JP2818056B2

JP2818056B2 - 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤

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Publication number: JP2818056B2
Application number: JP3186260A
Authority: JP
Inventors: 守冨田; 興三川瀬; 光徳高瀬; ベラミーウェイン; 恒治山内; 裕之若林
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1991-07-25
Publication date: 1998-10-30
Anticipated expiration: 2013-10-30
Also published as: US5304633A; NZ239683A; CA2050786C; EP0474506A1; CA2050786A1; AU8370491A; AU645342B2; JPH0592994A; EP0474506B1; DE69129395D1; DK0474506T3; DE69129395T2

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、抗菌性ペプチドおよ
び抗菌剤に関するものである。さらに詳しくは、この発
明は、新規な抗菌性ペプチド、このペプチドの塩、また
はそれらの２以上の混合物を有効成分として含有する抗
菌剤、この抗菌剤を用いて物品を処理する方法、および
このペプチドの塩、またはそれらの２以上の混合物を有
効成分として含有する抗菌性ペプチド配合物に関するも
のである。

【０００２】本明細書において、アミノ酸およびペプチ
ドはアイユーピーエーシー−アイユービー生化学命名委
員会（IUPAC-IUB CBN ）で採用された略記法に基づいて
表示され、例えば次の略号が使用される。 Ala-：L-アラニン残基 Arg-：L-アルギニン残基 Asn-：L-アスパラギン残基 Asp-：L-アスパラギン酸残基 Cys-：L-システイン残基 Gln-：L-グルタミン残基 Glu-：L-グルタミン酸残基 Gly-：L-グリシン残基 His-：L-ヒスチジン残基 Ile-：L-イソロイシン残基 Leu-：L-ロイシン残基 Lys-：L-リジン残基 Met-：L-メチオニン残基 Phe-：L-フェニルアラニン残基 Pro-：L-プロリン残基 Ser-：L-セリン残基 Thr-：L-スレオニン残基 Trp-：L-トリプトファン残基 Tyr-：L-チロシン残基 Val-：L-バリン残基

【０００３】

【従来の技術】従来より、種々の微生物に対して抗菌作
用を有するペプチドについては多数の発明が知られてい
る。例えば、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に有効な
ホスホノトリペプチド（特開昭57-106689 号公報）、ホ
スホノジペプチド誘導体（特開昭58-13594号公報）、環
状ペプチド誘導体（特開昭58-213744 号公報）、抗菌お
よび抗ウイルス作用を示すペプチド（特開昭59-51247号
公報）、酵母に有効なポリペプチド（特開昭60-130599
号公報）、グラム陽性菌に有効な糖ペプチド誘導体（特
開昭60-172998 号公報、特開昭61-251699 号公報、特開
昭63-44598号公報）、グラム陽性菌に有効なオリゴペプ
チド（特開昭62-22798号公報）、ペプチド系抗生物質
（特開昭62-51697号公報、特開昭63-17897号公報）、そ
の他北米産カブトガニの血球から抽出した抗菌性ペプチ
ド（特開平2-53799 号公報）、蜜蜂の血リンパから単離
した抗菌性ペプチド（特表平2-500084号公報）等が知ら
れている。

【０００４】一方、ラクトフェリンは涙、唾液、末梢
血、乳汁等に含まれている天然の鉄結合性蛋白質であ
り、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌等の有害
微生物に対して抗菌作用を示すことが知られている［ジ
ャーナル・オブ・ペディアトリクス（Journal of Pedia
trics ）、第９４巻、第１ページ、1979年］。また、ヒ
トのラクトフェリンについては詳細な研究が行われ、そ
の全アミノ酸配列が、メツ・ブティーグ (Mezt-Boutigu
e)ら［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー（Eouropean Jounal of Biochemistry）、第１４
５巻、第６５９〜６７６ページ、１９８４年］により報
告されているが、抗菌性を有するラクトフェリン加水分
解物のアミノ酸配列については知られていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】この発明の発明者等
は、望ましくない副作用等（例えば、抗原性等）がな
く、耐熱性があり、かつ強い抗菌作用を有する物質を自
然界から安価に単離することを企図し、チーズ製造時の
副産物であるホエーに着目し、この中に含まれているラ
クトフェリンの抗菌性について研究を行い、ラクトフェ
リンを酸又は酵素により加水分解した分解物が未分解の
ラクトフェリンよりも強い耐熱性および抗菌性を有する
ことを見出し、既に特許出願を行った（特願平2-13315
号。以下先願と記載する）。

【０００６】しかしながら、このようなラクトフェリン
の加水分解物中に存在する抗菌性物質については、その
組成および作用についての解明が十分ではなく、このた
め、有効な抗菌剤の開発にまでは到っていなかった。こ
の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたもので
あり、従来技術および先願発明の課題を解消し、ラクト
フェリンの加水分解物から単離することのできる特定の
アミノ酸配列を有する新規な抗菌性ペプチドと、このペ
プチドを有効成分として含有する抗菌剤、この抗菌剤を
用いて物品を処理する方法、およびこのペプチドを有効
成分として含有する抗菌性ペプチド配合物を提供するこ
とを目的としている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、少なくとも下記のアミノ酸配列
を含む抗菌性ペプチド、少なくとも下記のアミノ酸配列
を含むペプチド、それらの薬理学的または食品学的に許
容される塩類、およびそれらの２以上の混合物からなる
群より選択される物質を有効成分として含有することを
特徴とする抗菌剤、この抗菌剤を用いて物品を処理する
方法、および少なくとも下記アミノ酸配列を含むペプチ
ド、その薬理学的または食品学的に許容される塩類、お
よびそれらの２以上の混合物からなる群より選択される
物質を有効成分として含有することを特徴とするペプチ
ド配合物を提供する。

【０００８】

【０００９】以下、この発明の構成および作用、効果に
ついて詳しく説明する。この発明のペプチドは、常法に
より化学的に合成することもできるが、例えば哺乳類の
ラクトフェリンから次のようにして単離することができ
る。すなわち、哺乳類（例えば、人、牛、水牛、馬、山
羊、羊等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、これらの
処理物である脱脂乳、ホエー等（以下これらを乳等と記
載する）からイオン交換クロマトグラフィー等の常法に
より分離したラクトフェリン、ラクトフェリンから鉄を
除去したアポラクトフェリン、アポラクトフェリンに
鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属をキレートさせた金属
飽和ラクトフェリン（以下これらをまとめてＬＦと記載
する）を、例えば、酸または酵素で加水分解し、得られ
た加水分解物（以下この加水分解物をＬＦ加水分解物と
記載する）からペプチドを単離することができる。

【００１０】酸によりＬＦ加水分解物を得る場合は、Ｌ
Ｆを0.1 〜２０％（重量。以下特に断りのない限り同
じ）、望ましくは５〜１５％の濃度で水、精製水等に溶
解し、得られた溶液に塩酸、リン酸等の無機酸、または
クエン酸等の有機酸を添加し、溶液のpHを１〜４に調整
する。このpHを調整した溶液を、適当な温度で所定時間
加熱し、ＬＦを加水分解する。例えば、pHを１〜２に調
整した場合は８０〜130 ℃で、pH２〜４に調整した場
合は100 〜130 ℃でそれぞれ１〜120 分間加熱する。次
いで反応液を常法により冷却し、必要に応じて中和し、
脱塩し、脱色することもできる。

【００１１】酵素によりＬＦ加水分解物を得る場合は、
ＬＦを0.5 〜２０％、望ましくは５〜１５％の濃度で
水、殺菌水、精製水等に溶解し、酵素を添加し、加水分
解を行う。使用する酵素には特に制限はなく、市販の
品、例えばモルシンＦ（商標。盛進製薬社製。至適pH2.
5 〜3.0 ）、豚ペプシン（和光純薬社製。至適pH２〜
３）、スミチームＡＰ（商標。新日本化学社製。至適pH
3.0 ）、アマノＡ（商標。天野製薬社製。至適pH7.0
）、トリプシン（ノボ社製。至適pH8.0 ）等のエンド
ペプチダーゼを単独または任意に組合わせて使用する。
更にこれらの酵素に、例えば特公昭48-43878号公報記載
の方法により得られる乳酸菌由来のエキソペプチダー
ゼ、ペプチダーゼを含有する市販のしょう油酵素（田辺
製薬社製）を組合わせて使用してもよい。使用する酵素
の量は基質に対して0.1 〜5.0 ％の範囲とする。

【００１２】ＬＦ溶液のpHを使用する酵素の至適pH付近
に調整し、酵素を添加し、１５〜５５℃、望ましくは３
０〜５０℃で、３０〜600 分間、望ましくは６０〜30
0 分間保持してＬＦを加水分解する。次いで反応液をそ
のままあるいは中和し、常法により酵素を加熱失活さ
せ、必要に応じて中和し、脱色することもできる。この
ようにして得たＬＦ加水分解物から通常のクロマトグラ
フ法等を用いて、この発明の抗菌性ペプチドを単離する
ことができる。例えば、ＴＳＫゲルＯＤＳ120 Ｔ（東ソ
ー社製）を用いた高速液体クロマトグラフ法では、アセ
トニトリルのグラジエントで所定の分画に溶出させ、単
離することができる。

【００１３】以上のようにしてＬＦ加水分解物からこの
発明の抗菌性ペプチドを単離することができる。単離し
た抗菌性ペプチドは試験例２，４，６および８に示すよ
うに、いずれも次のＡまたはＢのアミノ酸配列を共通に
含んでおり、これらの共通アミノ酸配列以外の部分のア
ミノ酸配列が変化しても抗菌性に差異は認められなかっ
た（試験例１，３，５および７を参照）。

【００１４】

【００１５】この発明の抗菌性ペプチドを化学的に合成
する例を示せば次のとおりである。ペプチド自動合成装
置（例えば、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社
製。ＬＫＢ Biolynk 4170）を用い、シェパード等［ジ
ャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキン
Ｉ（Journal of Chemical Society Perkin Ｉ）、第53
8 ページ、1981年］による固相ペプチド合成法に基づい
て合成する。アミン官能基を９−フルオレニルメトキシ
カルボニル（Fmoc）基で保護したアミノ酸（以下Fmoc-
アミノ酸と略記する）に、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシル
カルボジイミドを添加して所望のアミノ酸の無水物を生
成させ、このFmoc−アミノ酸無水物を合成に用いる。ペ
プチド鎖を製造するためにＣ−末端のアミノ酸残基に相
当するFmoc- アミノ酸無水物を、そのカルボキシル基を
介し、ジメチルアミノピリジンを触媒としてウルトロシ
ンＡ樹脂（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社
製）に固定する。次いでこの樹脂をピペリジンを含むジ
メチルホルムアミドで洗浄し、Ｃ−末端アミノ酸のアミ
ン官能基の保護基を除去する。のち所望のペプチドのア
ミノ酸配列のＣ−末端から２番目のアミノ酸残基に相当
するFmoc−アミノ酸無水物を前記Ｃ−末端アミノ酸残基
を介して樹脂に固定された１番目のアミノ酸の脱保護ア
ミン官能基にカップリングさせる。以下同様にして順次
所望のアミノ酸を固定する。ただし、システインについ
てはアセトアミドメチルによりＳＨ基を保護したFmoc−
アミノ酸を用いる。全部のアミノ酸のカップリングが終
了し、所望のアミノ酸配列のペプチド鎖が形成された
後、溶媒（例えば、９４％トリフルオロ酢酸、５％フェ
ノールおよび１％エタンジオールからなる）でアセトア
ミドメチル以外の保護基の除去およびペプチドの脱離を
行い、高速液体クロマトグラフ法によりアセトアミドメ
チル化ペプチドを精製する。次いで、このアセトアミド
メチル化ペプチドを0.5mM の濃度で９０％酢酸水溶液に
溶解し、その1/4 量の１Ｍ塩酸を添加し、８倍量の５０
mMヨードを含む９０％酢酸水溶液を添加し、３０分間激
しく撹拌する。のち1/22.5量の１Ｍチオ硫酸ナトリウム
水溶液を添加して反応を停止し、1/3 の容積に濃縮す
る。この濃縮液をセファデックス−Ｇ１５（ファルマシ
ア社製）により分画し、ＳＳ結合を形成したペプチドを
精製する。

【００１６】以上のようにして合成したペプチドは、試
験例９に示すように天然から単離したペプチドと同様に
抗菌性を有していた。酵素で加水分解して得られた抗菌
性ペプチドおよび合成して得られた抗菌性ペプチドのジ
スルフィド結合の形成を防止するため、チオール基を常
法により化学的に修飾（例えばピリジルエチル化）した
下記のペプチドも同様に抗菌性を有している（試験例１
１）。 Lys-Cys*-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-G
ly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys*-Val- および Lys-Cys*-Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-A
rg-Gly-Pro-Pro-Val-Ser-Cys*-Ile- （上記アミノ酸配列においてCys*- は、チオール基を化
学的に修飾したシステインを示す）得られた抗菌性ペプチド、それらの薬理学的または食品
学的に許容される塩類、またはそれらの２種以上の混合
物を有効成分として少なくとも５ppm 、望ましくは１０
〜５０ppm の濃度で含有させ、この発明の抗菌剤、また
は抗菌性ペプチド配合物を得ることができる。

【００１７】この発明による抗菌性ペプチドまたはその
誘導体は、そのまま人または動物に投与することがで
き、あるいは食品（例えば、チュウインガム等）、医薬
品（例えば、目薬、乳房炎治療剤、下痢防止剤、水虫薬
等）、医薬部外品（例えば、口中洗浄剤、制汗剤、養毛
剤等）、各種化粧品（例えば、整髪料、クリーム、乳液
等）、各種歯磨用品（例えば、歯磨、歯ブラシ等）、各
種生理用品、各種ベビー用品（例えば、オムツ等）、各
種高齢者用品（例えば、入れ歯固定剤、オムツ等）、各
種洗剤（例えば、石鹸、薬用石鹸、シャンプー、リン
ス、洗濯用洗剤、キッチン用洗剤、住宅用洗剤等）、各
種除菌用品（例えば、キッチン用除菌ペーパー、トイレ
ット用除菌ペーパー等）、飼料（例えば、ペットフード
等）、それらの原料となる素材、その他一般に微生物の
増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる物品に添加、配
合、噴霧、付着、被覆、含浸等を行ってもよく、又その
他一般に微生物の増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる
物品の処理に用いることができる。

【００１８】この発明による抗菌性ペプチドまたはその
誘導体は、他の抗菌剤と併用して使用することができ、
そのまま人または動物に投与することができ、あるいは
食品（例えば、チュウインガム等）、医薬品（例えば、
目薬、乳房炎治療剤、下痢防止剤、水虫薬等）、医薬部
外品（例えば、口中洗浄剤、制汗剤、養毛剤等）、各種
化粧品（例えば、整髪料、クリーム、乳液等）、各種歯
磨用品（例えば、歯磨、歯ブラシ等）、各種生理用品、
各種ベビー用品（例えば、オムツ等）、各種高齢者用品
（例えば、入れ歯固定剤、オムツ等）、各種洗剤（例え
ば、石鹸、薬用石鹸、シャンプー、リンス、洗濯用洗
剤、キッチン用洗剤、住宅用洗剤等）、各種除菌用品
（例えば、キッチン用除菌ペーパー、トイレット用除菌
ペーパー等）、飼料（例えば、ペットフード等）、それ
らの原料となる素材、その他一般に微生物の増殖の防
止、抑制が望まれるあらゆる物品に添加、配合、噴霧、
付着、被覆、含浸等を行ってもよく、又その他一般に微
生物の増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる物品の処理
に用いることができる。

【００１９】次に、試験例を示してこの発明を詳述す
る。（試験例１）この試験は、牛のＬＦの酵素加水分解物か
ら単離した抗菌性ペプチドの抗菌活性を調べるために行
った。（１）試験方法前培養液の調製大腸菌(Escherichia coli)の保存スラントから１白金耳
を採取し、標準寒天培地（日水製薬社製）に塗抹して３
５℃で１６時間好気培養し、標準寒天培地の表面に生育
したコロニーを白金耳でかき取り、滅菌生理食塩水に懸
濁し、分光光度計（日立製作所製）で測定した濁度（測
定波長660nm ）を1.0 に調整し、前培養液を調製した。基本培地の調製バクトカジトン（ディフコラボラトリー社製）を１％の
濃度で、精製水に溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウムでpHを
7.0 に調整し、115 ℃で１５分間滅菌し、基本培地（液
体培地）を調製した。試験培地および対照培地の調製各試料を0.01％の濃度で精製水に溶解し、滅菌フィルタ
ー（アドバンテック社製）で除菌し、１，５，１０，５
０、および100ppmの濃度で基本培地に添加した試験培地
および無添加の対照培地を調製した。抗菌性試験上記試験培地および対照培地に上記前培養液を１％の濃
度で接種し、３５℃で１６時間好気培養し、培養液の濁
度を上記と同様の方法で測定し、次式から大腸菌の増殖
阻止率を算出した。

【００２０】増殖阻止率(%) ＝ 100（１−A/B ）ここで、Ａは試験培養液の濁度差（培養１６時間後の試
験培養液の濁度と培養前の試験培養液の濁度との差）
を、Ｂは対照培地の濁度差（培養１６時間後の対照培養
液の濁度と培養前の対照培養液の濁度との差）をそれぞ
れ示す。尚、増殖阻止率の百分率は重量によるものでは
ない（以下同じ）。（２）試料の調製および試験結果実施例１と同一の方法により調製した牛のＬＦのペプシ
ン加水分解物の透明な上清を、精製水により約２％（Ｗ
／Ｖ）に希釈し、その100 μlを、予め、0.05％のトリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む２０％アセトニトリル溶
液で平衡化したＴＳＫゲルＯＤＳ−120 Ｔ（4.6 ×150
mm）を用いたクロマトグラフィーにかけ、0.8 ml／分の
流速で１０分後から３０分間、0.05％のＴＦＡを含む２
０〜６０％のアセトニトリルのリニアグラジエントで溶
出し、ＬＦ加水分解物注入５分後から１分毎に溶出液を
集め、図１に示した溶出曲線を得た。この図１はリニア
グラジェント高速液体クロマトグラフィーにより溶出し
た分画の280nm における吸光曲線であり、横軸は時間
（分）を、右縦軸はアセトニトリルの濃度を、破線はア
セトニトリルの濃度変化をそれぞれ示している。この操
作を１０回反復し、各画分を真空乾燥し、それぞれの画
分について抗菌性を前記試験方法により試験した結果、
溶出液採取後２４〜２５分の画分にのみ５ppm の濃度で
抗菌性効果が認められた。

【００２１】そこでこの画分を、精製水により２％（Ｗ
／Ｖ）に溶解し、その100 μlを予め0.05％のトリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）を含む２０％アセトニトリル溶液で
平衡化したＴＳＫゲルＯＤＳ−120 Ｔ（4.6 ×150 mm）
を用いたクロマトグラフィーにかけ、0.8 ml／分の流速
で１０分後から３０分間、0.05％のＴＦＡを含む２４〜
３２％のアセトニトリルのリニアグラジエントで溶出
し、６つの画分を集め、図２に示した溶出曲線を得た。
この図２はリニアグラジエント高速液体クロマトグラフ
ィーにより溶出した分画の280nm における吸光曲線であ
り、横軸は時間（分）を、右縦軸はアセトニトリルの濃
度を破線はアセトニトリルの濃度変化をそれぞれ示し、
図中１〜６の数字はピークの番号を示している。この操
作を１０回反復し、各画分を真空乾燥し、それぞれの画
分について抗菌性を前記試験方法により試験した。その
結果、表１に示したようにピーク６にのみ５ppm の濃度
で抗菌性効果を認めた。なお、ピーク２，４および５は
収量がすくなかったので、100ppmの添加量の試験は行わ
なかった。

【００２２】

【表１】

【００２３】（試験例２）この試験は試験例１で単離し
た抗菌性ペプチドのアミノ酸配列を決定するために行っ
た。試験例１で得たペプチドを６Ｎ塩酸で加水分解し、
アミノ酸分析計を用いて常法によりアミノ酸組成を分析
した。同一の試料を気相シークェンサー（アプライド・
バイオシステムズ社製）を用いて２５回のエドマン分解
を行い、２５個のアミノ酸残基の配列を決定した。また
ＤＴＮＢ（５，５−ジチオービス（２−ニトロベンゾイ
ック・アシド））を用いたジスルフィド結合分析法［ア
ナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Bioc
hemistry）、第６７巻、第493 ページ、1975年］により
ジスルフィド結合が存在することを確認した。

【００２４】その結果、このペプチドは、２５個のアミ
ノ酸残基からなり、３番目と２０番目のシステイン残基
がジスルフィド結合し、３番目のシステイン残基からＮ
−末端側に２個のアミノ酸残基が、２０番目のシステイ
ン残基からＣ−末端側に５個のアミノ酸残基が、それぞ
れ結合した次のアミノ酸配列を有していた。

【００２５】

【００２６】（試験例３）この試験は、牛のＬＦの酸加
水分解物から単離した抗菌性ペプチドの抗菌活性を調べ
るために行った。（１）試料の調製実施例２と同一の方法により牛のＬＦ加水分解物から２
種のペプチドを単離した。（２）試験方法試験例１と同一の方法によった。（３）試験結果この試験の結果を表２に示した。実施例２と同一の方法
により分解した２種のペプチド（クロマトグラフィーに
より２１〜２２分に溶出したペプチド１および２９〜３
０分に溶出したペプチド２）にのみ５ppm の濃度で抗菌
性効果が認められた。

【００２７】

【表２】

【００２８】（試験例４）この試験は試験例３で単離し
た抗菌性ペプチドのアミノ酸配列を決定するために行っ
た。試験例３と同一の方法により単離した抗菌性ペプチ
ドを試験例２と同一の方法により試験を行い、次の２種
のペプチドのアミノ酸配列を決定した。

【００２９】その結果、一つは、３８個のアミノ酸残基
からなり、１６番目と３３番目のシステイン残基がジス
ルフィド結合し、１６番目のシステイン残基からＮ−末
端側に１５個のアミノ酸残基が、３３番目のシステイン
残基からＣ−末端側に５個のアミノ酸残基が、それぞれ
結合していた。

【００３０】

【００３１】他の一つは、３２個のアミノ酸残基からな
り、１０番目と２７番目のシステイン残基がジスルフィ
ド結合し、１０番目のシステイン残基からＮ−末端側に
９個のアミノ酸残基が、２７番目のシステイン残基から
Ｃ−末端側に５個のアミノ産残基が、それぞれ結合して
いた。

【００３２】

【００３３】（試験例５）この試験は、人のＬＦのペプ
シン加水分解物から単離した抗菌性ペプチドの抗菌活性
を調べるために行った。（１）試料の調製実施例３と同一の方法により人のＬＦ加水分解物からペ
プチドを単離した。（２）試験方法試験例１と同一の方法によった。（３）試験結果実施例３と同一の方法により分離したペプチドにのみ抗
菌性効果が認められ、このペプチドを１，５，１０，５
０および100ppmの濃度で添加したときの増殖阻止率は、
それぞれ３，８６，100 ，100 および100 ％であった。（試験例６）この試験は試験例５で単離した抗菌性ペプ
チドのアミノ酸配列を決定するために行った。

【００３４】試験例５と同一の方法により単離した抗菌
性ペプチドを試験例２と同一の方法により試験を行い、
次のアミノ酸配列を決定した。その結果、このペプチド
は、４７個のアミノ酸残基からなり、９番目と２６番目
のシステイン残基がジスルフィド結合し、９番目のシス
テイン残基からＮ−末端側に８個のアミノ酸残基および
Ｃ−末端側に１０個のアミノ酸残基が結合し、Ｃ−末端
側の３５番目のシステイン残基がジスルフィド結合して
システイン残基を含む１１個のアミノ酸残基と結合して
いた。この配列は、Ｎ−末端から１１番目のアラニン残
基と１２番目のバリン残基との結合が酵素により切断さ
れているが、前記メツ・ブティーグ(Mezt-Boutigue)ら
が報告した公知のヒトラクトフェリンのＮ−末端から４
７番目までのアミノ酸配列と完全に一致していた。

【００３５】

【００３６】（試験例７）この試験は、人のＬＦのＶ８
プロテアーゼ加水分解物から単離した抗菌性ペプチドの
抗菌活性を調べるために行った。（１）試料の調製実施例４と同一の方法により人のＬＦ加水分解物からペ
プチドを単離した。（２）試験方法試験例１と同一の方法によった。（３）試験結果実施例４と同一の方法により分離したペプチドにのみ抗
菌性効果が認められ、このペプチドを１，５，１０，５
０および100ppmの濃度で添加したときの増殖阻止率は、
それぞれ７，９３，100 ，100 および100 ％であった。（試験例８）この試験は試験例７で単離した抗菌性ペプ
チドのアミノ酸配列を決定するために行った。

【００３７】試験例７と同一の方法により単離した抗菌
性ペプチドを試験例２と同一の方法により試験を行い、
次のアミノ酸配列を決定した。その結果、このペプチド
は、２５個のアミノ酸残基からなり、４番目と２１番目
のシステイン残基がジスルフィド結合し、４番目のシス
テイン残基からＮ−末端側に３個のアミノ酸残基が、２
１番目のシステイン残基からＣ−末端側に４個のアミノ
酸残基が、それぞれ結合していた。

【００３８】

【００３９】（試験例９）この試験は、試験例２においてアミノ酸配列を決定した
ペプチドと同一のペプチドを、化学的に合成し、その抗
菌活性を調べるために行った。（１）試料の調製実施例５と同一の方法によりペプチドを合成した。（２）試験方法試験例１と同一の方法によった。（３）試験結果この試験の結果、化学的に合成したペプチドは牛のＬＦ
加水分解物から単離したペプチドである試験例２のペプ
チドと同等の抗菌性を示した。（試験例１０）この試験は、試験例９においてペプチドを合成する過程
で生成するアセトアミドメチル化ペプチドの抗菌性を調
べるために行った。

【００４０】実施例５と同一の方法によりアセトアミド
メチル化ペプチドを合成し、試験例１と同一の方法によ
り試験した結果、アセトアミドメチル化ペプチドも５pp
m の濃度で抗菌活性を示した。（試験例１１）この試験は、ジスルフィド結合を開裂し
たペプチドの抗菌性を調べるために行った。

【００４１】試験例１と同一の方法により調製したペプ
チドをフルマー等の方法［アナリティカル・バイオケミ
ストリー(Analytical Biochemistry) 、第142 巻、第33
6 頁、1984年］により還元し、ピリジルエチル化した。
このペプチドを試験例１と同一の方法により試験した結
果、５ppm の濃度で抗菌活性を示した。（試験例１２）この試験は、この発明の抗菌性ペプチドの抗菌スペクト
ルを調べるために行った。 (1) 試料の調製実施例１と同一の方法により抗菌性ペプチドを調製し、
使用前にフィルター（0.45μm マイレックス・フィルタ
ー）で瀘過して除菌した。 (2) 試験方法表３および表４に示した各種微生物を、１％バクトペプ
トン（ディフコ・ラボラトリー社製）からなるペプトン
培地２ml、および１％バクトペプトン（ディフコ・ラボ
ラトリー社製）、１％グルコースおよび0.05％酵母エキ
ストラクトからなるＰＹＧ培地２mlで１６から２０時間
培養した。各培地には０〜６０μｇ／mlの各種割合で抗
菌性ペプチドを添加した。対数期の各種微生物の標準菌
株を１０⁶／mlの菌濃度で各培地に接種し、表の注に記
載した菌株以外は３７°Ｃで培養した。各種微生物の成
育状態を660nm の吸光度を測定して試験した。各種微生
物の成育を完全に阻止した抗菌性ペプチドの最小濃度を
最小増殖阻止濃度（ＭＩＣ．μｇ／ml）とした。 (3) 試験結果この試験の結果は、表３および表４に示したとおりであ
る。表３および表４から明らかなように、抗菌性ペプチ
ドは、好気性および嫌気性の細菌を含む多種類のグラム
陽性細菌、グラム陰性細菌、および酵母に対して４５μ
ｇ／ml以下の低濃度で抗菌作用を示した。完全に微生物
の成育を阻止する抗菌性ペプチドの濃度は、培地により
異なっていた。試験した微生物の中でPseudomonas fluo
rescensIFO-141602およびEnterococcus faecalis ATCC-
E19433 は、この試験条件で抗菌性ペプチドに耐性を示
した。

【００４２】なお、この発明の他の抗菌性ペプチドにつ
いてもほぼ同様の結果が得られた。

【００４３】

【表３】

【００４４】

【表４】

【００４５】（試験例１３）この試験は、各種微生物の生残性に及ぼすこの発明の抗
菌性ペプチドの影響を調べるために行った。 (1) 試料の調製実施例１と同一の方法により抗菌性ペプチドを調製し
た。 (2) 試験方法表５および表６に示した各種微生物の対数期の菌を、試
験例１２と同一のＰＹＧ培地に懸濁し、抗菌性ペプチド
を添加しない対照と３１μｇ／mlの割合で添加した試料
とについてウォーターバスで３０℃に保持して振盪培養
機を用いて培養した。６０分後、試験例１２と同一のペ
プトン培地で１０倍毎に希釈した培養液を調製し、寒天
平板培地または形成したコロニーの測定のために適当な
他の培地を用いて菌数を測定し、各種微生物について対
照に対する抗菌性ペプチド添加試料の百分率を算出して
生残率を試験した。 (3) 試験結果この試験の結果は、表５および表６に示したとおりであ
る。表５および表６から明らかなように、抗菌性ペプチ
ドは、好気性および嫌気性の細菌を含む多種類のグラム
陽性細菌、グラム陰性細菌、および酵母に対して抗菌作
用を示した。

【００４６】抗菌性ペプチドの抗菌性は、３１μｇ／ｍ
ｌの濃度で６０分以内に完全に微生物のコロニー形成能
の喪失により示された。試験した微生物の中でPseudomo
nasfluorescens IFO-141602 およびBifidobacterium b
ifidum ATCC-15695は、この試験条件で抗菌性ペプチド
に耐性を示した。なお、この発明の他の抗菌性ペプチド
についてもほぼ同様の結果が得られた。

【００４７】

【表５】

【００４８】

【表６】

【００４９】（試験例１４）この試験は、この発明の抗菌性ペプチドの黴に対する効
果を調べるために行った。 (1) 試料の調製実施例１と同一の方法により抗菌性ペプチドを調製し、
使用前にフィルター（0.45μm マイレックス・フィルタ
ー）で瀘過して除菌した。 (2) 試験方法バクトペプトン（ディフコ・ラボラトリー社製）１％、
グルコ−ス４％、寒天１．５％よりなるSabouraud の斜
面培地４ｍｌに表７に示した黴を接種し、２５℃で１週
間培養した。この培地上に１％ペプトン水１ｍｌを積層
し、ボルテックスにより撹拌し、胞子を回収した。胞子
懸濁液２０μｌを１％バクトペプトン（ディフコ・ラボ
ラトリー社製）からなるペプトン培地２ｍｌ、および１
％バクトペプトン（ディフコ・ラボラトリー社製）、１
％グルコースおよび0.05％酵母エキストラクトからなる
ＰＹＧ培地２ｍｌで２０時間培養した。各培地には０〜
６０μｇ／ｍｌの各種割合で抗菌性ペプチドを添加し
た。初菌数はRose bengal を0.005%を添加したSabourau
d の寒天培地により測定し、２０時間後に菌糸の生育が
認められない濃度を最小発育阻止濃度（ＭＩＣ．μｇ／
ｍｌ）とした。 (3) 試験結果この試験の結果は、表７に示したとおりである。表７か
ら明らかなように、抗菌性ペプチドは、各種の黴に対し
て４５μｇ／ｍｌ以下の低濃度で抗菌作用を示した。完
全に黴の成育を阻止する抗菌性ペプチドの濃度は、培地
により異なっていた。試験した黴の中でAspergillus fu
migatus JCM1739TおよびRhizopus oryzae は、この試験
条件で抗菌性ペプチドに耐性を示した。なお、この発明
の他の抗菌性ペプチドについてもほぼ同様の結果が得ら
れた。

【００５０】

【表７】

【００５１】（試験例１５）実施例１と同一の方法によ
り製造した抗菌性ペプチドを０．００１％の濃度で精製
水に溶解し、ティシュペーパーを浸漬し、お手ふき用ウ
エットティシュペーパー（試料）を製造した。精製水に
ティシュペーパーを浸漬して同様に製造したお手ふき用
ウエットティシュペーパーを対照とした。

【００５２】大腸菌Ｏ−１１１株を１０⁶／mlの菌濃度
で含む水溶液０．３mlを、滅菌したシャーレに入れ、風
乾した。このシャーレを試料又は対照で１回清拭し、の
ちこのシャーレに滅菌水５mlを加え、この滅菌水中に生
残している大腸菌を、常法により普通寒天培地で培養し
て測定した。その結果、試料で清拭したシャーレでは４
２個の大腸菌が測定されたのに対して、対照で清拭した
シャーレでは３８，０００個の大腸菌が測定され、抗菌
性ペプチド水溶液に浸漬したウエットティシュペーパー
は、格段の殺菌効果を示した。

【００５３】次に実施例を示してこの発明をさらに詳し
く説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定され
るものではない。

【００５４】

【実施例】

実施例１市販の牛のＬＦ（シグマ社製）５０mgを精製水0.9 mlに
溶解し、0.1 Ｍ塩酸でpHを2.5 に調整し、のち市販の豚
ペプシン（シグマ社製）１mgを添加し、３７℃で６時間
加水分解した。次いで 0.1 Ｎ水酸化ナトリウムでpHを
7.0 に調整し、８０℃で１０分間加熱して酵素を失活さ
せ、室温に冷却し、15,000rpm で３０分間遠心分離し、
透明な上清を得た。この上清100 μｌをＴＳＫゲルＯＤ
Ｓ−120Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグ
ラフィーにかけ、0.8 ml／分の流速で試料注入後１０分
間0.05％ＴＦＡを含む２０％アセトニトリルで溶出し、
のち３０分間0.05％ＴＦＡを含む２０〜６０％のアセト
ニトリルのグラジエントで溶出し、２４〜２５分の間に
溶出する画分を集め、真空乾燥した。この乾燥物を２％
（Ｗ／Ｖ）の濃度で精製水に溶解し、再度ＴＳＫゲルＯ
ＤＳ−120 Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマト
グラフィーにかけ、0.8 ml／分の流速で試料注入後１０
分間0.05％ＴＦＡを含む２４％アセトニトリルで溶出
し、のち３０分間0.05％ＴＦＡを含む２４〜３２％のア
セトニトリルのグラジエントで溶出し、33.5〜35.5分の
間に溶出する画分を集めた。上記の操作を２５回反復
し、真空乾燥し、抗菌性ペプチド約1.5 mgを得た。実施例２市販の牛のＬＦ（ベルギーのオレオフィナ社製）５０mg
を精製水0.95mlに溶解し、１Ｍ塩酸でpHを2.0 に調整
し、120 ℃で１５分間加熱して加水分解し、室温に冷却
した。次いで0.1 Ｎ水酸化ナトリウムでpHを7.0 に調整
し、15,000rpm で３０分間遠心分離し、透明な上清を得
た。この上清100 μｌをＴＳＫゲルＯＤＳ−120 Ｔ（東
ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーにか
け、0.8 ml／分の流速で試料注入後１０分間0.05％ＴＦ
Ａを含む２０％アセトニトリルで溶出し、のち３０分間
0.05％ＴＦＡを含む２０〜６０％のアセトニトリルのグ
ラジエントで溶出し、２３〜２５分の間に溶出する画分
を集め、真空乾燥した。この乾燥物を２％（Ｗ／Ｖ）の
濃度で精製水に溶解し、再度ＴＳＫゲルＯＤＳ−120 Ｔ
（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーに
かけ、0.8 ml／分の流速で試料注入後１０分間0.05％Ｔ
ＦＡを含む２４％アセトニトリルで溶出し、のち３０分
間0.05％ＴＦＡを含む２４〜３２％のアセトニトリルの
グラジエントで溶出し、２１〜２２分および２９〜３０
分の間に溶出する画分を集めた。上記の操作を２５回反
復し、真空乾燥し、抗菌性ペプチド約３mgを得た。実施例３市販の人のＬＦ（シグマ社製）２０mgを精製水1.0 mlに
溶解し、0.1 Ｎ塩酸でpHを2.5 に調整し、のち市販の豚
ペプシン（シグマ社製）0.5 mgを添加し、３７℃で５時
間加水分解した。次いで0.1 Ｎ水酸化ナトリウムでpHを
7.0 に調整し、８０℃で１０分間加熱して酵素を失活さ
せ、室温に冷却し、15,000rpm で３０分間遠心分離し、
透明な上清を得た。この上清100 μｌをＴＳＫゲルＯＤ
Ｓ−120Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグ
ラフィーにかけ、0.8 ml／分の流速で試料注入後１０分
間0.05％ＴＦＡを含む２０％アセトニトリルで溶出し、
のち３０分間0.05％ＴＦＡを含む２０〜６０％のアセト
ニトリルのグラジエントで溶出し、２３〜２４分の間に
溶出する画分を集め、真空乾燥した。この乾燥物を２％
（Ｗ／Ｖ）の濃度で精製水に溶解し、再度ＴＳＫゲルＯ
ＤＳ−120 Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマト
グラフィーにかけ、0.8 ml／分の流速で試料注入後１０
分間0.05％ＴＦＡを含む２４％アセトニトリルで溶出
し、のち３０分間0.05％ＴＦＡを含む２４〜３２％のア
セトニトリルのグラジエントで溶出し、２８〜３１分の
間に溶出する画分を集めた。上記の操作を１０回反復
し、真空乾燥し、抗菌性ペプチド約１mgを得た。実施例４市販の人のＬＦ（シグマ社製）５０mgを１０mMリン酸緩
衝液0.95mlに溶解し、市販のＶ８プロテアーゼ（ベーリ
ンガーマンハイム社製）1.5 mgを添加し、３７℃で８時
間加水分解した。次いで 0.1 Ｎ水酸化ナトリウムでpH
を7.0 に調整し、８０℃で１０分間加熱して酵素を失活
させ、室温に冷却し、15,000rpm で３０分間遠心分離
し、透明な上清を得た。この上清100 μｌをＴＳＫゲル
ＯＤＳ−120 Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマ
トグラフィーにかけ、0.8 ml／分の流速で試料注入後１
０分間0.05％ＴＦＡを含む２０％のアセトニトリルで溶
出し、のち３０分間0.05％ＴＦＡを含む２０〜６０％の
アセトニトリルのグラジエントで溶出し、２３〜２４分
の間に溶出する画分を集め、真空乾燥した。この乾燥物
を２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で精製水に溶解し、再度ＴＳＫ
ゲルＯＤＳ−120 Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体ク
ロマトグラフィーにかけ、0.8 ml／分の流速で試料注入
後１０分間0.05％ＴＦＡを含む２４％のアセトニトリル
で溶出し、のち３０分間0.05％ＴＦＡを含む２４〜３２
％のアセトニトリルのグラジエントで溶出し、25.5〜2
6.5分の間に溶出する画分を集めた。上記の操作を２５
回反復し、真空乾燥し、抗菌性ペプチド約３mgを得た。実施例５ペプチド自動合成装置（ファルマシアＬＫＢバイオテク
ノロジー社製。商標。ＬＫＢ Biolynk 4170）を用い、
試験例２でアミノ酸配列を決定したペプチドを合成し
た。390 mgのFmoc−フェニルアラニン無水物を、そのカ
ルボキシル基を介し、ジメチルアミノピリジンを触媒と
してウルトロシンＡ樹脂（ファルマシアＬＫＢバイオテ
クノロジー社製）に固定した。次いでこの樹脂をピペリ
ジンを含むジメチルホルムアミドで洗浄し、Ｃ−末端ア
ミノ酸のアミン官能基の保護基を除去し、のちＣ−末端
から２番目のアミノ酸残基のFmoc−アラニン無水物156
mgを前記フェニルアラニン残基の脱保護アミン官能基に
カップリングさせる。以下システインについてはアセト
アミドメチル化したFmoc−アミノ酸を使用する以外は同
様にして順次所望のアミノ酸を固定し、Ｃ−末端から２
５番目のフェニルアラニン残基のカップリングが終了
し、所望のアミノ酸配列のペプチド鎖が形成された後、
溶媒（９４％トリフルオロ酢酸、５％フェノールおよび
１％エタンジオールからなる）で保護基の除去およびペ
プチドの脱離を行い、高速液体クロマトグラフ法により
精製し、真空乾燥し、約150 mgのアセトアミドメチル化
ペプチドを得た。この150 mgのアセトアミドメチル化ペ
プチドを１０mlの９０％酢酸水溶液に溶解し、2.5 ml
の１Ｍ塩酸を添加し、更に９０％酢酸水溶液に溶解した
５０mMヨード溶液を100 ml添加し、３０分間激しく攪拌
し、１Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液５mlを添加し、反応
を停止させ、ロータリーエバポレーターで約４０mlに濃
縮した。この濃縮液をセファデックスＧ−１５（ファル
マシア社製）カラム（５０×500 mm）を用いて精製し、
のち真空乾燥し、抗菌性ペプチド約７０mgを得た。実施例６実施例１と同一の方法で得た抗菌性ペプチド１mgを、
メチルセルロース０．５g および精製水１００mlの混合
液に溶解し、抗菌剤を製造した。実施例７実施例４と同一の方法で得た抗菌性ペプチド５mlを、
エチルアルコール２０mlおよび精製水８０mlの混合液に
溶解し、抗菌剤を製造した。実施例８次の組成の点眼薬を製造した。

【００５５】ホウ酸１．９（％）実施例１の抗菌性ペプチド０．２メチルセルロース０．５実施例９次の組成の口中洗浄液を製造した。この口中洗浄液は、
使用時水で５０〜１００倍に希釈して使用する。

【００５６】エチルアルコール２０．０（％）サッカリンナトリウム３．０実施例２の抗菌性ペプチド１．０精製水７６．０実施例１０次の組成のチューインガムを製造した。

【００５７】ガムベース２５．００（％）炭酸カルシウム２．００香料１．００実施例３の抗菌性ペプチド０．０３ソルビトール粉末７１．９７実施例１１次の組成の制汗スプレーを製造した。

【００５８】ｌ−メントール２．０（％）プロピレングリコール０．４エチルアルコール３．５フロン１１３０．０フロン１２４８．０ジエチルエーテル１６．０実施例５の抗菌性ペプチド０．１実施例１２次の組成の歯磨を製造した。

【００５９】ソルビトール４７．０（％）グリセリン１５．０カルボキシメチルセルロース・ナトリウム２．０ソルビタン脂肪酸エステル１．０サッカリンナトリウム１．０実施例１の抗菌性ペプチド０．１実施例１３次の組成の皮膚洗浄液を製造した。この皮膚洗浄液は、
使用時水で５０倍に希釈して使用する。

【００６０】塩化ナトリウム８．０（％）実施例２の抗菌性ペプチド１．０精製水９１．０実施例１４次の組成の防黴剤を製造した。

【００６１】エチルアルコール２０．００（％）実施例５の抗菌性ペプチド０．０１精製水７９．９９実施例１５次の組成の切り花用保存剤を製造した。この切り花用保
存剤は、使用時水で１００倍に希釈して使用する。

【００６２】アビセル９０．０（％）食塩９．０実施例１の抗菌性ペプチド１．０

【００６３】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明の
抗菌性ペプチドは、天然のＬＦおよびＬＦ加水分解物よ
りも顕著にすぐれた抗菌作用を、広範囲の微生物に対し
て有しているので、広範囲の用途を有しており、しかも
少量で抗菌効果を呈するため、食品等に使用した場合に
も風味への影響がほとんどない。

【図面の簡単な説明】

【図１】高速液体クロマトグラフィーによる抗菌性ペプ
チドの溶出曲線である。

【図２】高速液体クロマトグラフィーによる抗菌性ペプ
チドの溶出曲線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山内恒治神奈川県鎌倉市玉縄４−２−２ガーデンハイツ鎌倉玉縄405 (72)発明者若林裕之神奈川県横浜市旭区南希望ヶ丘118 森永希望ヶ丘寮 (56)参考文献特表昭62−501472（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−56273（ＪＰ，Ａ) Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．, （1990）18（13）ｐ．4013 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/79 A23L 3/3526 501 C07K 7/08 ZNA A61K 38/00 ADZ C12P 21/06 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記（ａ）ないし（ｄ）からなる群より
選択されるアミノ酸配列を含む２０から４７アミノ酸残
基からなる抗菌性ペプチド。 ┌──────────S ────S───────────── Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser- ─────┐ Ile-Thr-Cys-Val- ：（ａ） Lys-Cys^*-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser- Ile-Thr-Cys^*-Val- ：（ｂ） ┌──────────S ────S ───────────── Lys-Cys-Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg-Gly-Pro-Pro- ─────┐ Val-Ser-Cys-Ile- ：（ｃ）および Lys-Cys^*-Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg-Gly-Pro-Pro- Val-Ser-Cys^*-Ile- ：（ｄ）（ここで Cys^*- は、ジスルフィド結合の形成を防止す
るため、チオール基を化学的に修飾したシステインを示
す）
【請求項２】請求項１の抗菌性ペプチド、その薬理学
的、食品学的に許容される塩類、およびそれらの２以上
の混合物からなる群より選択される物質を有効成分とし
て少なくとも５ｐｐｍ（重量）の濃度で含有することを
特徴とする抗菌性ペプチド配合食品。
【請求項３】請求項１の抗菌性ペプチド、その薬理学
的、食品学的に許容される塩類、およびそれらの２以上
の混合物からなる群より選択される物質を有効成分とし
て少なくとも５ｐｐｍ（重量）の濃度で含有することを
特徴とする抗菌性ペプチド配合口中洗浄液。
【請求項４】請求項１の抗菌性ペプチド、その薬理学
的、食品学的に許容される塩類、およびそれらの２以上
の混合物からなる群より選択される物質を有効成分とし
て少なくとも５ｐｐｍ（重量）の濃度で含有することを
特徴とする抗菌性ペプチド配合制汗スプレー。
【請求項５】請求項１の抗菌性ペプチド、その薬理学
的、食品学的に許容される塩類、およびそれらの２以上
の混合物からなる群より選択される物質を有効成分とし
て少なくとも５ｐｐｍ（重量）の濃度で含有することを
特徴とする抗菌性ペプチド配合歯磨。