PT93416B

PT93416B - Processo para a preparacao de um polipeptido antigenico de rhoptries da forma merozoita de plasmodium, dos seus derivados e de composicoes imunogenicas que os contem

Info

Publication number: PT93416B
Application number: PT93416A
Authority: PT
Inventors: Robert George Ridley; John Graham Scaife
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1989-03-14
Filing date: 1990-03-13
Publication date: 1996-02-29
Also published as: GB2230009B; DE69004721T2; IL93659A0; PT93416A; AU5121590A; EP0388738B1; ES2059855T3; IE900891L; DE69004721D1; ATE97693T1; CA2011031A1; GB9005589D0; CA2011031C; DK0388738T3; AU633306B2; JPH0347088A; EP0388738A1; IE64212B1; GB2230009A; MY106275A

Description

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 93.416

REQUERENTE: F.HOFFMANN-LA ROCHE AG., suíça, com sede em 124 Grenzacherstrasse, CH-4002 Basileia, Suíça

EPÍGRAFE: Processo para a preparação de um polipeptido antigénico de rhoptries da forma merozoita de plasmodium, dos seus derivados e de composições imunogénicas que os contêm

INVENTORES: Robert George Ridley, John Graham Scaife,

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Grã-Bretanha, 14 de Março de 1989, sob ο NS 89.05857.2 Grã-Bretanha, 22 de Agosto de 1989, sob o Ns 89.19064.9

INPi MC:

R? 15732

F. HOFFEMANN-LA ROCHE AG

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM POLIPEPTILO ANTIGfíNICO DS RHOPTR1ES DA FORMA MEROZOITA DE rLASMODIUM, DOS SEUS DERIVADOS E DE COMPOSIÇOES IMUNOGENICAS QUE

OS CONTÊM

Nos seres humanos a malária é causada por quatro espécies de Plasmodium, nomeadamente pelo P. f alciparum, P. viva*,

P. ovale e P. Kalariae. De acordo com uma referência da Organização Mundial de Saúde (WHO) do ano de 1986, encontram-se dis seminados por todo o mundo quase 100 milhões de casos de infecção por malária- Destes, cerca e 1 milhão, na maioria dos casos, crianças de tenra idade infectadas com o P. falcipa rum, são são fatais. Devido a aparente resistência dos parasitas ao fármaco e à resietência aos insecticidas dos vectores mosquitos, a malária continua a disseminar-se (Bruce-Chwatt, Essential Malariology, Londres, Heinemann, 2^a edição, 1986).

Avanços técnicos recentes trouxeram a esperança de que se torne possível produzir rapidamente uma vacina anti-malária que actue contra a crescente disseminação da malária. Em primei re lugar, podem utilizar-se novos métodos no desenvolvimento de vacinas contra a malária, por exemplo, a clonagem dos .genes e a sua expressão nos organismos hospedeiros microbianos bem como a utilização de anticorpos monoclonais para identificação de antigenos. Sm segundo lugar, culturas a longo prazo de P, falciparum nos globulos vermelhos do sangue humano ZfTrager et al., Science 193 (1976) 673-675 -7, proporcionaram uma fonte fácil para ζ

estudo do parasita da malária. Mais recentemente, tornou-se possível manter todos os estádios do ciclo de vida qo parasita, no laboratório /Ponnudurai et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 76 (1982) 812-818; Mazier et al., Science 227 (1985)

440-442 J.

ciclo de vida natural do P. falciparum possui três estádios diferentes. No primeiro estádio, os mosquitos intro duzem os esporozóitos nos vasos sanguíneos dos vertebrados durante a ingestão de alimento;, Estes esporozóitos seguem através do sistema circulatório ate ao fígado e invadem os hepató’citos do hospedeiro. No segundo estádio, desenvolvem-se os me rozoitos a partir destes esporozóitos. Estes merozditos passam através de diversos ciclos de multiplicação nos eritrócitos do hospedeiro e depois desenvolvem-se em gametácitos. Os gametócitos, que constituem o estádio sexual do parasita, são novamente ingeridos pelos mosquitos quando se alimentam.

Após fertilização no estômago do insecto os gametácitos desemvolvem-se em esporozóitos que seguem para =s glândulas salivares do insecto. A partir daqui o ciclo pode recomeçar.

Esporozóitos, merozditos e gametócitos possuem antigenns diferentes Z~Scaife, Genetic Engineering 2? (1988) 57-90-7. Em princípio podem produzir-se vacinas contra qualquer dos dife rentes estádios do parasita da malária. Utilizaram-se diversos antígenos de merozditos para induzir a imunidade contra a malária. Nenhum destes antígenos mostrou ser o candidato a vacina ideal. Na presente invenção, apresenta-se um novo antígeno de esquizonte/merozóito do parasita da malária. Este antígeno á reconhecido por dois anticorpos monoclonais (MAEs) descritos

por Hall et al. Moí, Biochem. Parssitol, 2 (1983), 24/-205.

Um destes anticorpos monoclonais, o MAE 2,13 inibe fortecente a invasão dos eritrocitos pelos parasitas da malária. A análise de mancha Western /'Towbin et al., Proc. Natl. Acad, Scl, USA 76, (1979), 4350-4354^7 de extractos de proteína da totalidade dos parasitas utilizando o EAE 2,13 revelou 4 faixas principais com uma massa molecular relativa de 65 KD, 70 KD, 78 KD e oO KD, respectivamente, sendo 1 KD igual a 1 000 Dalton. A purificação por afinidade do extracto de proteína da totalidade dos parasitas seguida de análise electroforética sobre gel, revelou duas faixas adicionais com uma mas sa molecular relativa de 40 KD e de 42 KD. Provavelmente, a forma natural do antígeno reconhecido pelo KAB 2,13, ° chamado antígeno 2,13, á ^a espécie de 80 KD, enquanto as outras faixas representam formas processadas deste antígeno. Não está esclarecido se as formas processadas do antígeno ocorrem também na natureza, isto é, no parasita. Estudos de imunófluorescência demonstraram que o antígeno reconhecido pelo EAE 2,13 se encon tra associado com os organelos de rhoptry dos merozéitos do Plasmódium. Eais especificamente, o EAB 2,13 reconhece um determinante ou epitope num polipéptido associado com os organelos de rhoptry dos merozóitos do Plasmódium. Os rhoptries do Plasmodium consistem num par de corpos de densidade electrónica em forma de pera situados na extremidade apical de merozóito. Dctudos com o microscópio electrónico revelaram que estes organelos desempenham um papel chava na invasão dos eritrócitos pelo parasita. Descobriu-se que bloqueando o referido determinante, o MAE 2,13 é capaz de inibir a invasão dós

eritrócitos. 0 outro snticorpo monoclonal, ο MAE 7,12 possui propriedades semelhantes às do MAE 2,13 mas não bloqueia a invasão dos eritrócitos de modo tão eficiente como o MAE 2,13.

Campbell et al., Am, J, Trop. Med. Hyg. 33. (198U) 1051-105^, descreveram antígenos associados ao rhoptry de 73, 63, U2 e UO KD presentes nos extractos de proteínas de estirpes da Malásia e de S. Salvador do parasita P. falciparum. Howard et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. JJ, (I98U) 1055-1059 descobriram proteír.âs de 82 j 70, 67, 39 e 37 KD num imunopreci pitado de merozóitos de uma estirpe vietnamita do p. falciparum. Schofield et al. , Mol. Bj.ochem. Parasitol. 18, (1986), 183-195, descreveram quatro anticorpos monoclonais que reconhe cem os antígenos presentes nos rhoptry dos merozóitos do P. falciparum. A analise de mancha Western de um extracto de parasita utilizando estes anticorpos proporcionou faixas de proteínas de 30, 66 e U2 KD. Dois dos anticorpos monoclonais des critos por Schofield e outros são capazes de inibir a invasão dos eritrócitos pelos merozóitos in vitro. Clark et al., parasitol. Res . 731 (1987) U25-U3U, descreveram duas proteicas com, respectivamente, um peso molecular de 83 000 daltons e 65 000 daltons, associadas com os organelos rhoptry dos mera zóitos do P. falciparum. Braun-Ereton et al., Nature; 332 , (1988) U57-U59, demonstraram que a clivagem de um suporte de membrana de fosfatidil-inositol activa uma protease de serina associada com a forma solúvel de uma proteína de membrana do Plasmodium falciparum. de massa molecular relativa de 76 000 daltons que se encontra presente nos merozóitos ou nas membra5 χ** .¾ nas isolada? dos esquizontes. Ensaios in vit ro demonstraram que esta protease de serina parece estar envolvida no processo da invasão dos eritrócitos pelos merozóitos da malária e desempenha uma função importante na maturação dos merozóitos. Não existe evidência experimental de que as proteínas descritas nas anteriores referências se encontrem, de algum modo, relacionadas com a proteína reconhecida pelos MABs 2,13 ^ou 7,12. Para além disso, desconhece-se se as proteínas descritas nas referências anteriores são capazes de induzirem a formação de anticorpos num hospedeiro mamífero, sendo estes anticorpos susceptíveis de inibir a invasão dos eritrócitos pela forma merozóitica do parasita da malária in vivo, tal como se demonstrou ser o caso do anti geno 2,13 e, portanto, os polipeptidos descobertos pela primeira vez, na presente invenção (ver exemplo a seguir).

Uma vez estabelecida a presença do antígeno pela formação de um MAE que reaja especificamente com o referido antígeno, ainda se encontra longe uma definição clara do próprio antígeno, por exemplo, pelo peso molecular da forma natural do antígeno e, pela sua composição dos aminoácidos e, preferencialmente, pela sua sequência de aminoácidos. Isto deve-se, na maioria dos casos, à pouca abundância destes antígenos no parasita e, deste mo do, a dificuldade em isolar quantidades suficientes de proteína do parasita que permitam a caracterização do antígeno. Isto con duziu a esforços para se clonarem molecularmente o gene que codi. fica a proteína reconhecida como antígeno pelos MAEs 2,13 θ 7,12. Apesar de a tecnologia da engenharia genética se encontrar já muito avançada, ainda não é fácil clonar um gene específico dentro da grande quantidade de genes presentes num organismo £al co ο

mo o Plasmodium falciparum, especialmente quando não se encontra disponível uma sonda que consiste numa sequência oligonucleotídica que represente um, pequeno segmento do gene. Quando se dispõe apenas de um MAE, é necessário preparar, em primeiro lugar, uma biblioteca de expressão de gene, do genoma do parasita, preferencialmente, uma biblioteca de expressão do gene de bacteriófago lambda, tal como a descrita no Exemplo (adiante) na qual o ADN do parasita se expressa como polipéptidos de fusão com -galactosidase. Efectua-se, então, o rastreio da biblioteca de expressão do gene para se detectarem produtos de ex pressão que que reajam com o MAE 2,13 s/ou 7,12 e isola-se o ADN de um bacteriófago recombinante capaz de exprimir um polipéptido que compreenda os epítopes reconhecidos pelo MAE 2,1β e/ou 7jl2 (Young et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983), 1194-1198. Pode determinar-se a sequência nucleotídica que codifica o referido polipéptido utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. Um exemplo de tal sequência nucleotídica θ a sequência nucleotídica (1):

7./

Ç

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Ssts sequência nucleotidica representa uma sequencia nucleotídica parcial do gene que codifica o antígeno 2,13, possuin do esse gene a sequência nucleotidica (2) :

.¾

ATGAGTTTCTATTTGGGTAGCTTAGTAATAATATTCCATGTACTCTTCCGTAATGTCGCT GATGGTATAAATGTAAACGGAGATAATAATTATGGGAAAACAATAATCAATAATGATTTC AATTTTGATGATTACAATTATTGGACACCAATAAATAAAAAGGAATTTTTAAATTCCTAT GAAGATGAATTTTCAAGTGAATCCTTTTTAGAAAATAAATCTAGTGTTGATGATGGAAAT ATAAATTTAACAGATACAAGTACATCAAATAAAAGTTCTAAAAAAGGACATGGTAGAAGT AGAGTAAGATCAGCATCAGCTGCTGCAATTCTTGAAGAAGATGATTCAAAAGATGATATG GAATTTAAAGCTTCTCCTTCAGTTGTTAAAACATCTACTCCATCAGGTACACAGACATCT GGTTTAAAATCATCTAGTCCATCTAGTACAAAGTCATCAAGTCCATCAAATGTAAAATCA GCTAGTCCACATGGTGAATCTAATTCTTCTGAAGAAAGTACTACTAAATCCTCAAAGAGA AGTGCTTCGGTTGCAGGTATTGTAGGTGCCGACGAAGAAGCACCTCCTGCACCAAAAAAC ACCCTCACTCCATTAGAAGAATTATATCCTACTAATGTTAATTTATTTAACTATAAATAT TCATTAAACAATATGGAAGAAAATATCAATATACTTAAAAACGAAGGAGATTTAGTTGCA CAAAAAGAAGAATTTGAATATGATGAAAATATGGAAAAAGCTAAACAAGACAAAAAAAAA GCACTTGAGAAAATAGGAAAACAATCAGACGAAGAACCTTTTATGTTTTCAGAAAATAAA TTTCTTGAAAATCAAGTAAAAGAAAGAAATGTTGCTGGATCCTTTTCTCGATTTTTCAGT AAATTAAATCCTTTTAAGAAAGATGAAGTAATAGAAAAAACTGAAGTATCAAAGAAAACA TTTTCAGGTATAGGTTTTAATCTTACTGACAAAGAAGCTAAAGTATTAGGTGTAGGTGCA ACCTATCAAGAATATCCAGAAACCATGTTATATAACTGTCCAAACAATTCTAATTTGTTT GATACTATAGAATCATTACAAGGAAGAATAATTGATATTAAAAAAAGAGAAAGCATGATA TCAACAACTTTCGAACAACAAAAAGAATGTTTAAAAAATATGGGTGTACTTGATCTTGAA TTAAACGATACACAATGTAAATTTGGTACATGTATAGGTAGCTTTGGAGAACATCATCTT AGATTATACGAATTTGAGAATGACTTATTTAAATTTCATCCAAATATTGATTATTTAACT TTAGCTGATGGATATAAATTACAAAAAAATCATATATATGAATTATCCCATGTAAACTTT TGCTTATTAAATCCTAAAACATTAGAAGAATTTTTAAAAAAAAAAGAAATCAAGGATCTT ATGGGTGGTGATGATCTTATAAAATATAAAGAAAATTTTGATAACTTTATGAGTATATCT ATAACATGCCATATTGAATCTTTAATATATGATGATATTGAAGCATCTCAAGATATTGCT GCTGTATTAAAAATTGCTAAAAGTAAATTACATGTAATAACATCAGGTTTATCATATAAA GCAAGAAAATTAGTATATAAAATTTATAGTGAAATTCAAAAAAATCCAGATGAACTCTAT GAAAAATTAACATGGATTTATGATAATATCTATATGATTAAAAGATATTATACTGCATAT GCTTTAGAAGGTGTCTGTTCATATCTTGAACATGATAAAAGTCAAATGTATACAGAATTA CATATTTATAACAAAATAGTCGACTCTGTTCGTTATTATAGTTCATGCTTTAAAAACGTT ATTGTTTATAATGCTATCATTTCTGGTATACATGAAAAAATAAAACATTTCTTAAAATTA GTACCAAGACACAACTTTCTTTTGGATTATCACTTTAATTCAATTTTTGAAAAAGAAATT /

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AAATTAATAAACATACGTTACAGATCTCACTTAAAGAAAAACTACTTTGCCTTCAAGAGA

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Utilizando o código genético, descobriu-se que.nasequên cia nucleotídica (1), duas faixas de leitura se encontravam interrompidas por diversos codões de paragem e, deste modo, era pouco provável que codificassem um polipéptido do P. falciparuw. A terceira faixa de transcrição tinha início com os nucleótidos 3 a 5, isto é GAT como primeiro codão que codifica o aminoácido ácido aspártico (abreviado para D de acordo com o sistema de uma única letra descrito por Dayhoff, in Atlas of Protein Sequence and structure, Washington D. C., National Biomedical Research Foundation, 1972), encontra-se aberto e codifica um polipéptido que possui a sequência aminoácida (I).

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VIVYNAI ISGIHEKIKHFLKLVPRHNFLLDY

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A sequência de aminoa'cidos (I) codifica ura polipétido que contém 591 restos de aminoacidos. Se a forma natural do an tígeno do P. falciparura reconhecido pelos MABs 2,13 θ 7,12 isto é, do antígeno 2,13, possui, na verdade, ura peso molecular de 80000 Dalton, a sequência de aminoácidos (I) representa cerca de £rês quartos da sequência de aminoácidos do referido antigeno. Devido ao método utilizado para se clonar o ADN que codifi ca para a sequência de aminoácidos (I), a referida sequência de aminoácidos tem de compreender o determinante antigénico (=epítope) reconhecido pelo MAE 2,13. 0 determinante antigénico é constituído por uma configuração molecular específica de uma ou mais sub-sequências na ausência de aminoácidos do antigeno 2,13 ou do polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos (I) ou uma sequência parcial da mesma, reconhecida pelo MAB 2,13.

A sequência nucleotídica (2) codifica para um polipépti do que contém 782 restos de aminoa'cidos e que possui a sequência de aminoácidos seguinte:

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MSFYLGSLVI I F Η V L F GKTX INNDFNFDDYNY EFSSESFLENKSSVDD KKGHGRSRVRSASAAA SPSVVKTSTPSGTQTS SNVKSASPHGESNSSE IVGADEEAPPAPKNTL YKYSLNNMEENINILK ENMEKAKQDKKKALEK KFLENQVKERNVAGSF IEKTEVSKKTFSGIGF YQEYPETMLYNCPNNS

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Ο peso molecular calculado para este péptido está de acordo com o peso molecular aparente determinado para o antí geno do P. falciparum reconhecido pelos MABs 2,13 e 7,12, is to é 80000 Dalton.

Uma vez que a presente invenção proporciona a sequên cia de aminoãcidos do antígeno 2,13 torna-se agora possível preparar grandes quantidades de polipéptidos que compreendam a sequência de aminoãcidos (II) ou sequências parciais desta se quência compreendendo a sequência de aminoãcidos que constitui o determinante antigénico reconhecido pelo MAB 2,13 tal como, por exemplo, a sequência de aminoãcidos (I). Podem preparar-se estes polipéptidos sob uma forma substancialmente pura, isto é, isenta de produtos contaminantes derivados do parasita da malária .

Para além das sub-sequências reconhecidas pelo MAB 2,13, a sequência de aminoãcidos (II) pode compreender outros determ^ nantes antigénicos que reagem reticular (cross reactive) e imu nologicamente com determinantes do antígeno 2,13 dos organelos rhoptry dos merozóitos do Plasmodium. Os referidos determinantes no antígeno 2,13 nos merozóitos, por exemplo, utilizando o método de marcação pela lacto-peroxidase (Hogg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 71 (1974) 489-492, ou outros métodos conhecidos na es pecialidade e, determinando os restos de aminoãcidos marcados.

Os péptidos que compreendam os restos de aminoãcidos determina dos deste modo, podem utilizar-se como vacinas, de acordo com o método descrito na patente de invenção europeia Ns 44710.

Pode definir-se a estrutura tridimensional pormenorizada do antígeno 2,13 ou de uma sua sub-sequência formando um il /

determinante da superfície antigénica por análise de Paios X ou RMN assistida por computador.. Com base na informação est-ru tura.1 obtida deste modo, podem conceber-se novos polipéptidos compreendendo uma sub-sequência formando, aproximadamente a mesma estrutura tridimensional e, imitando, deste modo, um determinante antigénico (para uma revisão ver Blundell et al., Nature 326, (1987), 3^+7-352(-. Os novos polipéptidos referidos, podem possuir uma sequência de aminoácidos diferente da sequência de aminoácidos do sntígeno 2,13 ou das suas sub-sequências, formando o determinante antigénico de superfície, anriormente mencionado. Também se podem modificar alguns dos re,s tos de aminoácidos do novo polipéptido referido, no sentido de se estabilizar s configuração tridimensional da sub-sequência que forma o determinante antigénico. Uma vez que a referida sub -sequência no novo polipéptido tem, aproximadamente, a mesma estrutura tridimensional que o determinante antigénico no antígeno 2,13, o novo polipéptido reage imunologicamente de modo reti. cular (cross reacts) com o determinante presente no antigeno 2,13Deste modo, a presente invenção refere-se a polipéptidos antigénicos que possuem um determinante ou determinantes que reagem imunologicamente de modo reticular com determinantes nos polipéptidos do P. faic iparum associados aos organelos rhoptry da forma merozoitica do parasita da malária, tendo o polipétido de Plasmodium falciparum a sequência dos aminoácidos (II). No sentido de se tornarem utilizáveis como vacinas contra a malária, os determinantes no polipéptido do Plasmodium falciparum associados com os organelos rhoptry dos merozéitçs têm

BAD ORIGINAL

de ser acessíveis para uma reacção imunológica nos mamíferos contra o parasita da mala'ria. A presente invenção refere-se, ainda, a um polipeptido que compreenda a sequência de sminoáci· dos (II) ou uma sequência parcial da mesma tal como a sequência de aminoãcidos (I), cujo polipeptido reage imunologicamente de modo reticular com determinantes no polipéptido do Plasmo d i um falciparum, anteriormente definido. Um exemplo de um polipéptido da presente invenção é o antígeno de merozoito do Plasmodium associado aos organelos rhoptry dos merozoitos do Plasmodium e que têm ums massa molecular relativa de, aproxima, damente, 80 KD, cujo antígeno é reconhecido pelos y.AEs 2,13 θ 7,12. Os polipéptidos preferidos são capazes de induzir anticorpos num mamífero hospedeiro, sendo estes anticorpos capazes de inibir a invasão dos eritrócitos pela forma merozéitica do parasita da malária, in vive. Os polipéptidos podem encontrar-se sob a forma não glicosilada ou sob a forma glicosilada.

São possíveis outras modificações pós-tradução, tais como liga ção covalente a um radical glicosii-fosfatidil-inositol. 0 polipéptido pode ser, também um anticorpo anti-idiotípico ou um seu fragmento possuindo um determinante antigénico que reage imunologicamente de modo reticular com os determinantes de superfície anteriormente mencionados. Um anticorpo anti-idiotípico é um anticorpo dirigido contra o sítio de ligação de um an ticorpo dirigido contra um dado determinante antigénico e, deste modo, o sítio antigénico do referido anticorpo anti-idiotípi co possui uma configuração molecular semelhante à do determinan te antigénico (Linthicum et al., BioSssays J, (1985) 213-217).

Ce um modo preferencial os polipéptidos da presente invenção encontram-se sob uma forma substancialmente pura.

A presente invenção refere-se, também, a polipéptidos que possuem uma sequência de aminoácidos derivada das sequências de aminoácidos anteriormente indicadas por adições, eliminações, inserções ou substituições de aminoácidos, desde que estes polipéptidos reajam, ainda, imunologicamente de modo reticular com determinantes do polipéptido associados aos organelos rhoptry dos merozóitos do Plasmodium compreendendo a sequência de aminoácidos (I). A presente invenção refere-se, ainda, ao ADNs que codificam para um polipéptido, de acordo com a presente invenção e aos vectores recombinantes que contêm esse ADN, especialmente vectores de expressão, isto é, vectores recombinantes, nos quais o ADN que codifica um polipéptido, de acordo com a pre sente invenção, se liga a uma sequência de controlo de espressão de tal modo que o polipéptido que é codificado pelo ADN possa ex pressar-se. 0 ADN preferido compreende a sequência nucleotídica (2) ou uma sequência parcial desta, tal como a sequência nucleotídica (1). Para além disso, a presente invenção diz respeito a organismos hospedeiros unicelulares que contêmum tal vactor recombinante ou um tal vector de expressão e a um processo para a produção desses organismos. Para além disso, a presente invenção refere-se a um processo para a produção dos polipéptidos e à uti lização destes polipéptidos na imunização de mamíferos contra a malária.

Dado que determinadas substituições na sequência de aminoácidos de um polipéptido têm pouca ou nenhuma influência na influência na estrutura terciária ou na actividade biológica do polipéptido, a sequência de aminoácidos dos polipéptidos de acordo com a presente invenção pode diferir das sequências de aminoácidos anteriormente indicadas. Constituem exemplos de tais substituições de aminoácidos Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e vice-ver sa (ver Doolittle, in The Proteins, Eds. Neurath, H. e Hill,

B. L. New York, Acaóemic Press. 1979).

Os polipéptidos, de acordo com a presente invenção, podem ligar-se de modo covalente a um material veicular ou podem ser adsorvidos por este mesmo material. Materiais veiculares adequados são os compostos poliméricos, naturais ou sintéticos, tais como, por exemplo,, copolímeros de um ou mais aminoácidos (por exemplo polilisina) ou açúcares (por exemplo, polissacári dos). Outros materiais veiculares adequados são os polipéptidos naturais tais como as hemocianinas (por exemplo, KLH= hemo cianina de molusco (Keyhole limpet)), proteínas séricas (por exemplo, gamaglobulina, sero-albumina) e toxóides (por exemplo, os toxóides diftérico ou tetânico). 0 especialista conhecerá outros materiais veiculares adequados.

A ligação covalente dos polipéptidos, de acordo com a presente invenção, aos materiêis.veiculares, podem ser efectua das de um modo conhecido, por exemplo, directamente pela forma ção de uma ponte peptídica ou éster entre os grupos carboxilo,ami no ou hidroxilo livres do polipéptido e os grupos correspondentes no material veicular ou, indirectamente, utilizando reagentes bifuncionais, convencionais, tais como, por exemplo, o éster de m-maleimido-benzoíl-N-hidroxi-succinimida (MBS) ou o 4-(p-ma^leiffiido-fenilo-óutirato de succinimidilo (SMPB). Estes e outros tf reagentes bifuncionais são comercialmente adquiríveis, por exemplo na Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, U.S.A. para além disso, podem utilizar-se (C₂-C?)-dialcanais,tal como, por exemplo, gluteraldeído (Avrameas, Immunochem. 6 (1969),

43-52. 0 material veicular ligado aos polipéptidos pode ser separado dos polipéptidos não ligados se, se desejar, a partir de reagentes em excesso, de acordo com métodos conhecidos ( por exemplo diálise ou cromatografia em coluna).

Podem produzir-se os péptidos da presente invenção de acordo com métodos convencionais de síntese de péptidos em fase líquida ou, de preferência, em fase sólida, tal como de acordo com os métodos de Merrifield J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154, ou por outros métodos equivalentes utilizados na especialidade .

A síntese em fase sólida tem inicio com o aminoácido da extremidade C do péptido a ser sintetizado que é acoplado sob uma forma protegida a uma resina adequada. Pode produzir-se o material de partida mediante acoplamento de um aminiácido, que se encontra protegido no grupo amino, a uma resina clorometilada ou hidroximetilada através de uma ponte de éster benzílico ou através de uma ponte amida a uma resina de benzidrilamina (BHA), a uma resina de metilbenzidrilamina (MBHA) ou uma resina de álcool benziloxibenzílico. Estas resinas são comercialmente adquiríveis e a sua produção e utilização são bem conhecidas

Os métodos gerais para a protecção e remoção dos grupos protectores dos aminoácidos, que se podem utilizar na presente invenção, encontram-se descritos em The Peptides , editado por E. Gross e J. Meienhofer, New York, Academic Press,

Vol. 2 (1979), 1-284. Os grupos protectores incluem, por exemplo, os grupos, 9-fluorenilrcetoxicarbonilo (Fmoc), t-butiloxicarbonilo (Boc), benzilo (Bzl), t-butilo (But), 2-clorobenziloxicarbonilo (2C1-Z), diclorobenzilo (Dcb) e 3,4-dimetilbenzilo (Dmb).

Após remoção do grupo protector do radical ^-amino, ligam-se, passo a passo, os aminoácidos protegidos na sequência desejada ao aminoácido C-terminal ligado à resina. Pode assim, sintetizar-se o péptido completo. Como uma alternativa a este procedimento, podem sintetizar-se pequenos péptidos e podem ligar-se uns aos outros para se obter o péptido desejado. Os reagentes de acoplamento adequados são do conhecimento do especialista, dando-se especial preferência à diciclohexilcarbo diimida (DCC).

Adiciona-se cada um dos aminoácidos protegidos ou pé£ tidos em excesso, ao recipiente da reacção de síntese em fase sólida e, pode efectuar-se a reacção de acoplamento no seio de dimetilformamida (DFF) ou de cloreto de metileno (CH^Cl,) ou de 2 z uma mistura dos dois. Nos casos de acoplamento incompleto, repete-se a reacção de acoplamento antes de se removerem os grupos protectores do radical ^4,-amino N-terrcinsl, para se acoplar o aminoácido seguinte. Fode seguir-se cada um’, dos passos de acoplamento, de preferência de acordo cos. o método da, ninid rir.a . As reacções de acoplamento e os passos de lavagem podem efectuar-se automaticamente.

Pode efectuar-se a clivagem do péptido do material veicular, de acordo com métodos bem conhecidos na química dos péptidos, por exemplo per reacção com fluoreto de hidrogénio .(HF) , na presença de £-cresol e de sulfureto de dimetilo, durante 1 hora a temperatura de 0°C, seguido possivelmente, de uma segunda reacção com HF na presença de o-cresol, durante duas horas a 0°C . A clivagem dos péptidos cos materiais veiculares ciorometilados ou hicroximetilados proporciona péptidos que possuem uma extremidade C livre; a clivagem de péptidos de veículos de benzilidrilamina ou de met ilbenzid rilamir.a proporciona péptidos que possuem uma extremidade C amidada.

De um modo alternativo, podem, também, produzir-se os polipéptios da presente invenção, utilizando métodos bem conhe eidos na tecnologia do ADN recombinante (Maniatis et al., Molecular Cloning - Ά Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Por isso, um ADN que codifica um tal polipéptido pode sintetizar-se de acordo com métodos químicos convencionais, por exemplo, pelo método do fosfotriéster que foi descrito por Narar.g et al. , Ne th. Enyzmol. 68, (1979)

90-103, ou pelo método do fosfodiéster (Erown et al., Meth. Enzymol, 68 (1979)? 1Ο9-15Ό. 3m ambos os métodos sintetizam-se, em primeiro lugar, longos oligonucletítidos e, depois ligam-se uns aos outros de um modo previamente determinado. A sequência nucleótídica do ADN pode ser parcialmente ou totalmente idêntica á sequência nucleótídica que codifica para o po lipéptido natural nos organelos rhoptry dos merozóitos do plasn.od ium. Dado que o co'digo genético é degenerado, existe, por outro lado, a possibilidade de que uma sequência nucleotí. dica parcial ou completamente diferente codifique para o mesmo polipéptido. Os codões seleccionados podem ser adaptados aos codões de utilização preferidos do hospedeiro utilizado para expressar o polipéptido recombinsnte (Grosiean et al.,

Gene 18 (1982), 199-209· Devem tomar-se precauções para que o ADN obtido ceste modo não contenha sequências parciais que tornem difícil a cnnstrução do vector de expressão, por exemplo, por introdução de um sítio de clivagem indesejável do enzima de restrição, ou que evite a expressão do polipéptido .

Pode, também, obter-se um ADN que codifique um poli péptido da presente invenção por clonagem do ADN do parasita num vector de expressão de bacteriõfago, por edemplo, no vector gtlL do bacteriéfago X que se pode obter na American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Karyland, USA. Transferem-se estes vectores de bacteriófagos para células hospedeiras adequadas, por exemplo, para a ce lula E coli Y1O38, contendo o plasmido pMC9 (disponível, por exemplo na ATCC). Efectua-se, então o rastreio da biblio teca de expressão do gene obtida deste modo, utilizando anticorpos policlonais ou monoclonais, de acordo com o descrito por Young et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (I983), 1194-1198.

ADN obtém-se, preferencialmente por clivagem do ADN de ume estirpe parasita do Plasmodium com um ou mais endonucleases de restrição e elenando os fragmentos num vector adequado de acordo com procedimentos bem conhecidos na especia lidade (Maniatis e outros, supra). Efectua-se então o rastreio da biblioteca de ADN do parasita com uma sonda adequada. As sondas adequadas consistem em oligonucleotidos que correspondem a uma sequência parcial do ADN que codifica o antigeno

2,13 °u do ADN que possui s sequência ncleotídica (1). 0 mo do segundo o qual se seleccionam e utilizam estas sondas é do conhecimento do especialista nesta matéria. Constituem exemplos de tais sondas os oligonucleótidos que possuem a sequência TTGGTGCAGGAGGTGCT ou AAGCTACCTATACATGT. Desenvolvem-se e isolam-se os clones que contêm uma inserção de ADN que se hibridíza com a sonda. A seguir, pode-se inserir o fragmento de ADN num vector adequado, de preferência num vector que proporciona os sinais de expressão necessários. Encontram-se descritos no pedido de patente de invenção europeia N² 16Ó.OÓ9, que foi publicado a 2 de Julho de 1986, exemplos destes vectores de expressão. Podem também, produzir-se os polipéptidos da presente invenção, após a correspondente adaptação da sequência nucleotídica utilizando outros vectores de expressão adequados, conhecidos pelo especialista na matéria.

Introduz-se, depois, o vector recombinante que coném um ADN que codifica para um polipéptido, de acordo com a presente invenção, num organismo hospedeiro unicelular adequado. Os organismos hospedeiros unicelulares adequados são as células eucariotas ou procariotas. Constituem exemplos de células procariotas , os microgarnismos, por exemplo, células bacterianas, tais como as células de Ξ. coli ou células de B. subtilis, que são capazes de exprimir os polipéptidos codificados pelos, vectores de expressão recombinantes. 0 especialista, tem conhecimento de um grande número de células eucarióticas adequadas como organis mos hospedeiros unicelulares, para os vectores recombinantes. Constituem exemplos de tais células eucarióticas são as células de levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisae) e célules

cultivadas de eucariotas superiores, tais como células de insectos (por exemplo utilizando o sistema vector do baculovirus; para ume revisão ver Doerfler, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 131 (1986), 51-68 ou Young Kang, Adv. in Virus Research 35 (1588), 177-192 e células de vertebrados (para uma revisão ver Rigby, Genetic Sngineering, Vol. 3, R. Williamson, ed. , New York, Academic Press, 1982, pp. 83-14-1). Outros orgaa nismos hospedeiros adequados são a E. coli 294·., a Ξ, coli RRI e a Ξ. coli W3110 (que se encontram todos disponíveis na ATCC e em outras origens). Dependendo do organismo hospedeiro utilizado, o polipéptido pode estar na forma glicosilada.

modo segundo o qual se efectua a expressão dos polipéptidos , de acordo com a presente invenção, depende do vector de expressão recombinantes e do organismo hospedeiro utilizado. No caso das bactérias e leveduras, desenvolvem-se os organismos hospedeiros que contêm o vector de expressão recombinante, sob condições óptimas para o crescimento do organismo hospedeiro. Proximo do final da fase de crescimento exponencial, quando diminui o aumento do número de células por unidade de tempo, induz-se a expressão do polipéptido da presente invenção, isto é, o ADN que codifica para o polipéptido é transcrito e o mARN de transcrição é transferido. Pode efectuar-se a indução adicionando um indutor ou um desrepressor ao meio de cre-scimento ou alterando um parâmetro físico, por exemplo através de uma al teração de temperatura. No vector de expressão recombinante utilizado na presente invenção a expressão é controlada pelo repressor lac. Mediante a adição de isopropil--D-tiogalacto-piranosido (IPTG), desreprime-se a sequência de controlo de

expressão e, desse modo, induz-se a síntese do polipéptido.

polipéptido produzido nos organismos unicelulares po dem ser segregados por mecanismos especiais de transporte ou podem ser isolados por ruptura do organismo unicelular. Pode provocar-se a ruptura do organismo hospedeiro por meios mecâni cos (Charm et al ., Meth. Snzymol, 22 (1971), ^76-556), enzimáticos (tratamento por lisozima) ou químicos (por exemplo tra tamento com detergentes, tratamentos com ureia ou cloridrato de guanidina) ou por uma combinação dos referidos meios.

Nos eucariotas, os polipéptidos segregados pelas célu las, sintetizam-se sob a forma de uma molécula precursora.

polipéptido maduro resulta da clivagem do chamado péptido de sinal. Como os organismos hospedeiros procariotas não são capazes de clivar os péptidos de sinal eucariotas a partir de moléculas precursoras, os polipéptidos eucarioticos têm de ser expressos directamente na sua forma madura nos organismos hospedeiros procariotas. 0 sinal de início de transferência AUG , que corresponde ao codão ATG ao nível do ADN , faz com que todos os polipéptidos sintetizados num organismo hospedeiro pro cariota possuam um resto de metionina na extremidade N . Em de terminados sistemas de expressão este resto de metionina na extremidade N é clivado. Descobriu-se, no entanto, que a presença, ou ausência de metionina na extremidade N não tem. mui. tas vezes, influência na actividade biologica de um polipéptido (ver Winnacker, Gene und Klone, Weinhein, R.F.A. Verlag Chemie, 19Õ5,p.255)· Nos casos em que a metionina da extremidade N se torna indesejável, é também possível clivá-la mediante peptidases específicas da metionina da extremidade N . Miller etal., ,:2. ' ?roc. Natl, Acad. Sei. U.S.A. 84 (198 7), 2718-2722, descreve ram o isolamento de uma tal peptidase a partir da Salaiortella typhifflurium. A presente invenção refere-se, de acordo com o anteriormente exposto, aos polipéptidos com ou sem um resto de metionina na extremidade N .

Podem purificar-se os polipéptidos, de acordo com a presente invenção, por métodos bem conhecidos na especialidade, tais como, por exemplo, centrifugação a velocidades diferentes, precipitação com sulfato de amonio, dialise (à pressão norsal ou a pressão reduzida), focalização isoeléctrica preparativa, electroforese preparativa sobre gel ou por'diversos métodos cro matograficos, tais como a filtração por gel, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia de permuta iénica, cromatografia de fase inversa e cromatografia de afinidadade (por exemplo, sobre cepharose Blue CL-6B, em fosfocelulose, em anticorpos monoclonais ligados a um veículo, dirigidos contra o polipéptioo ou em resinas de quelatos de metais tais como as descritas no pedido de patente de invenção europeia N² 253.303 método de purificação preferido, na presente invenção consiste na purificação por cromatografia de afinidade. La-se especial preferência à purificação dos polipéptidos, de acordo com a presente invenção, nos anticorpos monoclonais 2,13 θ 7,1? ligados a un·. veículo.

Os polipéptidos da presente invenção podem encontrar-se presentes sob a forma de multímeros, por exemplo, sob a forma de dímeros, trímeros ou tetrâmeros. Podem ligar-se umas às outras subunidades destes multímeros, por ligações covalentes ou nao covalentes. Os multímeros resultam muitas vezes acuando da

BAD ORIGINAL

* produção dos polipéptidos nos organismos hospedeiros procariotas, por exemplo pela formação de pontes dissulfureto entre restos de cisteína. Também se podem preparar os polipéptidos da presente invenção sob a forma de polipéptidos de fusão. Nestes polipéptidos de fusão, liga-se de modo covalente, um polipétido da presente invenção, através de uma ponte peptídica, a um ou mais associados (partners) de fusão. Tais associados de fusão são péptidos ou polipéptidos, de preferência, péptidos ou polipéptidos que contribuem para melhorar as propriedades do polipéptido de fusão relativamente às dos polipéptidos sem o associado de fusão. Os associados de fusão adequados são os polipéptidos que possuem determinantes antigénicos ou determinantes imunológicos que reagem de modo reticular com outros antígenos do parasita da malária, de preferência antígenos de outro estádio do parasita da malária, melhorando, deste modo, a eficácia das vacinas que contêm este polipéptido de fusão. Conhecem-se diversos destes antígenos (ver a revisão de Scaífe, supra). Dá-se preferência aos antígenos da fase esporozóito tais como a proteína circunsporozóitica (CS) ou outros polipéptidos que compreendam sequências repetidas tais como a repetição tetrapeptídica Asn-Ala-Asn-Pro, presente na proteína CS do P. falciparum.

associado de fusão pode ser, também, um epítope de célula T tal como os descritos por Good et al., Sciense 235, (1987), 1059-1062. De um modo alternativo, o associado de fusão pode também ser, um péptido de afinidade e contribuir, deste modo, para facilitar a recuperação do polipéptido de fusão. Um exemplo de um tal associado de fusão é um péptido de afinidade que se liga, de modo preferencial, a um material veicular por croι rr.atogrsfia de afinidade. Constituem exemplos destes péptidos de afinidade os péptidos que contêm, pelo mecos, dois restos» de histidina. Estes péptidos de afinidade ligam-se selectivamente a resinas ce queleto de níquel de ácido nítrilotriacético, (ver por exemplo, a publicação do pedido de patente de invenção europeia NS 253·3θ3· Os polipéptidos de fusão que contêm um destes péptidos de afinidade podem, por isso, separar-se selectivamente dos outros polipéptidos por meio de tais resinas. Podem produzir-se proteínas de fusão segundo os métodos convencionais de síntese de péptidos ou por engenharia genética , em que fragmentos de ADN que codificam para um polipépti do da presente invenção se ligam com um ou mais fragmentos de ΑΓΝ que codificam para o referido associado de fusão.

De um modo preferencial, preparam-se os polipéptidos de fusão de acordo com a engenharia genética, introduzindo, per exemplo um ALN que codifique um polipéptido de acordo com a presente invenção num vector de expressão que compreenda as sequências de controlo de expressão necessárias e um ΑΓΝ que codifique pa^e o referido associado ce fusão.

Podem, também utilizar-se os polipéptidos da presente invenção pa^g detectar, para efeitos de diagnostico, anticorpos dirigidos contra o determinante do polipétido associado aos organelos rhoptry dos merozóitos do ?1 asn.odium que têm a sequência de aminoácidos (I), de acordo com métodos bem conhecidos ns especialidade.

A presente invenção, refere-se, ainda, a composições imunogénicas que contêm um polipéptido, de acordo com a presente invenção, assim como um adjuvante adequado. *

BAD ORIGINAL ’>5

2/ vante in io.

s de vírus exemolos ce ad/u alumínio e o fosfato ds alum outros adjuvantes ou sistema pio Salmolla t^phlmurium ou s adequados o hidróxido de especialista conhecerá produção adequados (por exem Vaccinia) para utilização nos seres humanos e animais (WHO Tecnn. hep_. .Series 595 (195?), 1-4-0; Warren et al,, Ann, Rev. Im.m.unol. 8, (1986), 369-388 ; Norein, Nature 332, (1983), 237-285; Klausner, BIO/TSCHNQLOGY,

6, (1938), 773-777 e Eromford, Parasitology Today (1989),

81-46.

Os polipéptidos ou composições imunogénicas, de acordo com a presente invenção, podem apresentar-se liofilizados para reconstituição com água esterilizada ou com uma solução salina, de preferencia solução salina de tampão fosfato. Introduzindo os polipéptidos e composições imunogénicas, de acordo com a pre sente invenção em mamíferos, activa-se o seu sistema imunológico, isto é, induz-se a produção de anticorpos contra o oolipéptido. A presente invenção refere-se, ainda a estes anticorpos. Os anticorpos, de acordo com a presente invenção reconhecem: o equivalente natural do polipéptico no parasita da malária e, po dem, por isso, ser utilizados terapeuticamente para bloquear a invasão dos glóbulos vermelhos do sangue pelos merozóitos, para imunização passiva ou para fins de diagnóstico.

Podem produzir-se os polipéptidos de acordo com a presente invenção, em macacos, coelhos, cavalos, cabras, porcos da índia, ratazanas, ratos, vacas, carneiros, etc, e, também, nos seres vivos. Pode utilizar-se, conforme requerido, 0 anti-soro ou o anticorpo purificado. Podem purificar-se os anticorpos, segundo um procedimento conhecido, por exemplo, por precipitaBAD ORIGINAL

çao com sulfato de amonio. 2 também possível, produzir anticorpos monoclonais dirigidos contra o polipéptido da presente invenção, de acordo com o método desenvolvido oor ífóhler et

os anticorpos policlonais ou monoclonais para purificação por cromatografia de afinidade dos péptidos da presente invenção ou do seu equivalente natural, o antigeno 2,13.

Podem utilizar-se os polipéptidos e as composições imunogénicss. De acordo com a presente invenção, como vacinas para imunização de mamíferos contra a mala'ria. Desse modo, o sistema imunoldgico de um mamífero, de preferência um ser huma no é estimulado com uma quantidade imunizante do referido polipéptido ou composição imunogénica. 0 modo de administração, a dose, bem como o número de injecções podem ser optimizados de acordo com um método conhecido do especialista na matéria. Tipicamente administram-se va'rias injecções durante um longo período para se obter um elevado título de anticorpos contra o antigeno da malária, isto é, contra o polipéptido da presente invenção.

Apds ter-se descrito, na generalidade, a presente inven çao, poderá a mesma ser mais facilmente entendida por referência ao exemplo que se apresenta, a seguir, juntamente com os desenhos, em que:

A fig. 1, apresenta codifica o antigeno 2,13 e as clonados do referido gene num apresenta um mapa de restrição do gene que 2,13 e as posições relativas dos fragmentos

A fig. 2A,E apresenta gene que codifica para o num Λ rap-1.1, % rap-1.2 e rap-1.3 enta s sequência nucleotídica (2) do antigeno 2,13 s a sequência de aminoBAD ORIGINAL θ’ ζ

ί “7Α ácidos (II) derivsdã da região de codigo.

Ceve entender-se que o exemplo tem apenas fins ilustra tivos e não devera* ser considerado como limitativo da presente invenção. Para perfeito entendimento, o exemplo e precedido de uma lista de abreviaturas, de uma lista de tampões e de meios, e de um conjunto de métodos gerais utilizados no exemplo.

Abreviaturas:

ATP	trifosfato de adenosina
bp	par de bases
BC IP	fosfato de 5-bromo-^Lr-cloro-3-indolilo
BSA	albumina de soro de bovino
cpm	impulsos por minuto
dATP	trifosfato de desoxiadenosina
dCTP	trifosfato de desoxicitidina
dGTP	trifosfato de desoxiguanosina
dTTP	trifosfato de desoxitimidina
CTT	ditiotreitol
SDTA	ácico etilenodiaminotetracetico
SGTA	ácido etilenoglicol-bis(eter-2-aminoetílico) ' -tetracetico
“SPSS	ácido /”4-(2-hidroxietil)-1-pipera?inoetano-sulfo- nico_7
IPTG	isopropil- -C-tiogalactopiranosido
kb	1000 pares de bases
ED	kilodalton (= 1000 Dalton)
m.M	molar milimolar

Ii z

ml	mililitro
nm	nanometro
νβτ	nitro-azul de tetrazólio
PFU	unidades que formam placas
PMSF	fluoreto de fenilmetil-sulfonilo
BPX	rotações por minuto
SDS	dodecilsulfato de sódio
TEXED	M ,N,N^{* 1},N¹-tetrametiletilenodiamina
Tris	tris(hid rodmetil)-aminorcetano
Xu s 1	5-bromo-ⁱ+-cloro-3-indolil- -D-galactosido
Tampões	e meios.

100 X Denhsrdt (100 ml);

g polivinilpirrolidona 2 g Ficoll (Pharmacia, (Jppssla, Sweden) 2 g BSA

100 mg a rida de sódio

Tampão de carga do gel de AEN x TBB (ver a composição adiante) ;ã glicerol

0,1 azul de bromo fenol 0,1 í xilenocianol

Xistura de Formamida :

X (W/V) formamida mX Tris/a'cido bórico ZpK ô,3_7 mK tEDIA

0,1 J xllenocignol

0,1 $ azul de bromofenol

Tampao HIN:

mM Tris/HCl ZTpK 7,4 J 10 rr.X cloreto de magnésio 50 mh cloreto de sódio

Tampão llgase:

mM Tris/HCl Z pH 7,5 J 10 mM cloreto de magnésio mM DTT rnM dAT?

Tampão LS :

440 mH HEPES ZTpH 6,cJ 110 mH Tris/HCl ZT?H S ,0 J mM cloreto de magnésio n:t - p-mercaptoetanol 44 SATP dTTP ya.y dGTP θ·4*26θ ^unidades de hexanucleótidos aleatórios (Pharmacia)

Meio LB : por litro:

g Bsctotriptona g extracto de levedura 10 g cloreto de sódio i3x

Tampão de	carga de gel de SES:
5 /	ς ro
5 mM	Tris/HCl Zpn 6,8 _7
200 mM	ETT
20 X	glicerol
0,1/	azul de bromofenol
20 x SSC:	por litro :
175,3	g cloreto de sódio
82 ,2	g citrato de sódio Z pH
Tampão SM:
10 mK	cloreto de sódio
10 mM	cloreto de magnésio
10 mM	Tris/KOI ΖΓρΗ 7Λ_7
10 x Tampão T4 polimerase:
0,33	y Tris/acetato Z7pH 7,'
0 ,66	M acetato de potássio
0,10	X acetato de magnésio
5 my ETT
1 r	nafalBSA
10 x TBS:

0,89 y Tris/ácido bórico Ζ pH 8,0 J

0,89 ácido bórico mM SETA

ζ .¾

X TEA:

Tris/HCl ZToH 7,4 7 cloreto ds sódio

Tris ZriCl ZpH 8,07 2DTA po r 1 it ro :

0,5 Μ

1,5 ·'·

100 χ Τ5;

V .l_ li

100 mM

Meio EEL:

g tripticsse (EEL , Eivision of Eecton Dickinson and Co. , Cockeysvii?-c, Mariland. OOP;

g cloreto de sódio

Tampão de kosf^tase alcalina:

100	mM Tris/HCl	7ph /,5 7
100 m	’·' cio re to	de sódio
5 n:	M cloreto	de magnésio
Tampão de sal superior:

50	H' t». L .	T ris/HC	! / r.^TJ 7 c /
10		cloreto	de magnésio
100	m.M	cloreto	de sódio

Tampão sal, ino médio :

mM Tris/HCi Z“?H 7,5y 10 mM cloreto de magnésio mM cloreto de sódio

Tampão Core:

50	:r.M	Tris/HCl θ,θJ
10	mM	cloreto de magnésio
50	ml··:	cloreto de sédio
Tampão T.	SS :
20	mM	Tris/HCl /7 pH 7,5.7
10	mM	cloreto de sodio
0	,1 mN	; EDT
Tampão T!	1 f ,
4o	mM	Tris/HCl /7pH, 7,5 J
10	mM	cloreto de magnésio
50	mM	cloreto de sédio
Tampão E	acteriofago: por litro
3	Ó	dihidrogenofosfato de
7	s	hidrogenofosfato d.e d
c	Ô	cloreto de sodio
rs u	,095	g sulfato de magnésio
0	,011	g sulfato de cálcio
'Λ	/01	g gelatina

Métodos Gerais:

Método 1: Precipitação de ADN com acetato de lítio

Trata-se a solução de ADN com nm décimo do volume de acetato de lítio 5 M e dois volumes de.isopropanol, mistu-se bem e coloca-se em neve carbónica, durante 10 minutos.

BAD ORIGINAL

Centrifuga-se ο AEN precipitado durante 10 minutos a 12300 rpm (20^vC) numa centrifugadora de contínua Eppendorf e remove-se cuidadosamente o sobrenadante. Lava-se uma vez o sedimento com etanol a CO (v/v) e seca-se, a seguir, durante 5 minu tos numa centrífuga de vacuo. 0 AEN dissolve-se na agua e processa-se de novo.

Método 2 : Electroforese de ADN em gel de agarose

Dissolve-se o AEN seco 1 x em tampão de carga de gel

d e	AEN	e aquece-se a Ó5°C, durante >	minutos.	Misturam-se
100	ml d	e 1 x tampão TBE com agarose	(800 mg p?	ira um gel a
0 ,8	,/ ou	1,2 g para um gel a 1,2 g) e d	eixa-se em	ebulição até

a agarose se dissolver completamente. Depois de arrefecer, adiciona-se 2 ^ul de solução de brometo de etídio (mO mg/ml) e verte-se a solução do gel num aparelho de electroforese horizontal em gel. Após solidificaçao do gel, aplicam-se as amostras so gel e separs-se o ADN durante 2 horas sob uma diferença de potencial constante de 150 volts. Utilizam-se como marcadores de comprimento misturas comerciais normalizadas de fragmentos de ADN de comprimento definido. Visualizam-se as faixas de ADN sob UV de 300 nm.

Método 3: Isolamento de ADN de um gel de agarose

Separa-se o num gel de agarose (Método 2). Abre-se um orifício na parte da frente da faixa a ser purificada e insere-se unia porção de um tubo de diálise na extremidade do orifício. Preenche-se o orifício com 1 x tampão TBE e o ADN é electro-eluído no tubo de diálise a 200 V, durante 10 a 15 mi

BAD OHlGlNAL

nutos. Depois, é eluído no sentido inverso para dentro do * orifício durante 45 segundos. Extrai-se a solução de ADN duas vezes no orifício com isobutanol-saturado de água, duas vezes com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25 : 24 : 1) e é, então, precipitado pela adição de 1/10 de volume de acetato de sódio 3M, a pH 5,2, e 2 volumes de etanol. Após permanecer em repouso a -70°C, durante 15 minutos, aglomera-se o precipitado a 12.000 g durante 10 minutos, seca-se e efectua-se nova suspensão em 1 X tampão TE.

Método 4: Purificação em placa dos bacteriófagos lambda.

Procede-se à infecção de uma cultura bacteriana (por exemplo, E. coli Y1088, que se encontra disponível, por exemplo, na ATCC) numa placa de agar (Maniatis et al., supra, pp. 70-71), com bacteriófagos lambda. Deste modo, formam-se placas líticas no tecido de bactérias. Corta-se, a partir do agar, um cilindro de agr (5 mm de diâmetro) contendo uma placa, com uma pipeta de Pasteur invertida. Transfere-se a cilindro de agar para um tubo de ensaio Eppendorf contendo 500 yll de tampão SM e agita-se o tubo de ensaio, durante 5 minutos. Centrifuga-se a suspensão de bacteriófago (5 minutos a 12.000 RPM, 20° C ) e transfere-se o sobrenadante para um tubo de ensaio. Dilui-se 1 ^cl da suspensão do bacteriófago em 1 ml de tampão SM. Adicionam-se 1, e 100 yUl desta solução a 50 ^££1 de uma suspensão celular de células de E. coli Y1090 contendo o plasmídeo pMC9 ( que se encontra disponível, por exemplo, na ATCC ) que foi tratada com Mg⁺⁺, de acordo com Morrison, Méthods Enzymol. 68 (1979),

326-331· Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, adiciona-se a solução a 3 ml de agar a 0,8% (p/v) em meio LB

κ

s.

e coloca-se a mistura sm olacas de agar com LB —ampicilina (meio LB, 40ytuL/ml de ampicilina) . Lecencenco da titulação, algumas laminas (por exemplo as com ?= diluições de 1:1 000) tinham placas individuais que, se podiam isolar quando positivas na reacção com o anticorpo ou na hibridização com o ACM. Podem desenvolver-se os. bacteriófagos das placas e, serem uti lizados, por exemplo no isolamento co ADN do bacteriófago.

Método 5: Preparação de uma reserva de lisados de bacteriófa. gos em placa..

um número adequado de unidades que formam 10.000), para se infectar 100^.1 de células e colocam-se estas numa placa de BBL recen deixa-se desenvolver a 37°C durante a noite porção superior de agar, que devera apresen, prra o interior de 5 ml de tampão de bacte

Utiliza-se placas (por exemplo em placa (Método 5) temente preparada e Raspa-se, então, a tar lise confluente riófagos, deixa-se em pouso durante 2 horas à temperatura ambiente. Pinalmente, aglo.mera-se a porção 4.00'3x g, durante 10 minutos e retém-se o superior do agar a sobrenadante como reserva de bacteriófagos.

Método 6: Preparação de células em placa p^ra infecção pelo bacteriófago lambda.

Inocula-se uma colónia individual da estirpe de S.coli que se vai utilizar (por exemplo Ϊ1090, que se encontra disponível na ATCC), em 5 m.l de meio LB e deixa-se desenvolver, durante a noite a 37°C. Depois, dilui-se a suspensão $0 vezes e deixa-se desenvolver, a 37°C, durante mais 2 horas antes de

BAD ORIGINAL &

se aglomerar as células a 4.000 ;· g, durante 10 linutos a 4°C e volta-se a efectuar nova suspensão cas células em 1/10 do volume de sulfato de magnésio 10 ml·, arrefecido em gelo. Podem armazenar-se as células a 4°C durante até 2 semanas. Utilizam -se as células para gerar placas de bacteriõfagos lambda, conforme se segue. Adiciona-se a 100Jil de células em placa um número adequado de unidades de ba cteriof a gos formando placa. Deixa-se a suspensão à temperatura ambiente durante 20 minutos, depois adiciona-se 3 ®1 de agar da porção superior em BBL lí quido (a 45°C e verte-se a mistura sobre uma placa de agar de 00 mm de fundo.

Método 7: Transformação da B. coli

Inocula-se 3 ^1 de meio LB com células de Ξ. coli e agita-se a 37°Uj durante uma noite. Utiliza-se 1 ml desta cul tura saturada para inoculação em ml de meio LB . Agita-se s cultura até a densidade óptica a ÓOO nm; (E0 Ó00) atingir o valor 0,2. Sedimentam-se as células (5 minutos a 6.000 PPM, a temperatura ambiente) e volta-se a efectuar nova suspensão em 25 ml de cloreto de magnésio arrefecido em gelo. Centrifugam-se as células novamente, (ver acima) e volta a efectu?r-se nova suspensão em > de cloreto de cálcio 100 n.M. Deixam-se as células competentes a 4°C, durante, pelo menos, 3θ·minutos. Para a transformação, adiciona-se 10jul de solução de ADN con tendo 1 a 10 ng de ADN a 100 kl de células competentes e incubam-se , ;rimeiro lugar em gelo durante 20 minutos, depois .0 a 42 C, durante 2 minutos e, finalmente, outra vez em gelo durante 20 minutos.

f

Quando se utilizam vactores do tipo M13 (Yanisch-Perron et al., gene 33, (1985), 103-119), adicionam-se então, 50 ytl de X-Gal a 10 % (p/v) em dimetilformamida, 10 ytl de IPTG 100 mM em água a 50de uma cultura saturada de E. coli TG-1 (a E. coli TG-1 encontra-se disponível na Amersham, Little Chalfont, Inglaterra; como alternativa pode utilizar-se a E. coli JM 101 que se encontra disponível na ATCC ou a E. coli JM 103)· Após misturar bem, adicionam-se 3 ml de agar a 0,8 í (p/v) em meio BBL, coloca-se a mistura numa placa de agar com BB1. Depois, incubam-se as placas de agar a 37°C, durante a noite.

Quando se utiliza o ADN plasmídico, que se pode seleccionar no que se refere à sua resistência aos antibióticos adiciona-se 1 ml de meio LB à mistura de transformação e efectua-se a incubação a 37°C durante uma hora. Centrifugam-se as células durante 3 minutos a 6.000 RPM (à temperatura ambiente e efectua-se nova suspensão das mesmas em 100^4,1 de meio LB. Distribuem-se uniformemente estes 100yxl na placa de agar que contém o antibiótico necessário para a selecção e incuba-se de modo idêntico, a 37°C, durante uma noite.

Método 8: Preparação do ADN para sequenciação

Podem utilizar-se as estirpes TG-1, JM 101 ou JM 103 de E. coli, como hospedeiros para a clonagem de vectores do tipo M13 para sequenciação do ADN de acordo com Messing, Meth.

Enzymol. 101 (1983), 20-78. Quando um vector do tipo M13, que compreende um fragmento do ADN que se pretende sequenciar, é transformado em uma das células hospedeiras mencionadas, então resultam placas brancas. Picam-se essas placas brancas com um palito e efectus-se nova suspensão em 3 ml de meio LB . Adiciona-se, posteriormente 60 jul de cultura de hospedeiros saturada e agita-se a mistura a 37°C, durante 6 horas. Transfere-se 1,5 ml da cultura para um tubo de ensaio de Eppendorf e centrifuga-se (5 minutos a 12.000 RPM, a 20°C). Transfere-se 1,2 ml do sobrenadante para-um novo tubo de ensaio e mistura-se com 300 XlL de polietilenoglicol a 20 (p/v), solução de cloreto de sódio 2,5M e, incuba-se à temperatura ambiente, durante 20 minutos. Armazena-se a parte restante da. cultura a 4°C ou utiliza-se para a preparação de ADN minilisado de ADN (Método 10). Efectua-se a precipitação dos bacteriófagos por centrifugação (10 minutos a 12.000 RPM, 20°C). Dissolve-se o sedimento em 100 JX de 1 x tampão TES e extrai-se com 100yxl de fenol saturado. Separam-se as fases por centrifugação (5 minutos a 12.000 RPM}. Transfere-se S0 X de fase aquor A⁷ sa para um novo tubo de ensaio com reagente, precipita-se o AD (Método 1) e dissolve-se er 12pX de agua.

Método 9: Sequênciação do ADN

Mistura-se 1 βΧ de ADN preparado de acordo com o Método 0, com ó βΧ de água, 2pX de 1 x tsmpãoTM e Jyul de precursor oligonucleotíd ico e aquece-se a Ó5°C, durante 2 minutos.

Depois, deixa-se arre:

er a solução 1 entemente rté 3 c ry v

Entretanto, preparam-se quatro tubos , o um das soluçoes de paragem de paragem possuem as seguintes composições:

, o aio contendo cada . <.0

As soluçoes ^M cOTP, 100j}X cGT?, bAD ORIGINAL

Ί Ο;Ί i,V Ί-’-Γ’Ο

-L LXi. < χ * ,-.0

125

,.ο

U : 16θ ρ

F dTTP : 250

125 l)M dTTP

Λ > ί ,,ν rifTO 1Í’C ,-ν ρ;·.φυ ddGTP, 125 fl. dCTP, 12,5 f>‘. dGTP, ddTT?, 100 ^iM dCTP, 100 μΜ dGTP ,

JIX dTTP.

?ipeta-se pare o interior dos tubos que contêm ADN

1,5 unidades de colime^ase de Klenow (Pharmacia), 0,5 de Z³⁵S_7-dATP (6.000 Ci/mmole), 0,3fl de LTT 0,1 M. l,6yjl de tampão 1 x TN e 4,3 jul de agua e mistura-se bem. Sm cada caso, misturam-se 4jul desta solução com a solução de paragem e incubs-se a 3θ°4, curante 20 minutos. Acicionam-se 2 jul de dATP 0,25 mM a cada um de quatro tubos de ensaio, mistura-se e efectun-se nova incubação durante 20 minutos. Finalmente, interrompe-se a receção adicionando 2jil de fonn^mids e aquece-> o

-se a bO C, durante 3 minutos. Aplica-se, então, o ADN sobre mm ce um g com a seguml compos içao

H.,,0

d.

ml 10 x tampão -TES

-Q Ό ío.o g ureia

ó j ° a	a c rilamid -
i o -> -	bisa crilsmida
860 ^ul	10 /1 persulfato de sódio
50 fl	TSMSD.
	Separa-se 0 ADN durante 1 a 6	horas, po r
rese a	uma saída constante de 40 watts.	Sepa ram-se

BAD ORIGINAL de vudro e fixa-se o gel durante 5 minutos erc ácido acético a 10 / (v/v) e metanol a 10 / (v/v). Lepois, lava-se duas vezes o gel com metanol a 10 / (v/v) durante 5 minutos, coloca-se num capei Whatman 3? (Wnatmsn Ltd., Maidstone, Lnglanc) e se ca-se num secador de géis. Efectua-se a auto-radiografia do gel seco, durante 20 horas, utilizando uma película de Raios-X (por exemplo, RODAL-XAR, Eastman Kodak Co., Rochester, New York, USA).

Método 10: Isolamento do ADN pequena escala (mini-lisado).

Centrifugou-se durante > minutos a 12.000 RPM (20°C) , cerca de 1 a 2 ml de cultura bacteriana (por exemplo E. coli TG-1 contendo um vector do tico M13; ver Método 8). Sfectua>brenadante. ???-?- s. suspensão das 9 Tris/HCl 50 mM (?H 7,6) , ce lisosims com 5 extremidade ce ums ;e a suspensão, à temperatura amfcien pois, adiciona-se 15jul de uma solução de dodecilsulfato de lítio a 25 / (ρ/ν) e 30 jul de acetato de potássio 5M e mexe-se cuidadosamente s suspensão. Apos incubação, durante 15 minutos, em gelo, centrifugs-se 2 amostra

-se a sucção cuicacosa
células	sedimentadas ea
ιγγ'Φλ r ~u 1 r- > iL	M. Apos a adi:
pequena	espátula, incul
te, dura	nte 5 minutos.

’/

durante 15 minutos	a li.000	D DM (	4°C). Decanta-se 0 sobrena-
d a nte oa^a um novo	t u bo d e	ensaio	9 trata-se com 5Gy>’l de so-
luçao de RNase (10	mg/ml) .	Apos	incubaçao a 37°C, durante 5 xi
nutos, extrai-se a	amost ra	uma ve	z com fenol e ums vez com cio
roformio (os mesmos	volumes	pa ra	cada caso). Drecipita-se 0
ADN na fase aquosa	(Método	1) e,	finalmente, dissolve-se em

BAD ORIGINAL ζ

100 Πΐ le águs.

oligo-m? reação

Diluiu-se o ADN que se pretende marcar (para cima de 100 ng) num. volume ce 7 yaJ- com ãgua, acuece-se a 95°C , durante 2 minutos e arrefece-se rapidamente em gelo. Apos a adição de -/^P _/ dCTP 5 .000 Ci/mmole), 12 ^il de tampão LS e 3 'uni dades de polimerase de nlenow (Maniatis et al., supra , pp 113-114), incuta-se s reacção, durante 9 a lò horas, a tempera, tura ambiente. Pode utilizar-se directamente o ADN marcado para hibridizações. imediatamente antes da sua utilização pa ra hibridizações, o ADN deve ser aquecido a 95°4, durante 10 minutos.

Método 12: hibridização do AD?⁷

Incuba-çe o filtro contendo o ADN, durante 1 hora a ;5 C em tampão de fosfato de sodio 0, f< (PH 7), SDS a 7 u.

Adicionou-se, (Método 11).

,7 roximadamente, 10' cpm de amostra radioactiva

Apés incubação a Ó5°C, durante a noite, lavam-se duas vezes os filtros, durante 3θ minutos em 0,2 x SSC,

-O

0,1 ; a 05 C. Secam-se os filtros e expoem-se, novamente a uma película de Raios-X (por exemplo Kodak XAR).

Método 13: Preparação de um gel de poliacrilamida SDS a 10 de acordo com Laemmli, Nature 227 (1970), 630-c8

Ó0 ml de gel de separação 15 ml 1,5 M Tris/HCl /7pH 8,8_Jã, 0,4 ,4 (p/v) SDS, 8 mM EDTA.

BAD ORIGINAL

s20 ml 29 D (p/v) acrilsmida, / (p/v) bisacriiamica em água.

ml agua.

500jul 10 - (p/v) persulfato de amónio em água.

Xistur?m-se as soluções. Imediatamente antes de se verter entre duas placas ce vidro, adicionam-se 100 ytf. ce Τ5ΜΞΒ. Após o gel de separação ter polimerizado, verte-se o gel de recolha, que possui a seguinte composição em:

ml de gel de recolha ml 0,5 X Tris/HCl Z~pH 6,3 J, 0,4 / (p/v) SDS, 3 mE ΞΓΤΑ.

ml 29 a (ρ/v) acrilamidá.

% (ρ/v) bisacrilamida em água.

ml agua.

250 ^j1 10 E (?/v) persulfsto de amónio em, agua .

Xisturam-se as soluções, adicionam-se 30 pl de ΤΞΧΕΕ e verte-se sobre o gel d@ separação. Insere-se um= sonda com antes d? polimerização. Utilizam-se glicina 190 mE, Tris 25 mE (?H 7,6), SDS a 1 / (p/v) como tampão electroforese.

?odem utilizar-se padrões de peso molecular comerciais como marcadores de tamanho

D.étodo 14: Manchas Imunológicas (Eancha Western)

Separa-se num gel de poliacrilamida SDS a 12 até

BAD ORIGINAL

100 jil de de uma amostra de proteína, durante a noite a uma voltagem constante de 100 V. Remove-se o gel e coloca-se em tampão de transferência. Kumidifics-se com água uma folha de papel de filtro ce nitrocelulose e coloca-se sobre o gel. Cobre-se o gel e a porção de nitrocslulose com papel Whatman [epois, coloca-se uma esponja sobre cada um deles

Introduz-se esta sanduiche assim obtida num aparelho de eleç troforese, orientando a folha de nitrocelulose para o polo po sitivo. A transferência das proteínas e efectuada por electroforese a uma corrente constante de 3^0 mA, durante 2 horas.

Apds a transferência, agita-se a folha de nitrocelulose, duran te 10 minutos em tampão 1 x TBS. Γθροίε, efectua-se uma incubação previa, durante 33 minutos em 1 x TES, leite em pd desnatado a 5 7 (p/v). Dilui-se um anticorpo dirigido contra a proteína que se pretende detectar numa proporção de 1 : 1.000 em 1 x TES, leite er:. pd desnatado a 5 / (ρ/v) e, incuba-se durante uma hora com a folha de nitrocelulose. Depois, lava-se 5 ve zes a folha de nitrocelulose, durante 3 minutos em 1 x TBS recentemente preparado e, a seguir, incuba-se durante uma hora com fragmentos FC anti-IgG de coelho, desenvolvidos na cabra e conjugados com fosfatase alcalina (Promega Biotech Corp., Madison, Wisconsin, USA), que se encontra diluído a 1·: 7. 530 em 1 x TBS contendo leite em po' desnatado a 5 n (p/v)·. Lava-se novamente a folha de nitrocelulose, tal como anteriormente descrito e, depois, coloca-se em 5 ml de tampão fosfatase alcalie ló,5j-il de BC IP (/0 mg/ml de cana contendo da em dirnetilformamida) e, mistura-se bem. Aprfs as bandas se terem tornado visíveis, armazena-se s folha de nitrocelulose .* para se evitar uma sobre-exposição. Podem utilizar-se proteí nas marcadoras previamente tingidas como indicadores em peso molécula r.

Método 15·· Transferência Southern de ALN para membranas de nylon.

Separaram-se por electroforese em gel de sgarose (?-eto do 2), cerca de 10 yil de ADN de plasmídeo ou de parasita por fenda. Sm crimeiro lugar fotografou-se o gel e, depois, incubou-se durante 15 minutos em hidróxido de sódio 0,5 M,solução de cloreto de sódio 1,5 M. Em seguida, neutralizou-se o gel incubando-o duas vezes, durante 15 minutos , em hidróxido de sódio 0,02 M e acetato de amónio IX e, cepois, colocou-se numa placa de vidro limpa. Coloca-se sobre gel uma membrana de Nylon (Hybond N, adquirível na Amersham) seguida de três folhas de Whatman 3 MM θ cerca de 20 toalhas de papel. Pesa-se o conjunto anterior com 500 g de peso. · Decorridas 3 horas, re move-se a membrana e seca-se à temperatura ambiente. Sxpóe-se a membrana seca à luz UV, voltada para um tansiluminado r, durante 5 minutos e, então, pode tratar-se mais tarde de acordo com o Método 12.

Exemplo

Construção do banco de genes de expressão do P. fslcipa rum

Desenvolveram-se as células do P. fslciparum (isolado

Kl) em 10 caixas de cultura, ds acordo com o descrito por

Trager et al., Science 193 (19/6), 673-675, θ, a seguir, lavaram-se em meio de cultura contendo saponina a 0,1 %. Sfectuou -se a suspensão dos parasitas lavados em 2 ml EDTA. 10 mX 6,0), SDS a 0,5 % (p/v). Após a adiça o de 50 mg de proteínase K in cubou-se s mistura a Ó5°C , durante 10 minutos e, subsequentemente, tratou-se com 2 ml de fenol (saturado com Tris-KCl (pH 8,0). Misturaram-se as fases agitando e separando-as novamente por centrifugação (10 minutos a 6.00 Fl PM, 20°C), repetiu-se duas, vezes a extracção com fenol (até ja não ser visível uma interfase. Precipitou-se o ADN de acordo com o Método 1, la vou-se com etanol e, secou-se. Dissolveu-se o ADN em 2 ml de agua e evaporou-se mecanicamente, isto é, submetendo a solução de ADN a compressão que resulta da passagem 80 vezes por uma seringa com uma agulha de 0,5 x lo mm. Depois disto, adicionaram 0,2 volumes de tampão 5 ^x EcoRl metilase (Tris/HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 0,25, EDTA 50 mM, -mercapto-etanol 25 mM,

S-adenosil-metionina 0,4 mM).

Metilaram-se lOjig de ADN a 37°C, durante 3θ minutos, com 50 unidades de EcoRl metilase (New England Eiolabs, Beverly, Massachusetts, USA). Extraiu-se o ADN uma vez com fenol, de acordo com o anteriormente descrito e, efectuou-se a sua pre cipitação de acordo com o Método 1. Dissolveu-se o ADN em 200 Jil de tampão polimerase T4 e, após a adição de dATP, dCTP, cOTP e dTTP 5 mM, bem como de 10 unidades de T4 polimerase, in cubou-se a 37°C durante 30 minutos. Extraiu-se novamente o ADN com fenol e precipitou-se de acordo com o Método 1. Dissolveu-se o ADN em 50 yal de tampão ligase. Após a adição de 0,01 unidades de de adaptadores oligonucleotídicos EcoRl'fosΑϊ forilscos (New Snglsnd Biolsbs) e de 2 ^il de ADN de T8 ligase

(12 unidades	c e Weiss,
tadores ao	ADN 8 18°í
cipitação do	ADN de a
20 yul d e 1 x	tampão de
bre gel de a	garose a 0
tos de A^N	que tinha·.;
com 0 Método	3. Disso.

uma extorsão

A^x e separou-se soísol.aram-se os fragmen 2 a 6 MB, de acordo tido em 50^1 de agua, após a adição de óyul de 10 x ligase tampão, 2 jtl de extremidades receptores lambda, desfosforilad ss (Promegs Eiotech Corp.) e de 6 unidades Weiss de ACM ligase T8, ligados a 18°C, durante a noite. Sfectuou-se a precipitação do ACM (Método 1) e dissolveu-se em 5 ^Jl de égua. Após a adição de 20 jul de Ex trscto de Empacotamento (Genofit, S.A., Geneve, Suíça) emba_ lou-se o ADN em particular de bacteriófagos a 20°C , durante 2 horas, de acordo com as indicações do fabricante. Após a adi. ção de 500 de tampão SM, bem como de 5q/)Ul de clorofó-mio, o banco de genes encontrava-se pronto para o ensaio com anticor oos .

Ir.saio com anticorpo do banco de genes

Produziram-se os anticorpos 2,lj e 7,12, conforme descrito por Bali e outros (supra) ;tes MABs reconhecem os polipéptidos de S0-5c KD nas manchas Western.

Incubaram-se células da. estirpe Y1090 da 2. col i, em ml d ,0 e meio LB a 37 C, durante uma noite. Na manhã seguinte, diluiram-se as células >0 vezes em meio LB e deixaram-se desenvolver, durante 2 horas a 37°C. Então, sedimentaram-se (10 minatos s 7.JOO g, 20°C) e efectuou-se nov? suspensão das ssssiss em 5 ~1 ce sulfato ce magnésio 10 a.X .

Adiciona rsm-se trinta lotes de ΙΟ*^1- partículas de bacteriófsgo do banco de genes s 100 yal desta suspensão de células e efectuou-se a incubação a temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionou-se a cada lote, 3 ml de solução de agar a 0,8 /, em meio BEI., aquecido a 42~C e misturou-se bem. íistribuiu-se em placas de agar E5L (82 mm. de diâmetro) o agar macio contendo as células infectadas. Incutaram-se, depois, as :1 a ea s de a 42 C, durar.te 3,5 ho^as. Colocou-se em cada caixa, um filtro de nitrocelulose, que tinha sido primeiro iner seco, ção a 37^6 durante 3 horas. Xarcou-se a posição do filtro rela, tivamente a caixa. Incubaram-se os filtros durante 30 minutos em 1 χ IBS, leite em pó desnatado a 5 , > contendo anti-espuma A a 0,01 / (Sigma. St. Louis, Xissuri, USA). diluiu-se de 1:1.000 so nume solução de IFTG 100 mX e seco, e efectuou-se a incubado, com 1 x IBS/Ieite em pó (ρ/v), fluído ascítico com anticorpos monoclonais contendo o XAB 2,13· Incubaram-se os filtros na presença do referido XAB de fluído ascítico à temperatura ambiente durante 30 minutos e, depois, isolou-se uma vez durante 5 minutos em. 1 x IBS, duas vezes durante g minutos em 1 x IBS, is em 1 x TES durante o d u ra n.t e 30 minuto s ”onid et ?40 0,05 minuto s. A isto .u-se uma meu:

com um.a ctiuiçao inti-IgG do rato desenvolvido na cabra conjugado com fosfatase alcalina (P^omega Biotech Corp.)

ES, leite em pó a 5 (p/v). Lavaram-se novaments os filtros como anteriormente ^eferido, o desenvolveram^se colorimet ricamente à temperatura ambiente utilizando 5 *ml de tampão

BAD ORIGINAL ram-s e soore a case das marcações

Cl

ζ .¾ fosf-tase alcalina contendo 33 £4 de DTE e 16,5^1 de BCI?

(P+S E io Chemicals , Sngland ; catalogo X² ?377D. Identifica-, placas positivss, retiraram-se das ca ixas de Petri Os bacteriófagos nas placas indi viduais colocaram-se em sgar macio em diluições diferentes, de acordo com o Xétodo 4 e as placas positivas identificaram-se novamente, conforme anteriormente descrito. Seleccionou— se um? placa individual, positiva ( \ 2,13), deixou-se desenvolver de acordo com. Orossterger, Mucleic Acics Pes. 15 (1987a ó737> s isolou-se o AEX .

Eetecçao da proteína recombinante expressa pelo 2,13

Efectuou-se a purificação em placa do clone A/ 2,13 (Xétodo 4) e preparou-se um? reserva em placa de lisado de baç, teriXfago (' -'tod^ 5) Eepois, lisoger.izou-se o bacteriófago clónado 2,13, ^ns estirpe Y1090 de Ξ. coli, conforme se segue.

A 13 jul de células em placa de Ϊ1090 (Xétodo 6) , adicionaram-s.e 13° unidades que formam placas do bacteriófago λ 2,13Adicionou-se meio LE (2

230 Jjl) uxou-se a mistura λΟ durante 3 horas a 3θ C. Eepois colocou-se a suspensão numa placa LB e desenvolveu-se durante a noite ? 33 C. Isolou-se as colónias e seleccionaram-se colocando-as em plscas.de repli caçao : um? cresceu a 3θ C e a outra cr^

4z C z Ο ~ ι O

-se que as colonias que cresceram a 33 C mas nao a 42' C como sendo lisógenos de Àr^.,13·

Desenvolveu-se, durante uma noite, um lisógeno de )^2,13 a 33°C, em 5 il õe meio LB. Depois, diluiu-se dez vezes com meio LB e desenvolveu-se durante 3 horas a 30°c

BAD ORIGINAL %

Lnduziu-se s síntese ds proteins de fusão adicionando IPTG até uma concentração final de 100 e passando a cultura para 42 C. Após 30 minutos, sedimentou-se 3 ml desta cultura a 12.000 g, durante 5 minutos e efectuou-se nova suspensão em 100^1 de tsm pão de carga SES-PAGE. Colocou-se a amostra em ebulição duran te 5 minutos e, depois verteu-se sobre um gel de poliacrilami da -SES a 10 (Método 13) 0 prosseguiu sob uma voltagem constante de 100 V durante um? noite. Depois, efectuou-se a mancha da amostra sobre papel de nitrocelulose e detectou-se imunulogicamente utilizando anti-soros (Método 14). Tanto o soro

Doliclonal contra a ^-gala ctosidase como o anticorpo 2,13, conheceram uma extensa banda mostrando a presença de uma proteína de fusão com um peso molecular aparente de 150-170 KD. Um soro policlonal lançado contra o antígeno purificado também, reconheceu estas bandas de um modo muito forte.

Análise e sequenciação da inserção de AEN clonedo λ 2,1 :jjg de AEN de /vp,i3 sm tampao de alto teor salino (20^1), digeriu-se a 37° 0 durante 1 hora com 11 unidades de DcoPl e analisou-se sobre gel de agarose a 0,5 f. (Método 2). Não se observou nenhuma inserção. Depois, dissolDissolveu-se 2 pg de AEN de veu-se o Au?: di ,13 (2jjg) em tampão de alto teor salino (20yu,l) ,0 _r.

digeriu-se a 37 Õ, durante 1 hora com unidades de’MluI.

Observou-se um fragmento de AEN de 3,9 13 por electroforese sobre gel de agarose (Método 2) indicando uma inserção clorada de 1,7 KD. Uma digestão posterior do ADN de .X 2,13 (2 jug) em tampão de alto teor salino (20 jul) com 11 unidades de ScoRl e 10 unidades de MluI a 37°G, durante 1 hora, proporcionou um fragmen

BAD ORIGINAL

X <5.

to de ADN de 3,4- Mb, 0 que sugere que o sítio EcoRI de extremidade 5' da inserção se conservou mas que se perdeu o sítio EcoRI da extremidade 3'·

Depois, efectuou-se a digestão do ADN de 2,13 em tampão nuclear (20jul) com 11 unidades de EcoRI durante 1 hora a 37°8. Inactivou-se o enzima pelo calor, por incubação duran te 10 minutos a ó5°C. Após adição de lóyil de a'gua, 2 jil de -mercaptoetsnol 14-0 mM e de 2^1 de Triton X-100 a 0,2 7, digeriu-se, depois o ADN adicionando 20 unidades de Kpnl. Incubou-se a mistura reaccional a 37°C durante 1 hora e, então, inactivou-se o enzima pelo calor a Ó5°C, durante 10 minutos. 0bse^rvou-?e um fragmento EcoRI/Kpnl de 2,7 KB, por electroforese sobre gel de agarose (Método 2). Para se efectuar a sequenciação, ligaram-se estes fragmentos vectores de sequenciação M13 mol3 e M13 mpl9 (disponíveis, por exemplo, nos New England Biolabs, Beverly, Massachusetts , USA). Efectuou-se isto por digestão de 2 jjg de cada vector com EcoRI e Kpnl, conforme descrito anteriormente pana A/2,13icionsram-se os vectores M13 í, mplS

M13 mpl9 (4-0 ng) digeridos ao ADN de A/ 2,13 ougerido comi EcoRI/Kpnl (100 ng) em PO^il de tampão ligase e incuba, ram-se a 1>°C, durante uma noite. Transformaram-se células TG-1 competentes com o ADN de ligação (Método 7). Isolaram-se as placas brancas, amplificanam-se e p^eoa rou-se ADN suficiente pana a determinação da sequência (Método 5). Dissolveu-se uma preparação de mini-lisado de ADN RF (Messing. supra; ver tam bém Método 10) a partir do sub-clone M13 mplS (0,5 jug) em 20jul de tampão salino de Meio e digeriu-se com 3 unidades de HindIII. De modo idêntico, digeriu-se também este ADN com Bamíil. Ambas

BAí) original

as digestões indicaram a presença de um sítio HindIII e de um sítio EamHI na inserção de ΑΓΝ clonada. Determinou-se a sequência de ADN da inserção de acordo com o Método 9 , utilizando a informação obtida a partir de uma análise de enzima de restrição do ADN . A inserção possui?, a sequência núcleo tídica (1) anteriormente indicada.

Método para obter o gene completo que codifica o antígeno 2,13

Aproximadamente ÓO óo gene que codifica o antígeno 2,13 está ja' compreendido no A/ 2,13· Utilizou-se o Método seguinte para se obter o gene completo que codifica o antígeno 2,13. Introduziu-se o ADN (5 jug) do suc-clone de M13 mplõ, contendo o fragmento ΜρηΙ/EcoRI de A 2,13 ^SK 20 jul de tampão de alto teor salino e tratou-se com os enzimas de restrição ScoRI (10 unidades) e Sall (10 unidades), durante 1 hora a, 37°C. Analisou-se o AIN por el ectroforese sobre gel de agarose (Método 2) e isolou-se um fragemento de ADN de 1,7 KB (Método 3). Marcou-se radioactivamente algum deste ADN (100 ng) (Método 11) ε hibridou-se (Método 12) com uma mancha Southern (Método 15) de AÍN (3 jug) de P. falcipa rum (estirpe Ml) que tinh=~ sido digerido com. HindIII (3 unidades) em 20 Jil ,0 de t am cão de meio s ·.

.no

0, durante 1 hora.. Observaram-s dois fragmentos de ADN de cerca, de 3 Mb e de cerca de 11 Mb. Sstes dois fragmentos de ADN também se encontravam presentes no banco do gene do fragmento HindIII de ADN de Ml, presente no vector \ι NM114-9 (Goman et al. , Mol. Biochem. Parasitol. jj, (19S2), 391-4-00. Sfectuando o rastreio deste banco do genes uti. lizando o fragmento SalI/EcoRI anteriormente mencionado, obtiBAD ORIGINAL

versm-se A.DNs contendo a porção restsr.te do gene (pode utilizar-se, com este objectivo qualquer outro banco de genes do P. fglcípsrum). Na Figura 1, indica-se a localização destes fragmentos e a sua relação com o gene do parasita. Efectuou-se a sua sequènciação ds acordo com o método de terminação da cadeia didesoxinucleotídica, após a sua subclonagem nos veç tores M13 adequados. A instabilidade de alguns sub-fragmentos torna necessária a utilização ce diversos promotores oligonucleotídicos sintéticos para completar a sequência. Ns cigura 2 indica-se a sequencia completa do ge^e.

A sequência de código revela diversos pontos de interes. se na estrutura do antígeno 2,13. Possui na sua extremidade N uma sequência principal putativa (ve” seta n? Fig. 2A) , o que sugere que este antígeno é comandado através do retículo endoplssmico e do aparelho de C-olgi pars 0 seu ponto de destino.

antígeno d,lj, não possui domínios de transmembrana ou repetições oligopeptísicas. As características sais interessantes são sequências que puderam formar hélices C£ ,snfifíiicas carregadas positivamente (sublinhado na rig. 2A ,E) . Podiam utilizar-se tais estruturas pare a proteína penetrar na membrana do eritrócito durante a invasão pelos merozóitos.

Referiu-se, na parte introdutória desta descrição que i: antígeno rhop.try que se com corta .s ce ooiiac se modo 10 en tico ao anre-se constituir uma protecção para os macacos tigero .

Saimiri 9 pensa-se ser uma protease de serina activsda pela fos folipase C, o que sugere que se encontra ligada s membrana por um ligante glicosil-fosfo-in_ositol (CPI). A inspecção da seBAD ORIGINAL quereia de aminoácidos do antigeno 2,13 indica, que nenhum doí rr.otivos conservados na protesse de serina se ercontra presente, nem possui um alvo potencial p^r= ligação de um ligante GPI. Conclui-se, que o antigeno rhoptry de Sraun-Breton et al., é diferente do antigeno 2,13.

Purificação do antigeno reconhecido pelo anticorpo monoclonal 2,13

Ligou-se o anticorpo monoclonal ¢.,13 purificado a uma e Sepharose^A“ 4fi (Pharmacia) activeda por brometo ce cianogénio, utilizando o método recomendado pelo fabricante.

Recolheram-se os sedimentos de células da maior parte das cul turas ce P. falciparum e extrairam-se com, pelo menos, 5 volu mes de Nonidet P40 a 1 ,1 (p/v), desoxicolato de sódio a 2 / (p/v), Tris/HCl 530 mM << pH 3,0) SETA 5 rrM, SGTA 5 mM, iorioaeetam.ida 5 m.M, PMSF 1,2 mM, pepestatina, quinostatina, anti’ o patina, leupeotina, 10 ^-2 cada, a 4 C, durante 1 hora. Adi. cionou-se PMSF ecentem.ente preparado, até 0,02 mM, e centrifu g, durante ' o.. , hor-s a u C. Ao sob¹ gou-se o extraeto a 100.000

nada nt	e adicionou-se	PMSF recent
f e z - s e	passar através	de um.a col
ao MAE	^,13 e equilib	rada com No
cola to	de sódio a <x /	( p /V ) , x τ. i

Eepois lavou-se a coluna de Sepharose 4B-li ada ao MAE A ,13 con, pelo .menos , 5 volumes de tampão m (Nonidet P4-0 a 1 /, desoxicolato d la va ‘ .O oc e sodio a 0,5 / (P/v),

Tris-HCl 50 mM (pií e,0) , SDTA 5 mM. SGTA 5 m.M seguido de 5 vo lumes de coluna de tampão de lavagem; contendo adicionaimente

BAD ORIGINAL a 7V

NsCl - 0,9 ,í e, gem isento de sal, antes

Irnente, re-equilitrada em tampao ce lava; se eluir com dietilamina 50 m.M em tampão ce lavagem a pH 11,5· Neutralizou-se a solução da pro teína com glicina sólida e, depois, purificou-se posteriormen te, vertendo a proteína num. gel de poliacrilamida e eluindo ss faixas com um peso molecular relativo de ó5 a 80 KD e de 40 a 42 KD, isto é, as faixas que representam o antígeno 2,13 puri ficado por afinidade (ver antes), após electroforese por eleç tro-eluição utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. Utilizou-se a proteína purificada para imunizar macacos.

istudos de Protecção ce Macacos no +0^ cia, subcutar.eamente com 1 ml ínjectou-se cada um cos quatro macacos £. sclureus no dia 0, no 24² dia = no 98 2 d 1 emulsão contendo um total de o5 yjg de antígeno 2,13 purificado (-vacina). Para a primeira injecção emulsionou-se o antígeno em adjuvante incompleto de Freund, enquanto para a segun da e terceiras injecções se emulsionou o antígeno em adjuvante incompleto de Freund. Injectou-se um segundo gruoo de qua tro macacos £. sclureus que funcionaram como grupo de controlo. De modo idêntico, com adjuvante de Freunc misturado com solução ilina de fosfato tampão. Decorridos 60 dias sobre 'imeira injecção, in_uectou-se intravascularmente nos ani7 ; 3,5 ^x 10 eritrócitos parasitados de um macaco £ . s ciu eus cue tinha sido infectado com a .irce Paio Alto do ?

falciparum. Avaliou-se a parasitemia subsequente por amostra.

gem ciaria de sangue obtido através da extracção de sangue das orelhas dos macacos. Determinou-se a percentagem de parasiteBAD ORIGINAL

mia, escalonando o número de eritrdcitos parasitados, so microscópio em 200 campos ópticns contendo cada um aproximadamente 200 eritrocitos. Os animais que apresentaram 20 % de parasitemia receberam terapia farmacológica. Eescobriu-se que 3 óos 4 macacos não necessitavam de terapia e se encontravam protegidos pela vacina contendo o antígeno 2,130 especialista verificara que se podem efectuar modificações e alterações à presente invenção sem deturpar o âmbi to e espírito da mesma. Os aspectos específicos aqui apresen tados têm apenas uma finalidade explicativa. A presente invenção encontra-se apenas limitada pelos ternos especificados nas reivindicações.

Rei

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de um polipéptido antigénico possuindo um determinante ou determinantes que inter-reagem imuno logicamente com determinantes do polipéptido de Plasmodium falciparum associado aos orgenelos rhoptry da forma merozoita do parasita da malária, cujo polipéptido de Plasmodium falciparum tem a seguinte sequência de aminoácidos:

MSFYLGSLVI IFHVLFRNVADGINVNGDNNY gktiinndfnfddynywtpinkkeflnsyed efssesflenkssvddgninltdtstsnkss KKGHGRSRVRSASAAAILEEDDSKDDMEFKA SPSVVKTSTPSGTQTSGLKSSSPSSTKSSSP SNVKSASPHGESNSSEESTTKSSKRSASVAG IVGADEEAPPAPKNTLTPLEELYPTNVNLFN YKYSLNNMEENINI LKNEGDLVAQKEEFEYD ENMEKAKQDKKKALEKIGKQSDEEPFMFSEN KFLENQVKERNVAGSFSRFFSKLNPFKKDEV IEKTEVSKKTFSGIGFNLTDKEAKVLGVGAT YQEYPETMLYNCPNNSNLFDTIESLQGRI ID IKKRESMI STTFEQQKECLKNMGVLDLELND TQCKFGTCIGSFGEHHLRLYEFENDLFKFHP NIDYLTLADGYKLQKNHIYELSHVNFCLLNP KTLEEFLKKKEIKDLMGGDDLIKYKENFDNF MS I S ITCHIESLIYDDIEASQDIAAVLKIAK SKLHVITSGLSYKARKLVYKIYSEIQKNPDE LYEKLTWIYDNIYMIKRYYTAYALEGVCSYL EHDKSQMYTELHIYNK IVDSVRYYSSCFKNV IVYNAI ISGIHEKIKHFLKLVPRHNFLLDYH FNSIFEKEIKPAKKYSTSHIYFDPTVASYAY YNLDRRTMVTI INDYFEAKKKELTVIVSRMK TDMLSLQNEESK IPNDKSANSKLATRLMKKF KAEIRDFFKEMRIQYAKLINIRYRSHLKKNY F A F K R L D caracterizado pelo facto:

(a) de se preparar uma cultura de um organismo hospedeiro unicelular constituído por um DNA recombinante que codifica o referido polipéptido antigénico para desenvolver e exprimir o polipeptido antigénico e;

(b) de se isolar o referido polipéptido antigénico da cultura
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o polipéptido antigénico ser constituído pela sequência de aminoácidos definida na reivindicação 1 ou uma sua sequência parcial e cujo polipéptido antigénico inter-reage imuno ζ

.ζ logicamente com determinantes no polipéptido Plasmodium falciparum definido na reivindicação 1.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o polipéptido antigénico ser o polipéptido de Plasmodium falciparum definido na reivindicação 1.
4. - Processo de acordo com .uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o polipéptido antigénico ser susceptível de induzir anticorpos em um hospedeiro mamífero, cujos anticorpos são susceptíveis de inibir a invasão de eritrõcitos de mamíferos pela forma merozoita do parasita da malãria in vivo.
5. - Processo de acordo com umaqualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se obter o polipéptido antigénico numa forma não glicosilada.
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se purificar adicionalmente o polipéptido antigénico até â homogeneidade.
7. - Processo para a preparação de um polipéptido antigénico de acordo com uma qualquen» das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se utilizarem métodos convencionais de síntese peptídica.
8.- Processo para a preparação de um organismo hospedeiro unicelular susceptível de exprimir um polipéptido antigénico tal como definido em uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se transformar um organismo hospedeiro unicelular por uma técnica apropriada com um vector recombinante constituído por um DNA recombinante que codifica o referido polipeptido antigénico e de se propagar o organismo hospedeiro transformado num meio de cultura.
9.- Processo para a preparação de anticorpos dirigidos contra um polipéptido antigénico obtido por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fac to de se injectar o referido polipéptido antigénico em um mamífero susceptível de produzir uma reacção imunolõgica contra o referido polipéptido antigénico e de se isolar o anticorpo formado por meio de uma técnica apropriada.
10.- Processo para a preparação de uma composição imunogénica susceptível de eliciar a formação de anticorpos tal como se definiu na reivindicação 9, caracterizado pelo facto de se misturar um polipéptido obtido por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7 com um adjuvante aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Lisboa, 13 de Março de 1990 O Ag2Tte_Oíll<ibcJa^Prppr^d^de Industriei k

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RESUMO

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM POLIPEPTIDO ANTIGÉNICO

DE RHOPTRIES DA FORMA MEROZOITA DE PLASMODIUM, DOS SEUS

DERIVADOS E DE COMPOSIÇÕES IMUNOGÉNICAS QUE OS CONTEM

A presente.invenção diz respeito a um processo para a preparação de polipeptidos antigénicos possuindo um determinante ou determinantes imunologicamente reticulados com determinantes num polipeptido associado com os organelos rhoptry da forma merozoita do parasita da malária Plasmodium falciparum que consiste:

(a) em preparar uma cultura de um organismo hospedeiro unicelular constituido por um DNA recombinante que codifica o referido polipeptido antigénico para desenvolver e exprimir o polipeptido antigénico e;

(b) em isolar o referido polipeptido antigénico da cultura.

A presente invenção refere-se ainda a um processo para a preparação de composições imunogénicas que contêm o referido polipeptido e um adjuvante adequado, DNAs que codificam o referido polipeptido, vectores recombinantes contendo a referida sequência de DNA, organismos hospedeiros unicelulares que contêm um vector replicável bem como anticorpos dirigidos contra um polipeptido