DE69024839T2

DE69024839T2 - Retro-Inverso-Peptide, Analoga von Thymopenthin, die eine oder mehrere Bindungen tragen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Zubereitung eines Medikamentes

Info

Publication number: DE69024839T2
Application number: DE69024839T
Authority: DE
Inventors: Sabina Mariotti; Luciano Nencioni; Antonello Pessi; Alessandro Sisto; Antonio Silvio Verdini; Luigi Villa
Original assignee: Sclavo SpA
Current assignee: Sclavo SpA
Priority date: 1989-04-21
Filing date: 1990-04-18
Publication date: 1996-05-30
Anticipated expiration: 2010-04-19
Also published as: DE69024839D1; EP0393786B1; IT1229658B; ES2084647T3; IT8920257A0; CA2015053A1; EP0393786A1; ATE133180T1; JPH02292250A

Description

Die Erfindung betrifft neue Analoge von Thymopentin (TP5), die in der Peptidkette eine oder zwei Retroinversbindungen enthalten, sowie das Verfahren zur Herstellung dieser neuen Verbindungen und ihre Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen.
Insbesondere besteht ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung in Thymopentin-Analogen mit einer der folgenden allgemeinen Formeln
worin R Wasserstoff oder einen Acylrest bedeutet und
R¹ eine Gruppe -OR² bedeutet, worin R² ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit einer geraden oder verzweigten Kette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen Alkenyl- oder Alkinylrest mit einer geraden oder verzweigten Kette mit einem Gehalt an 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Arylalkylrest oder einen Alkylarylrest, die 7 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, bedeutet,
und den entsprechenden pharmazeutisch verträglichen Säure- oder Basenadditionssalzen.
Die neuen Verbindungen der Erfindung, die durch die vorstehenden chemischen Strukturformeln definiert und charakterisiert sind lassen sich in kürzerer Form durch die international anerkannten Peptidsymbole folgendermaßen wiedergeben:
R-H-gArg-mLys-Asp-gVal-mTyr-R¹ (I)
R-H-Arg-Lys-gAsp-mVal-Tyr-R¹ (II)
R-H-Arg-Lys-Asp-gVal-mTyr-R¹ (III)
worin R und R¹ die vorstehend definierten Bedeutungen haben.
In diesen Formeln bedeutet gArg einen geminalen Diaminorest, der sich von der Aminosäure Arginin durch Substitution der Carboxylgruppe mit einer Aminogruppe ableitet, während mLys einen Malonylrest bedeutet, der in der 2-Stellung mit der Seitenkette der Aminosäure Lysin substituiert ist.
In ähnlicher Weise bedeuten gAsp und gVal einen geminalen Diaminorest, der sich von Asparaginsäure bzw. Valin durch Substitution der Carboxylgruppe mit einer Aminogruppe ableitet, während mVal und mTyr einen Malonylrest bedeuten, der in der 2-Stellung mit der Seitenkette der Aminosäuren Valin bzw. Tyrosin substituiert ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Acylrest" Acylreste, die sich von Alkansäuren mit einer geraden oder verzweigten Kette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ableiten, z. B. Formal, Acetyl, Propionyl, Succinoyl und dergl., sowie aromatische Acylreste, die sich von Benzoesäure und substituierter Benzoesäure ableiten, z. B. Benzoyl, 4-Nitrobenzoyl, 2,3,4-Trimethoxybenzoyl und dergl.
Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch verträgliche Salze" bedeutet Säure- oder Basenadditionssalze, in denen das Anion bzw. das Kation bei Verabreichung in Form der Additionssalze relativ zu den therapeutisch wirksamen Dosen untoxisch und unschädlich sind, so daß etwaige mögliche Nebenwirkungen der Anionen oder Kationen nicht die vorteilhaften Wirkungen des Wirkstoffs beeinträchtigen.
Unter den verschiedenen Säuren, die zur Bildung von pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzen mit den Verbindungen der Formeln (I), (II) und (III) befähigt sind, lassen sich anorganische Säuren erwähnen, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und dergl., organische Carbonsäuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure und dergl., sowie organische Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure und Naphthalinsulfonsäure.
Die Basen, die mit den Verbindungen der Formeln (I), (II) und (III) zur Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen befähigt sind, umfassen beispielsweise anorganische Basen, wie Natrium- oder Kaliumhydroxide, Ammoniumhydroxid und dergl., sowie organische Basen, wie Triethylamin, Triethanolamin und dergl. Diese Additionssalze lassen sich entweder direkt durch das Herstellungsverfahren für die neuen retroinversen Peptide oder nach herkömmlichen Verfahren ausgehend von den Verbindungen der Formeln (I), (II) und (III) in Form der freien Basen oder Säuren durch Behandlung mit einem oder mehreren Äquivalenten der gewählten Säure oder der gewählten Base erhalten. Gegebenenfalls ist es auch möglich, ein bestimmtes Säureadditionssalz in ein anderes überzuführen, indem man das erste Salz mit einem geeigneten Ionenaustauscherharz behandelt, wie es beispielsweise von R. A. Boissonas et al. in Helv. Chim. Acta, Bd. 43 (1960), S. 1349 beschrieben ist.
Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Erfindung umfaßt die Verbindungen der Formeln (I), (II) und (III), worin R ein Wasserstoffatom oder einen metabolisch labilen Acylrest oder einen Acylrest bedeutet, dessen Bindung mit der Aminogruppe in den ersten Stufen des Stoffwechselwegs des Produkts rasch aufgebrochen wird, der bei der Konzentration, in der die Verbindung der Formeln (I), (II) oder (III) die gewünschte pharmakologische Wirkung entfaltet, keine toxischen Wirkungen oder anderen Wirkungen, die für die Therapie kontraindiziert sind, entfaltet, wobei R¹ die vorstehend definierte Bedeutung hat und R² ein Wasserstoffatom bedeutet.
Eine Gruppe von Verbindungen, die besonders bevorzugt ist, umfaßt die Verbindungen der Formeln (I), (II) oder (III), worin R ein Wasserstoffatom bedeutet, R¹ die vorstehend definierte Bedeutung hat und R² Wasserstoff bedeutet.
Es hat sich gezeigt, daß die Verbindungen der Erfindung eine erhebliche Wirkung auf das Immunsystem ausüben.
Während der letzten 15 Jahre haben G. Goldstein und seine Arbeitsgruppe eingehend die biologische Wirkung und die mögliche pharmakologische Anwendung eines durch Thymus-Epithelzellen sekretierten Polypeptidhormons, d. h. Thymopoietin, untersucht (G. Goldstein, Nature, Bd. 247 (1974), S. 11; D. H. Schlesinger et al., Cell, Bd. 5 (1975), S. 361; T. Audhya et al., Biochemistry, Bd. 20 (1981), S. 6195). Die Primärsequenz dieser Verbindung besteht aus 49 Aminosäuren.
Thymopoietin weist verschiedene Regulationswirkungen auf den Organismus auf und beeinflußt die neuromuskuläre Transmission (G. Goldstein, Lancet, Bd. 2 (1968), S. 119), die Differenzierung der Lymphozyten T und B (M. P. Scheid et al., J. Exp. Med., Bd. 147 (1978), S. 1727) und die Immunantwort (C. Y. Lau et al., J. Immunol., Bd. 125 (1980), S. 1634).
Untersuchungen über Struktur-Aktivitäts-Beziehungen haben gezeigt, daß für die biologische Aktivität nicht die gesamte Sequenz der 49 Aminosäuren von Thymopoietin erforderlich ist, da das Pentapeptid H-Arg-Lys- Asp-Val-Tyr-OH (Thymopentin-TP5), entsprechend der Aminosäuresequenz 32- 36, die vollständige biologische Aktivität des natürlichen Hormons sowohl in vitro als auch in vivo besitzt (G. Goldstein et al., Science, Bd. 204 (1979), S. 1309).
Thymopentin wurde bereits klinisch eingesetzt, und zwar bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoider Arthritis, als Stimulationsmittel für das Abwehrsystem des Organismus, beispielsweise bei der Behandlung von primären Immundefekten, die durch das Fehlen oder die unvollständige Entwicklung der Thymusdrüse mit der sich daraus ergebenden Veränderung der Reifung von T-Lymphozyten hervorgerufen werden, und bei der Behandlung von akuten oder wiederkehrenden Viruserkrankungen oder als Adjuvans bei Impfungen.
Jedoch wird die Sicherstellung der therapeutischen Wirkung durch Probleme erschwert, die sich aus der Bestimmung der wirksamen Dosis ergeben, da die pharmakologische Wirkung sich stark in Abhängigkeit vom Verfahren und der Dauer der Verabreichung ändern kann (T. Audhya et al., Surv. Immunol. Res., 4. Suppl., Bd. 1 (1985), S. 17, und T. Audhya et al., Int. J. Peptide Protein Res., Bd. 22 (1983), S. 568). Über ein Beispiel für eine derartige Beschränkung berichten Bolla et al. in Int. J. Clin. Pharm. Res., Bd. IV (6) (1984), S. 431), wonach die die Bildung von Antikörpern stimulierende Wirkung von TP5, die bei subkutaner Verabreichung gegeben ist, vollständig unterdrückt wird, wenn die gleiche Dosis intravenös verabreicht wird. Eine mögliche Ursache hierfür ist die kurze Halbwertszeit von TP5 im Plasma. Tatsächlich wird TP5 im Plasma rasch (t1/2 = 1,5 min) durch die Wirkung verschiedener Proteasen abgebaut (T. P. Tischio et al., Int. J. Peptide Protein Res., Bd. 14 (1979), S. 479). Intensive Forschungsanstrengungen wurden in den letzten Jahren unternommen, um TP5-Analoge mit einer erhöhten Beständigkeit gegen Proteasen zu erhalten. Beispielsweise wird auf EP-A-135722 und US-4 505 853 verwiesen, die Thymopentin-Analoge betreffen, die durch geeignete Veränderungen einzelner Aminosäuren innerhalb der Peptidsequenz erhalten werden.
Zur Erreichung dieses Ziels wurde ein Thymopentin-Analoges synthetisiert, das eine Retroinversion an der labilsten Bindung in der Peptidkette enthält, d. h. an der Bindung zwischen dem Argininrest und dem Lysinrest (vgl. J. P. Tischio et al., Int. J. Peptide Protein Res., Bd. 14 (1979), S. 479-484 und insbesondere Fig. 4). Die erhaltene Verbindung, bei der in unveränderter oder sogar verbesserter Weise die immunomodulierende Wirkung von Thymopentin erhalten ist, hat sich als wesentlich stabiler gegenüber Peptidasen als die entsprechende Verbindung ohne Retroinversion erwiesen. Insbesondere hat sich beispielsweise gezeigt, daß die Halbwertszeit von Thymopentin in heparinisiertem Humanplasma 1,5 Minuten beträgt, während die analoge Verbindung mit Retroinversion an der Arg- Lys-Bindung unter den gleichen experimentellen Bedingungen eine Halbwertszeit von 22 Minuten aufweist.
Obgleich dies eine erhebliche Verbesserung darstellt, ist es offenkundig, daß die Bereitstellung von anderen Verbindungen mit den pharmakologischen Möglichkeiten von Thymopentin, jedoch mit im Vergleich zu Thymopentin längeren Halbwertszeiten die therapeutische Anwendung von Thymopentin erheblich rationeller gestalten würde.
Nunmehr wurde überraschenderweise festgestellt, daß dann, wenn man auch die Bindung zwischen Valin und Tyrosin neben der Bindung zwischen Arginin und Lysin invertiert, wie es bei den Verbindungen der Formel (I) der Fall ist, ein Produkt erhält, bei dem das immunostimulierende Aktivitätsspektrum von Thymopentin bestehen bleibt, das aber durch einen enzymatischen Abbau praktisch nicht angegriffen werden kann. Außerdem wurde festgestellt, daß durch Invertieren der Bindung zwischen Asparaginsäure und Valin, wie in der Strukturformel (II), oder zwischen Valin und Tyrosin, wie in der Strukturformel (III), anstelle der Bindung zwischen Arginin und Lysin analoge Verbindungen zu Thymopentin erhalten werden, die sich von der letztgenannten Verbindung durch eine längere Halbwertszeit unterscheiden. Insbesondere hat es sich gezeigt, daß das Thymopentin-Analoge, bei dem die beiden Bindungen Arg-Lys und Val-Tyr einer Retroinversion unterzogen worden sind (Verbindung von Beispiel 1), beim Stabilitätstest gegen enzymatische Hydrolyse in heparinisiertem Humanplasma bei paralleler Testdurchführung wie für Thymopentin eine Halbwertszeit von mehr als 6 Stunden aufweist. Beim gleichen Test hat es sich gezeigt, daß die Thymopentin-Analogen mit Retroinversion der Asp-Val-Bindung (Beispiel 2) und der Val-Tyr-Bindung (Beispiel 3) eine Halbwertszeit aufweisen, die etwa das 7-fache bzw. das 2-fache des Werts von Thymopentin beträgt.
Die Verbindungen der Erfindung lassen sich leicht aus den entsprechenden Verbindungen der Formel (Ia), (IIa) und (IIIa) herstellen
worin
R³ R oder eine Schutzgruppe der α-Aminofunktion bedeutet,
PG eine geeignete Schutzgruppe für die Guanidinfunktion bedeutet,
PL eine Schutzgruppe für die Aminofunktion in der Seitenkette bedeutet,
P eine Schutzgruppe für die Carboxylfunktion bedeutet,
PI eine Schutzgruppe für die Hydroxylfunktion von Tyrosin bedeutet und
R¹ die vorstehende Bedeutung hat,
indem man die Schutzgruppen entfernt.
Die Entfernung dieser Schutzgruppen wird gemäß auf diesem Gebiet bekannten Verfahren durchgeführt. Im allgemeinen werden sie bei Verwendung herkömmlicher Schutzgruppen, wie tert.-Butyl oder tert.-Amyl für die Carboxylgruppe und für die Hydroxylgruppe von Tyrosin, tert.-Butoxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl für die Aminogruppe von Lysin und die Benzolsulfonylgruppe für die Guanidinogruppe von Arginin, zweckmäßigerweise durch Acidolyse in einem sauren Medium, z. B. mit in Essigsäure verdünnter Chlorwasserstoffsäure, mit Trifluoressigsäure oder mit Gemischen aus Trifluoressigsäure und Trifluormethansulfonsäure, in Gegenwart geringer prozentualer Anteile an Ethandithiol, Anisol, Thioanisol oder Resorcin, die als "Fänger" zum Abfangen der gebildeten Carbokationen verwendet werden, entfernt.
Am Ende der Reaktion wird das gewünschte Produkt der Formeln (I), (II) oder (III) direkt oder in Form eines Additionssalzes gewonnen und anschließend nach Standardverfahren gereinigt.
Die Homogenität der auf diese Weise erhaltenen Verbindungen wird durch Dünnschichtchromatographie oder HPLC getestet. Ihre Reinheit wird durch Aminosäureanalyse und NMR festgestellt.
Die Ausgangsverbindung der Formel (Ia), in der R³ die Bedeutung R hat, läßt sich durch Behandlung des entsprechenden terminalen Amids der Formel (IV)
mit I,I-Bistrifluoracetoxy-jodbenzol (TIB) erhalten, wobei sich der Behandlung ggf. eine Acylierung der gebildeten endständigen Aminofunktion anschließt. Das Zwischenprodukt der Formel (IV) kann seinerseits durch Kondensation einer Verbindung der Formel (V)
mit einer Verbindung der Formel (VI)
in der PG, PL, P, PI und R¹ die vorstehend definierten Bedeutungen haben, herstellen. Eine derartige Kondensation wird in geeigneter Weise nach beliebigen Verfahren, die aus der Literatur für die Peptidsynthese bekannt sind, durchgeführt. Besonders günstige Ergebnisse in bezug auf Ausbeuten und Reinheitsgrade der Produkte werden durch Verwendung eines Carbodiimids, wie Dicyclohexylcarbodiimid oder Diisopropylcarbodiimid, und 1-Hydroxybenzotriazol erzielt. Insbesondere wird die Umsetzung durchgeführt, indem man einen geringfügigen Überschuß von 1-Hydroxybenzotriazol zu einer Lösung der Säure der Formel (V), die bei niedriger Temperatur gehalten wird, gibt, anschließend das Dicyclohexyl- oder Diisopropylcarbodiimid zusetzt, und sodann den Reaktionspartner der Formel (VI) zugibt.
Für eine derartige Kondensationsreaktion, die zweckmäßigerweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden kann, können standardmäßige aprotische polare organische Lösungsmittel verwendet werden, die zum Lösen der Reaktanten befähigt sind und das Reaktionsverhalten nicht negativ beeinflussen. Lösungsmittel der Wahl sind Dimethylformamid, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, ggf. im Gemisch mit weniger polaren Lösungsmitteln, wie halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Dichlorethan und dergl.
Bei den Schutzgruppen, die bei dieser Synthese zweckmäßigerweise verwendet werden können, handelt es sich um herkömmlicherweise verwendete Schutzgruppen, die aus der technischen Literatur bekannt sind und üblicherweise bei klassischen Peptidsynthesen herangezogen werden. Insbesondere handelt es sich bei PL vorzugsweise um eine tert.-Butoxycarbonylgruppe oder eine Benzyloxycarbonylgruppe, die ggf. einen Nitro- oder Halogensubstituenten aufweisen; bei PG handelt es sich vorzugsweise um eine Benzolsulfonylgruppe, die auf verschiedene Weise substituiert ist, beispielsweise um eine Alkylbenzolsulfonylgruppe, z. B. eine Toluolsulfonylgruppe, oder eine Alkylalkoxybenzolsulfonylgruppe, wie eine 4-Methoxy- 2,3,6-trimethylbenzolsulfonylgruppe; bei P¹ handelt es sich vorzugsweise um eine tert.-Butylgruppe oder eine tert.-Amylgruppe, da sich diese Gruppen als stabil gegen den Einfluß von TIB erwiesen haben; und schließlich kann es sich bei P um beliebige Gruppen handeln, die zum Schutz der endständigen Carboxylfunktion befähigt sind, beispielsweise um eine Alkylgruppe, wie die tert.-Butyl- oder tert.-Amylgruppe, oder eine Arylalkylgruppe, beispielsweise eine Benzylgruppe oder eine substituierte Benzylgruppe. Wenn die Kondensationsreaktion, deren Verlauf leicht durch Dünnschichtchromatographie verfolgt werden kann, beendet ist, wird das auf diese Weise erhaltene Produkt der Formel (IV) durch standardmäßige Verfahrensweisen gewonnen.
Insbesondere wenn gemäß einem bevorzugten Aspekt ein Carbodiimid als "Kupplungsmittel" verwendet wird, bedienen sich derartige Verfahrensweisen der Abtrennung des gebildeten Harnstoffs durch Filtration sowie der Abdampfung des Lösungsmittels, des Waschens des Rückstands oder einer Lösung des Rückstands in einem geeigneten organischen Lösungsmittel mit schwach alkalischen oder mit schwach sauren Lösungen, wobei sich an diese Schritte schließlich die Reinigung des Produkts durch Kristallisation oder Chromatographie anschließt.
Die Umsetzung des auf diese Weise erhaltenen Produkts mit TIB wird gemäß den in der Italienischen Patentanmeldung 25755, A/81 beschriebenen Verfahrensweisen durchgeführt, die die Umsetzung des Amidsubstrats mit einem geringfügigen Überschuß an TIB in Gemischen aus inerten organischen Lösungsmitteln, wie Dimethylformamid, Acetonitril und dergl., mit Wasser beinhalten. Die Umsetzung wird unter Durchleiten eines inerten Gases, typischerweise Stickstoff, durch das Reaktionsgemisch und unter Prüfen des Reaktionsverlaufs durch Dünnschichtchromatographie durchgeführt. Nachdem eine vollständige Umsetzung des Amids zum Amin festgestellt worden ist, wird das organische Lösungsmittel entfernt, und das Produkt läßt sich leicht durch Lyophilisation gewinnen.
Ist eine Verbindung der Formel (I) erwünscht, in der R eine Acylgruppe bedeutet, wird das erhaltene Zwischenprodukt der Formel (Ia), in der R³ Wasserstoff bedeutet, durch Verwendung der aktiven Ester der Säure R-OH, z. B. des p-Nitrophenylesters, 2,4,5-Trichlorphenylesters und dergl., acyliert.
Die Verbindungen der Formeln (IIa) und (IIIa) lassen sich dagegen aus den entsprechenden Verbindungen der Formeln (VII)
in denen P, PI und R¹ die vorstehend definierten Bedeutungen haben, durch aufeinanderfolgende Kondensationsreaktionen gemäß klassischen Verfahrensweisen, die auf dem Gebiet der Peptidsynthesen bekannt sind, mit einem Lysinrest und einem Argininrest, die in geeigneter Weise geschützt sind, herstellen, wodurch man Zwischenprodukte der allgemeinen Formeln (VIII) bzw. (IX) erhält
worin P, PG, PL, PI und R¹ die vorstehend definierten Bedeutungen haben und P" Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die α-Aminofunktion bedeutet, die leicht unter Bedingungen entfernt werden kann, die nicht zur Entfernung der übrigen Schutzgruppen führen. Die Ausgangsverbindungen der Formeln (V) und (VI) lassen sich ihrerseits leicht unter Verwendung von handelsüblichen Verbindungen und von Verbindungen, die für diesen Zweck durch auf dem Gebiet der organischen Synthese und der Peptidsynthese bekannte Verfahrensweisen hergestellt werden, erhalten.
Insbesondere läßt sich das Produkt der Formel (V) in zweckmäßiger Weise gemäß der Europäischen Patentveröffentlichung 282 891 herstellen, während die Produkte der Formel (VI) in geeigneter Weise durch Kondensation eines entsprechend geschützten Dipeptids der Formel (X)
in der P eine Schutzgruppe für die Carboxylfunktion bedeutet und P' eine Schutzgruppe für die Aminofunktion in der α-Position bedeutet, mit einer Verbindung der Formel (XI)
in der R¹ und PI die vorstehend definierten Bedeutungen haben, herstellen, wobei sich an diesen Verfahrensschritt die Entfernung der Schutzgruppe der primären Aminofunktion des Asparaginsäurerestes anschließt.
Die letztgenannte Verbindung läßt sich nach Verfahrensweisen herstellen, die aus der Literatur für die Alkylierung eines Malonesters und für die anschließende Durchführung einer halbseitigen Verseifung dieser Verbindung oder für die halbseitige Alkoholyse einer in entspechender Weise in der 5-Stellung substituierten Meldrum-Säure der Formel (XII)
bekannt sind. Das Zwischenprodukt der Formel (X) wird seinerseits durch Kondensation eines Asparaginsäurerestes, der in geeigneter Weise an der α-Aminofunktion und an der Carboxylfunktion in der Seitenkette geschützt ist, mit Valinamid hergestellt, wonach sich die Umwandlung des als Zwischenprodukt gebildeten Amids durch Behandlung mit TIB zum primären Amin anschließt.
Das Produkt der Formel (VIII) wird dagegen durch Kondensation eines Amids der Formel (XIII)
mit einer Verbindung der Formel (XIV)
hergestellt, wonach sich die Umwandlung der Amidgruppe durch Behandlung mit TIB zu einer primären Aminogruppe anschließt. Die Verbindung der Formel (XIV) läßt sich durch Kondensation einer Meldrum-Säure der Formel (XV), die in der 5-Stellung in geeigneter Weise mit der Seitenkette der Aminosäure Valin substituiert ist
mit einem in geeigneter Weise geschützten Tyrosin der Formel (XVI)
in Gegenwart eines Silanisierungsmittels herstellen.
Ist bei der Herstellung der Verbindungen der Formeln (II) und (III) eine Verbindung erwünscht, in der R eine Acylgruppe bedeutet, kann diese leicht erhalten werden, indem man die Schutzgruppe des entsprechenden Zwischenprodukts (IIa) und (IIIa), worin R³ eine Acylgruppe gemäß der vorstehenden Definition für R bedeutet, die ihrerseits durch Acylieren des entsprechenden Zwischenprodukts (IIa) und (IIIa), worin R³ Wasserstoff bedeutet, erhalten worden ist, entfernt.
Demgemäß bestehen weitere Erfindungsgegenstände in einem Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen sowie in den neuen Zwischenprodukten der Formeln (Ia), (IIa), (IIIa), (IV), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X) und (XIV), die bei einem derartigen Verfahren anfallen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in verschiedenen isomeren Formen vorliegen.
In den Strukturformeln (I), (II) und (III) sind mindestens fünf asymmetrische Kohlenstoffatome enthalten. Dabei ist jedoch die absolute Konfiguration der übrigen Aminosäuren, die nicht an der Retroinversion beteiligt sind, die L-Konfiguration (eine derartige bereits vorher gegebene Konfiguration wird in einfacher Weise erreicht, indem man bei der Synthese die entsprechenden L-Aminosäurederivate verwendet). Die absolute Konfiguration der gem-Diaminokohlenstoffatome ist ebenfalls gegeben, da die gem-Diaminoprodukte aus den entsprechenden D-Aminosäureamiden erhalten werden, während die Kohlenstoffatome der Malonylreste die R- oder S- Konfiguration aufweisen können. Demgemäß werden die Verbindungen der Erfindung als Gemische von Diastereoisomeren (insbesondere vier für die Verbindungen der Formel (I), und jeweils zwei für die Verbindungen der Formeln (II) und (III)) erhalten, wobei die Gemische ggf. nach bekannten Trennverfahren zu den einzelnen Isomeren aufgetrennt werden können.
Die Verbindungen der Formeln (I), (II) und (III) können sowohl in ihrer optisch aktiven Form als auch in Form von Isomerengemischen verwendet werden.
Die Verbindungen der Erfindung erwiesen sich im Vergleich zu Thymopentin als stabiler gegenüber der Wirkung von Plasmapeptidasen.
Insbesondere wurde die Labilität von
[gArg¹, (R,S)mLys²,gVal&sup4;, (R,S)mTyr&sup5;]TP5,
[gAsp³, (R,S)mVal&sup4;]TP5 und [gVal&sup4;, (R,S)mTyr&sup5;]TP5,
gegenüber enzymatischer Hydrolyse in einem parallelen Test mit TP5 untersucht, wobei heparinisiertes Humanplasma verwendet wurde und die Peptide getrennt in einer Konzentration von etwa 30 nmol/ml Plasma inkubiert wurden. Die Inkubation wurde bei 37ºC durchgeführt. Die aus den Plasmagemischen entnommenen Proben, jeweils 100 ul, wurden zu verschiedenen Zeitpunkten durch Zugabe von Trifluoressigsäure in einem Anteil von 10% gestoppt, wonach sich eine 5-minütige Zentrifugation bei 10 000 g anschloß. Ein Teil des Überstands wurde der Chromatographie unter Bedingungen unterworfen, die geeignet sind, Änderungen der Konzentration des zu testenden Peptids zu verschiedenen Zeitpunkten nachzuweisen. Die Halbwertszeit, d. h. die bei 37ºC zum Abbau von 50% des getesteten Peptids erforderliche Inkubationszeit wurde aus der auf diese Weise erhaltenen enzymatischen Kinetik berechnet. Diese Halbwertszeiten sind in nachstehender Tabelle I aufgeführt. Tabelle I Stabilität gegenüber enzymatischer Hydrolyse in Humanplasma (t/2 in min)
Die höhere Stabilität der retroinversen Analogen im Vergleich zu TP5 wurde auch durch Verwendung von isolierten Enzymen (Leucinaminopeptidase und Carboxypeptidase) nachgewiesen.
Die immunostimulierende Aktivität der neuen Analogen wurde in vivo im Vergleich mit der Aktivität von TP5 getestet.
Insbesondere wurde der sog. "Hämolyse-Plattentest" gemäß dem von Jerne und Nordin beschriebenen Verfahren angewandt (PFC).
Dieser Test wird durchgeführt, indem man auf intravenösem Wege männlichen Inzuchtmäusen C3H/HeNCrlBr (Calco-Italia) im Alter von 10-12 Wochen mit einem Körpergewicht von etwa 25 g eine pyrogenfreie Kochsalzlösung (0,2 ml) mit einem Gehalt an 1-2 x 10&sup8; Schaferythrozyten (SRBC) verabreicht. Nach 2 Stunden werden Gruppen von jeweils 3 Mäusen auf oralem Wege (Magenintubation) mit 0,2 ml Kochsalzlösung (Kontrolle) oder mit 0,2 ml Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 100 ng des zu testenden Peptids behandelt. Nach 4 Tagen werden die Mäuse getötet. Die Milz wird entnommen und mechanisch zur Abtrennung der Lymphozyten aufgebrochen. Die auf diese Weise isolierten Lymphozyten werden mit Eagle-Minimalmedium (MEM) (3 x 15 ml) gewaschen und sodann im gleichen Medium (1 ml) in einer Endkonzentration von 150 000 Zellen suspendiert. Die einzelnen Zellsuspensionen (0,1 ml) werden sodann mit MEM-Medium auf 1/100 verdünnt. 100 ul der einzelnen Verdünnungen werden in Doppelbestimmung in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit einem Gehalt an jeweils 25 ul MEM-Medium, 25 ul 10% Lösung von SRBC-Antigenen und 25 ul Meerschweinchen-Komplement in einer Endverdünnung von 1/64 gegeben. Die gesamte Suspension wird sofort mittels Kapillarwirkung aus den einzelnen Vertiefungen in übereinandergelegte Glas- Objektträger übertragen. Die Objektträger werden an ihren Kanten mit Paraffin verschlossen und sodann 1 Stunde bei 37ºC in einer thermostatisierten Kammer inkubiert.
Danach werden die Direkthämolyseplatten mittels eines Lichtkontrast- Sichtgeräts ausgezählt, wobei für die Platten die Anzahl der Lymphozyten, die Antikörper sekretieren, festgestellt wird (PFC). Die auf diese Weise nachgewiesenen Antikörper gehören zur IgM-Klasse, die für die primäre Antikörperreaktion verantwortlich sind. Die Ergebnisse, die als prozentualer Wert in bezug zur Kontrollprobe angegeben sind, sind in nachstehender Tabelle II aufgeführt. Tabelle II Verbindung Plattenbildung % Kontrolle
In der Tabelle II sowie in der gesamten übrigen Beschreibung bedeuten "r.i." eine "retroinverse" Anordnung;
"(3,4)r.i.-TP5" demgemäß das Analoge von TP5 mit Retroinversion an der Peptidbindung 3-4 und
"(1,2-4,5)r.i.-TP5" das Thymopentin-Analoge mit Retroinversion sowohl an der 1-2-Bindung als auch an der 4-5-Bindung.
Aufgrund ihrer biologischen Merkmale treten die erfindungsgemäßen Peptide mit der Immunantwort des Körpers in Wechselwirkung, wobei sie diese Immunantwort in wesentlichem Umfang stimulieren, falls diese unzureichend ist. Demgemäß erweisen sich die Verbindungen der Erfindung als therapeutisch wertvoll bei der Behandlung einer Gruppe von pathologischen Zuständen, die mit einem Immundefizit verbunden sind. Beispielsweise gehören zu diesen Zuständen das DiGeorge-Syndrom, das durch das angeborene Fehlen der Thymusdrüse charakterisiert ist, oder virale Infektionen, Pilz- oder Mycoplasmainfektionen sowie chronische oder langdauernde Infektionen.
Demgemäß besteht ein weiterer Gegenstand der Erfindung in pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einem Gehalt an einer therapeutisch wirksamen Menge an einer oder mehreren Verbindungen der Formeln (I), (II) und (III). Für die therapeutische Anwendung als immunostimulierende oder immunomodulierende Mittel können die Verbindungen der Erfindung in zweckmäßiger Weise parenteral, oral oder sublingual verabreicht werden.
Die die neuen Verbindungen enthaltenden Zubereitungen lassen sich nach standardmäßigen Verfahren herstellen, indem man den Wirkstoff mit einem inerten Träger und ggf. mit anderen standardmäßigen Additiven, die in geeigneter Weise ausgewählt werden, vereinigt.
Für die orale oder sublinguale Anwendung können die Verbindungen der Erfindung in Form von Tabletten, Kapseln, Tropfen, Elixieren und dergl. verabreicht werden, die unter Verwendung von herkömmlichen Trägern/Vehikeln, wie Stärke, Zucker, Wasser, Alkohol und dergl. hergestellt werden und ggf. Geschmacksstoffe, Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Gleitmittel und dergl. enthalten. Für die parenterale Anwendung stellt steriles Wasser für Injektionszwecke den Träger der Wahl dar. Additive können entsprechend dem Stand der Technik zugesetzt werden. Die therapeutisch wirksame Tagesdosis verändert sich je nach der zu behandelnden Person (Gewicht, Alter und Zustand), sowie gemäß dem Verabreichungsweg. Im allgemeinen sind die Verbindungen der Erfindung jedoch wirksam, wenn sie in einer Tagesdosis zwischen 2 und 200 ng/kg verabreicht werden. Demgemäß enthalten die pharmazeutischen Zubereitungen der Erfindung die Verbindungen der Formel (I), (II) oder (III) in Mengen, die zur Gewährleistung einer richtigen Tagesdosis im Rahmen des vorstehend angegebenen Bereichs geeignet sind.
Die nachstehenden Beispiele dienen zur ausführlichen Erläuterung einiger Verbindungen, die für die Erfindung repräsentativ sind, sowie für das Verfahren zu ihrer Herstellung.

Beispiel 1

[gArg¹, (R,S)mLys²,gVal&sup4;, (R,S)mTyr&sup5;]TP5

1) Z-Asp(OBut)-Val-NH&sub2;

Eine Lösung von Z-Asp(OBut)OH (6,83 g, 20 mmol) in Tetrahydrofuran (THF, 40 ml) mit einem Gehalt an N-Methylmorpholin (NMM, 2,2 ml, 20 mmol), die auf -18ºC gekühlt und unter einem Stickstoffmantel gehalten wird, wird mit Isobutylchlorformiat (iBCF) in kleinen Portionen (2,76 ml, 21 mmol) versetzt, wobei die Temperatur unter -15ºC gehalten wird.
Sodann wird eine Lösung von H-Val-NH&sub2; HCl (3,36 g, 22 mmol) in 10 ml THF mit einem Gehalt an NMM (2,4 ml, 22 mmol) zugegeben. Man läßt die Temperatur auf Raumtemperatur steigen. Sodann wird das Reaktionsgemisch mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung mit einer Konzentration von 5% (Gew.- /Vol.) (50 ml) behandelt, wodurch man einen Niederschlag erhält, der abfiltriert und mit der gleichen Lösung (2 x 30 ml), mit H&sub2;O (3 x 30 ml), mit 0,1 N HCl (3 x 30 ml) und erneut mit H&sub2;O (3 x 30 ml) gewaschen wird. Sodann wird der Niederschlag in einem Trockenschrank getrocknet. Man erhält 3,8 g Produkt (Ausbeute 45%) mit einem Schmelzpunkt von 193-194ºC. Die Struktur dieser Verbindung wird durch ¹H-NMR-Analyse bestätigt.
Die chromatographische Analyse zeigt keinerlei Spuren von Verunreinigungen.
Dünnschichtchromatographie (Chloroform/Methanol/Essigsäure, 85/10/5) (CMA) Rf = 0,7.
HPLC-Säule: Hibar, Lichrosorb RP-18 (10 u)
Elutionsmittel: Gradient von 0 bis 40% der Lösung B in A in den ersten 20 Minuten, von 40 bis 80% von B in A in den anschließenden 10 Minuten und sodann konstant mit einem Wert von 80% von B für weitere 5 Minuten (B = 0,1% TFA in CH&sub3;CN; A = 0,1% TFA in CH&sub3;CN bei 10% in H&sub2;O).
Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min
Nachweis: UV bei 230 nm
Einzelpeak bei TR = 22,85'

2) Z-Asp(OBut)-gVal-H CF&sub3;COOH

Eine Lösung von [Bis(trifluoracetoxy)-jod]benzol (TIB) (3 g, 6,98 mmol) in CH&sub3;CN (15 ml) wird in kleinen Portionen zu einer Suspension der in Stufe 1) erhaltenen Verbindung (2,94 g, 6,98 mmol) in einem 2/1- H&sub2;O/CH&sub3;CN-Gemisch (45 ml), das gerührt und unter einem Stickstoffmantel gehalten wird, gegeben. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand aus Diethylether (Et&sub2;O) kristallisiert. Man erhält ein weißes kristallines Produkt (3,11 g, Ausbeute 85%) mit einem Schmelzpunkt von 104-105ºC. Die ¹H-NMR-Analyse bestätigt die angegebene Struktur. Die HPLC-Analyse gemäß der vorstehenden Stufe ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 20,12'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,5.

3) HO-mTyr(But)OBut

tert.-Butylalkohol (tBuOH) (566 ul, 6 mmol) wird zu einer Lösung von 2,2-Dimethyl-5-(p-tert.-butoxy)-benzyl-1,3-dioxan-4,6-dion [(M)Tyr(But)] (918 mg, 3 mmol) (hergestellt gemäß dem Verfahren der gleichzeitig anhängigen Italienischen Patentanmeldung 23098/A/88) in Toluol (2,4 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf 70ºC erwärmt und 18 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Sodann wird das Gemisch zur Trockne eingedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird mit Ethylacetat (AcOEt) (30 ml) aufgenommen. Die organische Phase wird mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung in einer Konzentration von 5% (3 x 20 ml), sodann mit einer Citronensäurelösung vom pH-Wert 4,5 (2 x 20 ml) und schließlich bis zur neutralen Reaktion mit H&sub2;O (2 x 20 ml) gewaschen. Das Gemisch wird über MgSO&sub4; getrocknet. Sodann wird das Lösungsmittel entfernt. Man erhält ein öliges Produkt von leicht gelber Färbung (630 mg, Ausbeute 65%), dessen Struktur durch Massenspektroskopie und ¹H-NMR bestätigt wird.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 27,79' (UV-Nachweis bei 254 nm).
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,59.

4) Z-Asp(OBut)-gVal-(R,S)mTyr(But)OBut

Eine Lösung von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) (301 mg, 2,1 mmol) in N,N-Dimethylformamid (DMF) (2 ml) und eine Lösung von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (397 mg, 1,925 mmol) in DMF (3 ml) wird zu einer Lösung der Verbindung der vorhergehenden Stufe (620 mg, 1,92 mmol) in DMF (5 ml), die auf 0ºC gekühlt und unter einem Stickstoffmantel gerührt wird, gegeben. Nach 60 Minuten wird das Eisbad entfernt, und der Rührvorgang wird weitere 60 Minuten fortgesetzt. Sodann wird eine Lösung der in Stufe 2) erhaltenen Verbindung (888 mg, 1,75 mmol) in DMF (5 ml) mit einem Gehalt an Triethylamin (TEA) (246 ul, 1,75 mmol) zugegeben.
Nach 20-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird der gebildete N,N'- Dicyclohexylharnstoff (DCU) abfiltriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit 70 ml AcOEt aufgenommen und sodann mit einer 5% wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung (50 ml) 20 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Sodann wird die organische Phase abgetrennt, mit der gleichen Lösung (2 x 50 ml), anschließend mit einer wäßrigen gesättigten NaCl-Lösung (3 x 50 ml), mit einer Lösung von 0,1 N HCl (3 x 50 ml) und schließlich wieder mit einer wäßrigen gesättigten NaCl-Lösung (3 x 50 ml) gewaschen.
Hierauf wird die organische Phase über MgSO&sub4; getrocknet und sodann zur Trockne eingedampft. Es verbleibt ein leicht gelb gefärbter Feststoff (690 mg, Ausbeute 51%).
Die Massenspektroskopie und die ¹H-NMR-Analyse bestätigen die angegebene Struktur.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) ergibt einen Doppelpeak, der durch das Paar von Diastereoisomeren hervorgerufen wird, mit TR-Werten von 32,35' und 32,53'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,37.

5) H-Asp(OBut)-gVal-(R,S)mTyr(But)OBut

Eine Lösung der in der vorstehenden Stufe erhaltenen Verbindung (690 mg, 0,89 mmol) in einem 1/1-Gemisch von CH&sub3;OH/CH&sub3;CN (50 ml) wird eine Lösung von Ammoniumformiat (112 mg, 1,78 mmol) in 6/1-CH&sub3;OH/H&sub2;O (3,5 ml) und in kleinen Portionen Palladium-auf-Aktivkohle (Pd/C) mit einem Gehalt an 10 Gew.-% (350 mg) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird sodann bei Raumtemperatur belassen und 30 Minuten unter einem Stickstoffmantel gerührt. Sodann wird es über Celite filtriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit H&sub2;O (70 ml) aufgenommen und durch Zugabe einer wäßrigen 5% Na&sub2;CO&sub3;-Lösung auf den pH-Wert 9 gebracht. Die wäßrige Phase wird sodann mit AcOEt (3 x 70 ml) extrahiert. Die organischen Phasen werden über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Man erhält 500 mg des gewünschten Produkts in quantitativer Ausbeute.
Die chromatographische Analyse ergibt keine Anzeichen für Spuren an Verunreinigungen.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 27,59'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,31.

6) Fmoc-D-Arg(Mtr)-NH&sub2;

Eine Lösung des Ammoniumsalzes von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt NH&sub3;) (3,0 g, 16,45 mmol) in 10 ml DMF und eine Lösung von DCC (3,38 g, 16,45 mmol) in DMF (10 ml) wird zu einer Lösung von Fmoc-D-Arg(Mtr)-OH (10 g, 16,45 mmol) in DMF (50 ml), die auf 0ºC gekühlt und unter Rühren bei dieser Temperatur gehalten wird, gegeben. Nach etwa 1 Stunde läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur steigen und setzt den Rührvorgang eine weitere Stunde fort.
Sodann wird der gebildete DCU abfiltriert, und das Lösungsmittel wird abgedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird mit 70 ml AcOEt aufgenommen und sodann zunächst mit einer 5% wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung (3 x 50 ml) und anschließend mit einer wäßrigen gesättigten NaCl-Lösung (3 x 50 ml) gewaschen. Die organische Lösung wird über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der erhaltene feste Rückstand wird mit Et&sub2;O (100 ml) verrieben. Man erhält ein farbloses Pulver (9,2 g, Ausbeute 93%).
Schmelzpunkt 168-172ºC.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 26,19'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,44.

7) H-D-Arg(Mtr)-NH&sub2; HCl

Eine Suspension der in der vorstehenden Stufe erhaltenen Verbindung (9 g, 15,5 mmol) in einem 80/20-Gemisch von DMF/Diethylamin (100 ml) wird 1 Stunde gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel durch Abdampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird mit AcOEt (100 ml) aufgenommen. Die organische Lösung wird mit einer wäßrigen 0,1 N HCl-Lösung (3 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden mit AcOEt (50 ml) gewaschen und mehrmals lyophilisiert. Man erhält ein flockiges Produkt (4,5 g, Ausbeute 80%).
Das Produkt weist keinen exakten Schmelzpunkt auf.
Die ¹H-NMR-Analyse bestätigt die angegebene Struktur.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 12,69'.
Dünnschichtchromatographie (Butanol/H&sub2;O/Essigsäure = 4/1/1 (BWA)) Rf = 0,36.

8) HO-(R,S)mLys(Boc)-OEt

Die Titelverbindung wird ausgehend von N-tert.-Butoxycarbonyl-4- chlorbutylamin und Diethylmalonat im wesentlichen gemäß dem Verfahren von EP-A-253 190, Beispiel 1, Stufe c) hergestellt.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 19,58'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,58.

9) H&sub2;N-D-Arg(Mtr)-(R,S)mLys(Boc)-OEt

Eine Lösung von HOBt (0,76 g, 6,3 mmol) in DMF (10 ml) und eine Lösung von DCC (1 g, 4,85 mmol) in 5 ml DMF wird mit einer Lösung der Verbindung der vorhergehenden Stufe 1,47 g, 4,85 mmol) in 15 ml DMF, die auf 0ºC gekühlt und unter einem Stickstoffmantel gerührt wird, gegeben. Nach 1 Stunde läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur steigen. Der Rührvorgang wird eine weitere Stunde fortgesetzt. Sodann wird eine Lösung der in Stufe 7) erhaltenen Verbindung (1,86 g, 4,4 mmol) in DMF (15 ml) mit einem Gehalt an TEA (0,612 ml, 4,4 mmol) zugesetzt. Man läßt das Reaktionsgemisch 20 Stunden bei Raumtemperatur rühren, setzt sodann überschüssiges DCC zu (0,2 g, 0,97 mmol) und setzt den Rührvorgang weitere 4 Stunden fort. Anschließend wird der gebildete DCU abfiltriert, das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft, und der Rückstand wird mit THF (20 ml) aufgenommen. Das Gemisch wird auf -15ºC gekühlt und über Nacht bei dieser Temperatur belassen. Sodann wird es erneut filtriert, und das THF wird aus dem Filtrat abgedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit AcOEt (70 ml) aufgenommen. Die organische Lösung wird nacheinander mit 5% NaHCO&sub3;-Lösung (3 x 50 ml), mit einer wäßrigen gesättigten NaCl-Lösung (3 x 50 ml), einer wäßrigen 0,1 N HCl-Lösung (3 x 50 ml) und schließlich erneut mit gesättigter NaCl-Lösung (3 x 50 ml) gewaschen. Die gewaschene organische Phase wird sodann über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Hexan verrieben. Man erhält ein weißes, fein verteiltes Pulver (2,26 g, Ausbeute 76%).
Schmelzpunkt 148-149ºC.
Die ¹H-NMR- und Massenspektroskopie-Analysen bestätigen die angegebene Struktur.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 23,38'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,4.

10) H&sub2;N-D-Arg(Mtr)-(R,S)mLys(Boc)-OH

Eine Lösung von KOH (0,204 g, 3,63 mmol) in absolutem Ethylalkohol (EtOH) (5 ml) wird tropfenweise innerhalb von 90 Minuten zu einer Lösung der Verbindung der Stufe 9) (2,21 g, 3,3 mmol) in 20 ml absolutem EtOH, die auf 0ºC gekühlt und unter Stickstoff gehalten wird, gegeben.
Nach 16 Stunden wird das Reaktionsgemisch mit 50 ml H&sub2;O verdünnt, sodann auf ein geringes Volumen gebracht und mit Et&sub2;O (3 x 50 ml) extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit 0,1 N HCl bis zum pH-Wert 3 angesäuert und sodann erneut mit AcOEt (3 x 50 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft. Man erhält einen öligen Rückstand (1,97 g, Ausbeute 93%), dessen Struktur durch ¹H-NMR- und Massenspektroskopie-Analysen bestätigt wird. Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) ergibt einen Doppelpeak aufgrund des Paars von Diastereoisomeren mit TR-Werten von 20,02' bzw. 20,52'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,13 und 0,19.

11) H&sub2;N-D-Arg(Mtr)-(R,S)mLys(Boc)-Asp(OBut)-gVal-(R,S)mTyr(But)OBut

Eine Lösung von HOBt (157 mg, 1,1 mmol) in DMF (2 ml) und eine Lösung von DCC (206 mg, 1 mmol) in DMF (1,8 ml) wird zu einer Lösung der in der vorstehenden Stufe erhaltenen Verbindung (643 mg, 1 mmol) in DMF (3,2 ml), die vorher auf 0ºC gekühlt worden ist und unter einem Stickstoffmantel gehalten wird, gegeben. Nach 1 Stunde läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur steigen. Die Lösung wird 1 weitere Stunde gerührt. Sodann wird eine Lösung der in Stufe 5 erhaltenen Verbindung (500 mg, 0,89 mmol) in DMF (10 ml) zugesetzt. Nach 20-stündigem Rühren wird der gebildete DCU abfiltriert, und das Lösungsmittel wird abgedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit THF (15 ml) aufgenommen, sodann über Nacht auf -15ºC abgekühlt und erneut filtriert. Nach Entfernen des THF wird der Rückstand mit AcOEt (150 ml) aufgenommen und sodann mit einer 5% wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung (50 ml) 20 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Sodann wird die organische Phase abgetrennt und mit der gleichen Lösung (2 x 50 ml), anschließend mit einer wäßrigen gesättigten NaCl-Lösung (3 x 50 ml), mit einer 0,1 N HCl-Lösung (3 x 50 ml) und schließlich mit H&sub2;O (3 x 50 ml) gewaschen.
Die organische Phase wird anschließend über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der verbleibende Rückstand wird mit Et&sub2;O verrieben. Man erhält ein grauweißes Pulver mit einem Schmelzpunkt von 171-174ºC (574 mg, Ausbeute 54%).
Die ¹H-NMR- und Massenspektroskopie-Analysen bestätigen die angegebene Struktur.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 31,36'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,54.

12) TFA H-gArg(Mtr)-(R,S)mLys(Boc)-Asp(OBut)-gVal-(R,B)mTyr(But)OBut

Die in der vorstehenden Stufe erhaltene Verbindung (574 mg, 0,48 mmol) wird in einem Gemisch mit einem Gehalt an CH&sub3;CN (3 ml), DMF (1 ml) und H&sub2;O (2,5 ml), das bei Raumtemperatur unter einem Stickstoffmantel gehalten wird, gelöst. Sodann wird eine Lösung von TIB (245 mg, 0,57 mmol) in CH&sub3;CN (1 ml) zugesetzt. Nach 3 Stunden wird eine weitere Portion von TIB, die 20% entspricht (49 mg, 0,11 mmol), zugegeben. Die Lösung wird weitere 2 Stunden gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit CH&sub3;OH (20 ml) aufgenommen und erneut mehrfach zur Trockne eingedampft. Der Rückstand enthält die gewünschte Verbindung in einer Reinheit von mehr als 85% (bestimmt durch HPLC unter den Bedingungen von Stufe 1)), wobei sich ein Doppelpeak mit TR-Werten von 31,78' und 31,99' ergibt.
Das erhaltene Produkt wird ohne weitere Reinigung bei der nachstehenden Deblockierungsstufe verwendet.

13) CH&sub3;COOH H-gArg-(R,S)mLys-Asp-gVal-(R,S)mTyr-OH

Etwa 400 mg des in der vorstehenden Stufe erhaltenen Produkts (etwa 0,25 mmol) werden 20 Minuten bei Raumtemperatur und unter einem Stickstoffmantel mit einem frisch hergestellten Gemisch mit einem Gehalt an Trifluoressigsäure, Trifluormethansulfonsäure und 1,2-Ethandithiol (TFA/TFMSA/EDT, 89/1/10) (20 ml) behandelt. Nach 20 Minuten wird das Reaktionsgemisch auf 0ºC gekühlt und tropfenweise mit TEA (0,3 ml, 1,44 mmol) versetzt. Sodann wird die Lösung unter einem Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit H&sub2;O (70 ml) aufgenommen. Die wäßrige Lösung wird mit Et&sub2;O (50 ml) extrahiert. Die Ethyletherphase wird mit H&sub2;O (30 ml) gewaschen. Die beiden wäßrigen Phasen werden vereinigt und mit Et&sub2;O (3 x 50 ml) gewaschen. Sodann wird das Wasser unter vermindertem Druck abgedampft. Der ölige Rückstand wird der Ionenaustauschchromatographie an einer mit CM-Sephadex C-25 (2 g) gepackten Säule (15 x 0,9 cm) unterworfen und mit einem linearen Ammoniumacetatgradienten vom pH- Wert 5 von 0,1 bis 0,6 M 8 Stunden bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,8 ml/min eluiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, auf ein geringes Volumen eingeengt und sodann mehrfach lyophilisiert.
Man erhält 74 mg Produkt (Ausbeute 40%).
Die Massenspektroskopie- und ¹H-NMR-Analysen bestätigen die Struktur des Produkts, während die HPLC-Analyse unter den Standardbedingungen von Stufe 1) die Reinheit des Produkts bestätigen, da sich nur zwei Peaks ergeben, die auf das Paar von Diastereoisomeren zurückgehen. Die TR-Werte betragen 8,65' bzw. 9,44'.

Beispiel 2

[gAsp³, (R,S)mVal&sup4;]TP5

1) 2,2-Dimethyl-5-isopropyl-1,3-dioxan-4,6-dion[(M)Val]

Eine Lösung von 2,2-Dimethyl-1,3-dioxan-4,6-dion (Meldrum-Säure) (14,4 g, 100 mmol) in Aceton (50 ml) mit einem Gehalt an Pyridin (0,5 ml, 5 mmol) und Eisessig (0,3 ml, 5 mmol) wird 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann zur Trockne eingedampft. Der mit CH&sub3;OH (150 ml) aufgenommene Rückstand wird mit NaBH&sub4; (4,16 g, 110 mmol) versetzt. Nach 15 Minuten wird das CH&sub3;OH-Volumen unter etwa 50 ml verringert. Sodann wird H&sub2; (50 ml) zugegeben. Die Lösung wird durch Zugabe von 3 N HCl auf den pH- Wert 3 gebracht. Der erhaltene weiße Niederschlag wird abfiltriert und in einem Trockenschrank getrocknet (11,6 g, Ausbeute 63%).
Schmelzpunkt 98-99ºC
Die ¹H-NMR-Analyse bestätigt die angegebene Struktur. Die chromatographische Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) von Beispiel 1 ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 18,27'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,34

2) Fmoc-D-Asp(Obut)NH&sub2;

HOBt NH&sub3; (3,21 g, 20 mmol) und eine Lösung von DCC (4,13 g, 20 mmol) in DMF werden zu einer Lösung von Fmoc-D-Asp(OBut)OH (8,23 g, 20 mmol) in DMF (60 ml) gegeben, auf 0ºC gekühlt und unter einem Stickstoffmantel gerührt. Nach etwa 60 Minuten wird das Eisbad entfernt, und die Lösung wird weitere 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der gebildete DCU wird abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Das rohe Reaktionsprodukt wird in AcOEt (150 ml) aufgenommen, mit 5% wäßriger NaHCO&sub3;-Lösung (3 x 100 ml) und sodann mit gesättigter NaCl-Lösung (3 x 50 ml) extrahiert. Die organische Phase wird über MgSO&sub4; getrocknet und sodann zur Trockne eingedampft. Die erhaltene weiße gelatinöse Masse wird mit H&sub2;O verrieben und in einem Trockenschrank getrocknet (7,8 g, Ausbeute 95%).
Schmelzpunkt 134-136ºC.
Die ¹H-NMR-Analyse bestätigt die angegebene Struktur. Die chromatographische Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) von Beispiel 1 ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 27,03'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,62

3) H-D-Asp(OBut)NH&sub2;

Das in der vorstehenden Stufe erhaltene Produkt (7,5 g, 18 mmol) wird 60 Minuten bei Raumtemperatur und unter einem Stickstoffmantel mit einem 80/20-Gemisch von DMF-Diethylamin (100 ml) behandelt. Nach 1 Stunde wird das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit AcOEt (100 ml) aufgenommen und mit 0,1 N HCl (3 x 70 ml) extrahiert. Die wäßrigen Phasen werden vereinigt und auf ein Volumen von etwa 100 ml eingeengt und sodann mit 10% wäßriger Na&sub2;CO&sub3;-Lösung auf den pH-Wert 9 eingestellt und erneut mit AcOEt (4 x 50 ml) extrahiert.
Die organischen Phasen werden vereinigt, über MgSO&sub4; getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Es verbleibt ein öliger Rückstand, der durch Flash-Chromatographie über Siliciumdioxid unter Elution mit AcOEt und anschließend mit CH&sub3;OH gereinigt wird. Man erhält 1,45 g eines gelbstichigen Öls (Ausbeute 44%).
Die Massenspektroskopie- und die ¹H-NMR-Analyse bestätigen die angegebene Struktur.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) von Beispiel 1 ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 6,52'
Dünnschichtchromatographie (BWA) Rf = 0,48.

4) H-Tyr(But)OBut

Eine Lösung von Z-Tyr(But)OBut (hergestellt gemäß dem in "New Aspects in Physiological Antitumor Substances", Karger Basel (1985), S. 33 beschriebenen Verfahren) (6,92 g, 16 mmol) in CH&sub3;OH (60 ml) wird mit einer Lösung von Ammoniumformiat (2,52 g, 40 mmol) in CH&sub3;OH (40 ml) und 10% Pd/C (3,5 g) versetzt. Die erhaltene Suspension wird 30 Minuten bei Raumtemperatur unter einem Stickstoffmantel gerührt. Sodann wird sie durch Celite filtriert. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird mit einer 10% wäßrigen Na&sub2;CO&sub3;- Lösung (50 ml) aufgenommen und mit AcOEt (4 x 50 ml) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Abdampfen unter vermindertem Druck entfernt. Man erhält 3,6 g eines farblosen öligen Produkts (Ausbeute 77%).
Die ¹H-NMR-Analyse bestätigt die angegebene Struktur. Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) von Beispiel 1 ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 20,90'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,44

5) HO-(R,S)mVal-Tyr(But)OBut

Eine Lösung von H-Tyr(But)OBut (1,467 g, 5 mmol) in THF (25 ml) wird nacheinander mit (m)Val (1,012 g, 5,5 mmol), N,O-Bis-(trimethylsilyl)acetamid (BSA) (2,45 ml, 10 mmol) und Trimethylsilylchlorid (TMSC) (0,634 ml, 5 mmol) versetzt.
Die Umsetzung wird 20 Stunden bei Raumtemperatur unter einem Stickstoffmantel durchgeführt. Sodann wird H&sub2;O (50 ml) zugesetzt, und der pH- Wert wird mit Citronensäure auf 4 eingestellt. Anschließend wird die Lösung mit Methylenchlorid (3 x 50 ml) extrahiert. Die organischen Phasen werden gewonnen, mit Wasser (50 ml) gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 2,02 g eines farblosen Öls (Ausbeute 96%).
Die Massenspektroskopie- und die ¹H-NMR-Analyse bestätigen die angegebene Struktur.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) von Beispiel 1 ergibt einen einzelnen Peak mit einem TR-Wert von 27,80'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,6.

6) H&sub2;N-D-Asp(OBut)-(R,S)mVal-Tyr(But)OBut

Eine Lösung von HOBt (0,567 g, 3,96 mmol) in DMF (3 ml) und eine Lösung von DCC (0,73 g, 3,53 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) werden zu einer Lösung des in Stufe 5) erhaltenen Produkts (1,49 g, 3,53 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml), die auf 0ºC gekühlt und unter einem Stickstoffmantel gerührt wird, gegeben. Nach 60 Minuten wird das Eisbad entfernt. Die Lösung wird weitere 60 Minuten gerührt. Sodann wird eine Lösung von H-D-Asp(OBut)NH&sub2; (das D-Asparaginsäureamid, dessen Carboxylgruppe in der Kette in Form des tert.-Butylesters geschützt ist) (0,62 g, 3,3 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (7 ml) zugegeben. Die Umsetzung wird 20 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Der gebildete DCU wird abfiltriert, und das Lösungsmittel wird durch Abdampfen unter vermindertem Druck entfernt. Das rohe Reaktionsprodukt wird mit THF (30 ml) aufgenommen. Anschließend wird das Gemisch 2 Stunden auf -15ºC gekühlt. Der DCU-Niederschlag wird abfiltriert, das Lösungsmittel wird durch Abdampfen unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wird mit AcOEt (75 ml) aufgenommen. Sodann wird die Lösung mit einer 5% wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung (3 x 50 ml) mit gesättigter NaCl-Lösung (3 x 50 ml), mit 0,1 N HCl (3 x 50 ml) und schließlich mit H&sub2;O (3 x 50 ml) gewaschen. Die organische Phase wird über MgSO&sub4; getrocknet, das Lösungsmittel wird abgedampft, und der Rückstand wird mit n-Hexan (50 ml) verrieben. Man erhält einen weißen Feststoff (1,28 g, Ausbeute 65%) mit einem Schmelzpunkt von 113-115ºC. Die Massenspektroskopie- und ¹H-NMR- Analysen bestätigen die angegebene Struktur.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) von Beispiel 1 ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 29,21'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,62.

7) TFA H-gAsp(OBut)-(R,S)mVal-Tyr(But)OBut

Eine Lösung von TIB (0,807 g, 1,88 mmol) in CH&sub3;CN (5 ml) wird in kleinen Portionen zu einer Lösung der in der vorstehenden Stufe erhaltenen Verbindung (1,01 g, 1,706 mmol) in einem 2/1-Gemisch von CH&sub3;CN/H&sub2;O (15 ml), die unter einem Stickstoffmantel gerührt wird, gegeben. Nach 3,5 Stunden bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel entfernt, und der Rückstand wird mit einem 1/1-Gemisch von Ethylether/n-Hexan (20 ml) verrieben. Man erhält ein weißes Produkt (0,815 g, Ausbeute 70%) mit einem Schmelzpunkt von 143-145ºC.
Die Massenspektroskopie- und ¹H-NMR-Analysen bestätigen die angegebene Struktur.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) von Beispiel 1 ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 28,03'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,48.

8) Z-Lys(Boc)-gAsp(OBut)-(R,S)mVal-Tyr(But)OBut

Eine Lösung von HOBt (193 mg, 1,34 mmol) in DMF (2 ml) und eine Lösung von DCC (254 mg, 1,23 mmol) in DMF (2 ml) werden zu einer Lösung von Z-Lys(Boc)-OH (470 mg, 1,23 mmol) in DMF (4 ml), die auf 0ºC gekühlt und unter einem Stickstoffmantel gerührt wird, gegeben.
Nach 30 Minuten läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur steigen. Die Lösung wird weitere 30 Minuten gerührt.
Anschließend wird eine Lösung der in der vorstehenden Stufe erhaltenen Verbindung (770 mg, 1,12 mmol) in DMF (5 ml) mit einem Gehalt an TEA (123 ul, 1,12 mmol) zugegeben. Die Umsetzung wird 20 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Sodann wird der gebildete DCU abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit THF (10 ml) aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird über Nacht auf -15ºC gekühlt, sodann erneut filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit AcOEt (70 ml) aufgenommen. Die erhaltene organische Lösung wid zunächst mit 5% wäßriger Natriumbicarbonatlösung (3 x 50 ml), sodann mit gesättigter Natriumchloridlösung (3 x 50 ml), anschließend mit 0,1 N wäßriger HCl-Lösung (3 x 50 ml) und schließlich erneut mit wäßriger gesättigter NaCl-Lösung (3 x 50 ml) gewaschen.
Anschließend wird die organische Phase über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der erhaltene gelatineartige Rückstand wird mit Et&sub2;O verrieben. Man erhält einen grauweißen Feststoff (735 mg, Ausbeute 71%) mit einem Schmelzpunkt von 190-193ºC.
Die Massenspektroskopie- und ¹H-NMR-Analysen bestätigen die angegebene Struktur.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) von Beispiel 1 ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 33,90'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,73.

9) HCOOH H-Lys(Boc)-gAsp(OBut)-(R,S)mVal-Tyr(But)OBut

Eine Lösung der in der vorstehenden Stufe erhaltenen Verbindung (700 mg, 0,76 mmol) in einem 7/1-Gemisch von CH&sub3;OH/DMF (21 ml) wird mit einer Lösung von Ammoniumformiat (95 mg, 1,52 mmol) in CH&sub3;OH (3,5 ml) und H&sub2;O (0,2 ml) sowie mit kleinen Portionen an 10% Palladium-auf-Aktivkohle (350 mg) versetzt. Die Umsetzung wird bei Raumtemperatur unter einem Stickstoffmantel durchgeführt. Nach 30 Minuten wird das Reaktionsgemisch über Celite filtriert, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Man erhält einen weißen Feststoff (518 mg, Ausbeute 91%), dessen HPLC-Analyse unter den Standardbedingungen von Stufe 1) von Beispiel 1 keine Spuren an Verunreinigungen zeigt. Es ergibt sich ein einziger Peak mit einem TR-Wert von 29,95'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,39

10) Boc-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-gAsp(OBut)-(R,S)mVal-Tyr(But)OBut

Eine Lösung von HOBt (120 mg, 0,84 mmol) in DMF (3 ml) und eine Lösung von DCC (159 mg, 0,77 mmol) in DMF (2 ml) wird mit einer Lösung von Boc-Arg(Mtr)-OH (375 mg, 0,77 mmol) in DMF (10 ml), die auf 0ºC gekühlt und unter einem Stickstoffmantel gerührt wird, gegeben. Nach 30 Minuten läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur steigen. Die Lösung wird weitere 30 Minuten gerührt. Sodann wird eine Lösung der in Stufe 9) erhaltenen Verbindung (vorher durch Behandlung mit Na&sub2;CO&sub3; bei einem pH-Wert von etwa 9 (50 ml) und Extraktion mit AcOEt (3 x 30 ml) entsalzt) (518 mg, 0,69 mmol) in DMF (10 ml) zugegeben.
Die Umsetzung wird 20 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Sodann wird der gebildete DCU entfernt. Das DMF wird durch Abdampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird gemäß Stufe 8) behandelt. Durch Abdampfen der organischen Phase erhält man etwa 490 mg Produkt (Ausbeute 60%) vom Schmelzpunkt 179-182ºC.
Die HPLC-Analyse unter den Bedingungen von Stufe 1) von Beispiel 1 ergibt einen einzigen Peak mit einem TR-Wert von 34,10'.
Dünnschichtchromatographie (CMA) Rf = 0,77
Die Verbindung wird ohne spezielle Reinigungsverfahren in der anschließenden Deblockierungsstufe eingesetzt.

11) CH&sub3;COOH H-Arg-Lys-gAsp-(R,S)mVal-Tyr-OH

Das in der vorstehenden Stufe erhaltene Produkt (170 mg, 0,15 mmol) wird 20 Minuten bei Raumtemperatur unter einem Stickstoffmantel mit einer frisch hergestellten Lösung mit einem Gehalt an Trifluoressigsäure (TFA), Trifluormethansulfonsäure (TFMSA) und 1,2-Ethandithiol (EDT) (89/1/10) (20 ml) behandelt. Nach 20 Minuten wird das Reaktionsgemisch auf 0ºC gekühlt. TEA (0,3 ml, 1,44 mmol) wird zugetropft. Anschließend wird das Gemisch unter einem Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird mit H&sub2;O (50 ml) aufgenommen und mit Et&sub2;O (30 ml) extrahiert. Die Ethyletherphase wird mit H&sub2;O (20 ml) gewaschen. Die beiden Wasserphasen werden mit Et&sub2;O (3 x 30 ml) extrahiert und sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird durch Ionenaustauschchromatographie an einer mit CM-Sephadex C-25 (2 g) gepackten Säule (15 x 0,9 cm) gereinigt und mit einem linearen Ammoniumacetatgradienten vom pH-Wert 4,4 von 0,15 bis 0,6 innerhalb von 8 Stunden mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,8 ml/min entwickelt.
Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingeengt und mehrfach lyophilisiert. Man erhält 60,5 mg Produkt (Ausbeute 56%).
Die ¹H-NMR- und Massenspektroskopie-Analysen bestätigen die Struktur des Produkts, während die HPLC-Analyse unter den Standardbedingungen von Stufe 1) von Beispiel 1 die Reinheit bestätigt. Es ergibt sich ein einziger Peak mit einem TR-Wert von 8,21'.

Beispiel 3

[gVal&sup4;, (R,S)mTyr&sup5;]TP5

Die Herstellung dieser Verbindung ((III): R = H, R² = H), ausgehend von dem C-endständigen Tripeptid H-Asp(OBut)-gVal-(R,S)mTyr(But)OBut (erhalten gemäß Beispiel 1, Stufen 1) - 5)) wird in geeigneter Weise durch folgende Maßnahmen vorgenommen:
1) Kondensation mit der Verbindung der Formel Z-Lys(Boc)-OH;
2) katalytische Hydrierung zur Schutzgruppenentfernung von α-NH&sub2;;
3) Kondensation mit Boc-Arg(Mtr)-OH;
4) Deblockierung der endständigen Säure unter anschließender Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie.
Die in den vorstehenden Stufen 1)-4) angewandten Verfahrensweisen entsprechen vollkommen den der in den Stufen 8)-11) von Beispiel 2 beschriebenen Maßnahmen.
Man erhält das gewünschte Produkt, dessen Struktur durch Massenspektroskopie- und ¹H-NMR-Analysen bestätigt wird.
Die HPLC-Analyse unter den standardmäßigen Bedingungen von Stufe 1) von Beispiel 1 ergibt zwei Peaks aufgrund des Paars von Diastereoisomeren mit TR-Werten von 7,79' und 8,00'.

Claims

1. Thymopentin-Analoges mit einer der folgenden Formeln

worin R Wasserstoff oder einen metabolisch labilen Acylrest oder einen Acylrest bedeutet, dessen Bindung mit der Aminogruppe in den ersten Stufen des Stoffwechselwegs des Produkts leicht aufgebrochen wird, und R¹ eine Gruppe der Formel -OR² bedeutet,

worin R² ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit einer geraden oder verzweigten Kette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen Alkenyl- oder Alkinylrest mit einer geraden oder verzweigten Kette mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Arylalkyl- oder Alkylarylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet, sowie die entsprechenden pharmazeutisch verträglichen Säure- oder Basenadditionssalze.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R und R¹ die in Anspruch 1 definierte Bedeutung haben und R² Wasserstoff bedeutet.

3. Verbindung nach Anspruch 2, worin R Wasserstoff bedeutet.

4. Verbindung nach Anspruch 3, ausgewählt unter

[gArg¹, (R,S)mLys²,gVal&sup4;, (R,S)mTyr&sup5;]TP5,

[gAsp³, (R,S)mVal&sup4;]TP5, [(R,S)mVal&sup4;,gTyr&sup5;]TP5,

und den Säureadditionssalzen davon.

5. Verbindung nach Anspruch 4, ausgewählt unter

[gArg¹, (R,S)mLys²,gVal&sup4;, (R,S)mTyr&sup5;]TP5

und den Additionssalzen davon.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1 als Wirkstoff.

7. Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung als Arzneistoff.

8. Verfahren zur Herstellung eines Thymopentin-Analogen mit einer der folgenden Formeln

worin R ein Wasserstoffatom oder einen Acylrest bedeutet und

R¹ eine Gruppe der Formel -OR² bedeutet,

worin R² ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit einer geraden oder verzweigten Kette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen Alkenyl- oder einen Alkinylrest mit einer geraden oder verzweigten Kette mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Arylalkyl- oder Alkylarylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet, und der entsprechenden pharmazeutisch verträglichen Basen- oder Säureadditionssalze, wobei das Verfahren in der Entfernung der Schutzgruppen von den entsprechenden Verbindungen der Formeln (Ia), (IIa) und (IIIa) besteht

wobei

R³ R oder eine Schutzgruppe für die α-Aminofunktion bedeutet,

PG eine geeignete Schutzgruppe für die Guanidinfunktion bedeutet,

PL eine Schutzgruppe für die Aminofunktion in der Seitenkette bedeutet,

P eine Schutzgruppe für die Carboxylfunktion bedeutet,

PI eine Schutzgruppe für die Hydroxylfunktion von Tyrosin bedeutet und

R¹ die vorstehend definierte Bedeutung hat.

9. Zwischenprodukt der Formeln (Ia), (IIa), (IIIa), (IV), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X) und (XIV)

wobei

P" Wasserstoff oder eine geeignete Schutzgruppe für die α-Aminofunktion bedeutet,

PG eine Schutzgruppe für die Guanidinofunktion bedeutet,

PL eine Schutzgruppe für die Aminofunktion in der Seitenkette bedeutet,

P eine Schutzgruppe für die Carboxylfunktion bedeutet,

R¹ eine Gruppe der Formel -OR² bedeutet, worin R² die vorstehend definierte Bedeutung hat und

PI eine Schutzgruppe für die Hydroxylfunktion von Tyrosin bedeutet.

10. Zwischenprodukt der Formeln (Ia), (IIa), (IIIa), (IV), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X) und (XIV) nach Anspruch 9, wobei

PL eine tert.-Butoxycarbonyl- oder tert.-Amyloxycarbonylgruppe bedeutet,

PG eine Benzylsulfonylgruppe, die ggf. substituiert ist, bedeutet,

P eine tert.-Butyl-, tert.-Amyl-, Benzyl- oder substituierte Benzylgruppe bedeutet, und

PI eine tert.-Butyl- oder tert.-Amylgruppe bedeutet.