DE2152039A1

DE2152039A1 - Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellmasse

Info

Publication number: DE2152039A1
Application number: DE19712152039
Authority: DE
Inventors: Shigeo Abe; Mamoru Kohata
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1970-10-28
Filing date: 1971-10-19
Publication date: 1972-05-04
Also published as: JPS4937274B1; DE2152039B2; US3764476A; CA978116A; DE2152039C3; FR2113220A5; GB1349018A

Description

" Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellmasse " Priorität: 28. Oktober 1970, Japan, Nr. 9*329/70

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellmasse durch Züchten eines Methanol-assimilierenden Bakteriums in einem Methanol-haltigen Nährmedium.

Bisher· sind Mikroorganismen bekannt, die unter Verwendung von Methanol als einziger Kohlenstoffquelle bis zu einem gewissen Grad wachsen können. Es sind jedoch bisher keine Methanolassimilierenden Bakterien bekannt, die in einem Methanol-haltigen Nährmedium ein ausgezeichnetes* V/achstum zeigen.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein-neues Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellmasse durch Züchten von Bakterienstämmen in einem Methanol-haltigen Nährmedium zur Verfügung zu stellen, bei dem Bakterienzellmasse mit guten-Ausbeuten hergestellt werden kann. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellmasse, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Methanol-assimilierenden Bakterien stamm der Art Protaminobacter ruber in einem wässrigen, Jiethanol als Hauptkohlenstoff guelle enthaltenden Nahrmedium . unter kontrollierter Methanolzugabe züchtet und die Bakterienzellen aus der Gärmaische in an sich bekannter V/eise abtrennt.

Fach dem erfindungsgemässen Verfahren gelingt es, Bakterienzellmasse oder Komponenten von Bakterienzellen, wie Proteine * und Carotinoide« die als Arzneimittel oder Nahrungsmittel dienen, in grossem Masstab und mit guten Ausbeuten herzustellen. Als Hauptkohlenstoffquelle dient im erfindungsgemässen Verfahren das billig erhältliche Methanol.

lie Erfindung beruht auf der Feststellung, dass die zur Art

ruber

Protaminobacter/gehörenden, Methanol-assimilierenden Bakterienstämme" in einem Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden 'Nährmedium ausgezeichnet wachsen,

P Im erfindungsgemässen Verfahren können sämtliche Methanol—

ruber assimilierenden Stämme der Art Protaminobacter/eingesetzt wer-

ruber den. Vorzugsweise werden Stämme der Art Protaminobacter/var. machidanus, einer s"ö~bezeichneten und neu aufgefundenen Variante von Protaminobacter ruber eingesetzt. Insbesondere werden im erfindungsgemässen Verfahren die Stämme Protaminobacter ruber var. machidanus ATCC 21611 (G-253), ATCC 21612 (G-254)* ATCC 21613 (G-257) und ATCC 21614 (G-259) eingesetzt. Sämtliche dieser Stämme wurden aus dem Boden isoliert.

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Die mikrobiologischen Eigenschaften der Stämme Protaminobacter ruber var. machidanus ATCC 2l6ll, ATCC 21612, ATCC 21613 und ATCC 21614- sind nachstehend zusammengestellt:

Morphologie

(A) Mikroskopische Beobachtungen
(Methanol-haltiges synthetisches Agarmedium)

(1) Form: gewöhnlich einzelne oder paarige Stäbchen,

manchmal werden verzweigte Zellen festgestellt

(2) Grosse: 0,5 bis 0,8 auf 2 bis 3 u

(3) Gramfärbung: negativ.

(4) Beweglichkeit: ja

(5) Begeisselung: eine polar angeordnete Geissei

(6) Sporen: keine

(B) Agar-Kolonien

(Methanol-haltiges, synthetisches Agarmedium, 4 Tage, 30⁰C):

(1) Form: kreisförmig (Durchmesser: 1 bis 2 mm) ^

(2) Oberfläche: glatt

(3) Rand: vollständig ■

(4) Erhebung: eben

(5) Schimmer: glänzend bis matt - *

(6) Farbe: rosa

(C) Agar-Kolonien

(Bouillon-Agar-Medium)

Kein besonders gutes Wachstum
Rötliche, kleine Kolonien

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!Physiologische Eigenschaften;

(1) Wachstums- gutes Wachstum bei Temperaturen von 25 bis temperatur: 35⁰G, Wachstum bei Temperaturen von 20 bis ■■· ;■-■- 40°C möglich

(2) Prr-Bereichi gutes Wachstum im Pjj-Bereich von 6,5 bis 8,0,

Wachstum im p„—Bereich von 6 bis 9 möglich

(3) Reduktion von -

• Nitratent positiv

(4) Katalase: positiv

(5) Verwertung von Stickstoffquellen:

Jeder der vorgenannten vier Stämme kann Ammoniumsalze, .Nitrate, Harnstoff und Aminosäuren verwerten«

(6) Verwertung von Kohlenstoffquellen:

Jeder der vorgenannten vier Stämme kann Methanol, Glucose, Glycerin, Essigsäure und Äthanol verwerten. Monomethylamin kann, von den Stämmen ATCC 21612, ATCC 21613 und ATCO 2163-4 j jedoch nicht von dem Stamm'ATCC 21611 -verwertet werden. Bernsteinsäure kann von den Stämmen ATCC 21611 und ATCC 21614, jedoch nicht von den"Stämmen ATCC 21612 und ATCC 21613 verwertet werden. Citronensäure kann von keinem der vorgenannten vier Stämme verwertet werden. Oxalsäure kann von dem Stamm ATCC 21613, jedoch nicht von den Stämmen . ATCC 21611, ATCC 21612 und ATCC 21614 verwertet werden.

Das zur Züchtung der vorgenannten Stämme verwendete Nährmedium hat die folgende Zusammensetzung:

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Methanol (nicht sterilisiert) MH₄NO₃

MgSO₄.7H₂O PeSO₄.7H₂O

CaCl₂ CaCO₅ Maisquellwasser destilliertes Wasser

20 ml 3,0 g

V g

1,3 g

1,0.g

20 mg 10 mg

20,0 mg

0,5 g 1000 ml

"Das.A'earmeäiüm . wird, durch Zusatz von 20 g Agar/Liter · hergestellt.

Die Identifizierung der vier vorgenannten Stämme mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften wurde gemäss Bergey's Manual, of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, vorgenommen, und es wurde festgestellt, dass die vier Stämme anscheinend zur Gattung Protaminobacter gehören. Unter den Arten der Gattung Protarainobacter haben die vorgenannten vier Stämme fast die gleichen Eigenschaften wie di-e zur Art Protaminobacter ruber gehörenden Stämme. Da jedoch die erfindungsgemäss.eingesetzten Stämme keine Citronensäure verwerten können und auf Methanol auggezeichnet wachsen, wurden sie als Variante von

ruber
Protaminobaoter/bestimmt und als Protaminobacter ruber var· machidanus bezeichnet.

Wie bereits erwähnt, können die vorgenannten vier Stämme auf „ Methanol als einziger Kohlenstoffquelle wachsen. Biese Stämme

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können ferner auf einem Bouillon-Agar-Medium wachsen, das kein Methanol enthält.

Die im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Stämme sind ferner dadurch charakterisiert, dass sie, wenn dem Nährmedium während des Züchtens das Methanol nach und nach zugesetzt wird, eine Ausbeute von bis 50 g Zellmasse/Liter, ausgedrückt als Trockengewicht, ergeben. Es ist eine neue Feststellung, die bisher von anderen Methanol-assimilierenden Bakterien nicht be-, kannt ist, dass die im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Stämme auf Methanol als Hauptkohlenstoff ^u <-lle in so. vorzüglicher Weise wachsen.

Die Züchtung der Bakterien wird im erfindungsgemässen Verfahren vorzugsweise unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von vorzugsweise 20 bis 40 C durchgeführt. Das verwendete Nährmedium . enthält als Kohlenstoffquelle geeignete Mengen von Methanol, organische oder anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Harnstoff,· Ammoniak, Ammoniumchlorid und Nitrat, oder natür— liehe, stickstoffhaltige Substanzen, wie; Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt und Pepton, als Stickstoffquelle, Phosphate, wie Kaliumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat,verschiedene anorganische Salze}, wie Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisen(ll)-sulfat, Zinksulfat und Calciumchlorid, und Wuchsstoffaktoren. Die vorgenannten' vier Stämme benötigen für ihr Wachstum keinen besonderen Zusatz von Vitaminen. Durch ..den Zusatz von natürlichen, organischen Substanzen, wie Hefeextrakt, Fleischextrakt und Maisquellwasser, wird jedoch die " Ausbeute an Bakterienzellmasse erhöht. Der p„-Wert des Nährme-

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diums wird während des Ztichtens vorzugsweise innerhalb eines Bereiches gehalten, in dem der erfindungsgemäss eingesetzte Stamm wachsen kann, d.h. innerhalb eines p„-Bereiches von 6 bis 9» du der p_H-Wert des Nährmediüms während des Züchtens beträchtlich erniedrigt wird.

Eine grosse Ausbeute an Bakterienzellmasse kann erfindungsgemäss dadurch erhalten werden, dass man dem flüssigen Nährmedium während des Züchtens das Methanol nach und nach in solchen Mengen zusetzt, die das Wachstum des betreffenden Stammes nicht hemmen. Auf diese Weise lässt sich die Ausbev.tt- an Bakterienzellmasse beträchtlich erhöhen. Das Methanol kann dem Nährmedium während des Züchtens kontinuierlich oder diskontinuierlich zugesetzt werden, wobei jedoch die Methanolkonzentration im Nährmedium auf einem Wert gehalten werden muss, bei dem das Wachstum der erfindungsgemäss eingesetzten Stämme nicht gehemmt wird. Obwohl die Art der Methanolzugabe vom eingesetzten Bakterienstamra, der Zusammensetzung des Nährmediums und verschiedenen anderen Züchtungsbedingungen abhängt, wird das Methanol vorzugsweise kontinuierlich oder diskontinuierlich so zugegeben, dass die Methanolkonzentration im Nährmedium nach der Zugabe unterhalb von 6,0 Prozent (v/v) gehalten wird. So kann z.B. das Methanol dem Nährmedium kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,2 bis etwa 1,0 Prozent (v/v) pro Stünde zugesetzt werden, nachdem der erfindungsgemäss eingesetzte Stamm 1 Stunde in einem Nährmedium gezüchtet wurde, dem anfänglich etwa 0,1 bis 6,0 Prozent (v/v) Methanol zugesetzt worden war.

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Nach beendeter Züchtung wird die Gärmaische zentrifugiert und die erhaltene Zellmasse mit Wasser, gewaschen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiell

Es wird ein Nährmediμm folgender Zusammensetzung hergestellt: Methanol (nicht sterilisiert 20 ml

NH₄NO₃ ■ . 4,0 g

. KH₂PO₄ " · '1,Og

Na₂HPO₄ 2,6 g

MgSO₄.7H₂O . 1,0 g

. PeSO₄.7H₂O ' 20 mg

CaCl₂ 10"- mg

MnSO₄.4H₂O · 5 mg

Maisquellwasser 0,5 g

destilliertes Wasser ' 1000 ml

• P_H 7,0 · · - ' ,.

In Teströhrchen werden jeweils 10 ml dieses Nahrmediums gege-P ' ben. Die Teströhrchen werden mit den in der Tabelle I aufge- ' führten Stämmen in üblicher Weise beimpft·. Die Stämme wurden zuvor in einem Agar-Schrägröhrchen gezüchtet, das einen synthetischen, Methanol-haltigen Nährboden enthielt. Die Züchtung in dem flüssigen Nährmedium wird 2 Tage bei 30°C durchgeführt. Die er-' haltenen Mengen an Bakterienzellmasse sind in der Tabelle I zusammengestellt:

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Tabelle I

eingesetzter Stamm

Bakterienzellmasse,

ausgedrückt als

g Trockenmasse/Liter

Protaminobacter	ruber	ATCC	8457	1	,6 ; · ■
Protaminobacter (ATCC 21611)	ruber	var.	machidanus	5	,3
Protaminobacter (ATCC 21612)	ruber	var.	machidanus	7

Protaminobacter ruber var. machidanus (ATCC 21613) ' ■

Protaminobacter ruber var. machidanus (ATCC 21614)

6,0

5,4

Beispiel

Es wird ein Nährmedium mit folgender Zusammensetzung herge<stellt:

1,0 g ··

2,6 g mg mg

5 mg 3,0 g g ml

KH₂PO₄"
Na₂HPO₄

_r7H₂0
CaCl₂

MnS0_A.4Hp0
Maisquel!wasser
CaCO₅

destilliertes Wasser P₁₁ 7,0

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Jeweils 20 ml dieses Nährmediums werden in 250 ml fassende Erlenmeyer-Kolben gegeben. Die Kolben werden v/ie in Beispiel 1 beschrieben, mit den in der nachstehenden Tabelle II aufgeführten Stämmen beimpft» Das Nährmedium wird am Beimpfungszeitpunkt mit einer Methanolmenge versetzt, die 2 Prozent (τ/ν), bezogen auf das Ausgangsvolumen, entspricht. Am 2. Tag wird das Nährmedium mit einer 1 Prozent (v/v) und am 3. Tag mit einer 2 Prozent (v/v) entsprechenden Methanolmenge versetzt. Die Züchtung wird 5 Tage unter Schütteln bei 30 C durchgeführt. Die gesamte zugesetzte Methanolmenge entspricht also 5 Volumprozent. Die auf diese Weise erhaltenen Mengen an Zellmasse sind in der Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

eingesetzter Stamm

Bakterienzellmasse, ausgedrückt in g Trockenmasse/Liter

Protaminobacter ruber var. (ATCC 216.11)	machidanus	10,3
Protaminobacter ruber var. (ATCC 21612) .	machidanus	11,5
Protaminobacter ruber var, (ATCC 21613)	machidanus	12., 2
Protaminobacter ruber var. (ATCC 21614)	machidanus	•9,4 .

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- li - .

Beispiel 3

Die Stämme Protaminobacter ruber var. machidanus ATCC 21611 und ATCC 21613 werden in 5 Liter fassende Glasfermenter eingeimpft, die jeweils 3 Liter eines Nährmediums folgender Zusammensetzung enthalten: ' . Methanol (nicht sterilisiert 10 ml KH₂PO₄ ■ 1,Qg Na₉HPO, 2,6g (NH₄)₂SO₄ · 5,0 g FeSO..7H₉O 50 mg CaCl₂ 50 mg MnSO..4H₉O . 10 mg Maisquellwasser .5 g Leitungswasser ' 1000 ml P_H 7,0

Das Züchten wird unter Rühren und unter Belüftung bei 30 C durchgeführt. .Während des Züchtens wird-das Nährmedium mit wässriger Ammoniaklösung versetzt, um das durch das Wachstum des betreffenden Stammes bedingte Absinken des Pjr-V/ertes zu verhindern und den p„-Wert auf diese Weise zwischen 6 Und zu halten. Wenn der Pjj-Wert des Nährmediums mit vollständigem Verbrauch des Methanols ansteigt, wird das Nährmedium mit soviel Methanol versetzt, dass dessen Konzentration 1 Prozent (v/v) beträgt. Nach 40stündigem Züchten und anschliessendem Aufarbeiten werden bei einer Gesaiatzugabe von Methanol von 20 Vo-

_ nus

lumprpζent bei Verwendung von Protaminobacter ruber var.machidaA ATCC 21 611 A-I g Bakterientrockenmasse pro Liter erhalten. Im Falle der Verwendung von Protaminobacter ruber var, machidanus

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ATCG 21613 werden 38 g Bakterientrockenmasse/Liter "bei einer Gesamtzugabe von jj;?. Vfilumprozent Methanol erhalten. ..-_..

Beispiel 4-

Die Züchtung wird gemäss Beispiel 3 durchgeführt, mit der-Ausnahme, dass das Methanol dem Nährmedium 10 Stunden nach dem-Animpfen mit einer Geschwindigkeit von 0,5 bis 0,7 Prozent (v/v) pro Stunde kontinuierlich zugesetzt, das Züchten bei 35°C durchgeführt und der ρττ-Wert des Nährmediums auf 7>0 gehalten wurde. Nach 45stundiger Züchtung werden bei einer Gesamtzugabe von 22 Volumprozent Methanol bei Verwendung von Protaminobacter ruber var. machidanus AIDCC 21611 50 g/Liter und bei Verwendung von I'rotaminobacter ruber var.. machidanus ATCC 21613 4-6 g/Liter Bakterientrockenmasse erhalten.

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Claims

2f5203t ■ ■ · P _al t e ii, t ,a rig ρ . r u ehe - ' ■

1. ' Verfahren zur Herstellung vom" Bafcter'ieMzellmasse, ^-d a durch g e k e η η ζ e i e h π e t, dass maß¹ einen Me than σΐ-assimilierendeh BakterienstäiJim der lit- Prdtaffiinöbacter rub-e-r. in einem wässrigen, Methanol als Hatiptköhlehstöffquelle enthaltenden Kährmedium unter fcontröliierter Methanolzugabe züchtet'und' die Bakterienze'llen' aus der Gärfliaisehe in an sich bekannter Weise abtrennt, .

2. Verfahren nach Anspruch l_r dadurch gekennzeichnet, dass man das Verfahren mit i'rOtäntinobacter¹ ruber var. fflachidanus ATCO 21611, ATCG 21612, ATCC 21613 oder ATCC 21614 durchführt.'

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,

nach und-^ nach

dass man das Uährmedium während des Züchtens^mit solchen Methanolmengen versetzt, dass das Wachstum des eingesetzten Stammes nicht gehemmt wird.

,

4. Verfahren^ nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,

während des Züchtens mit insgesamt dass man das Nährraediüm V etwa 2 bis etwa· 30 Volumprozent ■ Methanol, bezogen auf das Volumen des Nährmediums, versetzt.· .

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Nährmedium diskoiitinuierlich mit soviel Methanol versetzt, dass die Methanoikonzentration im Uährmedium nach der Zugabe unterhalb von 6,0 Prozent (v/v) gehalten wird.

.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Nährraedium kontinuierlich mit Methanol mit einer Geschwindigkeit von pro Stunde etwa 0,2 bis etwa 1,0 Volumpro-

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ζent;, bezogen auf das Volumen des Nährmediums, versetzt.-, nach— dem der betreffende Stamm I Stunde in einem anfänglich etwa

Methanol.

0,1 bis 6,0 Völumprazent/enthaltenden Nährmedium: gezüchtet wurde. .

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gefeennzeichnLetv dass man das Zilöhten bei Temperaturen von 20 bis 4-0°C durch-' führt und den p„—Wert während des Zuchtexis im Bereich von.etwa 6 bis 9 hält.

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