TWI614022B - 降低黑色素含量的胜肽、方法及組合物 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種用於在哺乳類個體中降低黑色素含量的單離的胜肽。 該單離的胜肽係由SSASTTED(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列所組成。本發明亦提供用於在哺乳類個體中抑制黑色素生成的方法及組合物。

Description

降低黑色素含量的胜肽、方法及組合物

本發明整體而言關於一種於哺乳類個體中抑制黑色素生成或降低黑色素含量的胜肽，以及其方法及其組合物。

人類色素沉著最顯著的原因係由於皮膚及頭髮中黑色素的合成及分佈。因此，在皮膚和頭髮的顏色主要取決於存在的色素種類及其濃度。

美國第6,579,848號專利係關於刺鼠訊號蛋白及胜肽以及其醫藥組合物及它們在抑制黑色素細胞的黑色素生成的方法上的用途。美國第8,669,238號專利揭示一種用於治療過度色素沉著的方法，包投予一組合物至患有過度色素沉著之個體，該組合物包含至少一種選自於由下列所組成之群組之抑制劑：驅動蛋白Kif13A抑制劑、AP-1連接物複合體次單元的抑制劑、以及AP-1連接物複合體次單元或AP-1連接物複合體與驅動蛋白Kif13A之間的交互作用的抑制劑。美國第8,455,023號專利係關於香桂(Cinnamomum subavenium)萃取物以及其藉由抑制黑色素生成在美白美容中的用途。

本發明係非預期地發現序列為SSASTTED(SEQ ID NO：1)的胜肽可有效地在哺乳類個體中抑制或降低黑色素生成。

因此，在一方面，本發明提供一種單離的胜肽，用於在哺乳類個體中抑黑色素生成或降低哺乳個體的黑色素細胞的黑色素含量。該單離的胜肽係由SEQ ID NO：1的氨基酸序列所組成。

另一方面，本發明提供一種用於在哺乳類個體中抑制黑色素生成或降低哺乳個體的黑色素細胞的黑色素含量的方法，其包含對該個體或該黑色素細胞投予有效量的根據本發明的單離的胜肽。在本發明的較佳具體實施例中，該單離的胜肽係局部地投予至該個體。

又一方面，本發明提供一種用於在哺乳類個體中抑制黑色素生成或降低哺乳個體的黑色素細胞的黑色素含量的組合物。該組合物包含有效量的單離的胜肽，其係由SEQ ID NO：1的氨基酸序列所組成。根據本發明的特定具體實施例，該組合物可進一步包含一可接受的載體，且可調製為局部用製劑。

應理解的是，前述的一般性說明及以下的詳細說明皆僅為例示性及解釋性的，並不限制本發明。

配合附圖一起閱讀將可更佳地理解前述的發明內容，以及下述的詳細說明。為了說明本發明的目的，在圖式中顯示目前較佳的具體實施例。

在圖式中：圖1A顯示在細胞中由本發明的胜肽所致的減少的黑色素生成。以10-50μg/ml的SEQ ID NO：1之胜肽處理B16F10黑色素瘤細胞5天，並於第3天更換培養基。將細胞及培養基收集於試管中。已知麴酸對於酪胺酸酶活性的抑制效果，因此，在細胞試驗中以其做為陰性對照組。已知IBMX可增進細胞內 cAMP的含量，進而刺激黑色素生成，因此，在細胞試驗中，以其做為陽性對照組。

圖2A顯示細胞中的黑色素含量。圖2B顯示黑色素在培養基中的分泌情況。每次測量皆為三重複，數據以平均值±S.D.表示。相較於對照組，*p<0.05。

圖3顯示由本發明胜肽所增加的酪氨酸酶活性。相較於對照組，*p<0.05。

圖4顯示DOPA染色的結果。

在一方面，本發明提供一種用於在哺乳類個體中抑制黑色素生成或降低哺乳類個體的黑色素細胞的黑色素含量的單離的胜肽，該單離的胜肽係由SSASTTED(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列所組成。

另一方面，本發明提供一種用於在哺乳類個體中抑制黑色素生成或降低哺乳類個體的黑色素細胞的黑色素含量的方法。該方法包含以下步驟：將該單離的SEQ ID NO：1之胜肽，可在該哺乳類個體中有效抑制黑色素生成的量，或以可有效降低該黑色素細胞的黑色素含量的量，投予至該哺乳類個體或該哺乳類個體的黑色素細胞。較佳地，該單離的胜肽係局部地投予。

又一方面，本發明提供一種組合物，其包含一有效量的由SEQ ID NO：1的氨基酸序列所組成的單離的胜肽。本發明之組合物可用於抑制黑色素生成或降低哺乳類個體的黑色素細胞中的黑色素含量。該組合物可用於化妝品用途，例如，皮膚美白。

在本發明的特定具體實施例中，該組合物進一步包含一(生理上)可接受的載體。

在特定較佳具體實施例中，本發明的組合物係調製為局部用製劑。

除非另有定義，本文使用的所有技術及科學術語具有與本領域技術人員對於本發明所屬領域的理解相同的含義。

用語「一」或「一個」在申請專利範圍及/或說明書中與術語「包括」一起使用時，其意思為「一個」，但其亦與「一或多個」、「至少一個」、以及「一或多於一個」的含義一致。

語「胜肽」在本文中係以其常規含義而被使用，亦即為一種聚合物，其單體為氨基酸，並藉由醯胺鍵而互相連結在一起，另可選擇地，其係指多肽(polypeptide)。當該氨基酸為α-氨基酸時，可使用L-光學異構物或D-光學異構物。此外，亦可包含非天然的氨基酸，例如，β-丙氨酸、苯甘氨酸及高精氨酸。使用氨基酸的標準縮寫。

本文中所使用的術語「載體」係指一般用於調製可增進穩定性、無菌性、遞送性的藥物或化妝品組合物的材料。當胜肽遞送系統調製為一種溶液或懸浮液時，該遞送系統係於一可接受載體中，較佳地為水性載體。可使用多種水性載體，例如，水、緩衝液、0.8%鹽水、0.3%甘氨酸、透明質酸等。該組合物可含有如所需要而可接近生理條件的生理上可接受的輔助物質，例如pH調整及緩衝劑、溶液張力調節劑、潤濕劑及其類似物，例如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、山梨醇酐單月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。

術語「局部的」或「局部地」在本文中係以其常規含義而被使用，其係指可以在身體任何部位內或上的位置，包括但不限定於表皮、任何其他真皮、或任何其他身體組織。局部地投予或施予意指使該胜肽直接與組織接觸，例如含有黑色素生成細胞的皮膚或膜。

本發明思及使用單離的SEQ ID NO：1之胜肽作為針對各種用途的活性成分。在一較佳具體實施例中，本發明的單離的胜肽係與一可接受的載體組合而形成一種可置放於皮膚上的局部用製劑。局部用製劑可包括軟膏、乳液、糊劑、乳霜、凝膠、滴劑、塞劑、噴霧、液劑、洗髮劑、護髮劑、粉末及經皮貼片。根據需要，可使用增稠劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。較佳地，載體的功能為增加本發明胜肽的皮膚滲透性，並且在體內條件下應能將該胜肽遞送至黑色素細胞。對於本領域技術人員而言，合適的載體為習知，且其包括但不限於水、二甲基亞碸、乙醇、脂質體、液體石蠟、石蠟、二甲基甲醯胺、2-吡咯烷酮、油酸、以及品牌Azone®的滲透增進劑。

通過以下實例進一步說明本發明，所述實例係以提供例示性之目的提供而非限制。

實例

實例1：SEQ ID NO：1之胜肽抑制小鼠黑色素瘤細胞的黑色素生成

1. 材料與方法

1.1單離的SEQ ID NO：1之胜肽的製備

得自人類乳鐵蛋白且具有SSASTTED(SEQ ID NO：1)(796.75Da)氨基酸序列的胜肽係由生工有限公司(MDBio,Inc.)(台灣，台北)所合成。以高效 液相層析法(HPLC)及質譜儀確認該胜肽的純度及組成。使10mg的胜肽粉末溶解並與1ml的雙去離子水(ddH₂O)混合，而製得10mg/ml的SEQ ID NO：1胜肽樣本，將其儲存於-20℃下備用。

1.2 細胞培養

在37℃且含有5% CO₂的加濕空氣下，將B16F10小鼠黑色素瘤細胞培養於無酚紅而含10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素(100IU/50g/mL)的DMEM中。

1.3 黑色素含量檢測

根據Lee et al.,J Invest Dermatol 124,405-411,2005的方法稍加修改以測定培養的B16F10細胞中的黑色素含量。簡言之，將B16F10細胞種於6孔培養盤中(2×10⁴細胞/孔)，並培養過夜使細胞貼附。在培養箱中以各種測試樣本處理5天後，進行清洗、經胰蛋白酶處理並在丸粒化(pelleting)前計數。在1M NaOH中煮沸1小時後，定量每個細胞中的黑色素，並在400nm下從針對合成真黑色素的校正曲線讀取每個樣本的黑色素含量，並由3個獨立試驗中，將其轉換成黑色素pg/細胞的平均值±SE。

1.4 酪胺酸酶測定

酪胺酸酶是黑色素生成路徑的限速酶。其測定可提供針對黑色素生成的誘導程度的高特異性及靈敏性指標。根據Bellei et al.,J Biol Chem 285,7288-7299,2010的方法稍加修改以測定培養的B16F10細胞的酪氨酸酶酵素活性。簡言之，將B16F10細胞種於6孔培養盤中(2×10⁴個細胞/孔)，並培養過夜使細胞貼附。在培養箱中以各種測試樣本處理5天後，以PBS清洗細胞，之後使用胰蛋白酶收集細胞。達培養終點時，以含有1% Triton X-100的磷酸鹽緩衝液 (pH 6.8)使細胞溶解。然後藉由冷凍及解凍將細胞打破，在10,000×g下離心10分鐘使裂解液澄清。以裂解緩衝液進行蛋白質定量及調整蛋白質濃度後，將100μl的各裂解液(各含有相同量的蛋白質)等量分注於96孔盤中，然後將100μl的5mM L-DOPA添加至每孔中。在37℃下培養30分鐘後，以分光光度計測定在475nm下的吸光值。重複測定三次。

1.5 DOPA染色

亦進行DOPA染色以測定酪胺酸酶的酵素活性。將B16F10細胞種於6孔培養皿中(2×10⁴細胞/孔)，並培養過夜使細胞貼附。在培養箱中以各種測試樣本處理4天後，以PBS清洗細胞，再以2%多聚甲醛固定，並以PBS進一步清洗三次，在37℃下將細胞反應於0.1% DOPA(溶於0.1M的PBS中)中5小時，並以光學顯微鏡觀察(Wang et al.,Exp Ther Med 6,967-972,2013)。

2. 結果

2.1 對黑色素生成之影響

以50μg/ml的SEQ ID NO：1之胜肽處理的B16F10細胞培養物，顯示出較少的細胞色素沉著(圖1)。

2.2對黑色素含量之影響

以10及50μg/ml的SEQ ID NO：1之胜肽處理B16F10細胞顯示出顯著地降低的黑色素合成量(圖2A及圖2B)。

2.3 對於酪胺酸酶活性的效果

以10及50μg/ml的SEQ ID NO：1胜肽處理B16F10細胞顯示出顯著地降低的酪胺酸酶活性(圖3)，且細胞亦顯示出較弱的DOPA染色(圖4)。

本領域技術人員會理解在不脫離本發明的廣義發明概念的情況下，可修改上述具體實施例。因此，可理解的是，本發明並不局限於所揭示的特定具體實施例，而旨在於涵蓋由所附申請專利範圍所定義的本發明精神及範圍內的修飾。

<110> 肌活麗學創研所股份有限公司

<120> 降低黑色素生成的胜肽、方法及組合物

<130> 0766/REN0002TW

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Claims (10)

1. 一種用於抑制一哺乳動物個體中黑色素生成的經分離胜肽，其係由SEQ ID NO：1的氨基酸序列所構成。
2. 一種如申請專利範圍1的經分離胜肽用於製備皮膚美白製劑的用途。
3. 如申請專利範圍2的用途，其中黑色素的含量係藉由如申請專利範圍1的經分離胜肽抑制黑色素的生成而減少。
4. 如申請專利範圍2的用途，其中如申請專利範圍1的該經分離胜肽係局部地投予至該哺乳動物個體。
5. 一種用於抑制一哺乳動物個體中黑色素生成的組成物，其包含一有效劑量的如申請專利範圍1的經分離胜肽。
6. 如申請專利範圍5的組成物，其進一步包含一種生理上可接受的載體。
7. 如申請專利範圍5的組成物，其係被調製成一局部製劑。
8. 如申請專利範圍7的組成物，其中該局部製劑包含一種軟膏劑、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、噴霧劑或液劑。
9. 如申請專利範圍8的組成物，其中該局部製劑係一種洗劑或乳膏。
10. 如申請專利範圍8的組成物，其中該局部製劑係一種凝膠。