DE69017921T2

DE69017921T2 - Lactoferrinhydrolysat zur Verwendung als tyrosinagehemmendes Mittel.

Info

Publication number: DE69017921T2
Application number: DE69017921T
Authority: DE
Inventors: Susumu Asahi-Ku Yokohama-Shi Kanagawa Kobayashi; Mamoru Yokohama-Shi Kanagawa Tomita
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1990-01-23
Filing date: 1990-12-20
Publication date: 1995-10-12
Anticipated expiration: 2010-12-21
Also published as: EP0438750A3; US5214028A; DE69004242D1; EP0536805B1; US5389611A; NZ236830A; EP0438750A2; DE69004242T2; EP0438750B1; DE69017921D1; EP0536805A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Lactoferrinhydrolysat zur Herstellung eines Tyrosinase-Hemmstoffes.

Außgangssituation

Lactoferrin ist als ein eisenbindendes Protein bekannt, das in Tränenflüssigkeit, Speichel, peripherem Blut, Milch u.dgl. vorkommt. Nicht bekannt war, daß Lactoferrin und seine Hydrolysate starke Tyrosinase-Hemmaktivität aufweisen.
Tyrosinase ist als ein Enzym bekannt, das als Katalysator für die Oxidation von Tyrosin und anderen, mit einer Hydroxylgruppe versehenen Phenolen und entsprechenden, mit zwei Hydroxylgruppen versehenen Orthophenolen mit molekularem Sauerstoff wirken kann und das weitverbreitet in Pflanzen vorkommt, wie beispielsweise Pilzen, Kartoffeln, Äpfeln sowie in tierischen Geweben. Es ist ebenfalls bekannt, daß Tyrosinase im Zusammenhang mit der Erscheinung des Dunkelwerdens an einer verletzten Stelle des Pflanzengewebes steht und ebenfalls im Zusammenhang mit der Bildung von Melaninpigment in verschiedenen Geweben von Tieren, insbesondere in epidermalen Zellen (Editorial Committee of Encyclopedia Chimica, Encyclopedia Chimica, Bd. 5, S. 976, Kyohritsu Shuppan; 1960).
Ebenfalls ist bekannt, daß Pigmentierung durch Melanin in epidermalen Zellen oder Schleimhaut eine Folge der verringerten Sekretion von Hormonen der Nebennierenrinde ist, welche Melanotropin antagonisieren, das wiederum die Tyrosinase-Aktivität fördert (Editorial Committee of Encyclopedia Chimica, Encyclopedia Chimia, Bd. 1, S. 65, Kyohritsu Shuppan; 1960).
Es gab daher auf dem Gebiet der Pharmazie, Kosmetik, Lebensmittel u.dgl. ein starkes Bestreben zur Entwicklung eines Tyrosinase-Hemmstoffes für die Therapie von Symptomen, die eine Folge der unerwünschten Wirkungen von Tyrosinase- Aktivität sind, sowie zu deren Verhütung. Insbesondere waren Wissenschaftler auf dem Gebiet der Kosmetik lebhaft mit der Herstellung von Kosmetika oder Medikamenten zur äußeren Anwendung für die wirksame Hemmung der Melaninbildung und zum Aufhellen der Haut befaßt, und es wurden zahlreiche Produkte erfolgreich entwickelt, die Tyrosinase-Hemmstoffe enthielten. Es waren zahlreiche Tyrosinase-Hemmstoffe bekannt, beispielsweise Cystein und Vitamin C (Yutaka Mishima et al., Fundamental Dermatology, S. 258, Asakura Shoten; 1973), Kojisäure (Nikkei Sangyo Newspaper, 24. Mai 1988), Arbutin (Ken-ichi Tomita, vorläufiger Beitrag zum 20. F.J. Seminar, S. 21, Fragrane Journal Company, 14. März 1990), Produkte von Mikroorganismen, die zum Genus Trichoderma gehören (Offenlegung in der JP-A-2(1990)145189)
Die konventionellen Tyrosinase-Hemmstoffe hatten jedoch insofern mehr oder weniger Mängel, daß sie in den Produkten unstabil sind, eine zu starke Funktion auf Melaninpigmenterzeugende Melanocyten ausüben und wegen der Schwierigkeit zur Erlangung ihrer Rohstoffe zu kostspielig sind und sie in der Verwendung als Kosmetika oder Medikamente zur äußeren Anwendung vom Standpunkt der Sicherheit, Wirtschaftlichkeit, Konservierbarkeit, Zuverlässigkeit in bezug auf die aufhellende Wirkung usw. nicht zufriedenstellend waren.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, daß Lactoferrin und insbesondere sein Hydrolysat eine starke Tyrosinase-Hemmaktivität haben. Die vorliegende Erfindung beruht auf dieser Entdeckung.

Zusammenfassung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von Lactoferrinhydrolysat zur Herstellung von Tyrosinase- Hemmstoff gewährt, dadurch gekennzeichnet, daß Lactoferrinhydrolysat durch Hydrolyse von Lactoferrin erhalten werden kann. Vorzugsweise beträgt der Bereich der Abbaurate von Lactoferrinhydrolysat zur Verwendung als Tyrosinase-Hemmstoff 4 % ... 50 %, speziell 6 % ... 40 %, gemessen mit Hilfe der Methode der Formoltitration (prozentualer Anteil von Formol-Stickstoff bezogen auf Gesamtstickstoff).
Es muß festgestellt werden, daß ein zusätzlicher Effekt der bakteriostatischen Wirkung zu erwarten ist, wenn 0,05 % oder mehr Lactoferrinhydrolysat mit einer Abbaurate von 6 % ... 20 % in den Tyrosinase-Hemmstoff einbezogen werden. Diese Bedingung ist Gegenstand der EP-A-0 438 750.
Lactoferrinhydrolysat kann mit der konventionellen Methode hergestellt werden (beispielsweise Hydrolyse von Lactoferrin durch organische oder anorganische Säuren oder durch Enzyme).
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Lactoferrinhydrolysat kann jede Lactoferrin-Substanz verwendet werden, wie beispielsweise auf dem Markt erhältliches Lactoferrin, in der Natur vorkommendes, unmittelbar durch konventionelle Methoden (z.B. durch Ionenaustauschchromatographie) aus Milch von Säugern isoliertes Lactoferrin, Apolactoferrin, welches durch Entfernung von Eisen aus natürlich vorkommendem Lactoferrin mit Salzsäure, Citronensäure u.dgl. erhalten werden kann, metallgesättigtes Lactoferrin, welches durch Chelatbildung von Apolactoferrin mit Eisen, Kupfer, Zink, Mangan u.dgl. erhalten werden kann, oder eine Mischung davon (nachfolgend werden diese Lactoferrin-Substanzen abgekürzt als LF).
Als Ausgangsstoff für LF kann jede Milch von Säugern verwendet werden (beispielsweise Milch der menschlichen Brust sowie von Kuh, Schaf, Ziege, Pferdemilch u.dgl.), und zwar in jedem Lactationsstadium (beispielsweise Colostrum, Übergangsmilch, Reifemilch, Milch der späteren Lactation). Darüber hinaus können als Ausgangsstoff für Lactoferrin verarbeitete Milch oder Nebenprodukte der Milchverarbeitung, wie beispielsweise Magermilch, Molke u.dgl. (nachfolgend bezeichnet als Milch u.dgl.), verwendet werden.
Die saure Hydrolyse kann nach den konventionellen Verfahren durchgeführt werden, wie beispielsweise Auflösen von LF in Wasser oder gereinigtem Wasser in einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 20 % (Gewichtsprozent, gilt auch bei den übrigen Angaben, sofern nicht anders angegeben), vorzugsweise 5 % ... 15 %, gefolgt von einer pH- Wert-Einstellung der resultierenden Lösung auf 1 bis 4, vorzugsweise auf 2 bis 3, und Hydrolysereaktion bei einer geeigneten Temperatur in Abhängigkeit vom pH-Wert der Lösung. Wenn beispielsweise der pH-Wert auf 1 bis 2 eingestellt ist, wird die Lösung bei 80º bis 130 ºC erhitzt, vorzugsweise bei 90 º ... 120 ºC; wenn der pH-Wert auf 2 bis 4 eingestellt ist, wird die Lösung bei 100 º bis 130 ºC, vorzugsweise bei 100 º bis 120 ºC für jeweils 1 bis 120 Minuten erhitzt, vorzugsweise 5 bis 60 Minuten, bis die Abbaurate (anhand der Formoltitration) von LF-Hydrolysat von 6 % ... 20 %, vorzugsweise von 7 % ... 15 %, erreicht ist.
Eine enzymatische Hydrolyse kann nach den konventionellen Verfahren durchgeführt werden, wie beispielsweise Auflösen von LF in Wasser oder gereinigtem Wasser in einer Konzentration zwischen 0,5 % ... 20 %, vorzugsweise 5 % ... 15 %, gefolgt von einer pH-Wert-Einstellung der resultierenden Lösung auf den optimalen pH-Bereich und einer enzymatischen Hydrolyse unter geeigneten Bedingungen, wie beispielsweise einer Temperatur zwischen 15 º und 55 ºC, vorzugsweise zwischen 30 º und 50 ºC für 30 bis 600 Minuten, vorzugsweise für 60 bis 300 Minuten. Die umgesetzte Mischung wird neutralisiert, gefolgt von einer Deaktivierung des Enzyms entsprechend dem konventionellen Verfahren.
Bei der Herstellung von Tyrosinase-Hemmstoff gibt es keinerlei Beschränkung für die zu verwendenden Enzyme, z.B. Amano A (Warenzeichen von der Amano Saiyaku; optimaler pH- Wert: 7,0), Trypsin, von Milchsäurebakterien entsprechend den Angaben in der JP-A-48(1973)-43878 und kommerzielles Shohvu-Enzym (Soja-Enzym), umfassend Exopeptidase (von der Tanabe Seiyaku), das zusätzlich zu jedem beliebigen Säureenzym verwendet werden kann, wie beispielsweise Molsin F (Warenzeichen; von der Seishin Seiyaku; optimaler PH-Wert: 2,5 ... 3,0), Schweinepepsin (von der Wakoh Junyaku Kogyo; optimaler pH-Wert: 2 ... 3), Sumizyme AP (Warenzeichen; von der Shin Nihon Kagaku; optimaler pH-Wert: 3,0), Amano M (Warenzeichen; von Amano Seiyaku; optimaler pH-Wert: 3,0) u. dgl. und zwar einzeln oder beliebigen Kombinationen davon.
Die Menge der zu verwendenden Enzyme kann 0,1 % ... 5,0 %, vorzugsweise 0,5 % ... 3,0 %, bezogen auf das verwendete Substrat betragen.
Unabhängig von der Methode des Hydrolysierens wird die LF-Hydrolysat enthaltende resultierende Lösung nach dem konventionellen Verfahren gekühlt, wonach erforderlichenfalls Neutralisation, Demineralisation und Entfärbung folgen. Die resultierende Lösung kann in der Form, wie sie vorliegt, als ein flüssiges Produkt verwendet werden, oder die Lösung wird erforderlichenfalls weiter konzentriert und/oder getrocknet, um eine konzentriertes flüssiges Produkt oder ein pulverförmiges Produkt zu erhalten.
Die Bedingungen der Hydrolyse, auf die vorstehend bezug genommen wurden, sind nicht entscheidend, können jedoch in Abhängigkeit von der Temperatur, der Zeitdauer, dem Druck sowie der Art und der Menge der/des verwendeten Säure oder Enzyms modifiziert werden.
LF-Hydrolysat der vorliegenden Erfindung ist eine Mischung der abgebauten Substanzen mit verschiedenen relativen Molekülmassen.
Das so erhaltene LF-Hydrolysat ist äußerst stabil gegenüber Erhitzen und weist hervorragende Tyrosinase-Hemmaktivität auf.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Nachfolgend werden einige Tests beschrieben, um am Beispiel die Anwendbarkeit von LF-Hydrolysat als ein Tyrosinase-Hemmstoff zu veranschaulichen.

[Test 1]

Der Zweck dieses Tests besteht darin, um am Beispiel die Tyrosinase-Hemmaktivität von LF-Hydrolysat zu belegen, das aus einer sauren Hydrolyse von LF resultiert.

1) Herstellung der Proben

Es wurde auf dem Markt gehandelt es natürliches LF (von Oleofina, Belgien) in gereinigtem Wasser mit einer Konzentration von 5 % aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde in mehrere Chargen aufgeteilt, die auf unterschiedliche pH- Werte von 1, 2, 3 und 4 durch Zusatz von 1 M Salzsäure eingestellt wurden. Die resultierenden Lösungen mit unterschiedlichem pH-Wert wurden einer Hydrolysereaktion unter verschiedenen Bedingungen in einer Kombination einer Temperatur zwischen 60 und 130 ºC und einer Zeit zwischen 5 und 60 Minuten ausgesetzt, um dadurch Proben von LF- Hydrolysat mit unterschiedlichen Abbauraten entsprechend Tabelle 1 herzustellen. Die resultierenden Lösungen wurden mit 1 M Natriumhydroxid auf pH 7 eingestellt und sodann gefriergetrocknet, um dadurch 8 Arten von pulverförmigem LF- Hydrolysat in verschiedenen Abbauraten zwischen 4 % .. 30 % zu erhalten.

2) Methode

2-1) Bestimmung der Abbaurate

Die Abbaurate (in %) des resultierenden LF-Hydrolysats wurde in einer solchen Weise bestimmt, daß die Menge des Formol-Stickstoffs in den entsprechenden Proben durch das Verfahren der Formoltitration gemessen wurde und die erhaltenen Werte sodann auf die folgende Formel angewendet wurden:
Abbaurate (%) = 100 x (A / B)
(darin bezeichnen A die Menge des Formol-Stickstoffs und B die Menge des Gesamtstickstoffs).

2-2) Messung der Tyrosinase-Hemmaktivität

2-2-1) Herstellung unterschiedlicher Lösungen

2-2-1-1) Herstellung von Substratlösung

Es wurde L-Tyrosin (von der Wakoh Junyaku Kogyoh) als Reagens mit angegebenen Reinheitsgrad in 0,1M Phosphatpufferlösung einer Konzentration von 0,045 % (Gewicht pro Volumen) aufgelöst.

2-2-1-2) Herstellung von Enzymlösung

Es wurde von Pilzen abgeleitete Tyrosinase (von der Sigma, 3.000 Einheiten/mg) in 0,1m Phosphatpufferlösung (pH 7,0) in einer Konzentration von 0,1 % (Gewicht pro Volumen) aufgelöst.

2-2-1-3) Herstellung von Kupferionenlösung

Es wurde Kupfersulfat als ein Reagens mit angegebener Reinheit (von der Wakoh Junyaku Kogyoh) in gereinigtem Wasser in einer Konzentration von 1 % (Gewicht pro Volumen) aufgelöst.

2-2-1-4) Herstellung von Probelösung

Jede der Lösungen von LF-Hydrolysat, die zuvor nach Punkt 1) in verschiedenen Abbauraten zubereitet wurden, wurden in 0,1M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) zur Herstellung von Probelösungen in 8 verschiedenen Konzentrationen aufgelöst, so daß, wenn die Probelösungen in den im nachfolgenden Punkt 2-2-2) beschriebenen Anteilen zugesetzt wurden, 8 Chargen der Testproben in verschiedenen Konzentrationen entsprechend den Angaben in Tabelle 1 für jedes LF-Hydrolysat mit verschiedenen Abbauraten hergestellt wurden.

2-2-2) Enzymreaktion

Jede der resultierenden Probelösungen, die zuvor zubereitete Substratlösung und die Kupferionenlösung, die zuvor auf 37 ºC erhitzt wurden, wurden in einem Reagenzglas in den folgenden Anteilen gemischt:
Probelösung 1,0 ml
Substratlösung 0,9 ml
Kupferionenlösung 0,02 ml
Zu jeder der Mischungen wurden 0,08 ml Enzymlösung, die zuvor auf die gleiche Temperatur erhitzt worden war, zugesetzt (insgesamt 2,0 ml) und die Enzymreaktion bei 37 ºC für 3 Minuten ausgeführt. Nach der Reaktion wurden zu jeder der Reaktionsmischungen 2 ml 30%ige Essigsäurelösung zugesetzt, um die Enzymreaktion abzubrechen, wonach mit einem Spektrophotometer bei der Wellenlänge von 640 nm die Extinktion gemessen wurde (die Werte der Extinktion wurden mit B bezeichnet). Als eine Kontrolle wurde eine Lösung unter Ersatz der 0,1m Phosphatpufferlösung für die Probelösung zubereitet und die resultierende Lösung enzymatisch umgesetzt und die Extinktion in der gleichen Weise wie bei den Testproben Nr. 1 bis 8 gemessen (der Wert der Extinktion wurde mit A bezeichnet). Sofern diese Probelösung trüb war, wurde die Extinktion einer entsprechenden Mischung gemessen (der Wert der Extinktion wurde mit C bezeichnet), welche die gleiche Zusammensetzung wie die zu untersuchende getrübte Probelösung mit der Ausnahme hatte, daß die Enzymlösung durch 0,08 ml 0,1M Phosphatpufferlösung ersetzt wurde, und der Wert von C vom Wert B abgezogen, um die Differenz der Extinktion der Reaktionsmischung vor und nach der Enzymreaktion zu erhalten.
Die gemessenen Werte wurden auf die folgende Gleichung angewandt, um die Tyrosinase-Hemmrate in % zu erhalten:
Hemmrate = 100 x [1 - (B - C) / A]

3) Ergebnisse

Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Probe Nr. Abbaurate (%) Konzentration von LF-Hydrolysat (%) Kontrolle Hinweis: Tyrosinase-Hemmrate (%)
Probe Nr. 1, die eine Abbaurate von 4 % aufwies, zeigte mit Zusatz von 0,3 % LF-Hydrolysat eine Tyrosinase-Hemmrate von etwa 10 %. Die Hemmaktivität wurde mit zunehmender Konzentration von LF-Hydrolysat erhöht, wobei mit Zusatz von 1 % LF-Hydrolysat die Hemmrate 30 % und mit Zusatz von 2 % LF-Hydrolysat die Hemmrate 50 % betrugen.
Andererseits zeigten die Proben Nr. 2 bis 8 mit Abbauraten von 6 ... 30 % mit Zusatz von LF-Hydrolysat in einer Konzentration von nur 0,05 % eine Hemmrate von etwa 30 %. Die Hemmrate wurde mit zunehmender Konzentration von LF-Hydrolysat erhöht und betrug etwa 60 % bei einer Konzentration von 0,1 %, 80 % bei einer Konzentration von 0,3 % und 100 % bei einer Konzentration von 0,5 %.
Ebenfalls wurde festgestellt, daß Säurehydrolysat anderer LF-Substanzen, wie beispielsweise Apolactoferrin, Zink-, Kupfer- und Eisen-LF eine ähnliche Tyrosinase- Hemmrate zeigten.

[Test 2]

Der Zweck dieses Tests bestand darin, die Tyrosinase- Hemmwirkung von LF-Hydrolysat als Ergebnis der Enzymhydrolyse von LF an einem Beispiel zu veranschaulichen.

1) Herstellung der Proben

Es wurde auf dem Markt gehandeltes LF (von Oleofina) in gereinigtem Wasser in einer Konzentration von 5 % aufgelöst. Die resultierende LF-Lösung wurde in 8 Chargen aufgeteilt, zu denen eine unterschiedliche Kombination von Enzymen, umfassend Schweinepepsin, Amano A und Soja-Enzym mit auf dem Markt verkaufter Peptidase, in verschiedenen Konzentrationen zwischen 0,1 % ... 6 % zur Herstellung der Proben Nr. 9 bis 16 zugesetzt wurden. Die resultierenden Mischungen wurden für unterschiedliche Reaktionszeiten zwischen 10 Minuten und 24 Stunden zur Enzymreaktion bei 37 ºC gehalten, die umgesetzten Lösungen auf pH 7 eingestellt, für 10 Minuten zur Deaktivierung der Enzyme auf 80 ºC erhitzt und sodann gefriergetrocknet, um LF-Hydrolysat mit unterschiedlichen Abbauraten zwischen 6 % ... 50 % zu erhalten.

2) Methode

Die Abbauraten und Tyrosinase-Hemmraten des jeweiligen LF-Hydrolysats wurden in der gleichen Weise wie in Test 1 gemessen.

3) Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Probe Nr. Abbaurate (%) Konzentration von LF-Hydrolysat (%) Kontrolle Hinweis: Tyrosinase-Hemmrate (%)
Proben Nr. 9 bis 14, die eine Abbaurate zwischen 6 % ... 40 % hatten, zeigten mit Zusatz von 0,05 % LF-Hydrolysat eine Tyrosinase-Hemmung von etwa 30 %. Die Hemmaktivität wurde mit zunehmender Konzentration von LF-Hydrolysat erhöht, wobei mit Zusatz von 0,1 % LF-Hydrolysat eine Hemmrate von etwa 60 % erzielt wurde, mit Zusatz von 0,3 % eine Hemmrate von etwa 80 % und mit Zusatz von 0,5 % LF- Hydrolysat eine Hemmrate von 100 %.
Andererseits zeigten Proben Nr. 15 bzw. 16 mit Abbauraten von 40 % bzw. 50 % bei einer Konzentration von 0,3 % LF-Hydrolysat eine Hemmrate von etwa 10 %. Die Hemmrate wurde mit zunehmender Konzentration von LF-Hydrolysat erhöht und betrug bei einer Konzentration von 1 % etwa 30 % und bei einer Konzentration von 2 % etwa 50 %.
Es wurde ebenfalls festgestellt, daß das Enzymhydrolysat von anderen LF-Substanzen, d.h. Apolactoferrin, metallgesättigtes LF mit Chelatbildung mit Metallen wie Zink, Kupfer und Eisen u.dgl., im wesentlichen die gleiche Tyrosinase-Hemmrate zeigte. Insbesondere wurde festgestellt, daß die Tyrosinase-Hemmrate hauptsächlich von der Abbaurate von LF-Hydrolysat abhängt.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden die nachfolgenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Es wurde LF-Lösung hergestellt, indem 80 g von auf dem Markt gehandeltem LF (von der Oleofina) in 1.000 ml gereinigtem Wasser aufgelöst wurden, wonach der pH-Wert der resultierenden LF-Lösung mit Hilfe von 1m Salzsäure auf 2 eingestellt wurde. Die resultierende Lösung wurde für 10 Minuten auf 115 ºC erhitzt, die Lösung mit 1M Natriumhydroxidlösung auf pH 7 eingestellt und danach gefriergetrocknet, um dadurch etwa 77 g LF-Hydrolysat-Pulver mit 15 % Abbaurate zu erhalten, gemessen nach der gleichen Methode wie in Test 1.
Nach homogenem Mischen von 50 g des resultierenden LF- Hydrolysats, 900 g Glycin (von der Wakoh Junyaku Kogyo) und 50 g Lysozym (von der Wakoh Junyaku Kogyo) wurden etwa 1.000 g eines zum Frischhalten von Lebensmitteln zu verwendenden Tyrosinase-Hemmstoff es hergestellt.
Die Tyrosinase-Hemmrate von 20%iger wäßriger Lösung des resultierenden Tyrosinase-Hemmstoffes betrug 100 %, gemessen nach der gleichen Methode wie in Test 1.

Beispiel 2

Nach dem Auflösen von 270 g von auf dem Markt gehandeltem LF (von der Oleofina) in 6.300 ml gereinigtem Wasser wurde die resultierende Lösung mit 10 % wäßriger Lösung mit Citronensäure auf pH 2,5 eingestellt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur für die Reaktion zum Entfernen von Eisen gehalten. Die umgesetzte Lösung wurde einer Ultrafiltration unterzogen und das resultierende Konzentrat gefriergetrocknet, um damit etwa 260 g Apolactoferrin zu erhalten.
Es wurden 60 g des resultierenden Apolactoferrins in 1.000 ml Wasser aufgelöst und die resultierende Lösung mit 2M Phosphorsäurelösung auf pH 3 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde für 25 Minuten auf 121 ºC erhitzt, mit 1m Natriumhydroxid-Lösung auf pH 7 eingestellt und sodann gefriergetrocknet, um damit etwa 55 g pulverförmiges LF- Hydrolysat mit einer Abbaurate von 23 % zu erhalten, gemessen nach der gleichen Methode wie in Test 1.
Nach homogenem Mischen von 20 g des resultierenden LF- Hydrolysats, 400 g Propylenglykol (von der Wakoh Junyaku Kogyo), 4 g Oleylalkohol (von der Wakoh Junyaku Kogyo), 200 g Ethanol (von der Wakoh Junyaku Kogyo) und 3.376 g gereinigtem Wasser wurden zur Verwendung in der Kosmetik etwa 4.000 g Tyrosinase-Hemmstoff erhalten.
Die scheinbare Hemmrate des resultierenden Mittels gegen Tyrosinase betrug 75 %, wobei jedoch die praktische Hemmrate gegen Tyrosinase unter Berücksichtigung der Konzentration von LF-Hydrolysat mit 100 % berechnet wurde.

Beispiel 3

Nach dem homogenen Mischen von 100 g von auf dem Markt gehandeltem LF (von der Oleofina) und 1.000 ml gereinigtem Wasser wurde der pH der resultierenden Lösung mit 1m Salzsäure auf 2 eingestellt. Zu der resultierenden Lösung wurden 5 g von auf dem Markt gehandelt ein Schweinepepsin (von der Wakoh Junyaku Kogyo) zugesetzt und für 60 Minuten bei 37 ºC umgesetzt. Die umgesetzte Lösung wurde für 10 Minuten auf 80 ºC zum Deaktivieren des Enzyms erhitzt, sodann gefriergetrocknet, um damit etwa 95 g LF-Hydrolysat mit einer Abbaurate von 12 % zu erhalten, gemessen nach der gleichen Methode wie in Test 1.
Es wurden etwa 2.000 g Tyrosinase-Hemmstoff zur Verwendung in der Kosmetik durch homogenes Mischen von 30 g des resultierenden LF-Hydrolysats, 200 g Propylenglykol (von der Wakoh Junyaku Kogyo), 2 g Oleylalkohol (von der Wakoh Junyaku Kogyo), 100 g Ethanol (von der Wakoh Junyaku Kogyo) und 1.668 g gereinigtem Wasser hergestellt.
Die Tyrosinase-Hemmrate des resultierenden Tyrosinase- Hemmstoffes betrug 100 %, gemessen nach der gleichen Methode wie in Test 1.

Beispiel 4

Es wurden 150 g von auf dem Markt gehandeltem LF (von der Oleofina) in 150 g gereinigtem Wasser aufgelöst, der pH- Wert der resultierenden Lösung mit 1m Natriumhydroxid-Lösung auf 6 eingestellt und sodann für 10 Minuten bei 60 ºC pasteurisiert. Die resultierende Lösung wurde auf 50 ºC abgekühlt und 15 g Trypsin (von der Nobo) und 30 g Soja- Enzym mit auf dem Markt gehandelter Peptidase (von der Tanabe Seiyaku) zugesetzt und für 5 Stunden bei 50 ºC umgesetzt. Die umgesetzte Lösung wurde für 10 Minuten zur Deaktivierung des Enzyms auf 80 ºC erhitzt und gefriergetrocknet, um dadurch etwa 145 g pulverförmiges LF- Hydrolysat mit einer Abbaurate von 38 % zu erhalten, gemessen nach der gleichen Methode wie in Test 1.
Nach dem homogenen Mischen von 12 g Natriumhyaluronat (von der Wakoh Junyaku Kogyo), 15 g Placentaextrakt (von der Botoger, Deutschland), 10 g Glycerin (von der Wakoh Junyaku Kogyo) und 962 g gereinigtem Wasser wurden etwa 1.000 g Tyrosinase-Hemmstoff erhalten.
Die Tyrosinase-Hemmrate des resultierenden Mittels betrug 100 %, gemessen nach der gleichen Methode wie in Test 1.

Beispiel 5

Es wurden etwa 78 g Fe-LF durch Auflösen von 90 g von auf dem Markt gehandeltem LF (von der Oleofina) in 2.100 ml gereinigtem Wasser hergestellt, die resultierende Lösung mit 755 ml 2,6 mMol wäßriger Lösung Eisen(II)-sulfat bei Raumtemperatur für 24 Stunden umgesetzt, die umgesetzte resultierende Lösung der Ultrafiltration unterzogen und das resultierende Konzentrat sodann gefriergetrocknet.
Es wurden 40 g des resultierenden Fe-LF in 500 ml gereinigtem Wasser aufgelöst und der pH-Wert der resultierenden Lösung mit 1m Salzsäurelösung auf 3 eingestellt. Zu der resultierenden Lösung wurden 5 g Sumizyme AP (von der Shin Nihon Kakaku) zugesetzt und die resultierende Mischung für 3 Stunden bei 30 ºC hydrolysiert. Die umgesetzte Mischung wurde für 10 Minuten zur Deaktivierung des Enzyms bei 80 ºC erhitzt und sodann gefriergetrocknet, um dadurch etwa 35 g LF-Hydrolysat mit einer Abbaurate von 18 % zu erhalten, gemessen nach der gleichen Methoden wie in Test 1.
Es wurden etwa 500 g Tyrosinase-Hemmstoff, zu verwenden zum Frischhalten von Lebensmitteln, durch homogenes Mischen von 30 g des resultierenden LF-Hydrolysats, 450 g Glycin (von der Wakoh Junyaku Kogyo), 20 g Lysozym (von der Wakoh Junyaku Kogyo) hergestellt.
Die Tyrosinase-Hemmrate von 20 % wäßriger Lösung des resultierenden Mittels betrug 100 %, gemessen nach der gleichen Methode wie in Test 1.
Zusammenfassend kann der Schluß gezogen werden, daß 1) LF-Hydrolysat zur Verwendung als ein Tyrosinase-Hemmstoff bei Mensch und Tier sicher ist, da er eine in der Natur vorkommende für Tyrosinase inhibitorische Substanz ist, die sich aus der Hydrolyse von Milchbestandteilen u.dgl. ableitet;
2) LF-Hydrolysat zur Verwendung als ein Tyrosinase-Hemmstoff eine bemerkenswert starke Tyrosinase-Hemmaktivität aufweist;
3) LF-Hydrolysat zur Verwendung als ein Tyrosinase-Hemmstoff beim Erhitzen stabil ist und in flüssiger Form und Pulverform bereitgestellt werden kann und dadurch eine breitere Anwendung hat;
4) der Tyrosinase-Hemmstoff, welcher das LF-Hydrolysat aufweist, dadurch hergestellt werden kann, daß es mit einem oder mehreren Arzneimittelträgersubstanzen oder anderen Medikamenten einschließend andere Tyrosinase-Hemmstoffe gemischt wird;
5) der aus LF-Hydrolysat bestehende oder dieses aufweisende Tyrosinase-Hemmstoff kann eingesetzt werden als eine Komponente verschiedener Produkte, wie beispielsweise Kosmetika, Lebensmittel, Futtermittel und andere Produkte, bei denen es wünschenswert ist, unerwünschte Wirkungen von Tyrosinase- Aktivität zu vermeiden oder zu hemmen. Insbesondere wird darauf hingewiesen, daß die Einbeziehung von aus LF- Hydrolysat bestehendem oder dieses aufweisenden Tyrosinase- Hemmstoff in derartigen Produkten nicht nur zur Konservierung der Produkte wirksam ist, sondern auch bei der Therapie von Melaninpigmentierung oder deren Verhütung, wenn die Produkte an Mensch oder Tier verabreicht oder auf deren Körper aufgetragen werden;
6) der aus LF-Hydrolysaten bestehende oder diese aufweisende Tyrosinase-Hemmstoff zur Behandlung verschiedener Materialien eingesetzt werden kann, wie beispielsweise Waschen oder Tauchen der Materialien in eine Lösung des Stoffes, so daß der Stoff auf diesen Materialien haften bleibt oder auf ihnen aufgetragen oder in diese imprägniert wird, zum Aufrechterhalten sanitärer Bedingungen sowie zur Verhütung der Beeinträchtigung ihrer Frische. Insbesondere wird darauf hingewiesen, daß die behandelten Materialien ebenfalls wirksam sind zur Therapie gegen Melaninpigmentierung oder deren Verhütung, wenn sie von Mensch oder Tier eingenommen oder auf deren Körperfläche aufgetragen werden, vorausgesetzt, daß die wirksame Menge LF-Hydrolysat darin enthalten ist (oder darin verbleibt).

Claims

1. Verwendung von Lactoferrinhydrolysat zur Herstellung von Tyrosinase-Hemmstoff, dadurch gekennzeichnet, daß das Lactoferrinhydrolysat durch Hydrolyse von Lactoferrin erhalten werden kann.

2. Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher die Abbaurate des Hydrolysats 4 % ... 50 % beträgt.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, bei welcher mindestens 0,05 % des Hydrolysats in dem Stoff enthalten sind.