ES2287552T3 - Derivados de borrelidina y su utilizacion en medicina. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: Fórmula 1 R1 es un grupo cicloalquilo sustituido como se muestra a continuación: en donde R1 puede estar sustituido también opcionalmente con uno o más átomos de halógeno o uno o más grupos alquilo C1 a C3; R2, R3, R6, o R11 son cada uno independientemente H, OCH3, CH3 o CH2CH3; y R4 es CN, CO2H o CH3.

Description

Derivados de borrelidina y su utilización en medicina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos poliquétidos y usos de los mismos.

Antecedentes de la invención

Los poliquétidos son productos naturales producidos por una extensa gama de organismos, y particularmente por microorganismos. Los poliquétidos tienen muchos usos farmacéuticos, veterinarios y agrícolas importantes. Los poliquétidos abarcan una gama enorme de espacio químico estructural, y tienen una amplia gama de actividades biológicas asociadas. Poliquétidos con utilización en tratamientos médicos incluyen antibióticos, inmunosupresores, agentes antitumorales, otros agentes quimioterapéuticos, y otros compuestos que poseen una extensa gama de propiedades terapéuticas y biológicas. La bacteria Gram-positiva Streptomyces y sus géneros afines son productores prodigiosos de poliquétidos, y la genética y bioquímica de la biosíntesis de los poliquétidos en estos organismos están caracterizadas relativamente bien (Hopwood, 1997). Los genes para la biosíntesis de poliquétidos en Streptomyces están agrupados y el aprovechamiento de la tecnología del DNA ha hecho posible aislar agrupaciones de genes biosintéticos completos por exploración de genotecas de genes con sondas de DNA que codifican los genes responsables para su biosíntesis. Así, números crecientes de agrupaciones de genes para biosíntesis de poliquétidos en Streptomyces y otros microorganismos han sido aislados y secuenciados, incluyendo, por ejemplo, los correspondientes al poliéter monensina (WO 01/68867), el polieno nistatina (WO 01/59126) y para rapamicina (Schwecke et al., 1995).

Los poliquétidos se sintetizan por la condensación repetida de bloques de construcción que contienen una función ácido carboxílico. En cada etapa del proceso esto da como resultado la formación de una nueva función \beta-ceto y una ramificación de cadena lateral \alpha en la cadena creciente. La diversidad estructural de los poliquétidos se deriva de varios aspectos de su camino biosintético que incluye: la gran diversidad de unidades iniciadoras que pueden utilizarse en su biosíntesis; las diferentes longitudes de cadenas de poliquétidos que son posibles; las diversas cadenas laterales \alpha que se introducen sea durante o después del ensamblaje de la cadena del poliquétido; las diversas sustituciones \beta que pueden introducirse durante o después del ensamblaje de la cadena del poliquétido; los diversos grados de procesamiento que pueden sufrir los grupos \beta-ceto (ceto, hidroxilo, enoílo, y metileno); y las diversas estereoquímicas que son posibles en los centros \alpha y \beta.

La síntesis de poliquétidos es catalizada por una enzima, o por un complejo de enzimas, denominado(a) la poliquétido-sintasa (PKS) de una manera similar a la de la biosíntesis de los ácidos grasos. Las PKSs de Streptomyces y géneros afines caen dentro de tres categorías principales: tipo I, tipo II y tipo III. Las PKSs de Tipo III son pequeñas proteínas afines a las calcona-sintasas vegetales que han sido descubiertas sólo recientemente (Moore & Hopke, 2000). Sistemas de tipo III han sido implicados en la biosíntesis de un pequeño número de metabolitos secundarios, pero pueden estar implicados más generalmente en la biosíntesis de pigmentos solubles (Cortes et al., 2002). Las PKSs de tipo II están constituidas por varias proteínas monofuncionales que actúan como un complejo multi-polipeptídico. Poliquétidos aromáticos simples tales como actinorrodina se forman por varias tandas de ensamblaje de cadenas, que se realizan iterativamente sobre una serie de enzimas PKS de tipo II que son codificadas por una serie de genes PKS (Hopwood, 1997). Las PKSs de tipo I son proteínas multifuncionales que se requieren para la síntesis de poliquétidos más complejos tales como eritromicina y rapamicina. Como el foco de esta patente, se describen a continuación en detalle la organización y función de las PKS de tipo I:

Las PKSs de tipo I están organizadas en módulos, en donde cada módulo está constituido por varios "dominios" catalíticos que se requieren para llevar a cabo una tanda de ensamblaje de cadenas (Staunton & Wilkinson, 1997). En general, una PKS modular contiene el número correcto de módulos (módulos de carga más extensión) para seleccionar y condensar el número correcto de unidades de carga y extensión. Por ejemplo, la PKS de eritromicina consta de 7 módulos (un módulo de carga y 6 módulos de extensión) para seleccionar y condensar la unidad iniciadora y 6 unidades de tensión requeridas para la biosíntesis del precursor de eritromicina, 6-desoxieritronolida B. Así pues, existe una relación de uno a uno entre el número de módulos presentes en la PKS y el número de unidades incorporadas. Esta relación de uno a uno se describe como "co-linealidad".

El término "módulo de extensión", tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la serie de dominios contiguos, desde el dominio de proteína-sintasa portadora de \beta-cetoacil-acilo (KS) al dominio de la proteína portadora de acilo (ACP) siguiente, que realiza un ciclo de extensión de la cadena de poliquétido. El término "módulo de carga" como se utiliza en esta memoria, hace referencia a cualquier grupo de dominios contiguos que realiza la carga de la unidad iniciadora en la PKS y la pone así disponible para el dominio KS del primer módulo de extensión. Aparte de la condensación de la unidad ácido carboxílico extendedora siguiente (o quétido) sobre la cadena de poliquétido creciente, que es realizada por la actividad catalítica del dominio esencial KS, los módulos de PKSs de tipo I pueden contener dominios con actividades de \beta-cetorreductasa (KR), deshidratasa (DH), y enoil-reductasa (ER), que son responsables del procesamiento ulterior de los grupos \beta-ceto recién formados durante la extensión de la cadena. La acil-transferasa (AT) y los dominios ACP presentes en cada módulo son responsables de la elección de la unidad extendedora, y la ligadura de la cadena en crecimiento durante su paso sobre la PKS, respectivamente. Los dominios AT de una PKS modular pueden encontrarse también como proteínas discretas (Cheng et al., 2003). La cadena de poliquétido completada se libera generalmente de las PKSs por la acción de un dominio de tioesterasa terminal (TE) que está implicado también generalmente en la ciclación (lactonización) del producto final. Se emplean también otras estrategias de terminación/ciclación de cadenas, tales como la que consiste en la adición de un residuo de aminoácido y formación de macrolactama como se ha observado para la rapamicina (Schwecke et al., 1995), para la formación de macrolactamas y para rifamicina (August et al., 1998), y para incorporación de aminoácidos seguida por eliminación reductora como en el caso de la biosíntesis de la mixalamida (Silakowski et al., 2001). En resumen, existe un solo dominio enzimático presente para cada paso catalítico sucesivo que tiene lugar durante la biosíntesis en la PKS, y los mismos se utilizan en una secuencia definida que depende de su localización en la proteína y de la función particular que realicen. Este mecanismo se denomina "procesivo".

La configuración modular de las PKSs de tipo I fue confirmada por primera vez por mutación de la PKS de eritromicina (conocida también como 6-desoxieritronolida B-sintasa, DEBS) por una deleción en marco de una región del dominio KR del módulo 5 (Donadio et al., 1991). Esto condujo a la producción de los análogos de eritromicina, 5,6-didesoxi-3-\alpha-micarosil-5-oxoeritronolida B y 5,6-didesoxi-5-oxoeritronolida B, debido a la incapacidad del dominio KR mutado para reducir el grupo \beta-ceto 5 en esta etapa de la biosíntesis procesiva. Análogamente, la alteración de los residuos de sitio activo en el dominio ER del módulo 4 de DEBS2, por modificación mediante ingeniería genética del DNA correspondiente codificante de PKS y su introducción en Saccharopolyspora erythraea, condujo a la producción de 6,7-anhidroeritromicina C (Donadio et al., 1993). Adicionalmente, la longitud de la cadena de poliquétido formada por DEBS ha sido alterada por la relocalización específica del dominio TE de DEBS3 al final de DEBS1. El producto triquetido-lactona esperado se produjo con rendimiento satisfactorio (Cortés et al., 1995). Debe indicarse que los cambios descritos implicaban modificación por deleción de secuencia, o por desactivación específica de secuencia, o por la yuxtaposición alternativa de la secuencia de DNA desde el interior de la misma agrupación PKS (es decir, los mismos se consideran "cambios homólogos"). Otros cambios "homólogos" de este tipo a la PKS de eritromicina se describen en WO 93/13663.

La organización modular de los genes PKS de tipo I se presta por sí misma a la manipulación de estos genes a fin de producir estructuras de poliquétido alteradas. Las PKSs de tipo I representan una línea de ensamblaje para biosíntesis de poliquétidos que puede manipularse por cambio del número de módulos; por cambio de sus especificidades hacia diferentes unidades iniciadoras de ácido carboxílico y unidades extendedoras; por desactivación, mutación, eliminación, intercambio o inserción de dominios con actividades y especificidades diferentes; y por alteración del tamaño de la ca-
dena o del anillo mediante el reposicionamiento de dominios de terminación o ciclación (Stauton & Wilkinson, 1997).

WO 98/01546 describe la producción de ensamblajes de genes PKS híbridos que comprenden la incorporación de DNA heterólogo. WO 98/01546 describe métodos para generación de PKSs híbridas en los cuales la sustitución de genes que codifican módulos heterólogos, sub-módulos o dominios para los genes nativos genera nuevos poliquétidos con estructuras alteradas. Específicamente, por ejemplo los dominios AT de DNA heterólogo de las PKSs de rapamicina o monensina pueden intercambiarse por el nativo para la PKS de eritromicina a fin de generar nuevos poliquétidos con ramificación alquilo alterada. Un intercambio de dominio AT de este tipo representó el primer ejemplo de la producción de una PKS verdaderamente híbrida (Oliynyk et al., 1996). WO 98/01546 describe también en términos generales la producción de ensamblajes de PKS híbridas que comprenden un modo de carga y al menos un módulo de extensión. Dicho documento describe específicamente la construcción de un ensamblaje de gen PKS híbrido por injerto del módulo de carga de especificidad amplia para la PKS productora de avermectina sobre la primera proteína de la PKS de eritromicina (DEBS1) en lugar del módulo de carga normal (véase también Marsden et al., 1998). Ejemplos adicionales que comprenden intercambios de módulos de carga que son específicos de substrato han sido descritos también (WO 00/00618; US 5.876.991; Kuhstoss et al., 1996). WO 00/01827 describe métodos para variar la capacidad de procesamiento de \beta-ceto de un módulo PKS por la capacidad de intercambiar "bucles reductores", es decir la capacidad para, rápidamente y de manera combinatoria, alterar el número y tipo de dominios de cetorreductasa, deshidratasa y enoil-reductasa dentro de un módulo. Además de cambiar el nivel de procesamiento del grupo \beta-ceto, tales cambios pueden conducir también a cambios en la estereoquímica de los grupos \alpha-alquilo y \beta-hidroxilo así formados por los módulos alterados.

Aunque las PKSs modulares operan "normalmente" de una manera co-lineal y procesiva como se ha descrito arriba, ejemplos de una desviación de este modo de operación han sido descritos y se exponen más adelante.

La agrupación de genes PKS de picromicina en Streptomyces venezuelae es responsable de la biosíntesis tanto de picromicina (un macrólido heptaquétido de 14 miembros) y metimicina (un macrólido hexaquétido de 12 miembros) (Xue et al., 1998). La capacidad de una PKS simple para producir dos macrólidos afines, de tamaños de anillo diferentes, deriva de la expresión alternativa del gen PKS final pikA4 (Xue & Sherman, 2000). Cuando ocurre la expresión "normal" y se forma PikA4 de longitud total, se incorpora una sexta unidad de extensión y se produce la picromicin-aglicona; cuando ocurre expresión alternativa y se produce una forma truncada en el terminal N de PikA4, no se incorpora unidad sexta de extensión alguna y la cadena de poliquétido creciente se pasa directamente al dominio TE, lo que conduce a la formación de la metimicin-aglicona. Así pues, ocurre una ruptura de la co-linealidad y se forma un producto "de anillo contraído". La base bioquímica para este fenómeno ha sido investigada y se ha demostrado que es una transferencia de ACP5 a ACP6, con omisión de la unión covalente al dominio KS6 interpuesto; dicha ruptura de la co-linealidad ha sido denominada "salto" (Beck et al., 2002).

Se ha observado que también ocurre salto cuando se interpoló un módulo de extensión adicional de la PKS de rapamicina en la PKS de eritromicina a fin de convertir la PKS natural productora de heptaquétido en una productora de octaquétido (Rowe et al., 2001). Se produjo el octaquétido esperado macrólido de 16 miembros, pero el producto principal era el producto 6-desoxieritronolida heptaquétido normal. Se cree que este "salto" del módulo interpolado ocurre debido a que el módulo interpolado actúa en algunas ocasiones como una "lanzadera", pasando la cadena creciente del módulo precedente al módulo siguiente aguas abajo sin realizar una tanda de extensión de cadena. Posteriormente se demostró que el dominio ACP del módulo interpolado es esencial en el paso de la cadena de poliquétido creciente desde el dominio ACP precedente y el paso de la misma al dominio KS del módulo siguiente durante el salto (Thomas et al., 2002), un mecanismo similar al descrito anteriormente para la biosíntesis de metimicina. Se demuestra que puede producirse salto sin el nucleófilo del sitio activo del dominio KS. Se ha informado de una nemadectina (un macrólido antiparasitario) de anillo contraído (por salto), procedente de un mutante de un aislado de Streptomyces del suelo que se había modificado por mutación química (Rudd et al., 1990); se anuló la biosíntesis del producto PKS natural.

Una manera alternativa en la cual las PKSs modulares se desvían de la operación co-lineal implica la operación iterativa de módulos. Por ejemplo, el módulo 4 de la PKS de eritromicina parece operar iterativamente, a nivel bajo, para producir un macrólido octaquétido de anillo expandido de 16 miembros afín a la 6-desoxieritronolida B (Wilkinson et al., 2000). La capacidad de la PKS de eritromicina para realizar esta operación ha sido denominada "tartamudeo". El "tartamudeo" de la PKS de eritromicina está considerado como un proceso aberrante, dado que los productos de este tartamudeo se forman con rendimiento bajo y el producto principal de la PKS de eritromicina es el heptaquétido normal 6-desoxieritronolida B formado por operación co-lineal. Productos que parecen formarse tanto por tartamudeo como por salto han sido también comunicados como componentes menores del productor de epotilona Sorangium cellulosum (Hardt et al., 2001). La agrupación biosintética de estigmatelina de Stigmatella aurantiaca codifica una PKS que comprende diez módulos (uno de carga y nueve de extensión) (Gaitatzis et al., 2002); sin embargo, sobre la base de los resultados de la elucidación estructural y la alimentación de sustratos marcados con isótopos estables, la estigmatelina está formada por 11 unidades derivadas de módulos. Así, parecería que uno de los módulos de PKS de estigmatelina opera iterativamente (dos veces).

Desde la presentación de prioridad de la presente solicitud, la secuencia de la PKS responsable para la biosíntesis del macrólido lankacidina por Streptomyces rochei ha sido descrita (Mochizuki et al., 2003). Esta PKS parece contener también un número muy pequeño de módulos en comparación con el número de ciclos de extensión requeridos para la biosíntesis de la lankacidina, aunque el mecanismo por el cual podría ocurrir esto no está claro.

Puede generarse una diversidad estructural adicional mediante la modificación de poliquétidos por la acción de enzimas distintas de las PKS, sea durante el proceso de ensamblaje de cadenas como se ve durante la biosíntesis de algunas ansamicinas (Floss, 2001), o después del proceso de ensamblaje de cadenas siguiente a la liberación de la PKS. Tales reacciones no mediadas por PKS pueden incluir, pero sin carácter limitante, las siguientes: reducción, oxidación, hidroxilación, acilación, alquilación aminación, descarboxilación, deshidratación, isomerización/migración de enlaces dobles, ciclación, escisión de anillos, conjugación, glicosilación, eliminación reductora y cualquier combinación de éstas. Cuando estas reacciones ocurren después del ensamblaje de cadenas, las mismas se conocen como pasos post-PKS o pasos de adaptación. Tales pasos de adaptación son por regla general, pero no siempre, esenciales para dotar de actividad biológica al producto poliquétido natural.

Adicionalmente, la diversidad estructural de poliquétidos que pueden obtenerse por biosíntesis puede mejorarse adicionalmente por el uso de enzimas adaptadoras heterólogas post-PKS definidas así como por el uso de aquéllas que modifican naturalmente el poliquétido natural (Gaisser et al., 2000). El documento WO 01/79520 describe la modificación heteróloga de estructuras de poliquétidos macrólidos por glicosilación, epoxidación, hidroxilación, y metilación. La capacidad para generar análogos del compuesto agrícola espinosina por glicosilación con sustituyentes desoxihexosa alternativos ha sido comunicada (Gaisser et al., 2002).

La borrelidina 1 (Figura 1) es un macrólido de 18 miembros producido por varias cepas bacterianas que incluyen, pero sin carácter limitante, Streptomyces rochei ATCC 23956, Streptomyces parvulus Tü113 y Streptomyces parvulus Tü4055. La borrelidina se demuestra en esta memoria que se deriva de un ácido iniciador, ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico, 3 unidades extendedoras malonil-CoA y 5 unidades extendedoras metilmalonil-CoA (véase la Figura 2). A partir de la estereoquímica absoluta de la borrelidina, basada en la estructura cristalina y configurada recientemente por síntesis total, se predice que el ácido iniciador real es ácido trans-ciclopentano-(1R,2R)-dicarboxílico. La borrelidina aislada después de la alimentación de sustratos acetato y propionato marcados con isótopos estables indicaba claramente la incorporación esperada de estos bloques de construcción; adicionalmente, se ha demostrado en la presente solicitud que la alimentación de ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico era suficiente para restablecer la biosíntesis de borrelidina en mutantes en los cuales los genes específicos que se creía están involucrados en la formación de la unidad iniciadora habían sido desorganizados. La borrelidina contiene un grupo nitrilo unido a la posición C12, que se demuestra en esta memoria surge por la acción de enzimas adaptadoras que actúan sobre una ramificación metilo derivada de metilmalonil-CoA presente en esta posición. La estructura global de la borrelidina fue dilucidada por primera vez en 1967 (Keller-Scheirlein, 1967), y fue refinada subsiguientemente por análisis NMR detallado (Kuo et al., 1989). La configuración absoluta de la borrelidina fue confirmada por cristalografía de rayos X (Anderson
et al., 1989). Su co-identidad como el antibiótico treponemicina ha sido comprobada (Maehr & Evans, 1987).

Varios grupos han comunicado la síntesis de fragmentos de la estructura de borrelidina, y desde la presentación de prioridad de la presente solicitud, han sido consignadas dos síntesis totales independientes de borrelidina (Hanessian et al., 2003; Duffey et al., 2003).

La borrelidina fue descubierta por primera vez debido a su actividad antibacteriana (Berger et al., 1949), aunque esta actividad antibacteriana se extiende solamente a un número limitado de micrococos, y no se encuentra contra todas las bacterias de test comunes. El modo de acción en los microorganismos sensibles implica la inhibición selectiva de la treonil-tRNA-sintetasa (Paetz & Nass, 1973). Otras actividades contra espiroquetas del género Treponema (Singh et al., 1985; US 4.759.928), contra virus (Dickinson et al., 1965, usos para el control de plagas animales y malezas (DE 3.607.287) y uso como fungicida agrícola (DE 19835669; US 6.193.964) han sido consignadas. Adicionalmente, desde la presentación de prioridad de la presente solicitud, se ha informado que la borrelidina posee actividad antimalarial contra cepas fármaco-resistentes de Plasmodium falciparum (Otoguro et al., 2003). Entre todos estos informes, únicamente dos han comunicado algunos derivados modificados sintéticamente. El primero de éstos describe el éster bencílico y su derivado bis-O-(4-nitrobenzoílo) (Berger et al., 1949). El segundo de ellos describe el éster metílico de borrelidina, el derivado de éster metílico bis-O-acetilo, y los derivados del éster metílico \Delta_{14-15}-dihidro-, \Delta_{14-15,12-13}-tetrahidro-, y \Delta_{14-15,12-13}-tetrahidro-C12-amino (Anderton & Rickards, 1965). No se ha consignado actividad biológica alguna para ninguno de estos compuestos.

Una descripción reciente particularmente interesante es el descubrimiento de que la borrelidina exhibe actividad anti-angiogénesis (Wakabayashi et al., 1997). La angiogénesis es el proceso de la formación de nuevos vasos sanguíneos. La angiogénesis ocurre sólo local y transitoriamente en adultos, estando implicada, por ejemplo, en la reparación subsiguiente a traumatismos locales y el ciclo reproductivo de las hembras. Se ha establecido como componente fundamental en varios procesos patogénicos que incluyen cáncer, artritis reumatoide y retinopatía diabética. Su importancia en la habilitación del crecimiento de los tumores más allá de un diámetro de 1-2 cm fue establecida por Folkman (Folkman, 1986), y está provocada por la respuesta de los tumores a la hipoxia. En sus consecuencias aguas abajo, la angiogénesis es fundamentalmente un proceso derivado del hospedador, por lo que la inhibición de la angiogénesis ofrece un potencial importante en el tratamiento de los cánceres, evitando las dificultades de otras modalidades terapéuticas anticancerígenas tales como la diversidad de tipos de cáncer y la resistencia a los fármacos (Matter, 2001). Presenta interés adicional el hecho de que publicaciones recientes han descrito la implicación funcional de tirosinil- y triptofanil-tRNA-sintetasas en la regulación de la angiogénesis (Wakasugi et al., 2002; Otani et al., 2002).

En el cultivo matriz de la aorta de la rata utilizado como modelo de angiogénesis, la borrelidina exhibe un efecto potente inhibidor de la angiogénesis y causa también la desorganización de los tubos capilares formados de una manera dependiente de la dosis por inducción de la apoptosis de las células formadoras de capilares (Wakabayashi et al., 1997). La borrelidina inhibía la formación de tubos capilares con un valor CI_{50} de 0,4 ng/ml (0,8 nM). En el mismo estudio, se demostró que la borrelidina posee actividad anti-proliferativa frente a las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en un ensayo de crecimiento celular; el valor CI_{50} se midió como 6 ng/ml, que es 15 veces menor que la actividad anti-angiogénesis medida en el mismo medio. Se demostró que esta actividad anti-proliferativa de la borrelidina es general frente a diversas líneas de células. Además de estos datos, los autores consignan que la borrelidina inhibe la tRNA-sintetasa y la síntesis de proteínas en las células de rata cultivadas; sin embargo, el valor CI_{50} para la actividad anti-angiogénesis (0,4 ng/ml) era 50 veces menor que el consignado para la inhibición de la síntesis de proteínas (20 ng/ml), lo que indica actividades diferentes del compuesto.

La borrelidina exhibe también una inhibición potente de la angiogénesis in vivo utilizando el modelo del saco de aire dorsal del ratón (Funahashi et al., 1999), que examina la angiogénesis inducida por VEGF y es un modelo excelente para estudiar la angiogénesis de los tumores. La borrelidina se administró a una dosis de 1,8 mg/kg por inyección intraperitoneal y se demostró que reduce significativamente el incremento de volumen vascular inducido por las células WiDr, y en mayor grado que lo hace TNP-470, que es un inhibidor de angiogénesis sintético en pruebas clínicas. Controles detallados verificaron que estos datos se refieren a la inhibición de la angiogénesis y no a inhibición del crecimiento de las células tumorales. Los autores demostraron también que la borrelidina es eficaz para la inhibición de la formación de metástasis espontáneas en el pulmón de las células del melanoma B16-BL6 para la misma dosificación por inhibición de los procesos angiogénicos implicados en su formulación.

Los documentos JP 9-227.549 y JP 8-173.167 confirman que la borrelidina es eficaz contra la línea de células WiDr del cáncer de colon humano, y también contra las líneas de células PC-3 del cáncer de próstata humano. JP 9-227.549 describe la producción de borrelidina por Streptomyces rochei Mer-N7167 (Ferm P-14670) y su aislamiento del cultivo de fermentación resultante. Además de borrelidina 1, han sido descritos 12-desnitrilo-12-carboxil-borrelidina 2 (supuestamente un compuesto intermedio biosintético o metabolito de derivación), 10-desmetil-borrelidina 3 (supuestamente un análogo biosintético que surge por la incorporación errónea de una unidad extendedora malonil-CoA alternativa en el módulo 4 de la PKS de borrelidina), 11-epiborrelidina 4 y el análogo de C14,C15-cis-borrelidina 5 (véase la Figura 1). Así, JP 9-227.549 especifica borrelidina y análogos de borrelidina en los cuales un grupo nitrilo o carboxilo está unido al esqueleto de carbonos en C12, y un átomo de hidrógeno o grupo alquilo inferior está unido al esqueleto de carbonos en C10.

WO 01/09113 describe la preparación de análogos de borrelidina que han sufrido modificación por síntesis en el resto ácido carboxílico del anillo de ciclopentano. La actividad de estos compuestos se examinó utilizando la proliferación de las células endoteliales y ensayos de formación de capilares endoteliales de una manera similar a la arriba descrita. En general, la modificación del resto carboxilo mejoraba la selectividad para inhibir la formación de capilares: la razón principal para esta mejora en la selectividad se debe a una disminución en la actividad de inhibición de la proliferación celular, mientras que la actividad inhibidora de la formación de capilares se alteraba en un grado mucho menor. Específicamente, el éster borrelidin-morfolinoetílico exhibía un índice de selectividad de 60 veces, la borrelidin-amida exhibía un índice de selectividad de 37 veces, el éster borrelidin-(2-piridil)-etílico exhibía un índice de selectividad de 7,5 veces y la borrelidin-morfolinoetil-amida exhibía un índice de selectividad de 6 veces, para la actividad inhibidora de la formación de capilares en comparación con la proliferación celular con respecto a la borrelidina. La actividad inhibidora de la formación de capilares de estos y otros derivados de borrelidina se comprobó utilizando un ensayo de formación de micro-vasos. Adicionalmente, los autores demostraron que la borrelidina inhibía débilmente la propagación de nódulos metastásicos, después de la eliminación del tumor primario, cuando se utilizó un modelo de adenocarcinoma de pulmón de Lewis. No obstante, se informó que el derivado de borrelidin-(3-picolilamida) inhibe muy considerablemente el aumento de micrometástasis en las ratas después de administración intraperitoneal y también con la administración per os a dosis subtóxicas. Análogamente, utilizando el modelo bazo-hígado-colon 38 la capacidad formadora de metástasis de las células del adenocarcinoma de colon del ratón trasplantadas en bazo de ratón se reducía considerablemente después de tratamiento con una dosis subtóxica de este derivado de borrelidina. Estos datos confirman la capacidad comunicada previamente de la borrelidina y sus derivados para inhibir la formación de metástasis.

La borrelidina ha sido identificada también como un inhibidor de la quinasa Cdc28/Cln2 dependiente de ciclina de Saccharomyces cerevisiae con un valor CI_{50} de 12 \mug/ml (24 \muM) (Tsuchiya et al., 2001). Se demostró que la borrelidina detiene tanto las células haploides como las diploides en la fase tardía G_{1} (en un momento indiferenciable de la feromona de apareamiento \alpha), y a concentraciones que no afectan a la biosíntesis global de las proteínas. Estos datos se tomaron para indicar que la borrelidina tiene potencial como compuesto conductor para desarrollar agentes antitumorales.

Desde la presentación de prioridad de la presente solicitud, se han publicado dos informes adicionales concernientes a la actividad biológica de la borrelidina. El primero de éstos indica que los efectos anti-angiogénicos de la borrelidina están mediados por caminos distintos (Kawamura et al., 2003). Se encontró que concentraciones altas de treonina atenúan la capacidad de la borrelidina para inhibir tanto la formación de tubos capilares en el modelo de cultivo de la aorta de la rata como la proliferación de las células HUVEC; sin embargo, la misma no afectaba a la capacidad de la borrelidina para colapsar los tubos capilares formados o para inducir la apoptosis en las células HUVEC. Se encontró también que la borrelidina activa la caspasa-3 y la caspasa-8, y los inhibidores de estas dos suprimían la apoptosis en HUVEC inducida por borrelidina. El segundo de estos documentos utilizó el método de la presentación de perfiles de mRNA celulares globales para proporcionar comprensión en cuanto a los efectos de borrelidina sobre Saccharomyces cerevisiae (Eastwood y Schaus, 2003). Este análisis demostró la inducción de las enzimas de la biosíntesis de aminoácidos de una manera dependiente del tiempo por tratamiento con borrelidina, y se comprobó que la inducción de este camino implica el factor de transcripción GCN4.

En suma, el efecto inhibidor de la angiogénesis de la borrelidina está dirigido hacia los efectos duales tumoral-biológicos de proliferación y formación de capilares. Adicionalmente, se ha demostrado que la borrelidina y sus derivados, inhiben la propagación de las metástasis. La borrelidina tiene también indicaciones para uso en la modulación del ciclo celular. Así pues, la borrelidina y los compuestos afines son dianas particularmente atractivas para investigación como agentes terapéuticos para el tratamiento de tejidos tumorales, sea como agentes individuales o para uso como producto adjunto a otras terapias. Adicionalmente, aquéllos pueden utilizarse para tratamiento de otras enfermedades en las cuales está implicada la angiogénesis en el proceso patogénico, con inclusión, pero sin carácter limitante, de la lista siguiente: artritis reumatoide, psoriasis, ateroesclerosis, retinopatía diabética y diversos trastornos oftálmicos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona la secuencia de ácido nucleico entera de la agrupación de genes biosintéticos responsables del control de la síntesis del poliquétido macrólido borrelidina en Streptomyces parvulus Tü4055. Se proporciona también el uso de la totalidad o parte del DNA clonado y las secuencias de ácido nucleico del mismo en la detección específica de otros agrupaciones de genes poliquétidos biosintéticos, en la modificación por ingeniería genética de cepas mutantes de Streptomyces parvulus y otras cepas hospedadoras adecuadas para la producción de niveles incrementados de borrelidina, o para la producción de poliquétidos modificados o nuevos, y de genes recombinantes que codifican sistemas de PKS para la biosíntesis de poliquétidos modificados o nuevos.

La secuencia de nucleótidos completa de la agrupación de genes biosintéticos de borrelidina de Streptomyces parvulus Tü4055 se muestra en SEQ ID NO: 1. Su organización se presenta en la Figura 3 y comprende genes y marcos de lectura abierta designados en lo sucesivo en esta memoria como: borA1, borA2, borA3, borA4, borA5, borA6, borB, borC, borD, borE, borF, borG, borH, borI, borJ, borK, borL, borM, borN, borO, orfB1, orfB2, orfB3, orfB4, orfB5, orf86, orfB7, orfB8, orfB9, orfB10, orfB11, orfB12, orfB13, orfB14, orfB15, orfB16, orfB17, orfB18, orfB19, orfB20, orfB21 y orfB22.

Las funciones propuestas de los genes clonados se describen en las Figuras 4 (biosíntesis propuesta de la unidad iniciadora), 5 (organización de la PKS de borrelidina y biosíntesis de la pre-borrelidina) y 6 (introducción del resto nitrilo en C12) y se describen a continuación.

La presente descripción proporciona por tanto una molécula de ácido nucleico aislada que comprende:

(a)

una secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 1, o una porción o fragmento de la misma; o

(b)

una secuencia de nucleótidos que es el complemento de SEQ ID NO: 1, o una porción o fragmento de la misma; o

(c)

una secuencia de nucleótidos que está degenerada con una secuencia codificante de SEQ ID NO: 1, o una porción o fragmento de la misma.

Como se utiliza en esta memoria, el término "fragmento" con respecto a una secuencia de nucleótidos hace referencia a un tramo de residuos de ácido nucleico que tienen una longitud de al menos 10, preferiblemente al menos 20, al menos 30, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 150 o al menos 200 nucleótidos. Una porción o fragmento preferida(o) de SEQ ID NO: 1 es la secuencia que se extiende entre las posiciones de los nucleótidos 7603 y 59966 de SEQ ID NO: 1.

La secuencia puede codificar o ser complementaria de una secuencia que codifica un polipéptido de una agrupación de genes poliquétidos biosintéticos, o una porción de los mismos. Por "un polipéptido de una agrupación de genes biosintéticos de un poliquétido" se entiende un polipéptido codificado por uno o más marcos de lectura abierta de una agrupación de genes biosintéticos de un poliquétido, y particularmente la agrupación del gen biosintético de borrelidina.

Una agrupación de genes biosintéticos de poliquétidos es un segmento de DNA que comprende una pluralidad de genes que codifican polipéptidos que tienen actividad en la biosíntesis de un resto poliquétido o macrólido. Esto no está restringido a componentes de la poliquétido-sintasa (PKS) que funcionan inter alia en la síntesis de la cadena principal del poliquétido y al procesamiento reductor de los grupos laterales, sino que abarca también polipéptidos que tienen funcionales auxiliares en la síntesis del poliquétido. Así, los polipéptidos de la agrupación de genes biosintéticos pueden actuar también en la modificación del anillo macrólido o la cadena del poliquétido (v.g. catalizando una reacción en la formación del resto nitrilo en C12 de la borrelidina), en la síntesis de una unidad precursora o iniciadora para un poliquétido o resto macrólido (v.g. catalizando una reacción en la síntesis de la unidad iniciadora de ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico para la PKS de la borrelidina, o responsable de la activación de moléculas tales como los tioésteres de la coenzima-A de las unidades iniciadoras y extendedoras de la cadena), actividad reguladora (v.g. regulación de la expresión de los genes o proteínas implicados en la síntesis del poliquétido o el macrólido), actividad transportadora (v.g. en el transporte de sustratos para el resto poliquétido o macrólido en la célula, o de productos de síntesis tales como la molécula de poliquétido o macrólido fuera de la célula), y en conferir resistencia de la célula productora a los productos sintetizados (v.g. por fijación específica a la molécula sintetizada, o como un reemplazamiento para otras proteínas endógenas a las cuales puede fijarse la molécula sintetizada dentro o fuera de la célula).

La agrupación de genes incluye también regiones no codificantes, tales como promotores y otras secuencias reguladoras de la transcripción que están enlazadas operativamente a las regiones codificantes de la agrupación de genes. Las personas expertas están perfectamente capacitadas para identificar tales elementos sobre la base de la fracción proporcionada en esta memoria, y éstos están dentro del alcance de la presente exposición.

Los genes y marcos de lectura abierta codificados dentro de SEQ ID NO: 1 representan partes o fragmentos preferidos de SEQ ID NO: 1. Así, una molécula de ácido nucleico aislada puede comprender una secuencia que codifica un polipéptido de una agrupación de genes biosintéticos de borrelidina, en donde dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID Nos. 2 a 43 y 113.

En realizaciones preferidas, la secuencia de ácido nucleico comprende un marco de lectura abierta seleccionado del grupo de marcos de lectura abierta de SEQ ID NO: 1 constituidos por borA1, borA2, borA3, borA4, bor-A5, borA6, borB, borC, borD, borE, borF, borG, borH, borI, borJ, borK, borL, borM, borN, borO, orfB1, orfB2, orfB3, orfB4, orfB5, orfB6, orfB7, orfB8, orfB9, orfB10, orfB11, orfB12, orfB13a, orfB13b, orfB14, orfB15, orfB16, orfB17, orfB18, orfB19, orfB20, orfB21 y orfB22, estando descritos respectivamente dichos marcos de lectura abiertos por las bases 16184*-18814, 18875-23590, 23686-34188, 34185*-39047, 39122*-45514, 45514-50742, 7603-8397c, 8397-9194c, 9244-9996c, 9993-11165c, 11162-11980c, 11992-13611c, 13608-15659*c, 50739*-52019, 52113-53477, 53486-
54466, 54506-56176, 56181*-57098, 57112-57858, 57939-59966, 2-313 (incompleta), 501*-3107, 3172-3810c, 3935-4924C, 5123-5953, 5961-6518*c, 6564*-7538, 60153-60533*c, 60620-61003, 61188*-61436, 61526-61738, 61767-62285c, 62750-63067c, 62586-62858c, 63155-65071c, 65374-65871, 65942-68305*c, 68290-68910*c, 69681-70436, 70445-71848, 71851-72957, 73037-73942 y 73995-74534c de SEQ ID No.1.

En la lista anterior, "c" indica que el gen está codificado por la cadena complementaria a la que se muestra en SEQ ID NO: 1. Cada marco de lectura abierta anterior representa el marco de lectura abierta probable más largo presente. A veces ocurre que puede identificarse más de un codón potencial inicial. Un experto en la técnica reconocerá esto y será capaz de identificar codones iniciales posibles alternativos. Aquellos genes que tienen más de un codón de iniciación posible se indican con un símbolo "*". A lo largo de todo el documento, los autores han indicado lo que se cree que es el codón de iniciación; sin embargo, una persona con experiencia en la técnica apreciará que puede ser posible generar proteína activa utilizando un codón de iniciación alternativo, y las proteínas generadas utilizando estos codones de iniciación alternativos se consideran también dentro del alcance de la presente exposición.

Debe indicarse que cierto número de estos marcos de lectura abierta comienzan con un codón (GTG, CTG o TTG) distinto del codón de iniciación ATG más normal. Es bien sabido que en algunos sistemas bacterianos tales codones, que denotan normalmente valina (GTG) o leucina (CTG, TTG) pueden leerse como codones de iniciación que codifican metionina en el término N de la cadena del polipéptido. En las secuencias de aminoácidos (SEQ ID Nos. 2 a 43 y 113) proporcionados en esta memoria, tales codones se traducen por tanto como metionina.

Se proporcionan también moléculas de ácido nucleico que comprenden porciones de los marcos de lectura abierta identificados en esta memoria. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de este tipo puede comprender uno o más dominios aislados derivados de los marcos de lectura abierta identificados en esta memoria. Los polipéptidos codificados por estas porciones aisladas de los marcos de lectura abierta pueden tener actividad independiente, v.g. actividad catalítica. En particular, los polipéptidos que constituyen la PKS de borrelidina tienen estructuras modulares en las cuales dominios individuales tienen actividades catalíticas particulares como se ha expuesto anteriormente. Así, cualquiera de estos dominios puede expresarse solo o en combinación, con otros polipéptidos de la PKS de borrelidina descritos en esta memoria o dominios de los mismos, o con polipéptidos de la PKS de otros poliquétidos. En particular, cualquiera de estos dominios puede emplearse en sustitución de los dominios equivalentes sea dentro de la PKS de borrelidina o en otras poliquétido-sintasas y dominios adicionalmente equivalentes de otras PKSs pueden emplearse en sustitución de los dominios dentro de la PKS de borrelidina. En este contexto, un dominio equivalente incluye dominios que tienen el mismo tipo de función pero difieren, por ejemplo, en su especificidad; un ejemplo de sustituciones contempladas por la presente exposición incluye: el empleo de un dominio AT específico de malonil-CoA en lugar de un dominio AT específico de metilmalonil-CoA, o el empleo de un bucle reductor que contiene un dominio KR únicamente en lugar de uno que contiene KR, DH y ER. En realizaciones preferidas, los dominios expresados representan al menos un módulo de PKS como se describe más adelante.

El término "dominio de PKS" tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a una secuencia de polipéptido, capaz de plegarse independientemente del resto de la PKS, y que tiene una actividad enzimática individual diferenciada u otra función en la síntesis del poliquétido o macrólido con inclusión, pero sin carácter limitante, de la proteína-sintasa portadora de \beta-cetoacil-acilo (KS), proteína portadora de acilo (ACP), acil-transferasa (AT), \beta-cetorreductasa (KR), deshidratasa (DH), enoil-reductasa (ER) o tioesterasa terminal (TE).

De acuerdo con ello, la exposición proporciona adicionalmente:

(a)

una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica un dominio de PKS seleccionado de AT0 y ACP0, estando descritos dichos dominios por, respectivamente, los aminoácidos 322-664 y 694-763 de SEQ ID NO: 2. En una realización preferida, el dominio de PKS comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las bases 17147-18175 y 18263-18472 de SEQ ID NO: 1;

(b)

una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica un dominio de PKS seleccionado de KS1, AT1, KR1 y ACP1, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 34-459, 557-885, 1136-1379 y 1419-1486 de SEQ ID NO: 3. En una realización preferida, el dominio de PKS comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las bases 18974-20251, 20543-21529, 22280-23011 y 23129-23332 de SEQ ID NO: 1;

(c)

una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica un dominio de PKS seleccionado de KS2, AT2, DH2, KR2, ACP2, KS3, AT3, DH3, KR3 y ACP3, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 34-459, 559-887, 903-1050, 1354-1597, 1628-1694, 1724-2149, 2245-2576, 2593-2734, 3060-3307 y 3340-3406 de SEQ ID NO: 4. En una realización preferida, el dominio de PKS comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las bases 23785-25062, 25360-26346, 26392-26835, 27745-28476, 28567-28767, 28855-30132, 30418-31413, 31462-31887, 32863-33606 y 33703-33903 de SEQ ID NO: 1;

(d)

una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica un dominio de PKS seleccionado de KS4, AT4, KR4 y ACP4, estando descritos dichos dominios por, respectivamente, los aminoácidos 34-459, 555-886, 1179-1423 y 1459-1525 de SEQ ID NO: 5. En una realización preferida, el dominio de PKS comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las bases 34284-35561, 35847-36842, 37719-38453 y 38559-38759 de SEQ ID NO: 1;

(e)

una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica un dominio de PKS seleccionado de KS5, AT5, DH5, ER5, KR5 y ACP5, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 34-457, 553-888, 905-1046, 1401-1690, 1696-1942 y 1975-2041 de SEQ ID NO: 6. En una realización preferida, el dominio de PKS comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las bases 39221-40492, 40778-41785, 41834-42259, 43322-44191, 44207-44947 y 45044-45244 de SEQ ID NO: 1;

(f)

una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica un dominio de PKS seleccionado de KS6, AT6, KR6, ACP6 y TE, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 37-457, 555-883, 1101-1335, 1371-1437 y 1461-1708 de SEQ ID NO: 7. En una realización preferida, el dominio de PKS comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las bases 45622-46884, 47176-48162, 48814-49518, 49624-49824 y 49894-50637 de SEQ ID NO: 1.

En otro de sus aspectos, la descripción proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica un módulo PKS, seleccionándose dicho módulo del grupo constituido por los aminoácidos 322-763 de SEQ ID NO: 2, 34-1486 de SEQ ID NO: 3, 34-1694 de SEQ ID NO: 4, 1724-3406 de SEQ ID NO: 4, 34-1525 de SEQ ID NO: 5, 34-2041 de SEQ ID NO: 6 y 37-1437 o 1708 de SEQ ID NO: 7. En una realización preferida, el módulo comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las bases 17147-18472, 18974-23332, 23785-28767, 28855-33903, 34284-38759, 39221-45244, 45622-49824 o 50637 de SEQ ID NO: 1.

El término "módulo", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un polipéptido simple que comprende una pluralidad de dominios PKS, cada uno de los cuales tiene una actividad enzimática individual distinta en la síntesis de poliquétidos o macrólidos que incluye, pero sin carácter limitante, la proteína-sintasa portadora de \beta-cetoacil-acilo (KS), aciltransferasa (AT), proteína portadora de acilo (ACP), \beta-cetorreductasa (KR), deshidratasa (DH), o enoil-reductasa (ER) o tioesterasa terminal (TE). Un módulo de extensión comprende típicamente un dominio KS, AT y ACP (aunque algunas PKSs modulares pueden codificar sus dominios AT como proteínas independientes). Un módulo de extensión puede comprender adicionalmente uno o más dominios capaces de reducir un grupo \beta-ceto a un grupo hidroxilo, enoílo o metileno (haciéndose referencia en esta memoria a dicho grupo de dominios como un "bucle reductor"). Así pues, un módulo que comprende un bucle reductor contiene típicamente un dominio KR, dominios KR y DH, o dominios KR, DH y ER.

Una PKS puede comprender además un dominio TE para realizar la terminación de la cadena y/o la ciclación del producto final, o alternativamente puede contener otra funcionalidad que se sepa realiza una función similar tal como la adición de un residuo de aminoácido y formación de macrolactama como se observa para la rapamicina (Schwecke et al., 1995), para formación de macrolactama como en el caso de la rifamicina (August et al., 1998), y para incorporación de aminoácidos seguida por eliminación reductora como en el caso de la biosíntesis de la mixalamida (Silakowski et al., 2001).

Las secuencias proporcionadas en esta memoria proporcionan medios con los cuales es posible manipular y/o mejorar la síntesis de los poliquétidos. Así, se proporciona un método de modificación de una poliquétido-sintasa parental, que comprende expresar un dominio de una poliquétido-sintasa de borrelidina o un derivado del mismo como se describe en esta memoria en una célula hospedadora que expresa dicha poliquétido-sintasa parental, de tal modo que el dominio se incorpora en dicha poliquétido-sintasa parental. Se proporciona adicionalmente un método de modificación de una poliquétido-sintasa parental, que comprende introducir en una célula hospedadora un ácido nucleico que codifica un dominio de una poliquétido-sintasa de borrelidina, un derivado del mismo, en donde la célula hospedadora contiene ácido nucleico que codifica dicha poliquétido-sintasa parental, de tal manera que, cuando se expresa, el dominio se incorpora en dicha poliquétido-sintasa parental. El dominio de PKS de borrelidina puede insertarse además de los dominios nativos de la PKS parental, o puede reemplazar un dominio parental nativo. Típicamente, la PKS parental será una PKS tipo I.

La presente descripción proporciona adicionalmente métodos de modificación de una PKS de borrelidina parental. Un dominio donante (v.g. de una PKS tipo I) puede expresarse en una célula hospedadora que expresa dicha PKS de borrelidina parental. Se proporciona adicionalmente un método de modificación de una poliquétido-sintasa de borrelidina parental que comprende introducir en una célula hospedadora un ácido nucleico que codifica un dominio de una poliquétido-sintasa donante, en donde la célula hospedadora contiene ácido nucleico que codifica dicha poliquétido-sintasa de borrelidina parental, de tal manera que, cuando se expresa, el dominio se incorpora en dicha poliquétido-sintasa de borrelidina parental.

Adicional o alternativamente, un dominio de la PKS parental puede delecionarse o desactivarse de otro modo; v.g. un dominio parental puede delecionarse simplemente, o reemplazarse por un dominio de una PKS donante, o puede añadirse un dominio de una PKS donante al parental. En el caso en que se añade o reemplaza un dominio, el dominio donante puede derivarse de la sintasa parental, o de una sintasa diferente.

Estos métodos pueden utilizarse para mejorar la biosíntesis de la borrelidina, para producir nuevos derivados o análogos de borrelidina, u otras estructuras de poliquétidos o macrólidos. El número y la naturaleza de módulos en el sistema puede alterarse para cambiar el número y tipo de unidades extendedoras reclutadas, y para cambiar las diversas actividades de sintasa, reductasa y deshidratasa que determinan la estructura de la cadena del poliquétido. Tales cambios pueden hacerse por alteración del orden de los módulos que comprenden la PKS, por la duplicación o eliminación de módulos que comprenden la PKS, por la introducción de módulos de fuentes heterólogas, o por cualquier combinación de estos diversos enfoques.

Así, los dominios o módulos de la PKS de borrelidina pueden delecionarse, duplicarse, o intercambiarse con otros dominios o módulos de la PKS de borrelidina, o de sistemas PKS responsables de la síntesis de otros poliquétidos (sistemas PKS heterólogos, particularmente sistemas PKS tipo I), que pueden ser de diferentes cepas o especies bacterianas. Alternativamente, dominios o módulos de la PKS de borrelidina pueden introducirse en sistemas PKS heterólogos a fin de producir nuevos poliquétidos o macrólidos. Módulos combinatorios pueden intercambiarse también entre la poliquétido-sintasa de borrelidina y otras poliquétido-sintasas, extendiéndose estos módulos combinatorios entre dominios correspondientes de dos módulos de tipo natural, v.g. desde el AT de un módulo al AT del siguiente.

Por ejemplo, un módulo extendedor particular puede intercambiarse por uno que tenga especificidad para una unidad extendedora diferente (como se describe v.g. en WO 98/01571 y WO 98/01546), o mutarse para exhibir especificidad o selectividad para una unidad extendedora diferente, v.g. como se describe más adelante. Adicional o alternativamente, introducción, deleción, intercambio o mutación de dominios o módulos, tales como los dominios KR, DH y ER responsables del procesamiento de un resto \beta-ceto dado, pueden utilizarse para alterar el nivel de procesamiento reductor de una unidad extendedora durante la síntesis de los poliquétidos. Tales cambios pueden conducir también a cambios en la estereoquímica de los grupos alfa-alquilo y \beta-hidroxilo así formados por módulos alterados. En una realización preferida, el módulo borA5 puede introducirse en una PKS parental para proporcionar adición iterativa de unidades extendedoras a una cadena principal de poliquétido, v.g. por expansión del tamaño del anillo de un poliquétido macrólido con relación al producido naturalmente por la PKS parental.

El módulo de carga de borrelidina es el primer módulo de carga de PKS identificado que tiene especificidad para una unidad iniciadora de ácido di-carboxílico alicíclico. Así pues, este módulo o un derivado del mismo pueden utilizarse para producir unidades iniciadoras alicíclicas en las poliquétido-sintasas heterólogas. Esto no requiere estar limitado al uso del ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico utilizado normalmente como la unidad iniciadora de borrelidina. Se demuestra también en esta memoria que la molécula de carga de borrelidina es capaz de dirigir la incorporación de otras unidades iniciadoras que incluyen ácido trans-ciclobutano-1,2-dicarboxílico, ácido 2,3-metilsuccínico y ácido 2-metilsuccínico. La unidad iniciadora de borrelidina puede modificarse también en una célula productora de borrelidina, o reemplazarse por un módulo de carga heterólogo, para introducir unidades iniciadoras alternativas en el camino de síntesis de la borrelidina.

La posición del módulo de carga de la PKS puede seleccionarse (v.g. por fusión del mismo a una localización particular dentro de la PKS) a fin de controlar el tamaño del anillo de las moléculas poliquétido/macrólido resultantes.

Los dominios AT que determinan las unidades extendedoras ácido carboxílico-CoA-tioéster pueden delecionarse, modificarse o reemplazarse. Los dominios ACP pueden también delecionarse, modificarse o reemplazarse. Adicionalmente, pueden insertarse dominios que no están presentes normalmente en la PKS de borrelidina pero que se encuentran en otros sistemas PKS modulares y/o PKS/NRPS mixtos. Ejemplos incluyen, pero sin carácter limitante: dominios O-metil-transferasa, dominios C-metil-transferasa, dominios de epimerización, dominios de monooxigenasa y dominios de deshidrogenasa, dominios aminotransferasa y dominios de péptido-sintetasas no ribosómicos.

Adicionalmente, el dominio de tioesterasa de la PKS de borrelidina puede alterarse o reposicionarse (v.g. fusionarse a una localización seleccionada dentro de la PKS) a fin de cambiar su especificidad y/o con objeto de liberar moléculas poliquétido/macrólido con un tamaño de anillo seleccionado. Alternativamente, pueden insertarse dominios heterólogos de tioesterasa en la PKS de borrelidina para producir moléculas con tamaño de anillo alterado con relación a la molécula producida normalmente por la PKS parental, o para producir un ácido libre.

En otra alternativa adicional, los dominios de incorporación de aminoácidos y formación de macrolactama procedentes de sistemas NRPS/PKS mixtos tales como el de la rapamicina, o para sistemas afines tales como para la biosíntesis de rifamicina y biosíntesis de mixalamida, o módulos de sistemas NRPS (tal como para la biosíntesis de bleomicina) pueden insertarse en la PKS para producir nuevas moléculas afines a poliquétidos de origen mixto.

Los marcos de lectura abierta que codifican la PKS descrita en esta memoria pueden comprender también porciones codificantes de porciones no activas enzimáticamente que sin embargo tienen un papel funcional como regiones de entramado que separan y estabilizan los dominios enzimáticamente activos y/o módulos de la PKS a distancias y orientaciones apropiadas, y que pueden tener funciones de reconocimiento y enlace que ordenan los dominios y módulos de la PKS en la configuración espacial correcta. Así, las secuencias de ácido nucleico de la presente descripción comprenden secuencias que codifican tales regiones de entramado, sea solas o en combinación con secuencias que codifican dominios o módulos como se han descrito arriba. Se apreciará que las diversas manipulaciones de las secuencias codificantes de PKS arriba descritas pueden dar lugar a genes o sistemas PKS híbridos. Así pues, la presente descripción proporciona también ácidos nucleicos que codifican tales sistemas PKS híbridos. La descripción proporciona por tanto un constructo de ácido nucleico que comprende al menos una primera porción de ácido nucleico que codifica al menos un dominio de una PKS de borrelidina y una segunda porción o porciones de ácido nucleico que codifican al menos un dominio de PKS tipo I que es heterólogo a dicha PKS de borrelidina. En realizaciones preferidas, el constructo comprende un gen de poliquétido-sintasa híbrido, codificando dicho gen al menos un dominio de una PKS de borrelidina y al menos un dominio de PKS tipo I que es heterólogo a dicha PKS de borrelidina. Realizaciones preferidas adicionales son como se ha descrito arriba.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que cataliza un paso en la síntesis de una unidad iniciadora o sustrato para síntesis de poliquétidos, preferiblemente en la síntesis del resto ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico utilizado como unidad iniciadora por la PKS de borrelidina. El polipéptido puede tener actividad como una deshidrogenasa, 3-oxoacil-ACP-reductasa, ciclasa, deshidrogenasa dependiente de F420, o 2-hidroxihepta-2,4-dieno-1,7-dioato-isomerasa. Preferiblemente, el polipéptido comprende la secuencia codificada por uno del grupo de genes constituidos por borC, borD, borE, borF, borG, borH, borK, borL, borM y borN, como se muestra en SEQ ID NO: 8, 9, 10, 12, 13, 14, 17, 18, 19 ó 20.

Estos genes pueden estar delecionados, desorganizados, o desactivados de cualquier otro modo en una célula productora de borrelidina a fin de anular la producción de borrelidina. Líneas de células resultantes de tales cambios pueden complementarse químicamente por la adición de ácidos carboxílicos exógenos que pueden incorporarse en lugar de la unidad iniciadora natural. Así, pueden sintetizarse nuevas moléculas afines a borrelidina, que están iniciadas por el ácido carboxílico alimentado exógenamente. Un enfoque de este tipo se denomina mutasíntesis. Los genes responsables de la síntesis del ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico pueden introducirse en una célula productora de poliquétidos heterólogos para hacer posible que dicha célula sintetice el ácido dicarboxílico alicíclico como unidad iniciadora para su propia PKS.

Así, la presente descripción proporciona adicionalmente un método para la producción de borrelidina y análogos de borrelidina con títulos mejorados, comprendiendo dicho método desorganizar borG en la célula hospedadora, fermentar la línea de células resultante y alimentar un ácido carboxílico exógeno. En diversas realizaciones preferidas, el ácido carboxílico exógeno es ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico o el ácido carboxílico exógeno se selecciona del grupo constituido por ácido trans-ciclobutano-1,2-dicarboxílico, ácido 2,3-dimetil-succínico y ácido 2-metilsuccínico y/o el método adicional comprende delecionar, modificar o reemplazar uno o más genes biosintéticos de borrelidina, o dominios o módulos de poliquétido-sintasa de borrelidina. Una persona con experiencia en la técnica es sabedora de que las poliquétido-sintasas pueden expresarse también en hospedadores heterólogos, por lo que la presente descripción contempla también un método para la producción de títulos mayores de borrelidina y análogos de borrelidina en un hospedador heterólogo, comprendiendo dicho método transformar una célula hospedadora con la agrupación de genes de borrelidina entero con la excepción de borG o desorganizar el gen borG in situ una vez que se ha transferido la agrupación de genes.

Alternativamente, genes responsables para la síntesis de la unidad iniciadora pueden sobre-expresarse a fin de mejorar los títulos de fermentación de borrelidina o moléculas afines a borrelidina. Así pues, la presente descripción proporciona adicionalmente un método para aumentar el título de borrelidina y derivados de borrelidina o moléculas afines a borrelidina y sus derivados, comprendiendo dicho método regular en sentido creciente un gen biosintético de borrelidina implicado en la producción de la unidad iniciadora, seleccionándose dicho gen del grupo constituido por borC, borD, borE, borF, borH, borK, borL, borM y borN, siendo en una realización preferida el gen regulado en sentido creciente borE o borL.

En otro enfoque, los genes responsables de la síntesis de la unidad iniciadora pueden modificarse, o reemplazarse por otros genes sintéticos que dirigen la producción de ácidos carboxílicos alterados, conduciendo a la producción de moléculas afines a borrelidina. Estas técnicas pueden complementarse por la modificación del módulo de carga de la PKS como se ha descrito arriba.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica polipéptido que cataliza un paso en la modificación de una cadena lateral de un resto de poliquétido, por ejemplo en la conversión de un grupo metilo en un resto nitrilo, v.g. en C12 de pre-borrelidina (14). El polipéptido puede tener actividad como una oxidasa del citocromo P450, amino-transferasa, o NAD/quinona-oxidorreductasa. Preferiblemente, el polipéptido comprende la secuencia codificada por uno del grupo de genes constituido por borI, borJ, borK como se muestra en SEQ ID NO: 15, 16 ó 17.

Varios de estos genes pueden estar delecionados/desactivados de tal manera que se acumulen moléculas afines a borrelidina, o metabolitos de derivación de las mismas, que representan etapas intermedias del proceso que introduce el resto nitrilo. La adición de genes heterólogos a tales sistemas puede permitir la elaboración alternativa de cualesquiera compuestos intermedios biosintéticos acumulados o metabolitos de derivación de los mismos. Alternativamente, los genes pueden mutarse a fin de alterar su especificidad de sustrato de tal modo que funcionen en posiciones alternativas de moléculas pre-borrelidina a fin de proporcionar moléculas afines a borrelidina. Adicionalmente, los genes responsables de la formación del grupo nitrilo pueden sobre-expresarse a fin de mejorar los títulos de fermentación de borrelidina o moléculas afines a borrelidina.

Alternativamente, uno, algunos o la totalidad de estos genes pueden introducirse en células capaces de producir otros poliquétidos para proporcionar el procesamiento deseado de la cadena lateral de dicho poliquétido, v.g. la introducción de un resto nitrilo. Esto abre la posibilidad de introducción específica biosintética de restos nitrilo en poliquétidos, particularmente en cadenas laterales derivadas de unidades extendedoras metilmalonil-CoA o etilmalonil-CoA. También pueden utilizarse enzimas purificadas (véase más adelante) para efectuar la conversión de las cadenas laterales de poliquétido en restos nitrilo in vitro.

Las secuencias de nucleótidos de la descripción pueden ser porciones de la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1, o el complemento de la misma, o mutantes, variantes, derivados o alelos de estas secuencias. Las secuencias pueden diferir de la representada por un cambio que es uno o más de adición, inserción, deleción y sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia representada. Cambios a una secuencia de nucleótidos codificante pueden dar como resultado un cambio de aminoácido al nivel de proteína, o no, tal como se determina por la redundancia del código genético. Así, el ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción puede incluir una secuencia diferente de la secuencia representada en SEQ ID NO: 1 pero codificar todavía un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos. Preferiblemente mutantes, variantes, derivados o alelos de las secuencias proporcionadas codifican polipéptidos que tienen la misma actividad enzimática que los descritos en esta memoria.

En el caso en que la secuencia es una secuencia codificante, el polipéptido codificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere en uno o más residuos de aminoácido de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID Nos. 2 a 43 y 113. Se proporciona adicionalmente por la presente descripción un ácido nucleico que codifica un polipéptido que es una secuencia de aminoácidos mutante, variante, derivado o alelo de cualquiera de las secuencias mostradas. Tales polipéptidos se exponen más adelante. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de este tipo puede exhibir una identidad mayor que aproximadamente 60% con la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1, identidad mayor que aproximadamente 70%, identidad mayor que aproximadamente 80%, o identidad mayor que aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con el mismo. El porcentaje de identidad puede calcularse utilizando uno de los programas tales como BLAST o BestFit comprendidos dentro del paquete de soporte lógico Genetics Computer Group (GCG) Version 10, disponible de la Universidad de Wisconsin, utilizando parámetros por defecto.

En realizaciones preferidas, sean codificantes o no codificantes, las secuencias de nucleótidos de la descripción son capaces de hibridación específica con al menos una porción de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o el complemento de la misma.

Por ejemplo, pueden realizarse hibridaciones de acuerdo con el método de Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989), utilizando una solución de hibridación que comprende: 5X SSC, 5X Reactivo Denhardt, 0,5-1,0% SDS, 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado, 0,05% de pirofosfato de sodio y hasta 50% de formamida. La hibridación se lleva a cabo a 37-42ºC durante al menos 6 horas. Después de la hibridación, los filtros se lavan como sigue: (1) 5 minutos a la temperatura ambiente en 2X SSC y 1% SDS; (2) 15 minutos a la temperatura ambiente en 2X SSC y 0,1% SDS; (3) 30 minutos-1 hora a 37ºC en 1X SSC y 1% SDS; (4) 2 horas a 42-65ºC en 1X SSC y 1% SDS, cambiando la solución cada 30 minutos.

Una fórmula común para calcular las condiciones de severidad requeridas para conseguir hibridación entre moléculas de ácido nucleico de una homología de secuencia especificada es (Sambrook et al., 1989):

T_{m} = 81,5^{o}C + 16,6Log[Na+] + 0,41 \ (% \ G+C) - 0,63 \ (% \ formamida) - 600/#pb \ en \ dúplex

Como ilustración de la fórmula anterior, utilizando [Na+] = [0,368] y 50% formamida, con contenido de GC de 42% y un tamaño medio de sonda de 200 bases, la T_{m} es 57ºC. La T_{m} de un dúplex de DNA disminuye en 1-1,5ºC con cada 1% de disminución de homología. Así pues, dianas con identidad de secuencia mayor que aproximadamente 75% podrían observarse utilizando una temperatura de hibridación de 42ºC. Dicha hibridación se consideraría sustancialmente específica para la secuencia de ácido nucleico de la presente descripción.

Los ácidos nucleicos de la presente descripción comprenden preferiblemente al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1. Los mismos pueden comprender 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 300, 500 ó más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1.

Los ácidos nucleicos pueden utilizarse como p.ej. cebadores o sondas para la identificación de nuevos genes u otros elementos genéticos, tales como secuencias reguladoras de la transcripción, de agrupaciones de genes biosintéticos de poliquétidos o macrólidos, v.g. secuencias codificantes de enzimas de la PKS o dominios o módulos de las mismas enzimas implicadas en la biosíntesis de una unidad iniciadora, enzimas modificadoras de cadenas laterales de restos de poliquétidos, transportadores, genes de resistencia y moléculas reguladoras como se describe.

Así pues, la presente descripción proporciona un método de identificación de una nueva agrupación de genes biosintéticos de poliquétidos, o una porción de la misma, que comprende hibridar una muestra de ácido nucleico diana con un ácido nucleico de la presente descripción capaz de hibridarse específicamente a un ácido nucleico que tenga la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una porción del mismo. El ácido nucleico diana puede ser cualquier ácido nucleico adecuado, y preferiblemente es DNA genómico bacteriano.

Típicamente, el método comprende además el paso de detectar hibridación entre la muestra de ácido nucleico y el ácido nucleico de la descripción. La hibridación puede medirse utilizando cualquiera de una diversidad de métodos a disposición de los expertos en la técnica. Por ejemplo, las sondas pueden marcarse por radiactividad, por fluorescencia o por adición de enzimas. Otros métodos que no emplean marcación de las sondas incluyen amplificación utilizando PCR, escisión con RNAasas, y utilización de sondas de oligonucleótidos alelo-específicas.

Un método puede incluir la hibridación de una o más (v.g. dos) sondas o iniciadores al ácido nucleico diana. Donde el ácido nucleico es DNA bicatenario, la hibridación irá precedida generalmente por desnaturalización para producir DNA monocatenario. La hibridación puede ser como parte de un procedimiento PCR, o como parte de un procedimiento de sondeo que no implique PCR. Un procedimiento ilustrativo podría ser una combinación de PCR e hibridación de baja severidad. Un procedimiento de exploración, seleccionado de los muchos disponibles para los expertos en la técnica, se utiliza para identificar con éxito sucesos de hibridación y el ácido nucleico hibridado aislado.

Los expertos en la técnica están perfectamente capacitados para emplear condiciones adecuadas de la severidad deseada para hibridación selectiva, teniendo en cuenta factores tales como la longitud de oligonucleótidos y composición de las bases, temperatura, etcétera, como se ha descrito arriba.

Una molécula de ácido nucleico aislada de la descripción puede ser una molécula de ácido nucleico aislada existente naturalmente (es decir aislada o separada de los componentes con los cuales se encuentra normalmente en la naturaleza) tal como libre o esencialmente libre del ácido nucleico flanqueante del gen en el genoma bacteriano, excepto posiblemente una o más secuencias reguladoras para la expresión. El ácido nucleico puede ser total o parcialmente sintético y puede incluir DNA genómico, cDNA o RNA. En los casos en que el ácido nucleico de acuerdo con la descripción incluye RNA, la referencia a la secuencia representada debería interpretarse como referencia al RNA equivalente, con U en lugar de T.

La presente descripción proporciona adicionalmente un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción. El vector es preferiblemente un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de una agrupación de genes biosintéticos de poliquétido (preferiblemente una agrupación de genes biosintéticos de borrelidina), o una porción de la misma, como se describe. Pueden seleccionarse o construirse vectores adecuados que comprenden ácido nucleico para introducción en bacterias u hospedadores eucariotas, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias intensificadoras, genes marcadores y otras secuencias en caso apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, v.g. "fago", o "fagémido", según sea apropiado. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989. Muchas técnicas conocidas y protocolos para manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de DNA en células y expresión de genes, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel et al. Eds, John Wiley & Sons 1992. Las descripciones de Sambrook et al. y Ausubel et al. se incorporan en esta memoria por referencia.

En otro de sus aspectos, la presente descripción proporciona un polipéptido aislado codificado por una molécula de ácido nucleico de la descripción como se describe en esta memoria. Más particularmente, se proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera o más de SEQ ID Nos. 2 a 43 y 113 o una porción de las mismas. Como se ha expuesto anteriormente, estas secuencias de aminoácidos representan traducciones de los marcos de lectura abierta más largos posibles presentes en la secuencia de SEQ ID NO: 1 y el complemento de la misma. El primer aminoácido se representa siempre como Met, con indiferencia de si el codón de iniciación es ATG, GTG, CGT o TTG.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "polipéptido(s)" incluye péptidos, polipéptidos y proteínas, utilizándose estos términos de modo intercambiable a no ser que se especifique otra cosa.

Un polipéptido que es una secuencia de aminoácidos variante, alelo, derivado o mutante de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas puede exhibir al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con el polipéptido de una cualquiera de las SEQ ID Nos. 2 a 43 y 113, o con una porción de la misma. Variantes de secuencias de aminoácidos particulares pueden diferir de las representadas por inserción, adición, sustitución o deleción de 1 aminoácido, 2, 3, 4, 5-10, 10-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-150, o más de 150 aminoácidos. El porcentaje de identidad puede calcularse utilizando uno de los programas tales como FASTA o BestFit del paquete de soporte lógico de Genetics Computer Group (GCG) Version 10, disponible de la Universidad de Wisconsin, utilizando parámetros por defecto.

La presente descripción incluye también porciones activas, fragmentos, y derivados de los polipéptidos de la descripción.

Una "porción activa" significa un péptido que es menor que el polipéptido de longitud total, pero que requiere al menos algo de su actividad biológica esencial. Por ejemplo, dominios o módulos aislados de la PKS como se ha descrito arriba pueden considerarse como porciones activas de la PKS.

Un "fragmento" significa un tramo de residuos de aminoácidos de al menos cinco, al menos seis, o al menos siete aminoácidos contiguos, a menudo al menos ocho o al menos nueve aminoácidos contiguos, típicamente al menos 10, al menos 13 aminoácidos contiguos y, muy preferiblemente, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 50, al menos 75, al menos 100 o más aminoácidos contiguos. Fragmentos de la secuencia pueden comprender determinantes antigénicos o epítopes útiles para generar anticuerpos para una porción del polipéptido relevante. Así, el polipéptido no necesita comprender una secuencia completa proporcionada en cualquiera de SEQ ID Nos. 2 a 43 y 113, sino que puede comprender una porción de las mismas que tenga la actividad deseada, v.g. un dominio o módulo aislado, tal como los de la PKS arriba descrita. Debe indicarse que los términos parte, porción y fragmento se utilizan intercambiablemente en esta memoria descriptiva; no debe adscribirse significado particular alguno al uso específico de uno de estos términos en cualquier contexto particular.

Un "derivado" de un polipéptido de la descripción o un fragmento del mismo significa un polipéptido modificado por variación de la secuencia de aminoácidos de la proteína, v.g. por manipulación del ácido nucleico codificante de la proteína o por alteración de la proteína propiamente dicha. Tales derivados de la secuencia de aminoácidos natural pueden implicar inserción, adición, deleción o sustitución de uno, dos, tres, cinco o más aminoácidos, sin alterar fundamentalmente la actividad esencial del polipéptido de tipo salvaje.

Los polipéptidos de la descripción se proporcionan en forma aislada, v.g. aislados de uno o más componentes con los cuales se encuentran normalmente asociados en la naturaleza. Aquéllos pueden aislarse de un hospedador en el cual se expresan los mismos naturalmente, o pueden ser sintéticos o recombinantes.

La presente descripción abarca también un método de producción de un polipéptido (como se describe), incluyendo el método la expresión de ácido nucleico codificante del polipéptido (generalmente ácido nucleico de acuerdo con la descripción). Esto puede conseguirse convenientemente dejando crecer una célula hospedadora en cultivo, que contenga un vector de expresión como se ha descrito arriba, en condiciones apropiadas que causen o permitan la expresión del polipéptido. Los polipéptidos pueden expresarse también en sistemas in vitro, tales como sistemas de lisado de reticulocitos.

El método puede incluir el paso de introducir el ácido nucleico en una célula hospedadora. La introducción, a la cual puede hacerse referencia generalmente sin limitación como "transformación" (particularmente para la introducción in vitro), puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción utilizando retrovirus u otros virus, v.g. vaccinia o, en el caso de células de insecto, baculovirus. Para células bacterianas, técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, conjugación, electroporación y transfección utilizando bacteriófago. Como alternativa, podría emplearse la inyección directa del ácido nucleico. Genes marcadores tales como genes de resistencia o sensibilidad a antibióticos pueden utilizarse en la identificación de clones que contienen el ácido nucleico de interés, como es bien conocido en la técnica.

Células hospedadoras preferidas incluyen Actinomicetos, preferiblemente Estreptomicetos, y en particular los seleccionados del grupo constituido por Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces coelicolor, Streptomyces avermitilis, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces cinnamonensis, Micromonospora griseorubida, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces fradiae, Streptomyces longisporoflavus, Streptomyces lasaliensis, Streptomyces tsukubaensis, Streptomyces griseus, Streptomyces venezuelae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces lividans, Streptomyces rimosus y Streptomyces albus, Streptomyces rochei ATCC23956, Streptomyces parvulus Tü113 y Streptomyces parvulus Tü4055, más preferiblemente seleccionados del grupo constituido por Streptomyces rochei ATCC23956, Streptomyces parvulus Tü113 y Streptomyces parvulus Tü4055.

En su aspecto principal, la invención proporciona moléculas que pueden derivarse de los objetos de la descripción y compuestos modificados formados a partir de ellas y métodos para su producción. Las moléculas derivadas de los objetos de la descripción se representan por la Fórmula 1 y se extienden a sales farmacéuticamente aceptables de la misma, en donde:

1

R_{1} es un grupo cicloalquilo sustituido como se muestra a continuación;

2

en donde R_{1} puede estar sustituido también opcionalmente con uno o más átomos de halógeno o uno o más grupos alquilo C_{1} a C_{3}; R_{2}, R_{3}, R_{6}, o R_{11} son cada uno independientemente H, OCH_{3}, CH_{3} o CH_{2}CH_{3}; y R_{4} es CN, CO_{2}H o CH_{3}.

En realizaciones preferidas,

(a)

R_{4} es CH_{3} o COOH

(b)

R_{1} es ciclobutano-1'-carboxilato

(c)

R_{6} es CH_{3}, R_{2} y R_{11} son H, y R_{1} es ciclobutano-1'-carboxilato

(d)

R_{1} es ciclobutano-1'-carboxilato, y R_{4} es CH_{3} o COOH.

Los compuestos de la presente invención pueden tener actividad inhibidora de la tRNA-sintetasa (v.g. los mismos pueden inhibir treonil-, tirosinil-, o triptofanil-tRNA-sintetasa). Pueden exhibir actividad anti-microbiana, con inclusión de actividad contra parásitos intra- o extracelulares y organismos tales como bacterias, espiroquetas (v.g. Treponema), malaria, virus y hongos. Adicional o alternativamente, aquéllos pueden tener actividad anti-proliferativa contra células de mamífero, y/o actividad anti-angiogénica, sea como resultado de la inhibición de la tRNA-sintetasa, o por cualquier otro modo de acción. Esto puede hacer que los compuestos de la presente invención sean particularmente adecuados como agentes anti-cáncer (v.g. agentes para el tratamiento de cáncer intestinal, cáncer de próstata u otros), y pueden proporcionar también aplicación en el tratamiento de otros trastornos proliferativos, tales como psoriasis, o condiciones en las cuales ocurre vascularización inadecuada, tales como psoriasis, artritis reumatoide, ateroesclerosis y retinopatía diabética.

Los compuestos de la presente invención pueden formularse en composiciones farmacéuticamente aceptables, v.g. por mezcla con un excipiente, vehículo, tampón, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales composiciones caen también dentro del alcance de la presente invención.

Dichos materiales farmacéuticamente aceptables deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material puede depender de la ruta de administración, v.g. las rutas oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular o intraperitoneal.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden encontrarse en forma de tableta, cápsula, polvo o líquido. Una tableta puede incluir un vehículo sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen generalmente un vehículo líquido tal como agua, éter de petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Puede incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo se encontrará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que está exenta de pirógenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Las personas con experiencia relevante en la técnica están perfectamente capacitadas para preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer o Inyección de Ringer con Lactato. En caso requerido, pueden incluirse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos. Ejemplos de las técnicas y protocolos arriba mencionados pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, Edición 20ª, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.

La invención proporciona adicionalmente los compuestos y composiciones arriba descritos para uso en un método de tratamiento médico. Se proporciona también el uso de los compuestos de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de afecciones microbianas (con inclusión de la malaria), para la inhibición de la angiogénesis, para el tratamiento de trastornos proliferativos, o para el tratamiento de afecciones caracterizadas por vascularización inadecuada, como se ha descrito arriba.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la estructura de borrelidina y algunos metabolitos afines asilados de organismos productores de borrelidina.

La Figura 2 ilustra los patrones de incorporación para sustratos de extensión marcados con el isótopo estable ^{13}C y la posición de los carbonos derivados de la unidad iniciadora ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico.

La Figura 3 ilustra la organización de la agrupación de genes biosintéticos de borrelidina. Sitios de restricción: B, BamHI; Bc, Bc/I; E, EcoRI; X, XhoI.

La Figura 4 ilustra un esquema que muestra el camino de biosíntesis propuesto para la unidad iniciadora ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico.

La Figura 5 ilustra la organización de la PKS de borrelidina y la biosíntesis de la molécula de pre-borrelidina.

La Figura 6 ilustra la ruta biosintética propuesta para la introducción del resto nitrilo en la posición C12 de borrelidina.

La Figura 7 ilustra la estructura propuesta de la molécula 6.

La Figura 8 ilustra la estructura propuesta de las moléculas 7 & 8.

La Figura 9 ilustra la caracterización molecular de la del camino catabólico del ácido 4-hidroxifenilacético en E. coli W.

La Figura 10 ilustra las estructuras de las moléculas 18-20.

La Figura 11 ilustra las estructuras de las moléculas 21-26.

Descripción detallada de la invención

Una genoteca de cósmidos de DNA genómico de S. parvulus Tü4055 se construyó utilizando fragmentos obtenidos de una digestión parcial con Sau3AI que se clonaron en pWE15 y se introdujeron en células E. coli utilizando el kit Gigapack® III Gold Packaging Extract (Stratagene). Una genoteca de 3000 transformantes de E. coli se exploró con respecto a homología utilizando una sonda marcada que se generó utilizando el DIG DNA Labelling and Detection Kit (Roche). La sonda utilizada era un fragmento BglII-BamHI de 1,7 kpb obtenido del gen que codifica el módulo 6 de la tercera subunidad de la PKS de oleandomicina de Streptomyces antibioticus (Swan et al., 1994).

Se seleccionaron clones que daban una respuesta positiva y se aisló el DNA de cósmido. El DNA de cósmido se digirió con BamHI y los fragmentos de tamaño menor que 3 kpb se sub-clonaron en pOJ260 (Bierman et al., 1992). Los plásmidos se utilizaron luego para transformar protoplastos de S. parvulus Tü4055 y los mutantes resultantes se exploraron respecto a la capacidad para producir borrelidina. Se identificaron dos mutantes como no productores de borrelidina, los dos cuales se derivaban de plásmidos que contenían fragmentos de cosBor32A2. Estos dos fragmentos tenían un tamaño de 1,97 y 2,80 kpb, y se identificaron más tarde como fragmentos adyacentes que codificaban partes de la PKS de borrelidina (borA2 & bor-A3). Utilizando cosBor32A2 como sonda, se identificó un segundo cósmido solapante, cosBor19B9, de la genoteca original. Estos dos cósmidos son suficientes para cubrir la agrupación de genes biosintéticos de borrelidina entero (véase la Figura 3).

La secuencia de nucleótidos completa de cosBor32A2 y cosBor19B9 se determinó por secuenciación con perdigonada de una genoteca de subclones derivados de Sau3AI para cada cósmido, constituida por fragmentos de 1,5-2,0 kpb en pHSG397 (Takeshita et al., 1987). Detalles específicos se proporcionan en el Ejemplo 3. La secuencia codificante de nucleótidos completa solapante para cosBor32A2 y cosBor19B9 se presenta como SEQ ID NO: 1. La región codificada por el cósmido cosBor32A2 representa la secuencia de las posiciones de nucleótidos 0-40217 pb de SEQ ID NO: 1. La región codificada por el cósmido cosBor19B9 está superpuesta a esta región por 4452 nucleótidos, y corresponde a las posiciones de nucleótidos 35766-74787 pb de SEQ ID NO: 1. Como se describe con mayor detalle en el texto que sigue, los autores de la presente invención han realizado experimentos de desactivación de genes utilizando muchos de los marcos de lectura abierta identificados codificados dentro de SEQ ID NO: 1, y esto ha conducido a los autores de la invención a identificar los límites de la agrupación. La agrupación de genes biosintéticos de borrelidina está contenida entre las posiciones de nucleótidos 7603 y 59966 de SEQ ID NO: 1 (borB a borO, lo que incluye la región borA). Así, estos esfuerzos combinados han conducido a los autores de la invención a la identificación y secuenciación de la región de DNA que abarca la agrupación de genes biosintéticos de borrelidina entero, y a la identificación y descripción de las secuencias funcionales codificadas dentro de esta región.

Genes PKS

Codificados entre las posiciones 16184-50742 de SEQ ID NO: 1 se encuentran 6 marcos de lectura abierta que exhiben una homología muy alta con los genes que codifican las PKSs de organismos productores de macrólidos conocidos. Estos genes se designan borA1, borA2, borA3, borA4, borA5 y borA6, y codifican la PKS de borrelidina como se demostró anteriormente por desorganización de una región de 1,97 kpb dentro de borA2. Los 6 marcos de lectura abierta están dispuestos de manera cabeza-a-cola y cada uno de ellos está terminado por un codón de parada en marco. La secuencia de nucleótidos y los detalles de la secuencia de polipéptidos correspondiente se muestran a continuación en la Tabla 1:

TABLA 1

500

El gen borA1 codifica el módulo de comienzo o de carga (SEQ ID NO: 1, posición 16184-18814). La asignación del codón inicial no es obvia para este marco de lectura abierta. El codón inicial dado aquí es el que los autores de la invención creen es el verdadero codón inicial, pero existen al menos otros 3 codones iniciales posibles entre el primero y el comienzo de la secuencia de dominio AT0, y una persona con experiencia en la técnica apreciará que puede ser posible generar proteína activa utilizando uno de estos codones iniciales alternativos. El codón inicial dado aquí deja una cola importante N-terminal de 321 aminoácidos que preceden al dominio AT0. Para comparación, la cola N-terminal que precede al AT0 del módulo de carga de eritromicina tiene 108 aminoácidos, y la del módulo de carga de avermectina tiene 28 aminoácidos. Por consiguiente, es posible que uno de los otros codones iniciales candidato pudiera ser correcto; los más probables de éstos se encuentran en las posiciones 16298, 16607 y 16901 de SEQ ID NO: 1. La longitud de la cola N-terminal sugiere que la misma podría representar posiblemente una actividad catalítica, aunque no tiene homología significativa alguna con otras secuencias en las bases de datos. La posición de la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente para cada uno de los dominios funcionales dentro del módulo inicial se identifican a continuación en la Tabla 2:

TABLA 2

3

El gen borA2 codifica el primer módulo de extensión (SEQ ID NO: 1, Posición 18875-23590). La posición de la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente para cada uno de los dominios funcionales dentro del primer módulo de extensión se identifican a continuación en la Tabla 3:

TABLA 3

4

El gen borA3 codifica los módulos de extensión segundo y tercero (SEQ ID NO: 1, posición 23686-34188). La posición de la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente para cada uno de los dominios funcionales dentro de los módulos de extensión segundo y tercero se identifican a continuación en la Tabla 4:

TABLA 4

5

El gen borA4 codifica el cuarto módulo de extensión (SEQ ID NO: 1, posición 34185-39047). La posición de la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente para cada uno de los dominios funcionales dentro del cuarto módulo de extensión se identifican a continuación en la Tabla 5:

TABLA 5

6

El gen borA5 codifica el quinto módulo de extensión (SEQ ID NO: 1, posición 39122-45514). La posición de la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente para cada uno de los dominios funcionales dentro del quinto módulo de extensión se identifican a continuación en la Tabla 6:

TABLA 6

7

El gen borA6 codifica el sexto módulo de extensión y la tioesterasa de terminación de cadena (SEQ ID NO: 1, posición 45514-50742). La posición de la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente para cada uno de los dominios funcionales dentro del sexto módulo de extensión se identifican a continuación en la Tabla 7:

TABLA 7

8

La identificación de dominios funcionales y sus límites como se describen en lo mencionado anteriormente se determinan sobre la base de las similitudes con las secuencias de aminoácidos conservadas de otras PKSs modulares tales como las correspondientes a las biosíntesis de rapamicina (Schwecke et al., 1995; Aparicio et al., 1996) y eritromicina (Cortés et al., 1990). Los límites de los dominios catalíticos se establecen sobre la base de la homología con otras agrupaciones de PKS y el punto seleccionado en el cual comienza o termina un dominio no está definido absolutamente, sino que se selecciona basándose en las consideraciones mencionadas anteriormente. En el caso de los dominios de procesamiento \beta-ceto es menos obvio, dado que existe típicamente una región de gran tamaño no asimilada a un dominio funcional que precede al dominio KR. Esta región puede ser estructuralmente importante, o puede ser requerida para estabilidad del dímero de PKS. Una característica extraña de la PKS de borrelidina es que todos los dominios enzimáticos individuales parecen ser catalíticamente competentes sobre la base de su secuencia de oligonucleótidos/aminoácidos, y todos ellos son necesarios a fin de proporcionar el procesamiento \beta-ceto requerido para producir los grupos funcionales observados en la borrelidina. Esto es bastante extraño, dado que la mayoría de las secuencias PKS modulares comunicadas hasta ahora contienen uno o más dominios inactivos, siendo una excepción por ejemplo la PKS de espinosina (Waldron et al., 2001; US 6.274.50).

Un experto en la técnica está familiarizado con la degeneración del código genético; por tanto, el técnico experto puede modificar las secuencias de DNA específicas proporcionadas por esta descripción para producir proteínas que tengan las mismas características alteradas o mejoradas comparadas con los polipéptidos que se proporcionan específicamente en esta memoria. Un experto en la técnica puede modificar también las secuencias de DNA para expresar un polipéptido idéntico a los proporcionados, aunque expresado a niveles más altos. Adicionalmente, un experto en la técnica está familiarizado con medios para preparar sintéticamente, sea parcialmente o en su totalidad, secuencias de DNA que podrían ser útiles en la preparación de vectores de DNA recombinante o secuencias codificantes que están abarcados por la presente descripción. Adicionalmente, medios recombinantes para modificar las secuencias de DNA proporcionadas pueden incluir por ejemplo deleción orientada o mutagénesis orientada. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica y no precisan ser explicados aquí adicionalmente. Por consiguiente, como se utiliza en esta memoria, el DNA aislado de fuentes naturales, preparado sintéticamente o semi-sintéticamente, o que está modificado por métodos de DNA recombinantes, está dentro del alcance de la presente descripción.

Análogamente, los expertos en la técnica reconocerán que los polipéptidos de la descripción pueden expresarse recombinantemente. De modo alternativo, dichos polipéptidos pueden sintetizarse sea totalmente o en parte, por técnicas convencionales conocidas no recombinantes; por ejemplo, síntesis en fase sólida. Así, la presente descripción no debería interpretarse como limitada necesariamente a cualquier construcción de vector específica o medios para producción de las moléculas de agrupaciones biosintéticas específicas con inclusión de las moléculas de poliquétido-sintasa citadas como ejemplos.

El módulo de carga de la PKS de borrelidina existe como una proteína discreta. Esto es más bien extraño, dado que la mayoría de los módulos de carga se encuentran en la misma proteína como el primer módulo de extensión. Excepciones a ello incluyen, por ejemplo, las PKSs de nistatina (Brautaset et al., 2000) y de anfotericina (Caffrey et al., 2001). El módulo de carga, que está constituido por un didominio AT-ACP, es similar al módulo de carga de especificidad amplia de la PKS de avermectina, que acepta cierto número de adiciones iniciadoras alternativas, y son de uso en la generación de genotecas de nuevos poliquétidos (Marsden et al., 1998; Pacey et al., 1998). El dominio AT del módulo de carga de PKS de borrelidina diverge de la gran mayoría de los dominios AT dado que el residuo serina del sitio activo está reemplazado con una cisteína de tal manera que el motivo del sitio activo es GXCXG (específicamente GHCYG). En las secuencias de dominios AT de PKS tipo I disponibles, el motivo del sitio activo conservado es GXSXG; el mismo motivo se observa en lipasas, sintasas de ácidos grasos y la mayoría de las tioesterasas. La serina nucleofílica está sustituida por cisteína en dos dominios RNPS de tioesterasa, específicamente las sintetasas responsables de la producción de micobactina y piochelina (Shaw-Reid et al., 1999). Un motivo GXCXG se observa también en un dominio semejante a tioesterasa de orf1 en la agrupación de bialafós (Raibaud et al., 1991). Se ha sugerido que, dado que no es posible moverse entre los dos tipos de codones serina por un solo cambio de base, los sitios activos que contienen un residuo serina esencial pueden encontrarse en dos líneas de descenso desde una enzima antigua ancestral que tenía una cisteína en lugar de una serina en su sitio activo (Brenner, 1988). La presencia de enzimas que contienen cisteína en el sitio activo puede soportar este punto de vista. Alternativamente, puede ocurrir que la cisteína se presente en estos sitios activos debido a que es posible moverse desde un tipo de codón serina al otro por la vía de una cisteína que podría mantenerse activa. Los dominios AT de las PKSs seleccionan una unidad de ácido carboxílico particular como sustrato. Se ha demostrado que esta selectividad está en correlación con ciertas configuraciones de motivos dentro del dominio AT (Reeves et al., 2001; WO 02/14482). El motivo del dominio AT del módulo de carga de borrelidina difiere de cualesquiera descritos hasta ahora, lo cual no es sorprendente, dado que este dominio AT es el primero en ser secuenciado que selecciona un ácido dicarboxílico alicíclico. Los dominios AT para los módulos de extensión de PKS de borrelidina exhiben el motivo del sitio activo esperado GXSXG, y contienen también cada uno los motivos esperados para la selección de malonil-CoA o metilmalonil-CoA (Reeves et al., 2001; WO 02/14482). Los dominios AT selectivos de malonil-CoA (AT1, AT2 y AT6) exhiben semejanza muy alta unos respecto a otros, tanto a nivel de proteína como a nivel de DNA. Lo mismo sucede para los dominios AT selectivos de metilmalonil-CoA (AT3, AT4 y AT5); dos de estos dominios AT (AT3 y AT4) tienen secuencias de aminoácidos idénticas a todo lo largo de la región conservada. La alta semejanza de AT5 con AT3 y AT4 es evidencia de que la unidad extendedora seleccionada en el módulo 5 es metilmalonil-CoA, y que el grupo metilo C12 de la borrelidina así incorporado se modifica subsiguientemente para dar una función nitrilo después de la incorporación en la PKS.

Para demostrar que es posible alterar la estructura de borrelidina derivada de PKS, el dominio AT del módulo 4 (el dominio AT codificado por borA4) se reemplaza por el dominio AT del módulo 2 de la PKS de rapamicina (rapAT2) utilizando una estrategia de reemplazamiento (véase el Ejemplo 6). Esto da la cepa S. parvulus Tü4055/467. Después de fermentación y análisis por LCMS de los extractos de cultivo de este mutante, puede determinarse que se produce algo de borrelidina y se observa también un compuesto nuevo más polar con un valor m/z 14 unidades menor que la borrelidina. Esto es consistente con la incorporación de un malonato más bien que una unidad extendedora metilmalonato por el módulo 4 de la PKS para producir 10-desmetil-borrelidina 3. Además de la producción por métodos de intercambio de dominios, 3 se genera también por introducción de mutaciones específicas en el motivo de selectividad del dominio AT del módulo 4 (Reeves et al., 2001; WO 02/14482) (véase el Ejemplo 7). Un cambio de este tipo afecta la selectividad del dominio AT de tal modo que selecciona una molécula sustrato de malonil-CoA con preferencia a metilmalonil-CoA. Así pues, el motivo de aminoácidos YASH en las posiciones 739 a 742 de SEQ ID NO: 5 está mutado a HAFH para dar la cepa S. parvulus Tü4055/472. Después de fermentación y análisis por LCMS de los extractos de cultivo de este mutante, se determina que se produce borrelidina además de un nuevo compuesto más polar con un valor m/z 14 unidades menor que la borrelidina. Este nuevo compuesto es idéntico al descrito arriba y por tanto es consistente con la incorporación de un malonato más bien que una unidad extendedora metilmalonato por el módulo 4 de la PKS para producir 3.

Estos resultados indican claramente que la PKS de borrelidina es susceptible de manipulación genética y del intercambio de la secuencia nativa por la de una cepa heteróloga. Está claro para un experto en la técnica que la modificación por ingeniería genética de biosíntesis por los métodos arriba descritos, de la PKS de borrelidina conducirá a la producción de nuevas moléculas afines a borrelidina.

Genes distintos de PKS

Tanto aguas arriba como aguas abajo de los genes codificantes de PKS se encuentran otros marcos de lectura abiertos implicados en la biosíntesis de borrelidina. Un marco de lectura abierto (orf) está diseñado como constituido por al menos 100 nucleótidos contiguos, que comienzan con un codón de iniciación apropiado y termina con un codón de parada apropiado, y que tiene una preferencia de codones apropiada para regiones codificantes de proteínas de un organismo cuyo DNA es rico en los nucleótidos guanina y citosina. En la secuencia de DNA tanto aguas arriba como aguas abajo de los genes PKS de borrelidina (borA1-borA6) existen cierto número de orfs que podrían identificarse por comparación con otras secuencias en la base de datos NCBI (véase la Figura 3). Los detalles de secuencias de nucleótidos de estos orfs se dan a continuación en la Tabla 8:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 8

9

TABLA 8 (continuación)

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10

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Funciones potenciales de los polipéptidos predichos (SEQ ID NO: 7 a 43) se obtuvieron de la base de datos NCBI utilizando una búsqueda BLAST. Los apareamientos óptimos obtenidos de estas búsquedas se describen a continuación en la Tabla 9:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 9

11

TABLA 9 (continuación)

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TABLA 9 (continuación)

13

TABLA 9 (continuación)

14

El análisis de las funciones de los productos génicos supuestos indica que los genes borB a borO forman muy probablemente los límites de la agrupación biosintética de borrelidina. La evidencia para soportar esto llegó de la desorganización de borB2 que produjo borrelidinaa niveles indistinguibles de la cepa parental de tipo salvaje. Adicionalmente, borB3 a borB7 tienen homólogos en el genoma de Streptomyces coelicolor A3(2) codificados en el cósmido SCF76; están presentes los mismos orfs, pero en un orden diferente. Los orfs borB8 a borB10 están dispuestos idénticamente a los homólogos en el cósmido SC5E3 de S. coelicolor A3(2). Los orfs borB18 a borB21 tienen homólogos que están dispuestos análogamente en el cósmido SC1A2 de S. coelicolor A3(2). El orf borB13 contiene un desplazamiento de marco y por tanto cualquier producto génico sería muy probablemente inactivo. Además, no puede deducirse fácilmente función alguna para los productos de estos orfs durante la biosíntesis de la borrelidina.

Genes de biosíntesis de la unidad iniciadora

Con objeto de identificar los genes que están implicados en la biosíntesis de la unidad iniciadora trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico, cada uno de los genes borB a borN se desorganizó (v.g. véanse los Ejemplos 8-11). Esto se hizo de una manera diseñada para minimizar la posibilidad de efectos polares, lo que se verificó por complementación satisfactoria en trans con una copia de longitud total del gen desorganizado bajo el control del promotor ermE*, lo que proporcionó aproximadamente niveles de tipo salvaje (WT) de producción de borrelidina en cada caso.

Cada uno de los mutantes desorganizados se dejó crecer por triplicado como se describe en el Ejemplo 1, y se evaluó la producción de borrelidina. Junto con estos, cada mutante se dejó crecer por triplicado y se complementó, después de 24 horas, con el ácido iniciador exógeno hasta una concentración final de 1 mM, y se evaluó la producción de borrelidina. La extracción y el análisis para borrelidina proporcionaron los datos que se describen a continuación en la Tabla 10:

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TABLA 10

15

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Basándose en los datos de la Tabla 10, está claro para un experto en la técnica que los productos génicos BorC-F y K-M son esenciales o muy importantes para la biosíntesis del ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico, dado que estos mutantes no producían cantidad alguna o niveles muy bajos de borrelidina sin la adición del ácido iniciador exógeno, por lo cual aquéllos producían borrelidina a niveles que se aproximaban a, o eran mejores que, el del organismo WT. Adicionalmente, los productos génicos BorG, H y N parecen estar implicados en, pero sin ser esenciales para, la biosíntesis de la unidad iniciadora, dado que los mismos producían niveles significativamente menores de borrelidina a no ser que se añadiera ácido iniciador exógeno, por lo que aquellos producían borrelidina a niveles que se aproximaron o eran mejores que el del organismo WT; esto era particularmente notable en el caso del mutante borG^{-}.

La función metabólica normal de los homólogos de BorN es la producción de 2-oxo-hepta-3-eno-1,7-dioato 10, un paso fundamental en el catabolismo de la tirosina por la vía del ácido 4-hidroxifenil-acético 9 (Figura 9) (Prieto et al., 1996). Por consiguiente, 10 puede ser un compuesto intermedio en el camino biosintético para trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico. La capacidad del mutante desorganizado en borN para producir borrelidina, aunque a un nivel reducido, está basada muy probablemente en la presencia de un homólogo en cualquier otra parte del genoma utilizado en el catabolismo de la tirosina durante el metabolismo primario.

El compuesto intermedio 10 contiene toda la funcionalidad requerida para la formación eventual de ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico. El paso más probable siguiente de la biosíntesis es la reducción de la posición 3-eno en una reacción similar a la catalizada por una enoil-reductasa. Enzimas potenciales responsables de este paso son BorC, BorD, BorK o BorM; estas enzimas están involucradas todas ellas en la biosíntesis de unidades iniciadoras de borrelidina como se ve por los datos de la Tabla 10. El 2-oxohepta-1,7-dioato resultante 11 es un posible sustrato para ciclación por formación de un enlace nuevo C-C entre C6 y C2. Otro posible sustrato para esta ciclación podría ser 2-hidroxihepta-1,7-dioato 12 o alguna forma activada del mismo. Ésta podría formarse presumiblemente a partir de 11 por la acción de una oxidorreductasa tal como BorC, BorD o BorM.

El paso fundamental de la ciclación está catalizado muy probablemente por BorE, que exhibe semejanza con O-succinilbenzoil-CoA-sintasa y la cloromuconato-cicloiso-merasa. Estas enzimas pertenecen a la super-familia de las enolasas, cuyos miembros comparten la capacidad común para estabilizar la formación de un anión en el átomo de carbono adyacente a un grupo carboxilato (Schmidt et al., 2001). Adicionalmente, es notable que el sustrato para la muconato-cicloisomerasa es un hexa-1,6-dioato, que es similar en estructura global a 11 y 12. La abstracción de un protón y formación de un anión equivalente en C6 de 11 ó 12 (o una forma activada del mismo, v.g. 13) con ciclación subsiguiente a C2 proporciona la estructura del anillo ciclopentano correctamente sustituido, aunque la intermediación de 11 como sustrato requeriría algún procesamiento adicional del ciclopentano sustituido, muy probablemente por eliminación de agua para dar el ácido ciclopent-1-eno-1,2-dicarboxílico simétrico, o posiblemente el compuesto \Delta^{1}-insaturado, ácido ciclopent-1-eno-1,2-dicarboxílico. Sin embargo, la alimentación de ácido ciclopent-1-eno-1,2-dicarboxílico, o ésteres etílicos del mismo, a cepas de S. parvulus Tü4055 desorganizadas en cualquiera de borC-E, o a cepas WT, no producía cantidad alguna de borrelidina, o no producía borrelidina en cantidad incrementada en comparación con los controles no alimentados. Estos datos indican que este compuesto no es probablemente un compuesto intermedio en la biosíntesis de la unidad iniciadora, y que el sustrato de BorE es posiblemente el 2-hidroxihepta-1,7-dioato 12, o una forma activada del mismo (v.g. 13). Un camino supuesto para el camino biosintético al ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico se muestra en la Figura 4.

Los genes combinados específicos requeridos para los pasos biosintéticos hacia el ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico no están claros, pero probablemente están codificados por alguna combinación de borC-H, borK, borM y borN. La carencia de ciertos homólogos de genes que estén involucrados en el catabolismo del ácido 4-hidroxifenil-acético 9, y que podrían actuar antes de BorN en el camino, es muy probablemente una indicación de que genes metabólicos primarios realizan estas tareas. La adición de ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico exógeno a S. parvulus Tü4055 y cepas afines aumenta el título de borrelidina del orden de 2 a 3 veces en las condiciones empleadas por los autores de la invención, lo que indica que la biosíntesis del ácido iniciador es un factor limitante en la biosíntesis de la borrelidina. Estos datos son consistentes con la degradación metabólica primaria de la tirosina, que es la fuente del ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico.

En un intento para esclarecer adicionalmente cuáles son los genes que pueden ser específicamente responsables de la biosíntesis de la unidad iniciadora, se realizaron varios experimentos de co-cultivo con combinaciones de los mutantes diferentes - éstos requieren el conocimiento de que los productos génicos de borI y borJ están involucrados específicamente en la formación del resto nitrilo en C12, lo cual está clarificado por los datos proporcionados más adelante en la sección siguiente en combinación con los datos de la Tabla 10. En suma, el co-cultivo de mutantes borE^{-} & borD^{-}, y de borE^{-} & borM^{-} no logró producir cantidad alguna de borrelidina, mientras que el co-cultivo de mutantes borM^{-} & borI^{-}, y borM^{-} & borK^{-} produjo borrelidina a niveles aproximadamente iguales a los de tipo salvaje. Estos datos, en combinación con el de la Tabla 10, y siguientes, indican claramente que borD, borE y borM están involucrados en la biosíntesis de la unidad iniciadora, mientras que borI y posiblemente borK, están implicados en la formación del resto nitrilo en C12 de la borrelidina.

Está claro por los datos de la Tabla 10 que la adición exógena de ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico es suficiente para restablecer aproximadamente los niveles WT, o mejores, de producción de borrelidina en mutantes donde los genes que están involucrados en la biosíntesis de la unidad iniciadora han sido desorganizados. Estos datos indican que no existe problema alguno con la absorción activa de ácido carboxílico añadido por S. parvulus Tü4055, y que está presente una actividad que es capaz de convertir el ácido carboxílico en un CoA-tioéster equivalente. Así pues, dadas las tecnologías de mutasíntesis conocidas, es obvio para un experto en la técnica que la adición de ácidos carboxílicos exógenos a uno de los mutantes arriba mencionados, por ejemplo la cepa borE^{-} de S. parvulus Tü4055/borE:aac3(IV) descrita en el Ejemplo 8, puede conducir a la producción de análogos de borrelidina en los cuales el resto ácido carboxílico de la unidad iniciadora está reemplazado con un resto derivado del ácido carboxílico añadido exógenamente.

Para examinar esta posibilidad, se alimentó la cepa S. parvulus Tü4055/borE:aac3(IV) con un ácido trans-ciclobu-
tano-1,2-dicarboxílico de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 1 y se analizó luego como se describe en el Ejemplo 4. La estructura 18, descrita en la Figura 10, muestra la nueva estructura de borrelidina obtenida por alimentación de este ácido carboxílico; este compuesto 18 exhibía el cromóforo UV anticipado para borrelidina pero se eluía con un tiempo de retención más breve y exhibía la masa esperada por LCMS (m/z = 474,3 [M-H]^{-}). La verificación de esta metodología fue proporcionada por la producción, aislamiento y caracterización de 18 (Ejemplo 16). Está claro para un experto en la técnica que podrían utilizarse también otros ácidos carboxílicos en experimentos de alimentación similares para proporcionar adicionalmente nuevos análogos de borrelidina. Aunque es posible que no todos los ácidos carboxílicos pudieran incorporarse utilizando la metodología exacta descrita en esta memoria, una persona experta en la técnica es conocedora de numerosos métodos disponibles para mejorar la incorporación de las unidades iniciadoras alimentadas.

Además del uso de la cepa delecionada en borE, se observó (véase la Tabla 10) que la cepa S. parvulus Tü4055/
borG:aac3(IV), en la cual borG ha sido desorganizado, cuando se alimentó con la unidad iniciadora natural de la PKS de bor, ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico, producía borrelidina con títulos significativamente mayores que los observados cuando se alimentó (aumento de 4 veces) o no se alimentó (aumento de 15 veces) el organismo de tipo salvaje. Para examinar esto ulteriormente, se repitió dicho experimento utilizando a la vez el ácido iniciador natural y un ácido iniciador no natural como sustratos exógenos, alimentados, en paralelo, al tipo salvaje, el mutante borE y el mutante borG. Los datos resultantes se describen en la Tabla 11.

TABLA 11

16

Como puede verse por la Tabla 11, la utilización de S. parvulus Tü4055/borG:aac3(IV) en lugar de S. parvulus Tü4055/borE:aac3(IV) para la mutasíntesis aumenta el título aproximadamente 19 veces, y que S. parvulus Tü4055/borG:aac3(IV) alimentada con el ácido iniciador natural produce 38 veces más borrelidina A que el tipo salvaje por sí solo, o 13 veces más borrelidina A que la cepa de tipo salvaje alimentada con la misma cantidad de ácido ciclopentano-trans-1,2-dicarboxílico. Estos datos indican claramente que el uso de la cepa S. parvulus Tü4055/borG:aac3(IV) para experimentos de mutasíntesis es beneficioso para la producción de títulos mejorados de análogos de borrelidina. Este método tiene aplicabilidad general para la producción tanto de borrelidina como de análogos de borrelidina.

Sobre la base de este descubrimiento, se repitieron los experimentos de alimentación con ácidos carboxílicos alternativos en S. parvulus Tü4055/borG:aac3(IV), y se extendieron para incluir ácido 2,3-dimetil-succínico y ácido 2-metilsuccínico; los nuevos compuestos derivados de la incorporación de estas unidades iniciadoras alternativas, 19 y 20 respectivamente, se describen en la Figura 10.

Formación del resto nitrilo en C12

El análisis de la secuencia del dominio AT del módulo 3 de la PKS de borrelidina indica que el sustrato utilizado para la tercera tanda de extensión de la cadena es metilmalonil-CoA. Así pues, el átomo de carbono del resto nitrilo procede muy probablemente del grupo metilo de metilmalonil-CoA. Esto se comprobó por experimentos de alimentación con isótopos estables. La alimentación de [2,3-^{13}C_{2}]-propionato de sodio a S. parvulus Tü113 dio borrelidina que exhibía una marcación intacta de los carbonos en C4-C24, C6-C25, C8-C26, C10-C27 y C12-C28, e incorporaciones específicas idénticas (como se determina dentro de los límites de los métodos experimentales empleados por los inventores), como era de esperar (Figura 2). Estos datos indican que la conversión del grupo metilo C12 ocurre sea durante el ensamblaje de la cadena en el momento de o después de la incorporación de la tercera unidad de extensión, o que la misma ocurre después del ensamblaje de la cadena del poliquétido y liberación de la PKS. Basándose en asignaciones funcionales dadas a los genes biosintéticos de borrelidina, en asociación con los datos de desorganización de genes expuestos en la Tabla 10, tanto borI como borJ están involucradas claramente en la formación del resto nitrilo en C12, si bien pueden estarlo también otros tales como borK.

La hidroxilasa BorI del citocromo P450 comparte la máxima semejanza con TylHI, que cataliza la hidroxilación de un grupo metilo exocíclico de la tilosin-macrolactona antes de la adición de un resto desoxihexosa (Fouces et al., 1999). Por esta razón, se cree que BorI cataliza la oxidación del grupo metilo C12 durante la biosíntesis de la borrelidina. De acuerdo con esto, el mutante bolI^{-} de S. parvulus Tü4055/borI::aac3(IV) no produce cantidad alguna de borrelidina pero acumula un nuevo producto 14 (Figura 6), que es menos polar que la borrelidina. 14 se transforma fácilmente en borrelidina cuando se alimenta al mutante borE^{-} S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV) que carece de la capacidad para sintetizar la unidad iniciadora de la PKS pero mantiene el resto de los genes biosintéticos de borrelidina intactos. La fermentación de S. parvulus Tü4055/borI::aac3(IV) seguida por extracción y aislamiento proporcionó \sim30 mg
de 14 (Ejemplo 14). El análisis estructural completo de 14 identificó el mismo como 12-desnitrilo-12-metilborrelidina (pre-borrelidina). Esto es consistente con la función propuesta de BorI en la biosíntesis de la borrelidina y proporciona una ruta para nuevos análogos de borrelidina con un grupo metilo unido a C12 del anillo de macrolactona.

Se cree que la aminotransferasa BorJ supuesta dependiente de PLP cataliza la introducción de un átomo de nitrógeno en la borrelidina en la posición activada C28, probablemente por la vía de un resto formilo en C12. De acuerdo con esto, el mutante borJ^{-} de S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV) no produce borrelidina y acumula un nuevo compuesto que es más polar que la borrelidina. Este nuevo compuesto no se transforma en borrelidina cuando se alimenta al mutante S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV), lo que indica que es probablemente un metabolito de derivación más bien que un compuesto intermedio en la biosíntesis de la borrelidina. La fermentación de S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV) permitió el aislamiento de 17 mg del compuesto acumulado (Ejemplo 15). El análisis estructural detallado identificó el acumulante como 12-desnitrilo-12-carboxil-borrelidina 2.

Además de los compuestos aislados por la mutación de los genes biosintéticos de borrelidina, 12-desnitrilo-12-formil-borrelidina 15 se aísla a partir del sobrenadante de fermentación de S. parvulus Tü113. Los medios de fermentación y las condiciones utilizadas para estos experimentos difieren de los que han sido descritos hasta ahora por los autores de la invención en esta memoria, pero están diseñados para maximizar la producción de borrelidina. Se propone que este medio alterado, en combinación con una disminución en la concentración de oxígeno disuelto que se observa ocurre durante esta fermentación específica, promovía la acumulación de 15. 15 se transforma fácilmente en borrelidina cuando se alimenta al mutante S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV) que carece de la capacidad para sintetizar la unidad iniciadora de PKS pero mantiene el resto de los genes biosintéticos de borrelidina intactos.

Los datos anteriores han conducido a los autores de la invención a proponer una ruta de biosíntesis para el resto nitrilo de borrelidina como se presente en la Figura 6. El carbono del metilo C12 de la pre-borrelidina 14 se oxida primeramente a BorI para introducir un grupo hidroxilo alílico en C28 (16). Este grupo hidroxilo se convierte luego en el resto formilo unido a C12 (15) utilizando un método seleccionado del grupo que comprende: oxidación espontánea (con inclusión de oxidación derivada por alguna enzima de fondo) la acción de un gen específico de la agrupación de genes biosintéticos de borrelidina; productos génicos candidato son por tanto BorI propiamente dicho, que actúa de una manera multifuncional y opera por la formación de una estructura de gem-diol en C12 seguido por deshidratación; o alternativamente, por la vía de uno de los genes codificantes de oxidorreductasa tales como borC o borK. Se anticipa que el paso siguiente es la transaminación catalizada por BorJ de 15 a fin de introducir un átomo de nitrógeno en C28, en forma de una amina, por un proceso mediado por piridoxamina-fosfato. El producto amínico 17 supuesto sufre luego oxidación, posiblemente de modo espontáneo, pero muy probablemente por una actividad enzimática tal como BorI (pueden extraerse ciertos paralelismos con la biosíntesis de nitrilos en las plantas (Celenza, 2001; Hahn et al., 1999; Nielson y Møller, 1999)) o por los productos de uno de los genes codificantes de oxidorreductasas, v.g. borC o borK, o por una oxidorreductasa general dentro del proteoma.

A fin de examinar el camino propuesto con mayor detalle, se realizaron cierto número de experimentos de biotransformación utilizando pre-borrelidina 14 como sustrato para investigar la acción de borI-K individualmente y en combinación, utilizando pEM4 como vector y S. albus J1074 (Chater & Wilde, 1980) como cepa de expresión. La expresión de borI o borJ individualmente no aportaba producción de borrelidina por adición de 14. La 14 añadida se consumía únicamente durante la biotransformación con borI (y no en ninguno de los experimentos de control); el compuesto 14 añadido se identificó al convertirse en el metabolito de derivación 2. Sin embargo, la co-expresión de borI & borJ convertía de hecho el compuesto 14 añadido en borrelidina. Así pues, parece ser que o bien BorI o las actividades generales del proteoma en S. albus son capaces de oxidar el compuesto intermedio amínico propuesto 17 en el camino biosintético de la borrelidina. Además de la alimentación de pre-borrelidina 14, se alimentó también 12-desnitrilo-12-carboxil-borrelidina 2 a las tres cepas arriba descritas. No se observó conversión alguna de 2 en borrelidina en ninguno de estos experimentos, lo que refuerza la idea de que 2 es un metabolito de derivación.

La investigación detallada del DNA genómico de 3 cepas productoras de borrelidina, S. rochei ATCC23956, S. parvulus Tü113 y S. parvulus Tü4055, utilizando numerosos materiales digeridos por restricción y análisis subsiguiente por Transferencia Southern, indica que los agrupaciones de genes biosintéticos de borrelidina de estos tres organismos se conservan muy estrechamente. Por consiguiente, parece ser que los caminos biosintéticos de borrelidina de estas cepas son muy similares. Esta suposición permite a los autores de la invención considerar los datos anteriores, que se obtienen de cepas diferentes, como aplicables a un solo camino de biosíntesis.

Está claro para un experto en la técnica que la manipulación de los genes implicados en la formación del resto nitrilo en C12 de borrelidina, por ejemplo borI, o borJ, es un método de utilidad general para la producción de nuevas moléculas afines a borrelidina y derivados de borrelidina con funcionalidad alterada en C12. Adicionalmente, la transferencia de estos genes a otros organismos que producen otros productos poliquétidos naturales o modificados por ingeniería genética puede permitir la incorporación de restos nitrilo en tales compuestos.

En una extensión de este trabajo, se realizan por separado desorganizaciones en borI y borJ en la cepa S. parvulus Tü4055/borG:aac3(IV) para dar las cepas doblemente mutadas S. parvulus Tü4055/borG:aac3(IV)/borI::hyg y S. parvulus Tü4055/borG:aac3(IV)/borJ::hyg (Ejemplos 12 & 13 respectivamente). Estas cepas se alimentan con ácidos carboxílicos alternativos, ácido trans-ciclobutano-1,2-dicarboxílico, ácido 2,3-dimetilsuccínico y ácido 2-metilsuccínico (como se ha descrito arriba), y se encuentra que producen los análogos mutasintéticos de borrelidina que llevan, o bien una función metilo (21, 22 y 23 respectivamente) o una función carboxilo en C12 (24, 25 y 26 respectivamente) en lugar del grupo nitrilo, y que se derivan también de unidades iniciadoras alternativas correspondientes a los ácidos carboxílicos suministrados exógenamente. Esta genoteca ortogonal de nuevos compuestos se describe en la Figura 11 y se muestran los cromóforos UV y datos espectrales de masas observados para cada compuesto.

Ejemplos Métodos generales

Las enzimas de restricción, otros reactivos de biología molecular, antibióticos y producto químicos se adquirieron de fuentes comerciales estándar. La digestión con endonucleasas de restricción y ligación siguieron métodos estándar (Sambrook, J. et al., 1989).

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Ejemplo 1 Fermentación de cepas de S. parvulus

El método que sigue es generalmente útil para cultivar S. parvulus para la producción de borrelidina y/o análogos de borrelidina:

Se inoculó un matraz de siembra que contenía medio NYG (30 ml en un matraz Erlenmeyer de 250 ml) con un stock de trabajo (0,5 ml). El medio NYG contiene, en agua desionizada: extracto de carne de buey (0,3%), peptona Bacto (0,5%), glucosa (1%) y extracto de levadura (0,5%). Después de dos días de agitación mediante sacudidas en una incubadora rotativa (carrera de 2 pulgadas (5 cm); 30ºC; 250 rpm) el cultivo crema resultante se utilizó para inocular el medio de producción PYDG (30 ml en un matraz Erlenmeyer de 250 ml; 10% de inóculo). El medio PYDG contiene por litro de agua desionizada: nutriente de leche peptonizada (1,5%), autolizado de levadura (0,15%), dextrina (4,5%) y glucosa (0,5%) ajustados a pH 7,0. Después de 5 días de agitación mediante sacudidas en una incubadora rotativa (carrera de 2 pulgadas (5 cm); 30ºC; 250 rpm) se recogió el cultivo para análisis como se describe en el Ejemplo 4, o para propósitos de aislamiento en caso requerido. Estos experimentos se realizaron por triplicado para análisis cuantitativo.

El método siguiente es útil para la alimentación de ácidos carboxílicos exógenos a cepas de S. parvulus :

La cepa S. parvulus se desarrolló como se ha descrito arriba. Después de 24 horas de crecimiento en medio de producción PYDG, se añadió el ácido carboxílico de elección como una sola parte alícuota de 50 \mul (solución 0,6 M en metanol al 70% después de neutralización con NaOH 5 N). El cultivo resultante se recogió después de 5 días de fermentación total y se analizó como se describe en el Ejemplo 4. Para estudios cuantitativos, estos experimentos se realizaron por triplicado, y las cepas WT equivalentes alimentadas y sin alimentar sirvieron como controles.

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Ejemplo 2 Crioconservación de cepas de S. parvulus Stocks de trabajo

Se prepararon stocks de trabajo de micelios vegetativos por mezcla de un cultivo de siembra de 2 días desarrollado en medio NGY (0,5 ml) con crioconservante (0,5 ml). El crioconservante está constituido por 20% de glicerol y 10% de lactosa en agua desionizada.

Stocks de esporas

Se incubaron cepas de S. parvulus en placas de agar HA a 30ºC. Después de 14 días, las esporas resultantes de una sola placa se cosecharon y se suspendieron en crioconservantes (1 ml). El agar HA contiene, en agua desionizada: 0,4% de extracto de levadura, 1% de extracto de malta, 0,4% de dextrosa y 1,5% de agar ajustado a pH 7,3.

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Ejemplo 3 Clonación de la agrupación de genes biosintéticos de borrelidina y desorganización de borA2 & borA3 Generación de una genoteca de cósmidos

Se construyó una genoteca de cósmidos en el vector cósmido pWE15 utilizando el kit Gigapack® III Gold Packaging Extract de acuerdo con el manual del fabricante (Stratagene). Se extrajo DNA cromosómico de S. parvulus Tü4055 de acuerdo con protocolos estándar (Kieser et al., 2000) y se trató con Sau3AI antes de clonación en pWE15. Cierto número de los transformantes de E. coli resultantes (3300) se seleccionaron y se transfirieron a placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían medio de Caldo Luria (LB) (0,1 ml por pocillo) con ampicilina (100 \mug/ml). Los clones resultantes se replicaron en placas de agar Luria (LA) que contenían ampicilina (100 \mug/ml). Después de incubación durante una noche a 37ºC, se transfirieron las colonias a filtros de membrana de nailon para análisis de hibridación de colonias in situ de acuerdo con protocolos publicados (Sambrook et al., 1989).

Escrutinio de la genoteca

La genoteca de cósmidos se exploró utilizando una sonda que se generó utilizando el kit DIG de marcación y detección de DNA (Roche) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. La sonda utilizada era un fragmento BglII-BamHI (1,7 kpb) obtenido a partir del gen que codifica el módulo 6 de la tercera subunidad de la PKS de la oleandomicina de Streptomyces antibioticus (Swan et al., 1994).

Disgregación de la agrupación de genes biosintéticos de borrelidina

Los cósmidos que dieron una respuesta positiva cuando se exploraron como se ha descrito arriba se digirieron con BamHI y fragmentos de menos de 3 kpb se subclonaron en pOJ260 (Bierman et al., 1992). Se utilizaron luego éstos para transformar protoplastos de S. parvulus Tü4055 como se describe en el Ejemplo 5. Los transformantes resultantes se evaluaron luego en cuanto a la capacidad para producir borrelidina. Dos clones no eran productores de borrelidina; se obtuvieron ambos de cosBor32A2 y contenían una secuencia típica de una PKS modular. Los cósmidos restantes se exploraron luego utilizando sondas obtenidas a partir de los dos fragmentos BamHI, lo que condujo a la identificación del cósmido solapante cosBor19B9 que contenía el resto de la agrupación biosintético de borrelidina.

Secuenciación de cosBor32A2 y cosBor19B9

Los cósmidos cosBor32A2 y cosBor19B9 se transformaron en E. coli DH10B y los clones resultantes se dejaron crecer a 37ºC en medios 2xTY (30 ml) que contenían ampicilina. Después de 15 horas, las células se recogieron y se utilizaron kits Qiagen Tip 100 para preparar el DNA de cósmido. Aproximadamente 5 \mug del DNA de cósmido se digirieron con Sau3AI (1 U). Se tomaron muestras con intervalos de 2, 4, 6, 8 & 10 minutos después de la adición de la enzima y se apagaron en un volumen igual de EDTA 0,5 M enfriado con hielo. Las muestras se mezclaron y se analizaron luego por electroforesis en gel, y se recuperaron del gel aquellos fragmentos comprendidos entre 1,5 y 2,0 kpb. Los fragmentos se clonaron en pHSG397 linealizado y desfosforilado (Takeshita et al., 1987), y se transformaron en E. coli DH10B. Los clones resultantes que contenían la inserción se dejaron crecer en medio 2xTY (2 ml) que contenía cloranfenicol (30 \mug/ml) y se purificaron utilizando kits Wizard (Promega).

Se llevó a cabo la secuenciación del DNA utilizando un robot CATALYST Molecular Biology 800 de Applied Biosystems para realizar las reacciones del terminador didesoxi, que se cargaron luego en un secuenciador automático ABI Prism 3700 (Applied Biosystems). Los datos de secuencia brutos se procesaron utilizando el paquete de soporte lógico Staden. El ensamblaje y la revisión de los cóntigos se realizó utilizando GAP (Genome Assembly Program), versión 4.2 (Bonfield et al., 1995). Se utilizó el paquete GCG (Devereux et al., 1984) versión 10.0 para el análisis de secuencia.

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Ejemplo 4 Análisis químico de cepas de S. parvulus

El método siguiente es útil para análisis de las fermentaciones (véase Ejemplo 1) para la producción de borrelidinas naturales y de análogos de borrelidina modificados por ingeniería genética:

En un tubo Eppendorf de 2 ml se ajustó una parte alícuota de caldo de fermentación de 5 días (1 ml) a pH-3 por adición de ácido fórmico al 90% (aprox. 20 \mul). Se añadió acetato de etilo (1 ml) a la muestra y se mezcló enérgicamente durante 10 min utilizando una bandeja de agitación enérgica. La mezcla se separó por centrifugación en una microcentrífuga y la parte superior se llevó a un tubo Eppendorf limpio de 2 ml. Se eliminó el acetato de etilo por evaporación utilizando un Speed-Vac. Los residuos se disolvieron en metanol (950 \mul) y se clarificaron utilizando una microcentrífuga. El análisis se realizó en un sistema de HPLC Agilent HP1100 como se describe a
continuación:

Volumen de inyección:

50 \mul

Fase estacionaria de la columna:

Columna de 150 x 4,6 mm, gel de sílice de fase inversa desactivado con base, tamaño de partícula 3 \mum (Hypersil C_{18}-BDS).

Fase móvil A:

10% acetonitrilo:90% agua, que contiene acetato de amonio 10 mM y 0,1% de TFA.

Fase móvil B:

90% acetonitrilo:10% agua, que contiene acetato de amonio 10 mM y 0,1% de TFA.

Gradiente de la fase móvil:

T=0 min, 25%B; T=15, 100%B; T=19, 100%B; T=19,5, 25%B; T=25, 25%B.

Caudal:

1 ml/min.

Detección:

UV a 258 nm (adquisición DAD en 190-600 nm); detección MS por ionización mediante pulverización electrónica en el intervalo m/z 100-1000 amu, con mutación en modo iónico +/-ve.

Ejemplo 5 Protocolo de transformación de protoplastos para S. parvulus Tü4055

Un matraz de siembra que contenía medio de caldo triptona-soja (TSP) (10 ml en un matraz Erlenmeyer de 100 ml) se inoculó con un stock de trabajo (0,15 ml). Después de 3 días de agitación mediante sacudidas en una incubadora rotativa (30ºC, 250 rpm), se utilizaron 5 ml del cultivo para inocular medio R5 (Kieser et al., 2000) (50 ml en un matraz Erlenmeyer de 250 ml) que se agitó luego mediante sacudidas en una incubadora rotativa durante 24 horas (30ºC, 250 rpm). La transformación de los protoplastos mediada por PEG se realizó luego de acuerdo con protocolos estándar publicados (Kieser et al., 2000).

Ejemplo 6 Reemplazamiento de borAT4 con rapAT2 - producción de C10-desmetil-borrelidina

El dominio AT4 de PKS de borrelidina se reemplaza con el dominio AT2 de la poliquétido-sintasa de rapamicina como sigue:

Se digiere CosBor32A2 con EcoRI y se aísla la banda de 5429 pb. Se utiliza ésta como molde para PCR utilizando los oligos CM410 (5' AAAATGCATTCGGCCTGAACGG-CCCCGCTGCTA-3') (SEQ ID NO: 44) y CM411 (5'-AAATGGCCAGCGAACACCAACACCACACCACCA-3') (SEQ ID NO: 45). CM410 introduce un sitio de restricción NsiI para propósitos de clonación y CM411 introduce un sitio MscI para uso en la introducción de un AT heterólogo.

El producto de \sim1,1 kpb se clona en pUC18 digerido con SmaI y desfosforilado. La inserción puede ligarse en dos orientaciones y la orientación inversa se explora por análisis con enzimas de restricción, y se secuencia la inserción. Un plásmido correcto se designa pCJM462. El DNA deficiente en metilación (específicamente dcm^{-}) de pCJM462 y pCJR26 (Rowe et al., 1998) se aísla por paso de los plásmidos a través de E. coli ET12567. Cada plásmido se digiere luego con MscI y XbaI y el fragmento de \sim7,8 kpb de pCJR26, que contiene el AT2 de rapamicina y secuencias situadas aguas abajo en pCJR26, se liga a la cadena principal de \sim3,8 kpb generada por digestión de pCJM462. El plásmido pCJM463 se identifica por análisis de restricción.

Se digiere CosBor32A2 con EcoRI y EcoRV se aísla la banda de 2871 pb. Se utiliza ésta como molde para PCR utilizando los oligos CM412 (5'-AAAGTCCTAGGCGGCGGCCGGC-GGGTCGACCT-3') (SEQ ID NO: 46) y CM413 (5'-TTTAGATCTCGCGACGTCGCACGCGCCGAACGTCA-3') (SEQ ID NO: 47). CM412 introduce un sitio de restricción AvrII que une, en marco, la homología de borrelidina aguas abajo al AT heterólogo, y CM413 introduce un sitio BglII para propósitos de clonación. El producto de \sim1,1 kpb se clona a pUC18 digerido con SmaI y desfosforilado. La inserción puede ligar en dos orientaciones y la orientación inversa se explora por análisis con enzimas de restricción y se secuencia la inserción. Un plásmido correcto se designa pCJM464.

Los plásmidos pCJM463 y pCJM464 se digieren con AvrII y XbaI y el fragmento de \sim1,1 kpb de pCJM464 se liga a la cadena principal de \sim4,7 kpb de pCJM463 para dar pCJM465, que se identifica por análisis con enzimas de restricción. pCJM465 contiene el híbrido de rapamicina AT2 con genes flanqueantes de secuencia de borrelidina que proporcionan homología para integración y recombinación secundaria.

El plásmido pCJM465 se digiere con NsiI y BglII y el fragmento de \sim3 kpb se clona en pSL1180 digerido previamente con NsiI y BamHI para dar pCJM466. El plásmido pCJM466 se digiere luego con NsiI y la casete de apramicina se incorpora en un fragmento PstI de pEFBA (Lozano et al., 2000) para dar el vector de reemplazamiento pCJM467. Se introduce pCJM467 en S. parvulus Tü4055 por transformación de protoplastos como se describe en el Ejemplo 5. Las colonias resistentes a apramicina (25 \mug/ml) se identifican inicialmente, y se someten luego a pasos varias veces a través de medios MA sin selección de antibióticos a fin de promover la segunda recombinación (Fernández et al., 1998). Varias colonias sensibles a apramicina se aíslan y se analizan por PCR y transferencia Southern. El nuevo mutante se designa S. parvulus Tü4055/467.

S. parvulus Tü4055/467 se analiza como se describe en el Ejemplo 1 y se demuestra que produce una mezcla de compuesto con el espectro UV correcto. Uno de los nuevos componentes principales que es más polar que la borrelidina tiene el tiempo de retención correcto para 10-desmetil-borrelidina 3. El análisis LCMS indica una relación m/z para un compuesto que tiene 14 unidades de masa menos que la borrelidina como era de esperar, y con un patrón de fragmentación de masas apropiado. Se produce también borrelidina propiamente dicha, pero a niveles menores que el organismo WT.

Ejemplo 7 Mutación del motivo selectivo metilmalonil-CoA de borAT4 para generar 10-desmetil-borrelidina

La mutagénesis orientada de los dominios acil-transferasa puede utilizarse también para alterar la especificidad de un AT. En este ejemplo, la especificidad de borAT4 está dirigida desde metil-malonil-CoA hacia malonil-CoA. Ha sido identificado un motivo de aminoácido (Reeves et al., 2001; WO 02/14482) que dirige la especificidad de un AT. El motivo YASH, como se observa en bor-AT4, se encuentra en ATs específicos de metilmalonil-CoA y, en este ejemplo, está alterado a HAFH que se encuentra en ATs específicos de malonil-CoA.

Se digiere CosBor32A2 con NcoI y se aísla la banda de 5167 pb. Se utiliza ésta como molde para PCR utilizando los iniciadores CM414 (5'-AAACTGCAGAGTCGAACATCGGTCACAC-GCAGGC-3') (SEQ ID NO: 48) y CM415 (5'-AAAATGCATGATCCACA-TCGATACGACGCGCCCGA-3') (SEQ ID NO: 49). CM414 introduce un sitio de restricción PstI para propósitos de clonación, y CM415 es un iniciador mutagénico que cubre la región codificante de motivos del AT que efectuará los cambios de aminoácidos y contiene un sitio NsiI para propósitos de clonación. El fragmento de \sim1,1 kpb se clona en pUC18 digerido con SmaI y desfosforilado. La inserción puede ligarse en cualquier orientación y la alimentación directa se explora por análisis con enzimas de restricción, y se secuencia la inserción. Un plásmido correcto se designa pCJM468.

Se realiza una segunda reacción PCR utilizando el fragmento de 5167 pb NcoI de CosBor32A2 y los iniciadores CM416 (5'-TAAATGCATTCCATTCGGTGCAGGTGGAGTTGATCC-3') (SEQ ID NO: 50) y CM417 (5'-ATAG
GATCCCCTCCGGGTGCTCCAGACCG-GCCACCC-3') (SEQ ID NO: 51). CM416 introduce un sitio de restricción NsiI y es también un iniciador mutagénico que cubre la región codificante del motivo del AT, y CM417 introduce un sitio BamHI para propósitos de clonación. El fragmento de \sim1,1 kpb se clona en pUC18 digerido previamente con SmaI y desfosforilado. La inserción puede ligarse en dos orientaciones, y la orientación directa se explora por análisis con enzimas de restricción, después de lo cual se secuencia la inserción. Un plásmido correcto se designa pCJM469.

Los plásmidos pCJM468 y pCJM469 se digieren con NsiI y XbaI, y el fragmento de \sim1,1 kpb de PCJM468 se liga a la cadena principal de \sim3,8 kpb de pCJM469 para dar pCJM470, que se identifica por análisis con enzimas de restricción. pCJM470 contiene el motivo mutado de borAT4 con \sim1,1 kpb de DNA homólogo a ambos lados, que proporcionan homología para integración y recombinación secundaria.

El plásmido pCJM470 se digiere con PstI y BamHI y el fragmento de \sim2,2 kpb se clona en pSL1180 (Amersham Biosciences) digerido previamente con PstI y BamHI para dar pCJM471. El plásmido pCJM471 se digiere luego con PstI y la casete de apramicina se incorpora en un fragmento PstI de pEFBA (Lozano et al., 2000) para proporcionar el vector de reemplazamiento pCJM472.

El vector de reemplazamiento pCJM472 se introduce en S. parvulus Tü4055 por transformación de protoplastos como se describe en el Ejemplo 5. Las colonias resistentes a apramicina se identifican inicialmente y se someten luego a pasos varias veces a través de medio MA sin selección de antibióticos a fin de promover la segunda recombinación (Fernández et al., 1998). Se aíslan varias colonias sensibles a la apramicina y se analizan por PCR y transferencia Southern, seleccionándose una que contiene la nueva secuencia AT4 que contiene el motivo mutado y el sitio NsiI. El nuevo mutante se denomina S. parvulus Tü4055/472.

S. parvulus Tü4055/472 se cultiva y se analiza como se describe en el Ejemplo 1, demostrándose que produce una mezcla de compuestos con el perfil UV correcto para borrelidina. Uno de los nuevos componentes principales, que es más polar que la borrelidina, tiene el tiempo de retención correcto para 3 auténtica. El análisis LCMS indica una relación m/z para un compuesto que tiene 14 unidades másicas menos que la borrelidina como era de esperar, y con un patrón de fragmentación de masa apropiado. Se produce también borrelidina propiamente dicha, pero a niveles menores que el organismo de tipo salvaje (WT).

Ejemplo 8 Disgregación de borE (S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV)

A fin de desorganizar borE, se amplificó un fragmento interno de 761 pb del gen por PCR utilizando los iniciadores B25A (5'-TTCTGCAGCCGCGGCCTTCG-3') (SEQ ID NO: 81) y B25B (5'-AGAATTCGCCGGCGCCGCTG-3') (SEQ ID NO: 82) utilizando como molde cosBor32A2. El producto se purificó, se digirió con PstI-EcoRI y se clonó en pOJ260ermE* que se había digerido análogamente, para proporcionar pOJEd1. Este enfoque se utilizó a fin de evitar posibles efectos polares. El vector pOJEd1 se introdujo en S. parvulus Tü4055 por transformación de protoplastos como se describe en el Ejemplo 5, y se seleccionaron colonias respecto a resistencia a apramicina en R5 y luego en agar MA. La desorganización se verificó por hibridación Southern y el nuevo mutante se designó S. parvulus Tü4055/borE::aac3-(IV). La cepa S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV) se cultivó, se extrajo y se analizó como se describe en el Ejemplo 1. No se observó producción alguna de borrelidina, en tanto que un control de tipo salvaje producía borrelidina como era de esperar.

Para comprobar que no se introducían efecto polar alguno, se introdujo una copia de longitud total de borE bajo el control del promotor ermE* en trans respecto al mutante desorganizado. Se amplificó borE de longitud total por PCR utilizando los iniciadores B7T1 (5'-GGCTGCAGACGCGGCTGAAG-3') (SEQ ID NO: 83) y B7T2 (5'-CCG
GATCCCAGAGCCACGTC-3') (SEQ ID NO: 84), utilizando como molde cosBor32A2. El producto de 1216 pb se purificó, se digirió con PstI-BamHIy se clonó en pIJ2925 digerido con PstI-XbaI (Janssen & Bibb, 1993), junto con un fragmento de pLHyg digerido con BamHI-SpeI que contenía la casete de resistencia a la higromicina, para generar pIJEH. Un fragmento BamHI de 2,8 kpb se cortó de pIJEH y se clonó en pEM4 (Quiros et al., 1998), que se había digerido análogamente, para dar pborEH (en el cual el gen borE estaba clonado en la orientación correcta para expresión del gen). Se introdujeron pborEH y el plásmido de control pEM4 en S. parvulus Tü4055/borE::aac(3)IV por transformación de protoplastos como se describe en el Ejemplo 5. La cepa resultante de S. parvulus Tü4055/borE::aac(3)IV-/pborEH se analizó como se describe en el Ejemplo 1 y se demostró que producía borrelidina a un título similar a un control de tipo salvaje WT; la cepa de control S. parvulus Tü4055/borE::aac(3)IV/pEM4 no producía borre-
lidina.

La complementación química de S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV) con ácido trans-1,2-diciclopentano-dicarboxílico, siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 1, demostró que la cepa así desarrollada era capaz de producción de borrelidina en una proporción de 122 \pm 23% del control parental de tipo salvaje WT. Así pues, borE es necesario para la biosíntesis del ácido trans-1,2-ciclopentano-dicarboxílico.

Ejemplo 9 Disgregación de borG (S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV))

Con objeto de desorganizar borG, se amplificó una región interna de 885 pb por PCR utilizando los iniciadores B23A (5'-ATCTGCAGCGGCATCGGTGT-3') (SEQ ID NO: 105) y B23B (5'-AGAATTCTCCACTGCGGTCG-3') (SEQ ID NO: 106) y el cósmido Bor32A2 como molde. El producto resultante se purificó y se digirió en los sitios flanqueantes PstI-EcoRI y se subclonó luego en pOJ260P, aguas abajo del promotor ermE*, para generar pOJGd1.

El vector pOJGd1 se introdujo en S. parvulus Tü4055 por transformación de protoplastos como se describe en el Ejemplo 5. Las colonias resistentes a apramicina se seleccionaron sobre agar MA. La desorganización se verificó por hibridación Southern y el nuevo mutante se designó S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV). La cepa S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV) se cultivó, se extrajo y se analizó como se describe en el Ejemplo 1. La producción de borrelidina se comparó con un control de tipo salvaje. Adicionalmente, S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV) se complementó químicamente con ácido trans-1,2-diciclo-pentano-dicarboxílico, siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 1.

Ejemplo 10 Disgregación de borI (S. parvulus Tü4055/borI::aac3(IV))

El gen borI y el DNA circundante se amplificó a partir de cosBor19B9 utilizando los iniciadores PCR BP4501 (5'-CGTATGCATGGCGCCATGGA-3') (SEQ ID NO: 85) y BP4502 (5'-AGCCAATTGGTGCACTCCAG-3') (SEQ ID NO: 86). El producto de 2,32 kpb se purificó, se digirió con NsiI-MfeI y se clonó en pSL1180 digerido con NsiI-EcoRI, para dar el plásmido pSLI. La casete de resistencia a apramicina se cortó de pEFBA como un fragmento EcoRI y se clonó en pSLI digerido con EcoRI para dar el plásmido pSLIA. Finalmente, la casete de resistencia a higromicina se cortó con SpeI-PstI de pLHyg y se clonó en pSLIA que se había digerido con NsiI-SpeI para dar el plásmido pSLIr1.

El vector de reemplazamiento pSLIr1 se introdujo en S. parvulus Tü4055 por transformación de protoplastos como se describe en el Ejemplo 5. Se seleccionaron las colonias resistentes a apramicina (25 \mug/ml) y se sometieron luego a pasos varias veces a través de medio MA sin selección. El reemplazamiento se comprobó por hibridación Southern y el nuevo mutante se designó S. parvulus Tü4055/borI::aac3(IV).

Se cultivó S. parvulus Tü4055/borI::aac3(IV) y se analizó como se describe en el Ejemplo 1. No se observó producción alguna de borrelidina, en tanto que se observaron varios compuestos nuevos a niveles significativamente menores. Uno de los compuestos menos polares exhibía un máximo de absorbancia UV de 240 nm, y el análisis LCMS indicó una relación m/z de que era 11 unidades másicas menor que en el caso de la borrelidina, lo cual es consistente con la presencia de un grupo metilo en lugar de un grupo nitrilo en C12.

Para comprobar que no se introducía efecto polar alguno, se introdujo una copia de longitud total de borI bajo el control del promotor ermE* en trans respecto al mutante desorganizado. Se recuperó un fragmento NsiI-AvrII de 2,1 kb que contenía borI a partir de pSLI y se subclonó en los sitios PstI-XbaI de pEM4, junto con el fragmento NheI-SpeI de pLHyg que contenía el gen hyg. Ambos fragmentos se subclonaron en la misma orientación, generando pborIH. El plásmidopborIH y el plásmido de control pEM4 se introdujeron en S. parvulus Tü4055/borI::aac(3)IV por transformación de protoplastos como se describe en el Ejemplo 5. La cepa resultante S. parvulus Tü4055/borI::aac(3)IV/pborIH se analizó como se describe en los Ejemplos 1 & 4, demostrándose que produce borrelidina con un título similar a un control de tipo salvaje WT.

Ejemplo 11 Disgregación de borJ (S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV))

El gen borJ y el DNA circundante se amplificaron a partir de cosBor19B9 utilizando los iniciadores PCR BNHT1 (5'-GTCATGCATCAGCGCACCCG-3') (SEQ ID NO: 87) y BNHT2 (5'-GTGCAATTGCCCTGGTAGTC-3') (SEQ ID NO: 88). El producto de 2,75 kpb se purificó, se digirió con NsiI-MfeI y se clonó en pSL1180 que se había digerido con NsiI-EcoRI, para dar el plásmido pSL. La casete de resistencia a higromicina se cortó de pLHyg como un fragmento PstI-SpeI y se clonó en pSL digerido con NsiI-SpeI, para dar pSLJH. Finalmente, se cortó la casete de resistencia a apramicina de pEFBA con SpeI-BamHI y se clonó en pSLJH que había sido pre-digerido con AvrII-BglII a fin de eliminar un fragmento de 453 pb de borJ, para dar el plásmido pSLJr1.

El vector de reemplazamiento pSLJr1 se introdujo en S. parvulus Tü4055 por transformación de protoplastos como se describe en el Ejemplo 5. Se seleccionaron las colonias resistentes a apramicina (25 g/ml), y se sometieron luego a pasos varias veces a través de medio MA sin selección. El reemplazamiento se comprobó por hibridación Southern. El nuevo mutante se designó S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV).

S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV) se cultivó y se analizó como se describe en el Ejemplo 1. No se observó producción alguna de borrelidina, mientras que se observó un compuesto nuevo más polar que la borrelidina con un máximo UV a 262 nm. El análisis LCMS indicó un compuesto parental de 508 amu, lo cual es consistente con una función ácido carboxílico más bien que una función nitrilo en C12.

Para comprobar que no se introducía efecto polar alguno, se introdujo una copia de longitud total de borJ bajo el control del promotor ermE* en trans respecto al mutante desorganizado. Un fragmento NsiI-SphI de pSLJ de 2,4 kb, que contenía borJ se subclonó en los sitios PstI-XbaI de pEM4 junto con el gen hyg como un fragmento SphI-SpeI de pLHyg; ambos fragmentos se subclonaron en la misma orientación que la transcripción de los genes. El constructo final se designó pborJH. El plásmido pborJH y el plásmido de control pEM4 se introdujeron en S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV) por transformación de protoplastos como se describe en el Ejemplo 5. La cepa resultante S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV)/pborJH se analizó como se describe en los Ejemplos 1 & 4, y se demostró que produce borrelidina con un título similar a un control de tipo salvaje WT.

Ejemplo 12 Disgregación de borG y borI (S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV)/borI::hyg)

El gen hyg se aísla a partir de pLHyg como un fragmento EcoRV y se clona en pSLI (Ejemplo 10) digerido con EcoRI y tratado con fragmento Klenow para dar pSLIH; el gen hyg se clona en la misma orientación que borI. Se introduce pSLIH en S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV) por transformación de protoplastos, como se describe en el Ejemplo 5, y se selecciona para resistencia tanto a apramicina como a higromicina, después de lo cual se somete a pasos varias veces en medio MA sin selección a fin de promover la recombinación doble. Las colonias resistentes a apramicina e higromicina se analizan por hibridación Southern y PCR para verificar el reemplazamiento.

Ejemplo 13 Disgregación de borG y borJ (S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV)/borJ::hyg)

Se aísla el gen hyg a partir de pLHyg como un fragmento EcoRV y se clona en pSLJ (Ejemplo 11) digerido con AvrII-BglIII y tratado con Klenow, para dar pSLJH; el gen hyg se clona en la misma orientación que borI. Se introduce pSLJH en S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV) por transformación de protoplastos, como se describe en el Ejemplo 5, y se selecciona para resistencia tanto a apramicina como a higromicina, después de lo cual se somete a pasos varias veces en medio MA sin selección a fin de promover la recombinación doble. Las colonias resistentes a apramicina e higromicina se realizan por hibridación Southern y PCR para verificar el reemplazamiento.

Ejemplo 14 Producción de 12-desnitrilo-12-metil-borrelidina 14 (pre-borrelidina)

Se inocularon stocks de trabajo de S. parvulus Tü4055/borI::aac3(IV) (0,5 ml) en precultivos vegetativos primarios de NYG como se describe en el Ejemplo 1. Se prepararon pre-cultivos secundarios (como en el Ejemplo 1 pero con 250 ml de NYG en matraces Erlenmeyer de 2 l). Medio de producción PYDG (4 l), preparado con el Ejemplo 1 y con 0,01% de Plutronic L0101 añadido para reprimir la formación de espuma, se inoculó con pre-cultivo secundario (12,5% de inóculo). Un segundo fermentador que contenía medio de punto central (4 l) y 0,01% de Plutronic L0101 para reprimir la formación de espuma, se ajustó en paralelo y se inoculó también con pre-cultivo secundario (12,5% de inóculo). El medio de producción de punto central contiene, por litro de agua desionizada: polvo de leche desnatada Tesco (1,5%), Avidex W-80 (4,5%), glucosa (0,5%) y autolizado de levadura (0,15%) ajustado a pH 7,0 con NaOH
5 M.

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Se dejaron fermentar cada uno de estos lotes en un fermentador Applikon de 7 l durante 6,5 días a 30ºC. Se ajustó la corriente de aire a 0,75 vvm (volumen por volumen por minuto), con deflectores inclinados y se controló la velocidad del impulsor entre 400 y 800 rpm para mantener una tensión de oxígeno disuelto a o por encima de 30% de la saturación de aire. No se añadió cantidad alguna de antiespumante adicional. Al cabo de 22 horas se añadió a la fermentación el ácido de iniciación, ácido trans-ciclopentano-1,2-dicarboxílico, como una solución neutralizada de 1:1 MeOH/NaOH 5 M, a través de un filtro instalado en línea (0,22 \mum). La concentración final de ácido iniciador exógeno en el recipiente fermentador era 0,5 mM.

Después de 6,5 días de fermentación, se combinaron los caldos y se acidificaron a pH 3,5 con HCl concentrado (\sim6 ml), después de lo cual se clarificaron por centrifugación a 3500 rpm durante 10 minutos. Se extrajo el sobrenadante en acetato de etilo (3 x 1 volumen equivalente durante 4 horas cada vez) y el sedimento de células se dejó en remojo en metanol (2 x 1,5 litros durante 4 horas cada vez). Se reunieron las fases orgánicas y se eliminaron a presión reducida para dar una goma alquitranosa. Se resuspendió la goma en tampón de bórax 0,1 M (500 ml a pH 9,4) y se lavó con hexanos (500 ml) y acetato de etilo (500 ml). La capa acuosa se acidificó luego con HCl concentrado a pH 3,5 y se extrajo con acetato de etilo (3 x 500 ml), que se combinaron y se llevaron a sequedad. La goma resultante se disolvió en metanol (15 ml), se diluyó con agua (285 ml) y se cargó por gravedad en un cartucho C_{18} de fase inversa (50 g, preparado en metanol acuoso al 5%). El cartucho se lavó con metanol acuoso al 20% y al 50% (300 ml de cada uno) y se eluyó con metanol al 100% (500 ml). Esta última fracción se llevó a sequedad a presión reducida para dar un aceite gomoso negro (600 mg) que se recogió en metanol. Este residuo se purificó finalmente por HPLC preparativa secuencial en fase inversa (eluida con las fases móviles utilizadas en el Ejemplo 4, sin TFA añadido, realizándose la ejecución isocráticamente para 40% B). Las fracciones activas se reunieron y se desalaron en un cartucho C_{18} (1 g), para dar 28 mg de un aceite oscuro (3,5% mg/l de rendimiento aislado). La Tabla 12 resume los datos de desplazamiento químico NMR ^{1}H y ^{13}C para la 12-desnitrilo-12-metil-borrelidina 14 en CDCl_{3}.

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TABLA 12

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TABLA 12 (continuación)

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Ejemplo 15 Producción de 12-desnitrilo-12-carboxi-borrelidina 2

Se inocularon stocks de trabajo de S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV) (0,5 ml) en precultivos vegetativos primarios de NYG como se describe en el Ejemplo 1. Se prepararon pre-cultivos secundarios (como en el Ejemplo 1 pero con 250 ml de NYG en matraces Erlenmeyer de 2 l). El medio de producción PYDG (4 l), preparado como en el Ejemplo 1 y con 0,01% de Plutronic L0101 añadido para control de la espuma, se inoculó con el pre-cultivo secundario entero (10% inóculo). Se dejó fermentar éste en un fermentador Aplikon de 7 l durante 6 días a 30ºC. Se ajustó el caudal de aire a 0,75 vvm, con deflectores inclinados y con la velocidad del impulsor controlada entre 250 y 600 rpm para mantener una tensión de oxígeno disuelto a o por encima de 30% de la saturación de aire. No se añadió antiespumante adicional alguno. Se realizó una segunda fermentación exactamente como en el caso anterior, pero que se alimentó por lotes con 0,2 mol de glucosa como solución acuosa cada 12 horas a partir de las 60 horas después de la inoculación.

Después de 6 días se recogieron las fermentaciones y se combinaron. Se clarificó el caldo por centrifugación (3500 rpm, 10 minutos) y el sobrenadante resultante se acidificó con HCl 10 M (aq) hasta pH \sim3,5. Esta solución se extrajo luego en acetato de etilo por agitación (3 x 1 equivalente volumétrico durante 4 horas cada uno). El sedimento de células se extrajo dos veces por remojo de las células en metanol/acetato de etilo 1:1 (500 ml). Todas las fases orgánicas se reunieron y se eliminaron a presión reducida para dar un lodo acuoso. El lodo se diluyó a 500 ml con agua, se acidificó a pH \sim3,5 con HCl 10 M y se extrajo en acetato de etilo (3 x 300 ml). Las fases orgánicas se concentraron a presión reducida hasta \sim300 ml y se extrajeron con bórax 0,1 M (3 x 150 ml, pH = 9,4). Las soluciones de bórax reunidas se acidificaron con HCl 10 M a pH \sim3,5 y se extrajeron con 6 x 300 ml de acetato de etilo. La HPLC analítica demostró que algo del acumulante permanecía todavía en la solución de bórax y por tanto se cargó ésta, por gravedad, en un cartucho C_{18} de fase inversa (50 g). El cartucho se lavó con agua y el acumulante se eluyó en 100% metanol. Las fases orgánicas que contenían el acumulante se reunieron y se redujeron a una solución metabólica de 40 ml. Se cargó ésta en una columna Sephadex LH-20 (70 g, hinchada durante una noche en metanol, columna de 60 cm x 2,5 cm), que se reveló con metanol al 100%; las fracciones activas se reunieron y se llevaron a sequedad. El material se procesó luego adicionalmente por HPLC preparativa en fase inversa (eluida con las fases móviles utilizadas en el Ejemplo 4, sin TFA añadido, ejecutándose la realización isocráticamente para 40% B). Las fracciones activas reunidas se llevaron a sequedad, se disolvieron en metanol (4 ml) y se diluyeron con agua (200 ml). Esta mezcla se diluyó en 2 fracciones iguales y se cargaron cada una, por gravedad, en un cartucho C_{18} de fase inversa (20 g). Las columnas se eluyeron luego con 3 volúmenes de columna de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 90%, y 100% de metanol acuoso. El acumulante se eluyó en todas las fracciones desde 60% a 100% de metanol, que se reunieron y se llevaron a sequedad. El acumulante (disuelto en DMSO) se purificó luego finalmente por HPLC preparativa secuencial en fase inversa (eluida con las fases móviles utilizadas en el Ejemplo 4, sin TFA añadido, realizándose la ejecución isocráticamente para 40% B). Las fracciones activas se reunieron y se desalaron en un cartucho C_{18} (1 g), para dar 17 mg de un aceite pardo (2,1 ml de rendimiento aislado). La Tabla 13 resume los datos de desplazamiento químico NMR ^{1}H y ^{13}C para 12-desnitrilo-12-carboxi-borrelidina 2 en \delta_{4}-metanol.

TABLA 13

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Ejemplo 16 Producción por mutasíntesis de 17-des-(ácido ciclopentano-2'-carboxílico)-17-(ácido ciclobutano-2'-carboxílico)borrelidina 18

Se inocularon stocks de trabajo de S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV) (0,5 ml) en precultivos vegetativos primarios de NYG como se describe en el Ejemplo 1. Se prepararon pre-cultivos secundarios (como en el Ejemplo 1 pero con 250 ml de NYG en matraces Erlenmeyer de 2 l). El medio de producción PYDG (4 l), preparado como en el Ejemplo 1 y con 0,01% de Plutronic L0101 añadido para control de la espuma, se inoculó con pre-cultivo secundario (12,5% de inóculo). Se dispusieron 2 biorreactores adicionales del mismo modo. Estos lotes se dejaron fermentar cada uno en un fermentador Applikon de 7 l durante 5 días a 30ºC. Se ajustó el caudal de aire a 0,75 vvm (volumen por volumen por minuto), con deflectores inclinados y con la velocidad del impulsor controlada entre 400 y 700 rpm para mantener la tensión de oxígeno disuelto a o por encima del 30% de la saturación del aire. No se añadió antiespumante adicional alguno. Al cabo de 22 horas de fermentación, se añadió el ácido iniciador, ácido trans-ciclobutano-1,2-dicarboxílico como una solución neutralizada de MeOH/NaOH 5 M 1:1. La concentración final en el recipiente fermentador de ácido de iniciación exógeno era 0,5 mM.

Después de 5 días de fermentación, se reunieron los caldos y se acidificaron a pH 4,0 con HCl concentrado, después de lo cual se clarificaron por centrifugación a 3500 rpm durante 10 minutos. Se absorbió el sobrenadante en resina Diaion HP-20SS (1 l), que se había tratado previamente con metanol (2 l) y a continuación con metanol acuoso al 5% (2 l), por filtración a una tasa de aproximadamente 100 ml/min. La resina se eluyó luego con metanol acuoso al 20% (2,5 l) y luego con acetona acuosa al 80% (4,5 l). Se eliminó el disolvente orgánico de la acetona acuosa y el lodo acuoso resultante (1 litro) se extrajo en acetato de etilo (3 x 1 l). Se reunieron las fases orgánicas y se recogieron a vacío para dar un aceite amarillo/pardo (1,7 g). Entretanto, el sedimento de células se dejó en remojo en metanol-acetato de etilo, 1:1 (3 x 1 l durante 4 horas cada vez), y los sobrenadantes orgánicos resultantes se redujeron a vacío para dar un lodo acuoso (400 ml). La materia constituida por partículas se disolvió en metanol (50 ml), y se añadió de nuevo al lodo acuoso, que se completó hasta 500 ml con agua. Este lodo se absorbió sobre resina Diaion HP-20SS (300 ml), que se había tratado previamente con metanol (500 ml) y luego con metanol acuoso al 5% (500 ml). La resina se eluyó luego con metanol acuoso al 20% (1 l) y después con acetona acuosa al 80% (1,5 l). El disolvente orgánico se separó de la acetona acuosa y el lodo acuoso resultante (llevado a 750 ml) se extrajo en acetato de etilo (3 x 750 ml). Se reunieron las fases orgánicas y se redujeron a vacío para dar un aceite amarillo/pardo (1,7 g). Los extractos brutos se reunieron (3,4 g), se disolvieron en acetato de etilo (10 ml), se adsorbieron luego en una columna de sílice (5 cm de diámetro interior x 10 cm, tratada con EtOAc), y se eluyeron con EtOAc. Las fracciones activas se reunieron y el disolvente se eliminó a vacío para dar una goma parda (1,08 g). Este residuo se purificó finalmente por HPLC preparativa secuencial en fase inversa (eluida con las fases móviles utilizadas en el Ejemplo 4, sin TFA añadido, realizándose la ejecución desde 25% B a 75% B durante 25 minutos con un gradiente lineal). Las fracciones activas se reunieron y se desalaron en un cartucho C_{18} (5 g), para dar 83,9 mg (o 7,0 mg/l de rendimiento aislado). El espectro ^{13}C-NMR de 18 se muestra en la Tabla 14.

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Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 14

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Referencias

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\hskip1cm Méndez, Carmen

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\hskip1cm Olano, Carlos

\hskip1cm Oliynyk, Marko

\hskip1cm Salas, Jose A.

\hskip1cm Sanchez, Cesar

\hskip1cm Wilkinson, Barrie

\hskip1cm University of Oviedo

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<120> BORRELIDIN PRODUCING POLYKETIDE SYNTHASE AND ITS USES

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<130> POLEQUÉTIDO-SINTASA PRODUCTURA DE BORRELIDINA Y SUS USOS

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<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 675

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

126

127

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 868

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus T34055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

129

130

131

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

132

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

133

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

135

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

137

138

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

139

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

140

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34a

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34a

\vskip1.000000\baselineskip

144

145

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 638

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

146

147

148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 787

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

150

151

152

153

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 467

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

156

157

158

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 368

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

159

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

161

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM410

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatgcatt cggcctgaac ggccccgctg tca

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM411

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaatggccag cgaacaccaa caccacacca cca

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM412

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaagtcctag gcggcggccg gcgggtcgac ct

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM413

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttagatctc gcgacgtcgc acgcgccgaa cgtca

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM414

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaactgcaga gtcgaacatc ggtcacacgc aggc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM415

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatgcatg atccacatcg atacgacgcg cccga

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM416

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaatgcatt ccattcggtg caggtggagt tgatcc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM417

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataggatccc ctccgggtgc tccagaccgg ccaccc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM368

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttcctgcag gccatcccca cgatcgcgat cggct

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM369

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttcatatga caggcagtgc tgtttcggcc ccatt

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM370

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttcatatgg cggatgccgt acgtgccgcc ggcgct

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM371

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttcatatgc cccaggcgat cgtccgcacc ac

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM372

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttcatatgg tctcggcccc ccacacaaga gccctccggg c

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B1819A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcatgcatg cggcgggctc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B1819B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtctagaac ggccgaactt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B1819C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttctagaac ctcggtcggc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B1819D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggatccca cgctgctgcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211>19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo ELDA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagacttac gggggatgc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211>19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BLDB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccagcagc gaccagaac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B19A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccatgcatc accgacatac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B19B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgatatccc gaagaacgcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B1920A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccaagcttc ctcgacgcgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B1920B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactagtgcc tcacccagtt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B1920C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactagtgac ggccgaagcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B1920D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcggatccgt cagaccgttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM384

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacctgcagg taccccggtg gggtgcggtc gcccga

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM385

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgccgcacgc gtcgaagcca acga

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211>24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM386

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgggctgg tcgttggctt cgac

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM387

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgcctgca gcgtgagttc ctcgacggat ccga

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM388

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggaactca ccctgcaggc accgct

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM395

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgaacgtcca gccctcgggc atgcgt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM396

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggcacgcat gcccgagggc tggacgtt

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM397

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttcctgcag gccatgccga cgatcgcgac aggct

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM398

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaacatatgg tcctggcgct gcgcaacggg gaactg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM399

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttcctgcag gcgatgccga cgatggcgat gggct

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM400

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaacctgcag gttccccggc gacgtggact cgccggagtc gtt

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo CM401

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttctagag cgacgtcgca ggcggcgatg gtcacgcccg t

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B25A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctgcagcc gcggccttcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B25B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaattcgcc ggcgccgctg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B7T1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctgcagac gcggctgaag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B7T2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggatccca gagccacgtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BP4501

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtatgcatg gcgccatgga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BP4502

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agccaattgg tgcactccag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BNHT1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcatgcatc agcgcacccg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BNHT2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcaattgc cctggtagtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BTRNAS1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtctagact cgcgcgaaca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BTRNAS2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaattccga agggggtggt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B5B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactagtccg cagtggaccg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B5A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgatatcct caccgcccgt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B6B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactagtgtg gcagacggtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B5A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgatatcct caccgcccgt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B6T1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggatgcatc accggcacgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B6T2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggatccgc ggggcggtac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211>20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BBB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactagtgcg atcccgggga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BBA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtcgatatc ctccaggggc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BBT1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tactgcagca cacccggtgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BBT2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggatccgc tgtgtcatat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BCB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactagtcct cgccgggcac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BCA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggatcccg gtcagcggca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BCT1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctgcagcg acctcgccgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo BCT2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatcccg tggcgtggtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B23A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atctgcagcg gcatcggtgt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B23B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaattctcc actgcggtcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B9A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acctgcaggc cgggctcatc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B9B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaattcggg cgagccgccg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcaagcttc gtgtccatgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcatgcatc aggcgttcgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B251

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttctagatg aacccctcca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligo B252

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcaattgc gcggcagctt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptomyces parvulus Tü4055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

501

163

Claims (15)

1. Un compuesto de fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:

\vskip1.000000\baselineskip

164

\vskip1.000000\baselineskip

\quad

R_{1} es un grupo cicloalquilo sustituido como se muestra a continuación:

\vskip1.000000\baselineskip

165

\vskip1.000000\baselineskip

\quad

en donde R_{1} puede estar sustituido también opcionalmente con uno o más átomos de halógeno o uno o más grupos alquilo C_{1} a C_{3};

\quad

R_{2}, R_{3}, R_{6}, o R_{11} son cada uno independientemente H, OCH_{3}, CH_{3} o CH_{2}CH_{3}; y R_{4} es CN, CO_{2}H o CH_{3}.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un compuesto o sal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R_{4} es CH_{3} o COOH.

3. Un compuesto o sal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R_{4} es CN.

4. Un compuesto o sal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R_{1} es ciclobutano-1'-carboxilato.

5. Un compuesto o sal de acuerdo con la reivindicación 4, en donde R_{4} es CH_{3} o COOH.

6. Un compuesto o sal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R_{6} es CH_{3}, R_{2} y R_{11} son H y R_{1} es ciclobutano-1'-carboxilato.

7. Un compuesto o sal del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto se selecciona de la lista constituida por:

\vskip1.000000\baselineskip

166

167

y

168

8. El uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de afecciones microbianas que incluyen malaria, para la inhibición de la angiogénesis, para el tratamiento de trastornos proliferativos, o para el tratamiento de afecciones caracterizadas por vascularización inadecuada.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el medicamento es un agente anti-cáncer.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el trastorno proliferativo es psoriasis.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la afección caracterizada por vascularización inadecuada se selecciona del grupo constituido por psoriasis, artritis reumatoide, ateroesclerosis y retinopatía diabética.

12. El uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la fabricación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis.

13. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso como medicamento.

14. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en mezcla con un excipiente, vehículo, tampón o estabilizador farmacéuticamente aceptable.

15. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso como medicamento para el tratamiento de afecciones microbianas que incluyen malaria, para la inhibición de la angiogénesis, para el tratamiento de trastornos proliferativos, o para el tratamiento de afecciones caracterizadas por vascularización inadecuada.