C y D, que se pueden
procesar en el congénere más potente eritromicina A mediante una vía
enzimática que incluye la hidroxilasa Eryk dependiente de oxígeno
(véase la figura 1). La eritromicina B y sus análogos con
sustituciones en la posición 13 son útiles como precursores para la
producción semisintética de fármacos gastrointestinales
procinéticos llamados motílidos. Sin embargo, la eritromicina B es
un sustrato muy malo para la enzima EryK, y esencialmente es un
producto final de una derivación de esta vía (Lambalot et
al., 1995). Por lo tanto, el destino final de la molécula
eritromicina D depende de una reacción competitiva entre la metilasa
EryG y la hidroxilasa dependiente de oxígeno EryK. Previamente, se
demostró que la concentración de oxígeno disuelto durante las
bioconversiones en S. erythraea de los análogos del
6-desoxieritronolido B (6-dEB) es
decisiva para determinar si el congénere de la eritromicina A o B
es el producto final predominante de estos cultivos (Carreras et
al., 2002).
Las epotilonas (figura 2) han suscitado interés
recientemente como posibles sucesores quimioterápicos del
paclitaxel, un potente compuesto contra el cáncer (Bollag et, 1995,
Gerth et al., 1996). Tanto el paclitaxel (Taxol®) como la
epotilonas estabilizan los microtúbulos mediante el mismo mecanismo
de acción, pero las epotilonas son eficaces contra los tumores
resistentes al paclitaxel y son más hidrosolubles (Kowalski et
al., 1997, Su et al., 1997). Se han identificado por lo
menos 39 variantes diferentes de epotilonas y compuestos
relacionados en el caldo de fermentación del organismo productor de
tipo salvaje, Sorangium cellulosum (Hardt et al.,
2001). Se ha descrito que la epotilona D posee el mayor índice
terapéutico de los cuatro congéneres principales de las epotilonas
A, B, C o D (Chou et al., 1998, Chou et al., 2001)
pero se produce en muy poca cantidad en S. cellulosum (Gerth
et al., 2000). El dominio de la
acil-transferasa 4 (AT4) de la PKS de las epotilonas
puede incorporar una unidad extensora de
malonil-CoA o de ametilmalonil-CoA,
influyendo esta selectividad en la proporción final entre las
epotilonas A y B, o entre las epotilonas C y D (Gerth et al.,
2000). El congénere de la epotilona D es un precursor directo para
la epoxidación en epotilona B (figura 3), catalizado por la
monooxigenasa EpoK (Julien et al., 2000, Gerth et al.,
2001). La patente internacional WO 01/83800 describe células
hospedadoras recombinantes del suborden Cystobacterineae y
del género Myxococcus que contiene vectores de expresión
recombinantes que codifican genes heterólogos de PKS. Estas células
se describen por ser útiles para la producción de epotilonas y
otros policétidos. Por ejemplo, la patente internacional WO
01/83800 describe la producción de la epotilona D mediante la cepa
de Myxococcus xanthus K111-40.1 que
expresa los genes PKS de las epotilonas y con un gen no funcional
epoK, controlando el oxígeno disuelto a una saturación del
50% o mayor del 80%. La patente internacional WO 01/83800 también
describe la producción de epotilona B mediante la cepa de
Myxococcus xanthus K111-32.25 que
expresa los genes PKS de las epotilonas y con un gen funcional
epoK, con oxígeno disuelto a una saturación de más del
80%.
La eritromicina B y la epotilona D se presentan
como ejemplos de intermediarios de vías a medida de metabolitos
secundarios en las que el intermediario a veces es el producto
deseado. Adicionalmente, hay muchos otros ejemplos de productos
naturales en los que se necesita una reacción enzimática de la
monooxigenasa para procesar un intermediario de la vía en el
producto final. Los ejemplos incluyen la bioconversión de la
compactina en el hipocolesterolemiante pravastina (Serizawa et
al., 1991, Waranabe et al., 1995); la producción de la
hormona vegetal, la gibberellina (Tudzynski et al., 1998);
la producción de una micotoxina fúngica, la esterigmatocistina
(Keller et al., 2000); y la producción de doxorrubicina, un
fármaco contra el cáncer (Lomovskaya et al., 1999, Walczak
et al., 1999).
Se puede eliminar la actividad de estas enzimas
dependientes de oxígeno por métodos genéticos, pero esta
manipulación puede resultar difícil o imposible de llevar a cabo
por varias razones. La inactivación génica dirigida de una enzima
monooxigenasa requiere el conocimiento de la misma y el acceso a su
secuencia, así como la capacidad de manipular el ADN del organismo
hospedador. La presente invención proporciona un método alternativo
para que estos intermediarios sean los productos principales, sin
requerir ninguna manipulación genética de las enzimas a medida.
Dada la posibilidad de fabricar policétidos
valiosos y útiles en grandes cantidades en células hospedadoras
heterólogas, existe una necesidad de células hospedadoras capaces de
fabricar policétidos en la distribución modificada de congéneres.
La presente invención ayuda a satisfacer la necesidad de
proporcionar células hospedadoras recombinantes, vectores de
expresión y métodos para fabricar policétidos en diversas células
hospedadoras.
Las siguientes referencias proporcionan
información introductoria sobre la presente invención.
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Se describe en la presente memoria un método
para modular la distribución de congéneres de policétidos en una
célula hospedadora heteróloga sin manipulación genética de los genes
de la policétido sintasa (PKS) o enzimas a medida. En particular,
la presente invención proporciona un método para modular la
proporción de la producción de la distribución de los congéneres de
policétidos en una célula hospedadora mixobacteriana que comprende
una enzima a medida activa dependiente de oxígeno, comprendiendo el
método las etapas de cultivar dicha célula hospedadora en un
cultivo con el oxígeno agotado en el medio de cultivo en condiciones
que conducen a la producción de policétidos, en el que la
proporción de la producción de
\hbox{congéneres de policétidos
se cambia de epotilonas A y B a epotilonas C y D.}
Se describen en la presente memoria las células
hospedadoras heterólogas modificadas metabólicamente que se pueden
manipular para producir una determinada distribución de congéneres
de policétidos controlando la tensión de oxígeno durante el cultivo
de dichas células hospedadoras.
También se describen en la presente memoria las
células hospedadoras productoras de policétidos recombinantes que,
al cultivarse en condiciones moduladas de tensión de oxígeno,
cambian la producción de los congéneres. Las células hospedadoras
recombinantes pueden ser células hospedadoras de Sorangium
cellulosum que producen epotilonas A y B y que desplazan la
producción a epotilonas C y D al cultivarse en condiciones
agotamiento del oxígeno.
El policétido producido por la célula
hospedadora heteróloga puede ser epotilona, y se puede modular la
distribución de los congéneres epotilónicos para producir epotilona
D modulando la tensión de oxígeno durante el cultivo.
La distribución de congéneres epotilónicos
modulada por la tensión de oxígeno puede dar lugar a una mayor
proporción entre el congénere epotilona D y el congénere epotilona C
con una tensión de oxígeno en exceso. La proporción de congéneres
epotilona C y epotilona D puede aumentar en condiciones de
agotamiento del oxígeno. Los congéneres de las epotilonas se pueden
producir mediante una cepa K111-32.25 heteróloga de
Myxococcus xanthus. Las epotilonas A y B se pueden producir
con una tensión de oxígeno en exceso, y las epotilonas C y D se
pueden producir con agotamiento de la tensión de oxígeno en la cepa
K111-32.25.
Se describe en la presente memoria un método
para alterar la especificidad de los dominios
acil-transferasa (AT) de la epotilona modulando la
tensión del oxígeno del módulo 4 del agrupamiento de la policétido
sintasa (PKS) de epotilonas sin manipulación genética. Se puede
cambiar la especificidad de la AT de la cepa
K111-32.25 a metilmalonil-CoA, lo
que da lugar a un desplazamiento hacia los congéneres con el grupo
metilo en C-12 (epotilonas B o D).
También se describen en la presente memoria
nuevos policétidos producidos mediante células hospedadoras
modificadas metabólicamente que tienen una monooxigenasa EpoK
activa.
El nuevo policétido producido mediante la
modulación de la tensión de oxígeno durante el cultivo de una célula
hospedadora heteróloga puede ser la epotilona 506.
La figura 1 muestra las eritromicinas B, C y D
que se pueden procesar en el congénere eritromicina A más potente
mediante una vía enzimática que incluye la hidroxilasa EryK
dependiente de oxígeno.
La figura 2 muestra la estructura química de
varias epotilonas. (a) Epotilona A (R_{1} = H; R_{2} = S);
epotilona B (R_{1} = CH_{3}; R_{2} =S); epotilona G_{1}
(R_{1} = H; R_{2} = O); epotilona G_{2} (R_{1} = CH_{3};
R_{2} = O). (b) Epotilona C (R_{1} = H; R_{2} = S); epotilona
D (R_{1} = CH_{3}; R_{2} = S); epotilona H_{1} (R_{1} =
H; R_{2} = O); epotilona H_{2} (R_{1} = CH_{3}; R_{2} =
O). (c) 10,11-dideshidro-epotilona A
(R_{1} = H);
10,11-dideshidro-epotilona B
(R_{1} = CH_{3}). (d)
10,11-dideshidro-epotilona C
(R_{1} = H);
10,11-dideshidro-epotilona D
(R_{1} = CH_{3}).
La figura 3 muestra que el congénere epotilona
D, que es un precursor directo para la epoxidación en epotilona B
catalizada por la monooxigenasa EpoK.
La figura 4 muestra el cultivo de la cepa
K111-32.35 (EpoK^{+}) a) en exceso de oxígeno) o
b) con el oxígeno agotado, de manera que el agotamiento del oxígeno
da lugar a una densidad celular de más del 60% que la obtenida
durante el cultivo de la misma cepa en presencia de oxígeno en
exceso.
La figura 5 muestra cromatografías HPLC de
extractos de resinas a partir de fermentaciones de la cepa
K111-40.1 (EpoK^{+}) cultivados en a) la
condición de exceso de oxígeno que da lugar a una actividad máxima
de la enzima EpoK, y la producción de las epotilonas A y B como los
productos finales primarios; b) la condición de agotamiento del
oxígeno limita la actividad de esta enzima, lo que da lugar a la
producción de epotilonas C y D como los productos finales
primarios; c) el resultado de estos cultivos con agotamiento del
oxígeno es similar a los obtenidos con otra cepa
(K111-40.1) con exceso de oxigenación en la que se
ha eliminado la actividad de la enzima EpoK mediante ingeniería
genética.
La figura 6 muestra la redistribución viníloga
de Payne de
10,11-dideshidro-epotilona B (a) que
se convierte en Epo506 (b) en condiciones de oxígeno en exceso.
La figura 7 muestra el cultivo de la cepa
K165-79.7 en condiciones de oxígeno en exceso y
agotado que da lugar al cambio de la proporción de congéneres entre
10,11-dideshidro-epotilona D y
Epo506.
La figura 8 muestra la modulación de la tensión
de oxígeno durante el cultivo de la cepa de Sorangium
cellulosum Soce K111-150.17 que cambia la
distribución de la producción de las epotilonas. a) Crecimiento
celular en oxígeno disuelto (OD) al 50%; y b) y c) tensión de
oxígeno baja.
La figura 9 muestra la cinética de la titulación
de tres condiciones diferentes de oxígeno en disolución.
La figura 10 muestra una cromatografía HPLC que
muestra la distribución de los congéneres epotilona A y epotilona B
de una condición de oxígeno disuelto al 50% a un t = 112 horas.
La figura 11 muestra una cromatografía HPLC de
los máximos de las epotilonas A, B, C y D de una condición de
oxígeno disuelto al 0% a las 112 horas.
La presente invención proporciona un método
alternativo para producir intermediarios de policétidos como los
productos principales, sin requerir ninguna manipulación genética de
las enzimas a medida. Los presentes métodos de la presente
invención utilizan células hospedadoras que se han registrado en la
American Type Culture Collection (ATCC) bajo el Tratado de
Budapest y a los que se les han asignado números de designación del
depósito. La cepa de Myxococcus xanthus
K111-32.25 se registró el 1 de mayo de 2000 con el
número de depósito PTA-1700, y la cepa
Myxococcus xanthus K111-40.1 se
registró el 18 de enero de 2001 con el número de depósito
PTA-2712.
Previamente, se describió un procedimiento de
cultivo con alimentación discontinua para producir la epotilona D
en el sistema heterólogo de M. xanthus. Durante estos
cultivos con alimentación discontinua, se puede modular o regular
la tensión de oxígeno disuelto desde el oxígeno en exceso,
saturación de oxígeno disuelto a aproximadamente el 50%, hasta la
medida ausencia de oxígeno u oxígeno disuelto al 0%, para conseguir
un desplazamiento en la producción de los congéneres. Durante los
cultivos con alimentación discontinua, la tensión del oxígeno
disuelto se mantiene al 50% de la saturación de aire mediante un
control automático de la velocidad de agitación. Cuando el
intervalo superior de la velocidad de agitación se limita a un valor
insuficiente para mantener esta tensión del oxígeno disuelto, el
aumento continuado de la demanda metabólica del cultivo mediante su
creciente densidad celular puede finalmente agotar el oxígeno del
caldo de cultivo. El cultivo se encuentra entonces en un estado
metabólico en el que la velocidad de disolución del oxígeno en el
caldo de cultivo es equivalente a su velocidad de consumo por las
células. Este estado metabólico da lugar a una lectura cero de la
sonda de oxígeno disuelto, lo que indica que no se detecta ninguna
actividad de oxígeno residual en el caldo de cultivo. Este estado
de cultivo se puede explotar entonces para minimizar la actividad
de las enzimas a medida dependientes de oxígeno de la vía de
procesamiento, al mismo tiempo que proporciona suficiente oxígeno
para mantener la viabilidad del cultivo.
Los cultivos de la cepa productora de epotilona
B (EpoK^{+}) K111-32.25 (número de depósito de la
ATTC PTA-1700, 1 de mayo de 2000) se mantuvieron en
tensiones de oxígeno disuelto en exceso (50% de saturación) y
agotado (0%) durante toda la fase de producción de las epotilonas
controlando la velocidad de agitación (figura 4 a,b). La condición
de oxígeno en exceso da lugar a una actividad máxima de la enzima
EpoK, y a la producción de las epotilonas A y B como los productos
finales primarios (figura 5a). La condición de agotamiento de
oxígeno limita la actividad de esta enzima, lo que da lugar a una
producción de las epotilonas C y D como los productos finales
primarios (figura 5b). El resultado de estos cultivos con
agotamiento de la oxigenación es similar a los obtenidos con otra
cepa (K111-40.1, número de depósito de la ATCC
PTA-2712, 18 de enero de 2001) con oxigenación
excesiva en la que la actividad de la enzima EpoK se ha limitado
mediante ingeniería genética (figura 5c).
La modulación de la tensión del oxígeno disuelto
influye en la proporción entre los congéneres de las epotilonas A y
B (o C y D), además de en la titulación total máxima de las
epotilonas (véase el ejemplo 2, tabla 1). Sin embargo, el momento
en el que se consiguieron estas titulaciones máximas no dependía del
tipo de cepa ni del nivel de oxigenación en el biorreactor, ya que
las tres condiciones de cultivo descritas en la tabla 1 alcanzaron
su titulación total máxima de epotilonas alrededor del día 12. El
dominio acil-transferasa 4 (AT4) de la PKS de las
epotilonas puede incorporar bien una unidad extensora de
malonil-CoA o bien una unidad extensora de
metilmalonil-CoA, influyendo esta selectividad en la
proporción final entre estos congéneres de epotilonas (17).
La concentración de oxígeno puede influir indirectamente sobre la
distribución intracelular del conjunto entre
malonil-CoA y metilmalonil-CoA. El
cultivo de las cepas K111-40.1 (EpoK^{-}) y
K111-32-25 (EpoK^{+}) con oxígeno
en exceso dio lugar a un cambio pronunciado hacia el congénere con
el grupo metilo en el C-12 (epotilonas B o D), lo
que indica que las células favorecen la producción y/o la
incorporación de metilmalonil-CoA en estas
condiciones (tabla 1).
El cultivo de la cepa EpoK^{+} con agotamiento
del oxígeno dio lugar a una densidad celular que fue un 60% mayor
que la obtenida durante el cultivo de la misma cepa en presencia de
oxígeno en exceso (figura 4 a,b). La fase de crecimiento
exponencial del cultivo en exceso de oxígeno cesó el día 7, tras lo
cual la densidad celular permaneció relativamente constante (figura
4a). La velocidad de crecimiento específico (\mu) durante esta
fase exponencial fue de 0,7 d^{-1}. Sin embargo, cuando la tensión
de oxígeno disuelto en el cultivo con agotamiento del oxígeno
alcanzó el cero en el día 4 debido a la limitación de la respuesta
en cascada de la agitación, este cultivo cambió desde su fase de
crecimiento exponencial hasta una velocidad de crecimiento más
lento (\mu = 0,15 d^{-1}), que continuó hasta el día 12 (figura
4b). También se observó una patrón similar en el comportamiento del
crecimiento y un aumento en la densidad celular máxima con la cepa
EpoK^{-} con el oxígeno agotado, así como con otras cepas de
M. xanthus modificadas genéticamente que producen nuevas
epotilonas.
El aumento de la densidad celular en los
cultivos con el oxígeno agotado se puede atribuir a que 1) las
células pueden utilizar lo nutrientes a una velocidad diferente o
de una manera selectiva diferente durante el crecimiento lento
impuesto por la limitación de oxígeno, por lo que se pospone el
agotamiento de los nutrientes importantes, 2) los cultivos producen
diferentes tipos o niveles de metabolitos potencialmente inhibidores
del crecimiento durante la limitación de oxígeno que los que se
excretan con oxígeno en exceso, o 3) la limitación del oxígeno
potencia o reprime la expresión de los genes y la actividad de las
enzimas implicadas en el crecimiento bacteriano y en los procesos
respiratorios.
El control de la concentración del oxígeno
disuelto durante el cultivo de los cultivos bacterianos puede tener
un efecto drástico sobre la densidad celular del cultivo así como en
las titulaciones de los metabolitos secundarios y en las
distribuciones de sus congéneres. Esta estrategia de cultivo con
limitación de oxígeno se puede utilizar para que los intermediarios
de una vía a medida dependiente de oxígeno sean los productos
primarios. Sin embargo, la actividad de la monooxigenasa no está
completamente eliminada sino simplemente reducida a una fracción de
la velocidad máxima observada por lo general en las condiciones de
exceso de oxígeno. Para evitar que estos intermediarios se procesen
a pesar de todo a una velocidad más lenta, puede ser necesario
estabilizarlos de algún modo. Un ejemplo de esto es la reacción
competitiva entre la hidroxilasa EryK y la metilasa EryG para el
sustrato de eritromicina D (figura 1). Si se reduce la actividad de
la EryK, la EryG es capaz de catalizar la conversión de la
eritromicina D en eritromicina B, un mal sustrato para la
hidroxilasa EryK. Esto causa la acumulación del intermediario de la
vía enzimática, la eritromicina B. Esta vía también contiene otra
enzima a medida dependiente de oxígeno, la EryF (figura 1), que
sigue siendo capaz de procesar la
6-desoxieritronolida B (6-dEB) en
eritronolida B en condiciones de limitación de
oxígeno.
oxígeno.
Otro ejemplo de esta acumulación de
intermediarios es la producción de epotilona D durante el cultivo de
un sistema heterólogo de M. xanthus con una enzima activa
EpoK. La reducción de la actividad de una enzima EpoK con
agotamiento de oxígeno es aparentemente suficiente para enlentecer
la catálisis del intermediario epotilona D en su congénere la
epotilona B, y para permitir que la epotilona D difunda fuera de la
célula y se una y se estabilice mediante la resina
XAD-16 en el biorreactor. Se ha demostrado que la
adición de las epotilonas C y D para agitar los cultivos en
matraces de una cepa no productora de S. cellulosum que
conserva la actividad de EpoK da lugar a la difusión de estos
compuestos de vuelta a las células y a su transformación en
epotilonas A y B cuando no está presente ninguna resina. Julien y
colaboradores han demostrado que ocurre lo mismo con una cepa de
Myxococcus xanthus en la que la PKS de las epotilonas no es
funcional, mientras que la EpoK sí es activa.
Se crean nuevas epotilonas mediante cepas en las
que la secuencia de la policétido sintasa de las epotilonas se ha
manipulado (Julien et al., 2000, Tang et al., 2000).
La modulación de la tensión del oxígeno disuelto, junto con la
adición de precursores específicos, tales como el acetato y el
propionato, al medio de producción permite que cada uno de los
cuatro congéneres principales, epotilonas A, B, C o D (figura 2),
sean el producto primario de una única cepa de M. xanthus
con una enzima EpoK activa (Frykman et al., 2002).
El aumento de la concentración de serina en el
medio de producción aumenta su incorporación relativa mediante la
péptido sintetasa no ribosómica de las epotilonas (NRPS, por sus
siglas en inglés) en epotilona en lugar de cisteína (Frykman et
al., 2002). La complementación del medio de producción de la
cepa K111-32.25 con serina, junto con la modulación
de la concentración de oxígeno disuelto, da lugar a que cualquiera
de las oxazol-epotilonas G_{2} o H_{2} (figura
2) se convierta en el producto principal. La complementación con
serina, acetato y/o propionato al medio de producción, junto con el
control de la tensión del oxígeno disuelto, permite la acumulación
de cualesquiera de los 8 compuestos principales de tiazol y oxazol
(epotilonas A, B, C, D, G1, G_{2}, H_{1} y H_{2}) para que
sean el producto primario de una única cepa de M. xanthus.
Este método también debe permitir la producción y la modulación de
los congéneres de los homólogos con oxazol de la
10,11-dideshidro-epotilona D y la
Epo406.
Se ha demostrado que la PKS de las epotilonas de
tipo salvaje produce casi 35 variantes adicionales de epotilona
además de las epotilonas A-D (Hardt et al.
2001). De forma similar, también se ha descubierto que la expresión
heteróloga de la PKS de las epotilonas y de las variantes
manipuladas da lugar a una serie de compuestos nuevos además del
producto esperado. La concentración de estos productos se puede
potenciar o suprimir mediante las condiciones de cultivo. La
capacidad para generar nuevos compuestos y modular su distribución a
través de la manipulación de las condiciones de cultivo de una cepa
que posee un solo cambio genético en la secuencia de su PKS
demuestra lo poderosa que puede ser una herramienta de fabricación
de PKS cuando se combina con la situación fisiológica adecuada para
la generación rápida de nuevos productos naturales con actividades
biológicas potentes.
Habiéndose proporcionado anteriormente una
descripción detallada de la invención, los siguientes ejemplos se
dan con el propósito de ilustrar la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Cepas bacterianas. Se clonó la policétido
sintasa de las epotilonas a partir de Sorangium cellulosum
SMP44 y se introdujo en la cepa Myxococcus xanthus DZ1
(Julien et al., 2002). El M. xanthus productor de la
epotilona B (K11-32.25) tiene una epoxidasa EpoK
funcional (EpoK^{+}), mientras que esta enzima se ha inactivado
genéticamente (EpoK^{-}) en la cepa productora de la epotilona D
(K111-40.1). La actividad del dominio de la enoílo
reductasa (ER5) de la PKS de las epotilonas se eliminó mediante la
introducción de una mutación puntual en las cepas
K111-32.25 y K111-40.1 para producir
las cepas K165-79.7 y K165-76.2,
respectivamente. Se fabricaron las cepas K165-79.7
y K165-76.2 para producir las
10,11-dideshidro-epotilonas B y D
(figura 2), respectivamente.
\global\parskip0.920000\baselineskip
Expansión del inóculo en el biorreactor. Todos
los componentes de los medios se obtuvieron de Sigma (St. Louis,
MO), a menos que se especifique de otro modo. Todos los cultivos de
M. xanthus se iniciaron reviviendo un vial de 1 ml de un
banco de células congeladas en un tubo de vidrio a 25 ml que
contiene 3 ml del medio CYE-MOM [10 g/l de
casitona, una digestión pancreática de la caseína (Difco, Detroit,
MI); extracto de levadura a 5 g/l (Difco),
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O a 1 g/l (EM Science, Gibbstown, NJ) y 2
ml/l de oleato de metilo (Emerest 2301, Cognis Corporation,
Cincinnati, OH)] durante dos días a 28ºC y 175 rpm. Todo el
contenido de este tubo se expandió durante un día en 50 ml de
CYE-MOM en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con
deflectores y, luego, se utilizó este matraz para inocular 500 ml
de CYE-MOM en un matraz Fernbach con deflectores de
2,8 l y se cultivó durante un día.
Cultivo del biorreactor con alimentación
discontinua. Se mezclaron 100 g de la resina hidrófoba
XAD-16 (Rohm and Hass, Filadelfia, PA) y 10 g de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O en 4,5 l de agua desionizada y
esterilizada (90 minutos, 121ºC) en un biorreactor de 5 l (B.
Braun, Allentown, PA). Se incorpora esta resina en el medio de
producción para que se una a las epotilonas y las estabilice para
evitar su degradación. Se conectaron al biorreactor dos circuitos
de alimentación separados de una disolución a 250 g/l de la
digestión de caseína y oleato de metilo, y se añadió una cantidad
suficiente de estos dos nutrientes al biorreactor para obtener la
digestión de caseína inicial y las concentraciones de oleato de
metilo a 5 g/l y 2 ml/l, respectivamente. Finalmente, se añadieron
de manera aséptica 25 ml de una disolución de elementos traza
esterilizados con un filtro de 0,22 \mum [H_{2}SO_{4}
concentrado (al 1% v/v), FeCl_{3}\cdot6H_{2}O a 14,6 g/l,
ZnCl_{3} a 2,0 g/l, MnCl_{2}\cdot4H_{2}O a 1,0 g/l,
CuCl_{2}\cdot2H_{2}O a 0,43 g/l, H_{3}BO_{3} a 0,31 g/l,
CaCl_{2}\cdot6H_{2}O a 0,24 g/l y
Na_{2}MO_{4}\cdot2H_{2}O a 0,24 g/l]. Luego se inoculó el
biorreactor (al 5% v/v) con el cultivo semilla en
CYE-MOOM, con alimentaciones de la digestión de
caseína (2 g/(l\cdotdía)) y de oleato de metilo (3
ml/(l\cdotdía)) iniciadas 48 horas después de la inoculación. Se
mantuvo constante el flujo de aire en el biorreactor a
\hbox{0,4 vvm (volumen del flujo de aire por volumen del vaso
por minuto).}
La tensión del oxígeno disuelto en el
biorreactor se monitorizó utilizando un sensor de oxígeno
polarográfico in situ. Se calibró esta sonda a una tensión
de oxígeno disuelto al 0% equilibrando el medio de producción con
nitrógeno al 100%, y a una tensión de oxígeno disuelto al 100%
equilibrando el medio de producción con aire. La velocidad de
agitación inicial se estableció a 400 rpm, sin utilizar ninguna
contrapresión adicional del biorreactor durante los cultivos. La
concentración de saturación del oxígeno es de aproximadamente 7,7
mg/l a 28ºC (Pirt, S. J., 1975). Se mantuvo la tensión del oxígeno
disuelto a un mínimo del 50% de saturación del aire (O_{2} a 3,9
mg/l) mediante una cascada de agitación en los cultivos de exceso de
oxígeno, con la velocidad de la agitación limitada a un máximo de
450 rpm en los cultivos con agotamiento de oxígeno. El punto de pH
7,4 establecido se mantuvo mediante la adición automática de
H_{2}SO_{4} a 2,5 N y KOH a 2,5 N. Se tomaron muestras de los
biorreactores diariamente durante 12 a 14 días, y después se recogió
la resina.
Cuantificación de la densidad celular y de las
titulaciones de las epotilonas. Se retiró diariamente una muestra
de cultivo de 50 ml del biorreactor en un tubo cónico y se separó el
medio de la resina por decantación. Se centrifugó una alícuota de 1
ml del caldo en un tubo Eppendorf de 1,5 ml durante 5 minutos, y se
retiró el sobrenadante mediante una pipeta. Se resuspendió el
sedimento celular con agua desionizada para dar un volumen total de
1 ml, y se midió la absorbencia de esta suspensión de células al
espectrofotómetro a 600 nm (Geneys 20, Thermo Spectronic,
Rochester, NY). Los cultivos de Myxococcus xanthus crecen
como bastoncillos unicelulares individuales, lo que facilita unas
mediciones precisas de la densidad óptica (DO). Una medición de la
DO de 1,0 unidades de absorbencia se correlaciona con una masa de
células seca de aproximadamente 0,3 g/l, siendo esta correlación
lineal dentro del intervalo de 0 a 40 unidades de DO.
Se lavó una vez la resina XAD-16
con 45 ml de agua desionizada, de nuevo seguida por su decantación.
Se extrajo la resina en 25 ml de metanol de calidad para reactivo
durante 30 minutos, y se cuantificaron las titulaciones de las
epotilonas mediante HPLC o LC/MS. Se realizó el análisis por HPLC
utilizando una HPLC 1090 de Hewlet Packard (Palo Alto, CA) con
detección UV a 250 nm. Se inyectó una alícuota de 50 \mul de la
disolución extraída con metanol por dos columnas de guarda de 4,6 x
10 mm (MetaChem Inertsil C18 ODS 3, 5 \mum, Ansys, Lake Forest,
CA), y una columna mayor del mismo material para la separación
cromatográfica (4,6 x 150 mm). El método fue isostático con
acetonitrilo al 70% y agua al 30% durante una ejecución de 12
minutos. Se realizó un análisis por LC/MS de las mismas muestras
mediante la inyección en PE Sciex API100LC
(Perkin-Elmer, Shelton, CT), utilizando una fuente
APCI y las mismas columnas de guarda y cromatográficas tal y como se
describió previamente. El método cromatográfico fue un gradiente de
acetonitrilo/agua aumentado linealmente del 35% al 100% durante 10
minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se ha alterado genéticamente la PKS de las
epotilonas para crear cepas de la presente invención que producen
nuevas epotilonas que posiblemente pueden mostrar un aumento de la
solubilidad en agua y/o la capacidad de actuar contra estirpes
celulares tumorales. El método de control de oxigenación de la
presente invención se aplicó a una cepa de producción de
Myxococcus xanthus manipulada (cepa
K165-79.7, EpoK^{+}) que se había modificado
genéticamente para producir una nueva epotilona, la
10,11-dideshidro-epotilona B (figura
2). Cuando su homólogo, la cepa K165-76.2
(EpoK^{-}), se cultivó en condiciones de exceso de oxigenación, se
encontró que las
10,11-dideshidro-epotilonas C y D
(figura 2) eran los únicos productos. Se esperaba que la enzima
EpoK activa de la cepa K165-79.7 catalizara la
epoxidación de este intermediario de la
10,11-dideshidro-epotilona D en la
10,11-dideshidro-epotilona B (figura
6a) en presencia de oxígeno en exceso. Sin embargo, no se detectó
este compuesto; en su lugar, el producto primario de estos cultivos
fue un nuevo isómero (Epo506) (figura 6b). Se utilizaron la
espectrometría de masas de gran resolución y la RMN mono- y
\hbox{bidimensional para establecer la estructura de este
producto de tetrahidrofurano (véase el ejemplo 1).}
Este resultado observado puede ser el producto
de un procedimiento mediante el cual la
10,11-dideshidro-epotilona B
formada en estas condiciones de exceso de oxígeno se convierte luego
en Epo506 a través de una redistribución viníloga de Payne, tal y
como se resume en la figura 6. Esta reacción es favorable debido a
la apertura del epóxido para producir un carbocatión alílico
intermedio relativamente estable. El cultivo de la cepa
K165-79.7 en condiciones de agotamiento y exceso de
la oxigenación dio lugar a un cambio de la proporción de congéneres
entre la 10,11-dideshidro-epotilona
D y la Epo506 (figura 7), que fue similar al cambio de congéneres
entre los compuestos de la epotilona epoxidada y sin epoxidar
obtenidos mediante el cultivo de la cepa progenitora,
K111-32.25, en estos dos niveles de oxígeno en
disolución (tabla 1).
Se obtuvo un espectro de masas de gran
resolución de la Epo506 con un espectrómetro Mariner TOF (Applied
Biosystems, Foster City, CA) configurado con una fuente de
turbopulverización de iones en el modo de iones positivos. Se
registraron espectros de RMN mono- y bidimensionales de la Epo506 a
300 K con un espectrómetro DRK 400 (Bruker, Billerica, MA) equipado
con una cabeza sondadora en gradiente de eje z QNP. Los
desplazamientos químicos se refirieron a \delta 7.26 y 77.0 para
espectros de ^{1}H y ^{13}C, respectivamente.
La fórmula molecular de la Epo506 se determinó
que era C_{27}H_{39}NO_{6} mediante la medición de HREIMS del
máximo [M+H]^{+} a m/z 506,25887 (calculado para
C_{27}H_{40}NO_{6}S 506,25709), lo que indica la
incorporación de un átomo de oxígeno con respecto a la
10,11-dideshidro-epotilona D. El
espectro de ^{13}C indicó que la Epo506 poseía un doble enlace
menos que la
10,11-dideshidro-epotilona D, lo que
sugiere que la Epo506 contiene un anillo adicional. Los datos de
HSQC, HMBC, COSY y TOCSY permiten la asignación inequívoca de la
conectividad del carbono. Los desplazamientos químicos en los
carbonos 3, 7, 10 y 13 indicaron que los cuatro carbonos se unieron
a átomos de oxígeno. Se postuló que dos de estos carbonos oxigenados
formaban parte de un éter cíclico que justificaba la fórmula
molecular. Los protones de los hidroxilos de los carbonos 3 y 13
eran visibles en los espectros mono- y bidimensionales, y sus
correlaciones en HMBC y COSY con los átomos vecinos confirmaron sus
asignaciones. Por lo tanto, el éter cíclico debe incluir los
carbonos 7 y 10, lo que indica una estructura de tetrahidrofurano.
Los aductos importantes de Na^{+} y K^{+} en el espectro de
masas también confirmaron que el ion observado a 506,3 mediante
LC/MS es realmente el ion molecular, y no un fragmento generado
después de la ionización de un hipotético progenitor diólico.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se ha demostrado que la modulación del oxígeno
disuelto durante el cultivo de las células hospedadoras heterólogas
ha desplazado la distribución de los congéneres policetídicos. En
este ejemplo, se sometió la cepa productora de epotilonas a una
tensión del oxígeno que dio lugar a un cambio de la distribución de
los congéneres epotilónicos cuando se cultivó en condiciones de
agotamiento de oxígeno. La cepa de Sorangium cellulosum
Soce90 K111-150.17 es un mutante resistente a la
rifamicina derivado de la cepa progenitora Soce90 mediante
mutagénesis por UV (B. Julien, resultados sin publicar). Las
metodologías de cultivo y los métodos analíticos utilizados en este
ejemplo se realizaron tal y como se describió en el ejemplo 1
anterior.
La cepa de Sorangium cellulosum
Soce90 K111-150.17 es un productor de las epotilonas
A y B que tiene un gen activo epoK. La figura 8 (a) ilustra
la proliferación celular en el tiempo medida mediante la densidad
óptica (DO) a 600 nm en tres condiciones de oxigeno disuelto (OD) y
flujo de aire diferentes en lpm (litros por minuto). La figura 8
(b) muestra el efecto de la modulación del oxígeno disuelto sobre la
distribución del producto epotilónico. La cepa de Sorangium
cellulosum Soce90 K111-150.17, un productor
de las epotilonas A y B, produce las epotilonas C y D en
condiciones de agotamiento al 0% del oxígeno disuelto. La tabla 2
muestra las titulaciones de las epotilonas observadas producidas por
la cepa K111-150.17 en diferentes condiciones de
tensión del oxígeno. La producción observada de epotilona D es
varias veces mayor en agotamiento de oxígeno disuelto al 0% que en
un exceso del oxígeno disuelto al 50% para la cepa
K111-150.17.
La figura 9 muestra la cinética de la producción
de las epotilonas A, B, C y D de la cepa K111-150.17
en tres regímenes diferentes de oxígeno disuelto que muestra una
mayor producción de la epotilona D en regímenes bajos de la tensión
de oxígeno. Las cromatografías HPLC de las fermentaciones realizadas
en una tensión de oxígeno disuelto al 50% y una tensión del oxígeno
al 0% muestran la producción casi exclusiva de las epotilonas A y B
con una tensión del oxígeno al 50%, y que la mayor cantidad de las
epotilonas C y D se produjo con una tensión de oxígeno bajo.
Los ejemplos anteriores son para ilustrar la
presente invención.
Claims (8)
1. Un método para modular la proporción de la
producción de la distribución de los congéneres policetídicos en
una célula hospedadora mixobacteriana, que comprende una enzima a
medida activa dependiente de oxígeno, comprendiendo el método las
etapas de cultivar dicha célula hospedadora en un cultivo con
agotamiento de oxígeno en el medio de crecimiento en condiciones
que conducen a la producción de policétidos, en el que la proporción
de la producción de los congéneres policetídicos se desplaza de las
epotilonas A y B a las epotilonas C y D.
2. El método de la reivindicación 1, que además
comprende la etapa de complementar el medio de crecimiento con
serina.
3. El método de la reivindicación 1, que además
comprende la etapa de complementar el medio de crecimiento con
acetato.
4. El método de la reivindicación 1, que además
comprende la etapa de complementar el medio de crecimiento con
propionato.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha célula hospedadora es Myxococcus xanthus con
una monooxigenasa EpoK^{+} activa.
6. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha célula hospedadora es Sorangium cellulosum.
7. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha célula hospedadora es la cepa de Myxococcus
xanthus K111.32.25, con n.º de depósito
PTA-1700.
8. El método de la reivindicación 1, en el que
la enzima a medida dependiente de oxígeno es la EpoK.
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