DE69522564T2

DE69522564T2 - Alkalibeständiges proteinadsorbens

Info

Publication number: DE69522564T2
Application number: DE69522564T
Authority: DE
Inventors: Sven Oscarsson; Jerker Porath
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-06-07
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 2002-09-05
Anticipated expiration: 2015-06-07
Also published as: SE9401960L; DE69522564D1; JP3553962B2; ES2164154T3; ATE205112T1; SE9401960D0; WO1995033557A1; EP0764049A1; DK0764049T3; EP0764049B1; US5942463A; JPH10502862A

Description

Die Erfindung betrifft ein Adsorptionsmittel zur Abtrennung und Immobilisierung von Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren, umfassend ein Tägermaterial mit einem kovalent gebundenen Liganden, und ein Verfahren zur Herstellung des Adsorptionsmittels und die Verwendung davon. Im spezifischeren ist das Adsorptionsmittel alkaliresistent und dadurch geeignet für die Verwendung zusammen mit Proteinen, welche während bestimmter Behandlungsschritte Alkalilösungen ausgesetzt werden können.
Im chromatographischen Verfahren erhöht sich die Adsorption von Proteinen durch die Zugabe verschiedener Arten von Salzen in unterschiedlichen Salzkonzentrationen, und nach der Entfernung von Salz aus dem Elutionspuffer werden die Proteine von dem Adsorptionsmittel desorbieren und können auf diese Weise gereinigt oder in verschiedene Fraktionen geteilt werden.

Stand der Technik

Gegenwärtig werden für die Reinigung von Proteinen Adsorptionsmittel mit Liganden, welche bei der Elution des Proteins zu großen Proteinverlusten führen, verwendet.
Selbst nach dem Waschen des Adsorptionsmittels mit 1 M Ätzlösung verbleibt Protein auf dem Adsorptionsmittel und verändert dessen Merkmale. Die Wiederverwendung davon kann so Risiken der Kontamination weiterer Testmischungen mit den Proteinen, welche auf dem Adsorptionsmittel verbleiben, verursachen. Als eine Alternative zu diesen Adsorptionsmitteln wurden spezifischere Adsorptionsmittel entwickelt für die Isolation von u. a. IgG. Diese Adsorptionsmittel sind dadurch charakterisiert, daß ein Protein kovalent an das Adsorptionsmittel gebunden ist und in spezifischer Weise an IgG bindet. Die Nachteile bestehen darin, daß das kovalent gebundene Protein freigesetzt wird und ausleckt und dadurch medizinische Komplikationen verursachen kann.
Als eine Alternative zu solchen biospezifischen Adsorptionsmitteln (Protein A bzw. Protein G) wurden sogenannte thiophile Adsorptionsmittel entwickelt (Porath, Belew - SE - PS 8405431-1). Die thiophilen Adsorptionsmittel dieser Art, die bisher entwickelt worden sind, sind jedoch nicht alkalistabil, weshalb eine Reinigung und ein Waschen mit einer 1 M Ätzlösung nicht ohne das Risiko des unerwünschten Effektes durchgeführt werden kann, was eine Bedingung zur Verhinderung von bakteriellen und Virusinfektionen und einem Risiko von Pyrogenen ist, wenn das Adsorptionsmittel in großtechnischen Verfahren verwendet wird.
Ein Adsorptionsmittel mit der Struktur
wurde zuvor in SE-B-462 165 (Porath and Oscarsson) beschrieben. Der Nachteil bei diesem Adsorptionsmittel besteht darin, daß es nicht alkalistabil ist wegen der ungünstigen Elektronendichteverteilung innerhalb des Moleküls, welche durch die Positionen des Schwefels bzw. des Stickstoffs darin bestimmt wird.
In der EP-A-0 180 563 wird ebenfalls ein Gel-Produkt offenbart, gekennzeichnet dadurch, daß der hydrophobe Ligand die Struktur -S-CR&sub1;R&sub2;-Q hat, worin R&sub1; und R&sub2; H oder Alkyl ist, und Q Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Alkaryl, Aralkyl, Heteroaryl, Alkheteroaryl ist, mit oder ohne elektrisch neutrale Substituenten.
In der SE-B-462 165 wird ebenfalls offenbart, daß der verwendete Träger kovalent gebundene Liganden mit den Strukturen X-S, X-CH&sub2;S, X-CH&sub2;NR-, in welchem X ein isozyklisches oder heterozyklisches Ringsystem ist, welches π-Elektronen und/oder Liganden enthält, welche die Strukturen -SO&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-Y enthalten, worin Y S, N < oder NR- ist und R ist H oder ein Alkyl.
Die Elektronendichteverteilung innerhalb des Pyridylsulfidmoleküls in der Formel I ist in der Formel II nachstehend gezeigt.
Wenn die Elektronendichteverteilung innerhalb des Moleküls berechnet wird, wird gezeigt, daß das Kohlenstoffatom C&sub1; ein Elektronendefizit an seiner Position hat, was bedeutet, daß die nukleophile Hydroxylgruppe an der Position C&sub1; reagieren kann und zu der Eliminierung von Hydroxypyridin führt. Falls der Schwefel aus dem Pyridinring innerhalb des vorausstehend beschriebenen Moleküls entfernt wird, durch die Einführung einer Methylengruppe zwischen dem Schwefel und dem Pyridinring, tritt der unerwünschte Effekt eines Elektronendefizits an C&sub1; nicht auf. Dies wurde ebenfalls experimentell bestätigt. Das Adsorptionmittel wird dadurch stabil gegenüber Alkali bleiben und hat eine hohe Desorptionseffizienz gegenüber Proteinen, welche in Kontakt mit dem Adsorptionsmittel gewesen sind, und weiter sehr niedrige Proteinreste.
Das Ziel der Erfindung ist es, jetzt ein Adsorptionsmittel bereitzustellen, welches 1 M Alkali während eines verlängerten Zeitraums unterzogen werden kann, ohne abgebaut zu werden und dadurch in einer effektiven Weise von Bakterien, Viren und Pyrogenen gereinigt werden kann.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Adsorptionsmittel bereitzustellen, welches ohne merkliche Verluste eluiert werden kann.
Des weiteren zielt die Erfindung darauf ab, ein Adsorptionsmittel bereitzustellen, welches wiederverwendet werden kann nach einer Elution mit 1 M Ätzlösung, ohne ein Risiko der Weitergabe einer Infektion zu verursachen.
Das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung besteht aus einer Festphase eines polymeren Netzwerks in der Form fein zerteilter Teilchen mit einem Durchmesser von weniger als 1 mm oder Membranen mit einer Dicke, die 1 mm nicht übersteigt.
Das polymere Netzwerk besteht aus einem hydrophilen Polymer wie einem Polysaccharid, z. B. kreuzvernetzter Zellulose, Polyhydroxypolymer, Polygalaktan, wie Agar oder Agarose, einem kreuzvernetzten, mehrere Hydroxygruppen enthaltenden Polymer wie Polyvinylalkohol oder kann ebenfalls ein kreuzvernetztes Polyacrylamid sein, Polyamid sein, oder die Festphase besteht aus einem hydrophoben organischen Polymer wie Polystyrol, an welches die hydrophile Polymerkomponente gebunden, eingeschlossen oder oberflächenbeschichtet wurde. An das polymere Netzwerk sind Liganden mit der allgemeinen Formel
-X-S-(CHZ)n-R
kovalent gebunden, und in welchem X ein Spacerarm ist, n eine ganze Zahl 1 oder 2, R ein π-elektronenreiches Ringsystem, mit wenigstens einem Stickstoffatom in der Ringstruktur ist.
Das Adsorptionmittel gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt besondere Adsorptionseigenschaften, welche insbesondere in Kontakten mit Proteinlösungen gezeigt werden, insbesondere in Gegenwart hoher Konzentrationen lyotroper Salze wie Sulfat und Phosphat von Alkalimetallen, Magnesium und Ammonium, wobei die Proteine in Klassen mit verschiedenen Adsorptionsstärken unterteilt werden, abhängig von ihren bevorzugten Affinitätsverhältnissen zu dem Adsorptionsmittel. Das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung kann ebenfalls für die Adsorption bestimmter weicher Metallionen wie Ag&spplus;, Hg2+, Pd²&spplus; und Pt²&spplus; verwendet werden.
Die Erfindung wird nun nachstehend detaillierter zusammen mit Beispielen für die Herstellung des Adsorptionsmittels beschrieben werden. Beispiel 1 Pyridyl-2-methyl-thioether-Agarose
Zuerst wird ein epoxyaktives Gel hergestellt durch ein weiteres Waschen von 50 g gewaschenem 6%-igen Agarosegel (Sepharose 6B) mit destilliertem Wasser und danach der Zugabe von 0,34 g NaBH&sub4; und 35 ml 2 M NaOH und tropfenweise 25 ml Epichlorhydrin. Die Reaktion wird dann während etwa 20 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt.
Zu 50 g dieses Gels werden 10 ml 2 M Na&sub2;S&sub2;O&sub3; zugegeben und die Reaktion läßt man sich dann 10 Stunden lang bei Raumtemperatur fortsetzen.
Die Aktivierung wird durchgeführt durch die Zugabe von 1,5 g Dithiothreitol (DTT) in 100 ml 0,1 M NaHCO&sub3; zu 25 g Gel und einer Reaktion während 30 min bei Raumtemperatur.
Das aktivierte Gel wird auf einem Glasfilter mit destilliertem Wasser gewaschen, wonach 2,5 g Pikolylchlorid (2-Chlormethyl-pyridin) in 0,1 M NaHCO&sub3; zugegeben wird, und der pH wird auf 8,0 eingestellt. Die Reaktion wird während 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Stabilitätsstudien des Gels werden durch eine Elementanalyse des Stickstoffgehaltes vor und nach dem Halten des Gels in 1 M NaOH bei 40ºC während 13 Tagen gemacht.

Tabelle

Gew.-% Stickstoff

Testen eines neuen Gels gemäß der Erfindung 1,4
Nach 13 Tagen und Nächten in 40ºC Ätzlauge 1,3
Vergleichstest eines Gels mit direkt an den Pyridin-Nukleus gebundenem Schwefel 1,4
Nach Waschen der Vergleichsprobe mit kalter Ätzlauge 0,5
Das Gel gemäß der Erfindung kann so mit 1 M Ätzlauge gewaschen werde ohne irgendein Risiko eines Abbaus, während zuvor verwendete Gele zur Reinigung von z. B. IgG bereits zerstört werden, wenn sie mit 1 M Ätzlauge bei Raumtemperatur gewaschen wurden.
Die Reinigung (Fraktionierung) von IgG mit einem Gel gemäß der Erfindung vor und nach dem Waschen zeigte keinerlei signifikante Veränderungen bezüglich der Kapazität und Spezifität.
Bei der Wiederverwendung des Gels zur Fraktionierung von IgG konnte kein Unterschied bemerkt werden.
Entsprechend wurden gute Ergebnisse ebenfalls erhalten mit, unter anderem, Gelen mit den folgenden Liganden

Beispiel 2 Pyridyl-4-methyl-thioether-Agarose

Auf dieselbe Weise wie in dem Beispiel 1 wird Pyridyl-4-methyl-thioether- Agarose hergestellt, aber anstelle von 2-Pikolylchlorid wird dieselbe Menge von 4- Pikolylchlorid (4-Chlor-methyl-pyridin) verwendet.

Beispiel 3 Chinolin-2-methyl-thioether-Silika

In eine runde Flasche werden 100 ml getrocknetes Toluol und 24 g Silika zugegeben, dann werden 3 ml getrocknetes Triethylamin zugegeben, gefolgt von 30 ml g- Glycidoxypropyl-trimethoxysilan. Die Mischung wird 3 Stunden lang refluxiert und danach auf einem Glasfilter mit Toluol gewaschen und mit 10 ml 2 M Na&sub2;S&sub2;O&sub3; während 10 Stunden bei Raumtemperatur aktiviert. Zu dem gewaschenen Gel wird 1 g Dithioerythriol, gelöst in 0,1 M NaHCO&sub3; zugegeben, und der pH wird auf 7,5 eingestellt. Nach einer Reaktion von 30 min. wird das Gel auf einem Glasfilter mit destilliertem Wasser, gefolgt von Toluol gewaschen. 2 g in Toluol gelöstes Chinolin-2-methylchlorid wird zu dem mit Toluol gewaschenen Silikatgel gegeben und 6 Stunden lang bei 60ºC reagieren gelassen, wonach das Gel mit Toluol auf einem Glasfilter gewaschen wird.

Beispiel 4 Imidazolylethyl-thioether-Agarose

Herstellung auf dieselbe Weise wie in dem Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß anstelle von 2-Pikolylchlorid dieselbe Menge Vinylimidazol verwendet wird.

Beispiel 5 Uracilyl-6-methyl-thioether-Agarose

Herstellung auf dieselbe Weise wie in dem Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß anstelle von 2-Pikolylchlorid dieselbe Menge 6-Chlor-methyl-uracil verwendet wird.

Verwendung des Gels gemäß der Erfindung

In dem chromatographischen Verfahren wird die Adsorption des Proteins amplifiziert durch die Zugabe unterschiedlicher Typen von Salzen mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen. Wenn das Salz aus dem Elutionspuffer entfernt wird, werden die Proteine desorbiert.
Unter optimalen Bedingungen hat das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung eine Zurückhaltung von 2,7% des gesamten, aufgetragenen Proteins nach einer Desorption mit einem salzfreien Puffer gezeigt.
Die entsprechende kommerzielle Präparation, Oktyl-Sepharose und Phenyl- Sepharose, zeigten unter optimalen Bedingungen eine Zurückhaltung von 29,3 bzw. 8,1 Gew.- % des gesamten aufgetragenen Proteins nach einer Desorption mit einem salzfreien Puffer. Da jedes Prozent zurückgehaltenes Protein ein entsprechender Verlust ist, ist jede Reduktion der Zurückhaltung von großer ökonomischer Wichtigkeit.
Wie vorausstehend bemerkt, können sowohl gespeichertes Protein und Adsorptionsmittel Infektionen tragen, z. B. Viren, Bakterien, Pyrogene. Aber diese werden in einer effektiven Weise harmlos gemacht durch ein Waschen mit 1 M Ätzlauge. Die Gesamtmenge des verbleibenden Proteins auf dem Adsorptionsmittel nach dem Waschen mit 1 M Natronlauge wurde bestimmt mit einer Aminosäureanalyse und wurde mit den Werten der gegenwärtig verwendeten Adsorptionsmittel nach einer beträchtlich milderen Behandlung, d. h. nicht hinreichend für eine sichere Wiederverwendung, verglichen. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, wurde der Stickstoffwert bei 1,4 Gew.-% auf dem Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung nach einer Behandlung während 13 Tagen und Nächten bei 40ºC gehalten, während der Stickstoffwert bereits nach einer Waschung von kurzer Dauer mit kalter Ätzlauge von 1,4 auf 0,5 Gew.-% bei Pyridinthioether-Adsorptionsmittel reduziert wurde, wo Schwefel direkt an den Pyridin-Nukleus gebunden ist.
Man nimmt an, daß der Grund für die verbesserten Merkmale des Gels gemäß der Erfindung von der Wirkung des Stickstoffatoms und des Schwefels auf die Elektronenverteilung innerhalb des Liganden abhängig ist. Mit einer ungünstigen Plazierung von diesen innerhalb des Liganden wird ein Elektronendefizit, insbesondere an den Kohlenstoffatomen, einen nukleophilen Angriff der Hydroxylgruppen (der Alkalilösung) auf diese Kohlenstoffatome mit einem Elektronendefizit möglich machen, was eine Destabilisierung des Liganden bedeutet. Untersuchungen der Elektronenverteilung wurden an dem Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung gemacht und an entsprechenden, gegenwärtig verwendeten Präparationen, und bestätigen diese Annahme.

Claims

1. Adsorptionsmittel zur Abtrennung und Immobilisierung von Biopolymeren, wie Proteinen, Peptiden, welches gegenüber wäßrigem Alkali beständig ist, umfassend ein Trägermaterial mit kovalent gebundenen Liganden, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial eine feste Phase, welche vollständig oder teilweise mit einem polymeren Netzwerk durchdrungen oder oberflächenbehandelt ist, umfaßt, und die Liganden die Struktur aufweisen

X - S - (CH2)n - R,

worin X einen Spacerarm darstellt, n 1 oder 2 ist und R ein p-elektronenreiches Ringsystem mit mindestens einem Stickstoffatom in der Ringstruktur darstellt, wobei der Einführung von mindestens einer CH2-Gruppe zwischen dem S-Atom und dem gebundenem C-Atom in dem Ringsystem einen alkalisensitiven Elektronenmangel in der Bindungsposition des C-Atoms eliminiert.

2. Adsorptionsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase Teilchen mit einem Durchmesser von weniger als 1 mm oder ein Diaphragma mit einer Dicke, welche 1 mm nicht überschreitet, umfaßt.

3. Adsorptionsmittel nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymernetzwerk ein Polyhydroxypolymer darstellt.

4. Adsorptionsmittel nach mindestens einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyhydroxypolymer ein Polygalaktan ist, wie Agar oder Agarose.

5. Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymemetzwerk ein Polyamid, wie ein quervernetztes Polyacrylamid oder ein Derivat davon, umfaßt.

6. Adsorptionsmittel nach mindestens einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase ein anorganisches Polymer umfaßt, wie Silika oder ein Derivat, womit die hydrophile Polymerkomponente verbunden, eingeschlossen oder oberflächebehandelt worden ist.

7. Adsorptionsmittel nach mindestens einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase ein hydrophobes, organisches Polymer, wie Polystyrol, umfaßt, womit die hydrophile Polymerkomponente verbunden, eingeschlossen oder oberflächenbehandelt worden ist.

8. Adsorptionsmittel nach mindestens einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß R

umfaßt, worin Z, N oder CH ist.

9. Adsorptionsmittel nach mindestens einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand eine Picolylthioethergruppe umfaßt oder von ihr umfaßt ist.

10. Adsorptionsmittel nach mindestens einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacerarm die Struktur -CH2-CHOH-CH2- enthält.

11. Adsorptionsmittel nach mindestens einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorptionsmittel gegenüber 1 M NaOH bei 40ºC über mindestens 13 Tagen beständig ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines Adsorptionsmittels nach mindestens einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zuerst eine Thiolgruppe in ein Polymernetzwerk eingefügt wird, und daß anschließend eine heteroaromatische Gruppe mit einer elektrophilen Seitenkette eingeführt wird.

13. Verfahren zur Herstellung des Adsorptionsmittels nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die heteroaromatische Gruppe einen Seitengruppensubstituenten mit der Struktur -(CH2)n-Y aufweist, worin Y ein Halogen, wie Chlor, darstellt, und n 1 oder 2 ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrophile Seitenkette an der hetereoaromatischen Gruppe ein Vinylsubstituenten umfaßt.

15. Verwendung eines Adsorptionsmittels nach den Ansprüchen 1-11 zur Fraktionierung von Biopolymeren, wie Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren.

16. Verwendung eines Adsorptionsmittels nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, welches mit 1 M Ätzlauge gewaschen wird, zur Fraktionierung von Biopolymeren, wie Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren.

17. Verwendung eines Adsorptionsmittels nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Fraktionierung von Biopolymeren, wie Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren, nach der Eluierung mit 1 M Ätzlauge.

18. Verwendung eines Adsorptionsmittels nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, zur Fraktionierung von Biopolymeren, wie Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren, nachdem es alkalischen Lösungen ausgesetzt worden ist.

19. Verwendung eines Adsorptionsmittels nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, zur Fraktionierung von Biopolymeren, wie Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren, nachdem es 1 M Alkali während einer verlängerten Zeitdauer ausgesetzt worden ist.

20. Verwendung eines Adsorptionsmittels nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, zur Fraktionierung von Biopolymeren, wie Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren, nachdem es 1 M Alkali während einer verlängerten Zeitdauer ausgesetzt worden ist, wodurch es von Bakterien, Viren und Pyrogenen gereinigt worden ist.

21. Wiederverwendung eines Adsorptionsmittels nach den Ansprüchen 1 bis 11 zur Isolierung von IgG, wobei das Adsorptionsmittel vorher zur Fraktionierung von IgG verwendet worden ist.

22. Wiederverwendung eines Adsorptionsmittels nach den Ansprüchen 1 bis 11 zur Isolierung von IgG, wobei das Adsorptionsmittel vorher zur Fraktionierung von IgG verwendet und gewaschen worden ist.

23. Wiederverwendung eines Adsorptionsmittels nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Adsorptionsmittel vorher zur Fraktionierung von Biopolymeren verwendet worden ist.

24. Wiederverwendung eines Adsorptionsmittels nach Anspruch 23, worin die Biopolymere Proteine sind.