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DE69531826T2 - Chromatographische adsorbenden, die merkaptoheterozyklische liganden anwenden - Google Patents

Chromatographische adsorbenden, die merkaptoheterozyklische liganden anwenden Download PDF

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DE69531826T2
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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Affinitätschromatographie und insbesondere Pseudobioaffinitätschromatographie.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Mit der schnellen Entwicklung von und dem steigenden Bedarf an monoklonalen und polyklonalen Antikörpern für sowohl diagnostische als auch therapeutische Zwecke sind Forschungsbemühungen kürzlich auf das Erdenken neuer Techniken zur wirksamen Isolierung von Antikörpern aus Antikörper-enthaltenden Lösungen gerichtet worden. Einige wohl bekannte bestehende Techniken umfassen die Verwendung klassischer Flüssigkeitschromatographie-Adsorptionsmittel, wie Ionenaustauscher, hydrophobe Träger, Hydroxyapatit- und Gelfiltrationsmedien. Leider sind diese Techniken zeitraubend und aufwendig durchzuführen und können nicht allgemein auf die Isolierung heterogener Populationen von Antikörpern angewendet werden. Als Ergebnis davon müssen derartige Techniken in Abhängigkeit vom spezifischen Antikörper, dessen Isolierung erwünscht ist, auf den Einzelfall angepasst werden.
  • Affinitätschromatographie, welche auf spezifischen Wechselwirkungen zwischen einem immobilisierten Liganden und einem bestimmten Molekül, dessen Reinigung bzw. Aufreinigung erwünscht ist, beruht, ist eine weitere wohlbekannte bestehende Technik, die zur Reinigung von Antikörpern aus Lösung verwendet wird. Protein A, das sich von dem Bakterium Staphylococcus aureus ableitet, besitzt eine starke und spezifische Affinität für das Fc-Fragment der IgG-Antikörper und ist für etwa ein Jahrzehnt als Affinitätsligand zur Reinigung von IgG-Antikörpern verwendet worden. Protein A kann auf einer großen Vielzahl von festen Trägermaterialien, wie Chromatographie-Kügelchen und -membranen, immobilisiert werden und kann zum Erhalt hochreiner Antikörper in hoher Ausbeute verwendet werden.
  • Leider leidet Protein A an einer Anzahl von Begrenzungen als Affinitätsligand. Eine derartige Begrenzung sind die unerschwinglichen Kosten für Protein A. Wegen dieser hohen Kosten ist die Verwendung von Protein A in großem Maßstab als Affinitätsligand oft nicht wirtschaftlich durchführbar. Eine weitere derartige Begrenzung ist die Empfindlichkeit von Protein A gegenüber denjenigen Proteasen, die üblicherweise in den gleichen biologischen Fluiden (z. B. Seren, Aszites-Fluiden, Milch, Hybridoma-Zellkultur-Überständen und dergleichen) vorliegen, in denen die Antikörper, deren Reinigung durch Affinitätschromatographie erwünscht ist, ebenfalls vorliegen. Diese Empfindlichkeit von Protein A gegenüber derartigen Proteasen führt oft zu einem oder beiden der folgenden Wirkungen: (1) Die Erkennung von Protein A gegenüber Fc-Fragmenten von IgG wird zunehmend verringert; und (2) Fragmente von Protein A, die durch Proteasewirkung erzeugt werden, verunreinigen anderweitig reine Antikörper-Präparationen.
  • Eine noch weitere Begrenzung von Protein A ist, dass es möglich ist, dass Protein A intakt aus dem festen Trägermaterial, mit dem es verbunden ist, freigesetzt wird, wodurch Antikörper-Präparationen, die damit in Kontakt gebracht werden, verunreinigt werden. Die Verunreinigung von therapeutischen Antikörper-Präparationen mit Spuren von Protein A oder Protein A-Fragmenten ist sehr schwerwiegend, da Protein A und/oder Protein-A-Fragmente nicht nur in der Lage sind, eine Antigen-Antwort in Menschen hervorzurufen, sondern auch weil Protein A als potentes Mitogen bekannt ist.
  • Protein A ist nicht das einzige Protein, das als Affinitätsligand zur Reinigung einer Klasse von Antikörpern verwendet worden ist. Protein G ist in ähnlicher Wei se als Affinitätsligand verwendet worden. Vgl. Bjorck et al., J. Immunol., 133: 969 (1984). Protein G wechselwirkt ebenfalls mit dem Fc-Fragment von Immunoglobulinen und ist besonders wirksam bei der Isolierung von Mäuse-IgG-Antikörpern der Klasse 1 (im Gegensatz zu Protein A, das nicht sehr wirksam bei der Isolierung dieser Antikörper ist). Jedoch leidet Protein G an den gleichen Arten von Begrenzungen, wie sie oben im Zusammenhang mit Protein A diskutiert wurden.
  • Kürzlich ist ein drittes Protein als wirksamer Affinitätsligand zur Reinigung von Antikörpern identifiziert worden. Bei dem Protein handelt es sich um Protein L aus Peptostreptococcus magnus. Im Gegensatz zu Protein A und Protein G wechselwirkt Protein L spezifisch mit den leichten Ketten von IgG-Antikörpern, ohne sich in deren Antigen-Bindungsstellen einzumischen. Diese Spezifität erlaubt Protein L, nicht nur mit Antikörpern der IgG-Klasse Komplexe zu bilden, sondern auch mit Antikörpern der IgA- und IgM-Klassen. Trotz seiner breiten Affinität leidet Protein L an den gleichen Begrenzungen, wie sie oben im Zusammenhang mit den Proteinen A und G beschrieben wurden.
  • Zusätzlich zu dem, dass die Proteine A, G und L an den oben erwähnten Begrenzungen leiden, sind sie alle gegenüber einer Anzahl von chemischen und physikalischen Mitteln (z. B. extremer pH-Wert, Detergenzien, chaotrope Mittel, hohe Temperatur) empfindlich, die häufig zur Reinigung von Affinitätschromatographiesäulen zwischen Läufen verwendet werden. Folglich ziehen es manche Leute vor, die Anzahl der Reinigungszyklen, die bei den oben erwähnten Säulen angewandt werden, zu minimieren, um folglich eine Zersetzung darauf zu minimieren. Ein Nachteil dieser Taktik ist jedoch, dass ein nicht-reguläres Reinigen der Säulen eine optimale Antikörper-Reinigung verhindert.
  • Anti-Antikörper stellen noch einen anderen Typ von zur Gamma-Globulin-Reinigung verwendetem Affinitätsliganden dar. Jedoch sind Anti-Antikörper aufgrund ihrer hohen Kosten und sehr begrenzten Stabilität in der Verwendung eingeschränkt.
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen Affinitätsliganden auf Proteinbasis gibt es zahlreiche Pseudobioaffinitäts (d. h. weniger spezifische)-liganden niedrigeren Molekulargewichts, die zur Antikörper-Reinigung verwendet worden sind. Histidin, Pyridin und verwandte Verbindungen stellen einen Typ von Pseudobioaffinitätsligand dar, der üblicherweise zur Antikörper-Reinigung verwendet wird. Vgl. z. B. Hu et al., "Histidine-ligand chromatography of proteins: Multiple modes of binding mechanism", Journal of Chromatography, 646: 31–35(1993); El-Kak et al., "Interaction of immunoglobulin G with immobilized histidine: mechanistic and kinetic aspects", Journal of Chromatography, 604: 29–37(1992); Wu et al., "Separation of immunoglobulin G by high-performance pseudobioaffinity chromatography with immobilized histidine", Journal of Chromatography, 584: 35–41 (1992); El-Kak et al., "Study of the separation of mouse monoclonal antibodies by pseudobioaffinity chromatography using matrix-linked histidine and histamine", Journal of Chromatography, 570: 29–41(1991), von denen alle durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden. Vgl. allgemein US-Patent Nr. 5,185,313, 5,141,966, 4,701,500 und 4,381,239. Jedoch sind eine nicht-spezifische Bindung von Proteinen und niedrige Kapazität die Hauptbegrenzungen von Adsorptionsmitteln, bei denen die oben genannten Verbindungen eingesetzt werden.
  • Thiophile Verbindungen stellen eine weitere Klasse von Pseudobioaffinitäts-Liganden dar. Ein Adsorptionsmittel, bei dem ein Typ thiophiler Verbindung verwendet wird, wird von Porath et al. In FEBS Lett., 185: 306(1985) offenbart. Dieser Typ von Adsorptionsmittel wird durch Umsetzung entweder eines Hydroxyl- oder Thiol-enthaltenden Trägers zuerst mit Divinylsulfon und dann mit Mercaptoethanol erzeugt. Bei dem vorgenannten Adsorptionsmittel wird eine Vorgehensweise mit Salz-Promotor verwendet, um Immunoglobuline zu adsorbieren. Eine Elution von adsorbierten Immunoglobulinen wird durch Senken der Salzkonzentration und/oder durch Modifizieren des pH-Wertes bewirkt.
  • Bei einem weiteren Typ von Pseudobioaffinitäts-Adsorptionsmittel, das zur Adsorption von Antikörpern in der Lage ist, wird Mercaptopyridin als Ligand ver wendet. Vgl. Oscarsson et al., "Protein Chromatography with Pyridine- and Alkyl-Thioether-Based Agarose Adsorbents", Journal of Chromatography, 499: 235–247 (1990). Dieser Typ von Adsorptionsmittel wird beispielsweise erzeugt, indem Mercaptopyridin mit einem in geeigneter Weise aktvierten festen Träger umgesetzt wird. Das auf diese Weise gebildete Adsorptionsmittel ist in der Lage, Antikörper unter hohen Salzbedingungen zu adsorbieren.
  • Weitere Pseudobioaffinitäts-Adsorptionsmittel, bei denen thiophile Verbindungen verwendet werden, sind in den folgenden Patenten und Veröffentlichungen beschrieben. US-Patent Nr. 4,897,467; veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. PCT/LTS89/02329; veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 168,363; Oscarsson et al., "Thiophilic adsorbents for RIA and ELISA procedures", Journal of Immunological Methods, 143: 143–149(1991); und Porath et al., "A New King of 'Thiophilic' Elecron-Donor-Acceptor Adsorbent", Makromol. Chem., Macromol. Symp., 17: 359–371(1988).
  • Die oben beschriebenen thiophilen Adsorptionsmittel stellen allgemein ausreichende Mittel zur Reinigung von Antikörpern bereit; jedoch kann in denjenigen Fällen, in denen die anfängliche biologische Flüssigkeit eine proteinreiche Lösung ist, wie ein Serum oder Aszites, die nicht-spezifische Bindung einer Anzahl von Proteinen von anderen als den gewünschten Antikörpern durch derartige Adsorptionsmittel ein Problem sein. Dieses Problem einer nicht-spezifischen Bindung ist die primäre Begrenzung für diese thiophilen Adsorptionsmittel.
  • Eine weitere Gruppe von Liganden niedrigen Molekulargewichts, die zur selektiven Bindung von Antikörpern in der Lage sind, schließt Pentafluorpyridin und N-Dimethylaminopyridin, umgesetzt mit Ethylenglykol, Glycin oder Mercaptoethanol, ein. Vgl. Ngo, J. Chromatogr., 510: 281(1990). Adsorptionsmittel, bei denen diese Materialien verwendet werden, können zur Isolierung von Immunoglobulinen in Puffern entweder hoher Salz- oder niedriger Salzkonzentration oder zur Isolierung anderer Typen von Proteinen unter niedrigen Salzbedingungen ver wendet werden. Eine Elution von adsorbierten Proteinen kann durch Absenken des pH-Wertes erreicht werden.
  • Noch andere Pseudobioaffinitäts-Liganden niedrigen Molekulargewichts sind identifiziert worden, die in der Lage sind, selektiv Antikörper aus Eigelb und anderen biologischen Flüssigkeiten zu binden. Bei diesen Liganden handelt es sich um spezielle Farbstoffe. Eine Elution der gebundenen Antikörper aus den Liganden wird durch spezielle Verdrängungsmittel erreicht.
  • Alle oben erwähnten Adsorptionsmittel, bei denen Pseudobioaffinitäts-Liganden niedrigen Molekulargewichts verwendet werden, sind bezüglich ihrer niedrigen Kosten und ihrer chemischen und physikalischen Stabilität sehr attraktiv. Jedoch sind der Grad einer nicht-spezifischen Bindung und/oder ihre Toxizität (sollten sie beispielsweise eine therapeutische Antikörper-Präparation, die für eine Verabreichung an Menschen gedacht ist, verunreinigen) zu hoch und ihre Kapazität für Antikörper ist zu niedrig, um die Attraktivität von Adsorptionsmitteln, bei denen Protein A, G oder L als spezifische Antikörper-Liganden verwendet werden, auszugleichen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Daher besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines neuen Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittels, das wenigstens einige der im Zusammenhang mit bestehenden Affinitäts- und Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmitteln diskutierten Begrenzungen überwindet.
  • Zur Unterstützung der obigen und anderen, zu beschreibenden oder nachstehend offensichtlich werdenden Aufgaben wird ein Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel hierin im folgenden bereitgestellt, das an eine Verwendung bei der selektiven Adsorption von Immunoglobulinen angepasst ist, bereit gestellt, wobei das Adsorptionsmittel in einer ersten Ausführungsform umfasst: (a) ein festes Trägermaterial; und (b) einen Liganden, der an der Oberfläche des festen Trägermaterials immobilisiert ist, wobei der Ligand eine Verbindung der Formel (I) von Anspruch 1 ist.
  • Alternativ umfasst ein Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel, das an eine Verwendung bei der selektiven Adsorption von Immunoglobulinen angepasst ist, gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung: (a) ein festes Trägermaterial; und (b) einen Liganden, der an der Oberfläche des festen Trägermaterials immobilisiert ist, wobei der Ligand eine Verbindung der Formel (II) von Anspruch 4 ist.
  • Die vorliegende Erfindung ist auch auf Verfahren zur Herstellung der oben erwähnten Adsorptionsmittel und auf Verfahren zur Verwendung der oben erwähnten Adsorptionsmittel zur Durchführung von Affinitätstrennungen gerichtet.
  • Zusätzliche Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden teilweise in der folgenden Beschreibung dargelegt und teilweise aus der Beschreibung offensichtlich sein oder können durch Praktizieren der Erfindung erlernt werden. Diese Ausführungsformen werden in genügend Einzelheiten beschrieben, um dem Fachmann die Durchführung der Erfindung zu ermöglichen, und es versteht sich, dass andere Ausführungsformen verwendet werden können, und dass Änderungen durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Die folgende genaue Beschreibung ist daher nicht im beschränkenden Sinne zu nehmen, und der Umfang der vorliegenden Erfindung wird am besten durch die anhängenden Ansprüche definiert.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung ist auf neue Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel gerichtet, die bei der selektiven Adsorption eines breiten Be reichs von Immunoglobulinen nützlich sind. Die Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung können auch zur selektiven Adsorption von Nicht-Immunoglobulin-Proteinen verwendet werden.
  • Gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung umfassen die Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel (a) ein festes Trägermaterial; und (b) einen Liganden, der an der Oberfläche des festen Trägermaterials immobilisiert ist, wobei es sich bei dem Liganden um einen fünfgliedrigen heterozyklischen Mercapto-Ring des hierin im folgenden beschriebenen Typs handelt. In einer ersten Ausführungsform hat der Ligand die durch die Formel (I) von Anspruch 1 dargestellte Struktur.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung und Ansprüche können die Definitionen von R1 und R2 in CR1R2 der Verbindung I entweder gleich oder verschieden sein für zwei oder mehrere von X1, X2 und X3. R1 und R2 können beispielsweise Ethyl beziehungsweise OH für sowohl X1 als auch X2 sein.
  • Beispiele für die Verbindung I umfassen Mercaptothiazolin (z. B. 2-Mercaptothiazolin) und 2-Mercapto-5-thiazolidon.
  • In einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat der Ligand die durch die Formel (II) von Anspruch 4 dargestellte Struktur.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung und Ansprüche können die Definitionen von R in CR der Verbindung II entweder gleich oder verschieden für zwei oder mehrere von Y2, Y3 und Y4 sein. Beispielsweise könnte R Methyl im Fall von Y2 und OH im Fall von Y3 sein. Alternativ könnte R beispielsweise Ethyl für sowohl Y2 als auch Y3 sein.
  • Beispiele für die Verbindung II umfassen Mercaptoimidazol (z. B. 2-Mercaptoimidazol), Mercaptoimidazolin, Mercaptothiazol (z. B. 2-Mercaptothiazol), Mer captotriazol (z. B. 3-Mercapto-1,2,4-triazol und 5-Mercapto-1,2,3-triazol), Mercaptotetrazol (z. B. 5-Mercapto-1,2,3,4-tetrazol), Mercaptothiadiazol (z. B. 2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol) und Mercaptomethylimidazol (z. B. N-Methyl-2-mercaptoimidazol- ein Arzneimittel von dem bekannt ist, das es für Menschen sicher ist).
  • Das feste Trägermaterial der vorliegenden Adsorptionsmittel kann zusammengesetzt sein aus Polysacchariden, wie Zellulose, Stärke, Dextran, Agar oder Agarose, oder hydrophilen synthetischen Polymeren, wie substituierten oder unsubstituierten Polyacrylamiden, Polymethacrylamiden, Polyacrylaten, Polymethacrylaten, Polyvinyl-hydrophilen Polymeren, Polystyrol, Polysulfon oder dergleichen. Andere geeignete Materialien zur Verwendung als festes Trägermaterial schließen poröse Mineralmaterialien ein, wie Siliziumdioxid, Aluminiumoxid, Titandioxid, Zirconiumdioxid und andere keramische Strukturen. Alternativ können Verbund-Materialien als festes Trägermaterial verwendet werden. Derartige Verbund-Materialien können durch Copolymerisation von zwei oder mehreren der oben erwähnten Spezies oder durch ein ineinandergreifendes Netzwerk von zwei oder mehreren der oben erwähnten Spezies gebildet werden. Beispiele für geeignete Verbund-Materialien schließen Polysaccharid-synthetische Polymere und/oder Polysaccharid-Mineralstrukturen und/oder synthetische Polymer-Mineralstrukturen ein, wie sie in US-Patent Nrn. 5,268,097, 5,234,991 und 5,075, 371 offenbart sind.
  • Das feste Trägermaterial der vorliegenden Erfindung kann die Form von Kügelchen oder unregelmäßigen Teilchen im Größenbereich von etwa 0,1 mm bis 1000 mm Durchmesser, Fasern (Hohl- oder anderweitig) beliebiger Größe, Membranen, flachen Oberflächen im Dickenbereich von etwa 0,1 mm bis 1 mm dick und schwamm-ähnlichen Materialien mit Löchern von wenigen μm bis mehreren mm Durchmesser aufweisen.
  • Vorzugsweise sind die oben beschriebenen Liganden chemisch an das feste Trägermaterial über eine kovalente Bindung immobilisiert, die zwischen der Mercaptogruppe des Liganden und einer auf dem festen Träger vorliegenden reaktiven Gruppe ausgebildet ist. Reaktive Gruppen, die zur Reaktion mit der Mercaptogruppe des vorliegenden Liganden in der Lage sind, schließen Epoxygruppen, Tosylate, Tresylate, Halogenide und Vinylgruppen ein. Da viele der oben erwähnten festen Trägermaterialien keine der oben zitierten reaktiven Gruppen umfassen, können bifunktionelle Aktivierungsmittel, die sowohl zur Reaktion mit den festen Trägermaterialien als auch zur Bereitstellung der notwendigen reaktiven Gruppen befähigt sind, verwendet werden. Beispiele für geeignete Aktivierungsmittel schließen Epichlorhydrin, Epibromhydrin, Dibrom- und Dichlorpropanol, Dibrombutan, Ethylenglycoldiglycidylether, Butandioldiglycidylether, Divinylsulfon und dergleichen ein.
  • Durch Variieren der Konzentration des Aktivierungsmittels kann die Menge des immobilisierten Liganden der vorliegenden Erfindung irgendwo zwischen einem Anteil von einem μmol und mehreren hundert μmol pro ml fester Matrix variieren. Typischerweise führt eine kleine Menge von Ligand pro Einheitsvolumen zu einer niedrigen Trennungskapazität für Immunoglobuline, wohingegen eine große Menge von Ligand pro Einheitsvolumen zu einer erhöhten Sorptionskapazität für Immunoglobuline führt (und eine nicht-spezifische Bindung von anderen Proteinen als Immunoglobulinen auslösen kann).
  • Die oben aufgelisteten Aktivierungsmittel weisen unterschiedliche Kettenlängen auf. Dem gemäß kann man durch Auswählen eines bestimmten Aktivierungsmittels den Abstand zwischen dem festen Trägermaterial und dem immobilisierten Liganden steuern. Aufgrund sterischer Beschränkungen kann dieser Abstand zwischen dem Liganden und der festen Matrix die Adsorptionseigenschaften des Endprodukts sowohl bezüglich Spezifität als auch Sorptionskapazität beeinflussen. Im Allgemeinen kann in den Fällen, in denen die Kettenlänge groß ist im Verhältnis zu denjenigen Fällen, in denen sie es nicht ist, mehr Ligand auf dem festen Trägermaterial immobilisiert werden.
  • Eine Herstellung der Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung kann in einer Weise bewirkt werden, die ähnlich ist zu der, durch welche herkömmliche Adsorptionsmittel typischerweise hergestellt worden sind. Insbesondere kann dies durch Umsetzung eines festen Trägermaterials des oben beschriebenen Typs mit einem Aktivierungsmittel des oben beschriebenen Typs unter festgesetzten Bedingungen von Konzentration, Temperatur, pH-Wert, Mediumzusammensetzung und Zeit erfolgen. Sobald der Träger einmal aktiviert ist, wird er anschließend ausgedehnt in festgelegter Weise mit Lösungsmitteln gewaschen, um überschüssiges Aktivierungsmittel und/oder dessen Aktivierungsnebenprodukte zu entfernen. Der gewaschene, aktivierte Träger wird dann mit Liganden des oben beschriebenen Typs unter festgesetzten Bedingungen von Konzentration, pH-Wert, Reaktionstemperatur, Reaktionsmedium, Zeit und Rühren in Kontakt gebracht, um ein Adsorptionsmittel zu erzeugen, welches selektiv Immunoglobuline aus biologischen Flüssigkeiten, mit denen es in Kontakt gebracht wird, adsorbiert.
  • Bis auf die unten erwähnte Ausnahme können die Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung in der gleichen Weise, in der herkömmliche Adsorptionsmittel verwendet worden sind, verwendet werden. Dies umfasst das Einführen des Adsorptionsmittels in eine Chromatographiesäule und anschließendes Waschen der Säule mit einer geeigneten wässrigen Lösung von Salzen bei einem gegebenen pH-Wert. Eine biologische Lösung, die die Immunoglobuline enthält, die man isolieren möchte, wird dann mit Salzen (z. B. Na2SO4) kombiniert, und die Säule wird direkt damit beladen. Die in der Lösung vorliegenden Immunoglobuline werden durch das Adsorptionsmittel eingefangen, während die in der Lösung vorliegenden Nicht-Immunoglobulin-Proteine und der Rest der Lösung im Durchfluss gewonnen werden. Nach geeignetem Waschen zur Eliminierung der nichtspezifisch adsorbierten Makromoleküle werden die Immunoglobuline anschlie ßend durch eine pH-Änderung und/oder durch Änderung der Salzkonzentration desorbiert. Die isolierten Immunoglobuline werden dann neutralisiert.
  • Die eine Ausnahme, auf die oben angespielt wurde, besteht darin, dass bestimmte Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung keine Zugabe von Salz zur biologischen Lösung für die darin enthaltenden Antikörper erfordern, um diese an den Liganden zu adsorbieren. Diese Eliminierung der Notwendigkeit für ein Salz ist klar vorteilhaft in denjenigen Fällen, in denen die Zugabe von Salz unerwünscht ist. Diejenigen Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung, bei denen Salz nicht zugegeben werden braucht (und in der Tat nicht zugegeben werden kann, damit das Adsorptionsmittel in geeigneter Weise funktioniert) sind diejenigen, bei denen Liganden der Verbindungen I und II eingesetzt werden, in denen Stickstoffatome zwei oder mehrere Heteroatome des fünfgliedrigen heterozyklischen Rings darstellen. Beispiele für derartige Liganden umfassen 2-Mercaptoimidazol, 3-Mercapto-1,2,4-triazol, 5-Mercapto-1,2,3-triazol, 5-Mercapto-1,2,3,4-tetrazol und N-Methyl-2-mercaptoimidazol.
  • Die Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung können zur Isolierung einer Vielzahl von unterschiedlichen Typen von Antikörpern, wie nativen Antikörpern, chemisch modifizierten Antikörpern, biotechnischen Antikörpern, Antikörperfragmenten und Antikörperkonjugaten, die Enzyme enthalten, sowie verschiedenen Toxinen, Haptenen und dergleichen verwendet werden. Zusätzlich können die Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung zur Isolierung von Antikörpern aus einer Vielzahl von unterschiedlichen biologischen Flüssigkeiten, wie Hybridoma-Zellkultur-Überständen, Plasma und Plasmafraktionen, Milch und Milchfraktionen, Aszitesfluiden, Fermentationsnährlösungen und dergleichen verwendet werden.
  • Die Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung stellen eine signifikante Weiterentwicklung in der Technik gegenüber Adsorptionsmitteln dar, bei denen Antikörperspezifische Proteine, wie Protein A, Protein G, Protein L und dergleichen verwendet werden. Dies gilt zum Teil, weil die vorliegenden Adsorptionsmittel stabil gegen biologische Zersetzung, insbesondere Zersetzung durch hydrolytische Enzyme, sind. Zusätzlich sind viele der Liganden der vorliegenden Adsorptionsmittel im Handel erhältliche Chemikalien, deren laufende Kosten signifikant niedriger als die von Liganden auf Proteinbasis sind. Darüber hinaus können die vorliegenden Adsorptionsmittel mit stark saueren und alkalischen Lösungen behandelt werden, die ansonsten mit Adsorptionsmitteln, bei denen Proteinliganden eingesetzt werden, nicht geeignet wären. Zudem können die vorliegenden Adsorptionsmittel mit anderen Reinigungsmitteln, wie Detergenzien, chaotropen Salzen und dergleichen behandelt werden, ohne dass man das Risiko von Adsorptionsmittelzersetzung oder -inaktivierung eingeht. Darüber hinaus kann auf die Adsorptionsmittel der vorliegenden Erfindung eine Wärmebehandlung angewandt werden, ohne deren Einfangwirksamkeit oder -spezifität zu modifizieren.
  • Verglichen mit bestehenden Pseudobioaffinitäts-Adsorptionsmitteln sind die vorliegenden Adsorptionsmittel spezifischer und/oder zeigen eine höhere Sorptionskapazität für Antikörper.
  • Die folgenden Beispiele sind lediglich veranschaulichend und sollen in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränken:
  • Beispiel 1: Immobilisierung von 2-Mercaptoimidazol auf einem Epoxyaktivierten HyperDTM-Träger
  • 20 Gramm Epoxy-aktivierter HyperD7M-Siliziumdioxid/Polystyrol-Verbund-Träger mit funktionalisierten Hydrogel-gefüllten Poren (kommerziell erhältlich von BioSepra, Inc., Marlborough, MA und beschrieben in US-Patent Nr. 5,268,097) wurden in 100 ml von 35% 50 mM Carbonatpuffer, pH-Wert 8,6, und 65% Ethanol, der 5 mM 2-Mercaptoimidazol enthielt, suspendiert und 16 Stunden geschüttelt. Die Aufschlämmung wurde über ein Sinterglasfilter filtriert, mit Ethanol gewaschen und ausgetrocknet. Das modifizierte HyperDTM- Adsorptionsmittel wurde nochmals suspendiert in 1 M Ethanolamin, pH-Wert 10,5, 2,5 Stunden bei 45°C geschüttelt, filtriert und dann mit Wasser gewaschen. Die Kügelchen wurden dann nochmals suspendiert in 2 M Natriumacetat und 2 ml Essigsäureanhydrid wurden über eine Zeitdauer von einer Stunde unter Schütteln zugegeben. Das Gemisch wurde anschließend eine zusätzliche Stunde geschüttelt, über ein Sinterglasfilter filtriert und mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen.
  • Dann wurde auf dem oben genannten Adsorptionsmittel unter Verwendung von 10 mM HEPES bei pH-Wert 7,5 ein chromatographischer Assay durchgeführt. 1,5 ml Humanserum wurden drei Mal mit HEPES-Puffer verdünnt und durch eine Säule mit 1,2 ml Gelvolumen geleitet. Eine Elution wurde durch Ändern des pH-Wertes auf 3,5 mit Zitronensäurepuffer durchgeführt. Eine elektrophoretische Analyse der gesammelten Elutionsfraktionen zeigte, dass Immunoglobuline den Hauptteil der adsorbierten Proteine darstellten, und die Reinheit der Immunoglobuline wurde mit mehr als 75% beurteilt. Die dynamische Kapazität des modifizierten Gels durch Frontanalyse betrug 9,2 mg/ml bei c/10 (d. h. 10% Durchbruch) und 14,4 mg/ml bei c/2 (d. h. 50% Durchbruch) für Human-Immunoglobuline bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 120 cm/h.
  • Beispiel 2: Immobilisierung von 2-Aminoimidazol auf einem Epoxyaktivierten HyperDTM-Träger
  • Ein Adsorptionsmittel, das ähnlich zu dem in Beispiel 1 synthetisierten war, wurde hergestellt, wobei der einzige Unterschied darin bestand, dass 2-Mercaptoimidazol durch 2-Aminoimidazol ersetzt wurde. Eine Bewertung der dynamischen Kapazität des Adsorptionsmittels wurde unter Einsatz einer Frontanalyse durchgeführt und zeigte, dass das 2-Aminoimidazol-Adsorptionsmittel eine dynamische Kapazität von 1,5 mg/ml bei c/10 und 2,5 mg/ml bei c/2 für Human-Immunoglobuline bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 120 cm/h hatte.
  • Aus einem Vergleich der Ergebnisse von Beispiel 1 und 2 ist zu ersehen, dass, wenn eine Schwefelgruppe (Mercaptoimidazol) durch eine Stickstoffgruppe (Aminoimidazol) ersetzt wird, die Sorptionskapazität und Einfangwirksamkeit dramatisch abnehmen.
  • Beispiel 3: Immobilisierung von 2-Mercaptothiazol auf einem Epoxyaktivierten HyperDTM-Träger
  • Ein Adsorptionsmittel, das ähnlich zu dem in Beispiel 1 synthetisierten war, wurde hergestellt, wobei der einzige Unterschied darin bestand, dass 2-Mercaptoimidazol durch 2-Mercaptothiazol ersetzt wurde. Ein chromatographischer Assay wurde unter Verwendung von 10 mM HEPES und 500 mM Natriumsulfat bei pH-Wert 7,5 durchgeführt. 1,5 ml Human-Serum wurde durch eine Säule mit 4,6 ml Gelvolumen geleitet, und eine Elution wurde durch Ändern des pH-Wertes auf 3,5 mit Zitronensäurepuffer durchgeführt.
  • Eine elektrophoretische Analyse der gesammelten Elutionsfraktionen zeigte, dass Immunoglobuline den Hauptteil der adsorbierten Proteine darstellten, und die Reinheit der Immunoglobuline wurde mit mehr als 85% beurteilt. Die Kapazität des modifizierten Gels durch Frontanalyse wurde mit 6,2 mg/ml bei c/10 und 7,9 mg/ml bei c/2 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 120 cm/h bestimmt.
  • Beispiel 4: Immobilisierung von 2-Mercaptothiazolin auf einem Epoxyaktivierten HyperDTM-Träger
  • Ein Adsorptionsmittel, das ähnlich zu dem in Beispiel 1 synthetisierten war, wurde hergestellt, wobei der einzige Unterschied darin bestand, dass 2-Mercaptoimidazol durch 2-Mercaptothiazolin ersetzt wurde. Ein chromatographischer Assay wurde unter Einsatz von 10 mM HEPES und 500 mM Natriumsulfat bei pH-Wert 7,5 durchgeführt. 1,5 ml Human-Serum wurde durch eine Säule mit 4,6 ml Gelvolumen geleitet, und eine Elution wurde durch Ändern des pH-Wertes auf 3,5 mit Zitronensäurepuffer durchgeführt.
  • Eine elektrophoretische Analyse der gesammelten Elutionsfraktionen zeigte, dass Immunoglobuline den Hauptteil der adsorbierten Proteine darstellten, und die Reinheit der Immunoglobuline wurde mit mehr als 85% beurteilt. Die Kapazität des modifizierten Gels wurde durch Frontanalyse mit 6,2 mg/ml bei c/10 und 7,7 mg/ml bei c/2 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 120 cm/h bestimmt.
  • Beispiel 5: Immobilisierung von 3-Mercapto-1,2,4-triazol auf einem Epoxyaktivierten HyperDTM-Träger
  • Ein Adsorptionsmittel, das ähnlich zu dem in Beispiel 1 synthetisierten war, wurde hergestellt, wobei der einzige Unterschied darin bestand, dass 2-Mercaptoimidazol durch 3-Mercapto-1,2,4-triazol ersetzt wurde. Unter Verwendung der gleichen Sorte von Assay, der in Beispiel 1 oben beschrieben ist, wurde die Kapazität des modifizierten Gels für reine Human-Antikörper durch eine Frontanalyse mit 1,5 mg/ml bei c/10 und 8,1 mg/ml bei c/2 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 146 cm/h und einem Adsorptionspuffer, der 10 mM HEPES bei pH-Wert 7 enthielt, bestimmt.
  • Beispiel 6: Immobilisierung von 2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol auf einem Epoxy-aktivierten HyperDTM-Träger
  • Ein Adsorptionsmittel, das ähnlich zu dem in Beispiel 1 synthetisierten war, wurde hergestellt, wobei der einzige Unterschied darin bestand, dass 2-Mercaptoimidazol durch 2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol ersetzt wurde. Unter Verwendung der gleichen Sorte von Assay, der oben in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde die Kapazität des modifizierten Gels für reine Human-Antikörper durch Frontanalyse mit 9,1 mg/ml bei c/10 und 11,2 mg/ml bei c/2 bei einer Strömungs geschwindigkeit von 140 cm/h in einem Adsorptionspuffer, der 10 mM HEPES und 750 mM Natriumsulfat bei pH-Wert 7 enthielt, bestimmt.
  • Beispiel 7: Immobilisierung von 2-Mercapto-5-thiazolidon auf einem Epoxyaktivierten HyperDTM-Träger
  • Ein Adsorptionsmittel, das ähnlich zu dem in Beispiel 1 synthetisierten war, wurde hergestellt, wobei der einzige Unterschied darin bestand, dass 2-Mercaptoimidazol durch 2-Mercapto-5-thiazolidon ersetzt wurde. Unter Verwendung der gleichen Sorte von Assay, der oben in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde die Kapazität des modifizierten Gels für reine Human-Antikörper durch Frontanalyse mit 9 mg/ml bei c/10 und 12,2 mg/ml bei c/2 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 134 cm/h in einem Adsorptionspuffer, der 10 mM HEPES und 750 mM Natriumsulfat bei pH-Wert 7 enthielt, bestimmt.
  • Beispiel 8: Immobilisierung von 2-Mercaptothiazolin auf einem Vinylaktivierten HyperDTM-Träger
  • 15 Gramm Amino-HyperDTM (hergestellt durch Aminierung durch Umsetzung des Epoxy-aktivierten HyperDTM von Beispiel 1 mit Ethylendiamin) wurden in 80 ml eines Gemisches, das 35% 100 mM Carbonatpuffer, pH-Wert 9,5, und 65% Ethanol enthielt, suspendiert. Zu dieser Aufschlämmung wurden 7 ml Divinylsulfon zugegeben, und die Aufschlämmung wurde 20 Stunden bei 45°C geschüttelt. Die Aufschlämmung wurde filtriert, mit Ethanol gewaschen und getrocknet. Die Kügelchen wurden nochmals suspendiert in 75 ml eines Gemisches aus 35% 50 ml Carbonatpuffer, pH-Wert 8,6, und 65% Ethanol, der 5 mM 2-Mercaptothiazolin enthielt, und anschließend 24 Stunden bei 45°C geschüttelt. Die Aufschlämmung wurde dann über ein Sinterglasfilter filtriert, mit Ethanol gewaschen und getrocknet. Der modifizierte HyperDTM-Träger wurde dann nochmals suspendiert in 100 ml einer 1 M Ethanolamin enthaltenden Lösung, pH-Wert 10,5, 2,5 Stunden bei 45°C geschüttelt, filtriert und mit Wasser gewaschen.
  • Unter Verwendung von 10 mM HEPES und 500 mM Natriumsulfat bei pH-Wert 7,5 wurde ein chromatographischer Assay durchgeführt. 1,5 ml Human-Serum wurden durch eine Säule mit 4,6 ml Gelvolumen geleitet, und eine Elution wurde durch Ändern des pH-Wertes auf 2,5 mit Zitronensäurepuffer durchgeführt. Eine elektrophoretische Analyse der gesammelten Elutionsfraktionen zeigte, dass Immunoglobuline den Hauptteil der adsorbierten Proteine darstellten, und die Reinheit der Immunoglobuline wurde mit mehr als 85% beurteilt. Die Kapazität des modifizierten Gels wurde durch Frontanalyse mit 11,8 mg/ml bei c/10 und 14,4 mg/ml bei c/2 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 120 cm/h bestimmt.
  • Beispiel 9: Immobilisierung von 2-Mercaptothiazol auf einem Bromaktivierten HyperDTM-Träger
  • 5 Gramm Brom-aktiviertes HyperDTM wurden in 25 ml eines Gemisches aus 35% 50 mM Carbonatpuffer, pH-Wert 8,6, und 65% Ethanol, der 600 mg 2-Mercaptothiazol enthielt, suspendiert. Die Aufschlämmung wurde 20 Stunden kopfüber bei Raumtemperatur gedreht und dann über ein Sinterglasfilter filtriert, gewaschen und ausgetrocknet. Die Aufschlämmung wurde anschließend nochmals suspendiert in einer wässrigen Lösung aus 1 M Ethanolamin bei pH-Wert 10,5 und 2 Stunden bei Raumtemperatur kopfüber gedreht. Die Aufschlämmung wurde dann filtriert, mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen und dann nochmals in 2 M Natriumacetat suspendiert. 1 ml Essigsäureanhydrid wurde dann über den Verlauf einer Stunde zugegeben. Anschließend wurde die Aufschlämmung eine zusätzliche Stunde gedreht und dann über ein Sinterglasfilter filtriert, zur Neutralität gewaschen und ausgetrocknet.
  • Das modifizierte Gel wurde dann mit reinem Human-IgG bewertet. Eine Frontanalyse des modifizierten Gels zeigte eine dynamische Kapazität von 2,2 mg/ml bei c/10 und 7,8 mg/ml bei c/2 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 160 cm/h unter Einsatz von 10 mM HEPES und 500 mM Na2SO4 bei pH-Wert 7.0.
  • Beispiel 10: Immobilisierung von 2-Mercaptothiazol auf einem Epoxy-Sepharose CL-6B-Träger
  • 2,5 ml Epoxy-Sepharose CL-6B-Träger (Epoxy-aktivierte Agarose-Kügelchen mit einem Epoxy-Gehalt von 10 bis 12 μM/ml Gel; kommerziell erhältlich von Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) wurden in 15 ml eines Gemisches aus 35% 50 mM Carbonatpuffer, pH-Wert 8,6, und 65% Ethanol, der 600 mg 2-Mercaptothiazol enthielt, suspendiert. Die Aufschlämmung wurde 20 Stunden kopfüber gedreht und dann über ein Glasfilter filtriert, gewaschen und ausgetrocknet. Die Agarose-Kügelchen wurden dann nochmals suspendiert in einer wässrigen Lösung aus 1 M Ethanolamin bei einem pH-Wert von 10,5 und kopfüber 2 Stunden bei Raumtemperatur gedreht. Die Aufschlämmung wurde anschließend filtriert und mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen und dann nochmals suspendiert in 2 M Natriumacetat. 1 ml Essigsäureanhydrid wurde dann über den Verlauf einer Stunde zugegeben. Die Aufschlämmung wurde anschließend eine zusätzliche Stunde gedreht, über ein Sinterglasfilter filtriert, zur Neutralität gewaschen und ausgetrocknet.
  • Das modifizierte Gel wurde mit reinem Human-IgG bewertet. Eine Frontanalyse des modifizierten Gels zeigte eine dynamische Kapazität von 5,4 mg/ml bei c/10 und 24,2 mg/ml bei c/2 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 75 cm/h unter Einsatz von 10 mM HEPES und 500 mM Na2SO4 bei pH-Wert 7,0.
  • Beispiel 11: Immobilisierung von 2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol auf Eupergit®-Träger
  • 20 g Eupergit®-Träger (ein Copolymer aus Methacrylamid, N,N-Methylenbis(methacrylamid) und einer Komponente, die eine aktive Oxirangruppe enthält; kommerziell erhältlich von Rohm Pharma, Darmstadt, Deutschland) werden in 50 ml von 50% 50 mM Carbonatpuffer, pH-Wert 8,6, und 50% Ethanol suspendiert. Zu dieser Suspension werden 50 ml Ethanol, der 5 mM 2- Mercapto-1,3,4-thiadiazol enthält, zugegeben, und die Aufschlämmung wird 16 Stunden geschüttelt. Die Aufschlämmung wird dann filtriert, mit 50 mM Carbonatpuffer bei pH-Wert 8,6/Ethanol (1 : 1) gewaschen und unter Vakuum ausgetrocknet. Der modifizierte Träger wird sodann mit Ethanolamin, wie in Beispiel 1 beschrieben, gesättigt und auf seine Fähigkeit zur Abtrennung von Antikörpern aus Human-Plasma getestet. Seine Sorptionskapazität wird ebenfalls durch Frontanalyse unter Verwendung von reinem Human-IgG überprüft, und es wird erwartet, dass es innerhalb ±10% des für das Adsorptionsmittel in Beispiel 6 offenbarten Wertes liegt.
  • Beispiel 12: Immobilisierung von 2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol auf Epoxy-Fractogel-Träger
  • 20 g Epoxy-Fractogel-Träger (Epoxy-aktivierter Polymethacrylat-Träger; kommerziell erhältlich von E. Merck, Wakefield, RI) werden in 20 ml von 50% 50 mM Carbonatpuffer, pH-Wert 8,6, und 50% Ethanol suspendiert. Zu dieser Suspension werden 50 ml Ethanol, der 5 mM 2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol enthält, zugegeben, und die Aufschlämmung wird 16 Stunden geschüttelt. Die Aufschlämmung wird dann filtriert, mit 50 mM Carbonatpuffer bei pH-Wert 8,6/Ethanol (1 : 1) gewaschen und unter Vakuum ausgetrocknet. Der modifizierte Träger wird sodann mit Ethanolamin, wie in Beispiel 1 beschrieben, gesättigt und auf seine Fähigkeit zur Abtrennung von Antikörpern aus Human-Plasma getestet. Seine Sorptionskapazität wird ebenfalls durch Frontanalyse unter Verwendung von reinem Human-IgG überprüft, und es wird erwartet, dass es innerhalb + 10% des für das Adsorptionsmittel in Beispiel 6 offenbarten Wertes liegt.
  • Beispiel 13: Immobilisierung von 3-Mercapto-1,2,4-triazol auf Spherodex®-Träger
  • 20 g kommerziell erhältlicher Spherodex®-Träger (Dextran-Siliziumdioxid-Verbund-Träger, erhältlich von BioSepra, Inc., Marlborough, MA) werden in 70 ml entionisiertem Wasser suspendiert. Unter Rühren werden 10 ml Ethylenglycoldiglycidylether und 30 ml 1 M Natriumhydroxid, enthaltend 200 mg Natriumboronat, zugegeben. Das Gemisch wird 16 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und dann schnell mit entionisiertem Wasser bis zur Neutralität gewaschen. Das Epoxy-aktivierte Spherodex® wird dann mit 3-Mercapto-1,2,4-triazol, wie in Beispiel 1 beschrieben (ohne den letzten Acetylierungsschritt), umgesetzt und auf seine Fähigkeit zur Abtrennung von Antikörpern aus Human-Plasma getestet. Seine Sorptionskapazität wird ebenfalls durch Frontanalyse unter Verwendung von reinem Human-IgG überprüft, und es wird erwartet, dass es innerhalb + 10% des für das Adsorptionsmittel in Beispiel 5 offenbarten Wertes liegt.
  • Beispiel 14: Reinigung von Immunoglobulinen aus Rinder-Kolostrum auf 2-Mercaptoimidazol
  • Rinder-Kolostrum wurde 1 : 1 mit Adsorptionspuffer (10 mM HEPES, pH-Wert 7,3) verdünnt und filtriert. Auf einer 5,9 ml Säule wurde bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 120 cm/h eine Adsorption durchgeführt. Eine Elution wurde mit 200 mM Natriumdihydrogenphosphat, pH-Wert 4,25 durchgeführt. Eine elektrophoretische Analyse zeigte, dass die eluierten Immunoglobuline mehr als 80 % Reinheit aufwiesen.

Claims (15)

  1. Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel zur Verwendung bei der selektiven Adsorption von Immunoglobulinen, wobei das Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel umfasst: (a) ein festes Trägermaterial; und (b) einen Liganden, der an der Oberfläche des festen Trägermaterials über eine kovalente Bindung immobilisiert ist, die zwischen der Mercaptogruppe des Liganden und einer auf dem festen Trägermaterial vorliegenden reaktiven Gruppe ausgebildet ist, wobei der Ligand die Formel I hat:
    Figure 00220001
    wobei jedes von X1, X2 und X3 aus S, SCH3 +, O, NH, NCH3, CH2 und CR1R2 ausgewählt ist, wobei R1 und R2 aus substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl, Aryl, Alkenyl, Alkinyl, Aralkyl, Acyl, Cycloalkyl, Carboxyl, Amino, Aryloxy oder Alkoxy, Halogen, Hydroxy, Nitro, O, S und Cyano ausgewählt sind; wobei X4 aus N, NCH3 +, CH und CR ausgewählt ist, wobei R aus substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl, Aryl, Alkenyl, Alkinyl, Aralkyl, Acyl, Cycloalkyl, Carboxyl, Amino, Aryloxy oder Al- koxy, Halogen, Hydroxy, Nitro, O, S und Cyano ausgewählt ist; und wobei wenigstens zwei von X1, X2, X3 und X4 weder CH2, CH, CR noch CR1R2 sind, und wobei die reaktive Gruppe aus Epoxygruppen, Tosylaten, Tresylaten, Halogeniden und Vinylgruppen ausgewählt ist.
  2. Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel nach Anspruch 1, wobei der Ligand aus Mercaptothiazolin ausgewählt ist, insbesondere 2-Mercaptothiazolin und 2-Mercapto-5-thiazolidon.
  3. Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel nach Anspruch 1, wobei keines von X1, X2 und X3S, SCH3 + oder O ist.
  4. Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel zur Verwendung bei der selektiven Adsorption von Immunoglobulinen, wobei das Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel umfasst: (a) ein festes Trägermaterial; und (b) einen Liganden, der an der Oberfläche des festen Trägermaterials über eine kovalente Bindung immobilisiert ist, die zwischen der Mercaptogruppe des Liganden und einer auf dem festen Trägermaterial vorliegenden reaktiven Gruppe ausgebildet ist, wobei der Ligand die Formel II hat:
    Figure 00230001
    wobei Y1 aus S, SCH3 +, O, NH, NCH3, CH2 und CR1R2 ausgewählt ist, wobei R1 und R2 aus substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl, Aryl, Al- kenyl, Alkinyl, Aralkyl, Acyl, Cycloalkyl, Carboxyl, Amino, Aryloxy oder Alkoxy, Halogen, Hydroxy, Nitro, O, S und Cyano ausgewählt sind; wobei jedes von Y2, Y3 und Y4 aus N, NCH3 +, CH und CR ausgewählt ist, wobei R aus substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl, Aryl, Alkenyl, Alkinyl, und wobei die reaktive Gruppe aus Epoxygruppen, Tosylaten, Tresylaten, Halogeniden und Vinylgruppen ausgewählt ist.
  5. Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel nach Anspruch 4, wobei der Ligand aus Mercaptoimidazol, Mercaptoimidazolin, Mercaptothiazol, Mercaptotriazol, Mercaptotetrazol, Mercaptothiadiazol und Mercaptomethylimidazol ausgewählt ist; insbesondere wobei der Ligand aus N-Methyl-2-mercaptoimidazol, 2-Mercaptoimidazol, 2-Mercaptothiazol, 3-Mercapto-1,2,4-triazol, 5-Mercapto-1,2,3-triazol, 5-Mercapto-1,2,3,4-tetrazol und 2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol ausgewählt ist; insbesondere wobei der Ligand N-Methyl-2-mercaptoimidazol, 2-Mercaptothiazol oder 2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol ist.
  6. Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel nach Anspruch 4, wobei Y1 weder S, SCH3 + noch O ist.
  7. Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 oder 4, wobei der Ligand auf der Oberfläche des festen Trägermaterials über ein bifunktionelles Aktivierungsmittel immobilisiert ist, das die Gruppe aufweist, die zu der Mercaptogruppe des Liganden reaktiv ist; insbesondere wobei das bifunktionelle Aktivierungsmittel aus Epichlorhydrin, Epibromhydrin, Dibrompropanol, Dichlorpropanol, Dibrombutan, Ethylenglykoldiglycidylether, Butandioldiglycidylether und Divinylsulfon ausgewählt ist.
  8. Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der feste Träger ausgewählt ist aus Zellulose, Stärke, Dextran, Agar, Agarose, substituierten oder unsubstituierten Polyacrylamiden, Polymethacrylamiden, Polyacrylaten, Polymethacrylaten, Polyvinyl-hydrophilen Polymeren, Polystyrol und Polysulfon, Siliziumdioxid, Aluminiumoxid, Titandioxid, Zirkoniumdioxid, Polysaccharid-synthetischen Polymeren, Polysaccharid-Mineralstrukturen und synthetischen Polymer-Mineralstrukturen.
  9. Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das feste Trägermaterial eine physikalische Form aufweist, die aus Kügelchen, unregelmäßigen Teilchen, Fasern, Membranen, flachen Oberflächen und schwammähnlichen Materialien ausgewählt ist.
  10. Verfahren zur Herstellung eines Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittels zur Verwendung bei der Bindung eines Target-Proteins bzw. Zielproteins während Affinitätstrennungen des Target-Proteins von einem Gemisch von Verbindungen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines festen Trägermaterials; (b) Immobilisieren eines Liganden auf der Oberfläche des festen Trägermaterials über eine kovalente Bindung, die zwischen der Mercaptogruppe des Liganden und einer auf dem festen Trägermaterial vorliegenden reaktiven Gruppe ausgebildet wird, wobei der Ligand aus den Formeln I und II wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 und 4 bis 6 definiert, ausgewählt wird, und wobei die reaktive Gruppe aus Epoxygruppen, Tosylaten, Tresylaten, Halogeniden und Vinylgruppen ausgewählt wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Immobilisierungsschritt das Aktivieren des festen Trägermaterials mit einem bifunktionellen Aktivierungsmittel, das die Gruppe aufweist, die zu der Mercaptogruppe des Liganden reaktiv ist, und das In-Kontakt-Bringen des Liganden mit dem aktivierten festen Trägermaterial umfasst; insbesondere wobei das bifunktionelle Aktivierungsmittel wie in Anspruch 7 definiert ist.
  12. Verfahren zur Durchführung von Affinitätstrennungen eines Target-Proteins bzw. Zielproteins, das von einem Gemisch von Verbindungen abzutrennen ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittels wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 und 4 bis 6 definiert; (b) In-Kontakt-Bringen des Gemisches von Verbindungen, das das Target-Protein enthält, mit dem Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel, wobei dem Gemisch von Verbindungen eine geeignete Menge eines Salzes hinzugefügt worden ist, um dem Target-Protein zu gestatten, an den Liganden zu binden; und (c) Aufrechterhalten eines Kontakts zwischen dem Gemisch und dem Pseudobioaffinitätschromatographie-Adsorptionsmittel für eine Zeit, die ausreichend ist, um das Target-Protein selektiv und reversibel an den immobilisierten Liganden zu binden, wodurch das Target-Protein von dem Gemisch abgetrennt wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei in dem Liganden von Formel I keines von X1, X2 und X3S, SCH3 + oder 0 ist und die geeignete Menge an Salz Null beträgt ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei in dem Liganden von Formel II, Y1 weder S, SCH3 + noch 0 ist und die geeignete Menge an Salz Null beträgt.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei das Target-Protein ein Immunoglobulin ist.
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