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DE60130737T2 - Verstaerkte produktion von lipiden enthaltend mehrfachungesaettigte fettsaeuren durch hochdichte kulturen von eukariotischen mikroben in gaervorrichtungen - Google Patents

Verstaerkte produktion von lipiden enthaltend mehrfachungesaettigte fettsaeuren durch hochdichte kulturen von eukariotischen mikroben in gaervorrichtungen Download PDF

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DE60130737T2
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Germany
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microorganisms
lipids
fermentation
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dissolved oxygen
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DE60130737T
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DE60130737T3 (de
DE60130737T8 (de
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Craig M. San Diego RUECKER
Don San Diego DIMASI
Jon M. Chula Vista HANSEN
Peter J. San Diego MIRRASOUL
Richard B. Del Mar BAILEY
George T. Ramona WEEDER
Tatsuo San Diego KANEKO
William R. Boulder BARCLAY
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Martek Biosciences Corp
Original Assignee
Martek Biosciences Corp
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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zum Ziehen von Mikroorganismen und Gewinnen von mikrobiellen Lipiden. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Herstellung mikrobieller mehrfach ungesättigter Lipide.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es wurde allgemein angenommen, dass eine Herstellung von Polyenfettsäuren (Fettsäuren, die zwei oder mehrere ungesättigte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen enthalten) in eukaryontischen Mikroorganismen die Anwesenheit von molekularem Sauerstoff (d. h. aerobe Bedingungen) erfordert. Dies liegt daran, dass angenommen wird, dass die Doppelbindung in cis-Stellung, das in den Fettsäuren aller nicht-parasitischer eukaryontischer Mikroorganismen gebildet wird, eine unmittelbar sauerstoffabhängige Desaturierungsreaktion umfasst (oxidatives mikrobielles Desaturasesystem). Andere eukaryontische mikrobielle Lipide, von denen bekannt ist, dass sie molekularen Sauerstoff erfordern, umfassen Pilz- und Pflanzensterole, Oxycarotinoide (d. h. Xanthophylle), Ubiquinone und Verbindungen, die aus irgendeinem dieser Lipide hergestellt werden (d. h. sekundäre Metabolite).
  • Von bestimmten eukaryontischen Mikroben (wie Algen, Pilzen, einschließlich Hefe und Einzellern) wurde gezeigt, dass sie gute Produzenten von Polyenfettsäuren in Fermentern sind. Eine Kultivierung bei sehr hoher Dichte (größer als ungefähr 100 g/l mikrobielle Biomasse, insbesondere in kommerziellem Maßstab) kann jedoch zu verringerten Polyenfettsäuregehalten führen und damit zu einer verringerten Polyenfettsäureproduktivität. Dies kann teilweise auf mehreren Faktoren beruhen, einschließlich der Schwierigkeit, hohe Mengen an gelöstem Sauerstoff aufrecht zu erhalten, aufgrund der hohen Sauerstoffnachfrage, die sich aus der hohen Konzentration an Mikroben in der Fermentationsbrühe entwickelt. Verfahren zum Aufrechterhalten eines höheren Gehalts an gelöstem Sauerstoff umfassen das Steigern der Belüftungsrate und/oder Verwenden von reinem Sauerstoff anstelle von Luft für die Belüftung und/oder Steigern der Umwälzgeschwindigkeit in dem Fermenter. Diese Lösungen erhöhen im Allgemeinen die Kosten der Lipidherstellung und die Investitionskosten der Fermentationsausrüstung und können zusätzliche Probleme verursachen. Z. B. kann eine gesteigerte Belüftung leicht zu ernsthaften Problemen durch Aufschäumen in den Fermentern bei hohen Zelldichten führen und verstärktes Rühren kann zum Aufbruch von mikrobiellen Zellen aufgrund erhöhter Scherkräfte in der Fermentationsbrühe führen (dadurch werden die Lipide in die Fermentationsbrühe ausgeschüttet, worin sie oxidiert und/oder durch Enzyme abgebaut werden können). Ein Aufbrechen mikrobieller Zellen ist ein vermehrtes Problem bei Zellen, die einer Limitierung oder Verarmung an Stickstoff unterzogen wurden, um die Lipidbildung zu induzieren, was zu dünneren Zellwänden führt.
  • Werden lipidherstellende eukaryontische Mikroben bei sehr hohen Zellkonzentrationen gezogen, folgt daraus, dass ihre Lipide im Allgemeinen nur sehr geringe Mengen an Polyenfett sauren enthalten. Z. B. wurde die Hefe Lipomyces starkeyi auf eine Dichte von 153 g/l gezogen, woraus sich eine Lipidkonzentration von 83 g/l in 140 Stunden unter Verwendung von Alkohol als eine Kohlenstoffquelle ergab. Dennoch war der Gehalt an Polyenfettsäure der Hefe bei einer Konzentration von mehr als 100 g/l durchschnittlich nur 4,2% der gesamten Fettsäuren (wobei er von einem Höchststand von 11,5% der gesamten Fettsäure bei einer Zelldichte von 20 bis 30 g/l abfällt). Yamauchi et al., J. Ferment. Technol., 1983, 61, 275–280. Dies führt zu einer Polyenfettsäurekonzentration von nur ungefähr 3,5 g/l und einer durchschnittlichen Polyenfettsäureproduktivität von nur ungefähr 0,025 g/l/h. Zusätzlich war die einzige Polyenfettsäure, die in den Hefelipiden festgestellt wurde, C18:2.
  • Von einer anderen Hefe, Rhodotorula glutinus, wurde eine durchschnittliche Lipidproduktivität von ungefähr 0,49 g/l/h aber auch ein niedriger Gesamtpolyenfettsäuregehalt in ihren Lipiden gezeigt (15,8% der Gesamtfettsäuren, 14,7% C18:2 und 1,2% C18:3), was zu einer Polyenfettsäureproduktivität im Zulaufverfahren von nur ungefähr 0,047 g/l/h und 0,077 g/l/h in kontinuierlicher Kultur führte.
  • Einer der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat vorher gezeigt, dass bestimmte marine Mikroalgen der Ordnung Thraustochytriales ausgezeichnete Produzenten von Polyenfettsäuren in Fermentern sein können, insbesondere wenn sie bei geringen Salzmengen und insbesondere bei sehr geringen Chloridmengen gezogen werden. Andere haben Thraustochytride beschrieben, die eine durchschnittliche Polyenfettsäureproduktivität (DHA, C22:6n-3 und DPA, C22:5n-6) von ungefähr 0,158 g/l/h aufweisen, wenn sie bis zu einer Zelldichte von 59 g/l in 120 Stunden gezogen werden. Diese Produktivität wurde jedoch nur bei einem Salzgehalt von ungefähr 50% Meerwasser erreicht, eine Konzentration, die eine beträchtliche Korrosion in herkömmlichen Edelstahlfermentern verursachen würde.
  • Die Kosten zur Herstellung von mikrobiellen Lipiden, die Polyenfettsäuren und insbesondere die hochungesättigten Fettsäuren enthalten, wie C18:4n-3, C20:4n-6, C20:5n3, C22:5n-3, C22:5n-6 und C22:6n-3, blieben hoch, teilweise aufgrund der begrenzten Dichten, auf welche die mehrfach stark ungesättigten Fettsäuren enthaltenden eukaryontischen Mikroben gezogen wurden und die limitierte Verfügbarkeit von Sauerstoff sowohl bei diesen hohen Zellkonzentrationen als auch den höheren Temperaturen, die zum Erzielen einer hohen Produktivität benötigt wurden.
  • Daher besteht ein Bedarf für ein Verfahren zum Ziehen von Mikroorganismen bei hohen Konzentrationen, welches dennoch eine gesteigerte Herstellung von Lipiden, die Polyenfettsäuren enthalten, vereinfacht.
  • WO-A-92/13086 offenbart ein Verfahren für die Herstellung eines Arachidonsäure enthaltenden Öls, welches im Wesentlichen frei von Eicosapentansäure ist, welches folgendes umfasst: Kultivieren einer Spezies von Pythium, welche ein Ararchidonöl, welches im Wesentlichen frei von Eicosapentansäure ist, unter geeigneten Kultivierungsbedingungen für die Ölherstellung her stellt; Ernten des Pythium; Extrahieren des Öls von dem geernteten Pythium und Gewinnen des Öls.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen Lipiden zur Verfügung gestellt, welches folgendes umfasst:
    • (a) Zugeben einer Kohlenstoffquelle und einer limitierenden Nährstoffquelle zu einem Fermentationsmedium, welches Mikroorganismen umfasst, und Bereitstellen von Bedingungen, die geeignet sind, einen Gehalt an gelöstem Sauerstoff von wenigstens ungefähr 4% der Sättigung in dem Fermentationsmedium aufrecht zu erhalten, zum Erzeugen einer Biomassendichte von wenigstens ungefähr 100 g/l,
    • (b) anschließendes Bereitstellen von Bedingungen, die geeignet sind, einen Gehalt an gelöstem Sauerstoff von ungefähr 1% oder weniger der Sättigung in dem Fermentationsmedium aufrecht zu erhalten und Bereitstellen von Bedingungen, die geeignet sind, es den Mikroorganismen zu ermöglichen, die Lipide zu produzieren, und
    • (c) Gewinnen der mikrobiellen Lipide,
    wobei wenigstens ungefähr 15% der mikrobiellen Lipide mehrfach ungesättigte Lipide sind.
  • Gemäß einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Anreichern des Polyenfettsäuregehalts eines Mikroorganismus zur Verfügung gestellt, bei dem man den Mikroorganismus in einem Wachstumsmedium mit einem Gehalt an gelöstem Sauerstoff von weniger als 1% der Sättigung fermentiert.
  • Gemäß eines weiteren Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung wird ein heterotrophes Verfahren zum Herstellen von Produkten und Mikroorganismen zur Verfügung gestellt, bei dem man die Mikroorganismen in einem Wachstumsmedium züchtet, das einen Gehalt an gelöstem Sauerstoff von weniger als ungefähr 1% der Sättigung aufweist, wobei die Mikroorganismen Polyketidsynthasegene enthalten.
  • Weiterhin wird ein Verfahren zum Züchten von eukaryontischen Mikroorganismen offenbart, die in der Lage sind, wenigstens ungefähr 20% ihrer Biomasse als Lipide herzustellen und ein Verfahren zum Herstellen der Lipide. Bevorzugt enthalten die Lipide eine oder mehrere Polyenfettsäuren. Ausführungsformen der Erfindung umfassen folgendes: Zugeben einer Kohlenstoffquelle bevorzugt einer nicht alkoholischen Kohlenstoffquelle, und einer limitierenden Nährstoffquelle zu einem Fermentationsmedium, welches eukaryontische Mikroorganismen umfasst. Bevorzugt wird die Kohlenstoffquelle und die limitierende Nährstoffquelle mit einer Geschwindigkeit zugegeben, die geeignet ist, die Biomassendichte des Fermentationsmediums auf wenigstens ungefähr 100 g/l zu steigern.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Fermentationsbedingungen ein die Biomassendichte erhöhendes Stadium und ein Stadium für die Lipidherstellung, wobei das die Biomassendichte erhöhende Stadium folgendes umfasst: Zugeben der Kohlenstoffquelle und der limitierenden Nährstoffquelle, und das Stadium der Lipidherstellung folgendes umfasst: Zugeben des Kohlenstoffs ohne Zugabe der limitierenden Nährstoffquelle, zum Erzeugen von Bedingungen, die die Lipidherstellung auslösen.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Menge an gelöstem Sauerstoff, die in dem Fermentationsmedium während des Stadiums der Lipidherstellung vorhanden ist, geringer als die Menge an gelöstem Sauerstoff, die in dem Fermentationsmedium während des die Biomassendichte erhöhenden Stadiums vorhanden ist.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Algen, Pilzen (einschließlich Hefen), Einzellern, Bakterien und Mischungen davon, wobei die Mikroorganismen in der Lage sind, Polyenfettsäuren oder andere Lipide herzustellen, von denen im Allgemeinen angenommen wurde, dass molekularer Sauerstoff für ihre Synthese benötigt wird. Besonders geeignete Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung sind eukaryontische Mikroorganismen, die in der Lage sind, Lipide bei einem Sauerstoffgehalt im Fermentationsmedium von ungefähr weniger als 3% der Sättigung herzustellen.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Organismen in einem Zulaufverfahren gezogen.
  • Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt das Aufrechterhalten eines Sauerstoffgehalts von weniger als ungefähr 3% der Sättigung in dem Fermentationsmedium während der zweiten Hälfte des Fermentationsverfahrens zur Verfügung.
  • Weiterhin wird ein Verfahren zum Herstellen von eukaryontischen mikrobiellen Lipiden offenbart, welches folgendes umfasst:
    • (a) Ziehen eines eukaryontischen Mikroorganismus in einem Fermentationsmedium zur Erhöhung der Biomassendichte des Fermentationsmediums auf wenigstens ungefähr 100 g/l,
    • (b) Bereitstellen von Fermentationsbedingungen, die geeignet sind, den Mikroorganismen die Herstellung der Lipide zu ermöglichen, und
    • (c) Gewinnen der Lipide,
    wobei mehr als ungefähr 15% der Lipide mehrfach ungesättigte Lipide sind.
  • Ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Gewinnen von Lipiden zur Verfügung, welches folgendes umfasst:
    • (d) Entfernen von Wasser aus dem Fermentationsmedium, um trockene Mikroorganismen bereitzustellen, und
    • (e) Isolieren der Lipide aus den trockenen Mikroorganismen.
  • Bevorzugt umfasst die Stufe der Wasserentfernung das direkte Inkontaktbringen des Fermentationsmediums auf einem Walzentrockner ohne vorherige Zentrifugation.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Gewinnen von Lipiden zur Verfügung, welches folgendes umfasst:
    • (d) Behandeln der Fermentationsbrühe, um die mikrobiellen Zellen permeabel zu machen, zu lysieren oder zu zerreißen, und
    • (e) Gewinnen der Lipide aus der Fermentationsbrühe durch Schwerkrafttrennung und bevorzugt Zentrifugation, mit oder ohne die Hilfe eines wasserlöslichen Lösungsmittels, um die Durchbrechung der Lipid-/Wasser-Emulsion zu unterstützen.
  • Bevorzugt werden die mikrobiellen Zellen in Stufe (c) in einem Fermenter oder einem ähnlichen Gefäß behandelt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 ist eine Tabelle und eine graphische Darstellung von zahlreichen Parametern der Lipidherstellung eines Mikroorganismus im Vergleich zu der Menge an gelöstem Sauerstoff in einem Fermentationsmedium.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Ziehen von Mikroorganismen zur Verfügung, wie z. B. für Algen, Pilze (einschließlich Hefe), Einzellern und Bakterien. Bevorzugt werden die Mikroorganismen aus der Gruppe ausgewählt bestehend aus Algen, Einzellern und Mischungen daraus. Mehr bevorzugt sind die Mikroorganismen Algen. Überdies kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Vielzahl von Lipidverbindungen verwendet werden, insbesondere ungesättigte Lipide, bevorzugt mehrfach ungesättigte Lipide (d. h. Lipide, die wenigstens zwei ungesättigte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen enthalten, z. B. Doppelbindungen), und mehr bevorzugt hochungesättigte Lipide (d. h. Lipide, die vier oder mehr ungesättigte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen enthalten), wie Omega-3- und/oder Omega-6-mehrfach ungesättigte Fettsäuren, einschließlich Docosahexaensäure (d. h. DHA) und andere natürlich auftretende ungesättigte, mehrfach ungesättigte und hochungesättigte Verbindungen. Der Begriff „Lipid", wie er hier verwendet wird, umfasst Phospholipide, freie Fettsäuren, Fettsäureester, Triacylglycerine, Sterole und Sterolester, Carotinoide, Xanthophylle (z. B. Oxycarotinoide), Kohlenwasserstoffe, von Isoprenoid abgeleitete Verbindungen und andere Lipide, die einem Fachmann in dem Bereich bekannt sind.
  • Insbesondere sind Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet bei der Herstellung von eukaryontischen mikrobiellen Polyenfettsäuren, Carotinoiden, Pilz-Sterolen, Phytosterolen, Xanthophyllen, Ubiquinonen und anderen von Isoprenoid abgeleiteten Verbindungen, von denen allgemein angenommen wurde, dass zur Herstellung der ungesättigten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verbindungen Sauerstoff erforderlich ist (d. h. aerobe Bedingungen), und sekundäre Metabolite davon. Verfahren der vorliegenden Erfindung sind besonders geeignet beim Ziehen von Mikroor ganismen zur Herstellung von Polyenfettsäure(n) und zur Herstellung von mikrobieller/mikrobiellen Polyenfettsäure(n).
  • Während Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Ziehen einer großen Vielfalt an Mikroorganismen und zum Erhalten von mehrfach ungesättigtem Lipid enthaltenden Verbindungen, die von diesen erzeugt werden, verwendet werden können, wird die ausführliche Beschreibung der Erfindung, der Kürze, Einfachheit und Veranschaulichung willen, Verfahren zum Ziehen von Mikroorganismen, die in der Lage sind, Omega-3- und/oder Omega-6-mehrfach ungesättigte Fettsäuren umfassende Lipide zu produzieren, erörtern, insbesondere Mikroorganismen, die in der Lage sind, DHA herzustellen (oder eng verwandte Verbindungen, wie DPA, EPA oder ARA). Bevorzugte Mikroorganismen umfassen Mikroalgen, Pilze (einschließlich Hefe), Einzeller und Bakterien. Eine Gruppe bevorzugter Mikroorganismen sind die Mitglieder der mikrobiellen Gruppe mit dem Namen Stramenopiles, die Mikroalgen und algenähnliche Mikroorganismen umfasst. Die Stramenopiles umfassen die folgenden Gruppen an Mikroorganismen: Hamatores, Proteromonade, Opalines, Developayella, Diplophrys, Labrinthuliden, Thraustochytriden, Bioseciden, Oomyceten, Hypochytridiomyceten, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, Diatomeen, Xanthophytes, Phaeophytes (Braunalgen), Eustigmatophytes, Raphidophytes, Synuriden, Axodines (einschließlich Rhizochromulinaales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales und Chromulinales. Andere bevorzugte Gruppen an Mikroalgen umfassen die Mitglieder der Grünalgen und Dinoflagellaten, einschließlich Mitglieder der Gattung Crypthecodium. Insbesondere werden bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in Bezug auf ein Verfahren zum Ziehen von marinen Organismen erörtert werden, insbesondere Algen, wie Thraustochytride der Ordnung Thraustochytriales, mehr spezifisch Thraustochytriales der Gattung Thraustochytrium und Schizochytrium, einschließlich Thraustochytriales, die in den gemeinschaftlich übertragenen Patentanmeldungen US Nr. 5,340,594 und 5,340,742, beide ausgestellt für Barclay, offenbart sind. Es sollte angemerkt werden, dass viele Experten einig darüber sind, dass Ulkenia nicht eine separate Gattung ist, sondern tatsächlich ein Teil der Gattung Schizochytrium. Die Gattung Schizochytrium, wie sie hier verwendet wird, Ulkenia umfassen.
  • Bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die interessierende Verbindungen über das Polyketidsynthasesystem herstellen. Solche Mikroorganismen umfassen Mikroorganismen, die ein endogenes Polyketidsynthasesystem haben, und Mikroorganismen, in die ein Polyketidsynthasesystem durch genetische Manipulation eingebracht wurde. Polyketide sind strukturell unterschiedliche Naturstoffe, die einen weiten Bereich an biologischen Aktivitäten haben, einschließlich antibiotischen und pharmakologischen Eigenschaften. Die Biosynthese des Kohlenstoffkettenrückgrates von Polyketiden wird durch die Polyketidsynthasen katalysiert. Wie die strukturell und mechanistisch verwandten Fettsäuresynthasen katalysiert die Polyketidsynthasen die wiederholte decarboxylierende Kondensationen zwischen Acylthioestern, die die Kohlenstoff kette jeweils um zwei Kohlenstoffe verlängern. Jedoch im Gegensatz zu Fettsäuresynthasen können Polyketidsynthasen eine große strukturelle Variabilität des Endproduktes erzeugen. Einzelne Polyketidsynthasesysteme können dies durch die Verwendung von anderen Anfangseinheiten als Acetat, durch Verwendung von Methyl- oder Ethylmalonat als die verlängernde Einheit und durch Verändern des reduktiven Zyklus der Ketoreduktion, Dehydratisierung und Enoylreduktion der Beta-Ketogruppe, die nach jeder Kondensation gebildet wird, bewerkstelligen. Von besonderem Interesse ist hierbei, dass die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen, die bei der Dehydratisierungsstufe eingeführt werden, in dem Endprodukt erhalten bleiben können. Obwohl diese Doppelbindungen ursprünglich in der trans-Konfiguration sind, können sie weiterhin in die cis-Konfiguration, die in DHA (und anderen interessierenden Polyenfettsäuren) gefunden werden, durch enzymatische Isomerisierung umgewandelt werden. Sowohl die Dehydrase- als auch die Isomerisierungsreaktion können in der Abwesenheit von molekularem Sauerstoff wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein heterotrophes Verfahren zur Verfügung gestellt zur Herstellung von Produkten und Miroorganismen. Das Verfahren umfasst bevorzugt das Kultivieren der Mikroorganismen in einem Wachstumsmedium, wobei die Mikroorganismen ein Polyketidsynthasesystem enthalten. Der Gehalt an gelöstem Sauerstoff wird bei weniger als ungefähr einem Prozent aufrechterhalten.
  • Wenn man eine verhältnismäßig konstante Herstellungsgeschwindigkeit an Lipiden durch eine Alge unterstellt, wird es leicht ersichtlich, dass die höhere Biomassendichte zu einer höheren Gesamtmenge an hergestellten Lipiden pro Volumen führt. Derzeitige herkömmliche Fermentationsverfahren zum Ziehen von Algen ergeben eine Biomassendichten von ungefähr 50 bis ungefähr 80 g/l oder weniger. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass bei Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung eine signifikant höhere Biomassendichte als eine jetzt bekannte Biomassendichte erreicht werden kann. Bevorzugt erzeugen Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Biomassendichte von wenigstens ungefähr 100 g/l, mehr bevorzugt wenigstens ungefähr 130 g/l, noch mehr bevorzugt wenigstens ungefähr 150 g/l, noch immer mehr bevorzugt wenigstens ungefähr 170 g/l und am meisten bevorzugt mehr als 200 g/l. Daher ist mit einer solchen hohen Biomassendichte selbst wenn die Herstellungsgeschwindigkeit der Lipide der Algen leicht verringert ist, die Gesamtherstellungsgeschwindigkeit der Lipide pro Volumen signifikant höher als jetzt bekannte Verfahren.
  • Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Ziehen von Mikroorganismen der Ordnung Thraustochytriales umfassen das Zugeben einer Kohlenstoffquelle und einer limitierenden Nährstoffquelle zu einem Fermentationsmedium, welches die Mikroorganismen umfasst, mit einer Geschwindigkeit, die geeignet ist, die Biomassendichte des Fermentationsmediums zu den oben beschriebenen zu erhöhen. Der Begriff „limitierende Nährstoffquelle" wie er hier verwendet wird bezieht sich auf eine Nährstoffquelle (einschließlich des Nährstoffes selbst), die essentiell für das Wachstum eines Mikroorganismus ist, wobei, wenn der limitierende Nährstoff aus dem Wach stumsmedium aufgebraucht ist, seine Abwesenheit die Mikroorganismen im Wachstum und in der weiteren Replikation beschränkt. Da jedoch die anderen Nährstoffe immer noch im Überfluss vorhanden sind, kann der Organismus fortfahren, intrazelluläre und/oder extrazelluläre Produkte zu erzeugen und anzureichern. Durch Auswählen des spezifischen limitierenden Nährstoffes kann man die Art der Produkte, die angereichert werden, kontrollieren. Daher ermöglicht das Bereitstellen einer limitierenden Nährstoffquelle mit einer bestimmten Geschwindigkeit sowohl die Wachstumsrate des Mikroorganismus als auch die Herstellung oder Anreicherung von gewünschten Produkten (z. B. Lipiden) zu kontrollieren. Dieses Fermentationsverfahren, bei dem ein oder mehrere Substrat(e) in Schritten zugegeben werden (z. B. eine Kohlenstoffquelle und eine limitierende Nährstoffquelle), wird im allgemeinen Zulaufverfahren genannt. Es wurde herausgefunden, dass wenn das Substrat zu einem diskontinuierlichen Fermentationsverfahren zugegeben wird, die große Menge an vorhandener Kohlenstoffquelle (z. B. ungefähr 200 g/l oder mehr pro 60 g/l Biomassendichte) einen nachteiligen Effekt auf die Mikroorganismen hatte. Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass solch eine hohe Menge an Kohlenstoffquelle nachteilige Auswirkungen für Mikroorganismen verursacht, einschließlich osmotischem Stress, und die anfängliche Produktivität des Mikroorganismus hemmt. Verfahren der vorliegenden Erfindung vermeiden diesen unerwünschten nachteiligen Effekt, während eine geeignete Menge des Substrates zum Erreichen der oben beschriebenen Biomassendichte der Mikroorganismen bereitgestellt wird.
  • Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Ziehen von Mikroorganismen können ein Stadium zur Vergrößerung der Biomassendichte umfassen. In dem die Biomassendichte vergrößernden Stadium ist das hauptsächliche Ziel des Fermentationsverfahrens die Vergrößerung der Biomassendichte in dem Fermentationsmedium, um die oben beschriebene Biomassendichte zu erhalten. Die Geschwindigkeit der Zugabe der Kohlenstoffquelle wird üblicherweise bei einem bestimmten Niveau oder Bereich aufrecht erhalten, der keinen signifikant nachteiligen Effekt auf die Produktivität der Mikroorganismen oder die Überlebensfähigkeit der Mikroorganismen verursacht, die aus unzureichenden Fähigkeiten der Fermentationsausrüstung, Hitze von der flüssigen Brühe zu entfernen und Gase zu und von der flüssigen Brühe zu überführen, folgt. Ein angemessener Bereich für die Menge an Kohlenstoffquelle, die für einen bestimmten Mikroorganismus während eines Fermentationsverfahrens benötigt wird, ist einem Fachmann in dem Bereich bekannt. Bevorzugt ist eine Kohlenstoffquelle der vorliegenden Erfindung eine nicht alkoholische Kohlenstoffquelle, d. h. eine Kohlenstoffquelle, die keinen Alkohol enthält. Ein „Alkohol", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Verbindung mit vier oder weniger Kohlenstoffatomen mit einer Hydroxylgruppe, z. B. Methanol, Ethanol und Isopropanol, umfasst aber für den Zweck dieser Erfindung nicht organische Hydroxysäuren, wie Milchsäure und ähnliche Verbindungen. Mehr bevorzugt ist eine Kohlenstoffquelle der vorliegenden Erfindung ein Kohlenhydrat, einschließlich aber nicht beschränkt auf Fructose, Glucose, Saccharose, Melasse und Stärke. Andere geeigne te einfache und komplexe Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen werden in den Patenten angegeben, auf die oben verwiesen wird. Üblicherweise wird ein Kohlenhydrat, bevorzugt Maissirup, jedoch als die primäre Kohlenstoffquelle verwendet. Fettsäuren in der Form von Hydroxyfettsäuren, Triglyceriden und Di- und Monoglyceriden können auch als die Kohlenstoffquelle dienen.
  • Besonders bevorzugte Stickstoffquellen sind Harnstoff, Nitrat, Nitrit, Sojaprotein, Aminosäuren, Protein, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Tier-Nebenprodukte, anorganisches Ammoniumsalz, mehr bevorzugt Ammoniumsalze von Sulfat, Hydroxid, und am meisten bevorzugt Ammoniumhydroxid. Andere limitierende Nährstoffquellen umfassen Kohlenstoffquellen (wie oben bestimmt), Phosphatquellen, Vitaminquellen (wie Vitamin B12-Quellen, Pantothenatquellen, Thiaminquellen) und Spurenmetallquellen (wie Zinkquellen, Kupferquellen, Kobaltquellen, Nickelquellen, Eisenquellen, Manganquellen, Molybdänquellen) und Metallquellen (wie Magnesiumquellen, Calciumquellen, Natriumquellen, Kaliumquellen und Siliciumquellen, etc.). Spurenmetallquellen und Metallquellen können Sulfate und Chloridsalze dieser Metalle umfassen (z. B. aber nicht beschränkt auf MgSO4·7H2O, MnCl2·4H2O, ZnSO4·7H2O, CoCl2·6H2O, Na2MoO4·2H2O, CuSO4·5H2O, NiSO4·6H2O, FeSO4·7H2O, CaCl2, K2SO4, KCl und Na2SO4).
  • Wird Ammonium als eine Stickstoffquelle verwendet, wird das Fermentationsmedium sauer, wenn es nicht durch Basenzugabe oder Puffer kontrolliert wird. Wird Ammoniumhydroxid als primäre Stickstoffquelle verwendet, kann es auch zum Bereitstellen einer pH-Kontrolle verwendet werden. Die Mikroorganismen der Ordnung Thraustochytriales, insbesondere Thraustochytriales der Gattung Thraustochytrium und Schizochytrium wachsen über einen weiten pH-Bereich, z. B. von ungefähr pH 5 bis ungefähr pH 11. Ein geeigneter pH-Bereich für eine Fermentation eines bestimmten Mikroorganismus liegt innerhalb des Wissens eines Fachmanns.
  • Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Ziehen von Mikroorganismen können auch ein Herstellungsstadium umfassen. In diesem Stadium ist die primäre Verwendung des Substrats durch den Mikroorganismus nicht die Erhöhung der Biomassendichte sondern eher die Verwendung des Substrates zur Herstellung von Lipiden. Es sollte anerkannt werden, dass Lipide durch den Mikroorganismus auch während dem die Biomassendichte erhöhenden Stadium hergestellt werden, jedoch, wie oben angegeben, ist das hauptsächliche Ziel in dem die Biomassendichte erhöhenden Stadium die Erhöhung der Biomassendichte. Üblicherweise wird während der Herstellungsstufe die Zugabe des limitierenden Nährstoffsubstrates verringert oder bevorzugt gestoppt.
  • Es wurde zuvor allgemein angenommen, dass die Anwesenheit von gelöstem Sauerstoff in dem Fermentationsmedium entscheidend für die Herstellung von mehrfach ungesättigten Verbindungen, einschließlich Omega-3- und/oder Omega-6-mehrfach ungesättigten Fettsäuren durch eukaryontische Mikroorganismen ist. Daher wurde allgemein angenommen, dass eine verhältnismäßig große Menge an gelöstem Sauerstoff in dem Fermentationsmedium bevorzugt ist. Überraschend und unerwartet haben jedoch die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausge funden, dass die Herstellungsgeschwindigkeit von Lipiden drastisch gesteigert wird, wenn der Gehalt an gelöstem Sauerstoff während des Herstellungsstufe verringert wird. Während der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Fermentationsmedium während dem die Biomassendichte erhöhenden Stadium wenigstens ungefähr 4% der Sättigung und bevorzugt wenigstens ungefähr 8% der Sättigung ist, wird daher während des Herstellungsstadiums der gelöste Sauerstoff in dem Fermentationsmedium auf ungefähr 1% der Sättigung oder weniger und bevorzugt auf ungefähr 0% der Sättigung reduziert. Am Anfang der Fermentation kann der DO (gelöste Sauerstoff) bei oder in der Nähe der Sättigung sein und wenn die Mikroben wachsen, wird ein Absenken auf diese niedrigen DO-Einstellwerte gestattet. In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Menge an gelöstem Sauerstoffgehalt in dem Fermentationsmedium während des Fermentationsverfahrens verändert. Z. B. wird bei einem Fermentationsverfahren mit einer Gesamtfermentationszeit von ungefähr 90 Stunden bis ungefähr 100 Stunden der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Fermentationsmedium bei ungefähr 8% während der ersten 24 Stunden aufrechterhalten, ungefähr 4% von ungefähr der 24. Stunde bis ungefähr der 40. Stunde und ungefähr 0,5% oder weniger von ungefähr der 40. Stunde bis zum Ende des Fermentationsverfahrens.
  • Die Menge an gelöstem Sauerstoff, die in dem Fermentationsmedium vorhanden ist, kann durch Kontrollieren der Menge an Sauerstoff in dem Leerraum des Fermenters eingestellt werden oder bevorzugt durch Kontrollieren der Geschwindigkeit, bei welcher das Fermentationsmedium gerührt (oder umgerührt) wird. Z. B. kann eine hohe Rühr-(oder Umrühr-)Geschwindigkeit zu einer vergleichsweise höheren Menge an gelöstem Sauerstoff in dem Fermentationsmedium führen als eine geringe Rührgeschwindigkeit. Z. B. wird die Rührgeschwindigkeit in einem Fermenter mit ungefähr 14.000 Gallonen Kapazität auf ungefähr 50 U/min bis ungefähr 70 U/min während der ersten 12 Stunden, von ungefähr 55 U/min bis ungefähr 80 U/min während ungefähr der 12. Stunde bis ungefähr der 18. Stunde und von ungefähr 70 U/min bis ungefähr 90 U/min von ungefähr der 18. Stunde bis zum Ende des Fermentationsverfahrens gesetzt, um den oben besprochenen Gehalt an gelöstem Sauerstoff für eine Gesamtzeit des Fermentationsverfahrens von ungefähr 90 Stunden bis ungefähr 100 Stunden zu erreichen. Ein bestimmter Bereich an Rührgeschwindigkeiten, der zum Erreichen einer bestimmten Menge an gelöstem Sauerstoff in dem Fermentationsmedium benötigt wird, kann einfach durch einen Fachmann in dem Bereich bestimmt werden.
  • Eine bevorzugte Temperatur für Verfahren der vorliegenden Erfindung ist wenigstens ungefähr 20°C, mehr bevorzugt wenigstens ungefähr 25°C und am meisten bevorzugt wenigstens ungefähr 30°C. Es sollte gewürdigt werden, dass kaltes Wasser eine höhere Menge an gelöstem Sauerstoff zurückhalten kann als warmes Wasser. Daher hat eine höhere Temperatur des Fermentationsmediums den zusätzlichen Vorteil, die Menge an gelöstem Sauerstoff herabzusetzen, was wie oben beschrieben besonders erwünscht ist.
  • Bestimmte Mikroorganismen können eine bestimmte Menge an Salzmineralen in dem Fermentationsmedium erfordern. Diese Salzminerale, insbesondere Chloridionen, können eine Korrosion des Fermenters und anderer stromabwärts verwendeter Verfahrensgerätschaften verursachen. Um diese unerwünschten Effekte aufgrund einer verhältnismäßig großen Menge an in dem Fermentationsmedium vorhandenen Chloridionen zu verhindern oder zu verringern, können Verfahren der vorliegenden Erfindung auch nicht Chlorid enthaltende Natriumsalze, bevorzugt Natriumsulfat, in dem Fermentationsmedium als eine Natriumquelle enthalten. Insbesondere wird ein signifikanter Teil der Erfordernisse an Natrium der Fermentation als nicht Chlorid enthaltende Natriumsalze bereitgestellt. Z. B. wird weniger als ungefähr 75% des Natriums in dem Fermentationsmedium als Natriumchlorid bereitgestellt, mehr bevorzugt weniger als ungefähr 50% und mehr bevorzugt weniger als ungefähr 25%. Die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung können bei Chloridkonzentrationen von weniger als ungefähr 3 g/l, mehr bevorzugt weniger als ungefähr 500 mg/l, mehr bevorzugt weniger als ungefähr 250 mg/l und mehr bevorzugt zwischen ungefähr 60 mg/l und ungefähr 120 mg/l gezogen werden.
  • Nicht Chlorid enthaltende Natriumsalze können kalziniertes Soda (eine Mischung aus Natriumcarbonat und Natriumoxid), Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Natriumsulfat und Mischungen davon und bevorzugt Natriumsulfat umfassen. Kalziniertes Soda, Natriumcarbonat und Natriumbicarbonat neigen dazu, den pH des Fermentationsmediums zu erhöhen und erfordern daher Kontrollstufen, um den geeigneten pH des Mediums aufrecht zu erhalten. Die Konzentration des Natriumsulfates ist bei der Erfüllung der Salzerfordernisse der Mikroorganismen wirksam, bevorzugt ist die Natriumkonzentration (ausgedrückt als g/l von Na) wenigstens ungefähr 1 g/l, mehr bevorzugt in dem Bereich von ungefähr 1 g/l bis ungefähr 50 g/l und mehr bevorzugt in dem Bereich von ungefähr 2 g/l bis ungefähr 25 g/l.
  • Zahlreiche Fermentationsparameter zum Animpfen, Ziehen und Gewinnen von Mikroorganismen werden ausführlich in dem US-Patent Nr. 5,130,242 erörtert. Jedes derzeit bekannte Abtrennungsverfahren kann zum Abtrennen der Mikroorganismen aus dem Fermentationsmedium verwendet werden, einschließlich Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration, Dekantieren und Lösungsmittelverdunstung. Es wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass bei der Verwendung einer Zentrifuge zum Gewinnen der Mikroorganismen es aufgrund einer solch hohen Biomassendichte, die sich aus dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ergibt, bevorzugt ist, das Fermentationsmedium durch Zugabe von Wasser zu verdünnen, was die Biomassendichte verringert und dadurch eine effektivere Abtrennung der Mikroorganismen von dem Fermentationsmedium ermöglicht.
  • Die sehr hohe "Biomassendichte", die bei der vorliegenden Erfindung erreicht werden, erleichtern „lösungsmittelfreie" Verfahren zum Gewinnen von mikrobiellen Lipiden. Bevorzugte Verfahren zum Auflösen der Zellen in dem Fermenter werden in der vorläufigen US-Patentanmeldung Seriennr. 60/177,125 mit dem Titel „Lösungsmittelfreie Extraktionsverfahren", eingereicht am 19. Januar 2000, der US-Patentanmeldung Seriennr. 09/766,500 mit dem Titel „Lösungsmittelfreie Extraktionsverfahren", eingereicht am 19. Januar 2001 (jetzt US-Patent No. 6,750,048 ) und der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO-A-0153512 mit dem Titel „Lösungsmittelfreie Extraktionsverfahren", eingereicht am 19. Januar 2001 beschrieben. Bevorzugte Verfahren für die Gewinnung der Lipide, nachdem die Zellen in dem Fermenter permeabilisiert, aufgebrochen oder aufgelöst wurden (was ein Aufspalten der Lipidemulsion und ein Gewinnen der lipidreichen Fraktion ermöglicht), umfassen das in der WO 96/05278 zusammengefasste Verfahren zum Entölen, welches hier durch Verweise in vollem Umfang aufgenommen wird. Bei diesem Verfahren wird eine wasserlösliche Verbindung, z. B. Alkohol oder Aceton, zu der Öl/Wasser-Emulsion zum Aufspalten der Emulsion gegeben und die sich daraus ergebende Mischung wird durch Schwerkraftauftrennung, z. B. Zentrifugation, aufgetrennt. Dieses Verfahren kann auch durch die Verwendung anderer Mittel (wasser- und/oder lipidlöslich) zum Aufspalten der Emulsionen abgeändert werden.
  • Alternativ werden Mikroorganismen in trockener Form aus dem Fermentationsmedium durch Verdunsten des Wassers aus dem Fermentationsmedium gewonnen, z. B. durch unmittelbares Inkontaktbringen des Fermentationsmediums (d. h. ohne vorhergehende Aufkonzentration, z. B. durch Zentrifugation) mit einem Trockner, wie einem Trommeltrocknergerät, d. h. ein unmittelbares Gewinnungsverfahren mittels Trommeltrockner. Wird das unmittelbare Gewinnungsverfahren mittels Trommeltrockner zum Trennen der Mikroorganismen verwendet, wird üblicherweise ein dampfbeheizter Trommeltrockner eingesetzt. Zusätzlich ist bei Verwendung des unmittelbaren Gewinnungsverfahrens mittels Trommeltrockner die Biomassendichte des Fermentationsmediums bevorzugt wenigstens ungefähr 130 g/l, mehr bevorzugt wenigstens ungefähr 150 g/l und am meisten bevorzugt wenigstens ungefähr 180 g/l. Diese hohe Biomassendichte ist allgemein für das unmittelbare Gewinnungsverfahren mittels Trommeltrockner wünschenswert, da bei einer geringeren Biomassendichte das Fermentationsmedium eine ausreichende Menge an Wasser umfasst, um die Trommel signifikant zu kühlen, was zu einem unvollständigen Trocknen der Mikroorganismen führt. Andere Verfahren zum Trocknen von Zellen, einschließlich Sprühtrocknung, sind einem Fachmann in dem Gebiet gut bekannt.
  • Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen eine durchschnittliche Lipidherstellungsgeschwindigkeit von wenigstens ungefähr 0,5 g/l/h, bevorzugt wenigstens ungefähr 0,7 g/l/h, mehr bevorzugt wenigstens ungefähr 0,9 g/l/h und am meisten bevorzugt wenigstens ungefähr 1,0 g/l/h zur Verfügung. Überdies enthalten die durch Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Lipide mehrfach ungesättigte Lipide in einer Menge von mehr als ungefähr 15%, bevorzugt mehr als ungefähr 20%, mehr bevorzugt mehr als ungefähr 25%, noch mehr bevorzugt mehr als ungefähr 30%, und am meisten bevorzugt mehr als ungefähr 35%. Die Lipide können aus entweder getrockneten Mikroorganismen oder aus den Mikroorganismen in dem Fermentationsmedium gewonnen werden. Im allgemeinen sind wenigstens ungefähr 20% der durch die Mikroorganismen in den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Lipide Omega-3- und/oder Omega-6-mehrfach ungesättigte Fettsäuren, bevorzugt sind wenigstens ungefähr 30% der Lipide Omega-3- und/oder Omega-6-mehrfach ungesättigte Fettsäuren, mehr bevorzugt sind wenigstens ungefähr 40% der Lipide Omega-3- und/oder Omega-6-mehrfach ungesättigte Fettsäuren und am meisten bevorzugt sind wenigstens ungefähr 50% der Lipide Omega-3- und/oder Omega-6-mehrfach ungesättigte Fettsäuren. Alternativ stellen Verfahren der vorliegenden Erfindung eine durchschnittliche Herstellungsgeschwindigkeit von Omega-3-Fettsäuren (z. B. DHA) von wenigstens ungefähr 0,2 g/l/h an Omega-3-Fettsäure (z. B. DHA) zur Verfügung, bevorzugt wenigstens ungefähr 0,3 g/l/h Omega-3-Fettsäure (z. B. DHA), mehr bevorzugt wenigstens ungefähr 0,4 g/l/h Omega-3-Fettsäure (z. B. DHA), und am meisten bevorzugt wenigstens ungefähr 0,5 g/l/h Omega-3-Fettsäure (z. B. DHA). Alternativ stellen Verfahren der vorliegenden Erfindung eine durchschnittliche Herstellungsgeschwindigkeit von Omega-6-Fettsäuren (z. B. DPAn-6) von wenigstens ungefähr 0,07 g/l/h Omega-6-Fettsäure (z. B. DPAn-6) zur Verfügung, bevorzugt wenigstens etwa ungefähr 0,1 g/l/h Omega-6-Fettsäure (z. B. DPAn-6), mehr bevorzugt wenigstens ungefähr 0,13 g/l/h Omega-6-Fettsäure (z. B. DPAn-6), und am meisten bevorzugt wenigstens ungefähr 0,17 g/l/h Omega-6-Fettsäure (z. B. DPAn-6). Weiter ist alternativ wenigstens ungefähr 25% des Lipides DHA (basierend auf den gesamtem Fettsäuremethylester), bevorzugt wenigstens ungefähr 30%, mehr bevorzugt wenigstens ungefähr 35%, und am meisten bevorzugt wenigstens ungefähr 40%.
  • Die Mikroorganismen, die daraus extrahierten Lipide, die nach der Lipidextraktion verbleibende Biomasse oder Mischungen davon können direkt als Lebensmittelbestandteil verwendet werden, wie ein Bestandteil in Getränken, Soßen, auf Milch basierenden Lebensmitteln (wie Milch, Joghurt, Käse und Eiscreme) und gebackenen Waren, als Nahrungsmittelergänzung (in Kapsel- oder Tablettenform), als Futter oder Futtermittelergänzung für jegliches Tier, dessen Fleisch oder Produkte durch Menschen konsumiert werden, als Lebensmittelergänzung, einschließlich Babynahrung und Kleinkinderrezepten und als Arzneimittel (als direkte oder ergänzende Therapieanwendung). Der Begriff „Tier" bedeutet irgendein Organismus, der dem Reich der Animalia zugehört, und umfasst ohne Beschränkung jedes Tier, von dem Geflügelfleisch, Meeresfrüchte, Rindfleisch, Schweinefleisch oder Lammfleisch stammt. Meeresfrüchte stammen ohne Beschränkung von Fisch, Garnelen und Schalentieren. Der Begriff „Produkte" umfasst jedes Produkt, das kein Fleisch ist und von solchen Tieren stammt, einschließlich ohne Beschränkung Eier, Milch oder anderen Produkte. Wenn mehrfach ungesättigte Lipide an solche Tiere verfüttert werden, können diese in das Fleisch, Milch, Eier und andere Produkte solcher Tiere aufgenommen werden, um deren Gehalt dieser Lipide zu erhöhen.
  • Zusätzliche Ziele, Vorteile und neue Merkmale dieser Erfindung werden den Fachleuten in dem Bereich nach dem Studium der folgenden Beispiele davon aufgezeigt, welche nicht beschränkend sein sollen.
  • BEISPIELE
  • Der Schizochytrium-Stamm, der in diesen Beispielen verwendet wird, stellt zwei primäre Polyensäuren, DHAn-3 und DPAn-6 im allgemeinen in einem Verhältnis von ungefähr 3:1 und kleine Mengen anderer Polyensäuren, wie EPA und C20:3, unter einer großen Vielfalt an Fermentationsbedingungen her. Während die folgenden Beispiele nur die Menge an DHA angeben, kann man daher leicht die Menge an hergestelltem DPA(n-6) unter Verwendung des oben angegebenen Verhältnisses berechnen.
  • Vergleichsbeispiel 1
  • Dieses Beispiel veranschaulicht den Effekt des Sauerstoffgehalts in einem Fermentationsmedium auf die Lipidproduktivität.
  • Fermentationsergebnisse von Schizochytrium ATCC No. 20888 bei zahlreichen Mengen an gelöstem Sauerstoffgehalt wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt, wobei RCS die verbleibende Zuckerkonzentration und DCW das Trockenzellgewicht ist.
  • Vergleichsbeispiel 2
  • Dieses Beispiel zeigt auch den Effekt eines niedrigen Sauerstoffgehalts in dem Fermentationsmedium auf den DHA-Gehalt (% Trockengewicht) des endgültigen Biomasseproduktes.
  • Ein Experiment in kleinem Maßstab wurde in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben durchgeführt, um die Wirkung von einem niedrigen Sauerstoffgehalt auf den DHA-Gehalt in Schizochytrium sp.-Zellen, die in Fermentern in großem Maßstab kultiviert werden, nachzuahmen. Schizochytrium sp. (ATCC 20888) wurde in O4-4-Medium kultiviert. Dieses Kulturmedium besteht aus den folgenden Bestandteilen pro Liter gelöst in deionisiertem Wasser: Na2SO4 12,61 g, MgSO4·7H2O 1,2 g, KCl 0,25 g, CaCl2 0,05 g, Mononatriumglutamat 7,0 g, Glucose 10 g, KH2PO4 0,5 g, NaHCO3 0,1 g, Hefeextrakt 0,1 g, Vitaminmischung 1,0 ml, PII-Metalle 1,00 ml. Die PII-Metallmischung enthält (pro Liter): 6,0 Na2EDTA, 0,29 g FeCl3·6H2O, 6,84 g H3BO3, 0,86 g MnCl2·4H2O, 0,06 g ZnCl2, 0,026 g CoCl2·6H2O, 0,052 g NiSO4·H2O, 0,002 CuSO4·H2O und 0,005 g Na2MoO4·2H2O. Die Vitaminmischung enthält (pro Liter): 100 mg Thiamin, 0,5 mg Biotin und 0,5 mg Cyanocobalamin. Der pH des Kulturmediums wurde auf 7,0 eingestellt und es wurde dann filtersterilisiert.
  • Der Gedanke hinter diesem Experiment in kleinerem Maßstab war es, die Zellen in Schüttelkolben mit verschiedenen Volumina an Kulturmedium in den Kolben zu kultivieren – fast volle Kolben (z. B. 200 ml in einem 250 ml-Schüttelkolben) würden sich auf einem Schütteltisch nicht gut vermischen und während des Zellwachstums würden Bedingungen mit wenig gelöstem Sauerstoff erzeugt. Daher wurden vier Behandlungen in dem Experiment eingerichtet, die jeweils doppelt durchgeführt wurden: (1) 250 ml-Kolben, gefüllt mit 50 ml Kulturmedium, (2) 250 ml-Kolben gefüllt mit 100 ml Kulturmedium, (3) 250 ml-Kolben gefüllt mit 150 ml Kulturmedium, und (4) 250 ml-Schüttelkolben gefüllt mit 200 ml Kulturmedium. Jeder der acht Kolben wurde mit Zellen aus einer 48 Stunden alten Kultur von in O4-4-Medium unter den Bedingungen von Behandlung 1 und bei 28°C und 220 Upm auf einem Schütteltisch kultivierten Schizochytrium angeimpft.
  • Alle acht Kolben wurden für das Experiment auf einen Schütteltisch (220 Upm) in einen Inkubator (28°C) gestellt und für 48 Stunden im Dunkeln kultiviert. Am Ende des Experiments wurde der Gehalt an gelöstem Sauerstoff (DO) in jedem Kolben mit einem YSI-Messgerät für gelösten Sauerstoff (YSI, Inc.) gemessen, der pH des Kulturmediums wurde auch bestimmt und das Trockengewicht der Zellen und deren Fettsäuregehalt wurde auch gemessen. Die Ergebnisse des Experimentes sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1. Ergebnisse des Experiments in kleinerem Maßstab, bei dem die Wirkung von geringen Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff auf den Gehalt an langkettigen, hoch ungesättigten Fettsäuren (DHA % Trockengewicht) von Schizochytrium sp. untersucht wurde.
    ml Medium FAME (% TFA) DHA (% Trockengewicht) Biomasse (g/l) End-pH DO (% d. Sättigung)
    50 16,5 7,4 4,2 7,4 31
    100 17,0 6,5 3,9 7,2 29
    150 22,4 9,2 2,7 7,0 11
    200 35,9 14,5 1,8 6,9 3
  • Die Ergebnisse zeigen, dass der Lipidgehalt (als % FAME) und der DHA-Gehalt (% Trockengewicht) bei Zellen, die bei niedrigem Gehalt an gelöstem Sauerstoff kultiviert wurden, höher war – je niedriger der Gehalt an gelöstem Sauerstoff, desto höher der Lipid- und DHA-Gehalt. Dies ist unerwartet, da allgemein angenommen wurde, dass Sauerstoff zur Bildung von ungesättigten (Doppel-)Bindungen nötig ist. Es ist überraschend, dass soviel DHA bei niedrigem Gehalt an gelöstem Sauerstoff gebildet wurde, da DHA eine der am meisten ungesättigten Fettsäuren ist. Obwohl die Biomasseherstellung mit abnehmendem Gehalt an gelöstem Sauerstoff abnimmt, wird der DHA-Gehalt erhöht. Es ist daher vorteilhaft, eine Wachstumsphase mit höheren Gehalten an gelöstem Sauerstoff zur Maximierung der Bildung von Biomasse zu haben, und dann den Gehalt an gelöstem Sauerstoff abzusenken, um die Herstellung von langkettigen Fettsäuren zu maximieren.
  • Vergleichsbeispiel 3
  • Die Mikroorganismen wurden unter Verwendung von Fermentern mit einem nominalen Füllvolumen von 1.200 Gallonen hergestellt. Die sich daraus ergebende Fermentationsbrühe wurde konzentriert und die Mikroorganismen wurden unter Verwendung eines Trommeltrockners getrocknet. Lipide von Teilmengen der sich daraus ergebenden Mikroorganismen wurden extrahiert und unter Erhalt eines raffinierten, gebleichten und geruchlos gemachten Öls aufgereinigt. Ungefähr 3.000 ppm von d-1-α-Tocopherylacetat wurde vor der Analyse des Lipides für Nahrungsergänzungszwecke zugegeben.
  • Neun Fermentationen von Schizochytrium ATCC No. 20888 wurden durchgeführt und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Der Gehalt an gelöstem Sauerstoff war ungefähr 8% während der ersten 24 Stunden und ungefähr 4% danach. Tabelle 2. Ergebnisse aus einer Fermentation im Zulaufverfahren für die Herstellung von DHA aus Schizochytrium sp.
    Ansatz Alter (h) Ausbeute1 (g/l) DHA2 (%) FAME3 (%) Produktivität4
    1 100,3 160,7 17,8 49,5 0,285
    2 99,8 172,4 19,4 51,3 0,335
    3 84,7 148,7 14,4 41,4 0,253
    4 90,2 169,5 19,7 53,9 0,370
    5 99,0 164,1 12,5 38,9 0,207
    6 113,0 187,1 19,7 47,2 0,326
    7 97,0 153,5 13,7 41,0 0,217
    8 92,8 174,8 16,4 48,6 0,309
    Durchschn.5 97,1 166,4 16,7 46,5 0,288
    Std.6 8,4 12,3 2,9 5,4 0,058
    CV7(%) 8,7 7,4 17,3 11,7 20,2
    • 1. tatsächliche Ausbeute an Biomassendichte
    • 2. DHA-Gehalt als % Zelltrockengewicht
    • 3. Gesamtgehalt an Fettsäuren als % Zelltrockengewicht (gemessen als Methylester)
    • 4. (Gramm DHA)/l/h
    • 5. Durchschnitt
    • 6. Standardabweichung
    • 7. Variabilitätskoeffizienten. Werte der Variabilitätskoeffizienten unter 5% geben ein Verfahren mit ausgezeichneter Reproduzierbarkeit an, Werte zwischen 5% und 10% geben ein Verfahren mit einer guten Reproduzierbarkeit an und Werte zwischen 10% und 20% geben ein Verfahren mit einer angemessenen Reproduzierbarkeit an.
  • Maissirup wurde zugegeben bis das Volumen in dem Fermenter ungefähr 1.200 Gallonen erreichte, wobei zu diesem Zeitpunkt die Zugabe von Maissirup beendet wurde. Das Fermentationsverfahren wurde beendet, sobald die verbleibende Zuckerkonzentration unter 5 g/l fiel. Das typische Alter vom Animpfen bis zum Ende war ungefähr 100 Stunden.
  • Die Fermentationsbrühe, d. h. das Fermentationsmedium, wurde mit Wasser unter Verwendung eines Verhältnisses von ungefähr 2:1 verdünnt, um den Aschegehalt des Endproduktes zu verringern und die Phasentrennung während der Zentrifugationsstufe zu verbessern. Die konzentrierte Zellpaste wurde auf 160°F (ungefähr 71°C) erhitzt und in einem Blaw Knox-Zweiwalzentrockner (42'' × 36'') getrocknet. Bevorzugt wurden die Mikroorganismen jedoch direkt in einem Trommeltrockner getrocknet ohne vorhergehende Zentrifugation.
  • Die Analyseergebnisse der aus Teilmengen jedes Ansatzes in Tabelle 2 extrahierten Lipide ist in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3. Analyse der mikrobiellen Biomasse, die in den in Tabelle 2 zusammengefassten Fermentationen im Zulaufverfahren hergestellt wurde.
    Ansatz % DHA im Vergleich zu FAME1 Gesamtlipid Gew.-%
    1 36,0 72,3
    2 37,8 70,3
    3 34,8 61,5
    4 36,5 74,8
    5 32,1 52,8
    6 41,7 67,7
    7 33,4 49,9
    8 33,7 61,4
    Ansatz % DHA im Vergleich zu FAME1 Gesamtlipid Gew.-%
    Durchschnitt 35,8 63,8
    Std. Abweichung3 3,0 9,1
    CV4 (%) 8,5 14,2
    • 1. siehe Tabelle 2
    • 2. siehe obige Erörterung
    • 3. Standardabweichung
    • 4. Variabilitätskoeffizienten. Werte der Variabilitätskoeffizienten unter 5% geben ein Verfahren mit ausgezeichneter Reproduzierbarkeit an, Werte zwischen 5% und 10% geben ein Verfahren mit einer guten Reproduzierbarkeit an und Werte zwischen 10% und 20% geben ein Verfahren mit einer angemessenen Reproduzierbarkeit an.
  • Sofern nicht anders angegeben, umfasst das Fermentationsmedium, das durchgehend in dem Beispielabschnitt verwendet wurde, die folgenden Inhaltsstoffe, wobei die erste Zahl die nominale Zielkonzentration und die Zahl in Klammern einen annehmbaren Bereich angibt: Natriumsulfat 12 g/l (11–13), KCl 0,5 g/l (0,45–0,55), MgSO4·7H2O 2 g/l (1,8–2,2), Hodag K-60-Antischaummittel 0,35 g/l (0,3–0,4), K2SO4 0,65 g/l (0,60–0,70), KH2PO4 1 g/l (0,9–1,1), (NH4)2SO4 1 g/l (0,95–1,1), CaCl2·2H2O 0,17 g/l (0,15–0,19), 95 DE Maissirup (Feststoffbasis) 4,5 g/l (2–10), MnCl2·4H2O 3 mg/l (2,7–3,3), ZnSO4·7H2O 3 mg/l (2,7–3,3), CoCl2·6H2O 0,04 mg/l (0,035–0,045), Na2MoO4·2H2O 0,04 mg/l (0–0,045), CuSO4·5H2O 2 mg/l (1,8–2,2), NiSO4·6H2O 2 mg/l (1,8–2,2), FeSO4·7H2O 10 mg/l (9–11), Thiamin 9,5 mg/l (4–15), Vitamin B12 0,15 mg/l (0,05–0,25) und Calciumpantothenat 3,2 mg/l (1,3–5,1). Zusätzlich wird als die Stickstoffquelle eine 28%-ige NH4-OH-Lösung verwendet.
  • Der Aschegehalt der getrockneten Mikroorganismen beträgt ungefähr 6 Gew.-%.
  • Beispiel 4
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkung eines herabgesetzten Gehalts an gelöstem Sauerstoff in dem Fermentationsmedium auf die Produktivität von Mikroorganismen bei einem Maßstab von 14.000 Gallonen.
  • Unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens wurde eine Fermentation mit Nominalvolumen von 14.000 Gallonen unter Verwendung eines Schizochytrium-Wildtypstammes durchgeführt, der unter Verwendung von in den oben erwähnten US-Patenten Nr. 5,340,594 und 5,340,742 offenbarten Isolierungsverfahren erhalten werden kann. Der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Fermentationsmedium war ungefähr 8% während der ersten 24 Stunden, ungefähr 4% von der 24. Stunde bis zu der 40. Stunde und ungefähr 0,5% von der 40. Stunde bis zum Ende des Fermentationsverfahrens. Ergebnisse dieses niedrigeren Gehalts an gelöstem Sauerstoff in Verfahren mit Fermentationsmedium sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4. Ergebnisse von Fermentationen von Schizochytrium im Zulaufverfahren im Maßstabe von 14.000 Gallonen bei verringerten Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff.
    Ansatz Alter (h) Ausbeute (g/l) % DHA % FAME % DHA im Vgl. zu FAME DHA-Produktivität (g von DHA/l/h)
    1 2 82,0 99,0 179,3 183,1 21,7 22,3 52,4 55,0 41,4 40,5 0,474 0,412
    3 72,0 159,3 - - 40,9 -
    4 77,0 161,3 - - 43,2 -
    5 100,0 173,0 23,9 53,3 44,9 0,413
    6 102,0 183,3 21,6 50,8 42,6 0,388
    7 104,0 185,1 23,7 55,0 43,1 0,422
    8 88,0 179,3 22,3 52,6 42,4 0,454
    9 100,0 166,4 22,5 53,5 42,1 0,374
    10 97,0 182,6 22,8 51,6 44,1 0,429
    11 87,5 176,5 19,8 45,6 43,5 0,399
    12 67,0 170,8 18,8 48,1 39,1 0,479
    13 97,0 184,9 23,2 52,7 44,0 0.442
    14 102,0 181,9 23,6 52,9 44,6 0,421
    15 102,0 186,9 19,9 47,8 41,8 0.365
    16 97,0 184,4 19,6 45,5 43,0 0,373
    17 98,0 174,7 19,7 45,1 43,7 0,351
    18 103,5 178,8 18,3 44,5 41,2 0,316
    19 102,0 173,7 15,8 43,1 36,7 0,269
    20 94,0 190,4 19,3 46,9 41,1 0,391
    21 72,0 172,5 22,8 52,8 43,2 0,546
    Ansatz Alter (h) Ausbeute (g/l) % DHA % FAME % DHA im Vgl. zu FAME DHA-Produktivität (g von DHA/l/h)
    22 23 75,0 75,0 173,1 152,7 21,0 20,3 51,7 50,3 40,8 40,4 0,485 0,413
    24 75,5 172,5 21,9 51,7 42,3 0,500
    25 61,0 156,4 17,3 45,7 37,8 0,444
    26 74,5 150,6 20,2 50,1 40,2 0,408
    27 70,5 134,3 14,8 40,6 36,6 0,282
    28 75,5 146,1 21,3 49,7 42,8 0,412
    29 82,0 174,3 21,4 50,4 42,5 0,455
    30 105,0 182,3 21,7 50,7 42,8 0,377
    31 66,0 146,2 16,4 44,6 36,7 0,363
    Avg 87,2 171,5 20,6 49,5 41,6 0,409
    Std 13,9 14,1 2,4 3,8 2,3 0,061
    CV 16,0% 8,2% 11,6% 7,7% 5,5% 15,0%
  • Beispiel 5
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkung von einem verringerten Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Fermentationsmedium auf die Produktivität von Mikroorganismen einem Maßstab von 41.000 Gallonen.
  • Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 4 wurde angewendet, außer dass die Fermentation in einem Fermenter mit 41.000 Gallonen durchgeführt wurde. Die Volumina der Kulturmedien wurden so vergrößert, dass die Konzentrationen der Zielverbindungen bei diesem Maßstab aufrechterhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5. Fermentation von Schizochytrium bei einem Maßstab von 41.000 Gallonen
    Ansatz Alter (h) Ausbeute (g/l) % DHA % FAME % DHA im Vgl. zu FAME DHA-Produktivität (g von DHA/l/h)
    1 75,0 116,1 17,3 46,1 37,4 0,268
    2 99,0 159,3 17,4 47,0 37,1 0,280
  • Ansatz Alter (h) Ausbeute (g/l) % DHA % FAME % DHA im Vgl. zu FAME DHA-Produktivität (g von DHA/l/h)
    3 103,0 152,6 16,0 47,2 33,8 0,237
    4 68,0 136,8 17,9 45,9 39,1 0,360
    5 84,0 142,0 17,5 47,0 37,2 0,296
    Avg 85,8 141,4 17,2 46,6 36,9 0,288
    Std 15,1 16,6 0,7 0,6 1,9 0,046
    CV 17,5% 11,8 4,2% 1,3% 5,2% 15,8%
  • Beispiel 6
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkung von zusätzlichem Stickstoff auf das Fermentationsverfahren der vorliegenden Erfindung.
  • Vier Reihen an Experimenten im Zulaufverfahren bei einem Maßstab von 250 l wurden unter Verwendung eines zu Beispiel 4 ähnlichen Verfahrens durchgeführt. Es wurden zwei Kontrollexperimente und zwei Experimente, die zusätzlichen Ammoniak enthielten (1,15x und 1,25x der normalen Menge), durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6. Beeinflussungen von zusätzlichem Ammoniak auf eine Fermentation von Schizochytrium.
    Alter (h) Ausbeute (g/l) Biomassenproduktivität Stoffwandlungsleistung Gehalt an DHA Gehalt an FAME DHA-Produktivität
    Zielkonzentration des Zuckers: 7 g/l, Sollwert des basischen pH: 5,5, Sollwert des sauren pH: 7,3, 1,0X NH3
    48 178 3,71 g/l/h 51,5% 10,7% 37,8% 0,40 g/l/h
    60 185 3,08 g/l/h 46,9% 16,3% 47,2% 0,50 g/l/h
    72 205 2,85 g/l/h 45,2% 17,4% 47,4% 0,50 g/l/h
    84 219 2,61 g/l/h 43,8% 17,1% 45,5% 0,45 g/l/h
    90 221 2,46 g/l/h 44,1% 18,4% 48,9% 0,45 g/l/h
    Zielkonzentration des Zuckers: 7 g/l, Sollwert des basischen pH: 5,5, Sollwert des sauren pH: 7,3, 1,15X NH3
    48 171 3,56 g/l/h 55,6% 12,0% 36,3% 0,43 g/l/h
    60 197 3,28 g/l/h 54,6% 9,4% 38,4% 0,31 g/l/h
    Zielkonzentration des Zuckers: 7 g/l, Sollwert des basischen pH: 5,5, Sollwert des sauren pH: 7,3, 1,15X NH3
    72 191 2,65 g/l/h 52,8% 9,4% 40,0% 0,25 g/l/h
    84 190 2,26 g/l/h 52,5% 10,0% 42,5% 0,23 g/l/h
    90 189 2,10 g/l/h 52,2% 9,2% 43,3% 0,19 g/l/h
    Zielkonzentration des Zuckers: 7 g/l, Sollwert des basischen pH: 5,5, Sollwert des sauren pH: 7,3, 1,25X NH3
    48 178 3,71 g/l/h 56,4% 11,5% 33,7% 0,43 g/l/h
    60 179 2,98 g/l/h 48,6% 10,3% 36,0% 0,31 g/l/h
    72 180 2,50 g/l/h 48,8% 12,0% 37,6% 0,30 g/l/h
    84 181 2,15 g/l/h 46,1% 13,6% 40,1% 0,29 g/l/h
    90 185 2,06 g/l/h 45,7% 12,6% 40,7% 0,26 g/l/h
    Zielkonzentration des Zuckers: 7 g/l, Sollwert des basischen pH: 5,5, Sollwert des sauren pH: 7,3, 1,0X NH3
    48 158 3,29 g/l/h 55,7% 13,1% 36,5% 0,43 g/l/h
    60 174 2,90 g/l/h 48,9% 17,9% 39,2% 0,52 g/l/h
    72 189 2,63 g/l/h 45,7% 21,0% 39,4% 0,55 g/l/h
    84 196 2,33 g/l/h 44,1% 22,4% 40,1% 0,52 g/l/h
    90 206 2,29 g/l/h 44,8% 22,1% 40,3% 0,51 g/l/h
  • Im allgemeinen hat zusätzlicher Stickstoff eine negative Auswirkung auf das Ergebnis der Fermentation, da signifikante Abnahmen bei der DHA-Produktivität bei den zwei Ansätzen, bei denen zusätzlicher Ammoniak zugegeben wurde, beobachtet wurde. Wie in Tabelle 6 gezeigt, ergeben die Kontrollansätze endgültige DHA-Gehalte von 18,4% und 22,1% des gesamten zellulären Trockengewichtes gegenüber 9,2% (1,15x Ammoniak) und 12,6% (1,25x Ammoniak) bei mit zusätzlichem Stickstoff versehenen Ansätzen.
  • Beispiel 7
  • Dieses Beispiel zeigt ein kinetisches Profil eines Fermentationsverfahrens der vorliegenden Erfindung. Ein Experiment im Zulaufverfahren bei einem Maßstab von 1.000 Gallonen wurde unter Verwendung eines zu Beispiel 4 ähnlichen Verfahrens durchgeführt. Ein kinetisches Profil des Fermentationsverfahrens ist in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7. Kinetisches Profil einer Fermentation von Schizochytrium im Zulaufverfahren bei einem Maßstab von 1.000 Gallonen.
    Alter (h) Ausbeute (g/l) Biomassenproduktivität Stoffwandlungsleistung % Gehalt an DHA % Gehalt an FAME DHA-Produktivität
    24 118 4,92 g/l/h 78,2% 7,4 18,8 0,36 g/l/h
    30 138 4,60 g/l/h 60,3% 10,6 30,9 0,49 g/l/h
    36 138 3,83 g/l/h 46,6% 11,6 36,5 0,44 g/l/h
    42 175 4,17 g/l/h 49,8% 13,4 41,7 0,56 g/l/h
    48 178 3,71 g/l/h 45,1% 18,7 52,8 0,69 g/l/h
    48* 164 3,42 g/l/h 41,5% 15,3 33,1 0,52 g/l/h
    54 196 3,63 g/l/h 45,7% 16,6 51,2 0,60 g/l/h
    60 190 3,17 g/l/h 41,7% 16,9 33,9 0,54 g/l/h
    72 189 2,62 g/l/h 39,1% 15,6 31,8 0,41 g/l/h
    84 195 2,32 g/l/h 38,5% 16,4 32,7 0,38 g/l/h
    90 200 2,22 g/l/h 39,0% 18,8 33,3 0,42 g/l/h
    90 171 1,90 g/l/h 33,3% 22,2 61,6 0,42 g/l/h **
    • * Zwei getrennte Proben wurden bei 48 h analysiert.
    • ** Dies bezieht sich auf Trockenzellgewichte (DCW) einer gewaschenen Probe. Andere angegebene Werte sind für ungewaschene Proben.
  • Beispiel 8
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Beeinflussung der Menge an Kohlenstoffquelle auf die Produktivität.
  • Drei verschiedene Fermentationsverfahren wurden unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 4 durchgeführt, wobei verschiedene Mengen an Kohlenstoffquelle verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8. Fermentationsergebnisse mit verschiedenen Mengen an Kohlenstoffquelle bei einer Fermentation von Schizochytrium.
    Alter (h) Ausbeute (g/l) Kohlenstoffeintrag Stoffwandlungsleistung % Gehalt an DHA % Gehalt an FAME DHA-Produktivität (g/l/h)
    90 171 51,3% 33,3% 22,2 61,6 0,42
    94 122 40,5% 30,1% 19,1 57,3 0,25
    59 73 20,0% 36,5% 11,9 40,8 0,15
  • Vergleichsbeispiel 9
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkung von Nährstofflimitierung auf die Stoffwandlungsleistung von Kohlenstoff in Biomasse, Lipide und ganz spezifisch DHA.
  • Ein Experiment in kontinuierlicher Kultur zum untersuchen der Wirkung der Nährstoffbegrenzung wurde durch Kultivieren von Schizochytrium ATCC No. 20888 in einem Applikon-Fermenter mit zwei Liter Volumen in Grundnährmedium (ICM-2) durchgeführt, welches aus den folgenden Verbindungen besteht (nominelle Konzentration): Komponenten der Gruppe I: Na2SO4 (18,54 g/l), MgSO4·7H2O (2,0 g/l) und KCL (0,572 g/l), Komponenten der Gruppe II (jeweils getrennt hergestellt): Glucose (43,81 g/l), KH2PO4 (1,28 g/l), CaCl2·2H2O (0,025 g/l) und (NH4)2SO4 (6,538 g/l), Komponenten der Gruppe III: Na2EDTA (6,0 mg/l), FeCl3·6H2O (0,29 mg/l), H3BO3 (6,84 mg/l), MnCl2·4H2O (0,86 mg/l), ZnSO4·7H2O (0,237 mg/l), CoCl2·2H2O (0,026 mg/l), Na2MoO4 ·2H2O (0,005 mg/l), CuSO4·5H2O (0,002 mg/l) und NiSO4·6H2O (0,052 mg/l), und Komponenten der Gruppe IV: Thiamin HCl (0,2 mg/l), Vitamin B12 (0,005 mg/l), Calciumpantothenat (0,2 mg/l). Die Gruppen I und II wurden durch Autoklavieren sterilisiert, wohingegen die Gruppen III und IV vor der Zugabe in den Fermenter filtersterilisiert wurden. Das Wachstumsmedium wurde dann mit Schizochytrium angeimpft und unter kontrollierten Bedingungen bei 30°C, pH 5,5 und gelöstem Sauerstoff von 20% der Sättigung bis zum Erreichen der maximalen Zelldichte gezogen.
  • Es wurde dann eine kontinuierliche Betriebsart durch simultanes Pumpen sterilen ICM-2-Fütterungsmediums in den Fermenter und Entfernen der Schizochytrium-Zellen enthaltenden Brühe mit einer zum Aufrechterhalten einer Verdünnungsrate von 0,06 h–1 ausreichenden Fließgeschwindigkeit bis zum Erreichen eines stationären Zustandes festgelegt. Zum Untersuchen der Wirkung einer Nährstofflimitierung wird die Verbindung, die den spezifischen erforderlichen Nährstoff enthält, in dem ICM-2-Fütterungsmedium verringert, so dass dieser Nährstoff in der ablaufenden Zellen enthaltenden Brühe verarmt, so dass das Wachstum der Zellen durch die Abwesenheit des bestimmten erforderlichen Nährstoffes limitiert wird. Sobald der stationäre Zustand für jede Bedingung festgelegt war, wurde die trockene Biomasse der letzten Brühe, die verbleibende Glucose und die Konzentrationen des limitierenden Nährstoffs, der Lipidgehalt der Zelle und der DHA-Gehalt der Zellen gemessen. Die Stoffwandlungsleistung von Glucose zu Biomasse wurden durch Teilen der gesamten verbrauchten Glucose durch die gesamte gebildete trockene Biomasse berechnet und auf Prozentbasis ausgedrückt.
  • Die Wirkungen der Wachstumsbegrenzung durch jeden einzelnen Nährstoff wurden durch Wiederholen dieses Experiments für jeden einzelnen Nährstoff, der in der folgenden Tabelle aufgeführt ist, untersucht. Endgültige Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Tabelle 9. Wirkung einer Nährstofflimitierung auf die Biomassenausbeute, die Stoffwandlungsleistung (Glucose → Biomasse), den Lipidgehalt und den DHA-Gehalt von Schizochytrium sp.
    Limitierender Nährstoff Biomasse1 (g/l) Yx/s 2 RCS3 (g/l) Lipidgehalt4 (%) DHA-Gehalt5 (%)
    Glucose 18,7 46,8 0,0 19,8 7,3
    Stickstoff 14,5 36,3 0,6 47,5 10,3
    Phosphat 17,8 44,5 0,8 37,0 8,2
    Thiamin 7,5 18,8 7,7 11,1 4,0
    Zink 16,0 40,0 1,3 27,8 7,2
    Kupfer 14,0 35,0 0,4 13,8 ,3
    Cobalt 14,5 36,3 0,0 22,2 6,9
    Nickel 17,8 44,5 0,0 21,9 8,0
    Eisen 115,9 39,8 3,5 18,5 7,2
    Mangan 12,5 31,3 3,4 26,1 8,0
    Magnesium 13,9 34,8 5,3 18,7 6,4
    Calcium 16,7 41,8 4,3 18,7 6,4
    Vitamin B12 19,6 49,0 0,0 17,5 6,3
    Molybdän 18,9 47,3 0,0 19,3 7,0
    Pantothenat 19,2 48,0 0,0 20,4 6,7
    Natrium 17,9 44,8 1,8 21,8 8,2
    Kalium 13,0 32,5 8,8 14,1 5,3
    • 1. Konzentration der trockenen Biomasse (Gramm/Liter)
    • 2. Ausbeutekoeffizient (% hergestellte Biomasse/verbrauchte Glucose)
    • 3. Verbleibende Glucosekonzentration in der Brühe (Gramm/Liter)
    • 4. Lipidgehalt der trockenen Biomasse (g/Lipid (als FAME)/g trockene Biomasse)
    • 5. DHA-Gehalt der trockenen Biomasse (g DHA/g trockene Biomasse)
  • Aus der Tabelle wird klar, dass eine Stickstofflimitierung zu der höchsten Anreicherung von DHA in den Zellen führte, gefolgt von Phosphat, Natrium, Nickel, Mangan, Glucose (Kohlenstoff), Zink und Eisen. Diese Information kann kommerziell durch Zuführen von einem oder mehrerer dieser Nährstoffe zu einer diskontinuierlichen Fermentation, bei einer für die Limitierung des Zellwachstums ausreichenden Geschwindigkeit, verwendet werden. In dem am meisten bevorzugten Fall wird Stickstoff in einer limitierenden Weise der diskontinuierlichen Fermentation zur Maximierung des DHA-Gehalts der Zellen zugegeben. Andere Nährstoffe (oder Mischungen davon) können in einer limitierenden Weise zur Maximierung der Herstellung von Biomasse oder anderer wertvoller Produkte zugegeben werden. Andere biologisch erforderliche Elemente oder Nährstoffe, die nicht untersucht wurden, wie Schwefel, könnten auch als limitierende Nährstoffe bei dieser, eine Fermentation kontrollierenden Strategie verwendet werden.

Claims (25)

  1. Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen Lipiden, bei dem man: (a) eine Fermentation eines Mediums durchführt, das Mikroorganismen, eine Kohlenstoffquelle und eine limitierende Nährstoffquelle umfaßt, und Bedingungen bereitstellt, die geeignet sind, um einen Gehalt an gelöstem Sauerstoff von wenigstens etwa 4% der Sättigung in dem Fermentationsmedium aufrecht zu erhalten, um die Biomassendichte zu erhöhen, (b) anschließend Bedingungen bereitstellt, die geeignet sind, einen Gehalt an gelöstem Sauerstoff von etwa 1% oder weniger der Sättigung in dem Fermentationsmedium aufrecht zu erhalten, und Bedingungen bereitstellt, die geeignet sind, es den Mikroorganismen zu ermöglichen, die Lipide zu produzieren, und (c) die mikrobiellen Lipide gewinnt, wobei wenigstens etwa 15% der mikrobiellen Lipide mehrfach ungesättigte Lipide sind und wobei während der Fermentation eine Biomassendichte von wenigstens 100 g/l erzielt wird.
  2. Verfahren zur Anreicherung des Gehalts eines Mikroorganismus an Polyenfettsäure, bei dem man den Mikroorganismus in einem Wachstumsmedium fermentiert, das einen Gehalt an gelöstem Sauerstoff von weniger als 1% der Sättigung aufweist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Fermentationsmedium oder Wachstumsmedium bei einer Temperatur von wenigstens etwa 20°C vorliegt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verfahren Lipide bei einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von wenigstens etwa 0,5 g/l/h hervorbringt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verfahren Lipide bei einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von wenigstens etwa 0,5 g/l/h hervorbringt und wobei wenigstens etwa 15% der Lipide mehrfach ungesättigte Lipide sind.
  6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verfahren Lipide bei einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von wenigstens etwa 0,5 g/l/h hervorbringt und wobei die Gesamtmenge an Omega-3 und Omega-6-Fettsäuren wenigstens etwa 20% der Lipide ausmacht.
  7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verfahren Lipide bei einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von wenigstens etwa 0,5 g/l/h hervorbringt und wobei wenigstens etwa 25% der Lipide Docosahexaensäure sind.
  8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mikroorganismen ausgewählt sind unter Algen, Pilzen (einschließlich Hefe), Einzellern, Bakterien und Gemischen hiervon, wobei die Mikroorganismen in der Lage sind Polyenfettsäuren zu produzieren.
  9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mikroorganismen ausgewählt sind unter Algen, Pilzen (einschließlich Hefe), Einzellern, Bakterien und Gemischen davon, wobei die Mikroorganismen dazu in der Lage sind, Polyenfettsäuren zu produzieren, und wobei die Mikroorganismen in einem Zulaufverfahren gezogen werden.
  10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mikroorganismen ausgewählt sind unter Algen, Pilzen (einschließlich Hefe), Einzellern, Bakterien und Gemischen davon, wobei die Mikroorganismen dazu in der Lage sind, Polyenfettsäuren zu produzieren, und wobei die Mikroorganismen in einem Zulaufverfahren gezogen werden, und wobei man weiterhin während der Stufe (a) einen Sauerstoffgehalt von weniger als etwa 3% der Sättigung in dem Fermentationsmedium aufrecht erhält.
  11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mikroorganismen Mikroalgen und Algenähnliche Mikroorganismen sind.
  12. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Mikroorganismen Stramenopiles sind.
  13. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mikroorganismen der Ordnung Thraustochytriales angehören.
  14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mikroorganismen ausgewählt sind unter Thraustochytrium, Schizochytrium und Gemischen davon.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kohlenstoffquelle eine Kohlenstoffquelle ist, die kein Alkohol ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verfahren durchschnittlich wenigstens etwa 0,2 g/l/h Docosahexaensäure produziert.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei man bei der Stufe der Lipidgewinnung: (d) Wasser aus dem Fermentationsmedium entfernt, um trockene Mikroorganismen bereitzustellen, (e) die Lipide aus den trockenen Mikroorganismen isoliert.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei man bei der Stufe der Lipidgewinnung: (d) Wasser aus dem Fermentationsmedium ohne vorheriges Zentrifugieren evaporiert, um trockene Mikroorganismen bereitzustellen, und (e) die Lipide aus den trockenen Mikroorganismen isoliert.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei man bei der Stufe der Lipidgewinnung: (d) die Fermentationsbrühe behandelt, um die mikrobiellen Zellen permeabel zu machen, sie zu lysieren oder sie zu zereißen, und (e) die Lipide aus der Fermentationsbrühe durch Schwerkrafttrennung gewinnt, mit oder ohne der Hilfe eines Mittels, um die Durchbrechung der Lipid-/Wasser-Emulsion zu unterstützen.
  20. Verfahren nach Anspruch 2, wobei während der initialen Wachstumsphase der Gehalt an gelöstem Sauerstoff größer als etwa 10% der Sättigung ist, und während einer anschließenden Produktionsphase der Gehalt an gelöstem Sauerstoff weniger als 1% der Sättigung ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus Polyketidsynthase enthält.
  22. Heterotrophes Verfahren zur Herstellung von Produkten und Mikroorganismen, bei dem man die Mikroorganismen in einem Wachstumsmedium kultiviert, das einen Gehalt an gelösten Sauerstoff von wenigstens etwa 1% der Sättigung aufweist, wobei die Mikroorganismen Polyketidsynthasegene enthalten.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Polyketidsynthasegene in den Mikroorganismen natürlich vorkommen.
  24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Polyketidsynthasegene in die Mikroorganismen genetisch eingebracht werden.
  25. Verfahren nach Anspruch 22, wobei während einer initialen Wachstumsphase der Gehalt an gelöstem Sauerstoff größer als etwa 10% der Sättigung ist, und wobei während einer anschließenden Produktionsphase der Gehalt an gelöstem Sauerstoff weniger als etwa 1% ist.
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