KR101217549B1 - 광전 변환 소자를 구비한 핵산 분리 장치, 미세 유체 장치및 그 정제 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 입출구를 구비한 챔버, 상기 챔버를 한정하며 챔버 내에서 전기장을 형성하는 전극 및 상기 전극에 바이어스를 가하는 광전 변환 소자를 구비하는 핵산 분리 장치, 미세 유체 장치 및 그 정제 방법을 개시한다.
본 발명에 따른 핵산 분리 장치는 광전 변환 소자 및 전도성 투명 전극을 구비하여 자체적인 구동이 가능하면서도 PCR 버퍼를 핵산 용출액으로 사용할 수 있어 장치의 집적화 및 신속 간단한 정제가 가능하며 상기 정제 장치를 구비한 미세 유체 장치는 독립 구동 및 핵산의 정제 및 PCR을 동시에 수행할 수 있어 장치의 소형화 및 자동화가 가능하다.
Description
도 1 은 본 발명에 따른 핵산 분리 장치의 개략적인 모식도이다.
도 2 는 Cy3 표지된 핵산을 이용한 ITO 전극의 핵산 분리 효과를 보여주는 실험 결과이다.
도 3 은 핵산 분리 후의 PCR 증폭 효율을 보여주는 결과이다.
도 4 는 PCR 저해제를 첨가한 경우의 핵산 분리 후 PCR 증폭 효율을 보여주는 결과이다.
<본 발명에 사용된 부호의 설명>
1 : 챔버 2 : 전극
3 : 광전 변환 소자 4 : 입구
5 : 출구 10 : 핵산 분리 장치
20 : 입사광
본 발명은 광전 변환 소자 및 전도성 투명 전극을 구비한 핵산 분리 장치 및 이를 이용한 핵산의 정제 방법에 관한 것으로서 보다 구체적으로는 광전 변환 소자 및 전도성 투명 전극을 구비하여 별도 전원 없이도 구동이 가능하며 분리된 핵산의 용출과 PCR을 동시에 수행할 수 있는 핵산 분리 장치 및 이를 이용한 정제 방법에 관한 것이다.
랩온어칩(lab-on-a-chip) 등으로 대표되는 바이오칩에서 생물학적 샘플 중의 핵산을 분석하여 각종 질병의 진단 등을 실시할 경우에 당면하는 실질적인 문제 중의 하나는 샘플 중에 분석 대상인 핵산 등의 농도가 매우 낮다는 점이다. 따라서 핵산을 선택적으로 분리 농축하여 PCR 등으로 증폭시키는 방법이 일반적으로 사용되고 있으며 증폭을 위해서 핵산을 선택적으로 분리하여 농축하는 것이 중요한 문제가 되었다.
핵산을 선택적으로 분리하기 위한 종래 기술로는,
먼저 핵산과 선택적으로 결합하는 물질을 사용하는 방법으로서 이러한 물질의 예는 실리카, 유리 섬유, 음이온 교환수지 및 자성 비드 등이 있다.
예를 들어, 미국 특허 등록 제 5,234,809 호는 출발 물질, 카오트로픽 물질(chaotrophic material) 및 핵산 결합 고상 물질을 혼합하여 핵산을 정제하는 방법을 개시하고 있으나 상기 방법은 시간이 오래 소요되어 실제적인 사용에는 부적합하다.
미국 특허 등록 제 6,291,166 호는 양전하를 띠는 알루미나로 이루어진 고상 매트릭스를 이용하여 핵산을 정제하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 방법은 정제된 핵산이 분리되지 않아 이후의 추가적인 분석이 어려운 문제가 있다.
다음으로는 핵산이 포함된 시료에 전기장을 가하여 분리하는 방법이 있다.
예를 들어 WO97/041219는 전극을 사용하여 이들에 의해 발생한 전기장으로 핵산을 분리하는 방법을 개시한다. 핵산은 일반적으로 음이온을 띠므로 양으로 바이어스된 전극으로 이동시켜 분리하는 방법이다. 그러나 상기 방법은 별도의 용출 단계가 필요하며 전기장 발생을 위해 구동 전원이 요구된다는 점에서 소형화 경량화 및 단순화를 지향하는 랩온어칩에 부적합한 문제가 있다.
미국 특허 제 6,518,022 호는 전기장을 가하면서 전극표면 상에 특정 핵산과 결합할 수 있는 프로브를 형성시켜 특정 핵산과의 혼성화 효율을 높이는 방법이 기재되어 있다. 즉 전극 표면에 핵산과의 결합이 용이한 물질을 부착시켜 결합 수율을 높이면서도 핵산을 선택적으로 정제하는 방법이다. 그러나 상기 방법은 전극 표면의 개질이 필요하므로 제조가 복잡하고 결합된 핵산의 용출을 위해 별도의 용출 단계가 필요하다는 단점이 있다.
상기와 같이 종래의 핵산 분리 기술들은 일반적인 핵산 분리 물질을 사용할 경우 분리 효율이 나쁘거나 오랜 시간이 소요되는 문제가 있으며 전기장을 이용할 경우 시간은 단축되나 구동 전원이 요구되며 분리된 핵산을 용출하는 별도의 단계가 필요하게 되어 소형화 경량화 및 빠른 분석(assay) 시간이 요구되는 랩온어칩 상에 적용하기에 부적합한 문제가 있었다.
따라서 외부 전원 공급 없이도 구동될 수 있으며 간단하면서도 신속한 분석이 가능하여 랩온어칩을 보다 실질적으로 구현할 수 있는 실용적인 핵산 분리 수단 이 요구된다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 광전 변환 소자 및 전도성 투명 전극을 구비한 핵산 분리 장치를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 상기 장치를 구비한 미세 유체 장치를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 상기 장치를 이용한 핵산 분리 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 기술적 과제를 달성하기 위하여,
입출구를 구비한 챔버;
상기 챔버를 한정하며 챔버 내에서 전기장을 형성하는 전극; 및
상기 전극에 바이어스를 가하는 광전 변환 소자;
를 구비하는 핵산 분리 장치를 제공한다.
본 발명에 의한 일 실시예에 따르면 상기 전극은 상기 광전 변환 소자의 일표면상에 형성되는 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 일 실시예에 따르면 상기 전극은 유체와 접촉하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 전극은 전도성 투명 전극인 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여 상기 핵산 분리 장치를 구비하는 미세 유체 장치를 제공한다.
본 발명은 상기 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여,
핵산을 포함하는 시료를 전도성 투명 전극과 접촉시키는 단계;
상기 전극에 바이어스를 가하는 단계;
상기 전극을 세정하는 단계; 및
용출액으로 상기 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 핵산 분리 방법을 제공한다.
이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
통상의 핵산 분리 장치가 별도의 외부 전원 및 핵산 용출액이 필요하여 단독으로는 사용이 불가능하고 정제에도 여러 단계가 필요하였던 것과 달리, 본 발명에 따른 핵산 분리 장치는 광전 변환 소자 및 전도성 투명 전극을 구비하여, 자체적인 구동이 가능하면서도 PCR 버퍼를 핵산 용출액으로 사용할 수 있어 장치의 소형화, 집적화 및 신속 간단한 정제가 가능하다. 또한 상기 정제 장치를 구비한 미세 유체 장치는 핵산의 정제 및 PCR을 동시에 수행하는 것이 가능하다.
도 1에 도시된 바와 같이 본 발명의 핵산 분리 장치(10)는 입출구(4, 5)를 구비한 챔버(1), 상기 챔버를 한정하며 챔버 내에서 전기장을 형성하는 전극(2) 및 상기 전극에 바이어스를 가하는 광전 변환 소자(3)를 구비하는 것이 바람직하다. 상기 입출구(4,5)를 구비한 챔버에서 입출구는 각각 밸브를 추가적으로 구비하는 것이 바람직하며 입출구의 갯수 및 위치는 특별히 한정되지 않는다. 상기 챔버(1) 는 단순히 빈 공간으로 한정되지 않으며 챔버 내에서 유체의 혼합 등을 돕거나 보다 효율적인 정제를 돕기 위해 부분적인 격벽에 의해 전체적으로 연결된 보다 좁은 공간으로 구획되어 있을 수 있다. 상기 챔버내에 형성된 전극(2)은 복수개일 수 있으며 이들은 연속 또는 분리되어 존재할 수 있다. 상기 전극의 위치는 전극이 챔버 내에 노출되는 범위내에서 특별히 한정되지 않는다.
상기 광전 변환 소자(3)는 입사광(20)이 존재하면 전원으로 작용하므로 별도의 외부 전원 없이도 상기 정제 장치(10)를 구동할 수 있다. 또한 광전 변환 소자는 대부분 박막형이므로 상기 장치의 표면에 부착하는 방법 등으로 간단히 추가하는 것이 가능하다. 광전 변환 소자는 현재 실리콘계의 경우 최고 20% 이상의 광전 변환 효율을 보이고 있으며 수 볼트 수준의 전압을 구현할 수 있으므로 상기 핵산 분리 장치가 요구하는 전기장의 형성에 필요한 전압을 제공하는 것이 가능하다. 또한 상기 전압에서 전극 사이에서 전류는 거의 흐르지 않아 마이크로 암페어 미만의 수준이기 때문에 상기 전압을 정제가 완결될 때까지 유지하는 것이 가능하다. 상기 광전 소자에 입사하는 빛은 반드시 태양광으로 한정되지 않으며 자외선, 가시광선, 적외선 영역에 해당하는 모든 파장의 빛이 해당한다.
본 발명에서 상기 전극에 가해지는 바이어스는 전극 간 거리에 따라 조절될 수 있으며 그 크기는 1 uV 내지 10V인 것이 바람직하다. 상기 챔버 내에서 일정 크기의 전기장을 형성할 수 있으면 되므로 전극 간 거리가 um 수준일 경우에는 uV 수준의 바이어스로도 필요한 세기의 전기장을 얻을 수 있으며 전극간 거리가 증가할 경우 바이어스도 이에 비례하여 증가하게 된다. 상기 바이어스가 1 uV 미만인 경우 에는 바이어스를 정밀하게 제어하는 것이 곤란하고 10V 를 초과하는 경우에는 전극 표면에서 전기 분해가 일어나는 문제가 있다.
또한 상기 바이어스가 가해질 경우에 전극 간에 흐르는 전류는 작을수록 바람직하지만 1nA 내지 1mA인 것이 바람직하다. 전류가 1mA를 초과하는 경우에는 전기 분해가 일어나며 전류가 1nA 미만인 경우는 얻어지기가 어려운데 이는 전해질에 존재하는 다양한 화학종 들에 의해 완전한 절연 상태가 실제로 얻어지기 힘들기 때문이다.
본 발명에서 상기 광전 변환 소자(3)는 상기 전극(2)과 전기적으로 연결되어 있으면 되지만 상기 전극이 상기 광전 변환 소자의 일표면을 형성하는(2,3) 것이 바람직하다. 상기 전극이 광전 변환 소자의 일표면상에 형성될 경우 별도의 전극이 필요하지 않아 간단한 설계가 가능하며 일반적인 광전 변환 소자가 광전 변환층 상부 및 하부에 전극을 구비하고 있으므로 이들을 그대로 사용할 수 있기 때문이다. 상기 전극에 대한 대항 전극은 챔버의 반대편에 위치할 수 있으나 이에 한정되지 않으며 챔버 내에서 균일한 전기장을 형성할 수 있으면 그 위치가 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 전극은 핵산을 포함하는 시료와 직접 접촉하는 것이 바람직하다. 상기 전극에 양의 바이어스가 가해질 경우 음전하를 띠는 핵산이 일종의 전기장 속에서 양으로 대전된 전극 표면으로 이동하고 전극에 흡착된다. 전극 표면에서 핵산과 전극 사이에 가장 강력한 정전기적 인력이 작용하므로 가장 효과적으로 핵산을 보유할 수 있어 세정 등의 후속 단계에서 손실되는 핵산의 양을 최소화 시킬 수 있기 때문이다.
본 발명에서 상기 전극(2)은 일반적인 금속 전극인 금, 백금, 구리, 알루미늄, 티타늄 , 텅스텐 및 금속 규화물 등도 사용될 수 있으나 전도성 투명 전극인 것이 바람직하다. 상기 전도성 투명 전극은 광전 변환 소자에서 전극으로 주로 사용되며 광전 변환 소자에 입사하는 빛을 차단하지 않기 때문에 입사광(20)과 광전 변환 소자(3) 사이에 위치하는 것도 가능하여 챔버 내에서 그 위치에 제한 없이 설치할 수 있다.
본 발명에서 상기 전극이 보유하는 핵산의 용출을 위한 용출액은 PCR 버퍼이다. 따라서 전극이 보유하는 핵산을 용출하기 위해서는 별도의 용출액을 사용하여야 하는 종래의 핵산 분리 기술과 달리 본 발명의 장치에서는 PCR 버퍼만으로 핵산의 용출이 가능하다. 이 경우 용출액을 별도로 주입하여 용출하는 단계의 생략이 가능하므로 분석 시간을 단축할 수 있고 전체 장치의 구조도 간단해질 수 있다.
또한 상기 정제 장치를 구비한 미세 유체 장치는 핵산이 전극에 보유된 상태에서 바로 PCR을 수행하여 핵산의 용출 및 PCR이 동시에 가능하게 되며 이에 관해서는 미세 유체 장치 부분에서 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에서 상기 광전 변환 소자(3)는 상기 챔버의 수평면에 평행하게 위치하는 것이 바람직하다. 입사광(20)은 일반적으로 정제 장치(10)에 수직한 방향으로 입사하므로 상기 입사광에 수직하게 수평 방향으로 위치시키는 것이 가장 많은 빛의 흡수를 가능하게 하기 때문이다. 핵산 분리 장치는 일종의 칩 형태를 가지게 되므로 넓고 얇은 평면 형태를 가지게 되므로 광전 변환 소자는 상기 평면의 상부 또 는 하부에 위치하는 것이 바람직하다. 그러나 상기 장치의 외부로 노출된 다른 면에 광전 변환 소자가 배치되는 것을 금지하는 것은 아니며 광전 변환 소자의 설치가 가능한 어느 위치에도 설치가 가능하다.
본 발명에서 상기 핵산 분리 장치(10)는 입사광(20) 만으로 구동되는 것이 바람직하다. 상기 핵산 분리 장치를 외부 전원과 연결하여 사용하는 것도 가능하나 독자적으로도 상기 장치를 구동할 수 있어야 독립된 장치로 작동할 수 있기 때문이다.
또한 상기 핵산 분리 장치가 제어 장치를 추가적으로 구비하는 것이 바람직하다. 상기 제어 장치는 별도의 전원을 요구하는 중앙 처리 장치를 포함하는 것도 가능하나 한정된 전원을 고려하여 시간에 따라 미리 정해진 순서를 반복하는 간단한 회로가 보다 바람직하며 상기 핵산 분리 장치가 외부 장치와 전기적으로 연결 가능한 것도 가능하다.
본 발명에서 상기 전도성 투명 전극(2)은 ITO(인듐틴옥사이드), FTO(불소로 코팅된 틴옥사이드), SnO2 등을 예로 들 수 있다. 상기 전극들은 투명하면서도 전기 전도성을 가져 광전 변환 소자의 배치를 보다 유연성 있게 만들어 준다. 또한 상기 전극들은 고온에서도 견딜 수 있기 때문에 PCR에 수반되는 온도 변화에도 영향을 받지 않는다.
또한 상기 광전 변환 소자(3)는 실리콘계, 화합물 반도체, 염료 감응형 등을 예로 들 수 있으나 이들에 한정되지 않으며 빛에너지를 전기 에너지로 바꿀 수 있 는 모든 형태의 광전 변환 소자를 포함한다.
본 발명에서 상기 챔버는 열 출입 장치를 추가적으로 구비하는 것이 바람직하다. 열 출입 장치를 추가적으로 구비함으로써 상기 챔버에서 PCR이 가능해진다. 상기 열 출입 장치는 챔버에 열을 공급하거나 챔버에서 열을 흡수하는 기능을 수행할 수 있는 장치이면 어떤 장치라도 가능하지만 바람직하게는 열전 소자(thermoelectric device) 등을 예로 들 수 있다.
상기 핵산 분리 장치를 구비하는 미세 유체 장치는 시료 입력부, 샘플 챔버, 정제 및 증폭 챔버, 분석 챔버, 시료 배출부로 이루어지며 상기 핵산 분리 장치는 정제 및 증폭 챔버를 포함하는 부분에 해당한다. 시료 입력부는 일반적으로 외부에서 접근이 가능하지만 시료가 도입된 이후에는 밀봉될 수 있으며 샘플 챔버는 입력된 시료(세포)를 용해(lysis)시키며 정제 및 증폭 챔버에서 핵산의 정제 및 PCR이 수행된다. 상기 증폭된 핵산은 분석 챔버로 보내져 분석 기기를 이용해 분석되고 분석이 끝난 샘플은 시료 배출부로 보내진다.
상기 미세 유체 장치는 상기 기본 구조에 세정 용액, 용해 시약, PCR 혼합액을 보유하는 챔버와 상기 챔버에 연결된 밸브 및 유체를 이동시키는 펌프를 제어하는 제어부 및 구동 전원을 추가적으로 보유할 수 있다.
본 발명의 미세 유체 장치는 핵산의 용출과 용출된 핵산의 PCR이 동시에 행해지는 것이 바람직하다. 즉 핵산이 전극에 보유된 상태에서 용출액으로 PCR버퍼를 사용하여 가열함으로써 핵산의 용출 및 PCR이 동시에 수행되는 것이 가능하다. 이 경우 핵산의 정제와 PCR을 하나의 챔버에서 수행할 수 있으므로 구조를 보다 간단 하게 만들수 있다. 또한 상기 미세 유체 장치는 입사광 만으로 구동되는 것이 바람직하다. 상기 미세 유체 장치가 추가적인 외부 전원 없이 광전 변환 소자에서 공급되는 전력만으로 구동될 경우 독립적으로 사용될 수 있기 때문이다.
본 발명의 미세 유체 장치는 상기 핵산 분리 장치를 포함하는 범위내에서 상기 구성 이외에도 미세 유체 장치에 적용되는 당해 기술분야에서 알려진 모든 구성이 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 핵산 분리 방법은 다음과 같다.
우선 핵산을 포함하는 시료를 전도성 투명 전극과 접촉시키고, 상기 전극에 바이어스를 가하여 핵산을 전극상에 흡착시키고 여기에 세정액을 주입하여 상기 전극을 세정하고 마지막으로 용출액을 주입하고 가열하여 상기 핵산을 용출하여 핵산을 정제한다.
본 발명에 따라 상기 핵산을 용출하는 단계는 PCR을 수행하는 단계와 동시에 행해지는 것이 바람직하다. 즉 용출액으로 PCR 버퍼를 사용하고 상기 챔버의 온도를 변화시키면 전극이 보유하고 있던 핵산이 용출되면서 PCR이 동시에 일어나게 된다. PCR을 방해하는 것을 알려진 혈액 등이 존재하는 경우에도 PCR을 효율적으로 수행할 수 있다.
구체적으로 본 발명에서 본 발명에 사용되는 PCR 버퍼는 특별히 한정되지 않으나 바람직하게는 상기 핵산의 용출에 사용되는 PCR 버퍼는 BSA를 포함하는 것이 바람직하다
상기 방법에서 사용되는 전도성 투명 전극은 ITO, FTO, SnO2 등을 예로 들 수 있다.
그리고, 본 발명에서 상기 전극에 가해지는 바이어스는 전극간의 거리가 1~ 1.5cm 인 경우 2 내지 4V인 것이 바람직하다. 바이어스가 1V 미만인 경우에는 핵산이 전극으로 이동하는데 시간이 오래 걸리는 문제가 있으며 5V를 초과하는 경우에는 유체가 전기 분해되는 문제가 있다. 전극 간 거리에 따라 전극에 가해지는 전압은 달라지는데, 전극 간 거리가 좁을 때에는 낮은 전압이 요구된다.
보다 구체적으로는 본 발명에서 상기 전극에 가해지는 바이어스는 전극 간 거리에 따라 조절될 수 있으며 그 크기는 1 uV 내지 10V인 것이 바람직하며 상기 바이어스가 가해질 경우에 전극 간에 흐르는 전류는 작을수록 바람직하지만 1nA 내지 1mA인 것이 바람직하다. 전류가 1mA를 초과하는 경우에는 전기 분해가 일어나며 전류가 1nA 미만인 경우는 얻어지기가 어려운데 이는 전해질에 존재하는 다양한 화학종 들에 의해 완전한 절연 상태가 실제로 얻어지기 힘들기 때문이다.
이하에서 본 발명을 실시예 및 비교예를 들어 보다 상세히 설명하나 이는 본 발명을 당업자들에게 설명하기 위한 것으로서 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 전극을 이용한 핵산 분리 및 용출 효과
실시예 1
Eppendorf 튜브내에 1uM 의 Cy3 표지된 올리고뉴클레오티드(31머; AGG CTT CTT CTT TGC ACC GGT TGG CAA ACC A)를 포함하는 히스티딘 전해액(히스티딘 50mM) 2 ml를 준비하였다. 작동 전극으로 ITO 전극을 사용하였고 대항 전극으로 금 박막이 입혀진 웨이퍼를 사용하였다. 상기 두 전극 사이에 5V의 전압을 5분간 가한 다음 증류수로 5ml로 3회 세정하였다. 그런 후에 ITO 전극을 용출액으로 용출시켰다. 이때 용출액으로 0.1mg/ml의 BSA(Bovine Serum Albumin)가 포함된 10×PCR 버퍼(100mM Tris- HCl, 500mM KCl, 15mM MgCl2, Taq polymelase Enzyme 0.5M)를 사용하였다. 용출 후, 핵산을 예비변성(95도, 1분)하고, 변성(96도, 5분)/어닐링(60도, 13분)/연장(70도, 15분)을 25회 반복한 다음, 최종 연장(72도, 1분)반응시켜 PCR 증폭하였다. 그리고, ITO 전극에 잔존하는 DNA의 양을 정량적으로 측정하기 위해 레이저 스캐너(Axon사 모델 GenePix4000B PMT(photon multiplier tube) 520 사용)로 형광물질에서 나오는 형광의 상대적인 세기를 측정하였다. 결과는 도 2에 나타나 있다.
실시예 2
상기 실시예 1 에서 용출액으로 BSA(Bovine Serum Albumin)가 포함된 1× PCR 버퍼를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 과정을 수행하였다. 결과는 도 2에 나타나 있다.
실시예 3
상기 실시예 1 에서 용출액으로 BSA(Bovine Serum Albumin)가 포함되지 않은 10×PCR 버퍼를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 과정을 수행하였 다. 결과는 도 2에 나타나 있다.
실시예 4
상기 실시예 1 에서 용출액으로 BSA(Bovine Serum Albumin)가 포함되지 않은 1×PCR 버퍼를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 과정을 수행하였다. 결과는 도 2에 나타나 있다.
실시예 5
상기 실시예 1 에서 용출액으로, BSA가 포함된 PCR 버퍼 대신에 BSA(Bovine Serum Albumin) 10mg/ml만을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 과정을 수행하였다. 결과는 도 2에 나타나 있다.
비교예 1
대조군으로서 핵산과 접촉하기 전의 ITO 전극이다. 결과는 도 2에 나타나 있다.
비교예 2
상기 실시예 1 에서 용출액으로 전극에 결합된 핵산을 용출시키는 단계를 생략한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 과정을 수행하였다. 결과는 도 2에 나타나 있다.
비교예 3
상기 실시예 1 에서 용출액으로 뜨거운 증류수를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 과정을 수행하였다. 결과는 도 2에 나타나 있다.
상기 실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 3에 따른 실험 후 ITO 전극을 레이 저로 스캔한 결과를 도 2에 나타내었다. 상기 도면에서 보여진 바와 같이 비교예 1의 대조군은 핵산이 부착되지 않아 아무런 형광이 나타나지 않아 수치가 0에 가깝게 나타났으나 비교예 2의 핵산을 용출액으로 용출시키기 전 단계의 경우와 비교해 볼 때 비교예 3의 용출액으로 뜨거운 증류수를 사용한 경우는 핵산의 용출이 거의 일어나지 않음을 보여주고 있다. 반면 실시예 3 및 4에서 BSA를 포함하지 않은 PCR 버퍼는 비교예 3과 큰 차이를 보이지 않았으나 실시예 1 및 2 의 BSA를 포함한 PCR 버퍼는 상대적으로 우수한 핵산의 용출을 보여주어 원래의 ITO 층이 많이 회복된 모습을 보여주고 있다. BSA를 단독으로 사용한 경우(실시예5)도 BSA를 포함한 PCR 버퍼를 사용한 경우와 유사한 결과를 보여주었다.
본 발명의 전극에 의해 정제된 핵산의 PCR 증폭 효율
실시예 6
Eppendorf 튜브에 10ng/ul 농도로 1ml의 황색포도상구균 (Staphylococcus Aureus) gDNA를 첨가하고 히스티딘 전해액(히스티딘 50mM) 2 ml를 첨가하였다. 작동 전극으로 ITO 전극을 사용하였고 대항 전극으로 금 박막이 입혀진 웨이퍼를 사용하였다. 상기 두 전극 사이에 5V의 전압을 5분간 가한 다음 증류수로 3회 철저히 세정하였다. 그런 후에 ITO 전극을 BSA(Bovine Serum Albumin)가 포함된 10×PCR 버퍼가 들어있는 PCR 튜브에 옮긴 후 직접 PCR 반응을 수행하였다. 결과는 도 3의 1번 레인에 나타나있다. 마커는 M이다.
비교예 4
BSA(Bovine Serum Albumin)가 포함된 10×PCR 버퍼가 들어있는 PCR 튜브에 10ng/ul 농도의 황색포도상구균 (Staphylococcus Aureus) gDNA 1ul를 첨가한 후 실시예 6에서 사용한 것과 동일한 크기의 ITO를 첨가한 후 PCR 반응을 수행하였다. 결과는 도 3의 2번 레인에 나타나있다.
비교예 5
상기 실시예 6 에서 전압을 가하지 않고 단순히 5분간 ITO 전극을 버퍼에 담궈 두었다가 꺼낸 것을 제외하고는 상기 실시예 6과 동일한 과정을 수행하였다. 결과는 도 3의 3번 레인에 나타나있다
상기 실시예 6 및 비교예 4 내지 5에 따른 PCR 결과는 도 3에 나타난 바와 같이 전기장으로 핵산을 부착시킨 실시예 6 이 전기장을 가하지 않은 비교예 5에 비하여 확실한 차이를 보여주고 있으며 단순히 gDNA를 첨가한 비교예 4 보다도 상대적으로 많은 양의 gDNA를 용출한 것으로 나타났다.
본 발명의 전극에 의해 정제된 핵산의 PCR 저해제의 존재시의 PCR 증폭 효율
실시예 7
Eppendorf 튜브내에 100% 혈액 500ul 및 1ng/ul 농도의 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae) gDNA 1ul 를 첨가하고, 히스티딘 전해액(히스티딘 50mM) 2 ml를 첨가하였다. 작동 전극으로 ITO 전극을 사용하였고 대항 전극으로 금 박막이 입혀진 웨이퍼를 사용하였다. 상기 두 전극 사이에 5V의 전압을 5분간 가한 다음 증류수로 3회 철저히 세정하였다. 그런 후에 ITO 전극을 BSA(Bovine Serum Albumin)가 포함된 10×PCR 버퍼가 들어있는 PCR 튜브에 옮긴 후 직접 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 상기 실시예 6과 동일하게 수행하였다. 결과는 도 4의 1번 레인에 나타나있 다. 마커는 M이다.
실시예 8
상기 실시예 7 에서 혈액을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 7과 동일한 과정을 수행하였다. 결과는 도 4의 3번 레인에 나타나있다.
비교예 6
단순히 상기 실시예 7 에서 사용한 혈액과 gDNA 의 혼합 반응액 1ul를 사용하여 PCR을 수행하였다. 결과는 도 4의 2번 레인에 나타나있다.
비교예 7
상기 실시예 7 에서 전압을 가하지 않고 단순히 5분간 ITO 전극을 버퍼에 담궈두었다가 꺼낸 것을 제외하고는 상기 실시예 7과 동일한 과정을 수행하였다. 결과는 도 4의 4번 레인에 나타나있다.
상기 실시예 7 내지 8 및 비교예 6 내지 7 에 따른 PCR 결과는 도 4에 나타난 바와 같이 전기장으로 핵산을 부착시킨 실시예 7 및 단순히 gDNA를 첨가한 실시예 8 의 경우에 원하는 밴드를 보여주고 있으나, 혈액과 gDNA의 반응액을 사용한 비교예 6 의 경우에는 전기장을 가하지 않는 비교예 7의 경우와 같이 원하는 밴드를 보여주지 않았다. 일반적으로 혈액은 PCR을 방해하는 저해제가 존재하기 때문에 비교예 6과 같이 PCR이 전혀 이루어지지 않지만 실시예 7 과 같이 ITO로 정제를 하는 경우에는 혈액이 존재할 경우에도 DNA를 선택적으로 부착시키고 혈액을 제거할 경우 우수한 정제 효과가 있음을 보여주었다. 따라서 ITO를 이용한 정제가 혈액 등 기타 다른 실질적인 생체 시료의 경우에 효과적으로 핵산으로 분리 정제할 수 있음 을 보여주고 있다.
본 발명에 따른 핵산 분리 장치는 광전 변환 소자 및 전도성 투명 전극을 구비하여 자체적인 구동이 가능하면서도 PCR 버퍼를 핵산 용출액으로 사용할 수 있어 장치의 집적화 및 신속 간단한 정제가 가능하며 상기 정제 장치를 구비한 미세 유체 장치는 독립 구동 및 핵산의 정제 및 PCR을 동시에 수행할 수 있어 장치의 소형화 및 자동화가 가능하다.
Claims (23)
- 입출구를 구비한 챔버;상기 챔버 내벽의 적어도 일부를 형성하면서 챔버를 한정하며 챔버 내에서 전기장을 형성하는 복수의 평면 전극; 및상기 전극에 바이어스를 가하는 광전 변환 소자;를 구비하며, 상기 전극에 바이어스가 가해지면 핵산이 상기 전극에 흡착되는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서, 상기 전극에 가해지는 바이어스는 전극 간 거리에 따라 1 uV 내지 10V인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치.
- 제 2 항에 있어서, 상기 바이어스가 가해질 경우에 전극 간에 흐르는 전류가 1nA 내지 1mA인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서, 상기 전극이 상기 광전 변환 소자의 일표면상에 형성된 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서, 상기 전극이 유체와 접촉하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서, 상기 전극이 전도성 투명 전극인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서, 상기 광전 변환 소자가 상기 챔버의 수평면에 평행하게 위치하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 분리 장치가 입사광 만으로 구동되는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 분리 장치가 제어 장치를 추가적으로 구비한 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 분리 장치가 외부 장치와 전기적으로 연결 가능한 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치.
- 제 6 항에 있어서, 상기 전도성 투명 전극은 ITO, FTO 및 SnO2 로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서, 상기 광전 변환 소자는 실리콘계, 화합물 반도체 및 염료 감응형으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서, 상기 챔버가 열 출입 장치를 추가적으로 구비하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 장치
- 제 1 항 내지 13 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분리 장치를 구비하는 것을 특징으로 하는 미세 유체 장치.
- 제 14 항에 있어서, 핵산의 용출과 용출된 핵산의 PCR이 동시에 행해지는 것을 특징으로 하는 미세 유체 장치.
- 제 14 항에 있어서, 상기 미세 유체 장치가 입사광 만으로 구동되는 것을 특징으로 하는 미세 유체 장치.
- 핵산을 포함하는 시료를 전도성 투명 평면 전극과 접촉시키는 단계;상기 전극에 바이어스를 가하여 핵산을 전극에 흡착시키는 단계;상기 전극을 세정하는 단계; 및용출액으로 상기 핵산을 용출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 핵산을 용출하는 단계가 PCR을 수행하는 단계와 동시에 행해지는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 용출액이 BSA를 포함하는 PCR 버퍼인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 시료가 혈액인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 전도성 투명 전극이 ITO, FTO 및 SnO2 로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 전극에 가해지는 바이어스는 전극 간 거리에 따라 1uV 내지 10V인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
- 제 22 항에 있어서, 상기 바이어스가 가해질 경우에 전극 간에 흐르는 전류가 1nA 내지 1mA인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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