JPH0725800B2 - 硫酸エステル化物を用いて乳からラクトフエリンを分離、精製する方法 - Google Patents
硫酸エステル化物を用いて乳からラクトフエリンを分離、精製する方法Info
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- JPH0725800B2 JPH0725800B2 JP62088450A JP8845087A JPH0725800B2 JP H0725800 B2 JPH0725800 B2 JP H0725800B2 JP 62088450 A JP62088450 A JP 62088450A JP 8845087 A JP8845087 A JP 8845087A JP H0725800 B2 JPH0725800 B2 JP H0725800B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、種々の生理的活性を有し、薬理学的にも重要
な乳蛋白質であるラクトフエリンを、それを含有する乳
から有効に分離、精製する方法に関する。
な乳蛋白質であるラクトフエリンを、それを含有する乳
から有効に分離、精製する方法に関する。
従来技術とその問題点 ラクトフエリンは、乳等の外分泌液中に存在する鉄結合
性の糖蛋白質であつて、病原性細菌に対する静菌作用、
白血球の分化調節作用及び殺菌力増強作用、リンパ球の
増殖作用及び鉄吸収調節作用等の種々の生理的活性を有
するため、栄養学的のみならず薬理学的にも重要な乳蛋
白質であるといえる。
性の糖蛋白質であつて、病原性細菌に対する静菌作用、
白血球の分化調節作用及び殺菌力増強作用、リンパ球の
増殖作用及び鉄吸収調節作用等の種々の生理的活性を有
するため、栄養学的のみならず薬理学的にも重要な乳蛋
白質であるといえる。
したがつて、従来からも乳からラクトフエリンを分離、
精製する方法が検討されてきたが、ラクトフエリンは非
常に反応性に富んだ分子構造を有する蛋白質であり、か
つ他の乳蛋白質とも相互作用を示すため、高純度のラク
トフエリンを、簡易な操作により高収率で分離、精製す
るのが困難とされていた。すなわち、高純度のラクトフ
エリンを分離するには、工程が煩雑となり、分離に長時
間を要し、加うるにラクトフエリンの回収率も著しく低
いという問題があつた。
精製する方法が検討されてきたが、ラクトフエリンは非
常に反応性に富んだ分子構造を有する蛋白質であり、か
つ他の乳蛋白質とも相互作用を示すため、高純度のラク
トフエリンを、簡易な操作により高収率で分離、精製す
るのが困難とされていた。すなわち、高純度のラクトフ
エリンを分離するには、工程が煩雑となり、分離に長時
間を要し、加うるにラクトフエリンの回収率も著しく低
いという問題があつた。
最近、ラクトフエリンの分離精製法として、ラクトフエ
リンと生物学的親和性を持つヘパリンをセフアロースCL
−6B（フアルシア社製）のようなクロマトグラフイ−用
担体に CNBrなどにより固定化したアフイニテイ−カラ
ムに通液してラクトフエリンを分離、精製する方法〔Bl
ckberg,L.et.al「エフ イ−ビ−エス レターズ」
（FEBS LETT.）109,180（1980）〕が報告された。
リンと生物学的親和性を持つヘパリンをセフアロースCL
−6B（フアルシア社製）のようなクロマトグラフイ−用
担体に CNBrなどにより固定化したアフイニテイ−カラ
ムに通液してラクトフエリンを分離、精製する方法〔Bl
ckberg,L.et.al「エフ イ−ビ−エス レターズ」
（FEBS LETT.）109,180（1980）〕が報告された。
しかし、ヘパリンは豚や牛などの肝臓又は腸から抽出精
製されるものであり、その抽出源が違えばヘパリンの性
状も異なるため、同一性状のヘパリンを大量に入手する
のが困難であり、かつ高価である。したがつて、ヘパリ
ンを結合させて固定化したアフイニテイ−クロマトグラ
フイ−用担体を用いて乳からラクトフエリンを分離、精
製する方法は、実験的規模に限られ、大量の乳を処理す
る工業規模での方法には実用性が乏しい。さらに、上記
方法では担体に固定化させたヘパリンが脱落して分離し
たラクトフエリンに混入する恐れもあるという問題もあ
る。
製されるものであり、その抽出源が違えばヘパリンの性
状も異なるため、同一性状のヘパリンを大量に入手する
のが困難であり、かつ高価である。したがつて、ヘパリ
ンを結合させて固定化したアフイニテイ−クロマトグラ
フイ−用担体を用いて乳からラクトフエリンを分離、精
製する方法は、実験的規模に限られ、大量の乳を処理す
る工業規模での方法には実用性が乏しい。さらに、上記
方法では担体に固定化させたヘパリンが脱落して分離し
たラクトフエリンに混入する恐れもあるという問題もあ
る。
発明が解決しようとする課題 本発明は、叙上の状況に鑑みなされたものであつて、ヘ
パリンと同様なラクトフエリンに対して生物学的親和性
を有し、かつ物理的安定性の優れた硫酸エステル化物を
用いて乳からラクトフエリンを工業的規模で簡易な操作
により、高純度かつ高収率で極めて効率的に分離、精製
するための方法を提供することにある。
パリンと同様なラクトフエリンに対して生物学的親和性
を有し、かつ物理的安定性の優れた硫酸エステル化物を
用いて乳からラクトフエリンを工業的規模で簡易な操作
により、高純度かつ高収率で極めて効率的に分離、精製
するための方法を提供することにある。
以下本発明を詳しく説明する。
発明の構成 本発明の特徴は、架橋型ポリサツカライドの硫酸エステ
ル化物に、ラクトフエリン含有原料乳を接触させてラク
トフエリンを吸着させ、次いで吸着ラクトフエリンを溶
出して回収することにある。
ル化物に、ラクトフエリン含有原料乳を接触させてラク
トフエリンを吸着させ、次いで吸着ラクトフエリンを溶
出して回収することにある。
課題を解決するための手段 本発明で用いる架橋型ポリサツカライドの硫酸エステル
化物は、アガロース、セルロース並びにキチンなどのポ
リサツカライドを、架橋剤、例えばエピクロルヒドリン
などで架橋したもの（市販されている）を無水硫酸やク
ロルスルホン酸などで硫酸エステル化して得られるもの
であつて、大量に調製し得る。
化物は、アガロース、セルロース並びにキチンなどのポ
リサツカライドを、架橋剤、例えばエピクロルヒドリン
などで架橋したもの（市販されている）を無水硫酸やク
ロルスルホン酸などで硫酸エステル化して得られるもの
であつて、大量に調製し得る。
しかし、アガロースは軟らかく変形し易いため、ラクト
フエリンを工業的規模で取得することを目的とする場合
には、セルロースやキチン等硬質の担体を用いる方が望
ましい。
フエリンを工業的規模で取得することを目的とする場合
には、セルロースやキチン等硬質の担体を用いる方が望
ましい。
この架橋型ポリサツカライドの硫酸エステル化物は、水
性溶媒に不溶性であり、物理的安定性にも優れているの
で、該硫酸エステル化物を充填して成るアフイニテイ−
カラムは工業的規模での通液操作にも十分耐えることが
できる。
性溶媒に不溶性であり、物理的安定性にも優れているの
で、該硫酸エステル化物を充填して成るアフイニテイ−
カラムは工業的規模での通液操作にも十分耐えることが
できる。
架橋型ポリサツカライドの硫酸エステル化物としては、
架橋型セルロース（アミノ基を有する）を硫酸エステル
化した硫酸化セルロフアイン並びに架橋型キトサン（ア
ミ基を介して架橋）を硫酸エステル化した硫酸化キトパ
ール等を例示し得る。
架橋型セルロース（アミノ基を有する）を硫酸エステル
化した硫酸化セルロフアイン並びに架橋型キトサン（ア
ミ基を介して架橋）を硫酸エステル化した硫酸化キトパ
ール等を例示し得る。
これらの架橋型ポリサツカライドの硫酸エステル化物を
用いて乳からラクトフエリンを分離、精製するには、該
硫酸エステル化物を担体として充填したカラムに原料乳
を通液するか、もしくは原料乳に上記硫酸エステル化物
を混合して撹拌することにより行うとよい。
用いて乳からラクトフエリンを分離、精製するには、該
硫酸エステル化物を担体として充填したカラムに原料乳
を通液するか、もしくは原料乳に上記硫酸エステル化物
を混合して撹拌することにより行うとよい。
本発明では、硫酸エステル化物との接触は50℃以下の温
度、好ましくは室温で行い、原料乳のカラムへの通液に
よりカラムに対する非吸着画分を溶出させた後、0.3M食
塩水もしくは0.3M食塩を含むpH5.0〜9.0のリン酸ナトリ
ウム、トリス‐HCl、アムモニア‐HCl又はベロナール等
の0.01M〜0.02M緩衝液でカラムを洗浄し、次いで0.4M〜
1.5M食塩水、好ましくは1.0M食塩水もしくは1.0M食塩水
を含む上記緩衝液を通液してカラムに吸着しているラク
トフエリンを溶出することにより、乳からラクトフエリ
ンを分離できる。
度、好ましくは室温で行い、原料乳のカラムへの通液に
よりカラムに対する非吸着画分を溶出させた後、0.3M食
塩水もしくは0.3M食塩を含むpH5.0〜9.0のリン酸ナトリ
ウム、トリス‐HCl、アムモニア‐HCl又はベロナール等
の0.01M〜0.02M緩衝液でカラムを洗浄し、次いで0.4M〜
1.5M食塩水、好ましくは1.0M食塩水もしくは1.0M食塩水
を含む上記緩衝液を通液してカラムに吸着しているラク
トフエリンを溶出することにより、乳からラクトフエリ
ンを分離できる。
または、原料乳と硫酸エステル化物を混合した後に該エ
ステル化物をデカンテーションもしくは遠心分離により
回収する。このエステル化物を0.3M食塩水又は0.3M食塩
水を含むpH5.0〜9.0の緩衝液で洗浄し、再びデカンテー
ションもしくは遠心分離してエステル化物を回収する。
このエステル化物に0.4〜1.5Mの食塩水もしくは0.4〜1.
5Mの食塩水を含む上記緩衝液を加え、よく洗った後に静
置する。デカンテーション又は遠心分離によつて上澄液
を回収することにより乳からラクトフエリンを分離し得
る。
ステル化物をデカンテーションもしくは遠心分離により
回収する。このエステル化物を0.3M食塩水又は0.3M食塩
水を含むpH5.0〜9.0の緩衝液で洗浄し、再びデカンテー
ションもしくは遠心分離してエステル化物を回収する。
このエステル化物に0.4〜1.5Mの食塩水もしくは0.4〜1.
5Mの食塩水を含む上記緩衝液を加え、よく洗った後に静
置する。デカンテーション又は遠心分離によつて上澄液
を回収することにより乳からラクトフエリンを分離し得
る。
分離されたラクトフエリンは電気透折（ED）装置もしく
は逆浸透（RO）装置により脱塩した後、凍結乾燥して40
℃以下、好ましくは４℃で保存する。。なお、上記によ
りラクトフエリンを分離した後の上記エステル化物は2M
食塩水で洗浄し、さらに0.15M食塩水を通液することに
より再生できる。
は逆浸透（RO）装置により脱塩した後、凍結乾燥して40
℃以下、好ましくは４℃で保存する。。なお、上記によ
りラクトフエリンを分離した後の上記エステル化物は2M
食塩水で洗浄し、さらに0.15M食塩水を通液することに
より再生できる。
上述のようにして得られたラクトフエリンは、SDS電気
泳動図より、純度95％以上であることが確認される。
泳動図より、純度95％以上であることが確認される。
本発明において用いられる原料乳としては、ヒト並びに
牛や山羊等の哺乳動物の初乳、移行乳、常乳、末期乳等
を例示でき、さらに低温殺菌した乳及びホエー等も使用
できる。
牛や山羊等の哺乳動物の初乳、移行乳、常乳、末期乳等
を例示でき、さらに低温殺菌した乳及びホエー等も使用
できる。
発明の効果 本発明に従つて、これらの原料乳からラクトフエリンを
分離、精製すると、従来法にみられる操作や工程の煩雑
さに起因する処理時間の長いこと及び回収率の低いこと
等の問題が解決される。
分離、精製すると、従来法にみられる操作や工程の煩雑
さに起因する処理時間の長いこと及び回収率の低いこと
等の問題が解決される。
すなわち、本発明によるとラクトフエリンを高純度でか
つ高収率で回収できる。特に、本発明では、物理的安定
性の優れた架橋型ポリサツカライド硫酸エステル化物の
みを用いて乳中のラクトフエリンを吸着するものである
から、従来のヘパリンを固定化したアフイニテイ−クロ
マトグラフイ−用担体を用いる場合にみられるようなヘ
パリンが担体から脱落する等の懸念もなく、さらに、上
記吸着したラクトフエリンも食塩水のみの使用で容易に
溶出できるので、分離操作を極めて効率に行うことがで
きる。
つ高収率で回収できる。特に、本発明では、物理的安定
性の優れた架橋型ポリサツカライド硫酸エステル化物の
みを用いて乳中のラクトフエリンを吸着するものである
から、従来のヘパリンを固定化したアフイニテイ−クロ
マトグラフイ−用担体を用いる場合にみられるようなヘ
パリンが担体から脱落する等の懸念もなく、さらに、上
記吸着したラクトフエリンも食塩水のみの使用で容易に
溶出できるので、分離操作を極めて効率に行うことがで
きる。
また、本発明で用いる架橋型ポリサツカライド硫酸エス
テル化物は、資源的に豊富なセルロースやキチンを原料
とする架橋型ポリサツカライドを硫酸エステル化して得
られるので、大量に調製でき安価に入手し得る利点があ
る。
テル化物は、資源的に豊富なセルロースやキチンを原料
とする架橋型ポリサツカライドを硫酸エステル化して得
られるので、大量に調製でき安価に入手し得る利点があ
る。
さらに、本発明に従つて分離、精製されたラクトフエリ
ンは、その鉄結合能をWoodworthらの方法〔「プロタイ
ドス バイオロジカル フルーイドス プロシーデイン
グ コロキユーム」（Protides Biol.Fluids Proc.Coll
oq.）14,37（19669〕に準じて測定した結果、ラクトフ
エリン1g当り1.3〜2.1mgの鉄結合能を示すことから、本
来の鉄結合能を完全に保有していることが立証される。
したがつて、本発明により得られるラクトフエリンは、
鉄要求性病原菌に由来する乳児の感染防御のための予防
薬及び該病原菌によつてもたらされる各症状の治療薬と
して利用できる。
ンは、その鉄結合能をWoodworthらの方法〔「プロタイ
ドス バイオロジカル フルーイドス プロシーデイン
グ コロキユーム」（Protides Biol.Fluids Proc.Coll
oq.）14,37（19669〕に準じて測定した結果、ラクトフ
エリン1g当り1.3〜2.1mgの鉄結合能を示すことから、本
来の鉄結合能を完全に保有していることが立証される。
したがつて、本発明により得られるラクトフエリンは、
鉄要求性病原菌に由来する乳児の感染防御のための予防
薬及び該病原菌によつてもたらされる各症状の治療薬と
して利用できる。
更に、本発明では前記方法により分離、精製したラクト
フエリン溶液に、直接塩化第二鉄を混合し良く撹拌した
後、そのままFD装置又はRO装置に通すことにより、鉄飽
和型ラクトフエリンを簡易に分離することができるの
で、特にラクトフエリンの腸管での鉄吸収の促進にも有
効に利用できる。因に、鉄飽和型ラクトフエリンが腸管
からの鉄の吸収を向上させる効果を有することは報告さ
れている〔Cox,T.M.et at「バイオケミア バイオフイ
ジクス アクタ」（Biochim.Biophys.Acta）588,120（1
979）〕。
フエリン溶液に、直接塩化第二鉄を混合し良く撹拌した
後、そのままFD装置又はRO装置に通すことにより、鉄飽
和型ラクトフエリンを簡易に分離することができるの
で、特にラクトフエリンの腸管での鉄吸収の促進にも有
効に利用できる。因に、鉄飽和型ラクトフエリンが腸管
からの鉄の吸収を向上させる効果を有することは報告さ
れている〔Cox,T.M.et at「バイオケミア バイオフイ
ジクス アクタ」（Biochim.Biophys.Acta）588,120（1
979）〕。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。
実施例１ 市販の架橋セルロースであるセルロフアイン（商品名）
を常法により無水硫酸で硫酸エステル化した硫酸化セル
ロフアイン50mlを、直径2cm、長さ20cmのカラムに充填
し、このカラムに脱脂したヒト初乳50mlを10ml/min.で
通液した。次いでカラムを0.3M食塩水300mlで洗浄した
後、1.0M食塩水100mlでカラムに吸着しているラクトフ
エリンを溶出した。得られたラクトフエリン溶液を十分
量の脱イオン水に対して透折を行つた後、凍結乾燥して
ヒトラクトフエリン110mgを得た。回収したヒトラクト
フエリンの純度は、SDSポリアクリルアミドゲル電気永
動図より97％と測定され、鉄結合量は血清鉄測定キツト
（和光純薬社製）により0.2mg Fe/g蛋白質であつた。ま
た、総鉄結合能はWoodworthの方法により、100％と算定
された。
を常法により無水硫酸で硫酸エステル化した硫酸化セル
ロフアイン50mlを、直径2cm、長さ20cmのカラムに充填
し、このカラムに脱脂したヒト初乳50mlを10ml/min.で
通液した。次いでカラムを0.3M食塩水300mlで洗浄した
後、1.0M食塩水100mlでカラムに吸着しているラクトフ
エリンを溶出した。得られたラクトフエリン溶液を十分
量の脱イオン水に対して透折を行つた後、凍結乾燥して
ヒトラクトフエリン110mgを得た。回収したヒトラクト
フエリンの純度は、SDSポリアクリルアミドゲル電気永
動図より97％と測定され、鉄結合量は血清鉄測定キツト
（和光純薬社製）により0.2mg Fe/g蛋白質であつた。ま
た、総鉄結合能はWoodworthの方法により、100％と算定
された。
実施例２ 市販の架橋型キトサンであるキトパール（商品名）を常
法により無水硫酸で硫酸エステル化した硫酸エステル化
キトパール１を、直径8cm、長さ20cmのカラムに充填
し、このカラムに脱脂した牛乳50を20/hr.で通液し
た。次いでカラムを0.3M食塩水５で洗浄した後、1.0M
食塩水３でカラムに吸着しているラクトフエリンを溶
出した。得られたラクトフエリン溶液を小型のED装置
（TS-210、徳山ソーダ社製）を用いて脱塩した後、UF装
置（DH-2、アミコン社製）で10倍に濃縮して凍結乾燥し
た。
法により無水硫酸で硫酸エステル化した硫酸エステル化
キトパール１を、直径8cm、長さ20cmのカラムに充填
し、このカラムに脱脂した牛乳50を20/hr.で通液し
た。次いでカラムを0.3M食塩水５で洗浄した後、1.0M
食塩水３でカラムに吸着しているラクトフエリンを溶
出した。得られたラクトフエリン溶液を小型のED装置
（TS-210、徳山ソーダ社製）を用いて脱塩した後、UF装
置（DH-2、アミコン社製）で10倍に濃縮して凍結乾燥し
た。
回収したラクトフエリンは6gであり、純度は95％と測定
され、また、その鉄結合量は0.2mg Fe/g蛋白質を測定さ
れ、総鉄結合能は98％であることが確認された。
され、また、その鉄結合量は0.2mg Fe/g蛋白質を測定さ
れ、総鉄結合能は98％であることが確認された。
実施例３ 本例は、ラクトフエリンの分離、精製を、バツチ方式に
より原料乳と硫酸エステル化物を混合して行う態様を示
したものである。
より原料乳と硫酸エステル化物を混合して行う態様を示
したものである。
実施例例２において使用した硫酸化キトパールに2.0M食
塩水と、更に0.15M食塩水を通液して該硫酸化キトパー
ルを再生した。
塩水と、更に0.15M食塩水を通液して該硫酸化キトパー
ルを再生した。
この再生硫酸化キトパール１とチーズホエー100と
を１時間撹拌下に混合し、次いでゲル状の混合物を0.3M
食塩水５で洗浄した後、1.0M食塩水３で上記ゲル状
混合物に吸着しているラクトフエリンを溶出した。得ら
れたラクトフエリン溶液に塩化第二鉄50mgを添加し、よ
く撹拌して逆浸透装置（MRG 10型、三菱レーヨン社製）
で脱塩及び濃縮（10倍）した後、凍結乾燥し、鉄飽和型
ウシラクトフエリン4.8gを得た。回収したウシラクトフ
エリンは純度95％であり、鉄結合量は1.3mg Fe/g蛋白質
と測定され、鉄の飽和度が93％以上であると確認され
た。
を１時間撹拌下に混合し、次いでゲル状の混合物を0.3M
食塩水５で洗浄した後、1.0M食塩水３で上記ゲル状
混合物に吸着しているラクトフエリンを溶出した。得ら
れたラクトフエリン溶液に塩化第二鉄50mgを添加し、よ
く撹拌して逆浸透装置（MRG 10型、三菱レーヨン社製）
で脱塩及び濃縮（10倍）した後、凍結乾燥し、鉄飽和型
ウシラクトフエリン4.8gを得た。回収したウシラクトフ
エリンは純度95％であり、鉄結合量は1.3mg Fe/g蛋白質
と測定され、鉄の飽和度が93％以上であると確認され
た。
Claims (3)
- 【請求項１】架橋型ポリサツカライドの硫酸エステル化
物に、ラクトフエリン含有原料乳を接触させてラクトフ
エリンを吸着させ、次いで吸着ラクトフエリンを溶出す
ることを特徴とする乳からラクトフエリンを分離、精製
する方法。 - 【請求項２】架橋型ポリサツカライドの硫酸エステル化
物から成るアフイニテイ−カラムに、ラクトフエリン含
有原料乳を通して接触させる特許請求の範囲第（１）項
記載の方法。 - 【請求項３】吸着ラクトフエリンを0.4〜1.5M食塩水を
含む緩衝液で溶出した後、電気透析もしくは逆浸透に付
して脱塩する特許請求の範囲第（１）項又は第（２）項
のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62088450A JPH0725800B2 (ja) | 1987-04-10 | 1987-04-10 | 硫酸エステル化物を用いて乳からラクトフエリンを分離、精製する方法 |
| DE8888903358T DE3874527T2 (de) | 1987-04-10 | 1988-04-07 | Trenn- und reinigungsverfahren fuer laktoferrin von milch unter verwendung einer sulfatverbindung. |
| US07/273,337 US4997914A (en) | 1987-04-10 | 1988-04-07 | Method for separating and purifying lactoferrin from milk by use of sulfuric ester |
| PCT/JP1988/000353 WO1988008006A1 (en) | 1987-04-10 | 1988-04-07 | Process for separating and purifying lactoferrin from milk using sulfate compound |
| EP88903358A EP0348508B1 (en) | 1987-04-10 | 1988-04-07 | Process for separating and purifying lactoferrin from milk using sulfate compound |
| NZ224200A NZ224200A (en) | 1987-04-10 | 1988-04-08 | Adsorption of lactoferrin from milk |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62088450A JPH0725800B2 (ja) | 1987-04-10 | 1987-04-10 | 硫酸エステル化物を用いて乳からラクトフエリンを分離、精製する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63255300A JPS63255300A (ja) | 1988-10-21 |
| JPH0725800B2 true JPH0725800B2 (ja) | 1995-03-22 |
Family
ID=13943137
Family Applications (1)
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