DE3586609T2

DE3586609T2 - Antigenische proteine, dieselben enthaltende vakzine, schuetzende antikoerper dagegen fuer die verhuetung von durch eimeria tenella verursachte coccidiosis.

Info

Publication number: DE3586609T2
Application number: DE8585200889T
Authority: DE
Inventors: Virginia Mary Brothers; James Gordon Files; Thomas C Gore; Karel Z Newman; Leland Shawn Paul; Gary R Petersen; Randy R Simonson; John L Tedesco
Original assignee: Solvay SA
Current assignee: Dimminaco AG
Priority date: 1984-06-05
Filing date: 1985-06-05
Publication date: 1993-04-08
Anticipated expiration: 2005-06-06
Also published as: ATE80310T1; EP0164176B1; JPH0699475B2; EP0164176A2; CA1340520C; AU4332985A; AU585512B2; JPS6169798A; EP0164176A3; IL75455A; DE3586609D1

Description

Die Anmeldung ist eine Continuation-in-part-Anmeldung der U.S. Serial Nr. 617 483, eingereicht am 5. Juni 1984, deren Inhalt in die vorliegende Anmeldung durch diesen Hinweis einbezogen wird.
Verschiedene Veröffentlichungen innerhalb dieser Anmeldung werden durch arabische Ziffern in Klammern indiziert. Vollständige Zitate dieser Literaturstellen befinden sich am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen. Die Offenbarung dieser Publikationen sind in ihrer Gesamtheit durch diesen Hinweis in die Anmeldung einbezogen, um den Stand der Technik umfassender anzuführen, wie er dem Fachmann am Tag der Erfindung beschrieben bekannt war und hierin geltend gemacht wird.
Das Phylum Apicomplexa schließt Hunderte von verschiedenen Organismen ein, die zur Ordnung Eucoccidiorida gehören. Die Gattung Eimeria ist innerhalb der Ordnung echter coccidischer Mittel eingeschlossen. Von den Organismen, die zu dieser Gattung gehören, sind einige Arten als bedeutsam für die Geflügelindustrie erkannt worden. Diese Arten sind Eimeria tenella, maxima, E. acervulina, E. necatrix, E. brunetti, E. mivati, E. mitis und E. praecox.
Die Artendifferenzierung richtet sich nach der Infektionsstelle innerhalb des Wirts und der Oocystenmorphologie. Bislang wurden biochemische Marker nicht zur Speziation verwendet, obwohl Unterschiede für jede der vorstehenden Art beobachtet wurden.
Bei Eimeria vollendet sich der gesamte Lebenszyklus innerhalb eines einzigen Wirtes. Die tatsächlichen Stadien des Lebenszyklus ändern sich in der Komplexität in Abhängigkeit von den einbezogenen Eimeria-Arten. E. tenella hat ein komplexes Lebenszyklusmuster. Nach Aufnahme von mit Fäkalien kontaminierter(m) Nahrung oder Wasser werden die sporenbildenden Oocysten innerhalb des Verdauungstrakts im Ergebnis der gemeinsamen Wirkung von mechanischen Scherkräften und enzymatischer Hydrolyse des Sporocystendeckels in den Verdauungstrakt ausgeschüttet. Die freigesetzten Sporozoiten durchqueren die Epithelzellen innerhalb spezieller Bereiche des Zökum. Die Entwicklung beginnt in den Lieberkühn-Drüsen auf dem Niveau von Erstgenerations- Meronten. Die Meronte ist ein Übergangsstadium, bestehend aus dem rundenden Organismus mit einem betonterem Kern und einer erhöhten energieliefernden und proteinsynthetisierenden Leistung. Die Entwicklung von Merozoiten der ersten Generation erfolgt durch Mehrfachteilung von Meronten. Die Freisetzung von Merozoiten der ersten Generation zerstört die Wirtszelle und die Parasiten wandern weiter, um neue Wirtszellen zu infizieren, wobei sie einem zweiten asexualen Zyklus unterliegen. Meronten, die sich zu dem Niveau von Merozioten der zweiten Generation entwickeln, zerstören zusätzliche Epithelzellen, wenn sie freigesetzt werden. Eine weitere Zerstörung von Wirtszellen erfolgt mit der Freisetzung von Merozoiten der dritten Generation. Zweit- und Drittgenerationsmerozoiten können noch eine andere Population von Wirtsenterozyten bei Beginn der sexualen Phase befallen. Die sexuale Entwicklung beginnt mit der Produktion von Mikrogameten und Makrogameten durch den Prozeß der Gametogenese. Freigesetzte Mikrogameten befruchten Makrogameten unter Bildung von Zygoten. Die Entwicklung von unreifen Oozysten erfolgt durch Aufbruch der Wirtszelle. Oozysten, die in den Hohlraum der Gedärme freigesetzt werden, treten durch Fäkalien an die Umgebung und reifen (bilden Sporen) in Gegenwart von atmosphärischem Sauerstoff.
Der Prozeß der Parasitenentwicklung ist selbstbegrenzend, wenn der Wirt keine zusätzlichen Oozysten zu sich nimmt. Dies ist jedoch eine unrealistische Hoffnung bei großen Geflügelanlagen. Krankheiten durch E. tenella rufen schwere Verluste aufgrund pathologischer Symptome hervor.
Die Pathologie der Coccidiosis aufgrund von E. tenella und einigen anderen Arten ist zum großen Teil zurückzuführen auf das Aufbrechen der Wirtszellen während des Freisetzens der Merozoiten. Gewebe wird vorwiegend innerhalb der Lamina Propria der Eingeweide zerstört. Theoretisch kann die Aufnahme einer einzigen Oocyste zu einer Zerstörung von bis zu 2,5·10&sup6; Wirtszellen innerhalb 120 Stunden (45) führen. Blutungen innerhalb der Eingeweide sind auf das Aufbrechen von kleinen Kapillaren, die das Epithel versorgen, zurückzuführen. Es ist schwierig, das Fortschreiten der Krankheit unter Verwendung von Coccidiostatika zu bekämpfen, wenn sie sich einmal eingenistet hat. Zweitinfektionen komplizieren häufig durch Eimeria hervorgerufene Krankheit. Der Tod tritt im allgemeinen innerhalb von 4-7 Tagen bei infizierten Vögeln auf.
Eine übereinstimmende Eigenschaft von Coccidia besteht darin, daß die Sporozoiten den Infektionsvorgang innerhalb sehr spezieller Gewebebereiche beginnen (28, 33, 41). Die Ortsspezifität der Infektion ist ein Charakteristikum, das gewöhnlich zur Speziation von Eimeria verwendet wird. E. tenella zeigt die Neigung, Epithelzellen zu befallen, die innerhalb des hinteren Teils des Zökums angesiedelt sind (zökaler Beutel). Zum Teil können solche Infektionsspezifitäten von der Wechselwirkung der Oberflächendeterminanten der Parasiten mit dem Wirtszellentyp oder von speziellen Oberflächenkomponenten abhängen (9, 11, 40). Dieser Streitpunkt wird ebenfalls unterstützt durch Untersuchungen mit genetisch "resistenten" Vögeln, deren Zellen nicht durch Eimeria innerhalb der normalen Kolonisierungsstellen befallen sind. Eine Arbeit mit anderen Coccidia zeigt klar, daß die Expression von notwendigen Wirtsdeterminante(n) durch die Gewebeherkunft der Zellen zusätzlich auf das mitotische Stadium der Wirtszelle gerichtet (11) ist.
Die meisten Arbeiten auf dem Gebiet der Immunität gegen Coccidiosis wurden auf humorale Immunität beschränkt und insbesondere auf Serumantikörper. Die Untersuchungen haben einen Korrelationsmangel zwischen Serumantikörper und Krankheitsresistenz gezeigt (43). Jedoch deuten die meisten verfügbaren Daten darauf hin, daß eine örtliche Antwort mit dem Einbezug des sekretorischen Immunsystems oder des zellvermittelten Immunsystems (CMI) oder beider in der Schutzantwort inbegriffen ist.
Eine Störung bei der Erkennung und/oder der Anlagerung von Pathogenen an Wirtszellen hat nachgewiesenermaßen eine Schutzwirkung wie mit viralen, bakteriellen und einzelligen Mitteln gezeigt. Genetisches Löschen der Schlüsselwirtszellenrezeptoren oder Pathogenanlagerungsmerkmalen kann den anfänglichen Kolonisierungsprozeß verhindern (14, 40). Alternativ dazu können sekretorische Antikörper beim Kolonisierungsprozeß durch Anbinden stören und daher so die erforderlichen Wirtszellenerkennungsdeterminanten maskieren (22, 54). Von allen derzeitig geprüften Immunoglobulinklassen wurde berichtet, daß sie ein Störungsvermögen für den anfänglichen Kolonisierungsprozeß von Eimeria tenella besitzen (10). Jedoch weisen neuerliche Berichte aus, daß nur die Produktion von sekretorischem IgA mit natürlich schützender Immunität korreliert (9, 43). Porter und Davis (10) und andere (43) berichteten, daß sekretorisches IgA die extrazellulären Stadien des Parasiten durch signifikant begrenzende Penetration neutralisiert oder jene eingedrungenen Organismen so schwächt, daß die folgende Entwicklung verhindert wird.
Es wurde geschätzt, daß jährlich weltweit von Herstellern ein finanzieller Aufwand von annähernd 0,5-1,0 Milliarden $ ausgegeben wird, um die verheerende Wirkung der Coccidiosis bei Hühnern (28, 39) zu bändigen. Sogar bei laufenden Bekämpfungsmaßnahmen fallen Geflügelverluste schätzungsweise in den zig-Millionen Dollar-Bereich (45).
Derzeitig ist das verbreiteste Mittel zur Bekämpfung von Eimeria bei Geflügel die Anwendung von antiprotozoalen Chemikalien als Futteradditive. Die spezifische Zusammensetzung variiert mit dem verwendeten Coccidiostatikum und jedes Produkt wirkt nur auf ein bestimmtes Stadium des coccidischen Lebenszyklus (28, 38, 42). Nachteile bei der Verwendung von Coccidiostatika gibt es viele, einschließlich des kurzzeitigen Restschutzes bei Vögeln, gelegentliche Leistungsminderung, Hervorrufen von Widerstandsfähigkeit gegenüber dem Wirkstoff bei den Parasiten und in einigem Ausmaß Sicherheitsfragen. Die Produkte bleiben gewöhnlich aufgrund der Entwicklung von wirkstoffresistenten Stämmen nur für einige Jahre auf dem Markt. Dies übt einen beträchtlichen Druck auf die Entwicklungskosten und setzt die Anfertigung von effizienteren Produkten fort (38).
Der Schutz von Vögeln durch Immunisierung erfolgte mit einigem Erfolg. Forscher waren in der Lage, einen begrenzten Schutz unter Verwendung von Präparaten aus getöteten Organismen hervorzurufen (1, 30, 31). Eine wirksamere Möglichkeit zur Immunisierung von Hühnern wurde mit der Verwendung eines lebenden protozoalen Produkts - z. B. Coccivac® (13) erreicht. Das Produkt, das eine geringe Dosen lebender Oocysten enthaltende Mehrfachzusammensetzung ist, wird mit dem Trinkwasser verabreicht, um bei den Vögeln eine leichte Parasitämie hervorzurufen. Ein Nachteil dieses Produkts ist die gelegentlich herabgeminderte Leistung der Vögel während der ersten Wochen nach der Verabreichung. Variablen wie übermäßiges Dosieren oder der Feuchtegrad des Lagers haben aber auch zu schweren Ausbrüchen von Coccidiosis geführt. Siehe auch U.S. Patent Nr. 3 147 186 (1964), das die Verwendung von lebenden sporenbildenden Oocysten von E. tenella zur Immunisierung von Hühnern betrifft und U.S. Patent Nr. 4 301 148 (1981), das die Verwendung von Sporozoiten von E. tenella für den gleichen Zweck betrifft.
Eine Alternative ist das Einführen von Lebendimpfstoffen in Geflügelanlagen über das Futter. Dies wurde in einer kürzlich erschienenen Britischen Patentschrift GB-A-2 008 404 erörtert. Vor dem Mischen mit dem Futter werden völlig lebensfähige Oocysten von E. tenella in einem wasserlöslichen Polysaccharid eingekapselt und so gegen Austrocknen geschützt. Die Oocysten liegen in ausreichender Menge vor, so daß sie nur eine subklinische Infektion hervorrufen. Obwohl das Immunisierungsvermögen als ausgezeichnet befunden wurde, ist die Weiterentwicklung dieses Verfahrens aufgrund des fraglichen Billigung des Einsatzes nicht vorhersehbar. Wenn jedoch abgeschwächte Stämme von allen wichtigen Coccidia entwickelt werden könnten, kann das Verfahren akzeptabel werden.
Es wurden tatsächlich Bemühungen unternommen, um Eimeria-Linien verminderter Virulenz zu entwickeln. Einige Arten wurden erfolgreich durch Hühnerembryonenpassage abgeschwächt (15, 26, 29, 48). Diese Stämme haben ihre Fähigkeit verringert, die Krankheit hervorzurufen, haben jedoch noch ausreichend Immunisierungsvermögen bewahrt, um Immunität hervorzurufen. Es verbleiben jedoch einige Probleme bei der Handhabung dieser Stämme. Zum Beispiel besitzen die abgeschwächten Varianten von E. necatrix eine kritische Passagegrenze, wodurch mehr oder weniger Embryopassage zum Verlust des Immunisierungsvermögens oder zum Erhalt der ursprünglichen virulenten Form führen kann. Des weiteren kehren einige abgeschwächte Organismen nach geringer Rückpassage durch Hühner zur virulenten Form zurück (27, 50). Die Probleme, die mit dem Aufrechterhalten gemeinsamer Eigenschaften in abgeschwächten Organismen verbunden sind, sind also offensichtlich.
Die Abschwächung durch Frühselektion wurde auch durchgeführt, wenn Eimeria-Stämme nicht leicht auf die embryonierten Eier zu passagieren waren. Bei diesem Verfahren werden ausgeschüttete Oocysten später in der Latenzzeit vor Beginn des starken Oocystenausschüttens (18, 35, 37, 49) abgefangen. Eine derartige Selektion ergibt Kulturen mit verkürzten Lebenszyklen und einer entsprechenden Verminderung der Virulenzeigenschaften (18, 35, 37, 49). Obwohl die periodische Frühreife für E. tenella (19) und E. acervulina (36) als genetisch stabil dargestellt wurde, sind nicht genug Informationen über dieses Verfahren bekannt, um seine Brauchbarkeit als Instrument in der Geflügelindustrie einschätzen zu können. Es gibt wenig Informationen über die Oberflächenantigenzusammensetzung von avian coccidia. Hybridom-Zellinien, die auf Antigene an der Oberfläche von Sporzoiten von Eimeria tenella gerichtete monoklonale Antikörper sekretieren, wurden beschrieben (58). Die Antigene wurden bis auf ihr Molekulargewicht, das zwischen 13 und 150 Kilodaltons liegt, nicht identifiziert. Darüber hinaus wurde keine biologische Signifikanz oder beschriebene Wirksamkeit bei einem Impfstoff auf die Antigene zurückgeführt. Frühere Arbeiten im Laboratorium von M.H. Wisher lassen die Anwesenheit von etwa 16 Polypetiden vermuten, identifiziert durch Oberflächenjodierung von freigesetzten Sporozoiten von E. tenella, die Molekulargewichte von 20000 bis über 200000 besitzen (57).
Versuche mit Untereinheiten wurden bei der Impfstoffentwicklung über den Zeitraum der letzten Jahre erfolgreich geprüft. In solchen Versuchen wurden ausgewählte Schutzantigene identifiziert und für eine eventuelle Herstellung im großen Maßstab charakterisiert. Bei der Untersuchung von Parasitenantigenen benutzte eine Forschungsgruppe monoklonale Antikörper zur Identifizierung eines potentiellen Schutzantigens auf der Oberfläche von Babesia bovis (59). Ein B. bovis-Antigen mit 44000 Dalton wurde identifiziert, das nach Reinigung und Injektion in Versuchstiere einen gewissen Schutzgrad gegen die erste Exposition hervorrief. Ein immunologisch wichtiges Protein von Toxoplasma gondii mit 30000 Dalton wurde ebenfalls unter Verwendung monoklonaler Antikörper (21) identifiziert.
Seit Mitte der Jahres 1981 haben Danforth und Mitarbeiter verschiedene Artikel publiziert, in denen sie die Möglichkeit der Herstellung monoklonaler Antikörper, gerichtet gegen Antigene von avian Eimeria-Arten (6, 7, 8) anführen. In ähnlicher Weise haben Speer et al. (51, 52) die Entwicklung von Hybridomen gegen E. tenella und einige physiologische Eigenschaften davon gezeigt. Antikörper sekretierende Hybridomen wurden auf der Basis eines indirekten Fluoreszenzantikörpertests selektiert (7). Die mit Ultraviolettmikroskopie beobachteten Reaktionsmuster änderten sich in Abhängigkeit vom verwendeten monoklonalen Antikörper. Die Muster schließen ein, die ausschließliche Reaktion mit Sporozoiten nur gegen die Reaktion mit Sporozoiten und Merozoiten; Färben des vorderen Teils der Sporozoiten gegen die gesamte Membran und Färben von entfernten inneren Organellen gegen das nicht beschriebene innere Färben (8).
Obwohl die Herstellung von monoklonale Antikörper produzierenden Hybridomen muriner Herkunft bekannt ist, gibt es keinen Hinweis, daß die direkte und spezifische Selektion von Sporozoiten neutralisierenden Hybridomen Virulenzdeterminanten von E. tenella identifizieren, die für die Entwicklung eines Untereinheitvaccins brauchbar sind.
Es gibt tatsächlich keine Vorbeschreibung, die die Identifizierung von Antigenen von Eimeria betrifft, welche für Untereinheitvaccine brauchbar ist. In ähnlicher Weise gibt es keine Vorbeschreibung für die Formulierung und die Verwendung von Produkten, die monoklonale Antikörper einschließen, die auf die passive Immunität gegen E. tenella hinweisen.
Die Erfindung betrifft die Identifizierung, Charakterisierung, Herstellung und Verwendung von Polypeptidantigenen zum Aufbau der Immunität gegen Coccidiosis bei Eimeria tenella. Die Antigene sind in der Lage, genau hinsichtlich des direkten antigenen Gehalts dispensiert zu werden und können daher keine Erkrankung hervorrufen, vermeiden also vaccinstammbezogene Ausbrüche und Rückschläge oder Änderungen in den immunologischen Eigenschaften.
Die Erfindung betrifft auch die Herstellung, Formulierung und Verwendung eines monoklonalen Antikörperprodukts, das gegen das vorstehende Schutzproteinantigen gerichtet ist, das bei der Reinigung des Antigens verwendet werden kann, als auch passiven Schutz gegen Coccidiosis gegen E. tenella auf Hühner überträgt.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein gereinigtes Antigenprotein, hierin auch als A4- Protein oder A4-Antigen bezeichnet, wurde erhalten, das befähigt ist eine Immunantwort in einem Huhn zu induzieren, die einen Schutz gegen Infektion durch Eimeria tenella überträgt. Das Protein hat ein Molekulargewicht von etwa 25000 und ist aus zwei Polypeptiden zusammengesetzt, die über eine Disulfidbindung verbunden sind. Eines der Polypeptide ist durch ein Molekulargewicht von etwa 17000 und durch eine N-endständige blockierte Aminosäure gekennzeichnet. Das andere der Polypeptide ist durch ein Molekulargewicht von etwa 8000 charakterisiert. Die Aminosäuresequenzen beider Polypeptide sind in Fig. 3 angeführt.
Es können mit dem A4-Protein verwandte Polypeptide erhalten werden, die durch die Fähigkeit gekennzeichnet sind, in einem Huhn eine Immunantwort hervorzurufen, die einen Schutz gegen eine Infektion durch E. tenella überträgt. Zwei solcher Polypeptide wurden hergestellt, die mit SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen gewisse scheinbare Molekulargewichte von etwa 11500 bzw. 6500 besitzen.
Das gereinigte Proteinantigen mit einem Molekulargewicht von 25000 kann durch Trennisolierung aus der Sporocyste von Eimeria tenella hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die Isolierung Immunoadsorptionschromatographie oder Immunopräzipitierung ein, unter Verwendung des hoch spezifischen monoklonalen Antikörpers Ptn 7.2A4/4, hergestellt aus der Hybridomzellinie ATCC Nr. HB8561. Alternativ dazu kann das Protein durch Rekombinanten-DNA-Technologie hergestellt werden, unter Verwendung eines DNA-Moleküls, das das Protein codiert. Die Nukleotidsequenz eines solchen DNA-Moleküls ist in Fig. 3 dargestellt. Die Polypeptide mit 11500 und 6500 Dalton können in ähnlicher Weise hergestellt werden.
Aktive Immunität gegen eine Infektion von E. tenella kann bei einem Huhn nach Verabreichung einer wirksam immunisierenden Menge eines 25000 Dalton-Protein-Antigens oder eines Antigenpolypeptids der Erfindung z. B. des 11500 oder 6500 Dalton-Polypeptids übertragen werden. Vorzugsweise ist das Protein oder Polypeptid mit einem geeigneten Träger in einem Impfstoff eingeschlossen und wird in geeigneten Impfstoffdosierungen dem Huhn verabreicht.
Der monoklonale Antikörper Ptn 7.2A4/4 oder ein beliebiger anderer solcher Antikörper kann verwendet werden, um passive Immunität gegen E. tenella-Infektion zu übertragen, vorzugsweise im Gemisch mit einem geeigneten Träger. Zusätzlich kann ein Anti-Idiotyp-Antikörper, gerichtet gegen den monoklonalen Antikörper, hergestellt werden und zur Übertragung aktiver Immunität gegen Infektionen durch E. tenella verwendet werden. Vorzugsweise wird der Anti-Idiotyp- Antikörper mit einem geeigneten Träger in Form eines Impfstoffs verabreicht.

Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die durch Mikrosequenzierung bestimmte Aminosäuresequenz des 17000 Dalton-Polypeptidanteils des E. tenella A4-Antigens. Fig. 1 zeigt auch die durch verschiedene chemische und enzymatische Aufschlüsse hergestellten überlappenden Peptide.
Fig. 2 zeigt die Restriktionsenzymkarten von E. tenella genomischen Klonen, die das A4-Antigen codieren. Fig. 2 zeigt auch die Anordnung oder Orientierung des Gens zum A4-Antigen innerhalb des 5500 bp E. tenella Eco RI DNA- Fragments.
Fig. 3 zeigt die DNA-Nukleotidsequenz des Bg1 II-Eco RI DNA-Fragments des genomischen Klones, dargestellt in Fig. 2. Zusätzlich zeigt Fig. 3 die Aminosäuresequenz für das Signalpeptid und die 17000 Dalton- und die 8000 Dalton- Polypeptidbestandteile des A4-Antigens. Fig. 3 zeigt auch die Introns innerhalb des Gens.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein gereinigtes Antigenprotein, das in der Lage ist, bei einem Huhn eine Immunantwort hervorzurufen, die einen Schutz gegen die Eimeria tenella-Infektion überträgt. Das Protein hat ein Molekulargewicht von etwa 25000 und ist aus zwei Polypeptiden, die über eine Disulfidbrücke verbunden sind, zusammengesetzt. Eines der Polypeptide ist durch ein Molekulargewicht von etwa 17000 und durch eine blockierte Nendständige Aminogruppe gekennzeichnet und hat die Aminosäuresequenz gemäß Fig. 3. Das andere Polypeptid ist durch ein Molekulargewicht von etwa 8000 gekennzeichnet und hat die Aminosäuresequenz gemäß Fig. 3.
Das 25000 Dalton-Protein, hierin auch als A4-Protein oder A4-Antigen bezeichnet, wurde aus Sporocysten von Eimeria tenella erhalten. Obwohl das Protein von E. tenella abgeleitet wurde, wurde erwogen, daß das Protein durch andere Verfahren hergestellt werden kann, z. B. durch Rekombinanten- DNA-Technologie oder durch organische Totalsynthese und folglich ist die Erfindung nicht auf ein Protein beschränkt, das direkt aus E. tenella hergestellt wurde, sondern schließt das Protein an sich unabhängig von dessen Herstellungsverfahren ein.
Wenn das A4-Antigen durch Jodierung von E. tenella- Sporocysten-Membran-Präparaten radiomarkiert wurde, besitzt das jodierte Protein ein scheinbares Molekulargewicht von 17000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) (24) unter reduzierenden Bedingungen und ermittelt durch Autoradiographie. Unter solchen reduzierenden Bedingungen wird das 8000 Dalton-Polypeptid von dem 17000 Dalton- Polypeptid abgetrennt und wird nicht durch Autoradiographie bestimmt. Der isoelektrische Punkt des A4-Proteins beträgt etwa 5,2, bestimmt durch das Verfahren von Wrigley (45). Die N-endständige Aminosäure des 17000 Dalton-Bestandteils des Proteins ist blockiert. Bevor die vollständige Aminosäuresequenz bekannt war, wurde das Protein anfänglich durch Mikrosequenzierungsanalyse charakterisiert und es wurde gefunden, daß es darin die Aminosäuresequenzen enthält:
Die Anwesenheit dieser Aminosäuresequenzen wurde durch Erstellung der gesamten Aminosäuresequenz bestätigt (Fig. 1, 3). Die Blockierung der N-Endstelle des Proteins wird auch durch die vollständige Aminosäuresequenz gestützt, die die Anwesenheit eines vollständigen Glutaminmoleküls erkennen läßt. Solche Glutaminreste sind dafür bekannt, daß sie unter Bildung von Pyrrolidoncarbonsäure zyklisieren.
Das A4-Protein hat ein tatsächliches Molekulargewicht von etwa 25000 auf Grundlage seiner vollständigen Aminosäuresequenz und hat ein scheinbares Molekulargewicht von 21000-23000 nach SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen. Nach Reduktion mit β-Mercaptoethanol erscheinen die zwei Polypeptide im SDS-PAGE (24). Das A4-Protein besteht danach aus zwei Polypeptiden, einem Peptid mit 17000 und einem mit 8000 Dalton, die über eine Disulfidbindung miteinander verbunden sind. Die vollständige Aminosäuresequenz des Peptids mit 17000 Dalton und eine Teilaminosäuresequenz des 8000 Dalton-Peptids wurden durch Mikrosequenzierungsanalyse bestimmt. Die so bestimmten Sequenzen stimmen mit den separat bestimmten Sequenzen der Chromosom-DNA überein, die das Protein codiert.
Die Erfindung befaßt sich auch mit Antigen- Polypeptiden, die eine innerhalb des A4-Proteins befindliche Aminosäuresequenz einschließen und die in der Lage sind, bei einem Huhn eine Immunantwort hervorzurufen, die einen Schutz gegen Infektion durch Eimeria tenella überträgt. Solche Polypeptide sind alle Aminosäuresequenzen, die eine antigene Determinante aus dem A4-Protein enthalten und die in der Lage sind, eine Immunantwort hervorzurufen.
Es wurden zwei Präparate hergestellt, die solche Polypeptide enthalten. Diese Präparate sind durch ihr Vorkommen innerhalb des Polypeptids mit scheinbaren Molekulargewichten von etwa 11500 bzw. etwa 6500, gemäß SDS- Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen, gekennzeichnet. Diese Präparate wurden immunologisch durch als vom A4-Antigen stammend identifiziert.
Antigen-Polypeptide, die eine in dem A4-Protein vorliegende Aminosäuresequenz einschließen, können mit verschiedenen Verfahren hergestellt werden, z. B. können sie chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden, können durch Rekombinanten-DNA-Methoden hergestellt werden, können aus dem A4-Antigen hergestellt werden oder können aus der Sporocyste oder dem Sporozoit von E. tenella hergestellt werden. Selbstverständlich schließt der hier verwendete Ausdruck "Antigen-Polypeptid" Präparate ein, die unter nichtreduzierenden Bedingungen, wie sie hierin beschrieben wurden, hergestellt wurden, gekennzeichnet durch Anwesenheit bei der Herstellung eines Polypeptids mit einem definierten scheinbaren Molekulargewicht nach SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen. Wenn das Polypeptid bei einer solchen Herstellung vorliegt, kann es an einen anderen Bestandteil oder andere Bestandteile gebunden werden, zum Beispiel an ein anderes Polypeptid durch eine oder mehrere Disulfidbindungen, oder ein oder mehrere Bereiche innerhalb des Polypeptids können miteinander verbunden werden z. B. über eine Disulfidbindung. Für jene Präparate, die durch Anwesenheit innerhalb des Polypeptids mit einem wahren Molekulargewicht von 17000 oder weniger gemäß SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen gekennzeichnet sind, wird auch der Ausdruck "Fragment" verwendet, um solche Präparate mit der Mutmaßung zu beschreiben, daß die Präparate Aminosäuresequenzen einschließen, die innerhalb des vollständigen A4-Proteins enthalten sind, jedoch kein intaktes Protein darstellen. Zusätzlich wird der Ausdruck "Fragment" verwendet, um Aminosäuresequenzen zu beschreiben, die sich von dem A4- Protein durch proteolytische Spaltung ableiten.
Die Antigene dieser Erfindung und eine Aminosäuresequenz, die in der Aminosäuresequenz von dem A4- Protein eingeschlossen ist, können ein oder mehrere Substanzen wie Polysaccharide z. B. Dextran oder andere Aminosäuresequenzen, d. h. Aminosäuresequenzen enthalten, die nicht von der in Fig. 3 angeführten Aminosäuresequenz eingeschlossen sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des A4-Proteins. Das Verfahren schließt das Inkontaktbringen von Sporocysten von E. tenella mit einem Tensid unter geeigneten nichtreduzierenden Bedingungen in Gegenwart von Proteaseinhibitoren ein, so daß die Sporocysten-Membranproteine solubilisiert werden. Das Protein wird dann von den solubilisierten Sporocysten-Membran- Proteinen abgetrennt unter Anwendung von Trenn- und Reinigungsverfahren für Proteine. Derartige Verfahren, auf die diese Erfindung zurückgreift, sind bekannt und schließen z. B. die Teilreinigung der solubilisierten Sporocysten- Membran-Proteine durch Ionenaustauschchromatographie z. B. an DEAE-Cellulose und Hydroxyapatit-HPLC ein.
Alternativ dazu wird das A4-Protein aus einem Extrakt von E. tenella Sporocyst-Membran-Proteinen durch Immunopräzipitation oder Immunoadsorptionschromatographie abgetrennt unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der gegen das A4-Protein gerichtet ist, wie den als Ptn 7.2A4/4 bezeichneten monoklonalen Antikörper, wobei dieser aus einer Maushybridomzellinie, hinterlegt bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA 20852 unter ATCC Nr. HB8561 hergestellt werden kann. Diese Hinterlegung wurde unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags zur Internationalen Anerkennung bei der Hinterlegung von Mikroorganismen verfügt.
Das 17000 Dalton-Polypeptid des A4-Proteins kann durch dasselbe Verfahren hergestellt werden, das bei der Herstellung des A4-Proteins verwendet wird. Das 17000 Dalton- Polypeptid wird dann isoliert z. B. durch Teilreinigung mit Ionenaustauschchromatographie, d. h. mit DEAE-Cellulose, gefolgt von präparativer SDS-Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen.
Das 11500 Dalton-Antigen-Polypeptid kann durch Inkontaktbringen von Sporocysten von E. tenella mit Phenol in Gegenwart eines milden Reduktionsmittels, z. B. 8-Hydroxychinolin, hergestellt werden, so daß die Sporocysten-Membran- Proteine extrahiert werden. Das Polypeptid wird dann aus den extrahierten Sporocysten-Membran-Proteinen durch Immunopräzipitation oder Immunoaffinitätschromatographie mit einem geeigneten Antikörper wie Ptn 7.2A4/4-Monoklonalantikörper isoliert. Das 6500 Dalton Antigen-Polypeptid kann durch Inkontaktbringen von Membranen von durch Trypsin- Taurodesoxycholat ausgeschütteten Sporozoiten (9) mit einem Tensid hergestellt werden, so daß die Proteine solubilisiert werden. Das Polypeptid wird dann mit einem geeigneten Antikörper wie dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 aus den solubilisierten, ausgeschütteten Proteinen durch erneute Immunopräzipitation oder Immunoadsorptionschromatographie isoliert.
Das Verfahren schließt die Rekombinaten-DNA- Technologie ein und wird auch zur Herstellung des 25000 Dalton-A4-Protein, des 17000 Dalton-Poypeptids davon und der verschiedenen Antigen-Polypeptide dieser Erfindung bereitgestellt. Das Verfahren schließt auch die Herstellung eines DNA-Moleküls, das das A4-Protein oder Polypeptid codiert, durch Einsetzen des DNA-Moleküls in einen geeigneten Expressionsvektor z. B. einen Vektor, der den λPL oder lac- Promotor erhält. Der erhaltene Expressionsvektor wird dann in einen geeigneten Wirt, z. B. E. coli unter geeigneten Bedingungen zur Expremierung der DNA eingefügt und zur Erzeugung des Proteins oder Polypeptids, das dann isoliert wird.
Boten-RNA kann aus Sporocysten an vielen Punkten während des Sporenbildungsprozesses isoliert werden. Diese m- RNA-Proben können dann unter Verwendung eines in vitro- (32) oder in vivo-Systems übertragen werden. Die übertragenen Produkte können dann immunopräzipitiert werden unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers (Ptn 7.2A4/4) oder Antisporozoid-Hühnerserum. Das das A4-Antigen codierende mRNA-Präparat kann dann zur Herstellung von Doppelstrang-cDNA (32) verwendet werden. Diese cDNA kann dann in einen geeigneten Klonvektor eingesetzt werden, der dann verwendet wird, um E. coli unter Erzeugung einer cDNA-Genbank zu transformieren. Diese cDNA-Genbank kann dann durch Koloniehybridisierungsverfahren unter Verwendung isotopisch gekennzeichneter Oligonukleotidsonden abgesucht werden, deren Aufbau aus der Aminosäuresequenzinformation aus dem 17000 Dalton-Polypeptid-Bestandteil des A4-Antigens stammt. Die Vektor-DNA aus den bakteriellen Kolonien, die die Nukleotidsequenzen für das 17000 Dalton-Polypeptid enthalten, können dann isoliert werden und die eingefügte coccidiale DNA sequenziert werden (34, 44).
Alternativ dazu wurde genomische DNA aus E. tenella isoliert und mit Restriktionsendonuklease wie EcoRI aufgespalten. Die Restriktionsfragmente wurden in einen geeigneten Klonvektor wie λgt wes λB eingefügt unter Herstellung einer Genom-Genbank. Die Genom-Bank wurde dann durch Plaque-Hybridisierung, wie für die cDNA-Genbank beschrieben, abgesucht. Ein genomischer Klon, der das A4- Antigen codiert, wurde isoliert und die DNA-Sequenz zeigte die zwei Peptide des A4-Antigens, codiert durch eine anstoßende Nukleotidsequenz (Fig. 3). Folglich leiten sich die 17000 und 8000 Dalton-Peptide von der protolytischen Behandlung eines einzelnen 25000 Dalton-Peptids ab. Zusätzlich codiert die DNA-Sequenz eine "Signal"sequenz, die sich typischerweise am Aminoende vieler sekretorischer oder Membranproteine befindet.
Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zum Übertragen einer huhnaktiven Immunität gegen Infektionen durch Eimeria tenella ein, umfassend die Verabreichung einer wirksamen immunisierenden Menge eines A4-Antigens, eines Antigenpolypeptids oder anderen Antigenen dieser Erfindung, einschließlich, jedoch nicht einschränkend, der 11500 Dalton oder 6500 Dalton-Polypeptide, an ein Huhn. Mit diesem Verfahren kann aktive Immunität auf ein nicht immunisiertes Huhn übertragen werden. Zusätzlich kann die Verabreichung dieser Materialien zur Erhöhung des relativ niedrigen Immunitätsspiegels bei einem Huhn, das vorher E. tenella ausgesetzt war, verwendet werden und kann für Auffrischungsimpfungen genutzt werden.
Das A4-Antigen oder ein beliebiges der Antigen- Polypeptide dieser Erfindung, können an die Kühner durch eine Reihe bekannter Verfahren verabreicht werden. In wünschenswerter Weise kann die Verabreichung durch subkutane oder intramuskuläre Injektion in den hinteren Nacken erfolgen. Die Antigenmenge, die eine wirksam immunisierende Menge umfaßt, kann eine beliebige Menge von etwa 0,1 um bis etwa 1 mg annehmen. Die Antigenmenge liegt wünschenswerterweise etwa oberhalb 10 um. Die bevorzugte Antigenmenge beträgt etwa 500 um pro Kilogramm Körpergewicht. Alternativ dazu kann die Verabreichung oral (z. B. über eine Kapsel) oder wünschenswerterweise durch Injektion (z. B. subkutan, intradermal oder vorzugsweise intramuskulär) erfolgen. Wenn die Verabreichungsweise Injektion einschließt, können pharmazeutisch verträgliche Träger verwendet werden. Geeignete Träger sind 0,01 bis 0,1 molarer, vorzugsweise 0,05 molarer, Phosphatpuffer oder 0,8%-ige Kochsalzlösung.
Ein Impfstoff zum Übertragen aktiver Immunität gegen die Infektion durch Eimeria tenella auf ein Huhn wird bereitgestellt, der eine wirksam immunisierende Menge eines Antigenmaterials dieser Erfindung umfaßt, d. h. ein A4- Antigen, ein Antigen-Polypeptid oder ein anderes Antigen dieser Erfindung und einen geeigneten Träger. Vorzugsweise liegt die wirksam immunisierende Menge des Antigenmaterials im Impfstoff bei etwa 0,1 um/kg Körpergewicht Huhn.
Zusätzlich enthält der Träger wünschenswerterweise ein Konservierungsmittel. Ein besonders geeignetes Konservierungsmittel ist Thimerosal (Natriumethylmercurithiosalicylat), das eine Aktivität sowohl als Bakteriostat als auch als Fungistat aufweist. Wünschenswerterweise liegt Thimerosal im Impfstoff in einer Endkonzentration von 10-4 Prozent vor.
Des weiteren kann der Träger wünschenswerterweise auch einen Immunopotentator enthalten. Verschiedene bekannte Immunopotentatoren können verwendet werden. Das gegenwärtig angewendete Adjunvans ist 94%-iges Drakeol 6-VR, 5% Arlacel A, 1% Tween-80. Arlacel A ist ein Mannitmonooleat (Sandria Corp.). Es ist ein Reizstoff, der eine starke Immunopotentatorwirkung in Kombination mit Antigenen aufweist. Drakeol 6-VR ist ein hypoallergenisches Mineralleichtölprodukt (Penreco Corp.). Tween-80 ist ein Monooleatderivat von Polyoxyethylsorbitan und besitzt Tensideigenschaften.
Andere geeignete Träger oder Immunopotentatoren sind Aluminiumkaliumsulfat, Aluminiumhydroxid, Lymphokine und Wasser-in-Öl-Emulsionen.
Nach Verabreichung einer geeigneten Dosis eines solchen Impfstoffs an ein Huhn, ist das Huhn gegen E. tenella-Infektion geschützt. Die Menge an antigenem Material pro Dosis sollte ausreichen, um die Erzeugung von Antikörpern zu dem Antigenmaterial im Tier, dem der Impfstoff verabreicht wurde, zu indizieren. Um einen ausreichenden Grad an immunologischer Antwort bereitzustellen, gemessen durch Antikörpererzeugung und den Schutz, liegt die Menge an antigenischen Material pro Dosis wünschenswerterweise oberhalb etwa 20,0 um/kg Körpergewicht des geimpften Tieres. Die Menge an antigenischem Material für ein 50 g, einen Tag altes Küken würde also oberhalb etwa 1,0 um liegen. Derzeitig bevorzugt ist ein Impfstoff der 10 um des Antigenmaterials enthält. Im allgemeinen werden sie das Antigen auf einer Gewichtsbasis von 0,002 Prozent bis zu 0,2 Prozent Impfstoff umfassen und das Dosiervolumen wird etwa 0,1 ml betragen.
Andere Ausführungsformen dieser Erfindung schließen einen gegen das A4-Protein gerichteten monoklonalen Antikörper, und einen gegen ein antigenisches Polypeptid dieser Erfindung gerichteten monoklonalen Antikörper ein. Eine spezifische Ausführungsform ist der bereits genannte monoklonale Antikörper mit der Bezeichnung Ptn 7.2A4/4, hergestellt von der Hybridomzellinie ATCC Nr. HB8561.
Man kann auf ein Huhn passive Immunität gegen E. tenella-Infektion durch Verabreichen einer wirksam schützenden Menge eines monoklonalen Antikörpers, der gegen das A4-Antigen oder Antigenfragment davon gerichtet ist, übertragen z. B. mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4. Ein hierfür verwendbares Mittel umfaßt eine schützend wirksame Menge eines geeigneten monoklonalen Antikörpers z. B. dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 und einem geeigneten Träger. Das Mittel kann aus einer ausreichenden Dosis eines monoklonalen Antikörpers bestehen, so daß es gegen Infektion schützt, wenn es über den oralen Weg verabreicht wird. Eine typische Antikörperdosis können etwa 100 um Antikörper pro Vogel pro Tag, entweder in wässeriger oder lyophilisierter Form verabreicht, sein. Vorzugsweise wird dieses Mittel in wässeriger Form als Trinkwasserzusatz verwendet. Der Antikörper wird in 0,15 molarer phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7, enthaltend 0,0001 Prozent Thimerosal zu einem Endproteingehalt von 1-100 mg/ml gelöst. Das Produkt wird kontinuierlich im Wasser gelöst, so daß es den gewünschten Antikörperspiegel aufrechthält. Die Verabreichung einer geeigneten Dosis eines solchen Mittels an ein Huhn ist daher ein Verfahren zum Übertragen passiver Immunität gegen E. tenella-Infektion.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Verbundstruktur mit räumlichen Merkmalen, die jenen der grundlegenden Schutzstrukturen des A4-Antigens gemeinsam sind, gegen die bereits beschriebenen Antigene substituiert. Eine solche Zusammensetzung schließt einen antiidiotypischen Antikörper, entwickelt gegen die Strukturen des Antikörpers zum A4-Protein oder zu einem der antigenischen Polypeptide dieser Erfindung ein, z. B. den monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4, dessen Strukturen auf die betreffende Antigendeterminante Spezifität übertragen. Solche Antiidiotyp-Antikörper können selbst monoklonaler Natur sein oder können als polyklonale Antikörper auftreten. In dem früheren Beispiel kann der Antikörper Ptn 7.2A4/4 aus der Hybridomzellinie ATCC Nr. HB8561 isoliert, gereinigt und kovalent an ein beliebiges geeignetes Trägerprotein z. B. das Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin (KLH) [key-hole limpet] gebunden werden. Der gereinigte Antikörper, vorzugsweise der gereinigte Antikörper-KLH-Komplex, wird wiederholt injiziert, vorzugsweise mit einem Adjuvans wie Freund's kompletten Adjuvans in einen geeigneten Säugetierlymphocytendonor mit Balb/C-Stamm-Mäusen als bevorzugten Donor. Hybridomen werden aus Lymphocyten der immunisierten Mäuse entwickelt. Die Hybridomen werden hinsichtlich Antikörper abgesucht, die mit dem A4-Antigen um die Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 konkurrieren, jedoch weder das A4- Antigen noch das von Ptn 7.2A4/4 verschiedene Maus- Immunoglobulin erkennen. Solche gegen den monoklonalen Antikörper Ptn 7.2A4/4 gerichtete Antiidiotyp-Antikörper sekretierende Hybridomen, werden auseinandergezogen und geklont. Die Herstellung von Antiidiotyp-Antikörper kann durch Zellkulturen in einem beliebigen Medium durchgeführt werden, das zur Anzucht von Hybridomen und zur Expression von monoklonalen Antikörper oder zur Anzucht von Antikörper erzeugenden Hybridomen in Wirtstieren mit Balb/C-Mäusen als bevorzugte Vehicle geeignet ist.
Antiidiotypischer Antikörper kann auch durch Injektion von Ptn 7.2A4/4 in Tiere hergestellt werden. Ein bevorzugtes Verfahren ist die wiederholte Injektion von 500 um Ptn 7.2A4/4, gereinigt und formuliert in einen geeigneten Adjuvans, z. B. komplettes Freund Adjuvans, in ein geeignetes Tier z. B. ein Kaninchen. Nach ausreichenden Injektionen wird Blutserum nach einem geeigneten Zeitraum den Tieren entnommen. Die antiidiotypischen Antikörper werden dann aus dem Blutserum isoliert, z. B. durch Adsorption gegen Normalmausserum-Proteine, die an einen unlöslichen Träger wie Sepharose® immobilisiert sind. Die Spezifität des erhaltenen Antiserums wird durch Aufzeigen der Reaktivität mit monoklonalem Antikörper Ptn 7.2A4/4, jedoch nicht gegen Normal-Maus γ3(K) bestätigt.
Die wie vorstehend hergestellten Antiidiotyp- Antikörper werden weiter bis zum Grad der IgG-Fraktionen gereinigt. Gereinigtes Antiidiotyp-Antikörper-Protein kann durch ein beliebiges einer Reihe bekannter Verfahren, wie sie für Antigene selbst beschrieben wurden, verabreicht werden.
Die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antiidiotyp-Antikörpers dieser Erfindung an ein Huhn stellt ein Verfahren des Übertragens aktiver Immunität gegen Eimeria tenella-Infektion auf das Huhn bereit. Ein Impfstoff für diesen Zweck umfaßt eine wirksam immunisierende Menge eines Antiidiotyp-Antikörpers und einen geeigneten Träger. Das Verabreichen einer geeigneten Dosis eines solchen Impfstoffs an ein Huhn stellt also ein Verfahren zum Schutz des Huhns gegen Eimeria tenella-Infektion dar.
Die Menge an Antiidiotyp-Antikörper pro Dosis muß ausreichen, um die Erzeugung von Antikörper in einem Tier hervorzurufen, dem der Impfstoff verabreicht wurde. Zum Hervorrufen einer immunologischen Antwort, gemessen durch Antikörperproduktion, liegt die Menge an Antiidiotyp-Antikörper pro Dosis oberhalb 50 ug/kg Körpergewicht des zu impfenden Vogels. So würde die einem 50 g schweren, einen Tag alten Küken verabreichte Menge an Antiidiotyp-Antikörper 2,5 ug betragen. Derzeitig bevorzugt ist ein Impfstoff, der 25 ug des Antiidiotyp-Antikörpers enthält. Im allgemeinen wird der Antiidiotyp-Antikörper auf Gewichtsbasis 0,002 Prozent bis 0,2 Prozent des Impfstoffs umfassen und das Dosiervolumen wird 0,2 cm³ betragen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Nukleinsäuremolekül, z. B. DNA, cDNA, RNA oder mRNA, das das A4-Protein codiert. Eine Ausführungsform ist ein DNA-Molekül mit der Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 3. Eine andere Ausführungsform ist ein DNA-Molekül, das eines der Antigen- Polypeptide der Erfindung codiert.
Eine weitere Ausführungsform ist ein Klonierungsvehikel, umfassend ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung, z. B. das, das das A4-Protein oder eines der vorstehend beschriebenen Antigen-Polypeptide codiert. Das Klonierungsvehikel kann in einer Wirtszelle, z. B. einer bakteriellen Wirtszelle enthalten sein.
Das Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 3 kann unter Verwendung der Wirtszellen hergestellt werden, enthaltend ein Klonierungsvehikel, das das A4-Protein codierende Nukleinsäuremolekül enthält. Gemäß diesem Verfahren werden die Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen angezogen, die die Produktion des Proteins erlauben und das so produzierte Protein wird isoliert. Die Antigen-Polypeptide dieser Erfindung können ähnlich hergestellt werden, unter Verwendung eines geeigneten das Polypeptid codierenden Nukleinsäuremoleküls.
Wenn die Wirtszelle eine bakterielle Zelle ist, hat das produzierte A4-Protein dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Sequenz wie das natürliche A4-Protein, kann sich jedoch in seiner Aminosäuresequenz oder in seiner Aminoendständigkeit unterscheiden, aufgrund der Expression im bakteriellen Wirt, z. B. durch Addition eines N-abschließenden Methioninmoleküls oder aufgrund Herstellung und Isolierung als einzelnes unbearbeitetes Protein.
Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Herstellung des DNA-Moleküls mit der Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 3. Das Verfahren umfaßt die Isolierung genomischer DNA aus Eimeria tenella-Oocysten und die Herstellung von DNA-Fragmenten aus der so isolierten genomischen DNA, z. B. mit einem Restriktionsenzym. Die DNA-Fragmente werden in einen geeigneten Klonvektor ligiert. Geeignete Klone werden durch Hybridisierung ihrer DNA mit Oligonukleotiden identifiziert, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, die in der Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 3 vorliegen oder mit Komplementären dazu. Die das Protein codierende und die Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 3 aufweisende DNA wird aus den geeigneten Klonen isoliert.

Beispiel 1

Herstellung von Eimeria tenella-Oocysten, Sporocysten und Sporozoiten

Coccidia

Das gereinigte Praxisisolat von Eimeria tenella wurde ursprünglich von Dr. Allan Edgar von der Universität von Auburn geliefert. Die Reinheit dieses E. tenella-Isolats wurde unter Verwendung von Oocysten-Merkmalen und der Histologie infizierten Darmgewebes bestätigt. Oocystengröße und der Formindex lagen im Bereich von E. tenella.
Läsionen wurden durch das Verfahren von Johnson und Reid (20) gezählt. Die Läsionen bei infizierten Vögeln waren für E. tenella typisch. Die Pathologie war auf die Zöka begrenzt und bestand in schwerer Hämorrhagie und Gewebsschädigung. 5 Tage nach der Infektion ergab der histologische Befund größere Zweitgenerationsschizonten im Subepithelium der Zöka. Die Sterblichkeit ging mit schweren Infektionen (15000 Oocysten) einher. Einzeloocystenklonierungen wurde periodisch ausgeführt, um die Reinheit des E. tenella-Isolats zu sichern.

Vermehrung der Oocysten

Reine Kulturen dieses Isolats wurden routinemäßig auf 4- bis 6-Wochen alte SFP weiße Leghornhühner übertragen. Um äußere coccidiale Infektionen zu vermeiden, wurden die Hühner vom ersten Lebenstag an in Plexiglas-Isolationseinheiten aufgezogen. Die Oocysten wurden am 7. Tag nach der Infektion aus den Zöka unter Verwendung eines Trypsinaufschlußverfahrens, beschrieben bei Shirley (48), gewonnen. Sporenbildende Oocysten wurden typischerweise bei 24ºC in 2 Gew.-%/Vol-% K&sub2;Cr&sub2;O&sub7; gelagert.

Isolierung von Sporocysten

Sporenbildende Eimeria tenella-Oocysten (1·10&sup8;), die teilweise durch Salzflotation von den Zellresten gereinigt wurde, wurden fünfmal in 0,1 molarer phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS) gewaschen, um das Kaliumdichromatkonservierungsmittel zu entfernen. Diese Oocysten wurden weiter durch Rühren in einer 1,05%-igen Natriumhypochloritlösung für 15 Minuten, gefolgt durch fünfmaliges Waschen in PBS unter Entfernung restlichen Natriumhypochlorits und Zellresten gereinigt. Nach einem letzten Waschen wurden die gereinigten Oocysten in 10 ml PBS resuspendiert. Die suspendierten Oocysten wurden dann mechanisch durch Schütteln mit einem gleichen Volumen an Glaskugeln (1,0-1,05 mm) aufgebrochen. Die freigesetzten Sporocysten wurden von den Oocystenwänden gesäubert und von nicht aufgebrochenen Oocysten durch Durchleiten über eine Glaswollesäule, Zentrifugieren bei 10000 U/min für 10 Minuten bei 4ºC und Resuspendieren in 10 ml PBS.

Zubereitung der Sporozoiten

Gerade sporende Oocysten wurden durch Salzflotation, wiederholtes Waschen und Behandlung mit 1,05%-iger Natriumhypochloritlösung gereinigt. Die Sporozysten wurden durch mechanisches Aufbrechen der Oocysten mit Glaskugeln (1,0-1,05 mm) befreit. Um Sporozyten auszuschütten, wurden die Sporocysten mit Trypsin und Taurodesoxycholinsäure (0,25 bzw. 0,5 Gew.-%/Vol.-%) für einen Zeitraum von einer Stunde bei 41ºC inkubiert. Die so erhaltenen Sporozoiten wurden von der ausgeschütteten Flüssigkeit durch Zentrifugieren befreit und in Hank's Medium resuspendiert. Frisches Hank's Medium wurde verwendet, um die Sporozoiten zu der Arbeitskonzentration zu verdünnen.

Beispiel 2

Erzeugung, Identifizierung und Charakterisierung der Hybridome

Monoklonaler Antikörper.

Monoklonale Antikörper wurden von Hybridomen nach dem von VanDeusen und Whetstone (55) entwickelten Verfahren abgeleitet. Kurz, es wurden Balb/C ByJ-Mäuse mit 10&sup6;-10&sup7; intakten E. tenella-Sporozoiten immunisiert. Drei Tage nach einer letzten intravenösen Injektion mit intakten Sporozoiten wurde eine willkürlich ausgewählte Maus getötet und die Milz herausgetrennt. Die Splenocyten wurden aus dem Fasergewebe des Organs abgetrennt und die gewaschenen Zellen mit der murinen Plasmacytomzellinie SP2/OM fusioniert.

Mikroneutralisationsbestimmung.

Die Mikroneutralisationsbestimmung wurde mit primären Kükennierenzellkulturen ausgeführt. 1- bis 2-Wochen alte Küken wurden getötet und aseptisch die Nieren entfernt. Die Nieren wurden mit Trypsin behandelt und die Zellen in 96 Trogkulturen aufgeteilt bei einer Dichte von etwa 10&sup4;/pro Trog in Earle's LAH-Medium, ergänzt mit 5% hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum. Die Kulturen wurden bei 41ºC in einer 5%-igen CO&sub2;-Atmosphäre gehalten. Wenn die Zellkulturen einen Grad von etwa 50% Konfluenz erreicht hatten, wurden 50 ul Hybridom-Test oder Kontrollprobe zu allen Vertiefungen der Platte gegeben. Dann wurden 2,3·10&sup4; Sporozoiten in 50 ul Earle's Kulturmedium zu allen Vertiefungen der Platte zugegeben. Zwölf bis sechzehn Stunden später wurde der Kulturüberstand mit frischem Earle's LAH, enthaltend 2% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum, versetzt. Die Anzucht wurde 40-44 Stunden nach der Infektion beendet. Der Kulturüberstand wurde von den Platten gleichzeitig entleert. Anschließend wurden die Zellen auf den Platten durch Zugabe von mit 5%-iger Essigsäure angesäuertem Methanol fixiert. Die fixierten Kulturen wurden mit 0,1% Toluidinblau vor der Untersuchung angefärbt. Die Vertiefungen wurden wie für den etwa prozentualen Grad der Inhibierung der Schizogonie bewertet.

Indirektes Fluoreszenz-Antikörner-Screening

IFA-Platten wurden mit Sporozoiten von E. tenella (etwa 1·10&sup6;/Vertiefung) hergestellt. Die Platten wurden über Nacht luftgetrocknet, bevor 10 ul 1% BSA zu jeder Vertiefung zugegeben wurden. Fünf Minuten nach der BSA-Zugabe wurden 20 ul Testüberstand zugegeben. Das Überstehende wurde bei 37ºC für 20 Minuten inkubiert, gefolgt von dreimaligem Spülen mit 0,15 M PBS mit 0,0005% Tween-20 (PBS-Tween). Fluoreszenzkonjugierte Kaninchen-Antimaus-Antikörper (verdünnt 1:40 in PBS) wurden zu der Probe zugegeben und für 20 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Konjugat wurde dreimal mit PBS-Tween gespült, bevor das Medium eingebettet und die Abdeckung übergestreift wird.

Ergebnisse.

Von den mehreren tausend Hybridomen, die gegen Eimeria tenella entwickelt wurden, wurden 24 gefunden, die neutralisierende Antikörper gegen das Sporozoitstadium des Parasiten produzierten. Alle untersuchten Hybridomen lieferten Antikörper, die membrangebundene Antigene erkannten, obwohl nur die von einem Hybridom produzierten Antikörper als Innenmembranantigen erkannt wurden. Die anderen untersuchten monoklonalen Antikörper erkannten Antigene, die mit Plasmalemma verbunden waren.
Die in vitro-Neutralisierungspotenz wurde für verschiedene Überstände nach anfänglichem Klonen der betreffenden Zellinien verglichen. Die Überstände von zwei Linien zeigten die größte relative Neigung zum Neutralisieren von Sporozoiten von E. tenella. Wenn für jeden untersuchten Überstand der Antikörpergehalt bewertet wurde, wurde ermittelt, daß die zwanzigfach geringere Antikörpermenge (genannt Ptn 7.2A4/4) als der zweitwirksamste neutralisierende Antikörper erforderlich war, um Sporozoiten zu neutralisieren. Im speziellen ist die Menge an Ptn 7.2A4/4-Antikörper, die erforderlich ist, um E. tenella zu neutralisieren, etwa 3,5·10&sup5; Moleküle/Sporozoit.

Beispiel 3

Identifizierung des Antigens von E. tenella, erkannt sowohl durch Neutralisieren des monoklonalen Antikörpers A4 als auch mit E. tenella-Sporozoit-spezifischem Huhnantiserum

¹²&sup5;I markierte Eimeria-Proteine.

Eine Gesamtmenge an 2·10&sup8; Oocysten von E. tenella wurde für die Jodierung präpariert. In jedem Fall wurden die Sporocysten von den salzflottierten, mit Natriumhypochlorit behandelten, mit Glaskügelchen aufgebrochenen, dann durch eine Glaswollesäule passierten Oocysten, gereinigt. Sporocystenmembranen wurden aus einer Hälfte der Sporocysten durch mechanisches Aufbrechen in 1 ml 10 mM Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,2 (PBS) mit Glaskügelchen in Gegenwart von Proteaseinhibitoren hergestellt: 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,1 mM N-Tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon (TPCK), 1 mM N-α-p-Tosyl-L-lysinchlormethylketon (TLCK) und 10 KIU/ml Aprotinin. Die übrigen Sporocysten wurden mit Trypsin und Taurodesoxycholinsäure (Gesamtvolumen 1 ml) behandelt, um Sporozoiten auszuschütten. Beide Präparate wurden bei 45000 U/min für 45 Minuten bei 4ºC pelletiert und in 1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH 4,7) (PBS) resuspendiert. Es ist darauf zu achten, daß alle Trypsindesoxycholatereste von den Sporozoiten durch Waschen mit PBS und 1 mM PMSF vor dem Ultrazentrifugieren entfernt werden.
Die 1 ml-Proben werden in Scintillationsgläschen gegeben, die mit 40 mg IODOGEN (1,3,4,6-Tetrachloro-3α,6αdiphenylglycouril) beschichtet wurden, einem Festphasen- Jodierungsreagenz, unter Stickstoffgas getrocknet und mit PBS gespült. Zu jedem Röhrchen wurden 0,5 mCi ¹²&sup5;I gegeben und die Proben dann für 20 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend werden 100 ul KI (1 M) zu jedem Röhrchen zu einer Endkonzentration von 100 mM gegeben und die Reaktion wurde für weitere 15 Minuten auf Eis fortgesetzt. Sporozoit- und Sporocystenpräparate wurden dann auf 7 ml mit PBS, enthaltend 5 mM KI verdünnt und bei 45000 U/min für 45 min bei 4ºC pelletiert.

Extraktion von Sporocyst- und Sporozoitmembran-Proteinen.

¹²&sup5;I markierte Sporocysten- und Sporozoit-Pellets von der vorstehend genannten Hochgeschwindigkeitszentrifugierung wurden in 1 ml Protein-Extraktions-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl&sub2;; 25 mM NaCl, 1% NP40, 1 mM PMSF, 0,1 mM TPCK, 1 mM TLCK und 10 KIU/ml Aprotinin) resuspendiert. Die Suspensionen wurden für 30 Minuten auf Eis mit gelegentlichem Umschütteln inkubiert. Unlösliches Material wurde aus dem Tensid-solubilisierten Protein in einer Mikrofuge für 45 min bei 4ºC abgetrennt. Die Oberstände wurden über Nacht bei -70ºC gelagert.

TCA-Fällung von ¹²&sup5;I-Proteinen.

Zehn Mikroliter jeder Probe wurden in 90 ul 5 mM KI aufgenommen. Zehn Mikroliter jeder verdünnten Probe wurden dann zu einer Lösung, enthaltend 1 ml 5%-iger Trichloressigsäure (TCA), 25 ul BSA (10 mg/ml) und 5 mM KI gegeben und auf Eis für 30 Minuten inkubiert. Die gefällten Proben wurden durch Filtrieren durch Glasfaserfilter gesammelt, zweimal mit 5 ml 5% TCA, 5 mM KI gewaschen und dreimal mit 5 ml 95%-igem Ethanol, beides bei 0ºC, und in einem Scintillationszähler gezählt.

SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) vom Gesamten der ¹²&sup5;I markierten E. tenella-Fraktionen.

Die gesamten ¹²&sup5;I markierten Sporocysten-, Sporozoit- und löslichen Membranproteine und immunopräzipitierten Proteine (siehe unten) wurden auf 120·100·0,75 mm, 5-25% SDS-Polyacrylamid-Gelen mit exponentiellem Gradienten bei 20 mA für 3 Stunden analysiert. Die Gele wurden getrocknet und auf einen Röntgenfilm bei -70ºC gelegt.
Die Gele, die für Färbezwecke verwendet wurden, wurden durch Silberanfärben sichtbar gemacht.

Immunopräzipitationen mit monoklonalem Antikörper.

Fünfzig Mikroliter Monoklonalantikörper enthaltender Hybridomüberstand, wurden zu 25 ul Monoklonalantikörper- Verdünnungspuffer (MAB-DIL)(50 mM Tris-HCl, pH 8,6; 150 mM NaCl; 0,1% NP40; 0,1% BSA, RIA Reinheit; 1 mM TLCK; 1 mM PMSF, 10 KIU/ml Aprinin) gegeben. 20 Mikroliter ¹²&sup5;I markiertes Protein wurden dann zugegeben und der Röhrcheninhalt heftig gemischt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Kaninchen-Antimaus-Ig-Serum (IgA, IgG, IgM reaktiv) wurde 1:2 mit MAB-DIL verdünnt und 10 um zu jedem Immunopräzipitationsröhrchen gegeben und 1 Stunde bei 4ºC inkubiert. Protein A-Sepharose (10 Vol.-%/Vol.-%) wurde 1:4 mit Monoklonalantikörper-Waschpuffer, pH 8,6 (MABW) (59 mM Tris-HCl, 0,05% NP40, 0,05% Triton X-100, 150 mM NaCl, 0,02% NaN&sub3;, 5 mM KI) verdünnt und 400 ul zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Röhrchen wurden für 1 Stunde bei 4ºC unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Immunopräzipitationsprodukte wurden zweimal mit kalten MABW gewaschen, gefolgt von zweimaligem Waschen mit MABW bei Raumtemperatur. Das Pellet wurde in 50 um 1,5X SDS-PAGE-Probenpuffer (24) resuspendiert, für 5 Minuten gekocht und mikrofugiert, um das Sepharose-Sorbens zu entfernen. Die Überstände wurden als Gesamtradioaktivität gezählt und durch SDS-PAGE analysiert.

Immunopräzipitation mit E. tenella-Sporozoit-spezifischem Hühnerantiserum.

Das gleiche Verfahren, wie beschrieben in der Rubrik betreffend Immunopräzipitation mit monoklonalen Antikörpern, wurde mit einigen Ausnahmen verwendet. Die Sera wurden 1 : 10 in 90 ul Antikörper-Verdünnungspuffer (AB-DIL) verdünnt (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,1% BSA RIA Reinheit; 1 mM PMSF, 1 mM TLCK; 10 KIU/ml Aprotinin) vor einer Zugabe von 20 ul ¹²&sup5;I markierten Proteins. Der Antikörper-Waschpuffer (ABW) enthält 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% BSA RIA Reinheit; 1 mM PMSF; 1 mM TLCK, 10 KIU/ml Aprotinin; 0,05% NP40; 0,05% Triton X-100, ± 5 mM KI.

Ergebnisse der Immunopräzipitation von E. tenella-Antigenen mit Ptn 7.2A4/4-Monoklonal-Antikörper

Das oberflächenmarkierte E. tenella-Sporozoitpräparat ist mit hauptsächlich 2 jodierten Polypeptiden angereichert, einem bei 6500 Dalton und einem bei 25000 Dalton. Das 6500 Dalton-Peptid wurde vorher als Protease-Aufschlußfragment des 17000 Molekulargewicht-Polypeptids bestimmt, das bei der Sporocystenherstellung gefunden wurde und das leicht und spezifisch mit dem Monoklonal-Antikörper Ptn 7.2A4/4 immunopräzipitiert. Membranen aus Sporocysten werden hauptsächlich mit zwei jodierten Polypeptiden von 17000 und 27000 Dalton angereichert, obwohl einige andere wenige Proteine von verschiedenen Molekulargewichten ebenfalls vorliegen. Nach Immunopräzipitation von ¹²&sup5;I markiertem Sporocystenmembranprotein ist das einzige Antigen, das durch Monoklonal-Antikörper Ptn 7.2A4/4 erkannt wurde, das 17000 Molekulargewicht-Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz in Beispiel 5 beschrieben ist.

Ergebnisse der Immunopräzipitation von E. tenella-Antigenen mit E. tenella-Sporozoit-spezifischen Hühner-Antisera

Sera von durch wiederholte intravenöse Injektion mit abgetöteten E. tenella-Sporozoiten immunisierten Hühnern wurden verwendet zur Immunopräzipitation von E. tenella- Proteinen, um zu bestimmen, ob sie das 17000 Dalton Polypeptid erkennen, wie es bei monoklonalen Antikörper aus der Hybridom-zellinie HB8561 der Fall ist.
Aus den jodierten Sporocysten- und Sporozoitmembran- Präparaten werden die 17000 bzw. 6500 Dalton-Polypeptide, wie vorstehend beschrieben, besonders durch Antisera von immunisierten Hühnern immunopräzipitiert. Sera von spezifischen pathogenfreien Kontrollhühnern zeigen keine Erkennung irgendwelcher E. tenella-Proteine.

Ergebnisse von Western Blots von E. tenella-Antigenen mit Ptn 7.2A4/4-Monoklonal-Antikörper

Unter den Bedingungen, unter denen immunopräzipitiert wurde, wurden die jodierten Polypeptide mit SDS-PAGE analysiert, wie vorstehend beschrieben, und Polypeptide, die mit Disulfidbindungen verbunden sind, wurden abgetrennt. Jedoch zerstörte die Reduktion von Disulfidbindungen die Reaktivität auf Western Blots sowohl bei Sporocysten- als auch Sporozoitmembran-Präparaten. Wenn jodierte Sporocystenund Sporozoitmembran-Präparate auf SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen liefen, wanderte der Hauptteil der radiomarkierten Spezies mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 21-23000. Weiterhin war diese 21-23000 Dalton-Species reaktiv mit monoklonalen Antikörper A4 bei der Western Blot-Technik (Vectastain ABC Kit for Mouse IgG, Vector Labs, Burlingame, CA). Diese Ergebnisse weisen daraufhin, daß das 17000 Dalton-Polypeptid in Sporocysten- Membranen und das 6500 Dalton-Polypeptid in Sporozoit- Membranen zu (einem) anderen Polypeptid(en) in dem A4-Antigen komplexiert ist. Die Tatsache, daß dieser andere Polypeptidbestandteil des A4-Antigens bei den Immunopräzipitationsexperimenten mit jodierten Material nicht beobachtet wurde, kann durch die Beobachtung erklärt werden, daß dieses andere Polypeptid kein Tyrosin enthält, das jodiert werden könnte (siehe Beschreibung des 8000 Dalton- Polypeptid-Bestandteils des A4-Antigens in Beispielen 5 und 6).

Beispiel 4

Reinigung, Identifizierung und Charakterisierung von Eimeria tenella A4-Antigen und Fragmenten davon Reinigung des 17000 Dalton-Bestandteils des A4-Antigens

E. tenella sporenbildende Oocysten wurden in 10 ml PBS pro 10- Oocysten resuspendiert und durch Schütteln mit gleichem Volumen Glaskugeln aufgebrochen. Die Membranen wurden durch Zentrifugieren (100000 x g, 60 min., 4ºC) isoliert und die Proteine wurden in 1% NP-40, 10 mM Tris (pH 7,5), 25 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM TLCK, 0,1 mM TPCK und 10 KIU/ml Aprotinin solubilisiert. Unlösliches Material wurde mit einem weiteren 100000 x g-Umlauf (60 min., 4ºC) pelletiert. Das Protein wurde an einer mit 10 mM Tris (pH 7,7), 0,05 NP-40 äquilibrierten DEAE-Cellulose-Säule adsorbiert und dann mit diesem Puffer, enthaltend 50 mM NaCl, gewaschen. Nach Elution mit diesem Puffer, enthaltend 200 mM NaCl wurde das 17000 Dalton-Polypeptid durch Acetonfällung konzentriert und das Präzipitat im Füllpuffer resuspendiert, gekocht und einer SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese unterzogen (15%). Üblicher SDS-PAGE-Probenpuffer wurde in diesem und anderen Experimenten verwendet, enthaltend 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% (Gew.-/Vol.-) Natriumdodecylsulfat, 10-5 (Gew.-/Vol.-) Glycerin und 0,001% (Gew.-/Vol.-) Bromphenolblau. Der Puffer enthielt auch 5% (Gew.-/Vol.-) β-Mercaptoethanol, ausgenommen bei den SDS-PAGE-Versuchen, deren Bedingungen als nichtreduzierend bezeichnet wurden. Die 17000 Dalton-Polypeptidbande wurde durch Anfärben (Coomassie Blue oder KCl) identifiziert. Die geeignete Gelregion wurde herausgeschnitten, das Protein elektroeluiert und durch Acetonfällung konzentriert. Es ist anzumerken, daß diese Verfahren für Proteine und Peptide, die untereinander durch Disulfidbindungen gebunden sind und mit diesem Verfahren getrennt werden, denaturierend sind. Das 17000 Dalton- Polypeptid wird mit diesem Verfahren im wesentlichen rein erhalten.

Reinigung und Charakterisierung des A4-Antigens

Alternativ zur Reinigung durch Gelelektrophorese wurden die Sporocysten-Membranproteine aus der DEAE- Cellulosesäule gegen 10 mM Tris-HCl, pH 8, 0,05% NP-40 dialysiert und auf eine DEAE-HPLC-Säule (BioRad) aufgegeben und in diesem Puffer äquilibriert. Die Säule wurde mit einem NaCl-Gradienten (0-300 mM) in demselben Puffer entwickelt. Das 17000 Dalton-Polypeptid (identifiziert durch dessen Wanderung bei der Gelelektrophorese) wurde im Material, das bei 200 mM NaCl eluiert wurde, gefunden. Die Fraktionen, die dieses Protein enthielten, wurden auf eine Hydroxylapatitsäule gegeben (HPHT-BioRad), äquilibriert mit 30 mM Kaliumphosphat, pH 6,0, 0,05% Zwittergent 3-12 (Calbiochem- Behring, LaJolla, CA) 0,1 mM Dithiothreitol. Die Säule wurde mit dem Äquilibrierpuffer gewaschen und einem Kaliumphosphatgradienten (0-300 mM), enthaltend 0,05% Zwittergent und 0,1 mM Dithiothreitol entwickelt. Das 17000 Dalton-Polypeptid (identifiziert durch Gelelektrophorese wie vorstehend beschrieben) erschien im Material, das bei etwa 90 mM Kaliumphosphat eluiert wurde.
Die Fraktionen, die das 17000 Dalton-Polypeptid enthielten, und durch dieses Verfahren gereinigt wurden, enthielten auch ein zweites Peptid von 8000 Dalton. Dieses Peptid scheint über eine Disulfidbrücke an das 17000 Dalton- Polypeptid gebunden zu sein. Wenn die Fraktionen, die das 17000 Dalton-Polypeptid enthalten, mit Monoklonal-Antikörper A4 immunopräzipitiert wurden und die präzipitierten Proteine durch Gelenktrophorese unter reduzierenden Bedingungen analysiert wurden (wie vorstehend), erschienen beide, das 17000 und das 8000 Dalton-Polypeptid, immunopräzipitiert. Folglich scheint in Sporocysten-Membran-Präparaten, das 8000 Dalton und das 17000 Dalton-Polypeptid über eine Disulfidbindung (vermutlich über eine Cysteinbrücke) gebunden zu sein, da die zwei Peptide nicht bei der Elektrophorese erscheinen, sofern nicht ein stark reduzierendes Mittel anwesend ist. Unter nichtreduzierenden Bedingungen wandern die A4-reaktiven Spezies mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 21-23000.

Herstellung des 11500 Dalton-Fragments des A4-Antigens

E. tenella-Sporocyst-Membranen wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt und in 10 ml PBS + 1% Triton X - 100 resuspendiert. Zu diesen 10 ml Membransuspension wurden 10 ml 80%-iges Phenol, enthaltend 0,1% 8-Hydroxychinolin, gegeben. Die Suspension wurde mit einer maximalen Geschwindigkeit für 3 Minuten umgeschüttelt und für 10 Minuten bei 4000 U/min zentrifugiert. Das Phenol und die flockige Zwischenschicht wurden entfernt und mit fünf Volumina 100 mM Ammoniumacetat in Methanol verdünnt, gefolgt von Ausfällung bei -20ºC über Nacht. Nach zweimaligem Waschen in Aceton, wurden die unlöslichen Proteine für 8 Stunden in 0,5% SDS bewegt und unlösliches Material durch Zentrifugieren bei 20000 U/min für eine Stunde bei 4ºC entfernt. Die Probe wurde reichlich gegen PBS (pH 7,2), enthaltend AG 501-X8, gemischt mit Bettharz (1 mg/500 ml) dialysiert. Das 11500 Dalton-Fragment des A4-Antigens wurde dann vom Oberstand unter Verwendung des Ptn 7.2A4/4- Monoklonal-Antikörpers immunoadsorbiert. Dieses Polypeptid erwies sich als reaktiv mit Ptn 7.2A4/4-Monoklonal-Antikörper durch Mikrotiter-Platten-ELISA.
Für die Mikrotiter-Platten-ELISA wurden Polystyrol- Platten mit 96 Trögen (Immunlon II) mit Antigen in 10 mM Glycin gepufferter Salzlösung, pH 9,6, sensibilisiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit 0,15 M PBS mit 0,0005% Tween-20 gewaschen, mit 3% BSA in PBS-Tween blockiert, abermals gewaschen und mit Ptn 7.2A4/4- Monoklonal-Antikörper verdünnten PBS inkubiert. Die Vertiefungen wurden wie vorher gewaschen und dann mit Peroxidase konjugiertem Kaninchen-Antimaus-IgG-Serum verdünnt in PBS inkubiert. Die Vertiefungen wurden wieder gewaschen und dann mit Substrat (2,2'-Azino-di-[3-ethyl-benzthiazolinsulfonat]) in Gegenwart von H&sub2;O&sub2; inkubiert. Die Farbentwicklung wurde mit einem Dynatech MR-580-Mikrotiter- Platten-ELISA-Leser nach 15 Minuten bestimmt.

Herstellung des 6500 Dalton-Fragments des A4-Antigens

E. tenella-Sporocysten wurden präpariert. Die Sporocysten wurden dann für 1 Stunde bei 41ºC in einer Lösung, enthaltend 0,25% Trypsin und 0,5% Taurodesoxycholinsäure inkubiert, um Sporozoiten freizusetzen. Sporozoiten wurden dann mehrere Male in PBS, enthaltend 1 mM PMSF, gewaschen und die Sporozoitmembran durch mechanisches Aufbrechen der Sporozoiten mit Glaskugeln hergestellt. Das 6500 Dalton- Fragment des A4-Antigens konnte mit dem Ptn 7.2A4/4- Monoklonal-Antikörper oder mit E. tenella-spezifischem Hühner-Antiserum immunopräzipitiert werden.

Beziehung der verschiedenen Peptide und Fragmente des A4- Antigens

Wie in den Beispielen 5 und 6 gezeigt wird, codiert das A4-Antigen-codierende Gen ein 25000 Dalton-Protein. Dieses Protein wird anschließend durch Proteolyse behandelt unter Herstellung von 17000 und 8000 Dalton-Peptiden, die über eine Disulfidbindung verbunden sind. Sowohl vom 11500 als auch vom 6500 Dalton-Fragment des A4-Antigens wird angenommen, daß sie Fragmente des 17000 Dalton-Peptids sind. Da das 6500 Dalton-Fragment mit Jod markiert werden kann, während das 8000 Dalton-Peptid nicht jodiert werden kann, schlußfolgern wir, daß das 6500 Dalton-Fragment vom 17000 Dalton-Peptid abgeleitet ist. Das 11500 Dalton-Fragment wird bei reduzierender SDS-PAGE sichtbar und muß daher vom 17000 Dalton-Peptid stammen. Die exakte Lokalisierung dieser zwei Fragmente innerhalb des 17000 Dalton-Peptids ist unbekannt.

Beispiel 5

Aminosäuresequenz der 17000 und 8 000 Dalton- Pentidbestandteile des A4-Antigens

Aminosäuresequenz der 17000 Dalton-Peptidbestandteils des A4- Antigens

Die Aminosäuresequenzierung des 17000 Dalton-Peptids war aufgrund der blockierten N-endständigen Aminosäure kompliziert (d. h. nicht bestimmbar durch Edman-Abbau (12)). Um dieses Problem zu umgehen, wurde das Protein reduziert und alkyliert und dann mit verschiedenen Chemikalien und Enzymen aufgeschlossen. Die erhaltenen Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt (17). Das 17000 Dalton-Polypeptid oder das A4-Antigen wurden mit CNBr (CN), V8-Protease (V), Chymotrypsin (CH) und Endoprotease Arg-C (R) aufgeschlossen.
Vor dem Proteaseaufschluß des gereinigten 17000 Dalton-Polypeptids oder des A4-Antigens wurde mit 30 mM Dithiothreitol, 6 M Guanidin-HCl (Ph 8) für 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Festes Jodacetamid wurde zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben, der pH-Wert erneut auf 8 eingestellt und die Probe für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Reduktion und Alkyliertug wurden die Proben von den Reagenzien gereinigt entweder durch P6DG (Bio-Rad, Richmond Cal.) Spin-Säulen (spin columns), äquilibriert mit 0,1 M MOPS, pH 7,5; 0,1% SDS oder durch Umkehrphasen-HPLC.
Für den CNBr-Aufschluß wurde die Proteinprobe mit 1% CNBr in 70%-iger Ameisensäure für 20 Stunden bei 4ºC aufgeschlossen. Die Probe wurde in einer Savant-Speedvac-Zentrifuge zur Trockne eingedampft und in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) oder in 0,1% TFA, 20% Acetonitril (CH&sub3;CN) wieder gelöst. V8-Aufschluß wurde in 0,1% SDS, 0,1 M MOPS pH 7,5 für 2 Stunden bei Raumtemperatur bei einem Verhältnis von 50 ug 17000 Dalton Polypeptid: 1 ug V8 durchgeführt. Nach Aufschluß wurden die Proben mit 4 Volumina Aceton bei -20ºC über Nacht präzipitiert. Die Acetonniederschläge wurden in vorstehender Weise wieder aufgenommen. Der Chymotrypsin-Aufschluß wurde mit 0,05% Zwittergent 3-12, 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 7,8 für 1 Stunde bei 37ºC bei einem Verhältnis von 50 : 1, 17000 Dalton-Peptid : Chymotrypsin durchgeführt. Die Proben wurden mit TFA zur Peptidreinigung angesäuert. Arg-C-Aufschluß wurde in 0,05% Zwittergent 3-12, 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 7,8 für 2 Stunde bei 37&sup0; C bei einem Verhältnis von 15 : 1, 17000 Dalton-Peptid : Arg-C durchgeführt. Nach Acetonfällung über Nacht bei -20ºC befanden sich die Peptide hauptsächlich im Acetonüberstand. Der Überstand wurde verdampft und die Proben wie vorstehend wieder aufgenommen. Die Peptide wurden an einer Vydac C4- Säule (the Separations Group, Inc., Hisparia, CA) gereinigt und mit einem 0-100% CH&sub3; CN-Gradienten in 0,1% TFA eluiert.
Aminosäuresequenzierung wurde unter Verwendung eines Gasphasensequenzers (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), gemäß dem Verfahren von Hunkapiller et al. (16) ausgeführt. Phenylthiocarbamyl (PTC) derivatisierte Aminosäuren wurden durch HPLC analysiert (5).
Die N-endständige Aminosäure wurde direkt durch Entfernung des Blockierungsmittels bestimmt. Das 17000 Dalton-Peptid wurde mit Pyroglutamataminopeptidase (5:1 Protein : PAP) in 0,1 M Kaliumphosphat (pH 8,0), 10 mM EDTA, 5% Glycerin, 5 mM Dithiothreitol, 0,05% Zwittergent 3-12 für 1 Stunde bei 37ºC behandelt. Nach der Behandlung konnte die Aminosäuresequenz direkt bestimmt werden, mit der Annahme, daß die N-endständige Aminosäure Glutamin unter Bildung eines blockierten Restes von Pyrrolidoncarbonsäure cyclisiert ist.
Die vollständige Aminosäuresequenz des 17000 Dalton- Peptid-Bestandteils des A4-Antigens ist in Fig. 1 dargestellt.

Teilaminosäuresequenz des 8000 Dalton-Peptid-Bestandteils des A4-Antigens

Wenn das gereinigte 8000 Dalton-Peptid (abgeleitet von dem A4-Antigen durch Reduktion und Alkylierung) einer Edman-Sequenzierung unterzogen wurde, konnte die Nendständige Aminosäuresequenz direkt bestimmt werden. Eine Teilaminosäuresequenz der N-endständigen Region des Peptids ist nachstehend angeführt:
NH&sub2;- ala ala gly thr thr asp ala val ile cys leu thr asn pro ala pro leu glu ala arg ser gln pro phe asp asp glu

Beispiel 6

Isolierung und Charakterisierung des genomischen DNA-Klons, der das A4-Antigen codiert

Isolierung der DNA aus sporenbildenden E. tenella Oocysten.

Sporenbildende Oocysten (5·10&sup8;) wurden gewaschen und Sporocysten wurden wie vorher beschrieben isoliert. Isolierte Sporocysten wurden 2x mit 0,1 M Tris-HCl, (pH 8,5), 0,2 M NaCl, 10 mM EDTA gewaschen. Die Sporocysten wurden durch Inkubation für 30 Minuten bei 65ºC in 0,1 M Tris-HCl, (pH 8,5), 0,2 M NaCl, 50 mM EDTA, 1% SDS, 150 ug/ml Proteinase K lysiert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die DNA mit einem gleichen Volumen Phenol für 1 Stunden sanft extrahiert. Nach Zentrifugieren für 10 Minuten bei 3000 U/min wurde die wässerige Schicht entfernt und die Zwischenschicht und Phenol wurden wieder mit 10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA extrahiert. Die wässerigen Phasen wurden zusammengegeben und einmal mit Phenol und zweimal mit Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert. Die DNA wurde durch Ethanolfällung isoliert. Das DNA-Pellet wurde in 10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA aufgenommen und mit 0,15 mg/ml DNase freier RNase A für 1 Stunde bei 37ºC behandelt. Nach RNase-Aufschluß wurde die Probe einmal mit Phenol, einmal mit Chloroform : Isoamylalkohol extrahiert und dann mit Ethanol gefällt. Die an Agarosegelen bestimmte Größe der DNA belief sich auf mehr als 20 Kilobasen-Paare.

Aufbau der E. tenella Genom-Genbank im Bakteriophagen λgt wes λB

Die E. tenella genomische DNA-Genbank im Bakteriophagen λgt wes λB (25) wurde unter Verwendung von Verfahren durch Maniates et al. (32) erstellt. Der Phage wurde durch Polyethylenglycol-Fällung, Chloroformextraktion und CsCl- Gradienten-Zentrifugierung gereinigt. Gereinigter Phage wurde mit 1% SDS, 50 mM EDTA und 150 ug/ml Protenase K aufgebrochen und DNA durch Phenolextraktion, Chloroformextrakton und Ethanolfällung gereinigt. Die E. tenella genomische DNA und Phagen-DNA wurden mit EcoRI vollständig aufgeschlossen. Die linken und rechten Arme der Phagen-DNA wurden an ihren kohäsiven Enden getempert und die Arme wurden dann durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation gereinigt. 30 ug EcoRI aufgeschlossene DNA- Arme wurden zu 6 ug EcoRI aufgeschlossener E. tenella-DNA unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert. 20 ug der ligierten DNA wurden in vitro in die Phagenteilchen unter Herstellung einer Genbank von 5·10&sup6; rekombinanten Phagenteilchen geladen.

Synthetische Oligonukleotide

Oligonukleotidsonden, die komplementär zu den Bereichen des Gens, die den 17000 Dalton-Peptid-Bestandteil des A4-Antigens codieren, sein würden, wurden unter Verwendung eines Biosearch Sam I (Biosearch, Inc., San Rafael, CA) synthetisiert. Die erwarteten DNA-Sequenzen der geeigneten Bereiche wurden aus der Aminosäuresequenz des 17000 Dalton-Peptids geschlossen. Aufgrund der Nichteindeutigkeit des genetischen Kodes kann die exakte DNA- Sequenz nicht vorausgesagt werden. "Mischsonden" wurden entworfen und synthetisiert, die ein Gemisch von DNA- Sequenzen enthielten, von denen eines eine perfekte Musterhomologie mit dem Gen für das 17000 Dalton-Peptid aufweisen sollte.
Oligonukleotid COD 92 basiert auf Aminosäuren 6 bis 12 des Peptids V1 (siehe Beispiel 5 für die Aminosäuresequenz des 17000 Dalton Peptids). Es enthält ein Gemisch aus 256 verschiedenen Sequenzen. Die Struktur des Oligonukleotids COD 92 ist:
Aminosäuresequenz: GlyAsnPheAlaTyrTyrPro
Das Oligonukleotid COD 94 basiert auf Aminosäuren 3 bis 8 des Peptids V2 des 17000 Dalton-Peptids. Es enthält ein Gemisch aus 64 verschiedenen Sequenzen:
Aminosäuresequenz: TrpLysThrGluIleCys
Das Oligonukleotid COD 108 basiert auf Aminosäuren 25-30 des Peptids V1. Es enthält ein Gemisch aus 16 verschiedenen Sequenzen. Die Struktur des Oligonukleotids COD 108 ist:
Aminosäuresequenz: GluTyrTrpLysGlyGly

Screening der E. tenella genomischen DNA-Genbank

Rekombinante Phagen der genomischen E. tenella DNA- Genbank wurden auf 15 cm-Platten bei hoher Dichte bis zu 2-3 ·10&sup4; Phagen pro Platte gegeben. Nitrocellulosefilter- Abdrücke wurden von jeder Platte gemäß den Verfahren von Benton und Davis (2) hergestellt. Die Filter wurden dann mit den geeigneten synthetischen Oligonukleotiden inkubiert, die bei hoch spezifischer Aktivität mit (³²P)-ATP und T4- Polynukleotidkinase markiert wurden. Positive Plaques wurden durch Autoradiographie identifiziert. Nur jene Plaques, die mit beiden Oligonukleotiden COD-92 und 108 hybridisierten, wurden als positiv gezählt.
Kleine Agar-Blöcke wurden aus den Platten in den Bereichen ausgeschnitten, die dem Bereich auf dem Filter entsprachen, das die hybridisierte DNA enthielt. Der Phage wurden eluiert, mit geringerer Dichte zurückplattiert (20-100/Platte) und wiederum mit allen drei Oligonukleotidsonden abgesucht. Reine isolierte positive Beläge oder Klone wurden herausgenommen. Phage 108-1 hybridisierte stark zu Oligonukleotid COD-92 und mäßig zu Oligonukleotiden COD-108 und 94. Phage 108-1 wurde in einem größeren Maßstab zur Reinigung und Charakterisierung der E. tenella-DNA-Insertion angezogen. Die Charakterisierung von Phage 108-1 DNA zeigte eine EcoRI-Insertion von 5500 bp.

Detaillierte Charakterisierung des genomischen Klones, der das 17000 Dalton-Peptid codiert - Restriktionskarte

Das 5500 bp EcoRI-Fragment, eingefügt aus Klon 108-1, wurde aus dem λ-Phagenvektor in das Plasmid pUC 9 (56) subkloniert. Die rekombinanten Plasmide wurden mit einer Reihe von Restriktionsendonukleasen aufgeschlossen, um die Lage des Schlüssel-Restriktionsortes im Genom-DNA-Klone zu bestimmen. Die Lage des Restriktionsortes innerhalb der DNA wurde benötigt, um die Lokalisierung und Orientierung des 17000 Dalton-Peptid-Gens zu ermitteln und um eine Strategie für die Sequenzierung des EcoRI genomischen DNA-Fragments zu entwickeln. Die Restriktionskarte ist in Fig. 2 dargestellt. Die Lokalisierung und Orientierung des Gens für das 17000 Dalton-Peptid ist in dieser Karte dargestellt.

DNA-Sequenz-Analyse von Klon 108-1

Das BGlII-EcoRI-Fragment von Klon 108-1, enthaltend das Gen für den 17000 Dalton-Peptid-Bestandteil des A4- Antigens, wurde nach der Didesoxymethode von Sanger (44) unter Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzymfragmenten sequenziert. Primers für DNA-Synthese schließen Oligonukleotide COD-92, 94 und 108 als auch andere synthetische Oligonukleotide ein. Die DNA-Sequenz ist in Fig. 3 gezeigt.

Struktur des Gens, das das A4-Antigen codiert.

Die DNA-Sequenz stimmt mit der vorgegebenen durch Aminosäuresequenzanalyse bestimmten überein. Zusätzlich gab es drei Merkmale des Gens, die nicht aus der Proteinsequenz ersichtlich sind. Unter Verwendung der Proteinsequenzinformation und allgemeinen Informationen, die die Struktur von sekretorischen Proteinen betreffen, schlußfolgerten wir die Struktur des Gens für das A4-Antigen.
Aus dem bekannten Aminoende des Sporocysten-Membran-17000-Dalton-Peptids (siehe Beispiel 5), Gln-Asp-Tyr---, sehen wir, daß das Gen einen extra 23-Aminosäure-Upstream codiert. Diese DNA-Sequenz ist eine typische "Signal"sequenz, die sich am Aminoende des Gens für viele sekretorische oder Membranproteine befindet (23, 3). Das Peptid, das sie codiert, ist erforderlich für den Export der Proteine aus ihrem Syntheseort (Cytoplasma) zu und/oder durch die Plasmamembran. Das Signalpeptid wird gewöhnlich durch den sekretorischen Prozeß entfernt. Es ist nicht überraschend, daß das A4-Antigen mit einem Signal-Peptid versehen ist, da es höchstwahrscheinlich die cytoplasmische Membran durchquert, um sich an der äußeren Oberfläche der Sporozoite wiederzufinden. Das Aminoende der Signalsequenz ist vermutlich das Met-Codon, da im wesentlichen die Synthese aller Proteine mit Methionin beginnt.
Es gibt drei Bereiche des Gens, in denen sich die DNA-Sequenz nicht mit der Proteinsequenz genau decken. Der erste ist ein 101 bp Segment, das innerhalb des Codon für Val-7 der bekannten entwickelten 17000 Dalton-Proteinsequenz auftritt. Der zweite ist eine 114 bp Sequenz zwischen den Codonen für Gly-65 und Gly-66 des 17000 Dalton-Peptids. Der dritte ist eine 124 bp Sequenz im Codon für Asp-186 des 8000 Dalton-Peptids. Diese drei Sequenzen sind Intronstrukturen, die typischerweise in den Codierungsbereichen vieler eukaryotischer Gene gefunden werden. Sie liegen in der Vorstufe für die mRNA vor und werden dann durch einen RNA- Rekombinationsmechanismus, bekannt als "Spleißen" ("splicing") entfernt unter Erhalt entwickelter mRNA mit einer ununterbrochenen Codierungssequenz. Die DNA-Sequenzen um die "splice junctions" (Spleißknoten) sind mit jenen, die bei anderen eukaryotischen Genen zu sehen sind, übereinstimmend (47).
Diese Sequenz des 17000 Dalton-Peptids scheint abgeschlossen zu sein mit der Sequenz Gly-Gly, entsprechend den Codonen 157 und 158. Wir haben auch ein 8000 Dalton Peptid identifiziert mit der Sequenz beginnend bei Ala-162 und sich bis Glu-188 erstreckend. Die Peptidsequenz Arg-Arg- Leu, entsprechend den Codonen 159 bis 161, wurde nicht gefunden. Es ist wahrscheinlich, daß dieses Tripeptid durch einen Mechanismus ähnlich jenem der Spaltung anderer Proteine wie Insulin entfernt wird (53). Folglich sind die zwei Peptide des A4-Antigens durch eine anstoßende Nukleotidsequenz codiert und mindestens ein protolytischer Schritt tritt, beginnend mit Ala-162, unter Erzeugung des 8000 Dalton-Peptids auf.

Beispiel 7

Herstellung des Anti-Idiotyp-Antikörpers zum A4-Protein- Antigen

Der A4-Anti-Idiotyp-Antikörper wurde durch Sensibilisierung von Kaninchen mit gereinigten A4-monoklonal- Antikörper hergestellt.

Herstellung von A4-monoklonal-Antikörper

Ptn 7.2A4/4-Hybridom wurde in HB101®-Serum-freiem Medium (HANA Biologics) zu einer Dichte von etwa 2·10&sup6; Zellen/ml vermehrt. Die Überstände wurden durch ein Doppelkreis-Immunodiffusionsverfahren in Agarosegelen gegen Anti-Maus-IgG und Anti-Maus-γG3 geprüft. Positive Überstände wurden zusammengegeben und auf das etwa 50-fache durch Ultrafiltration und Dialyse gegen 29 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,2% NaN&sub3; pH 8,4 aufkonzentriert. Der Überstand wurde dann über eine Protein A - Sepharose-Säule gegeben, um Immunoglobulin zu binden. Die Säule wurde dann mit 15 Bett- Volumina des vorstehenden Puffers gewaschen, um alle Rückstände ungebundenen Proteins zu entfernen. Gebundener Antikörper wurde von der Säule in 2 ml-Fraktionen mit 100 mM Natriumacetat, 0,04% Natriumazid, pH 4,0 in Röhrchen mit 2 ml 500 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, eluiert. Der Antikörper wurde dann durch eine DEAE Affi-gel® Blausäule (Bio-Rad Labs) gegeben und die Peakfraktionen gesammelt und durch Ammoniumsulfatfällung aufkonzentriert. Der konzentrierte Antikörper wurde dialysiert, um Restsalz zu entfernen und mit der Lowry-Protein-Methode quantitativ bestimmt. Die Reinheit wurde durch elektrophoretische Trennung in 8-20% SDS-PAG- Polyacrylamidgel bestimmt.

A4-Anti-Idiotyp-Antikörper-Produktion.

Kaninchen wurden mit einer Anfangsdosis von 500 ug gereinigten Ptn 7.2A4/4-Antikörpern in kompletten Freund Adjuvans immunisiert, gefolgt von 3 Auffrischungs- Verabreichungen von 500 Hg Antikörper jeweils in inkompletten Freund Adjuvans 10 Tage später. Den Kaninchen wurde durch Herzpunktur Blut entnommen und die hergestellten Sera sofort bei -70ºC gelagert.

Herstellung der Maus-Serum-Protein-Immunoadsorptionssäule

Nicht-immunes Mausserum wurde mit Ammoniumsulfat (50% gesättigt) gefällt und die gefällten Proteine in PBS resuspendiert und über eine Sephadex G-25-Säule gegeben, um Restsalz zu entfernen. Die Peakfraktionen wurden gesammelt und gegen 100 mM NaHCO&sub3;, 500 mM NaCl, pH 8,3 dialysiert und kovalent an CNBr-aktivierte Sepharose gebunden.

Reinigung von A4-Anti-Idiotyp-Antikörper

Immunes Kaninchenserum gegen Ptn 7.2A4/4 wurde auf eine Immunoadsorptionssäule, hergestellt mit Mausserum- Protein gegeben. Ungebundener Antikörper wurde in 2 ml- Fraktionen gesammelt und hinsichtlich Aktivität gegen Ptn 7.2A4/4 durch Doppelkreis-Immunodiffusion getestet. Positive Fraktionen wurden dann für Antikörper schwerer und leichter Ketten durch SDS-PAGE geprüft. Dieses Präparat kann zur Impfung von Hühnern verwendet werden. Ein typisches Protokoll für Impf-/Schutzuntersuchungen kann wie das Nachstehende sein. Die Vögel können intramuskulär mit 100 ug A4 antiidiotypischen Antikörper verdünnt mit 3 Teilen Träger, bestehend aus 5% Arlacel 4, 94% Drakeol 6-VR und 1% Tween-80, geimpft werden. Kontrollvögel können entweder ungeimpft verbleiben oder Antikörper-Adjuvans aus Kontroll-Kaninchen, gereinigt in derselben Weise wie der A4-Antiidiotyp- Antikörper, erhalten. Vierzehn Tage später werden die Vögel erneut mit weiteren 100 ug Antikörper in Adjuvans geimpft. Vierzehn Tage später nach der zweiten Impfung können die Vögel mit 12000 E. tenella-Oocysten exponiert werden. Die Vögel können mit Läsionen 5 Tage nach der Exposition versehen sein. Die Läsionenzahl kann um 50-60% in A4-Antiidiotyp- Antikörper-geimpften Vögeln, verglichen mit den Kontrollen, vermindert sein.

Beispiel 8

Passiver Schutz von Hühnern unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers Ptn 7.2A4/4

Schutz gegen E. tenella und E. necatrix Sporozoiteninfektion unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers Ptn 7.2A4/4

Zwei Versuche wurden unternommen, um zu bestimmen, ob der monoklonale Antikörper Ptn 7.2A4/4, der gegen E. tenella- Sporozoiten entwickelt wurde und der Neutralisierung von E. tenella-Sporozoiten in vitro zeigt, passiv Hühner schützt, die von E. tenella oder E. necatrix-Sporozoiten über die cloacalen bzw. oralen Wege infiziert worden sind. Im Versuch 1 wurden 6-Gruppen 4-Wochen alter SPF weiße Leghornhühner mit entweder 10&sup6;, 10&sup5; oder 10&sup4; Sporozoiten von E. tenella intracoacal inoculiert. Sporozoiten wurden für 1 Stunde in 8 Fällen der minimalen Neutralisierungsdosis von Ptn 7.2A4/4 Monoklonal-Antikörper vorinkubiert (1,75·10&sup6; Antikörpermoleküle/Sporozoiten) oder ein gleiches Volumen von SP2/0 Myelom-Überständen. In Versuch 2 wurden 6 Gruppen von sieben 4-Wochen alten SPF weißes Leghorn-Hühnern oral mit 10&sup6;, 10&sup5; oder 10&sup4; E. necatrix-Sporozoiten inoculiert. Vor der Inoculierung wurde Sporozoiten für einen Zeitraum von 1 Stunde in dem fünffachen der minimalen Neutralisierungsdosis von Ptn 7.2A4/4 inkubiert. Kontrollsporozoiten wurden in SP2/0 Myelom-Kultur-Überständen inkubiert.
Intracloacale und orale Inokulierung mit Sporozoiten wurde unter Verwendung einer Spritze und Koagulationsspitze ausgeführt. Die geeignete Zahl an Sporozoiten wurde mit entweder 0,5 oder 1 ml Dosis angegeben.
In Experiment 1 starben 3 Vögel an Coccidiosis zwischen den Tagen 4 und 5 in der Kontrollgruppe, die 10&sup6; Sporozoiten enthielt. In der Behandlungsgruppe verendete ein Tier. Gleichfalls zeigten die Anzahl an Läsionen und die Hämatokritbefunde eine schwerere Infektion bei den Kontrollgruppen an als bei den Behandlungsgruppen. In vivo Neutralisation von E. tenella-Sporozoiten Sporozoitbehandlung Sporozoitdosis* Hämatokrit** Läsionszahl Anzahl der Todesfälle Kontrolle Ptn 7.2A4/4 *7 Vögel pro Dosisspiegel/Sporozoiten intracloacal verabreicht. **Hämatokrit wurden nur an überlebenden Vögeln bestimmt.
Die Resultate in einem zweiten Experiment zeigten, daß Vögel, die E. necatrix-Sporozoiten erhielten und mit Ptn 7.2A4/4 monoklonal-Antikörper behandelt worden waren, einen gewissen Schutz gegen Infektion aufwiesen. Die Anzahl der Läsionen in den Gruppen, die Ptn 7.2A4/4 erhielten, war geringer als die der entsprechenden Kontrollgruppe. In vivo Neutralisation von E. necatrix-Sporozoiten Sporozoitbehandlung Sporozoitdosis* Läsionszahl Kontrolle Ptn 7.2A4/4 *7 Vögel pro Dosisspiegel/Sporozoiten oral verabreicht.

Beispiel 9

Verwendung von E. tenella A4 Antigen und einem 11 500 Dalton- Fragment davon, um Sporozoit-neutralisierende Serumantwort hervorzurufen und eine Schutzantwort gegen E. tenella in Hühnern

Hervorgerufene Sporozoit neutralisierende Serumantwort gegen E. tenella unter Verwendung des A4 Antigens.

Das A4 Antigen, das in diesen Experimenten verwendet wird, wurde gemäß den Verfahren in Beispiel 4 zur Herstellung von nicht-reduziertem intakten A4 Antigen aus Sporocysten, hergestellt. Reinheit und Identität des Proteins wurden mit SDS-PAGE und Immunoreaktivität mit Monoklonal-Antikörper Ptn 7.2A4/4 vor Anwendung bei Hühnern bestätigt.
Die Impfstoff-Präparate wurden bei einem Spiegel von einem Volumen Antigen zu drei Volumina eines Ölträgers, bestehend aus 5% Arlacel A, 94% Drakeol 6-VR, 1% Tween 80 formuliert, so daß jeweils 0,1 ml Dosis etwa 15 ug A4 Antigen enthält. Falls erforderlich, wurde Antigen mit PBS (pH 7,2) zu einem für die Formulierung gewünschten Spiegel verdünnt. Die Hühner erhielten eine 0,1 ml Dosis über den intramuskulären Weg in den Nackenmuskel. Antigen wurde zwei weitere Male über denselben Weg unter Verwendung derselben Menge in 2-wöchigen Intervallen verabreicht.
Drei Tage vor jeder Verabreichung des Proteins und 11 Tage nach der letzten Verabreichung wurde den Vögel zum Sammeln von Serumproben Blut entnommen. Hitze-inaktivierte Sera wurden unabhängig im Sporozoit-Mikroneutralisations- Bestimmungsverfahren nach Beispiel 1 geprüft.
Die nachstehend angeführten Ergebnisse zeigen an, daß bei ungeimpften Vögeln, die nur Träger erhielten, kein nachweisbarer Neutralisationsantiserumtiter gegen E. tenella- Sporozoiten nachweisbar war, hingegen Vögel, die drei Dosen des Antigens erhielten, nachweisbare Neutralisationsantiserumtiter aufwiesen. A4 Antigen induzierte Sporozoit-Neutralisations- Bestimmungsdaten Serumprobe Sporozuoit-Neutralisationstiter (NDS) höchster niedrigster mittlerer Titer Vorbluta ungeimpft Kontrollen nur Träger (n=9) Träger/Protein Impfstoffe (n=15) Immunserumc (Ganzsporozoit-Vaccinate) a Sera von Vögeln innerhalb jeder Behandlungsgruppe wurden vereinigt und getestet. b N.D = nicht-bestimmbare Neutralisation. c Vereinigte Sera verschiedener Vögel.

Hervorrufen einer Schutzantwort bei Hühnern unter Verwendung des A4 Antigens

Dreiundsechzig (63) Tage nach der letzten Impfung wurden einige Tiere oral 1000 sporenbildenden E. tenella-Oocysten exponiert. Dies folgte den nächsten Tag mit 3000 sporenbildenden E. tenella-Oocysten, die ebenfalls oral gegeben wurden. Zökale Läsionen wurden 5 Tage nach dem letzten Befall ermittelt. Die Ergebnisse sind nachstehend in der Tabelle aufgeführt. Schutz von A4 Antigen geimpften Vögeln gegen E. tenella- Coccidiosis Läsionszahl nicht-geimpfte Kontrollen (n=17) nur Adjuvans (n=5) A4 Antigen/Adjuvans Vaccinate (n=8)

Hervorrufen einer Sporozoit-neutralisierenden Serum-Antwort gegen E. tenella unter Verwendung des 11500 Dalton-Fragments des A4 Antigens.

Das 11500 Dalton Immunogen, das in diesen Experimenten verwendet wurde, wurde aus Sporocysten durch Phenolextraktion, wie beschrieben in Beispiel 4, hergestellt. Reinheit und Identität des Proteins wurden durch SDS-PAGE und Immunreaktivität des monoklonal-Antikörper Ptn 7.2A4/4 vor Anwendung bei Hühnern bestätigt.
Lyophilisiertes gereinigtes Antigen wurde in 0,15 molarer phosphatgepufferter Salzlösung gelöst und mit drei Teilen Träger, bestehend aus 5% Arlacel A, 94% Drakeol 6- VR, 1% Tween-80 bei einer Endantigenkonzentration von 70 ug/ml emulgiert. Die Hühner erhielten 14 ug Protein/0,2 cm³ Dosis über den intramuskulären Weg in den Nackenmuskel. Das Antigen wurde nochmals zwei Wochen später über den gleichen Weg unter Verwendung der gleichen Menge verabreicht.
Einen Tag später wurden vor jeder Verabreichung des Proteins und zwei Wochen nach der zweiten Verabreichung des Proteins den Vögeln Blut für Serumproben entnommen. Hitzeinaktivierte Sera wurden unabhängig in der Sporozoit- Mikroneutralisationsbestimmung, gemäß Beispiel 1, geprüft.
Die Ergebnisse, die nachstehend angeführt werden, zeigen, daß während ungeimpfte Vögel, die nur einen Träger erhielten, keine nachweisbaren Neutralisationsantiserumtiter gegen E. tenella-Sporozoiten aufwiesen, Vögel, die zwei Dosen von Antigen erhielten, nachweisbare Neutralisationsantiserumtiter bis zu 1:81 aufwiesen. Sporozoit-Neutralisationsbestimmungsdaten Sporozoit-Neutralisationstiter (NDS) Serumprobe* Blutentnahme höchster niedrigester mittlerer Titer Vorblut nicht-geimpfte Kontrollen nur Träger Träger/Protein Impfstoff Immunserum** (Ganzsporozoit-Vaccinate) *5 Vögel je Gruppe. **Vereinigtes Serum von verschiedenen Vögeln.

Hervorrufen einer Schutzantwort in Hühnern unter Verwendung des 11500 Dalton-Fragments des A4 Antigens

Die Vögel erhielten etwa 3 ug des Antigens in dem vorstehend genannten Träger gleichzeitig in den Nackenmuskel. Eine zweite Gruppe von Vögeln erhielt nur die Trägersubstanz. Eine letzte Gruppe ungeimpfter [sentinaler] Vögel wurde mit jedem der zwei vorstehend genannten Gruppen zusammengebracht. Die Vögel wurden der Coccodia ausgesetzt durch Einhäusung in mit E. tenella exponierten Käfigen. Etwa zwei Wochen später wurden die Vögel geprüft und als E. tenella infiziert befunden. Die nachstehenden Beobachtungen wurden vermerkt. Schutz der geimpften Vögel gegen Coccidiosis durch E. tenella Behandlung Läsionszahl Zahl der Todesfälle nur Adjuvans (n=5) Antigenimpfung (n=5) sentinale Vögel (n=6)
Da die vorstehend beschriebenen Bedingungen eng den natürlichen Einfluß von E. tenella auf dem Gebiet nachempfinden, zeigen die dargestellten Daten klar und deutlich die Brauchbarkeit der Erfindung zum Schutz gegen durch E. tenella hervorgerufene Coccidiosis.

Nachweis, daß neutralisierende Serum-Antikörper von Hühnern den 17000 Dalton-Polypeptidbestandteil des A4 Antigens erkennen

Eine Analyse der Serum-Antikörper-Spezifität für den 17000 Dalton-Poypeptidbestandteil des A4 Antigens wurde unter Verwendung von Western Blots (4, 46) durchgeführt. Alle Hühnersera mit nachweisbarem Neutralisationstiter zu E. tenella-Sporozoiten zeigten, daß sie über Immunoglobuline mit Spezifität für den 17000 Dalton-Polypeptidbestandteil des A4 Antigens verfügten, umgekehrt verfügte keines der Sera aus Kontrollvögeln ohne Antwort über eine Spezifität für das 17000 Dalton-Polypeptid oder irgend ein anderes Sporozoit.

Nachweis, daß neutralisierende Serum-Antikörper von Hühnern mit Monoklonal-Antikörper Ptn 7.2A4/4 konkurrieren

Sera von geimpften Hühnern mit nachweisbaren Neutralisationstitern zu E. tenella-Sporozoiten als auch entsprechende Kontrollsera wurden hinsichtlich der Fähigkeit geprüft, mit Antikörper Ptn 7.2A4/4 für die Bindungsstellen an Sporozoitmembranen zu konkurrieren. Polystyrolplatten mit 96 Trögen (Immulon 11) wurden mit 50 ul Sporzoitmembranprotein in 10 mM Glycin-gepufferter Kochsalzlösung, PH 9,6, bei einem Spiegel von etwa 100 ug Gesamtprotein/ml sensibilisiert. Aufeinanderfolgende zweifache Verdünnungen der Sera wurden in 0,15 molarer phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,0005% Tween-20, die eine 1:80-Verdünnung von alkalischer Phosphatase, konjugiert an Ptn 7.2A4/4 enthielt, hergestellt und dann auf die sensibilisierten Platten mit einem Endvolumen von 75 ul/Vertiefung überführt. Nach Inkubieren bei 37ºC für 30 Minuten wurden die Platten von nichtumgesetzten Materialien unter Verwendung von 0,15 molarer phosphatgepufferter Salzlösung mit (0,0005%) Tween-20 freigespült. Danach wurde Substrat, das aus dem Natriumsalz von Phosphonitrophenol, gelöst in 100 mM Diethanolinpuffer zu einem Spiegel von 1 mg/ml zu jeder Vertiefung der Platte zu einem Endvolumen von 100 ul zugegeben. Das erhaltene Reaktionsprodukt wurde spektrophotometrisch beobachtet. Aus dieser Untersuchung war es möglich festzustellen, daß die Sera von Vögeln, die eine Antwort zur Impfung aufwiesen, wie ermittelt durch Neutralisation oder Immunoblots, auch Antikörper enthielten, die mit dem Monoklonal-Antikörper Ptn 7.2A4/4 konkurrieren. Dieses Experiment liefert den direkten Beweis, daß Antigen, gereinigt aus Sporozoitmembranen entweder durch Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung von Monoklonal- Antikörper Ptn 7.2A4/4 oder konventionelle Chromatographie, in der Lage ist, eine Immunantwort bei Hühnern zum Epitop, definiert durch Monoklonal-Antikörper Ptn 7.2A4/4 zu stimulieren.

Beispiel 10

Verwendung von E, tenella-Protein zum Hervorrufen einer Sporozoit-neutralisierenden Serum-Antwort gegen E. necatrix in Hühnern

Hitzeaktivierte Sera von Vögeln, die mit dem 11500 Dalton-Fragment des A4 Antigen (Beispiel 9) geimpft wurden, wurden gesammelt und in der Neutralisationsbestimmung (Beispiel 1) unter Ersatz von embryonischen Schweinelungenzellen für die embryonischen Kükennierenzellen geprüft. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt. Behandlung Neutralisationstiter nicht-immunisiertes Hühnerserum A4 Antigenimpfung E. tenella-Ganz-Sporozoit-Immun-Serum
Die Daten zeigen die Entwicklung von einem erhöhten Serumneutralisationtiter gegen E. necatrix, wenn Vögel ein gereinigtes 11500 Dalton-Fragment des A4 Antigens erhalten. Da bereits vorher aufgezeigt wurde, daß die Verabreichung eines A4 Antigens oder des 11500 Dalton-Fragments des A4 Antigens in einer Erhöhung der Serumneutralisationtiter für E. tenella resultiert und daß die Verabreichung eines A4 Antigens des 11500 Dalton-Fragments des A4 Antigens in einem Schutz gegen E. tenella-Befall resultiert und da E. necatrix- Sporozoitneutralisationstiter durch die Verabreichung des 11 500 Dalton-Fragments des A4 Antigens erhöht werden, kann man schlußfolgern, daß der Schutz gegen E. necatrix-Befall sich ebenfalls aus der Verabreichung von entweder dem A4 Antigen oder dem 11500 Dalton-Fragment des A4 Antigens ergibt.

Beispiel 11

Formulierung und Verwendung des Antigens zum Schutz von Hühnern gegen Krankheit, hervorgerufen durch E. tenella

Ein Mittel zur Immunisierung von Hühnern gegen Coccidiosis, hervorgerufen durch E. tenella, kann aus dem intakten A4 Antigen identifiziert durch monoklonal-Antikörper Ptn 7.2A4/4 oder einem Fragment davon hergestellt werden. Ein geeigneter Träger für das Antigen ist 5% Arlacel A, 94% Drakeol 6-VR, 1% Tween-80. Der Impfstoff kann durch Formulierung eines Teils der wässerigen Lösung des Antigens mit 3 Arlacel A/Drakeol 6-VR zu einer Endkonzentration von 10 ug Antigen/Dosis hergestellt werden. Der Impfstoff kann an Hühner beliebigen Alters über den intramuskulären Weg verabreicht werden. Geeignet geimpfte Hühner würden gegen die Krankheit geschützt sein und verminderte Anfälligkeit oder Tod, hervorgerufen durch Feldbefall mit E. tenella aufweisen.

Beispiel 12

Formulierung und Verwendung des Antigens zum Schutz von Hühnern gegen Krankheit, hervorgerufen durch E. necatrix

Ein Mittel kann das in Beispiel 10 Beschriebene einschließen. Der Impfstoff kann an Hühner beliebigen Alters über den intramuskulären Weg verabreicht werden. Geeignet geimpfte Hühner würden gegen die Krankheit geschützt sein und verminderte Anfälligkeit oder Tod, hervorgerufen durch Feldbefall mit E. necatrix, zeigen.

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Claims

1. Gereinigtes antigenisches Protein, das in einem Huhn eine Immunresponse verursachen kann, die Schutz gegen Infektion durch Eimeria tenella gewährt, welches Protein ein Molekulargewicht von ca. 25.000 aufweist und aus zwei Polypeptiden zusammengesetzt ist, die durch eine Disulfidbindung vereinigt sind, wobei eines der Polypeptide durch ein Molekulargewicht von ca. 17.000 und durch eine blockierte N-endständige Aminosäure gekennzeichnet ist und die in Figur (3) gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, und wobei das andere der Polypeptide durch ein Molekulargewicht von ca. 8.000 gekennzeichnet ist und die in Figur (3) gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

2. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1, wobei man:

a) Sporozysten von Eimeria tenella unter geeigneten nichtreduzierenden Bedingungen in Gegenwart von Proteaseinhibitoren mit einem Detergens in Berührung bringt, um die Sporozystenmembranproteine zu solubilisieren; und

b) das Protein unter geeigneten nicht-reduzierenden Bedingungen separat aus den solubilisierten Sporozystenmembranproteinen zurückgewinnt, wobei die separate Rückgewinnung Immunpräzipitation oder Immunaffinitätschromatografie mit dem durch die Hybridomazellinie ATCC Nr. HB 8561 erzeugten monoklonalen Antikörper Ptn 7.2 A4/4 umfaßt.

3. Verfahren zur Herstellung von 17.000 Dalton Polypeptid nach Anspruch 1, wobei man:

a) Sporozysten von Eimeria tenella unter geeigneten Bedingungen in Gegenwart von Proteaseinhibitoren mit einem Detergens in Berührung bringt, um die Sporozystenmembranproteine zu solubilisieren; und

b) das Polypeptid unter geeigneten reduzierenden Bedingungen separat aus den solubilisierten Sporozystenmembranproteinen zurückgewinnt, wobei die separate Rückgewinnung teilweise Reinigung der solubilisierten Sporozystenmembranproteine durch Chromatographie auf DEAE- Cellulose mit anschließender präparativer SDS-Elektrophorese unter geeigneten reduzierenden Bedingungen umfaßt.

4. Verfahren zur Herstellung eines antigenischen Polypeptids, das eine innerhalb der Aminosäuresequenz des Polypeptids nach Anspruch 1 befindliche Aminosäuresequenz aufweist und durch ein Molekulargewicht von ca. 11.500 gekennzeichnet ist, wobei man:

a) Sporozysten von Eimeria tenella in Gegenwart von 8-Hydroxychinolin mit Phenol in Berührung bringt, um die Sporozoitmembranproteine aus den Sporozysten zu extrahieren; und

b) das Polypeptid durch Immunpräzipitation oder Immunaffinitätschromatographie mit dem durch die Hybridomazellinie ATCC Nr. HB 8561 erzeugten monoklonalen Antikörper Ptn 7.2 A4/4 aus den extrahierten Sporozystmembranproteinen zurückgewinnt.

5. Verfahren zur Herstellung eines antigenischen Polypeptids, das eine innerhalb der Aminosäuresequenz des Polypeptids nach Anspruch 1 befindliche Aminosäuresequenz aufweist und durch ein Molekulargewicht von ca. 6.500 gekennzeichnet ist, wobei man:

a) Trypsin-Taurodesoxycholate-exzystierte Sporozoitmembranproteine mit Detergens in Berührung bringt, um die Proteine zu solubilisieren; und

b) das Polypeptid durch Immunpräzipitation oder Immunaffinitätschromatographie mit dem durch die Hybridomazellinie ATCC Nr. HB 8561 erzeugten monoklonalen Antikörper Ptn 7.2 A4/4 aus den solubilisierten, exzystierten Sporozoitmembranproteinen zurückgewinnt.

6. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1, wobei man ein für das Protein kodierendes DNA- Molekül herstellt, das DNA-Molekül in einen geeigneten Expressionsvektor einfügt, den resultierenden Expressionsvektor unter geeigneten Bedingungen, die Expression der DNA und Erzeugung des Proteins und Rückgewinnung des so hergestellten Proteins gestatten, in einen geeigneten Wirt einführt.

7. Verfahren zur Herstellung eines antigenischen Polypeptids, das eine innerhalb der Aminosäuresequenz des Polypeptids nach Anspruch 1 befindliche Aminosäuresequenz aufweist und in einem Huhn eine Immunresponse verursachen kann, die Schutz gegen Infektion durch Eimeria tenella gewährt, wobei man ein für das Polypeptid kodierendes DNA- Molekül herstellt, das DNA-Molekül in einen geeigneten Expressionsvektor einfügt, den resultierenden Expressionsvektor unter geeigneten Bedingungen, die Expression der DNA und Erzeugung des Polypeptids und Rückgewinnung des so hergestellten Polypeptids gestatten, in einen geeigneten Wirt einführt.

8. Verfahren zur Herstellung von 17.000 Dalton Polypeptid nach Anspruch 1, wobei man ein für das Polypeptid kodierendes DNA-Molekül herstellt, das DNA-Molekül in einen geeigneten Expressionsvektor einfügt, den resultierenden Expressionsvektor unter geeigneten Bedingungen, die Expression der DNA und Erzeugung des Polypeptids und Rückgewinnung des so erzeugten Polypeptids gestatten, in einen geeigneten Wirt einführt.

9. Vakzin zur Herbeiführung in einem Huhn einer wirksamen Immunität gegen Infektion durch Eimeria tenella, welches Vakzin je Dosis eine wirksame immunisierende Menge des Proteins nach Anspruch 1 und einen geeigneten Träger enthält.

10. Vakzin zur Herbeiführung in einem Huhn einer wirksamen Immunität gegen Infektion durch Eimeria tenella, welches Vakzin eine wirksame immunisierende Menge des Polypeptids nach Anspruch 7 und einen geeigneten Träger enthält.

11. Vakzin nach Anspruch 9, bei dem die wirksame immunisierende Menge über ca. 0,1 um/kg des Körpergewichts des Huhns liegt.

12. Monoklonaler Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach Anspruch 1.

13. Monoklonaler Antikörper, gerichtet gegen das Polypeptid nach Anspruch 7.

14. Monoklonaler Antikörper Ptn 7.2 A4/4, erzeugt durch die Hybridomazellinie ATCC Nr. HB 8561.

15. Zusammensetzung zur Herbeiführung in einem Huhn einer passiven Immunität gegen Infektion durch Eimeria tenella, welche Zusammensetzung eine wirksame Schutzmenge des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 12, 13 oder 14 und einen geeigneten Träger enthält.

16. Anti-idiotypischer Antikörper, gerichtet gegen den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 14.

17. Verfahren zur Herstellung des anti-idiotypischen Antikörpers nach Anspruch 16, wobei man:

a) den monoklonalen Antikörper Ptn 7.2 A4/4 aus der Hybridomazellinie ATCC Nr. HB 8561 zurückgewinnt;

b) den monoklonalen Antikörper reinigt;

c) den gereinigten monoklonalen Antikörper in ein geeignetes Tier injiziert, zusammen mit einem geeigneten Hilfsmittel;

d) Blutserum aus dem injizierten Tier entfernt; und

e) den anti-idiotypischen Antikörper aus dem Blutserum zurückgewinnt.

18. Nukleinsäuremolekül, welches das Protein nach Anspruch 1 enkodiert.

19. DNA-Molekül nach Anspruch 18 mit der in Figur (3) gezeigten Nukleinsäuresequenz.

20. cDNA-Molekül nach Anspruch 18.

21. DNA-Molekül, welches das Polypeptid nach einem der Ansprüche 4, 5 oder 7 enkodiert.

22. Klonierender Träger, der die Nukleinsäure nach Anspruch 18 enthält.

23. Wirtzelle, die den klonierenden Träger nach Anspruch 22 enthält.

24. Bakterieller Wirt nach Anspruch 23.

25. Verfahren zur Erzeugung des Proteins mit der in Figur (3) gezeigten Aminosäuresequenz, wobei man Wirtzellen nach Anspruch 23 unter geeigneten Bedingungen, die Erzeugung des Proteins und Rückgewinnung des so erzeugten Proteins gestatten, wachsen läßt.

26. Verfahren zur Erlangung der DNA nach Anspruch 19, wobei man totale genomische DNA aus Eimeria tenella-Oozysten isoliert; DNA-Fragmente aus der so isolierten genomischen DNA herstellt; die so hergestellten Fragmente in einen geeigneten klonierenden Vektor ligiert; die DNA der so hergestellten Klone einer Hybridisierung mit Oligonukleotiden unterwirft, enthaltend, oder komplementär mit, Nukleinsäuresequenzen, die innerhalb der in Figur (3) gezeigten Nukleinsäuresequenz anwesend sind, um geeignete Klone zu identifizieren; und aus den geeigneten Klonen DNA isoliert, die das Protein enkodiert und die in Figur (3) gezeigte Nukleinsäuresequenz aufweist.