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DE2840503C2 - Verfahren zur Herstellung eines festen porösen Materials für chromatographische Zwecke - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines festen porösen Materials für chromatographische Zwecke

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Publication number
DE2840503C2
DE2840503C2 DE2840503A DE2840503A DE2840503C2 DE 2840503 C2 DE2840503 C2 DE 2840503C2 DE 2840503 A DE2840503 A DE 2840503A DE 2840503 A DE2840503 A DE 2840503A DE 2840503 C2 DE2840503 C2 DE 2840503C2
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polysaccharide
chromatography
affinity
porous
carrier
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DE2840503A
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DE2840503A1 (de
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Michel Lyon Tardy
Jean-Louis La Tour de Salvagny Tayot
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Institut Merieux SA
Original Assignee
Institut Merieux SA
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Publication date
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Description

25
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines festen porösen Materials für chromatographische Zwecke, bei dem man einen mineralischen, porösen Träger mit einem Polysaccharid überzieht, sowie die Verwendung dieses Materials in einer chromatographischen Säule zur Isolierung und Reinigung von biologischen Makromolekülen.
Aus der eigenen älteren DE-OS 26 33 246 ist zwar bekannt, ein aminiertes Polysaccharid auf ein mineralisches Oxid, wie SiO2, Al2O3, MgO oder TiO2 aufzubringen und dieses Material zur Fixierung biologischer Makromoleküle zu verwenden, z. B. in chromatographischen Säulen zur Reinigung oder Isolierung solcher Moleküle.
Das erfindungsgemäß hergestellte Material unterscheidet sich von dem Material der DE-OS 26 33 246 dadurch, daß das als Ausgangsmaterial verwendete, an den porösen Träger Fixierte Polysaccharid zuerst oxydativ gespalten und dann aminiert und reduziert wird und somit eine unterschiedliche Struktur haben muß. Im wesentlichen werden die e-Glykolgruppen oxydativ gespalten, was an sich bekannt ist (L. und M. Fieser, Advanced Organic Chemistry 1961, Seite 184). Hier- so durch wird aber die Polysaccharidstruktur zerstört, insbesondere die cyclische Grundstruktur des Ausgangs-Saccharids.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines festen porösen Materials für chromatographische Zwecke, bei dem man einen porösen, mineralischen Träger mit einem Polysaccharid überzieht, ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Polysaccharid ein solches verwendet, das mit Perjodsäure oder einem ihrer Derivate oxydativ spaltet, daß man den Polysaccharidüberzug einer Perjodat-Oxidation unterwirft, daß man das so erhaltene Oxidationsprodukt mit einem primären Amin reagieren läßt und dann das erhaltene Iminoderivat der Einwirkung eines Reduktionsmittels, das die Iminobindung zu einer Aminobindung zu reduzieren vermag, unterwirft.
Nachdem das Material der Vorveröffentlichung stark kationisch ist und demgemäß elektrische Bindekräfte vorherrschend sind, war es überraschend, daß der PoIysaccharidüberzug, der erfindungsgemäß hergestellt ist, seine Eigenschaften auch nach der oxydativen Spaltung auf dem Trägermaterial beibehält und chromatographisch reaktionsfähige Absorptionsstellen beibehält Gegenüber dem bekannten Material brauchen aber keine genauen pH-Werte und Konzentrationen beim Fixieren und Eluieren aufrechterhalten werden, was den Anwendungsbereich erweitert und beim vorveröffentlichten Material auftretende Schwierigkeiten umgeht.
Erfindungsgemäß ist bevorzugt, daß man die Reduktion mit einem Hydrid wie Natriumborhydrid durchführt.
Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren ursprünglich eingesetzte Polysaccharid entspricht der schematischen Formel
R-(CH2)Z-N
R,
worin R einen Polysaccharid-Rest bedeutet, η eine ganze Zahl von 1 bis 10 und vorzugsweise von 2 bis 5 ist, Ri und R2 gleich oder verschieden sind und einen Niederalkylrest oder einen hydroxylierten Niederalkylrest bedeuten, wobei der Polysaccharidüberzug, wenn nötig, zu seiner Stabilisierung vernetzt ist, und wobei auf dem Polysaccharidüberzug Aminomoleküle oder -makromoleküle aufgepropit sind, die bei der Chromatographie eine reaktive Stelle darzustellen vermögen und der Formel R'-NH2 entsprechen, wobei R' der Rest des Aminomoleküls oder -makromoleküls ist und die Pfropfbindung des Aminomoleküls oder makromoleküls der schematischen Formel
R3-CH2-NH-R'
entspricht, worin R' die genannte Bedeutung hat und R3-CH2- den Rest des Polysaccharide bedeutet, nachdem es einer oxydativen Spaltung und anschließender Reduktion unterworfen worden ist. Ein »Niederalkyl«- Rest bezeichnet einen Alkylrest mit 1 bis 4 und vorzugsweise 1 oder 2 Kohlenstoffatomen.
Die Polysaccharide, die zur Herstellung des erfindungsgemäßen festen, porösen Materials brauchbar sind, sind gegebenenfalls modifizierte Polysaccharide, die die bekannte oxydative Spaltung mit Oxidationsmitteln, wie Perj odaten oder deren Derivaten oder mit Bleitetraacetat, erfahren können.
Das Polysaccharid ist insbesondere Cellulose, das modifizierte Polysaccharidpolymere ist ein Polymeres der Formel I, worin R ein Dextran-, Stärke- oder CeIIuloserest und insbesondere Diäthylaminoäthyldextran, DEAE-Dextran, Diäthylaminoäthylstärke oder Diäthylaminoäthylcellulose ist. Der bekannte mineralische, poröse Träger besteht insbesondere aus einem Metalloxid, wie Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Magnesiumoxid oder einem Titanoxid, oder aus synthetischen oder natürlichen Derivaten dieser Oxide, wie Gläsern, Silikaten, Borsilikaten oder Kaolin. Der Polysaccharidüberzug ist gegebenenfalls durch Vernetzung stabilisiert, wobei das Vernetzungsmittel z. B. eine Dicarbonylverbindung, ein Halogenhydrin oder ein Diepoxid ist, insbesondere 1,4-Butandioldiglycidyl-
äther, Epichlorhydrin, Epibromhydria oder ein Epoxid der Forme!
CH2 CH-R4-N-R4-CH CH2
O O
worin R5 ein Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ein Niederalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist und R4 und R6 eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ein Niederalkylenrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, bedeuten. Das Aminomolekül oder -makromolekül der Formel R'-NH2 kann als Träger der reaktiven Stelle bei der Chromatographie jedes Molekül s^in, das die NH2-Funktionen trägt und in der Chromatographie mit biospezifischer, chemischer oder physikalisch-chemischer Affinität brauchbar ist. Es handelt sich um Moleküle, die zu reversiblen Wechselwirkungen biospezifischer, chemischer oder physikalisch-chemischer Art befähigt sind, z. B. ionischen Wechselwirkungen, Wechselwirkungen, die hydrophobe Eigenschaften zum Zuge kommen lassen, Wechselwirkungen, die eine biospezifische oder chemische Affinität zum Zuge kommen lassen, z. B. die Bildung reversibler Komplexe. Das Aminomolekül oder -makromolekü! kann kationischen Charakter haben, der vorteilhaft bei Anionenaustauschreaktionen zur Geltung kommt; es kann anionische Gruppierungen tragen, wie Carboxyl- und Sulfongruppen, und Kationenaustauschreaktionen erlauben, es kann auch ein Aminomolekül oder -makromolekül sein, das bei der biospezifischen Chromatographie als reaktive Stelle dient, und z. B. ein Enzymsubstrat oder -inhibitor, einen Hormon-, Protein-, Virus- oder Bakterienrezeptor, ein Antigen oder ein Antikörper darstellen. Das Aminomolekül oder -makromolekül kann insbesondere ein Polyamin sein, wie 3-Diäthylaminopropylamin oder Ν,Ν-Diäthyläthylendiamin, Taurin, e-Aminocapronsäure, Lysin, Phenylalanin, Phenylhydrazin, meta-Aminophenylboronsäure, bakterielle Antigene, Globuline, insbesondere die ^Globuline, Bakterientoxine, Viren oder deren Abbauprodukte, wie die verschiedenen viralen Antigene, Zellenrezeptoren, wie die Hydrolyseprodukte der Ganglioside mit NH2-Funktionen, insbesondere die Hydrolyseprodukte des Gangliosids GMi, wie das Lysogangliosid Gm 1, oder die Produkte der partiellen Hydrolyse des Gangliosids GMi·
Man weiß, daß die Ganglioside eine N-Acylgruppierung (Acylderivat einer Fettsäure, wie der Stearinsäure) und wenigstens eine N-Acetylgruppierung besitzen (in 3-Stellung eines Galactosefragments), wobei weitere N-Acetylgruppierungen durch Moleküle von Sialinsäure gegebenenfalls vorliegen können. Diese N-Acyl- oder N-Acetyl-Gruppierungen sind teilweise oder vollständig zu NH2 Gruppierungen hydrolysiert^. Analog zu der von SVENNERHOLM für das Gangliosid GM1 vorgeschlagenen Nomenklatur werden nachfolgend als »Lysoganglioside« die Produkte bezeichnet, die durch vollständige Hydrolyse der N-Acyl- und N-Acetyl-Gruppierungen der Ganglioside an NH2-Gruppen erhalten wurden. Die Produkte der partiellen Hydrolyse der Ganglioside, in denen bestimmte NH2-Gruppen durch alkalische Hydrolyse deacyliert oder deacetyliert wurden, stellen gleichermaßen als Aminomoleküle, die als reaktive Stelle in dem erfindungsgemäßen Material dienen können, geeignete Derivate dar.
Erfindungsgemäß hergestellte Materialien, auf denen sich das Lysogangliosid GMi fixiert befindet, vermögen das Choleratoxin festzuhalten, selbst nach Behandlung in stark saurem Milieu, z. B. bei pH 1. Nun ist bekannt, daß in saurem Milieu die Ganglioside ein oder mehrere Sialinsäuremoleküle verlieren und in mono-Sialo- oder a-Sialoganglioside (oder -lysoganglioside) überführt werden können. Daraus ergibt sich, daß zur Fixierung des Choleratoxins ein erfindungsgemäßes Material verwendet werden kann, an dem als Aminomolekül der Formel R'-NH2 irgendein Gangliosidderivat verwendet werden kann (dessen N-Acetyl- und N-Acyl-Gruppierungen vollständig oder teilweise hydrolysiert wurden, um die NH2-Gruppen auftreten zu lassen), mit der Bedingung, daß dann das Material ausreichend lange sauer behandelt wird, um die Überführung der Poly-Sialogangliosid-Derivate in mono- oder a-Sialogangliosid-Derivate zu ermöglichen.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren wird so durchgeführt, daß man den mineralischen, porösen Träger mit dem Polysaccharid oder dem modifizierten Polysaccharid überzieht, daß man, gegebenenfalls, den Polysaccharidüberzug in einen (modifizierten) Polysaccharidüberzug überführt, daß man, wenn nötig, eine Vernetzung zur Stabilisierung des Überzugs vornimmt, daß man den gegebenenfalls modifizierten Polysaccharidüberzug einer oxidativen Spaltung unterwirft, daß man das so erhaltene Oxidationsprodukt mit dem Amin oder Aminomakromolekül der Formel R'-NH2 reagieren läßt und dann das erhaltene Iminoderivat der Einwirkung eines Reduktionsmittels, das die Iminobindung zu einer Aminobindung zu reduzieren vermag, unterwift.
Das Verfahren besteht also insbesondere in der Fixierung des Aminomoleküls oder -makromoleküls am Polysaccharidüberzug oder am Überzug des durch die folgenden Reaktionen modifizierten Polysaccharids:
a) Oxidative Spaltung der a-Glykol-Gruppierungen zur Carbonylderivaten, die man schematisch mit der Formel R4-CHO wiedergeben kann, wobei R4 der Rest des Polysaccharidmoleküls nach der oxidativen Spaltung ist;
b) Umsetzung des Aminomoleküls oder -makromoleküls mit Carbonylgruppen gemäß der Reaktion
R4-CHO + R'—NH2
—► R4- CH=N- R'+ H2O;
dann
c) Reduktion der Iminbindung zur stabilen Aminbindung, z. B. mit naszierendem Wasserstoff, nach der Reaktion
R4- CH=N- R'+ 2 H
—> R3-CH2-NH-R',
wobei R3 wie zuvor definiert ist.
Diese verschiedenen chemischen Umwandlungen können bei Raumtemperatur in einer Chromatogrphie-Säule erfolgen.
Ist das modifizierte Polysaccharid ein zu DEAE-Dextran analoges Aminopolysaccharid, ist es nach der Oxidationsreakiion nützlich, diese kationischen Gruppierungen mit Ionen zu sättigen, z. B. mit Halogenidiouen, um jede Gefahr der Störung der letzten Reaktion des Aminomoleküls oder -makromoleküls mit den Aldehydgruppen des Trägers zu vermeiden.
Für die Reduktionsreaktion kann man z. B. ein Hydrid, wie Natriumborhydrid, verwenden.
Zum Überziehen des mineralischen, porösen Trägers mit dem gegebenenfalls modifizierten Polysaccharid kann man z. B. gemäß der DE-OS 26 33 246 vorgehen, d. h., daß man den mineralischen, porösen Träger in Pulverform in eine Chromatographie-Säule einbringt, einen Puffer vom pH 3 bis 12 bis zum Gleichgewicht durchlaufen läßt, eine Lösung des Polymeren im gleichen Puffer einführt, dann bis zur Polymerenfreiheit in den Eluaten eluiert, oder man imprägniert den mineralischen, porösen Träger mit einer wäßrigen Lösung des Polymeren bei einem pH zwischen 3 und 12, trocknet dann im Ofen zwischen 50 und 120° C bis zur Gewichtskonstanz.
Ist das Aminomolekül R'-NH2, auf dem porösen Träger nach dem nachfolgend beschriebenen Verfahren fixiert, ein partielles oder vollständiges Hydrolyseprodukt eines Poly- oder Monosialogangliosids, gehört zum erfindungsgemäßen Verfahren außerdem eine fakultative Endstufe einer sauren Behandlung des erhaltenen Materials für eine zur Umwandlung des Hydrolyseprodukts in ein entsprechendes Hydrolyseprodukt eines mono- oder a-Sialogangliosids ausreichende Zeilspanne. Für diese saure Behandlung kann man z. B. eine 0,1 η wäßrige Salzsäurelösung oder eine solche höherer Konzentration verwenden.
Für die Bildung eines Celluloseüberzugs ist es von Vorteil, folgendermaßen vorzugehen:
Man imprägniert den mineralischen, porösen Träger mit Hilfe einsr Lösung eines Celluloseester«, trocknet und läßt auf den überzogenen Träger ein Hydrolysemittel einwirken, z. B. eine wäßrig-alkalische Lösung, um die Estergruppierungen zu hydrolysieren. So erhält man einen mineralischen, porösen, mit auf diese Weise regenerierter Cellulose überzogenen Träger. Dieser Celluloseüberzug ist sehr stabil und kleidet die Poren des mineralischen, porösen Tträgers vollständig aus. Es ist überflüssig, diesen Überzug durch Vernetzen zu stabilisieren.
In diesem Stadium kann der Celluloseüberzug in einen Überzug modifizierter Cellulose überführt werden, indem man ihn mit einem geeigneten Mittel umsetzt, z. B. mit einer Verbindung der Formel
X—(CH2),- N
55
R2
worin n, Ri und R2 wie zuvor definiert sind und X ein Halogenatom ist.
Man kann z. B. den mineralischen, porösen, mit Cellulose imprägnierten Träger mit 2-Chlortriäthylamin bei alkalischem pH umsetzen und so einen Überzug von Diäthylafninoäthylcellulose erhalten.
Der erfindungsgemäß brauchbare, mineralische, poröse 'XfugdT muß eine wohldefinierte, gesteuerte Porosität haben. Die innere Oberfläche des Trägers muß 100 m2/g oder darunter sein und, wenn möglich, zwischen 5 und 80m2/g betragen. Der mittlere Porendurchmesser soll über oder bei 25 nm und, wenn möglich, zwischen 50 und 1000 nm liegen, genauere Bireiche können je nach der beabsichtigten Verwendung empfohlen werden. Für größere Oberflächen oder geringere Porendurchmesser wird die innere Oberfläche des Trägers für das aminierte Polysaccharidpolymere und letztlich für die zu trennenden Makromoleküle unzugänglich. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der poröse, mineralische Träger Siliciumdioxid oder Aluminiumoxid und vorzugsweise ein poröser Siliciumdioxidträger mit anionischem Charakter, erhalten beispielsweise nach den in den FR-PS'en 14 73 239, 14 73 240, 14 75 929 und J 4 82 867 beschriebenen Verfahren. Verwendet werden z. B. poröse, handelsübliche Siliciumdioxide, die Oberflächen von 50, 25 bzw. 10 m2/g haben.
Das gegebenenfalls modifizierte Polysaccharid, das zum Imprägnieren und Überziehen der inneren Oberfläche des porösen, mineralischen Trägers dient, hat ein Molekulargewicht von wenigstens 104 Daltons und vorzugsweise zwischen 105 und 106 Daltons.
Gegenstand der Erfindung ist fernerauch die Verwendung der neuen, vorstehend beschriebenen Materialien zur Reinigung oder Trennung biologischer Makromoleküle.
Allgemein besteht diese Verwendung in der Ausnutzung der Affinitätseigenschaften des auf den Träger aufgepfropften Aminomoleküle oder -makromoleküls in einer Chromatographie-Säule, sei es zur selektiven Fixierung biologischer Makromoleküle, die man isolieren oder reinigen will, sei es zum selektiven Zurückhalten von Verunreinigungen oder anderen unerwünschten Proteinen.
Diese Verwendung zeichnet sich durch die Tatsache aus, daß man durch eine das erfindungsgemäße Material enthaltende Säule eine Lösung laufen läßt, die die biologischen Makromoleküle enthält, die man isolieren oder reinigen will. Fixiert das Material die biologischen Makromoleküle, die man reinigen oder isolieren will, werden diese anschießend mit einer geeigneten Lösung eluiert, was nach bekannten Methoden die Trennung der biologischen Makromoleküle vom Molekül R' -NH2 zuläßt, an das sie affinitiv gebunden sind. Beispielsweise trennt man in dem Fall, wo die zu isolierenden biologischen Makromoleküle durch biospezifische Affinität an einen Liganden fixiert sind, diese nach den bekannten Trennmethoden für biologische Makromoleküle von ihrem Liganden ab. Je nach dem zu isolierenden oder zu reinigenden biologischen Makromolekül wählt man ein poröses Material, an dem ein Molekül R'-NH2 fixiert ist, das Affinität für das biologische Makromolekül aufweist.
Fixiert das Material die Verunreinigungen, wird das gewünschte biologische Makromolekül in Lösung direkt aufgefangen, wozu also das poröse Material mit einem Aminomolekül R'-NH2 mit Affinität für die Verunreinigung, die entfernt werden soll, überzogen ist. Dann kann man die Verunreinigungen mit einer geeigneten Lösung eluieren und so das Material für einen neuen Arbeitsvorgang regenerieren.
Ist das zu isolierende biologische Makromolekül oder die zurückhaltende Verunreinigung am erfindungsgemäß hergestellten Material unter Ausnutzung von dessen Ionenaustauscheigenschaften fixiert, erfolgt die Elution des so fixierten Moleküls mit Hilfe einer Lösung geeigneten pH-Werts und geeigneter Molarität.
Wenn man nicht die Ionenaustauscheigenschaften des erfindungsgemäßen Materials ausnützen will, z. B. wenn man nur die biospezifischen Affinitätseigenschaften ausnützen will, ist es angebracht, in der Säule Lösungen ausreichender Ionenstärke zu verwenden, um die Ionenaustauschfunktionen zu neutralisieren. So ist es in dem Falle, in dem das erfindungsgemäße Material kationische Stellen aufweist, angebracht, die kationischen Gruppen zu neutralisieren, z. B. durch Cl~- Ionen, um jede nicht-spezifische Wechselwirkung ionisehen Charakters zu beseitigen.
In bestimmten Fällen kann man die Ionenaustauscheigenschaften und die anderen Affinitätseigenschaften, z.B. biospezifische Affinitätseigenschaften, des erfindungsgemäßen Materials gleichzeitig nutzen, um bei einer einzigen Chromatographie mehrere verschiedene Proteine zu trennen. Beispielsweise kann man mit einem Material, das gleichzeitig kationische Stellen und solche mit biospezifischer Affinität aufweist, leicht ein Gemisch dreier Proteine trennen: Ein erstes Protein mit elektropositiver Natur, ein zweites Protein mit elektronegativer Natur und ein drittes Protein, das an die Stellen mit biospezifischer Affinität fixiert zu werden vermag. Tatsächlich wird bei der Chromatographie eines solchen Gemischs das erste Protein nicht fixiert und findet sich also am Säulenauslauf wieder. Das zweite Protein wird an den kationischen Stellen fixiert und kann mit einer Lösung eluiert werden, die Anionen enthält, die die kationischen Stellen zu verdrängen vermögen, z. B. eine Natriumchloridlösung. Das dritte Protein wird an den Stellen mit biospezifischer Affinität fixiert und kann von diesen mit einem geeigneten Elutionsmittel getrennt werden.
Die Erfindung wird anhand einiger Beispiele für die Anwendung der Erfindung näher beschrieben.
A. Reinigung des Choleratoxins
Man weiß, daß die Cholera-Vibrione bei Entwicklung in einem geeigneten Kulturmedium ein Choleragen oder Enterotoxin genanntes Toxin abscheidet, das für die durch diesen Keim beim Menschen hervorgerufenen Durchfalle verantwortlich ist. Nach Zentrifugieren und Filtrieren des fertigen Kulturmediums kann man ein »Rohkulturfiltrat« erhalten, das das Choleratoxin im Gemisch mit zahlreichen anderen Makromolekülen des Ausgangskulturmediums oder von den Vibrionen abgeschieden enthält.
Das Choleratoxin wandelt sich teilweise und allmählich in eine nicht-toxische Form um, die Choleragenoid genannt wird. Das Choleragenoid hat eine Struktur, die der des Choleragens nahesteht, aber das Choleragen Hf»Ci17t Q?tR£>rHom oina DAUmanti^iretto Λ «4.Ά Γ7\~ AZn.
w vu..«_.. uuwwi uwiu wiiiv i. Vt j JS^)S 11UCV^rLt-W J~V, UlV IUl UIw Toxizität verantwortlich ist.
Das Choleragen und das Choleragenoid werden beide selektiv an einem Rezeptor fixiert, der 1973 identifiziert und mit »Gangliosid GM1« bezeichnet wurde.
Verschiedene Autoren haben die Bedeutung des Choleragens und des Choleragenoids für die Herstellung von Vaccinen beschrieben und daraus ist der Schluß zu ziehen, daß es nützlich ist, bedeutende Mengen dieser Produkte erhalten zu können.
Die Reinigung des Choleragens und des Choleragenoids wurde von zahlreichen Autoren beschrieben, erfordert aber häufig zahlreiche Stufen, um zu einwandfrei gereinigten und standardisierten Produkten zu gelangen; daher sind diese Methoden schwer in die . Industriepraxis umzusetzen. Durch Chromatographie mit biospezifischer Affinität ist es theoretisch möglich, in einer einzigen Stufe das gewünschte Produkt in einem sehr reinen Zustand zu erhalten. So hat Cuatrecasas (1973) eine Methode beschrieben, um das Choleratoxin durch Affinitätschromatographie selektiv zu erfassen. Agarose-Chromatographiesäulen wurden chemisch modifiziert, um das Gangliosid Gmi über kovalente Bindung zu fixieren. Dank der Affinität für das GM, war die Fixierung des Choleratoxins tatsächlich möglich, aber die Wiedergewinnung dieses Toxins war aufgrund einer extrem starken Affinität zwischen Gmi, an die Agarose gebunden, und dem Toxin schwierig geworden. Dies machte die Verwendung denaturierender Medien zur Spaltung des Komplexes notwendig und zog eine Denaturierung und schlechte Ausbeuten am Ende des Arbeitsgangs nach sich. Andererseits zwingt die anerkannte Methode der Aktivierung von Agarose zur Verwendung des sehr gefährlich zu handhabenden Bromcyans, was folglich zu unerwünschten Komplikationen bei einer eventuellen industriellen Entwicklung führen kann. Im übrigen haben sich die auf Agarose nach der Bromcyanmethode hergestellten Präparate als ziemlich instabil, vorallem bei sauren pH-Werten (ph <3) erwiesen. Da eine Ansäuerung des Mediums zur Rückgewinnung des Choleratoxins notwendig war, ist erkennbar, daß die Lebensdauer dieser Träger mit dem Risisko behaftet ist, im Falle industrieller Anwendung kurz zu sein.
Die Erfindung ermöglicht die Ausnutzung der Leistungsfähigkeit und Schnelligkeit der biospezifische Affinität anwendenden Chromatographie, aber unter Verwendung eines Trägers für die Chromatographie, der sich für die industrielle Verwendung vollkommen eignet.
Die Verwendung dieses Trägers bei der biospezifischen Affinität ist erst möglich, nachdem der auf der internen Oberfläche der Poren gewählte Ligand unbeweglich gemacht worden ist.
Zwei Arten verschiedener Liganden, beide für das Choleratoxin spezifisch, wurden eingesetzt. Der erste ist ein Derivat des Gangliosids GMi, das mit einer starken und für das Choleragen und das Choleragenoid spezifischen »biochemischen Affinität« ausgestattet ist. Der zweite ist der Anticholeratoxin-Antikörper, ausgestattet mit einer spezifischen »immunologischen Affinität« gegenüber dem Choleragen und dem Choleragenoid. Die Affinität des Toxins für das Gangliosid GM] ist bekanntlich sehr stark und wahrscheinlich stärker als die Affinität für Antikörper. Nach dem Aufpfropfen des Gangliosids GMi auf die Oberfläche des Siliciumdioxids nach den angegebenen Verfahren wurde jedoch festgestellt, daß die erzielte Affinität zwischen dem so bepfropfteri GMI und dem Choleratcxin vollständig reversibel ist. Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Cuatrecasas ist es also möglich, das Choleratoxin unter verhältnismäßig milden Elutionsbedingungen rückzugewinnen. Dies ist theoretisch nicht erklärbar und stellt ein überraschendes Ergebnis dar.
Zur Elution des an dem erfindungsgemäßen Material fixierten Choleratoxins kann man einen sauren Puffer verwenden, z. B. einen sauren Citratpuffer, eine stark konzentrierte Lösung von Harnstoff, Guanidin, Jodid (z. B. Natriumiodid), Thiocyanat (z. B. Kaliumthiocyanat) oder jedem anderen chaotropen oder denaturierenden Mittel.
Bezüglich der Stabilität der aufgepfropften Liganden wurde erfindungsgemäß ebenfalls ein wesentlicher Fortschritt erzielt Es ist tatsächlich möglich, regelmäßig die Träger mit Lösungen, wie 0,1 η HO oder 0,1η
NaOH zu waschen, d. h. mit einem pH von 1 bis 13, ohne daß die Qualitäten der biospezifischen Affinität darunter leiden. Solche Stabilitäten gibt es bei den bekannten Trägern beispielsweise auf der Basis von Agarose nicht, die nicht auf extreme pH-Werte gebracht werden dürfen.
Schließlich haben auf mechanischem Gebiet mögliche Durchsätze von 200 bis 400 ml/cmVh und das Fehlen einer Verdichtung des Trägers die Bedeutung dieser neuen Methoden für die beabsichtigte industrielle Entwicklung bestätigt.
B. Andere Anwendungen
Mit dem erfindungsgemäßen Material mit Lysin als Aminomolekül kann die Lysin-Plasminogen-Affinität zur Isolierung und Reinigung des Piasminogens des Blutes vorteilhaft genutzt werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Material mit meta-Aminophenylboronsäure als Aminomolekül ist es möglich, Zucker und Makromoleküle, die Zucker mit cis-ff-Glykol-Funktion tragen (Glykoproteine, Nukleinsäuren und Lipopolysaccharide) reversibel zu fixieren.
Ebenso kann man unter Verwendung von Bakterienantigenen als Aminomolekül die entsprechenden Antikörper reversibel fixieren; unter Verwendung von y-Globulinen als Aminomolekül kann man die entsprechenden Antigene reversibel fixieren; unter Verwendung von Bakterientoxinen als Aminomolekül kann man insbesondere die entsprechenden Antikörper fixieren usw.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1
Pfropfung des Lysogangliosids GMi auf einen mineralischen, porösen mit Diäthylaminoäthyldextran imprägnierten und dann vernetzten Träger.
Der Träger auf der Basis von DEAE-Dextran wird gemäß der DE-OS 26 33 246, Beispiel 1 hergestellt. Hierzu werden 10 g hochdisperse Kieselsäure (Oberfläche 50m2/g) vgl. FR-PSen 14 73 239, 14 73 240, 14 75 922 und 14 82 867 werden zu 30 ml DEAE-Dextran, 7,5%, bei pH 11,5 gegeben. Das Ganze wird eine Nacht bei 80° C getrocknet, dann mit 30 ml einer Lösung von Butandioldiglycidyläther, 1,5% in Äthyläther, versetzt. Der Äther wird in einem Luftstrom verdampft, dann wird das Ganze zur Vernetzung des DEAE-Dextrans 15 h auf 80° C gebracht.
Die Lösung der Ganglioside wird durch lonenaustauschchromatographie an porösem Siliciumdioxid, imprägniert mit DEAE-Dextran nach der in Beispiel 8 der DE-AS 26 33 246 bschriebenen Methode, hergestellt.
Die so erhaltene rohe Gangliosid-Lösung enthält ungefähr 40% Gangliosid GM1, das für die Erfindung brauchbar ist.
Die beiden N-Acetyl-Funktionen und die N-Acyl-Funktion des Gangliosids GMi werden dann zu NH2-Aminofunktionen durch alkalische Hydrolyse nach der zuvor von Holmgren, Mansson und Svennerholm »Medical Biology« (1974), 52,229-233, beschriebenen Arbeitsweise hydrolysiert. Das so erhaltene Produkt wird Lysogangliosid genannt, es besitzt drei NH2-Funktionen pro Molekül. Nach dem Lyophilisieren wird das erhaltene Pulver in einem 0,01m Carbonatpuffer vom pH 9 mit 20 g/l NaO zu einer Konzentration von 1 mg/ ml gelöst Ein ml dieser Lösung enthält etwa 370 μg Sialinsäure pro ml.
Perjodat-Oxidation des Trägers
10 g hochdisperse Kieselsäure (Oberfläche 50 m2/g) mit DEAE-Dextran imprägniert und dann vernetzt, werden mit 100 ml einer wäßrigen, 0,02m Natriumperjodatlösung versetzt (pH bei 4,5). Die Oxidationszeit beträgt 2 h bei Raumtemperatur.
Der Träger wird dann in einer 0,01m Natriumcarbonatlösung vom pH 9, mit 20 g/l Natriumchlorid versetzt und gewaschen. Die höhere Ionenstärke dieses Puffers soll die kationischen Gruppierungen des vernetzten und oxidierten DEAE-Dextrans durch CP-Ionen sättigen und sie daran hindern, das Lysogangliosid durch elektrostatische Kräfte schließlich zu fixieren, was die Gefahr heraufbeschwören würde, die Reaktion der Aminogruppen mit den Aldehyd-Funktionen des Trägers zu hindern.
In diesem Stadium treten die Aldehyd-Funktionen des oxidierten Trägers leicht hervor. In Gegenwart eines Schiffschen Reagenz entwickelt sich eine intensive violett-rosa Verfärbung.
Pfropfung des Lysogangliosids
Der obige Träger wird gewaschen, dann mit 50 ml der Lösung des Lysogangliosids GMi versetzt. Nach einer Kontaktzeit von 2 h wird die überstehende Flüssigkeit dekantiert. Durch eine Dosierung von Sialinsäure kann man leicht zeigen, daß praktisch das gesamte Lysogangliosid gekuppelt worden ist (95 bis 100%).
Der Träger wird mit Carbonatpuffer vom pH 9 gespült. In diesem Stadium ist leicht zu zeigen, daß die Färbung des Trägers mit dem Schiff-Reagenz viel schwächer ist als in der vorhergehenden Stufe, was eine gute Fixierung des Lysogangliosids an die Aldehyd-Funktionen des oxidierten Trägers anzeigt.
Reduktion mit Natriumborhydrid
50 ml einer 0,2m NaBHpLösung in Wasser (pH 9) werden zu dem obigen Träger gegeben. Nach einer Kontaktzeit von 2 h bei Raumtemperatur wird der Träger mit Wasser gespült und dann in eine Säule gebracht. Nach Gleichgewichtseinstellung in dem gewählten Chromatographie-Puffer (0,01m Phosphatpuffer vom pH 7,2 mit einem Gehalt von 20 g/l NaCl) ist die Säule mit biospezifischer Affinität zur Verwendung bereit.
In diesem Stadium ist keine Spur von Aldehydfunktion mehr durch Verfärbung mit dem SchifPschen Reagenz festzustellen. Die Aldehyd-Funktionen, die mit dem Lysogangliosid nicht reagiert haben, werden ihrerseits in primäre Alkoholfunktionen überführt.
Der so erhaltene Träger wirkt vollkommen als Ionenaustauscher. Will man die ionischen Wechselwirkungen mit den Proteinen unterdrücken, um nur die biospezifischen Wechselwirkungen beizubehalten, muß also eine Mindestionenstärke vorliegen. In der Praxis reicht eine Mindestkonzentration von 10 g/l NaCl zur Unterdrückung des Ionenaustauscheffekts.
Nach der gleichen Technik kann man ebenso wirksam Lysin, Phenylalanin, Phenylhydrazin, meta-Aminophenylboronsäure aufpfropfen. Man stellt fest, daß man auch jedes Molekül, das NH2-Funktionen trägt, pfropfen kann, z. B. ein Enzymsubstrat oder -inhibitor, einen Hormon-, Protein-, Virus- oder Bakterienrezeptor, ein Antigen oder ein Antikörper, und daB man jeden dieser Träger bsi der biospezifischen Affinitätschromatographie einsetzen kann.
Beispiel 2
Pfropfung von Lysogangliosid GM! auf
einen mit Cellulose imprägnierten
mineralischen, porösen Träger
Imprägnierung mit Cellulose
10 g hochdisperse Kieselsäure (Oberfläche 10 m2/g) vgl. FR-PSen 14 73 238, 14 73 240, 14 75 922 und 14 82 867 (oder irgendeines anderen mineralischen, porösen Trägers) werden mit 30 ml einer 3%igen Celluloseacetat/Acetonlösung versetzt (Cellulosepropionat oder andere in einem organischen Lösungsmittel lösliche und hydroldysierbare Äther können auch geeignet sein, vorausgesetzt, sie liefern wieder bei alkalischer Hydrolyse die Ausgangscellulose).
Das Ganze wird unter einem warmen Luftstrom getrocknet. Das Pulver kann dann, wenn nötig, gesiebt und in eine Säule gebracht werden.
Dann wird mit 101 einer 0,1η wäßrigen NaOH-Lösung bei einem Durchsatz von 500 ml/h eine Nacht lang kontinuierlich gewaschen. Nach dieser alkalischen Hydrolyse kann die Säule mit Aceton oder mit Wasser, je nach pH, gewaschen werden, die so regenerierte Cellulose ist nicht mehr löslich und bleibt vollständig in den Poren des mineralischen, porösen Trägers, die sie um so besser auskleidet, je leichter das Ausgangspolymere insgesamt zur internen Oberfläche Zutritt hatte. Aus diesem Grunde ist die Verwendung von Celluloseestern mit möglichst geringem Molekulargewicht ratsam. Analog Beispiel 1 erfolgt dann die Herstellung der Lösung Lysogangliosids Gm 1 mit Aminofunktionen,
die Perjodatoxidation des Trägers,
die Pfropfung des Lysogangliosids, und
die Reduktion mit Natriumborhydrid, NaBH4.
35
Im Unterschied zu dem in Beispiel 1 hergestellten Träger besitzt dieser keine Ionenaustauscheigenschaften und kann also gegenbenenfalls für geringere Ionenkräfte eingesetzt werden, in Fällen, in denen dies von Vorteil ist. Für die Affinität zwischen dem Lysogangliosid und dem Choleratoxin ist dies gleichgültig.
Nach der gleichen Technik kann man Ionenaustauschfunktionen insbesondere mit 3-Diäthylaminopropylamin oder Ν,Ν-Diäthyläthylendiamin aufpfropfen und die so erhaltenen Träger bei der Chromatographie von Proteinen einsetzen.
Nach der gleichen Technik kann man verschiedene Liganden mit Aminofunktionen aufpfropfen, also Lysin, Phenylalanin, Phenylhydrazin, meta-Aminophenylboronsäure, und die so erhaltenen Träger bei der biospezifischen Aflinitätschromatographie einsetzen.
Ebenso kann man jedes Molekül mit Aminofunk- tion(en) aufpfropfen, z. B. ein Enzymsubstrat oder - inhibitor, einen Hormon-, Protein-, Virus- oder Bakte rienrezeptor, ein Antigen oder einen Antikörper, und jeden dieser Träger bei der biospezifischen Affinitätschromatographie verwenden.
60 Beispiel 3
Verwendung bei Isolieren und Reinigen des Choleratoxins
Die in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Säulen sind bei der biospezifischen Aflinitätschromatographie anwendbar. Die Gegenwart von 10 bis 20 g/l NaQ in dem Chromatographiepuffer wird empfohlen, um jede nicht-spezifische Wechselwirkung ionischer Art mit den elektrischen Ladungen der Ionenaustauschfunktionen der Liganden oder der auf dem Träger vorhandenen Proteine zu beseitigen.
Durch Hindurchführen eines mit 10 g/l NaCl versetzten Filtrats einer Kultur von Choleravibrionen durch jede dieser Säulen ist leicht festzustellen, daß das Choleragen und das Choleragenoid sich an den Träger hängen. Um unter der maximalen Fixierkapazität der Säule zu bleiben, wird das am Auslauf der Säule aufgefangene Filtrat vollständig von toxischer, nach bekannten Tests meßbarer Aktivität befreit.
Nach dem Waschen mit dem Chromatographiepuffer zum Eliminieren nicht-fixierter Proteine kann man das fixierte Choleragen und Choleragenoid durch Elution mit dem 0,05m Citrat/Zitronensäure-Puffer vom pH 2,8 rückgewinnen. Die dabei eingetretene Denaturierung ist offenbar vernachläßigbar, da die erhaltenen Ausbeuten zwischen 50 und 100% liegen, gemessen nach den klassischen Tests der Dosierung des Choleratoxins.
Die Reinheit des Präparats kann chromatographisch an Sephadex G-200 (das Choleragen liefert einen Peak entsprechend einem Molekulargewicht von 84 000, das Choleragenoid liefert einen Peak entsprechend einem Molekulargewicht von 56 000) oder nach immunochemischen Methoden mit Kontrollantiseren ermittelt werden (ein Antikulturfiltrat-Antiserum ohne Anticholeratoxin-Antikörper darf keine Fällungslinie mit diesen gereinigten Präparaten geben).
Eine Säule mit 10 g, hergestellt nach einer der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Methoden, ermöglicht die Behandlung von Kulturfiltratmengen von 500 ml bis 10 1, wobei die genaue Menge offenbar von mehreren Parametern abhängt, d. h. der Menge des in dem Kulturfiltrat vorhandenen Toxins und der Menge an GMi in der rohen Gangliosid-Lösung.
Die möglichen Anwendungen sind folgende:
Herstellung einer Lösung gereinigten Choleragens und Choleragenoids zur Herstellung eines Vaccins, Befreien eines Choleravibrionen-Kulturfiltrats von jeder Spur Choleragen und Choleragenoid,
Herstellen von Antisera gegen diese beiden Arten von Lösungen.
Beispiel 4
Trennung der Bestandteile eines Gemisches»
von y-Globulinen, Albumin und Choleratoxinen
in einer einzigen Chromatographie.
Dieses Beispiel soll die Möglichkeiten der gleichzeitigen Verwendung des im Beispiel 1 beschriebenen Materials zugleich bei der Ionenaustauschchromatographie und der Affinitätschromatographie zeigen. Im Gegensatz zum Beispiel 3 gibt man kehl Natriumchlorid in das Chromatographielösungsmittel, das ein künstliches Gemisch von drei Proteinen enthält: y-Globuline, Albumin und Choleratoxin. Die y-Globu- line, die einen elektropositiven Charakter zeigen, werden an der Schicht modifizierten DEAE-Dextrans nicht absorbiert, während das Albumin, das einen elektronegativen Charakter zeigt, an dieser Schicht fixiert wird. Das Choleratoxin wird an den Stellen mit Lysogangliosid Gmi fixiert. Verwendet man einen Chromatographie-Puffer mit geringer Ionenstärke (0,01m Phosphatpuffer vom pH 6,8), findet man die y-Globuline am Säulenauslauf in Form nicht-absorbierten Peaks wieder. Durch anschließende Elution mit einem 10 g/l
atriumchlorid enthaltenden PufTer wird das Albumin
jrdrängt und eluiert. Die endgültige Elution mit einem
itratpuffer vom pH 2,8 ermöglicht dann die Elution
es Choleratoxins.
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Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines festen porösen Materials für chromatcgraphische Zwecke, bei dem man einen porösen, mineralischen Träger mit einem Polysaccharid überzieht, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polysaccharid ein solches verwendet, das mit Periodsäure oder einem ihrer Derivate oxidativ spaltet, daß man den Polysaccharidüberzug einer Perjodat-Oxidation unterwirft, daß man das so erhaltene Oxidationsprodukt mit. einem primären Amin reagieren läßt und dann das erhaltene Iminoderivat der Einwirkung eines Reduktionsmittels, das die Iminobindung zu einer Amino- ι s bindung zu reduzieren vermag, unterwirft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reduktion mit einem Hydrid durchführt.
3. Verwendung des gemäß einem der Ansprüche 1 und 2 hergestellten Materials in einer chromatographischen Säule zur Isolierung oder Reinigung von biologischen Makromolekülen.
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