DE69026975T2

DE69026975T2 - Impfstoff gegen Coccidiosis

Info

Publication number: DE69026975T2
Application number: DE69026975T
Authority: DE
Inventors: Lorraine Elisabeth Clarke; Rein Dijkema; Fiona Margaret Tomly; Arno Vermeulen
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1989-03-28
Filing date: 1990-03-22
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2010-03-23
Also published as: DE69026975D1; CA2013113A1; KR900013983A; HU217793B; GR3020388T3; ZA902147B; KR0165115B1; EP0390267A1; US5677438A; NZ233085A; AU628149B2; ES2090085T3; JPH0395198A; HU901852D0; EP0390267B1; US5814320A; HUT54304A; JP3037359B2; AU5233590A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein mit den immunologischen Eigenschaften der Eimeriaspezies und Fragmente davon, DNA-Sequenzen, die für diese codieren, sowohl rekombinante Vektoren und Wirtsorganismen, die diese DNA- Sequenzen enthalten, als auch Impfstoffe, die das genannte Protein oder Proteinfragmente enthalten, oder DNA, die für diese codiert.
Coccidiose ist eine Krankheit die durch intrazelluläre Parasiten, Protozoen des Unterstamms Apicomplexa und der Gattung Eimeria verursacht wird. Diese Parasiten vermehren sich in Zellen die einen Teil des gastrointestinalen Traktes und der Verdauungsorgane bilden.
Durch die Zunahme der intensiven Produktion ist der Schaden, der durch diese Parasiten in der Geflügelindustrie verursacht wird, in den letzten Jahrzehnten alamierend angewachsen. Zum Beispiel gehen die Verluste, die die Geflügelzüchter in den Niederlanden jedes Jahr erleiden, in die Millionen von Gulden; der Verlust 1986 betrug ungefähr 13 Millionen Gulden; im selben Jahr wurde in den USA trotz der Anwendung von Coccidiostatika ein Verlust von 300 Millionen US-Dollar erlitten.
Die Krankheitserreger von Coccidiose bei Hühnern können in neun verschiedene Spezies unterteilt werden, d. h. Eimeria acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. mitis, E. praecox, E. mivati und E. hagani. Jedoch bezweifeln einige Leute die Existenz der letzten zwei Spezies. Alle diese Arten haben nur das Huhn als Wirt und zeigen einen hohen Grad an Gewebespezifität. Die Lebenszyklen der genannten Arten sind jedoch ähnlich.
Die Arten unterscheiden sich in ihrer krankheitserregenden Wirkung auf Hühner, wobei der Hühnertyp ebenfalls eine Rolle spielt; somit erfährt ein Masthuhn sehr grossen Schaden durch einen Parasiten wie E. acervulina oder E. maxima, weil diese grosse Teile des Dünndarms befallen, wo das Verdauen der Nahrung die Hauptrolle spielt.
Die Eimeriaparasiten durchlaufen während des Lebenszyklus eine Anzahl von Stadien. Das infektiöse Stadium (die sporulierende Oozyste) wird oral aufgenommen und wechselt in den Magen des Huhns über, wo die Wand der Zyste als Resultat der mahlenden Bewegung aufbricht. Die vier Sporozysten, die diese Oozyste enthält, werden freigesetzt und wechseln in den Zwölffingerdarm wo sie Galle und Verdauungsenzymen ausgesetzt sind. Als Resultat entsteht eine Öffnung in der Sporozystenwand und die in der Sporozyste anwesenden Sporozoiten werden freigesetzt. Diese Sporozoiten sind beweglich und suchen geeignete Wirtszellen, Epithelzellen, um in sie eindringen und sich zu vermehren. Abhängig von der Art dauert diese erste Reproduktionsphase 20 bis 48 Stunden und Dutzende bis Hunderte von Merozoiten werden gebildet, wobei wiederum jede in eine neue Wirtszelle eindringt und sich vermehrt. Nach zwei bis manchmal fünf dieser asexuellen Vermehrungszyklen, abhängig von der Art, entwickeln die intrazellulären Merozoiten die sexuelle Form, männliche und weibliche Gametozyten. Nach der Befruchtung des weiblichen durch den männlichen Gameten bildet sich eine Zygote, die um sich herum eine Zystenwand ausbildet. Diese Oozyste verlässt die Wirtszelle und wird mit dern Stuhl ausgeschieden. Wenn die Temperatur und Feuchtigkeit ausserhalb des Huhns relativ hoch sind und gleichzeitig genügend Sauerstoff in der Luft vorhanden ist, kann die Oozyste zum infektiösen Stadium sporulieren.
Somit wird für den Transfer des Parasiten von Huhn zu Huhn kein zusätzlicher Wirt benötigt. Es ist daher denkbar, dass mit einem hohen Grad an Auslastung des verfügbaren Raumes, der Infektionsdruck in einer Hühnerfarm schnell an wächst.
Der Parasit kann auf verschiedene Arten bekämpft werden.
Ausser durch ein gutes Management, kann Coccidiose durch Verabreichung von coccidiostatischen Agentien, die häufig in Futter und Trinkwasser gemischt werden, kontrolliert werden. Jedoch nach die Wirkung dieser Agentien in den letzten Jahren ab, teils wegen der grossen genetischen Fähigkeit des Parasiten, Resistenz gegen verschiedene ihn bekämpfende Agentien zu entwickeln. Ausserdem hinterlassen eine Anzahl dieser Agentien Rückstände im Fleisch, was zu Problemen im Verbrauch führen kann.
Immunologische Vorsorge würde daher eine viel bessere Bekämpfungsmethode darstellen. Es ist bekannt, dass Hühner die eine genügend starke Infektion durchlebt haben, imstande sind, einem anschliessenden Kontakt mit demselben Typ von Eimeria zu wiederstehen. Resistenz gegen Eimeria kann auch durch mehrfaches Infizieren der Vögel mit schwachen Dosen von Oozysten oder mit Oozysten von geschwächten (nicht krankheitserregenden) Stämmen ausgelöst werden. Jedoch ist eine kontrollierte Verabreichung insbesondere an grosse Zahlen von Masthühnern in diesem Fall ein praktisch unüberwindbares Problem. Inaktivierte Impfstoffe scheinen somit eine mögliche alternative Lösung zu sein.
Ein inaktivierter Impfstoff kann aus einem vom Parasiten abstammenden Antigen bestehen, möglicherweise mit einem Adjuvans.
Als Alternative für die Verwendung eines aus dem Parasiten isolierten Antigens ist es möglich, ein mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie hergestelltes Produkt zu verwenden, einer Technik, die gemäss bekannter Verfahren durchgeführt werden kann.
Es ist ebenfalls möglich, das Antigen oder Teile davon synthetisch zu reproduzieren und es den Vögeln in einer immunologisch erkennbaren und stimulierenden Form, zum Beispiel an ein Trägerprotein in Anwesenheit eines Adjuvanten gebunden, zu verabreichen.
Ferner kann die Impfung durch das Verabreichen eines lebenden Wirtsorganismus, wie ein Bakterium oder ein Virus in das ein für das Antigen codierendes Gen eingebaut wurde, durchgeführt werden. Dieser Organismus garantiert dann eine angemessene Langzeitsynthese des Antigens, so dass das Immunsystem des Huhns entsprechend stimuliert wird.
EP-A-O 167443 offenbart E. tenella-Polypeptidantigene von 94 und 105 kD Molekulargewicht, welche für die Herstellung eines Coccidioseimpfstoffs verwendet werden.
Ein E. tenella-Polypeptidfragment mit der Aminosäuresequenz 406-712 von Figur 8 der vorliegenden Erfindung wird in EP-A-O 344808 offenbart, welches den Stand der Technik gemäss Artikel 54(3) EPC umfasst.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein Protein (genannt Etp100) oder ein Fragment davon zur Verfügung gestellt, das für die Immunisierung von Geflügel gegen Coccidiose eingesetzt werden kann. Genanntes Protein ist durch die Aminosäuresequenz in Figur 8 gekennzeichnet.
Genanntes Protein Etploo kann aus einem Extrakt von E. tenella durch Auftragen des genannten Extraktes auf ein Säulensubstrat, das den monoklonalen Antikörper E. TEN. 11P-2 enthält, durch Trennen der adsorbierten Fraktion von der nicht adsorbierten Fraktion des Extraktes und durch nachfolgendes Freisetzen der absorbierten Fraktion vom Säulensubstrat durch im Stand der Technik bekannte Verfahren isoliert werden.
Das durch dieses Immunchromatographieverfahren erhaltene Proteinmaterial kann, wenn gewünscht, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Reinigung von auf natürliche Weise erhaltener Produkte weiter gereinigt werden
Charakterisierung des so erhaltenen Proteins Etp100 von E. tenella zeigte die folgenden Eigenschaften:
a. Molekulargewicht in der SDS-PAGE von ungefähr 100 kD;
b. Binden an den monoklonalen Antikörper E. TEN. 11P-2 unter nicht-reduzierenden Bedingungen, aber nicht unter reduzierenden Bedingungen;
c. Auftreten in der sporulierten Oozyste, Sporozyste, im Sporozoiten, in der ersten und zweiten Generation der Schizonten und in der zweiten Generation der Merozoiten.
Das 100 kD Protein kann geeigneterweise sowohl aus Sporozoiten als auch aus Merozoiten, von aus verschiedenen Quellen erhaltenen E. tenella, isoliert werden.
Überdies können Proteine die Etp100 entsprechen, aus anderen Eimeriaspezies wie E. maxima und E. acervulina isoliert werden. Die Idendifikation dieser entsprechenden Proteine wurde durch Züchten von Mausantiserum gegen ein Fragment des genannten 100 kD Proteins von E. tenella und Einsetzen der Antikörper dieses Antiserums in einem Westernblotassay unter Verwendung von E. maxima- und E. acervulina- Sporozoiten etabliert, wie in Figur 5 dargestellt. Es wurde festgestellt, dass die Proteine, die auf diese Art nachgewiesen werden können, ähnliche Molekulargewichte wie Etp100 von E. tenella besitzen. Dasselbe Antiserum kann für die immunchromatographische Auftrennung der genannten Proteine von E. maxima und E. acervulina verwendet werden.
DNA Sequenzen, die für das E. tenella-Protein oder Polypeptidfragmente davon codieren, wurden sowohl von genomischer DNA als auch von E. tenella-mRNA stammender, komplementärer DNA (cDNA) erhalten, wie die folgenden Beispiele verdeutlichen. Diese DNA-Sequenzen (wie auch Teilsequenzen davon), zusammen mit den Polypeptiden mit Eimeria-Antigenität, die durch diese DNA Sequenzen und Teilsequenzen codiert werden, sind ebenfalls Teil dieser Erfindung, vorausgesetzt das genannte Protein kommt nicht ausschliesslich in der Aminosäuresequenz 406-712 von Figur 8 vor.
Es ist bekannt, dass eine gegebene Aminosäure oft durch mehrere verschiedene Codons (Triplets aus Nukleotidbasen) in der DNA codiert werden kann. Somit ist zum Beispiel das Codon für Glutaminsäure GAT oder GAA, etc. Es ist offensichtlich, dass für die Expression des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz gemäss Figuren 6-8 (oder eines Polypeptidfragments davon) von einer DNA mit einer ähnlichen alternativen Codonzusammensetzung ebenfalls Gebrauch gemacht werden kann.
Ausserdem sind Fragmente dieser Polypeptide, die für die Immunisierung von Geflügel gegen Coccidiose verwendet werden können, auch Teil dieser Erfindung, vorausgesetzt das genannte Protein kommt nicht ausschliesslich in der Aminosäuresequenz 406-712 von Figur 8 vor.
Mehrere Verfahren sind für den Nachweis solcher verwendbarenbaren Polypeptidfragmente (genannt Epitope) innerhalb einer bekannten oder unbekannte Aminosäuresequenz bekannt. Auf der Basis einer bekannten Aminosäuresequenz können diese Epitope zum Beispiel experimentell mit Hilfe der in Patentpublikationen WO 84/03564 und WO 86/06487 beschriebenen Screeningverfahren bestimmt werden.
Darüberhinaus können eine Anzahl von Regionen des Polypeptids mit der festgestellten Aminosäuresequenz auf der Basis theoretischer Überlegungen und struktureller Übereinstimmung mit Epitopen, die nun bekannt sind, als Epitope bezeichnet werden. Die Bestimmung dieser Regionen basierte auf einer Kombination des Hydrophiliekriteriums gemäss Hopp und Woods (PNAS USA 78: 3824-3828; 1981) und den Sekundärstrukturaspekten gemäss Chou und Fasman (Advances in Enzymologie 47: 45-148; 1987).
Die folgenden Regionen enthalten vermutliche Epitope für Antikörper (siehe Figur 8): Aminosäurenummern ungefähr 270- 300 und ungefähr 495-525.
Künftig bilden sowohl die Aminosäuresequenzen ISPQKPGSPPCPTCEAPRGRSCAEQPPGLTR und PVDEVVGDWEDWGQCSEQCGGGKRTRNRGPS als auch Polypeptide die die erste der genannten Sequenzen enthalten, Teil der vorliegenden Erfindung.
Möglicherweise notwendige T-Zellenepitope können ebenfalls aufgrund theoretischer Grundlagen mit Hilfe von Berzofsky's Amphiphilizitätskriterium (Science 235: 1059-62; 1987) hergeleitet werden.
Für die Immunisierung gegen Coccidioseinfektion gemäss der vorliegenden Erfindung ist es zum Beispiel auch möglich anti- Idiotypenantikörper oder Antigenbindungsfragmente davon zu verwenden. Solche Antikörper sind gegen den Idiotyp der Antikörper gerichtet, die wiederum gegen die Polypeptide gemäss der Erfindung gerichtet sind. Die immunogenen Äquivalente der Polypeptide gemäss der Erfindung, auf die oben hingewiesen wurde, sollen unter anderem anti-Idiotypantikörper von diesem Typ bedeuten.
Für die Immunisierung von Geflügel gegen Coccidiose gemäss der vorliegenden Erfindung ist es möglich, entweder die vorliegenden Polypeptide, Fragmente oder immunogenen Äquivalente den Vögeln zu verabreichen, oder alternativ, Mikroorganismen zu verabreichen, die durch genetische Manipulation unter Verwendung rekombinanter DNA- oder RNA- Techniken die Fähigkeit erhalten haben, die vorliegenden Polypeptide oder immunogenen Abschnitte oder Äquivalente davon in situ zu produzieren.
"Untereinheitsimpfstoff" ist ein häufig verwendeter Begriff für den ersteren Fall, "Vektorimpfstoff" wird gewöhnlich für den letzteren Fall verwendet - wir werden uns diese Nomenklatur hier ebenfalls aneignen.
Die Untereinheitsimpfstoffe gemäss der Erfindung enthalten die Polypeptide im allgemeinen in gereinigter Form, wahlweise in der Anwesenheit eines pharmazeutisch geeigneten Excipienten.
Die Polypeptide für solche Anwendungen können mit Hilfe bekannter Verfahren hergestellt werden, wie durch Isolation aus Eimeria, durch rekombinante DNA-Techniken oder durch Peptidsynthese.
Das Polypeptid kann wahlweise kovalent an ein nicht verwandtes Protein gebunden sein, das zum Beispiel bei der Reinigung des Fusionsproduktes von Vorteil oder eine Hilfe bei der Umwandlung in ein reifes Protein sein kann. Beispiele sind β- Galaktosidase, Protein A, Prochymosine, Blutgerinnungsfaktor Xa, etc.
Wenn gewünscht, kann das Polypeptid ebenfalls in vivo oder in vitro modifiziert werden, zum Beispiel durch Glykosylierung, Amierung, Carboxylierung, Acylierung oder Phosphorylierung.
Um ihre Immunogenität zu verstärken, können diese Polypeptide geeigneterweise gebunden werden an, oder assoziiert werden mit einem Träger und/oder mit Verbindungen, die Adjuvanseigenschaften besitzen, kombiniert werden. Weiterhin kann ein Impfstoff der auf diesen Polypeptiden basiert, andere, gewöhnlich in Impfstoffen verwendete Verbindungen enthalten, wie Stabilisatoren, Puffer, etcetera.
In Vektorimpfstoffen wird das Polypeptidprodukt gemäss der Erfindung von einem genetisch manipulierten Organismus hergestellt, der dem zu immunisierenden Individuum selber verabreicht wird und der sich im Körper einige Zeit erhält oder sogar reproduziert. Verschiedene Organismen können für diesen Zweck als Wirt verwendet werden, so zum Beispiel Bakterien wie Escherichia coli, Bacillus oder Salmonella oder Viren wie Kuhpocken- oder Geflügelpockenvirus. In Wirtsorganismen dieses Typs, kann sich das Polypeptid als Oberflächenantigen exprimieren. In diesem Zusammenhang sind Fusion des genannten Polypeptids mit OMP-Proteinen oder Pilus-Proteinen von Escherichia coli oder synthetisches Anfügen von Signal- und Ankersequenzen, die vom Organismus erkannt werden, denkbar. Es ist auch möglich, dass das genannte immunogene Polypeptid, wenn gewünscht, als Teil einer grösseren Einheit innerhalb des zu immunisierenden Tieres freigesetzt wird. In all diesen Fällen ist es ebenfalls möglich, dass ein oder mehrere immunogene Produkte exprimiert werden, die Schutz gegen verschiedene Krankheitserreger und/oder gegen verschiedene Antigene eines gegebenen Krankheitserregers erzeugen.

Beispiel 1

Herstellung von Hybridomazellen

Präparation von Parasiten und Fraktionen davon

E. tenella-Parasiten wurden gehalten und Oocysten wurden gemäss den von Long et al. (Fol. Vet. Lat. 6: 201-217; 1976) beschriebenen Verfahren isoliert. Sporozoiten wurden wie beschrieben von Wisher & Rose (Parasitology 88: 515-519, 1984) mit einer zusätzlichen, von Larsen, et al. (J.Parasitol. 70: 597-601; 1984) beschriebenen Nylonwollereinigung isoliert und gereinigt. Merozoiten der zweiten Generation wurden 96 Stunden post infektionem durch das Verfahren von Stotish & Wang (J. Parasitol. 61: 700-703; 1975) aus Hühnerblinddärmen isoliert und weiter durch Zentrifugation in einem kontinuierlichen 70%-igen Percollgradienten gereinigt.

Immunisierung und Zellfusion

Balb/C-Mäuse wurden mit 10&sup6; E. tenella-Sporozoiten immunisiert, intraperitoneal verabreicht in 0,5 ml PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung), gefolgt von einer Boosterimfpung mit der gleichen Dosis und Weg vier Tage vor der Fusion. Sechs Wochen nach der ersten Immunisierung wurden die Milzen steril entfernt und die Zellen wurden mit der Myelomalinie P3X63Ag 8. 6. 53, wie von Köhler und Milstein beschrieben (Nature 256: 495-7; 1975) fusioniert und gemäss Standardprotokollen gezüchtet.

Auswahl der Hybridomas

Hybridomas wurden auf Erkennung von Sporozoitenantigenen durch Verwendung eines Immunfluoreszenzassays (IFA) ausgewählt. Die Sporozoiten wurden in PBS (1-3 × 10&sup6; pro ml) suspendiert und in Volumen von 3 µlh auf 10 Loch- Glassobjektträger (Celline) getropft, über Nacht getrocknet und bei -70ºC aufbewahrt.
Nach dem Auftauen und Fixieren der Objektträger in Aceton wurden 25 µl des Hybridomaüberstandes in jedes Loch getropft und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Objektträger wurden in PBS gespült und 3 mal 5 Minuten in PBS gewaschen.
Markiertes Hase-anti-Maus FITC (Nordic; Fluorisothiocyanat) wurde als Konjugat in der Verdünnung 1:100 bis 200 verwendet und 30 Minuten bei 37ºC in der Anwesenheit von 0.05% Evans Blau als Gegenfärbung inkubiert. Nach dem Waschen und Spülen wurden die Objektträger mit 0.1 mol/l Tris-HCl; pH 9.0; 75%-igem Glycerin bedeckt und unter Verwendung eines Leitz Ortholux Fluoreszenzmikroskops untersucht. Hybridomas, die sich in diesem Assay als positiv erwiesen, wurden durch begrenzende Verdünnung weiter kloniert, erneut untersucht und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt oder direkt in mit Pristan vorbehandelten Balb/c Mäusen ihr die Ascitesproduktion injiziert (2.5 × 10&sup6; Hybridomazellen pro Maus i.p.). Von diesen positiven Hybridomas wurden zwei Klone ausgewählt, die brauchbare Antikörper produzierten. Diese monoklonalen Antikörper bezeichnet als E. TEN. 11P-2 beziehungsweise E. TEN. 10Y-2, erkannten im IFA sowohl E. tenella-Sporozoiten als auch Merozoiten der zweiten Generation. Beide Fluoreszenzmuster waren gleich. Und beide monoklonalen Antikörper banden an in der hinteren Hälfte des Zoiten befindliches Material, möglicherweise an ein zytoplasmatisches Protein.

Hinterlegung von Proben

Proben von Hybridomazelllinien, die diese E. TEN 11P-2- und E. TEN. 10Y-2-Antikörper produzieren, wurden am 2. Februar 1989 unter der Nummer 89020202 beziehungsweise Nummer 89020201 in der European Collection of Animal Cell Cultures in Porton Down, England hinterlegt.

Beispiel 2

Charakterisierung der monoklonalen Antikörpern E. TEN 11P-2 und E. TEN. 10Y-2

A. Verfahren

Zielantigene von Moak E. TEN 11P-2 und E. TEN. 10Y-2 wurden unter Verwendung von SDS-PAGE/ Immunblotting-Techniken wie von Vermeulen et al. (J. EXP. Med. 162: 1460-76; 1985) beschrieben, charakterisiert. Kurz, 2 × 10&sup7; frisch von der Cystenwand befreite, über Nylonwolle gereinigte Sporozoiten wurden in Laemmli-Probenpuffer (Natur 227: 680-4; 1970), ohne Zugabe von reduzierenden Agentien wie DTT oder β-Mercaptoethanol, gelöst. Nach 5-minütigem Kochen und 3-minütiger Zentrifugation bei 18000 g wurde der Überstand entfernt, auf 20% Glycerin gebracht und auf ein 7 bis 18%-iges Acrylamid- Gradientengel (oder ein 12%iges gleichförmiges Gel) mit einem 4%-igen Stacking-Gel, geladen.
Nach der elektrophoretischen Auftrennung wurden die Proteine auf Nitrozellulosepapier (0,45 µm; Schleicher & Schuell) in 0,01 mol/l Tris; 0,079 mol/l Glycin; pH 8,3 bei 10 V/cm eine Stunde geblottet.
Für den Immunnachweis wurden die Nitrozellulosestreifen in 0,2% fettfreiem Milchpulver (NFMP) in PBS 30 Minuten vorbehandelt und 90 Minuten bei Raumtemperatur mit zehnfach verdünnten Hybridomaüberständen in PBS, 0,05% Tween -20; 0,1% NFMP inkubiert, ausgiebig gewaschen und mit anti-Maus-Ig, markiert mit alkalischer Phosphatase, inkubiert. Gebundenes Ig-Konjugat wurde mit Nitroblautetrazol (0,33 mg/ml) und 5- Brom-4-chlor-3-indoylphosphat-p-Toluidinsalz (0,17 mg/ml) in 100 mmol/l Tris/HCl; pH 9,5; 100 mmol/l NaCl; 5 mmol/l MgCl&sub2; dargestellt.

B. Ergebnisse

Die monoklonalen Antikörper E. TEN 11P-2 und E. TEN. 10Y-2 reagierten auf Westernblots von nicht-reduzierten E. tenella Sporozoyten-Merozoyten-Proteinen mit Banden von 95 bis 110 kD (Fig.1). SDS-PAGE-Molekulargewichtsmarker von Bio Rad wurden als Referenz verwendet. Mit spezifischen Antiseren wurden E. TEN 11P-2/ E. TEN. 10Y-2 im ELISA als IgG1-Isotypen charakterisiert.

Beispiel 3

Expression des mit Moak E. Ten. 11P-2 reaktionsfähigen Antigens während der Entwicklung des Parasiten

A. Verfahren

Westernblots wurden mit Laufspuren, die vergleichbare Mengen an sporulierten Oozysten, gereinigten Sporozysten und gereinigten Sporozoiten enthielten, ausgeführt. Westernblots wurden sowohl mit monoklonalen Antikörpern als auch mit Hühner-Hyperimmunserum gemäss dem in Beispiel 3A beschriebenen Verfahren, geprüft.
Hühner-Hyperimmunserum wurde in neun Hühnern (7 Wochen alt) durch orale Verabreichung von zwei Dosen 2 × 10&sup4; lebender E. tenella-Oozysten innerhalb von 4 Tagen, gefolgt von vier 10&sup4; Dosen in viertägigen Intervallen, gezüchtet. Eine Woche nach der letzten Dosis wurden alle Hühner ausgeblutet. Das Serum wurde vereint und der anti-Sporozoitentiter wurde im Immunfluoreszenzassay, wie in Beispiel 1 beschrieben, als 1:1280 bestimmt.

B. Ergebnisse

Es wurde gezeigt, dass die 95-110 kD Proteine, die die Zielproteine von Moak E. TEN. 11P-2 und E. TEN. 10Y-2 sind, bereits in der sporulierten Oozyste anwesend sind und auch im Sporozysten- und Sporozoitenstadium exprimiert werden. Die 95-110 kD Proteine wurden vorherrschend durch das Hyperimmun- Hühnerserum erkannt (Fig. 2).

Beispiel 4

Immunchromatographische Reinigung des E. tenella Proteins

Herstellung von Immunaffinitätssäulen

IgG von E. TEN 11P-2 wurde mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bei 50%-iger Sättigung und Raumtemperatur aus Ascitesflüssigkeit gefällt. Das Material wurde 30 Minuten mit 2500 UpM in einer Minifuge T (Heraeus Christ) abzentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 50% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gewaschen und mit der Hälfte des ursprünglichen Volumens 0,2 mol/l NaHCO&sub3; resuspendiert, über Sephadex G25 (Pharmacia PD10 Säulen) gemäss den Instruktionen des Herstellers entsalzt und über Nacht bei 4ºC an eine BrCN- aktivierte Sepharose (Pharmacia) gekoppelt. Die endgültige Kopplungsrate war 6,7 mg IgG pro ml Gel. Für E. TEN. 10Y-2 wurde IgG mit Protein A-Sepharose (Pharmacia) gemäss den Instruktionen des Herstellers konzentriert und von Ascitesflüssigkeit gereinigt. Nach Neutralisierung und Entsalzen wurde die Kopplung wie oben mit einer endgültigen Kopplungsrate der E. TEN. 10Y-2-Säule von 4.8 mg/ml Gel ausgeführt.
5-7 ml IgG-gekoppelter Sepharose wurde in eine geeignete Säule gegossen und in Laufpuffer äquilibriert (25 mmol/l Tris/HCl; pH 8,0; 0,5 mol/l NaCl; 0,1% NP40).

Immunaffinitätsreinigungen von Etploo

320 × 10&sup6; E. tenella-Sporozysten, als Pellet gefroren bei -70ºC, wurden aufgetaut und in 3 ml 25 mmol/l Tris/HCl; pH 8,0; 1 mmol/l EDTA; 1 mmol/l PMSF resuspendiert.
Die Zysten wurden durch Vortexen in Anwesenheit von 3 g Glasperlen ( 0.3 mm Durchmesser) aufgebrochen. Die Lösung wurde auf 0,1% Nonidet P40 (NP40) gebracht und eine Stunde bei 0ºC inkubiert. Ungelöstes Material wurde bei 4ºC durch 15-minütiges Zentrifugieren mit 2000 UpM, gefolgt von einstündigem Zentrifugieren mit 3000 UpM abzentrifugiert. Der Überstand wurde vor der Auftragung auf die Immunsäule durch 0,22 µm Filter gegeben.
5 ml des E.-tenella Sporozystenextraktes wurden an die E. TEN. 11P-2- und E. TEN. 10Y-2-Säulen mit einer Fliessrate von 0,15 ml/min. in einem rezirkulierenden System über Nacht bei Umgebungstemperatur gebunden.
Nach ± 20 Durchläufen wurde die nicht gebundene Fraktion gesammelt und für weitere Analysen aufbewahrt. Die Säulen wurden mit mindestens drei abwechselnden Zyklen des Waschgangs 4 (0,1 mol/l Acetat; 0,5 mol/1 NaCl; 0,1 % NP40; pH 4,0) und des Waschgangs 8 (0,1 mol/l Tris/HCl; 0,5 mol/l NaCl; 0,1 % NP40; pH 8,0), Fliessrate 0,5 ml/min. gewaschen. Nach Waschen mit zwei Bettvolumen Laufpuffer, wurden 4 ml von 0,1 mol/l Karbonat/Bikarbonat; pH 10,6; 0,1% NP40 für die alkalische Elution verwendet.
Die Fraktionen wurden mit 1 mol/l Tris pH 8.0 neutralisiert und die Säule wurde mit Laufpuffer re-äquilibriert. Die nachfolgende Elution wurde mit 0,1 mol/l Glycin/HCl; 0,15 ml/l NaCl; 0,1% NP40; pH 2,6 ausgeführt. Die sauren Fraktionen wurden mit 1 mol/l Tris; ph 8,0 neutralisiert.
Alle Fraktionen wurden auf SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen und auf Westerblots mit polyklonalem Hase-anti-Sporozoiten-Serum als Testantikörper analysiert (Figur 3). Von beiden Säulen wurde die Hauptfraktion unter sauren Bedingungen eluiert. Von der E. TEN 11P-2 Säule eluiertes Material reagierte positiv mit den E. TEN 10Y-2 MoAk (nicht dargestellt).

Beispiel 5

Herstellung der cDNA Bibliothek von E. tenella und immunologisches Screening

A. Isolation der RNA

Für die Isolation der RNA wurden vollständig sporulierte Oozysten in 2,8 ml Puffer, enthaltend 10 mmol/l Tris-Acetat (pH 7,6); 75 mmol/l Natriumacetat; 1% SDS; 2 mmol/l EDTA; 0.2 mg/ml Proteinase K und 10 mmol/l Vanadylribonukleosid-Komplexe, aufgenommen. Die Oozysten wurden durch Vortexen für 60 Sekunden (max.) in Anwesenheit von 13 g Glasperlen (∅ 0.5 mm) aufgebrochen. 5 ml Phenol wurden dem gesamten Extrakt zugegeben und die Mischung wurde weitere 60 Sekunden gevortext. Nach dem Zentrifugieren wurde die wässrige Phase abpipettiert und mit dem gleichen Volumen einer Mischung aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol (25:24:1) noch einmal extrahiert. RNA wurde nach Zugabe von 2,5 Volumen Ethanol gefällt und das resultierende Präzipität wurde in 800 µl eines Puffers, der 10 mmol/l Tris; 0,1 mmol/l EDTA; pH 7.6 enthält, gelöst und danach zwei weitere Male mit dem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert und dann mit Ethanol gefällt. Poly A&spplus; -RNA wurde mittels Oligo(dT)-Zellulose-Chromatographie (Maniatis et al., ibid) isoliert. Ungefähr 100 µg Poly A&spplus; -RNA wurden aus 5 × 10&sup8; Oozysten isoliert.

B. cDNA-Synthese

Poly A&spplus; -RNA wurde durch das Enzym MMLV Reverse Transkriptase in cDNA umgewandelt. Zu diesem Zweck wurden 25 µg Poly A&spplus; -RNA in 90 µl Wasser gelöst und durch Zugeben von Quecksilbermethylhydroxid bis 10 mmol/l während 5 Minuten bei 20ºC denaturiert, worauf β-Mercaptoethanol bis 45 mmol/l zugegeben und die Mischung für weitere 3 Minuten bei 20ºC inkubiert würde. Die Enzymreaktion wurde in 190 µl Puffer, enthaltend 4 µg Oligo(dT)&sub1;&sub5;, 150 E RNAsin , 20 mmol/l Tris (pH 7,6), 30 mmol/l KCl, 4 mmol/l Dithiothreitol (DTT), 2 mmol/l MgCl&sub2;, 1 mmol/l von jedem dNTP und 3000 E MMLV Reverse Transkriptase, durchgeführt. Die Reaktion wurde nach einer Stunde Inkubation bei 37ºC durch Zugabe von 10 µl 0,5 mol/l EDTA gestoppt. Nach Extraktion mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) wurde das RNA/DNA Hybrid durch Zugabe von Ammoniumacetat bis 2 mol/l und 2,5 Volumen Ethanol gefällt. Die kombinierte Wirkung der Enzyme DNA Polymerase I und RNAse H resultiert in der Synthese des zweiten Stranges. Das Pellet wurde in 960 µl Puffer, enthaltend 20 mmol/l Tris (pH 7,6), 5 mmol/l MgCl&sub2;, 100 mmol/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,6 mmol/l β-NAD, 16 E RNAse H, 200 E DNA- Polymerase I und 20 E DNA-Ligase (E. coli), gelöst. Die Inkubationszeit betrug eine Stunde bei 12ºC und dann eine Stunde bei 22ºC, worauf die Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumens an Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:- 24:1) gestoppt und mit Ethanol gefällt wurde.
Bevor die cDNA in einen für diesen Zweck geeigneten Vektor kloniert wurde, wurde sie zuerst modifiziert. cDNA (5 µg) wurde in 100 µl Puffer, enthaltend 30 mmol/l Natriumacetat (pH 5,6), 50 mmol/l NaCl, 1 mmol/ ZnSO&sub4; und 21 E Mung Bean Nuklease, gelöst. Nach dreiminütiger Inkubation bei 37ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von EDTA bis 10 mmol/l und Tris bis 25 mmol/l gestoppt. Nach Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) wurde die Mischung über eine Sephadex G50-Säule entsalzt.
Folgendes wurde zum Eluat (125 µl) gegeben: Tris pH 7,6 bis 50 mmol/l, EDTA bis 2,5 mmol/l, DTT bis 5 mmol/l, S'- Adenosylmethionin bis 0,5 µg und 100 E EcoRI- Methylase. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37ºC wurde die Reaktion durch 15- minütiges Erhitzen auf 65ºC gestoppt und danach 1/10 Volumen einer Lösung, die 100 mmol/l Tris-HCl, 100 mmol/l MgCl&sub2;, und 500 mmol/l NaCl (ph 7.5) enthält, zugegeben und, zur gleichen Zeit, jedes dNTP bis 1 mmol/l und 12.5 E Klenow DNA- Polymerase. Die Reaktion wurde nach 60-minütigem Inkubieren bei 22ºC durch Zugeben des gleichen Volumens Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) gestoppt. In der wässrigen Phase befindliche Nukleinsäuren wurden nach Zugabe von 350 µl H&sub2;O und 50 µl 3 mol/l Natriumacetat (pH 5,6) mit 500 µl Isopropanol gefällt. Nach Lösen in 100 µl H&sub2;O wurde das Pellet über eine Sephadex G-50 Säule entsalzt und das Eluat mit Ethanol gefällt.
Nach Lösen des Pellets in 24 µl H&sub2;O wurde die Ligation in 50 µl durch Zugabe von 2 µg EcoRI-Linker, Tris-HCl (pH 8.0) bis 30 mmol/l, MgCl&sub2; bis 10 mmol/l, Dithiothreitol bis 10 mmol/l, ATP bis 1 mmol/l, Gelatin bis 0.1 mg/ml und 10 E T4- DNA-Ligase, durchgeführt. Die Reaktion wurde nach 16-stündiger Inkubation bei 4ºC durch Erhitzen (15 Minuten auf 70ºC) gestoppt, worauf das Schneiden mit Restriktionsendonuklease EcoRI in 210 µl Puffer, der 100 mmol/l TrittHCl (pH 7,6) 50 mmol/l NaCl, 10 mmol MgCl&sub2;, 2,5 mM DTT und 500 E EcoRI enthielt, durchgeführt wurde. Nach 90-minütiger Inkubation bei 37ºC wurde die Reaktion durch Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) gestoppt. Die in der wässrigen Phase befindlichen Nukleinsäuren wurden mit 2,5 Volumen Ethanol, nach Zugabe von Natriumacetat (pH 5,6) bis 300 mmol/l, gefällt, cDNA und Linker wurden mittels einer Biogel A15m-Säule getrennt. Die cDNA wurde mit Ethanol gefällt, worauf das Präzipitat in 10 mmol/l Tris-HCl, 0.1 mmol/l EDTA (pH 7,6) gelöst wurde. Die cDNA Moleküle wurden dann sowohl in den Phagen λgt11 als auch in den Phagen λgt10 kloniert, gemäss Huyn et al. in: DNA Cloning Techniques: A Practial Approach, 1984.

C. Screening von λgt11 cDNA-Bibliotheken mit MoAk E.TEN.11P- 2

Proteine, die von mit λgt11 cDNA-Klonen infizierten E. coli Y1090&supmin; hergestellt wurden, wurden wie beschrieben (Huyn et al., ibid) auf Nitrozellulosefilter immobilisiert. Das Immunscreening der cDNA Bibliothek mit MoAk E. TEN. 11P-2 resultierte in einer positiven Reaktion von ungefähr 1 in 2 × 10&sup5; Phagenklonen. Die monoklonalen Antikörper wurden über Protein A-Sepharose gereinigt und mit einem Volumen Tris- Puffer (10 mmol/l Tris-HCl; 150 mmol/l NaCl; pH 8,0) plus 0.05% Tween 20 und 10% FCS verdünnt. Die Inkubation der Filter dauerte zwei Stunden bei 25ºC. Die Filter wurden vier Mal für 10 Minuten mit 50 ml des oben genannten Tris-Puffers plus 0.05% Tween 20 gewaschen. Die zweite Antikörperinkubation mit einem Konjugat von Ziege-anti-Maus-Antikörper und Alkalischer Phosphatase (verdünnt 1:7500 mit dem obigen Tris-Puffer plus 0,05% Tween 20 und 10% FCS) wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt, worauf die Filter, wie für die erste Antikörperinkubation beschrieben, gewaschen wurden. Gebundene alkalische Phosphatase wurde nach Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in 100 mmol/l Tris-HCl; 100 mmol/l NaCl; 10 mmol/l MgCl&sub2;; pH 9,6;, das 0,33 g/l Nitroblau-Tetrazol und 0,17 g/l 5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat enthielt, nachgewiesen.
Ein Klon, der im Immunassay positiv war, wurde plaquegereinigt und dieser Klon wurde als Klon Et100 bezeichnet (siehe Fig. 7).

Beispiel 6

Herstellung der genomischen Bibliothek von E. tenella und immunologisches Screening

A. Verfahren

E. coli Stämme

E. coli Y1088 (supE supF strA metB trpR hsdR hsdM tonA21 ΔlacU169 (proC::Tn5) (pMC9)), Y1089 (ΔlacU169 proA&spplus; Δlon araD139 strA hfla150 (chr::Tn10) (pMC9))und Y1090 (ΔlacU169 proA&spplus; Δlon araD139 strA supF (trpC22::Tn10) (pMC9)) wurden von der American Type Culture Collection erhalten.

Isolation von DNA

Die Isolierung von chromosomaler E. tenella-DNA, von Hühner-DNA und E. coli-DNA wurde wie von Clarke et al. Mol. Biochem. Parasitol., 22: 79-87; 1987 beschrieben, durchgeführt.

Konstruktion der genomischen Bibliothek

E. tenella-DNA wurde partiell mit Eco RI (Bethesda Research Laboratories) verdaut und mit Eco RI verdautem, mit intestinaler Kälberphosphatase (Boehringer Mannheim) behandeltem λamp3 unter Verwendung von T4 DNA Ligase (Boehringer Mannheim) bei 4ºC 16 Stunden ligiert. Das endgültige Ligationsvolumen für 1 µg DNA war 10 µl und das Verhältnis Vektor:Insert betrug 4:1. λamp3 wurde von Kemp et al. (P.N.A.S. USA 80: 3787; 1983) aus λgt11 entwickelt. Die Phagen wurden in vitro gepackt (Maniatis et al, Cold Spring Harbor Laboratoriy, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; 1982), inkubiert mit E. coli Stamm Y1088 und in Anwesenheit von X- Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-thiogalaktopyranosid) und IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid) (Bachem) ausplattiert. Diese Bibliothek wurde vor dem Screening vermehrt (Maniatis et al., ibid.) und der Titer bestimmt.

Immunologisches Screening der genomischen Bibliothek und Herstellung von Antiseren

Durchgeführt wie von Clark et al. (ibid.) beschrieben.

B. Ergebnisse

Der rekombinante Bakteriophage EtHL6 enthält ein 722 bp EcoRI Restriktionsfragment von E.-tenella DNA. Siehe auch Fig. 7. Von EtHL6 erzeugte Plaques wurden ursprünglich als Antikörper-positiv identifiziert, dem Screening der genomischen Bibliothek mit Hühnerimmunserum folgend.

Beispiel 7

Charakterisierung von EtHL6 Fusionsprotein

A. Verfahren

Affinitätsselektion des Antikörpers

Bakteriophagen (1 × 10&sup4;) einer EtHL6-Stammlösung wurden in 9 cm Schalen auf E. coli Stamm Y1090 auspiattiert und drei Stunden bei 42ºC inkubiert. Jede Seite eines Filters, mit IPTG wie vorher behandelt, wurde mit der Oberfläche der Platten zwei Stunden bei 42ºC in Kontakt gebracht. Die Filter wurden bei Raumtemperatur eine Stunde mit Hühnerimmunserum (mit E. coli vor-absorbiert und 1:20 in PBS, pH 7,0 mit 1% BSA verdünnt) inkubiert. Nach dem Waschen wurden gebundene Antikörper mit 5 ml 0,2 mol/l Glycin (pH 2,8) 10 Minuten eluiert, dann mit 650 µl einer Lösung die 2 mol/l Tris (80 µ 1); 10 × PBS (500 µl); 2 mg/ml Chloramphenicol (50 µl) und 0.25 g BSA umfasst, neutralisiert. Der ausgewählte Antikörper wurde ohne weitere Verdünnung verwendet, um Westernblots von Sporozoiten- und Merozoiten-Proteinen zu testen.

Fusionsproteine

E. coli Stamm Y1089 wurde mit Phagen, wie in Beispiel 6B beschrieben, lysiert und die Lysate wurden aus einem ml log- Phasenkulturen hergestellt (Coppel et al., Nature 306: 751- 756; 1983).

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

Gewaschene Sporozoitenpellets oder gelöste Phagenlysate wurden in 2% (G/V) Natriumdodecylsulfat; 6 mol/l Harnstoff; 5% (V/V) 2-Mercaptoethanol; 0,49 mol/l Tris-HCl; pH 6,7 unter 5-minütigem Kochen gelöst. Nach 5-minütigem Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge wurde den Überständen 50% (V/V) Glycerin mit 0,1% (G/V) Bromphenolblau zugegeben. Die Gele waren diskontinuierlich, mit einem 3,6% (G/V) Acrylamid Spacer-Gel pH 6,7 und einem 6-14%-igen (G/V) Acrylamid- Gradiententrenngel, pH 8,9 (16 × 0.1 cm). Die Elektrophorese wurde bei 50-70 V (konstante Spannung) 16 Stunden durchgeführt und die Banden wurden, Proteinen gemäss mit 0.2%-igem (G/V) PAGE Blau 83 (BDH Chemikalien) in 35 % (V/V) Methanol, 10 % (V/V) Essigsäure angefärbt.

Immunblotting von Polypeptiden

Nach der SDS-PAGE wurde das Gelstück 30 Minuten in 500 ml 25 mmol/l Tris; 192 mmol/l Glycin; pH 8,3; 20 % (V/V) Methanol (Transferpuffer) äquilibriert Polypeptide im Gel wurden elektrophoretisch in einer Transblot-Transferzelle (Bio-Rad Laboratories) auf Nitrozellulosepapier (Towbin et al., PNAs 76: 4350-4354; 1979) (Schleicher & Schuell, BA 85, 0,45 µm) transferiert. Die Elektrophorese wurde mit Transferpuffer bei 4ºC 16-22 Stunden bei 30 V konstanter Spannung durchgeführt. Nach dem Transfer wurde das, die Sporozoitenproben enthaltende Nitrozellulosepapier in PBS pH 7,0 mit 3% (G/V) Rinderserumalbumin (BSA; Sigma A4503) blockiert. Die Nitrozellulosestreifen mit den transferierten Markerproteinen wurden mit Indian-Ink angefärbt. Die Blots wurden mit immun- oder normalem Hühnerserum (1:200 Verdünnung in 1 % (G/V) BSA; PBS; pH 7,0; 0.05 % (V/V) Tween 20) eine Stunde bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die Blots wurden fünf Mal je fünf Minuten in PBS; pH 7,0; 0,05% Tween 20 gewaschen, bevor die Inkubation eine Stunde bei Raumtemperatur mit Affinitätsgereinigten Hase-anti-Hunhn-IgG- (H+L)-Peroxidasekonjugat (Zymed Laboratories Inc.; 1:200 Verdünnung in 1% (G/V) BSA; PBS; pH 7,0; 0,05 % Tween 20) durchgeführt wurde. Die Blots wurden dann weitere fünf Mal wie oben beschrieben gewaschen. Bindung des Peroxidasekonjugates wurde durch Einwirken von 0,5 mg/ml Diaminobenzidin; 50 mmol/l Tris-HCl pH 7,4; 200 mmol/l NaCl und 0,03% (V/V) H&sub2;O&sub2; auf die Nitrozellulose nachgewiesen. Die Reaktion wurde durch Waschen des Blots in PBS pH 7,0; 0,05 % Tween 20 gestoppt.

B. Ergebnisse

SDS-PAGE und Westernblot-Analyse des von EtHL6 produzierten β-Galaktosidase-Fusionsproteins bestätigte seine Reaktion mit dem Immunserum und auch mit dem Maus anti-β- Galaktosidase-Serum. Die Grösse des von Eimeria-DNA codierten Polypeptids wurde auf 35,5 kD (Mittel zweier Gele) geschätzt.
Die nativen Proteine, die dem EtHL6-Antigen entsprechen, wurden mit Antikörpern identifiziert, die entweder in Mäusen oder in Hasen duch Injektion von Polyacrylamidgelstücken gezüchtet wurden, die EtHL6-Fusionsprotein oder affinitätsgereinigte Protein aus Hühnerimmunserum enthalten. Diese Antikörper reagierten stark mit einem Polypeptid-Duplett von 110,0 + 1,0 kD (Mittel ± S.E.M., n= 12) auf Westernblots von Proteinen, die aus beiden, Sporozoiten und Merozoiten der zweiten Generation Merozoiten von E. tenella isoliert wurden (Fig. 4, einzelne Pfeilköpfe). Eine schwächere Reaktion mit einem dritten Sporozoitenpolypeptid von 94.0 ± 1.0 kD (n= 5) erscheint in Fig. 4 (Doppeipfeilköpfe). Ein gleiches Polypeptid wurde in Merozoiten identifiziert.
Das Maus-Antiserum gegen das EtHL6-Fusionsprotein reagierte auch mit kleinen Gruppen von Polypeptiden, auf Westernblots von Proteinen aus E. maxima- und E. acervulina Sporozoiten (Fig. 5). Die Molekulargewichte der Polypeptide entsprachen denen, die auf Westernblots von E. tenella-Proteinen reagieren, zwischen von 108 bis 92 kD für E. maxima und von 102 bis 94 kD für E. acervulina.

Beispiel 8

Charakterisierung von EtHL6-verwandten DNA-Sequenzen

A. Verfahren

Analyse von DNA

Aus Lysaten von Platten wurden Phagenstammlösungen hergestellt und DNA extrahiert. Plasmid- und Cosmid-DNA wurden mit Standardtechniken gereinigt (Maniatis et al., ibid.). Nach Verdauen mit Restriktionsendonukleasen in Anwesenheit von 50 µg/ml RNAse, wurde die DNA auf Agarosegelen in 40 mmol/l Tris-HCl, 20 mmol/l Natriumacetat, 0,1 mmol/l EDTA (ph 8,3) (TAE Puffer) aufgetrennt.

DNA Hybridisierungen

Restriktionsverdaungen von genomischer, Phagen-, Cosmid- und Plasmid-DNA wurden auf 1%-igen Agarosegelen aufgetrennt und auf Genescreen (New England Nuclear) in 25 mmol/l Phosphatpuffer pH 6,5 mit dem Verfahren von Southern (J. Mol. Biol. 98: 503-517; 1975) transferiert. Hybridisierung mit DNA Sonden, die mit einer Nicktranslations-Garnitur gemäss den Anleitungen des Herstellers (Amersham) mit ³²P-markiert wurden, fand bei 37ºC 16 Stunden in 1 × Denhardt's Lösung (0,1 % (G/V) SDS und 4 x Natriumcitratsalzlösung (SSC) statt. Kobniehybridisierung wurde nach dem Verfahren von Grundstein und Hogness (P.N.A.S. USA 72: 3961-3965; 1975) durchgeführt.
Die DNA-Insertion von Klon EtHL6 wurde durch Elektroelution (Maniatis et al., ibid.) aus einem 1 % Agarosegel in 40 mmol/ Tris-HCl; 20 mmol/l Natriumacetat ; 0.1 mmol/l EDTA; pH 8,3 gereinigt.
Autoradiographie wurde bei -70ºC unter Verwendung von Dupont Intensifying Screens und Fuji RX Röntgenfilmen durchgeführt.

Konstruktion und Screening einer Cosmid-Bibliothek aus genomischer E. tenella-DNA

Genomische DNA von E. tenella wurde partiell mit Mbo I verdaut, mit Bam HI verdautem Cosmid pHC79 ligiert und gemäss Maniatis et al (ibid.) verpackt. Ungefähr 500 Kolonien von der unvermehrten Bibliothek wurden mit Nick-translatierter, gereinigter EtHL6-Insertion als Sonde durchgemustert. Der Cosmid-Klon 7.46 (die Insertion wird als Etg 100 bezeichnet - siehe auch Fig. 7) wurde mit einer Anzahl verschiedener Restriktionsendonukleasen verdaut, die Fragmente auf Agarosegelen aufgetrennt, mit Southernblot auf Nitrozellulose überführt und wiederum getestet, um die Restriktionsfragmente zu identifizieren, die EtHL6-verwandte Sequenzen enthalten.

Screening der E. tenella cDNA-Bibliothek in λgt10

cDNA-Klone der mRNA von sporulierten E. tenella-Oozysten in λgt10 wurden mit der nick-translatierten, gereinigten EtHL6-Insertion als Sonde, wie oben beschrieben, durchmustert. Einundzwanzig positive Phagen wurden gefunden. Einer von diesen (cDNA 10 - die Insertion wird als Etc100 bezeichnet - siehe auch Fig. 7) wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt.

Sequenzieren der Klone

Die Insertionen von EtHL6 und EtHL6-verwandten Klonen (Cosmid Etg100 und Etc100) wurden vor dem Sequenzieren in, entweder von M13mp, pUC13 oder pAT153 abstammende Vektoren&sub1; subkioniert. Sequenzierreaktionen wurden nach dem Dideoxyverfahren ausgeführt (Bankier & Barrell, Techniques in Life Sciences (Biochemistry) 85: Techniques in Nucl. Acids Bioch. 1-34; 1983).

B. Ergebnisse

Physikalische Kartierung der DNA von EtHL6 zeigte&sub1; dass die Grösse der EcoRI-Insertion annähernd 700 bp betrug und das es eine einzige HindIII Schnittstelle enthält. Nukleotidsequenzanalyse legte die exakte Grösse der Insertion mit 722 bp fest und bestätigte das Vorhandensein einer HindIII-Stelle nahe einem Ende der Insertion. Das Leseraster wurde in Hinblick auf das bekannte Leseraster der EcoRI-Klonierungsstelle im λamp3-Vektor festgelegt, das in der Produktion eines Fusionsproteins resultieren würde. Das einzige grosse offene Leseraster (ORF,) das identifiziert wurde, war so orientiert, dass die HindIII-Stelle in Bezug auf das β- Galaktosidase-Gen im entfernteren Teil der Insertion plaziert war. Restriktionskartierung der EtHL6 Bakteriophagen-DNA bestätigte, dass dies tatsächlich die aktive Orientierung war.
Da das EtHL6-Fragment nicht das gesamte Gen enthält, wurde eine Cosmid-Bibliothek partiell verdauter genomischer DNA von E. tenella gescreent und ein rekombinantes Cosmid 7.64 isoliert. Southernblots verschiedener Restriktionsenzymverdauungen dieses Cosmids zeigte zwei HindIII-Fragmente von ungefähr 3 kb und 1,3 kb, die mit der Sonde hybridisierten. Ein weiteres 1,7 kb HindIII-Fragment, das 3' von dem 1,3 kb HindIII-Fragment liegt, wurde identifiziert.
Die 3 kb HindIII- (H3), 1,3 kb HindIII- (H3A), 1,35 EcoRI- (E5) und 1,7 kb HindIII- (C4) Fragmente wurden in pUC 13 subkloniert und deren Nukleotidsequenzen bestimmt, die eine 5990 bp lange aufeinanderliegende genomische Sequenz mit dem EtHL6-Fragment, das sich von Position 2359 bis 3080 erstreckt, ergaben. Diese Nukleotidsequenz ist in Figur 6 dargestellt.
Zusätzlich zum genomischen Sequenzieren wurde die Sequenz von einem cDNA-Klon, cDNA10, einer λgt10-Bibliothek bestimmt, die durch Hybridisierung mit der EtHL6-Insertion identifiziert wurde. Die Insertion ist 3402 bp lang, beginnt an Position 688 auf der genomischen Sequenz und endet an Position 4993 mit drei dazwischenliegenden, in der genomischen Sequenz identifizierten, nicht codierenden Regionen (Introns). Die von diesem cDNA-Klon erhaltenen Sequenzdaten stimmen mit der genomischen Sequenz, die in Fig. 6 gezeigt wird, überein. Es gibt eine zusätzliche Sequenz von A(17) am 3'- Ende von Etc100, die den Poly A-Schwanz von Etc100 darstellt.

Aneinanderreihung von EtHL6 - verwandten Sequenzen

Fig. 7 zeigt die Anneinanderreihung von EtHL6, Etg100, Etc100 und Et100.
Die Positionen der Enden von Etc100 werden zusammen mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz und den genomischen Introns in Figur 6 gezeigt. Etc100 scheint nicht auf seiner ganzen Länge codierend zu sein. Am 5'Ende befindet sich ein einzelnes Stop-Codon bei den Nukleotiden 9-11 (TAG, Nukleotide 696-698 der genomischen Sequenz von Fig. 6) im Anschluss auf das unmittelbar in dem gleichen Leseraster die vorhergesagte codierende Sequenz folgt, die ihr erstes mögliches Startcodon bei Nukleotid 78-80 (ATG, Nukleotide 765-767 der genomischen Sequenz von Figur 6) hat und ununterbrochen weiterläuft bis Nukleotid 2213 (Nukleotid 3804 der genomischen Sequenz von Figur 6), wo sie innerhalb des Leseasters von einem Stopcodon (TAA) gefolgt wird. Auf dieses folgen vor dem 3'Ende 1189 bp einer offensichtlich nicht codierenden Sequenz gefolgt.
Das Polypeptid das durch dieses offenen Leseraster vorhergesagt wird, hat eine Länge von 712 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 74,8 kD. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz ist in Figur 8 zusammen mit einer Tabelle der Sequenzzusammensetzung dargestellt. Diese Sequenz wurde für mögliche Antikörperbindungsepitope unter Verwendung der Algorithmen von Hopp und Woods (ibid.) und Chou und Fassman (ibid.) analysiert, die in den folgenden Epitopregionen resultierte: 270-300 und 495- 525.

Beispiel 9

Konstruktion eines rekombinanten Geflügelpestvirus, der Et100 exprimiert

A. Plasmidkonstruktion

1 µg des Plasmids p1019, das das Gesamte Etc100 ausser den 362 Nukleotiden am 3'-Ende enthält, wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII geschnitten.
Das Etc100 BamHI/HindIII-Fragment enthält den BamHI- bis EcoRI Teil des puC13 Polylinkers stromaufwärts der 5'-nichtcodierenden Sequenz und das vorhergesagte offene Leseraster und Enden bei der HindIII-Stelle innerhalb der 3' nichtcodierenden Region (Position 4309-4314 in Figur 6c). Der Restriktionsverdau wurde an den Enden mit 10 Einheiten T4 DNA-Polymerase und 10 Einheiten E. coli DNA-Polymerase (grosses Fragment) repariert und dann in eine stumpfe Insertionsstelle in ein mit Geflügelpestvirus-rekombiniertes Plasmid kloniert. Bakterienkolonien, die Plasmid mit der Etc100-Insertion enthalten, wurden mit einer ³²P-markierten Etc100-Sonde identifiziert und die Orientierung der Insertion wurde durch Restriktionsverdau von DNA aus Minipräparationen bestimmt. Es wurde ein Plasmid identifiziert, dass die Insertion in der korrekten Orientierung zur Expression in Geflügelpestvirus enthält. Ein Oligonukleotid, das komplementär zu einer Region, die genau im für Etc100 vorhergesagten offenen Leseraster liegt (Nukleotide 788-802 in Figur 6a), wurde als Primer verwendet, um die Verbindungsstelle der Etc100-Sequenz und dem mit Geflügelpestvirus rekombinierten Plasmid direkt von der Plasmid DNA zu sequenzieren. Dies Sequenzieren bestätigte, dass das Etc 100-BamHI/HindIII- Fragment, dem Transkriptions-Promoter des Geflügelpestvirus benachbart und in der richtigen Orientierung zu diesem vorlag.

B. Rekombinante in Geflügelpestvirus

Plasmid wurde mit Kalziumphosphat-Standardtechniken in mit Geflügelpestvirus-Stamm FP9 infizierte Hühnerembryofibroblasten (CEFS) transfiziert. Rekombinante Viren wurden isoliert und dreimal plaquegereinigt. Ein rekombinanter Virus, als Geflügelpestvirus E10 bezeichnet, wurde für weitere Untersuchungen verwendet. Eine Master-Stammlösung von E10 wurde durch Animpfen einer 25 cm²-Flasche mit Virus eines einzelnen Plaques erhalten und das resultierende Virus wurde in Aliquots bei -20ºC aufbewahrt. Submaster-Stammlösungen wurden durch Animpfen von 20 125 cm²-Flaschen mit 0,1 plaquebildenden Einheiten (P.b.E.) der Master-Stammlösung pro Zelle erhalten. Alle Stammlösungen wurden durch Plaquebildung auf CEF's unter Verwendung von Standardtechniken titriert.

C. Expression von Et100 durch Geflügelpestvirus E10

Subkonfluente Monolayer von CEF in 25 cm²- oder 125 cm²- Flaschen wurden mit 0,1 P.b.E. Geflügelpestvirus E10 pro Zelle infiziert. Infizierte Zellen wurden zu verschiedenen Zeiten post infektionem durch Abkratzen in phosphatgepufferte Salzlösung pH 7,0 geerntet und durch Zugabe des gleichen Volumens an 2 Laemmli-Puffer lysiert. Die Lysate (Äquivalent von ungefähr 106 infizierten Zellen) wurden 5 Minuten gekocht, dann auf ein 10 %-iges Polyacrylamidgel geladen und die Elektrophorese über Nacht bei 100 V durchgeführt. Äquivalente Lysate von mit elterlichem Geflügelpestvirus infizierten Zellen wurden daneben laufen gelassen.
Die Gele wurden mittels Elektroblotting unter Verwendung von Standardtechniken auf Nitrozellulose übertragen und die Nitrozellulosemembranen wurden mit Antiseren gegen Eimeria tenella inkubiert. In den Lysaten von E10 wurde ein Polypeptid in der Grösse von ungefähr 100 kD durch Hase-anti- Sporozoiten-Antiserum und Antiserum rekonvaleszenter Hühner erkannt. Dieses Polypeptid war im Lysat der mit elterlichem Geflügelpestvirus infizierten Zellen nicht vorhanden. Das 100 kD Polypeptid wurde zwei Tage post infectionem mit einer Infektionsmultiplizität von 0,1 P.b.E. nachgewiesen und dauerte bis 7 Tage an, zu welchem Zeitpunkt der Monalayer vollständig durch viruszytopathische Wirkungen zerstört war. Das Polypeptid wurde sowohl auf reduzierenden als auch nichtreduzierenden Gelen nachgewiesen.

D. Impfung mit Geflügelpestvirus, das Et100 exprimiert

1) Gruppen von drei Wochen alten Vögeln (Helle Sussex) wurden intravenös mit 3 × 10&sup7; P.b.E. von elterlichem Geflügelpestvirus (Group I) oder rekombinantem Geflügelpestvirus E10 (Gruppe II) angeimpft, welches in 500 µl des Gewebekulturmediums 199 angesetzt wurde. Eine dritte Gruppe wurde nur mit Medium 199 angeimpft (Gruppe III) Alle Vögel erhielten eine zweite, identische Injektion in der fünften Lebenswoche und zehn Tage nach dem Booster wurden alle ausgeblutet. ELISA-Titer sowohl gegen Geflügelpestvirus als auch aufgebrochene, sporulierte Eimeria tenella-Oozyten wurden nachgewiesen. Über 90% der Vögel der beiden mit den Viren angeimpften Gruppen hatten Antikörper gegen das Geflügelpestvirus, die unter 1 in 64000 austitrierten, wo hingegen Vögel in der Kontrollgruppe vernachlässigbare Titer zeigten. Die Titer gegen Eimeria tenella waren nicht signifikant erhöht, aber bei einer Verdünnung von 1 in 1000 waren die Werte der optischen Dichte in der E10 Gruppe leicht erhöht (Beispiel siehe unten). ELISA-Werte bei einer 1 in 1000 Antiserenverdünnung Gruppe anti-FPV (Mittel) Anti-E.t(Mittel)
Antiseren jeder Gruppe von zehn Vögeln wurden vereint und verwendet, um Westernblots von elektrophoretisch aufgetrennten Proteinen von Eimeria tenella-Sporozoiten oder Merozoiten nungen von 1 in 1000 erkannten die vereinten Antiseren der mit rekombinantem E10 angeimpften Vögel, das Et100 Polypeptid sowohl der Sporozoiten als auch der Merozoiten, während Seren der anderen Gruppen es nicht erkannten.
2) Gruppen von einer Woche alten Vögel wurden durch kleine Einschnitte ins Flügelgewebe mit 3 × 10&sup6; P.b.E. entweder von elterlichem oder rekombinantem Geflügelpestvirus E10 angeimpft in 50 µl Gewebekulturmedium 199. Eine dritte Gruppe Vögel wurde nur mit Medium 199 angeimpft. In der vierten Lebenswoche wurde den Vögel eine zweite Impfung verabreicht, aber diesmal mit 3 × 10&sup7; P.b.E. des entsprechenden Virus, wieder in 50 µl 199 Medium. Von vier Wochen an wurden alle Vögel in wöchentlichen Intervallen geblutet und die Seren verwendet, um Westernblots von elektrophoretisch aufgetrennten Proteinen von Eimeria tenella-Sporozoiten und Merozoiten der zweiten Generation zu testen. Nach vier Wochen wurde keine Reaktivität nachgewiesen, jedoch eine Woche später (eine Woche nach der zweiten Inokulation) erkannten die Vögel, die Et10 erhalten hatten, Et100 sowohl von Sporozoiten als auch von Merozoiten.

Legenden zu den Figuren

Figur 1

Westernblots von E. tenella-Sporozoiten und Merozoiten der zweiten Generation, getestet mit monoklonalen Antikörpern.
A. Sporozoitenblot getestet mit E. TEN 10Y-2 (Spur 1), E. TEN 11P-2 (Spur 2)
B. Merozoitenblot getestet mit E. TEN 10Y-2 (Spur 1), E. Ten 11P-2 (Spur 2)

Figur 2

Expression von Etp100 (Pfeil) in verschiedenen sporogenen Stadien. Westernblot von SDS-PAGE-geetrenntem Material verschiedener Stadien, getestet mit Hühner-Hyperimmunserum
Spur 1: sporulierte Oozysten
Spur 2: Sporozysten
Spur 3: Sporozoiten

Figur 3

Immunaffinitätsreinigung von Etp100 (Pfeil) von E. tenella- Sporozysten mit monoklonalen Antikörpern gegen E. Ten 11P-2 oder E. TEN 10Y-2.
A. Silber-gefärbtes SDS-PAGE von Glyzin/HCl(pH 2.6)-eluierten Fraktionen und Ausgangsmaterial
Spur 1: eluiert aus E. TEN 10Y-2 Säule
Spur 2: eluiert aus E. Ten 11P-2 Säule
Spur 2: eluiert aus E. Ten 11P-2 Säule
Spur 3: Ausgangsmaterial
B. Westernblot von Ausgangsmaterial und pH 2,6-eluierten Fraktionen, die mit polyklonalem Hase-anti-Sporozoiten-Serum getestet wurden.
Spur 1: Ausgangsmaterial
Spur 2: eluiert aus E. Ten 11P-2 Säule
Spur 3: eluiert aus E. TEN 10Y-2 Säule

Figur 4

Identifizierung von nativen, EtHL6-Antigen entsprechenden Proteinen.
Tafel A. Antikörper wurden mit Protein von Plaques ausgewählt, die durch rekombinante EtHL6 Bakteriophagen (Spuren 1 und 5) und λamp3 erzeugt wurden (negative Kontrolle; Spuren 2 und 6), Hühnerimmunserum (Spuren 3 und 7) und normales Hühnerserum (Spuren 4 und 8) wurde verwendet, um Westernblots von reduzierten E. tenella-Proteinen von Sporozoiten-(Spz) und Merozoiten(Mz)-Proteinen zu testen.
Tafel B. Antiseren, die gegen das EtHL6-Fusionsprotein gezüchtet wurden.
Maus-anti-EtHL6-Fusionsprotein (Spuren 1 und 7), Hase-anti- EtHL6-Fusionsprotein (Spuren 2 und 8), Hasenantiserum gezüchtet gegen Proteine, die von einem λamp3-Lysogen produziert werden, die auf einem SDS-PAGE Gel in der gleichen Region wie das EtHL6-Fusionsprotein laufen (negative Kontrolle ; Spuren 3 und 9), normales Hasenserum (Spuren 4 und 10), Hühnerimmunserum (Spur 5), normales Hühnerserum ( Spur 6) und Antiserum, das gegen E. tenella-Sporozoiten in Hasen (Spur 11) gezüchtet wurde, wurden verwendet um Westernblots von reduzierten Proteinen der E. tenella-Sporozoiten-(Spz) und/ oder Merozoiten (Mz)-Proteinen zu testen.
Die einfachen Pfeilkipfe zeigen die Position der Polypeptiddupletts von 110 und 102 kD; die Position eines dritten Polypeptids von 94 kD ist durch doppelte Pfeilköpfe dargestellt (siehe Text für weitere Details). Die Molekulargewichtsmarker waren Myosin, 200 kD; Phosphorylase, 92 kD; Rinderserumalbumin, 67 kD; Ovalbumin, 45 kD; Karbonanhydrase, 28 kD und Myoglobin, 19 kD.

Figur 5

Nachweis von nativen Polypeptiden von heterologen Spezies, dem EtHL6-Antigen entsprechend.
Maus-Antiseren, die gegen das EtHL6-Fusionsprotein (Spuren 1, 3 und 5) und Proteine, die von λamp3-Lysogen produziert wurden, in der gleichen Region wie das EtHL6 Fusionsprotein auf dem SDS-PAGE Gel laufen (negative Kontrolle, Spuren 2, 4 und 6), wurden für Westernblots von reduzierten Sporozoitenproteinen aus E. tenella (Spuren 5 und 6), E. maxima (Spuren 3 und 4), E. acervulina (Spuren 5 und 6) reagieren gelassen. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker sind bezeichnet.

Figur 6

Die Nukleotidsequenz von genomischer E. tenella-DNA (Etg100) erstreckt sich von Nukleotid 1- 5990. Die genomische Insertion von EtHL6 entspricht den Nukleotiden 2359 bis 3080. Die dargestellte transiatierte Aminosäuresequenz ist diejenige, die für Etc100 vorhergesagt wurde. Drei genornische Introns sind durch gestrichelte Regionen und die 5'-und 3'- Enden von Etc100 sind durch dicke Punkte bezeichnet.

Figur 7

Schematische Ausrichtung von EtHL6 und EtHL6-verwandten genomischen und cDNA-Squenzen.
Die 5'-und 3'-Enden sind durch dicke Punkte bezeichnet. Die drei genomischen Introns sind durch gestrichelte Regionen bezeichnet.

Figur 8

Die vorhergesagte Aminosäuresequenzen von Etp100 und eine statistische Analyse des Aminosäurengehaltes.

Claims

1. Polypeptid mit den immunologischen Eigenschaften von Eimeria tenella, gekennzeichnet durch die in Figur 8 dargestellte Aminosäuresequenz oder ein Fragment davon, vorausgesetzt das genannte Fragment kommt nicht ausschliesslich in der Sequenz 406-712 von Figur 8 vor.

2. Polynukleotidsequenz die für ein Polypeptid oder ein Polypeptidfragment gemäss Anspruch 1 codiert.

3. Polynukleotidsequenz gemäss Anspruch 2 gekennzeichnet durch die Nukleotidsequenz dargestellt in Figur 6 oder eine Teilsequenz davon.

4. Polynukleotidsequenz gemäss Anspruch 2 gekennzeichnet durch die Nukleotidsequenz dargestellt in Figur 6.

5. Rekombinanter Vektor, der eine Polynukleotidsequenz gemäss Ansprüchen 2-4 enthält positioniert in Hinblick darauf, Sequenzen zu kontrollieren, die die Expression der genannten Polynukleotidsequenz ermöglichen.

6. Wirtsorganismen die mit dem Vektor gemäss Anspruch 5 transfiziert wurden.

7. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder Proteins oder eines Fragments davon mit Antigeneigenschaften einer Eimeriaspezies, dass das Züchten eines Wirtsorganisrnus gemäss Anspruch 6 umfasst.

8. Antikörper oder Antiserum immunreaktiv mit einem Polypeptid oder einem Fragment gemäss Anspruch 1, vorausgesetzt dass es nicht mit einem Epitop reagiert, das auschliesslich in der Aminosäuresequenz 406-712 von Figur 8 vorkommt.

9. Verfahren zur Isolation eines Polypeptids oder eines Fragments gemäss Anspruch 1, das im wesentlichen besteht aus:

a. Immunadsorbtion eines Extraktes einer Eimeriaspezies an ein Säulensubstrat, das Antiserum gemäss Anspruch 8 enthält;

b. Trennen der adsorbierten Fraktion des Extraktes von der nicht adsorbierten Fraktion; und

c. Freisetzen der adsorbierten Fraktion von Säulensubstrat.

10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Säulensubstrat den monoklonalen Antikörper Et11P-2, hinterlegt unter Nummer 89020202 bei der ECACC, enthält.

11. Impfstoff mit schützender Aktivität gegen Eineriamfektion, der ein Polypeptid oder Fragment gemäss Anspruch 1, ein Polynukleotid gemäss Ansprüchen 2-4, einen rekombinanten Vektor gemäss Anspruch 5, einen Wirts- Organismus gemäss Anspruch 6, Antikörper gemäss Anspruch 8, oder ein Protein, gereinigt gemäss dem Verfahren der Ansprüche 9-10, enthält.

12. Polypeptid mit der Aminosäuresequenz ISPQKPGSPPCPTCEAPRGRSCAEQPPGLTR als auch Polypeptide die diese Sequenz enthalten.

13. Polypeptid mit der Aminosäuresequenz PVDEVVGDWEDWGQCSEQCGGGKRTRNRGPS.