DE69836587T2

DE69836587T2 - Nukleinsäuresammlung

Info

Publication number: DE69836587T2
Application number: DE69836587T
Authority: DE
Inventors: C. John Denver GERDES; M. Jeffrey Aurora MARMARO; A. Christopher ROEHL
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2018-04-17
Also published as: US6291166B1; AU745126B2; JP2002512688A; WO1998046797A1; DE69836587D1; ATE347615T1; CA2286573A1; EP1003908B1; JP3666604B2; EP1003908A4; AU7127198A; CA2286573C; EP1003908A1

Description

NUKLEINSÄURESAMMLUNG
Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die allgemeinen Fachgebiete der Molekularbiologie, Biochemie, Genetik und biologischen Forschung und insbesondere ein Verfahren zum Einfangen und irreversiblen Binden von Nucleinsäure aus einer beliebigen biologischen Probe an eine Festphasenmatrix, so dass die gebundene Nucleinsäure mit wässrigen Puffern gründlich gewaschen werden kann, ohne dass sie von der Festphase eluiert wird. Weiterhin kann die an die Festphase gebundene Nucleinsäure direkt als ein zugängliches Substrat für Enzymreaktionen oder Hybridisierungsprimer oder komplementäre Sonden-Basenpaarung und anschließenden Nachweis, entweder mit oder ohne Amplifikation, genutzt werden. Die Festphasen-gebundene Nucleinsäure kann nicht nur einmal, sondern mehrmals in Hybridisierungs- oder Amplifikationsreaktionen eingeführt werden. Somit betrifft dieses Verfahren weiterhin kommerzielle Anwendungen, bei denen das Einfangen von Nucleinsäure mit einer Nucleinsäure-Hybridisierung und/oder Amplifikation kombiniert wird.
Stand der Technik
Die Molekülstruktur von Nucleinsäuren macht einen spezifischen Nachweis anhand einer komplementären Basenpaarung von Oligonucleotid-Sonden oder Primern an Sequenzen, die für spezifische Zielorganismen oder Geweben einmalig sind, möglich. Da alle biologischen Organismen oder Proben eine Nucleinsäure mit spezifischen und definierten Sequenzen enthalten, hat eine universelle Strategie zum Nachweisen von Nucleinsäure in mehreren verschiedenen Forschungs- und Entwicklungsbereichen und außerdem in der kommerziellen Industrie ein extrem breites Anwendungsspektrum. Das Potential für praktische Anwendungen eines Nucleinsäure-Nachweises wurde dadurch noch stark gesteigert, dass Verfahren beschrieben wurden, mit denen genaue Sequenzen von Nucleinsäuren, die in einer niedrigen Konzentration vorliegen, mit Wiedergabetreue auf viel höhere Kopienzahlen amplifiziert oder kopiert werden können, so dass sie durch Nachweisverfahren viel einfacher festgestellt werden können.
Das ursprüngliche Amplifikationsverfahren ist die Polymerasekettenreaktion, die von Mullis et al. beschrieben wird (US Patent Nr. 4 683 195, US Patent Nr. 4 683 202 und US Patent Nr. 4 965 188). Nachdem die PCR eingeführt worden war, wurde ein großes Spektrum von Strategien zur Amplifikation beschrieben. Vgl. z.B. US Patent Nr. 5 130 238 an Malek, Nucleinsäuresequenz-basierte Amplifikation („nucleic acid sequence based amplification", NASBA); US Patent Nr. 5 354 668 an Auerbach, isothermale Methodik; US Patent Nr. 5 427 930 an Buirkenmeyer, Ligase-Kettenreaktion; und US Patent Nr. 5 455 166 an Walker, Strangverdrängungs-Amplifikation („strand displacement amplification", SDA). Für einige dieser Amplifikationsstrategien, wie SDA und NASBA, ist ein einzelsträngiges Nucleinsäure-Ziel erforderlich. Das Ziel wird normalerweise vor der Amplifikation durch eine Schmelzprozedur unter Verwendung einer hohen Temperatur einzelsträngig gemacht. Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Mechanismus zum Umwandeln von doppelsträngiger Nucleinsäure zu einzelsträngiger Nucleinsäure ohne diesen herkömmlichen Schmelzschritt bereit.
Die Ziel-Nucleinsäure muss vor der Amplifikation und dem Nachweis der Nucleinsäure aus der biologischen Probe extrahiert und gereinigt werden, so dass Inhibitoren von Enzymen der Amplifikationsreaktion entfernt werden. Weiterhin muss ein Nucleinsäure-Ziel bereitgestellt werden, das für das Anlagern von Primern („Primer Annealing") frei und ständig verfügbar ist. Eine große Vielfalt von Strategien zum Reinigen von Nucleinsäure sind bekannt. Diese umfassen z.B. Phenol-Chloroform- und/oder Ethanol-Fällung (Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), Fällung durch eine hohe Salzkonzentration (Dykes, (1988), Electrophoresis 9: 359-368), Proteinase-K-Spaltung (Grimberg et al., (1989), Nucleic Acids Res. 22: 8390), Chelex- und andere Kochverfahren (Walsh et al., (1991), Bio/techniques 10: 506-513) und Festphasen-Bindung und Elution (Vogelstein und Gillespie, (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 615-619).
Die Analyse von Nucleinsäure-Zielen besteht somit aus drei Schritten: Extraktion/Reinigung von Nucleinsäure aus biologischen Proben, direkte Sondenhybridisierung oder Amplifikation der spezifischen Zielsequenz, und spezifischer Nachweis davon, In den zurzeit eingesetzten herkömmlichen Verfahren wird jeder dieser Schritte getrennt durchgeführt, was dazu führt, dass die Nucleinsäureanalyse arbeitsintensiv ist. Außerdem sind zahlreiche Manipulationen, Instrumente und Reagenzien erforderlich, um jeden Schritt der Analyse durchzuführen.
Ein weiteres Risiko bei den herkömmlichen Methoden besteht in der signifikanten Wahrscheinlichkeit einer Kreuzverunreinigung der Proben zwischen den gleichzeitig laufengelassenen Proben oder einer aus einer früher amplifizierten Probe. Es wäre vorteilhaft, den Schmelzschritt, der zum Erzeugen von einzelsträngiger Nucleinsäure für Sondenhybridisierung oder Amplifikations-Primer-Annealing erforderlich ist, wegzulassen und die drei Nucleinsäure-Analyseschritte direkt zu integrieren, so dass die Analy seprozedur und Methodik vereinfacht werden und außerdem das Risiko einer Kreuzverunreinigung reduziert und/oder eliminiert wird. Die hier diskutierte Erfindung stellt ein Verfahren für ein direktes Kombinieren der vorstehend besprochenen Extraktions- und Hybridisierungs- oder Amplifikationsschritte bereit.
Für Analysezwecke muss Nucleinsäure häufig aus extrem kleinen Proben extrahiert werden, bei denen es schwierig, wenn nicht sogar unmöglich ist, eine zweite Probe zur Bestätigung zu erhalten. Beispiele umfassen eine Analyse von Beweismitteln bei einer Straftat oder von Feinnadelbiopsien für klinische Tests. In solchen Beispielen wird somit der Umfang der klinischen Tests und einer Bestätigung durch Replika-Tests durch die Größe der Nucleinsäureprobe eingeschränkt. Wenn man für diese kleinen Proben herkömmliche Extraktionsverfahren verwendet, geht die Nucleinsäure häufig verloren, oder die Ausbeuten sind so, dass nur eine einzige oder einige wenige Amplifikationsanalysen möglich sind. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum irreversiblen Binden und somit permanenten Archivieren von Nucleinsäure aus Proben bereit. Das heißt, dass die Nucleinsäure während der Analyse weder verändert noch aufgebraucht wird, und dass sie deshalb unbegrenzte Male erneut analysiert werden kann. Die vorliegende Erfindung nutzt die DNA-Bindungseigenschaften von Festphasen, die dem Fachmann zwar bekannt waren, von denen jedoch angenommen wurde, dass sie mit einer Nucleinsäureanalyse nicht kompatibel sind. Außerdem werden Bindungseigenschaften bei der Verwendung für die Analyse von RNA charakterisiert.
Proben, die hohe Spiegel von endogener oder Hintergrund-Nucleinsäure enthalten, wie Blut, sind extrem schwierig auf das Vorliegen von spezifischen Zielen, die in niedrigen Spiegeln vorliegen, zu analysieren. Festphasen mit einer hohen Affinität für Nucleinsäuren können eingesetzt werden, um Oligonucleotid- oder Sondensequenzen ineversibel einzufangen. Anschließend können diese Stoffe durch Ändern der Pufferbedingungen selektiv Zielsequenzen einfangen, und zwar auch dann, wenn hohe Spiegel von Hintergrund-Nucleinsäure vorliegen.
Die Erfordernisse für das Binden von DNA an Festphasen und dafür, sie anschließend davon eluieren zu können, wurden von Boom (US Patent Nr. 5 234 809) und Woodard (US Patent Nr. 5 405 951, US Patent Nr. 5 438 129, US Patent Nr. 5 438 127) beschrieben. Insbesondere bindet DNA an Festphasen, die elektropositiv und hydrophil sind. Festphasen-Stoffe, die aus den Atomen Silicium (Si), Bor (B) oder Aluminium (al) bestehen, können durch Hydroxyl- (-OH) oder andere Gruppen ausreichend hydrophil gemacht werden, so dass eine Oberfläche zustande kommt, die DNA ineversibel bindet, während Proteine oder Inhibitoren nicht binden. Die Bindung von RNA wurde vorher noch nicht charakterisiert und wird in der vorliegenden Erfindung gezeigt. Da für herkömmliche Reinigungsverfahren die Elution der gebundenen Nucleinsäure erforderlich ist, werden diese Festphasen-Stoffe als solche Stoffe beschrieben, die für die Reini gung von DNA nicht geeignet sind. Tatsächlich war ein großer Arbeitsaufwand erforderlich, um Festphasen-Stoffe herzuleiten, die ausreichend elektropositiv und hydrophil sind, um Nucleinsäure adäquat zu binden und doch ihre Elution hiervon noch möglich zu machen. (Vgl. z.B. die US Patente Nr. 5 523 392, 5 525 319 und 5 503 816, alle an Woodard).
EP 0391 608 beschreibt die Herstellung eines Trägers zum Sorbieren von Nucleinsäure, wobei der Träger ein Metalloxid umfasst. Die Nucleinsäure wird an mindestens einen Teil der verfügbaren Oberfläche des Trägers in einer Weise sorbiert, dass die Nucleinsäure im Wesentlichen ihre biologische Zugänglichkeit und Reaktivität beibehält. Der Träger kann zum Hybridisieren, Markieren, Sequenzieren oder zum Synthetisieren von Nucleinsäuren verwendet werden.
WO 92/18514 beschreibt ein Verfahren und Kits zum Reinigen von Nucleinsäuren unter Verwendung von Metalloxid-Trägern, die in der Lage sind, vorzugsweise Nucleinsäure aus Lösung zu sorbieren. Danach kann die adsorbierte Nucleinsäure abgelöst oder eluiert werden, oder sie kann in ihrem sorbierten Zustand verwendet werden.
WO 90/0604 beschreibt magnetische Partikel, die synthetische Oligonucleotide aufweisen, welche an ihre Oberfläche durch spezifische chemische Verfahren, wie die Reaktion mit Avidin oder Streptavidin, die Reaktion einer 5'-Aminogruppe mit einer Carboxyl- oder Tosyloxygruppe oder eine direkte chemische Synthese des Oligonucleotids an Partikeln, welche Hydroxyl- oder geschützte Hydroxylgruppen enthalten, angelagert werden. Anschließend werden die Partikel mit den angelagerten Oligonucleotiden verwendet, um Nucleinsäure durch Hybridisierung zu binden.
Die vorliegende Erfindung verwendet Festphasenmatrizen, um Nucleinsäure irreversibel zu binden, und beschreibt Verfahren zum direkten Manipulieren, Hybridisieren und/oder Amplifizieren von Festphasen-Nucleinsäure. D.h. die Analyse wird durchgeführt, ohne dass die Nucleinsäure von der Festphase eluiert wird.
Boom, vorstehend, beschreibt eine Festphasen-DNA-Amplifikation, wobei er ein stark chaotropes Salz für eine reversible Bindung an Silica verwendet. Wenn diese Festphase in den Amplifikations-Reaktionspuffer eingebracht wird, wird die Nucleinsäure tatsächlich eluiert. Deshalb findet die Amplifikation in Wirklichkeit in Lösung und nicht an der Festphase statt. Da weiterhin die Bindung nicht irreversibel ist, kann die Amplifikation nur einmal durchgeführt werden. Del Rio et al. ((1996), Bio/techniques 20: 970-974) beschreiben ein Filter-Einfangen von Nucleinsäure in einer Weise, die eine wiederholte Amplifikation möglich macht. Jedoch beschreiben sie keinen Bindungsmechanismus, der ineversibel ist, deshalb wird das Verfahren nur für die Analyse von höheren Nucleinsäurekonzentrationen und dann auch nur für eine begrenzte Anzahl von Analysen empfohlen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Umwandeln von doppelsträngiger Nucleinsäure zu einzelsträngiger Nucleinsäure ohne irgendeinen Schmelzschritt und stellt Verfahren zum schnellen Einfangen von DNA und RNA bereit, wodurch die Extraktion und Reinigung direkt mit entweder Hybridisierung oder Amplifikation kombiniert werden. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum irreversiblen Binden und somit permanenten Archivieren von Nucleinsäure aus Proben bereit. Die vorliegende Erfindung nutzt Festphasenmatrizen, um Nucleinsäure irreversibel zu binden, und beschreibt eine echte, direkte Festphasen-Manipulation und Analysen, einschließlich Enzymerkennung, Hybridisierung und Primer-abhängige Amplifikation. Eine echte Festphasen-Analyse macht stringente wässrige Waschgänge, ein schnelles automatisierbares Nucleinsäure-Einfangen und Reinigung, einen selektiven Nucleinsäure-Nachweis, eine wiederholte und/oder erweiterte Analyse der gebundenen Nucleinsäure und eine langfristige Lagerung von Nucleinsäure möglich. Jede dieser offenbarten Methoden überwindet die Nachteile des bisherigen Stands der Technik.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf neuen Verfahren zum Verwenden von Festphasen zum irreversiblen Einfangen von RNA, DNA oder anderen Nucleinsäuren als ein Mittel für: wässrige Waschgänge, Pufferaustausche und Volumenreduktionen während prozeduraler Manipulationen; schnelles und unmittelbares Einfangen von Nucleinsäure als ein Verfahren zum Automatisieren einer Extraktion; Vereinigen des Einfangens und Reinigens von Nucleinsäure mit Oligonucleotid- oder Sondenhybridisierung oder Ziel- oder Signal-Amplifikation für eine direkte Analyse von Nucleinsäure, die entweder als Einzel- oder als Doppelstränge an die Festphase gebunden ist; wiederholte und/oder erweiterte Analyse der gebundenen Nucleinsäure nach ihrem Einfangen auf der Festphasenmatrix (Nucleinsäure-Archivierung); mittels Schwerkraft oder mit hoher Fließrate erfolgende Festphasen-Chromatographie als ein Mittel entweder zum Konzentrieren von Nucleinsäure aus Proben mit großem Volumen oder zum Entfernen einer Nucleinsäure-Verunreinigung aus wässrigen Puffern oder Lösungen.
Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von stark elektropositiven Festphasen-Stoffen, die Aluminiumoxid oder Aluminiumhydroxid enthalten, wobei dieses Material hydrophil gemacht wird, indem die Probe auf einen alkalischen pH-Wert oder eine hohe chaotrope Salzkonzentration eingestellt wird, so dass eine Oberfläche zustand kommt, die Nucleinsäure irreversibel einfängt. Unter Verwendung dieser Stoffe mit hoher Affinität wird Nucleinsäure als doppelsträngige Nucleinsäure direkt aus wässrigen biologischen Proben oder Puffern eingefangen. Durch Einstellen der Probe auf den alkalischen pH-Wert oder durch Einstellen einer hohen chaotropen Salzkonzentration, wird die Nucleinsäure als einzelsträngige Nucleinsäure an die Festphase gebunden. Das Binden der Nucleinsäure als ein Einzelstrang ist erforderlich, so dass ein Kombinieren mit Hybridisierungs- oder isothermalen Amplifikationsverfahren möglich wird. Die an eine Festphase gebundene Nucleinsäure kann mit wässrigen Puffern einfach gewaschen werden, wodurch ein günstiger Mechanismus für Pufferaustausche und Volumenreduktion bereitgestellt wird. In der bevorzugten Ausführungsform wird dies durch Nutzen der Schwerkraft („gravity flow") erreicht. Die an eine Festphase gebundene Nucleinsäure kann direkt mit Reaktionsgemischen in Kontakt gebracht werden, welche eine Nucleinsäurehybridisierung, Signal- oder Ziel-Amplifikation möglich machen. Die Nucleinsäure verbleibt auch noch nach mehreren Pufferwaschgängen, Hybridisierungs- oder Amplifikationsreaktionen an der Festphase gebunden. Die Fähigkeit, die gleiche Nucleinsäureprobe erneut analysieren zu können, ist ein Mechanismus, der ein Mittel für eine Bestätigung von Ergebnissen und/oder eine erweiterte Analyse bereitstellt, dies ist insbesondere dann nützlich, wenn die Probe in einer begrenzten Menge verfügbar ist oder nicht ersetzt werden kann. Irreversibel gebundene Nucleinsäure ist bei Raumtemperatur stabil, dies stellt weiterhin ein geeignetes Verfahren zum Lagern von Nucleinsäure bereit.
Die hier beschriebene Erfindung stellt ein Verfahren zum Einfangen und irreversiblen Binden von Nucleinsäure bei niedrigen Konzentiationen und hohen Fließraten aus einer beliebigen biologischen Probe an eine Festphasenmatrix bereit, so dass die gebundene Nucleinsäure mit wässrigen Puffern gründlich gewaschen werden kann, ohne dass sie von der Festphase eluiert wird. Diese Bindung stellt eine hohe Stringenz für kommerzielle Anwendungen, wie Microarray-Hybridisierungen, bereit, für die ein niedriger Hintergrund erforderlich ist, um eine hohe Empfindlichkeit zu erreichen. Dieses Verfahren betrifft somit weiterhin kommerzielle Anwendungen zum Automatisieren der Nucleinsäure-Extraktion, zum Konzentrieren von in niedriger Kopienzahl vorliegender Nucleinsäure aus Proben mit einem großen Volumen und zum Kombinieren der Extraktion und Reinigung mit einer Amplifikation oder Hybridisierung der eingefangenen Nucleinsäure. Kommerzielle Anwendungen umfassen Nucleinsäure-Tests mit hohem Durchlauf, die von einer Roboter-Automation profitieren würden, oder ein wirtschaftliches Screening von selten vorkommenden Zielen anhand von Tests gepoolter Proben. Weiterhin kann die Festphase-gebundene Nucleinsäure durch Enzym-, Hybridisierungs- oder Amplifikationsreaktionen direkt manipuliert werden, und zwar nicht nur einmal, sondern mehrmals. Somit bietet sich die vorliegende Erfindung weiterhin für Anwendungen an, bei denen eine biologische Probe in einer begrenzten Menge vorliegt und/oder möglicherweise nicht ersetzbar sein könnte, und bei denen die erneute Analyse entweder unmittelbar oder nach der Lagerung der ursprünglichen Probe von Vorteil ist. Bereiche, wo dies zutrifft, umfassen z.B. forensische Untersuchungen, die medizinische und biologische Forschung, tiermedizinische oder menschliche klinische Diagno stika, Zahnmedizin-, Umwelt-, Lebensmittel- oder Wasser-Mikrobiologie und landwirtschaftliche oder andere industrielle Anwendungen.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind aus der folgenden genauen Beschreibung in Verbindung mit den beiliegenden Figuren ersichtlich, welche beispielhaft die Prinzipien der vorliegenden Erfindung erläutern.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Balkendiagramm, welches die prozentuale Bindung von 1 ng ³²P-radiomarkierter DNA an 198 mg von entweder Aluminiumoxid oder Aluminiumhydroxid nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur unter Rühren in Wasser, 0,1 N Natriumhydroxid- (NaOH-) oder 4 M Guanidinthiocyanat- (GuSCN-) Bindungspuffern erläutert.
2 zeigt die Wirkung von steigenden DNA-Konzentrationen auf die Bindungseffizienz von ³²P-markierter DNA an 198 mg Aluminiumoxid nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur unter Rühren in Wasser, 0,1 N NaOH- oder 4 M Guanidinthiocyanat-Bindungspuffern.
3 macht deutlich, dass die an Aluminiumoxid gebundene DNA irreversibel gebunden ist, wobei sogar noch nach zehn Waschgängen mit entweder 70 % EtOH, Wasser oder PCR-Puffer bei 95°C mehr als 90 % zurückgehalten werden.
4 vergleicht die Wirkung von Fließrate und Konzentration auf die DNA-Bindung an Siliciumdioxid gegenüber Aluminiumoxid.
Die 5a und 5b erläutern die gleichzeitige Bindung von 106 Kopien von HIV-DNA und 1 μl eines Plasmidpräparats von Mycobacterium-DNAs an Aluminiumoxid in Wasser, gefolgt von einer direkten Festphasen-Amplifikation der zwei Ziele nacheinander. HIV wurde eingangs unter Verwendung von 35 Zyklen einer Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert, gefolgt von einer Amplifikation des Mycobacterum-Ziels unter Verwendung von Strangverdrängungs-Amplifikation („strand displacement amplification", SDA). 5a zeigt ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarose-Gel eines HIV-Amplifikationsprodukts. Vertiefung 1 ist eine Molekulargewichts-Leiter, die Vertiefungen 2 und 3 sind positive wässrige 1000 Kopie Kontroll-Amplifikationen, die Vertiefungen 4, 5, 6 und 7 sind Aluminium-Festphasen-PCR-Amplifikationen, die Vertiefungen 8, 9, 10 und 11 sind negative Aluminium-Festphasen-Kontrollen, die Vertiefungen 12 und 13 sind wässrige negative Kontrollen. 5b zeigt ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarose-Gel der SDA-Amplifikationsprodukte. Die Vertiefungen 1 und 2 sind wässrige positive Kontrollen, die Vertiefungen 3, 4, 5 und 6 sind Aluminium-Festphasen-SDA-Amplifikationen, die Vertiefungen 7, 8, 9 und 10 sind negative Aluminium-Kontrollen, und 11 und 12 sind wässrige negative Kontrollen.
6 zeigt die exzellente Amplifikation von Aluminium-gebundener RNA nach einer Ethidium-Färbung eines Agarose-Gels des rtTH-PCR-Produkts, hergestellt aus HIV-RNA-Guanidin, extrahiert aus 0,5 ml Plasma eines AIDS-Patienten. Vertiefung 1 = eine Molekulargewichts-Leiter, Vertiefungen 2 = 1000 Kopie positive wässrige Kontroll-HIV-DNA, Vertiefungen 3, 4 und 5 = rtTH-PCR-Produkt nach drei getrennten Guanidin-Aluminiumoxid-Extraktionen, Vertiefungen 6 und 7 = negative Aluminiumoxid-Kontrollen, Vertiefung 8 = wässrige negative Kontrolle.
7 zeigt das mit Silber gefärbte Muster für das Primega STR CTT Multiplex, welches den vierten amplifizierten Gensatz darstellte, und das Promega FFV Multiplex, welches den fünften amplifizierten Gensatz darstellte. Die Bahnen 1, 8, 9 und 16 sind Allel-Leitern, Bahn 17 ist eine menschliche genomische wässrige positive Kontrolle, die Bahnen 2, 3 und 4 sind die vierte Amplifikation (CTT Multiplex) auf Aluminiumoxidgebundener DNA, die Bahnen 5, 6 und 7 sind die negativen Aluminium-CTT-Kontrollen, die Bahnen 10, 11 und 12 sind die fünften Aluminiumoxid FFV Multiplex Amplifikationsprodukte, die Bahnen 13, 14 und 15 sind die negativen Aluminium-FFV-Kontrollen.
8 zeigt die prozentuale radiomarkierte DNA, gebunden entweder an Aluminiumoxid oder an Siliciumdioxid bei verschiedenen Ausgangsvolumina und bei unterschiedlichen Fließraten.
9 zeigt eine Festphasen-PCR-Amplifikation, wie durch EtBr-Agarose-Gel bestätigt, unter Verwendung von HLA-DR-beta-Primern nach einem irreversiblen Einfangen für unterschiedliche Einfangzeiten nach Zusatz von 50 μl ACD-antikoaguliertem Blut in Gegenwart von 0,1 NaOH und Aluminiumoxid.
10 ist ein PCR-Amplifikationsröhrchen, enthaltend Festphasen-Bindungsmaterial für eine automatisierte Nucleinsäure-Extraktion.
11 erläutert die Grenze eines PCR-Amplifikations-Nachweises für ein reines RNA-Ziel (pAW 109) nach einer direkten Bindung an Aluminiumoxid oder nach einer Hybridisierung an eine irreversibel an Aluminiumoxid gebundene Oligonucleotid-Einfang-Sonde.
12 zeigt den Nachweis einer niedrigen Kopienzahl von HIV, enthalten in 5,5 ml Plasma, nach Guanidium-Extraktion und Hybridisierungs-Einfangen an Aluminiumoxid-HIV-Einfang-Perlen bei einem endgültigen Hybridisienangs-Reaktionsvolumen von 28 ml.
Genaue Beschreibung der bevorzugen Ausführungsform
Es ist so zu verstehen, dass sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende genaue Beschreibung lediglich als Beispiele und zur Erklärung dienen sollen und die Erfindung wie beansprucht dadurch in keiner Weise eingeschränkt werden soll.
Die allgemeinen Prinzipien und Bedingungen für Manipulationen, umfassend Hybridisierung und Amplifikation, sind dem Fachmann bekannt. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Einfangen und irreversiblen Binden von Nucleinsäu re an eine Festphasenmatrix, und zwar unmittelbar und bei hohen Fließraten. Die Bindung erfolgt sowohl für DNA als auch für RNA sogar bei großen Volumina und niedrigen Zielkonzentrationen. Eine ineversibel gebundene Nucleinsäure kann stringenten wässrigen Waschgängen unterworfen werden, für eine spätere Analyse gelagert werden und wiederholt amplifiziert oder auf andere Weise analysiert werden, ohne dass eine Elution erfolgt und ohne dass ein signifikanter Verlust an gebundener Nucleinsäure auftritt. Eine wiederholte Festphasen-Manipulation, die gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann, ist diejenige einer beliebigen Nucleinsäure.
Der Fachmann weiß, dass eine irreversible Nucleinsäure-Bindung, wie hier offenbart, in einem breiten Spektrum von biologischen Proben durchgeführt werden kann. Solche Proben umfassen z.B. biologische Proben aus landwirtschaftlichen Quellen, bakterieller und viraler Herkunft und solche, die vom Menschen oder von anderen Tieren stammen, sowie andere Proben, wie Abwasser oder Trinkwasser, landwirtschaftliche Produkte, verarbeitete Lebensmittel und Luft. Insbesondere umfassen Proben z.B. Blut, Stuhl, Sputum, Schleim, Zervix- oder Vaginalproben, Zerebrospinalflüssigkeit, Serum, Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Biopsieproben, histologische Gewebeproben, ein Gewebekultur-Produkt, ein landwirtschaftliches Produkt, Abwasser oder Trinkwasser, Lebensmittel und Luft. Die vorliegende Erfindung ist für die irreversible Bindung von Nucleinsäure an eine Festphasenmatrix aus einer beliebigen Probe, die Nucleinsäure enthält, welche entweder natürlich vorkommt oder als Verunreinigung vorliegt, geeignet.
In der vorliegenden Beschreibung werden verschiedene Begriffe verwendet, für die es hilfreich sein kann, Definitionen zu haben. Diese werden hier bereitgestellt und sollten einem geläufig sein, wenn diese Begriffe in den folgenden Beispielen und in der ganzen vorliegenden Anmeldung verwendet werden.
Der hier verwendete Begriff „Archivieren bzw. Archivierung" bezieht sich auf die Analyse von Nucleinsäure, die irreversibel an eine Festphasenmatrix gebunden ist, anhand von prozeduralen Manipulationen, worauf die Lagerung der gebundenen Nucleinsäure folgt. Die Lagerung umfasst sowohl die Möglichkeit für eine spätere Analyse als auch für eine wiederholte Analyse der gleichen Nucleinsäure, und außerdem eine erweiterte Analyse von mehreren Nucleinsäure-Zielen, entweder gleichzeitig oder nacheinander. Hierfür umfassen prozedurale Manipulationen z.B. Festphasen-Nucleinsäure-Enzymreaktionen, Oligonucleotid- oder Sondenhybridisierung und/oder Signal- oder Ziel-Amplifikationsreaktionen.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff ein „Matrizen-abhängiges Verfahren" ist als ein Verfahren definiert, das entweder die Matrizen-abhängige Erkennung anhand einer spezifische Sonde, das Kopierverfahren anhand einer Signal-Amplifikationsreaktion oder eine Zielexpansion anhand einer Matrizen-abhängigen Verlängerung eines Primermoleküls umfasst. Eine Matrizen-abhängige Verlängerung be zieht sich auf eine Nucleinsäuresynthese und Kopieexpansion von RNA- oder DNA-Zielsequenzen, wobei die Sequenz des neu synthetisierten Nucleinsäurestrangs durch die Regeln der komplementären Basenpaarung der Zielnucleinsäure und der Primer vorgeschrieben wird. Ein Matrizen-abhängiges Verfahren, das auf der komplementären Basenpaarung beruht, insbesondere unter Verwendung von Oligonucleotiden oder Sonden einer spezifischen Sequenz, ist als „Hybridisierungs"-Nachweis bekannt.
Ein „Primer"-Molekül bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die zu einem bekannten Teil der Zielsequenz/Kontrollsequenz komplementär ist, welcher erforderlich ist, um die Synthese durch DNA- oder andere Polymerasen zu initiieren.
„Ziel-Nucleinsäuresequenz" bezieht sich auf das Nucleinsäuremolekül, das nachgewiesen oder amplifiziert werden soll. Das Zielmolekül kann in einem gereinigten, teilweise gereinigten oder nicht-gereinigten Zustand in der Probe vorliegen.
„Einfangen" bezieht sich auf das Binden von Nucleinsäure an eine Festphasenmatrix. Das Binden kann in geeigneten Puffern, basierend auf den chemischen/physikalischen Eigenschaften von Nucleinsäure, direkt erfolgen. Andererseits kann das Einfangen zielspezifisch erfolgen, indem Sonden irreversibel an eine Festphasenmatrix gebunden werden, worauf eine spezifische Hybridisierung folgt.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zum Einfangen und irreversiblen Binden von Nucleinsäure an eine Festphase und zur anschließenden Festphasen-Manipulation. Ungeachtet der spezifischen Anwendung der vorliegenden Erfindung werden die methodischen Einzelheiten gemäß Protokollen, die dem Fachmann bekannt sind, und solchen, die hier offenbart sind, berechnet. Weiterhin kann die Vervollkommnung der erforderlichen Berechnungen routinemäßig vom Fachmann durchgeführt werden und liegt im Umfang der Aufgaben, die routinemäßig von ihm ohne ein übermäßiges Experimentieren durchgeführt werden können.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt spezifische Anwendungen des irreversiblen Bindens von Nucleinsäuren an Festphasen-Stoffe. Die bekannten spezifischen Bindungsstoffe sind durch die atomare Struktur mit einer hohen Elektropositivität charakterisiert, die hydrophil gemacht wurden. Diese Stoffe wurden früher vom Fachmann als ungeeignet für die Nucleinsäureanalyse angesehen, da die Nucleinsäure nicht eluiert werden kann. Dagegen wird in der vorliegenden Erfindung diese irreversible Bindung für spezifische Anwendungen genutzt.
Für den Fachmann wird klar sein, dass die vorliegende Erfindung vielfältig auf Nucleinsäure-Extraktion, Reinigung und Nachweis angewendet werden kann. Die folgenden Beispiele dienen dazu, die vorliegende Erfindung zu erklären und zu erläutern. Die Beispiele sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken. Verschiedene Modifikationen sind innerhalb des Umfangs der Erfindung möglich.
Beispiel 1: Material und Methoden
Die DNA-Bindung wird unter Verwendung einer Radiomarkierung mit ³²P gemessen. Das 4361 Basenpaar PBR322-Plasmid, erhalten von New England Biolabs, wird unter Verwendung des Prime-It II Stratagene Kits durch „Random Priming" markiert. Das Plasmid wird mit HindIII gespalten, nicht-markierte Nucleotide werden unter Verwendung von BioRad Biospin 6 entfernt, und eine Konzentration von 1 Nanogramm pro Mikroliter (ng/μl) wird eingestellt. Höhere DNA-Konzentrationen werden durch Zugabe von Lachssperma-DNA eingestellt. Die Werte der Radiomarkierungsexperimente stellen den Mittelwert aus fünf Replika-Messpunkten dar.
Aluminiumoxid (74 bis 149 μm Größe), erhalten von Aldrich (Katalog Nr. 34 265-3), wird mit 0,1 N NaOH eine Stunde bei Raumtemperatur behandelt, um Aluminiumhydroxid herzustellen. Verwendet werden DNA-Bindungspuffer, bestehend aus Wasser (ddH₂O), 0,1 N NaOH oder einem 4 M Guanidinthiocyanat-Puffer (12 g GuSCN, 277 μl Triton^TM X-100, 2,2 ml 0,2 M EDTA, pH 8,0, und 10 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 6,4). Die Bindung wird entweder durch Rotation in einem geschlossenen Zentrifugenröhrchen oder durch Filtration mit Hilfe der Schwerkraft („gravity flow") zugelassen. Größe Perlen setzen sich ohne Zentrifugation sogleich am Boden des Röhrchens ab und erleichtern somit das Waschen. Für Experimente mit Hilfe der Schwerkraft („gravity flow") wird ein Spectrum SpectraMesh 43 μm Filter (Spectrum, Katalog Nr. 146530) in eine ANSYS 4 mM Chromatographie-Säule eingepasst. Die Aluminiumperlen werden als flüssige Aufschlämmung in diese Säule gepackt, man lässt sie ablaufen, trocknen, sie werden einmal mit 1 ml 70 % EtOH gewaschen und vor der Zugabe der DNA in den verschiedenen Bindungspuffern getrocknet.
Zur Erläuterung der Festphasen-Amplifikation werden veröffentlichte Sequenzen und Verfahren für gut charakterisierte Loci verwendet. Außerdem sind alle in den vorliegenden experimentellen Verfahren verwendeten Sequenzen in Tabelle I aufgelistet (SEQ ID NOs: 1 bis 10). Insbesondere werden für die PCR von HIV der SK38/SK39 Primersatz (Kellog und Kwok, (1990), in: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, M. A., et al., Hrsg., Academic Press Inc., S. 337-347, hier durch Bezugnahme spezifisch eingeschlossen, SEQ ID NO: 8 bis 9, vgl. Tabelle I), das Kontroll-HIV-DNA-Plasmid, erhalten von Perkin Elmer (Katalog Nr. N808-0016), und rtTH reverse Transcriptase Amplifikation verwendet. In der Strangverdrängungs-Amplifikation werden das Mycobacterium-Plasmid-Ziel und Primersätze verwendet, die von Walker et al. beschrieben sind, (1996), Clinical Chemistry 42: 9-13, hier durch Bezugnahme spezifisch eingeschlossen, (SEQ ID NOs: 4 bis 7, vgl. Tabelle I). Die menschliche kurze direkte (tandemartige) Sequenzwiederholungs- („short tandem repeat", STR) Primersätze und Protokolle sind diejenigen, die von Promega kommerziell verfügbar sind, CTT und FFV Multiplexes.
Beispiel 2: Bestätigung einer irreversiblen Festphasen-Bindung von DNA
Radiomarkierte DNA (1 ng) lässt man entweder an Aluminiumoxid oder an Aluminiumhydroxid bei Raumtemperatur unter Rotation für eine Stunde in Wasser (ddH₂O), 0,1 N NaOH oder 4 M Guanidin-Puffer binden. Die DNA bindet an Aluminiumoxid in Wasser oder Guanidin. Die Bindung wird durch Verwendung entweder von NaOH als Bindungspuffer oder von Aluminiumhydroxid-Perlen stark gesteigert (1). Um die Bindungskapazität von 198 mg Aluminiumoxid zu bestimmen, wird 1 ng radiomarkierte DNA zu verschiedenen Konzentrationen von Lachssperma-DNA zugegeben. Insbesondere wird mit diesem Verfahren der Punkt bestimmt, an dem es zur Sättigung des Aluminium kommt, so dass die Bindung von radiomarkierter DNA blockiert wird (2). Die Wasser-Bindung ist bei 50 ng gesättigt, und beim Guanidin erfolgt dies im Bereich von 50 ng bis 5000 ng. Die Natriumhydroxid-Bindung ist bis 100 000 ng nicht gesättigt. Wenn man also Aluminium mit NaOH hydrophil macht, wird auf diese Weise sowohl seine Bindungseffizienz als auch seine Gesamtkapazität stark erhöht. Die Irreversibilität der DNA-Bindung wird gezeigt, indem die Radiomarkierung gezählt wird, die nach zehn aufeinander folgenden Waschgängen entfernt wird (3). Wie in 3 erläutert, bleibt die DNA nach zehn Waschgängen mit 95°C PCR-Puffer fest gebunden, und zwar mit einer Retention von 92 %. Die Elution des Großteils der eluierten Zählimpulse, 6 %, findet während der ersten vier Waschgänge statt, und nur eine Elution von insgesamt 2 % erfolgt während der letzten sechs Waschgänge. Deshalb kann eine Aluminium-gebundene DNA einfach wässrigen Waschgängen und Pufferaustauschen unterworfen werden, ohne dass eine Zentrifugation erfolgen muss und ohne dass die Gefahr besteht, dass die DNA verlorengeht. Die Festphasen-gebundene Nucleinsäure, selektiert aus Proben mit einem großen Volumen, kann gewaschen und danach bei einem beliebigen gewünschten Volumen resuspendiert werden. Z.B. kann die DNA aus einer 3 Milliliter (ml) Probe, enthaltend Guanidin, absorbiert werden, mit Phosphat- oder Tris-Puffer gewaschen werden, und danach können die Perlen in kleinen Volumina Amplifikations-Reaktionsgemischen (50 μl) resuspendiert werden. Durch diese Eigenschaften wird ein Verfahren bereitgestellt, mit dem das Kombinieren von DNA-Reinigung und Amplifikation erleichtert wird.
Beispiel 3: Chromatographie mit Hilfe der Schwerkraft ("gravity flow")
Eine signifikante Verbesserung in der Empfindlichkeit des DNA-Nachweises aus Proben mit großem Volumen und niedriger Konzentration wird aufgrund der Fähigkeit von Aluminium erhalten, die DNA durch Chromatographie bei einer hohen Fließrate effizient zu absorbieren. Radiomarkierte DNA lässt man während der Schwerkraft-Filtration von entweder 74 bis 149 μm Aluminiumoxid-Perlen oder 150 bis 212 μm Siliciumdioxid-Perlen (Sigma, Katalog Nr. GI 145) absorbieren (4). Die Menge an Silicium und Aluminium wird so eingestellt, dass sie beide die gleiche Oberfläche, die für die DNA-Bindung verfügbar ist, aufweisen. Die DNA (50 ng) bindet während der Schwerkraft-Filtration, wobei sie entweder in 1 ml (1,5 bis 2 Minuten Durchflusszeit, etwa 0,5 ml/Min.) oder in 10 ml (5 bis 8 Minuten Durchflusszeit, etwa 2 ml/Min.) verdünnt wird. Aluminium ist bei der Bindung von DNA während der Chromatographie mit Hilfe der Schwerkraft des 1-ml-Volumens viel wirksamer (SiO₂ = 6 % gegenüber AIOX = 52 %, beide in 4 M Guanidin-Bindungspuffer). Die Bindungseffizienz für sowohl SiO₂ als auch AIOX verbessert sich mit 1 ml NaOH-Bindungspuffer (SiO₂ = 12,4 % gegenüber AIOX = 60 %). Durch Erhöhen der Fließrate auf das Vierfache unter Verwendung des Volumens von 10 ml und Beginn mit den gleichen 50 ng DNA (d.h. eine zehnmal niedrigere Konzentration pro ml als bei der 1-ml-Probe) wird die Bindungseffizienz von Siliciumdioxid drastisch auf weniger als 2 % reduziert. Im Gegensatz dazu findet bei Aluminium nur eine Reduktion von 10 % in der Gesamtausbeute von Zählimpulsen statt. Weitere experimentelle Verfahren zeigen, dass beim Aluminiumoxid durch Wiederholen der Chromatographie unter Verwendung einer zweiten und dritten Passage der Probe mit großem Volumen eine Effizienz der Bindung von bis zu 80 % erhalten wird. Aluminium ist im Vergleich zu Silicium für die Festphasen-DNA-Bindung deutlich besser geeignet und ist in der Lage, DNA bei hohen Fließraten und niedrigen Konzentrationen chromatographisch einzufangen. Diese Eigenschaft macht die Verwendung von Aluminiumoxid zum Konzentrieren von DNA aus gepoolten Proben oder aus Proben mit großem Volumen möglich und stellt eine stark erhöhte Empfindlichkeit des DNA-Nachweises pro ml bereit. Außerdem ist die hohe Affinität von Aluminium für DNA zum Entfernen von in niedrigen Spiegeln vorliegenden DNA-Verunreinigungen aus Wasser, Puffern und anderen Reagenzien nützlich.
Beispiel 4: Festphasen-Amplifikation
Da diese Nucleinsäurebindung irreversibel ist, ist Aluminium nur dann geeignet, wenn die gebundene DNA direkt an der Festphase amplifiziert werden kann. Um die Kompatibilität mit verschiedenen Amplifikationsverfahren zu erläutern, werden 10⁶ Kopien von HIV-DNA und 1 μl eines Plasmidpräparats von Mycobacterium-DNAs gleichzeitig an Aluminiumoxid in Wasser gebunden. Diese gebundenen DNA-Ziele werden sodann nacheinander amplifiziert, wobei HIV anfangs unter Verwendung von 35 Zyklen einer Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert wird, und sodann die Amplifikation des Mycobacterium-Ziels anhand einer Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA) folgt. Ein mit Ethidiumbromid (EtBr) gefärbtes Agarose-Gel der HIV-PCR, dargestellt in 5a, zeigt ein ausgezeichnet gutes Amplifikationsprodukt. Nach der HIV-PCR-Amplifikation wird das Aluminium viermal mit 70 % EtOH gewaschen, zehn Minuten bei 55°C getrocknet, und sodann wird eine SDA-Amplifikation für das Mycobacterium-Ziel durchgeführt. Ein EtBr-gefärbtes Agarose-Gel der SDA-Amplifikation zeigt auch, dass das Amplifikationsprodukt in äquivalenten Spiegeln wie bei den wässrigen Kontrollen vorliegt (5b). Weitere experimentelle Verfahren zeigen, dass die Mycobacterium-Plasmid-DNA unter Verwendung von entweder 4 M Guanidin- oder 0,1 N NaOH-Bindungspuffern an Aluminium gebunden wird und die SDA-Amplifikation an diesen Festphasen stattfindet.
Es ist allgemein bekannt, dass alkalische Bedingungen Einzelstränge produzieren. Außerdem liegt DNA in 4 M Guanidin einzelsträngig vor (Thompson und Gillespie, (1987), Analytical Biochemistry 163: 281-291). Die SDA-Amplifikation einer an Aluminiumoxid gebundenen DNA läuft in NaOH- oder Guanidin-Puffer ohne einen Schmelzschritt ab. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die DNA in diesen Bindungspuffern als Einzelstränge gebunden ist, wodurch ein direktes Kombinieren einer DNA-Reinigung mit Aluminiumoxid und isothermalen Amplifikationsverfahren, für die eine einzelsträngige Ziel-Nucleinsäure erforderlich ist, möglich wird.
Um zu erläutern, dass Aluminiumoxid auch in der Lage ist, RNA effizient zu binden, wird der 4 M Guanidin-Bindungspuffer eingesetzt, um HIV direkt aus einer ACD-Plasmaprobe eines AIDS-Patienten mittels Aluminiumoxid zu reinigen. Für diese Probe wurde vorher durch quantitative PCR die Virusbelastung bestimmt, wobei ein Titer von 2 × 10⁴ RNA-Kopien pro ml festgestellt wurde. Für die Aluminium-Extraktion werden 0,5 ml Plasma, die in 4 M Guanidinthiocyanat-Bindungspuffer auf 5 ml verdünnt werden, verwendet, und anschließend erfolgt eine Schwerkraft-Filtration auf 40 mg Aluminiumoxid. 6 zeigt die außerordentlich gute Bildung des PCR-Produkts, das auf einem EtBr-gefärbten Agarose-Gel nach einer rtTH reversen Transcriptase-Amplifikation nachgewiesen wurde. Das 4-M-Guanidin-Protokoll ist in der Lage, RNA aus den im Plasma vorliegenden HIV-Virionen freizusetzen, und diese wird dann anhand einer Schwerkraft-Filtration mit einem großen Volumen (5 ml) auf Aluminiumoxid in einem amplifizierbaren Zustand eingefangen. Aluminiumoxid bindet Nucleinsäuren im Allgemeinen.
Beispiel 5: DNA-Archivierung
Durch das Kombinieren von irreversibel gebundener Nucleinsäure und der direkten Festphasen-Amplifikation ist es möglich, die gleiche DNA-Probe unendliche Male wiederholt zu analysieren. Um diesen Punkt zu erläutern, werden 10 μl ACD-Blut an Aluminium in 4 M Gunanidin-Puffer gebunden. Danach wird die gebundene DNA fünfmal, jeweils 30 Zyklen, PCR-amplifiziert, wobei fünf sequentielle kurze direkte (tandemartige) Sequenziederholungs- (STR-) Marker von Promega verwendet werden. Die Reihenfolge der Amplifikation ist wie folgt: 1) F13B, 2) FESFPS, 3) VWA, 4) CTT Multiplex, und 5) FFV Multiplex. Nach dem letzten Amplifikationssatz hat die DNA-Probe insgesamt 150 PCR-Zyklen durchlaufen. Die Ergebnisse, die in dem Silber-gefärbten Gel von 7 dargestellt sind, machen deutlich, dass die Amplifikation bei allen fünf PCRs stattfindet, wodurch eine DNA-Archivierung oder wiederholte Festphasen-Aluminium-Amplifikation der gebundenen DNA bestätigt wird.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die DNA auf Aluminiumoxid archiviert wird, so dass sie für eine weitere Amplifikationsanalyse verfügbar ist. Dies umfasst eine wiederholte Analyse des gleichen Gens, eine serielle Amplifikation verschiedener Gene, z.B. um unterschiedliche infektiöse Agenzien nachzuweisen, oder eine erweiterte Analyse, z.B. für eine bessere Unterscheidungsmöglichkeit bei der Analyse der Identität von Menschen.
Beispiel 6: Puffer, welche die irreversible Bindung von Nucleinsäure an Aluminiumoxid entweder fördern oder blockieren
Radiomarkierte DNA (50 ng) wird zu 500 μl wässrigen Lösungen der in Tabelle I aufgeführten verschiedenen Substanzen in Gegenwart von 198 mg Aluminiumoxid zugegeben. Um die Bindung ausschließlich der radiomarkierten DNA genauer zu messen, werden freie nicht-eingebaute Nucleotide, die nach der Biospin-6-Reinigung verbleiben, anhand einer TCA-Fällung bestimmt. Wie in Tabelle I unter Verwendung dieses korrigierten Verfahrens dargestellt ist, bindet DNA an Aluminiumoxid mit einer Effizienz von 100 % in entweder 4 M Guanidium oder Natriumhydroxid. Bestimmte andere Substanzen und/oder Bedingungen blockieren die Bindung von DNA vollständig. Diese umfassen in Tabelle I z.B. 10 % Rinderserumalbumin oder K₂HPO₄. Da sowohl die Bindungsals auch die Blockierungsbedingungen definiert wurden, ist es somit möglich, spezifische Oligonucleotide oder Sonden einfach und spezifisch irreversibel zu binden und danach die Blockierungspufferbedingungen zu ändern, so dass ein Ziel-spezifisches Einfangen durch Hybridisierung möglich wird. Das heißt, Phosphat- oder andere Puffer, welche die Bindung von Nucleinsäure an Aluminiumoxid vollständig verhindern, stellen die Grundlage von Hybridisierungspuffern mit einem niedrigen Hintergrundsignal für eine irreversibel gebundene Nucleinsäure bereit; das hybridisierte Ziel wird entfernt, und die an die Festphase gebundene Einfang-Sonde wird mehrmals wiederverwendet. Es ist bekannt, dass RNA in 0,1 N NaOH zerstört wird. Deshalb wird unter Verwendung dieses Bindungspuffers ausschließlich DNA eingefangen. Ein effizienter Zellaufschluss und eine schnelle Nucleinsäure-Bindung sowohl mit Guanidium- als auch mit Natriumhydroxid-Puffern ist wirksam für Blut, Wangenabstriche, Urin und HIV-Virionen, gespickt in Plasma- oder Serumproben. Jedoch ist es für bestimmte infektiöse Organismen, wie Cryptosporidium parvum, erforderlich, die Probe auf 95°C zu erhitzen und Protein-Reduktionsmittel, wie Dithiothreitol (DTT), zuzugeben, um die Zelle effizient aufzuschließen (SEQ ID NOs: 1 bis 3, vgl. Tabelle II).
Beispiel 7: Unmittelbare Bindung bei hoher Fließrate und Einbau von Aluminiumoxid in PCR-Röhrchen
Die Fähigkeit von Aluminiumoxid, DNA bei hohen Fließraten zu binden, wird gemessen, indem die gleichen Gesamt-cpm von radiomarkierter DNA, suspendiert in 1 ml, 5 ml oder 10 ml 4 M Guanidium-Puffer, verwendet werden und diese entweder durch Aluminiumoxid oder durch Siliciumdioxid bei gemessenen Fließraten passiert werden. Die in 8 gezeigten Ergebnisse bestätigen, dass Aluminiumoxid dem Siliciumdioxid deutlich überlegen ist. Aluminiumoxid bindet Nucleinsäure wirksam bei Proben mit niedriger Konzentration und großem Volumen (10 ml) bis zur 1-ml-Probe mit der zehnfach höheren ml-Konzentration und dem zehnfach kleineren Volumen. Die DNA-Bindung erfolgt unmittelbar, wie durch die in 9 dargestellten experimentellen Ergebnisse erläutert wird. Hier werden 50 μl eines ACD-antikoagulierten Bluts zu aluminiumoxid in 0,1 N NaOH-Bindungspuffer zugegeben, und das HLA-DR-beta-Gen wird aus der Festphasen-gebundenen DNA entweder unmittelbar oder nach Zulassen verschiedener Inkubationszeiten zum Binden der DNA PCR-amplifiziert. Die Bindung, die durch die Wirksamkeit der Amplifikation gezeigt wird, ist für die unmittelbaren, 1- oder 2-Minuten-Zeitpunkte identisch. Diese experimentellen Ergebnisse sind die Grundlage für ein extrem günstiges und schnelles Protokoll für eine automatisierbare Nucleinsäure-Extraktion, die direkt mit einer PCR-Amplifikation kombiniert wird. Hierfür wird das Aluminiumoxid anhand eines Silicium- oder anderen Klebemittels, für das gezeigt wurde, dass es die PCR nicht hemmt, in den PCR-Röhrchen angeheftet, wie in 10 dargestellt ist. Alternativ kann es für einen höheren Durchsatz in eine 96-PCR-Röhrchen-Platte eingebracht werden. Jede dieser Alternativen macht eine einfache Nucleinsäure-Extraktion durch ein Protokoll möglich, das aus den folgenden Schritten besteht: 1) Zufügen von Bindungspuffer zu dem Aluminiumoxid-PCR-Röhrchen, 2) Zufügen einer Probe zu jedem Röhrchen, Mischen und danach Absaugen der Flüssigkeit und Verwerten, 3) Waschen durch wiederholtes Pipettieren von Waschpuffer (dreimal), danach Absaugen des Waschpuffers und Verwerfen, 4) Zufügen von PCR-Amplifikations-Stammgemisch, und 5) Amplifizieren in einem Thermozykler. Die Pipettierschritte dieses Protokolls können für einen hohen Durchsatz einfach automatisiert werden, indem ein Robotersystem eingesetzt wird.
Beispiel 8: Bestätigung der Bindung von reiner RNA an Aluminiumoxid
Beispiel 4 legte nahe, dass RNA an Aluminiumoxid ineversibel bindet und daran amplifiziert werden kann, dies beruhte auf dem Nachweis von HIV aus einer Plasmaprobe eines Patienten. Es ist möglich, dass dieses Ergebnis auf einer als Verunreinigung vorliegenden Provirus-DNA im Serum beruht. Die RNA-Bindung unter Verwendung eines reinen RNA-Ziels bestätigt eine irreversible Bindung und eine Festphasen-Amplifikation. 11 zeigt Ergebnisse der Amplifikation eines reinen pAW109-RNA- Ziels, an der Aluminiumoxid-Festphase gebunden in 4 M Guanidium-Puffer und rtPCR-amplifiziert. Die Bindung und Amplifikation von IL-2-mRNA und Cryptosporidium-dsRNA werden in ähnlicher Weise gezeigt.
Beispiel 9: Verwendung von irreversibel gebundener Nucleinsäure zum Einfangen eines spezifischen Ziels durch Hybridisierung
Mit Experimenten zur Bestimmung der Nachweisgrenze wird festgestellt, dass für einen Nachweis nach einer PCR-Amplifikation von Aluminiumoxid-gebundener DNA 1000 Kopien erforderlich sind, und bei gebundener RNA sind 10³ Kopien erforderlich (11). Die Nachweisempfindlichkeit wird bei Verwendung des Festphasen-Sonden-Einfangens und anschließender Hybridisierung sowohl für RNA als auch für DNA auf weniger als 100 Kopien signifikant verbessert. Ein in großer Kopienzahl vorliegendes Einfang-Oligonucleotid mit einer Länge von 20 bis 100 Basenpaaren, das zu einer an das gewünschte Amplifikations-Ziel angrenzenden Sequenz komplementär ist, wird irreversibel an Aluminiumoxid in 0,1 N NaOH-Puffer gebunden. Nach dem Waschen wird diese Einfang-Perle zum Hybridisieren mit dem Ziel eingesetzt, und zwar auch in Proben, die hohe Nucleinsäure-Hintergrundspiegel enthalten. Für dieses Verfahren wird die Probe mit 4 M Guanidium-Puffer aufgeschlossen und in Gegenwart der Festphasenmatrix, welche die Einfang-Sonde enthält, dreifach verdünnt. Die Hybridisierung wird zugelassen, und nach einem Waschschritt wird die Einfang-Perle, welche das hybridisierte Ziel enthält, direkt PCR-amplifiziert. Wie in 11 dargestellt, führt dies zu Nachweisgrenzen von 10 bis 100 Kopien des Ziels.
Beispiel 10: Einfangen von Zielen mit geringer Kopienzahl in Proben mit einem großen Volumen oder in gepoolten Proben
Das Hybridisierungs-Einfangen an eine Festphasen-Sonde lässt sich für die spezifische Selektion von Zielsequenzen auch mit anfänglich größeren Probenvolumina wirksam durchführen. Wie in 12 gezeigt wird, sind 1000 Kopien von HIV aus einer Plasmaprobe eines AIDS-Patienten mit den vorstehend beschriebenen Hybridisierungs-Festphasen-Einfang-Verfahren nachweisbar; und diese sind auch dann noch nachweisbar, wenn eine Verdünnung mit Plasma auf ein anfängliches Volumen von 5,5 ml erfolgt. Für die Extraktion wird das Plasma direkt zu dem trockenen Guanidium-Pulver zugegeben, um die Verdünnung so niedrig wie möglich zu halten. Mit dieser Anpassung beträgt das Endvolumen für die Hybridisierung mit der Einfang-Perle 30 ml. Außerdem wird positives HIV-Plasma mit einem Volumen von 100 μl mit weiteren 24 negativen 100-μl-Plasmaproben gepoolt, und es kann immer noch nachgewiesen werden. Pooling-Experimente wie dieses bestätigen eine Nachweisempfindlichkeit von 48 HIV-Virion-Kopien pro ml. Weitere Verfahren zeigten den Nachweis von 100 Kopien von Cryptosporidium, gepoolt in 30 ml Wasser. Das Hybridisierung-Verfahren anhand von Einfang-Perlen kann somit eingesetzt werden, um gepoolte Proben mit einer Empfind lichkeit zu screenen, die fast gleich gut ist wie diejenige für eine einzelne Probe, wobei dies ein enormes kommerzielles Potential hat, da hierdurch hochempfindliche Tests von gepoolten Proben möglich werden und dadurch die Kosten signifikant gesenkt werden können.
Beispiel 11: Lagerung von Nucleinsäure, nachdem sie irreversibel an Aluminiumoxid gebunden wurde
Die Nucleinsäure aus 50 μl ACD-Blut wird unter Verwendung von entweder 4 M Guanidium-Puffer oder 0,1 N NaOH-Puffer an Aluminiumoxid gebunden. Die gebundene Nucleinsäure wird anschließend entweder trocken, in 70 % EtOH oder in Tris-EDTA-Puffer bei Raumtemperatur, 4°C oder –20°C gelagert. Nucleinsäure ist im Allgemeinen bei allen diesen Bedingungen für drei Monate stabil, und möglicherweise unter Verwendung der vorliegenden Erfindung noch länger, vielleicht unbegrenzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bindung von RNA an Aluminiumoxid und verschiedene Anwendungen für Festphasen-gebundene DNA und/oder RNA. Dies umfasst Verfahren zur Verwendung von Aluminiumoxid oder eines anderen Materials, das Nucleinsäure irreversibel bindet, für ein Festphasen-Einfangen und lässt sich direkt mit verschiedenen Manipulationen kombinieren, wobei für diese Verfahren wässrige Puffer verwendet werden, und außerdem sowohl für einzelne als auch für der Reihe nach erfolgende Multiplex-Amplifikations- oder Hybridisierungs-basierte Reaktionen. Weiterhin ist das Einfangen von Nucleinsäure für den Zweck geeignet, eine als Verunreinigung vorliegende Nucleinsäure zu entfernen oder eine Nucleinsäure mit niedriger Kopienzahl anzureichern, um sie in einer Analyse entweder von großen Volumina oder von gepoolten Proben nachweisen zu können. Aluminiumoxid zeigt eine ausreichende Affinität für Nucleinsäure, um sie auch bei niedrigen Konzentrationen und hohen Fließraten, z.B. 5 ml/Min, zu binden. Somit ist die vorliegende Erfindung sowohl für ein Einfangen bei einem großen Volumen, für ein auf Schwerkraft basierendes Einfangen, oder ein Einfangen mit einer hohen Fließrate als auch für das Einfangen von Nucleinsäure in einer Art und Weise geeignet, das mit gründlichen wässrigen Waschgängen kompatibel ist, wodurch extrem saubere Nucleinsäure erhalten wird, die frei von Inhibitoren ist, welche möglicherweise Amplifikationsreaktionen stören könnten.
Die hier offenbarten Hybridisierungsreaktionen umfassen eine direkte Hybridisierung mit eingefangener Nucleinsäure in Form von Perlen und planen Oberflächen, wie Blots oder Microarray-Chips. Die Hybridisierung kann auch das spezifische Einfangen einer spezifischen Sequenz durch eine irreversible Bindung von Einfang-Sonden umfassen, z.B. Oligonucleotid, cDNA, cloniertes Plasmid, transkribierte oder synthetisierte RNA oder PNA, um die komplementäre Sequenz aus einer komplexen Probe zu selektieren, die einen hohen Hintergrundspiegel von unspezifischer Nucleinsäure aufweist. Die Methodik mit Einfang-Perlen ist für das Einfangen einer spezifischen Sequenz ge eignet, wie etwa durch Verwendung von Aluminiumoxid-gebundenen Poly-T-Oligonucleotiden, um Poly-A-messenger-RNA zu reinigen. Durch Verwendung des geeigneten Einfang-Oligonucleotids kann ein beliebiges spezifisches Nucleinsäure-Ziel selektiv entfernt werden und aus einer Vielzahl von Probentypen angereichert werden.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine Enzymerkennung, spezifische Manipulations- oder Amplifikationsreaktionen mit einer Nucleinsäure, die irreversibel an eine Festphase gebunden ist. Dies umfasst sowohl Ziel-Amplifikationsreaktionen, wie PCR, SDA, NASBA, IsoCR oder CRCA, als auch Signal-Amplifikationsreaktionen, wie Q-Beta-Replicase oder verzweigtkettige DNA. Außerdem werden hier der Einbau von Aluminiumoxid als eine Bindungssubstanz, die an der Oberfläche von Standard-PCR-Röhrchen angeheftet ist, und ein Protokoll zur schnellen Nucleinsäure-Extraktion beschrieben, das sich direkt und einfach mit PCR-Thermozyklus-Reaktionen unter Verwendung des gleichen Röhrchens kombinieren lässt. Die Röhrchen oder Gefäße stellen eine Plattform für die Automatisierung unter Verwendung von Hochdurchsatz-Robotern bereit.
Außerdem werden Puffersysteme diskutiert, welche die Verwendung von Aluminiumoxid für andere Nucleinsäure-Anwendungen möglich machen. Sie umfassen z.B. einen Guanidium-basierten Puffer, der ein spezifisches Reduktionsmittel enthält, welches extrem robuste Proben, wie Cryptosporidium, aufschließt. In diesem Puffer binden sowohl DNA als auch RNA effizient an Aluminiumoxid, und zwar mit einer Effizienz von fast 100 %. Ein weiteres Puffersystem betrifft alkalische Puffer, wie NaOH, welche einen schnellen und wirtschaftlichen DNA-Bindungspuffer bereitstellen. In diesem Puffer wird RNA zerstört, so dass hierdurch lediglich ein Mittel zur selektiven Bindung von DNA bereitgestellt wird. Noch ein anderes System umfasst Puffer, welche die Bindung von Nucleinsäure an Aluminiumoxid vollständig verhindern, z.B. Phosphatpuffer. Dieses Puffersystem stellt die Grundlage von Hybridisierungspuffern mit einem niedrigen Hintergrundsignal zu Rauschen für eine empfindliche und effiziente Microarray-, Perlen- oder Blot-Hybridisierung bereit.
Die Eigenschaften der irreversiblen Bindung von z.B. Aluminiumoxid machen eine wiederholte Analyse entweder der gleichen oder anderer Gene nacheinander möglich. Dies umfasst die Analyse von sowohl DNA als auch RNA gleichzeitig oder von DNA und RNA unabhängig voneinander, jedoch nacheinander. Außerdem kann das Einfangen mittels Hybridisierung durch die Bindung mehrerer Sonden für spezifische Ziele gleichzeitig mehrfach durchgeführt werden („multiplexed"). Somit ist die vorliegende Erfindung für eine wiederholte Analyse oder eine nacheinander erfolgende Analyse einer beliebigen Nucleinsäure entweder durch Hybridisierungs- oder durch Amplifikationsreaktionen geeignet. Sobald die Nucleinsäure irreversibel gebunden ist, ist sie stabil und kann für längere Zeiträume bei Raumtemperatur gelagert werden.
Während die vorliegende Beschreibung zahlreiche spezifische Formen enthält, sollten diese spezifischen Formen nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung angesehen werden, vielmehr dienen sie als Beispiele der bevorzugten Ausführungsform davon. Das heißt, die vorstehende Beschreibung der Erfindung ist beispielhaft und dient lediglich der Erläuterung und Erklärung. Der Fachmann kann, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen, verschiedene Änderungen und Modifikationen der Erfindung durchführen, um sie an verschiedene Anwendungen und Bedingungen anzupassen. Diese Änderungen und Modifikationen als solche sind rechtmäßig, recht und billig und sollen innerhalb des vollständigen Gleichwertigkeits-Bereichs der folgenden Patentansprüche liegen. Somit sollte der Umfang der Erfindung durch die beigefügten Patentansprüche und ihre erlaubten Äquivalente bestimmt werden, und nicht durch die hier bereitgestellten Beispiele. SEQUENZPROTOKOLL

Tabelle I Binden von radiomarkierter DNA an Aluminiumoxid
Tabelle II

Claims

Verfahren zum Archivieren von Nucleinsäure, umfassend: a) irreversibles Binden einzel- oder mehrsträngiger Nucleinsäure, die in einer wässrigen Probe enthalten ist, an eine Hochaffinitäts-Festphasenmatrix, die elektropositiv und hydrophil ist, wobei die Matrix Aluminiumoxid oder Aluminiumhydroxid enthält und durch Einstellen der Probe auf einen alkalischen pH-Wert oder eine hohe chaotrope Salzkonzentration hydrophil gemacht wird; b) Manipulieren der Festphasen-gebundenen Nucleinsäure unter Verwendung von Amplifikationsreaktionen; und c) Lagern der gebundenen Nucleinsäure auf der Festphasenmatrix.
Verfahren gemäß der Definition in Anspruch 1, wobei das irreversible Binden der Nucleinsäure an die Festphasenmatrix durch eine in großem Volumen erfolgende, auf Schwerkraft basierende oder mit hoher Fließrate erfolgende Festphasen-Chromatographie vor der Lagerung durchgeführt wird.
Verfahren gemäß der Definition in Anspruch 1, wobei die Festphasenmatrix Perlen oder plane Oberflächen darstellt.
Verfahren gemäß der Definition in Anspruch 3, wobei die an die plane Oberfläche gebundene Nucleinsäure in Form von Blots oder Microarrays vorliegt.
Verfahren gemäß der Definition in Anspruch 1, wobei die Probe im Wesentlichen aus Nucleinsäure und Puffer besteht.
Verfahren gemäß der Definition in Anspruch 5, wobei der Puffer einen Guanidium-basierten oder alkalischen Puffer umfasst.
Verfahren gemäß der Definition in Anspruch 1, wobei der pH-Wert mit Natriumhydroxid eingestellt wird.
Verfahren gemäß der Definition in einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die durchgeführte Amplifikationsreaktion eine Signal-Amplifikation oder Ziel-Amplifikation ist.
Verfahren gemäß der Definition in Anspruch 8, wobei die Amplifikationsreaktion aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus PCR, SDA, NASBA, IsoCR, CRCA, Q-Beta-Replicase und verzweigtkettiger DNA besteht.
Verfahren gemäß der Definition in Anspruch 9, wobei die Hybridisierung eine direkte oder spezifische Einfang-Hybridisierung ist.
Verfahren gemäß der Definition in einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Archivieren für die Verwendung in einem Standard-Polymerasekettenreaktions-Röhrchen adaptiert ist.