DE69004721T2

DE69004721T2 - Plasmodium-Merozoit-Rhoptry-Antigen und Derivate.

Info

Publication number: DE69004721T2
Application number: DE90104561T
Authority: DE
Inventors: Robert George Dr Ridley; John Graham Prof Dr Scaife
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: Saramane Pty Ltd
Priority date: 1989-03-14
Filing date: 1990-03-09
Publication date: 1994-03-17
Anticipated expiration: 2010-03-10
Also published as: GB2230009B; IL93659A0; PT93416A; AU5121590A; EP0388738B1; ES2059855T3; IE900891L; DE69004721D1; ATE97693T1; CA2011031A1; GB9005589D0; CA2011031C; DK0388738T3; AU633306B2; JPH0347088A; EP0388738A1; IE64212B1; GB2230009A; MY106275A; PT93416B

Description

Malaria wird bei Menschen durch vier Arten von Plasmodium verursacht, nämlich P. falciparum, P. vivax, P. ovale und P. malariae. Nach einem Bericht der Weltgesundheits-Organisation (WHO) aus dem Jahr 1986 gibt es weltweit fast 100 Millionen Fälle einer Malaria-Infektion. Von diesen sind etwa eine Million Fälle, meistens kleine Kinder, die mit P. falciparum infiziert sind, tödlich. Wegen des Auftretens von arzneimittelresistenten Parasiten und insektizidresistenten Moskitos verbreitet sich die Malaria (Bruce- Chwatt, Essential Malariology, 2. Ausgabe, Heinemann, London (1986)).
Technische Fortschritte in letzter Zeit haben Hoffnungen erzeugt, daß es bald möglich wäre, einen Antimalaria-Impfstoff herzustellen, der der wachsenden Verbreitung von Malaria entgegenwirken wurde. Erstens können neue Methoden für die Entwicklung von Malaria-Impfstoffen verwendet werden, z.B. das Klonieren von Genen und deren Expression in mikrobiellen Wirtsorganismen ebenso wie die Verwendung von monoklonalen Antikörpern zur Antigen-Identifizierung. Zweitens haben Langzeitkulturen von P. falciparum in menschlichen roten Blutkörperchen (Trager et al., Science 193, 673-675 (1976)) eine einfache Materialquelle für die Untersuchung des Malaria-Parasiten geliefert. Kürzlich wurde es möglich, alle Stadien des Lebenszyklus des Parasiten im Labor zu erhalten (Ponnudurai et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 76, 812-818 (1982); Mazier et al., Science 227, 440-442 (1985)).
Der natürliche Lebenszyklus von P. falciparum hat drei verschiedene Stadien. Im ersten Stadium schleppen Moskitos während der Nahrungsaufnahme Sporozoiten in die Blutgefäße von Wirbeltieren ein. Diese Sporozoiten wandern über den Blutstrom in die Leber und dringen in die Leberzellen des Wirts ein. Im zweiten Stadium entwickeln sich Merozoiten aus diesen Sporozoiten. Diese Merozoiten durchlaufen mehrere Vermehrungszyklen in Erythrozyten des Wirts und entwickeln dann Gametozyten. Die Gametozyten, die das geschlechtliche Stadium des Parasiten sind, werden von Moskitos aufgenommen, wenn sie fressen. Nach der Befruchtung im Magen des Insekts entwickeln sich die Gametozyten zu Sporozoiten, die dann zu den Speicheldrüsen des Insekts wandern. Von dort kann der Zyklus wieder beginnen.
Sporozoiten, Merozoiten und Gametozyten haben verschiedene Antigene (Scaife, Genetic Engineering 7, 57-90 [1988]). Impfstoffe können im Prinzip gegen irgendeines der verschiedenen Stadien des Malaria-Parasiten erzeugt werden. Verschiedene Merozoiten-Antigene wurden verwendet, um eine Immunität gegenüber Malaria zu induzieren. Keines dieser Antigene erwies sich als idealer Kandidat für einen Impfstoff. Hier wird nun ein neues Schizont/Merozoit-Antigen des Malaria-Parasiten vorgestellt. Dieses Antigen wird von zwei monoklonalen Antikörpern (MAB), die von Hall et al. beschrieben wurden (Mol. Biochem. Parasitol. 7, 247-265 [1983]), erkannt. Einer dieser monoklonalen Antikörper MAB 2.13 hemmt die Invasion von Malaria-Parasiten in Erythrozyten stark. Eine Westernblot-Analyse (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 [1979]) von Proteinextrakten von ganzen Parasiten unter Verwendung von MAB 2.13 lieferte vier Hauptbanden mit einer relativen Molekülmasse von 65 kD, 70 kD, 78 kD bzw. 80 kD, wobei 1 kD = 1.000 Dalton. Die Affinitätsreinigung des Proteinextraktes der ganzen Parasiten und die anschließende gelelektrophoretische Analyse lieferte zwei zusätzliche Banden mit einer relativen Molekülmasse von 40 kD und 42 kD. Am wahrscheinlichsten ist die Art mit 80 kD die natürliche Form des von MAB 2.13 erkannten Antigens, des sogenannten 2.13- Antigens, wohingegen die anderen Banden prozessierte Formen dieses Antigens darstellen. Ob die prozessierten Formen des Antigens auch in der Natur auftreten, z.B. in den Parasiten, ist nicht klar. Immunofluoreszenz-Untersuchungen zeigten, daß das Antigen, das von MAB 2.13 erkannt wird, verbunden ist mit den Rhoptry-Organellen von Plasmodium-Merozoiten. Genauer erkennt MAB 2.13 eine Determinante oder ein Epitop auf einem Polypeptid, das mit den Rhoptry-Organellen von Plasmodium-Merozoiten verbunden ist. Die Rhoptries eines Plasmodiums sind ein Paar birnenförmiger, für Elektronenstrahlen dichte Körper, die am apikalen Ende des Merozoiten angeordnet sind. Elektronenmikroskopische Untersuchungen haben ergeben, daß diese Organellen eine Schlüsselrolle bei der Invasion der Parasiten in Erythrozyten spielen. Es wurde gefunden, daß durch Blockierung dieser Determinante MAB 2.13 die Erythrozyten-Invasion hemmen kann. Der andere monoklonale Antikörper MAB 7.12 hat ähnliche Eigenschaften wie MAB 2.13, blockiert aber die Erythrozyten-Invasion nicht so effizient wie MAB 2.13.
Campbell et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 33, 1051-1054 [1984] beschrieben mit Rhoptry verbundene Antigene mit 78, 63, 42 und 40 kD, die in Proteinextrakten von Stämmen aus El Salvador und Malaysia des Parasiten P. falciparum vorhanden sind. Howard et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 33, 1055-1059 [1984] fanden Proteine mit 82, 70, 67, 39 und 37 kD in einem Immunpräzipitat aus Merozoiten eines vietnamesischen Stammes von P. falciparum. Schofield et al., Mol. Biochem. Parasitol. 18, 183-195 [1986] beschrieben vier monoklonale Antikörper, die Antigene erkennen, die in Rhoptries von P. falciparum-Merozoiten vorhanden sind. Eine Westernblot-Analyse eines Parasiten-Extraktes unter Verwendung dieser Antikörper lieferte Proteinbanden mit 80, 66 und 42 kD. Zwei der von Schofield et al. beschriebenen monoklonalen Antikörper können die Invasion von Erythrozyten durch Merozoiten in vitro hemmen. Clark et al. (Parasitol. Res. 73, 425-434 [1987]) beschrieben zwei Proteine mit einem Molekulargewicht von 82.000 Dalton bzw. 65.000 Dalton, die mit den Rhoptry-Organellen von Plasmodium falciparum Merozoiten verbunden sind. Braun-Breton et al. (Nature 332, 457-459 [1988]) zeigten, daß die Spaltung eines Phosphatidylinosit-Membranankers eine Serinprotease aktiviert, die mit der löslichen Form eines Membranproteins von Plasmodium falciparum verbunden ist mit einer relativen Molekülmasse von 76.000 Dalton, das in Merozoiten oder isolierten Schizont-Membranen vorhanden ist. In vitro-Untersuchungen haben gezeigt, daß diese Serin-Protease an dem Prozeß der Invasion der roten Blutkörperchen durch Malaria- Merozoiten beteiligt zu sein scheint und eine wichtige Rolle bei der Reifung der Merozoiten spielt. Es gibt keinen experimentellen Beweis, daß die in den obigen Literaturstellen beschriebenen Proteine in irgendeiner Weise mit dem Protein, das von den MAB's 2.13 oder 7.12 erkannt wird, in Beziehung stehen. Außerdem ist nicht bekannt, ob die in den obigen Literaturstellen beschriebenen Proteine solche Antikörper in einem Säugetierwirt induzieren können, die die Invasion von Erythrozyten durch die Merozoitenform des Malaria-Parasiten in vivo hemmen können, was für den Fall des 2.13-Antigens, und somit die Polypeptide, die zum ersten Mal in der vorliegenden Erfindung offenbart wurden (siehe Beispiel unten) gezeigt wurde.
Sobald die Gegenwart eines Antigens feststeht durch Erzeugung eines MAB's, der spezifisch mit diesem Antigen reagiert, ist man immer noch sehr weit weg von einer zweifelsfreien Definition des Antigens selbst, d.h. durch das Molekulargewicht der natürlichen Form des Antigens und die Aminosäurezusammensetzung oder vorzugsweise die Aminosäuresequenz. Dies ist hauptsächlich den geringen Mengen dieser Antigene in den Parasiten zuzurechnen und somit der Schwierigkeit, ausreichende Mengen des Proteins aus den Parasiten zu isolieren, die die Charakterisierung des Antigens zulassen. Dies hat zu Bemühungen geführt, das Gen, das das als Antigen von den MAB's 2.13 und 7.12 erkannte Protein codiert, molekular zu klonieren. Obwohl der Stand der Gentechnik heutzutage weit fortgeschritten ist, ist es noch nicht ohne weiteres möglich, ein spezifisches Gen aus einer Vielzahl von Genen, die in einem Organismus wie Plasmodium falciparum vorhanden sind, zu klonieren, insbesondere, wenn keine Sonde verfügbar ist, die aus einer Oligonukleotid- Sequenz besteht, die ein kurzes Segment des Gens darstellt. Wenn nur ein MAB zugänglich ist, muß zuerst eine Expressionsgenbank des Parasitengenoms erstellt werden, vorzugsweise eine lambda-Phagen-Expressionsgenbank, wie eine solche, die im Beispiel (unten) beschrieben wurde, worin die Parasiten-DNA in Form von Fusionspolypeptiden mit β-Galactosidase exprimiert wird. Die Expressionsgenbank wird dann auf Expressionsprodukte gescreent, die mit MAB 2.13 und/oder 7.12 reagieren und die DNA eines rekombinanten Phagen, der ein Polypeptid exprimieren kann, das die Epitope umfaßt, die von MAB 2.13 und/oder 7.12 erkannt werden, wird isoliert (Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194-1198 [1983]). Die Nukleotidsequenz, die das Polypeptid codiert, kann bestimmt werden unter Verwendung von auf diesem Gebiet wohlbekannten Methoden. Ein Beispiel einer solchen Nukleotidsequenz ist die Nukleotidsequenz (1):
Diese Nukleotidsequenz stellt eine Teil-Nukleotidsequenz dar von dem Gen, das das 2.13-Antigen codiert, das die Nukleotidsequenz (2) hat:
Unter Verwendung des genetischen Codes wurde gefunden, daß in der Nukleotidsequenz (1) zwei Leserahmen unterbrochen waren durch verschiedene Stopcodons und somit höchstwahrscheinlich kein P. falciparum-Polypeptid codieren. Der dritte Leserahmen, der mit den Nukleotiden 3 bis 5 begann, d.h. GAT als erstem Codon, das die Aminosäure Asparaginsäure codiert (abgekürzt "D" gemäß dem Einbuchstaben- System, das von Dayhoff in "Atlas of Protein Sequence and Structure", National Biomedical Research Foundation, Washington D.C., 1972 beschrieben wird) ist offen und codiert ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz (I):
Die Aminosäuresequenz (I) codiert ein Polypeptid mit 591 Aminosäureresten. Wenn die natürliche Form des P. falciparum-Antigens, die von den MAB's 2.13 und 7.12 erkannt wird, d.h. das 2.13-Antigen, tatsächlich ein Molekulargewicht von 80.000 Dalton hat, stellt die Aminosäuresequenz (I) etwa 3/4 der Aminosäuresequenz des Antigens dar. Aufgrund der für die Klonierung der DNA, die die Aminosäuresequenz (I) codiert, verwendeten Methode, muß die Aminosäuresequenz die antigene Determinante (=Epitop), die von MAB 2.13 erkannt wird, umfassen. Die antigene Determinante wird von einer spezifischen Molekülkonfiguration von einer oder mehreren Subsequenzen der Aminosäuresequenz des 2.13-Antigens oder dem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz (I) oder eine Teilsequenz davon enthält, gebildet, wobei die Teilsequenz die von MAB 2.13 erkannte Subsequenz umfaßt.
Die Nukleotidsequenz (2) codiert ein Polypeptid mit 782 Aminosäureresten und hat die folgende Aminosäuresequenz (II):
Das berechnete Molekulargewicht dieses Polypeptids steht in guter Übereinstimmung mit dem wahrscheinlichen Molekulargewicht, das für das von den MAB's 2.13 und 7.12 erkannte P. falciparum-Antigen bestimmt wurde, d.h. 80.000 Dalton.
Da die vorliegende Erfindung die Aminosäuresequenz des 2.13-Antigens liefert, wurde es nun möglich, große Mengen von Polypeptiden herzustellen, die die Aminosäuresequenz (II) oder Teilsequenzen davon umfassen, die die Aminosäuresequenz enthalten, die die antigene Determinante, die von MAB 2.13 erkannt wird, bilden, z.B. die Aminosäuresequenz (I). Diese Polypeptide können in im wesentlichen reiner Form hergestellt werden, d.h. frei von kontaminierenden von Malaria-Parasiten stammenden Materialien.
Zusätzlich zu den von MAB 2.13 erkannten Subsequenzen kann die Aminosäuresequenz (II) andere antigene Determinanten umfassen, die mit Determinanten des 2.13-Antigens der Rhoptry-Organellen von plasmodium-Merozoiten immunologisch kreuzreagieren können. Diese Determinanten des 2.13-Antigens können definiert werden, indem das 2.13-Antigen auf Merozoiten markiert wird, d.h. durch Verwendung des Lactoperoxidase-Harkierungs-Verfahrens (Hogg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 489-492 [1974]) oder durch ein anderes auf diesem Gebiet bekanntes Verfahren und die markierten Aminosäurereste bestimmt werden. Peptide, die die Aminosäurereste umfassen, die auf diese Weise bestimmt wurden, können als Impfstoffe gemäß dem in dem Europäischen Patent Nr. 44710 offenbarten Verfahren verwendet werden.
Die detaillierte dreidimensionale Struktur des 2.13-Antigens oder einer Subsequenz davon, die eine antigene Oberflächendeterminante bildet, kann durch computergestützte Röntgenstrahl- oder NMR-Analyse definiert werden. Auf Basis der Information über die Struktur, die auf diesem Weg erhalten wird, können neue Polypeptide entworfen werden, die eine Subsequenz umfassen, die etwa dieselbe dreidimensionale Struktur bildet und somit eine antigene Determinante nachahmt (für eine Übersicht siehe Blundell et al., Nature 326, 347-352 [1987]). Diese neuen Polypeptide können eine Aminosäuresequenz haben, die verschieden ist von der Aminosäuresequenz des 2.13-Antigens oder der Subsequenzen davon, die die antigene Oberflächendeterminante bilden, die oben erwähnt wurde. Einige dieser Aminosäurereste des neuen Polypeptids können auch modifiziert sein, um die dreidimensionale Konfiguration der Subsequenz, die die antigene Determinante bildet, zu stabilisieren. Da diese Subsequenz in dem neuen Polypeptid etwa die gleiche dreidimensionale Struktur hat, wie die antigene Determinante auf dem 2.13-Antigen, ergibt das neue Polypeptid eine immunologische Kreuzreaktion mit der auf dem 2.13-Antigen vorhandenen Determinante.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung antigene Polypeptide mit einer Determinante oder mit Determinanten, die mit Determinanten auf dem Plasmodium falciparum-Polypeptid die mit den Rhoptry-Organellen der Merozoitform des Malaria- Parasiten verbunden sind, eine immunologische Kreuzreaktion ergeben, wobei das Plasmodium falciparum-Polypeptid die Aminosäuresequenz (II) hat. Um als Malaria-Impfstoff nützlich zu sein, müssen die Determinanten auf dem Plasmodium falciparum-Polypeptid, das mit den Rhoptry-Organellen der Merozoiten verbunden ist, für eine Immunreaktion der Säugetiere gegen die Malaria-Parasiten zugänglich sein. Die Erfindung betrifft auch ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz (II) oder eine Teilsequenz davon, z.B. die Aminosäuresequenz (I) umfaßt, wobei das Polypeptid mit Determinanten auf dem Plasmodium falciparum-Polypeptid, das oben definiert wurde, immunologisch kreuzreagiert. Ein Beispiel für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist das mit den Rhoptry-Organellen von Plasmodium-Merozoiten assoziierte Plasmodium-Merozoit-Antigen mit einer relativen Molekülmasse von ungefähr 80 kD, wobei dieses Antigen von den MAB's 2.13 und 7.12 erkannt wird. Die bevorzugten Polypeptide können Antikörper bei einem Säugetierwirt induzieren, wobei die Antikörper fähig sind, die Invasion von Erythrozyten durch Merozoitformen des Malaria-Parasiten in vivo zu hemmen. Die Polypeptide können in unglykosylierter Form sein oder können glykosyliert sein. Andere Posttransnations-Modifikationen sind möglich, wie z.B. die kovalente Bindung eines Glykosylphosphatidylinositrestes. Das Polypeptid kann auch ein Anti-Idiotyp-Antikörper oder ein Fragment davon sein mit einer antigenen Determinante, die eine immunologische Kreuzreaktion mit den oben erwähnten Oberflächen-Determinanten ergibt. Ein Anti-Idiotyp-Antikörper ist ein Antikörper, der gegen die Bindungsstelle eines Antikörpers gerichtet ist, der wiederum gegen eine gegebene antigene Determinante gerichtet ist und somit hat die antigene Stelle des Anti-Idiotyp-Antikörpers eine ähnliche Molekül-Konfiguration wie die antigene Determinante (Linthicum et al., BioEssays 3, 213-217 [1985]). Vorzugsweise sind die Polypeptide der vorliegenden Erfindung im wesentlichen in reiner Form.
Die Erfindung betrifft auch Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, die von den oben angegebenen Aminosäuresequenzen abgeleitet ist durch Zufügungen, Deletionen, Insertionen oder Aminosäuresubstitutionen, vorausgesetzt, daß diese Polypeptide immer noch mit Determinanten des mit den Rhoptry-Organellen von Plasmodium-Merozoiten verbundenen Polypeptids, das die Aminosäuresequenz (I) umfaßt, kreuzreagieren. Die Erfindung betrifft auch DNA, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert und rekombinante Vektoren, die eine solche DNA enthalten, insbesondere Expressionsvektoren, d.h. rekombinante Vektoren, in denen die DNA, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, an eine Expressions-Kontrollsequenz in solcher Weise gebunden ist, daß das Polypeptid, das von der DNA codiert wird, exprimiert werden kann. Die bevorzugte DNA umfaßt die Nukleotidsequenz (2) oder eine Teilsequenz davon, z.B. die Nukleotidsequenz (1). Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung einzellige Wirtsorganismen, die einen solchen rekombinanten Vektor oder Expressionsvektor enthalten und ein Verfahren zur Herstellung solcher Organismen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Polypeptide und die Verwendung dieser Polypeptide für die Immunisierung von Säugetieren gegen Malaria.
Da bestimmte Substitutionen in der Aminosäuresequenz eines Polypeptids wenig oder keinen Einfluß auf die Tertiärstruktur oder die biologische Aktivität des Polypeptids haben, kann sich die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Polypeptide von den oben angegebenen Aminosäuresequenzen unterscheiden. Beispiele für solche Aminosäure-Substitutionen sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu und umgekehrt (siehe Doolittle in "The Proteins", Herausgeber H. Neurath und R.L. Hill, Academic Press, New York [1979]).
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können kovalent an ein Trägermaterial gebunden sein oder darauf adsorbiert sein. Geeignete Trägermaterialien sind natürliche oder synthetische Polymerverbindungen, z.B. Copolymere von einer oder mehreren Aminosäuren (z.B. Polylysin) oder Zucker (z.B. Polysaccharide). Andere geeignete Trägermaterialien sind natürliche Polypeptide, z.B. Hämocyanine (z.B. KLH = keyhole limpet hemocyanin), Serumproteine (z.B. Gammaglobulin, Serumalbumin) und Toxoide (z.B. Diphtherie- oder Tetanustoxoid). Andere geeignete Trägermaterialien sind dem Fachmann bekannt.
Die kovalente Bindung der erfindungsgemäßen Polypeptide an Trägermaterialien kann in bekannter Weise bewirkt werden, z.B. direkt durch die Bildung einer Peptid- oder Esterbindung zwischen freien Carboxyl-, Amino- oder Hydroxylgruppen des Polypeptids und den entsprechenden Gruppen des Trägermaterials oder indirekt unter Verwendung von üblichen bifunktionellen Reagenzien, z.B. m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) oder Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (SMPB). Diese und andere bifunktionelle Reagenzien sind im Handel erhältlich, z.B. von Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, U.S.A. Weiterhin können C&sub2; - C&sub7;-Dialkanale, z.B. Glutaraldehyd (Avrameas, Immunochem. 6, 43-52 [1969]) verwendet werden. Das Trägermaterial mit den daran gebundenen Polypeptiden kann von nicht gebundenen Polypeptiden getrennt werden und, falls erwünscht, von überschüssigen Reagenzien, mit bekannten Methoden (z.B. Dialyse oder Säulenchromatographie).
Die erfindungsgemäßen Peptide können mit üblichen Methoden der Peptidsynthese in flüssiger Phase oder vorzugsweise fester Phase, z.B. mit dem Methoden von Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 [1963]) oder andere äquivalente Methoden des Standes der Technik hergestellt werden.
Die Festphasensynthese beginnt mit der C-terminalen Aminosäure des zu synthetisierenden Peptids, das in geschützter Form an ein geeignetes Harz gekuppelt wird. Das Ausgangsmaterial kann hergestellt werden, indem eine Aminosäure, die an der Aminogruppe geschützt ist, an ein chlormethyliertes oder hydroxymethyliertes Harz über eine Benzylesterbindung oder über eine Amidbindung an ein Benzhydrylamin (BHA) Harz, ein Methylbenzhydrylamin (MBHA) Harz oder ein Benzyloxybenzylalkohol-Harz gekuppelt wird. Diese Harze sind im Handel erhältlich und ihre Herstellung und Verwendung sind wohlbekannt.
Allgemeine Methoden zum Schutz und zur Entfernung von Schutzgruppen für Aminosäuren, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind beschrieben in "The Peptides", Band 2 (herausgegeben von E. Gross und J. Meienhofer, Academic Press, New York, 1-284 [1979]). Schutzgruppen schließen z.B. die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl- (Fmoc), die tert- Butyloxycarbonyl- (Boc), die Benzyl- (Bzl), die t-Butyl (But), die 2-Chlorbenzyloxycarbonyl- (2Cl-Z), die Dichlorbenzyl- (Dcb) und die 3,4-Dimethylbenzyl- (Dmb) Gruppe ein.
Nach der Entfernung der α-Aminoschutzgruppe werden die geschützten Aminosäuren stufenweise in der gewünschten Sequenz an die an dem Harz gebundene C-terminale Aminosäure gekuppelt. Das vollständige Peptid kann auf diese Weise synthetisiert werden. Als eine Alternative dazu können kleine Peptide synthetisiert werden und dann miteinander verbunden werden, um das gewünschte Peptid zu ergeben. Geeignete Kupplungsreagenzien gehören zum Stand der Technik, wobei Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) besonders bevorzugt ist.
Jede geschützte Aminosäure oder jedes geschützte Peptid wird im Überschuß dem Festphasen-Synthese-Reaktionsgefäß zugegeben und die Kupplungsreaktion kann in Dimethylformamid (DMF) oder Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) oder einer Mischung der beiden durchgeführt werden. In Fällen einer unvollständigen Kupplung wird die Kupplungsreaktion wiederholt, bevor die N-terminale α-Amino-Schutzgruppe entfernt wird zur Kupplung der nächsten Aminosäure. Die Ausbeute bei jeder Kupplungsstufe kann verfolgt werden, vorzugsweise mit der Ninhydrinmethode. Die Kupplungsreaktionen und die Waschstufen können automatisch durchgeführt werden.
Die Abspaltung des Peptids von dem Trägermaterial kann erreicht werden mit in der Peptidchemie wohlbekannten Methoden, z.B. durch Reaktion mit Fluorwasserstoff (HF) in Gegenwart von p-Kresol und Dimethylsulfid eine Stunde lang bei 0ºC und anschließend möglicherweise eine zweite Reaktion mit HF in Gegenwart von p-Kresol zwei Stunden lang bei 0ºC. Die Abspaltung der Peptide von chlormethylierten oder hydroxymethylierten Trägermaterialien ergibt Peptide mit einem freien C-Ende; die Abspaltung der Peptide von Benzylhydrylamin- oder Methylbenzylhydrylamin-Trägern ergibt Peptide mit einem amidierten C-Ende.
Alternativ können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung auch hergestellt werden unter Verwendung von auf diesem Gebiet wohlbekannten Methoden der rekombinanten DNA- Technik (Maniatis et al. in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory [1982]). Dabei kann eine DNA, die ein solches Polypeptid codiert, mit üblichen chemischen Methoden synthetisiert werden, z.B. mit der Phosphotriester-Methode, die von Narang et al. in Meth. Enzymol. 68, 90-108 [1979] beschrieben wurde oder mit der Phosphodiester-Methode (Brown et al., Meth. Enzymol. 68, 109-151 [1979]). Bei beiden Methoden werden zuerst lange Oligonukleotide synthetisiert und dann in vorbestimmter Weise zusammengefügt. Die Nukleotidsequenz der DNA kann teilweise oder vollständig identisch sein mit der Nukleotidsequenz, die das natürliche Polypeptid in den Rhoptry- Organellen von Plasmodium-Merozoiten codiert. Da der genetische Code degeneriert ist, existiert andererseits die Möglichkeit, daß eine teilweise oder vollständig verschiedene Nukleotidsequenz dasselbe Polypeptid codiert. Die ausgewählten Codons können an die bevorzugte Codon-Verwendung des für die Expression des rekombinanten Polypeptids verwendeten Wirts angepaßt werden (Grosjean et al., Gene 18, 199-209 [1982]). Es muß darauf geachtet werden, daß die so erhaltene DNA nicht Teilsequenzen enthält, die die Konstruktion des Expressionsvektors schwierig machen, z.B. durch Einführen einer unerwünschten Spaltungsstelle für ein Restriktionsenzym, oder die die Expression des Polypeptids verhindert.
Eine das erfindungsgemäße Polypeptid codierende DNA kann auch erhalten werden, indem Parasiten-DNA in einen Expressions-Phagenvektor kloniert wird, z.B. in dem lambda- Phagenvektor gt11, der von American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, erhältlich ist. Geeignete Wirtszellen, z.B. E. coli Y1088, die das Plasmid pMC9 enthalten (erhältlich z.B. von ATCC), werden mit diesen Phagenvektoren transfiziert. Die auf diesem Weg erhaltene Expressions-Genbank wird dann gescreent unter Verwendung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, wie von Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194-1198 [1983] und im Beispiel beschrieben.
Vorzugsweise wird die DNA erhalten, indem DNA eines Plasmodium-Parasiten-Stamms mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen geschnitten wird und die Fragmente in einem geeigneten Vektor kloniert werden, mit auf diesem Gebiet wohlbekannten Verfahren (Maniatis et al., oben). Die Parasiten-DNA-Bank wird dann mit einer geeigneten Sonde gescreent. Solche geeigneten Sonden sind Oligonukleotide, die einer Teilsequenz der DNA, die das 2.13-Antigen codiert, oder der DNA mit der Nukleotidsequenz (1) entsprechen. Die Art, in der diese Sonden ausgewählt werden und verwendet werden, ist dem Fachmann bekannt. Beispiele für solche Sonden sind Oligonukleotide mit der Sequenz TTGGTGCAGGAGGTGCT oder AAGCTACCTATACATGT. Klone, die ein DNA-Insert enthalten, das mit der Sonde hybridisiert, werden gezüchtet und die DNA wird isoliert. Anschließend kann das DNA-Fragment in einen geeigneten Vektor insertiert werden, vorzugsweise in einen Vektor, der die notwendigen Expressionssignale liefert. Beispiele für solche Expressionsvektoren sind in der Europäischen Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nummer 186 069 beschrieben, die am 02. Juli 1986 veröffentlicht wurde. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können nach entsprechender Anpassung der Nukleotidsequenz auch erzeugt werden unter Verwendung anderer geeigneter Expressionsvektoren, die dem Fachmann bekannt sind.
Der rekombinante Vektor, der eine DNA enthält, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, wird anschließend in einen geeigneten einzelligen Wirtsorganismus eingeschleust. Geeignete einzellige Wirtsorganismen sind prokaryontische oder eukaryontische Zellen. Beispiele für prokaryontische Zellen sind Mikroorganismen, z.B. Bakterienzellen, z.B. E. coli Zellen oder B. subtilis Zellen, die Polypeptide, die von den rekombinanten Expressionsvektoren codiert werden, exprimieren können. Eine große Anzahl von eukaryontischen Zellen, die als einzellige Wirtsorganismen für rekombinante Vektoren geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für solche eukaryontischen Zellen sind Hefezellen (z.B. Saccharomyces cerevisiae) und Zellkulturen höherer Eukaryonten, z.B. Insektenzellen (z.B. unter Verwendung des Baculovirus-Vektorsystems; für eine Übersicht siehe Doerfler, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 131, 51-68 [1986] oder Yong Kang, Adv. in Virus Research 35, 177-192 [1988]] und Wirbeltierzellen (für einen Überblick siehe Rigby, Genetic Engineering, Band 3, R. Williamson, Academic Press, New York, Seiten 83-141 [1982]). Der bevorzugte einzellige Wirtsorganismus ist E. coli M15 (beschrieben als DZ291 von Villarejo et al. in J. Bacteriol. 120, 466-474 [1974]). Andere geeignete Wirtsorganismen sind E. coli 294, E. coli RR1 und E. coli W3110 (alle erhältlich von ATCC und anderen Quellen). Abhängig von dem verwendeten Wirtsorganismus kann das Polypeptid in glykosylierter Form sein.
Die Art, in der die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide bewirkt wird, hängt ab von dem verwendeten rekombinanten Expressionsvektor und dem Wirtsorganismus. Im Fall von Bakterien und Hefen wird der Wirtsorganismus, der den rekombinanten Expressionsvektor enthält, unter solchen Bedingungen gezüchtet, die optimal sind für das Wachstum des Wirtsorganismus. Gegen Ende des exponentiellen Wachstums, wenn der Anstieg der Zellzahl pro Zeiteinheit abnimmt, wird die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids induziert, d.h. die DNA, die das Polypeptid codiert, wird transkribiert und die transkribierte mRNA wird translatiert. Die Induktion kann bewirkt werden, indem ein Induktor oder ein Derepressor dem Wachstumsmedium zugegeben wird, oder indem ein physikalischer Parameter geändert wird, z.B. eine Temperaturänderung. In dem rekombinanten Expressionsvektor, der für die vorliegende Erfindung verwendet wird, wird die Expression durch den lac-Repressor kontrolliert. Durch Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wird die Expressions-Kontrollsequenz dereprimiert und dadurch die Synthese des Polypeptids induziert.
Das von den einzelligen Wirtsorganismen produzierte Polypeptid kann durch spezielle Transportmechanismen ausgeschieden werden oder kann isoliert werden, indem der einzellige Organismus aufgebrochen wird. Der Wirtsorganismus kann durch mechanische (Charm et al., Meth. Enzymol. 22, 476-556 [1971]), enzymatische (Lysozymbehandlung) oder chemische (d.h. Detergenz-Behandlung, Harnstoff- oder Guanidin HCl-Behandlung) Mittel oder eine Kombination davon, aufgebrochen werden.
Bei Eukaryonten werden Polypeptide, die von den Zellen ausgeschieden werden, in Form eines Vorläufermoleküls synthetisiert. Das reife Polypeptid ergibt sich durch Abspaltung des sogenannten Signalpeptids. Da prokaryontische Wirtsorganismen eukaryontische Signalpeptide nicht von Vorläufer- Molekülen abspalten können, müssen eukaryontische Polypeptide direkt in ihrer reifen Form in prokaryontischen Wirtsorganismen exprimiert werden. Das Translations-Startsignal AUG, das dem Codon ATG auf der Ebene der DNA entspricht, bewirkt, daß alle in einem prokaryontischen Wirtsorganismus synthetisierten Polypeptide einen Methioninrest am N-Ende haben. In bestimmten Expressionssystemen wird dieser N-terminale Methioninrest abgespalten. Es wurde jedoch gefunden, daß die Gegenwart oder Abwesenheit des N-terminalen Methionins oft keinen Einfluß auf die biologische Aktivität eines Polypeptids hat (siehe Winnacker in "Gene und Klone", Seite 255, Verlag Chemie, Weinheim, BRD [1985]). In Fällen, in denen ein N-terminales Methionin schädlich ist, kann es auch mit Hilfe von Peptidasen, die für N-terminales Methionin spezifisch sind, abgespalten werden. Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2718-2722 [1987] haben die Isolierung einer solchen Peptidase aus Salmonella typhimurium beschrieben. Die vorliegende Erfindung betrifft somit Polypeptide mit oder ohne einen N-terminalen Methioninrest.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können mit bekannten Methoden gereinigt werden, z.B. durch Zentrifugation bei verschiedenen Geschwindigkeiten, durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat, durch Dialyse (bei normalem Druck oder bei vermindertem Druck), durch präparative isoelektrische Fokussierung, durch präparative Gelelektrophorese oder mit verschiedenen chromatographischen Methoden, z.B. Gelfiltration, Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), Ionenaustausch-Chromatographie, Reverse-Phase-Chromatographie und Affinitäts-Chromatographie (z.B. auf Sepharose Blue CL-6B, auf Phosphocellulose, an Träger gebundenen, gegen das Polypeptid gerichteten monoklonalen Antikörpern oder Metall-Chelat-Harzen, wie den in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nummer 253 303 beschriebenen).
Das bevorzugte Reinigungsverfahren für die vorliegende Erfindung ist die Reinigung mit Affinitäts-Chromatographie. Die Reinigung der erfindungsgemäßen Polypeptide an trägergebundenen monoklonalen Antikörpern 2.13 und 7.12 ist besonders bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in Form von Multimeren vorhanden sein, d.h. in Form von Dimeren, Trimeren oder Tetrameren. Die Untereinheiten dieser Multimere können miteinander durch kovalente oder nicht kovalente Bindungen verbunden sein. Multimere ergeben sich oft, wenn Polypeptide in prokaryontischen Wirtsorganismen erzeugt werden, z.B. durch Bildung von Disulfid-Brücken zwischen Cysteinresten.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch in Form von Fusionspolypeptiden hergestellt werden. Bei solchen Fusionspolypeptiden wird ein erfindungsgemäßes Polypeptid kovalent über eine Peptidbindung mit einem oder mehreren Fusionspartnern verbunden. Solche Fusionspartner sind Peptide oder Polypeptide, vorzugsweise solche Peptide oder Polypeptide, die dazu beitragen, die Eigenschaften des Fusions-Polypeptids im Vergleich zu solchen Polypeptiden ohne Fusionspartner zu verbessern. Geeignete Fusionspartner sind Polypeptide mit einer antigenen Determinante oder antigenen Determinanten, die mit anderen Antigenen des Malaria-Parasiten immunologisch kreuzreagieren, vorzugsweise Antigene eines anderen Stadiums des Malaria-Parasiten und die dadurch die Wirksamkeit der Impfstoffe, die dieses Fusionspolypeptid enthalten, verbessern. Mehrere solcher Antigene sind bekannt (siehe Überblick von Scaife, oben). Antigene des Sporozoiten-Stadiums, z.B. das Circumsporozoit-(CS)-Protein oder andere Polypeptide, die sich wiederholende Sequenzen enthalten, z.B. das Tetrapeptid mit dem sich wiederholenden Asn-Ala-Asn-Pro, das in P. falciparum- CS-Protein vorhanden ist, sind bevorzugt. Der Fusionspartner kann auch ein T-Zell-Epitop sein, wie z.B. eines, das von Good et al. beschrieben wurde (Science 235, 1059-1062 [1987]). Alternativ kann der Fusionspartner auch ein Affinitätspeptid sein und damit zur leichteren Gewinnung des Fusionspolypeptids beitragen. Ein Beispiel für einen solchen Fusionspartner ist ein Affinitätspeptid, das vorzugsweise an ein Trägermaterial für die Affinitäts-Chromatographie bindet. Beispiele für solche Affinitätspeptide sind Peptide, die mindestens zwei Histidinreste enthalten. Solche Affinitätspeptide binden selektiv an Nitrilotriessigsäure-Nickel-Chelatharz (siehe z.B. Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nummer 253 303). Fusionspolypeptide, die ein solches Affinitätspeptid enthalten, können daher selektiv von den verbleibenden Polypeptiden abgetrennt werden mit Hilfe solcher Harze. Fusionsproteine können mit üblichen Methoden der Peptidsynthese oder mit Gentechnik hergestellt werden, wobei DNA-Fragmente, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren, mit einem oder mehreren DNA-Fragmenten verbunden sind, die den Fusionspartner codieren. Vorzugsweise werden Fusionspolypeptide durch Gentechnik hergestellt, z.B. indem eine DNA, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, in einen Expressionsvektor eingeführt wird, der die notwendigen Expressionskontrollsequenzen und eine DNA, die den Fusionspartner codiert, umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch diagnostisch verwendet werden, um Antikörper nachzuweisen, die gegen die Determinante des Polypeptids gerichtet sind, das mit den Rhoptry-Organellen von Plasmodium-Merozoiten verbunden ist, mit der Aminosäuresequenz (I), mit auf diesem Gebiet wohlbekannten Methoden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch immunogene Zusammensetzungen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid ebenso wie ein geeignetes Adjuvans enthalten. Beispiele für geeignete Adjuvantien sind Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat. Andere geeignete Adjuvantien oder Abgabesysteme (z.B. Salmonella thyphimurium oder Vacciniavirus) zur Verwendung bei Menschen und Tieren sind dem Fachmann bekannt (WHO Techn. Rep. Series 595, 1-40 [1987]; Warren et al., Ann. Rev. Immunol. 4, 369-388 [1986]; Morein, Nature 332, 287-288 [1988]; Klausner, BIO/TECHNOLOGY 6, 773-777 [1988] und Bromford, Parasitology Today 5, 41-46 [1989]).
Die erfindungsgemäßen Polypeptide oder immunogenen Zusammensetzungen können als Lyophilisate zur Rekonstitution mit sterilem Wasser oder einer Salzlösung, vorzugsweise phosphatgepufferter Kochsalzlösung, vorliegen. Indem die Polypeptide und immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung in Säugetiere eingeführt werden, wird deren Immunsystem aktiviert, d.h. die Produktion von Antikörpern gegen das Polypeptid wird induziert. Die vorliegende Erfindung betrifft auch solche Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper erkennen das natürliche Äquivalent des Polypeptids auf den Malaria-Parasiten und können daher therapeutisch verwendet werden, um die Invasion roter Blutkörperchen durch Merozoiten zu blockieren, zur passiven Immunisierung oder für diagnostische Zwecke.
Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide können in Affen, Kaninchen, Pferden, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten, Mäusen, Kühen, Schafen etc. und auch in Menschen erzeugt werden. Je nachdem können das Antiserum oder der gereinigte Antikörper verwendet werden. Die Antikörper können in bekannter Weise gereinigt werden, z.B. durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat. Es ist auch möglich, monoklonale Antikörper zu erzeugen, die gegen das erfindungsgemäße Polypeptid gerichtet sind, mit der von Köhler et al. entwickelten Methode (Nature, 256, 495-497 [1975]). Polyklonale oder monoklonale Antikörper können auch für die Reinigung der erfindungsgemäßen Polypeptide oder deren natürlichem Äquivalent, dem 2.13-Antigen, mit Affinitäts- Chromatographie verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide und immunogenen Zusammensetzungen können als Impfstoffe für die Immunisierung von Säugetieren gegen Malaria verwendet werden. Dabei wird das Immunsystem eines Säugetiers, vorzugsweise eines Menschen, mit einer immunisierenden Menge des Polypeptids oder der immunogenen Zusammensetzung stimuliert. Die Verabreichungsart, die Dosierung ebenso wie die Anzahl von Injektionen können in dem Fachmann bekannter Weise optimiert werden. Typischerweise werden mehrere Injektionen über einen langen Zeitraum verabreicht, um einen hohen Antikörper-Titer gegen das Malaria-Antigen zu erhalten, d.h. gegen das erfindungsgemäße Polypeptid.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie leichter verstanden unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel im Zusammenhang mit den folgenden Zeichnungen, wobei
Figur 1 eine Restriktionskarte des Gens, das das 2.13-Antigen codiert und die relativen Positionen der klonierten Fragmente dieses Gens im lambda-rap-1.1, lambda-rap-1.2 und lambda-rap-1.3 zeigt.
Figur 2A,B die Nukleotidsequenz (2) des Gens, das das 2.13-Antigen codiert und die Aminosäure-Sequenz (II), die sich aus der codierenden Region ableitet, zeigt.
Es versteht sich, daß das Beispiel nur der Erläuterung dient und nicht die Erfindung in irgendeiner Weise auf die darin wiedergegebene spezifische Ausführungsform beschränken soll. Aus Gründen der Klarheit ist dem Beispiel eine Liste von Abkürzungen, eine Liste von Puffern und Medien und eine Zusammenfassung allgemeiner Methoden, die in dem Beispiel verwendet werden, vorgeschaltet.

Abkürzungen:

ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaar
BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat
BSA Rinderserumalbumin
cpm Impuls pro Minute
dATP Desoxyadenosin-triphosphat
dCTP Desoxycytidin-triphosphat
dGTP Deosyguanosin-triphosphat
dTTP Desoxythymidin-triphosphat
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGTA Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N',N'- tetraessigsäure
HEPES [4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure]
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
kb 1.000 Basenpaare
kD Kilodalton (= 1.000 Dalton)
M molar
mM millimolar
ml Milliliter
nm Nanometer
NBT Nitroblau-Tetrazolium
PFU Plaquebildende Einheit
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
UPM Umdrehungen pro Minute
SDS Natriumdodecylsulfat
TENED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
Tris Tri(hydroxymethyl)aminomethan
X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid

Puffer und Medien:

100 x Denhardt's (100 ml):

2 g Polyvinylpyrrolidon
2 g Ficoll (Pharmacia, Uppsala, Schweden)
2 g BSA
100 mg Natriumazid

DNA-Gel-Beladungspuffer

1 x TBE (Zusammensetzung siehe unten)
20 % Glycerin
0,1 % Bromphenolblau
0,1 % Xylolcyanol

Formamidmischung:

80 % (G/V) Formamid
50 mM Tris/Borsäure (pH 8,3)
1 mM EDTA
0,1 % Xylolcyanol
0,1 % Bromphenolblau

HIN-Puffer:

10 mM Tris/HCl (pH 7,4)
10 mM Magnesiumchlorid
50 mM Natriumchlorid

Ligase-Puffer:

50 mM Tris/HCl (pH 7,8)
10 mM Magnesiumchlorid
20 mM DTT
10 mM dATP

LS-Puffer:

440 mM HEPES (pH 6,6)
110 mM Tris/HCl (pH 8,0)
11 mM Magnesiumchlorid
22 mM β-Mercaptoethanol
44 uM dATP
44 uM dTTP
44 uM dGTP
11 OD&sub2;&sub6;&sub0;-Einheiten statistische Hexanukleotide (Pharmacia)

LB-Medium: pro Liter:

10 g Bactotrypton
5 g Hefeextrakt
10 g Natriumchlorid

SDS-Gel-Beladungs-Puffer:

5 % SDS
5 mM Tris/HCl (pH 6,8)
200 mM DTT
20 % Glycerin
0,1 % Bromphenolblau

20 x SSC: pro Liter:

175,3 g Natriumchlorid
82,2 g Natriumcitrat (pH 7,0)

SM-Puffer:

10 mM Natriumchlorid
10 mM Magnesiumchlorid
10 mM Tris/HCl (pH 7,4)

10 x T4-Polymerase-Puffer:

0,33 M Tris/Acetat (pH 7,9)
0,66 M Kaliumacetat
0,10 M Magnesiumacetat
5 mM DTT
1 mg/ml BSA

10 x TBE:

0,89 M Tris/Borsäure (pH 8,0)
0,89 M Borsäure
20 mM EDTA

10 x TBS:

0,5 M Tris/HCl (pH 7,4)
1,5 H Natriumchlorid

100 x TE:

1 M Tris/HCl (pH 8,0)
100 mM EDTA

BBL-Medium: pro Liter:

10 g Trypticase (BBL, Division of Becton Dickinson and Co., Cockeysville, Maryland, USA)
5 g Natriumchlorid

Alkalischer Phosphatase-Puffer:

100 mM Tris/HCl (pH 9,5)
100 mM Natriumchlorid
5 mM Magnesiumchlorid

Puffer mit hohem Salzgehalt:

50 mM Tris/HCl (pH 7,5)
10 mM Magnesiumchlorid
100 mM Natriumchlorid

Puffer mit mittlerem Salzgehalt:

10 mM Tris/HCl (pH 7,5)
10 mM Magnesiumchlorid
10 mM Natriumchlorid

Kernpuffer:

50 mM Tris/HCl (pH 8,0)
10 mM Magnesiumchlorid
50 mM Natriumchlorid

TES-Puffer:

20 mM Tris/HCl (pH 7,5)
10 mM Natriumchlorid
0,1 mM EDTA

TM-Puffer:

40 mM Tris/HCl (pH 7,5)
10 mM Magnesiumchlorid
50 mM Natriumchlorid

Phagen-Puffer: pro Liter:

3 g Kaliumdihydrogenphosphat
7 g Dinatriumhydrogenphosphat
5 g Natriumchlorid
0,095 g Magnesiumsulfat
0,011 g Calciumsulfat
0,01 g Gelatine

Allgemeine Methoden:

Methode 1: DNA-Ausfällung mit Lithiumacetat

Die DNA-Lösung wird mit 1/10 Volumen 5 M Lithiumacetat und 2 Volumina Isopropanol versetzt, gut gemischt und 10 Minuten auf Trockeneis gestellt. Die ausgefällte DNA wird 10 Minuten mit 12.000 UPM (20ºC) in einer Eppendorf-Laborzentrifuge zentrifugiert und der Überstand wird sorgfältig entfernt. Das Sediment wird einmal mit 80 % (V/V) Ethanol gewaschen und anschließend 5 Minuten in einer Vakuum-Zentrifuge getrocknet. Die DNA wird in Wasser gelöst und weiter aufgearbeitet.

Methode 2: Agarose-Gel-Elektrophorese von DNA

Die getrocknete DNA wird in 1 x DNA-Gel-Beladungs-Puffer gelöst und 5 Minuten auf 65ºC erhitzt. 100 ml 1 x TBE- Puffer werden mit Agarose (800 mg für ein 0,8 % Gel oder 1,2 g für ein 1,2 % Gel) vermischt und gekocht, bis sich die Agarose vollständig gelöst hat. Nach dem Abkühlen werden 2 ul Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) zugegeben und die Gellösung wird in eine horizontale Gelelektrophorese-Vorrichtung gegossen. Nach Verfestigung des Gels werden die Proben auf das Gel aufgetragen und die DNA wird zwei Stunden bei konstanter Spannung von 150 Volt getrennt. Im Handel erhältliche Standardmischungen von DNA-Fragmenten mit definierter Länge werden als Größenmarkierungen verwendet. Die DNA-Banden werden unter 300 nm UV-Licht sichtbar gemacht.

Methode 3: Isolierung der DNA von dem Agarose-Gel

Die DNA wird auf einem Agarose-Gel aufgetrennt (Methode 2). Eine Vertiefung wird vor der Bande, die gereinigt werden soll, in das Gel geschnitten und ein Stück Dialyseschlauch auf der Seite der Vertiefung eingesetzt. Die Vertiefung wird mit 1xTBE-Puffer gefüllt und die DNA in den Dialyseschlauch 10 bis 15 Minuten lang mit 200 Volt elektroeluiert. Sie wird dann in die Vertiefung 45 Sekunden lang rückeluiert. Die DNA-Lösung wird 2x mit mit Wasser gesättigtem Isobutanol, 2x mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert und dann durch Zugabe 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat mit pH 5,2 und 2 Volumina Ethanol ausgefällt. Nach 15 Minuten Stehen bei -70ºC wird der Niederschlag bei 12.000 g 10 Minuten lang pelletisiert, getrocknet und in 1x TE-Puffer resuspendiert.

Methode 4: Plaque-Reinigung der lambda-Phagen

Eine Bakterienkultur (z.B. E. coli Y1088 erhältlich z.B. von ATCC) wird auf einer Agarplatte (Maniatis et al., oben, Seiten 70 bis 71) mit lambda-Phagen infiziert. Dabei werden lytische Plaques in Bakterienrasen gebildet. Ein Agarzylinder (Durchmesser 5 mm), der ein Plaque enthält, wird aus dem Agar mit einer umgedrehten Pasteur-Pipette herausgeschnitten. Der Agarzylinder wird in ein Eppendorf-Teströhrchen, das 500 ul SM-Puffer enthält, überführt und das Teströhrchen wird 5 Minuten lang geschüttelt. Die Phagen- Suspension wird zentrifugiert (5 Minuten bei 12.000 UPM, 20ºC) und der Überstand wird in ein frisches Teströhrchen überführt. 1 ul der Phagen-Suspension wird mit 1 ml SM-Puffer verdünnt. 1, 10 und 100 ul dieser Lösung werden zu 50 ul einer Zellsuspension von E. coli Y1090 Zellen, die das Plasmid pMC9 (erhältlich z.B. von ATCC) enthalten, die mit Mg&spplus;&spplus; gemäß Morrison behandelt wurden (Methods Enzymol. 68, 326-331 [1979]) zugegeben. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wird die Lösung zu 3 ml 0,8 % (G/V) Agar in LB-Medium zugegeben und die Mischung wird auf LB-Ampicillin-Agarplatten (LB-Medium, 40 ug/ml Ampicillin) gegossen. Abhängig von dem Titer haben einige Platten (d.h. solche mit der Verdünnung 1:1.000) einzelne Plaques, die dann, wenn die Antikörper-Reaktion oder der DNA-Hybridisierung positiv ist, isoliert werden können. Die Phagen von den Plaques können gezüchtet werden und z.B. für die Isolierung von Phagen-DNA verwendet werden.

Methode 5: Herstellung eines Plattenlysat-Phagen-Vorrats

Eine geeignete Anzahl von Plaquebildenden Einheiten (z.B. 10.000) wird verwendet, um 100 ul Plattierungszellen zu infizieren (Methode 5) und diese werden auf einer frisch hergestellten BBL-Platte plattiert und über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Der Top-Agar, der eine konfluente Lyse zeigen sollte, wird dann in 5 ml Phagen-Puffer gekratzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Der Top-Agar wird schließlich mit 4.000 g 10 Minuten lang pelletisiert und der Überstand als Phagen-Vorrat behalten.

Methode 6: Herstellung von Plattierungszellen für die Infektion mit lambda-Phagen

Eine einzelne Kolonie des zu verwendenden E. coli-Stammes (z.B. Y1090, erhältlich z.B. von ATCC) wird auf 5 ml LB- Medium geimpft und über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Die Suspension wird dann 50fach verdünnt und weitere 2 Stunden bei 37ºC gezüchtet, bevor die Zellen bei 4.000 g 10 Minuten lang bei 4ºC pelletisiert werden und die Zellen in 1/10 Volumen eiskaltem 10 mM Magnesiumsulfat resuspendiert werden. Die Zellen können bis zu 2 Wochen bei 4ºC aufbewahrt werden. Die Zellen werden verwendet, um Plaques von Phagenlambda zu erzeugen, wie folgt. Eine geeignete Anzahl von Plaquebildenden Phagen-Einheiten wird zu 100 ul Plattierungszellen zugegeben. Die Suspension wird 20 Minuten bei Raumtemperatur belassen, dann werden 3 ml flüssiger BBL- Top-Agar (45ºC) zugegeben und die Mischung auf eine 80 mm Boden-Agar-Platte gegossen.

Methode 7: Transformation von E. coli

3 ml LB-Medium werden mit E. coli-Zellen beimpft und über Nacht bei 37ºC geschüttelt. 1 ml dieser gesättigten Kultur wird verwendet, um 50 ml LB-Medium zu beimpfen. Die Kultur wird geschüttelt, bis die optische Dichte bei 600 nm (OD&sub6;&sub0;&sub0;) einen Wert von 0,2 erreicht hat. Die Zellen werden sedimentiert (5 Minuten mit 6.000 UPM, Raumtemperatur) und in 25 ml eiskaltem 100 mM Magnesiumchlorid wieder suspendiert. Die Zellen werden wiederum abzentrifugiert (siehe oben) und in 5 ml 100 mM Calciumchlorid suspendiert. Die kompetenten Zellen werden mindestens 30 Minuten auf 4ºC belassen. Für die Transformation werden 10 ul DNA-Lösung, die 1 bis 10 ng DNA enthält, zu 100 ul der kompetenten Zellen zugegeben und zuerst 20 Minuten auf Eis, dann 2 Minuten bei 42ºC und schließlich wiederum 20 Minuten auf Eis inkubiert.
Wenn Vektoren des M13-Typs (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119 [1985]) verwendet werden, werden nun 50 ul 10 % (G/V) X-Gal in Dimethylformamid, 10 ul 100 mM IPTG in Wasser und 50 ul einer gesättigten E. coli TG-1-Kultur (E. coli TG-1 ist erhältlich von Amersham, Little Chalfont, England; alternativ können E. coli JM 101, erhältlich von ATCC oder E. coli JM 103 verwendet werden) zugegeben. Nach gutem Vermischen werden 3 ml 0,8 % (G/V) Agar in BBL-Medium zugegeben und die Mischung wird auf eine BBL-Agarplatte gegossen. Die Agarplatten werden dann bei 37ºC über Nacht inkubiert.
Wenn Plasmid-DNA verwendet wird, die auf Antibiotika-Resistenz selektioniert werden kann, werden 1 ml LB-Medium zu der Transformationsmischung zugegeben und die Inkubation wird eine Stunde bei 37ºC durchgeführt. Die Zellen werden 3 Minuten mit 6.000 UPM (Raumtemperatur) abzentrifugiert und in 100 ul LB-Medium wieder suspendiert. Diese 100 ul werden gleichmäßig auf einer LB-Agarplatte verteilt, die das Antibiotikum enthält, das für die Selektion erforderlich ist, und ebenso bei 37ºC über Nacht inkubiert.

Methode 8: Herstellung der DNA für die Sequenzierung

Die E. coli-Stämme TG-1, JM 101 oder JM 103 können als Wirte für das Klonieren von Vektoren des M13-Typs verwendet werden zur Sequenzierung von DNA gemäß Messing, Meth. Enzymol. 101, 20-78 [1983]. Wenn ein Vektor des M13-Typs, der ein zu sequenzierendes DNA-Fragment enthält, in eine der erwähnten Wirtszellen transformiert wird, ergeben sich weiße Plaques. Diese weißen Plaques werden mit einem Zahnstocher aufgepickt und in 3 ml LB-Medium wieder suspendiert. Weitere 60 ul gesättigter Wirtskultur werden zugegeben und die Mischung wird 6 Stunden bei 37ºC geschüttelt. 1,5 ml Kultur werden in ein Eppendorf-Teströhrchen überführt und zentrifugiert (5 Minuten mit 12.000 UPM, 20ºC). 1,2 ml Überstand werden in ein neues Teströhrchen überführt und mit 300 ul 20 % (G/V) Polyethylenglykol, 2,5 M Natriumchlorid-Lösung vermischt und bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubiert. Der Rest der Kultur wird bei 4ºC aufbewahrt oder zur Herstellung von "Minilysat"-DNA verwendet (Methode 10). Die Phagen werden durch Zentrifugation (10 Minuten bei 12.000 UPM, 20ºC) ausgefällt. Das Sediment wird in 100 ul 1xTES-Puffer gelöst und mit 100 ul gesättigtem Phenol extrahiert. Die Phasen werden durch Zentrifugation getrennt (5 Minuten bei 12.000 UPM). 80 ul der wäßrigen Phase werden in ein neues Reagenz-Teströhrchen überführt, die DNA wird ausgefällt (Methode 1) und in 12 ul Wasser gelöst.

Methode 9: DNA-Sequenzierung

1 ul der gemäß Methode 8 hergestellten DNA werden mit 6 ul Wasser, 2 ul 1xTM-Puffer und 1 ul Oligonukleotid-Primer vermischt und 2 Minuten auf 65ºC erhitzt. Danach wird die Lösung langsam auf 35ºC abkühlen gelassen. In der Zwischenzeit werden 4 Teströhrchen, die jeweils 2 ul der Stoplösungen A&sup0;, G&sup0;, T&sup0; und C&sup0; enthalten, hergestellt. Die Stoplösungen haben die folgende Zusammensetzung:
A&sup0; : 1 uM ddATP, 100 uM dCTP, 100 uM dGTP, 100 uM dTTP
C&sup0; : 160 uM ddCTP, 12,5 uM dCTP, 125 uM dGTP, 125 uM dTTP
G&sup0; : 250 uM ddGTP, 125 uM dCTP, 12,5 uM dGTP, 125 uM dTTP
T&sup0; : 400 uM ddTTP, 100 uM dCTP, 100 uM dGTP, 25 uM dTTP.
1,5 Einheiten Klenow Polymerase (Pharmacia), 0,5 ul [³&sup5;S]- dATP (6.000 Ci/mM), 0,8 ul 0,1 M DTT, 1,6 ul 1xTM-Puffer und 4,8 ul H&sub2;O werden in die Teströhrchen, die die DNA enthalten, pipettiert und gut gemischt. In jedem Fall werden 4 ul dieser Lösung mit der Stoplösung vermischt und 20 Minuten bei 30ºC inkubiert. 2 ul 0,25 mM dATP werden zu jedem der vier Teströhrchen zugegeben, gemischt und wiederum 20 Minuten inkubiert. Schließlich wird die Reaktion gestoppt, indem 2 ul Formamid-Mischung zugegeben werden und 3 Minuten auf 80ºC erhitzt wird. Die DNA wird nun auf ein 0,4 mm Gel aufgetragen mit der folgenden Zusammensetzung:
34 ml H&sub2;O
3 ml 10xTBE-Puffer
28,8 g Harnstoff
3,6 g Acrylamid
180 mg Bisacrylamid
360 ul Ammoniumpersulfat
50 ul TEMED
Die DNA wird 1 bis 6 Stunden durch Elektrophorese mit einer konstanten Leistung von 40 Watt aufgetrennt. Die Glasplatten werden getrennt und das Gel wird 5 Minuten in 10 % (V/V) Essigsäure und 10 % (V/V) Methanol fixiert. Das Gel wird dann zweimal mit 10 % (V/V) Methanol 5 Minuten lang gewaschen, auf Whatman 3M Papier gelegt (Whatman Ltd., Maidstone, England) und in einem Geltrockner getrocknet. Das getrocknete Gel wird 20 Stunden autoradiographiert unter Verwendung eines Röntgenfilms (z.B. KODAK-XAR, Eastman Kodak Co., Rochester, New York, USA).

Methode 10: DNA-Isolierung in kleinem Maßstab ("Mini-Lysat")

Etwa 1 bis 2 ml der Bakterienkultur (z.B. E. coli TG-1, der einen Vektor des M13-Typs enthält, siehe Methode 8) werden 5 Minuten mit 12.000 UPM (20ºC) zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig abgesaugt. Die sedimentierten Zellen werden wieder in 500 ul 50 mM Tris/HCl (pH 7,6), 5 mM EDTA suspendiert. Nach der Zugabe einer kleinen Spatelspitze Lysozym wird die Suspension bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert. 15 ul 25 % (G/V) Lithiumdodecylsulfatlösung und 30 ul 5 M Kaliumacetat werden dann zugegeben und die Suspension wird sorgfältig vermischt. Nach Inkubation 15 Minuten auf Eis wird die Probe 15 Minuten mit 12.000 UPM (4ºC) zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert in ein neues Teströhrchen und mit 50 ul RNase-Lösung (10 mg/ml) versetzt. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37ºC wird die Probe einmal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert (in jedem Fall das gleiche Volumen). Die DNA in der wäßrigen Phase wird ausgefällt (Methode 1) und schließlich in 100 ul Wasser gelöst.

Methode 11: Radioaktive Markierung von DNA "Oligo-Markierung"

Die zu markierende DNA (bis zu 100 ng) wird auf ein Volumen von 7 ul mit H&sub2;O verdünnt, 2 Minuten auf 95ºC erhitzt und schnell auf Eis gekühlt. Nach Zugabe von 5 ul α-[³²P]dCTP (3.000 Ci/mM), 12 ul LS-Puffer und 3 Einheiten Klenow Polymerase (Maniatis et al., oben, Seiten 113-114) wird der Ansatz 4 bis 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die markierte DNA kann direkt für Hybridisierungen verwendet werden. Direkt vor ihrer Verwendung für Hybridisierungen muß die DNA 10 Minuten auf 95ºC erhitzt werden.

Methode 12: Hybridisierung der DNA

Der Filter, der DNA enthält, wird eine Stunde bei 65ºC in 0,5 M Natriumphosphatpuffer (pH 7), 7 % SDS inkubiert. Es werden ungefähr 10&sup7; cpm der radioaktiven Probe (Methode 11) zugegeben. Nach einer Inkubation bei 65ºC über Nacht werden die Filter zweimal 30 Minuten lang in 0,2xSSC, 0,1 % SDS bei 65ºC gewaschen. Die Filter werden getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt (z.B. Kodak XAR).

Methode 13: Herstellung von 10 % SDS-Polyacrylamid-Gel gemäß Laemmli, Nature 227, 680-685 [1970]

60 ml Trenngel 15 ml 1,5 M Tris/HCl (pH 8,8), 0,4 % (G/V) SDS, 8 mM EDTA.
20 ml 29 % (G/V) Acrylamid, 1 % (G/V) Bisacrylamid in Wasser
29 ml Wasser.
500 ul 10 % (G/V) Ammoniumpersulfat in Wasser.
Die Lösungen werden vermischt. Direkt vor dem Gießen zwischen zwei Glasplatten werden 100 ul TEMED zugegeben. Nachdem das Trenngel polymerisiert ist, wird das Sammelgel mit der folgenden Zusammensetzung hineingegossen:
20 ml Sammelgel: 5 ml 0,5 M Tris/HCl (pH 6,8), 0,4 % (G/V) SDS, 8 mM EDTA
3 ml 29 % (G/V) Acrylamid, 1 % (G/V) Bisacrylamid in Wasser
12 ml Wasser.
250 ul 10 % (G/V) Ammoniumpersulfat in Wasser
Die Lösungen werden vermischt, 30 ul TEMED werden zugegeben und auf das Trenngel gegossen. Ein Sondenkamm wird eingesetzt vor der Polymerisierung. 190 mM Glycin, 25 mM Tris (pH 7,6), 1 % (G/V) SDS werden als Elektrophorese-Puffer verwendet. Übliche Molekulargewichts-Standards können als Größenmarkierungen verwendet werden.

Methode 14: Immunoblots (Westernblot)

Bis zu 100 ul einer Proteinprobe werden auf einem 12 % SDS- Polycarylamid-Gel über Nacht bei 100 Volt konstanter Spannung aufgetrennt. Das Gel wird entfernt und in Transferpuffer gebracht. Ein Blatt Nitrocellulose-Filterpapier wird mit Wasser angefeuchtet und auf das Gel gelegt. Gel und Nitrocellulose-Blatt werden mit Whatman 3MM-Papier bedeckt und dann wird ein Schwamm daraufgelegt. Das so erhaltene Sandwich wird dann in eine Elektrophorese-Vorrichtung eingesetzt, wobei das Nitrocellulose-Blatt zum positiven Pol gerichtet ist. Der Transfer der Proteine wird zwei Stunden lang durch Elektrophorese bei 300 mA konstanter Stromstärke durchgeführt. Nach dem Transfer wird das Nitrocellulose- Blatt 10 Minuten in 1xTBS-Puffer geschüttelt. Anschließend wird es 30 Minuten in 1xTBS, 5 % (G/V) Magermilchpulver vorinkubiert. Ein gegen das nachzuweisende Protein gerichteter Antikörper wird im Verhältnis 1:1.000 in 1xTBS, 5 % (G/V) Magermilchpulver verdünnt und eine Stunde mit dem Nitrocellulose-Blatt inkubiert. Danach wird das Blatt fünfmal 3 Minuten lang mit frischem 1xTBS gewaschen und anschließend eine Stunde mit mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Fc-Fragmenten (Promega Biotech Corp., Madison, Wisconsin, USA), die 1:7500 in 1xTBs, der 5 % (G/V) Magermilchpulver enthielt, verdünnt waren, inkubiert. Das Nitrocellulose-Blatt wird wiederum wie oben gewaschen und anschließend in 5 ml alkalische Phosphatase-Puffer gelegt, der 33 ul NBT und 16,5 ul BCIP (50 mg/ml jeweils in Dimethylformamid) enthält und gut gemischt. Nachdem die Banden sichtbar gemacht worden sind, wird das Nitrocellulose-Blatt in Wasser aufbewahrt, um eine Überbelichtung zu verhindern. Vorgefärbte Markierungs-Proteine können als Molekulargewichts-Marker verwendet werden.

Methode 15: Southern-Transfer von DNA auf Nylon-Membranen

Etwa 10 ug Plasmid- oder Parasiten-DNA werden pro Spur mit Elektrophorese auf einem Agarose-Gel (Methode 2) aufgetrennt. Das Gel wird zuerst fotografiert und dann 15 Minuten in 0,5 M Natriumhydroxid, 1,5 M Natriumchlorid-Lösung inkubiert. Danach wird das Gel neutralisiert, indem es zweimal 15 Minuten lang in 0,02 M Natriumhydroxid, 1 M Ammoniumacetat inkubiert und auf eine saubere Glasplatte gelegt wird. Eine Nylonmembran (Hybond N, erhältlich von Amersham) wird auf das Gel gelegt und anschließend werden drei Blätter Whatman 3 MM und etwa 20 Papiertücher aufgelegt. Die Anordnung wird von oben mit einem 500 g Gewicht beschwert. Nach 3 Stunden wird die Membran entfernt und bei Raumtemperatur getrocknet. Die getrocknete Membran wird 5 Minuten lang UV-Licht ausgesetzt mit der Oberseite nach unten auf eine Durchleuchtungsvorrichtung und kann dann gemäß Methode 12 weiterbehandelt werden.

Beispiel

Konstruktion der Expressions-Genbank von P. falciparum

P. falciparum-Zellen (K1-Isolat) wurden in 10 Kulturschälchen gezüchtet, wie von Trager et al., Science 193, 673-675 [1976] beschrieben, und anschließend in Kulturmedium, das 0,1 % Saponin enthielt, gewaschen. Die gewaschenen Parasiten wurden in 2 ml 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 % (G/V) SDS wieder suspendiert. Nach Zugabe von 50 mg Proteinase K wurde die Mischung bei 65ºC 10 Minuten inkubiert und anschließend mit 2 ml Phenol versetzt (gesättigt mit Tris/HCl (pH 8,0)). Die Phasen wurden vermischt durch Schütteln und wiederum durch Zentrifugation (10 Minuten bei 6.000 UPM, 20ºC) getrennt. Die Phenolextraktion wurde zweimal wiederholt (eine Phasengrenzfläche sollte nicht mehr sichtbar sein). Die DNA wurde gemäß Methode 1 ausgefällt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet. Die DNA wurde in 2 ml Wasser gelöst und mechanisch geschert, d.h., indem die DNA-Lösung 80x durch eine Spritze mit einer 0,5x16 mm Nadel gedrückt wurde. Danach wurden 0,2 Volumina 5xEcoR1-Methylase-Puffer (50 mM Tris/HCl, (pH 7,5), 0,25 M NaCl, 50 mM EDTA, 25 mM β-Mercaptoethanol, 0,4 mM S-Adenosylmethionin) zugegeben. 10 ug DNA wurden 30 Minuten bei 37ºC mit 50 Einheiten EcoR1-Methylase (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USA) methyliert. Die DNA wurde einmal mit Phenol extrahiert, wie oben beschrieben, und gemäß Methode 1 ausgefällt. Die DNA wurde in 200 ul T4-Polymerase-Puffer gelöst und nach Zugabe von 5 ul 5 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP ebenso wie von 10 Einheiten T4-Polymerase 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die DNA wurde wiederum mit Phenol extrahiert und gemäß Methode 1 ausgefällt. Die DNA wurde in 50 ul Ligasepuffer gelöst. Nach Zugabe von 0,01 OD&sub2;&sub6;&sub0;-Einheiten phosphorylierter EcoRI-Oligonukleotid-Adaptoren (New England Biolabs) und 2 ul T4-DNA-Ligase (12 Weiss-Einheiten, New England Biolabs), wurden die Adaptoren mit der DNA bei 14ºC über Nacht ligiert. Die DNA wurde gemäß Methode 1 ausgefällt, in 20 ul 1xDNA-Gel-Beladungs-Puffer gelöst und auf einem 0,8 % Agarose-Gel getrennt (Methode 2). DNA-Fragmente mit einer Länge von 2 bis 6 kb wurden gemäß Methode 3 isoliert. Die erhaltene DNA wurde in 50 ul Wasser gelöst und nach Zugabe von 6 ul 10x Ligasepuffer wurden 2 ul dephosphorylierter lambda-Arme (Promega Biotech Corp.) und 6 Weiss-Einheiten T4-DNA-Ligase zugegeben und bei 14ºC über Nacht ligiert. Die DNA wurde ausgefällt (Methode 1) und in 5 ul Wasser gelöst. Nach Zugabe von 20 ul "Packaging Extract" (S. A. Genofit, Genf, Schweiz) wurde die DNA 2 Stunden lang bei 20ºC in Phagenteilchen verpackt gemäß den Angaben des Herstellers. Nach Zugabe von 500 ul SM-Puffer ebenso wie 50 ul Chloroform war die Genbank fertig für den Antikörpertest.

Antikörpertest der Genbank

Die monoklonalen Antikörper 2.13 und 7.12 wurden hergestellt, wie von Hall et al. (oben) beschrieben. Diese MAB's erkennen Polypeptide mit 80 bis 65 kD in Western-Blots.
E. coli-Zellen des Stamms Y1090 wurden in 3 ml LB-Medium über Nacht bei 37ºC inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Zellen 50fach in LB-Medium verdünnt und 2 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Sie wurden dann sedimentiert (10 Minuten mit 7.000 g, 20ºC) und wieder in 5 ml 10 mM Magnesiumsulfat suspendiert
30 Chargen mit 10&sup4; Phagenteilchen aus der Genbank wurden zu 100 ul dieser Zellsuspension zugegeben und die Inkubation wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang durchgeführt. 3 ml 0,8 % Agarlösung in BBL-Medium, das auf 42ºC erwärmt war, wurden zu jeder Charge zugegeben und gut vermischt. Der Weichagar mit den infizierten Zellen wurde auf BBL-Agarplatten (Durchmesser 82 mm) verteilt. Die Agarplatten wurden dann 3,5 Stunden bei 42ºC inkubiert. Ein Nitrocellulose-Filter, der zuerst in 100 mM IPTG-Lösung getaucht und dann getrocknet worden war, wurde auf jede Schale gelegt und die Inkubation wurde 3 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Die Position des Filters auf der Schale wurde markiert. Die Filter wurden 30 Minuten in 1x TBS, 5 % Magermilchpulver, das 0,01 % Antischaum-Mittel A (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) enthielt, inkubiert. Ascites-Flüssigkeit mit monoklonalen Antikörpern, die MAB 2.13 enthielt, wurde 1:1.000 mit 1x TBS/5 % (G/V) Milchpulver verdünnt. Die Filter wurden in Gegenwart der MAB-Ascites-Flüssigkeit bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert und dann einmal 5 Minuten in 1 x TBS, zweimal 5 Minuten in 1 x TBS, 0,05 % Nonidet P40 (Sigma) und noch einmal 5 Minuten lang in 1 x TBS gewaschen. Dann erfolgte eine 30 Minuten lange Inkubation mit einer 1:7500 Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-Antimaus-IgG (Promega Biotech Corp.) in 1 x TBS, 5 % (G/V) Milchpulver. Die Filter wurden wiederum wie oben gewaschen und die Filter bei Raumtemperatur colorimetrisch entwickelt unter Verwendung von 5 ml alkalischem Phosphatase-Puffer, der 33 ul NBT und 16,5 ul BCIP (P+S Biochemicals, England; Katalog Nr. P3771) enthielt. Plaques, die positiv waren, wurden identifiziert und aus den Petrischalen auf Basis der Markierungen herausgepickt. Die Phagen in den einzelnen Plaques wurden in Weichagar in verschiedenen Verdünnungen ausplattiert gemäß Methode 4 und positive Plaques wurden wiederum wie oben beschrieben identifiziert. Ein einzelner positiver Plaque (lambda 2.13) wurde herausgepickt, gemäß Grossberger, Nucleic Acids Res. 15, 6737 [1987] gezüchtet und die DNA wurde isoliert.

Nachweis des von lambda 2.13 exprimierten rekombinanten Proteins

Der Klon lambda2.13 wurde von Plaques gereinigt (Methode 4) und ein Plattenlysat-Phagen-Vorrat wurde hergestellt (Methode 5). Der klonierte Phage lambda 2.13 wurde dann lysogenisiert in E. coli Stamm Y1090 wie folgt. Zu 10 ul Y1090 Plattierungszellen (Methode 6) wurden 106 Plaquebildende Einheiten des Phagen lambda 2.13 zugegeben. LB-Medium (200 ul) wurde zugegeben und die Mischung wurde 3 Stunden auf 30ºC belassen. Die Suspension wurde dann auf eine LB- Platte ausgestrichen und über Nacht bei 30ºC gezüchtet. Die Kolonien wurden isoliert und auf Replica-Platten gepickt, wobei die eine bei 30ºC und die andere bei 42ºC gezüchtet wurde. Die Kolonien, die bei 30ºC, nicht aber bei 42ºC wuchsen, wurden als Lysogene von lambda2.13 betrachtet.
Ein Lysogen von lambda2.13 wurde über Nacht bei 30ºC in 5 ml LB-Medium gezüchtet. Es wurde dann 10fach mit LB-Medium verdünnt und 3 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Die Synthese des Fusions-Proteins wurde induziert, indem IPTG auf eine Endkonzentration von 100 uM zugegeben wurde und die Kultur auf 42ºC gebracht wurde. Nach 30 Minuten wurden 3 ml dieser Kultur mit 12.000 g 5 Minuten lang pelletisiert und in 100 ul SDS-PAGE Beladungs-Puffer wieder suspendiert. Die Probe wurde 5 Minuten gekocht und dann auf ein 10 % SDS- Polyacrylamid-Gel (Methode 13) geladen und mit einer konstanten Spannung von 100 Volt über Nacht laufengelassen. Die Probe wurde dann auf Nitrocellulose-Papier geblottet und immunologisch nachgewiesen unter Verwendung von Antiseren (Methode 14). Sowohl das polyklonale Serum gegen β-Galactosidase als auch der monoklonale Antikörper 2.13 erkannten eine breite Bande, die die Gegenwart eines Fusionsproteins mit einem wahrscheinlichen Molekulargewicht von 150 bis 170 kD zeigte. Ein polyklonales Serum gegen das gereinigte Antigen erkannte auch diese Banden sehr stark.

Analyse und Sequenzierung des geklonten DNA-Inserts

Die lambda 2.13-DNA (2 ug) wurde in dem Puffer mit hohem Salzgehalt gelöst (20 ul), eine Stunde bei 37ºC mit 11 Einheiten EcoRI verdaut und auf einem 0,8 % Agarose-Gel analysiert (Methode 2). Kein Insert wurde beobachtet. Die lambda 2.13 DNA (2 ug) wurde dann in dem Puffer mit hohem Salzgehalt (20 ul) gelöst und eine Stunde bei 37ºC mit 10 Einheiten Mlul verdaut. Ein 3.9 kb DNA-Fragment wurde mit Agarose-Gel-Elektrophorese (Methode 2) beobachtet, was auf ein kloniertes Insert von 1,7 kb hinweist. Ein weiterer Verdau von lambda2.13-DNA (2 ug) in dem Puffer mit hohem Salzgehalt (20 ul) mit 11 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten MluI eine Stunde bei 37ºC lieferte ein DNA-Fragment mit 3,4 kb, was darauf hindeutet, daß die EcoRI-Stelle am 5'-Ende des Inserts erhalten wird, aber die EcoRI-Stelle am 3'-Ende des Inserts verlorengeht.
Die lambda 2.13-DNA (2 ug) wurde dann in Kernpuffer (20 ul) mit 11 Einheiten EcoRI eine Stunde bei 37ºC verdaut. Das Enzym wurde durch Hitze inaktiviert durch 10minütige Inkubation bei 65ºC. Nach Zugabe von 16 ul Wasser, 2 ul 140 mM β-Mercaptoethanol und 2 ul 0,2 % Triton X-100 wurde die DNA weiter verdaut durch Zugabe von 20 Einheiten KpnI. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert und das Enzym dann durch Hitze 10 Minuten bei 65ºC inaktiviert. Ein EcoRI/KpnI-Fragment von 2,7 kb wurde beobachtet mit Agarose-Gel-Elektrophorese (Methode 2). Für die Sequenzierung wurde dieses Fragment in die sequenzierungsvektoren M13 mp18 und M13 mp19 (z.B. erhältlich von New England BioLabs, Beverly, Massachusetts, USA) ligiert. Dies erfolgte, indem 2 ug jedes Vektors mit EcoRI und KpnI verdaut wurden, wie für lambda 2.13 oben beschrieben. Die verdauten Vektoren M13 mp18 und M13 mp19 (40 ng) wurden jeweils zu der mit EcoRI/KpnI verdauten lambda 2.13-DNA (100 ng) in 20 ul Ligasepuffer mit einer Einheit T4-DNA-Ligase zugegeben und über Nacht bei 15ºC inkubiert. Kompetente TG-1-Zellen wurden mit der ligierten DNA transformiert (Methode 7). Weiße Plaques wurden isoliert, amplifiziert und eine ausreichende Menge an DNA für die Sequenz-Bestimmung wurde hergestellt (Methode 8). Ein Minilysatpräparat von RF-DNA (Messing, oben; siehe auch Methode 10) aus dem M13 mp18- Subklon (0,5 ug) wurde in 20 ul Puffer mit mittlerem Salzgehalt gelöst und mit 3 Einheiten HindIII verdaut. In ähnlicher Weise wurde diese DNA auch mit BamHI verdaut. Beide Verdaus zeigten die Gegenwart einer HindIII-Stelle und einer BamHI-Stelle in dem klonierten DNA-Insert. Die DNA- Sequenz des Inserts wurde bestimmt gemäß Methode 9 unter Verwendung der durch die Restriktionsenzym-Analyse der DNA erhaltenen Information. Das Insert hatte die Nukleotidsequenz (1), die oben gezeigt ist.

Methode, um das vollständige Gen, das das 2.13-Antigen codiert, zu erhalten

Ungefähr 60 % des Gens, das das 2.13-Antigen codiert, sind bereits in lambda 2.13 enthalten. Die folgende Methode wurde verwendet, um das vollständige Gen, das das 2.13- Antigen codiert, zu erhalten. DNA (5 ug) von dem Subklon M13 mp18, der das KpnI/EcoRI-Fragment von lambda2.13 enthielt, wurde in 20 ul Puffer mit hohem Salzgehalt aufgenommen und mit den Restriktionsenzymen EcoRI (10 Einheiten) und SalI (10 Einheiten) eine Stunde bei 37ºC behandelt. Die DNA wurde mit Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert (Methode 2) und ein 1,7 kb Fragment wurde isoliert (Methode 3). Etwas von dieser DNA (100 ng) wurde radioaktiv markiert (Methode 11) und hybridisiert (Methode 12) in einem Southern-Blot (Methode 15) von P. falciparum-(K1-Stamm)-DNA (3 ug), die mit HindIII (3 Einheiten) in 20 ul Puffer mit mittlerem Salzgehalt bei 37ºC eine Stunde verdaut worden war. Zwei DNA-Fragmente mit etwa 3 kb und 11 kb wurden beobachtet. Diese zwei DNA-Fragmente waren auch in der Genbank der HindIII-Fragmente von K1-DNA vorhanden, die in dem Vektor lambdaNM1149 (Goman et al., Mol. Biochem. Parasitol. 5, 391-400 [1982]) enthalten waren. Durch Screening dieser Genbank unter Verwendung des oben erwähnten SalI/EcoRI- Fragmentes wurde DNA erhalten, die den Rest des Gens enthielt (jede andere Genbank von P. falciparum könnte für diesen Zweck verwendet werden). Die Lokalisierung dieser Fragmente und ihre Beziehung zu dem Parasiten-Gen erscheint in Figur 1. Sie wurden sequenziert durch Didesoxynukleotid- Kettenabbruch-Verfahren nach Subklonierung in den geeigneten M13-Vektoren. Die Instabilität einiger Subfragmente machte es notwendig, mehrere synthetische Oligonukleotid- Primer zu verwenden, um die Sequenz zu vervollständigen. Die gesamte Sequenz des Gens erscheint in Figur 2.
Die codierende Sequenz liefert eine Anzahl von interessanten Punkten in der Struktur des 2.13-Antigens. Am N-Ende hat sie eine mutmaßliche Signalpeptid-Sequenz (siehe Pfeil in Figur 2A), was darauf hinweist, daß dieses Antigen durch das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat zu seinem Bestimmungspunkt geleitet wird. Das 2.13-Antigen hat keine Transmembran-Domänen oder Oligopeptid-Wiederholungen. Die interessantesten Merkmale sind Sequenzen, die positiv geladene amphiphile α-Helices bilden könnten (in den Figuren 2A,B unterstrichen). Solche Strukturen könnten von dem Protein verwendet werden, um in die Membran des Erythrocyten während der Invasion des Merozoiten einzudringen.
Im einleitenden Teil der Beschreibung wird gesagt, daß Braun-Breton et al. ein Rhoptry-Antigen definiert haben, das sich auf Polyacrylamidgelen ähnlich wie das 2.13-Antigen verhält. Es wird angenommen, daß es Saimiri-Affen schützt und eine Serinprotease ist, die durch Phospholipase C aktiviert wird, was darauf hindeutet, daß sie an die Membran über Glykosylphosphoinosit-(GPI)-Linker gebunden wird.
Die Untersuchung der Aminosäuresequenz des 2.13-Antigens zeigt, daß kein Merkmal, das in der Serinprotease konserviert ist, vorhanden ist, noch gibt es ein mögliches Ziel für die Bindung eines GPI-Linkers. Daraus wird geschlossen, daß das Rhoptry-Antigen von Braun-Breton et al. von dem 2.13-Antigen verschieden ist.

Reinigung des von dem monoklonalen Antikörper 2.13 erkannten Antigens

Gereinigter monoklonaler Antikörper 2.13 wurde an mit Bromcyan aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) gekuppelt unter Verwendung des von den Herstellern empfohlenen Verfahrens. Zellpellets aus Massenkulturen von P. falciparum wurden geerntet und mit mindestens 5 Volumina 1 % (G/V) Nonidet P40, 2 % (G/V) Natriumdesoxycholat, 500 mM Tris/HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM Iodacetamid, 0,2 mM PMSF und jeweils 10 ug/ml Pepstatin, Chymostatin, Antipain, Leupeptin eine Stunde bei 4ºC extrahiert. Frisches PMSF wurde auf 0,2 mM zugegeben und der Extrakt mit 100.000 g 3 Stunden bei 4ºC zentrifugiert. Dem Überstand wurde frisches PMSF auf 0,2 mM zugegeben und dreimal durch eine 10 ml Säule mit an Sepharose 4B gebundenem MAB 2.13, die mit 1 % (G/V) Nonidet P40, 2 % (G/V) Natriumdesoxycholat, 50 mM Tris/HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA, 5 mM EGTA äquilibriert war, geleitet. Die Säule mit an Sepharose 4B gebundenem MAB 2.13 wurde dann mit mindestens 5 Volumina Waschpuffer (1 % Nonidet P40, 0,5 % (G/V) Natriumdesoxycholat, 50 mM Tris/HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA, 5 mM EGTA) gewaschen und anschließend mit 5 Säulen-Volumina Waschpuffer, der zusätzlich 0,9 % NaCl enthielt und schließlich in salzfreiem Waschpuffer wieder äquilibriert, bevor sie mit 50 mM Diethylamin in Waschpuffer bei pH 11,5 eluiert wurde. Die Proteinlösung wurde mit festem Glycin neutralisiert und dann weiter gereinigt, indem das Protein auf ein Polyacrylamid-Gel geladen wurde und die Banden mit einem relativen Molekulargewicht von 65 bis 80 kD und 40 bis 42 kD eluiert wurden, d.h. die Banden, die das durch Affinität gereinigte 2.13-Antigen (siehe oben) darstellten, nach Elektrophorese mit Elektroelution unter Verwendung von wohlbekannten Methoden. Das gereinigte Protein wurde zur Immunisierung von Affen verwendet.

Untersuchungen über den Schutz der Affen

Jedem von vier S. sciureus Affen wurde am Tag 0, Tag 24 und Tag 48 subcutan 1 ml einer Emulsion, die insgesamt 65 ug gereinigtes 2.13-Antigen (= Impfstoff) enthielt, injiziert. Für die erste Injektion wurde das Antigen in Freund's komplettem Adjuvans emulgiert, während für die zweiten und dritten Injektionen das Antigen in Freund's inkomplettem Adjuvans emulgiert wurde. Einer zweiten Gruppe von vier S. sciureus Affen, die als Kontrollgruppe diente, wurden auf gleiche Weise Freund's Adjuvans vermischt mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung injiziert. 60 Tage nach der ersten Injektion wurde den Tieren intravaskulär 3,5x10&sup7; von Parasiten befallene rote Blutkörperchen eines S. sciureus Affen injiziert, der mit dem Palo Alto Stamm von P. falciparum infiziert war. Die anschließende Parasitämie wurde ausgewertet durch tägliche Probennahme von Blut, das erhalten wurde, indem Blut aus dem Ohr der Affen genommen wurde. Der Prozentanteil der Parasitämie wurde bestimmt, indem die Zahl der von Parasiten befallenen roten Blutkörperchen unter dem Mikroskop in 200 optischen Feldern, die jeweils ungefähr 200 rote Blutkörperchen enthielten, ausgewertet wurde. Tiere mit 20 % Parasitämie erhielten eine Arzneimittel-Therapie. Es wurde gefunden, daß 3 von 4 Affen keine Therapie brauchten und daher durch den Impfstoff, der das 2.13-Antigen enthielt, geschützt waren.
Modifikationen und Variationen der Erfindung können erfolgen, ohne vom Sinn und Bereich der Erfindung abzuweichen, was für den Fachmann selbstverständlich ist. Spezifische Ausführungsformen werden nur als Beispiele angegeben und die Erfindung wird nur durch die Ansprüche begrenzt.

Claims

1. Antigenes Polypeptid mit der Aminosäuresequenz

und Fragmente davon, wobei die Fragmente immunologisch kreuzreagierend sind mit Determinanten, die mit den Rhoptry- Organellen der Merazoitform des Malariaparasiten Plasmodium falciparum verbunden sind.

2. Antigenes Polypeptid gemäß Anspruch 1 mit der Aminosäuresequenz

3. Antigenes Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Polypeptid fähig ist, Antikörper in einem Säugetierwirt zu induzieren, wobei die Antikörper fähig sind die Invasion von Säugetier-Erythrozyten durch die Merozoitform des Malariaparasiten in vivo zu verhindern.

4. Antigenes Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 in unglykosylierter Form.

5. Rekombinierte DNA, die für ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.

6. Rekombinierte DNA gemäß Anspruch 5 umfassend eine Nucleotidsequenz, die lautet

oder eine Teilsequenz davon.

7. Rekombinierter Vektor umfassend eine DNA gemäß Anspruch 5 oder 6.

8. Einzelliger Wirtsorganismus, der einen rekombinierten Vektor gemäß Anspruch 7 enthält und, wobei der einzellige Organismus fähig ist, ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zu exprimieren.

9. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung von Antikörpern, die gegen eine antigene Determinante an besagtem Polypeptid gerichtet sind.

10. Polypeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Immunisierung von Säugetieren gegen Malaria.

11. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, welches umfaßt:

(a) Züchten eines einzelligen Wirtsorganismus gemäß Anspruch 8 unter Bedingungen, die die Expression des besagten Polypeptids zulassen; und

(b) Isolieren des Polypeptids aus der Kultur.

12. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren die Verwendung von üblichen Peptidsyntheseverfahren umfaßt.

13. Verfahren zur Herstellung eines einzelligen Wirtsorganismus gemäß Anspruch 8, wobei das Verfahren die Transformation eines einzelligen Wirtsorganismus mit einem rekombinierten Vektor gemäß Anspruch 7 umfaßt.

14. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die gegen Determinanten gerichtet sind, die mit den Rhoptry-Organellen der Merozoitform des Malariaparasiten Plasmodium falciparum verbunden sind, wobei das Verfahren das Injizieren eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in ein Säugetier, das fähig ist, eine Immunreaktion gegen das Polypeptid zu entwickeln, und das Isolieren des gebildeten Antikörpers in bekannter Weise umfaßt.

15. Immunogene Zusammensetzungen, die ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und ein geeignetes Adjuvans enthalten.

16. Immunogene Zusammensetzungen gemäß Anspruch 15 als Impfstoff.

17. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung zur Immunisierung von Säugetieren gegen Malaria.