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WO1999057314A1 - Elektrische, integrierte nucleinsäureisolierung, -reinigung und -detektion - Google Patents

Elektrische, integrierte nucleinsäureisolierung, -reinigung und -detektion Download PDF

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Publication number
WO1999057314A1
WO1999057314A1 PCT/EP1999/003047 EP9903047W WO9957314A1 WO 1999057314 A1 WO1999057314 A1 WO 1999057314A1 EP 9903047 W EP9903047 W EP 9903047W WO 9957314 A1 WO9957314 A1 WO 9957314A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
nucleic acids
sample
affine material
dna
Prior art date
Application number
PCT/EP1999/003047
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen Bernhagen
Herwig Brunner
Frank Vitzthum
Bentsian Elkine
Georg Geiger
Günter Tovar
Original Assignee
Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19819889A external-priority patent/DE19819889A1/de
Application filed by Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. filed Critical Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
Priority to HU0101828A priority Critical patent/HUP0101828A3/hu
Priority to EP99923521A priority patent/EP1075548A1/de
Priority to US09/674,655 priority patent/US6511831B1/en
Priority to CA002330819A priority patent/CA2330819A1/en
Priority to JP2000547265A priority patent/JP2002513591A/ja
Priority to AU40366/99A priority patent/AU746005B2/en
Priority to IL13939499A priority patent/IL139394A/xx
Publication of WO1999057314A1 publication Critical patent/WO1999057314A1/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method and a device for isolating nucleic acids from a sample, in particular a biotic or abiotic material.
  • nucleic acids The specific or quantitative isolation of nucleic acids from certain starting materials plays an important role in a variety of scientific, industrial or other areas. Such areas are, for example, environmental analysis, forensics, basic research, food diagnostics, veterinary diagnostics, epidemiology, tumor diagnostics, genetic analysis, analysis of hereditary diseases and infectious diseases, disease monitoring, disease therapy, early detection of multiple drug-resistant germs, soil studies, search and development of pharmaceuticals and vaccines, agricultural engineering or the like.
  • the starting materials for the isolation of the nucleic acids can be just as varied as the fields of application, for example eukaryotic or prokaryotic cells or their homogenates, soil samples, blood samples, body fluids or tissue homogenates. Depending on this starting material or sample material, different digestion methods have to be used, for example in cells and / or cell nuclei
  • nucleic acids are isolated, for example by means of gel electrophoresis, ultracentrifugation or affinity chromatography.
  • nucleic acid diagnostics is based on nucleic acid isolation, ie sample preparation for the release of nucleic acids from biological material, nucleic acid purification, their detection and subsequent evaluation, see for example Lichtensteiger et al. , J. Clin. Microbiol. 34: 3035-3039 (1996).
  • the affinity chromatography which can be used for nucleic acid diagnostics is essentially based on the ability of nucleic acids to bind reversibly to positively charged and / or positively polar matrices.
  • an anionic or polar binding of the nucleic acids to the matrix is first achieved and then the nucleic acid is freed of impurities by using suitable solvents.
  • the nucleic acid bound to the matrix is detached from the matrix using a further solvent, for example with a higher ionic strength. Subsequently the nucleic acid isolated in this way must generally be deionized again in order to be able to be used for further investigations.
  • Both DNA and RNA are conventionally also isolated by means of ultracentrifugation, with protease and phenol treatments frequently having to be carried out.
  • This procedure has the disadvantage that high molecular weight DNA in particular is often still contaminated with proteins even after the isolation has been carried out and the molecules are exposed to the risk of breakage due to the acting shear forces.
  • the phenol treatment is also harmful to health and the environment.
  • Another method is based on the binding of nucleic acids to silica materials under high salt conditions, such as 6 M GdnSCN, which previously also served as a cell disruption agent.
  • the use of such substances is now disadvantageous because of their toxicity, viscosity and inhibition of subsequent processes such as PCR.
  • the gel electrophoresis that is often used for nucleic acid isolation also has comparatively cumbersome features, among other things - 4 -
  • the technical problem on which the present invention is based is therefore to provide an inexpensive and easy-to-carry out cell disruption and isolation method for nucleic acids which, from any biotic and / or abiotic sample material, provides highly specific nucleic acids in a particularly pure form in a single step during sample digestion.
  • this method should be able to isolate and purify quantitatively nucleic acids as a class of substances from many different individual individuals as well as specifically very specific nucleic acid sequences.
  • the invention solves this problem by providing a method for isolating nucleic acids from a sample, the sample being digested under the influence of at least one electrical field and the released nucleic acids being brought into contact with a nucleic acid-affine material in such a way that at least part of the nucleic acid can bind to the nucleic acid-affine material.
  • the invention relates in particular to a aforementioned method, in which a free or unbound or immobilized or immobilized nucleic acid-affine material is brought into contact with the sample after its electrically effected digestion such that a binding or hybridization of nucleic acids present in the sample to the nucleic acid-affine material can take place and where appropriate the - 5 -
  • bound nucleic acids can be detached from the nucleic acid-affine material after an optional washing step and, for example, amplified, detected or otherwise used. "Affine” can also mean the binding of nucleic acids to positively charged materials.
  • the invention thus provides an affinity-chromatographic method for isolating nucleic acids in which nucleic acids contained in a sample are brought into contact with a nucleic acid-affine material after digestion of the sample by means of at least one electrical field and this nucleic acid-affine material is specifically one, several or all or essentially binds all the nucleic acids contained in the sample, for example DNA or RNA, and thus isolates them from the other sample components such as proteins, carbohydrates, fats or nucleic acids etc. which may not be of interest.
  • the hybridization conditions to be observed such as temperature and buffer composition and / or the electrical parameters of the field such as pulse number, pulse frequency or field strength depend on the respective specific insulation task.
  • the invention therefore advantageously provides a one-step process, a sample being disrupted in the course of a single process step under the influence of at least one electrical field and the nucleic acids released and originally present in the sample being brought into contact with a nucleic acid-affine material simultaneously or subsequently, that depending used nucleic acid-affine material either quantitatively all or essentially all nucleic acids or only individual nucleic acid groups or individual specific nucleic acid sequences can be separated.
  • the invention enables a universally applicable, standardizable and automatable nucleic acid diagnosis for gene and genome analysis with a multitude of possible uses.
  • the procedure according to the invention is extremely rapid, the material expenditure to be used being low and the use of expensive and toxic substances being minimized. Finally, the risk of cross-contamination is reduced, so that the sensitivity of the process is high.
  • the method can be implemented inexpensively.
  • the method according to the invention also has the advantage that a high degree of purification of the nucleic acids is achieved in the nucleic acid isolation and purification that subsequently an amplification of nucleic acids without interference by amplification inhibitors and cross-contamination is possible, which would lead to false negative and false positive results . For example, electrical cell disruption can take place entirely without the addition of chemical disruption reagents, which in turn could interfere.
  • the sample is subjected to the influence of at least one electric field of constant voltage or a pulsed electric field to release the nucleic acids and / or lysis of the biological ones - 7 -
  • field strengths of 0.5 to 50, preferably 5 to 30 kV / cm, and pulse lengths or time constants of approximately 0.5 ⁇ s to 50 ms and, for example, 1 to 1,000,000, preferably 1,000 to 10,000, pulses can be used.
  • electrical parameters that deviate significantly therefrom can also be used.
  • the pulse shape can be, for example, rectangular, exponentially decreasing or sinusoidal, preferably in the radio frequency range.
  • the electrical field can be generated by alternating current as well as direct voltage. Usual electrical parameters are also described, for example, in US Pat. No. 5,447,733; US Pat. No. 5,235,905 or US Pat. No. 5,393,541, which in this respect are described in the present - 8th -
  • the field strengths to be used are preferably above the critical voltage V c across the membrane of the biological material. Further suitable conditions are, for example, in Vitztum et al. , FEBS Abstracts, 155 (1998), which is also included in the present disclosure.
  • pulsed electrical fields for nucleic acid isolation it is possible according to the invention, for example, to lyse only certain cell types in a suspension of different cell types, ie the sample used, by the choice of the treatment parameters. This allows certain nucleic acids of one cell type to be separated from nucleic acids of another cell type.
  • the use of pulsed electric fields can selectively release nucleic acids from cells of a cell type by choosing the appropriate conditions, the resulting chromatographic effect leading to a combination of nucleic acid isolation and nucleic acid purification.
  • an electric field with constant voltage is used for cell disruption, under conditions such as those described in Pollard-Knight et al. WO 97/41219 (1997) are described, which is included in the present disclosure content.
  • substances can also be introduced into the cells or micelles with the help of the electric fields by cell fusion, which later support or specify the lysis and / or nucleic acid release or serve as a label for later detection.
  • sample digestion with other parameters of the electric field and / or to additionally provide chemical agents, for example chaotropic substances or detergents, which support cell digestion, for example SDS, lipases, proteases such as proteinase K or DMSO (dimethyl sulfoxide), urea, guanidinium thiocyanate or guanidinium hydrochloride.
  • chemical agents for example chaotropic substances or detergents, which support cell digestion, for example SDS, lipases, proteases such as proteinase K or DMSO (dimethyl sulfoxide), urea, guanidinium thiocyanate or guanidinium hydrochloride.
  • an essential advantage of the present invention lies in the fact that no chaotropic reagents or detergents have to be used for the cell disruption, but rather that the cell disruption can be carried out in physiological solution, buffer solution or water.
  • the sample brought into contact with the immobilized or free nucleic acid-affine material is exposed to the influence of ultrasound in combination with the electrical treatment, for example by means of electrical spark discharge as described in US Pat. No. 5,368,724, in order to support sample digestion, in particular cell digestion .
  • this leads to a heating of the reaction mixture of sample and nucleic acid-affine material, so that the DNA contained in the sample is denatured and can bind to the immobilized DNA mixture on cooling.
  • fragmentation of the nucleic acid which may be advantageous, takes place.
  • the ultrasound treatment thus supports the digestion and / or the binding of the nucleic acid to the nucleic acid-affine material.
  • the cell disruption not only the cell disruption, but also the binding of the released nucleic acids to the free or immobilized nucleic acid-affine material is carried out using an electric field.
  • At least one electric field for example one or more pulsed electric fields and / or one or more fields of constant voltage, are used when the released nucleic acids are brought into contact with the nucleic acid-affine material.
  • Electrohybridization favors the hybridization or binding or adsorption of the nucleic acids to the nucleic acid-affine material and can improve the specificity of the binding.
  • the electrically negatively charged nucleic acids released can first be enriched in the area of the anode of a sample chamber used for carrying out the method, with the application of an electrical voltage, it being possible, for example, to advantageously provide material immobilized in the anode area so that nucleic acid-affine material is present in the area nucleic acid-affine material a locally high nucleic acid concentration occurs, which favor adsorption or hybridization kinetically and thermodynamically.
  • the polarity of the electrical field is reversed when the nucleic acids are brought into contact with the nucleic acid-affine material when the electrical field is applied, so that washing can be carried out in an electrically stringency manner due to the changed kinetic and thermodynamic conditions in the cathode region.
  • the nucleic acid-affine material is freely available during sample digestion, it must preferably have a negative net charge in order to support the nucleic acid purification by means of electrophoretic effects.
  • the nucleic acid-affine material and the released nucleic acids migrate in the same direction towards the anode, so that their concentration increases locally there.
  • this has the advantage that the association of nucleic acid-affine material and nucleic acid is favored kinetically and thermodynamically.
  • electro-hybridization can be carried out according to the invention.
  • an electro-stringent washing and electro-elution can be carried out, as described, for example, in Hintsche, Medical Genetics 11 (1999), 12 to 13, Cheng et al. , Anal. Chem. 70 (1998), 2321 to 2326, Cheng et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998), 541 to 546, DE 196 281 71 and US 5,632,957, which are included in the present disclosure.
  • nucleic acid-affine material is used, a - 13 -
  • electrostring washing and electroelution may be provided.
  • the invention therefore provides that one or more electric fields, which may be reversed, are used both during sample digestion and during the simultaneous or subsequent contacting of the nucleic acid-affine material with the nucleic acids, so as to release the To enable nucleic acids and a selective binding of the nucleic acids to the nucleic acid-affine material. If necessary, the bonded nucleic acids can also be washed using the electric field. In a further preferred embodiment it is provided that the subsequent detection step of the purified nucleic acids also takes place by means of an electrical field by means of electrical detection. The procedure can be as described in Hintsche, Medical Genetics 11, (1999) 12 to 13. However, detection can also be carried out using conventional optical, spectrophotometric, luminometric or radioactive methods.
  • the nucleic acid-affine materials can be either freely in solution or immobilized on a matrix, for example a sample holder or the electrodes themselves.
  • a matrix for example a sample holder or the electrodes themselves.
  • an electrode or a wall area made of non-conductive material of a sample chamber can also serve as the matrix.
  • the invention provides that, after the nucleic acids have bound to the nucleic acid-affine material, the remaining sample is separated from the nucleic acids bound to the nucleic acid-affine material and the isolated nucleic acids are washed in a preferred embodiment, for example also using an electrical one Field, i.e. an electro-stringent washing is carried out.
  • the invention provides that after the nucleic acids have been bound to the nucleic acid-affine material, either before or after the removal of the remaining sample, the bound nucleic acid is detected, if appropriate after prior amplification, for example by means of PCR, in particular optically, for example luminometric or spectrophotometric, radioactive or electrical.
  • the sample digestion, sample purification and detection in a one-step process in one and the same sample carrier, an electrical field preferably being applied during the entire process or being switched on at specific times, which nucleic acid purification and detection ensured.
  • the amplification of the nucleic acids to be detected which may be carried out according to the invention can be an electrical isothermal amplification as described in WO 98/02573, WO 93/15224 or WO 95/25177. - 15 -
  • the invention thus provides a method according to which the nucleic acid isolation from a sample, the nucleic acid purification by binding to nucleic acid-affine material, optionally washing the isolated nucleic acids and the detection is carried out in a one-step method using at least one electric field.
  • the integration achieved thereby provides the basis for a product, i.e. a device, by means of which all of the above-mentioned steps can be carried out in one work step in a sample chamber, i.e. the nucleic acid diagnostics is considerably accelerated, the risk of cross-contamination is reduced, the sensitivity and Specificity increased and automation also possible on a chip scale, i.e. in the mm range.
  • a sample is understood to mean any organic, inorganic or biotic / abiotic material, provided that it contains a nucleic acid, ie DNA or RNA.
  • a sample can be a prokaryotic or eukaryotic cell or a cell homogenate, a virus, for example contained in a virus suspension, blood, sperm, lymph or other body fluid, organ or tissue preparation, water or soil samples, liposomes, cell organ - be nell, cell nucleus, yeast, vegetable hoogenates, amber or other.
  • the sample preferably has - 16 -
  • sample disruption is understood to mean the most complete possible release of nucleic acids, optionally the sequence and / or compartment-selective release of nucleic acids from a biological material, ie a sample, which involves destruction of the sample, for example lysis, or reversible damage to the sample, for example pore formation.
  • a nucleic acid-affine material is understood to mean a material which is capable of binding nucleic acids, preferably reversibly.
  • the nucleic acid-affine material is a material which, with regard to the specific nucleic acid sequence, non-specifically binds all or essentially all nucleic acids of a sample, for example silica, diatoms or anion exchangers.
  • DNA mixtures, proteins, carbohydrates, glycoproteins or proteoglycans consisting only of random sequences are materials which bind nucleic acids quantitatively, that is to say materials which are nucleic acid-friendly in the sense of the invention.
  • nucleic acid-affine material is also understood to mean material that binds only certain nucleic acids, that is to say has a nucleic acid specificity, such as, for example, fragmented target genomes.
  • nucleic acid-affine material is also understood to mean a highly sequence-specific nucleic acid, - 17 -
  • nucleic acid-affine materials are, for example, random oligonucleotides or sequence-specific oligonucleotides of, for example, 7 to 50 nucleotides in length.
  • a DNA mixture consisting only of random sequences is understood to mean a mixture of DNA random sequences, which are also referred to as random primers, which is not specifically put together for a nucleic acid to be specifically isolated, but rather has any desired nucleotide permutation , so that all nucleic acids present in the sample are bound indiscriminately with a chain length sufficient for hybridization.
  • the DNA random sequences have an essentially uniform, but any chain length, preferably an average chain length of 15 to 30.
  • the DNA mixture, which consists only of random sequences therefore has a large number of different DNA molecules in single-strand form, the sequence of which is composed randomly is.
  • This DNA mixture is carried out in such a way that in the course of the DNA synthesis the four nucleosides involved in DNA construction, that is to say deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxycytidine and deoxythymidine and, if appropriate, - 18 -
  • a DNA mixture with random DNA sequences each of 20 nucleotides in length for example, represented by the sequence 5 '(N) 20 3', where N stands for deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxythymidine and deoxycytidine, thus also represents a mixture of all single-stranded DNA molecules a chain length of 20 nucleotides, ie 4 20 different DNA molecules.
  • the number of different DNA random sequences per DNA mixture according to the invention is therefore 4 X , where x is the chain length or number of nucleotides of the DNA random sequence.
  • the invention relates to a aforementioned method, the 4 X random sequences present in the DNA mixture occurring in the same, preferably in essentially molar, proportions.
  • the DNA mixture used according to the invention is therefore not developed with a view to a specific isolation task, but rather represents a DNA mixture that can be used for any DNA or RNA isolation task without any specific DNA or RNA specificity DNA mixture is only specific to the extent that it can separate nucleic acids, ie DNA or RNA, from other substances such as proteins, sugars or the like. According to the invention, however, it can be provided, by suitable selection of the binding - 19 -
  • the method according to the invention can therefore advantageously be carried out specifically for DNA or RNA.
  • the DNA mixture of random sequences or specific oligonucleotides to be used according to the invention can also contain other nucleosides such as deoxyinosine, uridine, pseudouridine, N 2 -dimethylguanosine, N 6 -isopentenyladenosine, that is to say synthons.
  • nucleosides such as deoxyinosine, uridine, pseudouridine, N 2 -dimethylguanosine, N 6 -isopentenyladenosine, that is to say synthons.
  • pentoses ie RNA building blocks, instead of the deoxypentoses.
  • a DNA mixture may also be understood to mean an RNA mixture.
  • oligonucleotides can be used as the material with affinity for nucleic acids, it being possible to use both highly specific probes and also more unspecific oligonucleotides, such as fragmented target genomes or random oligonucleotides, that is to say DNA mixtures consisting of random sequences, so-called random oligonucleotides.
  • random oligonucleotides as nucleic acid-affine material offers, compared to materials such as anion exchangers and silica, which can also be used according to the invention, the advantage of a lower affinity for polyanions other than nucleic acids and a higher affinity for the nucleic acids due to the principle - 20 -
  • the complementary base pairing in comparison to materials such as silica or anion exchangers, but they are suitable in comparison to oligonucleotides with specific sequences for the purification of various different nucleic acids.
  • the coupling of the oligonucleotides to the support or the matrix is preferably carried out via the 3 'end of the oligonucleotide, so that no by-products can arise when amplification is carried out, for example by means of PCR.
  • RNA oligonucleotides and peptide nucleic acids are possible according to the invention.
  • modified bases it is preferred according to the invention to use modified bases in order to achieve certain hybridization effects.
  • special sugars in connection with nucleic acid oligonucleotides as described, for example, in Beier et al., Science 283 (1999), 699 to 703, is also provided according to the invention and is therefore included in the present disclosure.
  • the invention has the advantage that highly specific nucleic acids can be isolated from a sample during the sample digestion in a single step and are obtained in pure form, so that they can be used directly for other analysis or preparation steps, such as, for example, a - 21 -
  • PCR methods can be used.
  • the procedure according to the invention advantageously does not require any costly and time-consuming adaptation steps of the method to the respective insulation task. Rather, the method according to the invention can be used directly for any insulation task without further modification.
  • the affinity-bound nucleic acid can be detached from the nucleic acid-affine material by increasing the ambient temperature, for example to at least 70 ° C., for example boiling temperature, in the presence of a suitable solvent, for example a buffer solution or water.
  • a suitable solvent for example a buffer solution or water.
  • the detachment can also be done by increasing the ionic strength of the dissolving buffer or by changing the pH value or by electrical washing.
  • the nucleic acid obtained is free from impurities and can be amplified in particular by PCR methods, even in the presence of the optionally immobilized DNA mixture.
  • the invention relates to a device for isolating and processing nucleic acids, in particular for carrying out a method mentioned above, the device, also referred to below as the sample carrier, having at least one sample chamber with at least - 22 -
  • the sample chamber comprises at least two flat electrodes and at least one non-conductive frame part, and wherein the at least two flat electrodes and the at least one frame part are designed as wall, cover or bottom part of the sample chamber.
  • the sample chamber according to the invention thus has a chamber which is circular or rectangular in cross-section and is enclosed by the base part, wall part or wall parts and optionally the cover part, areas of the wall, base and / or cover parts being designed as flat electrodes.
  • the at least two electrodes which are preferably arranged opposite one another according to the invention have electrical connections and are used to generate a sample digestion and, if appropriate, electrohybridization, electro-washing and electro-elution as well as an electric field of constant voltage or pulsed electric field which enables electrodetection.
  • the at least one non-conductive frame part has at least one opening, for example input and removal units, which is used for filling or removing sample liquid.
  • provision can be made to locate measuring units, for example optical measuring units and their connections, if any, between regions of the frame part and / or between the electrodes, which enable the detection of bound nucleic acids.
  • the electrodes are made of aluminum, stainless steel, silver, gold, platinum, graphite or the like - 23 -
  • non-conductive frame parts are made of plastic, glass, silicon or the like.
  • the invention therefore provides a sample holder in which the entire one-step method according to the invention can be carried out, that is to say the sample digestion, the nucleic acid isolation, the nucleic acid purification and, if appropriate, the nucleic acid detection. It proves to be advantageous that the sample liquid does not have to be transferred between different containers, but rather that the method can be carried out in a single container that is able to generate an electric field in its internal volume, which the sample digestion and the Support of the nucleic acid binding to the nucleic acid-sensitive material is used.
  • the sample carrier is designed in microsystem technology in the size of a chip, ie it has dimensions of 1 to 2 cm 2 .
  • the frame part can accordingly also be flat, that is to say evenly constructed, with no sample chamber being provided and the electrodes being integrated into the frame part. This minimizes the amount of consumables and maximizes sample throughput. Furthermore, when using the device according to the invention in chip size, there are advantages with regard to the voltage to be applied, since high field strengths can be achieved even at low voltages due to the small electrode spacing. In this way, the geometry of the sample carrier is advantageously too - 24 -
  • such a chip is constructed according to the principles of microfluidics.
  • the device according to the invention is preferably characterized in that at least parts of the region of the electrodes and / or of the frame part facing the inner volume have immobilized nucleic acid-affine material. Accordingly, in a preferred manner according to the invention, a region of the electrodes can be coupled, for example, with specific or non-specific oligonucleotides.
  • the present invention also relates to a device, in particular an affinity matrix, for isolating nucleic acids from a sample, in particular for carrying out a method mentioned above, comprising a nucleic acid-affine material, for example a DNA mixture consisting only of random sequences and described above, which is based on a Matrix for example an electrode is immobilized.
  • the invention therefore provides a device, in particular an affinity matrix, with which the aforementioned method can be carried out, in particular with the aid of which nucleic acids can be isolated from any sample in a simple and inexpensive manner.
  • the device according to the invention comprises a matrix, for example as a membrane, as beads - 25 -
  • beads or column gel can be performed and acts as a support or framework for the DNA mixture consisting only of random sequences. It can also be provided to use magnetic particles, for example beads, or electrodes, for example made of aluminum, silver, stainless steel, gold, platinum and / or graphite, as the matrix.
  • the invention advantageously provides for the material for the matrix to be a chemically and physically largely inert material, such as glass or plastic, for example polystyrene or polypropylene, or a correspondingly inert electrode material.
  • a chemically and physically largely inert material such as glass or plastic, for example polystyrene or polypropylene, or a correspondingly inert electrode material.
  • the material in a preferred embodiment of the invention is suitable, temperature differences in an interval between 10 ° C. and 95 ° C., pH differences in an interval between 0 to 14 and sodium or potassium chloride ion concentrations in an interval of 10 mM tolerate up to 2 M without significant change in material properties.
  • the material used is insoluble in water detergents and surfactant mixtures and is chemically inert to chaotropic reagents, such as isoguanidine thiocyanate.
  • the surface of the matrix is modified in an advantageous manner, for example by the application of biomolecules which bind with high affinity to the surface of the matrix material.
  • biomolecules which bind with high affinity to the surface of the matrix material.
  • Such a biomolecule immobilized on the matrix can - 26 -
  • the matrix surface can also be modified in such a way that a covalent bond between the nucleic acid-affine material, for example the random sequences of the DNA mixture, and the matrix is made possible.
  • the matrix can have amino groups which, via a dialdehyde spacer or a dialdehyde compound molecule, for example glutaraldehyde, form a Schiff base with an amino function introduced, for example, at the 5 'or 3' end of the DNA random sequences Can enter into a bond.
  • the matrix is cleaned before modification of its surface, for example with nitric acid.
  • the invention provides for the surface of the matrix to be silanized before the modification.
  • nucleic acids of the present invention used as nucleic acid-affine material for example the random sequences of the DNA mixture, accordingly also have modifications at the 3 'or 5' end for the purpose of immobilization on the matrix.
  • modifications can be, for example, biomolecules, such as biotin, which are linked to the 5 'end of the DNA random sequence and which bind with high affinity to other biomolecules immobilized on the matrix, such as, for example, streptavidin.
  • the modified nucleic acids for example the single-stranded DNA random sequences and the modified matrix, are brought into contact with one another so that the nucleic acids are immobilized on the matrix.
  • the matrix loaded with the nucleic acid-affine material to be used according to the invention in the form of nucleic acids is also referred to in the context of the present invention as the affinity matrix.
  • the affinity matrix according to the invention can advantageously also be applied to the surface of particles which are exposed or exposed to the digestion in the course of digestion.
  • the invention also relates to the use of a DNA mixture consisting only of random sequences, in particular a mixture of the same part, of 4 X different DNA random sequences, where x is the chain length of the DNA random sequence, preferably 5 to 50, in particular 15 to 30, for Isolation of nucleic acids from a sample.
  • FIG. 1 shows a matrix of a device according to the invention
  • FIG. 2 shows a device or DNA affinity matrix according to the invention
  • FIG. 3 shows an electropherogram
  • FIG. 4 shows two chromatograms of the binding of standard DNA to untreated and treated glass beads
  • FIG. 5 shows a further embodiment of a device according to the invention in the form of a sample carrier
  • FIG. 6 shows a further embodiment of a device according to the invention implemented as a chip.
  • FIG. 1 shows a matrix 10 which is designed in the form of a membrane 1.
  • the membrane 1 is coated on its surface with streptavidin molecules 3.
  • FIG. 2 shows an affinity matrix 100 which was produced by bringing the matrix 10 into contact with 5 'modified chemically or synthetically produced DNA random sequences 7, 7', 7 '' of a DNA mixture in single-strand form, the 5th -Modification of the random DNA sequence - 29 -
  • FIG. 2 shows that the 5 'ends of the DNA random sequences 7, 7', 7 1 'are each bound to biotin 5.
  • the biotin modification at the 5 'end of the DNA random sequences 7, 7', 7 '' binds with high affinity to the immobilized streptavidin molecules 3, so that a DNA mixture immobilized on a matrix 10 with the individual DNA random sequences 7, 7 ', 7 '' is formed.
  • Example 2 Isolation of DNA from a cell disruption
  • the glass beads were boiled in nitric acid. 50 g of the glass beads were placed in a 1 liter three-necked flask with a reflux condenser to 500 ml of approximately 7% nitric acid. The mixture was heated to boiling over a heating element and refluxed for 1 hour. In the meantime, stirring was carried out using a magnetic stirrer. After cooling, the supernatant liquid was decanted off. The glass beads were washed three times with MilliQ quality water and filtered through a filter. They were dried in a drying cabinet at 95 ° C. overnight. Since after drying with - 30 -
  • a potassium phosphate buffer was prepared from 160 ml 0.1 MK 2 HP0 4 and 40 ml 0.1 M KH 2 P0 4 and adjusted to pH 7.5.
  • a 2.5% glutardialdehyde solution was prepared from 10 ml of 25% glutaraldehyde solution and 90 ml of the potassium phosphate buffer.
  • 4 g of the silanized glass beads were added to 40 ml of the 2.5% glutardialdehyde solution and stirred at room temperature for about 1 hour. The glass beads were then washed with water, potassium phosphate buffer and again well with water.
  • Oligonucleotides (1 ⁇ mol per batch) (15-mer, each 15-mer in the same concentration, that is, there is a distribution of all theoretically possible oligomers with the nucleotides A, T, G and C in equal proportions, company Interactiva, Ulm, Germany) were taken up in 1 ml of potassium phosphate buffer. In a 15 ml tube (Greiner - 31 -
  • UV spectra were recorded at 260 mm from the primer stock solution and from the supernatant after the attachment. The respective primer concentration was determined from the spectra.
  • Lanes 3 and 4 of the electropherogram represent the MIF-PCR product of plasmid DNA, which could be isolated from random DNA sequences. This is contrasted in lanes 5 and 6 with the MIF-PCR products of the plasmid DNA isolated using the commercial system. There is neither a qualitative nor a quantitative difference between the two isolation strategies. - 34 -
  • FIG. 4 shows chromatograms of the binding of standard DNA (25 ⁇ g in each case) at 50 ° C.
  • Example 5 Nucleic acid isolation using electrical fields using a sample carrier in chip format
  • FIG. 5 shows a device 200 comprising a sample chamber 210 consisting of four to two opposing - 35 -
  • the sample carrier is rectangular in cross section and constructed in chip format, that is to say has a size of 1 to 2 cm 2 .
  • the top and bottom part of the sample chamber 210 is not shown.
  • Frame part 230 and the four flat electrodes 220, 220 ' form the walls and enclose an internal volume which serves to hold the sample. Provision can be made for a distance between the two electrode pairs 220, 220 ′ arranged opposite one another and each forming a wall, from 100 nm to 5 mm and an electrode diameter of up to 1 cm.
  • non-conductive regions 240 separate the individual electrodes 220, 220 'of the respective electrode pairs from one another with their connections 225, so that inhomogeneous and approximately homogeneous electric fields can be generated.
  • the formation of inhomogeneous fields can be achieved by applying a voltage to only two or three of four conductive elements 220, 220 '.
  • the non-conductive areas 240 between the conductive elements 220, 220 'of a pair of electrodes are chosen to be as small as possible, so that approximately homogeneous electric fields can arise if, for example, the conductive elements, i.e. electrodes 220' as cathode and the conductive elements, i.e. Electrodes 220 act as an anode.
  • the sample chamber 210 has a frame part 230 which has input 260 and removal units 270 provided with filters. The input and removal units 260, 270 are fitted into connection-like non-conductive elements 280 of the frame part 230 so that the - 36 -
  • Sample holder 200 can be filled and emptied.
  • the device 200 has optical units 290 between non-conductive regions 295 and 280 of the frame part 230, so that the optical units can be adapted such that connections are created.
  • the connections 225 of the electrodes 220, 220 ' can be used for electrical detection.
  • random sequences 300 of the DNA mixture used according to the invention are immobilized on the electrodes 220. Provision can also be made to attach the random sequences 300 additionally or exclusively to the non-conductive element 240 in the region of the electrodes 220, 220 '. In order to be able to carry out all process steps using electrical fields, i.e.
  • the device according to the invention is characterized in particular by the fact that parts or areas of the sample chamber 210, that is to say the wall, the base and / or cover part, are constructed from electrodes which can generate at least one electric field in the chamber, in walls, floor or cover openings for sampling, inputs and / or detection may be present.
  • a sample such as E. coli cells in water
  • a dielectrophoresis can optionally be provided using an electric field to concentrate or separate certain biological cells or as a prerequisite for an electrofusion, a corresponding voltage being applied to the connections 225 of the electrodes 220, 220 '.
  • An electrofusion can be provided to support the electrolysis or to carry out a marking.
  • An electrical voltage is then applied, for example to generate pulsed electrical fields or an electrical field of constant voltage, in such a way that the biological cells or viruses are electrolyzed, where appropriate the conditions can be set such that only certain biological cells are electrolyzed.
  • An electric field with a field strength of 0.5 to 50 kV / cm is present.
  • the conditions are then selected such that the nucleic acids released from the disrupted cells using an electric field with random sequences of the DNA mixture used according to the invention either freely available in the sample chamber or with the conductive and / or non-conductive areas of the sample chamber 210 in the anode region immobilized random sequences 300 of the DNA mixture used according to the invention can be electro-hybridized.
  • Pulse numbers from 1000 to 10000, pulse duration or time constants from 2 ⁇ s to 50 ms and field strengths from 0.5 to 20 kV / cm were used for cell disruption and electro-hybridization. - 38 -
  • electrostringent washing can be carried out with reversed polarity and enrichment or de-enrichment of certain nucleic acids and removal of undesired substances, for example amplification inhibitors.
  • sample chamber 210 there is then optionally an electroelution and optionally an amplification of the nucleic acids still present, preferably via an electrical, isothermal PCR, as described in WO 97/47767.
  • the bound or freely available purified nucleic acids can be detected, preferably electrically (described for example in Hintsche, 1999, op. Cit.)
  • FIG. 6 shows a device 400 according to the invention for carrying out a method according to the invention, the device 400 being constructed from a flat non-conductive frame part 560 and at least two electrodes 500 integrated into this flat frame part - 39 -
  • the device 400 according to the invention is designed as a chip, that is to say has no sample chamber formed from a wall or cover part.
  • the invention thus also relates to a flat sample carrier, that is to say a chip, made of a non-conductive chip base 560, also referred to as a frame part, and two flat electrodes 500 integrated into this chip base 560.
  • nucleic acid-sensitive materials 550 can be attached to the electrodes 500 , such as a DNA mixture of random sequences, can be immobilized.
  • the method according to the invention can be carried out by targeted control of the electrodes in chronological order, for example an electrode control 1 for the electrical digestion of the biotic or abiotic material (nucleic acid isolation), an electrode control 2 for electrical nucleic acid purification, an electrode control 3 for electrical isothermal nucleic acid amplification and an electrode control 4 for electrical detection.
  • an electrode control 1 for the electrical digestion of the biotic or abiotic material (nucleic acid isolation)
  • an electrode control 2 for electrical nucleic acid purification
  • an electrode control 3 for electrical isothermal nucleic acid amplification
  • an electrode control 4 for electrical detection.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Nucleinsäureisolierung und Reinigung, wobei im Anschluss an einen Probenaufschluss eine Isolierung und Aufreinigung von in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren erfolgt.

Description

Elektrische. integrierte Nucleinsäureisolierungf -reinigung und -detektion
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Isolierung von Nucleinsäu- ren aus einer Probe, insbesondere einem biotischen oder abiotischen Material.
Die spezifische oder quantitative Isolierung von Nucleinsäuren aus bestimmten Ausgangsmaterialien spielt in einer Vielzahl von wissenschaftlichen, industriellen oder sonstigen Bereichen eine große Rolle. Derartige Bereiche sind zum Beispiel die Umweltanalytik, Kriminaltechnik, Grundlagenforschung, Lebensmitteldiagnostik, Veterinärdiagnostik, Epidemiologie, Tumordiagnostik, Erbgutanalyse, Analyse von Erbkrankheiten und Infektionskrankheiten, Monitoring von Krankheiten, Therapie von Krankheiten, Früherkennung von Multiple-Drug-resistenten Keimen, Bodenuntersuchungen, Suche und Entwicklung von Pharmaka und Impfstoffen, Agrotechnik oder ähnliches. Ebenso vielfältig wie die Anwendungsbereiche können die Ausgangsmaterialien für die Isolierung der Nucleinsäuren sein, beispielsweise eukaryoti- sche oder prokaryotische Zellen oder deren Homo- genate, Bodenproben, Blutproben, Körperflüssigkei- ten oder Gewebehomogenate. In Abhängigkeit von diesem Ausgangs- oder Probenmaterial müssen unterschiedliche Aufschlußverfahren eingesetzt werden, um die beispielsweise in Zellen und/oder Zellkernen
BESϊÄπßUNΘSKDHE - 2 -
vorhandenen Nucleinsäuren einer Isolierung zugänglich zu machen. Häufig eingesetzte Aufschlußverfahren sind zum Beispiel die Ultraschall- und/oder Enzymbehandlung. Nach Durchführung der Aufschlußbe- handlung werden die Nucleinsäuren beispielsweise mittels Gelelektrophorese, Ultrazentrifugation oder Affinitätschromatographie isoliert .
Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren wie Enzym- Immuno-Assays (EIA) , Zellkulturen und Tierversuchen liefern genetische Untersuchungen über eine entsprechende Nucleinsäurediagnostik recht schnell empfindlichere und spezifischere Aussagen, so daß Kosten reduziert werden können. Die Nucleinsäurediagnostik basiert auf der Nucleinsäureisolierung, das heißt der Probenvorbereitung zur Freisetzung von Nucleinsäuren aus biologischem Material, der Nucleinsäurereinigung, deren Nachweis und der anschließenden Auswertung siehe zum Beispiel Lichten- steiger et al . , J. Clin. Microbiol. 34 (1996), 3035 bis 3039.
Die für eine Nucleinsäurediagnostik einsetzbare Affinitätschromatographie beruht im wesentlichen auf der Fähigkeit von Nucleinsäuren, reversibel an positiv geladene und/oder positivpolare Matrizes zu binden. In der Regel wird zunächst eine anionische oder polare Bindung der Nucleinsäuren an die Matrix erwirkt und anschließend die Nucleinsäure durch Einsatz geeigneter Lösemittel von Verunreinigungen befreit. In einem zweiten Schritt wird die an die Matrix gebundene Nucleinsäure unter Einsatz eines weiteren Lösemittels, beispielsweise mit höherer Ionenstärke, von der Matrix gelöst. Anschließend muß die so isolierte Nucleinsäure im allgemeinen wieder deionisiert werden, um für weitere Untersuchungen verwendet werden zu können.
Als nachteilig erweist sich dabei, daß je nach eingesetztem Probenmaterial und durchgeführtem Aufschlußverfahren unterschiedliche Isolierungsstrate- gien entwickelt und eingesetzt werden müssen. Zudem ist es nicht möglich, Probenaufschluß und Nuclein- säureisolierung beziehungsweise -reinigung in einem Verfahrensgang vorzunehmen.
Sowohl DNA als auch RNA wird herkömmlicherweise auch mittels Ultrazentrifugation isoliert, wobei häufig Protease- und Phenolbehandlungen durchgeführt werden müssen. Diese Verfahrensweise weist den Nachteil auf, daß insbesondere hochmolekulare DNA selbst nach Durchführung der Isolierung häufig noch mit Proteinen verunreinigt sind und die Moleküle aufgrund der einwirkenden Scherkräfte der Gefahr des Zerbrechens ausgesetzt sind. Zudem ist die Phenolbehandlung gesundheits- und umweltschädlich.
Eine weitere Methode basiert auf der Bindung von Nucleinsäuren an Silicamaterialien unter Hochsalz- bedingungen, wie 6 M GdnSCN, welches zuvor dann auch als Zellaufschlußagens diente. Der Einsatz von solchen Stoffen ist jetzt wegen deren Giftigkeit, Viskosität und Hemmung nachfolgender Prozesse wie der PCR nachteilig.
Auch die zur Nucleinsäureisolierung oftmals eingesetzte Gelelektrophorese weist unter anderem aufgrund der notwendigen vergleichsweise umständlichen - 4 -
Vor- und Nachbehandlung der Proben beziehungsweise Nucleinsäuren Nachteile auf.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem liegt also darin, ein kostengünstiges und einfach durchzuführendes Zellaufschluß- und Isolierungsverfahren für Nucleinsäuren bereitzustellen, das aus beliebigem biotischem und/oder abiotischem Probenmaterial bereits während des ProbenaufSchlusses in einem einzigen Schritt hochspezifisch Nucleinsäuren in besonders reiner Form bereitstellt. Dieses Verfahren soll grundsätzlich in der Lage sein, sowohl quantitativ Nucleinsäuren als Substanzklasse aus vielen verschiedenen Einzelindividuen als auch spezifisch ganz konkrete Nuclein- säurensequenzen isolieren und reinigen zu können.
Die Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, wobei die Probe unter dem Einfluß mindestens eines elektrischen Feldes aufgeschlossen wird und die freigesetzten Nucleinsäuren mit einem nucleinsäureaffinen Material so in Kontakt gebracht werden, daß zumindest ein Teil der Nucleinsäure an das nucleinsäureaffine Material binden kann. Die Erfindung betrifft insbesondere ein vorgenanntes Verfahren, wobei ein frei beziehungsweise ungebunden vorliegendes oder immobilisiertes nucleinsäureaffines Material mit der Probe nach deren elektrisch bewirkten Aufschluß so in Kontakt gebracht wird, daß eine Bindung beziehungsweise Hybridisierung von in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren an das nucleinsäureaffine Material stattfinden kann und wobei gegebenenfalls die - 5 -
gebundenen Nucleinsäuren nach einem gegebenenfalls erfolgenden Waschschritt von dem nucleinsäureaffine Material abgelöst und zum Beispiel amplifiziert , nachgewiesen oder sonstwie verwendet werden können. Dabei kann „affin" auch die Bindung von Nucleinsäuren an positive geladene Materialien bedeuten.
Die Erfindung stellt also ein affinitätschroma- tographisches Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren bereit, bei dem in einer Probe enthaltene Nucleinsäuren nach Aufschluß der Probe mittels mindestens eines elektrischen Feldes mit einem nucleinsäureaffinen Material in Kontakt gebracht werden und dieses nucleinsäureaffine Material spezifisch einzelne, mehrere oder alle beziehungsweise im wesentlichen alle in der Probe enthaltenen Nucleinsäuren, zum Beispiel DNA oder RNA, bindet und damit von den anderen Probenbestandteilen wie Proteinen, Kohlenhydraten, Fetten oder gegebenenfalls nicht interessierenden Nucleinsäuren etc. isoliert. Die dabei einzuhaltenden Hybridisierungs- bedingungen wie Temperatur und Pufferzusammensetzung und/oder die elektrischen Parameter des Feldes wie Impulszahl, Impulsfrequenz oder Feldstärke hängen von der jeweiligen konkreten Isolieraufgabe ab.
Die Erfindung stellt in vorteilhafterweise also ein einstufiges Verfahren bereit, wobei im Rahmen eines einzigen Verfahrensschrittes eine Probe unter dem Einfluß mindestens eines elektrischen Feldes aufgeschlossen und gleichzeitig oder anschließend die freigesetzten und ursprünglich in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren mit einem nucleinsäureaffinen Material so in Kontakt gebracht werden, daß je nach eingesetztem nucleinsäureaffinen Material entweder quantitativ alle oder im wesentlichen alle Nucleinsäuren oder aber nur einzelne Nucleinsäuregruppen beziehungsweise einzelne spezifische Nucleinsäure- sequenzen abgetrennt werden können.
Die Erfindung ermöglicht eine universell einsetzbare, standardisierbare und automatisierbare Nucleinsäurediagnostik zur Gen- und Genomanalyse mit einer Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten. Die erfindungsgemäße Verfahrensweise weist eine hohe Schnelligkeit auf, wobei der einzusetzende Materialaufwand gering und der Einsatz kostenintensiver und giftiger Substanzen minimiert ist. Schließlich ist das Risiko von Querkontaminationen vermindert, so daß die Empfindlichkeit des Verfahrens groß ist. Zudem läßt sich das Verfahren kostengünstig realisieren. Das erfindungsgemäße Verfahren weist ferner den Vorteil auf, daß bei der Nucleinsäureisolierung und -reinigung ein derart hoher Reinigungsgrad der Nucleinsäuren erreicht wird, daß anschließend eine Amplifikation von Nucleinsäuren ohne Störung durch Amplifikationsinhibitoren und Querkontaminationen möglich ist, die zur falsch-negativen und falschpositiven Ergebnissen führen würde. So kann zum Beispiel der elektrische Zellaufschluß gänzlich ohne Zugabe von chemischen Aufschlußreagenzien, die wiederum stören könnten, erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, die Probe dem Einfluß mindestens eines elektrischen Feldes konstanter Spannung oder eines gepulsten elektrischen Feldes zur Freisetzung der Nucleinsäuren und/oder Lyse der biologischen - 7 -
Probe auszusetzen. Durch die Einwirkung des elektrischen Feldes und den elektrischen Durchbruch entstehen in den Lipidschichten, aus denen die Zellmembran besteht, Poren. Im Rahmen des Einsatzes gepulster elektrischer Felder kann eine Elektroporation und eine osmotische Lyse von Zellen kombiniert werden, so daß die in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren vollständig freigesetzt und auch gereinigt werden können. Geeignete Parameter für gepulste elektrische Felder sind zum Beispiel in Kinosita und Tsong, Nature 268 (1977), 438 bis 441, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 1923 bis 1927 oder Benz und Zimmermann, Bioelektrochem. Bioenerg. 7 (1988), 723 bis 739 beschrieben, die insoweit in den vorliegenden Offenbarungsgehalt mit einbezogen sind. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß es sich bei dem hier beschriebenen Verfahren nicht um die Elektroporation handelt, die bekannt ist, sondern um den umgekehrten Vorgang des Nucleinsäure- austritts. Erfindungsgemäß können Feldstärken von 0,5 bis 50, vorzugsweise 5 bis 30 kV/cm, und Pulslängen beziehungsweise Zeitkonstanten von ca. 0,5 μs bis 50 ms sowie zum Beispiel 1 bis 1000000, vorzugsweise 1000 bis 10000 Impulse, eingesetzt werden. Selbstverständlich können jedoch auch erheblich davon abweichende elektrische Parameter eingesetzt werden. Die Impulsform kann zum Beispiel rechteckig, expontiell abnehmend oder sinusartig, vorzugsweise im Radiofrequenzbereich, sein. Das elektrische Feld kann dabei sowohl durch Wechselais auch Gleichspannung erzeugt werden. Übliche elektrische Parameter sind zum Beispiel auch in den US-PS 5,447,733; US-PS 5,235,905 oder US-PS 5,393,541 beschrieben, die insofern in den vorlie- - 8 -
genden Offenbarungsgehalt mit einbezogen sind. Die einzusetzenden Feldstärken liegen bevorzugt über der kritischen Spannung Vc über der Membran des biologischen Materials. Weitere geeignete Bedingungen sind beispielsweise in Vitztum et al . , FEBS Ab- stracts, 155 (1998) beschrieben, das insoweit ebenfalls in den vorliegenden Offenbarungsgehalt mit einbezogen ist . Bei der Verwendung von gepulsten elektrischen Feldern zur Nucleinsäureisolierung ist es beispielsweise erfindungsgemäß möglich, über die Wahl der Behandlungsparameter nur bestimmte Zelltypen in einer Suspension verschiedener Zelltypen, also der eingesetzten Probe, zu lysieren. Dadurch können bestimmte Nucleinsäuren eines Zelltyps von Nucleinsäuren eines anderen Zelltyps abgetrennt werden. Zudem kann durch den Einsatz gepulster elektrischer Felder eine selektive Freisetzung von Nucleinsäuren aus Zellen eines Zelltyps durch Wahl der geeigneten Bedingungen bewirkt werden, wobei der entstehende chromatographische Effekt zu einer Kombination einer Nucleinsäureisolierung mit einer Nucleinsäurereinigung führt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird für den Zellaufschluß ein elektrisches Feld mit konstanter Spannung eingesetzt, unter Bedingungen wie sie beispielsweise in Pollard-Knight et al. WO 97/41219 (1997) beschrieben sind, das insofern in den vorliegenden Offenbarungsgehalt mit einbezogen ist.
Während des Probenaufschlusses können mit Hilfe der elektrischen Felder durch Zellfusion auch Substanzen in die Zellen oder Micellen eingebracht werden, die später die Lyse und/oder Nucleinsäurefreiset- zung unterstützen, spezifizieren oder der Markierung für eine spätere Detektion dienen.
Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß auch bevorzugt, mehrere gleiche oder verschiedene elektrische Felder gleichzeitig oder nacheinander auf die Probe einwirken zu lassen.
Es ist erfindungsgemäß auch bevorzugt, den Zellaufschluß durch den Einsatz hoher Temperaturen, zum Beispiel von 30°C bis 95°C, zu unterstützen.
Selbstverständlich ist es auch möglich, den Probenaufschluß mit anderen Parametern des elektrischen Feldes durchzuführen und/oder gegebenenfalls chemische Agenzien, zum Beispiel chaotrope Substanzen oder Detergenzien, zusätzlich vorzusehen, die den Zellaufschluß unterstützen, zum Beispiel SDS, Lipa- sen, Proteasen wie die Proteinase K oder DMSO (Dimethylsulfoxid) , Harnstoff, Guanidiniumthiocya- nat oder Guanidiniumhydrochlorid.
Bevorzugt ist es jedoch, das erfindungsgemäße Verfahren ohne Zusatz chemischer Substanzen, zum Beispiel ausschließlich in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder Pufferlösung durchzuführen.
Tatsächlich liegt ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung nämlich darin, für den Zellaufschluß keine chaotropen Reagenzien oder Detergenzien einsetzen zu müssen, sondern den Zellaufschluß in physiologischer Lösung, Pufferlösung oder Wasser durchführen zu können. - 10 -
In besonders vorteilhafter Weise kann vorgesehen sein, die mit dem immobilisierten oder freien nucleinsäureaffinen Material in Kontakt gebrachte Probe Ultraschalleinfluß in Kombination mit der elektrischen Behandlung, zum Beispiel durch elektrische Funkenentladung wie beschrieben in US 5,368,724, auszusetzen, um einen Probenaufschluß, insbesondere Zellaufschluß, zu unterstützen. Dies führt gleichzeitig zu einer Erwärmung des Reakti- onsgemisch.es aus Probe und nucleinsäureaffinem Material, so daß die in der Probe enthaltende DNA denaturiert wird und beim Abkühlen an die immobilisierte DNA-Mischung binden kann. Zusätzlich findet eine gegebenenfalls vorteilhafte Fragmentierung der Nucleinsäure statt. Die Ultraschallbehandlung unterstützt also den Probenaufschluß und/oder die Bindung der Nucleinsäure an das nucleinsäureaffine Material.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt vorgesehen, nicht nur den ZellaufSchluß, sondern auch die Bindung der freigesetzten Nucleinsäuren an das frei oder immobilisiert vorliegende nucleinsäureaffine Material unter Einsatz eines elektrischen Feldes durchzuführen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, daß während des Inkon- taktbringens der freigesetzten Nucleinsäuren mit dem nucleinsäureaffinen Material mindestens ein elektrisches Feld, zum Beispiel ein oder mehrere gepulste elektrische Felder und/oder eine oder mehrere Felder konstanter Spannung eingesetzt werden, - 11 -
um so eine Elektrohybridisierung zu bewirken. Die Elektrohybridisierung begünstigt die Hybridisierung beziehungsweise Bindung oder Adsorption der Nucleinsäuren an das nucleinsäureaffine Material und kann die Spezifität der Bindung verbessern. Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, die freigesetzten elektrisch negativ geladenen Nucleinsäuren unter Anlegen einer elektrischen Spannung zunächst im Bereich der Anode einer für die Durchführung des Verfahrens eingesetzten Probekammer anzureichern, wobei beispielsweise vorteilhafterweise vorgesehen sein kann, im Anodenbereich immobilisiertes nucleinsäureaffines Material vorzusehen, so daß im Bereich dieses nucleinsäureaffinen Materials eine lokal hohe Nucleinsäurekonzentration auftritt, die eine Adsorption beziehungsweise Hybridisierung kinetisch und thermodynamisch begünstigt. Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, während des Anliegens des elektrischen Feldes beim Inkontaktbringen der Nucleinsäuren mit dem nucleinsäureaffinen Material ein Umpolen des elektrischen Feldes vorzunehmen, so daß aufgrund der veränderten kinetischen und ther- modynamischen Bedingungen im Kathodenbereich elek- trostringent gewaschen werden kann.
Sofern freie nucleinsäureaffine Materialen, zum Beispiel ungebundene Zufallssequenzen eingesetzt werden, können bei Anliegen eines elektrischen Feldes konstanter Spannung oder eines gepulsten elektrischen Feldes im Rahmen der erfindungsge äß vorgesehenen Elektrohybridisierung die elektrophoreti- schen Effekte, die sich bei der Wanderung der negativ geladenen Nucleinsäuren mit dem vorzugsweise - 12 -
auch negativ geladenen nucleinsäureaffinen Material einstellen, ausgenützt werden.
Liegt das nucleinsäureaffine Material erfindungsgemäß also frei während des Probenaufschlusses vor, muß es vorzugsweise eine negative Nettoladung besitzen, um über elektrophoretische Effekte die Nucleinsäurereinigung zu unterstützen. Im elektrischen Feld, vorzugsweise in einem inhomogenen elektrischen Feld, wandert das nucleinsäureaffine Material und die freigesetzten Nucleinsäuren in dieselbe Richtung zur Anode hin, so daß sich deren Konzentration dort lokal erhöht. Neben der Abtrennung von Substanzen anderer elektrischer Eigenschaften hat dies den Vorteil, daß die Assoziation von nucleinsäureaffinen Material und Nucleinsäure kinetisch und thermodynamisch begünstigt wird.
Liegt das nucleinsäureaffine Material immobilisiert, zum Beispiel an den Probenträger gebunden vor, kann erfindungsgemäß eine Elektrohybridisierung durchgeführt werden. Außerdem kann während oder nach der Elektrohybridisierung ein elek- trostringentes Waschen und eine Elektroelution durchgeführt werden, wie sie beispielsweise in Hintsche, Medizinische Genetik 11 (1999), 12 bis 13, Cheng et al . , Anal. Chem. 70 (1998), 2321 bis 2326, Cheng et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998), 541 bis 546, DE 196 281 71 und US 5,632,957 beschrieben sind, die insofern in den vorliegenden Offenbarungsgehalt mit einbezogen sind. Selbstverständlich kann auch im Fall der Verwendung von freiem, nucleinsäureaffinen Material gegebenenfalls ein - 13 -
elektrostringentes Waschen und eine Elektroelution vorgesehen sein.
Die Erfindung sieht also in bevorzugter Ausführungsform vor, daß sowohl während des Probenauf- schlußes als auch während des gleichzeitig oder darauffolgend stattfindenden Inkontaktbringens des nucleinsäureaffinen Materials mit den Nucleinsäuren ein oder mehrere elektrische Felder, die gegebenenfalls umgepolt werden, eingesetzt werden, um so eine Freisetzung der Nucleinsäuren und eine selektive Bindung der Nucleinsäuren an das nucleinsäureaffine Material zu ermöglichen. Gegebenenfalls kann durch den Einsatz des elektrischen Feldes auch ein Waschen der gebundenen Nucleinsäuren stattfinden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß auch der nachfolgende Nachweisschritt der aufgereinigten Nucleinsäuren mittels eines elektrischen Feldes durch elektrische Detektion stattfindet. Dabei kann verfahren werden, wie in Hintsche, Medizinische Genetik 11, (1999) 12 bis 13 beschrieben. Der Nachweis kann jedoch auch mittels herkömmlicher optischer, spektrophotometrischer, luminometrischer oder radioaktiver Verfahrensweisen erfolgen.
Die nucleinsäureaffinen Materialien können entweder frei in Lösung oder an eine Matrix, zum Beispiel einen Probenträger oder die Elektroden selbst immobilisiert vorliegen. Als Matrix kann zum Beispiel auch eine Elektrode oder ein Wandbereich aus nicht leitendem Material einer Probenkammer dienen. - 14 -
Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, daß nach Bindung der Nucleinsäuren an das nucleinsäureaffine Material die restliche Probe von den an das nucleinsäureaffine Material gebundenen Nucleinsäuren abgetrennt und die isolierten Nucleinsäuren in bevorzugter Ausfüh- rungsform gewaschen werden, zum Beispiel ebenfalls unter Einsatz eines elektrischen Feldes, das heißt es wird ein elektrostringentes Waschen durchgeführt .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung vor, daß nach der Bindung der Nucleinsäuren an das nucleinsäureaffine Material entweder vor oder nach der Abtrennung der restlichen Probe ein Nachweis der gebundenen Nucleinsäure, gegebenenfalls nach vorheriger Amplifikation beispielsweise mittels PCR, durchgeführt wird, insbesondere optisch zum Beispiel luminometrisch oder spektrophotometrisch, radioaktiv oder elektrisch.
In besonders bevorzugter Ausführungsform ist es möglich, den Probenaufschluß, die Probenaufreini- gung und den Nachweis in einem einstufigen Verfahren in ein und demselben Probenträger durchzuführen, wobei vorzugsweise während des gesamten Prozesses ein elektrisches Feld angelegt beziehungsweise zu bestimmten Zeiten zugeschaltet wird, welches den Probenaufschluß, die Nucleinsäureaufreini- gung und die Detektion gewährleistet. Die gegebenenfalls durchgeführte Amplifikation der nachzuweisenden Nucleinsäuren kann erfindungsgemäß eine elektrische isotherme Amplifikation sein, wie sie in WO 98/02573, WO 93/15224 oder WO 95/25177 be- - 15 -
schrieben ist und die insoweit in den vorliegenden Offenbarungsgehalt mit einbezogen sind.
Die Erfindung stellt also ein Verfahren zur Verfügung, gemäß dem die Nucleinsäureisolierung aus einer Probe, die Nucleinsaurereinigung durch Bindung an nucleinsäureaffines Material, gegebenenfalls das Waschen der isolierten Nucleinsäuren und der Nachweis in einem einstufigen Verfahren unter Einsatz mindestens eines elektrischen Feldes durchgeführt wird. Die dadurch erzielte Integration ermöglicht die Grundlage für ein Produkt, das heißt eine Vorrichtung, mittels derer alle vorgenannten Schritte in einem Arbeitsgang in einer Probenkammer durchgeführt werden können, das heißt, dadurch wird die Nucleinsäurediagnostik erheblich beschleunigt, die Gefahr von Querkontaminationen vermindert, die Empfindlichkeit und Spezifität gesteigert sowie eine Automatisierung auch im Chipmaßstab, also im mm- Bereich ermöglicht .
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Probe jedes beliebige organische, anorganische oder biotisch/abiotische Material verstanden, sofern dieses eine Nucleinsäure, also DNA oder RNA, enthält. Eine Probe kann demgemäß eine pro- karyotische oder eukaryotische Zelle oder ein Zell- homogenat, ein Virus, zum Beispiel enthalten in einer Virussuspension, Blut, Sperma, Lymph- oder sonstige Körperflüssigkeit , Organ- oder Gewebepräparat, Wasser- oder Bodenproben, Liposomen, Zellorga- nell, Zellkern, Hefe, Pflanzenho ogenate, Bernstein oder sonstiges sein. Die Probe weist vorzugsweise - 16 -
Wasser oder eine physiologische Salzlösung oder Pufferlösung als Lösungsmittel auf.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter Probenaufschluß die möglichst vollständige Freisetzung von Nucleinsäuren, gegebenenfalls die Sequenz- und/oder Kompartiment-selektive Freisetzung von Nucleinsäuren aus einem biologischen Material, einer Probe also, verstanden, die mit Zerstörung der Probe, zum Beispiel Lyse, oder reversibler Schädigung der Probe, zum Beispiel Porenbildung einhergehen kann.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem nucleinsäureaffinen Material ein Material verstanden, das in der Lage ist, Nucleinsäuren, vorzugsweise reversibel, zu binden. In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist das nucleinsäureaffine Material ein Material, das hinsichtlich der konkreten Nucleinsäuresequenz unspezifisch alle oder im wesentlichen alle Nucleinsäuren einer Probe bindet, zum Beispiel Silica, Diatomeen oder Anionentauscher . Auch nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Gemische, Proteine, Kohlenhydrate, Glycoproteine oder Proteoglycane sind Materialien, die quantitativ Nucleinsäuren binden, also nucleinsäureaffine Materialien im Sinne der Erfindung. Selbstverständlich wird unter einem nucleinsäureaffinen Material auch Material verstanden, das nur bestimmte Nucleinsäuren bindet, das heißt eine Nucleinsäurespezifität aufweist, wie beispielsweise fragmentierte Zielgenome. Unter nucleinsäureaffinen Material wird jedoch auch eine höchst sequenzspezifische Nucleinsäure verstanden, - 17 -
die ganz spezifisch nur ein konkretes Nucleinsäure- spezies aus einer viele Nucleinsäurespezies enthaltenen Probe isoliert und bindet, zum Beispiel eine bestimmte cDNA oder genomische DNA-Sequenz. In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung sind die nucleinsäureaffinen Materialien zum Beispiel Zu- fallsoligonucleotide oder sequenzspezifische Oligo- nucleotiden von zum Beispiel 7 bis 50 Nucleotiden Länge .
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA-Mischung eine Mischung aus DNA-Zufallssequenzen, die auch als random primer bezeichnet werden, verstanden, die nicht spezifisch auf eine konkret zu isolierende Nucleinsäure zusammengestellt ist, sondern jede beliebige Nucleotidpermutation aufweist, so daß unterschiedslos alle in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren mit für eine Hybridisierung ausreichende Kettenlänge gebunden werden. Die DNA-Zufallssequenzen weisen eine im wesentlichen einheitliche, aber beliebige Kettenlänge auf, vorzugsweise eine durchschnittliche Kettenlänge von 15 bis 30. Die nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung weist also eine Vielzahl von unterschiedlichen DNA-Molekülen in Einzelstrangform auf, deren Sequenz jeweils zufallsgemäß zusammengesetzt ist .
Bei der Herstellung dieser DNA-Mischung wird so vorgegangen, daß im Verlauf der DNA-Synthese die vier am DNA-Aufbau beteiligten Nucleoside, das heißt Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxycytidin und Desoxythymidin sowie gegebenenfalls deren je- - 18 -
weilige Synthone, das heißt deren strukturanaloge Modifikationen, pro DNA-Kettenverlängerungsschritt in einem Mischungsverhältnis von 1:1:1:1 eingesetzt werden. Das hat zur Folge, daß je Position in einer DNA-Molekülkette alle vier Nucleoside mit gleicher Wahrscheinlichkeit eingebaut werden. Eine DNA- Mischung mit DNA-Zufallssequenzen von jeweils beispielsweise 20 Nucleotiden Länge, dargestellt durch die Abfolge 5' (N) 20 3 ' , wobei N für Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin und Desoxycytidin steht, repräsentiert demnach eine Mischung aller einzelsträngiger DNA-Moleküle mit einer Kettenlänge von 20 Nucleotiden, das heißt 420 verschiedene DNA- Moleküle. Die Anzahl von unterschiedlichen DNA- Zufallsequenzen pro erfindungsgemäßer DNA-Mischung beträgt demnach 4X, wobei x die Kettenlänge oder Nucleotidanzahl der DNA-Zufallssequenz ist.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung betrifft die Erfindung ein vorgenanntes Verfahren, wobei die in der DNA-Mischung vorhandenen 4X Zufallssequenzen in gleichen, vorzugsweise in im wesentlichen, molaren Mengenanteilen vorkommen. Die erfindungsgemäß eingesetzte DNA-Mischung ist also nicht im Hinblick auf eine konkrete Isolieraufgabe hin entwickelt, sondern stellt vielmehr eine für jede beliebige DNA- oder RNA-Isolieraufgabe ein- setzbare DNA-Mischung ohne jegliche konkrete DNA- oder RNA-Spezifität dar. Die eingesetzte DNA- Mischung ist nur insoweit spezifisch, als daß sie Nucleinsäuren, das heißt DNA oder RNA, von anderen Stoffen wie zum Beispiel Proteinen, Zuckern oder ähnlichem trennen kann. Erfindungsgemäß kann jedoch vorgesehen sein, durch geeignete Auswahl der Binde- - 19 -
beziehungsweise Hybridisierungsbedingungen zwischen zu isolierender Nucleinsäure und nucleinsäureaffinen Material oder der Lösebedingungen (Temperatur, Ionenstärke etc.) DNA von RNA zu unterscheiden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann also in vorteilhafter Weise DNA- oder RNA-spezifisch durchgeführt werden.
Selbstverständlich kann die erfindungsgemäß einzusetzende DNA-Mischung aus Zufallssequenzen oder spezifischen Oligonucleotiden auch andere Nucleosi- de wie Desoxyinosin, Uridin, Pseudouridin, N2- Dimethyl-guanosin, N6-Isopentenyladenosin, also Synthone, enthalten. Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, anstelle der Desoxypentosen, Pentosen, also RNA-Bausteine, einzusetzen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer DNA-Mischung gegebenenfalls also auch eine RNA- Mischung verstanden.
Erfindungsgemäß können insbesondere Oligonucleotide als nucleinsäureaffines Material eingesetzt werden, wobei sowohl hochspezifische Sonden aber auch unspezifischere Oligonucleotide, wie fragmentierte Zielgenome oder Zufallsoligonucleotide, das heißt nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischungen, sogenannte Random-Oligonucleotide eingesetzt werden können. Die Verwendung von Random-Oligonucleotiden als nucleinsäureaffines Material bietet gegenüber Materialien wie Anionentauschern und Silica, die erfindungsgemäß auch eingesetzt werden können, den Vorteil einer geringeren Affinität gegenüber anderen Polyanionen als Nucleinsäuren und einer höheren Affinität zu den Nucleinsäuren aufgrund des Prinzip - 20 -
der komplementären Basenpaarung im Vergleich zu Materialien wie Silica oder Anionenaustauschern, sie sind aber im Vergleich zu Oligonucleotiden mit spezifischen Sequenzen zur Reinigung verschiedener unterschiedlicher Nucleinsäuren geeignet. Die Kopplung der Oligonucleotide an den Träger oder die Matrix erfolgt vorzugsweise über das 3 '-Ende des Oli- gonucleotids, so daß bei einer gegebenenfalls erfolgenden Amplifikation, beispielsweise mittels PCR, keine Nebenprodukte entstehen können. Bei Verwendung spezifischer Oligonucleotide ist es erfin- dungsgemäß bevorzugt, Schmelztemperaturen unterhalb derer der PCR-Primer zu wählen, um Kompetitionen zu minimieren.
Neben der bevorzugten Verwendung von DNA- Oligonucleotiden ist der Einsatz von RNA- Oligonucleotiden und Peptide Nucleic Acids (PNAs) erfindungsgemäß möglich. Des weiteren ist es erfin- dungsgemäß bevorzugt, modifizierte Basen einzusetzen, um bestimmte Hybridisierungseffekte zu erzielen. Auch der Einsatz von speziellen Zuckern im Zusammenhang mit Nucleinsäureoligonucleotiden, wie beispielsweise in Beier et al., Science 283 (1999), 699 bis 703 beschrieben, ist erfindungsgemäß vorgesehen und insofern in den vorliegenden Offenbarungsgehalt mit einbezogen.
Die Erfindung weist den Vorteil auf, daß aus einer Probe bereits während des Probenaufschlusses in einem einzigen Schritt hochspezifisch Nucleinsäuren isoliert werden können und in reiner Form erhalten werden, so daß diese direkt für andere Analyseoder Präparationsschritte, wie beispielsweise ein - 21 -
PCR-Verfahren, eingesetzt werden können. Die erfindungsgemäße Vorgehensweise setzt in vorteilhafter Weise keine kosten- und zeitintensiven Anpassungsschritte des Verfahrens an die jeweilige Isolier- aufgabe voraus. Vielmehr kann das erfindungsgemäße Verfahren direkt ohne weitere Modifikation für jede beliebige Isolieraufgabe eingesetzt werden.
In besonders bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, daß nach der Affinitätsbindung der in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren an das nucleinsäureaffine Material Verunreinigungen mittels geeigneter Pufferlösungen oder Wasser entfernt werden. Nach dem erfolgten Waschschritt kann die affinitätsgebundene Nucleinsäure durch Erhöhung der Umgebungstemperatur, beispielsweise auf mindestens 70°C, zum Beispiel Siedetemperatur, in Gegenwart eines geeigneten Lösemittels, zum Beispiel einer Pufferlösung oder Wasser, von dem nucleinsäureaffine Material abgelöst werden. Die Ablösung kann auch durch Erhöhung der Ionenstärke des Lösepuffers oder eine Veränderung des pH-Wertes oder durch elektrisches Waschen erfolgen. Die erhaltene Nucleinsäure ist frei von Verunreinigungen und kann insbesondere durch PCR-Verfahren, auch in Gegenwart der gegebenenfalls immobilisierten DNA-Mischung, amplifiziert werden.
Die Erfindung betrifft in einer weiteren Ausführungsform eine Vorrichtung zur Isolierung und Prozessierung von Nucleinsäuren, insbesondere zur Durchführung eines vorgenannten Verfahrens, wobei die Vorrichtung, im folgenden auch als Probenträger bezeichnet, mindestens eine Probenkammer mit minde- - 22 -
stens zwei flächig ausgebildeten Elektroden und mindestens einem nichtleitenden Rahmenteil umfaßt, und wobei die mindestens zwei flächig ausgebildeten Elektroden und das mindestens eine Rahmenteil als Wand-, Deckel- oder Bodenteil der Probenkammer ausgeführt sind. Die erfindungsgemäße Probenkammer weist also eine von Bodenteil, Wandteil oder Wandteilen sowie gegebenenfalls Deckelteil umschlossene im Querschnitt kreisförmige oder rechteckige Kammer auf, wobei Bereiche der Wand-, Boden- und/oder Dek- kenteile als flächig ausgebildete Elektroden ausgeführt sind. Die erfindungsgemäß vorgesehenen vorzugsweise gegenüberliegend angeordneten mindestens zwei Elektroden weisen elektrische Anschlüsse auf und dienen der Erzeugung eines ProbenaufSchluß und gegebenenfalls Elektrohybridisierung, Elektro- waschen und Elektroelution sowie Elektrodetektion ermöglichenden elektrischen Feldes konstanter Spannung oder gepulsten elektrischen Feldes. In bevorzugter Weise kann vorgesehen sein, daß das mindestens eine nichtleitende Rahmenteil mindestens eine Öffnung, zum Beispiel Eingabe- und Entnahmeeinheiten aufweist, die dem Einfüllen beziehungsweise der Entnahme von Probeflüssigkeit dient. Zudem kann vorgesehen sein, zwischen Bereichen des Rahmenteiles und/oder zwischen den Elektroden Meßeinheiten, zum Beispiel optische Meßeinheiten und deren gegebenenfalls vorhandene Anschlüsse zu lokalisieren, die den Nachweis gebundener Nucleinsäuren ermöglichen.
In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, die Elektroden aus Aluminium, Edelstahl, Silber, Gold, Platin, Graphit oder ähnlichem - 23 -
auszuführen, während in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die nichtleitenden Rahmenteile aus Kunststoff, Glas, Silicium oder ähnlichem ausgeführt sind.
Die Erfindung sieht also einen Probenträger vor, in dem das gesamte erfindungsgemäße einstufige Verfahren durchgeführt werden kann, das heißt der Probenaufschluß, die Nucleinsäureisolierung, die Nucleinsaurereinigung und gegebenenfalls der Nucleinsäu- renachweis. Als vorteilhaft erweist sich dabei, daß die Probeflüssigkeit nicht zwischen verschiedenen Behältern transferiert werden muß, sondern daß das Verfahren vielmehr in einem einzigen Behälter durchgeführt werden kann, der in der Lage ist, in seinem Innenvolumen ein elektrisches Feld zu erzeugen, welches dem Probenaufschluß und der Unterstützung der Nucleinsäurebindung an das nucleinsäureaf- fine Material dient. In besonders bevorzugter Weise ist der Probenträger im Mikrosystemtechnik in der Größe eines Chips ausgeführt, weist also Abmessungen von 1 bis 2 cm2 auf. Das Rahmenteil kann demgemäß in solcher Ausführungsform auch flächig, das heißt eben ausgeführt sein, wobei keine Probenkammer vorgesehen ist und die Elektroden in das Rahmenteil integriert vorliegen. Auf diese Weise wird die Menge an Verbrauchsmaterial minimiert und der Probendurchsatz aximiert. Des weiteren bieten sich beispielsweise bei Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in Chipgrδße Vorteile bezüglich der anzulegenden Spannung, da hohe Feldstärken durch den geringen Elektrodenabstand bereits bei geringen Spannungen erreicht werden können. In vorteilhafter Weise ist die Geometrie des Probenträgers so zu - 24 -
wählen, daß gegebenenfalls sowohl homogene als auch inhomogene elektrische Felder erzeugt werden können. In bevorzugter Ausführungsform ist ein solcher Chip nach den Prinzipien der Mikrofluidik aufgebaut .
In bevorzugter Weise ist die genannte erfindungsgemäße Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, daß zumindest Teile des dem Innenvolumen zugewandten Bereichs der Elektroden und/oder des Rahmenteils immobilisiertes nucleinsäureaffines Material aufweisen. Demgemäß kann in erfindungsgemäß bevorzugter Weise ein Bereich der Elektroden beispielsweise mit spezifischen oder unspezifischen Oligonucleotiden gekoppelt sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung, insbesondere eine Affinitätsmatrix, zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, insbesondere zur Durchführung eines vorgenannten Verfahrens, umfassend ein nucleinsäureaffines Material, zum Beispiel eine nur aus Zufallssequenzen bestehende, vorstehend beschriebene, DNA-Mischung, die an einer Matrix zum Beispiel einer Elektrode immobilisiert ist. Die Erfindung sieht also eine Vorrichtung, insbesondere eine Affinitätsmatrix, vor, mit Hilfe derer das vorgenannte Verfahren durchgeführt werden kann, insbesondere mit Hilfe derer Nucleinsäuren aus einer beliebigen Probe in einfacher und kostengünstiger Weise isoliert werden können.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt eine Matrix, die beispielsweise als Membran, als Kügelchen - 25 -
(beads) oder Säulengel ausgeführt sein kann und als Träger oder Grundgerüst für die nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung fungiert. Es kann auch vorgesehen sein, magnetische Partikel, zum Beispiel Kügelchen, oder Elektroden, zum Beispiel aus Aluminium, Silber, Edelstahl, Gold, Platin und/oder Graphit als Matrix einzusetzen.
Die Erfindung sieht in vorteilhafter Weise vor, als Material für die Matrix ein chemisch und physikalisch weitgehend inertes Material einzusetzen, wie Glas oder Kunststoff, zum Beispiel Polystyrol oder Polypropylen oder ein entsprechend inertes Elektrodenmaterial .
Insbesondere ist das Material in bevorzugter Aus- führungsform der Erfindung geeignet sein, Temperaturunterschiede in einem Intervall zwischen 10°C und 95°C, pH-Unterschiede in einem Intervall zwischen 0 bis 14 und Natrium- beziehungsweise Calium- chloridionenkonzentrationen in einem Intervall von 10 mM bis 2 M ohne signifikante Veränderung der Materialeigenschaften zu tolerieren. Darüber hinaus ist es bevorzugt, daß das eingesetzte Material unlöslich in Wasser Detergentien und Tensidmischungen ist sowie sich chemisch inert gegenüber chaotropen Reagenzien, wie zum Beispiel Isoguanidinthiocyanat , verhält .
Die Matrix ist in vorteilhafter Weise auf ihrer Oberfläche modifiziert, beispielsweise durch das Aufbringen von Biomolekülen, die hochaffin an der Oberfläche des Matrixmaterials binden. Ein derartiges auf der Matrix immobilisiertes Biomolekül kann - 26 -
zum Beispiel Streptavidin sein. Die Matrixoberfläche kann jedoch auch derart modifiziert sein, daß eine kovalente Bindung zwischen dem nucleinsäureaffinen Material, zum Beispiel den Zufallssequenzen der DNA-Mischung, und der Matrix ermöglicht wird. Demgemäß kann die Matrix Aminogruppen aufweisen, die über einen Dialdehydspacer beziehungsweise ein Dialdehydverbindungsmolekül, zum Beispiel Glu- tardialdedyd, unter Bildung einer Schiff 'sehen Base mit einer zum Beispiel am 5 ' - oder 3 ' -Ende der DNA- Zufalls-sequenzen eingeführten Aminofunktion eine Bindung eingehen kann. Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, die Matrix vor Modifizierung ihrer Oberfläche zu reinigen, zum Beispiel mit Salpetersäure. Zudem sieht die Erfindung in vorteilhafter Ausführungsform vor, die Oberfläche der Matrix vor der Modifizierung zu silanisieren.
Die als nucleinsäureaffines Material eingesetzten Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel die Zufallssequenzen der DNA-Mischung, weisen demgemäß zum Zweck der Immobilisierung an der Matrix ebenfalls Modifikationen, am 3 ' - oder 5 '-Ende, auf. Derartige Modifikationen können beispielsweise mit dem 5 ' -Ende der DNA-Zufallssequenz verbundene Biomoleküle wie Biotin sein, die hochaffin an auf der Matrix immobilisierte andere Biomoleküle binden, wie beispielsweise Streptavidin. Es kann auch vorgesehen sein, Aminofunktionen, Epoxidgruppen oder Succinimidester oder andere gängige funktio- nelle Gruppen in die als nucleinsäureaffines Material verwendeten Nucleinsäuren einzuführen vorzugsweise am 5'- oder 3 '-Ende, so daß diese unter Bildung einer Schiff 'sehen Base mit an der Matrix im- - 27 -
mobilisierten Aldehydgruppen kovalent binden können.
In jedem Fall werden die modifizierten Nucleinsäuren, zum Beispiel die DNA-Zufallssequenzen in Einzelstrangform und die modifizierten Matrix miteinander in Kontakt gebracht, so daß die Nucleinsäuren an der Matrix immobilisiert werden. Die mit dem erfindungsgemäß einzusetzenden nucleinsäureaffinen Material in Form von Nucleinsäuren beladene Matrix wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch als Affinitätsmatrix bezeichnet.
Die erfindungsgemäße Affinitätsmatrix kann in vorteilhafter Weise auch auf der Oberfläche von Partikeln aufgebracht werden, die im Rahmen eines Aufschlusses dem Aufschluß zu- beziehungsweise ausgesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA-Mischung, insbesondere einer gleichteiligen Mischung, aus 4X verschiedenen DNA-Zufallssequenzen, wobei x gleich der Kettenlänge der DNA-Zufallssequenz ist, vorzugsweise 5 bis 50, insbesondere 15 bis 30, zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen und dazugehöriger Figuren näher erläutert.
Die Figuren zeigen: - 28 -
Figur 1 eine Matrix einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Figur 2 eine erfindungsgemäße Vorrichtung beziehungsweise DNA-Affinitätsmatrix,
Figur 3 ein Elektropherogramm,
Figur 4 zwei Chromatogramme der Bindung von Standard-DNA an unbehandelte und behandelte Glasperlen,
Figur 5 eine weitere Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in Form eines Probenträgers und
Figur 6 eine weitere Ausführungsform einer erfin- dungsgemäßen Vorrichtung ausgeführt als Chip.
Beispiel 1 : Vorrichtung zur DNA-Isolierung
Die Figur 1 zeigt eine Matrix 10, die in Form einer Membran 1 ausgeführt ist. Die Membran 1 ist auf ihrer Oberfläche mit Streptavidinmolekülen 3 beschichtet .
Die Figur 2 stellt eine Affinitätsmatrix 100 dar, die hergestellt wurde, indem die Matrix 10 mit 5' modifizierten chemisch oder synthetisch hergestellten DNA-Zufallssequenzen 7, 7', 7'' einer DNA-Mischung in Einzelstrangform in Kontakt gebracht wurde, wobei die 5 ' -Modifikation der DNA-Zufallsse- - 29 -
quenz diese in die Lage versetzt, hochaffin an die Streptavidinmoleküle 3 zu binden. Die Figur 2 stellt dar, daß die 5 ' -Enden der DNA-Zufallssequenzen 7, 7', 71' jeweils an Biotin 5 gebunden sind. Die Biotinmodifikation am 5 ' -Ende der DNA- Zufallssequenzen 7, 7', 7'' bindet hochaffin an die immobilisierten Streptavidinmoleküle 3, so daß eine auf einer Matrix 10 immobilisierte DNA-Mischung mit den einzelnen DNA-Zufallssequenzen 7, 7', 7'' gebildet wird.
Beispiel 2: Isolierung von DNA aus einem Zellaufschluß
A) Herstellung der Affinitätsmatrix
Für die Versuche wurden Bailotini Micro-Glaskugeln Typ 3000 der Firma Potters-Ballotini GmbH, Kirch- heimbolanden verwendet . Ihre Größe war mit bis zu 50 μm angegeben. Um das Ausgangsmaterial zu reinigen und die Oberfläche für die Silanisierung vorzubereiten, wurden die Glaskügelchen in Salpetersäure gekocht. 50 g der Glaskügelchen wurden in einen 1 1-Dreihalskolben mit Rücklaufkühler zu 500 ml circa 7%iger Salpetersäure gegeben. Über einen Heizpilz wurde bis zum Sieden erhitzt und 1 Stunde unter Rückfluß gekocht. Währenddessen wurde über einen Magnetrührer mit Rührfisch gerührt . Nach dem Erkalten wurde die überstehende Flüssigkeit abdekantiert. Die Glaskügelchen wurden dreimal mit Wasser in MilliQ-Qualität gewaschen und über eine Nut- sche abfiltriert. Bei 95°C wurden sie über Nacht im Trockenschrank getrocknet. Da nach dem Trocknen mit - 30 -
bloßem Auge noch Verunreinigungen zu erkennen waren, wurde der gesamte Reinigungsvorgang nochmals wiederholt .
10 g der trockenen und gereinigten Glaskügelchen wurden zu 200 ml trockenem Methanol in einen 250 ml Einhals-Rundkolben gegeben. Der Kolben wurde mit Argon gespült. Es wurden 20 ml 3- Aminopropyltrime- thoxysilan (Fluka) zugegeben. Als Katalysator wurden 0 , 5 ml Triethylamin zugesetzt. Der Ansatz wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde abdekantiert und die Glaskügelchen mit Wasser (MilliQ) gewaschen und über eine Nutsche abfiltriert.
Zunächst wurde aus 160 ml 0,1 M K2HP04 und 40 ml 0,1 M KH2P04 ein Kaliumphosphatpuffer hergestellt und auf pH 7,5 eingestellt. Aus 10 ml 25%iger Glu- tardialdehyd-Lösung und 90 ml des Kaliumphosphat- puffers wurde eine 2,5%ige Glutardialdehyd-Lösung hergestellt. Zu 40 ml der 2,5%igen Glutardialdehyd- Lösung wurden 4 g der silanisierten Glaskügelchen zugegeben und circa 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Glaskügelchen wurden anschließend mit Wasser, Kaliumphosphatpuffer und wieder gut mit Wasser gewaschen.
Oligonucleotide (1 μmol pro Ansatz) (15-mere, jedes 15-mer in gleicher Konzentration, das heißt, es liegt eine Verteilung sämtlicher theoretisch möglicher Oligomere mit den Nucleotiden A,T,G und C in jeweils gleichen Anteilen vor, Firma Interactiva, Ulm, Deutschland) wurden in 1 ml Kaliumphosphatpuffer aufgenommen. In einem 15 ml Röhrchen (Greiner - 31 -
GmbH) wurde zu 4 ml Kaliumphosphatpuffer 1 g der silanisierten und mit Glutardialdehyd aktivierten Glaskügelchen sowie 1 ml der Primer-Lösung zugegeben. Der Ansatz wurde kurz in Eis gekühlt. Über Nacht wurde das Röhrchen im Kühlraum auf einen Roller gelegt und dort 17 Stunden gerollt. Die Glaskügelchen wurden in einer Minifuge (Heraeus) 5 Minuten bei 1500 U/min abzentrifugiert . Der Überstand wurde abdekantiert und zunächst im Kühlschrank aufbewahrt. Das Pellet wurde dreimal in circa 6 ml Kaliumphosphatpuffer aufgenommen und abzentrifugiert, um ungebundene Primer auszuwaschen. Die Kügelchen wurden mit Wasser (MilliQ) aufgeschlemmt und je zur Hälfte in zwei Eppendorfhütchen gegeben. Die eine Hälfte wurde so eingefroren, die andere Hälfte wurde in 3 Durchgängen zu je 10 Minuten in der Speed- vac getrocknet und ebenfalls im Gefrierschrank gelagert. Um abschätzen zu können, ob tatsächlich Primer gebunden wurden, wurden von der Primer- Stammlösung und vom Überstand nach dem Anfügen UV- Spektren bei 260 mm aufgenommen. Aus den Spektren wurde die jeweilige Primer-Konzentration ermittelt.
B) Zellaufschluß und DNA-Isolierung
In einem Reaktionsgefäß wurden 300 μl einer physiologisch gepufferten Kochsalzlösung (pH 7,4; 3 M EDTA) mit 109 KBE/ml an Escherichia coli mit 100000 elektrischen Impulsen einer Feldstärke von 1 , 5 kV/cm behandelt. Die Zeitkonstante betrug 2 μs (exponentiell abfallende Impulsform) . Die Impulsfrequenz betrug 5 Hz. Anschließend wurden 50 bis 500 mg der Oligonucleotid-beschichteten Affinitätsperlen zugegeben. Das Reaktionsgemisch erwärmte - 32 -
sich dabei, was ausreichte, die freigesetzte dop- pelsträngige DNA zu denaturieren, so daß sie beim Abkühlen der Reaktionsmischung durch Hybridisierung an die Affinitätsmatrix zu binden vermochte. Durch Unterschichten des Reaktionsgemisches mit Chloroform wurde eine Phasentrennung herbeigeführt, wobei sich die Glasperlen, aufgrund ihres hohen spezifischen Gewichtes in der Chloroformphase anreicherten. Der wäßrige Überstand, der neben Zelltrümmern alle wasserlöslichen Bestandteile des Zellaufschlusses enthält, wurde abgenommen und die Glasperlen, denen die zu isolierende DNA anhaftete, im Vakuum getrocknet .
Wurde die Isolierung der DNA an Dynabeads durchgeführt, wurden 50 μl Zellysat mit 50 μl konjugierten Dynabeads der Konzentration 5 mg/ml in einem Puffer der Zusammensetzung 20 mM Tris/HCl pH = 7,5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA, versetzt. Das resultierende Gemisch inkubierte hier für 10 Minuten auf einem Roller und für weitere 10 Minuten im Stehen. Die mit DNA beladenen Partikel wurden magnetisch separiert und zweimal mit je 100 μl Waschpuffer nach Herstellerangaben gewaschen.
C) Elution von DNA von der Affinitätsmatrix
Die DNA enthaltenden Affinitätsmatrices wurden wahlweise in Wasser oder einem Puffer der Zusammensetzung 10 mM Tris, 1 mM EDTA, ph = 8,0 aufgewärmt. Die resultierende Suspension wurde 10 Minuten zum Sieden erhitzt, wobei sich die an die Affinitätsmatrix gebundene DNA löste und mit dem Überstand, in der Hitze, abgenommen werden konnte. - 33 -
Beispiel 3: DNA-Isolierung und PCR
In einem ersten Experiment wurde die prinzipielle Durchführbarkeit der Isolierung von DNA an immobilisierten DNA-Zufallssequenzen (15-mere, wie in Beispiel 2) gezeigt. Dazu wurden am 5'-Ende bio- tinylierte DNA-Zufallssequenzen an kommerziell erhältliche Streptavidin-beschichtete magnetische Partikel immobilisiert und ihre DNA-Bindungseigen- schaften mit den Bindungseigenschaften eines kommerziell erhältlichen DNA-Isolierungssystems (DYNAL Direct) verglichen. Als Referenz-DNA diente ein das MIF-Gen enthaltendes Plasmid, das aus intakten Escherichia coli Zellen durch chemischen Zellauf- schluß freigesetzt wird. Nach der Plasmid- Isolierung wurde das MIF-Gen mit einem geeigneten Sondenpaar amplifiziert und die PCR-Produkte elek- trophoretisch getrennt. Die Ergebnisse dieser Vergleichsuntersuchungen sind in Figur 3 dargestellt. Die Bahnen 3 und 4 des Elektropherogramms repräsentieren das MIF-PCR-Produkt von Plasmid-DNA, die an DNA-Zufallssequenzen isoliert werden konnte. Dem sind in den Bahnen 5 und 6 die MIF-PCR-Produkte der mit Hilfe des kommerziellen Systems isolierten Plasmid-DNA gegenübergestellt. Es zeigt sich weder ein qualitativer, noch ein quantitativer Unterschied zwischen beiden Isolierungsstrategien. - 34 -
Beispiel 4: Affinitätschromatographie
Die als Affinitätsmatrix zur DNA-Isolierung hergestellten Glasperlen nach Beispiel 2 wurden in eine HPLC-Leersäule übergeführt und dort auf ihre DNA- Bindungskapazität untersucht. Ein wesentlicher Vorteil säulenchromatographischer Verfahren gegenüber sogenannten Batch-Verfahren ist ihre hohe Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit, die Versuchsbedin- gungen (Flußrate, Laufmittel, Temperatur) auf einfache Weise variieren zu können. Die Figur 4 stellt Chromatogramme der Bindung von Standard-DNA (jeweils 25 μg) bei 50 °C und einem Puffer der Zusammensetzung 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH = 8,0 an unbehandelte Glasperlen und an Glasperlen mit immobilisierten DNA-Zufallssequenzen dar. Die Differenz der Flächen unter den Kurven (Kurve 1: Glasperlen ohne DNA-Zufallssequenz ; Kurve 2: Glasperlen mit DNA-Zufallssequenz) entspricht der DNA-Bindungskapazität der Affinitätsmatrix. Die Flußrate betrug jeweils 0,1 ml/min. Unter den gewählten Bedingungen zeigte sich (vgl. Figur 4) , daß die DNA-Bindungskapazität der mit Zu- fallssequenzen beschichteten Glasperlen die Bindungskapazität unbeschichteter Glasperlen um das 7,16 fache übertraf.
Beispiel 5: Nucleinsäureisolierung unter Einsatz elektrischer Felder mittels eines Probenträgers in Chipformat
Die Figur 5 zeigt eine Vorrichtung 200, umfassend eine Probenkammer 210 aus vier zu zwei gegenüber- - 35 -
liegenden Elektrodenpaaren zusammengefaßte Elektroden 220, 220' und einem Rahmenteil 230 aus nicht leitenden Materialien. Der Probenträger ist im Querschnitt rechteckig und im Chipformat aufgebaut, das heißt weist eine Größe von 1 bis 2 cm2 auf. Nicht dargestellt ist der Deckel- und Bodenteil der Probenkammer 210. Rahmenteil 230 und die vier flächig ausgebildeten Elektroden 220, 220' bilden die Wände und umschließen ein Innenvolumen das der Aufnahme der Probe dient. Es kann vorgesehen sein, einen Abstand der beiden gegenüberliegend angeordneten und jeweils eine Wand bildenden Elektrodenpaare 220, 220' von 100 nm bis 5 mm und einen Elektrodendurchmesser bis 1 cm auszuführen. Dargestellt ist, daß nicht leitende Bereiche 240 die einzelnen Elektroden 220, 220' der jeweiligen Elektrodenpaare mit ihren Anschlüssen 225 voneinander trennen, so daß inhomogene und annähernd homogene elektrische Felder erzeugt werden können. So kann die Bildung von inhomogenen Feldern durch Anlegen einer Spannung an nur zwei oder drei von vier leitenden Elementen 220, 220' erreicht werden. Vorzugsweise werden die nicht leitenden Bereiche 240 zwischen den leitenden Elementen 220, 220' eines Elektrodenpaares möglichst klein gewählt, so daß annähernd homogene elektrische Felder entstehen können, wenn zum Beispiel die leitenden Elemente, also Elektroden, 220' als Kathode und die leitenden Elemente, also Elektroden, 220 als Anode fungieren. Die Probenkammer 210 weist ein Rahmenteil 230 auf, welches mit Filtern versehene Eingabe- 260 und Entnahmeeinheiten 270 aufweist. Die Eingabe- und Entnahmeeinheiten 260, 270 sind in anschlußartige nicht leitende Elemente 280 des Rahmenteils 230 so eingepaßt, daß der - 36 -
Probenträger 200 befüllt und entleert werden kann. Um gegebenenfalls spektrophotometrische oder lumi- nometrische Messungen durchführen zu können, weist die Vorrichtung 200 optische Einheiten 290 zwischen nicht leitenden Bereichen 295 und 280 des Rahmenteils 230 auf, so daß die optischen Einheiten so angepaßt werden können, daß Anschlüsse entstehen. Zur elektrischen Detektion können die Anschlüsse 225 der Elektroden 220, 220' verwendet werden. Dargestellt ist auch, daß an den Elektroden 220 Zufallssequenzen 300 der erfindungsgemäß eingesetzten DNA-Mischung immobilisiert sind. Es kann auch vorgesehen sein, die Zufallssequenzen 300 zusätzlich oder ausschließlich am nicht leitenden Element 240 im Bereich der Elektroden 220, 220' anzubringen. Um sämtliche Verfahrensschrittte unter Einsatz elektrischer Felder, das heißt Probenaufschluß, Nucleinsäureaufreinigung und gegebenenfalls Nucleinsäure-Waschen sowie -detek-tion mit dem Probenträger 200 durchführen zu können, müssen ein oder mehrere entsprechende spannungsgebende Apparaturen an den Probenträger 200 angeschlossen werden, um so die verschiedenen notwendigen Felder erzeugen zu können. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich also insbesondere dadurch aus, daß Teile oder Bereiche der Probenkammer 210, also der Wand, des Boden- und/oder Deckelteils aus Elektroden aufgebaut sind, die mindestens ein elektrisches Feld in der Kammer erzeugen können, wobei in Wänden, Boden oder Deckel Öffnungen zur Probeentnahme, eingäbe und/oder Detektion vorhanden sein können.
Die erfindungsgemäße Verfahrensweise sieht unter Einsatz der vorgenannten Vorrichtung zunächst vor, - 37 -
daß eine Probe, wie in Wasser befindliche E. coli- Zellen, in den Probenträger 200 eingebracht wird. Anschließend kann gegebenenfalls eine Dielektropho- rese unter Einsatz eines elektrischen Feldes zur Konzentrierung beziehungsweise Abtrennung bestimmter biologischer Zellen oder als Voraussetzung für eine Elektrofusion vorgesehen sein, wobei an die Anschlüsse 225 der Elektroden 220, 220' eine entsprechende Spannung angelegt wird. Dabei kann eine Elektrofusion vorgesehen sein, um die Elektrolyse zu unterstützen oder eine Markierung durchzuführen. Anschließend wird eine elektrische Spannung beispielsweise zur Erzeugung gepulster elektrischer Felder oder eines elektrischen Feldes konstanter Spannung so angelegt, daß eine Elektrolyse der biologischen Zellen oder der Viren erfolgt, wobei gegebenenfalls die Bedingungen so eingestellt werden können, daß nur bestimmte biologische Zellen elek- trolysiert werden. Vorliegend wird ein elektrisches Feld mit einer Feldstärke von 0,5 bis 50 kV/cm. Anschließend werden die Bedingungen so gewählt, daß die aus den aufgeschlossenen Zellen freigesetzten Nucleinsäuren unter Einsatz eines elektrischen Feldes mit entweder frei in der Probenkammer vorliegenden Zufallssequenzen der erfindungsgemäß eingesetzten DNA-Mischung oder mit den im Anodenbereich an leitenden und/oder nicht leitenden Bereichen der Probenkammer 210 immobilisierten Zufallssequenzen 300 der erfindungsgemäß eingesetzten DNA-Mischung elektrohybridisieren können. Für den Zellaufschluß und die Elektrohybridisierung wurden Impulszahlen von 1000 bis 10000, Impulsdauer beziehungsweise Zeitkonstanten von 2 μs bis 50 ms und Feldstärken von 0,5 bis 20 kV/cm eingesetzt. - 38 -
Anschließend kann gegebenenfalls elektrostringentes Waschen unter Umpolung und An- beziehungsweise Entreicherung bestimmter Nucleinsäuren und Abtrennung unerwünschter Stoffe, zum Beispiel von Amplifikationsinhibitoren, durchgeführt werden. In der Probenkammer 210 schließt sich anschließend gegebenenfalls eine Elektroelution und gegebenenfalls eine Amplifikation der noch vorhandenen Nucleinsäuren an, vorzugsweise über eine elektrische, isotherme PCR, wie beschrieben in WO 97/47767. Schließlich kann, vorzugsweise elektrisch, eine Detektion der gebundenen oder frei vorliegenden aufgereinigten Nucleinsäuren erfolgen (beschrieben zum Beispiel in Hintsche, 1999, a.a.O.)
Dem Fachmann ist klar, daß zwischen oder nach einzelnen beschriebenen Schritten je nach Isolierstrategie ein Waschen oder Eluieren erwünschter oder gegebenenfalls nicht erwünschter Substanzen oder Nucleinsäuren ebenso wie eine Änderung des elektrischen Feldes hinsichtlich Polung, Feldstärke, Im- pulszahl, Impulsdauer oder Impulsfrequenz erfolgen kann.
Beispiel 6 :
Die Figur 6 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung 400 zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die Vorrichtung 400 aus einem flächig ausgebildeten nichtleitenden Rahmenteil 560 und mindestens zwei in dieses flächig ausgebildete Rahmenteil integrierten Elektroden 500 aufgebaut - 39 -
ist. Die erfindungsgemäße Vorrichtung 400 ist als Chip ausgeführt, das heißt weist keine aus Wandoder Deckelteil gebildete Probenkammer auf. Die Erfindung betrifft also auch einen flächig ausgebildeten Probenträger, das heißt einen Chip, aus einer nichtleitenden Chipbasis 560, auch als Rahmenteil bezeichnet, und zwei in diese Chipbasis 560 integrierten flächigen Elektroden 500. In bevorzugter Weise können an den Elektroden 500 nucleinsäureaf- fine Materialien 550, wie beispielsweise eine DNA- Mischung aus Zufallssequenzen, immobilisiert sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich durch eine gezielte Ansteuerung der Elektroden in chronologischer Abfolge durchführen, beispielsweise eine Elektrodenansteuerung 1 zum elektrischen Aufschluß des biotischen beziehungsweise abiotischen Materials (Nucleinsäureisolierung) , eine Elektrodenansteuerung 2 zur elektrischen Nucleinsaurereinigung, eine Elektrodenansteuerung 3 zur elektrischen isothermen Nucleinsäureamplifikation und eine Elektrodenansteuerung 4 zur elektrischen Detektion.

Claims

- 40 -Ansprüche
1. Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, wobei die Probe unter dem Einfluß wenigstens eines elektrischen Feldes aufgeschlossen wird und die freigesetzten Nucleinsäuren mit einem nucleinsäureaffinen Material so in Kontakt gebracht werden, daß eine Bindung zwischen den freigesetzten Nucleinsäuren und dem nucleinsäureaffinen Material stattfinden kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei im Anschluß an das Inkontaktbringen der Nucleinsäuren mit dem nucleinsäureaffinen Material die restliche Probe von den an dem nucleinsäureaffinen Material gebundenen Nucleinsäuren abgetrennt wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das elektrische Feld ein gepulstes elektrisches Feld ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 , wobei das elektrische Feld ein Feld einer konstanten Spannung ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens zwei elektrische Felder eingesetzt werden. - 41 -
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei während des Inkontaktbringens der Nucleinsäuren mit dem nucleinsäureaffinen Material wenigstens ein elektrisches Feld eingesetzt wird, vorzugsweise ein gepulstes elektrisches Feld oder ein elektrisches Feld konstanter Spannung.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das elektrische Feld während des Inkontaktbringens der Nucleinsäuren mit dem nucleinsäureaffinen Material umgepolt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die gebundenen Nucleinsäuren gewaschen werden, vorzugsweise unter Einsatz eines elektrischen Feldes.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im Anschluß an die Bindung der Nucleinsäuren an das nucleinsäureaffine Material oder ein gegebenenfalls erfolgtes Ablösen der gebundenen Nucleinsäure von dem nucleinsäureaffinen Material die Nucleinsäuren optisch, luminometrisch, spektro- photometrisch, radioaktiv oder elektrisch unter Einsatz eines elektrischen Feldes nachgewiesen werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nucleinsäuren vor dem Nachweis amplifiziert werden.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nucleinsäureaffine Material frei in Lösung vorliegt. - 42 -
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 , wobei das nucleinsäureaffine Material an einem Probenträger immobilisiert vorliegt.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nucleinsäureaffine Material ein Anionentauscher , Silica, Diatomeen, ein nucleinsäu- rebindendes Protein oder eine Nucleinsäure ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nucleinsäureaffine Material ein fragmentiertes Zielgenom, ein Gemisch von Zufalls- nucleinsäuresequenzen oder eine sequenzspezifische Nucleinsäuresequenz ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Nucleinsäuresequenz ein Oligonucleotid ist.
16. Vorrichtung zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, insbesondere zur Durchführung eines der vorgenannten Verfahren, umfassend mindestens eine Probenkammer (210) mit mindestens zwei flächig ausgebildeten Elektroden (220,220') und mindestens einem nicht-leitenden Rahmenteil (230) , wobei die mindestens zwei flächig ausgebildeten Elektroden (220,220') und das Rahmenteil (230) als Wand-, Deckel- oder Bodenteil der Probenkammer
(210) ausgeführt sind.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16 , wobei die Elektroden (220,220') aus Aluminium, Edelstahl, Silber, Gold, Platin oder Graphit bestehen oder dieses einzeln oder in Kombination enthält. • 43
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei das nicht-leitende Rahmenteil (230) aus Kunststoff, Glas oder Silicium besteht oder diese einzeln oder in Kombination enthält .
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei in das mindestens eine Rahmenteil (230) Eingabe- und Entnahmeeinheiten (260,270) integriert sind.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei in das Rahmenteil (230) optische Einheiten
(290) integriert sind.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei das nucleinsäureaffine Material an mindestens einer Elektrode (220,220') und/oder dem mindestens einen Rahmenteil (230) immobilisiert ist.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei das nucleinsäureaffine Material Silica, Anio- nentauscher oder eine Nucleinsäure (300) ist, insbesondere ein fragmentiertes Zielgenom, Zufallssequenzen oder eine seguenzspezifische Nucleinsäure- sequenz.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei die Vorrichtung Chipformat von 1 bis 2 cm2 aufweist .
2 . Vorrichtung zur Durchführung eines vorgenannten Verfahrens, umfassend ein flächig ausgebildetes nichtleitendes Rahmenteü C5 Ü) , mindestens zwei -in
RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA/EP - 44 -
de Rahmenteil (560) integrierte flächig ausgebildete Elektroden (500) sowie auf dem Rahmenteil (560) und/oder den Elektroden (500) immobilisiertes nucleinsäureaffines Material (550) .
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