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KR20030032942A - 폴리케타이드의 제조방법 - Google Patents

폴리케타이드의 제조방법 Download PDF

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KR20030032942A
KR20030032942A KR1020027014529A KR20027014529A KR20030032942A KR 20030032942 A KR20030032942 A KR 20030032942A KR 1020027014529 A KR1020027014529 A KR 1020027014529A KR 20027014529 A KR20027014529 A KR 20027014529A KR 20030032942 A KR20030032942 A KR 20030032942A
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개리 애쉴리
스코트 프릭먼
브라이언 쥴리안
레오나드 캇쯔
챠이탄 코슬라
재니스 라우
피터 제이. 리카리
라이카 레젠틴
다니엘 산티
리 탕
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코산 바이오사이언시즈, 인코포레이티드
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Abstract

재조합믹소코커스 (Myxococcus) 숙주 세포를 이용하여 발효 브로쓰로부터 정제되어 결정화될 수 있는 에포틸론 및 에포틸론 유사체를 비롯한, 폴리케타이드를 제조할 수 있다.

Description

폴리케타이드의 제조방법{PRODUCTION OF POLYKETIDES}
[2] 폴리케타이드는 일련의 Claisen형 축합반응과 후속적인 변형을 거쳐, 적어도 부분적으로는 2개의 탄소 단위 빌딩 블록 화합물로부터 합성된, 다양한 구조의 화합물 군으로 이루어져 있다. 폴리케타이드는 테트라사이클린 및 에리쓰로마이신과 같은 항생제, 에포틸론 및 다우노마이신과 같은 항암제, 그리고 FK506, FK520및 라파마이신과 같은 면역억제제를 포함한다. 폴리케타이드는 곰팡이 및 균사체를 비롯한 많은 종류의 생명체에서 자연적으로 발생한다. 폴리케타이드는 흔히 PKS 효소라고 부르는 폴리케타이드 신타제 효소에 의해 생체내에서 합성된다. PKS에는 그 구조와 폴리케타이드의 합성방식을 달리하는 2가지 중요한 PKS가 알려져있다. 이들 2 유형은 흔히 타잎 I 또는 모듈형 PKS 효소와 타잎 II 또는 반복형 (방향성) PKS 효소라고 칭해진다.
[3] 본 발명은 모듈형 및 반복형 PKS 효소의 생산을 위한 방법, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포, 그리고 이들 효소에 의해 생산되는 폴리케타이드를 제공한다. 모듈형 PKS 효소는 일반적으로 다단백질 복합체 (multi-protein complexes)로서 여기서 각각의 단백질은 복수개의 활성부위를 함유하며, 이들 각각은 탄소쇄 조립 및 변형이 진행되는 동안 오직 한번만 이용된다. 한편 반복형 PKS 효소도 일반적으로 다단백질 복합체이지만, 여기서 각각의 단백질은 오직 하나 또는 많아야 2개의 활성부위만을 함유하며, 이들 각각은 탄소쇄 조립 및 변형이 진행되는 동안 여러차례 이용된다. 하기란에서 상세히 설명되는 바와 같이, 모듈형 및 방향성 PKS 효소 두가지 모두에 대한 다수의 유전자가 클로닝 되었다.
[4] 모듈형 PKS 유전자는 로딩 모듈, 몇개의 익스텐더 모듈 및 방출 도메인을 코딩하기 위해 조직된 코딩 서열들로 이루어진다. 이하에 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, 이들 각각의 도메인과 모듈은 하나 이상의 특정 기능을 갖는 폴리펩타이드에 대응한다. 일반적으로 로딩 모듈은 폴리케타이드를 합성하는데 이용되는 제 1 빌딩 블록과 결합하여 이것을 제 1 익스텐더 모듈에 전달하는 역할을 한다. 복합폴리케타이드를 형성하는데 사용되는 빌딩 블록은 일반적으로 아실티오에스테르, 가장 흔하게는 아세틸, 프로피오닐, 말로닐, 메틸말로닐, 히드록시말로닐, 메톡시말로닐 및 에틸말로닐 CoA이다. 다른 빌딩 블록들로는 아미노산 및 아미노산-유사 아실티오에스테르를 들 수 있다. PKS는 아실티오에스테르 빌딩 블록들 사이의 반복적인 탈카르복실화 Claisen 축합반응을 통해 폴리케타이드의 생합성을 촉매한다. 각각의 모듈은 빌딩 블록의 결합, 그 빌딩 블록에 대한 한가지 이상의 기능의 수행, 및 결과적인 화합물을 다음 모듈에 전달하는 역할을 한다. 다음 모듈은 이번에는, 다음 빌딩 블록을 부착하여 합성이 완결될 때까지, 점점 성장하는 화합물을 다음 모듈에 전달하는 역할을 한다. 이 시점에서, 방출 도메인, 흔히 효소적 티오에스테라제 (TE: thioesterase)의 활성에 의해 폴리케타이드가 PKS로부터 분리된다.
[5] 6-데옥시에리쓰로놀라이드 B (6-dEB: 6-deoxyerythronolide B)로 알려진 폴리케타이드는 프로토타잎 모듈 PKS 효소에 의해 합성된다. 6-dEB를 합성하는 데옥시에리쓰로놀라이드 B 신타제 또는 DEBS로 알려진 멀티-서브유닛 단백질을 코딩하는eryAI, eryAII및eryAIII로 알려진 유전자들이 미국 특허 제 5,672,491호, 5,712,146호 및 5,824,513호에 기재되어 있으며, 이들은 본 명세서에 참조삽입되었다.
[6] DEBS PKS의 로딩 모듈은 아실트랜스퍼라제 (AT: acyltransferase)와 아실 캐리어 단백질 (ACP: acyl carrier protein)로 구성된다. DEBS 로딩 모듈의 AT는 프로피오닐 CoA을 인식하여 (다른 로딩 모듈 AT들은 아세틸, 말로닐, 메틸말로닐, 또는 부티릴 CoA와 같은 다른 아실-CoA를 인식할 수 있음) 이것을 티오에스테르로서 로딩 모듈의 ACP에 전달한다. 이와 동시에, DEBS의 6개의 익스텐더 모듈 각각의 AT는 메틸말로닐 CoA를 인식하여 (다른 익스텐더 모듈 AT들은 말로닐 또는 알파-치환 말로닐 CoA, 즉, 말로닐, 에틸말로닐 및 2-히드록시말로닐 CoA와 같은 다른 CoA를 인식할 수 있음) 이를 그 모듈의 ACP에 전달함으로써 티오에스테르를 형성한다. 일단 DEBS가 프로피오닐- 및 메틸말로닐-ACP에 의해 프라임되면, 로딩 모듈의 아실기가 이동하여 제 1 익스텐더 모듈의 KS에서 티오에스테르를 형성한다 (에스테르-전환); 이 단계에서, 모듈 1은 메틸말로닐 ACP에 인접한 아실-KS를 갖는다. DEBS 로딩 모듈로부터 유도된 아실기는 부수적으로 일어난 탈카르복실화에 의해 추진되어이제 익스텐더기의 알파-탄소에 공유적으로 결합하여 탄소-탄소 결합을 형성하게 되고, 로딩 유닛보다 2개 탄소가 더 긴 (신장 또는 확장) 백본을 갖는 새로운 아실-ACP를 발생시킨다. 성장하는 폴리케타이드 사슬은 ACP로부터 DEBS의 다음 모듈의 KS로 전달되고, 이 프로세스는 이런 방식으로 계속된다.
[7] DEBS의 각 모듈의 2개 탄소에 의해 성장하는 폴리케타이드 사슬은 조립-라인과 유사한 프로세스로, 모듈에서 모듈로, 공유결합된 티오에스테르로서 연속적으로 전달된다. 이 프로세스 단독에 의해 생산된 탄소 사슬은 탄소 원자를 하나씩 걸러서 케톤을 가짐으로 해서 폴리케톤을 생산하며, 여기서 폴리케타이드라는 이름이 유래된 것이다.그러나, 보통은, 사슬이 다음 모듈로 전달되기 전에 2-탄소 유닛이 미리 부가되어 있는 폴리케타이드 사슬의 베타 케토기를 부가적인 효소활성이 변형시킨다. 다라서, 탄소-탄소 결합을 형성하는데 필요한 ACP, KS 및 AT를 함유하는 최소 모듈에 더해서, 모듈은 베타-케토기를 알코올로 환원시키는 케토리덕타제(KR: ketoreductase)를 함유할 수 있다. 모듈은 또한 KR과 이에 더해 알코올을 이중 결합으로 탈수시키는 탈수효소 (DH: dehydratase)를 함유할 수 있다. 모듈은 또한 KR, DH, 그리고 메틸렌 관능기로서 베타 탄소를 이용하여 이중결합을 포화단일결합으로 전환시키는 에노일리덕타제 (ER: enoylreductase)를 함유할 수도 있다. DEBS 분자는 KR 도메인만, 불활성 KR 도메인만, 그리고 KR, DH 및 ER 도메인의 세가지 모두와 함께 이들을 포함한다.
[8] 일단 폴리케타이드 사슬이 PKS의 최후 모듈을 가로지르면, 방출 도메인, 대개는 대부분의 PKS 효소의 카르복실 말단에서 발견되는 티오에스터라제와 마주치게 된다. 여기서, 폴리케타이드는 효소로부터 떨어져 나오고, 전부는 아니지만 대다수의 폴리케타이드가 고리화된다. 폴리케타이드는 테일러링 또는 변형 효소에 의해 더욱 변형될 수 있으며; 이 효소들은 탄수화물기 또는 메틸기를 부가하거나 또는 다른 변형들, 즉, 폴리케타이드 코어 분자 및/또는 그의 치환기 상에 산화 또는 환원을 가한다. 예컨대, 6-dEB는 히드록실화 및 글리코실화 (글리코시드화)되고, 글리코실 치환기의 하나는 메틸화되어사카로폴리스포라 에리쓰라에아(Saccharopolyspora erythraea) 세포에서 자연적으로 생산되는 공지의 항생제인 에리쓰로마이신 A를 생산한다.
[9] 상기의 설명은 일반적으로는 모듈형 PKS 효소, 특히 DEBS에 적용되며, 자연에는 많은 수의 변형이 존재한다. 예컨대, 많은 PKS 효소는 DEBS의 로딩 모듈과 달리, 데카르복실라제 (decarboxylase)로서 작용하는 "불활성" KS 도메인을 함유하는 로딩 분자를 포함한다. 이 불활성 KS는 대부분의 경우에 있어서 KSQ라고 칭해지는데, 상기 윗첨자는 케토신타제 활성에 요구되는 활성 부위 시스테인 대신 존재하는 아미노산 (글루타민)의 단일-문자 약자이다. 에포틸론 PKS 로딩 모듈은 활성 부위 시스테인 대신 티로신이 존재하는 KSY도메인을 함유한다. 또한, 다른 폴리케타이드의 합성은 DEBS나 에포틸론 로딩 모듈에 의해 결합된 것들과는 다른 스타터 유닛에 의해 개시된다. 이러한 스타터 유닛에 결합하는 효소에는 예컨대 FK520, FK506 및 라파마이신의 생합성에 사용되는 것과 같은 AMP 리가제, 레이나마이신의 생합성에 사용되는 것과 같은 비-리보좀성 펩타이드 신타제 (NRPS: non-rebisiomal peptide synthase), 또는 가용성 CoA 리가제가 포함될 수 있다.
[10] PKS 효소 중의 다른 중요한 변형은 익스텐더 유닛으로서 인코포레이션된 빌등 블록 유형과 관계가 있다. 스타터 유닛의 경우, 익스텐더 모듈로서 하나 이상의 NRPS 모듈을 이용하여 아미노산과 유사한 아실티오에스테르 빌딩 블록을 인코포레이션한다. 에포틸론 PKS는 예컨대, NRPS 모듈을 함유한다. 이러한 또 다른 변형예가 FK506, Fk520 및 라파마이신 PKS 효소에서 발견되는데, 이들은 피페콜레이트 잔기를 인코포레이션하면서 PKS의 방출 도메인 역할을 하는 NRPS를 함유한다. 또 다른 변형은 익스텐더 모듈 중의 부가적인 활성에 관련되어 있다. 예컨대, 에포틸론 PKS의 한 모듈은 메틸기를 폴리케타이드에 인코포레이션시키는 메틸트랜스퍼라제 (MT) 도메인을 함유한다.
[11] 모듈형 및 반복형 PKS 유전자를 조작하기 위한 재조합 방법이 미국특허5,962,290호; 5,672,491호; 5,712,146호; 5,830,750호; 및 5,843,718호; 및 PCT 특허공개 98/49315호 및 97/02358호에 개시되어 있으며 이들은 본 명세서에 참조삽입되었다. 상기 및 다른 특허문헌은 신규한 폴리케타이드를 생산하는 2가지 이상의 서로 다른 PKS 유존자 또는 유전자 클러스터 부분들을 결합시킴으로써 조립된 재조합 PKS 유전자 뿐만 아니라, 폴리케타이드의 이종 (heterologous) 생산을 위한 재조합 발현 벡터에 대해서도 개시하고 있다. 현재까지, 자연적으로 폴리케타이드를 생산하는스트렙토마이세스(Streptomyces)와 같은 미생물, 및 자연적으로는 폴리케타이드를 생산하지 않는E. coli및 효모와 같은 미생물에서 공지 또는 신규한 폴리케타이드를 생산하기 위해 상기한 방법들이 이용되어 왔다 (미국 특허 6,033,883호, 본 명세서에 참조삽입됨). 후자의 숙주에 있어서, 폴리케타이드 생산은 PKS의 ACP 도메인을 활성화시키는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (phosphopantetheinyl transferase)의 이종 발현에 의존한다 (PCT 공개 No. 97/13845호 참조. 본 명세서에 참조 삽입됨).
[12] 이러한 방법이 나름대로 가치있고 매우 유용하긴 하지만, 어떤 폴리케타이드들은 극히 낮은 농도로만 발현되거나, 또는 사용된 이종 숙주 세포에 대해 독성을 나타낸다. 일례로, 에포틸론 PKS 유전자의 이종 발현에 의해 스트렙토마이세스 (Streptomyces)에서 항암제 에포틸론 A, B, C 및 D가 생산되었다 (Tang 외, 2000. 01. 28, Cloning and heterologous expression of the epothilone gene cluster, Science, 287: 640-642, 및 PCT 공개번호 00/031247 참조. 각각 본 명세서에 참조 삽입됨). 에포틸론 A와 B는 50 내지 100μg/L 미만의 농도로 생산되었으며 프로듀서 세포에 대해 나쁜 영향을 미치는 것으로 나타났다.
[13] 에포틸론 A와 B는 처음에는 믹소박테리움인소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum)으로부터 추출된 항진균 활성을 갖는 것으로 동정되었으며 (Gerth 외, 1996, J. Antibiotics 49: 560-563 및 독일특허 제 DE 41 38 042 참조, 본 명세서에 참조삽입됨), 후에는 튜불린 중합 분석에서 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (Bollag 외, 1995, Cancer Res. 55:2325-2333, 본 명세서에 참조삽입됨). 이후, 에포틸론 A와 B 그리고 특정의 자연발생적인 유도체와 합성 유도체가 암 치료를 위한 잠재적인 항종양제로서 집중적으로 연구되어왔다.소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum) 스트레인 So ce 90에 의해 생산된 에포틸론의 화학 구조는 Hofle 외, 1996, Epothiolone A and B - novel 16-membered macrolides with cytotoxic activity: isolation, crystal structure, and conformation in solution, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (13/14): 1567-1569에 설명되어 있다 (본 명세서에 참조삽입됨). 에포틸론 A (R=H)와 B (R=CH3)는 하기의 구조를 가지며 진핵 세포에 대해 광범위한 세포독성 활성과 유방종양 및 결장 종양 세포주에 대해 두드러진 활성 및 선택성을 갖는 것으로 나타났다.
[14] 에포틸론 C (R=H)와 D (R=CH3)로도 알려진 에포틸론 A와 B의 데속시 (desoxy) 카운터파트들이 de novo법으로 화학적으로 합성된 바 있지만,소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum)의 발혀시 소량 생성물로서도 존재한다 에포틸론 C와 D는 에포틸론 A 및 B에 비해 세포독성이 약하며; 그 구조는 다음과 같다.
[15] 자연발생적인 다른 에포틸론들도 설명되어 왔다. 이들에는 에포틸론 E와 F가 포함되며 여기에는 에포틸론 A 및 B의 티아졸 부분의 메틸 측쇄가 히드록실화되어 다른 많은 에포틸론 화합물 뿐만 아니라 각각 에포틸론 E 및 F가 생산된다 (PCT 공개번호 99/65913호 참조, 본문에 참조삽입됨)
[16] 에포틸론은 항암제로서의 잠재적 용도를 갖고, 자연의 So ce 90 스트레인에 의해 생산된 에포틸론은 농도가 낮기 때문에, 몇몇 연구팀들이 에포틸론을 합성하기 위한 시도를 행하였다. 상기한 바와 같이, 이러한 노력은 성공을 거두었다 (Balog 외, 1996, Total synthesis of (-)-epothilone A,Angezv. Chem. Int. Ed. Engl.35 (23/24) : 2801-2803 ; Su 외., 1997, Total synthesis of (-)-epothilone B : an extension of the Suzuki coupling method and insights into structure-activity relationships of the epothilones,Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36(7) : 757-759 ; Meng 외., 1997, Total syntheses of epothilones A andB,JACS 119(42) : 10073-10092 ; and Balog 외., 1998, A novel aldol condensation with 2-methyl-4-pentenal and its application to an improved total synthesis of epothilone B,Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 37(19) : 2675-2678 참조, 모두 본 명세서에 참조삽입됨). 이러한 노력의 성공에도 불구하고, 에포틸론의 화학적 합성은 지루하고, 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 든다. 실제로, 이 방법은 항암제로서의 에포틸론을 대규모로 약학적으로 개발하는데는 무용지물이다.
[17] 에포틸론 A - D 뿐만 아니라 많은 수의 에포틸론 유도체가 생체외 및 생체내에서 연구되었다 (Su 외, 1997, Structure-activity relationships of the epothilones and the first in vivo comparison with paclitaxel,Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36(19) : 2093-2096 ; 및 Chou 외, Aug. 1998, Desoxyepothilone B : an efficacious microtubule-targeted antitumor agent with a promising in vivo profile relative to epothilone B,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 9642-9647, 본문에 참조삽입됨). 부가적인 에포틸론 유도체 및 에포틸론과 에포틸론 유도체의 합성방법이 PCT 공개번호 00/23452, 00/00485, 99/67253, 99/67252, 99/65913, 99/54330, 99/54319, 99/54318, 99/43653, 99/43320, 99/42602, 99/40047, 99/27890, 99/07692, 99/02514, 99/01124, 98/25929, 98/22461, 98/08849, 및 97/19086 ; 미국특허 No. 5,969,145; 및 독일 특허공개 DE 4138 042에 설명되었으며 상기 문헌은 본 명세서에 참조삽입되었다.
[18] 향상된 특성을 갖는 새로운 에포틸론 유도체 뿐만 아니라 자연발생적인에포틸론, 그의 유도체 또는 전구체를 생산하기 위한 경제적인 수단에 대한 필요가 남아있다. 이러한 자연적인 생산자인 소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum)보다 취급 및 발효가 더 용이하게 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 생산하고 소망되는 폴리케타이드 산물을 더 많이 생산하는 숙주 세포가 필요하다. 본 발명은 폴리케타이드를 높은 수준으로 생산하며, 에포틸론 뿐만 아니라, 본 발명에 설명된 새로운 에포틸론 유도체 및 기타의 폴리케타이드를 생산하는데 유용한 숙주 세포를 제공함으로써 상기한 필요를 만족시킨다.
발명의 요약
[19] 한가지 구체예에서, 본 발명은 이종 PKS 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 함유하며 이들 벡터 상의 상기 유전자에 의해 코딩된 PKS 효소에 의해 합성된 폴리케타이드를 생산하는시스토박테리네아에(Cystobacterineae) 아목의 재조합 숙주 세포를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는믹소코커스(Myxococcus)속 또는스티그마텔라(Stigmatella)속으로부터 유래하는 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 믹소코커스 스티피타투스 (M. stipitatus), 믹소코커스 풀부스 (M. fulvus), 믹소코커스 잔투스 (M. xanthus), 믹소코커스 비레센스 (M. virescens), 스티그마텔라 에렉타 (S. erecta),및스티그마텔라 아우란티아카 (S. aurantiaca)중에서 선택되는 것이 좋다.
[20] 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포에서 염색체 삽입 또는 엽색체외 복제를 할 수 있는 재조합 DNA 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 PKS 코딩 서열을 적어도 일부분 포함하며 본 발명의 숙주 세포 내에서 기능적 PKS효소의 발현을 지시할 수 있다. 관련된 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포에서 생산되지 않거나 적은 양으로만 생산되는 폴리케타이드 생합성의 기질을 생산하는데 요구되는 유전자 또는 유전자 산물을 포함하는 숙주 세포 및 벡터를 제공한다. 한가지 구체예에서, 유전자 및 유전자 산물은 에틸말로닐 CoA의 합성을 촉매한다. 또 다른 구체예에서, 상기 유전자 및 유전자 산물은 부티닐 CoA의 합성을 촉매한다.
[21] 또 다른 구체예에서 본 발명은 시스토박테리네아에 (Cystobacterineae) 아목의 숙주세포에서 폴리케타이드를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 폴리케타이드는 상기 숙주 세포에서는 자연적으로는 생산되지 않는 것으로, 상기 방법은 본 발명의 재조합 DNA 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포를 상기 벡터 상에 코팅된 PKS 유전자가 발현되는 조건 하에서 배양한 다음 상기 폴리케타이드를 생산하는 단계를 포함한다. 관련 구체예에서, 본 발명은 폴리케타이드의 고수율 생산을 가능케 하는 본 발명의 숙주 세포의 발효방법을 제공한다.
[22] 바람직한 구체예에서, 본 발명의 재조합 숙주 세포는 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 생산한다. 따라서, 본 발명은 소망되는 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 생산하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 이 숙주 세포는 1종 이상의 에포틸론을 10 mg/L 이상의 양으로 생산한다. 한가지 구체예에서, 본 발명은 에포틸론을 자연적으로 생산하는 생물에서 생산되는 양모다 더 많은 양으로 한가지 이상의 에포틸론을 생산하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 에포틸론을 생산하는 자연 발생적인 숙주 세포에 의해 생산되는혼합물보다 덜 복잡한 에포틸론의 혼합물을 생산하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 재조합 숙주 세포는 또한 주생성물로서 오직 1종의 소망되는 에포틸론 또는 에포틸론 유도체만을 생산하는 숙주 세포도 포함한다.
[23] 관련된 바람직한 구체예에서, 본 발명은 에포틸론 PKS의 일부 또는 전부를 코딩하는 재조합 DNA 발현 벡터를 제공한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포에서 에포틸론 A, B, C 및 D를 생산하는데 요구되는 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 발현 벡터도 제공한단. 본 발명은 또한 에포틸론 생합성에 관계된 단백질의 전부 또는 일부 및, 또 다른 폴리케타이드나 리보좀-유래 펩타이드의 생합성과 관련된 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 하이브리드 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 화합물도 제공한다.
[24] 또 다른 구체예에서, 본 발명은 농업, 수의학 및 의약 분야에서 유용한 실제로 순수한 형태의 신규한 에포틸론 유도체 화합물을 제공한다. 이 화합물들에는 에포틸론 A, B, C 및 D의 16-데스메틸; 14-메틸; 13-옥소; 13-옥소-11,12-데히드로; 12-에틸; 13-히드록시-10,11-데히드로; 11-옥소; 11-히드록시; 10-메틸; 10,11-데히드로; 9-옥소; 9-히드록시; 8-데스메틸; 6-데스메틸; 및 2-메틸 유사체 (analogues), 및 자연발생적인 에포틸론의 메틸티아졸 부분이 다른 부분으로 대체된 여러가지 유사체가 포함된다. 한가지 구체예에서, 이 화합물들은 살진균제 (fungicide)로서 유용하다. 또 다른 구체예에서, 이 화합물들은 항암제로서 암의 화학요법에 유용하다. 바람직한 구체예에서, 이 화합물은 종양 세포에 대해 적어도에포틸론 B 또는 D만큼 강력한 활성을 갖는 에포틸론 유도체이다. 또 다른 구체예에서, 이 화합물들은 면역억제제로서 유용하다. 또 다른 구체예에서, 이 화합물들은 또 다른 화합물의 제조에 유용하다. 바람직한 구체예에서, 이 화합물들은 인간 또는 동물에 투여하기 위한 혼합물 또는 용액제로서 조제될 수 있다.
[25] 또 다른 구체예에서, 본 발명은 에포틸론의 정제방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 에포틸론은 발효 브로쓰로부터 정제되는 것이 좋다.
[26] 또 다른 구체예에서, 본 발명은 에포틸론 화합물을 고도로 정제된 형태로 제공한다. 바람직한 구체예에서, 에포틸론은 순도가 95%를 초과하는 것이 좋다. 더욱 바람직한 구체예에서, 에포틸론은 순도가 99%를 초과하는 것이 좋다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 에포틸론을 결정 형태로 제공한다. 특히 바라직한 구체예에서, 본 발명은 결정성 에포틸론 D를 제공한다.
[27] 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 신규한 에포틸론 화합물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료법을 제공한다. 본 발명의 화합물과 조성물은 건선 및 염증을 비롯한 (그러나 이들로 한정되지 않음) 기타의 증식성 질환 또는 증상을 치료하는데도 효과적이다.
[28] 본 발명의 이들 및 기타의 구체예는 다음의 설명, 실시예 및 청구범위에서 보다 상세히 설명하기로 한다.
[1] 본 발명은 재조합 숙주 세포에서 폴리케타이드를 제조하기 위한 재조합 방법 및 재료; 폴리케타이드를 생산하는 재조합 숙주 세포; 에포틸론과 구조적으로 연관된 신규한 폴리케타이드; 에포틸론의 정제방법; 및 에포틸론 D의 결정 형태를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 재조합 숙주 세포는 모듈형(modular)또는 반복형(iterative) 폴리케타이드 신타제 (PKS: polyketide synthase) 유전자를 코딩하는 본 발명의 재조합 DNA 발현 벡터에 의해 형질전환된,시스토박테리네아에(Cystobacterineae) 아목, 바람직하게는믹소코커스(Myxococcus)속 및스티그마텔라(Stigmatella)속으로부터 유래한 것이다. 본 발명의 재조합 숙주 세포는 에포틸론 및 에포틸론 유도체를 비롯한 공지 및 신규의 폴리케타이드를 생산하며 생산할 수 있는 폴리케타이드는 이들로 한정되지 않는다. 본 발명은 농업, 화학, 의약화학, 의약, 분자생물학 및 약물학 분야에 관한 것이다.
[29] 도 1은 신규한 에포틸론 유도체를 생산하기 위해 NRPS-유사 모듈 1 또는 모듈 2 KS 도메인이 불활성화된 본 발명의 에포틸론 PKS에 공급될 수 있는 N-아세틸 시스티아민 티오에스테르 유도체의 몇몇 전구체 화합물들을 보여준다. 이러한 화합물을 만들기 위한 일반적인 합성과정도 도시되어 있다.
[30] 도 2는 플라스미드 pKOS35-82.1 및 pKOS35-82.2의 제한효소 자리 및 기능 지도를 나타낸 것이다.
[31] 도 3은 플라스미드 pKOS35-154 및 pKOS90-22의 제한효소 자리 및 기능지도를 나타낸 것이다.
[32] 도 4는 실시예 2에 설명된 바와 같이믹소코커스 잔투스(Myxococcus xantus) 숙주 세포의 염색체 내로 에포틸론 PKS를 도입하기 위한 프로토콜 및 수식 효소 유전자의 개략도를 도시한 것이다.
[33] 도 5는 실시예 2에 설명된 바와 같은 pBeloBACII의 지도를 도시한다.
[34] 도 6은 5g/L 카시톤 (췌장의 카제인 소화) 및 2g/L 마그네슘 설페이트만으로 이루어진 단순 생산 배지에서믹소코커스 잔투스(Myxococcus xantus) K111-40-1의 베이스라인 성능을 도시한 것이다. 부호 설명: 뱃치 프로세스에서 기초 CTS 배지에서의 성장 (●), 생산 (■), 및 암모니아 발생 (▲); 배양 조건은 실시예 3의 재료 및 방법란에 설명된 바와 같다.
[35] 도 7은 CTS 생산 배지에서믹소코커스 잔투스(Myxococcus xantus) 균주 K111-40-1의 발효 성능에 미치는 XAD-16 수지의 효과를 도시한 것이다. 부호설명: 뱃치 프로세스에서 CTS 생산 배지에 20g/L의 XAD-16 수지를 첨가한 경우의 성장 (●) 및 생산 (■) 프로필.
[36] 도 8은 성장 및 생산 수율에 미치는 카시톤의 영향을 도시한다. 부호설명: 성장 (●), 생산 (■), 및 비생산성 (specific productivity) (▲)에 미치는 카시톤 농도의 효과.
[37] 도 9는 성장 및 생산 수율에 미치는 미량원소 및 고농도 메틸 올리에이트의 영향을 도시한다. 부호설명: 생산에 미치는 메틸 올리에이트 (●) 및 미량 원소 (■)의 효과.
[38] 도 10A는 뱃치 발효 프로세스에서 메틸 올리에이트와 미량 원소가 최적 농도로 존재하는 경우믹소코커스 잔투스(Myxococcus xantus) 균주의 성장 및 생산을 도시한다. 대수기는 접종한지 최초 2일 이내에 일어났다. 에포틸론 D의 생산은 정상기 시작과 함께 개시되어 제 5일에 메틸 올리에이트가 고갈되면서 세포 용해 (cell lysis)가 일어나자 중단되었다. 도 10B는 뱃치 발효 프로세스에서 메틸 올리에이트와 미량원소가 최적 농도로 존재하는 경우믹소코커스 잔투스(Myxococcus xantus) 균주의 성장 및 생산이 진행되는 동안의 암모니아의 발생과 메틸 올리에이트의 소비에 상응하는 시간 경과를 도시한다. 부호설명: A) 뱃치 프로세스에서 CTS 생산 배지에 최적 농도의 메틸 올리에이트 (7mL/L)와 미량원소 (4mL/L)를 첨가한 경우의 성장 (●) 및 생산 (■) 프로필. B) 메틸 올리에이트의 소비량 (●) 및 암모니아 발생량 (■)에 대응하는 시간 경과.
[39] 도 11A는믹소코커스 잔투스(Myxococcus xantus) 균주의 성장 및 생산에 미치는 간헐적인 주입-뱃치 프로세스 (intermittent fed-batch process)의 영향을 도시한다. 부호설명: 진탕-플라스크에서 간헐적인 주입-뱃치 프로세스에 있어서의 성장 (●) 및 생산 (■) 프로필. 카시톤과 메틸 올리에이트의 주입 속도는 각각 2 g/L/1일 및 3mL/L/1일이었다. 도 11B는 발효가 진행되는 동안 암모니아의 발생 및 메틸 올리에이트의 일정 소비속도를 보여준다. 부호설명: 배지에 첨가된 메틸 올리에이트의 총량(●), 메틸 올리에이트의 총 소비량 (■), 및 암모니아 발생량 (▲)에 대응하는 시간 경과.
[40] 도 12는 5-L 들이 바이오리액터 중에서 간헐적인 주입-뱃치 프로세스에있어서의 생산 프로필을 도시한다. 카시톤 및 메틸 올리에이트의 주입 속도는 각각 2g/L/1일과 3mL/L/1일이었다.
[41] 도 13A는 성장 및 생산에 미치는 연속식 주입의 효과를 도시한다. 부호설명: 5-L 들이 바이오리액터 중에서 연속식 주입-뱃치 프로세스에 있어서의 성장 (●) 및 생산 (■) 프로필. 카시톤 및 메틸 올리에이트의 주입 속도는 각각 2g/L/1일과 3mL/L/1일이었다. 도 13B는 연속식 주입-뱃치 프로세스가 진행되는 동안 암모니아의 발생량 뿐만 아니라 메틸 올리에이트의 첨가 및 소비량에 대한 시간 경과를 도시한다. 부호설명: 배지에 첨가된 메틸 올리에이트의 총량(●), 메틸 올리에이트의 총 소비량 (■), 및 암모니아 발생량 (▲)에 대응하는 시간 경과. 배양 조건은 재료 및 방법 란에 설명된 바와 같다.
[42] 본 발명의 범위 및 본 명세서에 사용된 용어의 정의를 이하에 제시한다. 특별한 경우에서 달리 한정되지 않는한, 이들 정의는 본 명세서 전반에 걸쳐개별적으로, 혹은 보다 큰 범위의 일부로서 사용된대로의 용어에 적용된다.
[43] 순수한 본 발명의 화합물, 그의 혼합물 뿐만 아니라 본 발명 화합물의 모든 입체이성체도 본 발명의 범위에 포함된다. 개별적인 에난티오머, 부분입체이성체, 기하이성체, 및 이들의 복합물과 혼합물 역시 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 이들 화합물의 결정 형태의 일부가 폴리모르프 (polymorphs)로서 존재할 수 있으며, 그 형태 그대로 본 발명에 포함된다. 또한, 이들 화합물 중 일부는 물과 용매화합물을 형성하거나 (즉, 수화물), 또는 흔한 유기 용매와 용매화합물을 형성할 수 있으며, 이러한 용매화합물 역시 본 발명의 범위에 포괄된다.
[44] 본 발명의 화합물의 보호된 형태들도 본 발명의 범위에 포함된다. 다양한 보호기가 예컨대 T.H. Greene 및 P.G.M. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis, 제3판, John Wiley & Sons, New Yokr (1999)에 예시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조삽입되었다. 예컨대, 본 발명 화합물의 히드록시 보호 형태라 함은 히드록시기들 중 적어도 하나가 히드록시 보호기에 의해 보호된 것이다. 히드록시 보호기의 예로는 테트라히드로피라닐; 벤질; 메틸티오메틸; 에틸티오메틸; 피발로일; 페닐설포닐; 트리페닐메틸; 트리메틸 실릴, 트리에틸실릴, 트리부틸실릴, 트리-이소프로필실릴, t-부틸디메틸실릴, 트리-t-부틸실릴, 메틸디페닐실릴, 에틸디페닐실릴, t-부틸디페닐실릴 등과 같은 트리치환된 실릴; 아실 및 아세틸, 피발로일벤조일, 4-메톡시벤조일, 4-니트로벤조일 및 지방족 아실아릴 등과 같은 아로일 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명 화합물의 케토기도 유사한 방식으로 보호될 수 있다.
[45] 본 발명의 범위에는 본 발명의 화합물들의 전구체도 포함된다. 일반적으로, 이러한 전구체는 생체내에서 소망되는 화합물로 쉽게 변환될 수 있는, 목적 화합물의 기능성 유도체들이다. 따라서, 본 발명의 치료방법에서 "투여하는"이라는 용어는 여러가지 질환을 치료하기 위해, 본 명세서에 명시적으로 기재된 화합물 또는 명시적으로 기재되지는 않았으나, 환자에게 투여된 후 생체내에서 명시된 화합물로 전환되는 화합물을 이용하여 치료하는 것도 포함한다. 적절한 전구체 유도체의 선택 및 제조를 위한 통상적인 방법이 예컨대 "Design of Prodrugs", H. Bundgaard편, Elsevier, 1985에 설명되어 있다.
[46] 본 명세서에서 "지환족 (aliphatic)"이라는 용어는 하나 이상의 위치에서 임의로 치환될 수 있는 포화 및 불포화 직쇄, 분기쇄, 시클릭, 또는 폴리시클릭 탄화수소를 가리킨다. 지환족기의 예로는 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 및 시클로알키닐 부분(moiety)을 들 수 있다. "알킬"이라는 용어는 직쇄 또는 분기쇄의 포화 탄화수소 치환기를 가리킨다. "알케닐"이라 함은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 직쇄 또는 분기쇄상의 탄화수소 치환기를 가리킨다. "알키닐"이라 함은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분기쇄상 탄화수소 치환기를 가리킨다.
[47] "아릴"이라는 용어는 임의로 하나 이상의 이종원자와 바람직하게는 3 내지 14개의 탄소원자를 포함하는, 적어도 하나의 방향성 고리 구조를 갖는 모노시클릭 또는 폴리시클릭기를 가리킨다. 아릴 치환기는 임의로 하나 이상의 위치에치환될 수 있다. 아릴기의 예로는: 퓨라닐, 이미다졸릴, 인다닐, 인데닐, 인돌릴, 이소옥사졸릴, 이소퀴놀리닐, 나프틸, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 페닐, 피라지닐, 피리딜, 피리미디닐, 피롤릴, 피라졸릴, 퀴놀릴, 퀴녹살릴, 테트라히드로나프틸, 테트라조일, 티아조일, 티에닐, 티오페닐 등을 들 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
[48] 지환족 (즉, 알킬, 알케닐 등) 및 아릴 부분은 하나 이상의 치환기, 바람직하게는 1 내지 5개의 치환기, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 치환기, 가장 바람직하게는1 내지 2개의 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다. 분자내의 특정 위치에서의 어떠한 치환기나 배리어블 (variables)의 정의는 그 분자 외의 다른 곳에서의 그의 정의와 관계없다. 본 발명의 화합물 상의 치환기 및 치환 패턴은 당업자에 의해 선택되어 본 명세서에 제시된 방법 뿐만 아니라 공지 기술에 의해 쉽게 합성될 수 있으며 화학적으로 안정한 화합물을 제공할 수 있다. 적절한 치환기의 예로는: 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 할로; 트리플루오로메틸; 트리플루오로메톡시; 히드록시; 알콕시; 시클로알콕시; 헤테로시클로옥시; 옥소; 알카노일 (-C(=O)-알킬, "아실"이라고도 칭해짐), 아릴옥시; 알카노일옥시; 아미노; 알킬아미노; 아릴아미노; 아르알킬아미노; 시클로알킬아미노; 헤테로시클로아미노; 2개의 아미노 치환기가 알킬, 아릴 또는 아르알킬 중에서 선택된 2치환 아민; 알카노일아미노; 아로일아미노; 아르알카노일아미노; 치환된 알카노일아미노; 치환된 아릴아미노; 치환된 아르알카노일아미노; 티올; 알킬티오; 아릴티오; 아르알킬티오; 시클로알킬티오; 헤테로시클로티오; 알킬티오노; 아릴티오노; 아르알킬티오노; 알킬설포닐; 아릴설포닐; 아르알킬설포닐; 설폰아미도 (예컨대 SO2NH2); 치환된 설폰아미도; 니트로; 시아노; 카르복시; 카르바밀 (예컨대, CONH2); 치환된 카르바밀 (예컨대, -C(=O)NRR' 여기서 R과 R'은 각각 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아르알킬 등임); 알콕시카르보닐, 아릴, 치환된 아릴, 구아니디노 및 인돌릴, 이미다졸릴, 퓨릴, 티에닐, 티아졸릴, 피롤리딜, 피리딜, 피리미딜 등과 같은 헤테로시클로를 들 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
[49] "알킬아릴" 또는 "아릴알킬"은 지방족기를 통해 화합물에 결합된 지방족 치환기를 갖는 아릴기를 가리킨다. 알킬아릴 또응 아릴알킬기의 예로는 벤질, 즉 메틸기를 통해 화합물에 결합된, 메틸기를 갖는 페닐을 들 수 있다 (즉, -CH2PH 여기서 Ph는 페닐임).
[50] "아실"이라는 용어는 -C(=O)R을 가리키며, 여기서 R은 지방족기, 바람직하게는, C1-C6부분이다.
[51] "알콕시"라는 용어는 -OR을 가리키며, 여기서 O는 산소이고 R은 지방족기이다.
[52] "아미노알킬"이라 함은 -RNH2를 가리키며, 여기서 R은 지방족 부분이다.
[53] "할로겐", "할로", 또는 "할라이드"는 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 가리킨다.
[54] "할로알킬"은 -RX로서 여기서 R은 지방족 부분이고 X는 하나 이상의 할로겐이다.
[55] "히드록시알킬"은 -ROH로서 여기서 R은 지방족 부분이다.
[56] "옥소"라 함은 카르보닐 산소 (=O)를 가리킨다.
[57] 상술한 기에서의 명시된 치환기에 더해, 본 발명의 화합물들은 적당한 경우에는 다른 치환기들도 포함할 수 있다. 예컨대, 락탐 또는 락탐 골격이나 골격 치환기는 C1-C5지방족, C1-C5알콕시, 아릴 또는 관능기와 같은 한가지 이상의 치환기로 부가적으로 치환될 수 있다 (예컨대, 수소중 하나를 대체하거나 또는 비-수소기를 유도화하거나 함으로써). 적절한 관능기의 예로는: 아세탈, 알코올, 알데히드, 아미드, 아민, 보로네이트, 카바메이트, 카보알콕시, 카보네이트, 카보디이미드, 카르복실산, 시아노히드린, 디설파이드, 에나민, 에스테르, 에테르, 할로겐, 히드라지드, 히드라존, 이미드, 이미도, 이민, 이소시아네이트, 케탈, 케톤, 니트로, 옥심, 포스핀, 포스포네이트, 인산, 4차 암모늄, 설페닐, 설파이드, 설폰, 설폰산, 티올 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
[58] 본 명세서에서 본 발명의 화합물에 대해 "분리된 (isolated)" 이라는 용어를 사용하는 경우는, 본래의 자연적인 상태로부터 인간의 간섭에 의해 변경된 것을 의미한다. 예컨대, 어떤 화합물이 자연적으로 발생한 경우, 이것은 그의 본래의 환경으로부터 변경된 것이거나 제거된 것이거나, 또는 양쪽 모두의 경우일 수 있다. 즉, 살아있는 생명체 내에 존재하는 화합물은 "분리된"것이 아니지만, 본 명세서의 용례에 따르면, 그의 자연적인 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 화합물은 "분리된" 것이다. "분리된"이라는 용어는 불순물이나 소망되지 않은 물질이실질적으로 없는 조제물 중의 화합물도 의미한다. 자연에서 발견되는 화합물의 경우, 그의 본래의 상태에서 그 화합물 또는 조성물과 결합되어 있는 물질이 실제로 없는 것을 의미한다.
[59] 화합물에 대해 "정제된"이라는 의미는 조제물 중에 그 화합물이 주성분으로 존재하는 경우, 즉, 조제물의 총 성분 중량에 대해 약 505, 약 60%, 약 705, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상의 중량으로 존재하는 것을 의미한다.
[60] 본 명세서에서 "환자 (subject)"라 함은 치료, 관찰 또는 실험의 대상이 된 동물, 바람직하게는 포유동물을 가리키는 것으로서, 가장 바람직하게는, 치료 및/또는 관찰 대상이 된 인간을 가리킨다.
[61] "치료적 유효량"이라 함은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상학자에 의해 탐구되는 조직 시스템, 동물 또는 인간에 있어서 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어내는 활성 화합물 또는 약학적 제제의 양을 의미하는 것으로, 여기에는 치료대상인 질병 또는 장애의 증상을 완화시키는 것도 포함된다.
[62] "조성물"이라 함은 특정 성분들의 조합으로부터 직접 또는 간접적으로 결과된 특정량의 여하한 생성물 뿐만 아니라, 특정 성분들을 특정 량으로 포함하는 생성물도 포함한다.
[63] "약학적으로 허용가능한 염"이라 함은 본 발명 화합물의 한가지 이상의 염을 가리킨다. 본 발명 화합물의 적절한 약학적으로 허용가능한 염에는 예컨대, 염산, 황산, 푸마르산, 말렌, 숙신산, 아세트산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 카본산 또는 인산과 같은 약학적으로 허용가능한 산의 용액을 화합물 용액과 혼합함으로써 형성될 수 있는 산부가염이 포함된다. 또한, 본 발명의 화합물이 산성 부분을 지니는 경우, 그의 적절한 약학적으로 허용가능한 염으로는, 알칼리 금속염 (예컨대 소듐 또는 포타슘염); 알칼리토금속염 (예컨대 칼슘 또는 마그네슘염); 및 적절한 유기 리간드와 함께 형성된 염 (예컨대 암모늄, 4차 암모늄 및 할라이드, 히드록시드, 카르복실레이트, 설페이트, 포스포네이트, 니트레이트, 알킬설포네이트 및 아릴 설포네이트와 같은 카운터음이온을 이용하여 형성된 아민 양이온)을 들 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염의 예로는: 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이카보네이트, 바이설페이트, 바이타트레이트, 보레이트, 브로마이드, 부티레이트, 칼슘 에데테이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 캄실레이트, 카보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 클라불라네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 디히드로클로라이드, 도데실설페이트, 에데테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 퓨마레이트, 글루셈테이트, 글루코헵토네이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리세로포르페이트, 글리콜아사닐레이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 헥실레조르시네이트, 히드라바민, 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 히드로요오다이드, 2-히드록시-에탄설포네이트, 히드록시나프토에이트, 요오다이드, 이소티오네이트, 락테이트, 락토바이오네이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 메탄설포네이트, 메실설페이트, 뮤케이트, 2-나프탈렌설포네이트, 납실레이트, 니코티네이트, 니트레이트, N-메틸슬루카민 암모늄염, 올리에이트, 옥살레이트, 파모에이트 (엠보네이트), 팔미테이트, 판토테네이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트/디포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 폴리갈랄튜로네이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 설페이트, 수바세테이트, 석시네이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트, 트리에티오다이드, 운데카노에이트, 발레레이트 등을 들 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
[64] "약학적으로 허용가능한 담체"라 함은 본 발명 화합물의 소명되는 투여 형태를 제조하는데 이용되는 매질을 의미한다. 약학적으로 허용되는 담체에는 용매, 희석제 또는 기타의 액상 비히클; 분산 또는 현탁 보조제; 계면활성제; 등장제; 농후제 또는 유화제, 방부제; 고체 결합제; 윤활제 등이 포함된다. Remington's Pharmaceutical Sciences, 15판, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa, 1975) 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3판, A. H. Kibbe,편 (Amer. Pharmaceutical Assoc. 2000)에는 약학적 조성물을 조제하는데 사용되는 다야한 담체와 그 조제를 위한 공지 기술이 설명되어 있으며, 두 문헌 모두 본 명세서에 참조삽입되었다.
[65] "약학적으로 허용가능한 에스테르"라 함은 생체내에서 수화되어 본 발명의 화합물 또는 그의 염으로 변하는 에스테르를 말한다. 적절한 에스테르기의 예로는 예컨대 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 아크릴레이트 및 에틸석시네이트와 같은 약학적으로 허용가능한 지방족 카르복실산으로부터 유도된 것들이 포함된다.
[66] 본 발명은 재조합 숙주 세포에서 폴리케타이드를 생산하기 위한 재조합방법 및 재료; 폴리케타이드를 생산하는 재조합 숙주 세포; 에포틸론과 구조적으로 관련된 신규한 폴리케타이드; 에포틸론의 정제방법; 및 에포틸론 D의 결정 형태를 제공한다.
[67] 한가지 구체예에서, 본 발명은 이종의 (heterologous) PKS 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 함유하며 상기 벡터에 코딩된 PKS 효소에 의해 합성된 폴리케타이드를 생산하는시스토박테리네아에(Cystobacterineae) 아목의 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본 명세서에서, 재조합이라 함은 유전자 또는 그의 일부를 인간의 간섭에 의해, 전형적으로는 특이적으로 직접 조작함으로써 생산된 세포, 화합물, 또는 조성물에 대해 쓰이는 용어이다.시스토박테리네아에(Cystobacterineae) 아목은믹소코칼레스(Myxococcales)목에 속하는 두가지 중 하나이다 (다른 하나는소란지네아에(Sorangineae)로서, 여기에는 에포틸론을 생산하는소란지움 셀룰로섬(Sorangium cellulosum)이 포함된다).시스토박테리네아에(Cystobacterineae) 아목에는믹소코카세아에(Myxococcaceae)과 및시스토박테리네아에(Cystobacterineae)과가 포함된다.믹소코카세아에(Myxococcaceae)과에는 다시안지오코커스(Angiococcus)속 (즉,A. disciformis), 믹소코커스(Myxococcus)속,코랄로코커스(Corallococcus)속 (즉,C. macrosporus, C. corralloides,및C. exiguus)이 포함된다.시스토박테리네아에(Cystobacterineae)과에는시스토박터(Cystobacter)속, (즉,C. fuscus, C. ferrugineus, C. minor, C. velatus, 및C. violaceus),멜리탄지움(Melittangium)속 (즉,M. boletus및M. lichenicola),스티그마텔라(Stigmatella)속 (즉,S. erecta및S. aurantiaca), 및아르칸지움(Archangium)속 (즉,A. gephyra)이 포함된다. 본 발명에서 특히 바람직한 숙주 세포는 폴리케타이드를 10 내지 20 mg/L 이상, 더욱 바람직하게는 100 내지 200 mg/L 이상, 가장 바람직하게는 1 내지 2 g/L 이상 생산하는 것이다.
[68] 바람직한 구체예에서, 본 발명의 숙주 세포는믹소코커스(Myxococcus)속 또는스티그마텔라(Stigmatella) 속으로부터 유래되는 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는M. stipitatus, M. fulvus, M. xanthus, M. virescens, S. erecta및S. aurantiaca중에서 선택된다. 본 발명의 특히 바람직한 믹소코커스 숙주 세포는 폴리케타이드를 10 내지 20 mg/L 이상, 더욱 바람직하게는 100 내지. 200 mg/L 이상, 가장 바람직하게는 1 내지 2 g/L 이상 생산하는 것이다. 특히 바람직한 것은 이러한 농도로 생산하는 M. xanthus 숙주 세포이다. 본 발명의 목적에 이용가능한 M. xanthus 숙주 세포로는 DZ1 세포주 (Campos 외, 1978,J. Mol. Biol.119:167-178, 본 명세서에 참조삽입됨), TA-생산 세포주 ATCC 31046, DK1219 세포주 (Hodgkin 및 Kaiser, 1979,Mol. Gen. Genet.171: 177-191, 본 명세서에 참조삽입됨) 및 DK1622 세포주 (Kaiser, 1979,Proc. Natl. Acad. Sci. USA76: 5952-5956, 본 명세서에 참조삽입됨)를들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
[69] 본 발명의 숙주 세포들은 재조합 DNA 발현 벡터를 포함하여, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 이들 숙주 세포에서 염색체 삽입 (chromosomal integration) 또는 염색체외 복제 (extrachromosomal replication)가 가능한 재조합 DNA 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 PKS 코딩 서열의 적어도 일부를 포함하며 본 발명의 숙주 세포 내에서 기능적인 PKS 효소의 발현을 지향할 수 있다. 본 명세서에서, 발현 벡터라 함은 숙주 세포 내로 도입가능한 여하한 핵산을 모두 가리키는 것이다. 발현 벡터는 세포 또는 세포의 컴파트먼트, 예컨대 세포질 중 복제 벡터에서 염색체나 기타 DNA의 일부로서 세포 내에서 안정하게 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 발현 벡터는 또한 세포 또는 세포 추출물 중에서 폴리펩타이드로 번역되는 합성 RNA를 지향하는 역할을 하는 유전자를 포함한다. 따라서, 이 벡터는 유전자 발현을 증진시키는 프로모터를 포함하거나 또는 유전자 발현이 달성되도록 염색체 내의 어떤 부위로 삽입된다. 뿐만 아니라, 발현 벡터는 내성-부여 유전자 (resistance-conferring genes)와 같이 부가적인 기능적 요소를 일반적으로 함유하기 때문에, 프로모터 활성을 증진시키는 조절 유전자 및 선별가능한 마커로서 작용한다.
[70] 일반적으로, 발현 벡터는 그 벡터를 함유하는 숙주 세포가 동정 및/또는 선별될 수 있도록 하나 이상의 마커 유전자를 함유할 것이다. 본 발명의 벡터에 사용될 항생제 내성 부여 유전자의 예로는ermE(에리쓰로마이신 및 린코마이신에 대한 내성 부여),tsr(티오스트렙톤에 대한 내성 부여),aaaA(스펙티노마이신 및 스트렙토마이신에 대한 내성 부여),aaaC4(아프라마이신, 카나마이신, 젠타마이신, 제네티신 (G418), 및 네오마이신에 대한 내성 부여),hyg(하이그로마이신에 대한 내성 부여), 및vph(바이오마이신에 대한 내성 부여) 내성 부여 유전자를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.믹소코커스 잔투스(Myxococcus xanthus)에 사용되는 선별가능한 마커로는 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 제오신, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 내성 부여 유전자를 들 수 있다.
[71] 발현 벡터의 여러가지 성분들은 벡터의 목적하는 용도에 따라 크게 변할 수 있다. 특히, 벡터의 성분들은 벡터가 사용될 숙주 세포 및 벡터에 의도된 기능에 크게 좌우된다. 예컨대, 본 발명의 바람직한 특정 벡터들은 삽입 벡터들이다: 벡터는 숙주 세포의 염색체 DNA내로 삽입된다. 이러한 벡터는 파지 부착 부위나 또는 삽입을 지향하는 숙주 세포의 염색체 DNA의 세그먼트에 상보적인 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 예시된 바와 같이, 일련의 이러한 벡터들은 숙주 세포 내에서 PKS 유전자 클러스터를 구축하는데 사용될 수 있으며, 여기서 각각의 벡터는 완전한 PKS 유전자 클러스터의 일부만을 포함한다. 따라서, 본 발명의 재조합 DNA 발현 벡터는 PKS 유전자 또는 유전자 클러스터의 일부만을 포함할 수도 있다. 숙주 세포에 미리 도입된 이종 PKS 유전자를 비롯한 유전자를 제거, 파괴 또는 변경시키는데 동종 재조합이 사용될 수도 있다.
[72] 바람직한 구체예에서, 본 발명은 발현 벡터 및 재조합믹소코커스 (Myxococcus),바람직하게는믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus), 즉, 폴리케타이드를 생산하는 발현벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. Mx4 파지 복제에 기초한 인공적인 플라스미드의 미공개 보고가 있기는 하지만, 현재,믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus)에서 염색체외적으로 복제하는 벡터들이 알려져 있다. 그러나, Mx8, Mx9, Mx81, 및 Mx82를 비롯하여,믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus)의 염색체 DNA 내로 삽입되는 것으로 알려진 파지가 몇가지 있다. 이들 파지의 통합 및 부착 기능을 플라스미드에 적용함으로써믹소코커스 잔투스(Myxococcus xanthus)의 염색체 DNA내로 삽입되는 파지-기초 발현 벡터를 만들어낼 수 있다. 이들 중, 본 발명의 목적에 바람직한 것은 파지 Mx9와 Mx8이다. Salmi 등, Feb. 1998, (Genetic determinants of immunity and integration of temperature Myxococcus xanthus phage Mx8, J. Bact. 180(3): 614-621)에 설명된 플라스미드 pPLH343은E. coli에서 복제하는 플라스미드로서 부착 및 삽입 기능을 코딩하는 파지 Mx8 유전자를 포함한다.
[73] 광범위한 프로모터가 본 발명의 바람직한믹소코커스(Myxococcus) 발현 벡터에서 사용될 수 있다. 예컨대 후술하는 실시예 8 참조. 예컨대,소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum) 에포틸론 PKS 유전자 (PCT 공개번호 제 00/031247호 참조. 본문에 참조삽입됨)의 프로모터는믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus) 숙주 세포에서 기능한다. 에포틸론 PKS 유전자 프로모터는 재조합 숙주 세포 내에서 하나 이상의 에포틸론 PKS 유전자 또는 다른 PKS 유전자 생산의 발현을 추진시키는데 이용될 수 있다. 본 발명의 재조합 PKS를 발현시키기 위한 목적에서믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus)에서 사용가능한 또 다른 바람직한 프로모터는믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus)의pilA유전자의 프로모터이다.pilA프로모터,pilA에 의해 조절되는 유전자로부터의 유전자 산물을 고도로 발현하는 2개의믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus) 균주인 pilA 삭제 균주와 pilS 삭제 균주와 이 프로모터는 Wu and Kaiser, Dec. 1997, Regulation of expression of the pilA gene inMyxococcus xanthus, J. Bact.179 (24): 7748-7758 (본문에 참조삽입됨)에 설명되어 있다. 본 발명은 또한 두가지 모두의pilA및pilS삭제를 포함하는 재조합믹소코커스 (Myxococcus) 숙주 세포도 제공한다. 또 다른 바람직한 구체예는sdeK유전자의 굶주림 의존성 프로모터이다.
[74] 본 발명은 본 발명의 재조합믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus)발현 벡터 및 숙주 세포를 제조하는데 사용되는 바람직한 발현 벡터를 제공한다. 플라스미드 pKOS35-82.1 및 pKOS35-82.2라 명명된 이들 벡터 (도 2 참조)들은믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus)의 염색체 DNA 내로 삽입될 수 있을 뿐만 아니라E. coli숙주 세포를 복제시킬 수 있다. 이 벡터들 편리하게 다운스트림에 위치된 제한효소 인식 부위를 갖는pilA프로모터 뿐만 아니라 Mx8 부착 및 삽입 유전자도 포함한다. 이 두가지 벡터들은 벡터상의pilA프로모터의 방향성만 서로 다르고 본 발명의 수식 표소 유전자와 에포틸론 PKS 또는 다른 PKS와 수식 효소 유전자를 포함하도록 쉽게 수식될 수 있다. 벡터의 구조를 실시예 1에 설명하였다.
[75] 또 다른 구체예에서, 본 발명은시스토박테리네아에(Cystobacterineae) 아목의 숙주 세포에서 자연적으로는 생산되지 않는 폴리케타이드를 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 재조합 DNA 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포를 벡터상에 코딩된 PKS 유전자가 발현되어 폴리케타이드를 생산하도록 하는 조건 하에서 배양시키는 단계를 포함하여 이루어진다. 이 방법에 의해, 모듈형 또는 반복형 PKS 효소에 의해 생산되는 다양한 유형의 폴리케타이드를 모두 생산할 수 있다. 또한, 하이브리드 또는 기타의 재조합 PKS 유전자로부터 유도된 신규한 폴리케타이드 역시 이 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 바람직한 구체예에서, PKS 유전자는 하이브리드 모듈형 PKS를 코딩한다.
[76] 다수의 모듈형 PKS 유전자가 클로닝되었으며 본 발명의 방법 및 벡터에서 즉시 이용가능하다. PKS 효소에 의해 생산된 폴리케타이드는 폴리케타이드를 히드록실화, 에폭시화, 메틸화 및/또는 글리코실화시키는, 소위 맞춤형 (tailoring) 효소라 불리우는, 폴리케타이드 수식 효소에 의해 추가로 수식될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라, 이들 유전자는 목적하는 수식된 폴리케타이드의 제조를 위해 숙주 세포내로 도입될 수도 있다. 다음의 표는 예시적인 PKS를 설명하는 참조문헌 및 재조합 PKS를 제조하는데 이용될 수 있는 PKS 효소, 그리고 본 발명의 그것들을 코딩하는 대응 DNA 화합물을 나타낸다. 또한 폴리케타이드의 맞춤 (tailoring) 및 수식 표소 및 본 발명의 재조합 DNA 화합물을 만드는데 이용될 수 있는 대응 유전자를 설명하는 여러가지 참조문헌도 제시된다.
PKS 및 폴리케타이드 맞춤 효소 유전자
아버멕틴(Avermectin)
[77] Merck사의 미국특허 5,252,474; 미국특허 4,703,009; 및 유럽공개 118,367.
[78] MacNeil 외, 1993, Industrial Microorganisms : Basic and Applied Molecular Genetics, Baltz, Hegeman, & Skatrud, eds. (ASM), pp. 245-256, A Comparison of the Genes Encoding the Polyketide Synthases for Avermectin, Erythromycin, and Nemadectin.
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[120] 상기 유전자들은 폴리케타이드 수식을 위한 유전자의 존재 여부와 무관하게 본 발명의 재조합 DNA 발현 벡터에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 숙주 세포들은 각각 소망하는 PKS의 일부 및 수식 효소 유전자 클러스터를 함유하는 복수개의 벡터에 의해 형질전환시켜 만들 수도 있다: 미국특허 No. 6,033,883호 참조. 본 명세서에 참조삽입됨.
[121]믹소코커스 (Myxococcus)를 비롯한 본 발명의 숙주 세포에서의 폴리케타이드 생산을 증대시키기 위해, 이종의 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제를 발현하도록 상기 세포를 형질전환시킬 수도 있다. PKS 단백질은 여하한 NRPS의 PCP 도메인 뿐만 아니라 로딩 및 익스텐더 모듈의 ACP 도메인의 포스포판테테이닐화 (phosphopantetheinylation)도 요구한다. 포스포판테테이닐화는 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTases; phosphopanthetheinyl transferase)라고 불리우는 효소에 의해 매개된다. 소망하는 PKS 효소에 작용할 수 있는 PPTase를 자연적으로 발현하지 못하는 숙주 세포에서 기능적인 PKS 효소를 생산하기 위해서, 또는 PPTase가 제한된 숙주 세포 중에서 기능적인 PKS 효소의 양을 증대시키기 위해서, Sfp를 비롯한 (그러나 이에 한정되지 않음) 이종 PPTase를 도입할 수 있다 (PCT 공개 Nos. 97/13845 및 98/27203, No. 미국특허 6,033,883 참조. 본 명세서에 참조삽입됨). 이 목적을 위해 사용될 수 있는 또 다른 적합한 PPTase는스티그마텔라 아우란티아카 (Stigmatella aurantiaca)로부터의 MtaA이다.
[122]믹소코커스, 스트렙토마이세스,및소란지움숙주 세포를 비롯한 여하한 종류의 생명체에서 폴리케타이드 생산을 증대시키기 위해 본 발명이 제공하는 또 다른 방법은 스트렙토마이신, 리팜피신 및/또는 젠타마이신에 대해 내성을 갖는 세포를 선별하는 것이다. 바람직한 구체예에서, 폴리케타이드를 생산하는 숙주 세포를 이 각각의 화합물들 (또는 그와 구조가 유사한 화합물들)로 계속 챌린지시켜, 폴리케타이드 생산 능력이 증대된 내성 세포들을 분리하여 이를 선별 다음 단계에사용한다. 이러한 방식으로, 아무런 제한 없이 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 고농도로 생산하며 스트렙토마이신, 리팜피신 및 젠타마이신에 내성을 갖는, 예컨대믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus) 숙주 세포를 얻을 수 있다.
[123] 본 발명의 숙주 세포는 자연에서 발견되는 폴리케타이드의 생산 뿐만 아니라, 재조합 PKS 유전자 및 수식 효소의 산물에 의해 생산되는 폴리케타이드를 생산하는데도 이용할 수 있다. 한가지 중요한 구체예에서, 본 발명은 하이브리드 PKS를 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 목적을 위해, 하이브리드 PKS는 제 1 PKS의 하나 이상의 익스텐도 모듈, 로딩 모듈, 및 티오에스터라제/사이클라제 도메인의 전부 또는 일부와 제 2 PKS의 익스텐더 모듈, 로딩 모듈 및 티오에스터라제/사이클라제 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 재조합 PKS이다.
[124] 당업자라면 본 발명의 하이브리드 PKS 중의 제 1 또는 제 2 PKS의 전부 또는 일부가 자연발생적인 소스에서 분리되야 할 필요는 없음을 인식할 것이다. 예컨대, 아주 소량의 AT 도메인이 그의 특이성을 결정한다. PCT 공개 No. 00/001838 (본문에 참조삽입됨) 참조. 종래의 NA 합성 기술수준으로, 당업자들은 PKS 모듈 또는 도메인의 유용한 일부를 구축하는데 충분한 크기의de novoDNA 화합물을 제조할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 합성 DNA 화합물은 PKS의 일부인 것으로 여겨진다.
[125] 상기 표가 나타내는 바와 같이, 본 발명의 하이브리드 PKS-코딩 DNA 화합물을 제조하는데 이용되기 위한 쉽게 얻을 수 있는 DNA 소스 및 서열 정보 역할을 하는 PKS 유전자가 다양하게 있다. 하이브리드 PKS-코딩 DNA 화합물을 제조하기 위한 방법들이 미국특허 Nos. 6,022,731; 5,962,290; 5,672,290; 5,672,491; 및 5,712,146, 그리고 PCT 공개 Nos. 98/49315; 99/61599; 및 00/047724에 설명되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참조삽입되었다. 본 발명의 하이브리드 PKS-코딩 DNA 화합물은 두개보다 많은 PKS 유전자의 하이브리드일 수 있다. 단지 2개의 유전자만 사용된 경우에도, 모듈의 전부 또는 일부가 제 2 PKS 유전자로부터 유래하는 하이브리드 유전자에 종종 2개 이상의 모듈이 있다. 당업자라면 본 발명의 하이브리드 PKS가 다음 유형 중 어느 하나의 PKS를 포함하며 이에 한정되지 않음을 이해할 것이다: (i) 적어도 하나의 도메인이 이종 모듈인 모듈을 함유하는 PKS; (ii) 이종 PKS로부터의 모듈을 함유하는 PKS; (iii) 이종 PKS로부터의 단백질을 함유하는 PKS; 및 (iv) 전술한 것들의 조합체.
[126] 본 발명의 하이브리드 PKS 효소들은 제 1 PKS로부터의 모듈의 하나 이상의 도메인의 코딩 서열을, 재조합 코딩 서열을 제조하기 위한 제 2 PKS로부터의 모듈의 하나 이상의 도메인의 코딩 서열로 치환시킴으로써 종종 제조된다. 일반적으로, KR, DH, 및/또는 ER 도메인을 삽입 또는 치환하기 위한 본문의 모든 레퍼런스는 그 모듈의 어소시에이트된 KR, DH 또는 ER 도메인을, 그로부터 삽입 또는 치환된 도메인이 얻어지는 모듈로부터의 대응 도메인으로 대체시키는 것을 포함한다. 소망되거나 또는 유리한 경우라면, 여하한 모듈의 KS 및/또는 ACP 역시 다른 KS 및/또는 ACP로 대체될 수 있다. 예컨대, 모듈의 변경으로 인해 에포틸론 유도체 화합물의 생산이 저조하게 되면, 연속되는 모듈의 KS 및/또는 ACP 도메인을 변경시킴으로써 생산성을 향상시킬 수 있다. 이들 각각의 치환 또는 삽입에 있어서, 이종의 KS, AT, DH, KR, ER 또는 ACP 코딩 서열은 같거나 다른 PKS의 또 다른 모듈 또는 하이브리드 PKS 코딩 서열을 얻기 위한 화학 합성으로부터에서 유래될 수 있다.
[127] 본 발명의 중요한 구체예는 하이브리드 PKS 유전자에 관계되는 한편, 본 발명은 또한 제 2의 PKS 유전자 서열은 없으나, 자연발생적인 PKS 유전자와는 하나 이상의 변이 및/또는 결실만큼 차이가 나는 재조합 PKS 유전자도 제공한다. 이 결실은 하나 이상의 모듈 또는 도메인을 포괄하고/또는 하나 이상의 모듈 또는 도메인 이내의 결실로 한정될 수 있다. 결실이 익스텐더 모듈 (NRPS 모듈은 제외) 전체를 포괄할 경우, 결과적인 폴리케타이드 유도체는 결실된 버젼이 유도된 PKS로부터 생산된 화합물보다 적어도 2개의 탄소만큼 짧다. 결실은 또한 NRPS 모듈 및/또는 로딩 모듈도 포괄할 수 있다. 결실이 모듈 하나 이내이면, 결실은 오직 하나의 도메인, 전형적으로는 KR, DH 또는 ER 도메인, 또는 두개 이상의 도메인, 예컨대 DH와 ER 도메인 두가지 모두, 또는 KR과 DH 도메인 모두, 또는 KR, DH 및 ER 도메인의 세가지 모두를 포함할 수도 있다. PKS의 도메인은 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이에 의한 것과 같은 변이에 의해 기능적으로 "결실"될 수도 있다. 따라서, 본 명세서에서 예시된 바와 같이, KR 도메인은 변이에 의해 비-기능적으로 또는 완전히 기능적이지 못하게 만들 수 있다. 뿐만 아니라, AT 도메인의 특이성 역시 랜덤 또는 부위-특이적인 돌연변이에 의한 것과 같은 변이에 의해 변경될 수 있다.
[128] 본 발명의 여하한 PKS를 구축하기 위해, 예컨대 PCT 공개 No. 98/27203, 미국특허 No. 6,033,883 (모두 본문에 참조삽입됨)에 기재된 바와 같이,PKS의 여러 다양한 유전자들과, 필요에 따라 하나 이상의 폴리케타이드 수식 효소의 유전자를 2개 이상, 종종 3개의 세그먼트로 분할시키고, 각각의 세그먼트를 분리된 발현 벡터 (PCT 공개 No. 00/053361, 두가지 모두 본문에 참조삽입됨)에 위치시키는 기술을 이용할 수 있다. 이러한 방식으로, 이종 발현을 위한 유전자의 완결체를 조립 및 조작을 훨씬 쉽게 수행할 수 있으며 유전자의 세그먼트 각각을 변경시킬 수 있으며 다양하게 변경된 세그먼트들을 단일 숙주 세포에서 결합시켜 본 발명의 재조합 PKS 유전자를 제공할 수 있다. 이 기술은 재조합 PKS 유전자, 이 유전자들을 발현하기 위한 벡터 및 이들 벡터들을 포함하는 숙주 세포의 큰 라이브러리를 보다 효율적으로 구축할 수 있게 만든다. 이 맥락 그리고 다른 맥락에서, 소망하는 PKS를 코딩하는 유전자들은 2개 이상의 벡터에 존재할 수 있을 뿐만 아니라, 그 유전자가 유래한 자연적인 프로듀서 생명체에 존재하는 것과 다르게 순서화 또는 배치될 수 있다.
[129] 바람직한 그리고 예시적인 구체예에서, 본 발명의 재조합 숙주 세포는 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 생산한다. 자연발생적인 에포틸론 (에포틸론 A, B, C, D, E, 및 F 포함)과 이와 구조적으로 관련된 비-자연발생적인 화합물 (에포틸론 유도체 또는 유사체)은 진핵 세포에 특이적인 강력한 세포변성제이다. 이 화합물들은 항진균제, 암 치료를 위한 화학요법제, 및 면역억제제, 그리고 일반적으로 염증이나 여하한 과증식성 질환, 예컨대 건선, 다발성 경화증, 동맥경화증 및 스텐트의 폐색을 치료하는데 그 효용을 발휘한다. 에포틸론은 이들이 동정된 바 있는소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum) 세포에서는 자연발생적으로는 극히낮은 농도로만 생산된다. 또한,소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum)은 매우 서서히 자랄 뿐만 아니라,소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum) 균주는 발효시키기가 힘들고 시간도 많이 걸린다. 본 발명이 제공하는 한가지 중요한 장점은소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum)이 아닌 숙주 세포에서 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 쉽게 생산할 수 있는 능력에 있다. 본 발명의 또 다른 장점은 자연발생적인 에포틸론 생산자 세포에서 가능한 것보다 본 발명에서 제공되는 재조합 숙주 세포에서 에포틸론이 더 높은 농도, 그리고 더 많은 양으로 생산될 수 있다는 것이다. 본 발명의 또 다른 장점은 재조합 숙주 세포에서 에포틸론 유도체를 제조할 수 있다는 것이다. 따라서, 본 발명은 소망되는 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 생산하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 숙주 세포는 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 10 mg/L 이상의 농도로 생산한다. 한가지 구체예에서, 본 발명은 에포틸론을 생산하는 자연발생적인 생명체에서 생산되는 것보다 더 높은 농도로 한가지 이상의 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 생산하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 에포틸론을 생산하는 자연발생적인 숙주 세포에 의해 생산되는 혼합물보다 덜 복잡한 에포틸론의 혼합물을 생산하는 숙주 세포를 제공한다.
[130] 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 숙주 세포는 에포틸론을 생산하는 자연발생적인 세포보다 덜 복잡한 혼합물을 생산한다. 한 예로써, 본 발명의 특정 숙주 세포는 자연발생적인소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum)에 의해 생산되는 것보다 덜 복잡한 혼합물로 에포틸론 D를 생산할 수 있는데, 이는, 에포틸론 D가 전자에서는 주생성물이고 후자에서는 부생성물이기 때문이다. 에포틸론을 생산하는 자연발생적인소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum)은 일반적으로 에포틸론 A, B, C, D, E, F 및 다른 매우 소량의 생성물의 혼합물을 생성하며 여기서 에포틸론 A와 B만이 주생성물로 존재할 뿐이다. 다음의 표 1은 본 발명의 여러가지 예시적인 숙주 세포에서 생산되는 에포틸론을 요약한 것이다.
세포 종류 생산된 에포틸론 생산되지 않은 에포틸론*
1 A, B, C, D E, F
2 A, C B, D, E, F
3 B, D A, C, E, F
4 A, B C, D
5 C, D A, B
6 B A, C, D, E, F
7 C A, B, C, E, F
* 또는 소량 생성물로만 생산된 것
[131] 따라서, 본 발명의 재조합 숙주 세포는 주생성물로서 소망하는 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 한가지만 생산하는 숙주 세포도 포함한다.
[132] 에포틸론 PKS의 도메인 분석결과에만 기초하는 경우, PKS 효소가 임의로 "G" 및 "H"로 표시된 에포틸론의 생산을 촉매할 수 있을 것으로 예측할 수 있다. 이들 구조는 다음에 나타낸 바와 같다:
[133] 이 화합물들은, 에포틸론 G의 경우 C-12에 수소를 갖는 반면, 에포틸론 H는 그 위치에 메틸기를 갖는다는 점에서만 서로 다르다. C-12 위치의 다양성은 PKS의 상응하는 AT 도메인 (익스텐더 모듈 4)이 말로닐 CoA에도 결합 (이 경우 수소가 됨)할 수 있고, 또는 메틸말로닐 CoA에도 결합 (이 경우 메틸이 됨)할 수 있는 능력을 갖기 때문인 것으로 추측된다. 그러나, 에포틸론 G와 H는 자연에서 또는 본 발명의 재조합 숙주 세포에서는 관찰된 바 없었다. 그 보다는, PKS의 생성물은 C-12 - C-13 이중 결합을 갖고, C-13 히드록시 치환기는 결여한다는 점에서, 각각 에포틸론 G 및 H와 상이한 에포틸론 C 및 D인 것으로 믿어진다. 이종 숙주 세포에서의 에포틸론 PKS 유전자의 발현 및 이들 유전자의 유전학적 변경에 의해 생산된 생성물에 기초할 때 (이하에 더욱 상세히 설명함), 에포틸론 C 및 D에서 C12-C13 이중 결합ㅇㄹ 형성하는 탈수반응은 에포틸론 PKS 자신에 의해 수행되는 것으로 믿어진다. 에포틸론 A 및 B는 각각 에포틸론 C 및 D로부터, epoK 유전자 산물에 의한 C12-C13 이중 결합의 에폭시화에 의해 형성된다. 이하에 상세히 설명되는 바와 같이, 에포틸론 E 및 F는 각각 에포틸론 A 및 B로부터, C-21 메틸기의 히드록실화 또는 에포틸론 PKS의 로딩 모듈에 의해 말로닐 CoA 대신 히드록시말로닐 CoA의 삽입에 의해 형성될 수 있다.
[134] 따라서, 본 발명의 숙주 세포에서epoK유전자 및 에포틸론 PKS 유전자의 발현은 에포틸론 A, B, C 및 D의 생산을 일으킨다. 만약 epoK 유전자가 존재하지 않거나 또는 변이에 의해 불활성화 또는 부분적으로 불활성화되면, 에포틸론 C 및 D가 주생성물로서 생산된다. 익스텐더 모듈 4의 AT 도메인이 말로닐 CoA에 특이적인 AT 도메인에 의해 대체되면, 에포틸론 A 및 C가 생성되며, 기능적인epoK유전자가 없으면, 에포틸론 C가 주생성물로서 생산된다. 익스텐더 모듈 4의 AT 도메인이 메틸말로닐 CoA에 특이적인 AT 도메인에 의해 대체되면, 에포틸론 B 및 D가 주생성물로서 생산되고, 기능적인epoK유전자가 없으면, 에포틸론 D가 주생성물로서 생산된다.
[135] 에포틸론 PKS 및 수식 효소 유전자를 에포틸론 생산 균주인소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum) SMP44로부터 클로닝시켰다. 본 명세서에 참조된 Jaoua 등의 1992,Plasmid 28: 157-165에 설명된 방법을 이용하여 이 균주로부터 총 DNA를 제조하였다. pSupercos (Stratagene)에서소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum)의 게놈 DNA로부터 코스미드 라이브러리를 제작하였다. 본문에 참조된 PCT 공개 No. 00/031237에 설명된 바와 같이, 4개의 오버래핑 코스미드 클론 (부다페스트 조약에 의해, 1999. 2. 17. American Type Culure Collection (ATCC), 10801, University Blve., Manassas, VA, 20110-2209, USA에 기탁하여 다음의 기탁번호를 부여받음: pKOS35-70. 1A2 (ATCC 203782), pKOS35-70. 4 (ATCC 203781),pKOS3570. 8A3 (ATCC 203783), 및 pKOS35-79. 85 (ATCC 203780))으로부터 전체 PKS 및 수식 효소 유전자 클러스터를 분리하고 DNA 서열을 결정하였다. DNA 서열 분석결과, 로딩 모듈 및 9개의 익스텐더 모듈을 갖는 PKS 유전자 클러스터가 밝혀졌다. PKS 서열의 다운스트림은epoK라고 명명된 오픈 리딩 프레임 (ORF)으로서, 시토크론 p450 옥시다제 유전자와 강항 상동성을 보이며 에포틸론 에폭시다제 수식 효소를 코딩한다.
[136] PKS 유전자는 6개의 ORF로 조직되어 있다. 폴리펩타이드 수준에서, 로딩 모듈과 익스텐더 모듈 1 (NRPS), 2 및 9는 개개의 폴리펩타이드를 나타내며; 이들의 대응하는 유전자들을 각각epoA, epoB, epoC및epoF라고 칭한다. 모듈 3, 4, 5 및 6은 그 유전자가epoD로 칭해지는 단일 폴리펩타이드상에 함유되고, 모듈 7 및 9은 그의 유전자가epoE라고 칭해지는 또 다른 폴리펩타이드상에 함유된다. ORF들 사이의 간격은epoC, epoD, epoE및epoF가 오페론을 구성함을 시사하는 것이다.epoA, epoB및epoK유전자는 또한 이 커다란 오페론이 일부를 구성할 수 있지만, epoB와 epoC 사이에는 약 100bp, 그리고 epoF와 epoK 사이에는 115bp의 공간이 있으며 이만한 공간이라면 프로모터가 함유될 수 있다. 에포틸론 PKS 유전자 클로스터를 아래의 반응식 1에 도식적으로 나타내었다.
[137] epoK의 바로 하류인 P450 에폭시다제 유전자는 ORF1으로서, 이것은 막 스패닝 도메인 (membrane spanning domains)과 에포틸론 전달에 연관이 있을지도 모르는 것으로 보여지는 폴리펩타이드를 코딩한다. 이 ORF는 전달 및 조절에 연관된 단백질을 코딩할 수 있는 유전자를 포함하는 다수의 ORF를 수반한다. 이 모듈을 세밀히 시험하자 에포틸론 생합성과 조직 및 조성면에서 일치하는 것으로 나타났다. 다음의 설명은 폴리펩타이드 수준에서 제시되는 것이다. 로딩 모듈과 익스텐더 모듈 3, 4, 5, 및 9 중의 AT 도메인의 서열은 로딩 모듈 뿐만 아니라, C-14, C-12 (에포틸론 A 및 C), C-10, 및 C-2 각각에서의 H 측쇄의 존재와 일치하는, 말로닐 로딩 모듈에 대한 콘센서스 서열과 유사성을 보인다. 모듈 2, 6, 7, 및 8의 AT 도메인은 메틸말로닐 지정 AT 도메인의 콘센서스 서열과 닮았고, 이는 다시 C-16, C-8, C-6 및 C-4에서의 메틸 측쇄의 존재와 각각 일치한다.
[138] 로딩 모듈은 대개 활성 부위에 존재하는 잔기가 시스테인이 아닌 티로신인 KS 도메인을 함유한다. 이 도메인은 KSY라고 표시되며 그의 정상 기능의 일종인 데카르복실라제로서을 역할을 하지만, 축합효소로서의 기능은 할 수 없다. 따라서, 로딩 모듈은 말로닐 CoA을 로딩하여, 이를 ACP로 이동시키고, 탈카르복실화시켜서 시스테인에 의한 축합에 요구되는 아세틸 잔기를 생산할 것으로 기대된다. 익스텐드 모듈 1은 시스테인을 활성화시키는 비-리보좀성 펩타이드 신쎄타제로서 로딩 모듈 상에서 아세테이트와의 축합을 촉매한다. 이 서열은 아미노산, 포스포판테테이닐화 부위, 산화 도메인, 사이클화 도메인 및 연장 (elongatin) 도메인의 활성화에 요구되는, ATP-결합 및 ATPase 도메인에 매우 유사한 세그먼트를 함유한다. 익스텐더 모듈 2는 C-15 - C-17에서의 에포틸론의 구조를 결정한다. 모듈 2에 DH 도메인이 존재하면 분자 내에 C-16-17 데히드로 부분을 생선한다. 모듈 3의 도메인은 C-14 및 C-15에서의 에포틸론 구조와 일치한다; KR의 작용에 의해 초래되는 OH는 분자의 락톤화에 사용된다. 익스텐더 모듈 4는 에포틸론 C 및 D에서sms 이중결합이 발견되는 C-12 및 C-13에서의 구조를 제어한다. AT 도메인의 서열이 말로네이트 로딩을 특정하는 것들과 닮은 것으로 보이기는 하지만, 이것은 메틸말로네이트를 로딩할 수도 있기 때문에, 자연발생적인 생명체의 발효 브로쓰에서 발견되는 에포틸론들의 혼합물에 대한 설명을 부분적으로 해준다.
[139] 익스텐더 모듈 4에서 기대했던 기능들의 어레이의 의미있는 출발점이 감지되었다. 이 모듈은 DH 도메인을 포함함으로 해서, PKS의 생성물로서 에포틸론 C 및 D의 합성을 지시할 것으로 예상되었다. 분석 결과 모듈 4의 AT 및 KR 도메인 사이의 공간은 기능적인 DH 도메인을 수용할만큼 충분히 크지 않은 것으로 밝혀졌다. 따라서, 모듈 4에서의 환원 정도는 익스텐더 모듈 4에 의해 지향된 축합 후에 형성된 베타-케토의 케토환원을 넘어서 진행되는 것 같지는 않다. 여기에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 속조 세포에 에포틸론 C 및 D의 생산 능력을 부여하는데는에포틸론 PKS 유전자 단독으로 충분하다. 에포틸론 C 및 D의 이종 생산은 이중결합을 도입하는 데히드라타제 기능이 있음을 증명한다. 에포틸론 PKS 유전자의 이종 발현 및 변경된 에포틸론 PKS 유전자에 의해 생산된 생성물에 기초할 때, 이 이중결합을 형성하는 탈수 반응은 에포틸론 PKS의 익스텐더 모듈 5의 DH 도메인 및 모듈 5의 ER 도메인에 의한 환원에 앞서 컨쥬게이트된 디엔 전구체의 생성에 의해 매개되는 것으로 믿어진다.
[140] 익스텐더 모듈 5 및 6은 각각 C-11 및 C-9에서 메틸렌 관능기를 생성하는 완전한 세트의 환원 도메인 (KR, DH 및 ER)을 갖는다. 익스텐더 모듈 7 및 9는 KR 도메인을 가지므로 C-7 및 C-3에서 히드록실을 갖고, 익스텐더 모듈 8은 기능적인 KR ㄷ메인을 갖지 않는데 이는 C-5에서 케토기가 존재하는 것과 부합된다. 익스텐더 모듈 9 역시 폴리케타이드 합성을 종결하고 폐환을 촉매하는 티오에스터라제 도메인을 갖는다.
[141] 에포틸론 PKS의 유전자, 단백질, 모듈 및 도메인을 다음 표 2에 요약하였다.
유전자 단백질 모듈 존재하는 도메인
epoA epoA 로드 KSYmAT Er ACP
epoB epoB 1 NRPS, 축합, 헤테로사이클화
아데닐화, 티오닐화, PCP
epoC epoC 2 KSmmAT DH KR ACP
epoD epoD 3-6 KS mAT KR ACP; KS mAT KR ACP; KS
mAT DH ER KR ACP; KS mmAT DH ER
KR ACP
epoE epoE 7-8 KS mmAT KR ACP; KS mmAT MT DH* KR* AC
epoF epoF 9 KS mAT KR DH* ER* ACP TE
NRPS - 비리보좀성 펩타이드신쎄타제 (non-rebosomal peptide synthetase);KS - 케토신타제 (ketosynthase); mAT - 말로닐 CoA 특정 아실트랜스퍼라제 (malonyl CoA specifying acyltransferase); mmAT - 메틸말로닐 CoA 특정 아실트랜스퍼라제 (methylmalonyl CoA specifying acyltransferase); DH - 데히드라타제 (dehydratase); ER - 에노일리덕타제 (enoylreductase); KR - 케토리덕타제 (ketoreductase); MT - 메틸트랜스퍼라제 (methyltransferase); TE 티오에스터라제; * - 불활성 도메인.
[142] 서열들을 검사한 결과epoA와epoB(로딩 모듈 및 익스텐더 모듈 1 NRPS) 사이, 및epoC와epoD사이에 번역 커플링이 존재하는 것으로 밝혀졌다.epoD와epoE그리고epoE와epoF사이에 매우 작은 갭이 보이지만,epoB와epoC그리고 epoF와epoK사이에는 100 bp를 초과하는 갭이 밝견되었다. 이러한 유전자내 대역 (intergenic region) 프로모터를 함유할 수 있다.
[143] 따라서, 에포틸론 PKS는epoA, epoB,epoC, epoD,epoE,및epoF유전자의 유전자 산물로 구성된 다단백질 복합체 (multiprotein complex)이다. 에포틸론의 생산능력을 숙주 세포에게 부여하기 위해, 숙주세포에게 본 발명의 재조합epoA, epoB,epoC, epoD,epoE,및epoF유전자, 및 그 숙주 세포에서 발현가능한 임의의 다른 유전자, 예컨대epoK를 제공한다. 당업자라면, 에포틸론 및 다른 PKS 효소가 본 명세서에서 단일의 엔터티 (entity)로서 추론되지만, 이 효소들이 일반적으로 멀티서브유닛 단백질임을 이해할 것이다. 따라서, PKS를 구성하는 복수개의 단백질을 하나 이상 코딩하는 하나 이상의 유전자를 변경시킴으로써, 유도성 PKS (자연발생적인 PKS가 결실 또는 변이됨으로써 달라짐) 또는 하이브리드 PKS (2개의상이한 PKS 효소의 일부들로 이루어진 PKS)를 만들 수 있다.
[144] 에포틸론의 포스트-PKS 수식 또는 맞춤은 다수의 효소들에 의해 매개되는 다단계로 이루어진다. 이 효소들은 본문에서 맞춤 (tailorgin) 효소 또는 수식 (modification) 효소라고 칭한다.epoK를 발현하지 않는 본 발명의 숙주 세포에서 에포틸론 PKS 유전자epoA, epoB, epoC, epoD, epoE,및epoF를 발현시키면 에포틸론 A 및 B의 C-12-C-13 에폭사이드가 결여된 대신 C-12-C-13 이중결합을 갖는 에포틸론 C 및 D가 생산된다. 따라서, 에포틸론 C와 D는 epoK 유전자에 의해 코딩된 에폭시다제에 의해 에포틸론 A와 B로 전환된다. 에포틸론 A 및 B는 에포틸론 PKS 유전자 클러스터와 관련있는 유전자에 의해 또는소란지움 셀룰로섬의 내인성의 또 다른 유전자에 의해 코딩될 수 있는, 히드록실라제 유전자에 의해 에포틸론 E 및 에포틸론 F로 전환될 수 있다. 다른 한편, 이 화합물들은 말로닐 CoA가 아닌 다른 스타터 유닛 (예컨대 히드록시말로닐 CoA)에 결합하는 로딩 모듈에 의해 형성될 수도 있다. 따라서, 숙주세포에 본 발명에 의해 제공된 하나 이상의 재조합 수식 효소 유전자를 제공하거나 또는 수식 효소를 자연적으로 발현시키는 (또는 발현하지 않는) 숙주 세포를 이용하거나/또는 말로닐 CoA 이외의 다른 스타터 유닛을 제공함으로써 필요에 따라 수식된 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 생산하는 것이 가능하다.
[145] 따라서, 본 발명은 자연발생적인 에포틸론 A, B, C, 및 D 및 그의 유도체를 발현시키기 위한 광범위한 종류의 재조합 DNA 화합물 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 에포틸론 E 및 F와 유사한 방식으로 수식된 에포틸론 유도체를 생산하는 재조합 숙주 세포도 제공한다. 또한, 본 발명의 여하한 에포틸론 또는 에포틸론 유도체는 본명세서에 참조된 PCT 공개 No. 00/039276에 설명된 방법에 따라, 상응하는 에포틸론 E 또는 F 유도체로 전환될 수 있다.
[146] 본 발명은 또한 에포틸론 유도체를 생산하는 광범위한 재조합 DNA 화합물 및 숙주 세포도 제공한다. 본 명세서에서 에포틸론 유도체라는 표현은 적어도 하나의 도메인이 삽입되거나 또는 결실 또는 변이에 의해 어떤 도메인이 불활성화 되었거나, 그의 촉매적 기능이 변질되도록 돌연변이되었거나, 또는 다른 기능을 갖는 도메인에 의해 어떤 도메인이 치환된 재조합 에포틸론 PKS에 의해 생산된 화합물을 가리킨다. 어떤 경우에서든, 이렇게 생산된 에포틸론 유도체 PKS는 에포틸론 A, B, C, D, E 및 F 중에서 선택된 자연발생적인 에포틸론과는 그 구조가 상이한 화합물을 생산하도록 기능한다. 본 발명에 의해 제공된 재조합 DNA 화합물 및 숙주 세포에 대한 이해를 돕기 위해, 에포틸론 PKS의 각각의 모듈 및 로딩 모듈, 및 그의 신규한 재조합 유도체들에 대한 상세한 설명을 이하에 제공한다.
[147] 에포틸론 PKS의 로딩 모듈은 KSY라고 칭해지는 "불활성" KS 도메인을 포함하는데, 이것은 "활성" KS 도메인에서 발견되는 시스테인 잔기 대신 티로신 (Y) 잔기의 존재로 인해, 활성 KS 도메인에 의해 매개되는 축합 반응을 수행하지 못한다. KSY도메인은 KS 도메인에 의해 매개되는 탈카르복실화 반응을 수행한다. 이러한 "불활성" KS 도메인은 대개 활성 부위의 시스테인 대신 글루타민 (Q) 잔기와 함께 다른 PKS 효소에서 발견되며, 이것은 KSQ도메인이라고 칭해진다. 래트의지방산 신타제 중의 KSQ도메인은 축합하지는 못하지만 탈카르복실화 반응에 있어서 2차수 큰 강도 증가를 나타내었다. Witkowski 외, 7 Sep. 1999, Biochem. 38(36):11643-11650, 참조 (본 명세서에 참조됨). KSQ도메인은 KSY도메인보다 탈카르복실화 반응에 더욱 효과적임으로 해서, 에포틸론 PKS의 KSY도메인을 KSQ도메인으로 대체시킬 경우 특정 배양 조건 하에서 어떤 숙주 세포의 에포틸론의 생합성 효율이 증가될 수도 있을 것이다. 이것은 하기의 실시예 6에 설명된 바와 같이 티로신 코돈을 글루타민 코돈으로 변경시킴으로써 간단히 수행할 수 있다. 이것은 또한 KSY도메인을 올레안돌라이드 (oleandolide) PKS 또는 나르보놀라이드 (narbonolide) PKS와 같은 다른 PKS의 KSQ도메인으로 치환시킴으로써도 수행가능하다 (올레안도마이신, 나르보마이신 및 피크로마이신 PKS 및 수식 효소와 관련한 상기 표의 문헌 참조).
[148] 에포틸론 로딩 모듈은 또한 말로닐 CoA에 특이적인 AT 도메인 (KSY도메인에 의해 탈카르복실화되어 아세틸기를 생산하는 것으로 믿어짐) 및 ACP 도메인도 함유한다. 본 발명은 말로닐 특이적인 AT 도메인 또는 그의 코딩 서열이 예컨대 메틸말로닐 CoA, 에틸말로닐 CoA 및 2-히드록시말로닐 CoA와 같은 다른 특이성을 갖도록 변화된 재조합 에포틸론 유도체 로딩 모듈 또는 그의 코딩 DNA 서열을 제공한다.에포틸론 PKS의 다른 단백질에 의해 발현될 경우, 이러한 로딩 모듈은 에포틸론의 티아졸 고리의 메틸 치환기가 각각 에틸, 프로필 및 히드록시메틸로 대체된 에포틸론이 생산되도록 만든다. 본 발명은 이러한 로딩 모듈을 포함하는 재조합 PKS 효소 및 이러한 효소를 생산하는 숙주 세포 및 그에 의해 생산된 폴리케타이드를 제공한다. AT 도메인이 2-히드록시말로닐 CoA를 특정하도록 변경되면, 상응하는 에포틸론 PKS 유도체는 에포틸론 E와 F 유도체를 생산할 것이다. 2-히드록시말로닐 CoA에 특이적인 AT 도메인은 생산된 폴리케타이드 중의 대응 위치에서 히드록실기를 갖는 폴리케타이드를 결과시킬 것이고; 히드록실기는 메틸화되어 폴리케타이드 수식 효소에 의해 메톡시기를 생산할 수 있다. 예컨대 상기 표 중 FK-520 PKS에 관련된 문헌 참조. 결국, 여기의 AT 도메인에 특이적인 2-히드록시말로닐을 갖는 PKS는 폴리케타이드 중의 대응 위치에 히드록실 또는 메톡시기를 갖는 PKS에 의해 생산된 폴리케타이드를 마찬가지로 가리킨다.
[149] 에포틸론 PKS의 로딩 모듈 또한 ER 도메인을 포함한다. 이 ER 도메인은 에포틸론의 티아졸 부분 중의 이중 결합중 하나를 형성하는데 관련될 수 있는 한편 (그의 정상적인 반응의 역반응에서), 비-기능적일 수도 있다. 어떤 경우든, 본 발명은 에포틸론 로딩 모듈의 ER 도메인 대신 다른 PKS (활성적이건 불활성적이건, KR 및 DH 도메인을 수반하건 수반하지 않건)로부터의 ER 도메인을 함유하는 하이브리드 로딩 모듈뿐만 아니라, ER 대역이 있건 없건 에포틸론 PKS 로딩 모듈을 코딩하는 재조합 DNA 화합물을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 로딩 모듈들을 포함하는 재조합 PKS 효소 및 이러한 효소를 생산하는 숙주 세포와 그에 의해 생산된 폴리케타이드도 제공한다.
[150] 에포틸론 PKS의 로딩 모듈은 또한 이종 PKS로부터의 로딩 모듈에 의해 대체되어 에포틸론 유도체를 만드는 하이브리드 PKS를 형성할 수도 있다. 한가지 구체예에서, 에포틸론 PKS의 로딩 모듈은 하기 실시예에 설명된 바와 같이 NRPS로 대체된다.
[151] 에포틸론 PKS의 로딩 모듈은 시스테인에 특이적인 익스텐더 NRPS 모듈인 PKS의 제 1 익스텐더 모듈을 수반한다. 이 NRPS 모듈은epoB유전자의 생성물인 불연속 단백질 (discrete proteind)으로서 자연적으로 발현된다. 한가지 구체예에서, NRPS 모듈 코딩 서열의 일부는 이종의 코딩 서열과 연대하여 사용된다. 이 구체예에서, 본 발명은 예컨대 시스테인으로부터 다른 아미노산으로, 에포틸론 PKS의 NRPS 모듈의 특이성을 변화시키는 것을 제공한다. 이러한 변화는 에포틸론 PKS NRPS ㅁ듈 코딩 서열의 전부 또는 일부가 상이한 특이성을 갖는 NRPS 모듈을 코딩하는 것에 의해 치환되어버린 코딩 서열을 구축함으로써 달성된다.
[152] 한가지 예시적인 구체예에서, 에포틸론 NRPS 모듈의 특이성이 시스테인으로부터 세린 또는 쓰레오닌으로 변화된다. 이렇게 수식된 NRPS 모듈은 에포틸론 PKS의 다른 단백질에 의해 발현되고, 재조합 PKS는 에포틸론 (또는 에포틸론 유도체)의 티아졸 부분이 각각 옥사졸 또는 5-메틸옥사졸 부분으로 변화된 에포틸론 유도체를 생산하게 된다. 따라서, 예시적인 구체예에서, 본 발명은, 에포틸론 NRPS의 아데닐화 도메인이 entF 유전자 (세린을 나타냄)에 의해 코딩된 NRPS의 아데닐화 도메인으로 치환됨으로써 NRPS 도메인이 변경된 숙주 세포, 벡터 및 재조합 에포틸론 PKS 효소를 제공한다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본 발명은 에포틸론NRPS의 아데닐화 도메인이 bivF 유전자 (쓰레오닌을 나타냄)에 의해 코딩된 NRPS의 아데닐화 도메인으로 치환됨으로써 NRPS 도메인이 변경된 숙주 세포, 벡터 및 재조합 에포틸론 PKS 효소를 제공한다. 한가지 구체예에서, 이들 NRPS의 치환은, 메틸말로닐 CoA 대신 말로닐 CoA에 결합함으로 해서, 옥사졸 및 메틸옥사졸 에포틸론 유도체의 16-데스메틸 유도체를 생산하는 익스텐더 모듈 2도 함유하는 에포틸론 PKS에서 만들어진다.
[153] 한편, 본 발명은 이종 PKS로부터의 NRPS 모듈과 함께 또는 NRPS 모듈 없이,epoA, epoC, epoD, epoE 및 epoF유전자 (또는 그의 수식된 버젼)의 생성물로 이루어진 재조합 PKS 효소를 제공한다. 이종 NRPS 모듈은 epoA 또는 epoC 유전자와의 융합 단백질로서, 또는 불연속 단백질로서 발현될 수 있다. PKS의 한가지 모듈을 다른 모듈로 치환하는데 있어서, 반드시 호환가능한 (compatible) 모듈간 (intermodular) 링커 서열을 유지하거나 또는 사용해야만 한다. PCT 공개 No. 00/047724 참조.
[154] 또 다른 구체예에서, 본 발명은 NRPS 모듈이 불활성화되거나 결실된 재조합 에포틸론 PKS 효소 및 상응하는 재조합 DNA 화합물과 벡터를 제공한다. 따라서 본 발명에 의해 제공된 불활성 NRPS 모듈 단백질과 코딩 서열은, PCP 도메인의 전체 또는 일부가 결실되거나 또는 활성 부위의 세린 (포스포판테테이닐화 부위)이 알라닌과 같은 다른 아미노산으로 변경됨으로써 불활성화되었거나 또는 아데닐화 도메인이 결실 또는 불활성화된 것들을 포함한다. 어떠한 경우든, 얻어지는 에포틸론 PKS는 에포틸론 PKS 또는 에포틸론 유도체의 PKS의 익스텐더 모듈 2 (또는 후속 모듈)의 KS 도메인에 결합하는 기질이 제공된 경우에만 기능을 발휘할 수 있다. 본 발명이 제공하는 방법에서, 이렇게 수식된 세포들에는 바람직하게는 제 2, 그러나 잠재적으로는 여하한 후속적인 익스텐더 모듈에 의해 결합되어 신규한 에포틸론 유도체로 프로세스된 활성화 아실티오에스테르가 주입된다. 본 발명의 신규한 에포틸론 유도체를 생산하기 위해 활성화된 아실티오에스테르들이 숙주세포로 주입된다. PKS를 발현하는 숙주 세포 또는 이를 함유하는 무세포 추출물에 신규한 전구체 분자의 N-아실시스테아민 티오에스테르 (NACS: N-acylcysteamine thioesters)가 주입 또는 공급되어 에포틸론 유도체가 제조된다. PCT 공개 Nos. US99/03986 및 00/044717 참조, 두 문헌 모두 하기의 실시예 9 및 10에 참조삽입됨.
[155] 에포틸론 PKS의 제 2 (제 1의 비-NRPS) 익스텐더 모듈에는 KS, 메틸말로닐 CoA에 특이적인 AT, DH, KR 및 ACP이 포함된다. 에포틸론 PKS의 제 2 익스텐더 모듈은epoC유전자에 의해 불연속 단백질로서 생산된다. 제 2 익스텐더 모듈 코딩 서열의 전부 또는 일부를 다른 PKS 코딩 서열과 연계적으로 사용함으로써 하이브리드 모듈을 만들어낼 수 있다. 이 구체예에서, 본 발명은 예컨대 메틸말로닐 CoA 특이적인 AT를 말로닐 CoA, 에틸말로닐 CoA, 또는 2-히드록시말로닐 CoA 특이적인 AT로 치환; DH와 KR중 어느 하나 또는 두가지 모두의 결실; DH 또는 KR 또는 두가지 모두를 다른 입체화학을 지정하는 DH 또는 KR 또는 두가지 모두로 치환; 및/또는 ER을 삽입하는 것도 제공한다. 결과적인 이종의 제 2 익스텐더 모듈 코딩 서열은 에포틸론, 에포틸론 유도체 또는 다른 폴리케타이드를 합성하는 PKS를 구성하는 다른 단백질과 함께 발현될 수 있다. 한편, 에포틸론 PKS의 제 2 익스텐더 모듈은epoB또는epoD유전자 산물 중 어느 하나에 융합된 융합 단백질로서 또는 불연속 단백질로서 발현될 수 있는, 이종 PKS로부터의 모듈에 의해 치환되거나 결실될 수 있다.
[156] 본 발명의 예시적인 재조합 PKS 유전자로는 에포틸론 PKS의 제 2의 익스텐더 모듈의 AT 도메인 코딩 서열이, 코딩된 AT 도메인이 메틸말로닐 특이적인 AT로부터 말로닐 특이적인 AT로 전환되도록 변경 또는 치환된 것을 들 수 있다. 이러한 말로닐 특이적인 AT 도메인 코딩 핵산은 예컨대, 그리고 비제한적으로, 나르보놀라이드 PKS, 소라펜 PKS, 라파마이신 PKS (즉 익스텐더 모듈 2 및 12), 및 FK-520 PKS (즉, 익스텐더 모듈 3, 7, 및 8)를 코딩하는 PKS 유전자로부터 분리될 수 있다. 이러한 하이브리드 제 2 익스텐더 모듈이 에포틸론 PKS를 구성하는 다른 단백질과 함께 발현될 경우, 생산된 결과적인 에포틸론 유도체는 16-데스메틸 에포틸론이다. 한가지 구체예에서, 하이브리도 PKS는 익스텐더 모듈 4에서 또한 메틸말로닐 CoA 특이적인 AT 도메인도 함유하며, 기능적인 epoK 유전자를 결여하는 숙주 세포에서, 생성된 화합물이 16-데스메틸 에포틸론 D가 되도록 발현된다. 또 다른 구체예에서, 하이브리드 PKS 역시 쓰레오닌에 특이적인 변경된 NRPS를 함유함으로써, 5-메틸옥사졸-16-데스메틸에포틸론이 생산된다.
[157] 이에 더해, 본 발명은 재조합 에포틸론 PKS 효소를 코딩하는 DNA 화합물 및 벡터, 그리고 제 2 익스텐더 모듈의 제 2 (또는 후속적인) KS 모듈이 실시예 9 및 10에 설명된 바와 같이 불활성화 또는 결실된 대응 재조합 단백질을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 불활성화는 활성 부위 시스테인에 대한 코돈을 알라닌 코든으로 변화시킴으로써 달성된다. NRPS 모듈에 대한 상술한 대응 배리언츠들의 경우처럼, 결과적인 재조합 에포틸론 PKS 효소는, 재조합 PKS 효소의 나머지 도메인 및 모듈에 의해 결합 및 연장될 수 있는 전구체가 공급되지 않는 한, 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 생산하지 못한다. 하기 실시예 10에 예시적인 전구체 화합물을 설명하였다. 한편,epoD, epoE,및epoF유전자만을 발현하는 숙주 세포에 이러한 전구체를 간단히 제공할 수 있다.
[158] 에포틸론 PKS의 제 3의 익스텐더 모듈에는 KS, 말로닐 CoA에 특이적인 AT, KR 및 ACP가 포함된다. 에포틸론 PKS의 제 3의 익스텐더 모듈은 단백질인 epoD 유전자의 생성물로서 발현되며, 이것은 모듈 4, 5 및 6도 함유한다. 익스텐더 모듈 3 내지 6 중의 어느 것에서건 변경이 일어남으로 해서, 에포틸론 유도체를 생산하는 재조합 에포틸론 PKS를 만들기 위해, 일반적으로 네가지 익스텐더 모듈 모드를 포함하는 단백질을 발현시킨다. 한가지 구체예에서, 제3의 익스텐더 모듈 코딩 서열의 전부 또는 일부를 다른 코딩 서열과 함께 이용함으로써 하이브리드 모듈을 만든다. 이 구체예에서, 본 발명은 예컨대 말로닐 CoA 특이적인 AT를 메틸말로닐 CoA, 에틸말로닐 CoA, 또는 2-히드록시말로닐 CoA 특이적인 AT로 치환하거나; KR을 결실시키거나; KR을 다른 입체화학을 특정하는 KR로 치환하거나; 및/또는 DH 또는 DH 및 ER를 삽입한다. 결과적인 이종의 제 3 익스텐더 모듈 코딩 서열은 에포틸론, 에포틸론 유도체 또는 다른 폴리케타이드를 합성하는 PKS의 코딩 서열과 함께 이용가능하다.
[159] 본 발명의 예시적인 재조합 PKS 유전자에는 에포틸론 PKS의 제 3 익스텐더 모듈의 AT 도메인 코딩 서열이 변경 또는 치환됨으로 해서 말로닐 특이적인 AT로부터 메틸말로닐 특이적인 AT로 AT 도메인이 변경된 것이 포함된다. 이러한 메틸말로닐 특이적인 AT 도메인 코딩 핵산은 예컨대, 제한없이 PKS 유전자 코딩 DEBS, 나르보놀라이드 PKS, 라파마이신 PKS 및 FK-520 PKS로부터 분리될 수 있다. 에포틸론 PKS 또는 에포틸론 PKS 유도체의 나머지 모듈 및 단백질과 함께 공동으로 발현될 경우, 재조합 PKS는 본 발명의 14-메틸 에포틸론 유도체를 생산한다.
[160] 당업자라면 PKS의 제 3의 익스텐더 모듈의 KR 도메인이 에포틸론의 고리화와 관련된 히드록실기를 형성하는데 책임이 있음을 인식할 것이다. 결국, 제 3의 익스텐더 모듈의 KR 도메인을 피하거나 또는 DH 또는 DH 및 ER 도메인을 추가함으로써 고리화를 방해하여, 선형 분자, 또는 에포틸론 A, B, C, D, E 및 F와는 다른 위치에서 고리화된 분자가 생산되게 된다.
[161] 에포틸론 PKS의 4번째 익스텐더 모듈은 KS, 말로닐 CoA 또는 메틸말로닐 CoA에 결합할 수 있는 AT, KR 및 ACP를 포함한다. 한가지 구체예에서, 제 4의 익스텐더 모듈 코딩 서열의 전부 또는 일부를 다른 PKS 코딩 서열과 함께 사용하여 하이브리드 모듈을 제조한다. 이 구체예에서, 본 발명은 예컨대, 말로닐 CoA 및 메틸말로닐 특이적인 AT를 말로닐 CoA, 메틸말로닐 CoA, 에틸말로닐 CoA, 또는 2-히드록시말로닐 CoA 특이적인 AT로 치환시키거나; KR을 결실시키거나; 및/또는 KR을 다른 입체 화학을 특정하는 KR로 대체시키거나; 및/또는 DH 또는 DH 및 ER를 삽입시킨다. 결과적인 이종의 제 4의 익스텐더 모듈 코딩 서열을, 에포틸론, 에포틸론 유도체 또는 다른 폴리케타이드를 합성하는 재조합 PKS의 단백질 서브유닛 내로 삽입시킨다. 다른 한편, 본 발명은 제 4의 익스텐더 모듈 전체가 결실 또는 이종의 PKS로부터의 모듈에 의해 치환된, 에포틸론 및 에포틸론 유도체에 대한 재조합 PKS 효소를 제공한다.
[162] 바람직한 구체예에서, 본 발명은 메틸말로닐 CoA에는 결합하나 말로닐 CoA에는 결합하지 않는 (또는 말로닐 CoA에는 결합하지만 메틸말로닐 CoA에는 결합하지 않는) AT를 코딩하도록 수식된 에포틸론 PKS의 제 4의 익스텐더 모듈에 대한 코딩 서열을 포함하는 재조합 DNA 화합물을 제공한다. 한가지 구체예에서, 이러한 특이성 변경은 익스텐더 모듈 4 AT 도메인에 대한 코딩 서열을 돌연변이시킴으로써 달성된다. 이러한 돌연변이는 UV 광선과 같은 돌연변이원을 이용하거나 또는 부위-특이적인 돌연변이에 의해 무작위적으로 달성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이러한 특이성의 변경은 익스텐더 모듈 4 AT 도메인 코딩 서열의 전부 또는 일부를 이종의 AT 도메인의 코딩 서열로 치환시킴으로써 달성한다. 따라서, 본 발명은 제 4 익스텐더 모듈과 메틸말로닐 특이적인 AT와의 하이브리드가 삽입된 재조합 DNA 화합물 및 발현 벡터 및 대응하는 재조합 PKS를 제공한다. 메틸말로닐 특이적인 AT 코딩 서열은 예컨대 제한없이 올레안돌라이드 PKS, DEBS, 나르보놀라이드 PKS, 라파마이신 PKS 또는 메틸말로닐 특이적인 AT 도메인을 포함하는 여하한 다른 PKS의 코딩 서열로부터 유래될 수 있다.
[163] 본 발명에 따라, 이 코딩 서열로부터 발현된 하이브리드 제 4 익스텐더 모듈은 전형적으로 익스텐더 모듈 3, 5, 및 6 뿐만 아니라 수식된 제 4 익스텐더 모듈 (이들 중 어느 하나 또는 그 이상은 임의로 에포틸론 PKS의 유도체 형태일 수 있음)을 포함하는 유도체epoD유전자 산물로서 에포틸론 PKS (또는 에포틸론 유도체의 PKS)내로 삽입될 수 있다. 따라서 본 발명에 의해 제공된 재조합 메틸말로닐 특이적인 에포틸론 제 4 익스텐더 모듈 코딩 서열은 소망하는 에포틸론 화합물을 숙주 세포에서 생산하는 또 다른 방법을 제공해준다. 특히, 이러한 화합물들은 에포틸론 D, B 및 F가 될 것이며, 특히 에포틸론 B의 생산은 기능적인epoK유전자가 또는 그의 유도체가 존재하는지의 여부에 따라 좌우된다.
[164] 본 발명은 또한 말로닐 CoA에는 결합하나, 메틸말로닐 CoA에는 결합하지 않는 AT를 코딩하도록 수식된 에포틸론 PKS의 제 4 익스텐더 모듈의 코딩 서열을 포함하는 재조합 DNA 화합물을 제공한다. 본 발명은 재조합 DNA 화합물과 벡터 및 상기 하이브리드 제 4 익스텐더 모듈이 유도체 epoD 유전자 산물내에 삽입되어 있는 대응 재조합 PKS을 제공한다. 에포틸론 PKS (또는 에포틸론 유도체의 PKS) 내로 삽입될 경우, 결과적인 재조합 에포틸론 PKS는 에포틸론 C, A 및 E를 생산하며 여기서 에포틸론 A의 생산은 기능적인 epoK 유전자가 존재하는지의 여부에 좌우된다.
[165] 또 다른 구체예에서, 본 발명은 12-데스메틸-12-에틸-에포틸론 D를 생산하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 이 구체예에서, 본 발명은 익스텐더 모듈 4의 AT 도메인이 예컨대 FK520 또는 닛다마이신 PKS 효소로부터의 에틸말로닐 CoA-특이적인 익스텐더 모듈에 의해 치환된 재조합 에포틸론 PKS 유도체를 발현하는 숙주 세포를 제공한다. 한가지 구체예에서, 이 숙주 세포는 이종 프로모터의 조절 하에 또는 이종 숙주 세포로부터의 유전자 (ccr유전자)에 의해 코딩된 크로토닐 CoA 리덕타제를 발현하여 에틸말로닐 CoA의 생산성이 증대된 재조합 숙주 세포이다. 한가지 구체예에서, 이 숙주 세포는스트렙토마이세스숙주 세포로부터 분리된ccr유전자를 발현하는믹소코커스숙주 세포이다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포를 부티레이트를 전달하여 이를 에틸말로닐 CoA로 전환되는 부티릴 CoA로 전환시키는E. coli atoA, D,및E유전자를 발현 또는 과발현시키도록 수식시켰다.
[166] 내인성 (endogenous) AT 코딩 서열을 메틸말로닐 CoA에 특이적인 AT의 코딩 서열로 치환하는 것에 더해, KR도메인 코딩 서열을 다른 KR, DH 및 KR (예컨대 비제한적인 예로, 라파마이신 PKS의 모듈 10 또는 FK-520 PKA의 모듈 1 또는 5로부터 유래된), 또는 DH, KR 및 ER의 코딩 서열로 치환할 수 있다. KR을 다른 KR로 또는 KR 및 DH로 치환시키고 익스텐더 모듈 5 (또는 PKS의 다른 부위)에는 아무런 변화도 가하지 않은 경우, 재조합 에포틸론 PKS는 에포틸론 C와 D를 생산하는데, 이는 익스텐더 모듈 5의 DH 도메인이 에포틸론 C와 D에서 C-12-C-13 이중결합의 형성을 매개하기 때문이다. KR을 KR, DH 및 ER로 치환하고 익스텐더 모듈 5 (또는 PKS의 다른 부위)에는 아무런 변화를 가하지 않은 경우에는, 재조합 에포틸론 PKS가 12,13-디히드로-에포틸론 C 및 D를 생산한다. 또한 만일 KR을 불활성 KR로 치환하거나 또는 KR을 불활성화시킨 경우에는, 재조합 에포틸론 PKS는 13-옥소-11,12-데히드로-에포틸론 C 및 D를 생산한다.
[167] 따라서, 본 발명은 돌연변이, 결실 또는 다른 PKS로부터의 비기능적인 KR 도메인에 의해 치환됨으로 해서 익스텐더 모듈 4의 KR 도메인이 불활성화된 재조합 에포틸론 PKS를 제공한다. 이 재조합 PKS는 주로 13-옥소-11,12-데히드로 에포틸론 B를 생산한다; 이 미생물에 의해 생산된 화합물들 중에서 관찰된 C-11-C-12 이중 결합은 그 모듈의 ER 도메인에 의한 환원에 앞서 익스텐더 모듈 5의 DH 도메인에 의해 자라기 시작하는 폴리케타이드 사슬 중에 형성된 이중 결합의 이동에 기인하여 유래된 것인 것으로 믿어진다. 본 발명은 또한 이 신규한 폴리케타이드를 생산하는 숙주 세포도 제공한다. 예컨대,믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus) 균주 K122-56 (이 균주는 부다페스트 조약에 의거하여 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA에 2000년 11월 21일자로 기탁되어 기탁번호 PTA-2714를 부여받았다)는 결실에 의해 모듈 4의 KR 도메인이 불활성화되어 13-옥소 에포틸론 A 및 B와 그의 데히드로 유도체 (주로 13-옥소-11,12-데히드로 에포틸론 B)를 생산하는 에포틸론 PKS 유전자를 함유한다.
[168] 에포틸론 PKS의 제 5 익스텐더 모듈은 KS, 말로닐 CoA에 결합하는 AT, DH, ER, KR 및 ACP 도메인을 포함한다. 한가지 구체예에서, 에포틸론 PKS의 제 5 익스텐더 모듈을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 화합물을, 에포틸론 유도체를 생산하는 에포틸론 PKS 또는 재조합 에포틸론 PKS의 코딩 서열을 포함하는 DNA 화합물내에 삽입한다. 또 다른 구체예에서, 제 5 익스텐더 모듈 코딩 서열의 일부를 다른 PKS 코딩 서열과 함께 이용하여 하이브리드 모듈 코딩 서열과 그에 의해 코딩된 하이브리드 모듈을 만든다. 이 구체예에서, 본 발명은 임의로 상이한 입체화학을 특정하도록, 예컨대 말로닐 CoA 특이적인 AT를 메틸말로닐 CoA, 에틸말로닐 CoA, 또는 2-히드록시말로닐 CoA 특이적인 AT로 치환하고; ER, DH 및 KR 중 어느 하나, 두개 또는 세개 모두를 결실시키고; 및/또는 ER, DH, 및 KR 중 어느 하나, 두개 또는 세개 모두를 KR, DH 및 KR, 또는 KR, DH 및 ER로 치환시키는 것을 제공한다. 결과적인 하이브리드 제 5 익스텐더 모듈 코딩 서열은 에포틸론, 에포틸론 유도체 또는 다른 폴리케타이드를 합성하는 PKS의 코딩 서열과 함께 사용될 수 있다. 한편, 에포틸론 PKS의 제 5 익스텐더 모듈은 이종 PKS 모듈에 의해 통째로 치환되거나 결실됨으로 해서, 에포틸론 PKS 또는 그의 유도체의 다른 단백질과 연계적으로 에포틸론 유도체를 생산하는 PKS를 구성하는 단백질을 생산할 수 있다.
[169] 본 발명의 예시적인 재조합 PKS 유전자에는 에포틸론 PKS의 제 5 익스텐더 모듈의 AT 도메인 코딩 서열이 변경 또는 치환되어 말로닐 특이적인 A로부터 메틸말로닐 특이적인 AT가 되도록 코딩된 AT 도메인이 변경된 재조합 epoD 유전자 유도체가 포함된다. 이러한 메틸말로닐 특이적인 AT 도메인 코딩 핵산은 비제한적인 예로서, DEBS, 나르보놀라이드 PKS, 라파마이신 PKS 및 FK-520 PKS를 코딩하는 PKS 유전자로부터 분리해낼 수 있다. 이러한 재조합epoD유전자가epoA, epoB, epoC, epoE, epoF및/또는epoK유전자 (또는 그의 유도체)와 함께 발현되리 경우, 그로 구성된 PKS는 10-메틸 에포틸론 또는 그의 유도체를 생산한다. 본 발명에 의해 제공되는 또 다른 재조합epoD유전자에는 변경된 이 모듈 5 코딩 서열뿐만 아니라, 메틸말로닐 CoA에만 결합하는 AT 도메인을 코딩하는 모듈 4 코딩 서열도 포함된다. PKS에epoA, epoB, epoC, epoE, epoF및/또는epoK유전자를 삽입하면, 재조합epoD유전자 유도체 산물은 10-메틸 에포틸론 B 및/또는 D 유도체를 생산한다.
[170] 본 발명의 또 다른 예시적인 재조합 epoD 유전자 유도체로는 에포틸론 PKS의 제 5 익스텐더 모듈에 대한 하나 이상의 ER, DR, 및 KR 도메인 코딩 서열이 치환되거나 돌연변이되어: (i) 비기능적인 ER, DH 또는 KR 도메인; (ii) 기능적인 KR 도메인만; (iii) 기능적인 KR 및 DH 도메인만; (iv) 다른 PKS로부터의 기능적인 ER, DH 또는 KR 도메인을 제공하는 것들을 들 수 있다. 익스텐더 모듈 5의 DH 도메인이 에포틸론 C 및 D에서의 C-12-C-13 이중결합의 형성에 책임이 있다는 발견은소란지움 셀룰로섬을 비롯한 여하한 생명체, 및 에포틸론 PKS 유전자를 함유하는 재조합 숙주 세포에서 에포틸론 및 에포틸론 유도체를 만들어내기 위한 본 발명의 새로운 방법을 제공해준다. 뿐만 아니라, 익스텐더 모듈 6의 DH 도메인 역시 신규한 에포틸론 유도체를 만들기 위한 본 발명의 방법에 따라 이용가능한, 이전 모듈에 결합된, 새로 형성되는 폴리케타이드의 베타-카르보닐에도 작용할 수 있는 것으로 밝혀지게 되었다.
[171] 따라서, 세가지 모듀의 익스텐더 모듈 5KR, DH 및 ER 도메인이 결실되거나 불활성화되면, 재조합 에포틸론 PKS는 에포틸론 A 및 B의 13-히드록시-11-옥소 유사체를 생산한다. DH 및 ER 도메인이 결실되거나 불활성화되면, 재조합 에포틸론 PKS는 13-히드록시-10,11-데히드로-에포틸론, 주로 13-히드록시-10,11-데히드로 에포틸론 D를 생산한다. 본 발명은 또한 이 신규한 폴리케타이드를 생산하는 숙주세포도 제공한다. 예컨대,믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus) 균주 K122-148 (이 균주는 부다페스트 조약에 의거하여 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA에 2000년 11월 21일자로 기탁되어 기탁번호 PTA-2711를 부여받았다)는 익스텐더 모듈 5의 Dh, KR 및 ER 도메인이 KR 도메인만에 의해 치환되어 13-히드록시-10,11-데히드로-에포틸론 D를 생산하는 에포틸론 PKS 유전자를 함유한다. 본 발명은 또한 이 균주에 의해 생산되는 신규한 에포틸론 유도체를 제공한다. ER 도메인만이 결실되거나 또는 달리 불활성화되면, 재조합 에포틸론 PKS는 에포틸론 C 및 D의 10,11-데히드로 유사체, 주로 10,11-데히드로 에포틸론을 생산한다. 따라서, 한가지 측면에서, 본 발명은 익스텐더 모듈 5의 ER 도메인이 돌연변이에 의해 불활성화되거나 결실되어 10,11-데히드로-에포틸론 D를 생산하는 재조합 에포틸론 PKS를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 에포틸론 PKS의 익스텐더 모듈 5의 ER 도메인의 코딩 서열의 돌연변이로 인해 10,11-데히드로-에포틸론 D를 생산하는소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum) 숙주 세포를 제공한다.
[172] 본 발명의 이러한 재조합epoD유전자 유도체들은epoA, epoB, epoC, epoE및epoF유전자 또는 다르게 변경된 재조합epo유전자 (그리고 그들 자신 부가적인 변경을 함유할 수 있음)와 함께 발현되어 대응하는 에포틸론 유도체를 만드는 PKS를 생산한다. 예컨대, 본 발명에 의해 제공되는 재조합epoD유전자 유도체중 하나는 메틸말로닐 CoA에만 결합하는 AT 도메인을 코딩하는 모듈 4 코딩 서열도 포함한다. 상기한 바와 같이, 에포틸론 C-11 유도체를 생산하는 기능적으로 유사한epoD유전자 역시, 에포틸론 제 5 익스텐더 모듈의 ER, DH 및 KR 도메인중 어느 하나, 두개 또는 세개 모두를 불활성화시킴으로써 만들수도 있다. 여하한 모듈 중 이러한 도메인을 변경시키기 위한 또 다른 방식은 동종 또는 이종 PKS 코딩 서열의또 다른 ㅁ듈로부터 취한 소망되는 도메인의 완전한 세트로 치환시키는 것이다. 이러한 방식으로, PKS의 본래의 구조가 유지된다. 또한, 천연 PKS 내에서 함께 기능하는 KR과 DH 또는 KR, DH, 및 ER 도메인은 존재할 경우 재조합 PKS에서 바람직하게 이용된다. 상술한 치환체의 예시적인 대체 도메인으로는 예컨대, 라파마이신 PKS 익스텐더 모듈 3으로부터의 불활성 KR 도메인, 라파마이신 PKS 익스텐더 모듈 5 로부터의 KR 도메인 및 라파마이신 PKS 익스텐더 모듈 4로부터의 KR 및 DH 도메인을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 다른 이러한 불활성 KR, 활성 KR 및 활성 KR 및 DH 도메인 코딩 핵산은 예컨대 DEBS, 나르보놀라이드 PKS, 및 FK-520 PKS를 코딩하는 PKS 유전자로부터 분리될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 결과적인 PKS 효소 각각은 표준 화학방법학에 의해 생체외에서 더욱 유도화시켜 본 발명의 반합성 에포틸론 유도체를 생산할 수 있는 폴리케타이드 화합물을 생산한다.
[173] 에포틸론 PKS의 제 6 익스텐더 모듈에는 KS, 메틸말로닐 CoA와 결합하는 AT, DH, ER, KR 및 ACP가 포함된다. 한가지 구체예에서, 제 6 익스텐더 모듈 코딩 서열의 일부는 다른 PKS 코딩 서열과 함께 이용되어 하이브리드 모듈을 형성할 수 있다. 이 구체예에서, 본 발명은 임의로 상이한 입체화학을 특정하기 위해, 예컨대 메틸말로닐 CoA 특이적인 AT를 말로닐 CoA, 에틸말로닐 CoA, 또는 2-히드록시말로닐 CoA 특이적인 AT로 치환시키고; ER, DH 및 KR 중 어느 하나, 두개 또는 세개 모두를 결실시키고; 및/또는 ER, DH 및 KR 중 어느 하나, 두개, 또는 세개 모두를 KR, DH, 및 KR, 또는 KR, DH 및 ER로 치환시키는 것을 제공한다. 결과적인 이종의 제 6 익스텐더 모듈 코딩 서열은 에포틸론, 에포틸론 유도체, 또는 다른 폴리케타이드를 만드는 PKS의 단백질 서브유닛의 코딩 서열과 함꼐 사용될 수 있다. 다른 한편, 에포틸론 PKS의 제 6 익스텐더 모듈을 결실시키거나 또는 그 전체를 이종의 PKS 모듈에 의해 치환시킴으로써 에포틸론 유도체에 대한 PKS를 생산할 수 있다.
[174] 본 발명의 예시적인 재조합 PKS 유전자에는, 에포틸론 PKS의 제 6 익스텐더 모듈의 AT 도메인 코딩 서열이 변경 또는 치환됨으로 해서 그에 의해 코딩된 AT 도메인이 메틸말로닐 특이적인 AT로부터 말로닐 특이적인 AT로 변경된 것이 포함된다. 이러한 말로닐 특이적인 AT 도메인 코딩 핵산은 예컨대, 비제한적인 예로, 나르보놀라이드 PKS, 라파마이신 PKS, 및 FK-520 PKS를 코딩하는 PKS 유전자로부터 분리해 낼 수 있다. 이러한 하이브리드 모듈 6을 코딩하는 본 발명의 재조합epoD유전자가 다른 에포틸론 PKS 유전자와 함께 발현되면, 재조합 PKS는 8-데스메틸 에포틸론 유도체를 만든다. 이 재조합epoD유전자 유도체는 또한 다른 변경을 포함하는epo유전자 유도체와 함께 발현되거나 또는 대응하는 8-데스메틸 에포틸론 유도체를 만드는 PKS를 생산할 수 있도록 그 자체가 추가 변경될 수도 있다. 예컨대, 본 발명에 의해 제공된 한가지 재조합epoD유전자는 메틸말로닐 CoA에만 결합하는 AT 도메인을 코딩하는 모듈 4 코딩 서열도 포함한다.epoA, epoB, epoC, epoE및epoF유전자와 함께 PKS 내로 삽입될 경우, 재조합epoD유전자 산물은 에포틸론 B (기능적인 epoK 유전자가 존재할 경우) 및 D의 8-데스메틸 유도체를 생산하게 한다.
[175] 본 발명의 기타의 예시적인 재조합epoD유전자 유도체에는 에포틸론 PKS의 제 6 익스텐더 모듈의 ER, DH 및 KR 도메인 코딩 서열들이 (i) KR 및 DH 도메인; (ii) KR 도메인; 및 (iii) 불활성 KR 도메인을 코딩하는 것들에 의해 치환되어 있는 것들이 포함된다. 본 발명의 이들 재조합epoD유전자 유도체들은, 다른 에포틸론 PKS 유전자와 함께 발현될 경우 대응하는 (i) C-9 알켄, (ii) C-9 히드록시 (두가지 에피머 모두, 다음 모듈에서 부가적인 KS 및/또는 ACP 치환이 일어나지 않는다면, 그중 하나만 프로세스될 수 있음), 및 (iii) C-9 케토 (C-9-옥소) 에포틸론 유도체를 만든다. 기능적으로 동등한 제 6 익스텐더 모듈 역시 에포틸론 제 6 익스텐더 모듈의 ER, DH 및 KR 도메인 중 어느 하나, 두개 또는 세개 모두를 불활성화시킴으로써도 만들 수 있다. 예컨대, 본 발명은믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus) 균주 K39-164 (이 균주는 부다페스트 조약에 의거하여 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA에 2000년 11월 21일자로 기탁되어 기탁번호 PTA-2711를 부여받았다)를 제공하는데, 이 균주는 익스텐더 모듈 6의 KR 도메인이 돌연변이에 의해 불활성화되어 9-케토-에포틸론 D를 생산하는 에포틸론 PKS 유전자를 함유한다. 본 발명은 또한 이 균주에 의해 생산되는 신규한 에포틸론 유도체도 제공한다.
[176] 따라서, 재조합 epoD 유전자 유도체는 다른 변경을 포함하는 다른 재조합 epo 유전자 유도체와 함께 발현될 수도 있고 또는 그 자체로 추가 변경되어 대응하는 C-9 에포틸론 유도체를 만드는 PKS를 생산할 수도 있다. 예컨대, 본 발명에 의해 제공되는 한가지 재조합 epoD 유전자 유도체는 메틸말로닐 CoA에만 결합하는 AT 도메인을 코딩하는 모듈 4 코딩 서열들도 포함한다.epoA, epoB, epoC, epoE및epoF유전자와 함꼐 PKS내로 삽입될 경우, 재조합epoD유전자 산물은 기능적인epoK유전자의 존재 여부에 따라, 에포틸론 B 및 D의 C-9 유도체를 생산한다.
[177] 상술한 치환체에 의한 치환 도메인들에는 케톤 형성을 위한 라파마이신 PKS 모듈 3으로부터의 불활성 KR 도메인, 알코올 형성을 위한 라파마이신 PKS 모듈 5로부터의 KR 도메인 및 알켄 형성을 위한 라파마이신 PKS 모듈 4로부터의 KR 및 DH 도메인이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 이러한 다른 불활성 KR, 활성 KR, 및 활성 KR과 DH 도메인 코딩 핵산은 비제한적인 예로 DEBS, 나르보놀라이드 PKS, 및 FK-520 PKS를 코딩하는 PKS 유전자로부터 분리해낼 수 있다. 결과적인 PKS 각각은 표준 화학방법학에 의해 생체외에서 추가로 유도화되어 본 발명의 반합성 에포틸론 유도체를 생산할 수 있는 C-9 위치에 관능기를 포함하는 폴리케타이드 화합물을 생산한다.
[178] 에포틸론 PKS의 제 7 익스텐더 모듈에는 KS, 메틸말로닐 CoA에 특이적인 AT, KR 및 ACP가 포함된다. 에포틸론 PKS의 제 7 익스텐더 모듈은 제 8 익스텐더 모듈도 함유하는,epoE유전자의 유전자 산물에 함유되어 있다. 한가지 구체예에서, 에포틸론 PKS의 제 7 익스텐더 모듈을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 화합물을 발현시켜, 다른 단백질과 함께, 에포틸론 PKS 또는 에포틸론 유도체를 생산하는 PKS를 구성하는 단백질을 형성시킨다. 이들 그리고 관련 구체예에서, 에포틸론 PKS 또는 그 유도체의 제 7 및 제 8 익스텐더 모듈은 일반적으로 단일 단백질이며epoA, epoB, epoC, epoD및epoF유전자 또는 그의 유도체와 함께 발현되어 PKS를 구성한다. 또 다른 구체예에서, 제 7 익스텐더 모듈 코딩 서열의 일부 또는 전부를 다른 PKS 코딩 서열과 함께 이용하여 하이브리드 모듈을 만든다. 이 구체예에서,본 발명은 예컨대, 메틸말로닐 CoA 특이적인 AT를 말로닐 CoA, 에틸말로닐 CoA, 또는 2-히드록시말로닐 CoA 특이적인 AT로 치환하거나; KR을 결실시키거나; KR을 다른 입체화학을 특정하는 KR로 치환시키거나; 및/또는 DH 또는 DH 및 ER를 삽입하는 것을 제공한다. 결과적인 이종의 제 7 익스텐더 모듈 코딩 서열은 임의로 다른 코딩 서열과 함께 사용되어, 다른 단백질과 함께 에포틸론, 에포틸론 유도체, 또는 다른 폴리케타이드를 합성하는 PKS를 구성하는 단백질을 발현시킨다. 다른 한편, epoE 유전자 중의 제 7 익스텐더 모듈의 코딩 서열을 이종 모듈에 대한 서열로 치환시키거나 결실시킴으로써,epoA, epoB, epoC, epoD,및epoF유전자와 함께 에포틸론 유도체의 PKS를 만들도록 발현될 수 있는 재조합epoE유전자 유도체를 제조할 수 있다.
[179] 본 발명의 재조합 epoE 유전자 유도체의 예로는 에포틸론 PKS의 제 7 익스텐더 모듈에 대한 AT 도메인 코딩 서열이 변경 또는 치환되어 그에 의해 코딩된 AT 도메인이 메틸말로닐 특이적인 AT로부터 말로닐 특이적인 AT로 변경된 것을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.이러한 말로닐 특이적인 AT 도메인 코딩 핵산은 예컨대 비제한적인 예로, 나르보놀라이드 PKS, 라파마이신 PKS, 및 FK-520 PKS를 코딩하는 PKS 유전자로부터 분리할 수 있다. 다른 에포틸론 PKS 유전자, epoA, epoB, epoC, epoD 및 epoF 또는 그의 유도체와 함꼐 발현될 경우, C-6 메틸 대신 C-6 수소를 갖는 에포틸론 유도체의 PKS가 생산된다. 따라서, 만약 이 유전자가 다른 변경을 함유하지 않는다면, 생산된 화합물은 6-데스메틸 에포틸론이다.
[180] 에포틸론 PKS의 제 8 익스텐더 모듈에는 KS, 메틸말로닐 CoA에 특이적인 AT, 불활성 KR 및 DH 도메인, 메틸트랜스퍼라제 (MT) 도메인 및 ACP가 포함된다. 한가지 구체예에서, 에포틸론 PKS의 제 8 익스텐더 모듈을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 화합물을, 에포틸론 유도체를 생산하는 PKS 또는 에포틸론 PKS를 구성하는 다른 단백질과 함께 발현시킨다. 또 다른 구체예에서는, 제 8 익스텐더 모듈 코딩 서열의 전부 또는 일부를 다른 PKS 코딩 서열과 함께 사용하여 하이브리드 모듈을 만든다. 이 구체예에서, 본 발명은 예컨대, 메틸말로닐 CoA 특이적인 AT를 말로닐 CoA, 에틸말로닐 CoA, 또는 2-히드록시말로닐 CoA 특이적인 AT로 치환하거나; 불활성 KR 및/또는 불활성 DH를 결실시키거나; 불활성 KR 및/또는 DH를 활성 KR 및/또는 DH로 치환하거나; 및/또는 ER을 삽입하는 것을 제공한다. 결과적인 이종의 제 8 익스텐더 모듈 코딩 서열은 임의로 다른 코딩 서열과 함께 사용되어, 다른 단백질과 함께 에포틸론, 에포틸론 유도체, 또는 다른 폴리케타이드를 합성하는 PKS를 구성하는 단백질로서 발현된다. 다른 한편, epoE 유전자 중의 제 8 익스텐더 모듈의 코딩 서열을 이종 모듈에 대한 서열로 치환시키거나 결실시킴으로써,epoA, epoB, epoC, epoD,및epoF유전자와 함께 에포틸론 유도체의 PKS를 만들도록 발현될 수 있는 재조합epoE유전자 유도체를 제조할 수 있다.
[181] 에포틸론 PKS의 제 8 익스텐더 모듈은 또한 에포틸론 전구체를 메틸화시키는 활성을 갖는 메틸화 또는 메틸트랜스퍼라제 (MT) 도메인을 포함한다. 이 기능을 결실시킴으로써, 에포틸론 분자의 대응하는 C-4 위치에서, 제 8 익스텐더 모듈의 AT 도메인이 말로닐 특이적인 AT 도메인이 변경되었는지의 여부에 따라, 하나 또는 두개의 메틸기 모두가 결여된 에포틸론 유도체를 만드는 다른 에포틸론 PKS유전자 또는 그의 유도체에 의해 발현될 수 있는, 본 발명의 재조합 epoD 유전자 유도체를 생산할 수 있다.
[182] 에포틸론 PKS의 제 9 익스텐더 모듈에는 KS, 말로닐 CoA 특이적인 AT, KR, 불활성 DH 및 ACP가 포함된다. 에포틸론 PKS의 제 9 익스텐더 모듈은 epoF 유전자의 생성물인 단백질로서 발현되며, 이것은 또한 에포틸론 PKS의 TE 도메인도 함유한다. 한가지 구체예에서, 에포틸론 PKS의 제 9 익스텐더 모듈을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 화합물을, 다른 단백질과 함께 단백질로서 발현시켜, 에포틸론 유도체를 생산하는 PKS 또는 에포틸론 PKS를 구성시킨다. 이들 구체예에서, 제 9 익스텐더 모듈은 일반적으로 에포틸론 PKS 도는 이종 PKS의 TE 도메인도 함유하는 단백질로서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제 9 익스텐더 모듈 코딩 서열의 일부 또는 전부를 다른 PKS 코딩 서열과 함께 이용하여 하이브리드 모듈을 만든다. 이 구체예에서, 본 발명은 예컨대, 말로닐 CoA 특이적인 AT를 메틸말로닐 CoA, 에틸말로닐 CoA, 또는 2-히드록시말로닐 CoA 특이적인 AT로 치환시키거나; KR을 결실시키거나; KR을 다른 입체 화학을 특정하는 KR로 치환시키거나; 및/또는 DH 또는 DH 및 ER를 삽입시키는 것을 제공한다. 예컨대, 익스텐더 모듈 9의 AT 도메인을 메틸말로닐 CoA 특이적인 AT 도메인으로 치환하면 본 발명의 재조합믹소코커스숙주 세포에서 2-메틸-에포틸론 A, B, C 및 D를 생산하는 재조합 에포틸론 PKS가 초래된다. 결과적인 이종의 제 9 익스텐더 모듈 코딩 서열은 에포틸론, 에포틸론 유도체, 또는 다른 폴리케타이드를 합성하는 PKS를 구성하는 다른 단백질과 함께 발현된다. 한편, 본 발명은 에포틸론 또는 제 9 익스텐더 모듈이 이종 PKS로부터의 모듈에 의해 치환되었거나 또는 그 전체가 결실된 에포틸론 유도체의 PKS를 제공한다. 후자의 예에서, TE 도메인은 불연속 단백질로서 발현되거나 또는 제 8 익스텐더 모듈에 융합된다.
[183] 또 다른 구체예에서, 본 발명은 티오에스터라제 타잎 II 단백질 ("TE II")를 코딩하는 유전자 뿐만 아니라, 이종 PKS 유전자 클러스터 (동일한 종류의 비변형, 자연발생적인 숙주 세포에는 존재하지 않는 PKS 유전자 클러스터)를 함유하는 본 발명의 숙주 세포를 제공한다. 바람직한 구체예에서, TE II 유전자는 PKS 유전자 클러스터와 이종인 것이 좋다 - - TE II 유전자는 PKS와 동일한 유전자 클로스터로부터 유도되지 않음. 한가지 예로서, 한가지 구체예 중 본 발명의 재조합 숙주 세포는 에포틸론 PKS 또는 에포틸론 PKS 유도체의 발현을 코딩하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 에포틸론 PKS 유전자 클러스터 이외의 PKS 유전자 클러스터로부터 분리된 TE II 유전자를 함유하도록 숙주 세포를 변형시킨다. 그 예로는,스트렙토마이세스 베네주엘라에 (Streptomyces venezuelae)의 피크로마이신 PKS 유전자 및소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum)의tmbAPKS 유전자 클러스터 (이 PKS 유전자 클러스터는 미국특허 No. 6,090,601; 1998년 8월 31일자 미국특허출원 No. 144,085; 2001년 2월 15일자 미국특허출원 No. 60/271,245, 모두 본문에 참조됨)를 들 수 있다.
[184] 하이브리드 모듈 (에포틸론 PKS와 동일한 특이성을 갖는 다른 모듈)의 변경된 특이성을 리스팅함으로써 동정된, 본 발명의 재조합 에포틸론 유도체 PKS 유전자의 예로는 다음을 들 수 있다:
(a) 메틸말로닐 특이적인 AT (mmAT) 및 KR을 갖는 모듈 4 및 말로닐 특이적인 AT (mAT) 및 KR을 갖는 모듈 2;
(b) mmAT를 갖는 모듈 4 및 mmAT를 갖는 모듈 3;
(c) mmAT를 갖는 모듈 4 및 mmAT를 갖는 모듈 5;
(d) mmAT를 갖는 모듈 4 및 mmAT와 오직 DH 및 KR을 갖는 모듈 5;
(e) mmAT를 갖는 모듈 4 및 mmAT와 오직 KR만을 갖는 모듈 5;
(f) mmAT를 갖는 모듈 4 및 mmAT와 오직 불활성 KR만을 갖는 모듈 5;
(g) mmAT를 갖는 모듈 4 및 mAT를 갖는 모듈 6;
(h) mmAT를 갖는 모듈 4 및 mAT와 오직 DH 및 KR을 갖는 모듈 6;
(i) mmAT를 갖는 모듈 4 및 mAT와 오직 KR만을 갖는 모듈 6;
(j) mmAT를 갖는 모듈 4 및 mAT와 오직 불활성 KR만을 갖는 모듈 6;
(k) mmAT를 갖는 모듈 4 및 mAT를 갖는 모듈 7;
(l) 모듈 5가 mAT를 갖는 것을 제외하고는 하이브리드 (d) 내지 (f);
(m) 모듈 6이 mmAT를 갖는 것을 제외하고는 하이브리드 (h) 내지 (j);
(n) 모듈 4가 mAT를 갖는 것을 제외하고는 하이브리드 (a) 내지 (m).
상기 리스트는 오직 예시적인 것으로서 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 제시된 것 이외의 2개의 하이브리드 모듈뿐만 아니라, 3개 이상의 하이브리드 모듈을 갖는 효소 및 재조합 에포틸론 PKS 유전자도 포함한다.
[185] 본 발명의 숙주 세포들은 다른 목적으로 기술분야에 알려진 조건 하에서 생육 및 발효되어 본 발명의 화합물을 생산할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 숙주 세포를 발효시키기 위한 새로운 방법도 제공한다. 본 발명의 화합물들은 예컨대 후술하는 실시예 3의 방법에 따라 이들 배양된 세포의 발효 브로쓰로부터 분리되어 정제될 수 있다.
[186] 본 발명은 폴리케타이드 및 다른 생성물의 생산을 위해믹소코커스 (Myxococcus) 균주를 발효시키는 몇가지 방법을 제공한다. 본 발명 이전에는, 특정믹소코커스 (Myxococcus) 균주에 의해 자연적으로 생산되는 TA 및 사프라마이신 이외의 여하한 폴리케타이드를 생산할 목적으로믹소코커스 (Myxococcus)를 발효시킨 바가 없었다. 따라서, 한가지 측면에서, 본 발명은 폴리케타이드, 비리보좀성 펩타이드, 에포틸론, 리파제, 프로테아제, 다른 단백질, 지질, 당지질 (glycolipids) 및 폴리히드록시알카노에이트를 비롯한 (이에 한정되지 않음) 유용한 생활성 화합물을 발효에 의해 생산하기 위한 생산 숙주로서믹소코커스 (Myxococcus)를 이용하는 것을 가능케 한다.
[187] 본 발명에 의해 제공된 방법 중에는,믹소코커스 (Myxococcus) 균주의 제조방법, 보관용 세포 은행 및 발효 배지에 적응시키기 위한 방법이 있다. 본 발명 전까지는, 오일-기제의 발효 배지 중에서 생산되기 위해 적응된믹소코커스 (Myxococcus) 균주의 냉동 세포 은행이 만들어진 적이 없었고, 이러한 적응 없이는, 특히 오일-기제의 발효 배지에서믹소코커스 (Myxococcus) 균주들이 잘 죽기 때문에 이 방법들은 특히 중요하다.
[188] 본 발명은 또한믹소코커스 (Myxococcus)를 키우기 위한 발효법과 본 발명의 방법에 유용한 발효 배지도 제공한다. 놀랍게도,믹소코커스 잔투스(Myxococcus xanthus)와 다른믹소코커스 (Myxococcus) 균주들은 탄수화물, 글리세롤, 알코올 또는 TCA 사이클 중간체를 탄소원으로서 이용하지 못한다. 본 발명이 발명되기 전에는,믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus)의 발효는 단백질을 기제로 한 배지에서 수행되었다. 그러나, NH4가 단백질 기제 배지 중에서 생육에 유독한 농도까지 많아져서 발효를 제한한다. 본 발명에 따라,믹소코커스 (Myxococcus) 균주들은 탄소원으로서 오일 및/또는 지방산을 함유하는 배지 중에서 발효시킨다.
[189] 이 방법에 유용한 오일 및 지방산의 예로는 메틸 올리에이트; 코코넛, 라아드, 평지씨, 참깨, 대두 및 해바라기로부터 유래된 오일; 샐러드 오일; Agrimul CoS2, R5O5, 및 R5O3와 같은 자기유화 오일; 글리세롤 모노 올리에이트 및 글리세롤 트리 올리에이트를 비롯한 글리세롤 올리에이트; 메틸 헵타데카노에이트, 메틸 노나데카노에이트, 및 메틸 펠라고네이트와 같은 홀수 사슬 에스테르; 프로필 올리에이트 및 에틸 올리에이트와 같은 에스테르 사슬; 식물성 메틸 올리에이트; 메틸 스테아레이트; 메틸 리놀리에이트; 올레산; 및 대두 또는 난황으로부터 유도되거나 순수한 포스파티딜 콜린을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 따라서, 예컨대 해바라기 또는 대두유와 같은여하한 식물 또는 곡물로부터 유래된 오일, 라아드 오일, 포화 또는 불포화된 여하한 사슬 길이의 유리 또는 에스테르화된 지방산과 같은 여하한 동물 유래의 오일, 각각 포스파티딜 콜린 또는 메틸 펠라고네이트와 같은 천연 또는 합성 지방산 혼합물, 및 Cognis Corporation's Agrimul 시리즈와 같은 공업 발효유 등을 모두 본 발명에 사용할 수 있다. 바람직한 구체예에서,발효 배지에 탄소원으로 메틸 올리에이트를 사용하는 것이 좋다. 일반적으로, 상온에서 액체인 오일들이 고체 오일보다 바람직하며, 이는 주로 분산 용이성 때문에 그러하다. 발효 배지의 다른 중요한 성분들은 Fe 및 Cu와 같은 미량의 금속을 함유하는데, 이것은 뱃치식 (batch) 및 페드-뱃치식 (fed-batch) 프로세스에서 복합 배지 및 규정 배지에서 생산성과 생장성을 증대시켜준다. 메틸 올리에이트와 미량 금속을 함유하는 배지가 에포틸론을 생산하는데 바람직하다.
[190] 한가지 구체예에서, 본 발명은 동물성 재료를 전혀 또는 소량만 함유하는 본 발명의 숙주 세포용 발효 배지를 제공한다. 바이러스 및 프라이온과 같은 감염원에 의한 오염 잠재성, 인간이나 동물에게 투여될 화합물 생산을 위한 발효 프로세스에서 동물성 부산물의 사용으로 인해, 동물성 재료를 전혀 함유하지 않거나 소량만 함유하는 발효 배지를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 배지는 본 발명의 방법에 사용되도록 제공된다. 발효 배지 중에 함유된 오일 또는 지방산은 비-동물성 소스, 예컨대 식물로부터 유래된 것일 수 있다. 뿐만 아니라, 동물성 재료를 비-동물성 소스로부터 유래된 동등한, 그러나 동일하지 않은 재료로 대체시킬 수 있다. 예컨대, 유단백질인 카제인의 췌장 소화물인 카지톤 (casitone)을 식물성 단백질 가수분해물과 같은, 식물성 소스를 비롯한 (그러나 이에 한정되지 않음) 비동물성 소스로부터의 단백질 가수분해물로 대체시킬 수 있다.
[191] 일반적으로, 페드-뱃치식 프로세스가 발효에 바람직하다. 피드는 세포로 하여금 영양분을 효과적으로 이용하게끔 한다 (예컨대, 세포는 독성 유기산을발생시키는 대신 탄소를 CO2와 H2O로 분해 대사시킨다). 영양분 농도가 높으면 2차 대사를 억제할 수 있으며, 발효가 저해 역치 미만의 속도로 영양분을 주입하면, 생산성이 더 높아질 수 있다.
[192] 본 발명의 발효 방법 역시 에포틸론의 생산에 특히 관련있는 방법 및 이들 방법에 유용한 발효 배지를 포함한다. 한가지 구체예로서, 프로피오네이트 및 아세테이트는 에포틸론 D:C (또는 B:A)의 비율과 얻어지는 에포틸론의 타이터 (titer)에 영향을 주기 위해 이용될 수 있다. 이러한 효과가 바람직한 메틸 올리에이트/미량 금속 발효 배지에서는 최소인 반면, CTS 배지와 같은 다른 배지에서는 그 효과가 상당히 큰 효과일 수 있다. 발효 배지 중의 아세테이트의 양을 증가시키면 믹소코커스의 성장 및 에포틸론 생산을 증대시킬 수 있다. 아세틸론은 단독으로 에포틸론 C (또는 에포틸론 A)의 타이터를 극적으로 증가시킬 수 있고, 에포틸론 D (또는 에포틸론 A)의 타이터는 극적으로 감소시킬 수 있다. 프로피오네이트는 에포틸론 타이터를 단독으로 증가시키지 못하며 고농도에서는 타이터를 감소시킬 수 있다. 그러나, 프로피오네이트와 아세테이트는 함께 에포틸론 C (또는 에포틸론 A)로부터 에포틸론 D (또는 에포틸론 B)로 생산을 이동시킬 수 있다. 에포틸론 D를 생산하기 위한 한가지 바람직한 배지는 카지톤, 10mM 아세테이트 및 30mM 프로피오네이트를 함유한다. 홀수사슬의 지방산을 함유하는 배지는 에포틸론 C 및 D를 생산하는 믹소코커스 잔투스 세포의 발효시 에포틸론 C의 생산성을 저하시킬 수 있다. 미량 금속 역시 아세테이트 존재 하에서, 그리고 발효 배지 중에 오일이 전혀 없을경우 에포틸론 D 생산 및 에포틸론 D;C 비율을 증대시킬 수 있다.
[193] 본 발명은 또한 발효 배지로부터 에포틸론을 정제하는 방법 및 결정 형태의 에포틸론을 제조하는 방법도 제공한다. 일반적으로, 정제 방법은 에포틸론을 발효가 진행되는 동안 XAD 수지상에 포획하여, 수지로부터 용출시키고, 고상추출하여, 크로마토그래피한 다음 결정화 시키는 단계를 포함한ㄷ. 이 방법은 실시예 3에 상세히 설명되어 있으며,에포틸론 D의 경우 이 방법이 바람직하여 예시되었지만, 이 방법은 자연발생적인 에포틸론 및 본 발명의 숙주 세포에 의해 생산되는 에포틸론 유사체를 비롯한 (그러나 이에 한정되지 않음) 결정성 에포틸론을 제조하는데에 일반적으로 이용가능하다.
[194] 따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 농업, 수의학, 및 의약 분야에서 유용한 분리 정제된 형태로 신규한 에포틸론 유도체 화합물들을 제공한다. 한가지 구체예에서, 이 화합물은 살진균제로서 유용하다. 또 다른 구체예에서, 이 화합물은 암의 화학요법에 유용하다. 또 다른 구체예에서, 이 화합물은 염증, 자기면역 질환 및 건선과 같은 과증식성 질환의 치료, 및 스텐트에서의 세포 성장 방지를 비롯한 (이에 한정되지 않음), 바람직스럽지 못한 세포 성장을 방지하는데 유용하다. 바람직한 구체예에서, 이 화합물은 종양 세포에 대해 적어도 에포틸론 B 또는 D만큼 강력한 에포틸론 유도체이다. 또 다른 구체예에서, 이 화합물은 또 다른 화합물의 제조에 유용하다. 바람직한 구체예에서, 이 화합물은 인간 또는 동물에 투여하기 위한 혼합물 또는 용액으로 조제된다.
[195] 본 발명의 숙주 세포에 의해 생산되는 에포틸론 뿐만 아니라, 본 발명의 신규한 에포틸론 유사체도 PCT 특허 공개 Nos. 93/10121, 97/19086, 98/08849, 98/22461, 98/25929, 99/01124, 99/02514, 99/07692, 99/27890, 99/39694, 99/40047, 99/42602, 99/43320, 99/43653, 99/54318, 99/54319, 99/54330, 99/65913, 99/67252, 99/67253, 및 00/00485, 그리고 미국특허 No. 5,969,145에 설명된 바와 같이 유도화 및 조성될 수 있다.
[196] 본 발명의 화합물들로는 14-메틸 에포틸론 유도체 (말로닐 CoA 대신 메틸말로닐 CoA에 결합하는 AT를 갖는 본 발명의 하이브리드 모듈 3을 이용하여 만들어짐); 8,9-데히드로 에포틸론 유도체 (ER, DH, 및 KR 대신 DH 및 KR을 갖는 본 발명의 하이브리드 모듈 6을 이용하여 만들어짐); 10-메틸 에포틸론 유도체 (말로닐 CoA 대신 메틸말로닐 CoA에 결합하는 AT를 갖는 본 발명의 하이브리드 모듈 5를 이용하여 만들어짐); 9-히드록시 에포틸론 유도체 (ER, DH, 및 KR 대신 KR을 갖는 본 발명의 하이브리드 모듈 6을 이용하여 만들어짐); 8-데스메틸-14-메틸 에포틸론 유도체 (메틸말로닐 CoA 대신 말로닐 CoA에 결합하는 하이브리드 모듈 6과 말로닐 CoA 대신 메틸말로닐 CoA에 결합하는 AT를 갖는 본 발명의 하이브리드 모듈 3을 이용하여 만들어짐); 8-데스메틸-8,9-데히드로 에포틸론 유도체 (ER, DH 및 KR 대신 DH와 KR을 갖고 메틸말로닐 CoA 대신 말로닐 CoA를 특정하는 AT를 갖는 본 발명의 하이브리드 모듈 6에 의해 만들어짐); 및 9-옥소-에포틸론 D를 들 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 신규한 에포틸론에는 실시예 11에 설명된 것과 다음의 것이 포함된다.
[197] 본 발명의 한가지 측면에서, 다음 식으로 표시되는 화합물이 제공된다:
식 중,
R1, R2, R3, R5, R11, 및 R12는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸;
R4, R6, 및 R9은 각각 독립적으로 수소, 히드록실 또는 옥소;
또는 R5와 R6는 탄소탄소 이중 결합을 형성하고;
R7은 수소, 메틸, 또는 에틸;
R8및 R10은 두가지 모두 수소이거나 똔느 함께 탄소 탄소 이중 결합 또는 에폭사이드를 형성하고;
Ar은 아릴이며;
W는 O 또는 NR13(여기서 R13은 수소, C1-10지방족, 아릴 또는 알킬아릴임)을타낸다. 또 다른 구체예에서, R1, R4, R5, R6, R9, 및 R11중 적어도 하나가 수소가 아님을 전제로 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12및 R13, Ar 및 W가 상기한 바와 같은 화학식 I의 화합물이 제공된다.
[198] 또 다른 구체예에서, 다음 정의를 갖는 화학식 I의 화합물이 제공된다:
R1, R2, R3, 및 R11은 각각 독립적으로 수소 또는 메틸;
R4와 R9는 각각 독립적으로 수소, 히드록실 또는 옥소;
R5와 R6는 두가지 모듀 수소이거나 또는 함께 탄소탄소 이중결합을 형성하고;
R7과 R12는 두가지 모두 메틸;
R8과 R10은 두가지 모두 수소 또는 함께 탄소탄소 이중결합을 형성하고;
Ar은 헤테로아릴;이며
W는 O 또는 NR13(여기서 R13은 R1, R4, R5, R6, R9, 및 R11중 적어도 하나가 수소가 아님을 전제로 C1-5 알킬이거나 수소임)이다.
[199] 본 발명의 또 다른 측면에서, 다음 식의 화합물이 제공된다:
식 중, R4, R6, 및 R9는 각각 독립적으로 수소, 히드록실 또는 옥소;
R5, R11, R12는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸; 또는
R5와 R6는 함께 탄소탄소 이중결합을 형성하고;
R7은 수소, 메틸 또는 에틸;
R8과 R10은 두가지 모두 수소 또는 탄소탄소 이중결합 또는 에폭사이드를 형성하고;
Ar은 아릴;
W는 O 또는 NR13임 (여기서 R13은 수소 또는 C1-5알킬임). 또 다른 구체예에서, R4, R5, R6, 및 R9중 적어도 하나가 수소가 아님을 전제로 R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, Ar 및 W가 상기한 바와 같은 화학식 II의 화합물도 제공된다.
[200] 또 다른 구체예에서, 다음 정의를 갖는 화학식 II의 화합물이 제공된다:
R4와 R9는 각각 독립적으로 수소, 히드록실 또는 옥소;
R5및 R6는 각각 수소이거나 함께 탄소탄소 이중결합을 형성하고;
R7및 R12는 두가지 모두 메틸이고;
R8과 R10은 두가지 모두 수소 또는 탄소 탄소 이중 결합을 형성하고;
Ar은 2-메틸-1,3-티아졸리닐, 2-메틸-1,3-옥사졸리닐, 2-히드록시메틸-1,3-티아졸리닐, 또는 2-히드록시메틸-1,3-옥사졸리닐;이고,
W는 R4, R5, R6, 및 R9중 적어도 하나가 수소가 아님을 전제로 NH 또는 O임.
[201] 또 다른 구체예에서, 다음 식을 갖는 화합물이 제공된다:
식 중,
R1, R2, R3, R5, R11, R12는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸;
R6는 수소; 또는
R5와 R6는 함께 탄소탄소 이중결합을 형성하고;
R7은 수소, 메틸, 또는 에틸;
Ar은 아릴이며;
W는 O 또는 NR13(여기서 R13은 수소 또는 C1-5 알킬임)이다. 또 다른 구체예에서, R1, R5, R6, 및 R11중 적어도 하나가 수소가 아님을 전제로 R1, R2, R3, R5, R6, R7, R11, R12및 R13, Ar 및 W가 상기한 바와 같은 화학식 III의 화합물이 제공된다.화학식 III의 화합물이 제공된다.
[202] 또 다른 구체예에서, 다음의 정의를 갖는 화학식 III의 화합물이 제공된다:
R1, R2, R3, 및 R11은 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸;
R5와 R6는 각각 독립적으로 수소 또는 함께 탄소탄소 이중결합을 형성하고;
R7과 R12는 두가지 모두 메틸;
Ar은 2-메틸-1,3-티아졸리닐, 2-메틸-1,3-옥사졸리닐, 2-히드록시메틸-1,3-티아졸리닐, 또는 2-히드록시메틸-1,3-옥사졸리닐이고;
W는 R1, R5, R6및 R11중 적어도 하나가 수소가 아님을 전제로 NH 또는 O이다.
[203] 본 발명의 또 다른 측면에서, 다음 식을 갖는 화합물이 제공된다:
식 중, R4는 수소 또는 옥소;
R5와 R6는 두개 모두 수소 또는 함께 탄소탄소 이중결합을 형성하고;
R7은 수소 또는 메틸;
R9은 수소 또는 히드록실;
R8과 R10은 두개 모두 수소 또는 함께 탄소탄소 이중결합이나 에폭사이드를 형성하고;
W는 O 또는 NH;
X는 O 또는 S이고;
R14는 메틸 또는 히드록시메틸임.
[204] 본 발명의 또 다른 측면에서, 다음 식을 갖는 화합물이 제공된다:
화학식 IV
식 중,
R4는 수소 또는 옥소;
R5와 R7은 각각 독립적으로 수소 또는 메틸;
R6는 수소;
R8과 R10은 두가지 모두 수소 또는 함께 탄소탄소 이중결합이나 에폭사이드를 형성하고; 또는
R6과 R8은 함께 이중결합을 형성하며;
R9는 수소, 히드록시 또는 옥소;
W는 O 또는 NH;
X는 O 또는 S;이고
R14는 메틸 또는 히드록시메틸임.
[205] 본 발명의 또 다른 구체예에서, 다음 식을 갖는 화합물들이 제공된다:
[206] 본 발명의 화합물은 세포독성 제제 (cytotoxyc agents)로서 항암제로서 등 여러가지 비제한적인 여하한 방식으로 사용가능하다. 튜불린 중합 및 세포독성의 정도를 평가하기 위한 예시적인 분석법을 실시예 12에 서렴ㅇ하였다.
[207] 본 발명의 화합물은 몇가지 방법을 이용하여 만들 수 있다. 본 발명의 한가지 측면에서, 이들 화합물은 에포틸론 PKS를 발현하는 재조합 숙주 세포에 의해 생산된다. 한가지 구체예에서, 하나 이상의 모듈에서의 AT 특이성을 변경시키고/또는 하나 이상의 모듈에서 효소 도메인을 변경시킴으로써 다음 식을 갖는 화합물이 제조된다 (식 중, R1내지 R12는 화학식 I의 화합물에서 정의된 바와같음):
실시예 11에 이 방법에 사용될 수 있는 수식유형 및 특정 화합물을 설명하였다.
[208] 본 발명의 또 다른 구체예에서, 화학식 V의 옥사졸 대응부분 (counterparts)은 보통은 화학식 V의 화합물을 만들 숙주 세포의 발효 조건을 변경시킴으로써 만들어질 수 있다. 화학식 V의 화합물의 티아졸 부분은 NRPS에서 시스테인 결합 부위로부터 유래한 것이다. 에포틸론 C와 D의 옥사졸 대응부분인 에포틸론 H1및 H2는 숙주 세포에 의해 미량으로 만들어지며 에포틸론 NRPS에서 시스테인 대신 세린에 종종 결합함으로써 발생하는 것으로 믿어진다.
[209] 본 발명의 방법은 에포틸론 PKS의 NRPS 결합 부위에 대한 세린과 시스테인의 명백한 (apparent) 경쟁관계를 이용하는 것으로서 에포틸론 NRPS에서 시스테인 대신 세린에 더 잘 결합하는 발효 조건을 이용하는 것이다. 세린이 보강된 (기초 농도의 예컨대 약 50배 농도) 배지에서 숙주 세포를 생육시킬 경우, 보통 생산되는 티아졸-함유 화합물 대신, 대부분 옥사졸-함유 화합물이 생성된다는 것이밝혀졌다. 결국, 화학식 V의 하합물 또는 특정 에포틸론 화합물을 만들기 위해 조작된 재조합 숙주 세포를 세린이 보강된 배지에서 키움으로써 이들 동일 세포들은 이제 다음 화학식 VI으로 표시되는 옥사졸 대응부분 화합물을 더 잘 생산하게 된다:
[210] 즉, 본 발명의 방법은 화학식 V에 대응하는 화합물과 화학식 VI에 대응하는 그의 대응화합물의 두가지 화합물을 한꺼번에 간편하고 세련된 방식으로 얻는 방법이다. 옥사졸-함유 화합물을 제조하기 위한 세린 보강 방법은 실시예 13에 더 자세히 설명되어 있다. 이 실시예는 각각 에포틸론 D 및 C의 옥사졸 대응 화합물인 에포틸론 H2및 H1의 생산을 증진시키기 위해, 균주 K111-40-1에 의해 일반적으로 생산되는 에포틸론 D 및 C의 농도를 감소시키는데 이용된 조건들을 설명한다. 본 발명의 또 다른 화학식 V의 화합물을 생산하기 위한 다른 재조합 구조물도 화학식 VI의 화합물을 제조하는 것과 유사한 조건을 이용하여 키울 수 있다.
[211] 본 발명의 또 다른 측면에서, 화학생합성 (chemobiosynthesis)이라고칭해지는 방법을 이용하여 화합물들이 생산된다. 이 방법은 PKS가 지정된 위치에서 합성 전구체를 수용 및 결합하도록 하는 방식으로 변경된 에포틸론 PKS를 이용한다. 이어서 합성 전구체는 그 시점부터 통상적인 방식으로 PKS에 의해 프로세싱된다.
[212] 화학생합성에 요구되는 변경의 종류가 실시예 9에 예시되어 있는데, 실시예 9는 주생성물로서 일반적으로 에포틸론 A, B, C 및 D를 생산하는믹소코커스 잔투스균주의 KS2녹아웃 (knockout) 버젼의 구조를 설명한다. KS2 녹아웃이란 익스텐더 모듈 2의 KS 도메인이 불활성화됨으로 해서 결과적인 PKS가 이전 모듈, 로딩 도메인 및 NRPS (익스텐더 모듈 1로 여겨짐)의 생성물을 로딩 및 가공하지 못하게 되는 것을 말한다. 결국, PKS-지향된 합성은 익스텐더 모듈 2의 ACP에서 중지되고 합성 전구체 부재하에서는 이러한 균주에 의해서는 에포틸론 생산이 일어나지 못한다. 그러나, 균주에 합성 전구체를 공급하면, 이것이 로딩 도메인과 익스텐더 모듈 1의 생성물을 흉내내어 익스텐더 모듈 2의 ACP가 전구체에 결합하게 되고 PKS는 그 지점부터 전구체를 가공하게된다. 예컨대, 실시예 9의 녹아웃 균주에 다음의 합성 전구체
를 제공하면 실시예 10에 상세히 설명되는 바와 같이 에포틸론 B 및 D (에포틸론 A와 B도 생산되지만 그 양은 미량에 불과하다)가 생산되게 된다. 도 1도 참조. 실시예 9의 녹아웃 균주에 예컨대 다음의 합성 전구체들을 제공하면,
(식 중, R은 수소, 히드록시, 할로겐, 아미노, C1-5알킬, C1-5히드록시알킬, C1-5알콕시, 및 C1-5아미노알킬, 더욱 바람직하게는 수소 또는 메틸)
다음의 에포틸론 화합물 및 이들의 각각 12,13-에폭사이드 대응화합물이 생산된다.
[213] 따라서, 합성 전구체를 변화시킴으로써, 광범위한 화합물을 만드는데단일한 KS2 녹아웃 균주를 이용할 수 있다. 실제로, 실시예 9에 설명된 균주에 다음 식의 합성 전구체
를 제공함으로써 다음 식을 갖는 화합물을 만드는데 이용할 수 있다.
식 중, Ar은 아릴이고 R7은 수소 또는 메틸임,
적절한 Ar기의 예로는 다음을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다:
식 중, R은 수소, 히드록시, 할로겐, 아미노, C1-5알킬, C1-5히드록시알킬, C1-5알콕시, 및 C1-5아미노알킬이다. 보다 바람직한 구체예에서, R은 수소 또는 메틸이다. 실시예 10은 여러가지 전구체의 합성법과 화학생합성에서의 이들의 용도 및 각각 이들에 대응하는 12,13-에폭사이드 대응화합물을 설명한다.
[214] 또 다른 구체예에서, 본 발명의 특정 화합물을 만들기 위해 로딩 도메인 녹아웃이 이용된다. 예컨대, 실시ㅖ 9에서 사용된 출발물질의 로딩 도메인 녹아웃 역시 다음 식의 합성 전구체를 제공함으로써 화학식 VII 및 VIII의 화합물을 만드는데 이용될 수 있다.
[215] 또 다른 구체예에서, 본 발명의 다른 균주들의 KS2 또는 로딩 도메인 녹아웃은 실시예 11에 설명된 균주들이 포함되며 (이에 한정되지 않음) 2-메틸 티아졸 이외의 아릴 부분을 갖는 화합물을 만드는데 사용된다. 예컨대, 화학식 IX의 합성 전구체를 주로 9-옥소-에포틸론 D를 만드는 구조물의 KS2 녹아웃에 공급하면 다음 식을 갖는 화합물이 생산될 것이다.
식 중, Ar은 아릴이다.
[216] 본 발명의 또 다른 측면에서, 에포틸론 PKS를 발현하는 숙주 세포로부터 만들어진 화합물은 생물학적 및/또는 합성 방법을 이용하여 더욱 수식시킬 수있다. 한가지 구체예에서, Ar이
인 화학식 I의 화합물을 미생물-유도된 히드록실라제를 이용하여 C-21 탄소에서 히드록실화시킬 수 있다. 이러한 트랜스포메이션을 수행하기 위한 프로토콜은 예컨대 PCT 공개 No. WO 00/39276에 설명되어 있으며, 그 내용 전체가 본 명세서, 특히 실시예 14에 참조되었다.
[217] 또 다른 구체예에서, 에포틸론 A-D의 C-12 및 C-13에 대응하느 위치에서 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 본 발명의 화합물은 EpoK 또는 또 다른 P450 에폭시다제를 이용하여 에폭시화시킬 수 있다. 에폭시화를 위해 EpoK를 사용하는 일반적인 방법은 PCT 공개 No. WO 00/31247의 실시예 5에 설명되어 있으며, 그 내용은 본 명세서, 특히 실시예 15에 참조되었다. 또한, 탄소-12와 탄소-13 사이의 결합에 대응하는 위치에 이중결합을 함유하는 에포틸론 화합물을, 기능적인 EpoK를 발현하는 세포 배양체에 접촉시킴으로써 에폭시화 반응이 일어날 수 있다. 이러한 세포로는 믹소박테리움인소란지움 셀룰로섬을 들 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서,소란지움 셀룰로섬은 EpoK를 발현하지만, 기능적인 에포틸론 폴리케타이드 신타제 ("PKS")는 함유하지 않는다. 이러한 균주는 에포틸론 PKS 유전자 중 하나 이상의 돌연변이로 인해 이 유전자를 작동하지 못하게 하는 돌연변이에 의해 만들 수 있다. 이러한 돌연변이주는 자연적으로 생길 수도 있고 (스크리닝에 의해 발견될 수 있음) 또는 화학약품이나 광조사 또는 유전자 조작과 같은 돌연변이원에 의해 생길수도 있다. 비작동성 에포틸론 PKS를 이용하여 이들 균주를 만드는데 특히 효과적인 전략은 PCT 공개 WO 00/31247에 설명된 바와 같은 동종 재조합 (homologous recombination)이다.
[218] 또 다른 구체예에서, 에폭시화 반응은 합성법을 이용하여 일어날 수도 있다. 예컨대, 다음 반응식 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 데속시 (desoxy) 화합물들은 이들 데속시 화합물을 디메틸디옥시란과 반응시킴으로써 그의 에폭시 대응 화합물로 전환될 수 있다.
실시예 16에 이 합성법을 상세히 기재하였다.
[219] 또 다른 구체예에서, 본 발명의 마크로락톤은 본 발명의 마크로락탐으로 전환될 수 있다. 반응식 3에 도시되어 있는 바와 같이, 본 발명의 데속시 마크로락톤은 반응식 2에 설명된 디메틸디옥시란을 이용하여 에폭시화시킴으로써 그의 옥시 대응화합물로 전환된다.
옥시-마크로락톤을 소듐 아자이드 및 테트라키스 (트리페닐포슬린) 팔라듐으로 처리하여 개환시켜 아지도산을 형성시킨다. 이어서 아자이드를 트리메틸포스핀으로 환원시켜 아미노카르복시산을 만든다.
[220] W가 NH인 본 발명의 에폭시-화합물 은 아미노카르복시산을 마크로락탐화시켜 만들 수 있다.
반응식 4에 도시된 바와 같이, 아미노 카르복시산을 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸-카르보디이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸로 처리하여 에폭시-마크로락탐을 형성시킨다. 텅스텐 헥사클로라이드와 부틸리튬을 이용하여 에폭시-마크로락탐을 처리함으로써 데속시-마크로락탐을 만들 수 있다.
[221] W가 NR13(여기서 R13은 수소가 아님)인 본 발명의 에폭시-화합물은 마크로락탐화에 앞서, 아미노 카르복시산을 알데하이드와 소듐 시아노보로하이드로 처리함으로써 만들 수 있다.
반응식 5에 도시된 바와 같이, 아미노 카르복시산을 알데하이드, R13HO 및 소듐 시아노보로하이드라이드로 처리하여 치환된 아미노산을 만들고 이어서 이를 마크로락탐화 및 반응식 4에 설명된 바와 같이 임의로 데옥시화시켜 R13이 수소가 아닌, 에폭시 및 데속시 마크로락탐을 만든다.
[222] 본 발명의 마크로락탐을 만들기 위한 합성법은 실시예 17-19에 더 상세히 설명하였다. 실시예 17은 예시적인 출발물질로서 9-옥소-에포틸론 D를 이용하여 아미노산을 만드는 것을 서명한다. 실시예 18과 19는 9-옥소-에포틸론 D의 에폭시 및 데속시 마크로락탐 버젼을 만드는 방법을 각각 설명한다. 실시예 20 및 21은 9-옥소-에포틸론 D의 에폭시 및 데속시 치환 마크로락탐 버젼을 만드는 방법을 각각 설명한다.
[223] 본 발명의 조성물은 일반적으로 본 발명의 화합물과 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 화합물은 유리 형태일수도 있고 또는 적절한 경우 본 발명 화합물의 전구체 및 염 및 에스테르와 같은 약학적으로 허용가능한 유도체 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 형태 등 적절한 모든 형태일 수 있다. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 제 5판, Lippicott Williams & Wilkins (1991) 참조. 일반적으로, 이러한 약학적 제제는 활성성분으로서 본 발명의 화합물 한가지 이상을 외용, 장용 또는 비경구 투여에 적합한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제와의 혼합물 형태로 함유할 것이다. 활성 성분은 예컨대 일반적인 정제, 펠릿, 캡슐, 좌약, 페싸리, 용액제, 유제, 좌약, 및 기타 적합한 여하한 형태를 위한 비독성이면서, 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 혼합될 수 있다. 사용가능한 담체에는 물, 글루코스, 락토스, 아카시아검, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 우레아 및 고체, 반고체 또는 액체 형태의 제제로 제조하기에 적합한 여하한 담체가 포함된다. 또한, 보조적인 멸균제, 농후제 및 착색제와 향료도 사용할 수 있다.
[224] 한가지 구체예에서, 본 발명 화합물을 함유하는 조성물에는 Cremophor가 함유되어 있지 않다. Cremophor(BASF Aktiengesellschaft)는 용해도가 낮은 약물을 조제하는데 계면활성제로서 널리 사용되는 폴리에톡실화 카스터유이다. 그러나, Cremophor는 환자에서 알러지 반응을 일으킬 수 있기 때문에, 조성물은 Cremophor를 최소한으로 함유하거나 아예 함유하지 않는 것이 바람직하다. Cremophor가 없이 에포틸론 A 또는 B를 함유하는 조성물이 예컨대 PCT 공개 No. WO 99/39694에 설명되어 있으며, 본문에 참조되었다.
[225] 적용가능한 경우, 본 발명의 화합물은 마이크로캡슐 및 나노입자로서 조성될 수 있다. Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy by Max Donbrow, ed., CRC Press (1992) 및 미국특허 Nos. 5, 510, 118 ; 5, 534, 270 ; 및 5, 662, 883 에 일반적인 프로토콜이 설명되어 있으며 본문에 참조되었다. 표면적 대 부피의 비율을 증가시킴으로써 이 조성물들은 활성 화합물을 경구전달하는데 적당하게 만들어지는데, 그렇지 않으면, 경구 전달하기에 적합하지 못하다.
[226] 본 발명의 화합물은 저용해성 약물에 이전부터 사용되어 온 다른 방법을 이용해서도 조성가능하다. 예컨대, 본 발명의 화합물은 본문에 이미 참조된 WO 98/30205 및 00/71163에 설명된 바와 같이 비타민 E 또는 그의 PEGylated 유도체와 함께 유제를 형성할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 화합물은 에탄올 (바람직하게는 1% w/v 미만)을 함유하는 수용액에 용해된다. 비타민 E 또는 PEGylated-비타민 E가 첨가된다. 이어서 에탄올을 제거하여 정맥내 또는 경구 투여를 위해 조성될 수 있는 예비-유제를 형성시킨다. 또 다른 방법은 본 발명 화합물을 리포좀 캡슐에 담는 것이다. 약물전달용 비히클로서 리포좀을 형성하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 에포틸론 B와 관련된 PCT 공개 No. WO 01/10413와 비교적 용해도가 낮은 항암제인 택솔과 관련해서 적합한 프로토콜로는 미국특허 Nos. 5,683,715; 5,415,869; 및 5,424,073을 들 수 있으며 이들 모두 본문에 참조되었다. 사용가능한 여러가지 지질 중에서, 에포틸론-캡슐화 리포좀을 만드는데 특히 바람직한 지질로는 포스파티딜콜린과 폴리에틸렌글리콜-유도된 디스테아릴 포스파티딜에탄올아민을 들 수 있다. 실시예 22에는 9-옥소-에포틸론 D를 함유하는 리포좀을 만드는 프로토콜이 제시되어 있으며 이 방법은 본 발명의 다른 화합물을 함유하는 리포좀을 만드는 데에도 쉽게 적용될 수 있다.
[227] 또 다른 방법은 바이오폴리머 또는 생체적합한 (합성 또는 자연발생적인) 폴리머와 같은 폴리머를 이용하여 본 발명 화합물을 약물로 조성하는 것과 관련된다. 생체적합성 폴리머는 생체분해가능한 것과 생체분해가 불가능한 것으로 나뉘어진다. 생체분해성 폴리머는 화학 조성, 제조방법 및 임플랜트 구조의 함수로서 생체내에서 분해된다. 합성 폴리머의 예로는 폴리안하이드라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산과 같은 폴리히드록시산 및 그의 코폴리머, 폴리에스테르 폴리아미드 폴리오르토에스테르 및 몇몇 폴리포스파젠을 들 수 있다. 자연발생적인 폴리머의 예로는 젤라틴, 알부민, 히알루론산, 콜라겐과 같은 폴리사카라이드 및 단백질을 들 수 있다.
[228] 또 다른 방법은 본 발명의 화합물을, 수용성을 증대시키는 폴리머에 콘쥬게이션시키는 것이다. 적절한 폴리머의 예로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-(d-글라탐산), 폴리-(l-글루탐산), 폴리-(l-글루탐산), 폴리-(d-아스파르트산), 폴리-(l-아스파르트산), 폴리-(l-아스파르트산), 및 이들의 코폴리머를 들 수 있다. 분자량이 약 5,000 내지 약 100,000인 폴리글루탐산이 바람직하고, 분자량이 약 20,000 내지 약 80,000이면 더욱 바람직하며, 분자량이 약 30,000 내지 60,000인 폴리글루탐산이 가장 바람직하다. 미국특허 No, 5,977,163호에 기본적으로 설명된(본문, 특히 실시예 23에 참조됨) 프로토콜을 이용하여 본 발명의 에포틸론의 한가지 이사의 히드록실에 엣테르 결합을 경유하여 폴리머를 콘쥬게이션시킨다. 바람직한 콘쥬게이션 위치에는 본 발명의 21-히드록실 유도체의 경우, 히드록실 오프 (hydroxyl off) 탄소-21이 포함된다. 다른 콘쥬게이션 위치에는 히드록실 오프 탄소 3과 히드록실 오프 탄소 7이 포함된다.
[229] 또 다른 방법에서, 본 발명의 화합물은 모노클로날 항체에 콘쥬게이션된다. 이 방법에 의해 본 발명의 화합물을 특정 표적에 표적화시킬 수 있다. 콘쥬게이트된 항체의 디자인과 용도에 대한 일반적인 프로토콜이 Michael L. Grossbard편집, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer (1998) 에 설명되어 있으며 본문에 참조되었다.
[230] 단일 투약 형태 (single dosage form)를 제조하기 위해 담체 물질과 결합될 수 있는 활성성분의 양은 치료받을 환자와 특정 투여방식에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 정맥내 투여용 조성물은 본 발명의 화합물을 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 바람직하게는 약 5 mg/mL 내지l 15 mg/mL, 더욱 바람직하게는 약 10 mg/mL의 양으로 함유한다. 정맥투여용 조성물은 대개 일반 생리식염수 또는 5% 덱스트로스 용액으로 사용전 약 2배 내지 약 30배의 비율로 희석된다.
[231] 본 발명의 한가지 측면에서, 본 발명 화합물은 암을 치료하는데 사용된다. 한가지 구체예에서, 본 발명의 화합물은 머리와 목에 있는 암, 예컨대 머리, 목, 비강, 부비강, 비인두, 구강, 중인두, 후두, 하인두, 침샘, 및 파라강글리오마의 종양을 치료하는데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 간과 담도 (biliary tree), 특히 간세포 암종을 치료하는데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 장암, 특히 직장암을 치료하는데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 난소암을 치료하는데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 소형 세포 및 비-소형 세포 폐암암을 치료하는데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 유방암을 치료하는데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 섬유육종, 악송 섬유성 조직구종, 태아의 횡문근육종, 평활근육종, 신경섬유육종, 골육종, 활막육종, 지방육종 및 포상 연부육종을 치료하는데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 중추신경계의 신생조직, 특히 뇌암을 치료하는데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 Hodgkin' 임파종, 임파형질세포양 임파종, 낭포성 임파종, 점액-관련 임파양 조직 임파종, 맨틀 세포 임파종, B-리니지 대형 세포 임파종, Burkitt 임파종, 및 T-세포 미분화 대형 세포 임파종을 비롯한 임파종을 치료하는데 이용된다.
[232] 이 방법은 본 발명의 화합물의 치료학적 유효량을 암에 걸린 대상에게 투여하는 것으로 이루어진다. 이 방법은 암을 억제하거나 (즉 추가의 생육을 방지함) 또는 암을 제거하는데 필요한만큼 반복할 수 있다. 임상적으로, 본 발명을 실시함으로써 암 성장과 관련한 크기 및 숫자가 감소되고/또는 관련 증상 (해당될 경우)도 완화될 것이다. 병리학적으로, 본 발명을 실시함으로써 다음중 적어도 한가지 결과가 초래될 것이다: 암세포 증식 억제, 암 또는 종양 크기 감소, 추가적인 전이 방지, 및 종양의 혈관신생 억제.
[233] 본 발명의 화합물과 조성물은 복합요법에 이용될 수 있다. 즉, 본 발명의 화합물과 조성물은 한가지 이상의 다른 소망되는 치료 또는 의학적 처치와 동시에, 그에 앞서, 또는 후속적으로 투여될 수 있다. 복합치료법에 있어서 요법 및 방식의 특정 조합은 요법 및/또는 방식의 공존가능성과 달성하고자 하는 소망되는 치료효과를 고려하여 행하여야 한다.
[234] 한가지 구체예에서, 본 발명의 화합물과 조성물은 다른 항암제 또는 치료법과 조합하여 사용된다.다른 항암제의 비제한적인 예로는: (i) 메클로레타민, 클로람부실, 시클로포스파미드, 멜팔란, 이포스파미드와 같은 알킬화 약물; (ii) 메토트렉세이트와 같은 항대사제; (iii) 빈블라스틴, 파클리탁셀, 데소탁셀, 및 디스코데몰라이드와 가은 마이크로튜불 안정화제; (iv) 혈관신생 억제제; 및 (v) 독소루비콘 (아드리아마이신), 블레오마이신 및 미토마이신과 같은 세포독성 항생제를 들 수 있다. 다른 항암치료법의 예로는: (i) 외과수술; (ii) 방사능요법; 및 (iii) 광역학요법을 들 수 있다.
[235] 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물과 조성물은 설사, 구역질 및 구토와 같은 본 발명의 화합물 또는 조성물로부터 야기될 수 있는 잠재적인 부작용을 완화시키기 위한 약제 또는 방법과 함꼐 복합적으로 사용된다. 설사는 아편양 제제 (예컨대 코데인, 디페녹실레이트, 디페녹신 및 로에라미드), 비스무쓰 서브살리실레이트 및 옥트레오타이드와 같은 지사제로 다스릴 수 있다. 구역질 및 구토는 덱사메타손, 메토클로프라미드, 디페닐하이드라민, 로라제팜, 온단세트론, 프로클로르페라진, 티에틸페라진 및 드로나비놀과 같은 진토제로 치료할 수 있다. Cremophor와 같은 폴리에톡실화된 카스터 오일을 포함하는 조성물의 경우, 덱사메타손 및 메틸프레드니솔론과 같은 코스티코스테로이드 및/또는 디페닐히드라민 HCl과 같은 H1안타고니스트/ 및 또는 H2안타고니스트를 이용하여 아나필락시스를 완화시킬 수 있을 것이다. 정맥내 투여 용도 및 치료전 레지멘의 설명이 각각 실시예 24 및 실시예 25에 제시되어 있다.
[236] 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 화합물은 세포 과증식으로 특징지어지는 암이 아닌 질환을 치료하는데 이용된다. 한가지 구체예에서, 본 발명의 화합물은 건선, 즉, 피부위에 딱딱하게 솟아오르는 병변을 형성하는 각질세포의 세포성 과증식으로 특징지어지는 건선을 치료하는데 이용된다. 본 발명의 방법은 건선을 앓는 환자에게 본 발명의 화합물을 치료학적 유효량만큼 투여하는 것을 포함한다. 이 방법은 병변의 숫자 또는 위중도를 감소시키거나 병변이 제거될때까지 필요한만큼 반복할 수 있다. 임상적으로, 이 방법을 실시함으로써 피부 병변의 크기나 숫자의 감소, 피부 증상 (치료하고자 하는 피부의 동통, 화상 및 출혈)의 감소 및/또는 관련 증상 (예컨대, 관절 발적, 발열, 팽창, 설사, 복부 동통)의 완화가 달성될 것이다. 병리학적으로, 본 발명의 방법을 실시함으로써, 다음 중 적어도 한가지 결과를 얻게 될 것이다: 각질세포 증식 억제, 피부 염증 감소 (예컨대, 성장인자, 항원 제시, 반응성 산소 스피시스 생성 및 매트릭스 메탈로프로테이나제에 영향을 미침으로써), 및 피부 혈관신생의 억제.
[237] 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 뇌에서의 수초탈락 (demyelination) 진행으로 특징지어지는 증상인 다발성 경화증을 치료하는데 이용된다. 미엘린의 손실과 관련된 정확한 메카니즘이 이해되고 있지는 않지만, 미엘린 파괴부위에서의 성상세포 증식 및 축적이 증가가 일어난다. 이 부위에서, 대식세포-유사 활성이 있으며 적어도 부분적으로는 미엘린 수초의 분해에 책임이 있는 프로테아제 활성이 증가된다. 본 발명의 방법은 본 발명으 화합물의 치료학적 유효량을 다발성 경화증을 앓는 대상에게 투여하는 것으로 된다. 본 방법은 성상세포 증식의 억제 및/또는 모터 기능의 위중도 경감 및/또는 이 질병의 만성적인 진행을 예방 또는 약화시키는데 필요한만큼 반복실시할 수 있다. 임상적으로, 본 발명의 방법을 실시하면 시각적 증상 (시력손상, 복시), 걸음걸이와 관련된 장애 (약함, 축 불안정성, 감각 손상, 경련, 반사항진, 덱스테리티 손실), 상지 장애 (약함, 경련, 감각 손상), 방광 장애 (긴급, 뇨실금, 배뇨 주저, 불완전 배뇨), 우울증, 심리불안, 및 인지력 손상의 증상이 개선될 것이다. 병리학적으로, 본 발명의 방법을 실시하면 미엘린 손실, 혈액-외 장벽의 파괴, 단핵 세포의 혈관주위 침윤, 면역이상, 아교질 상처 형성 및 성상세포 증식, 메탈로프로테이나제 생산, 및 손상된 전도속도 중 한가지 이상의 증상이 완화될 것이다.
[238] 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 류마치스성 관절염 치료, 만성 멀티시스템, 회귀, 때로 치료를 요하는 관절의 관절경직 및 파괴로까지 이어지는 염증성 질환을 치료하는데 이용된다. 류마치스성 관절염은 관절 공간내로 뻗는 섬모 돌기를 형성하는 활막의 현저한 비후, 활막세포 라이닝의 복층화 (활막세포 증식), 백혈구 세포에 의한 활막 침윤 (대식세포, 임파구, 혈장세포 및 임파양 낭포; "염증성 활막염"이라고 칭함), 및 활막내 세포성 괴사가 수반되는 피브린 침착에 의해 특징지어진다. 이 과정의 결과 형성된 조직은 파누스 (pannus)라고 불리우며, 실제로 파누스는 관절 공간을 채울때까지 자라게 된다. 파누스는 활막염의 시작에 필수적인 혈관신생 프로세스를 통해 새로운 혈관의 과다한 네트워크를 일으킨다. 파누스 조직 세포로부터의 염증성 프로세스의 다른 매개자 (예컨대, 과산화수소, 수퍼옥사이드, 리소좀성 효소, 및 아라키돈산 대사산물) 및 소화효소의 방출 (매트릭스 메탈로프로테이나제 (예컨대 콜라게나제, 스트로멜리신))은 연골 조직을 점진적으로 파괴시킨다. 파누스는 아티큘라 연골내로 침입하여 연골조직의 부식 및 절편화 일으킨다. 실제로 관련 관절의 섬유상 관절경직 및 궁극적인 뼈의 관절경직일 수반하는 연골하골의 부식이 일어난다.
[239] 본 발명의 방법은 류마치스성 관절염을 앓는 환자에게 본 발명 화합물을 치료학적 유효량만큼 투여하는 것으로 된다. 이 방법은 활막세포 증식 억제 및/또는 치료하고자 하는 관절의 운동성 상실의 위중도 완화 및/또는 이 질병의 만성적 진행의 예방 또는 경감이 달성될 때까지 필요한만큼 반복하여 실시 할 수 있다. 임상적으로, 본 발명 방법을 실시하여 다음 중 한가지 이상을 달성할 수 있다: (i) 증상 (관련 관절의 동통, 팽윤 및 텐더니스; 모닝 강직, 약함, 피로, 식욕감퇴, 체중감소)의 위중도의 감소; (ii) 이 질환의 임상적 징후 (관절 캡슐의 비후, 활막 비대, 관절 삼출액, 연조직 구축, 활동반경 감소, 관절경직 및 관절기형 고정화)의 감소; (iii) 이 질환 (류마치스성 결절, 맥관염, 폐결절, 개재성 섬유증, 심막염, 상공막염, 홍채염, Felty 증후군, 골다공증) 관절외 발현 감소; (iv) 이 질환이 차도를 보이는 빈도 및 기간/무증상 기간의 증가; (v) 장애 및 불구의 고정화 방지;및/또는 (vi) 이 질환의 만성적인 진행의 예방/완화. 병리학적으로, 본 발명의 방법을 실시함으로써 다음 중 적어도 한가지 결과를 얻을 수 있을 것이다: (i) 염증성 반응의 감소; (ii) 염증성 시토카인 (IL-1, TNFa, FGF, VEGF) 활성 파괴; (iii) 활막세포 증식 억제; (iv) 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성 억제, 및/또는 (v) 혈관신생 억제.
[240] 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 특히 맥관내 스텐트로 폐색을 치료할 수 있는 환자에 있어서, 동맥경화증 및/또는 재협착을 치료하는데 이용된다. 동맥경화증은 정상적이라면 혈관의 톤 조절 혈류를 조절하는 동맥 벽 중의 정상적인 혈관 평활근 세포 ("VSMC: vascular smoth muscle cells)의 일부의 특성이 변화되어 "암과 같은" 양태를 발병시키는 만성적인 혈관 손상이다. 이러한 VSMC는 비정상적으로 증식하여, 이들을 혈관내벽으로 침투 및 확산시킬 수 있는 물질 (성장인자, 조직-분해 효소 및 다른 단백질들)을 분비하여, 혈류를 차단함으로 해서, 국소적인 응혈에 의해 그 혈관을 완전히 비정상적으로 폐색시킨다. 재협착, 즉, 보정 처치 후에 협착 또는 동맥 협착이 재발하는 재협착은 동맥경화증이 누적된 형태이다.
[241] 이 방법은 본 발명의 화합물의 치료적 유효량을 스텐트에 코팅시켜 동맥경화증을 앓는 대상의 병든 동맥에 이 스텐트를 전달하는 것으로 이루어진다. 스텐트에 화합물을 코팅하는 방법은 예컨대 미국특허 Nos. 6,156,373, 및 6,120,847호에 설명되어 있다. 임상적으로, 본 발명의 방법을 실시함으로써 다음 중 적어도 한가지가 달성될 것이다: (i) 동맥의 혈류 증가; (ii) 질환의 임상적 증상의 위중도 감소; (iii) 재협착률 감소; 또는 (iv) 동맥경화증의 만성적인 진행의 예방/완화. 병리학적으로, 본 발명을 실시하면 스텐트 이식 부위에서 다음 중 적어도 한가지가 달성될 것이다: (i) 염증성 반응의 감소, (ii) 매트릭스 메탈로프로테이나제의 VSMC 분비 억제; (iii) 평활근 세포 축적 억제; 및 (iv) VSMC 표현형 미분화.
[242] 한가지 구체예에서, 암 또는 세포 증식에 의해 특징지어지는 암이 아닌 질환을 앓고 있는 환자에게 투여되는 투약량은, 약 1 mg/m2내지 약 200 mg/m2일 수 있고 이것은 필요에 따라 매주, 2주마다, 3주마다 대형환제 (bolus)로서 (여하한 적절한 투여경로로) 또는 연속식 주입 (예컨대, 1시간, 3시간, 6시간, 24시간, 48시간 도는 72시간)에 의해 투여될 수 있다. 그러나, 특정 환자에 대한 특정 투여량은 여러가지 인자에 따라 달라질 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 인자에는 사용된 특정 화합물의 활성; 대상환자의 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별, 및 식이수준; 약물의 배설률 및 투여경로; 치료에 다른 약물과 조합사용되는지의 여부; 및 치료되는 증상의 위중도가 포함된다.
[243] 또 다른 구체예에서, 투여량은 필요에 따라 그리고 관용되는 한, 3주일에 한번씩 약 10 mg/m2내지 약 150 mg/m2, 바람직하게는 약 10 mg/m2내지 약 75 mg/m2, 더욱 바람직하게는 약 15 mg/m2내지 약 50 mg/m2인 것이 좋다. 또 다른 구체예에서, 투여량은 필요에 따라 그리고 관용되는 한, 2주일에 한번씩 약 1 mg/m2내지 약 150 mg/m2, 바람직하게는 약 10 mg/m2내지 약 75 mg/m2, 더욱 바람직하게는약 25 mg/m2내지 약 50 mg/m2인 것이 좋다. 또 다른 구체예에서, 투여량은 필요에 따라 그리고 관용되는 한, 1주일에 한번씩 약 1 mg/m2내지 약 100 mg/m2, 바람직하게는 약 5 mg/m2내지 약 50 mg/m2, 더욱 바람직하게는 약 10 mg/m2내지 약 25 mg/m2인 것이 좋다. 또 다른 구체예에서, 투여량은 필요에 따라 그리고 관용되는 한, 하루 한번씩 약 0.1 mg/m2내지 약 25 mg/m2, 바람직하게는 약 0.5 mg/m2내지 약 15 mg/m2, 더욱 바람직하게는 약 1 mg/m2내지 약 10 mg/m2인 것이 좋다.
[244] 상기한 상세한 설명 및 다음의 실시예들은 어디까지나 본 발명의 설명 목적을 위해 제시된 것으로서 본 발명의 범위나 청구범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus ) 발현 벡터의 제조
[245] 파아지 Mx8의 삽입 및 부착 기능을 제공하는 DNA를 시판되는 pACYC184 (New England Biolabs)에 삽입하였다. Salmi 등의 Feb. 1998, J. Bact. 180(3):614-621에 설명된 바와 같이 플라스미드 pPLH343으로부터 ~2360 bpMfeI-SmaI을 분리하고 플라스미드 pACYC184의 커다란EcoRI-XmnI 제한효소 단편에 접합시켰다. 이렇게 얻어진 원형 DNA는 크기가 ~6 kb였으며 이를 플라스키드 pKOS35-77이라고 명명하였다.
[246] 플라스미드 pKOS35-77은 에포틸론 PKS 유전자 프로모터의 조절 하에서본 발명의 재조합 PKS 유전자를 발현시키기 위한 편리한 플라스미드 역할을 한다. 한가지 구체예에서, 동종 프로모터를 갖는 에포틸론 PKS 유전자 전체를 이 플라스미드의 하나 이상의 단편에 삽입하여 본 발명의 발현 벡터를 생산한다.
[247] 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 PKS 유전자가믹소코커스 잔투스프로모터에 의해 조절되는 발현 벡터도 제공한다. 예시적인 벡터를 제조하기 위해,믹소코커스 잔투스의pilA유전자의 프로모터를 PCR 증폭 산물로서 분리해냈다.pilA유전자의 프로모터를 포함하며 Wu 및 Kaiser, Dec. 1997,J. Bact. 179(24):7748-7758에 설명된 바와 같은 플라스미드 pSWU357를 PCR 프라이머 Seq1 및 Mxpil1 프라이머와 혼합하고:
Seql : 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGC-3' (SEQ ID NO:1) 및Mxpill : 5'-TTAATTAAGAGAAGGTTGCAACGGGGGGC-3' (SEQ ID NO:2),
표준 PCR 조건을 이용하여 증폭시켜 ~800 bp 단편을 얻었다. 이 단편을 제한효소KpnI으로 절단하고, 시판되는 플라스미드 pLitmus 28 (New England Biolabs)의 대형KpnI-EcoRV제한효소 단편에 접합시켰다. 얻어진 원형 DNA를 플라스미드 pKOS35-71B라고 명명하였다.
[248] 플라스미드 pKOS35-71B로부터의pilA유전자의 프로모터를 ~800 bpEcoRV-SnaBI 제한효소 단편으로서 분리하고 플라스미드 pKOS35-77의 대형MScI 제한효소 단편에 접합시켜 ~6.8kB 크기의 원형 DNA를 얻었다. ~ 800 bp 단편은 두방향중 어느 방향으로나 삽입될 수 있기 때문에, 이 접합으로 동일 크기의 플라스미드 2개가 얻어졌으며 이들을 플라스미드 pKOS35-82.1과 pKOS35-82.2라고 명명하였다. 이 플라스미드들의 제한효소 자리와 기능 지도를 도 2에 나타내었다.
[249] 플라스미드 pKOS35-82.1과 pKOS35-82.2는믹소코커스 잔투스 pilA유전자 프로모터의 조절하에 재조합 PKS 유전자가 놓여지게 되는 본 발명의 벡터의 편리한 출발물질 역할을 한다. 이 플라스미드들은 프로모터의 전사개시부위 바로 하류 (다운스트림)에 위치하는 단일PacI제한효소 인식 부위를 포함한다. 한가지 구체예에서, 동종 프로모터가 없는 에포틸론 PKS 유전자 전체를PacI제한효소 자리에서 이들 플라스미드 내로 한개 이상의 단편에 삽입시켜 본 발명의 발현 벡터를 얻는다.
[250] 이들 플라스미드 중의pilA프로모터 서열은 다음과 같다:
[251] 본 발명의 재조합믹소코커스 잔투스숙주 세포를 만들기 위해, 300 rpm에서 30℃에서 Klett 100이 될 때까지믹소코커스 잔투스를 CYE 배지 (Campos 및 Zusman, 1975, Regulation of development inMyxococcus xanthus: effect of 3' : 5'-cyclic AMP, ADP, and nutrition,Proc. Natl. Acad. Sci. USA72 : 518-522)에서 키운다. 프로토콜의 나머지는 달리 언급하지 않는 한 25℃에서 수행한다. 세포들을 원심분리 (SS34 또는 SA600 로터 중 8000 rpm에서 10분간)시켜 펠릿화시키고 탈이온수에서 재현탁시킨다. 세포들을 다시 펠릿화 및 원래 부피의 1/100으로재현탁시킨다.
[252] 8.8 - 9.4의 일정 시간 범위에서 실온, 400 ohm, 25μFD, 0.65V에서 DNA (1 내지 2 μL)를 0.1 cm 큐벳 중의 세포내로 전기영동시킨다. DNA에는 염분이 없으며 증류되어 탈이온화된 물에 재현탁시키거나 또는 0.025 μm Type VS막 (Millipore) 상에서 투석시킨다. 저효율 전기영동의 경우, DNA를 스폿 투석하며 CYE에서 과성장한다. 전기영동을 수행한 직후, CYE 1mL를 첨가하고, 큐벳 중의 세포에 한번 첨가된 바 있는 CYE 1.5mL를 더 첨가하여 (총 부피 2.5 ml) 50 mL 어얼렌마이어 플라스크에 위치시킨다. 30 내지 32℃, 300 rpm에서 4 내지 8시간 (또는 밤새) 세포들을 생육시켜 선별가능한 마커가 발현되도록 하였다. 이어서, 페로들은 CYE 연질 한천 (soft agar) 상에 플레이팅하고 선별한다. 선별가능한 마커로스 카나마이신을 이용할 경우, 일반적인 생산량은 103내지 105/1 μg DNA이다. 스트렙토마이신을 선별마커로서 이용한 경우에는, 한천에 결합하기 때문에 한천 상부 (top agar)에 포함된다.
[253] 이 방법에 의해, 본 발명의 재조합 PKS들을 발현하며 에포틸론, 에포틸론 유도체 및 그에 의해 코딩되는 다른 신규한 폴리케타이드를 생산하는믹소코커스숙주 세포 내로 본 발명의 재조합 DNA 발현 벡터를 전기영동시킨다.
실시예 2
믹소코커스 잔투스에서의 에포틸론 발현을 위한 염색체 삽입 및 박테리아의 인공 염색체 (BAC: Bacterial Artificial Chromosome)
[254] 발효에 의해 에포틸론을 생산시키기 위해 이종 숙주에서 에포틸론 PKS 및 수식 효소 유전자를 발현시키기 위해,소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum)과 밀접히 관련되고, 몇가지 클로닝 벡터를 사용할 수 있는믹소코커스 잔투스 (Myxococcus xanthus)를 본 발명의 방법에 이용한다.믹소코커스 잔투스와소란지움 셀룰로섬은 모두 믹소박테리아이기 때문에 유전자 발현, 번역 조절 및 번역후 수식 등에서 공통 적인 요소를 공유할 수 있다.믹소코커스 잔투스는 유전자 클로닝 및 발현을 위해 개발되었다: 전기영동에 의해 DNA가 도입되며, 염색체 내로 그의 안정한 삽입을 허용하는 것들을 비롯하여 몇가지 벡터와 유전자 마커들이 외래 DNA의 도입에 이용가능하다.믹소코커스 잔투스는 발효조의 복합 배지에서 비교적 수월하게 키울 수 있으며 필요하다면, 유전자 발현을 증대시키기 위한 조작을 행할 수도 있다.
[255]믹소코커스 잔투스는 내로 에포틸론 유전자 클로스터를 도입시키기 위해, 동종 재조합에 의해 에포틸론 클러스터를 염색체에 결합시킴으로써 완전한 유전자 클러스터를 조립할 수 있다. 한편, 완전한 에포틸론 유전자 클러스터를 박테리아의 인공 염색체 (BAC) 상에 클로닝시킨 다음 이를 염색체 내로 삽입시키기 위해믹소코커스 잔투스에 집어넣을 수도 있다.
[256] 코스미드 pKOS35-70.1A2 및 pKOS35-79.85로부터 유전자 클러스터를 만들기 위해, 이들 코스미드로부터의 작은 대역 (~ 2kb 또는 그 이상)을믹소코커스 잔투스에 도입하여 보다 큰 단편의 유전자 클러스터를 위한 재조합 부위를 만든다. 도 3에 도시된 바와 같이, 플라스미드 pKOS35-154와 pKOS90-22를 만들어 이들 재조합 부위를 도입한다.믹소코커스 잔투스의 염색체에서 에포틸론 유전자 클러스터를 조립하기 위한 전략을 도 4에 도시하였다. 먼저, 어떤 유전자나 전사 단위도 파괴시키지 않는 이 박테리아의 염색체의 중간 부분 (neutral site)을 선택한다. 이러한 대역의 하나는devS유전자의 다운스트림으로서,믹소코커스 잔투스의 성장이나 발달에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타난 바 있다. 제 1 플라스미드 pKOS35-154를DraI으로 선형화시켜믹소코커스 잔투스내로 전기영동시킨다. 이 플라스미드는 에포틸론 유전자 클러스터의 단편 2개를 플랭킹하는dev위치의 2 대역을 함유한다. 카나마이신 내성 마커와E.coli galK유전자로 이루어진 카세트를epo유전자 대역 사이에 삽입한다. Ueki 등, 1996, Gene 183:153-157 참조. 카나마이신 내성은dev서열을 상동성 대역으로서 이용한 이중 재조합에 의해 DNA가dev대역으로 재결합하는 경우 콜로니에서 발생한다.
[257] 이 균주, K35-159는 pKOS35-79.85의 재조합을 허락해줄 에포틸론 유전자 클러스터의 작은 (~2.5kb) 대역을 함유한다. pKOS35-79.85 상의 내성 마커는 K35-159상의 내성 마커와 동일하기 때문에, 테트라사이클린 트랜스포존이 코스미드 내로 트랜스포즈 되었고, 카나마이신 마커내로 삽입된 이 트랜스포존을 함유하는 코스미드가 선별되었다. 이 코스미드 pKOS90-23을 K35-159내로 전기영동시키고, 옥시테트라사이클린 내성 콜로니들을 선별하여 균주 K35-174를 만들었다. 코스미드로부터의 원치않는 대역을 제거하고 에포틸론 유전자만을 남기기 위해, 세포들을 1% 갈락토스를 함유하는 CYE 플레이트 상에 플레이팅시켰다.galK유전자가 존재할 경우 세포들은 1% 갈락토스에 민감하게 된다. K35-174의 갈락토스 내성 콜로니들은galK유전자에서 돌연변이 또는 재조합에 의해galK마커를 상실하였다. 재조합이 일어나면, 갈락토스 내성 균주가 카나마이신 및 옥시테트라사이클린에 민감해진다. 두가지 항생제 모두에 민감한 균주들을 Southern 블롯 분석에 의해 동정한다. 정확한 균주를 동정하여 K35-175라고 명명하였으며, 이들은epoK의 종결 코돈의 7 내지 4680 bp 다운스트림으로부터의 에포닐론 유전자 클러스터를 함유한다.
[258] 모듈 1 내지 모듈 7을 도입하기 위해, 상기 프로세스를 한번 더 반복한다. 플라스미드 pKOS90-22를 DraI으로 절단하여 K35-175내로 전기영동시켜 K111-13.2를 만들었다. 이 균주를 pKOS35-70.1A2, pKOS90-38의 테트라사이클린 내성 버젼으로 전기영동시켜 옥시테트라사이클린에 내성인 콜로니들을 선별한다. 이렇게 하여 균주 K111-13.23이 만들어진다. 이제 에포틸론 유전자 클러스터 전체를 갖게된 재조합체를 1% 갈락토스에 대한 내성을 이용하여 선별한다. 이에 따라 클론 K111-32.25, K111-32.26, 및 K111-32.35가 얻어진다. 균주 K111-32.25를 부다페스트 조약에 의거하여 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA에 2000년 4월 14일자로 기탁하여 기탁번호 PTA-1700을 부여받았다. 이 균주는 에포틸론 유전자 및 그의 프로모터(들)을 모두 함유한다.
[259] 50 mL 플라스크 중 5 mL의 CYE (1 리터 당 10g 카지톤, 5g 효모 추출물, 및 1g MgSO4·7H2O) 내로 균주를 접종하여 발효를 수행하여 배양체가 대수기 중간까지 자라도록 하였다. CTS 플레이트에 100μL 분주액을 분주시키고, 이 플레이트를 32℃에서 4 내지 5일간 인큐베이션시켰다. 에포틸론을 추출하기 위해, 플레이트로부터 한천과 세포를 함침시키고 50mL 원추형 시험관에 넣고 시험관이 채워질 때까지 아세톤을 첨가하였다. 이 용액을 4 내지 5시간 동안 록킹 (rocking)시키면서 인큐베이션시키고, 아세톤을 증발시킨 다음, 나머지 액체를 동 부피의 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 마그네슘 설페이트를 첨가함으로써 에틸 아세테이트 추출물로부터 물을 제거하였다. 마그네슘 설페이트를 걸러내고, 액체가 건조될때까지 증발시켰다. 에포틸론을 아세토니트릴 200μL에 재현탁시키고 LC/MS로 분석하였다. 분석결과 이 균주는 에포틸론 A 및 B를 생산하는 것으로 나타났다. 에포틸론 B는 배양체 중 약 0.1 mg/L의 양으로, 그리고 에포틸론 A는 이보다 5 내지 10배 낮은 농도로 생산되었다.
[260] 이 균주 역시 액체 배지에서 에포틸론을 생산하는데 이용될 수 있다. CYE를 함유하는 플라스크에 에포틸론 생산 균주를 접종하였다. 다음 날, 세포가 대수기 중간에 이르른 동안, 5% 접종물을 1mg/mL 세린, 알라닌, 및 글리신 및 0.1% 소듐 피루베이트와 함께 0.5% CMM (0.5% 카지톤, 0.2% MgSO4·7H2O, 10 mM MOPS pH 7.6)을 함유하는 플라스크에 첨가한다. 에포틸론 B의 생산성을 증대시키기 위해 소듐 피루베이트를 0.5%까지 첨가할 수 있지만, 이 경우 에포틸론 B 대 에포틸론 A의 비율의 감소가 일어나게된다. 배양체를 30℃에서 60 내지 72시간 동안 키운다. 인큐베이션을 오래할수록 에포틸론 타이터가 감소한다. 에포틸론을 휘수하기 위해, 배양체를 SS34 로터에서 10분간 10,000 rpm으로 원심분리시킨다. 상등액을 에틸 아세테이트로 2회 추출하고 건조할때까지 회전 증발 ("rotavaped")시킨다. 이 액상 배양체는 에포틸론 A와 B를 플레이트 배양시 관찰된 것과 유사한 비융로 2 내지 3 mg/L 생산하였다. 배양체에 XAD (0.5-2%)가 첨가된 경우, 에포틸론 C와 D가 관찰되었으며, 에포틸론 D는 0.1 mg/L, 에포틸론 C는 이보다 5 내지 10배 더 낮은 농도로 존재하는 것으로 관찰되었다.
[261] 유전자 클러스터 전체를 하나의 단편으로서 클로닝하기 위해, 박테리아의 인공 염색체 (BAC) 라이브러리를 제조한다. 먼저, BIO-RAD 게놈 DNA 플러그 키트에 따라 SMP44 세포를 아가로스에 접종시켜 용해시킨다. DNA 플러그를 Sau3AI 또는 HindIII와 같은 제한효소로 부분 절단하고 FIGE 또는 CHEF 겔 상에서 전기영동시킨다. 아가로스로부터 DNA 단편을 전기용출시키거나 또는 아가로스를 분해시키기 위해 젤라제 (gelase)를 이용함으로써 DNA 단편을 분리한다. 단편을 분리하기 위한 선별 방법은 Strong 외, 1997,Nucleic Acids Res. 19: 3959-3961 (본문에 참조됨)에 설명된 바와 같이 전기 용출시키는 것이었다. DNA를 적절한 효소로 절단시킨 BAC (pBeloBACII) 내로 접합시킨다. pBeloBACII의 지도를 도 5에 나타내었다.
[262] DNA를 Sheng 등, 1995,Nucleic Acids Res. 23: 1990-1996 (본문에 참조됨)의 방법에 따라 DH10B 세포내로 DNA를 전기영동시켜소란지움 셀룰로섬게놈 라이브러리를 만들었다. 에포틸론 클러스터의 NRPS 대역으로부터의 프로브를 이용하여 콜로니를 스크리닝한다. 양성 클론을 선별하여 DNA를 제한효소 분석을 위해 분리하여 완전한 유전자 클러스터의 존재여부를 확인하였다. 이 양성 클론을 pKOS35-178로 명명하였다.
[263] pKOS35-178을 도입하는데 사용가능한 균주를 만들기 위해,dev위치에 의해 클랭킹된 에포틸론 유전자 클러스터의 업스트림과 다운스트림과 상동성을 갖는 대역을 함유하며, 플라스미드 pKOS90-22 및 pKOS35-154와 유사하게, 카나마이신 내성galK카세트를 함유하는 플라스미드 pKOS35-164를 만들었다. Kafeshi 등, 1995,Mol. Microbiol. 15: 483-494의 방법에 따라, 이 플라스미드를DraI으로 절단하여믹소코커스 잔투스내로 전기영동시켜 K35-183을 만들었다. 이 플라스미드 pKOS35-178은 박테리오파지 P1을 이용한 트랜스덕션에 의해, 또는 전기영동에 의해 K35-183 내로 도입될 수 있으며 클로람페니콜 내성 콜로니를 선별하였다. 한편, E.coli로부터 K35-183으로 DNA를 전달하기 위해 pRP4로부터의 융합성 전달 기원을 함유하는 pKOS35-178 버젼을 만들었다. 이 플라스미드는, 먼저 RP4로부터의 oriT 대역과 pACYC184로부터의 테트라사이클린 내성 마커를 함유하는 트랜스포존을 만든 다음 이 트랜스포존을 생체외에서 또는 생체내에서 pKOS35-178 내로 트랜스포즈 시킴으로써 제조한다. 이 플라스미드를 S17-1 내로 형질전환시키고믹소코커스 잔투스에 콘쥬게이션시켰다. 제 2의 재조합이 일어났는 지 여부를 선별하기 위해이 균주 K35-190을 1% 갈락토스 존재 하에 키웠다. 이 균주는 잠재적인 프로모터 뿐만 아니라 에포틸론 유전자 전체를 함유한다. 이 균주를 발효시켜 에포틸론 A 및 B의 생산성 여부에 대해 시험하였다.
[264] 다른 한편, 이 트랜스포존은 온도 민감성 플라스미드인 pMAK705 또는 pKO3 내로 이 트랜스포존을 트랜스포즈시켜, tetR 및 camS 플라스미드를 선별하는 방식으로 BAC 내로 재조합시킬 수 있으며; 재조합은 Hamilton 외, Sep. 1989,J.Bact. 171(9) : 4617-4622 및 Link 외, Oct. 1997,J. Bact. 179(20) : 6228-6237 (모두 본문에 참조됨)에 설명된 바와 같이 수행한다.
[265] pKOS35-178을dev위치에 삽입시키는 것 외에, 믹소파지 Mx8 또는 Mx9로부터의 삽입 기능을 이용하여 파지 부착 부위내로 이것을 삽입시킬 수도 있다. pACYC184로부터의 테트라사이클린 유전자와 함께 MX8 또는 Mx9로부터의att부위 및 삽입 유전자를 함유하는 및 트랜스포존을 제조하였다. 이 트랜스포존의 또 다른 버젼은 부착 부위만을 가질 수도 있다. 이 버젼에서, 삽입 유전자를 함유하는 플라스미드를 함께전기영동시키거나 또는 mgl 프로모터와 같은 여하한 구성 프로모터로부터의 삽입 단백질을 전기영동된 균주에서 발현시키도록 함으로써 삽입 유전자를 트랜스 공급시킨다 (Magrini외, Jul. 1999, J. Bact. 181(13): 4062-4070, 본문에 참조됨). 일단 트랜스포존이 제조되면, 이를 pKOS35-178내로 트랜스포즈시켜 pKOS35-191을 만든다. 상술한 바와 같이 이 플라스미드를믹소코커스 잔투스내로 도입한다. 이 균주는 잠재넉인 프로모터 뿐만 아니라 에포틸론 유전자 전체를 함유한다. 이 균주를 발효시켜 에포틸론 A 및 B의 생산 여부를 테스트하였다. 다른 한편,att부위 및oriT대역을 함유하는 균주를 BAC상에 트랜스포즈시키고 결과적인 BAC를믹소코커스 잔투스내로 콘쥬게이션시킬 수 있다.
[266] 일단 에포틸론 유전자가믹소코커스 잔투스균주 내에 수립되면, 후술하는 바와 같이 프로모터 변경 또는 모듈 바꿔치기와 같은 유전자 클러스터의 여하한 부분의 조작도 카나마이신 내성 및galK카세트를 이용하여 수행할 수 있다. epo 유전자를 함유하는믹소코커스 잔투스배양체를 몇가지 배지에서 생육시켜 에포틸론 생산성 여부를 시험하였다. 에포틸론 (특히 B 또는 D)의 생산량이 적으면, 다음 실시예에서 설명되는 바와 같이,믹소코커스 잔투스- 생산 클론 배지 개발하고 돌연변이 기초 균주를 개발하였다.
실시예 3
에포틸론의 생산 및 정제방법
A. 믹소코커스 잔투스 에서의 에포틸론 D의 이종 생산성 최적화
[267] 흡착제 수지의 인코포레이션, 적절한 탄소원의 동정, 및 주입-뱃치식 프로세스를 수행함으로써, 0.16 mg/L의 타이터로부터 믹소코커스 잔투스에서의 에포틸론 D의 이종 생산성을 140배까지 증대시켰다.
[268] 기초 배지 중에서의 에포틸론 D의 분해를 감소시키기 위해, XAD-16 (20g/L)을 첨가하여 세포외 생성물을 안정화시켰다. 이에 따라 그의 회수가 크게 쉬워졌으며 수율도 3배까지 증대되었다. 세포 성장 및 생성물 형성을 위한 탄소원으로서 오일을 사용한 데 대한 것도 평가하였다. 여러가지 오일을 스크리닝한 결과, 메틸 올리에이트가 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 뱃치 프로세스에서 최적 농도인 7 mL/L에서, 최대 세포 밀도는 0.4 g 건조세포중량 (DCW: dry cell weight)/L로부터 2g DCW/L로 증가하였다. 생산수율은 생산 배지 중의 미량원소의 존재여부에 의해 좌우된다. 기초 배지에 미량원소를 외부로부터 공급하면, 에포틸론 D의 피크 타이터 (peak titer)가 8배 증가하였으며, 이는, 세포 대사 및 에포틸론 생합성에 있어서 금속 이온의 역할이 중요함을 입증하는 것이다. 생산 수율을 더욱 증가시키기 위해, 연속식 페드-뱃치 공정을 이용하여 세포밀도를 더 높이고생산기간도 더 연장되게 유지시켰다. 최적화된 페드-뱃치 배양에 의해 세포 밀도가 7 g DCW/L로 계속 유지생산되었고 평균 생산 타이터도 23 mg/L이 되었다.
[269] 에포틸론은 믹소박테리움인소란지움 셀룰로섬의 여러가지 균주에 의해 자연적으로 생산되는 2차 대사산물이다 (Gerth 외, 1996; Gerth 외, 2001; 이 실시예에 인용된 참조문헌은 이 섹션 말미에 수록되었으며 본문에 참조되었음). 이들은 마이크로튜불 탈중합화의 강력한 억제제이며, 그의 활성 메카니즘은 항암약물인 Taxol과 유사하다 (Bollag 외, 1995). P-당단백질을 발현하는 복수-약물 내성 종양세포주에 대한 이들의 세포독성 효과는 이들을 막대한 상업적 가치를 갖는 잠재적인 치료화합물로 만들었다 (Su 외, 1997; Kowalski외, 1997). 이들은 또한 수용성이 비교적 높기 때문에 임상적 평가를 위해 이들을 조제하는 것도 쉽게 만든다.
[270] 에포틸론 A 및 B는 자연적인 숙주의 주요 발효산물이다 (Gerth외, 1996). 이 폴리케타이드 분자의 마크로사이클 코어는 아세테이트 및 프로피오네이트 유닛의 연속적인 탈카르복실화 축합에 의해 형성된다 (Gerth외, 2000). 에포틸론 A와 B는 이들의 탄소 골격의 C-12위치에서 하나의 메틸기가 서로 다르다. 이 구조적인 차이는 에포틸론 A의 구조에서는 아세테이트가, 에포틸론 B에서는 프로피오네이트가 삽입된데 따른 결과이다. 에포틸론 C와 D는 각각 에포틸론 A 및 B의 생합성 경로중에 얻어지는 중간체들이다 (Tang 외, 2000; Molnar 외, 2000). 이들은 발효과정 중 소량 생성무물로서 분비되며, 그 양은 합쳐서 약 0.4 mg/L정도이다. 이제까지의 생체내 연구에 따르면, 에포틸론 D가 위의 네가지 화합물중 항종양제로서가장 유망한 것으로 밝혀졌기 때문에 (Chou외, 1998), 이 분자를 대규모로 생산하는 것이 커다란 관심사가 되고 있다.
[271] 에포틸론의 생합성에 책임이 있는 유전자 클러스터를 서열화하여 (Tang외, 2000; Molnar 외, 2000),소란지움 셀룰로섬과 매우 밀접히 관련되어 있으면서, 유전자 조작에 더 적당한 미생물 숙주인믹소코커스 잔투스에서 이들 화합물을 생산하는데 이용하였다. 에포틸론 D 생산을 촉진하기 위해, 이 재조합 균주의 결실 돌연변이주 (하기 실시예 4에서 후술함)를 제조하여 에포틸론 C와 D를 에포틸론 A와 B로 각각 변환시키는 것을 촉매하는 P450 에폭시다제를 불화성화시켰다 (Tang 외, 2000). 이 유전적 조작은믹소코커스 잔투스의 유일한 발효산물로서의 에포틸론 C아 D의 분비를 효과적으로 촉진시켰으며, 여기서 에포틸론 D 대 C의 비율은 4:1이었다. 결과적인 변이주는 소망 생성물의 회수율과 정제율 모두에서 천연 숙주보다 훨씬 더 유리하였다. 이 실시예에는,믹소코커스 잔투스에서의 에포틸론 D의 생산성을 140배 증가시키는 배지 조성 및 발효 전략이 설명되어 있다.
[272] 소량 생산되는 생물학적 활성 분자를 연속적으로 포획하기 위해 믹소박테리아 발효에 흡착 수지를 이용하였다 (Reichenbach 및 Hoefle, 1993). 에포틸론 D의 분리를 용이하게 하기 위해, 배양 배지에 소수성 수지인 XAD-16을 첨가하였다. 적절한 용매를 이용할 경우 결합된 생성물이 수지로부터 쉽게 용출되기 때문에, 생성물을 회수하는 것이 크게 간편해졌다. 뿐만 아니라, XAD-16을 사용함으로써 생성물 안정화를 통해 에포틸론 분해가 최소화되었다.
[273]믹소코커스 잔투스는 펩톤 및 카지톤과 같은 카제인의 효소 가수분해물로 주로 구성되고, 유일한 탄소원 및 질소원으로서 아미노산에 의존하는 배지에서 전통적으로 배양되어왔다 (Reichenbach 및 Dworkin, 1991). 그 결과, 아미노산의 분해로 인해, 발효 브로쓰 내에 암모니아가 축적된다. Gerth 등(1986)은믹소코커스 비레센스 (Myxococcus virescens) 배양체 중의 세포외 암모니아 농도 35~42 mM은 놀랍게도 세포내 암모니아 농도 80 ~140 mM에 맞먹는다는 것을 밝혀냈다. 더욱 중요한 것은, 과량의 암모니아를 in situ 막 프로세스를 이용하여 8mM 미만이 되도록 연속적으로 제거할 경우, 세포 질량과 2차 대사산물의 생산량이 극적으로 증가하는 것으로 나타났다 (Hecht 외, 1990). 암모니아의 고농도 생산은 믹소코커스 잔투스의 성장 및 에포틸론 D 생산을 저해시키는 것으로 생각되기 때문에, 아미노산 소비를 감소시키기 위한 대체적인 탄소원이 요망되고 있다.
[274] 비록 적응 과정이 요구되기는 하지만, 여러가지 오일을 집중적으로 스크리닝한 결과, 메틸 올리에이트가믹소코커스 잔투스에 의해 대사될 수 있는 기질이라는 것이 동정되었다. 성장배지에 외부로부터 미량원소 용액을 첨가함으로써 단순한 뱃치 발효에서 에포틸론 D의 생산량이 8배 증가되었고, 그 수율은 3.3mg/L에 달하였다. 이 프로세스를 더욱 최적화시키기 위해, 카지톤 및 메틸올리에이트의 간헐적 또는 연속적 주입을 이용한 페드-뱃치 접근을 채택하여 세포의 생산 페이즈를 연장시켰다. 두가지 서로다른 주입 전략을 이용하여 얻어진 결과들을 이 실시예에서 서로 비교하였다.
재료 및 방법
접종물 제조
[275] 메틸 올리에이트를 함유하지 않는 배양 배지에서 에포틸론 D를 생산하기 위해, 20% (v/v) 글리세롤 중의믹소코커스 잔투스균주 K111-40.1의 동결세포 1 mL를, 50-mL 유리제 배양시험관 중 10g/L 카지톤 (Difco), 5g/L 효모 추출물 (Difco), 1g/L MgSO4·7H2O 및 50mM HEPES로 구성된 pH 7.6의 CYE 배지 3 mL에 접촉하였다. 세포를 30℃에서 175 rpm의 회전 진탕기를 이용하여 3일간 인큐베이션시켰다. 50mL의 CYE를 함유하는 250-mL 어얼렌마이어 플라스크에 이것을 옮긴 다음 동일 조건 하에서 2일간 배양하였다. 얻어진 종배양물 (seed culture)을 이용하여 접종규모 5% (v/v)로 50-mL 생산 플라스크에 접종하였다.
[276] 메틸 올리에이트를 함유하는 배지에서믹소코커스 잔투스를 배양하기 위해, 오일 존재 하에 세포들이 자라도록 적응시켜야만 했다. 3 μL의 메틸 올리에이트 (Emerest 2301) (Cognis Corp.)가 보강된 CYE 배지 3mL에 동결세포 1 씨드 바이알 (seed vial)을 접종하였다. 현미경으로 관찰할 때 배양체가 충분히 조밀해질 때까지, 30℃, 175 rpm에서 2-6일간 세포를 유리제 배양 시험관에서 키웠다. 이어서, 10g/L 카지톤 (Difco), 5g/L 효모 추출물 (Difco), 1g/L MgSO4·7H2O, 2mL/L 메틸 올리에이트, 및 50mM HEPES로 구성된 pH 7.6의 CYE-MOM 배지 50 mL를 함유하는 250mL 들이 어얼렌마이어 플라스크에 이 세포들을 옮겼다. 배양 2일 후, 20% (v/v) 글리세롤 중 1 mL 분주액으로서 세포를 -80℃에서 동결보관하였다.
[277] 메틸 올리에이트를 함유하는 배지에서 에포틸론 D를 생산하기 위해, 동결된 오일-적용된 세포 1 mL를 유리제 배양 시험관 중 CYE-MOM 배지 3 mL에 접종하였다. 세포를 30℃, 175 rpm에서 2일간 인큐베이션시키고 50 mL의 CYE-MOM 배지를 함유하는 250mL 어얼렌마이어 플라스크로 옮겼다. 얻어진 종배양뮬을 동일 조건하에서 2일간 더 배양시키고 접종규모 5% (v/v)로 50mL 생산 플라스크에 접종하였다.
[278] 5L-발효물을 위한 접종을 준비하기 위해, 오일-적응된 종배양물 25 mL를 CYE-MOM 매지 475mL를 함유하는 2.8L 페른바흐 (Fernbach) 플라스크에 옮겼다. 세포를 30℃, 175 rpm에서 2일간 배양시켰다. 이어서, 이 2차 종배양물 250mL를 4.75L의 생산 배지를 함유하는 5-L 들이 발효조에 접종하여 최종 접종 농도 5% (v/v)를 얻었다.
진탕 플라스크 생산
[279] 메틸 올리에이트 부재시 믹소코커스 잔투스 K111-40-1의 뱃치 배양체를 다음과 같이 준비하였다. 5mL 탈이온수가 들어있는 250mL 어얼렌마이어 플라스크에서 XAD-16 수지 1 그램 (Rohn and Haas)을 121℃에서 30분간 오토클라브처리하였다. 과량의 물을 플라스크로부터 제거하고, 5g/L 카지톤, 2g/L MgSO4·7H2O 및 50mM HEPES로 구성된 pH 7.6의 CTS 배지 50mL를 첨가하였다. 생산 배지 존재하에서 흡착 수지를 오토클라브 처리하면 세포가 요구하는 필수영양분이 결합하기 때문에, 수지와 배지성분을 별도로 멸균하였다. 생산 플라스크에 2.5mL의 종배양물을 접종하고 30℃, 175 rpm에서 6일간 인큐베이션하였다.
[280] 메틸 올리에이트 존재하에 뱃치 배양물을 상술한 바와 같이 제조하였다. 또한, 이 생산 배지에 10mL/L 진한 H2SO4, 14.6g/L FeCl3·6H2O, 2.0g/L ZnCl3, 1.0g/L MnCl2·4H2O, 0.43g/L CuCl2·2H2O, 0.31g/L H3BO3, 0.24g/L CaCl2·6H2O, 및 0.24g/L Na2MO4·2H2O로 이루어진 필터-멸균된 미량원소 용액 4mL/L와 7 ml/L의 메틸올리에이트를 보강하였다. 생산 플라스크에 오일-적응된 종배양물 2.5mL를 접종하고 30℃, 175 rpm에서 5일간 배양하였다.
[281] 카지톤과 메틸 올리에이트를 간헐적으로 공급한 페드-뱃치 배양체를 다음과 같이 제조하였다. 5mL 탈이온수를 넣은 250mL 들이 어얼렌마이어 플라스크에서 XAD-16 수지 1 그램을 121℃에서 30분간 오토클라브 처리하였다. 멸균처리 후, 과량의 물을 플라스크로부터 제거하고, 2mL/L 메틸 올리에이트, 4mL/L 미량원소 용액, 및 50mM HEPES가 보강된 pH 7.6의 CTS 배지 50 mL를 첨가하였다. 생산 플라스크에 오일-적응된 종배양물 2.5mL를 접종하고 30℃, 175 rpm에서 인큐베이션시켰다. 접종 2일 후, 배양배지에 24시간 간격으로 2g/L 카지톤과 3mL/L 메틸 올리에이트를 첨가하였다. 카지톤 공급물은 농축시킨 100g/L 용액으로서 준비하였다. 배양체를 10-12일간 실질적인 세포 용해가 관찰될 때까지 배양시켰다.
[282] 모든 생산 배양체는 동일 배양조건 하, 2.8-L Fernbach 플라스크 중 500mL 규모로 키울 수 있다.
발효조 생산
[283] 간헐적 또는 연속적인 카지톤과 메틸 올리에이트의 공급이 수반되는 5-L 규모의 페드-뱃치 발효물을 다음과 같이 제조하였다. 20g/L XAD-15 및 2g/LMgSo4·7H2O를, 4.75L의 탈이온수가 들어있는 5-L 발효조 (B.Braun)에서 121℃에서 30분간 오토클라브 처리하였다. 멸균 후, 농축 카지톤 용액 (150g/L), 메틸 올리에이트 및 미량원소를 바이오리액터에 무균적으로 첨가하여 카지톤, 메틸 올리에이트 및 미량원소의 최종농도가 각각 5g/L, 2mL/L 및 4mL/L가 되도록 하였다. 이어서 배지에 250mL의 오일-적응된 종배양물을 접종하였다. 환기율 0.4-0.5v/v/m 및 초기 교반속도 400 rpm으로 30℃에서 발효를 수행하였다. 캐스캐이드를 400-700 rpm으로 교반함으로써 용존 산소를 50% 포화도로 조절하였다. 2.5N KOH와 2.5M H2SO4를 자동화첨가시킴으로써 배양 pH를 7.4로 유지하였다. 접종 24시간 후, 카지톤 (150g/L)과 메틸 올리에이트를 주입속도 2g/L/1일 카지톤 및 3mL/L/1일 메틸 올리에이트의 속도로 생산배지에 첨가하였다. 연동 펌프를 이용하여 매 24시간마다 또는 연속적으로 주입물을 단일 볼루스로서 전달하였다 (W. Marlow). 세포 용해가 상당한 수준으로 인지될 때까지 10-12일간 세포를 배양시켰다.
에포틸론 정량
[284] 발효시 XAD-16 수지를 사용하기에 앞서, 배양 브로쓰 1mL를 생산 플라스크 또는 바이오리액터로부터 채취하여 13,000g에서 10분간 원심분리시켰다. 250nm에서의 UV 검출에 의해 Hewlett Packard 1090 HPLC를 이용하여 상등액 중의 에포틸론 생성물의 정량을 수행하였다. 4.6 x 10 mm 가드 컬럼 (Inertsil, ODS-3,5 μm)을 통해 500 마이크로리터의 상등액을 주입하였다. 100% 물로 0.5분간 1 mL/1분의 유속으로 온라인 추출을 수행한 다음, 50% 아세토니트릴 구배를 이용하여1.5분간 추출하였다. 최초 2분은 그대로 보내기 위해 용출액을 우회시키고난 후, 보다 긴 분리 컬럼 (4.6x150mm, Inertsil, ODS-3,5μm)을 통해 통과시켰다. 50% 내지 100% 아세토니트릴로부터의 구배를 이용하여 에포틸론 C와 D의 분리를 8분간 수행한 후, 이어허 100% 아세토니트릴로 3분간 세척하였다. 이러한 조건 하에서, 에포틸론 C는 9.4분에, 에포틸론 D는 9.8분에 용출되었다.
[285] XAD-16 수지를 이용하여, 5-50mL의 잘 혼합된 배양 브로쓰와 수지를 생산 플라스크 또는 바이오리액터로부터 채취하였다. 수지를 중력에 의해 고정시킨 후, 배양 브로쓰를 따라내었다. 수지를 5-50mL의 물로 세정하고 다시 중력에 의해 고정시켰다. 수성 혼합물을 완전히 제거하고, 에포틸론 생성물을 100% 메탄올을 이용하여 수지로부터 추출하였다. 용매의 사용량은 샘플 부피의 50%였다. 250nm에서의 UV 검출과 함꼐 HPLC 분석에 의해 에포틸론 C 및 D를 정량하였다. 2개의 4.6 x 10 mm 가드 컬럼 (Inertsil, ODS-3,5 μm) 및 이보다 긴 4.6 x 150 mm 가드 컬럼 (Inertsil, ODS-3,5 μm)을 통해 메탄올 추출물 50 마이크로리터를 주입하였다. 분석방법은 아이소크래틱 (isocratic)하였고, 1mL/1분의 유속으로 60% 아세토니트릴과 40% 물을 이용하여 18분간 용출시켰다. 이러한 조건 하에서, 에포틸론 C는 10.3분에, 에포틸론 D는 13.0분에 검출되었다. 정제된 에포틸론 D를 이용해서 스탠다드를 제조하였다.
세포 성장 측정
[286] 메틸 올리에이트 부재시의 세포 성장을 600nm에서 광학밀도 (OD)를 측정함으로써 모니터링하였다. 최종 OD값이 0.4 미만이 될 때까지 샘플을 물로 희석하였다. 배지에 메틸 올리에이트를 첨가하면 600nm에서 강한 흡수를 나타내는 유제가 형성되기 때문에, 메틸 올리에이트 존재하에서의 세포 성장은 건조세포중량 (DCW)에 의해 측정하였다. 배양 브로쓰 40 밀리미터를 미리 무게를 단 시험관 중에서 4200g에서 20분간 원심분리시켰다. 이어서 펠릿을 40mL의 물로 세정하고 칭량하기에 앞서 80℃에서 2일간 건조시켰다.
암모니아 측정
[287]13,000g에서 5분간 원심분리시킴으로써 발효 브로쓰 1 밀리리터를 청정화시켰다. 이 상등액을 암모니아 분석 키트 (Sigma)를 이용한 암모니아 분석에 이용하였다. 최종 농도가 880μM 미만이 될 때까지 샘플을 20-100배의 물로 희석하였다.
메틸 올리에이트 측정
[288] 1-mL 발효 브로쓰 중 나머지 메틸 올리에이트를 5mL의 아세토니트릴로 추출하였다. 혼합물을 보텍스로 교반하고 4200g에서 20분간 원심분리시켜 청정화하였다. 메틸 올리에이트의 정량은 210 nm에서 UV 검출과 함께 HPLC 분석에 의해 수행하였다. 상등액 50 마이크로리터를 2개의 4.6 x 10 mm 가드 컬럼 (Inertsil, ODS-3,5 μm) 및 이보다 긴 4.6 x 150 mm 가드 컬럼 (Inertsil, ODS-3,5 μm)을 통해 주입하였다. 컬럼을 아세토니트릴-물 (1:1)로 2분간 1mL/1분의 유속으로 세정하였다. 이어서 50% 내지 100% 아세토니트릴 구배로 24분간 용출시킨 다음, 이어서 100% 아세토니트릴로 5분간 세정하였다. 시판되는 메틸 올리에이트의 탄소사슬 길이의 상이함 때문에, 이 화합물은 25.3분 및 27.1분에서 검출된 2개의 주요 피크로서 용출되었다. XAD-16 수지에 결합된 메틸 올리에이트를 동일한 HPLC법을 이용하여 메탄올 추출물로부터 정량하였다. 메틸 올리에이트의 스탠다드를 83.3% 아세토니트릴 중에서 제조하였다. 세포에 의한 메틸 올리에이트의 소비량은 다음과 같이 계산하였다: (첨가된 총 메틸 올리에이트) - (배지 중의 잔류 메틸 올리에이트) - (수지에 결합된 메틸 올리에이트).
결과
[289] 5g/L 카지톤 (췌장의 카제인 소화물)과 2g/L의 마그네슘 설페이트만으로 구성된 단순한 생산 배지를 이용하여믹소코커스 잔투스균주 K111-40-1을 처음으로 뱃치발효에 의해 배양하였다. 이 세포의 기초적인 성능을 도 6에 나타내었다.
[290] 최대 세포 밀도 및 에포틸론 D 생산은 3일간 접종 후 OD6001.6 및 대응 타이터 0.16mg/L로 얻어졌다. 그 후로는 세포 밀도와 생산 수율 모두가 실제로 감소하였다. 세포가 카지톤을 소비함에 따라, 생산 배지 중에 암모니아의 점진적인 축적도 검색되었다. 5일간의 발효 말기에 암모니아의 최종 농도는 20 mM에 달하였다.
XAD-16이 생산 안정성에 미치는 효과
[291] 에포틸론 D의 급속한 분해를 방지하기 위해, 소수성 흡착 수지인 XAD-16을 생산 배지에 첨가하여 배출된 생성물을 결합 및 안정화시켰다. XAD-16은 미생물 생산자인,소란지움 셀룰로섬So ce90의 발효물로부터 에포틸론 A와 B를 분리하기 위해 Gerth 등 (1996)이 이미 사용한 바 있는 폴리아로마틱 수지이다. 도 7에도시된 바와 같이, 흡착 수지의 존재는 세포 성장에 아무런 영향을 미치지 않았다. 그러나, 이것은 발효 브로쓰 중 에포틸론 D의 손실을 효과적으로 감소시켜, 이 생성물의 회수율을 3배나 증진시켰다.
배지 개발
[292] 보다 높은 세포 밀도와 에포틸론 생산성을 뒷받침해줄 수 있는 배지를 개발하기 위한 노력의 일환으로, 성장 및 생산 수율에 미치는 카지톤의 영향을 생산 배지 중 1g/L 내지 40g/L로 그 농도를 변화시켜가면서 평가하였다. 비록 카지톤 농도를 증가시킴에 따라 세포 성장도 촉진되었지만, 세포의 특이적 생산성은 도 8에 나타난 바와 같이 유의적으로 감소하였다. 에포틸론 D 생산에 있어 최적 카지톤 농도는 5g/L이었으며, 그보다 농도가 높아지면 타이터가 감소되었다.
[293] 카지톤의 사용에 따라 배지 향상이 제한되었기 때문에, 기초 생산 배징 대한 보강물로서 또 다른 기질을 평가하였다. 여러가지 오일을 상세히 스크리닝한 결과, 메틸 올리에이트가 에포틸론 D생산 증가를 최대로 촉진시킨 탄소원인 것으로 동정되었으며, 이를 표 3에 요약하였다.
오일 (7mL/L) 오일이 보강되지 않은 대조구에 대한 에포틸론의상대적인 생산성 (%)
메틸 올리에이트 780
에틸 올리에이트 740
코코넛 오일 610
라아드 470
프로필 올리에이트 420
세서미 오일 380
글리세롤 트리-올리에이트 370
샐러드 오일 360
해바라기 오일 330
대두 오일 290
메틸 헵타데카노에이트 190
오일 없음 (대조구) 100
메틸 노나데카노에이트 96
메틸 펠라고네이트 40
평지씨 오일 40
[294] 그러나, 생산 배지에 메틸 올리에이트를 직접 첨가하면 세포 용해가 조기에 일어난다. 따라서, 종배양물을 생산 발효에 앞서 메틸 올리에이트 존재 하에 배양하였다. 흥미롭게도, 이러한 적응 프로세스는 세포를 용해에 덜 민감하게 만들었다. 표 4 (뱃치 발효에 있어서 CTS 배지 중 베이스라인 성능에 비교한 성장 및 생산성 향상)에 나타낸 바와 같이, 메틸 올리에이트 농도 7 mL/L와 미량원소 농도 4mL/L에 의해 에포틸론 D 타이터 3.3mg/L 및 피크 바이오매스 농도 2.1g/L가 얻어졌다.
발효 조건 최대 세포 밀도(g DCW/L) 최대 에포틸론 D 생산량(mg/L)
XAD-16 무첨가 CTS 배지, 뱃치 프로세스 0.44 ±0.04 0.16 ±0.03
XAD-16 첨가된 CTS 배지, 뱃치 프로세스 0.44 ±0.04 0.45 ±0.09
7mL/L 메틸 올리에이트가 첨가된 CTS배지, 뱃치 프로세스 1.2 ±0.1 0.12 ±0.02
7mL/L 메틸 올리에이트와 4mL/L 미량 원소가 첨가된 CTS 배지, 뱃치 프로세스 2.1 ±0.2 3.3 ±0.7
간헐적인 페드-뱃치 프로세스 0.6 ±0.6 9.8 ±2.0
연속식 페드-뱃치 프로세스 7.3 ±0.7 23 ±4.6
[295] 도 9에 도시된 바와 같이, 더 높은 메틸 올리에이트 농도에서는 추가의 타이터 향상이 관찰되지 않았다.
[296] 세포 성장 및 생산에 미치는 메틸 올리에이트의 유의성을 입증하는데 더해, 상기한 그래프는 생산 배지 중 미량 원소의 중요성도 강조하고 있다. 카지톤에 의해 공급되는 영양분이 왕성한 세포 성장에 충분치 못할 것이라고 예상되어, 메틸 올리에이트와 함께 미량의 금속을 외부로부터 추가하였다. 놀랍게도, 이러한 공급은 성장 및 생산 증대 두가지 모두에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 즉, 부재할 경우, 최대 바이오매스 농도와 에포틸론 D 타이터는 단지 각각 1.2g/L 및 0.12mg/L에 불과하였다. 이러한 낮은 타이터는 기초 배지에서 얻어진 것에 필적할만한 것이었다.
페드-뱃치 개발
[297] 뱃치 발효 프로세스에서 메틸 올리에이트 및 미량 원소의 최적 농도 존재 하에서, 접종한지 처음 2일간,믹소코커스 잔투스균주의 대수기 성장이 일어났다. 에포틸론 D의 생산은 도 10A 및 도 10B에 도시된 바와 같이 정상기 개시와 함께 시작되어 제 5일에 메틸 올리에이트의 고갈과 함께 세포 용해가 일어났다. 메틸 올리에이트 소비 및 암모니아 발생의 시간 경과 역시 도시하였다. 생산 배지에서의 암모니아의 농도는 발효 과정을 통해 < 4 mM 였다.
[298] 플라스크 배지 중 세포의 생산 기간을 연장시키기 위해서, 카지톤과 메틸 올리에이트를 하루 한번 배지에 각각 2g/L 1일 및 3mL/L/1일의 비율로 주입하였다. 기질 주입은 접종 48시간 후에 개시하였고, 세포들은 그 후 3일 동안 대수적으로 자랐다. 도 11A에 도시된 바와 같이, 바이오매스 농도는 제 5일에 일정하게 유지되었고 제 10일에 최대 6.3g/L로 되었다. 다시, 에포틸론 D의 생산은 정상기와 일치하였으며, 제 12일 말에 최종 수율 9.8mg/L에 달하였다. 도 11B에 도시된 바와 같이, 메틸 올리에이트의 소비와 암모니아의 발생 두가지는 모두 발효과정을 통털어 일정 속도로 증가하였다.
[299] 메틸 올리에이트는 바이오리액터에 주입되는 것과 같은 속도로 고갈되었으며, 암모니아는 3.2 mM/1일의 속도로 축적되었다. 카지톤 또는 메틸 올리에이트의 주입 속도가 낮을수록 에포틸론 D의 타이터가 감소된 반면, 주입 속도가 높을수록 유의적인 생산이 달성되기 전에 세포의 조기 용해가 일어났다.
[300] 보다 큰 규모에서의 페드-뱃치 공정의 효율성을 테스트하기 위해, 카지톤과 메틸 올리에이트를 바이오리액터 중 5L-발효 규모로 간헐적으로 24시간 간격으로 첨가하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 얻어진 생산 곡선은 플라스크 배양의 경우와 매우 유사하였다. 기질 주입은 접종 24시간 후에 개시하였으며, 에포틸론의 생산은 제 4일에 개시되었다. 접종 10일 후에 피크 에포틸론 D 타이터 9.2mg/L가 얻어졌다.
[301] 성장 및 생산성에 보다 정교한 주입 기술이 미치는 효과를 평가하기 위해, 바이오리액터에 이중 주입 (dual feeds)를 연속적으로 전달하였다. 도 13A에 도시된 바와 같이, 연속식 주입의 수행은 세포 성장에 아무런 영향을 미치지 않았으나, 그의 생산성을 거의 3배 가까이 증가시켰다. 최종적인 에포틸론 D 타이터 27mg/L는 접종 10일 후에 얻어졌다. 도 13B에 도시된 바와 같이, 메틸 올리에이트는 생산 배지에 첨가되는 것과 같은 속도로 소비되었고, 암모니아는 발효 기간에 걸쳐 6.4mM/1일 의 일정한 속도로 방출되었다.
토의
[302] 에포틸론 D가 최근 화학적으로 합성되었지만 (Harris외, 1999; Meng외, 1998; Sinha 외, 1998), 그 복잡한 20단계의 공정은 이 화합물의 대규모 생산에 경제적으로 적합한 방법이라고 할 수는 없다.믹소코커스 잔투스균주에서의 에포틸론 D의 초기 생산 수율이 0.16mg/L였던 반면, 본 발명의 개선된 발효 공정은 실질적으로 생산 수준을 23mg/L까지 증가시켰다.
[303] 보다 높은 에포틸론 D 타이터를 얻는데 있어서의 중요한 장애물 가운데 하나는 발효 브로쓰에서 생성물이 너무 빨리 분해된다는 것이었다. 이 문제는 배양 배지에 흡착 수지를 인코포레이션시킴으로써 완화되었다. XAD-16을 첨가하여도 세포의 성장에는 아무런 영향이 없었고 오히려 분비된 생성물의 손실이 최소화되고 그의 회수율은 3배까지 증가되었다.
[304] 생산 수율을 증대시키는데 있어서의 또 다른 장애물은 주요 탄소원 및 질소원으로서 카지톤을 사용할 경우 타이터 향상이 제한적이라는 것이다. 비록믹소코커스 잔투스균주의 성장이 카지톤 농도를 증가시킴에 따라 촉진되기는 하지만, 농도가 5g/L를 초과하면 오히려 타이터가 극적으로 감소한다. 고농도 펩톤 또는 카지톤의 이러한 2차 대사산물 생산성의 저해 효과는 이미 여러가지 다른 믹소박테리아 발효에서 입증된 바 있었는데, 이는 배양 배지 중 암모니아의 축적에 기인하는 것으로 여겨진다.
[305]믹소코커스 잔투스균주는 다당류와 당을 대사시키지 못하므로 (Reichenbach 및 Dworkin, 1991), 오일을 탄소원으로 사용하는 그의 능력이 시험되었다. 지방산의 산화는 세포에 있어 에너지원 역할을 할 뿐만 아니라, 분해산물로서의 아세틸-CoA의 형성은 에포틸론 생합성의 전구체도 제공해주기 때문에, 오일은 매력적인 탄소원이 된다.사카로폴리스포라 에리쓰라에아 (Saccharopolyspora erythraea), 스트렙토마이세스 프라디아에 (Streptomyces fradiae) 및스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus)의 발효시 오일을 첨가하자 각각 에리쓰로마이신, 타일로신 및 면역조절제인 L-683590과 같은 폴리케타이드 분자의 생산이 증진된 것으로 나타났다 (Mirjalili외, 1999; Choi 외, 1998; Junker 외, 1998).
[306] 여러가지 오일을 스크리닝한 결과, 메틸 올리에이트가 세포 성장 및 에포틸론 D의 생산성을 촉진시키는데 있어 선도적인 후보인 것으로 동정되었다. 이러한 개선사항은 그러나, 생산 배지에 미량의 금속을 동시 첨가할 때만 관찰되었다. 메틸 올리에이트만을 단독으로 7mL/L의 양으로 첨가한 경우 최대 세포 밀도는 0.4 g DCW/L에서 1.2g DCW/L로 증가한 반면, 생산량은 베이스라인 수준에 머물렀다. 미량 원소를 4mL/L의 양으로 외부로부터 공급하자, 피크 바이오매스 농도는 2.1g DCW/L로 증가하였고, 에포틸론 D 타이터도 0.45mg/L에서 3.3mg/L로 크게 뛰었다. 이러한 발견은 카지톤에 부족한 영양성분이믹소코커스 잔투스균주의 성장 및 에포틸론 형성에 중요한 것일 수 있음을 가리키는 것이다.
[307] 뱃치 프로세스에서 메틸 올리에이트 및 미량 원소의 최적 농도를 정립하기 위해, 왕성한 세포 성장을 유지하면서 생산 기간을 연장시키기 위한 주입 작전을 개발하기 위한 노력을 하였다. 카지톤과 메틸 올리에이트를 일정 속도로 간헐적 및 연속적으로 주입한 결과를 평가하자, 두 방법 모두 성장 프로파일을 유사하게 개선시킨 것으로 나타났다. 두가지 기질의 최적 주입에서, 약 6.8 g DCW/L의 최대 세포 밀도가 얻어졌다. 두가지 경우 모두, 메틸 올리에이트는 발효 배지에 첨가되는 만큼 고갈되었다.
[308] 세포 성장 및 메틸 올리에이트의 소비와 대조적으로, 에포틸론 성장과 암모니아 발생은 주입 전략의 선택방식에 크게 영향을 받았다. 연속식 페드-뱃치 배양에서, 피크 에포틸론 D 타이터는 23mg/L이었다. 이것은 간헐적인 페드-뱃치 배양의 경우 얻어진 타이터의 거의 2.5배에 달하는 값이다. 연속식 주입을 이용할 경우, 암모니아가 세포에 의해 방출되는 속도 역시 2배로 높았는데, 이는 카지톤 소비가 그만큼 빨랐음을 가리키는 것이다. 이와 함께. 이러한 결과는 간헐적인 페드-뱃치 프로세스에서 타이터가 낮게 얻어진 것이 분해대사물 억제 (catabolite repression)에 기인한 것인지 암모니아 누적에 의한 것이 아닐 수 있음을 가리키는 것이다. 뿐만 아니라, 이러한 결과는믹소코커스 잔투스균주의 생산성이 배양 배지 중에 존재하는 기질의 양에 민감하게 반응하며 기질-제한 조건에서 최대가 될 수 있음을 시사하는 것이다. 이것은 또한 생산 배지 중의 카지톤 농도를 증가시키면 세포 밀도는 높아지나 타이터는 낮아진다는 관찰과도 일치하는 것이다.
[309] 기초 배지를 이용한 뱃치 배양과 비교해서, 연속식 페드-뱃치 배양시, 세포 밀도가 17배나 증가하였고, 타이터는 140배나 증가하였다. 이 프로세스는 5-L규모에서 1000-L 규모로 수행되었으며 동일한 방식으로 수행되었다. 생산 규모에 따른 에포틸론 D의 생산성과 관련하여 나타난 결과는믹소코커스 잔투스균주가 믹소박테리아의 다른 생물학적 활성 분자의 생산에도 숙주로서 이용가능함을 입즈애준다.
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B. 에포틸론 B의 생산
플라스크
[328] K111-32-25 균주 1mL 바이알을 해동하여 내용물을 유리 시험관 중 CYE 종배지 (seed media) 3mL에 옮겼다. 이 배양체를 72 ±12 시간동안, 30℃에서 인큐베이션시킨 다음, 이 시험관 배양체 3mL를 배플이 구비된 250mL의 어얼렌마이어 플라스크 중 50mL의 CYE 배지에서 서브컬춰시켰다. 이 CYE 플라스크를 24 ±8 시간동안, 30℃에서 인큐베이션시키고, 이 씨드 (5% v/v) 2.5mL를 사용하여 에포틸론 생산 플라스크 (배플이 달린 250mL들이 어얼렌마이어 플라스크 중 CTS-TA 배지 50mL)에 접종하였다. 이 플라스크들을 30℃에서 48 ±12 시간동안, pH 7.4로부터 시작하는 배지와 함께 인큐베이션시켰다.
발효조
[329] 상기한 바와 같은 K111-32-25의 유사한 접종 확장을 이용하였으며, 단, 50mL CYE 씨드 25mL를 500mL의 CYE에 서브컬춰하는 단계를 추가하였다. 이 2차 씨드를 CTS-TA 9.5L, 및 소듐 피루베이트 1g/L를 함유하는 10L 발효조에 접종하였다. 이 발효에 있어서 공정 변수 스텝포인트는: pH - 7.4; 교반속도 - 400 rpm; 스파지 (sparge) 속도 - 0.15 vvm 이었다. 이 변수들은 DO를 80%의 포화도 이상으로 유지시키는데 충분하였다. pH 조절은 2.5N 황산 및 소듐 하이드록사이드를 배양물에 첨가함으로써 수행하였다. 피크 에포틸론 타이터는 48 ±8 시간에 얻어졌다.
C. 에포틸론 D의 생산
플라스크
[330] K111-32-25 균주 (실시예 4에서 설명됨) 1mL 바이알을 해동하여 내용물을 유리 시험관 중 CYE 종배지 (seed media) 3mL에 옮겼다. 이 배양체를 72 ±12 시간동안, 30℃에서 인큐베이션시킨 다음, 이 시험관 배양체 3mL를 배플이 구비된 250mL의 어얼렌마이어 플라스크 중 50mL의 CYE 배지에서 서브컬춰시켰다. 이 CYE 플라스크를 24 ±8 시간동안, 30℃에서 인큐베이션시키고, 이 씨드 (5% v/v) 2.5mL를 사용하여 에포틸론 생산 플라스크 (배플이 달린 250mL들이 어얼렌마이어 플라스크 중 1x 밀가루 글루텐 배지 50mL)에 접종하였다. 이 플라스크들을 30℃에서 48 ±12 시간동안, pH 7.4로부터 시작하는 배지와 함께 인큐베이션시켰다.
발효조
[331] 상기한 바와 같은 K111-40-1의 유사한 접종 확장을 이용하였으며, 단, 50mL CYE 씨드 25mL를 500mL의 CYE에 서브컬춰하는 단계를 추가하였다. 이 2차 씨드 250mL를 CTS-TA 4.5L, 및 소듐 피루베이트 1g/L를 함유하는 5L 발효조에 접종하는데 이용하였다. 이 발효에 있어서 공정 변수 스텝포인트는: pH - 7.4; 교반속도 - 400 rpm; 스파지 (sparge) 속도 - 0.15 vvm 이었다. 이 변수들은 DO를 80%의 포화도 이상으로 유지시키는데 충분하였다. pH 조절은 2.5N 황산 및 소듐 하이드록사이드를 배양물에 첨가함으로써 수행하였다. 피크 에포틸론 타이터는 36 ±8 시간에 얻어졌다. 피크 에포틸론 C 타이터는 0.5mg/L였으며, 피크 에포틸론 D 타이터는 1.6mg/L였다.
[332] 다음 표 5에 사용된 배지 및 그의 구성성분을 요약하였다.
CYE 종배지 성분 농도
카지톤 10 g/L
효모 추출물 (Difco) 5 g/L
MgSO4·7H2O (EM Science) 1 g/L
HEPES 완충액 50 mM
CTS-TA 생산 배지 성분 농도
카지톤 (Difco) 5g/L
MgSO4·7H2O (EM Science) 2 g/L
L-알라닌, L-세린, 글리신 1 mg/L
HEPES 완충액 50 mM
1x 밀가루 글루텐 생산배지 성분 농도
밀가루 글루텐 (Sigma) 5g/L
MgSO4·7H2O (EM Science) 2 g/L
HEPES 완충액 50 mM
CYE 종배지와 CTS0TA 생산배지를 121℃에서 30분간 오토클라브로 멸균처리하였다. 밀가루 글루텐 생산 배지는 121℃에서 45분간 오토클라브로 멸균처리한다.
D. 믹소코커스 잔투스 로부터의 에포틸론 C 및 D 생산
[333] 한가지 측면에서, 본 발명은믹소코커스 잔투스K111-40-1 (그러나 이에 한정되지 않음)을 비롯한믹소코커스균주에서의 개선된 발효법을 제공하는데, 이 방법에서 발효배지는 암모니아를 발생시키는 일 없이 이용될 수 있는 탄소원을 제공한다. 한가지 바람직한 구체예에서, 탄소원은 메틸 올리에이트 또는 이와 유사한 오일과 같은 오일이다. 주입 비율을 달리한 진탕 플라스크 테스트에서, 이 방법은 에포틸론 C 및 D를 생산시켰으며, 주로 에포틸론을 후술하는 바와 같으 15 내지 25mg/L의 농도로 생산하였다.
종배양
[334] 2mL/L 메틸 올리에이트가 보강된 CYE 배지 50mL에서 키운믹소코커스 잔투스K111-40-1 세포 1 mL 냉동 바이알을 멸균 유리 시험관에 든 1mL/L 메틸 올리에이트가 보강된 3mL의 신선한 CYE 배지에 접종하였다. 이 시험관을 30℃, 250 RPM의 진탕기에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 유리 시험관 중의 접종물을, 2mL/L 메틸 올리에이트가 보강된 신선한 CYE 배지 50 mL를 함유하는 배플없는 250mL 들이 플라스크로 옮겼다. 이 플라스크를 30℃, 250 RPM의 진탕기에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다.
생산 플라스크
[335] Amberlite XAD-16 1g을 250mL-배플없는 플라스크 중에서 121℃에서 30분간 오토클라브처리함으로써 멸균시켰다. 이 플라스크에 5% (v/v) 종배양체를 접종하고 250 RPM, 30℃에서 작동하는 인큐베이터 진탕기에 넣었다. 멸균된 메틸 올리에이트 3 mL/L/1일 주입을 접종 2일 후부터 개시하고, 카지톤 2g/L/1일 주입은 접종 1일 후부터 개시하였다.
생성물 추출
[336] 14일 후, 생산 플라스크 중의 XAD 수지를 5mL 원심분리 시험관에 옮겼다. 시험관 중 과량의 배지를 따라내고 이 때 수지는 제거되지 않도록 주의하였다. 이어서 XAD 수지를 물 25mL에 넣고 고정시켰다. 시험관 중의 물을 수지를 제거하지 않도록 주의하면서 따라내고 메탄올 20mL를 시험관에 첨가하였다. 원심분리 시험관을 175 RPM의 진탕기에 20-30분간 넣어 수지로부터의 에포틸론 생성물을 추출하였다. 메탄올 추출물을 저장을 위해 새로운 원심분리 시험관에 옮겨 LC/MS 분석을 행하였다.
[337] 다음 표 6에 사용된 배지 및 그의 성분을 요약하였다.
CYE 종배지 성분 농도
카지톤 10 g/L
효모 추출물 (Difco) 5 g/L
MgSO4·7H2O (EM Science) 1 g/L
생산 배지 성분 농도
카지톤 (Difco) 5g/L
MgSO4·7H2O (EM Science) 2 g/L
오토클라브 후 생산배지에 첨가됨
1000x 미량원소 용액 4 mL/L
메틸 올리에이트 2 g/L
CYE 배지와 생산 배지를 121℃에서 30분간 오토클라브 처리하여 멸균시켰다. 미량원소 용액을 필터-여과하고 메틸 올리에이트를 별도로 오토클라브 처리하였다.
[338] 다음 표 7의 성분 모두룰, 10mL/L 진한 황산 용액에 첨가하여 최종 부피 1L가 되도록 결합시킴으로써 미량 원소 용액을 만들었다.
1000x 미량원소 용액 성분 농도
FeCl3 8.6 g/L
ZnCl2 2.0 g/L
MnCl2·4H2O 1.0 g/L
CuCl2·2H2O 0.43 g/L
H3BO3 0.31 g/L
CaCl2·6H2O 0.24 g/L
Na2MoO4·2H2O 0.24 g/L
얻어진 용액을 필터 여과시켰다.
E. 믹소코커스 잔투스 로부터의 에포틸론의 발효, 생산 및 정제
믹소코커스 잔투스 균주 설명
[339] 균주 K111-25-1은 에포틸론 B 생산 균주로서, 에포틸론 A도 생산한다. 균주 K111-40-1은 에포틸론 D 생산 균주로서 에포틸론 C도 생산한다.
플레이트 상에서 믹소코커스 잔투스 의 유지
[340]믹소코커스 잔투스균주를 CYE 한천 플레이트 (플레이트 조성은 표 8 참조) 상에 유지시켰다. 플레이트상에 스트리킹항지 약 3일 후 콜로니들이 나타났다. 플레이트를 32℃에서 원하는 성장 수준에 달할때까지 인큐베이션시킨 다음 실온에서 3주일까지 보관하였다 (플레이트상에서 4℃에서 보관할 경우 세포가 죽을 수 있다).
CYE 한천 플레이트* 성분 농도
가수분해된 카제인 (췌장 소화물) 10 g/L
효모 추출물 5 g/L
한천 15 g/L
MgSO4 1 g/L
1M MOPS 완충 용액 (pH 7.6) 10 mL/L
* 1L 한천 배지 뱃치를 45분간 오토클라브시킨 다음, 페트리 디쉬에 부었다.
세포 은행용 믹소코커스 잔투스의 오일 적응
[341] 3mL의 CYE 종 배지와 100μL 피펫으로부터의 메틸 올리에이트 1방울을 함유하는 50mL 유리제 배양 시험관에 냉동 세포 바이알 또는 CYE 플레이트로부터의 비-오일 적응 콜로니를 옮겼다. 세포를 배양체가 현미경하에서 조밀한 것으로 관찰될 때까지 2-6일간 (30℃, 175 rpm) 배양시켰다. 이 세포들이 오일에 항상 잘 적응하는 것은 아니기 때문에 몇개 (5-7개)의 시험관을 가지고 시작하였다.
세포 은행 제조방법 (마스터 세포 은행)
[342] 상술한 바와 같이 오일-적응된 시험관 배양을 개시하였다.시험관 배양체가 충분히 조밀해지면 (OD = 5 +/-1), CYE-MOM 종배지 (배지 조성에 관해서는 하기의 표 참조) 50mL를 함유하는 멸균된 250mL 진탕 플라스크에 시험관 내용물 전체를 옮겼다. 진탕 인큐베이터 (30℃, 175 rpm)에서 48 ±12시간 동안 배양시킨 후, 이 종 배양체 5mL를 500 mL 진탕 플라스크 중의 CYE-MOM 100mL에 옮겼다. 이 배양을 진탕 인큐베이터 (30℃, 175 rpm)에서 1일간 계속시켰다. 배양체가 적절히 배양되고 있는지, 오염되지는 않았는지를 현미경으로 관찰하였다.
[343] 이 종배양체 80mL와 멸균 250mL의 진탕 플라스크 중 멸균된 90% 글리세롤 24mL를 혼합하였다. 완전히 혼합하여 잘 섞고 이 혼합물 1mL씩의 분주액을 100개의 멸균되어, 미리 표지시킨 냉동 바이알에 담았다. 바이알들을 -80℃ 냉동기에서 서서히 동결시켰다.
세포 은행 반드는 방법 (작업 세포 은행)
[344] 상기 제조된 마스터 세포 은행 바이알 중 하나를 실온으로 해동시킴으로써 시험관 배양을 개시한 다음, 그 내용물 전체를 3mL의 CYE-MOM 종 배지를 함유하는 유리제 시험관으로 옮겼다. 이 시험관 배양체가 충분히 조밀해지면 (OD = 5+/-1), 튜브 내용물 전체를 50mL의 CYE-MOM 종배지를 함유하는 멸균 250mL 진탕 플라스크에 옮겼다. 48 ±12시간 동안 배양 (30℃, 175 rpm)시킨 후, 이 종 배양체 5mL를 500 mL 진탕 플라스크 중의 CYE-MOM 100mL에 옮겼다. 이 배양을 진탕 인큐베이터 (30℃, 175 rpm)에서 1일간 계속시켰다. 배양체가 적절히 배양되고 있는지, 오염되지는 않았는지를 현미경으로 관찰하였다.
[345] 이 종배양체 80mL와 멸균 250mL의 진탕 플라스크 중 멸균된 90% 글리세롤 24mL를 혼합하였다. 완전히 혼합하여 잘 섞고 이 혼합물 1mL씩의 분주액을 100개의 멸균되어, 미리 표지시킨 냉동 바이알에 담았다. 바이알들을 -80℃ 냉동기에서 서서히 동결시켰다.
종배지의 조성
[346] 세포 은행 제조 및 세포 은행 바이알을 소정의 부피로 증폭시키는데 있어서 다음 표 9에 설명된 것과 동일한 종배지를 이용하였다.
CYE-MOM 종배지* 성분 농도
가수분해된 카제인 (췌장 소화물) - Difco 10 g/L
효모 추출물 - Difco 5 g/L
MgSO4·7H2O - EM Science 1 g/L
메틸 올리에이트 - Cognis 2 mL/L
*각주: 메틸 올리에이트는 카지톤 중에서 유제를 형성하여 다른 성분들과 완전히 혼합되지 않기 때문에, 다른 성분들을 모두 첨가한 후에 첨가한다.
진탕 플라스크, 5L, 및 1000L 발효를 위한 접종 대규모화
[347] 메틸올리에이트 적응된 세포들의 동결된 작업 세포 은행 바이알을 해동시켰다. 바이알 내용물 전체를 3mL의 CYE-MOM 종배지를 함유하는 50mL 유리제 배양 시험관에 옮겼다. 이 시험관을 진탕기 (30℃, 175 rpm)에 넣고 48 ±12시간 동안 배양시켰다. 배양 시험관 내용물 전체를 50mL의 CYE-MOM 종배지를 함유하는 250mL 진탕 플라스크에 옮겼다. 이 플라스크를 진탕기 (30℃, 175 rpm)에 넣고 48 ±12시간 동안 배양시켰다. 진탕 플라스크 실험에 사용하기 위해, 이 배양체 10mL를 5개의 새로운 씨드 플라스크 중 신선한 CYE-MOM 40mL에 넣어 서브컬춰시킴으로써 이 종배양체를 증폭시켰다. 플라스크 부피 (30 - 100mL) 생산 배양체용으로 접종물을 이용하기 위해 진탕기 (30℃, 175 rpm)에서 씨드 플라스크를 24 ±12시간동안 인큐베이션시켰다. 결합된 (종배지 및 생산배지) 초기 부피 4.5%로 생산 플라스크를 접종하였다.
[348] 소규모 (5-10L) 발효용 씨드를 준비하기 위해, CYE-MOM 500mL를 함유하는 멸균된 2.8L 페른바흐 플라스크에 이들 50mL의 씨드 플라스크중 하나의 내용물 전체를 넣어 서브컬춰시켰다. 진탕기 (30℃, 175 rpm)에서 이 페르바스 플라스크를 48 ±12시간 동안 배양시켜 발효기 접종물로서 사용하였다. 결합된 초기 부피의 약 5% 규모로 생산 발효 접종시켰다.
[349] 대규모 (1000L) 발효를 위해서는 추가의 씨드 증폭이 필요하다. 여기서, 페른바흐 플라스크 씨드 1L를 이용하여 9L의 CYE-MOM을 함유하는 10L 씨드 발효조를 접종하였다 (5부피%). 2.5N 수산화칼륨과 2.5N 황산을 첨가함으로써 발효조의 pH를 7.4로 조절하였다. 온도는 30℃로 고정시켰다. 400-700 rpm 사이로 교반 속도를 캐스캐이딩시킴으로써 용존 산소를 50% 이상의 포화도로 유지시켰다. 초기 교반속도는 400 rpm으로 고정시키고 스파징 속도는 0.1 v/v/m으로 유지시켰다. 10 L 발효조에서 24 ±12시간 동안 배양시킨 후, 배양물 전체를 90L CYE-MOM이 함유된 150L의 발효조로 옮겼다. 2.5N 수산화칼륨과 2.5N 황산을 이용하여 pH를 다시한먼 7.4로 조절하였다. 온도를 30℃로 고정시켰다. 400-700 rpm 사이로 교반 속도를 캐스캐이딩시킴으로써 용존 산소를 50% 이상의 포화도로 유지시켰다. 초기 교반속도는 400 rpm으로 고정시키고 스파징 속도는 0.1 v/v/m으로 유지시켰다.
발효용 XAD-16 수지 제조
[350] XAD-16 수지 중량의 최소 3배 부피를 갖는 메탄올 안전 용기 (즉, 1.2 kg의 수지는 적어도 3.6L의 용기를 필요로 함)에 필요량의 XAD-16 수지 (Rohn &Haas)를 넣었다. 이 수지를 100% 메탄올로 철저히 세정하여 새 수지에 존재하는 모든 모노머를 제거하였다. 수지의 킬로그램 중량의 2배에 해당하는 리터 단위의 메탄올 (즉, XAD-16 3 킬로그램에 대해 메탄올 6 리터)을 첨가하였다. 메탄올과 XAD 슬러리를 5분간 혼합하여 XAD-16에 존재하는 여하한 모노머를 제거하였다. 슬러리를 가볍게 교반하면서 혼합하여 수지 분획화를 최소화시켰다. 교반을 중단시키고, 수지를 15분 이상 중력 고정시켰다. 용기로부터 메탄올을 배수시켜, XAD 베지 위에 메탄올 층 0.5 내지 1인치 층만 남겼다. 혼합 용기로부터 XAD와 메탄올을 Amicon VA250 컬럼에 옮겼다. 상층 베드 지지체를 컬럼에 부착시키고 마개를 시계방향으로 꽉 죄어 베드 지지체를 밀봉시켰다. 300 ±50 cm/hr의 속도로 메탄올 5 컬럼 부피 이상을 이용하여 컬럼 중의 XAD를 세정하였다. 폐용매 수거 용기에 메탄올을 수집하였다. 300 ±50 cm/hr의 속도로 탈이온수 10 컬럼 부피 이상을 이용하여 컬럼 중의 XAD를 세정하였다.
[351] 에포틸론 생산 배지의 조성을 다음 표 10에 나타내었다.
CTS-MOm 생산 배지 성분 농도
카지톤 (Difco) 5 g/L
MgSO4·7H2O (EM Science) 2 g/L
XAD-16 20 g/L
오토클라브 처리 후 첨가
1000 x 미량원소 용액 4 mL/L
메틸 올리에이트 2 mL/L
*각주: 메틸 올리에이트는 카지톤 중에서 유제를 형성하여 다른 성분들과 완전히 혼합되지 않기 때문에, 다른 성분들을 모두 첨가한 후에 첨가한다. 미량원소 용액은 표 7에 설명된 것과 같다.
준비 및 플라스크-규모 (50mL) 에포틸론 생산 및 발효
[352] 충분한 양의 탈이온수 (~ 3mL)로 250mL 진탕 플라스크 중 XAD-15 1g을 오토클라브시켜 수지를 회수하였다. 121℃에서 30분간 오토클라브처리함으로써 플라스크를 살균시켰다. 다음의 배지 성분들을 플라스크에 무균첨가하였다: CTS-MOm 생산 배지 50mL, 및 1M HEPES 완충액 (수산화칼륨을 이용하여 pH 7.6으로 적정시킴) 2.5mL의 CYE 씨드 플라스크 (4.5% 부피/부피 접종)로 배양체 접종하였다. 30℃ 및 175 rpm의 진탕기에서 생산 플라스크를 인큐베이션시켰다.
[353] 카지톤 및 메틸 올리에이트의 주입을 접종 24 ±6시간 후에 개시하였다. 이 시점에서, 그리고, 그 후 매 24 ±6시간 마다, 100g/L 카지톤 1mL 용액과 메틸 올리에이트 150μL를 주입하였다. 초기 주입 후 13일까지, 또는 세포가 용해를 일으키기 시작하는 것으로 관찰될 때까지 (11-14일), 주입 스케쥴을 계속하였다. 에포틸론 생산 키네틱스를 측정하기 위해, 잘 혼합된 발효 브로쓰와 XAD의 mL 샘플을 대표적으로 샘플링할 수 있다. 부가적으로, XAD 없이 브로쓰의 소량 (0.25-0.5mL) 샘플을 매일 취해서 배양 상태를 육안으로 검사할 수도 있다. 세포용해가 대규모로 관찰되면, 배양 부피의 나머지도 수확하여야 한다.
준비 및 5-L 규모 에포틸론 생산 발효
[354] 100g XAD와 8g MgSO4-7H2O를 3.9L의 탈이온수와 함께 섞고, 5L B-Braun 바이오리액터 중에서 멸균시켰다 (90분, 121℃). 충분한 부피 (133mL)의 파스퇴르처리한 카지톤/탈이온수 용액 (150g/L)을 무균펌프시켜 발효조 중의 카지톤의 최종농도를 5g/L로 만들었다. 초기 메틸 올리에이트 농도 2ml/L는 이 오일 10mL를 첨가함으로써 달성한다. 마지막으로, 미리살균시킨 미량원소 용액 16mL를 접종에 앞서 무균적으로 첨가하였다. 이어서 발효조에 CYE 종배양체 (4.8% 부피/부피) 200mL를 접종하여 24 ±6시간 동안 배양시켰다. 이 시점에서, 카지톤 (2g/L/1일, 연속 주입)과 메틸 올리에이트 (3mL/L/1일 토탈, 반연속적으로 매 90분마다 주입) 주입을 개시하였다. 바이오리액터 중의 기류는 0.4-0.5 vvm으로 일정하게 유지시켰다 (주입 프로그레스에 따라 발효 용량이 증가할수록 이 변화도 커짐). 용존산소 농도는 캐스캐이드 교반에 의해 (400-700 rpm) 50% 포화도로 조절하였다. 400 rpm으로 초기 교반속도를 고정시키고 초기 기류는 0.5 vvm으로 함으로써 100% 포화 용존산소 칼리브레이션 지점을 수립하였다. 2.5N H2S4와 2.5N KOH를 자동 첨가함으로써 pH를 7.4로 고정시켰다. 에포틸론 생산은 접종 후 11-14일간 계속되었으며, 브로스 샘플 중 세포 용해가 현저해지고, 산소 요구도 (교반속도에 의해 표시됨)가 급격히 떨어지면, 바이오리액터를 수확하였다. 이 발효 프로세스에서 에포틸론 D의 타이터는 일반적으로 18-25 mg/L였다.
준비 및 1000L-규모 에포틸론 생산 발효
[355] 에포틸론 생산을 위한 1000L 발효조를 다음과 같이 준비하였다. 발효조에서 물 600L와 XAD-16 18L (11.574kg)를 멸균시켰다 (45분간, 121℃). 발효용기 내로 미량원소와 MgSO4를 직접 필터여과 (미리멸균시킨 0.2 마이크론 폴리에테르설폰 막 캡슐 필터를 통해서)시켰다. 진한 MgSO4용액 충분량 (발효조 중 최종 농도2g/L까지)과 미량원소 2.9L를 동일한 캡슐 필터를 통해 첨가하였다. 117 g/L 카지톤과 175mL/L 메틸 올리에이트의 혼합물 약 200mL를 260L 주입 탱크에서 멸균시켰다. 이 멸균 혼합물 약 32L를 1000L으 발효조에 첨가하였다. 물을 용기 (동일한 캡슐 필터를 통해)내로 여과하여 최종 부피 710L가 되도록 하였다. 100 rpm에서 교반하였다. 역압력은 100-300 mbar로 유지하였다. 용존산소 (DO:dissolved oxygen)가 접종 후 50%에 달하면, 교반속도를 150 rpm으로 증가시켰다. DO가 다시 50%가 되면, 교반속도를 200 rpm으로 증가시켰다. 기류를 캐스캐이딩시킴으로써 (0 Lpm-240 Lpm) DO를 50% 포화도로 조절하였다. pH 스텝포이트는 2.5M KOH와 2.5N H2SO4를 자동첨가시킴으로써 7.4로 유지시켰다. 발효조에 150L 발효조로부터의 38L 시드를 접종하였다 (5% 부피/부피).
[356] DO가 50%에 도달한 후 (두번째로, 접종한지 약 10 ±5시간 후), 카지톤-메틸 올리에이트 주입 용액을 0.570L/시간의 속도로 첨가하고, 발효조를 수확할 때까지 계속 첨가하였다. 접종 10일 후에 바이오리액터를 수확하였다. 최종 에포틸론 D 타이터는 약 20 ±5 mg/L인 것으로 측정되었다.
발효 채취 공정
[357] 플라스크에서의 키네틱 실험을 위해, 5-50mL의 잘 혼합된 브로쓰와 XAD 수지를 25mL 피펫으로 채취하여 10mL 또는 50mL 원추형 시험관에 침착시켰다. 바이오리액터 샘플을 위해, 수지 및 혼합된 브로쓰의 샘플을 50mL의 원추형 튜브에 침착시켰다. 이어서 원추형 튜브를 10분간 정치시켜 XAD가 시험관 바닥에 가라않게하였다. 이 시점에서 브로쓰를 XAD 수지로부터 따라낼 수 있다. XAD가 고정되지 않으면, 10-25mL 피펫을 이용해서 브로쓰를 제거할 수 있다.
에포틸론 타이터 적량을 위한 XAD 수지의 메탄올 추출
[358] 샘플 시험관 바닥에 XAD 수지가 중력고정된 후 (매 채취 공정마다), 상등액 모두를 새로운 50mL 원추형 시험관으로 옮겼다. 50mL 눈금까지 물을 다시 첨가함으로써 XAD 수지를 한번 세정하고, 뒤집어서 완전히 혼합하여 XAD 수지가 중력고정 되도록 하였다. XAD가 쏟아지지 않도록 하면서, 시험관으로부터 수성 혼합물을 따라내었다. 시험관 바닥에 1mL 피펫맨의 끝을 집어넣어서 마지막 몇 mL의 물을 제거할 수 있다. 메탄올을 시험관 25mL 눈금까지 첨가하고, 시험관을 막았다. 원추형 시험관을 진탕기에 30분간 (20-30℃) 수평으로 놓아서 XAD 수지로부터 모든 에포틸론을 완전히 추출되도록 하였다.
에포틸론 정량을 위한 HPLC 공정
[359] 250 nm에서 UV 검출을 행하면서 Hewlett Packard 1090 HPLC를 이용하여 에포틸론 C 및 D를 분석하였다. XAD 수지 (50μL)로부터의 메탄올-추출 용액을 4.6 x 10 mm 가드 컬럼 (Inertsil, C18 OD 53, 5μm), 및 크로마토그래피 분리를 위한, 같은 재료로 만들어진 이보다 더 긴 컬럼 (4.6 x 150 mm)을 통해 주입하였다. 18분간 수행된 이 방법은 60% 아세토니트릴과 40% 물에 아이소크래틱하였다. 이 방법에 의할 때, 에포틸론 D는 13분에, 에포틸론 C는 10.3분에 용출되었다. 발효 브로쓰로부터 정제된 에포틸론 D를 이용하여 스탠다드를 제조하였다.
성장곡선용 건조 세포 중량 공정
[360] Sorvall RC5B 원심분리기 (SH-3000 버킷 로터가 구비됨)의 온도를 20℃로 고정시켰다. 적어도 하루동안 80℃의 오븐에 넣어둔 50mL 원추형 시험관을 칭량하였다. 테어 (tare) 중량을 기록하고 시험관 쪽의 발효 샘플을 동정하였다. 40 mL 브로쓰 (XAD를 함유하지 않음)를 테어된 시험관에 넣거나 피펫팅하였다. 원추형 시험관을 4700 RPM (4200g)에서 30분간 회전시켰다. 침강 후, 상등액을 따라내고, 세포 펠릿을 탈이온수 40mL에 재현탁시키고, 이 튜브를 80℃의 건조 오븐에 적어도 2일간 넣어두었다. 시험관을 칭량하고 최종 중량을 시험관에 기록하였다. 다음 방정식에 따라 건조 세포 중량 (DCW)을 계산해낼 수 있다:
DCW (g/L) = (최종 시험관 중량 (g) - 테어 시험관 중량 (g)) / .04 L
암모늄 이온 농도의 측정
[361] 에포틸론 발효시 대개 발효 브로쓰의 암모니아 농도를 측정한다. 발효 브로쓰 1mL를 마이크로원심분리기를 이용한 원심분리에 의해 (5분, 12000 rpm) 청정화시켰다. Sigma사의 암모니아 분석 키트 (Catalog #171-UV)를 정량하는데 사용하고, 키트 프로토콜에 설명된 혈장 대신 발효 브로쓰를 치환하여 청정화시켰다. 이 열량 분석의 선형 응답범위는 겨우 0.01176 - 0.882 mmoles/L에 불과하므로, 청정화된 발효 샘플을 대개 탈이온화수에 20-100배 희석하여 이 범위 내에서 암모늄 농도를 분석하였다.
잔류 메틸 올리에이트 농도의 측정
[362] 발효 브로쓰 내에 존재하는 잔류 메틸 올리에이트의 양은 발효 브로쓰 샘플을 메탄올 추출시킨 다음, 이들 추출된 브로쓰 샘플을 HPLC 처리함으로서 평가하였다. 메틸 올리에이트 농도의 정량은 210 nm에서의 UV 검출과 함께 hewlett Packard 1090 HPLC를 이용하여 수행하였다. 전체 브로쓰 샘플 (1-4mL)을 동 부피의 메탄올로 추출하고 12,000g으로 원심분리시켜 여하한 불용성 성분을 모두 침강시켰다. 청정화된 상등액 (50μL)을 4.6 x 10 mm 추출 컬럼 (Inertsil, C18 OD 53,5 μm) 상에 주사하여, 50% 아세토니트릴로 2분간 세정한 다음 주 컬럼 (4.6 x 150 mm, 동일한 정상상 및 유동속도) 상에서 24사분간 50% 아세토니트릴로부터 시작하여 100% 아세토니트릴로 마감되는 구배를 이용하여 용출시켰다. 100% 아세토니트릴 컬럼 흐름을 5분간 유지시켰다. 그의 이질적인 특성으로 인해, 메틸 올리에이트는 단일의 순수한 화합물 대신, 불연속적인 몇개의 피크로서 용출된다. 그러나, 추출가능한 총 메틸 올리에이트의 약 64-67%는 각각 25.3 ±0.2분 및 27.1 ±0.2분에 용출되는 2개의 주요 피크로 나타났다. 메탄올 추출된 발효 샘플 중의 메틸 올리에이트는 이들 2개의 피크의 합계면역을 정량한 다음, 이들을 50% 물/메탄올 용액에서 제조된 메틸 올리에이트 스탠다드 중의 이들 두 피크의 면적 합계에 대해 외삽시킴으로써 평가할 수 있다.
에포틸론 D의 정제 및 결정화
[363] 본 발명은 에포틸론 및 에포틸론 D의 정제방법 및 결정형태의 에포틸론 D를 비롯한 에포틸론 D의 고도로 정제된 조제물을 제공한다. 본 발명의 방법의 장점으로는 단지 알코올 (메탄올과 같은)과 물만을 필요로 함으로써, 시간이 많이 들고 노동력이 많이 드는 증발 단계에 대한 필요성을 최소화하면서 생성물 풀의 효과적인 이용성을 가능케 하는 초기 정제 공정을 들 수 있다. 본 발명의 방법은 단일의 증발 단계만을 필요로 하고, 이는, 10 내지 15g의 에포틸론마다 에탄올 1L를 증발시킬 것을 요구한다. 이 방법에서, HP20SS와 같은 합성 폴리스티렌-디비닐벤젠 수지으로 충전시킨 컬럼을 사용하여 극성 및 친지질성 불순물을 모두 제거할 수 있다. 이 컬럼은 10% 에포틸론을 함유하는 중간생성물을 발생시키며 매우 불에 타기 쉽거나 유독한 용매를 사용할 것을 요하는 액체/액체 추출물의 필요성도 제거시켜준다.
[364] 또 다른 장점은 Bakerbond C18과 같은 40-60 마이크론 입자 분포와 C18 수지를 사용하는 것과 관련된 것으로서, 이는 비용을 크게 감소시켜주는 저압 컬럼과 펌프 (50psi 미만)의 사용을 가능케한다. C18 크로마토그래피 처리를 위한 출발물질은 묽은 로딩 용매 중에 로딩된 용액이다. 용매는 충분히 묽어서 에포틸론이 컬럼 상부에 매우 농축된 형태, 타이트한 밴드로 들러붙고, 이는, 컬럼이 과중한 로딩 (2-5g 에포틸론/L 수지)에서도 제대로 수행할 수 있게 해준다. 일반적인 컬럼 로딩량이 1g/l 이하이므로, 크로마토그래피는 대개 정제방법 중 가장 비용이 많이드는 단계이고, 이러한 개선은 비용을 크게 절감시켜주는 결과를 제공한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 방법은 크로마토그래피 단계에서 아세토니트릴 대신 메탄올과 같은 알코올의 사용을 가능케한다. 에포틸론을 함유하는 푸울을 이중 용매계 (물은 결정 형태의 에포틸론을 제공하는 강제용매임)로부터 결정화시켰다.
[365] 한가지 구체예에서, 정제방법은 다음의 단계와 재료들로 이루어진다. 발효 브로쓰 중의 XAD 수지를 (1) 필터 바스켓 중에 수집하고, (2) XAD 추출물을 제공하도록 용출시켜, 이를 (3) 물로 희석한 다음 (4) HP20SS 컬럼을 통해 통과시켜 HP20SS 푸울을 얻는다. HP20SS 푸울을 (5) 물로 희석하고, (6) C18 크로마토그래피로 처리하여 에포틸론 푸울을 얻고, 이를 (7) 물로 희석한 다음 (8) 용매교환시켜 농축된 에포틸론 푸울을 얻는다. 이렇게 농축된 에포틸론 푸울을 (9) 챠콜 여과시켜, (10) 증발시킨 다음 (11) 결정화시켜 고도로 정제된 생성물을 얻는다.
[366] 총 11g의 에포틸론 D를 분리 및 정제하여 2개의 1000-L 믹소코커스 잔투스 발효공정 (103100K 및 1117001K) 으로부터 백색 결정성 분말을 얻었다. 최종 생성물의 순도는 >95%였고, 에포틸론 D의 회수율은 71%였다.
[367] 다음의 표 11은 정제기간 중 사용된 HPLC 방법을 요약한 것이다ㅏ.
Epo1 방법
컬럼 Inertsil ODS3, 5μm, 4.6 x 150 mm
유속 1 ml/min
컬럼 오븐 50℃
수행 시간 15분
검출 250 nm에서 UV
구배 0분; 60:40 ACN/H2O12분; 100:0 ACN/H2O12.1분; 60:40 ACN/H2O
Epo89 방법
컬럼 Inertsil ODS3, 5μm, 4.6 x 150 mm
유속 1 ml/min
컬럼 오븐 50℃
수행 시간 5분
검출 250 nm에서 UV
구배 0분; 78:22 ACN/H2O
[368] 이 섹션에서 사용된 재료는 다음과 같다. Mitsubishi사로부터 HP20SS 수지를 구입하였다. C18 수지는 Bakerbond사로부터 구입한 C18 40g이었고, 메탄올은 Fisher Bulk로부터 구입하였다 (55 gal). 탈이온수를 사용하였다.
발효 수행 1031001K
제 1 단계 XAD 용출 (K125-173)
[369] 13-리터 150 μm 포획 (capture) 배스킷이 달린 Mainstream 여과 유닛을 이용하여 발효 배양액으로부터 XAD-16 수지 17리터 (17L)를 여과하였다. 포획된 XAD 수지를 Amicon VA250 컬럼에 충전시키고 65 L (3.8 컬럼 부피)의 물 1.0L/분으로 세정하였다. 물 중 80% 메탄올 230L를 이용하여 에포틸론 D 생성물을 수지로부터 용출시켰다.
제 2 단계 고상 추출 (K125-175)
[370] 제 1단계의 생성물 푸울 (230L)에 물 77리터 (77L)를 첨가하여 로딩 용매를 물 중 60^ 메탄올로 희석시켰다. 얻어진 현탁액 (307L)을 혼합하고 60% 메탄올 5 컬럼 부피로 미리 평형화시킨 HP20SS 수지 5L로 채운 Amicon VA180 컬럼 상에 로딩시켰다. 로딩 유속은 1L/분이었다. 로딩 후, 컬럼을 60% 메탄올 13L로 세정하고 325 mL/분의 유속으로 75% 메탄올 77L로 용출시켰다. 31개의 2.5L-분획이 수집되었다. 분획 10-26 (42.5L)은 에포틸론 D를 함유하는 것으로 밝혀졌으며, 이들 분획을 함께 모았다.
제 3 단계 크로마토그래피 (K125-179)
[371] 제 2단계의 생성물 푸울을 20-L rotovaps 2개를 이용하여 오일로 증발시켰다. 증발도중, 기포발생을 최소화시키기 위해 에탄올을 첨가해야 했다. 건조 물질을 1.0L의 메탄올에 다시 현탁시키고 0.67L의 물로 희석시켜 60% 메탄올 용액 1.67L를 만들었다. 얻어진 용액을 60% 메탄올 3 컬럼 부피로 미리 평형화시킨 1-L C18 크로마토그래피 컬럼 (55 x 4.8cm) 상에 로딩시켰다. 로딩 유속은 평균 64 mL/분이었다. 로딩된 컬럼을 1 리터의 60% 메탄올로 세정하고, 에포틸론 D 생성물의 용출을 33mL/분의 유속으로 70% 메탄올을 이용하여 이소크래틱하게 수행하였다. 총 27개 분획을 수집하였으며, 첫번째 분획은 3.8 L 부피를 함유하였다. 이것에 이어 3개의 500-mL 분획과 23개의 250-mL 분획이 얻어졌다. 4.8 g의 에포틸론 D를 함유하는 분획 5-20이 최고의 푸울 (K125-179-D)로서 얻어졌다. 분획 3-4 (K125-179-C)는 에포틸론 D를 1.4g 함유하였다. 이 푸울 역시 에포틸론 C를 고농도로 함유하였기 때문에, 재작업 (제 3b 단계)을 위해 따로 챙겨두었다.
제 4 단계 크로마토그래피 (K119-153)
[372] 고농도의 에포틸론 유사체 C도 함유하는 에포틸론 D 분획을 다음과 같이 C18 수지상에서 재-크로마토그래피시켰다. 2.5 x 50 cm 컬럼을 C18 수지로 충전시키고, 100% 메탄올 1 L로 세정한 다음 20 mL/분의 유속으로 물 중 55% 메탄올 1L로 평형시켰다. 압력강하는 125 psi였다. 출발물질 (K125-179-C, 1040mL)을 물 260mL로 희석하자 로딩 용액이 물 중 메탄올을 55% 함유하였다. 얻어진 용액 (1300mL)을 수지상에 로딩시키고 다시 55% 메탄올 250mL를 컬럼을 통해 통과시켰다. 이 컬럼을 먼저 물 중 65% 메탄올 5L, 이어서 70& 메탄올 3L로 용출시켰다. 65% 메탄올 용출시, 총 48개의 100-mL 분획이 수집되었다. 70% 메탄올로 바꾼 후에는, 총 10개의 250-mL 분획이 수집되었다. 분획 50-58로 이루어진 최고의 에포틸론 D 푸울 (K119-153-D)은 소망 생성물을 1.0g 함유하였다.
제 5a 단계 결정화 (K119-158)
[373] 이 단계를 위한 출발물질은 제 3단계와 제 4단계로부터의 크로마토그래피 산물의 결합물이었다. 먼저, 에탄올 120mL를 에포틸론 D 5.5g을 함유하는 고체 7.9g에 첨가하였다. 가볍게 혼합하면서, 고체를 완전히 용해시키고, 용액을 퓸 후드 (fume hood) 중 교반 플레이트상에 놓아둔 400-mL 비이커에 옮겼다.1" 교반 막대를 첨가하여, 용액을 급속히 교반시켰다. 한편, 약 5분에 걸쳐 물 100mL를 서서히 첨가하였다. 작은 백색 결정이 형성되는 것이 관찰될 때, 이 용액이 백색 고체로 진해질 때까지 15분간 용액을 더 교반하였다. 이어서 교반 플레이트로부터 비이커를 치우고, 알루미늄 호일로 덮어, 냉장고 (2℃)에 12시간 동안 넣어두었다. 백색 고체를 Whatman# 50여과지를 이용하여 여과시키고, 이 첫번째 수확에서는 더 이상의 세정은 행하지 않았다. 고체를 결정화 접시위에 놓아두고 진공 오븐 (15 mbar에서 40℃) 중에서 1시간 동안 건조시켰다. 이어서, 오븐으로부터 물질을 제거하고, 보다 미세한 입자로 만든 다음, 진공 오븐에서 4시간 더 건조시켰다. 이 결정화 공정에 의해 회백색 고체 3.41g이 얻어졌다. Epo1 HPLC법을 이용하여 최종 생성물의 크로마토그래피 순도를 측정하였다. 대응하는1H 및13C NMR 데이타와 함께, HPLC는 건조된 물질이 >95% 에포틸론을 함유한다는 것을 확인해주었다. 이 제 1 수확의 회수율은 58%였다.
제 5b 단계 결정화 (K119-167)
[374] 이 단계의 출발물질은 제 5a 단계로부터의 증발된 모액이었다. 먼저, 에탄올 70 mL와 물 30 mL를 에포틸론 2.1g을 함유하는 고체 3.4g에 첨가하였다. 이 맑은 용액을 비이커에 옮기고, 1g의 탈이온화된 챠콜을 여기에 첨가하였다. 10분간고정시킨 배지상에서 혼합물을 교반한 다음 Whatman #50 여과지를 이용하여 여과시켰다. 2개의 10-mL 에탄올 분주액을 이용하여 챠콜을 세척하고 다시 여과시켰다. 결합된 여액을 rotovap을 이용해서 건조시키고, 고체를 50mL의 에탄올에 재현탁시켰다. 얻어진 용액을 250mL 비이커에 넣고, 잘 교반하면서 물 50mL를 서서히 첨가하였다. 결정 형성을 촉진시키기 위해, 소량의 종결정 (1mg)을 이 혼합물에 첨가하였다. 몇분간 교반한 후, 부가적으로 백색 고체가 형성되는 것이 관찰되었다. 교반을 계속하면서 혼합물 주위로 질소 기류를 살살 흘렸다. 15분 후, 2℃의 냉장고에 비이커를 36시간 동안 넣어두었다. 이 혼합물을 Whatman #50 여과지를 이용하여 여과시켜 결정들을 포획한 다음, 7ml의 부가적인 50:50 에탄올:물을 이용하여 고체를 세척하였다. 진공 오븐에서 결정을 4시간동안 건조시켰다. 이 결정화 단계에 의해, 백색 결정 1.46g이 얻어졌으며, 이것은 >95% 에포틸론 D를 함유하였다.
발효 수행 1117001K
제 1 단계 XAD 용출 (K125-182)
[375] XAD-16 수지 17리터를 150 μm 포획 배스킷이 달린 Mainstream 여과 유닛을 이용하여 발효 배양액으로부터 XAD-16 수지 17리터 (17L)를 여과하였다. 포획된 XAD 수지를 Amicon VA250 컬럼에 충전시키고 58 L (3.4 컬럼 부피)의 물 1.0L/분으로 세정하였다. 물 중 80% 메탄올 170L를 이용하여 에포틸론 D 생성물을 수지로부터 용출시켰다. 수세 도중, 그리고 제 1 컬럼 부피 용출중, 컬럼의 역압력을 꾸준히 약 3bar 이상으로 올려 최종 유속을 300mL/분으로 하였다. 따라서, XAD 수지는 컬럼으로부터 제거되고, 또 다른 Amicon VA250 컬럼에 재충전되었다. 교환후, 1bar 미만으로 역압력이 감소하였고, 유속은 1.0L/분으로 유지되었다. 단일의 170-L 분획이 600-L 스테인레스 스틸 탱크 중에 수집되었다. HPLC 분석에 기초할 때, 제 1 단계의 생성물 푸울은 에포틸론 D를 8.4g 함유하는 것으로 밝혀졌다.
제 2 단계 고상 추출 (K145-150)
[376] 제 1단계의 생성물 푸울 (170L)에 물 57리터 (57L)를 첨가하여 로딩 용매를 물 중 60% 메탄올로 희석시켰다. 얻어진 현탁액 (227L)을 오버헤드 라이트닝 믹서로 교반하여, 60% 메탄올 5 컬럼 부피로 미리 평형화시킨 HP20SS 수지 6.5-L로 채운 Amicon VA180 컬럼 상에 로딩시켰다. 로딩 유속은 1L/분이었다. 로딩 후, 컬럼을 60% 메탄올 16L로 세정하고 300 mL/분의 유속으로 75% 메탄올 84L로 용출시켰다. 7개의 분획이 각각 18L, 6L, 6L, 6L, 36L, 6L, 및 6L의 부피로 얻어졌다. 에포틸론 D를 총 8.8g 함유한 분획 4 및 5가 함께 수집되었다.
제 3 단계 크로마토그래피 (K145-160)
[377] 제 2단계의 생성물 푸울을 20-L rotovaps 2개를 이용하여 오일로 증발시켰다. 증발 도중, 기포발생을 최소화시키기 위해 에탄올 10L를 첨가했다. 건조 물질을 2.8L의 메탄올에 다시 현탁시키고 3.4 L의 물로 희석시켜 45% 메탄올 용액 6.2 L를 만들었다. 얻어진 용액을 45% 메탄올 5 컬럼 부피로 미리 평형화시킨 1-L C18 크로마토그래피 컬럼 (55 x 4.8cm) 상에 펌핑시켰다. 로딩 유속은 평균 100 mL/분이었다. 로딩된 컬럼을 1 리터의 60% 메탄올로 세정하고, 100 mL분의 유속으로 단계 구배를 이용하여 수지로부터 에포틸론 D 생성물을 용출시켰다. 컬럼을 55% 메탄올 5L, 60% 메탄올 11.5L, 및 65% 메탄올 13.5L로 용출시켰다. 55% 메탄올로용출시키는 동안 총 10개의 500-mL 분획이 얻어졌다. 60% 메탄올로 바꾼 후, 총 23개의 500-mL 분획이 수집되었다. 마지막으로 65% 메탄올 용출시, 11개의 500-mL 분획이 수집되었으며, 이어서 8개의 1-L 분획이 얻어졌다. 분획 28-50으로 이루어진 최고의 에포틸론 D 푸울 (K145-160-D)는, 소망 생성물을 8.3g 함유하였다. 0.4g의 에포틸론 C로 오염된 분획 26-27 (K145-160-C)는 에포틸론 D를 0.2g 함유하였다. 이들 25개 분획 모두를 결합시켰다.
[378] 생성물 푸울을 물 중 40% 메탄올로 희석하기 위해, 로딩 용액 15.8L에 물 9.5L를 첨가하였다. 얻어진 용액 (25.3L)을, 40% 메탄올 4 컬럼 부피로 미리 평형화시킨 700-mL C-18 크로마토그래피 컬럼 (9x10cm) 상에 펌핑시켰다. 로딩 유속은 평균 360mL/분이었다. 로딩된 컬럼을 1리터의 40% 메탄올로 세정하고, 100% 에탄올 3.75L를 이용하여 수지로부터 에포틸론 D 생성물을 용출시켰다. 용출물을 rotovap을 이용하여 증발건조시켰다. 이 고체를 100mL의 아세톤에 재현탁시키고, 용해되지 않은 물질을 Whatman#2 여과지를 이용하여 용액으로부터 걸러냈다. 여과된 입자를 부가적인 아세톤 115mL로 세척하고, 한번 더 여과하였다. 아세톤 추출에 이어, 2g의 탈색된 챠콜을 결합된 여액에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 고정 배지 상에서 교반하고 Whatman #50 여과지를 이용하여 여과시켰다. 챠콜을 180mL의 에탄올로 세척하고 다시 여과하였다. 여액을 함께 모아 건조될때까지 rotovap으로 처리하였다.
제 4 단계 크로마토그래피 (K119-174)
[379] 제 3 단계로부터의 건조 물질을 물 중 50% 메탄올 5.0L에 재현탁시키고 50% 메탄올 3 컬럼 부피로 미리 평형화시킨 1-L C18 크로마토그래피 컬럼 (55 x 4.8 cm) 상에 로딩시켰다. 로딩 유속은 평균 80mL/분이었다. 컬럼을 후속적으로 50%메탄올 1리터로 세정하고, 에포틸론 D 생성물을 동일 유속에서 70% 메탄올을 이용하여 수지로부터 아이소크래틱하게 용출시켰다. 총 48개의 분획이 수집되었는데, 처음의 분획 47개는 240mL를, 마지막 한개의 분획은 1L를 함유하였다. 에포틸론 D를 7.4g 함유하는 분획 25-48이 최고의 푸울로서 취해졌다 (K119-174-D). 이 푸울 은 에포틸론 C도 고농도로 함유하였기 때문에, 재작업을 위해 따로 챙겨두었다.
제 5 단계 결정화 (K119-177)
[380] 재결정 단계에 앞서 용매 교환을 수행하기 위해, 제 5 단계로부터의 최고의 에포틸론 D 푸울 (K119-174-D) 6.4L에 물 3.9L를 첨가하여 로딩 용액을 물 중 40% 메탄올로 희석하였다. 얻어진 용액을 40% 메탄올 3 컬럼 부피로 미리 평형화시킨 200-mL의 C18 크로마토그래피 컬럼 (2.5 x 10 cm) 상에 로딩시켰다. 로딩도니 컬럼을 40% 메탄올 200mL로 세척하고 에포틸론 D 생성물을 100% 에탄올 1 L를 이용하여 수지로부터 용출시켰다. 용출액을 rotovap을 이용하여 증발건조시키고, 고체를 100% 에탄올 150mL로 재현탁시켰다. 이 맑은 용액을 비이커에 옮겨 담고 잘 교반하면서 175mL의 물을 천천히 첨가하였다. 이 용액에 소량의 (1mg) 종결정도 첨가하여 결정 형성을 촉진시켰다. 작은 백색 결정 형성이 관찰되면, 용액이 백색 고체로 진해지기 시작할 때까지 15분간 더 교반하였다. 이어서 교반 플레이트로부터 비이커를 제거하고, 알루미늄 호일로 덮은 다음, 냉장고 (2℃)에 12시간 동안 넣어두었다. 백색 고체를 Whatman #50 여과지를 이용하여 여과하고, 이 첫번째 수확물에 대해서는 더 이상의 세정을 수행하지 않았다. 결정화 접시 위에 이 고체를 올려 놓고 진공 오븐 (15 mbar에서 40℃) 중에서 6시간동안 건조시켰다. 이 결정화 단계에 의해 백색 고체 6.2g이 얻어졌으며, 이것은 >95%의 에포틸론 D를 함유하였다. 이 제 1 수확 단계의 회수율은 74%였다.
결과
[381] 1031001K 수행시 에포틸론 D의 회수량은 순도는 약 97.5 ~ 98.8%의 결정성 물질 4.8g이었다. 1117001K 수행시의 에포틸론 D 회수량은 순도 약 97.7%의 결정성 물질 6.2g이었다. 이러한 수행의 불순물 프로필을 표 12에 나타내었다.
1031001K 수행 단계 생성물 Epo C Epo 490 Epo D
2 SPE 23 4 74
3-4 총 Chrom 0.7 0.7 90.6
5a 결정화 1.0 1.0 97.5
5b 결정화 0.7 0.5 98.8
1117001K 수행 단계 생성물 Epo C Epo 490 Epo D
2 SPE 18 2 60
3 C18 Chrom 5.2 1.6 81.4
4 C18 Chrom 1.6 1.8 96.6
5 결정화 0.8 1.4 97.7
"Epo 490"은 본 발명의 신규한 에포틸론 화합물로서,믹소코커스숙주 세포에 의해 생산되는 10,11-데히드로에포틸론 D이다.
[382] 이 정제방법은 발효 배지 중 메틸 올리에이트의 이용성에 부응하기 위한 에포틸론 D 정제 방법에 맞게 대규모 변경을 위한 노력의 일환으로 개발되었다. XAD 수지로부터의 에포틸론 D 생성물의 용출을 직설적 방식으로 수행하였다. 100% 메탄올을 사용하는 대신, 80% 메탄올의 10 컬럼 부피를 이용하여 컬럼 중 비드로부터의 생성물을 용출시켰다. XAD 용출 단계 동안, 발효 브로쓰 중 용해된 세포의 존재가 정제 컬럼의 응결을 일으킬 수 있음이 인식되었다. 유의적인 세포 용해가 일어나기 전에 103100-1K 발효 수행의 수확을 수행하였고, 111700-1K 발효의 경우에는, 상당한 세포 용해가 일어난 연후에야 수확을 행하였다. 그러나, 용출 단계가 일어나는 동안 오직 후자의 발효 수행의 경우에만 높은 역압력과 낮은 유속이 관찰되었다. 따라서, 이 수행에 있어서 용해된 세포는 서로 응집되어 후에 컬럼 필터에 엉겨붙을 것이다.
[383] 이 정제 수행 단계들은 에포틸론 D가 실온에서 적어도 하루동안은 80% 메탄올 중에서 안정함을 보여준다. HPLC 분석에 기초해서, 이러한 조건 하에서 생성물의 분해는 검출되지 않았다. 이러한 발견으로 인해, XAD 용출 단계로부터의 170-L 생성물 푸울을 600-L 스테인레스 스틸 탱크 중에서 냉장시킬 필요 없이 하룻밤 저장할 수 있었다. 이 방법을 더욱 개선시키기 위해, 용매-교환 컬럼을 사용하였으며, 이 방법은 생성물 푸울의 부피를 농축시키는데 있어서 rotovap을 사용하는 것보다 훨씬 시간이 절약되고 노동력도 덜 필요하다. 따라서, 대규모 rotovap 공정을 용매-교환 단계로 대체시킬 수 있다.
[384] 비록 XAD 용출 단계 동안, 상당량의 오일이 수지에 결합된채로 남아있지만, 용출물 중에 사이즈가능한 양이 여전히 존재하였다. 심지어 HP20SS 고상 추출 후에조차, 오일 방울들이 생성물 푸울 중에서 명확히 육안관찰가능하여서, C18 크로마토그래피가 진행되는 동안 문제의 소지를 일으킬 것이었다. 최적 크로마토그래피 수행을 위해, 로딩 용액 중의 에포틸론 D의 농도는 2g/L 미만으로 유지시켜야 한다. 보다 높은 농도에서, 출발물질은 컬럼 상에서 오일을 배출하는 경향이 있다.
[385] 주입 물질이 에포틸론 C 또는 Epo 490을 3% 보다 많이 함유할 경우에는 결정화되지 못하였다. 이것은 1117001K의 정제시 일어났다. 첫번째 크로마토그래피 단계는 5% 에포틸론 C를 함유하는 생성물을 생산하였다. 수많은 시도에도 불구하고, 이 물질은 결정화되지 못했다. 그러나, 이 물질을 두번째 크로마토그래피 단계르 통해 에포틸론 C를 1%로 감소시키자 쉽게 결정화되는 주입 물질이 얻어졌다.
실시예 4
비기능성 epoK 유전자를 이용한 믹소코커스 균주의 제조
[386]epoK유전자의 삽입 불활성화에 의해 균주 K111-32.25로부터 균주 K111-40-1을 제조하였다.epoK돌연변이주를 만들기 위해, 카나마이신 내성 카세트를epoK유전자 내로 삽입하였다. 이것은epoK를 함유하는 pKOS35-79.85로부터 4879bp 단편을 분리하고, 이를 pBluescriptSKII+의NotI 부위에 접합시킴으로써 행하였다. 이 플라스키드, pKOS35-83.5를ScaI으로 부분절단하고, DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편을 이용하여 블런트 말단으로 만든 DNA를 갖는, pBJ180-2로부터의 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 1.5kbEcoRI-BamHI 단편을 이용하여 7.4kb 단편을 접합시켜, 플라스미드 pKOS90-55를 만들었다. 마지막으로, pBJ183으로부터의 ~400 bp RP4 oriT 단편을XbaI 및EcoRI 부위 내로 접합시켜 pKOS90-63을 만들었다. 이 플라스미드를 DraI으로 절단하고믹소코커스 잔투스균주 K111-32.25내로 전기영동시킨 다음 형질전환체를 선별하여믹소코커스 잔투스균주 K111-40.1을 제공하였다. 이 균주 K111-40.1을 부다페스트 조약에 의거하여 American TypeCulture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA에 2000년 11월 21일자로 기탁하여 기탁번호 PTA-2712를 부여받았다.
[387] 마커없는epoK돌연변이주를 만들기 위해, pKOS35-83.5를 ScaI으로 절단하고, 2.9kb와 4.3kb 단편을 서로 접합시켰다. 이 플라스미드, pKOS90-101은epoK에서 인-프레임 결실을 가졌다. 다음, 폴리머라제 I의 Klenow 단편에 의해 블런트 말단을 갖는 DNA를 갖고 카나마이신 내성 및galK유전자를 갖는, KG2로부터의NdeI및 3kbBamHI 단편을 pKOS90-101의DraI 부위내로 접합하여 pKOS99-105를 만들었다. 이 플라스미드를 K111-32.25 내로 전기영동시켜 카나마이신 내성 전기영동체를 선별하였다.epoK의 야생형 카피를 결실에 의해 치환시키기 위해, 갈락토스 플레이트 상에서 제 2의 재조합체를 선별하였다. 이 갈락토스 내성 콜로니들을 에포틸론 C 및 D의 생산성 여부에 대해 테스트하고, 생산 균주를 K111-72.4.4로 명명하고, 부다페스트 조약에 의거하여 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA에 2000년 11월 21일자로 기탁하여 기탁번호 PTA-2713을 부여받았다.
실시예 5
matBC 의 첨가
[388] matBC 유전자는 각각 말로닐 Co-A 신쎄타제와 디카르복실레이트 담체 단백질을 각각 코딩한다. An 및 Kim 1998,Eur. J. Biochem. 257:395-402 참조. 이들 두가지 단백질은 외래 말로네이트가 세포내에서 말로닐-CoA로 전환되는데 책임이 있다. 이들 두가지 유전자의 산물은 디카르복실산을 전달하여 이들을 CoA 유도체로 전환시킬 수 있다 (PCT 특허출원 No. US00/28573, 본문에 참조됨). 이들 두 유전자는믹소코커스 잔투스의 염색체 내로 삽입되어 말로닐-CoA 및 메틸말로닐-CoA의 세포농도를 증가시킴으로 해서 폴리케타이드 생산성을 증가시킬 수 있다. 이것은 pMATOP-2를BglII 및SpeI으로 절단하고 이를 테트라사이클린 내성 부여 유전자인 Mx8att부위 및,mtaBC의 발현을 추진하기 위한믹소코커스 잔투스 pilA프로모터를 함유하는, pKOS35-82.1의 BglII과 SpeI 부위 내로 접합시켰다. 이 플라스미드는믹소코커스 잔투스내로 전기영동시킬 수 있다.pilA프로모터는 고도로 전사되기 때문에, 지나치게 많이 MatB와 MatC가 세포 성장에 영향을 미칠 경우, 보다 약한 프로모터를 삽입할 필요가 있을 수 있다. 또 다른 프로모터는 카나마이신 내성 부여 유전자의 프로모터를 포함한다.
실시예 6
로딩 모듈에서의 KS Y 의 돌연변이
[389] 에포틸론 생합성 개시와 관련하여 제안된 메카니즘은 말로네이트가 로딩 도메인의 ACP에 결합하고 후속적으로 로딩 KS 도메인에 의해 탈카르복실화된다는 것이다. 로딩 KS 도메인은 활성 부위 시스테인 (KSY)에서 티로신을 함유하는데 이로 인해 축합반응을 수행하지 못한다. 그러나, 여전히 탈카르복실화 반응은 수행하는 것으로 믿어지고 있다. 래트의 지방산 신타제를 이용한 실험결과 활성 부위 시스테인 (KSQ)에서 글루타민을 함유하는 KS 도메인은 탈카르복실화를 2차수 만큼 강도를 높여주는 반면, 이 아미노산을 세린, 알라닌, 아스파라진, 글리신 또는 쓰레오닌으로 변화시키는 것은 야생형에 비해 아무런 증가를 초래하지 않는 것으로 나타났다. 따라서, KSY를 KSQ로 변화시키면 에포틸론 생산을 증가시키는 결과를 초래하는 에포틸론 프라이밍의 증가를 이룰 수 있다. 균주 K111-32.25에서 변화를 만들기 위해, 에포틸론 KS 로딩 모듈 코딩 서열의 ~850bp를 갖도록 플라스미드 pKOS39-148을 제조하였다. 부위 지향 (site directed) 돌연변이에 의해 이 플라스미드 내에 KSQ돌연변이를 일으켰다. K111-32.25에서 유전자 치환을 수행하기 위해, KG2로부터의 카나마이신 내성 및galK유전자를 pKOS39-148의DraI 위치에 삽입하여 플라스미드 pKOS111-56.2A 및 pKOS111-56.2B를 만들었다. 이 플라스미드들은 카나마이신-galK 카세트에서의 방향성이 서로 다르다. 이 플라스미드들을 K111-32.25 내로 전기영동시켜 카나마이신 내성 콜로니들을 선별하여 K111-63 균주를 만들었다. 야생형 로딩 모듈 KS를 대체시키기 위해, K111-63을 CYE 갈락토스 플레이트상에 플레이팅시키고, PCR 및 시퀀싱에 의해 KSQ의 존재여부에 대해 이들을 스크리닝하였다.
실시예 7
mtaA 의 부가
[390] 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 단백질 농도를 증가시키기 위해,스티그마텔라 아우란티아카 (Stigmatella aurantiaca)균주 DW4로부터의 PPTase를 K111-32.25에 첨가할 수 있다. 이것은 프라이머 111-44.1 (AAAAGCTTCGGGGCACCTCCTGGCTGTCGGC) (SEQ ID NO:4) 및 111-44.4(GGTTAATTAATCACCCTCCTCCCACCCCGGGCAT) (SEQ ID NO:5)를 이용하여 DW4 염색체 DNA로부터의 mtaA의 PCR 증폭에 의해 수행하였다. Silakowski외, 1999,J. Biol. Chem. 274(52):37391-37399 참조. ~800 bp 단편을NcoI로 절단하여PstI으로 절단된 pUHE24-2B에 접합시키고, DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편을 이용하여 말단을 블런트하게 만든 다음,NcoI로 절단하였다. 이 플라스미드를 pKOS111-54로 명명하였다. 테트라사이클린 내성 부여 유전자인 Mx8att부위 및,mtaA의 발현을 추진하기 위한믹소코커스 잔투스 pilA프로모터를 함유하는 pKOS35-82.1에,mtaA유전자를 전달하였다. 이 플라스미드를믹소코커스 잔투스에 도입시키고 Mx8 파지 부착 부위내로 통합시켰다.
실시예 8
프로모터 대체 플라스미드의 제조
[391] 에포틸론 생산 수준을 증대시키고 본 발명의 숙주세포에서 PKS 유전자를 발현하는데 사용가능한 여러가지 프로모터를 설명하기 위해, 일련의 벡터와 숙주세포를 만들어,소란지움 셀룰로섬에포틸론 PKS 유전자 프로모터를 이 실시예에 설명된 바와 같은 다른 적절한 포로모터로 치환시킬 수 있다.
A. 다운스트림 플랭킹 대역을 갖는 플라스미드의 제조
[392] 코스미드 pKOS35-70.8A3을NsiI 및AvrII로 절단하였다. 9.5 kb 단편을pStI 및AvrII로 절단한 pSL1190 절단체와 접합시켜 pKOS990-13을 만들었다. 플라스미드 pKOS90-13은 ~12.9kb이다. 플라스미드 pKOS90-13을EcoRI/AvrII로 절단하였다. 5.1 kb 단편을EcoRI/AvrII로 절단한 pBluescript와 접합시킴으로써pKOS90-64 (~8.1 kb)를 만들었다. 이 플라스미드는 프로모터의 다운스트림 플랭킹 대역을 함유한다 (개시 코돈의 몇몇 서열 업스트림 및epoA). EcoRI 위치는epoA유전자 개시 코돈으로부터 ~220 bp 업스트림이다.AvrII 위치는EcoRI 위치로부터 5100 bp 다운스트림이다.
B. 업스트림 플랭킹 대역의 클로닝
[393] 프라이머 90-66.1 및 90-67 (하기한 바와 같음)을 이용하여 업스트림 플랭킹 대역을 클로닝하였다. 프라이머 90-67은 PCR 단편의 5' 말단에 위치하며, 90-66.1은 PCR 단편의 3' 말단에 있다. 이 단편은epoA유전자의 개시코돈 2481 bp 전에서 종결된다. 이 ~2.2 kb 단편을HindIII로 절단하였다. Klenow 폴리머라제를 첨가하여HindIII 부위를 블런트하게 만들었다. 이 단편을 pNEB193의HincII 위치에 접합시켰다. 삽입체의 다운스트림 말단에EcoRI 위치와 삽입체의 업스트림 말단에HindIII 위치를 갖는, 적절한 방향성을 갖는 클론들을 선별하여 pKOS90-90이라고 명명하였다.
C. 최종 플라스미드의 제조
[394] 플라스미드 pKOS90-90을EcoRI과HindIII로 절단하였다. 이 2.2 kb 단편을EcoRI/HindIII로 절단시킨 pKOS90-64와 접합시켜 pKOS90-91 (10.3kb)를 만들었다. 플라스미드 pKOS90-91은 pBluscript 중 프로모터의 업스트림 플랭킹 대역과그에 이어 다운스트림 플랭킹 대역을 함유한다. 2개의 플랭킹 대역 사이에, 목적하는 프로모터를 클로닝하기 위한PacI위치가 있다.이어서,galK/kan r 카세트를 삽입시켜믹소코커스 잔투스를 재조합시켰다. 플라스미드 pKOS90-91을DraI으로 절단하였다.amp유전자에서DraI을 한번, 벡터에서 2번 (amp유전자 부근에서) 절단시켰다. 플라스미드 KG-2를BamHI/NdeI으로 절단하고 Klenow 폴리머라제를 첨가하여 단편을 블런트화시켰다. 이 3kb 단편 (galK/kan r 유전자)을 pKOS90-91의 ~9.8 kb DraI 단편과 접합시켜 pKOS90-102 (12.8kb)를 만들었다.
D. 또 다른 리더를 이용한 플라스미드의 제조
[395] 에포틸론 PKS 유전자의 천연적인 리더 대역은 상이한 리보좀 결합 부위를 갖는 리더를 대체할 수 있다. 플라스미드 pKOS39-136 (1999년 11월 19일자 미국특허 출원 No. 09/443,501에 설명되어 있음)을PacI/AscI으로 절단하였다. 리더 서열과epoA의 일부를 함유하는 3kb 단편을 분리하여 pKOS90-102의 9.6 kbPacI/AscI단편과 접합시켜 pKOS90-106 (~12.7 kb)를 만들었다.
E. 프로모터 치환 플라스미드의 제조
I. MTA (믹소티아졸) 프로모터
[396] 프라이머 111-44.3과 111-44.5를 이용하여스티그마텔라 아우란티아카의 염색체 DNA (균주 DW4)로부터 믹소티아졸 프로모터를 PCR 증폭시켰다 (후술됨). ~ 554 bp를 pNEB193의HincII 위치에 클로닝시켜 pKOS90-107을 만들었다. 플라스미드 pKOS90-107을PstI과XbaI으로 절단하여 Klenow 충전시켰다. 560 bp 밴드를pKOS90-102에 클로닝시키고 pKOS90-106을PacI으로 절단한 다음 Klenow 충전시켰다 (pKOS90-102와 pKOS90-106에서 PacI 절단은 오직 한번). 정확한 방향성에 대해 플라스미드들을 스크리닝하였다. MTA 프로모터/pKOS90-102 플라스미드를 pKOS90-114 (13.36 kb)로 명명하고 MTA 프로모터/pKOS90-106 플라스미드는 pKOS90-113 (13.26kb)로 명명하였다.
[397] 이 플라스미드들을 에포틸론 PKS 유전자를 함유하는믹소코커스숙주 세포에 전기영동시켜, 카나마이신 내성 형질전환체를 선별하여 단일 크로스오버 재조합체를 동정하였다. 이 형질변환체를 갈락토스 내성에 대해 선별하여 이중 크로스오버 재조합체를 동정하고, 이를 Southern 분석 및 PCR로 스크리닝하여 소망하는 재조합체를 갖는 것들을 동정하였다. 소망되는 재조합체들을 배양하여 에포틸론 생산 여부를 테스트하였다.
II. TA 프로모터
[398] 추정적인 전사적인 항-터미네이터 (transcriptional anti-terminator)를 코딩하는,taA를 갖는 TA에 대한 추정적인 프로모터를 프라이머 111-44.8 (AAAGATCTCTCCCGATGCGGGAAGGC) (SEQ ID NO:10) 및 111-44.9 (GGGGATCCAATGGAAGGGGATGTCCGCGGAA) (SEQ ID NO:11)을 이용하여 균주 TA로부터 증폭시켰다. 약 1.1 kb 단편을BamHI 및BglII으로 절단하여,BamHI으로 절단한 pNEB193에 접합시켰다. 이 플라스미드를 pKOS111-56.1로 명명하였다. 플라스미드 pKOS111-56.1을EcoRI과HindIII로 절단하고 Klenow 충전시켰다. ~1.1 kb 밴드를 pKOS90-102내로 클로닝시키고 pKOS90-106을PacI으로 절단한 다음 Klenow 충전시켰다 (pKOS90-102와 pKOS90-106에서PacI절단을 오직 한번). 플라스미드를 정확한 방향성에 대해 스크리닝하였다. TA 프로모터/90~102 플라스미드를 pKOS90-115 (13.9kb)라고 명명하고, TA 프로모터/pKOS90-106 플라스미드를 pKOS90-111 (13.8kb)이라고 명명하였다.
[399] 에포틸론 PKS 유전자를 함유하는 믹소코커스 숙주 세포에 이 플라스미드들을 전기영동시키고, 카나마이신 내성 형질전환주를 선별하여 단일 크로스오버 재조합체를 동정하였다. 이 형질저놘체들을 갈락토스 내성에 대해 선별하여 이중 크로스오버 재조합체를 동정였다. Southern 분석 및 PCR에 의해 스크리닝하여 소망되는 재조합이 일어났는지를 동정하였다. 이들 소망되는 재조합체를 배양시켜 에포틸론 생산성에 대해 조사하였다.
III. pilA 프로모터
[400] 플라스미드 pKOS35-71B를EcoRI으로 절단하여 Klenow 충전시켰다. 800 bp 단편을 pKOS90-12에 클로닝시키고 pKOS90-106을PacI으로 절단한 다음 Klenow 충전하였다. 플라스미드들을 올바른 방향성에 대해 스크리닝하였다.PilA프로모터/pKOS90-102를 pKOS90-120 (13.6kb)로 명명하고,pilA프로모터/pKOS90-106 플라스미드는 pKOS90-121 (13.5 kb)로 명명하였다.
[401] 이 플라스미드들을 에포틸론 PKS 유전자를 함유하는믹소코커스숙주 세포로 전기영동시켜 카나마이신 내성 형질전환체를 선별하여 단일 크로스오버 재조합체를 동정하였다. 이 형질전환체들을 갈락토스 내성에 대해 선별하여 이중 크로스오버 재조합체를 동정하였으며, 이것은 Southern 분석과 PCR에 의해 스크리닝하여 이들 소망되는 재조합이 일어났는지를 조사하였다. 소망되는 재조합체를 배양하여 에포틸론 생산성에 대해 조사하였다.
IV. kan 프로모터
[402] 플라스미드 pBJ108-2를 BamHI/BglII로 절단하여 Klenow 충전시켰다. 350 bp 단편을 pKOS90-102내로 클로닝시키고 pKOS90-106을 PacI으로 절단하고 Klenow 충전시켰다. 플라스미드를 정확한 방향성에 대해 스크리닝하였다. kan 프로모터/pKOS90-102 플라스미드를 pKOS90-126 (13.15kb)로 명명하고 kan 프로모터 pKOS/90-106 플라스미드는 pKOS90-122 (13/05 kb)로 명명하였다.
[403] 이 플라스미드들을 에포틸론 PKS 유전자를 함유하는 믹소코커스 숙주 세포에 전기영동시키고 카나마이신 내성 형질전환체를 선별하여 단일 크로스오버 재조합체를 동정하였다. 이 형질전환체를 갈락토스 내성에 대해 선별하여 이중 크로스오버 재조합체를 동정하였으며, 이는 Southern 분석과 PCR에 의해 스크리닝하여 소망되는 재조합체를 함유하는지를 동정하였다. 소망되는 재조합체를 배양하여 에포틸론 생산에 대해 시험하였다.
V. So ce90 프로모터
[404] So ce90 프로모터는 프라이머 111-44.6 및 111-44.7 (하기와 같음)을이용하여 So ce90 염색체 DNA로부터 증폭시켰다. ~900 bp 밴드를PacI으로 절단하여PacI으로 절단한 pNEB193에 클로닝시켜 pKOS90-125를 만들었다. 플라스미드 pKOS990-125를PacI으로 절단하였다. 924bp 밴드를 pKOS990-102에 클로닝시키고 pKOS90-106을PacI으로 절단하였다. 플라스미드들을 올바른 방향성에 대해 스크리닝하였다. Soce90 프로모터/pKOS90-102 플라스미드를 pKOS90-127 (13.6kb)로 명명하고, Soce90 프로모터/pKOS90-106 플라스미드는 pKOS990-128 (13.7kb)로 명명하였다.
[405] 이 플라스미드들을 에포틸론 PKS 유전자를 함유하는믹소코커스숙주 세포에 전기영동시키고 카나마이신 내성 형질전환체를 선별하여 단일 크로스오버 재조합체를 동정하였다. 이 형질전환체를 갈락토스 내성에 대해 선별하여 이중 크로스오버 재조합체를 동정하였으며, 이는 Southern 분석과 PCR에 의해 스크리닝하여 소망되는 재조합체를 함유하는지를 동정하였다. 소망되는 재조합체를 배양하여 에포틸론 생산에 대해 시험하였다.
실시예 9
KS2 녹아웃 균주의 제조
[407] 이 실시예는 익스텐더 모듈 2의 KS 도메인이 활성부위인 시스테인 코돈을 알라닌 코돈으로 변화시키는 변이에 의해 불활성화된, 에포틸론 PKS의 제조방법을 설명한다. 얻어진 유도체 PKS에 합성 전구체 (다음 실시예에 설명된 바와 같음)를 제공하여 본 발명의 에포틸론 유도체를 만들 수 있다.
[408] 에포틸론 PKS 유전자의 다운스트림 플랭킹 대역을 플라스미드 pKOS35-78.2로부터의 프라이머 90-103 (5'- AAAAAATGCATCTACCTCGCTCGTGGCGGTT-3') (SEQ ID NO: 14) 및 90-107.1 (5'-CCCCCTCTAGA ATAGGTCGGCAGCGGTACCCG-3') (SEQ ID NO: 15)를 이용하여 PCR 증폭시켰다. ~ 2kb PCR 생성물을NsiI/XbaI으로 절단하고NsiI 및SpeI로 절단한 pSL11990에 접합시켜 pKOS90-123 (~5.4kb)를 만들었다. ~2kb PCR 단편을 pKOS35-78.2로부터의 프라이머 90-105 (5'-TTTTTATGCATGCGGCAGTTTGAACGG-AGATGCT-3') (SEQ ID NO: 16) 및 프라이머 90-106 (5'-CCCCCGAATTCTCCCGGAAGGCAC ACGGAGAC-3') (SEQ ID NO: 17)로 증폭시켰다. DNA를NsiI으로 절단하여NsiI/EcoRV로 절단된 pKOS90-123에 접합시켜 pKOS90-130 (~7.5kb)를 만들었다. 이 플라스미드를NsiI으로 절단한 경우, 그 DNA 말단은 DNA 폴리머라제 I의 Koenow 단편으로 블런트 말단으로 만들어 재접합시켜, 플라스미드 pKOS90-131을 만들었다.galK/kan r 카세트를 이 플라스미드내로 클로닝시키기 위해, 플라스미드 KG-2를 BamHI/Nde으로 절단하고 DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편을 이용하여 블런트 말단으로 만들었다. 3kb 단편을 pKOS90-131의DraI위치로 클로닝시켜 (DraI은 벡터 내에서 3회 절단함) 플라스미드 pKOS90-132 (10.5 kb)를 만들었다.NsiI 위치는 시스테인을 알라닌으로 원하는대로 변화시켜 KOS2 녹아웃을 수행할 목적으로 이용된다. pKOS90-130이NsiI으로 절단된 경우, DNA 폴리머라제 I으로부터의 Klenow 단편으로 블런트 말단으로 만들어 재접합시키고 시스테인 코돈을 알라닌 코돈으로 치환시킨다. 얻어진 플라스미드를 상기 프로토콜에 따라 본 발명의믹소코커스 잔투스균주에 도입하여 원하는 균주를 만들 수 있다.
[408] 믹소코커스 잔투스 균주 K90-132.1.1.2를 이 방법 (에포틸론 A, B, C 및 D 생산자인 K111-32.25를 이용)에 의해 제조하고, 부다페스트 조약에 의거하여 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA에 2000년 11월 21일자로 기탁하여 기탁번호 PTA-2715를 부여받았다. 이 균주에 의해 생산된 PKS가 적절한 "디케타이드" 개시 유닛이 제공될 경우 에포틸론을 합성할 수 있는지를 입증하기 위해, 균주 K90-132.1.1.2를 90% XAD가 플러스된 CTS 50mL 중에서 3익간 30℃에서 배양시키고, 다음과 같은 티아졸 디케타이드 200mg/mL를 공급하였다:
이 균주를 5일 더 배양하고, XAD를 수집하여 에포틸론을 10% 메탄올 추출하였다. 추출물을 건조시키고 아세토니트릴 0.2ml 중에 재현탁시켜, 0.05mL 샘플을 LC/MS 분석하자 기대했던대로 에포틸론 B와 D가 존재하는 것으로 나타났다. 다음 실시예에서 논의된 바와 같이, 이 시스템을 이용하여 다양한 에포틸론 유사체를 생산할 수 있다.
실시예 10
화학생합성으로부터의 변형된 에포틸론
[409] 이 실시예는 화학생합성을 통한 에포틸론 유도체 생산용 티오에스테르 시리즈를 설명한다. 소란지움 셀룰로섬으로부터 에포틸론을 생산하기 위한 생합성 유전자 클러스터의 DNA 서열은 PKS의 프라이밍이 폴리케타이드와 아미노산 성분의 혼합물과 관련되어 있음을 가리킨다. 프라이밍은 로딩 모듈의 PKS-유사 부위의 말로닐 CoA 로딩 및 그에 이은 탈카르복실화 및 익스텐더 모듈 1 NPRS의 시스테인 로딩, 및 효소-결합 N-아세틸시스테인 형성을 위한, 그에 이은 축합과 관련되어 있다. 티아졸린 형성을 위한 고리화에 이어서, 산화가 일어나, 로딩 모듈과 NPRS의 생성물인 2-메틸티아졸-4-카르복실레이트 결합된 효소가 생성된다. 모듈 2의 케토신타제에 의한 후속적인 메틸말로닐 CoA와의 축합에 의해 다음 반응식 6에 도시된 바와 같이 디케타이드 등가물이 제공된다.
[410] 본 발명은 PCT 공개 Nos. 99/03986 및 97/02358에서 설명된 6-dEB 및 에리쓰로마이신을 만드는 것과 유사한 ㅂ\방법으로 에포틸론 유도체를 생산하기 위한 생합성법 및 시약을 제공한다. 2가지 종류의 주입 기질이 제공된다: NRPS 생성물의 유사체와 디케타이드 등가물의 유사체가 그것들이다. NRPS 생성물 유사체는 돌연변이된 NRPS-유사 도메인과 함께 PKS 효소와 함꼐 사용되고, 디케타이드 등가물은 모듈 2에서 돌연변이된 KS 도메인과 함께 PKS 효소와 함께 사용된다 (실시예 9에 설명된 바와 같음). 후술하는 반응식 7 및 8의 구조에서, R, R1및 R2는 독립적으로 메틸, 에틸, 저급 알킬 (C1-6) 및 치환된 저급 알킬 중에서 독립적으로 선택될수 있다.
[411] 다음의 반응식 7은 로딩 모듈 유사체를 예시한 것이다.
로딩 모듈 유사체는 대응하는 카르복실산을 활성화시켜 이를 N-아세틸시스테아민으로 처리함으로써 제조한다. 활성화방법은 산 클로라이드의 형성, 혼합된 무수물의 형성 또는 카르보디이미드와 같은 축합 시약과의 반응을 포함한다.
[412] 다음의 반응식 8은 디케타이드 등가물을 예시한 것이다.
디케타이드 등가물을 3단계 공정으로 제조하였다. 먼저, 대응하는 알데하이드를 Wittig 시약 또는 그 등가물로 처리하여 치환된 아크릴 에스테르를 형성시킨다. 이 에스테르를 비누화시켜 산으로 만들고, 이를 N-아세틸시스테아민으로 활성화 및 처리한다.
[413] 로딩 모듈 생성물 유사체 및 디케타이드 등가물을 제조하기 위한 예시적인 반응식은 다음과 같다. 디케타이드 등가물을 만드는데 적합한 부가적인 화합물은 본 발명의 숙주세포에 공급될 N-아실시스테아미드로 전환되는 카르복실산으로서 (또는 카르복실산으로 전환될 수 있는 알데하이드) 도 1에 도시되어 있다.
A. 티오펜-3-카르복실레이트 N-아실시스테아민 티오에스테르
[414] 불활성 분위기 하 건조 테트라히드로퓨란 2mL 중 티오펜-3-카르복실산 (128mg) 용액을 트리에틸아민 (0.25mL)과 디페닐포스포릴 아자이드 (0.50ml)로 처리하였다. 1시간 후, N-아세틸시스테아민 (0.25mL)을 첨가하고, 12시간 동안 반응을 진행시켰다. 이 혼합물을 물에 붓고 동부피의 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기 추출물을 결합시키고, 물, 1N HCl, 포화 CuSO4및 식염수로 순차 세척하고 MgSo4를 이용하여 건조시킨 다음 여과 및 진공농축시켰다. 에테르 이어서 에틸 아세테이트를 이용하여 SiO2상에서 크로마토그래피시키자 순수한 생성물이 얻어졌으며 이를 정치시키자 결정화되었다.
B. 퓨란-3-카르복실레이트 N-아세틸시스테아민 티오에스테르
[415] 불활성 분위기 하, 건조 테트라히드로퓨란 2mL 중 퓨란-3-카르복실산 (112 mg) 용액을 트리에틸아민 (0.25mL)과 디페닐포스포릴 아자이드 (0.50mL)로 처리하였다. 1시간 후, N-아세틸시스테아민 (0.25mL)을 첨가하고, 12시간 동안 반응을 진행시켰다. 이 혼합물을 물에 붓고 동부피의 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기 추출물을 결합시키고, 물, 1N HCl, 포화 CuSO4및 식염수로 순차 세척하고 MgSo4를 이용하여 건조시킨 다음 여과 및 진공농축시켰다. 에테르 이어서 에틸 아세테이트를 이용하여 SiO2상에서 크로마토그래피시키자 순수한 생성물이 얻어졌으며이를 정치시키자 결정화되었다.
C. 피롤-2-카르복실레이트 N-아세틸시스테아민 티오에스테르
[416] 불활성 분위기 하, 건조 테트라히드로퓨란 2mL 중 피롤-2-카르복실산 (112 mg) 용액을 트리에틸아민 (0.25mL)과 디페닐포스포릴 아자이드 (0.50mL)로 처리하였다. 1시간 후, N-아세틸시스테아민 (0.25mL)을 첨가하고, 12시간 동안 반응을 진행시켰다. 이 혼합물을 물에 붓고 동부피의 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기 추출물을 결합시키고, 물, 1N HCl, 포화 CuSO4및 식염수로 순차 세척하고 MgSo4를 이용하여 건조시킨 다음 여과 및 진공농축시켰다. 에테르 이어서 에틸 아세테이트를 이용하여 SiO2상에서 크로마토그래피시키자 순수한 생성물이 얻어졌으며 이를 정치시키자 결정화되었다.
D. 2-메틸-3-(3-티에닐)아크릴레이트 N-아세틸시스테아민 티오에스테르
[417](1) 에틸 2-메틸-3-(3-티에닐)아크릴레이트: 건조 테트라히드로퓨란 (20mL) 중 티오펜-3-카르복스알데하이드 (1.12g)과 (카르브에톡시에틸리덴)트리페닐포스포란 (4.3g)의 혼합물을 16시간 동안 가열환류시켰다. 이 혼합물을 주변온도로 냉각시키고 진공 건조 농축시켰다. 고체 잔사를 1:1 에테르/헥산에 현탁시키고 여과하여 트리페닐포스핀 옥사이드를 제거하였다. 여액을 1:1 에테르/헥산을 이용하여 SiO2패드를 통해 여과시켜 생성물 (1.78g, 91%)을 담황색 오일로서 얻었다.
[418](2) 2-메틸-3-(3-티에닐)아크릴산: 상기 (1) 단계로부터의 에스테르를 메탄올 (5mL)과 8N KOH(5mL)와의 혼합물에 녹인 다음 30분 동안 가열환류시켰다.이 혼합물을 주변온도로 냉각시키고, 물로 희석한 다음 에테르로 2회 세척하였다. 수성상을 1N HCl로 산성화시킨 다음 동 부피의 에테르로 3회 추출하였다. 유기 추출물을 결합시켜 MgSO4로 건조, 여과시킨 다음 진공하에서 농축건조시켰다. 2:1 헥산/에테르로부터 결정화시켜 무색 침상의 생성물을 얻었다.
[419](3) 2-메틸-3-(3-티에닐)아크릴레이트 N-아세틸시스테아민 티오에스테르: 불활성 분위기 하 건조한 테트라히드로퓨란 2mL 중 2-메틸-3-(3-티에닐)아크릴산 (168mg)의 용액을 트리에틸아민 (0.56mL) 및 디페닐포스포릴 아자이드 (0.45mL)로 처리하였다. 15분 후, N-아세틸시스테아민 (0.15mL)을 첨가하고 4시간 동안 반응을 진행시켰다. 이 혼합물을 물에 붓고 동 부피의 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기 추출물을 결합시키고, 물, 1N HCl, 포화 CuSO4및 식염수로 순차 세척하고 MgSo4를 이용하여 건조시킨 다음 여과 및 진공농축시켰다. 에틸 아세테이트를 이용하여 SiO2상에서 크로마토그래피시키자 순수한 생성물이 얻어졌으며 이를 정치시키자 결정화되었다.
[420] 상기 화합물은 익스텐더 모듈 2의 NRPS 또는 KS 도메인이 돌연변이에 의해 불활성화되어 본 발명의 대응 에포틸론 유도체를 만들도록 된, 본 발명의 재조합 에포틸론 PKS를 함유하는 숙주 세포의 배양체에 공급된다.
실시예 11
에포틸론 유사체의 생산
A. 13-케토-에포틸론 유사체의 생산
[421] 에포틸론 PKS의 익스텐더 모듈 4 중의 KR 도메인의 불활성화에 의해 13-케노 에포틸론 생산에 유용한 본 발명의 하이브리드 PKS가 얻어진다. 익스텐더 모듈 4 KR 도메인은 후술하는 바와 같이 야생형 유전자를 여러가지 결실 버젼으로 대체시킴으로써 변형시켰다. 먼저, 주형 (template)으로서 플라스미드 pKOS39-118B (코스미드 pKOS35-70.4로부터의epoD유전자의 서브클론)를 이용하여 단편들을 증폭시켰다. 결실 좌측부를 형성하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머들은 다음에 나타낸 바와 같은 TL3과 TL4였다:
TL3 : 5'-ATGAATTCATGATGGCCCGAGCAGCG (SEQ ID NO: 18) 및
TL4 : 5'-ATCTGCAGCCAGTACCGCTGCCGCTGCCA (SEQ ID NO: 19)..
결실 우측부를 형성하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머들은 다음과 같은 TL5 및 TL6이었다:
TL5 : 5'-GCTCTAGAACCCGGAACTGGCGTGGCCTGT (SEQ ID NO: 20) 및
TL6 : 5-GCAGATCTACCGCGTGAGGACACGGCCTT (SEQ ID NO: 21).
PCR 단편들을 벡터 Litmus 39내로 클로닝시키고 시퀀싱하여 소망하는 단편들이 얻어졌는지를 확인하였다. 이어서, TL3/TL4 단편을 함유하는 클론을 제한효소PstI 및BamHI으로 절단하여, ~ 4.6 kb 단편을 분리하였다. 프라이머 TL5/TL6을 이용하여 얻어진 2.0 kb PCR 단편을 제한효소BglII 및XbaI으로 처리한 다음 (i) "짧은" KR 링커 TL23 및 TL24 (함꼐 어닐링되어 단일-사슬 오버행과 함께 이중 사슬 링커를 형성함)에 접합되어 pKOS122-29를 형성하던가; 또는 (ii) 프라이머 TL33+TL34를 이용한 PCR 및 이어서 제한효소NsiI및SpiI처리에 의해 얻어진, "긴" (epoDH3*) 링커에 결합하여 플라스미드 pKOS122-30을 얻었다. 이들 올리고뉴클레오타이드 링커 및 프라이머의 서열은 다음과 같다:
[422] 소망되는 치환을 함유하는 플라스미드를 시퀀싱에 의해 확인한 다음 제한효소 DraI으로 절단하였다. 이어서, 각각의 클론의 큰 단편을 카나마이신 내성과 galK 유전자 (KG 또는kan-gal) 카세트에 접합시켜 전달용 플라스미드를 만들었다. 이 전달 플라스미드를 이용하여 에포틸론 B 생산자믹소코커스 잔투스K111-32.25를 전기영동에 의해 형질전환시켰다. 형질전환체를 스크리닝하여 카나마이신-민감성, 갈락토스-내성 생존자를 선별하여 KG 유전자가 제거된 클론들을 동정하였다. KG 제거를 확인하고 재조합 균주에 의한 소망되는 유전자 치환을 PCR에 의해 수행하였다. 재조합 균주를 CTS 배지 50mL 및 2% XAD-16과 함꼐 플라스크 중에서 5일동안 발효시켜 에포틸론 유사체를 XAD 및 10mL 메탄올로 용출시켰다. 구조 결정은 LC/MS 스펙트럼과 NMR에 기초하였다. 이러한 한가지 균주를 K122-56으로 명명하고 부다페스트 조약에 의거하여 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA에 2000년 11월 21일자로 기탁하여 기탁번호 PTA-2714를 부여받았다. K122-56 균주 (플라스미드 ㅔㅏㅒㄴ122-29로부터 유도됨)는 다음 구조를 갖는 13-케토-11,12-데히드로-에포틸론 D를 주요 생성물로서 생산한다:
[423] K122-56 균주는 또한 각각 다음 구조를 갖는 13-케토-에포틸론 C 및 D를 부 생성물로서 생산한다:
[424] 플라스미드 pKOS122-30으로부터 유도된 균주 K122-30을 이용한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다. 이 화합물들과 균주 및 이들을 생산하는 PKS 효소는 본 발명의 신규한 화합물, 균주 및 PKS 효소이다.
[425] 13-케토-11,12-데히드로에포틸론을 생산하는 본 발명의 다른 균주들은 하나 이상의 포인트 돌연변이에 의해 KR 도메인이 불활성화된 것들을 포함한다. 예컨대, KR 도메인 중 구성원 티로신 잔기를 페닐알라닌 잔기로 돌연변이시키면 KR 활성이 약 10% 감소되고 13-케토-에포틸론 생산이 결과된다. KR 도메인의 추가 돌연변이는 KR 활성을 추가적으로, 또는 모두 제거할 수 있지만, 에포틸론 생산도 감소시키는 결과를 초래할 수 있다.
B. 13-히드록시-에포틸론 유사체의 생산
[426] 에포틸론 PKS의 익스텐더 모듈 5KR, DH 및 ER 도메인을 라파마이신 PKS의 익스텐더 모듈 2 또는 FK520 PKS의 익스텐더 모듈 3으로부터의 KR 도메인과 같은 이종 KR 도메인으로 치환시키면 13-히드록시 에포틸론 생산에 유용한 본 발명의 하이브리드 PKS가 얻어진다. 이것은 이 실시예의 파트 A 에 설명된 것과 유사한 방식으로 수행된다. 주형으로서 플라스미드 pKOS39-118B를 이용하여epoD유전자의 소망되는 부분을 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머들은 다음과 같았다:
TL7 : 5'-GCGCTCGAGAGCGCGGGTATCGCT (SEQ ID NO:26);
TL8 : 5'-GAGATGCATCCAATGGCGCTCACGCT (SEQ ID NO: 27);
TL9 : 5'-GCTCTAGAGCCGCGCGCCTTGGGGCGCT (SEQ ID NO: 28) 및
TL10 : 5-GCAGATCTTGGGGCGCTGCCTGTGGAA (SEQ ID NO: 29).
[427] 프라이머 TL7/TL8로부터 생산된 PCR단편들을 벡터 LITMUS 28에 클로닝시키고, 얻어진 클론을 제한효소NsiI과BglII로 절단하여 5.1 kb 단편을 분리하고 이를 제한 효소BglII 및XbaI으로 처리된 TL9/TL10으로부터 생성된 2.2 kb PCR 단편과 접합시켜 KR 카세트에 접합시켰다. 프라이머 TL31 및 TL32를 이용하여 PCR에 의해 생산된 FK520 PKS로부터의 KR 카세트를 제한효소XbaI과PstI을 이용하여 절단하였다. 이 프라이머들은 다음과 같다:
[428] 균주 제조의 나머지는 수용체로서믹소코커스 잔투스K111-72.44가 사용된 것을 제외하고는 이 실시예의 파트 A에 설명된 것과 유사한 방식으로 진행된다. FK520 PKS의 익스텐더 모듈 3의 KR 도메인이 에포틸론 PKS의 익스텐더 모듈의 KR, DH 및 ER 도메인을 대체한 균주를 K122-148로 명명하고, 부다페스트 조약에 의거하여 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA에 2000년 11월 21일자로 기탁하여 기탁번호 PTA-2711을 부여받았다. 균주 K122-148은 주요 생서물로서 13-히드록시-10,11-데히드로 에포틸론 D를 생산하며 부생성물로서 에포틸론 C 유도체를 생산하며 그 구조는 다음과 같다:
[429] 라파마이신 PKS의 익스텐더 모듈 2의 KR 도메인이 치환에 사용된 유사한 균주 K122-52는 동일 화합물을 생산하였다. 이 화합물들과 균주 및 이들을 생산하는 PKS 효소는 본 발명의 신규한 화합물, 균주 및 PKS 효소였다.
C. 9-케토-에포틸론 유사체의 생산
[430] 에포틸론 PKS의 익스텐더 모듈 6의 KR 도메인의 불활성화는 9-케토-에포틸론을 생산할 수 있는 본 발명의 신규한 PKS를 결과시킨다. KR 도메인은 하나 이상의 보존 잔기를 변경시킴으로써 위치-특이적인 돌연변이에 의해 활성화될 수 있다. 에포틸론 PKS의 익스텐더 모듈 6의 KR 도메인의 DNA와 아미노산 서열은 다음과 같다:
[431] 본 발명에 의해 제공되는 신규한 9-케토-에포틸론 PKS의 익스텐더 모듈 6의 돌연변이되어 불활성인 KR 도메인의 DNA 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
[432] 수용체로서믹소코커스 잔투스k111-72.4.4를 사용한 것을 제외하고, 이 실시예의 A 파트에서 설명된것과 일반적으로 같은 방식으로 이 돌연변이된 KR 도메인 코딩 서열을 포함하는 균주를 제작하였다. 익스텐더 모듈 6의 KR 도메인이 불활성화된 이 균주를 K39-164로 명명하고 부다페스트 조약에 의거하여 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA에 2000년 11월 21일자로 기탁하여 기탁번호 PTA-2716을 부여받았다. 균주 K39-164는 주 생성물로서 9-케토-에포틸론 D를 생산하고 부생성물로서 C 유도체를 생산하며 그 구조는 다음과 같다:
이들 화합물과 균주 및 이들을 생산하는 PKS 효소는 본 발명의 신규한 화합물, 균주 및 PKS 효소이다.
D. 2-메틸-에포틸론 유사체의 생산
[433] 에포틸론 A, B, C 및 D의 2-메틸-에포틸론 유사체는, 익스텐더 모듈 9 AT 도메인 ("epoAT9")의 코딩 서열을 메틸말로닐 CoA에 특이적인 AT 도메인의 코딩 서열로 치환시킴으로써 제작할 수 있다. 따라서, 적절한 치환 AT 도메인 코딩 서열은 예컨대, FK520 PKS의 익스텐더 모듈 2 ("FKAT2"; PCT 공개 No. 00/020601, 본문에 참조됨); 에포틸론 PKS의 익스텐더 모듈 2 ("epoAT2"); 및 tmbA 유전자에 의해 코딩된 PKS의 익스텐더 모듈 3 ("tmbAT3"; 미국특허 No. 6,090601 및 2001년 2월 15일자 미국특허출원 No. 60/271.245, 본문 참조됨)을 코딩하는 유전자로부터 얻을 수 있다. 이러한 치환은 일반적으로 상술한 바와 같이 수행되며, 생산된 특정 에포틸론은 단지 치환이 유도된믹소코커스숙주에 의해 어떤 에포틸론이 생산되는지에 의해 좌우된다.
[434] 따라서, epoAT9 코딩 서열 (뉴클레오타이드 50979 내지 뉴클레오타이드 52026)은 epoAT2 (뉴클레오타이드 12251 내지 뉴클레오타이드 13287) 또는 FKAT2, 또는 tmbAT3 코딩 서열에 의해, 정션에서, 조작된 BglII (ATATCT) 및 NsiI(ATGCAT) 제한효소 인식 서열들로 치환된다.
[435] 첫번째 PCR은 주형으로서 사용된 pKOS39-125 DNA로부터 ~ 1.6 kb 단편을 생산하는데 이용된다. 이 PCR 단편을HindIII 및BglII 위치에서 벡터 LITMUS28 내로 서브클로닝시켜 시퀀싱한다; 소망되는 서열을 갖는 플라스미드를 P1이라고 칭한다. 이 PCR에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:
TLII-1 : 5'-ACAAGCTTGCGAAAAAGAACGCGTCT (SEQ ID NO:36); 및
TLII-2 : 5'-CGAGATCTGCCGGGCGAGGAAGCGGCCCTG (SEQ ID NO:37).
[436] 두번째 PCR은 주형으로서 사용된 pKOS39-125 DNA로부터 ~ 1.9 kb 단편을 생산하는데 이용된다. 이 PCR 단편을NsiI 및SpeI 위치에서 벡터 LITMUS28 내로 서브클로닝시켜 시퀀싱한다; 소망되는 서열을 갖는 플라스미드를 P2라고 칭한다. 이 PCR에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:
TLII-3B : 5'-GCATGCATGCGCCGGTCGATGGTGAG (SEQ ID NO:38) ; 및
TLII-4 : 5'-AGACTAGTCACCGGCTGGCCCACCACAAGG. (SEQ ID NO:39)
[437] 플라스미드 P1을 제한효소 BglII 및 SpeI으로 절단하여 4.5 kb 단편을 분리하고 플라스미드 P2로부터의 ~1.9 kb NsiI-SpeI 제한효소 단편 및 NsiI-BglII 제한효소 단편으로서 분리된 3개의 치환 AT 단편들 (FKAT2, epoAT2, tmbAT3) 중 하나와 접합시켜, 플라스키드 P3.1, P3.2 및 P3.3을 얻는다. 치환 AT 단편들은 다음올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 생산된다:
[438] 플라스미드 P3.1, P3.2 및 P3.3을 kan-gal 카세트의 DraI 위치에 삽입시킴으로써 변형시킨다. 얻어진 플라스미드를 본 발명의 에포틸론을 생산하는 믹소코커스 잔투스 숙주 세포 (즉, K111-72.4.4) 내로 형질전환시키고, 이 세포들을 배양하여 상기한 바와 같이 이중-크로스오버 재조합 여부에 대해 선별한다. 선별된 콜로니들을 PCR로 스크리닝한다. 소망되는 재조합을 일으킨 콜로니들을 50mL 배양체로 배양시켜 소망 화합물의 생산 여부를 LC/MS로 스크리닝하였다. 기대된 생성물은 2-메틸-에포틸론 D와 2-메틸-에포틸론 C로서 그 구조는 다음과 같다.
E. 6-데스메틸-에포틸론 유사체의 생산
[439] 익스텐더 모듈 7 AT 도메인 ("epoAT7")의 코딩 서열을 말로닐 CoA 특이적인 AT 도메인의 코딩 서열로 대체시킴으로써 에포틸론 A, B, C 및 D의 6-데스메틸-에포틸론 유사체를 만들 수 있다. 따라서, 적절한 치환 AT 도메인 코딩 서열은 예컨대, FK520 PKS의 익스텐더 모듈 3; 에포틸론 PKS ("epoAT5")의 익스텐더 모듈 5; 및 tmbA 유전자에 의해 코딩된 PKS의 익스텐더 모듈 4를 코딩하는 유전자로부터 얻을 수 있다. 이러한 치환은 일반적으로 상술한 바와 같이 수행되며, 생산된 특정 에포틸론은 단지 치환이 유도된믹소코커스숙주에 의해 어떤 에포틸론이 생산되는지에 의해 좌우된다.
[440] 따라서, epoAT7 코딩 서열 (뉴클레오타이드 39585 내지 뉴클레오타이드 40626)은 epoAT5 (뉴클레오타이드 26793 내지 뉴클레오타이드 27833) 또는 FKAT3, 또는 tmbAT4 코딩 서열에 의해, 정션에서, 조작된 BglII (AGATCT) 및 NsiI (ATGCAT) 제한효소 인식 서열들로 치환된다.
[441] 첫번째 PCR은 주형으로서 사용된 pKOS39-125 DNA로부터 ~ 1.8 kb 단편을 생산하는데 이용된다. 이 PCR 단편을NSiI 및SpeI 위치에서 벡터 LITMUS28 내로 서브클로닝시켜 시퀀싱한다; 소망되는 서열을 갖는 플라스미드를 P4라고 칭한다. 이 PCR에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:
LII-5 : 5'-GGATGCATGTCGAGCCTGACGCCCGCCG (SEQ ID NO:46); 및
LII-6 : 5'-GCACTAGTGATGGCGATCTCGTCATCCGCCGCCAC (SEQ ID NO:47)
[442] 두번째 PCR은 주형으로서 pKOS039-118B를 이용하녀 ~2.1 kb 단편을 생산하는데 이용된다. 이 PCR에 사용된 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:
TL16 : ACAGATCTCGGCGCGCTGCCGCCGGAG (SEQ ID NO:48) 및
TL15 : GGTCTAGACTCGAACGGCTCGCCACCGC (SEQ ID NO:49).
[443] PCR 단편을 EcoRV 제한효소 위치에서 LITMUS28로 서브클론시키고 소망되는 서열을 갖는 플라스미드를 시퀀싱에 의해 동정하여 플라스미드 pKOS122-4로 명명하였다. 이 플라스미드 pKOS122-4를 제한효소 BglII 및 SpeI으로 절단하여 4.8 kb 단편을 분리하고 플라스미드 P4로부터의 ~1.8 kb NsiI-SpeI 제한효소 단편 및 NsiI-BglII 제한효소 단편으로서 분리된 3개의 치환 AT 단편들 (FKAT3, epoAT5, tmbAT4) 중 하나와 접합시켜, 플라스미드 P5.1, P5.2 및 P5.3을 얻는다. 치환 AT 단편들은 다음 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 생산된다:
FKAT3:
TLII-11 : 5'-GTATGCATCCAGTAGCGGACCCGCTCGA (SEQ ID NO:50); 및
TLII-12 : 5'-GCAGATCTGTGTGGCTCTTCTCCGGACA (SEQ ID NO: 51);
tmbAT4 :
TLII-15 ; 5'-GCATGCATCCAGTAGCGCTGCCGCTGGAAC (SEQ ID NO:52); 및
TLII-16 ; 5'-GGAGATCTGCGGTGCTGTTCACGGGGCA (SEQ ID NO:53); 및
PCR epoAT5 :
TLII-19 ; 5'-GTAGATCTGCTTTCCTGTTCACCGGACA (SEQ ID NO:54); 및
TL8 (이 실시예의 파트 참조).
[444] 플라스미드 P5.1, P5.2 및 P5.3은kan-gal카세트DraI 위치에서의 삽입에 의해 변형된다. 얻어진 플라스미드를 본 발명의 에포틸론 생산 믹소코커스 잔투스 숙주 세포 (즉, k111-72.4.4)에 형질전환시키고, 세포를 배양하여 전술한 바와 같이 이중-크로스오버 재조합체 대해 선별하였다. 선별된 콜로니를 PCR에 의해 스크리닝하였다. 소망되는 재조합을 나타내는 콜로니들을 50mL 배양체로 배양하여 LC/MS에 의해 소망 생성물의 생산 여부를 스크리닝하였다. 기대된 화합물은 6-데스메틸-에포틸론 D 및 6-데스메틸-에포틸론 C로서 그 구조는 다음과 같다:
F. 10-메틸-에포틸론 유사체의 생산
[445] 익스텐더 모듈 5 AT 도메인 ("epoAT5")의 코딩 서열을 메틸말로닐 CoA 특이적인 AT 도메인의 코딩 서열로 대체시킴으로써 에포틸론 A, B, C 및 D의 10-메틸-에포틸론 유사체를 만들 수 있다. 따라서, 적절한 치환 AT 도메인 코딩 서열은 예컨대, FK520 PKS의 익스텐더 모듈 2; 에포틸론 PKS의 익스텐더 모듈 2("epoAT2"); 및 tmbA 유전자에 의해 코딩된 PKS의 익스텐더 모듈 3을 코딩하는 유전자로부터 얻을 수 있다. 이러한 치환은 일반적으로 상술한 바와 같이 수행되며, 생산된 특정 에포틸론은 단지 치환이 유도된믹소코커스숙주에 의해 어떤 에포틸론이 생산되는지에 의해 좌우된다.
[446] 따라서, epoAT5 코딩 서열 (뉴클레오타이드 26793 내지 뉴클레오타이드 27833)은 epoAT2 (뉴클레오타이드 12251 내지 뉴클레오타이드 13287) 또는 FKAT2, 또는 tmbAT3 코딩 서열에 의해, 정션에서, 조작된 BglII (AGATCT) 및 NsiI(ATGCAT) 제한효소 인식 서열들로 치환된다.
주형으로서 플라스미드 pKOS39-118B를 이용하여 프라이머 TL11과 TL12로부터 제조된 PCR 단편을 벡터 LITMUS 28에 클로닝시켰ㄷ. 사용된 PCR 프라이머는 다음과 같다:
TL11 : 5'-GGATGCATCTCACCCCGCGAAGCG (SEQ ID NO:55) 및;
TL12 : 5'-GTACTAGTCAAGGGCGCTGCGGAGG (SEQ ID NO:56).
[447] 소망되는 삽입체를 함유하는 플라스미드를 DNA 시퀀싱에 의해 동정하였다. 이 플라스미드를 제한효소 NsiI과 XbaI으로 절단하고, 4.6 kb 단편을 분리하였다. 이 단편을 제한효소 BglII 및 XbaI으로 절단시킨 프라이머 Tl5 및 TL6 (이 실시예의 섹션 A에서 설명됨)으로부터 얻은 2.0 kb PCR 단편과, NsiI-BglII 제한효소 단편으로서 분리된 3개의 치환 AT 단편들 (FKAT2, epoAT2, tmbAT3) 중 하나와 접합시켜, 플라스미드 P6.1, P6.2 및 P6.3을 얻는다. 이들 후자의 3 플라스미드들을 kan-gal 카세트의 DraI 위치에서 삽입시킴으로써 변형시켰다. 얻어진 플라스미드를 본 발명의 에포틸론 생산 믹소코커스 잔투스 숙주 세포 (즉, K111-72.4.4)에 형질전환시키고, 세포를 배양하여 전술한 바와 같이 이중-크로스오버 재조합체 대해 선별하였다. 선별된 콜로니를 PCR에 의해 스크리닝하였다. 소망되는 재조합을 나타내는 콜로니들을 50mL 배양체로 배양하여 LC/MS에 의해 소망 생성물의 생산 여부를 스크리닝하였다. 기대된 화합물은 10-메틸-에포틸론 D 및 10-메틸-에포틸론 C로서 그 구조는 다음과 같다:
G. 14-메틸-에포틸론 유사체의 생산
[448] 익스텐더 모듈 3 AT 도메인 ("epoAT3")의 코딩 서열을 메틸말로닐 CoA 특이적인 AT 도메인의 코딩 서열로 대체시킴으로써 에포틸론 A, B, C 및 D의 14-메틸-에포틸론 유사체를 만들 수 있다. 따라서, 적절한 치환 AT 도메인 코딩 서열은 예컨대, FK520 PKS의 익스텐더 모듈 2; 에포틸론 PKS의 익스텐더 모듈 2("epoAT2"); 및 tmbA 유전자에 의해 코딩된 PKS의 익스텐더 모듈 3을 코딩하는 유전자로부터 얻을 수 있다. 이러한 치환은 일반적으로 상술한 바와 같이 수행되며, 생산된 특정 에포틸론은 단지 치환이 유도된믹소코커스숙주에 의해 어떤 에포틸론이 생산되는지에 의해 좌우된다.
[449] 따라서, epoAT3 코딩 서열 (뉴클레오타이드 17817 내지 뉴클레오타이드 18858)은 epoAT2 (뉴클레오타이드 12251 내지 뉴클레오타이드 13287) 또는 FKAT2, 또는 tmbAT3 코딩 서열에 의해, 정션에서, 조작된BglII (AGATCT) 및NsiI (ATGCAT) 제한효소 인식 서열들로 치환된다.
[450] 첫번째 PCR은 주형으로서 사용된 pKOS39-124 DNA로부터 ~1.8kb 단편을 만드는데 사용된다. 이 PCR 단편을XbaI 및BglII 위치에서 벡터 LITMUS 28에 클로닝시킨 다음 시퀀싱하였다; 소망되는 서열을 갖는 플라스미드를 P9으로 명명하였다. 이 PCR에 사용된 올리고뉴클레오타이드들은 다음과 같다:
TLII-'7 : 5'-GCAGATCTGCCGCGCGAGGAGCTCGCGAT (SEQ ID NO:57:) 및
TLII-8 : 5'-CATCTAGAGCCGCTCCTGTGGAGTCAC (SEQ ID NO:58).
[451] 두번째 PCR은 주형으로서 pKOS39-124 DNA를 사용하여 ~1.9 kb 단편을 만드는데 사용된다. 이 PCR 단편을NSiI 및SpeI 위치에서 벡터 LITMUS 28에 클로닝시킨 다음 시퀀싱하였다; 소망되는 서열을 갖는 플라스미드를 P10으로 명명하였다. 이 PCR에 사용된 올리고뉴클레오타이드들은 다음과 같다:
TLII-9B : 5'-GGATGCATGCGCCGGCCGAAGGGCTCGGAG (SEQ ID NO:59); 및
TLII-10 : 5'-GCACTAGTGATGGCGATCGGGTCCTCTGTCGC (SEQ ID NO:50).
[452] 플라스미드 P9을 제한효소BglII와SpeI으로 절단하고, 4.5 kb 단편을 분리하여, 플라스미드 P10으로부터의 ~1.9 kbNsiI-SpeI 제한효소 단편 및,NsiI-BglII 제한효소 단편으로서 분리된 3개의 치환 AT 단편들 (FKAT2, epoAT2, tmbAT3) 중 하나와 접합시켜, 플라스미드 P11.1, P11.2 및 P11.3을 얻는다. 이들 후자의 3 플라스미드들을kan-gal카세트의DraI 위치에서 삽입시킴으로써 변형시켰다. 얻어진 플라스미드를 본 발명의 에포틸론 생산믹소코커스 잔투스숙주 세포 (즉, K111-72.4.4)에 형질전환시키고, 세포를 배양하여 전술한 바와 같이 이중-크로스오버 재조합체 대해 선별하였다. 선별된 콜로니를 PCR에 의해 스크리닝하였다. 소망되는 재조합을 나타내는 콜로니들을 50mL 배양체로 배양하여 LC/MS에 의해 소망 생성물의 생산 여부를 스크리닝하였다. 기대된 화합물은 14-메틸-에포틸론 D 및 14-메틸-에포틸론 C로서 그 구조는 다음과 같다:
H. 10,11-데히드로-에포틸론 유사체의 생산
[453] 한가지 구체예에서, 본 발명은 신규한 에포틸론, 10,11-데히드로-에포틸론 D, 및 이 화합물을 생산하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 10,11-데히드로-에포틸론 D의 구조는 다음과 같다.
[454] 또 다른 구체예에서, 본 발명은 대응하응 에포틸론을 생산하는 에포틸론 PKS의 익스텐더 모듈 5의 ER 도메인을 불활성화시킴으로써 여하한 10,11-데히드로-에포틸론 유사체를 만들기 위한 방법을 제공한다.
[455] 또 다른 구체예에서는, 익스텐더 모듈 5의 에노일 리덕타제 (ER: enoyl reductase) 도메인을 불활성화시킴으로서 10,11-데히드로에포틸론 D를 생산하는 균주가 만들어진다. 한가지 구체예에서, ER 불활성화는 NADPH 결합 대역 중 2개의 글리신 (-Gly-Gly-)를 알라닌 및 세린 (-Ala-Ser-)으로 변경시킴으로써 달성된다. 위치 지향된 돌연변이를 위해, 플라스미드 pKOS39-118B로부터의 2.5 kb BbvCi-HindIII 단편 (코스미드 pKOS35-70.4로부터의 epoD 유전자의 서브클론)을 주형으로서 사용된 pTL7로서 pLitmus28에 클로닝시켰다. -Gly-Gly-로부터 -Ala-Ser-로의 돌연변이를 NADPH 결합 도메인에 도입하기 위한 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:
TLII-22, 5'-TGATCCATGCTGCGGCCG CTA GCGTGGGCATGGCCGC(SEQ ID NO:61).
TLII-23, 5'-GCGGCCATGCCCACGC TAG CGGCCGCAGCATGGATCA(SEQ ID NO:62).
[456] 치환체를 함유하는 PCR 클론을 시퀀싱에 의해 확인하고 제한효소DraI으로 절단한 다음 새우 알칼라인 포스파타제로 처리하였다. 이어서, 각각의 클론의 큰 단편을 카나마이신 내성 및galK유전자 (KG 또는kan-gal) 카세트에 접합시켜 전달 플라스미드를 만들었다. 이 전달 플라스미드를 이용하여 에포틸론 D 생산자믹소코커스 잔투스K111-72.4.4 또는 K111-40-1을 전기영동에 의해 형질전환시켰다. 형질전환체를 스크리닝하여 카나마이신-민감성, 갈락토스-내성 생존자를 선별하여 KG 유전자가 제거된 클론들을 동정하였다. KG 제거를 확인하고 재조합 균주에 의한 소망되는 유전자 치환을 PCR에 의해 수행하였다. 재조합 균주를 CTS 배지 (카지톤, 5 g/L; MgSo4, 2 g/L; L-알라닌, 1 mg/L; L-세린, 1 mg/L; 글리신, 1 mg/L; 및 HEPES 완충액, 50 mM) 50mL 및 2% XAD-16과 함꼐 플라스크 중에서 7일 동안 발효시키자, 10,11-데히드로-에포틸론 D가 10 mL 메탄올과 함께 XAD 수지로부터 용출되었다.
I. 발효에 의한 옥사졸-함유 에포틸론의 생산
[457] 한가지 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 에포틸론 생산 균주, 예컨대소란지움 셀룰로섬균주 또는믹소코커스균주를 L-세린이 보강된 배지에서 발효시킴으로써, 옥사졸 함유 에포틸론 (대응하는 에포틸론의 티아졸 부분이 옥사졸에 의해 치환됨)을 얻는 방법을 제공한다.
[458] 본 발명의 이 측면을 설명하기 위해, 뱃치 배지 (2.3mM) 중 L-세린이 기초 세린 농도의 11x, 51x, 101x 및 201x의 양으로 존재하도록 한 것을 제외하고,믹소코커스 잔투스균주 K111-40.1 또는 K111-72.4.4 배양체를 실시예 3의 방법에 따라 발효시켰다. 뱃치 배지-함유 50mL 배양체는 따라서: 20 g/L XAD-16; 5 g/L 카지톤; 2g/L MgSO4; 7 mL/L 메틸 올리에이트; 및 4mL/L 미랴 원소 용액을 함유하며, L-세린의 필터-멸균시킨 1.25M 용액을 적절한 농도로 첨가하였다. 기초 배지에서 관찰된 뱃치 타이터는 Epo C: 0.4 mg/L, Epo D: 2 mg/L, Epo H1 (옥사졸의 C 유사체)였다. 검출불능, 및 Epo H2 (옥사졸의 D 유사체); 0.02 mg/L. 세린 농도를 증가시키자 epoC 및 epoD 농도가 감소하였다 (51x 서플리멘테이션의 거의 검출불능 수준으로). 따라서, 기초 배지 중 L-세린의 51x 서플리멘테이션 중 뱃치 타이터는: Epo C: 0.03 mg/L, Epo D: 0.05 mg/L, Epo H1 : 0. 12 mg/L, 및 Epo H2 : 0. 13 mg/L였다. 페드-뱃치 프로토콜은 관찰된 타이터를 약 10배 증가시킬 수 있었다.
J. 에포틸론 유사체의 제조
[459] 한가지 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 에포틸론 PKS 효소에 의해 생산되는, (i) 익스텐더 모듈 1 NRPS의 특이성은 시스테인에서 다른 아미노산으로 변경되고; (ii) 로딩 도메인은 NRPS 또는 CoA 리가제로 변경되거나; 또는(iii) (i)과 (ii) 두가지 모두인 에포틸론 및 에포틸론 유도체를 제공한다. 이 실시예는 본 발명의 이러한 재조합 에포틸론 PKS 효소가 어떻게 제조되는지를 설명한다; 이 실시예에서 인용된 참조문헌은 본 실시예 말미에 기록되어 있으며, 인용분헌 숫자에 의해 참조표시된다.
[460] 에포틸론은 고리화된 아미노산 시스테인을 함유하며 산화되어 티아졸을 형성한다. 2개의 다른 아미노산인 세린과 쓰레오닌은 유사한 고리화와 산화를 수행하여, 각각 옥사졸 및 메틸옥사졸을 생산할 수 있다. 예컨대, 에포틸론 D의 옥사졸과 메틸옥사졸은 다음과 같다:
[461] 옥사졸이나 메틸옥사졸에 의한 에포틸론 유사체를 제조하기 위해, 익스텐더 모듈 1, NRPS 모듈을 조작할 수 있다. 성장하는 분자를 연장시키는 NRPS 모듈은 아미노산을 활성화시키는 도메인, 아데닐화 도메인, 아미노산을 NRPS에 묶어두는 PCP 또는 펩티딜 캐리어 단백질 도메인 및 아미노산을 성장하는 분자의 카르복실기에 축합시켜 펩티드 결합을 형성시키는 축합 도메인으로 최소한으로 구성된다 (5,7). 아미노산의 특이성을 결정하기 위한 인식 서열은 아데닐화 도메인, 특히, A4 및 A5 콘센서스 서열 사이에서 발견된다 (4). 이 대역을 분석하자 이 단백질 대역에서의 핵심 아미노산이, NRPS에 의해 어떤 아미노산이 이용될지를 예측할수 있음을 보여주었다 (2,8). 완전한 NRPS 아데닐화 대역을 다른 것으로 교환하는 실험을 수행하였는데, 이는 새로운 아데닐화 도메인의 아미노산 특이성을 갖는 하이브리드 NRPS를 결과시킨다 (6,9). A4 및 A5 콘센서스 서열 사이의 것과 같은, 아데닐화 대역의 보다 작은 대역을 이용하는 실험이 보고된 바 있다. 한가지 구체예에서,epoB로부터의 아데닐화 도메인의 A4와 A5 콘센서스 대역 사이의 대역을, 쓰레오닌을 이용하는vibF및blmVII로부터의 대역, 및 세린을 이용하는 블레오마이신 유전자 클러스터의blmVI로부터의 NRPS-4 대역으로 치환시킴으로써 본 발명의 하이브리드 PKS가 제작된다 (3).
[462] 최근의 실험은 PCP에 정확치 못한 아미노산이 부착될 경우 축합 도메인이 이를 검출해낼 지도 모른다는 것을 시사하고 있다 (1). 일단 올바르지 못한 아미노산이 검색되면 축합반응의 효율성이 떨어진다. 이를 피하기 위해, 아데닐화 도메인을 바꿔치기하는 것에 더해, 아데닐화 도메인의 특이성을 변경시키고, 완전히 활성적인 NRPS를 조작하기 위해 동원 (cognate) 축합 도메인을 가져올 수 있다.
[463] 본 발명은 또한, 에포틸론의 옥사졸 및 메틸옥사졸 형태의 16 데스메틸 유도체를 생산하는 재조합 에포틸론 PKS 효소도 제공한다. 이러한 효소는 익스텐더 모듈 2, epoC의 AT 도메인을 메틸말로닐 특이적으로부터 말로닐 특이적으로 변경시킴으로써 만들어진다. 이 구조물을 만드는데 사용가능한 AT 도메인은 에포틸론 클러스터의 익스텐더 모듈 5 및 9와 소라펜 (soraphen) 유전자 클러스터로부터의 익스텐더 모듈 2 및 4를 포함한다.
[464] 본 발명은 또한 EpoA 단백질이 NRPS에 의해 치환되어 있는 재조합 PKS효소도 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 효소에 의해 생산되는 신규한 에포틸론도 제공한다. 에포틸론 생합성은 로딩 모듈, EpoA의 ACP상에 말로네이트를 로딩함으로써 개시된다. 이 말로네이트는 KS 도메인에 의해 탈카르복실화된 다음 이어서 아세틸 부분으로서 EpoB, NRPS 모듈에 전달된다. 모듈이 EpoB에 의해 작용되면, 얻어진 화합물은 2-메틸티아졸이다.
[465] 티아졸의 2 위치에 부착된 아미노산을 갖는 유사체를 만들기 위해서는,epoA의 결실 및 NRPS 모듈의 삽입이 요구된다. 여하한 NRPS 모듈도 사용가능하다; 그러나, 가장 보존족인 변경을 달성하기 위해서는, 다운스트림 NRPS 모듈과 자연적으로 커뮤니케이트하는epoA를 치환시키는 NRPS 모듈을 사용할 수 있다. 뿌만 아니라, NRPS 치환epoA는 로딩 모듈이기 때문에, 축합 도메인도 필요로 하지 않는다. 이것은 익스텐더 NRPS 모듈을 취하고, 축합 도메인을 제거하거나, 자연적으로 로딩 모듈임으로 해서 축합 도메인이 결여된 NRPS를 사용함으로써 달성될 수 있다. 예시적인 NRPS 로딩 모듈은믹소코커스 잔투스로부터 유래되어, 알라닌을 이용하는safB으로부터의 것이다.
[466]epoA위치에safB로딩 모듈을 함유하는믹소코커스 잔투스균주를 제작함에 있어서, 새로운 모듈과epoB에 대한 최적 바운더리를 결정할 수 있다. PKS 단백질들 간의 링커 대역은 종종 이들 단백질들 사이의 "커뮤니케이션"에 있어 매우 중요하다. 최적 링커를 시험하기 위해 세가지 상이한 균주를 제작할 수 있다. 먼저,safB의 로딩 도메인의 아데닐화 도메인에 EpoA의 ACP 도메인을 융합시킨다. 이 구조물은 EpoA의 ACP가 PCP로서 작용할 것을 필요로 한다. 비록 PCP 및 ACP 도메인은 기능적으로 유사히는 하지만, 이들은 고도의 서열상동성을 나타내지느 않기 때문에, 이들이 인식 및 결합하는 것에 의해 제한될 수 있다. 두번째 구조물은 SafB 로딩 모듈의 PCP 도메인의 EpoA 다운스트림의 마지막 몇몇 아미노산을 융합시킴으로 해서, "커뮤니케이션"에 필요한 하이브리드 로디 모듈의 필요한 링커 대역을 EpoB에 제공한다. 마지막으로, SafB 로딩 모듈과 EpoB와의 융합물을 제조한다. SafB는 2개의 모듈로 구성되므로, SafB의 로딩 모듈을 모두 취하여, 이를 EpoB에 직접 융합시킴으로써 SafB 로딩 모듈과 EpoB 사이의 커뮤니케이션에 가장 적합한 융합 단백질이 제공된다.
[467] 일단 SafB 또는 기타 여하한 로딩 NRPS 도메인이 에포틸론의 티아졸 상의 2-메틸을 어떤 아미노산으로 치환시키는데 이용되면, 여하한 아미노산이든지 에포틸론 유사체의 합성을 개시하는데 이용될 수 있도록 새로운 로딩 NRPS에 변화가 일어날 수 있다. 이용가능한 아미노산의 리스트와 이러한 교환에 사용가능한 그의 대응하는 NRPS 모듈이 Challis 등의 (2)번 문헌에 제공되어 있다.
[468] 에포틸론 유전자를 함유하는믹소코커스 잔투스균주인 K111-32.25, 또는 에포틸론 유전자를 함유하며 epoK 유전자가 기능적인 생성물을 생산하지 않는 는믹소코커스 잔투스균주인 K111-40-1, 또는 본 발명의 기타 여하한 에포틸론 생산 균주 또는소란지움 셀룰로섬에서 모든 이러한 치환이 일어날 수 있다. 믹소코커스에서, 야생형 유전자를 유전자조작된 것으로 치환시키는데 사용되는,galK및 카나마이신 선택성을 이용하여, 적절한 구조물을 플라스미드에 만들 수 있다. 예컨대, K111-40-1에서 NRPS를 NRPS 특이적인 세린으로 치환시킬 경우 각각 주생성물및 부생성물로서 에포틸론 D의 2-메틸-옥사졸 유도체와 에포틸론 C의 2-메틸-옥사졸 유도체가 생산될 것으로 기대된다. 이 화합물들의 구조는 다음과 같다:
[469] K111-40-1에서 NRPS를 NRPS 특이적인 쓰레오닌으로 치환시킬 경우 각각 다음의 화합물들이 주생성물 및 부생성물로 생산될 것으로 기대된다:
[470] K111-40-1의 NRPS를 글리신, 알라닌, 글루탄산, 아스파르트산, 페닐알라닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 발린, 및 티로신 특이적인 NRPS로 치환시키면 주생성물과 부생성물로서 다음의 화합물이 만들어질 것으로 예상된다:
식 중, R'은 아미노산 중 특이적인 측쇄에 해당한다 (예컨대, 일반적인 아미노산 식 NH2-CHR'COOH에서 글리신의 경우 R'은 H, 알라닌의 경우에는 메틸, 이런 식이다).
[471] K111-40-1의 NRPS를 프롤린에 특이적인 NRPS로 치환시킬 경우 다음의 주생성물과 부생성물이 만들어질 것으로 예상된다:
[472] 이 서브섹션에 인용된 문헌들은 다음과 같다.
[473]1. Belshaw 외 1999. Aminoacyl-CoAs as probes of condensation domain selectivity in nonribosomal peptide synthesis Science. 284 : 486-9.
[474] 2. Challis 외 2000. Predictive, structure-based model of amino acid recognition by nonribosomal peptide synthetase adenylation domains Chem Biol. 7 : 211-24.
[475] 3. Du 외 2000. The biosynthetic gene cluster for the antitumor drug bleomycin from Streptomyces verticillus ATCC15003 supporting functional interactions between nonribosomal peptide synthetases and a polyketide synthase Chem Biol. 7 : 623-42.
[476] 4. Konz 외 1999. How do peptide synthetases generate structural diversity ? Chem Biol. 6 : R39-48.
[477] 5. Marahiel 외 1997. Modular peptide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis Chem. Rev. 97 : 2651-2673.
[478] 6. Schneider 외 1998. Targeted alteration of the substrate specificity of peptide synthetases by rational module swapping Mol Gen Genet. 257 : 308-18.
[479] 7. Stachelhaus 외 1995. Modular structure of peptide synthetases revealed by dissection of the multifunctional enzyme GrsA J Biol Chem. 270 : 61639.
[480] 8. Stachelhaus 외 1999. The specificity-conferring code of adenylation domains in nonribosomal peptide synthetases Chem Biol. 6 : 493-505.
[481] 9. Stachelhaus 외 1995. Rational design of peptide antibiotics by targeted replacement of bacterial and fungal domains Science. 269 : 69-72.
실시예 12
생물학적 활성
[482] 10,11-데히드로에포틸론 D를 설포로다민 B (SRB) 분석을 이용하여 4가지 서로 다른 인간 종양 세포주에서의 항암 활성에 대해 스크리닝하였다. 10,11-데히드로에포틸론 D는 28nM 내지 40nM 범위에서 IC50s의 저해효과로 네가지 세포주 모두에 대해 저해활성을 나타내었다. 작용 메카니즘은 세포-기초 튜불린 중합에 의해측정하였는데, 이것은 이 화합물이 튜불린 중합을 촉진한다는 것을 밝혀내었다. 인간 암 세포주 MCF-7 (유방), NCI/ADR-Res (유방, MDR), SF-268 (글리오마), NCI-H460 (폐)를 National Cancer Institute로부터 얻었다. 이 세포들을 10% 소의 태아 혈청 (Hyclone)과 2mM L-글루타민이 보강된 RPMI 1640 배지 (Life Technology) 중, 37℃의 5% CO2-습한 분위기에서 유지시켰다.
[483] 10,11-데히드로에포틸론 D의 세포독성을 SRB 분석에 의해 측정하였다 (Skehan외,J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112 (1990) - 본문에 참조삽입됨). 배양된 세포들을 트립신화시켜, 계수하고 배지를 이용하여 100 μL 당 다음의 농도로 희석시켰다: MCF-7, 5000; NCI/ADR-Res, 7500; NCI-H460, 5000; 및 SF-268, 7500. 세포들을 96-웰 마이크로타이터 플레이트 중 100μ L/웰로 접종하였다. 20시간 후, 10,11-데히드로에포틸론 D (배양 배지 배지 중, 1000nM 내지 0.001 nM) 100μL을 각각의 웰에 첨가하였다. 3일간 화합물과 함께 인큐베이션시킨 후, 세포들을 10% 트리클로린산 ("TCA") 100 μL과 함께 4 에서 1시간 동안 고정시킨 다음, 실온에서 20분동안, 0.2% SRB/1% 아세트산으로 염색시켰다. 결합되지 않은 염료를 1% 아세트산으로 헹궈낸 다음, 결합된 SRB를 10mM Tris 염기 200 μL를 이용하여 추출하였다. 결합된 염료의 양은 OD 515nm에서 측정하였아며, 이것은 총 세포 단백질 함량과 관계된다. 이어서 Kaleida Graph 프로그램을 이용하여 데이터를 분석하고, IC50을 계산하였다. 화학적으로 합성된 에포틸론 D를 서로 비교하면서 테스트하였다.
[484] 튜불린 중합 분석을 위해, MCF-7 세포를 35 mm-배양체 접시에서 조밀해질 때까지 배양시킨 다음 37℃에서 1 μM의 10,11-데히드로에포틸론 D 또는 에포틸론 D로 0,1 또는 2시간 동안 처리하였다. (Giannakakou외,J. Biol. Chem. 271: 17118-17125 (1997);Int. J. Cancer75: 57-63 (1998) 본문에 참조됨). 칼슘 또는 마그네슘 없이 2mL의 PBS를 이용하여 세포를 세척한 다음, 세포들을 실온에서 300 μL의 용해 완충액 (20mM Tris, pH 6.8, 1mM MgCl2,2mM EGTA, 1% Triton X-100, 플러스 프로테아제 억제제)과 함께 5-10분간 용해시켰다. 세포들을 스크레이핑시키고 용해물 (lysates)을 1.5 ml 에펜도르프 튜브내로 옮겼다. 용해물을 18000 g에서 12분간 실온에서 원심분리시켰다. 가용성 또는 중합되지 dskg은 (cytosolic) 튜불린을 함유하는 상등액을 불용성 또는 중합된 (cytoskeletal) 튜불린을 함유하는 펠릿으로부터 분리하여 새로운 시험관으로 옮겼다. 이어서 300 μL의 용해 완충액 중에 펠릿들을 재현탁시켰다. 세포 중 튜불린 중합 변화는 각 샘플의 동부피의 분주액을 SDS-PAGE로 분석한 다음, 항-튜불린 항체 (Sigma)를 이용하여 면역블롯팅시킴으로써 측정하였다.
[485] 몇몇 실험 결과 10,11-데히드로에포틸론 D ("Epo490"으로 명명함)는 4가지 상이한 인간 종양 세포주에 대해 28 nM 내지 40 nM 범위의 IC50을 갖는다.
세포주 EpoD (nM) Epo490 (nM)
N=3 N=2
MCF- 21 ±10 28 ±8
NCI/ADR 40 ±12 35 ±9
SF-268 34 ±8 40 ±5
NCI-H460 30 ±2 34 ±1
불린 중합 분석결과 10,11-데히드로에포틸론 D는 에포틸론 D와 동일한 작용 메카니즘을 갖는 것으로 드러났다. MCF-7 세포에서, 10,11-데히드로에포틸론 D는 시험된 조건에서 에포틸론과 유사한 키네틱과 효과로 튜불린 중합을 강력하게 촉진시켰다. 본 발명의 다른 화합물들도 본 발명의 화합물을 10,11-데히드로에포틸론 D로 치환시킴으로써 유사한 방식으로 테스트할 수 있다.
실시예 13
옥사졸 유도체
[486] 이 실시예는 발효 조건을 이용하여 숙주 세포에 의해 생산된 에포틸론 화합물 종류를 변형시키는 것을 설명한다. 숙주세포에 과량의 세린을 보강함으로써, 숙주세포에 의해 일반적으로 생산되는 화합물들을 옥사졸 대응물을 생산하기 좋은 방식으로 변형시킨다. 예컨대, 화학식 V의 화합물 또는 화합물들을 주로 생산하는 세포들을 화학식 VI의 화합물에 대응하는 옥사졸 대응 화합물을 생산하기 좋도록 만들 수 있다.
[487] 한가지 구체예에서, 에포틸론 C와 D를 주로 생산하는 균주인믹소코커스 잔투스균주인 K111-40-1을, 에포틸론 C와 D의 옥사졸 대응화합물인 에포틸론 H1과 H2의 생산을 유의적으로 증가시키도록 만들 수 있다. 균주 K111-40-1 (PTA-2712)을 American Type Culture Collection ("ATCC"), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110-2209 USA에 2000년 11월 21일 기탁하였다. 균주 K111-40-1을 부가적인 세린이 보강되거나 보강되지 않은 배지에서 배양시켰다. 보강되지 않은 배지 중에서의 성분들의 최종농도는 다음과 같았다: 가수분해된 카제인 (췌장 소화물, Difco사가 Casitone이라는 브랜드명으로 시판함0, 5g/L; MgSO4·7H2O, 2g/L; XAD-16, 20g/L; 미량원소 용액 4mL/L; 메틸 올리에이트 7 ml/L; 및 Hepes 완충액, 40mM (KOH를 이용하여 pH 7.6으로 적정). 미량원소 용액은 다음을 포함한다: 진한황산 H2SO4, 10mL/L; FeCl3·6H2O, 14.6 g/L; ZnCl22.0g/L; MnCl2·4H2O, 1.0g/L; CuCl2·2H2O, 0.42g/L; H2BO3, 0.31g/L; CaCl2·6H2O 0.24 g/L; 및 Na2MoO4·2H2O 0.24g/L. 세린의 기초 농도는 4.82% w/w로 취해졌으며, 이 값은, 특정 로트의 Casitone의 Difco' 아미노산 분석에 의해 측정된 값이다. 결과적으로, 기초 세린 농도는 2.3mM이었으며, 이 값은 평균 5g/L의 Casitone의 최종 농도로부터 계산된 것이다. 세린 보강된 배지는 50배 더 높은 세린, 즉 117mM를 함유하였다.
[488] 세포들을 30℃에서 120시간 동안 250rpm의 코핀 진탕기에서 배양하였다. 발효가 진행동안 세포균주가 생산한 화합물들을 수지를 포획함으로써 추출하고, 물에 수지를 한번 세척하고, 20 mL의 메탄올 중에서 30분 동안 수지 중의 화합물을 추출하였다. 샘플을 HPLC 및 질량 스펙트로스코피를 이용하여 분석하였다.
[489] 세포에 의해 생산된 화합물의 분석결과, 세린 농도를 50배 증가시키자 세린이 보강되지 않은 배지에서 배양된 세포에 의해 생산된 양보다, 에포틸론 H1 생산은 30배 증가되고 (0.12 mg/L), 에포틸론 H2의 생산은 5배 증가한 것으로 나타났다. 주목할 것은 세포가 에포틸론 C와 D를 거의 검색불가능한 양으로 생산했다는 것이다 (<50 μg/L).
[490] 세린 공급에 의해 옥사졸-함유 화합물의 증가와 티아졸-화합물의 감소가 동시에 일어남으로 해서, 정상적으로라면 티아졸-함유 대응화합물을 생산했을 숙주세포로부터 옥사졸 화합물을 생산하는 방법이 제공되었다. 예컨대, 9-옥소 에포틸론 D를 만들기 위한 재조합체 (실시예 11의 서브파트 C에 설명됨)는 9-옥소-에포틸론 D의 옥사졸-대응화합물인 17-데스(2-메틸-4-티아졸)-17-(2-메틸-4-옥사졸릴)-9-옥소-에포틸론 D를 만들기 위한 것과 유사한 조건에서 배양될 수 있다. 마찬가지로, 실시예 11에 의해 설명된 것들을 비롯한 본 발명의 다른 재조합 구조물도 과량의 세린 공급과 함께 배양되어, 대응하는 옥사졸 화합물을 생산할 수 있다.
실시예 14
C-21 메틸로부터 C-21 히드록시메틸로의 미생물에 의한 형질전환
[491] 이 실시예는 Ar이 다음과 같은 화학식 I의 화합물의 C-21메틸로부터 C-21히드록시메틸의 미생물에 의한 형질전환을 설명한다:
PCT 공개 No. WO 00/39276에 설명된 바와 같이아미콜라타 아우토트로피카(Amycollata autotrophica) ATCC 35203 또는악티노마이세스sp. 균주 PTA-XXX의 동결 바이알 (약 2ml)을 이용하여 배지 100mL를 함유하는 1500mL 플라스크에 접종하였다. 영양 배지는 탈이온수 1 리터 당 덱스트로스 10g, 말트 추출물 10g, 효모 추출물 10g, 및 펩톤 1g으로 이루어져있다. 영양 배양체를 250 rpm에서 작동하는 회전 진탕기상, 28℃에서 3일간 인큐베이션시켰다. 결과적인 배양체 1mL를 영양 배지와 동일한 조성을 갖는 형질전환 배지를 함유하는 각각의 62개의 500mL 플라스크에 첨가하였다. 배양체를 28℃, 250rpm에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 본 발명의 적절한 화합물을 에탄올 155 mL에 용해시키고에탄올 155mL에 용해시키고 용액을 62개의 플라스크에 나눠 담았다. 이어서 이 플라스크를 진탕기에 다시 놓고 28℃, 250 rpm에서 43시간 더 인큐베이션시켰다. 이어서 반응 배양체를 프로세싱시켜 출발 화합물의 21-히드록시 대응화합물을 회수하였다.
실시예 15
EpoK를 이용한 에폭시화
[492] 이 실시예는 R8과 R10이 함께 탄소탄소 이중결합을 형성하는 화학식 I의 화합물 (본 발명의 데속시 화합물)의 효소적 에폭시화를 설명한다. 본문에 참조된 PCT 공개 WO00/31247에 설명된 바와 같이, 폴리히스티딘 tag (his tag)을 이용하여E. coli에서epoK유전자 산물을 융합 단백질로서 발현시킨 다음 정제시켰다. 반응물은 100 μL부피 중, 50mM Tris (pH7.5), 21 M 시금치 페레독신, 시금치 페레독신 0.132 유닛: NADP+옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 0.8 유닛, 1.4mM NADP, 및 7.1mM 글루코스-6-포스페이트, 본 발명의 100 μM 또는 200 μM 데속시 화합물, 및 1.7 μM 아미노 말단 히스티딘 표지된 EpoK 또는 1.6 μM 카르복시 말단 히스티딘 표지된 EpoK로 이루어져있다. 반응물을 30℃에서 67분간 인큐베이션시킨 다음 90℃에서 2분간 가열시킴으로써 반응을 정지시켰다. 불용성 물질을 원심분리에 의해 제거하고, 소망되는 생성물을 함유하는 상등액 50 μL을 LC/MS로 분석하였다.
실시예 16
화학적 에폭시화
[493] 이 실시예는 R8과 R10이 함께 탄소탄소 이중결합을 형성하는 화학식 I의 화합물 (본 발명의 데속시 화합물)의 화학적 에폭시화를 설명한다. 디메틸디옥시란 용액 (아세톤 중 0.1M, 17mL)을 -78 에서 CH2Cl210mL 중 본 발명의 데속시 화합물 용액에 적가하였다. 이 혼합물을 -50℃로 승온시키고, 1시간 동안 유지시킨 다음, 디메틸디옥시란 용액 (5mL)을 더 첨가하고, -50℃에서 다시 1.5시간 동안 반응을 계속시켰다. 이어서, 반응물을 -50℃에서 N2기류하에서 건조시켰다. 생성물을 SiO2상에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
실시예 17
( 3S,6R,7S,8R,12R,13S,15S,16E )-15-아미노-3,7-디히드록시-5,9-디옥소-12,13-에폭시-4,4,6,8,12,16-헥사메틸-17-(2-메틸티아졸-4-일)-16-헵타데카노산
[494] 제 1 단계.9-옥소에포틸론 B. -78℃에서 CH2Cl2 10mL 중 9-옥소에포틸론 D (505 mg) 용액에 디메틸디옥시란 용액을 (아세톤, 17mL 중 0.1M) 적가하였다. 혼합물을 -50℃로 승온시키고, 1시간 유지시킨 다음 디메틸디옥시란 용액(5mL)을 더 첨가하고 반응을 -50℃에서 1.5시간 동안 계속시켰다. 이어서 반응물을 -50℃에서 N2기류하에서 건조시켰다. 생성물을 SiO2상에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
[495] 제 2 단계. (3S,6R,7S,8R,12R,13S,15S,16E)-15-아지도-3,7-디히드록시 -5,9-디옥소-12,13-에폭시-4,4,6,8,12,16-헥사메틸-17-(2-메틸티아졸-4-일)-16-헵타데카노산.
탈기시킨 테트라히드로퓨란/물 (10:1 v/v) 55 mL 중 9-옥소에포틸론 B (2.62g)과 소듐 아자이드 (0.49g)의 용액을 아르곤 분위기 하, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0.58g)으로 처리하였다. 이 혼합물을 45℃에서 1시간 동안 유지시킨 다음, 물 50mL로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 식염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시킨 다음, 여과 및 증발시켰다. 이 생성물을 SiO2상에서 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
[496] 제 3 단계. (3S,6R,7S,8R,12R,13S,15S,16E)-15-아미노-3,7-디히드록시 -5,9-디옥소-12,13-에폭시-4,4,6,8,12,16-헥사메틸-17-(2-메틸티아졸-4-일)-16-헵타데카노산. 15mL THF/물 (10:1 v/v) 중 (3S,6R,7S,8R,12R,13S,15S,16E)-15-아지도 -3,7-디히드록시-5,9-디옥소-12,13-에폭시-4,4,6,8,12,16-헥사메틸-17-(2-메틸티아졸-4-일)-16-헵타데카노산 (565 mg) 용액을 아르곤 하, 주변 온도에서 톨루엔 (3mL) 중 트리메틸포스핀 1.0M 용액으로 처리하였다. 이 혼합물을 농축시킨 다음, 생성물을 SiO2상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
실시예 18
( 4S,7R,8S,9R,13R,14S,16S )-13,14-에폭시-4,8-디히드록시-2,6,10-트리옥소-5,5,7,9,13-펜타메틸-16-(1-(2-메틸티아졸-4-일)프로펜-2-일)-1-아자-11-시클로헥사데센
[497] 아세토니트릴/디메틸포름아미드 (20:1 v/v, 150 mL) 중 (3S,6R,7S, 8R,12R,13S,15S,16E)-15-아미노-3,7-디히드록시-5,9-디옥소-12,13-에폭시-4,4,6,8, 12,16-헥사메틸-17-(2-메틸티아졸-4-일)-16-헵타데카노산 (540mg)의 용액을 0℃로 냉각시키고, 1-히드로시벤조트리아졸 (0.135g)과 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염 (0.5g) 으로 순차적으로 처리하였다. 이 혼합물을 주변온도로 승온시키고 12시간 동안 유지시킨 다음 물로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이 추출물을 물, 포화 NaHCO3및 식염수로 순차적으로 세정한 다음, Na2SO4로 건조시킨 다음, 여과시키고, 증발시켰다. 이 생성물을 SiO2상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
실시예 19
( 4S,7R,8S,9R,13Z,16S )-4,8-디히드록시-2,6,10-트리옥소-5,5,7,9,13-펜타메틸-16-(1-(2-메틸티아졸-4-일)프로펜-2-일)-1-아자-11-시클로헥사데센
[498] 78℃에서 테트라히드로퓨란 (20mL) 중 텅스텐 헥사클로라이드 (0.76g) 용액을 헥산 (2.5mL) 중 n-부틸리튬 1.6M 용액으로 처리하였다. 이 혼합물을 주변온도로 20분간 승온시켰다. 얻어진 녹색 용액 13.8mL 부분을 주변온도에서 2mL 테트라히드로퓨란 중 (4S,7R,8S,9R,13R,14S,16S)-4,8-디히드록시-13,14-에폭시-2,6,10-트리옥소-5,5,7,9,13-펜타메틸-16-(1-(2-메틸티아졸-4-일)프로펜-2-일)-1-아자-11-시클로헥사데센 (360mg) 용액에 첨가하였다. 30분 후, 물로 희석시키고 CH2Cl2로 추출하였다. 이 추출물을 Na2SO4로 건조시킨 다음, 여과시키고, 증발시켰다. 생성물을 SiO2상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
실시예 20
( 4S,7R,8S,9R,13R,14S,16S )-13,14-에폭시-4,8-디히드록시-2,6,10-트리옥소-1,5,5,7,9,13-헥사메틸-16-(1-(2-메틸티아졸-4-일)프로펜-2-일)-1-아자-11-시클로헥사데센
[499] 제 1 단계. (3S,6R,7S,8R,12R,13S,15S,16E)-3,7-디히드록시-5,9-디옥시-12,13-에폭시-4,4,6,8,12,16-헥사메틸-15-(메틸아미노)-17-(2-메틸티아졸-4-일)-16-헵타데카노산. 10mL 메탄올 중, (3S,6R,7S,8R,12R,13S,15S,16E)-15-아미노-3,7-디히드록시-5,9-디옥시-12,13-에폭시-4,4,6,8,12,16-헥사메틸-17-(2-메틸티아졸-4-일)-16-헵타데세노산 (540 mg)을 37% 수성 포름알데히드 (1mL), 아세트산 (25 L), 및 소듐 시아노보로하이드라이드 (100mg)으로 처리하였다. 1시간 후, 혼합물을 1N HCl로 처리한 다음 에틸 아세테이트와 물로 희석하였다. 수성상을 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기상을 결합시킨 다음, Na2SO4로 건조시킨 다음, 여과 및 증발시켰다. 생성물을 SiO2상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
[500] 제 2 단계. (4S,7R,8S,9R,13R,14S,16S)-13,14-에폭시-4,8-디히드록시-2,6,10-트리옥소-1,5,5,7,9,13-헥사메틸-16-(1-(2-메틸티아졸-4-일)프로펜-2-일)-1-아자-11-시클로헥사데센. 아세토니트릴/디메틸포름아미드 (20:1 v/v, 150 mL) 중 (3S,6R,7S,8R,12R,13S,15S,16E)-3,7-디히드록시-5,9-디옥소-12,13-에폭시-4,4,6,8, 12,16-헥사메틸-15-(메틸아미노)-17-(2-메틸티아졸-4-일)-16-헵타데세노산 (554 mg) 용액을 0℃로 냉각시키고, 1-히드록시벤조트리아졸 (0.135g)과 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염 (0.5g)으로 순차적으로 처리하였다. 혼합물을 12시간동안 주변 온도로 승온시킨 다음, 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 물, 포화 NaHCO3, 및 식염수로 순차적으로 세척한 다음, Na2SO4로 건조시키고, 여과 및 증발시켰다. 생성물을 SiO2상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
실시예 21
( 4S,7R,8S,9R,13Z,16S )-4,8-디히드록시-2,6,10-트리옥소-1,5,5,7,9,13-헥사메틸-16-(1-(2-메틸티아졸-4-일)프로펜-2-일)-1-아자-11-시클로헥사데센
[501] 테트라히드로퓨란 (20mL) 중 텅스텐 헥사클로라이드 (0.76g) 용액을 78℃에서 헥산 (2.5mL) 중 n-부틸리튬 1.6M으로 처리하였다. 이 혼합물을 20분간 실온으로 승온시켰다. 얻어진 녹색 용액 13.8mL 부분을, 주변온도에서 테트라히드로퓨란 2mL 중 (4S,7R,8S,9R,13R,14S,16S)-13,14-에폭시-4,8-디히드록시-2,6,10-트리옥소-1,5,5,7,9,13-헥사메틸-16-(1-(2-메틸티아졸-4-일)프로펜-2-일)-1-아자-11-시클로헥사데센 (370mg)에 첨가하였다. 30분 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고, 포화 NaHCO3(10mL)으로 처리하였다. 이 혼합물을 물로 희석하고 CH2Cl2로 추출하였다. 추출물을 Na2SO4로 건조시킨 다음, 여과시키고, 증발시켰다. 이 생성물을 SiO2상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
실시예 22
리포좀 조성물
[502] 이 실시예는 9-옥소-에포틸론을 함유하는 리포좀 조성물 (liposomalcomposition)을 설명한다. 지질 및 9-옥소-에포틸론 D의 혼합물을 에탄올에 용해시킨 다음 이 용액을 감압하에 회전시켜 박막으로서 건조시켰다. 얻어진 지질 필름을 수성상 첨가에 의해 수화시키고, 리포좀을 함유하는 에포틸론-유도체의 입자 크기를 소망 범위로 조정하였다. 바람직하게는 평균 입자 직경이 10 마이크론 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 4 마이크론인 것이 좋다. 입자 크기는 예컨대, 밀 (예컨대 에어-제트 밀, 볼밀, 또는 바이브레이터 밀), 미세침전, 스프레이-건조, 동결건조, 고압 균질화, 초결정 용매로부터의 재결정화에 의해, 또는 리포좀의 수성 현탁액을 소정의 균일한 포어 크기를 갖는 일련의 막 (예컨대 폴리카보네이트 막)을 통해 사출시킴으로써, 원하는 수준으로 감소시킬 수 있다. 한가지 구체예에서, 리포좀 조성물은 다음을 함유한다: 본 발명의 화합물 (1.00mg); 포스파티딜콜린 (16.25mg); 콜레스테롤 (3.75mg); 폴리에틸렌글리콜 유도된 디스테아릴 포스파티딜에탄올아민 (5.00mg); 락토스 (80.00mg); 시트르산 (4.20mg); 타르타르산 (6.00mg); NaOH (5.44mg); 물 (1 mL 되는 양). 또 다른 구체예에서, 리포좀 조성물은 다음을 포함한다: 본 발명 화합물 (1.00mg); 포스파티딜콜린 (19.80mg); 콜레스테롤 (3.75mg); 디스테아릴 포스파티딜콜린 (1.45mg); 락토스 (80.00mg); 시트르산 (4.20mg); 타르타르산 (6.00mg); NaOH (5.44mg); 물 (1 mL 되는 양). 또 다른 구체예에서, 리포좀 조성물은 다음을 함유한다: 본 발명 화합물 (1.00mg); 1-팔미토일-2-올레인-sn-글리세로-3-포스포콜린 (17.50mg); 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤, Na(7.50mg); 락토스 (80.mg); 시트르산 (4.20mg); 타르타르산 (6.00mg); NaOH (5.44mg); 물 (1 mL 되는 양). 본 발명의 다른 화합물들을 함유하는 조성물은 상기한 것과 유사한 조건을 이용하여 제조한다.
실시예 23
폴리글루탐산 콘쥬게이트
[503] 이 실시예는 폴리-글루탐산-21-히드록시-9-옥소-에포틸론 D 콘쥬게이트의 제조방법을 설명한다. 폴리(1-글루탐산) ("PG") 나트륨염 (MW 34K, Sigma, 0.35g)을 물에 용해시켰다. 수용액의 pH를 0.2M HCl을 이용하여 2로 조정하였다. 침전물을 모아, 증류수로 투석하고, 동결건조시켜 0.29g의 PG를 얻었다. 건조 DMF (1.5mL) 중 이 PG 용액 (75mg, 반복 단위 FW 170, 0.44mmol)에 21-히드록시-9-옥소-에포틸론 D를 20mg 넣고, 디시클로헥실카르보디이미드 ("DCC") 15mg과 디메틸아미노피리딘 흔적량을 첨가하였다. 실온에서 4시간 동안, 또는 박막 크로마토그래피에 의해 반응이 완결된 것으로 나타날 때까지 반응을 진행시켰다. 반응 혼합물을 클로로포름에 넣고 결과적인 침전물을 수집하여 진공건조시켜 PG-21-히드록시-9-옥소-에포틸론 D 콘쥬게이트 약 65mg을 얻었다. 출발물질 중 본 발명의 화합물 대 PG의 중량비율을 변화시켜 여러가지 농도의 21-히드록시-10,11-데히드로에포틸론 D를 폴리머 콘쥬게이트로서 얻었다. 본 발명의 다른 화합물의 콘쥬게이트를 상기한 것과 유사한 조건을 이용하여 제조한다.
실시예 24
정맥용 조성물
[504] 이 실시예는 9-옥소-에포틸론 D의 정맥용 조성물을 설명한다. 이 조성물은 30% 프로필렌 글리콜, 20% Creomophor EL, 및 50% 에탄올을 함유하는 비히클중에 9-옥소-에포틸론 D를 10mg/mL 함유한다. 비히클은 에탄올 (591.8g)을 교반 막대가 들어있는 비이커로 칭량하여; Creomophor El (315.0g)을 이 용액에 첨가하여 10분간 혼합한 다음; 프로필렌 글리콜 (466.2g)을 용액에 첨가하고 다시 10분간 혼합함으로써 제조한다. 9-옥소-에포틸론 D (1g)을 비히클 400-600mL를 함유하는 1L의 볼륨 플라스크에 넣고 5분간 혼합하였다. 10,11-데히드로에포틸론을 용액에 넣은 후, 부피를 1L로 하고; 다시 10분간 혼합한 다음 0.22μm Millipore Millipak 필터를 통해 여과하였다. 얻어진 용액을 이용하여 계측기가 달린 페리스탈틱 펌프를 이용해서 멸균된 5mL 바이알에 5.15mL/바이알이 되는 부피로 바이알을 충전시켰다. 충전된 바이알을 즉시 스토포링 및 크림프시켰다.
[505] 환자에게 투여될 수 있도록, 9-옥소-에포틸론 D를 10mg/mL 함유하는 이 바이알을 일반식염수 또는 5% 덱스트로스 용액에 희석하여 비-PVC, 비-DEHP 백에 넣어 투여세트로 만들었다. 생성물을 1 내지 6시간 동안의 기간동안 원하는 투여량이 전달되도록 주입시켰다.
[506] 한가지 구체예에서, 본 발명의 조성물을 정맥 주사에 앞서, 멸균식염수로 20배 희석하였다. 최종 주입 농도는 본 발명 화합물 0.5mg/mL, 프로필렌글리콜 1.5%, Chremophor EL 1%, 및 에탄올 2.5%였으며, 이를 원하는 투여량이 전달되도록 1 내지 6시간 동안 주입하였다.
[507] 본 발명의 다른 화합물들을 함유하는 정맥용 조성물도 이와 유사한 방식으로 제조하여 이용할 수 있다.
실시예 25
Cremophor 독성의 전처리
[508] 이 실시예는 Cremophor독성을 전처리하는 방법을 설명한다. Cremophor를 함유하는 본 발명 화합물의 조성물은 환자에게 독성을 일으킬 수 있다. 아나필락시스를 방지하기 위해 스테로이드를 이용한 전처리를 이용하였다. 여하한 적절한 코르티코스테로이드 또는 코르티코스테로이드와 H1안타고니스트 및/또는 H2안타고니스트와의 복합체가 이용가능하다. 한가지 구체예에서, Cremophor를 함유하는 조성물 중의 본 발명 화합물로 치료하기 1시간 전에, 환자에게 디페닐히드라민 50mg과 시메티딘 300mg을 경구투여한다. 또 다른 구체예에서는, Cremophor를 함유하는 조성물 중의 본 발명 화합물로 치료하기 적어도 1시간 반 전에, 환자에게 덱사메타손 20mg을 미리 정맥투여한다. 또 다른 구체예에서는, Cremophor를 함유하는 조성물 중의 본 발명 화합물로 치료하기 적어도 1시간 반 전에, 환자에게 디페닐히드라민 50mg, 시메티딘 300mg 및 덱사메타손 20mg을 미리 정맥 투여한다. 또 다른 구체예에서, Cremophor를 함유하는 조성물 중의 본 발명 화합물로 치료하기 적어도 1시간 반 전에, 환자의 체중을 고려하여 환자에게 디페닐히드라민 (5mg/kg, i.v.); 시메티딘 (5mg/kg, i.v.); 및 덱사메타손 (1mg/kg, i.m.)을 투여하였다.
[509] 본문에 인용된 모든 과학문헌 및 특허기술문헌이 본문에 참조되었다. 본 발명을 이제까지 실시예와 상세한 설명에 의해 설명하였으나, 당업자라면 전술한 상세한 설명과 실시예는 첨부된 특허청구범위를 한정함이 없이 어디까지나 설명목적을 위해 제시된 것임과, 그 외에도 여러가지 구체예가 가능함을 이해할 것이다.

Claims (47)

  1. 이종 폴리케타이드 신타제 (PKS: polyketide synthase) 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 함유하며, 상기 벡터에 코딩된 PKS 효소에 의해 합성되는 폴리케타이드를 생산하는,시스토박테리네아에(Cystobacterineae) 아목의 재조합 숙주 세포.
  2. 제 1항에 있어서,믹소코카세아에 (Myxococcaceae)과로부터 선택된 숙주 세포.
  3. 제 1항에 있어서,시스토박테라세아에 (Cystobacteraceae)과로부터 선택된 숙주 세포.
  4. 제 2항에 있어서,안지오코커스 (Angiococcus), 믹소코커스 (Myxococcus) 및코랄로코커스 (Corallococcus) 중에서 선택된 속으로부터 선택된 숙주 세포.
  5. 제 3항에 있어서,시스토박터 (Cystobacter), 멜티탄지움 (Melittangium), 스티그마텔라 (Stigmatella), 및아르칸지움 (Archangium) 중에서 선택된 속으로부터 선택된 숙주 세포.
  6. 제 4항에 있어서,믹소코커스 (Myxococcus) 속으로부터 선택된 숙주 세포.
  7. 제 5항에 있어서,스티그마텔라 (Stigmatella) 속으로부터 선택된 숙주 세포.
  8. 제 6항에 있어서,믹소코커스 스티피타투스 (Myxococcus stipitatus), 믹소코커스 풀부스 (Myxococcus fulvus), 믹소코커스 잔투스 (Myxocuccus xanthus), 및믹소코커스 비레센스 (Myxococcus virescens) 중에서 선택된 숙주 세포.
  9. 제 7항에 있어서,스티그마텔라 에렉타 (Stigmatella erecta) 및스티그마텔라 아우란티아카 (Stigmatella aurantiaca) 중에서 선택된 숙주 세포.
  10. 제 8항에 있어서,믹소코커스 잔투스 (Myxocuccus xanthus)인 숙주 세포.
  11. 자연적으로는 폴리케타이드를 생산하지 않는시스토박테리네아에 (Cystobacterineae) 아목의 숙주 세포에서 폴리케타이드를 생산하는 방법으로서, 제 1항의 숙주 세포를, 벡터에 코딩된 PKS 유전자가 발현되어 상기 폴리케타이드가 생산되는 조건 하에서 배양시키는 것을 포함하여 이루어지는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 생산하는 재조합 숙주세포.
  13. 제 10항에 있어서, 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 생산하는 숙주 세포.
  14. 제 13항에 있어서, 에포틸론 A, B, C 및 D를 생산하는 숙주 세포.
  15. 제 14항에 있어서,믹소코커스 잔투스 (Myxocuccus xanthus) K111-32.25인 숙주 세포.
  16. 제 14항에 있어서, 주생성물로서 에포틸론 A와 B를 생산하고 부생성물로서 에포틸론 C와 D를 생산하는 숙주 세포.
  17. 제 13항에 있어서, 에포틸론 C와 D를 주생성물로서 생산하는 숙주 세포.
  18. 제 17항에 있어서,epoK유전자를 함유하지 않거나, 기능적인epoK유전자 산물을 완전히 발현시키지 않는 숙주 세포.
  19. 제 18항에 있어서,믹소코커스 잔투스 (Myxocuccus xanthus) K111-40.1인 숙주 세포.
  20. 제 18항에 있어서,믹소코커스 잔투스 (Myxocuccus xanthus) K111-72.4.4인 숙주 세포.
  21. 제 13항에 있어서, 에포틸론 PKS의 모듈의 코딩 서열이 돌연변이, 결실 또는 치환에 의해 변경된 에포틸론 PKS 유전자를 함유하는 숙주 세포.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 모듈이 익스텐더 모듈 6인 숙주 세포.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 모듈이 기능적인 케토리덕타제 도메인을 결여하고, 9-케토 에포틸론을 생산하는 숙주 세포.
  24. 제 21항에 있어서, 상기 모듈이 익스텐더 모듈 5인 숙주 세포.
  25. 제 24항에 잇어서, 상기 모듈 5가 기능적인 데히드라타제 도메인을 결여하고 13-히드록시 에포틸론을 생산하는 숙주 세포.
  26. 제 21항에 있어서, 상기 모듈이 익스텐더 모듈 4인 숙주 세포.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 모듈이 기능적인 케토리덕타제 도메인을 결여하고 13-케토 에포틸론을 생산하는 숙주 세포.
  28. 제 21항에 있어서, 상기 모듈이 익스텐더 모듈 2이고, 케토신타제 도메인의 코딩 서열이 돌연변이에 의해 변경되어 활성 부위 시스테인이 다른 아미노산으로 변경되고, 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 생산하기 위해서는 디케타이드와 등가인 화합물이 제공되어야만 하는 숙주 세포.
  29. 제 28항에 있어서,믹소코커스 잔투스 (Myxocuccus xanthus) K190-132.1.1.2인 숙주 세포.
  30. 제 21항에 있어서, 상기 모듈이 익스텐더 모듈 1인 숙주 세포.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 모듈이 시스테인 이외의 아미노산에 결합되도록 변경된 숙주 세포.
  32. 제 21항에 있어서, 상기 모듈이 로딩 모듈인 숙주 세포.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 모듈이 아미노산에 결합하는 모듈에 의해 치환된 숙주 세포.
  34. 제 28항의 숙주 세포를 다음 화학식을 갖는 디케타이드 등가 화합물
    와 함께 배양함으로써 생산되는 다음 식을 갖는 에포틸론 유도체:
    식 중, R7은 수소 또는 메틸이고 Ar은 다음 중에서 선택된 아릴이며;
    여기서 R은 수소, 히드록시, 할로겐, 아미노, C1-5알킬, C1-5히드록시알킬, C1-5알콕시 및 C1-5아미노알킬임.
  35. 제 1항에 있어서, 폴리케타이드의 생합성에 이용되는 화합물을 상기 세포에 전달하는 효소, 폴리케타이드의 새합성에 이용되는 화합물을 합성하는 효소, 및 PKS를 포스포판테테이닐화시키는 효소 중에서 선택된 효소를 코디하는 이종 유전자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 효소가 MatB인 숙주 세포.
  37. 제 35항에 있어서, 상기 효소가 MatC인 숙주 세포.
  38. 제 35항에 있어서, 상기 효소가 MtaA인 숙주 세포.
  39. 제 13항에 있어서, 상기 에포틸론 또는 에포틸론 유도체가,소란지움 셀룰로섬 (Sorangium cellulosum) 에포틸론 PKS 유전자로부터의 프로모터, 믹소티아졸 생합성 유전자로부터의 프로모터, TA 생합성 유전자로부터의 프로모터, pilA 프로모터, 카나마이신 내성 부여 유전자로부터의 프로모터, 및 So ce90 프로모터 중에서 선택된 프로모터의 조절 하에 PKS에 의해 생산되는 것이 특징인 숙주 세포.
  40. 에포틸론을 생산하는 세포로부터 에포틸론을 정제하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 세포를 XAD 수지 존재 하에 배양시켜, 상기 수지로부터 에포틸론을 용출시키고, 상기 수지로부터 용출된 에포틸론의 고상 추출을 수행한 다음, 상기 고상 추출물로부터 얻어진 에포틸론을 크로마토그래피 처리하는 단계를 포함하여 이루어지는 방법.
  41. 제 36항에 있어서, 결정화 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. 결정성 에포틸론 D.
  43. 지방산 또는 오일을 탄소원으로서 함유하는 액체 배지에서믹소코커스 (Myxococcus) 숙주 세포를 배양시키는 것을 포함하는,믹소코커스 (Myxococcus) 숙주 세포의 발효방법.
  44. 제 43항에 있어서, 상기 발효가 페드-뱃치식 (fed-batch) 발효인 방법.
  45. 제 43항에 있어서, 상기믹소코커스 (Myxococcus) 숙주 세포가 에포틸론 또는 에포틸론 유도체를 생산하는 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 상기 숙주 세포가 티아졸 대신 옥사졸을 함유하는 에포틸론 유도체를 생산하고, 상기 액체 배지는 L-세린을 포함하는 방법.
  47. 다음 식을 갖는 분리된 화합물;
    식 중, R1, R2, R3, R5, R11및 R12는 각각 독립적으로 수소, 메틸 또는 에틸;
    R4, R6및 R9는 각각 독립적으로 수소, 히드록실 또는 옥소;
    또는
    R5와 R6는 함께 탄소탄소 이중결합을 형성하고;
    R7은 수소, 메틸 또는 에틸이며;
    R8과 R10은 두가지 모두 수소를 나타내거나 또는 함께 탄소탄소 이중결합 또는 에폭사이드를 나타내고;
    Ar은 아릴이며;
    W는 O 또는 NR13이고 여기서 R13은 수소, C1-10지방족, 아릴 또는 알킬아릴임.
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