DE69313842T2

DE69313842T2 - Teilweise modifizierte und retro-invertierte tetrapeptides analogue von fragmenten des c reaktiven proteins

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Publication number: DE69313842T2
Application number: DE69313842T
Authority: DE
Inventors: Silvana I-20099 Sesto S. Giovanni Cappelletti; Laura I-20099 Sesto S. Giovanni Gazerro; Flavio I-20099 Sesto S. Giovanni Leoni; Massimo I-20099 Sesto S. Giovanni Pinori; Antonio Silvio I-20099 Sesto S. Giovanni Verdini
Original assignee: Italfarmaco SpA
Current assignee: Italfarmaco SpA
Priority date: 1992-04-16
Filing date: 1993-04-02
Publication date: 1998-04-09
Anticipated expiration: 2013-04-03
Also published as: ITMI920939A0; US5578575A; NZ251697A; HU9402952D0; IT1254883B; ITMI920939A1; CN1078476A; NO943903L; US5521159A; ZA932614B; AU667096B2; CN1039124C; JPH07505640A; DE69313842D1; FI944224A; EP0636140B1; EP0636140A1; ATE157987T1; HUT70179A; ES2109487T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf retro-invertierte Tetrapeptid- Analoga von C-reaktiven Protein-Fragmenten (nachstehend als CRP bezeichnet).
CRP ist ein Protein, das im allgemeinen in einer sehr niedrigen Konzentration im Blut vorkommt, die nach einem Entzündungsprozeß bis auf das 2000-fache ansteigt [J.J. Morley und I. Kushner, "Am. N.Y. Acad. Sci.", 389, 406-418 (1989)]. F.A. Robay et al. beschreiben in "J. Biol. Chem.", 262, Nr. 15, 7053- 7057 (1987), drei CRP-Tetrapeptid-Sequenzen, die sehr ähnlich denjenigen von Tuftsin sind. Die chemisch synthetisierten Tetrapeptide stimulieren, wie darin angegeben ist, die phagozytischen Leukozyten zur Bildung von Superoxid und induzieren mononukleare Zellen zur Bildung von Interleukin 1 in qualitativ und quantitativ ähnlicher Weise wie Tuftsin. Wie Tuftsin sollten die drei CRP-Tetrapeptide in vivo schnell durch Proteasen verstoffwechselt werden und Peptid-Metabolite ergeben, die konkurrierend die biologische(n) Aktivität(en) der Stamm-Peptide inhibieren könnten.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß teilweise modifizierte und N- terminal retro-invertierte Analoga der genannten CRP-Tetrapeptid-Fragmente nicht nur eine beträchtliche Stabilität gegenüber dem enzymatischen Abbau aufweisen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer immunmodulierenden Aktivität wie sie bereits für Tuftsin bekannt ist (vgl. EP-A-0 253 190), sondern daß sie insbesondere in der Lage sind, unterschiedliche biologische Effekte je nach Struktur und angewendeter Dosis, insbesondere bei der Behandlung des septischen Schocks,zu ergeben.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf retro-invertierte Tetrapeptide der allgemeinen Formel (I)
worin bedeuten:
R ein Wasserstoffatom oder die Seitenkette von Threonin;
R&sub1; die Seitenkette von Arginin, Leucin oder Glutamin; und
R&sub2; ein Wasserstoffatom oder eine metabolisch abbaubare Acylgruppe;
mit der Maßgabe, daß dann, wenn R&sub1; die Seitenkette von Arginin ist, R nicht die Seitenkette von Threonin sein kann; und
ihre diastereoisomeren Formen und ihre pharmakologisch akzeptablen Salze, Ester und Amide.
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die retro-invertierte Tetrapeptide ggly-(R,S)mLys-Pro-Arg, gThr-(R,S)mLys-Pro-Leu, gThr-(R,S)mLys-Pro-Gln, worin die Vorzeichen g und m bedeuten, daß die jeweilige Aminosäure ein gem-Diamin- bzw. Malonylrest ist, sowie ihrer diastereoisomeren Formen.
Die erfindungsgemäßen retro-invertierten Tetrapeptide werden nach bekannten Verfahren synthetisiert, die der Fachmann auf diesem Gebiet in Abhängigkeit von der Art der Aminosäuren, die retro-invertiert werden sollen, auswählen kann.
Wenn beispielsweise der gem-Diamin-Rest die 1,1-Diaminomethan-Gruppe (gGly) ist, kann das retro-invertierte Tetrapeptid hergestellt werden, indem man zuerst das Meldrum-Säure-Derivat c-mLys(Z) (d.h. 5-[4- Benzyloxycarbonyl]-2,2-dimethyl-1,3-dioxan-4,6-dion) in Gegenwart eines Silanierungsmittels wie N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (TSMAc), Trimethylsilylchlorid (TMS-Cl) oder Trimethylsilylcyanid (TMSCN) mit H- Gly-NH&sub2; umsetzt (M.J.O. Anteunis & Chr. Becu, "Bull. Soc. Chim. Belg.", 96, 119-139 (1986)). Die zweite Gruppe an dem Malonyl-Rest des so erhaltenen Pseudopeptids OH-(R,S)mLys (Z)-Gly-NH&sub2; (Z = Benzyloxycarbonyl) wird in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) mit t- Butyl-prolinat kondensiert unter Bildung des Pseudotripeptids [(R,S)mLys(Z)- Gly-NH&sub2;]-Pro- H. Seine Prolin-Carboxygruppe wird mit DCC und N-Hydroxysuccinimid (HOSu) aktiviert und mit ungeschütztem Arginin umgesetzt [P. Gottlieb et al., "Ann. N.Y. Acad. Sci.", 419,12 (1983)], wobei man das retroinvertierte Tetrapeptid [(R,S)m-Lys (Z)-Gly-NH&sub2;]-Pro-Arg-OH erhält. Die Reinigung erfolgt dann durch RP-DC-Verdrängungschromatographie und auf diese Weise ist es auch möglich, gewünschtenfalls die Diastereoisomeren voneinander zu trennen. Das gereinigte Produkt wird durch HCOOH in Gegenwart von Palladium katalytisch hydriert zur Entfernung der verbliebenen Schutzgruppen und dann mit [1,1-Bis(trifluoroacetoxy)iodo]benzol (TIB) behandelt, um das Glycincarboxamid in den N-terminalen Rest von gGly umzuwandeln. Eine letzte Reinigung durch lonenaustauschchromatographie ermöglicht es, das Endprodukt als Acetat zu erhalten.
Ein anderes Beispiel ist dasjenige, bei dem Threonin der gem-Diamin-Rest ist. Die Synthese des retro-invertierten Tetrapeptids beginnt mit einem C-terminalen Dipeptid, das erhalten wird durch Kondensation von Z-Pro-OH und H-Y- OtBu, worin Y für die Aminosäure Leu oder Gin steht, entsprechend den Angaben in der Definition der Formel I, die gegebenenfalls in geeigneter Weise geschützt ist, und durch anschließende Entfernung der Benzyloxycarbonylgruppe durch katalytische Hydrierung. Ein solches Dipeptid wird mit dem N- terminalen retro-invertierten Dipeptid umgesetzt, das hergestellt wird, wie beispielsweise in der italienischen Patentanmeldung Nr.21349 A/90 beschrieben.
Das MNP-Thr(tBu)-OH, das erhalten wird durch Acylierung des vorher silanierten H-THr(tBu)-OH mit MNP-COOH in Gegenwart von geeigneten Carboxy- Aktivierungsmitteln, wird mit Biphenylphosphorazid (DPPA) behandelt, wobei man das relevante Azid erhält, aus dem, man durch Erhitzen das Isocyanat erhält. Dieses wird in Gegenwart von katalytischen Mengen Amin, vorzugsweise eines tertiären Amins wie Triethylamin oder Dusopropylamin, mit Thiophenol behandelt, wobei man das Phenylthiocarbonyl-Derivat MNP-gthr(tbu)-PTC erhält. Anschließend wird der Am in-Rest von Schutzgruppen befreit, beispielsweise durch Behandlung mit verdünntem Natriumhydroxid, wobei man MNP-gTHr(tBu)-H erhält. Die Kondensation des letzteren mit c-mLys(Boc) ergibt das N-terminale Pseudodipeptid MNP-gThr(tBu)-(R,S)mlys(Boc), das seinerseits in Gegenwart von DCC/HOBT mit H-Pro-Y-OTBu, worin Y wie oben definiert ist, kondensiert wird unter Bildung des geschützten retro-invertierten Tetrapeptids der Formel I, worin R für 1-Hydroxyethyl steht. Durch Behandlung mit einer Säure werden alle Schutzgruppen entfernt mit Ausnahme derjenigen an dem gem-Diamin-Rest. Gleichzeitig mit der Reinigung durch RP-DC ist es gewünschtenfalls möglich, die beiden Diastereoisomeren voneinander zu trennen. Die MNP-Gruppe kann durch katalytische Hydrierung entfernt werden, beispielsweise durch Verwendung von Ammoniumformiat auf Pd-Schwamm. Das retro-invertierte Tetrapeptid wird unter Anwendung geeigneter chromatographischer Verfahren der Endreinigung unterzogen.
Nachstehend werden Herstellungsbeispiele für einige retro-invertierte Tetrapeptide, die repräsentativ für die hier beanspruchte Klasse sind, angegeben, die Erfindung ist jedoch keineswegs darauf beschränkt.
Die HPLC-Analyse der Aminosäure-Derivate, der geschützten Fragmente und des retro-invertierten Tetrapeptids wird unter den folgenden Versuchs- Bedingungen durchgeführt:
Kolonne: Lichrosorb RP-18;
Fließgeschwindigkeit 1,5 ml/min;
Detektor: Merck L-4200 UV-VIS (230 oder 254 nm);
Eluierungsmittel A: Wasser 90 %, MeCN 10 %, Trifluoressigsäure(TFA) 0,1 %;
Eluierungsmittel B: MeCN, TFA 0,1 %;
Eluierungsmittel C: Wasser, TFA 0,1 %;
Gradienten:
(I) 0 bis 40% B in A (20') bis 80% Bi n A (10')
(II) 37 bis 80 % B in A (20')
(III) 0 bis 50 % A in C (20'), bis 100 % A (3') bis 40 % B in A (20')
(IV) 10 bis 40% A in C (8') bis 100% A (2') bis 40% Bin A (20')
Bei den Ionenaustausch-Reinigungen wird das FPLC-System von Pharmacia, ausgestattet mit dem LKB UVICORD S II-Detektor mit einem Filter bei 226 nm, dem Pharmacia-Rekorder (Aufzeichnungs-Geschwindigkeit = 0,1 cm/min) und dem Pharmacia FRAC 200-Fraktionskollektor, verwendet.
Die Aminosäure- und NH&sub3;-Zusammensetzungen und die Verhältnisse (Mengenanteile) (als spezifischer Wert des gem-Diamino-Restes) der verschiedenen retro-invertierten Peptide werden bestimmt mit dem automatischen Beckman SYSTEM GOLD-Aminosäure-Analysator nach 22-stündiger Hydrolyse bei 110ºC mit 6M HCl.
Der in Klammern nach dem Namen einiger Verbindungen angegebene alphanumerische Code ist ein interner Code zur Identifizierung.

Beispiel 1

H-gGly-(R,S)mLys-Pro-Arg-OH-2AcOH (ITF 1127)

A) Eine Suspension von H-Gly-NH&sub2;.HCl (3,32 g, 30 mmol) in THF (200 ml) wurde nacheinander mit TMSAc (19,6 ml, 80 mmol) und TMS-Cl (2,54 ml, 20 mmol) versetzt. Nach 30 Minuten wurde c-mLys(Z) (6,98 g, 20 mmol) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde weitere 3 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum eingedampft und der Rückstand wurde mit Wasser (20 ml) aufgenommen, während der pH-Wert mit 0,1 N HCl auf 3 eingestellt wurde. Nach 1-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde der gebildete Feststoff abfiltriert,jnit Wasser gewaschen und in heißem Ethanol gelöst. Der nach dem Abkühlen erhaltene Feststoff wurde filtriert, mit Ethylether gewaschen und getrocknet. Man erhielt 3,8 g (R,S)mLys(Z)-Gly-NH&sub2; (Ausbeute 51 %).
HPLC [Gradient (I) (254 nm)]: r.t. 13,5 min;
Reinheit 98 %; F. 161 ºC (Zers.)
Das ¹H-NMR-Spektrum bestätigte die Struktur des Produkts.
B) Eine Lösung des unter (A) erhaltenen Produkts (3,65 g, 10 mmol) in DMF (15 ml), die in einem Eisbad gekühlt wurde, wurde nacheinander mit HOBT (1,43 g, 10,5 mmol) und DCC (1,96 g, 9,5 mmol) versetzt. Nach 30- minütigem Rühren wurde die Mischung filtriert und das Filtrat wurde zu einer DMF-Lösung (10 ml), die HCl.H-Pro-OtBu (2,49 g, 12 mmol) und TEA (1,67 ml, 12 mmol) enthielt, zugegeben. Die Mischung wurde 3 h lang gerührt, dann wurde das Lösungsmittel unter Vakuum eingedampft, der Rückstand wurde mit Ethylacetat (50 ml) aufgenommen und die organische Phase wurde mit 2 % Kaliumbisulfat, 5 % Natriumhydrogencarbonat gewaschen und mit Wasser neutralisiert, dann auf Natriumsulfat entwässert. Die erhaltenen 4,2 g eines leichten Öls (Ausbeute: 82 %) wurden in einem DMC/TFA-Gemisch (Volumenverhältnis 1:1,16 ml) gelöst und 1 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum eingedampft und der Rückstand wurde mit Ethylacetat und Ethylether vermahlen, wobei man 3,6 g [(R,S)mLys(Z)-Gly-NH&sub2;]-Pro-OH in Form eines weißen Feststoffes erhielt (Ausbeute: 79 %).
HPLC [Gradient (1) (254 nm)]: r.t. 14,6 und 15,7 min (zwei Diastereoisomere);
Reinheit 97 %.
Das ¹H-NMR-Spektrum bestätigte die Struktur des Produkts.
C) Eine Lösung des unter (B) erhaltenen Produkts (3,36 g, 7,5 mmol) in THF (50 ml) wurde mit HOSu (0,95 g, 8,25 mmol) und nach dem Abkühlen auf -10ºC mit DCC (1,54 g, 7,5 mmol) versetzt. Nach 4-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung futriert und das Filtrat wurde zu einer Lösung von Dmfiwasser (Volumenverhältnis 7:3,125 ml) zugegeben, die H-Arg-OH (1,74 g, 10 mmol) und KCl (0,74 g, 10 mmol) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 90 min lang unter Rühren bei Raumtemperatur gehalten, dann wurde das Lösungsmittel unter Vakuum verdampft und der Rückstand wurde einige Male mit Ethylether gewaschen und getrocknet. Der erhaltene Feststoff wurde in einer wäßrigen TFA-Lösung (Volumenverhältnis 0,16, 30 ml) gelöst und durch RP-DC in drei aliquoten Anteilen gereinigt. Bei jeder Reinigung wurden 10 ml Lösung auf eine Dynamax 300 Å C&sub1;&sub8; (21,4 mm × 300 mm)-Kolonne aufgegeben, die vorher mit Wasser enthaltendem TFA (Volumenverhältnis 0,1 %) bei einer Fließgeschwindigkeit von 2,7 mllmin äquilibriert worden war. Nach Beendigung der Beschickung wurde die Kolonne ebenfalls mit 2,7 ml/min, mit einer wäßrigen Lösung von 50 mM Benzyldimethylhexadecylammoniumchlorid (BDHA-Cl), die TFA (0,1 Vol./Vol.-%) enthielt, eluiert. Nach etwa 1-stündiger Elution wurden 2,7 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden durch HPLC [Gradient (I)] analysiert und diejenigen, die Verunreinigungen enthielten, wurde eliminiert, während die anderen in drei Gruppen gesammelt wurden, die jeweils enthielten das Isomer A, eine Mischung aus den beiden Isomeren und das Isomer B der Verbindung [mLys(Z)-Gly-NH&sub2;]- Pro-Arg-OH. Am Ende der drei Chromatographien wurden die drei Gruppen von Fraktionen gefriergetrocknet, wobei man 1,9 g Isomer A, 0,45 g der Isomerenmischung und 1,8 g Isomer B erhielt (Gesamtausbeute: 89 %).
HPLC [Gradient (1) (220 nm)]: r.t. 13,6 min (lsomera), Reinheit: 96%; r.t. 14,7 min (Isomer B); Reinheit 93%+4% Isomer A.
FAB-MS: m/z=61 9 amu [M+H]&spplus;; m/z=485 amu [M-Z+H]&spplus; (identische Spektren für die beiden Isomeren).
D) Frischer Pd-Schwamm (etwa 0,1 g) wurde zu einer Lösung der Isomerenmischung, wie sie unter (C) erhalten worden war (0,31 g, 0,5 mmol) in Ameisensäure (85 %, 5 ml) zugegeben und die Mischung wurde 90 min lang bei Raumtemperatur langsam gerührt. Nach dem Abfutrieren das Katalysators wurde das Lösungsmittel unter Vakuum eingedampft und der Rückstand wurde mit Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Der erhaltene Feststoff wurde in einem DMF/Wasser-Gemisch (Volumenverhältnis 3:1, 5 ml) gelöst und mit TIB (0,43 g, 1 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung, die gegenüber Licht abgeschirmt wurde, wurde 16 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum eingedampft und der Rückstand wurde in Wasser gelöst, mit Ethylether gewaschen und gefriergetrocknet. Der erhaltene Feststoff wurde bei pH 6 in Wasser gelöst und auf eine Kolonne (6 mm × 200 mm) aufgegeben (Fließgeschwindigkeit = 1 ml/min), die mit CM-52 Carboxymethylcellulose gefüllt und vorher mit einer Lösung von 15 mM Ammoniumacetat bei pH 6 äquilibriert worden war. Nach dem Beschicken wurde die Kolonne mit einem linearen Gradienten von Ammoniumacetat von 0,15 mM bis 150 mM innerhalb von 6 h bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 mllmin eluiert, während der pH-Wert bei 6 gehalten wurde. Es wurden Fraktionen von 3 ml gesammelt und durch HPLC analysiert [Gradient (III))]: die Fraktionen, die das Titelprodukt (ITF 1127) enthielten, wurden gesammelt und mehrmals gefriergetrocknet. Der erhaltene Feststoff wurde in absolutem Ethanol gelöst und 0,085 g Produkt wurden durch Zugabe von Ethylether ausgefällt (Ausbeute: 30 %). HPLC: [Gradient (III)]: r.t. 8,8 (lsomera) und 10,2 (Isomer B) min; Reinheit 99
FAB-MS: m/z=457 amu (M+H]&spplus;
Nach einem analogen Verfahren erhielt man 0,452 g des lsomers A (ITF 1357) (Ausbeute: 30 %).
¹H-NMR (200 MHz; DMSO)
t (1H; NHG) 8.25; d (1H; NH-R) 7.20; m (1H; CαP) 4.30; m (4H; αG; αR; δAP) 3.93÷3.64; m (3H; δBP; δK) 3.61÷3.37; t(2H; δR) 3.04; t (2H; &epsi;K) 2.74: m (6H; βP; tP; βK) 2.09÷1.79; s (6H CH&sub3;COCH) 1.75; m (8H; δK; τK; βR; tR) 1.70÷1.18.
Nach dem Verfahren für das Isomer A wurden 0,45 g Produkt als Isomer B (ITF 1358) (Ausbeute: 32 %) und 0,1 g Mischung (ITF 1127) erhalten. HPLC: (Gradient (III)]: 10,2 min; Reinheit 96 %+Isomer A:
FAB-MS; m/z-457 amu [M+H]
¹H-NMR (200 MHz; DMSO)
t (1H; NGH) 8.30; d (0.4H; NHR) 7.57; d (0.6H; NHR) 7.47; m (1H; CαP) 4.43; m (3H; αG; αR) 3.97÷3.62; m (4H; δP; δK) 3.63÷3.33; m (2H; δR) 3.06; m (2H; &epsi;K) 2.72; s (6H CH&sub3;COO) 1.76; m (14H; βτP; β,τ,δK; β,τR) 1.21÷1.15.

Beispiel 2

H-gThr-(R.S)mLys-Pro-Leu-OHAcOH (ITF 1192)

A) Eine Lösung von Bis(trichloromethyl)carbonat (3,71 g, 12,5 mmol) in Methylenchiond (125 ml) von 0ºC wurde mit 1-Methylimidazol (5,96 ml, 75 mmol) in 80 ml Methylenchond versetzt. Nach 5 min wurde MNP-OH (5,63 g, 25 mmol), gelöst in Methylenchlond (80 ml), zugegeben und nach weiteren 5 min wurden H-Thr(tBu)-OH (5,26 g, 30 mmol), das vorher mit TMSCN (11,3 ml, 90 mmol) silaniert worden war, und außerdem 200 ml Methylenchlond zugegeben. Nach 10 min wurde die Reaktionsmischung mit einem wäßrigen Puffer, der auf pH 3,5 angesäuert worden war, gewaschen, entwässert (getrocknet) und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit 5 %igem Natriumcarbonat (300 mi) aufgenommen und mit Methylenchiond gewaschen. Die wäßrige Phase wurde mit weiteren 200 ml Ethylacetat versetzt und der pH-Wert wurde auf 5,7 gebracht. Die organische Phase wurde abgetrennt und entwässert und das Lösungsmittel wurde eingedampft, wobei man MNP-Thr(tBu)-OH in Form eines Öls erhielt (6,5 g, Ausbeute: 68 %).
HPLC (Gradient (1) (254 nm)]: r.t. 25,1 min; Reinheit 88 %.
B) Eine Lösung der unter (A) erhaltenen Verbindung (5,2 g, 13,6 mmol) in wasserfreiem Toluol (50 ml) von 0ºC wurde mit DPPA (3,22 ml, 14,9 mmol) und TEA (2,09 ml, 14,9 mmol) versetzt. Nach 4 h wurde die Reaktionsmischung dreimal mit einer mit Natriumhydrogencarbonat gesättigten Lösung und mit einer mit Natriumchlorid gesättigten Lösung gewaschen, wobei beide Lösungen vorher auf 0ºC abgekühlt worden waren, dann wurde sie entwässert. Die das Azid enthaltende Lösung wurde auf 80ºC erhitzt und 40 min lang bei dieser Temperatur gehalten. Das gebildete lsocyanat wurde mit Thiophenol (1,39 ml, 13,6 mmol) und einer katalytischen Menge TEA (191 µl, 1,36 mmol) bei Raumtemperatur versetzt. Nach einer Nacht wurde die Mischung mit Ethylacetat und Wasser behandelt und die organische Phase wurde mit 2 %igem Kaliumbisulfat, 5 %igem Natriumhydrogencarbonat gewaschen und mit Wasser neutralisiert, dann über Natriumsuifat getrocknet, zur Trockne eingedampft und das erhaltene Öl wurde mit Petrolether verrieben. Dabei erhielt man 4,7 g MNP-gThr(tBu)-PCT (Ausbeute: 71,2 %).
HPLC [Gradient (II) (254 nm)]: r.t. 14,9 min; Reinheit: 95 %.
C) Eine Mischung von Natriumhydroxid (1M, 26 ml) und Wasser (877 ml), die bei 0ºC gehalten wurde, wurde langsam mit einer Lösung der unter (B) erhaltenen Verbindung (4,7 g, 9,6 mmol) in THF (64 ml) versetzt. 5 min nach Beendigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung mit HCl (1M, 26 ml) neutralisiert. Das THF wurde eingedampft und es wurde Chloroform (80 ml) zugegeben und der pH-Wert der biphasischen Mischung wurde mit 1 M Natriumhydroxid auf 9,0 gebracht. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wäßrige Phase wurde dreimal mit Chloroform behandelt, wobei der pH-Wert jedesmal auf 9,0 eingestellt wurde: die organischen Phasen wurden gesam melt und zur Trockne eingedampft. Der in Ethylether wieder suspendierte Rückstand wurde mit Wasser (50 ml) versetzt und die Mischung wurde bis auf pH 3,5 mit 1M HCl titriert, bis der pH-Wert konstant war. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und die Behandlung wurde zweimal wiederholt. Die gesammelten wäßrigen Phasen wurden gefriergetrocknet, wobei man 2,8 g MNP gThr(tBu)-H.HCl erhielt (Ausbeute: 85 %).
HPLC [Gradient (I) (254 nm)]: r.t. 16,43 min; Reinheit 99,9 %.
D) Eine Lösung der unter (C) erhaltenen Verbindung (2,6 g, 6,6 mmol) und von c-mLys(Boc) (2,4 g, 8 mmol) in THF (120 ml) wurde langsam mit TMSAc (4,6 ml, 20 mmol) versetzt. Nach 20 h wurde die Reaktionsmischung eingedampft und der Rückstand wurde Wasser aufgenommen und in Gegenwart von Ethylacetat mit 1M HCl auf pH 3,5 gebracht. Die wäßrige Phase wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert und die gesammelten organischen Phasen wurden entwässert (getrocknet), auf ein geringes Volumen eingeengt und mit Disopropylether versetzt, wobei man 3,4 g MN P-gThr(tBu)-(R,S)mLys(Boc)- OH (Ausbeute: 85 %) erhielt.
HPLC [Gradient (II) (230 nm)]: r.t. 9,9 und 10,2 min (zwei Diastereoisomere); Reinheit 93 %.
E) Eine Lösung von Z-Pro-OH (2,4 g, 10 mmol) und H-Leu-OtBu.HCl (2,7 g, 12 mmol) in Methylenchlond (50 ml) wurde mit TEA (3 ml, 22 mmol) und anschließend mit BOP (4,4 g, 10 mmol) und HOBT (1,35 g, 10 mmol) versetzt. Nach 5 h wurde die Reaktionsmischung einmal mit einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung behandelt, dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat und Wasser aufgeteilt. Die organische Phase wurde mit 2 %igem Kaliumbisulfat, 5 %igem Natriumhydrogencarbonat gewaschen, mit Wasser neutralisiert und über Natriumsulfat entwässert, dann getrocknet und aus dem Rückstand, gelöst in Dusopropylether, erhielt man durch Zugabe von Petrolether 3,8 g Z-Pro-Leu-Otbu (Ausbeute: 92,7 %).
HPLC [Gradient (1) 230 nm)]: r.t. 28,6 min: Reinheit 100 %.
F) Das unter (E) erhaltene Dipeptid (1,5 g, 3,5 mmol) wurde in Methanol (70 ml) gelöst und diese Lösung wurde unter Stickstoff mit Pd/C-Katalysator (100 mg) und dann sehr langsam mit Triethylsilan (2,9 ml, 18 mmol) versetzt. Nach 3 h wurde die Reaktionsmischung filtriert und das Lösungsmittel wurde eingedampft, wobei man 1 g H-Pro-Leu-Otbu erhielt (Ausbeute: 100 %).
HPLC [Gradient (I) (230 nm)]: r.t. 15,9 min; Reinheit 93 %.
G) Eine Lösung des unter (D) erhaltenen Pseudodipeptids (1,1 g, 1,9 mmol) in Methylenchlond (15 ml) wurde mit HOBT (320 mg, 2,3 mmol), gelöst in 200 ml DMF, zersetzt. Die Temperatur wurde auf 0ºC gebracht und es wurde DCCI (392 mg, 1,9 mmol) zugegeben. Nach 15 min wurde die Mischung in einen Kolben filtriert, der das unter (E) erhaltene C-terminale Dipeptid (540 mg, 1,9 mmol) enthielt, und über Nacht reagieren gelassen. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt und die organische Phase wurde mit 2 %igem Kahumbisulfat, 5 %igem Natriumhydrogencarbonat gewaschen und mit Wasser neutralisiert, dann über Natriumsulfat entwässert. Aus der getrockneten organischen Phase erhielt man durch Verreiben des Rückstandes mit Disopropylether 12,3 g MNP-gThr(tBu)-(R;S)mLys(Boc)-Pro-Leu-OtB (Ausbeute: 77 %).
HPLC: isokratisch aus 65 % B (230 und 254 nm): r.t. 8,2 und 8,6 min; Reinheit: 100%.
H) Ein aliquoter Anteil der unter (G) erhaltenen Verbindung (1,4 g, 1,3 mmol) wurde 8 min lang in einem Eisbad mit konzentrierter HCl (5 ml) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockne eingedampft, dann mit Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Man erhielt 910 mg eines Rohprodukts, das durch RP-DC auf einer Dynamax-Kolonne (300 Å C18, 12 pm, 21 mm × 250 mm) gereinigt wurde unter Verwendung von Benzyldimethyldodecylammoniumbromid (BDDA-Br, 50 mM in 90 % Wasser, 10 % Acetonitril und 0,1 % TFA) als Verdrängungsmittel, bei einer Fließgeschwindigkeit von 2,7 ml/min. Auf diese Weise erhielt man drei Fraktionen von MNP-gthr-mlys-Pro-Leu-OH: 320 mg Isomer A, 320 mg Isomer B und 160 mg Diastereoisomeren-Gemisch.
HPLC [Gradient (I) (230 nm)]: r.t. 16,1 und 18 min; Reinheit 99,9 %.
I) Das unter (H) erhaltene Isomer A (315 mg, 0,4 mmol) wurde in Methanol (15 ml) gelöst und mit Pd-Schwamm, der mit Ameisensäure aktiviert worden war, und einer Lösung von Ammoniumformiat (120 mg) in Ameisensäure (5 ml) versetzt. Nach 2 h wurde der Katalysatoren abfiltriert und nach dem Eindampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand in Wasser aufgenommen. Die wäßrige Phase wurde mit Ethylether gewaschen und gefriergetrocknet, wobei man 200 mg eines Rohprodukts erhielt, das durch lonenaustausch an einer Pharmacia XK16-Kolonne (16 mm × 200 mm), gefüllt mit 5-Sepharose Fast Flow, unter Verwendung von 0,015 M Ammoniumacetat, pH 6,0 (A), und 0,3 M Ammoniumacetat, pH 6,0 (B), als Eluierungsmittel in einem linearen Gradienten von 0 bis 25 % B in A (30') und dann isokratisch 40 min lang bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min gereinigt wurde. Die alle 2 min gesammelten Fraktionen wurden durch HPLC analysiert und diejenigen, die das Titelprodukt enthielten, wurden gefriergetrocknet.
HPLC (Gradient (III) (230 nm)]: r.t. 12,8 min; Reinheit 97 %.
Aminosäure-Zusammensetzung: Pro(1) 1,0; Leu(1) 1,0; NH&sub3;(2) 1,9; Peptid- Gehalt: 77 µmol (40 mg; Ausbeute: 20 %).
¹H-NMR (200 MHz ¹H-DMSO: 30ºC) (isomer A - ITF 1432):
d (1H; NH-gT) 7.79; d (1H; NH-L) 6.93; m (2H; Cα-P, Cα-gT) 4.31÷4.21; q (1H; Cα-L) 3.84; m (1H; Cδ-P) 3.74; m (3H; Cδ²P; Cβ-gT; Cα-mK) 3.63÷3.37; m (2H; C&epsi;-mK) 2.75; m (4H; Cβ,Cτ-P) 2,19÷1,74; m (9H; Cβ,Cτ,Cδ-mK; Cβ,Cτ-L) 1.73÷1.13; d (3H; Cτ-gT) 1.06; d (3H; Cδ¹L) 0.88; d (3H; Cδ²L) 0.87.
Nach dem gleichen Verfahren, wie es für das Isomer A angewendet worden war, wurde das Isomer B (ITF 1443) erhalten:
¹H-NMR (200 MHz ¹H-DMSO; 30ºC)
d (0.9H; NAH-gT) 8.13; d (0.1H; NBH-gT) 8.03; d (0.1H; NBH-L) 7.45; d (0.9H; NAH-L) 7.36; m (2H; Cα-P, Cα-gT) 4.37÷4.24; m (1H; Cα-L) 3.86; m (3H; cδ-P; Cβ-gT) 3.56÷3.38; m (1H; Cα-mK) 2.16; m (2H; C&epsi;-mK) 2.76; m (13H; Cβ,Cτ-P; Cβ,Cτ,Cδ-mK; Cβ,Cτ-L) 2.23÷1.15; d, (3H; Cτ-gT) 1.03; d (6H; Cδ-L) 0.88.

Beispiel 3

H-gThr-(R,S)mLys-Pro-Gln-OH.AcOH (ITF 1193)

A) Z-Gln-OH (5,6 g, 20 mmol) wurde in Eisessig (60 ml) gelöst und mit Trt- OH (Trt=Trityl) (10,4 g, 40 mmol), Ac&sub2;O (3,77 ml, 40 mmol) und Schwefelsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde auf 50ºC erhitzt und 90 min lang bei dieser Temperatur gehalten, dann wurde sie auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Wasser behandelt. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, in Wasser suspendiert und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Aus den gesam melten und entwässerten organischen Phasen erhielt man 8,12 g Z-Gln(Trt)- OH als Niederschlag nach dem Einengen und nach der Zugabe von n-Hexan (Ausbeute: 77 %).
HPLC [Gradient (II) (230 nm)]: r.t. 11,3 min; Reinheit: 100%.
B) Eine Lösung des unter (A) erhaltenen Produkts (4 g, 7,6 mmol) in Methylenchlorid (50 ml) wurde mit Borotrifluoroetherat (153 pl) und t-Butyl-2,2,2- trichloroacetimidat (TBTA; 4,2 g, 15,3 mmol) versetzt. Nach 10 min wurde die Reaktionsmischung einmal mit einer mit Natriumhydrocarbonat gesättigten Lösung und Wasser gewaschen, dann entwässert und zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde in Methanol (60 ml) gelöst und durch Zugabe von Wasser wurden 3,5 g Z-Gln(Trt)-Otbu ausgefällt (Ausbeute: 81 %).
HPLC [Gradient (II) (230 nm)]: r.t. 17,7 min; Reinheit 100 %.
C) Eine Lösung der unter (B) erhaltenen Verbindung (2,5 g, 4,3 mmol) in 200 ml Methanol, die mit Stickstoff gesättigt war, wurde mit Pd-Schwamm, der mit Ameisensäure aktiviert worden war, und mit einer Lösung von Ammoniumformiat (200 mg in 5 ml) versetzt. Nach 3 h wurde der Katalysator abfiltriert und die Methanollösung wurde zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat aufgenommen, einmal mit 5 %igem Natriumhydrogencarbonat gewaschen und dann mit Wasser neutralisiert. Die organische Lösung wurde entwässert und auf ein geringes Volumen eingeengt, dann auf 0ºC abgekühlt und mit 1 Äquivalent HCl in Ethylacettat (4M, 1,08 ml) behandelt. Durch nachfolgende Zugabe von Petrolether wurden 2 g HCl.H-Gln(Trt)-OtBu ausgefällt (Ausbeute: 100 %).
HPLC [Gradient (II) (230 nm)]: r.t. 7,4 min; Reinheit: 100 %.
D) Z-Pro-OH (1,15 g, 4,6 mmol) wurde in Methylenchlond (15 ml) gelöst und mit HOBT (0,7 g, 5,5 mmol) in DMF (250 pl) versetzt. Diese Lösung wurde in einem Eisbad mit DCCl (0,95 g, 4,6 mmol) versetzt. Nach 15 min wurde die Reaktionsmischung in einen Kolben filtriert, der die unter (C) erhaltene Verbindung (2 g, 4,1 mmol) enthielt, und mit TEA (587 µl, 4,1 mmol) neutralisiert. Nach 18 h wurde das Lösungsmittel eingedampft und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt, die organische Phase wurde mit 2 %igem Kaliumbisulfat, 5 %igem Natriumhydrogencarbonat gewaschen und mit Wasser neutralisiert, dann über Natriumsulfat entwässert. Aus der organischen Lösung, eingeengt auf ein geringes Volumen, erhielt man durch Zugabe von n-Hexan 2,6 g Z-Pro-Gln(Trt)-Otbu (Ausbeute: 93 %).
HPLC [Gradient (II) (230 nm)]: rt. 16,8 min; Reinheit: 100 %.
E) Das unter (D) erhaltene geschützte Dipeptid (2,4 g, 3,5 mmol) wurde in 100 ml Methanol mit Pd-Schwamm und Ameisensäure wie unter (C) angegeben hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators und nach dem Eindampfen des Methanols wurde der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen, einmal mit 5 %igem Natriumhydrogencarbonat gewaschen und entwässert. Die eingeengte organische Phase wurde mit HCl in Ethylacetat (4M, 875 pl) bei 0ºC behandelt und durch Zugabe von Petrolether erhielt man 2 g HCl.H-Pro-Gln(Trt)- OtBu (Ausbeute: 100 %).
HPLC [Gradient (II) (230 nm)]: r.t. 7,8 min; Reinheit: 100 %.
F) Eine Lösung des in Beispiel 2D erhaltenen Pseudodipeptids (1,38 g, 2,26 mmol) in Methylenchlond (15 ml) wurde mit HOBT (382 mg, 2,82 mmol), gelöst in 200 pl DMF, versetzt. Die Temperatur wurde auf 0ºC gebracht und es wurde DCCl (466 mg, 2,26 mmol) zugegeben. Nach 15 min wurde die Mischung direkt in einen Kolben filtriert, der das unter (E) erhaltene Dipeptid enthielt (1,31 g, 2,26 mmol), mit TEA (318 µl, 2,26 mmol) neutralisiert und über Nacht reagieren gelassen. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt, die organische Phase wurde mit 2 %igem Kahumbisulfat und 5 %igem Natriumhydrogencarbonat gewaschen mit mit Wasser neutralisiert, dann über Natriumsulfat entwässert. Die organische Phase wurde zur Trockne eingedampft und dann mit Ethylacetatin-Hexan (Volumenverhältnis 1:1,15 ml) aufgenommen, wobei man nach der Zugabe von n-Hexan 2,3 g MPN-gThr(tBu)-(R,S)mLys(Boc)-Pro-Gln(Trt)- OtBu erhielt (Ausbeute: 92 %).
HPLC [Gradient (II) (230 nm)]: r.t. 21,5 und 22,0 min (zwei Diastereoisomere); Reinheit: 92,5 %.
G) Das unter (F) erhaltene retro-invertierte Tetrapeptid (2,13 g, 1,87 mmol) wurde in Methylenchloriditfa (Volumenverhältnis 1:1, 40 ml) bei Raumtemperatur gelöst. Nach 90 min wurde das Lösungsmittel verdampft, wobei durch Zugabe von Ethylether ein Rohprodukt ausfiel. Auf diese Weise erhielt man 1,416 g MPN-gThr-(R,S)mLys-Pro-Gln-OH (Ausbeute: 95 %).
HPLC [Gradient (I) (230 nm)]: r.t. 12,4 min; Reinheit: 91,5 %.
Aminosäure-Zusammensetzung: Pro(1) 1,0; Gln(1) 1,0; NH&sub3; (3)2,9; Peptid- Gehalt: 92,7 %.
Das geschützte retro-invertierte Tetrapeptid wurde durch RP-DC auf einer Dynamax (300 Å Cl 8,12 µm, 21,4 mm × 300 mm)-Kolonne unter Verwendung von BDDA-Br (50 mM in Wasser, 0,1 %,TFA) als Verdrängungsmittel bei einer Fließgeschwindigkeit von 2,7 mumm gereinigt. Auf diese Weise erhielt man 1,04 g Produkt (Ausbeute: 81 %).
HPLC [Gradient (I) (230 nm)]: r.t. 12,4 min; Reinheit: 100 %. In einem Gradienten von 0 bis 20 % in A (20 min): r.t.: 17,5 und 17,8 min (zwei Diastereoisomere): Reinheit: 100 %.
H) Das unter (G) erhaltene geschützte retro-invertierte Tetrapeptid (875 mg, 1,1 mmol) wurde in 15 ml einer wäßrigen Lösung von Ammoniumformiat (0,25 M, pH 3,0) gelöst, mit Pd-Schwamm, der mit Ammoniumformiat (0,5 M, pH 3,0) aktiviert worden war, versetzt und 15 min lang bei 60ºC reagieren gelassen. Die Behandlung wurde viermal wiederholt, wobei die Reaktionstemperatur auf 70ºC erhöht wurde, bis die HPLC das Verschwinden der Ausgangs- Verbindung anzeigte. Dann wurde der Katalysator abfiltriert und die wäßrige Phase wurde mit Ethylether gewaschen und gefriergetrocknet. Das Rohprodukt wurde durch lonenaustausch an einer Pharmacia XK26-Kolonne (26×300 mm), gefüllt mit CM-Sephadex C-25, gereinigt unter Verwendung von 0,015 M Ammoniumacetat, pH 6,0 (A), und 0,3M Ammoniumacetat, pH 6,0 (B), als Eluierungsmittel mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % B (360 min) bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 mllmin. Es wurden Fraktionen von 3,7 ml gesammelt; diejenigen, die ergeben hatten, daß sie das Titelprodukt enthielten, wurden gefriergetrocknet.
HPLC [Gradient (IV) (230 nm)]: r.t. 6,5 und 7,7 min (zwei Diastereoisomere im Verhältnis 1:1); Reinheit: 99 %.
Aminosäure-Zusammensetzung: Pro(1) 1,0; GIN(1) 1,0; NH&sub3;(3) 2,9; Peptid- Gehalt: 966 pmol (515 mg); Ausbeute: 88 %.
¹H-NMR (200 MHz; DMSO)
d (0.5H; NHT) 8.26; d (0.5H; NHT) 7.99; d (0.5H; NHQ) 7.49; s (1H; N Q) 7.31; d (0.5H; NαQ) 7.04; (1H; NαQ) 6.67; m (1 H; Cα T) 4.31; m (1 H; CαP) 4.22; m (2H; CαQ; CδP) 3.83÷3.70; m (3H; CβT; CαK; Cδ'P) 3.64÷3.34; m (2H; C&epsi;K) 2.74; m (8H; CβP; CβK; Cβ e CτQ) 2.17÷1.66; s (6H CH&sub3;COOH) 1.85; m (6H; CτP; Cτ e CδK) 1.64÷1.12; τ (3H; CτT) 1.04.
Einige für die Erfindung repräsentative Verbindungen wurden auf ihre biologische Aktivität hin getestet.

Stimulierung der in vitro IFN-τ-Bildung durch Maus-Milzzellen

Die Milzzellen wurden aus der Milz von BALB/C-Mäusen als Einzel-Zellen- Suspension erhalten. Die so erhaltenen Milzzellen wurden in einem RPMI 1640-Kulturmedium (Fiow Lab., Hertz, UK), das 5 % fötales Kalbsserum (FCS) (Hyclone, ST, Utah, USA) in einer End-Konzentration von 10&sup7; Zellen/ml enthielt, und 24 h lang bei 37ºC in Gegenwart der getesteten Verbindungen bei der angegebenen Konzentration in Platten mit 96 Vertiefungen inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde der Kulturüberstand gesammelt, durch ein 22 pm- Filter filtriert und bei -80ºC bis zum Zeitpunkt der Durchführung des Tests mit dem handelsüblichen ELISA-Kit (Genzyme, Boston, MA, USA) bei -80ºC eingefroren.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1
Die in bezug auf die Kontrolle (unbehandelte Zellen) als U/ml und Stimulierungs-lndex (IS) erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen in der Lage sind, dosisabhängig die IFN-τ-Bildung durch Maus- Milzzellen zu stimulieren. Insbesondere erwies sich die Verbindung des Beispiels 1 als stärkste der erfindungsgemäßen Klasse: sie verdoppelte nämlich das fragliche Cytokin bereits bei einer Dosis von 1,0 µg/ml.

Stimulierung der IL-1-Bildung durch Maus-Peritoneal-Makrophagen

Maus-Peritoneal-Makrophagen wurden erhalten durch Inokulieren einer Lösung von hydrolysierter Stärke (BDH Chemicals, Poole, Dorset, UK) in dem Peritoneal-Hohlraum von BALB/C-Mäusen drei Tage vor dem Töten der Tiere. Die Peritoneal-Zellen wurden dann gesammelt durch Waschen des Peritoneal Hohlraums mit einer Lösung von RPMI 1640, die 10 % FCS enthielt, und sie wurden in der gleichen Lösung bei einer Konzentration von 106 Zelleniml in Platten mit 96 Vertiefungen wieder suspendiert. Die Inkubation wurde 96 h lang bei 37ºC in Gegenwart der fraglichen Verbindungen durchgeführt. Am Ende der Behandlung wurden die Kulturüberstände gesammelt und für die Bestimmung von Cytokin mittels eines geeigneten handelsüblichen ELISA-Kits (Genzyme, Boston, MA, USA) verwendet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2
Die im Vergleich zur Kontrolle als U/ml und IS erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die getesteten Verbindungen eine bemerkenswerte stimulierende Wirkung haben. Insbesondere erhöhte die Verbindung des Beispiels 3 die IL-1-Bildung bei allen angewendeten Dosen etwa auf das 10-fache (9,3< IS< 10,7).

Stimulierung der Stickstoffoxid-Bildung durch Maus-Peritoneal-Zellen

Die Peritoneal-Zellen wurden wie in dem vorhergehenden Test beschrieben erhalten und 96 h lang bei 37ºC in Gegenwart der fraglichen Verbindungen und von Lipopolysaccharid in einer Konzentration von 30 pglml inkubiert. Am Ende der Behandlung wurden die Kulturüberstände gesammelt und der Stickstoffoxid-Gehalt wurde nach dem von R.M.J. Palmer et al.in "Nature", 327, 524,1987, beschriebenen Chemolumineszenz-Test bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3
Die im Vergleich zur Kontrolle als nmollml und Stimulierungs-Index erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen die Stickstoffoxid-Bildung bei allen angewendeten Dosen stimulieren. Insbesondere die Verbindung des Beispiels 2 wies einen Stimulierungs-Spitzenwert bereits bei 0,01 µg/ml (IS=4,3) auf.

Einfluß des Maus-Peritoneal-Makrophagen auf die leishmanizide Aktivität

Die wie vorstehend beschrieben gesammelten Peritoneal-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit ebenem Boden eingeimpft (Nunc, Roskiled, DK) in einer Konzentration von 10&sup5;/100 µl und 24 h lang bei 37ºC inkubiert. Am Ende der Behandlung wurden die an der Vertiefung nicht anhaftenden Zellen abgetrennt und entfernt, während die anhaftenden Zellen dreimal mit dem Kulturmedium gewaschen und 24 h lang mit den fraglichen Verbindungen inkubiert wurden, dann wurden die Zellqn durch 24-stündige Inkubation mit Promastigoten von Leishmania major (L. major, PVL49-Stamm, geliefert von Dr. Neal R.A., London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, UK) infiziert. Am Ende der Infektions-Behandlung wurde jede Vertiefung mit 100 µl einer 0,01 %igen Lösung von Natriumdodecylsulfat in RPMI 1640 versetzt und die Platten wurden 30 min lang bei 37ºC inkubiert. Es wurde das Schneider- Kultur-Medium (Schneider Drosophila medium, Gibco, Lab., Grand Island, New York, USA) mit 30 % FCS zugegeben. Jede Vertiefung wurde mit 1 µCi ³H- Thymidin versetzt und es wurde eine 72-stündige Inkubation bei 37ºC durchgeführt. Es wurde die Aufnahme der Radioaktivität durch die lebenden Parasiten in das Innere der Peritoneal-Zellen, die in Korrelation steht zu dem Infekti onsgrad und als Folge davon zu der leishmaniziden Aktivität der Zellen, bestimmt durch Sammeln der Zeilen mittels einer Zellenernte-Einrichtung und Messen der Radioaktivität mit einem Flüssigkeits-Szintillations-ß-Zähler. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4
* Zähler pro min
** = 100 - [cpm der behandelten Zeilen/cpm der Kontroll-Zellen × 100]
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen den Infektionsgrad vermindern können. Insbesondere die Verbindung des Beispiels 1 erwies sich als äußerst wirksam, da sie eine Infektions-Verminderung von über 70 % bereits bei der in dem Test verwendeten Minimaldosis ergab.

Bewertung des in vivo-Schutzes gegen septischen Schock

BALB/C-Mäuse (6 Mäuse/Gruppe) mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 g wurden intraperitoneal mit 50 mg/kg LPS (Lipopolysaccharid-Sigma) inokuliert. Die Gruppen mit Ausnahme der Kontrollgruppe wurden mit steigenden Dosen einer der erfindungsgemäßen Verbindungen, gelöst in einer physiologischen Lösung mit einem Endvolumen von 0,5 ml, zum Zeitpunkt 0 (d.h. zusammen mit LPS) oder 30 min nach der LPS-lnokulation inokuliert. Die Mäuse wurden 8 Tage lang überprüft zur Bestimmung des Überlebens-Prozentsatzes. Die Verbindung des Beispiels 1 ergab einen Überlebens-Prozentsatz von etwa 65 % bei Dosen von 6,2 µg/Maus und 0,62 µg/Maus und sein Isomer B ergab einen Überlebens-Prozentsatz von etwa 80 % bei einer Dosis von 6,25 µg/Maus und von 75 % bei einer Dosis von 62,5 µg/Maus.
Im Hinblick auf die vorstehenden Angaben sind die erfindungsgemäßen Verbindungen nützlich in allen pathologischen und nicht-pathologischen Situationen, in denen es darauf ankommt, die Immun-Antwort sowohl in der Therapie als auch in der Prophylaxe zu verstärken oder wiederherzustellen. Deshalb können als Beispiele für die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen genannt werden Bakterien-Infektionen, hauptsächlich im Falle des septischen Schocks, Viren-Infektionen (Herpes), Parasitosis, Infektionen als Folge des erworbenen Immundefizit-Syndroms (AIDS), die Prophylaxe in der Jugend und im Alter, schwere Verbrennungen, Dialyse, Tumore und Transplantationen. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen als Adjuvans in Impfstoffen verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind außerdem die Verwendung der neuen Verbindungen als immun-stimulierende Agentien sowie alle industriellen Aspekte, die mit der genannten Verwendung in Verbindung stehen einschließlich der pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten. Für die vorgesehenen therapeutischen Verwendungszwecke können die Verbindungen der Formel I, in geeigneter Weise formuliert in pharmazeutischen Zusammensetzungen, verabreicht werden entsprechend den Angaben, wie sie beispielsweise in "Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook", Mack Pub. Co., XVII ed., N.Y. USA, zu finden sind. Die Posologie hängt offensichtlich von mehreren Aspekten, beispielsweise der Art und Schwere des zu behandelnden Falles und den Zuständen des Patienten (Gewicht, Alter, Geschlecht und dgl.), ab.

Claims

1. Retroinvertierte Tetrapeptide der allgemeinen Formel (I)

worin bedeuten:

R ein Wasserstoffatom oder die Seiten kette von Threonin;

R&sub1; die Seitenkette von Arginin, Leucin oder Glutamin; und

R&sub2; ein Wasserstoffatom oder eine metabolisch abbaubare Acylgruppe; mit der Maßgabe. daß dann, wenn R&sub1; die Seiten kette von Arginin ist, R nicht die Seitenkette von Threonin sein kann;

die diastereoisomeren Formen und die pharmakologisch akzeptablen Salze, Ester und Amide derselben.

2. Tetrapeptid nach Anspruch 1, bei dem es sich handelt um

gGly-(R,S)mLys-Pro-Arg

und die einzelnen diastereoisomeren Formen.

3. Tetrapeptid nach Anspruch 1, bei dem es sich handelt um

gThr-(R,S)mLys-Pro-Leu

und die einzelnen diastereoisomeren Formen.

4. Tetrapeptid nach Anspruch 1, bei dem es sich handelt um

gThr-(R,S)mLys-Pro-Gln

und die einzelnen diastereoisomeren Formen.

5. Retroinvertiente Tetrapeptide nach Anspruch 1 als immun-modulierende Substanzen und Agentien für die Prophylaxe und Behandlung des septischen Schocks.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein Tetrapeptid nach Anspruch 1, allein oder in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten, in einer Menge enthält, die wirksam ist bei der Immunmodulierung und bei der Prophylaxe und Behandlung des septischen Schocks.