DE3851108T2 - Verfahren zur herstellung von d-alanin. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur industriellen Herstellung von D-Alanin durch Fermentation.
• Ein Verfahren zur Herstellung von D-Alanin durch Züchten einer Hefe in einem sowohl Glukose als auch DL-Alanin enthaltenden Medium ist durch Oshima et al in "Amino Acid and Nucleic Acid", 15, 89-94 (1967) geoffenbart. Für eine derartige Hefe ist ein alkalischer pH-Wert zu empfehlen.
• JP-B-20683/85 beschreibt ein Verfahren zur parallelen Herstellung von etwa gleichen Mengen von D-Alanin und Brenztraubensaure unter Verwendung eines Mikroorganismus, der fähig ist, L-Alanin in Gegenwart sowohl von Glukose als auch von DL-Alanin zu oxidieren. Es eignet sich wiederum ein pH-Wert von 6,8-7.
• Beide herkömmliche Verfahren sind als Verfahren für die Gewinnung von teurem D-Alanin mit hoher Reinheit aus billigem DL-Alanin ausgezeichnet.
• Bei Oshima et al (oben) wurde jedoch klar zum Ausdruck gebracht, daß bei einer Konzentration von DL-Alanin von 20 g/l oder mehr nicht nur das Wachstum der Stämme gehemmt wurde, sondern auch seine Fähigkeit abnahm, selektiv abzubauen. Da somit die Konzentration des Ausgangsmaterials DL-Alanin auf eine Menge von weniger als 20 g/l beschränkt war, kann die Ausbeute von D-Alanin höchstens nur 10 g/l betragen, selbst wenn eine theoretisch quantitative Menge erzielt werden kann; daher handelt es sich um kein industriell geeignetes Verfahren.
• Beim Verfahren gemäß JP-B-20683/85 betrug die Konzentration von DL-Alanin höchstens 50 g/l, und die Ausbeute von D-Alanin war auch gering, nämlich höchstens 17 g/l. Die zum Züchten der Stämme und Oxidieren des L-Alanins erforderliche Zeit war lange (nämlich insgesamt 72 Stunden), weshalb sich dieses Verfahren auch nicht für die industrielle Herstellung eignet. Außerdem ist es in diesem Verfahren erforderlich, eine große Menge an Brenztraubensäure abzutrennen und zu entfernen, um D-Alanin zu erhalten. Auch aus diesem Grund ist das Verfahren industriell nicht geeignet.
• Die Autoren der vorliegenden Erfindung führten umfassende Untersuchungen durch, um die oben beschriebenen Probleme zu lösen und bieten ein industriell vorteilhaftes Verfahren zum Herstellen von D-Alanin an. Weiters stellten sie fest, daß D-Alanin in großen Mengen durch Züchten einer speziellen Hefe in einem eine spezielle Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthaltendem Kulturmedium gewonnen werden kann.
• Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Herstellen von D-Alanin mit hoher Ausbeute, nämlich in einer fast theoretischen quantitativen Menge, aus DL-Alanin durch ein selektives Assimilationsverfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus bereitzustellen.
• Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von D-Alanin mit hoher Ausbeute durch Zuführen einer hohen Konzentration an DL-Alanin in ein Kulturmedium bereitzustellen, welches Verfahren das Wachstum von Stämmen nicht hemmt und seine Fähigkeit nicht senkt, selektiv abzubauen.
• Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, bei dem eine sehr geringe Menge an organischem Nebenprodukt und organischer Verunreinigung im Kulturmedium vorhanden sind, wenn das Züchten abgeschlossen ist.
• Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein wirkungsvolles Verfahren bereitzustellen, bei dem die für das Züchten und Assimilieren einer Hälfte von DL-Alanin erforderliche Zeit verkürzt werden kann.
• Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden ausführlichen Beschreibung.
• Diese Ziele können durch ein Verfahren zur Herstellung von D-Alanin durch Züchten einer Hefe, die den Gattungen Candida, Saccharomycopsis, Pichia, Torulopsis, Cryptococcus, Hansenula oder Trichosporon angehört und die Fähigkeit besitzt, L-Alanin im wesentlichen zu assimilieren, ohne D-Alanin zu assimilieren, in einem Medium, das einen pH-Wert von 6,5 oder weniger aufweist und das DL-Alanin, das in einer Menge von 60 bis 200 g/l verwendet wird, als kombinierte Quelle sowohl von Kohlenstoff als auch von Stickstoff enthält und von 0 bis weniger als 10 g/l einer zusätzlichen Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle enthält, sowie durch Gewinnen von D-Alanin aus der gezüchteten Substanz erreicht werden.
• Es folgt eine ausführliche Beschreibung von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
• Als Hefen eignen sich jene, die den Gattungen Candida, Saccharomycopsis, Pichia, Torulopsis, Cryptococcus, Hansenula oder Trichosporon angehören. Unter diesen Hefen kann man jene in der vorliegenden Erfindung verwenden, die in einem Medium wachsen können, das im wesentlichen DL-Alanin als einzige kombinierte Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält und gleichzeitig die Fähigkeit besitzt, L-Alanin zu assimilieren und im wesentlichen D-Alanin nicht zu assimilieren.
• In der vorliegenden Erfindung umfassen Hefen, die D-Alanin im wesentlichen nicht assimilieren, jene Hefen, die nur eine so geringe Menge an D-Alanin assimilieren, daß die Wirkung der vorliegenden Erfindung nicht im wesentlichen verloren geht oder jene Hefen, die D-Alanin ohne Vorhandensein von L-Alanin assimilieren, nachdem g-Alanin vollständig assimiliert wurde.
• Es werden beispielsweise verwendet: Candida humicola ATCC 36992, Candida rugosa ATCC 10571, Saccharomycopsis lipolytica ATCC 20306, Saccharomycopsis lipolytica IFO 0717, Cryptococcus laurentii ATCC 36832, Torulopsis candida ATCC 20284, Torulopsis glabrata IFO 0005, Pichia burtonii ATCC 20279, Pichia pastoris IFO 0948, Hansenula polymorpha ATCC 26012, Hansenula capsulata ATCC 16753, Trichosporon beigelii ATCC 36993.
• Obige ATCC-Nummern sind die Registrierungsnummern von Hinterlegungen bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, und die IFO-Nummern sind die Registrierungsnummern von Hinterlegungen am Institute of Fermentation, 17-35, Jusanbon-machi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaki-shi, Osaka 532, Japan.
• Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Züchtung in einem Medium, das im wesentlichen DL-Alanin als kombinierte Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält. Somit wird beim Verfahren als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle im Medium DL-Alanin verwendet, doch geringe Mengen anderer Kohlenstoffquellen (wie z. B. Glukose) und/oder Stickstoffquellen können auch bis zu einem solchen Ausmaß enthalten sein, daß die Wirkung der vorliegenden Erfindung nicht verloren geht, nämlich in einer Menge von weniger als 10 g/l.
• Es ist vorzuziehen, daß die Menge enthaltener Glukose so gering wie möglich ist, da die Assimilierungsrate von L-Alanin sinkt, wenn Glukose in einer Menge von 10 g/l oder mehr im Kulturmedium als kohlenstoffquelle vorhanden ist.
• Im Kulturmedium können je nach verwendetem Mikroorganismus Salze von Metallionen hinzugefügt werden. Als Beispiele für Metallionen seien Na&spplus;, K&spplus;, Ca²&spplus;, Mg²&spplus;, Fe²&spplus;, Ni²&spplus;, Zn²&spplus;, Co²&spplus;, Mn²&spplus; usw. angeführt. Die Salze verschiedener anorganischer Säuren wie z. B. der Schwefelsäure, Salzsäure, Phosphorsäure usw. dieser Metallionen können verwendet werden.
• Die Konzentration von DL-Alanin im Medium beträgt 60 bis 200 g/l. Ist die Konzentration von DL-Alanin niedrig, verschlechtert sich die produktive Wirksamkeit. Ist die Konzentration hingegen hoch, verlängert sich die Züchtungszeit, und das Wachstum der Mikroorganismen kann unterbrochen werden.
• Die gesamte Menge an DL-Alanin kann dem Kulturmedium von Beginn an zugeführt werden, doch da sich beim Ansteigen der Konzentration das Wachstum von Mikroorganismen verlangsamt und sich die Züchtungszeit daher verlängert, ist eine Züchtung unter fließender Zugabe vorzuziehen, bei der die Anfangskonzentration 20 bis 50 g/l beträgt und das restliche DL-Alanin in Teilmengen zugeführt wird.
• Das Züchten erfolgt im sauren Zustand, d. h. bei einem pH-Wert von 6,5 oder weniger. Im Kulturmedium wird der pH-Wert bei Beginn des Züchtens üblicherweise auf 5 eingestellt, doch der pH-Wert nimmt mit Fortdauer des Züchtens zu. Da die Gewinnungsrate von D-Alanin abnimmt, wenn die Züchtung so belassen wird, wie sie ist, ist es erforderlich, den pH-Wert in den sauren Bereich zu bringen.
• Man nimmt an, daß der Grund, warum die Gewinnungsrate von D-Alanin abnimmt, wenn der pH-Wert alkalisch wird, darin liegt, daß D-Alanin assimiliert wird, da Alaninracemase oder D-Alaninaminotransferase aktiviert wird.
• Ausgehend von diesen Gründen wird der pH-Wert während des Züchtens üblicherweise auf 4 bis 6,5, vorzugsweise 4,5 bis 6,0 eingestellt. Als Säure für die Einstellung ist z. B. eine wässerige Lösung einer anorganischen Säure wie z. B. Phosphorsäure, Schwefelsäure oder Salzsäure vorzuziehen.
• In einem veröffentlichten Abstract von Oshima et al., siehe oben, wurde der Schluß gezogen, daß der selektive Abbau bei einem hohen pH-Wert während des Züchtens eintrat und sich die Selektivität bei einem niedrigen pH-Wert eher verschlechterte. In Fig. 4 wurde im oben angeführten vollständigen Artikel ein Beispiel gezeigt, bei dem der selektive Abbau durch Torulopsis famata bei einem pH-Wert von 8,5 abgeschlossen war.
• Wenn der pH-Wert - wie beim erfindungsgemäßen Verfahren - während des Züchtens 6,5 oder weniger beträgt, wo herkömmliche Bakterien kaum wachsen, liegt ein Vorteil darin, daß die Kontaminierung mit Saprophyten während des Züchtens kaum auftritt.
• Die Züchtungstemperaturen liegen üblicherweise bei 20 bis 40ºC, vorzugsweise bei 25 bis 35ºC. Die Züchtung erfolgt unter Rühren und Belüftung. Die Menge an Luftzufuhr beträgt üblicherweise 0,5 bis 2,0 vvm, vorzugsweise 0,6 bis 1,2 vvm. Wenn die Menge an zugeführter Luft zu gering ist, besteht die Tendenz, daß die Assimilierungsgeschwindigkeit von L-Alanin gering wird. Wenn die Menge zu groß ist, ändert sich die Wirkung nicht, doch es ist in diesem Fall nicht wünschenswert, daß die Konzentration des Kulturmediums höher ist; darüber hinaus tritt heftiges Schäumen auf, da das Verdampfen des Kulturmediums eher beschleunigt wird.
• Das Züchten ist üblicherweise abgeschlossen, wenn L-Alanin vollständig assimiliert ist. Eine vollständige Assimilierung von L-Alanin kann man durch überwachen der Menge an gelöstem Sauerstoff oder durch Analysieren der Menge an D-Isomer und L-Isomer von Alanin feststellen. Eine Säure wird zum Neutralisieren von Ammoniak hinzugefügt, der durch Assimilierung von L-Alanin während des Züchtens entsteht, doch die Zugabe der Säure ist nicht mehr erforderlich, nachdem die Assimilierung von L-Alanin abgeschlossen ist. Daher kann sie auch durch überwachen der Menge an hinzugefügter Säure festgestellt werden.
• Da D-Alanin nach vollständiger Assimilierung von L-Alanin auch allmählich assimiliert wird, ist es in einigen Fällen wünschenswert, daß der Endpunkt der Züchtung klar ermittelt wird.
• Nach dem Entfernen der Zellen aus der Kulturbrühe, die solcherart mittels eines zentrifugalen Trennverfahrens gewonnen wird, wird D-Alanin durch ein herkömmliches Verfahren abgetrennt.
• Alanin wird z. B. an einem Ionenaustauschharz "SK-1B" (hergestellt durch Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd.) adsorbiert, indem das Medium durch das Harz hindurchgeschickt und danach gut ausgewaschen wird. Dann wird Alanin mit einer wässerigen Ammoniaklösung eluiert und das Eluat eingeengt. Raffiniertes D-Alanin kann man durch Umkristallisieren des so erhaltenen D-Alanins mit Wasser gewinnen.
• Die vorliegende Erfindung zeigt die folgenden Ergebnisse.
• (1) D-Alanin kann aus DL-Alanin in hoher Ausbeute gewonnen werden, nämlich mit einer fast theoretischen quantitativen Menge.
• (2) Darüber hinaus kann man D-Alanin in hoher Ausbeute gewinnen, indem eine hohe Konzentration an DL-Alanin einer Kulturbrühe zugeführt wird, ohne das Wachstum von Stämmen zu hemmen und die Fähigkeit zu selektivem Abbau zu verringern.
• (3) Weiters wird verbrauchtes L-Alanin hauptsächlich in Kohlendioxid und Wasser umgewandelt, und es sind im wesentlichen weder organische Nebenprodukte noch organische Verunreinigungen in der Kulturbrühe vorhanden. Daher ist es leicht, D-Alanin abzutrennen und zu raffinieren.
• (4) D-Alanin kann wirkungsvoll gewonnen werden, da die zum Züchten und Assimilieren einer Hälfte von DL-Alanin erforderliche Zeit verkürzt werden kann.
• (5) Da das Züchten unter einer sauren Bedingung mit einem pH-Wert von 6,5 oder weniger erfolgt, tritt während des Züchtens kaum eine Kontaminierung mit Saprophyten auf.
• Es folgt eine konkrete Beschreibung der vorliegenden Erfindung anhand von Beispielen.
• In den Beispielen erfolgt die DL-Analyse von Alanin durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (nachstehend als "HPLC" bezeichnet). Die Probe wird durch Verestern von Alanin als Pulver mit Methanol-Salzsäure und Umsetzen mit 3,5-Dinitroonenyiisocyanat hergestellt. Die Analysebedingung von HPLC ist wie folgt:
• Säule: OA-1000 (Sumitomo Chemical Co., Ltd.)
• Mobile Phase: n-Hexan : Dichlormethan : Aethanol (20 : 8:1)
• Fließrate: 1 ml/Min.
• Detektor: UV 254 nm
Beispiel 1
• 50 ml eines Mediums, das 30 g/ l getrockneter Bouillon (pH-Wert 6,0) enthielt, wurde geteilt in einen 1l-Erlenmeyer-Kolben gegossen und 20 Minuten lang bei 120ºC sterilisiert, um ein Medium zum Züchten von Spezies zu bilden. Eine Platinöse Candida humicola ATCC 36992 wurde auf das Medium aufgeimpft und unter Schütteln bei 30ºC einen Tag lang gezüchtet. Anderseits wurde 1 l eines Mediums (pH-Wert 5,0), das 100 g/l DL-Alanin, 2 g/l Kaliumhydrogenphosphat, 0,5 g/l Magnesiumsulfat und 0,5 g/l Pulverhefeextrakt enthielt, in einen 3 l-Minigefäß-Fermentor gefüllt und sterilisiert, um ein Hauptkulturmedium zu bilden. Die oben beschriebene Kulturbrühe wurde darauf beimpft und unter Rühren und Luftzufuhr von 1,0 vvm bei 30ºC gezüchtet. Während des Züchtens wurde der pH-Wert mit 2 N Schwefelsäure auf 5,0+0,1 eingestellt. L-Alanin wurde etwa 70 Stunden lang vollständig assimiliert; man erhielt 1,2 der Kulturbrühe, die 48 g D-Alanin und 35 g Ammoniumsulfat enthielt.
• Nach dem Entfernen der Zellen aus dieser Kulturbrühe mittels eines Zentrifugenseparators bei 10.000 U/Min. über einen Zeitraum von 10 Minuten wurde D-Alanin an einem Ionenaustauschharz SK-1B (H-Typ) adsorbiert, indem das Medium durch eine mit dem Harz bepackte Säule hindurchgeschickt wurde. Nach dem gründlichen Auswaschen der Säule mit Wasser wurde D-Alanin mit 4% wässeriger Ammoniaklösung eluiert. Dieses Eluat wurde unter verringertem Druck eingeengt, um 45 g D-Alanin zu erhalten. Die optische Reinheit betrug laut Analyse durch HPLC 99,6% je oder mehr. Die chemische Reinheit betrug 99,4%.
Beispiel 2
• In diesem Fall wurde unter den in Beispiel 1 dargestellten Verfahrensweisen die Konzentration von DL-Alanin im Hauptkulturmedium gut 80 g/l geändert; die anderen Verfahrensweisen waren die gleichen wie -ne von Beispiel 1. Das Züchten war nach etwa 35 Stunden abgeschlossen, und man gewann etwa 1,2 l der Kulturbrühe, die 38 g D-Alanin und 28 g Ammoniumsulfat enthielt.
• Nach dem Entfernen der Zellen aus dieser Kulturbrühe mittels eines Zentrifugenseparators erfolgte ein Salzaustauschvorgang durch Hinzufügen und Verrühren von 18,3 g Kalziumhydroxid über einen Zeitraum von etwa 2 Stunden. Diese Suspension wurde unter verringertem Druck auf etwa ein Drittel der ursprünglichen Menge eingeengt und danach, um anorganische Salze zu entfernen, gefiltert. Eine geringe Menge an Metallionen wurde an einem Ionenaustauschharz SK-1B (Ammoniumtyp) absorbiert, indem das Filtrat durch eine mit dem Harz bepackte Säule hindurchgeschickt wurde. Das Eluat und die Waschflüssigkeit der Säule wurden kombiniert und die kombinierte Lösung wurde eingeengt, um D-Alanin herauszukristallisieren. 32 g raffiniertes D-Alanin wurden auf diese Weise gewonnen.
• Die optische Reinheit und die chemische Reinheit betrugen 99,9% ee bzw. 99,9%.
Vergleichsbeispiel
• Eine Züchtung erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie bei den Verfahrensweisen von Beispiel 2, mit der Ausnahme, daß 10 g/l Glukose dem Hauptkulturmedium hinzugefügt wurden. Die Züchtung war nach etwa 54 Stunden abgeschlossen, und man erhielt etwa 1,2 l des Kulturmediums, das 32 g D-Alanin und 29 g Ammoniumsulfat enthielt. Die Feststoffe, die durch Behandeln von 50 ml dieses Kulturmediums mittels der gleichen Verfahrensweisen wie in den vorhergehenden Beispielen gewonnen wurden, wurden durch HPLC analysiert. Die optische Reinheit des solcherart erhaltenen D-Alanins betrug 99,6% ee oder mehr.
• Industriell eignet sich D-Alanin für ein medizinisches Ausgangsmaterial oder ein Ausgangsmaterial des Süßstoffes "Alithame".

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von D-Alanin durch Züchten einer Hefe in einer Kulturbrühe und Gewinnen des D-Alanins aus der Kulturbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefe den Gattungen Candida, Saccharomycopsis, Pichia, Torulopsis, Cryptococcus, Hansenula oder Trichosporon angehört und die Fähigkeit besitzt, L-Alanin zu assimilieren und D-Alanin nicht zu assimilieren, und die Kulturbrühe einen pH-Wert von 6,5 oder weniger aufweist, als kombinierte Quelle sowohl von Kohlenstoff als auch von Stickstoff in einer Menge von 60 bis 200 g/l verwendetes DL-Alanin enthält, und von 0 bis unter 10 g/l einer zusätzlichen Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Hefe der Spezies Candida humicola oder Candida rugosa angehört.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Züchten bei einem pH-Wert von 4 bis 6,5 ausgeführt wird.