DD267999A1 - Verfahren zur herstellung von 2-oxoglutarsaeure durch hefen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von 2-Oxoglutarsaeure mit einer stabilen, leistungsfaehigen Hefemutante des Stammes Yarrowia lipialytica H 222-27-11 ZIMET 43856 unter aeroben, submersen Bedingungen. Die Mutante ist in der Lage, unter Nutzung unterschiedlicher Kohlenstoffquellen, wie n-Paraffine, Glucose u. a., 2-Oxoglutersaeure in hoher Konzentration und mit hoher Geschwindigkeit im Kulturmedium zu akkumulieren. Unter den Bedingungen einer optimalen stammspezifischen Thiaminkonzentration von 0,05-0,15 mg/l Thiaminhydrochlorid werden bei einem p H-Wert von vorzugsweise 3,0-4,0 und einer Geloestsauerstoffkonzentration von 50-90%, besonders auf der Basis von n-Paraffinen, 125 g/l 2-Oxoglutarsaeure in 90 Stunden produziert. Die Anwendung der Erfindung liegt im Bereich der mikrobiellen Produktsynthese.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-OxoglutarsSure durch Hefen mit geeigneten Kohlenstoffquellen untei aeroben, submorten Bedingungen und ist somit in das Gebiet der technischen Mikrobiologie einzuordnen.

Charakteristik das bekannton Standen dot Technik

2-Oxoflluiertäure findet zunehmend Interesse als Ausgangssubstanz für v/eiterführende chemische Synthesen. Sie kann chemisch nur in aufwendigen Mehrstufenverfahren hergestellt werden.

Es Ist bekannt, daß 2-Oxoglutarslure sowohl durch Bakterien als auch durch Hefen im Kulturmedium akkumuliert werden kann. AIa Kohienstoffquelle werden sowohl Glucose als auch Paraffine eingesetzt. Mit dem Bakterium Arthrobacter paraffineus Nr. 2411 (ATCC 15691) z.B. werden maximal 60g/l 2-Oxoglutarsäure mit einer Produktbildjngsgeschwindigkeit von 0,8g/l h und einer Ausbeute voii 74%, bezogen auf das eingesetzte Paraffin erhalten

(GB 1.192905,1965, Prior. JP 38921,1964, Firma Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.).

Mit dem gleichen Stamm infolge Nebenproduktbildung von L-Glutaminsäure geringere Leistungen erzielt (US 3450.599,19fl5, Prior. JP 3947169,1964, Fa. Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Es ist bekannt, daß thiaminauxotrope Hefen, besonders der Gattung Candida lipolytica unter Thiaminmangelbedingungen auf

der Basis von η-Paraffinen bevorzugt 2-Osoglutarsäure und auf der Basis von Glucose bevorzugt Brenztraubensäure ausscheiden (Ermakova, J.T. u.a. Frikladnaja Biochimija i Mikrobiologie 22 (1986| 3,341-347).

Die mit Hefen der Gattung Candida, ζ. R. Candida lipolytica, erzielten Säurekonzentrationen De'ragnn maximal 48 g/l bei einer ProduktbitdungsgeschwindigkfeitvonO.eg/l · hund einer Ausbeute von 60% (GB 1.187.006,1968, Prior. JP 4104,1968, Fa. Ajlnlmoto Co., Inc.). Mit dem Einsau des diploiden Stammes von Candida lipolytica D 1805 (FR 2.207.989,1973, Inst. Francais du Petrole des Carburonts et Lubricants, Paris) konnten diese Leistungspurameter weit übertroffen werden, so daß eine

2-Oxoglutarsiurekonzentration von 185g/l in 240h (Produktivität 0,9g/l · h) mit einer Ausbeute von 80%^ bezogen auf die eingesetzte Paratfinmenge, erzielt werden konnte.

Die Nachteile der aufgeführten Verfahren sind die geringen Produktbildungsraten und geringen Endkonzentrationen sowie die Bildung von Nebenprodukten, wie z.B. L-Glutaminsaure (GB 1.187.006 und US 3.450.593). Von diploiden Leistungsstfimmen >st

bekannt, daß eine Revertierung in haploide Formen mit geringerer Leistung auftreten kann.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, mit einer Hefe aus unterschiedlichen Kohlenstoffquellen mittels eines Fermentationsverfahrens 2-Oxoglutarslure in hohen Endkonzentretionen und mit hoher Produktbildungsgeschwindigkeit herzustellen.

Wesen der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, eine speziell hergestellte Hefemutante auszuwählen und unter spezifischen Verfahrensbedingungen zu kultivieren. Erfindungsgemfiß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man den Hefestamm Yarrowia iipolytica H 222-27-11 (ZIMET 43856) in bekannten Nährmedien bei einem pH-Wo: i < 6,5, vorzugsweise von 3,0-4,0, einer optimalen, stammspezifischen Thiaminkonzentration von 0,05-0,1 5μg/l Thlamlrhydrochlorid, einer Temperatur von < 35⁰C, bevorzugt 28-32'C und einer Gelöstsauerstoffkonzontration von 50-90% kultiviert.

Der Stamm zeichnet sich dadurch aus, daß er auf den unterschiedlichsten assimilierbaren Kohlenstoffq'jellen, wie z. B. η-Paraffinen, Glucose, glucos>>naltigen Hydrolysaten, Invertzucker, Triglyceriden, Äthanol, Glycerin, Essigsäure bzw. Acetat in Gegenwart einer mineralischen Nihrsalzlösung sowie genau dosierten Wuchsstoffen und Vitamin B1 wichst und 2-Oxoglutartä. ·β akkumuliert. Besonders auf der Basis von η-Paraffinen werden große Mengen an 2-Oxoglutarsfiure mit hoher Produktionsbill lungsgeschwindigkeit und hoher Ausbeute, die die bisher bekannten übertreffen, produziert. So betragt die Produktionsbildungsgeschwindigkeit für 2-Oxoglutarsfiure aus n-Paraffinen durchschnittlich 1,4g/l h, d.h. dia Produktionsbildungsleistung ist um etwa 50% höher als die beschriebene Bestleistung mit einem diploiden Stamm, die erzielte die erzielte Ausbeute um etwa 10%.

Eine weitere wesentliche Eigenschaft des Stammes ist darin begründet, daß er unterschiedliche C-Quellen, wie z. B. nPa-affine und Glucose auch im Gemisch gleichzeitig verwerten kann oder aber, daß man unterschiedliche C-Quellen zu unterschiedlichen Zeiten verwendet, wie z. B. für die Wachstumsphase Paraffin und für die Produktbildungsphase Glucose oder umgekehrt. Der Stamm behält seine Eigenschaft, 2-O-oglutarsfiure in großen Mengen mit hoher Geschwindigkeit und hoher Ausbeute zu produzieren, unverändert über einen langen Test- Zeitraum von mehreren Jahren.

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Nachfolgend wird der neue Stamm charakterisiert: Der Stamm H 222-27-11, ZIMET 43656 stellt eine methlonfnunabhingfge Revertante der methioninbedürftigen,

zitronenslureproduzlereiiden Mutante H 222-27 dar.

1. Morphologische Eigenschaften Kolonien nach *J8h auf YEP-G (1 % Hefeextrak), 2% Pepton, 2% Glucose, pH 5.5-6,0): etwa 2 mm groll, rund, weißgrau, glatt (spater faltig) mit glattem Rand. Zellen: deutlicher Dimorphismus, Hefezellen oval, von unterschiedlicher Größe Hyphen bilden Pseudomyzel

2. Physiologische Eigenschaften Subttratverwertung: Glucose +

Fr uct ο te f

Acetat +

Äthanol +

n-Alkane +

Zitronensäure + L-Sotbose -

Glyzerin +

Galactose

Lactose

Maltota

Seccharoio -

Stärke KNOi

Maximale Wachstumstemperatur: 25-32'C Vitaminbedarf: thiaminbedürftig 3. Genetische Eigenschaften Kernstalus: haploid

Paarungstyp: A

Genotyp: A, melA, SUPA, SP01 In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung nfiher erläutert;

Beispiel 1 Zu 31 Medium folgen der Zusammensetzung NH₄CI2%, ΚΗ,ΡΟ, 0,i%. MgSO₄ 7H₁O 0,1 %. FeSO₄ · 7H₂O 10mg/I, ZnSO₄ · 7H₁O 44mg/1, gslöst in destilliertem Wasser.

werden 700mi η-Paraffine der Kettenlange C₁₁-C₁I zugesetzt.

Das Kulturmedium wird bei 120'C 30min sterilisiert. Nach dem Abkühlen werdon 0,3pg Thiaminhydrochlorid (in 10ml dost. Wasser) gelöst und durch Filtration gesondert sterilisiert sowie 300ml einer 24 Stunden gewachsenen Kultur der Hefn Yarrowia

lipolytica H 222-27-11, ZIMET 43856 als Inokulum zugesetzt.

Das Medium für das Inokulum hat folgende Zusammensetzung: NH₄CI 0,3%, KH]PO₄ 0,07%, MgSO₄ · 7H,00,035%, Hefeextrakt 0,1 %, η-Paraffine C₁₁-C₁₁2%, Spurenelemente: CuSO₄ 5HjC

1 mg/1, MnSO₄ · 4 H₁015 my/I, ZnCI₂10mg/l, CoSo₄ · 7H₂O 4 mg/l, H]BOj 40mg/l, gelöst in destilliertem Wasser.

Die Fermentation wird in einem 12-l-Rührfermentor durchgeführt. Fermentationsbadingungen: sterile Formentationsweise, Luftmenge 50-250l/h, ZO'C. nührung 1500-2000U/min, pH-Wert der Wachstumsphase 4,0-5,0, pH-Wert der Produktionsphase

3,5, pH-Regulation mit 40%iger NaOH.

Etwa 10 Stunden nach Wachstumsbeginn der Kultur beginnt die Akkumulation der 2-OxogluiarsSuro, zunSchst langsam, später

mit einer hohen Produktbildungsgeschwindigkeit von durchschnittlich 1,4g/l · h.

Nach weiteren 90 Stunden wird die Fermentation abgebrochen. Die Konzentration en gebildeter 2-Oxoglutarsaure im Kulturmedium betragt 125g/l (unter Berücksichtigung der Verdünnung durch das zugeführte Laugevolumen). Die erzielte Ausbeute, bozogen auf dig eingesetzte Paraffinmenge, einschließlich des Paraffinverbrauches für die Biomassebildung, betrügt 90%. Beispiel 2 Es wird verfahren, wie im Beispie! 1 beschrieben worden ist. 50 Stunden nach Beginn der Produktbildung werden weitere 350ml

η-Paraffine in steriler Arbeitsweise zugegeben. Die Fermentation wird 100 Stunden fortgesetzt. Nach insgesamt 150 Produktionsstunden betragt die 2-OxoglutarsAurekonzentration 195g/l.

BaIpIeI 3

tu wird verfahren, wie im Beispiel 1 beschrieben worden ist, wob6i jedoch anstelle von Paraffin zur Produktbildung 450g/l Glucoto eingesetzt werden. Die Thiaminkonzentration wird auf 0,3 ug Thiaminhydrochlorid erhöht.

Nach insgesamt 120 Stunden wird die Fermentation abgebrochen. Im Kulturmedium werden 36g/l 2-Cxoglutarsäure und

16g/l Brenztraubensäure bestimmt.

Beispiel 4

Verfahren nach Beispiel 1, wobei anstelle von 700ml Paraffin zu Beginn der Fermentation ein Gemisch aus Paraffin (300ml) und Glucose (75g/l) als Kohlenstoffquellen vorgegeben werden. Nach 90 Stunden wird dia Fermentation abgebrochen. Die Konzentration der gebildeten 2-Oxoglutarsäure betragt 60g/l.

Claims (2)

1. -1- 267 99'Si Patentanspruch:

   Verfahren zur Hersteilung von
2. 2-Oxoglutarsäure durch Hefen, dadurcn gekennzeichnet, daß eine stabile Leistungsrr.utante der Hefe Yarrowia lipolytica H 222-27-11 ZIMET 43856 bei einem pH-Wert < 6,0, vorzugsweise boi 3,0-4,0 und einer Temperatur von < 37°C, vorzugsweise 2&-32°C unter aeroben, submersen Bedingungen in bekannter Weise kultiviert wird.