DE69704900T2

DE69704900T2 - Verfahren zur Herstellung von Aspartase und L-Asparginsäure

Info

Publication number: DE69704900T2
Application number: DE69704900T
Authority: DE
Inventors: Kuniki Kino; Junichi Takano
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-18
Publication date: 2001-10-25
Anticipated expiration: 2017-03-19
Also published as: DK0798377T3; EP0798377A3; TW487733B; AU1650697A; EP0798377A2; AU708588B2; ATE201443T1; PT798377E; ES2159372T3; CA2200420A1; EP0798377B1; KR970065723A; US5916782A; DE69704900D1; CN1165860A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Aspartase mit einem Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört und Aspartase produzieren und anreichern kann, sowie ein Verfahren zur Produktion von L-Asparaginsäure mit der Aspartase.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es gibt bisher viele Berichte in Bezug auf Verfahren zur Herstellung von L- Asparaginsäure aus Fumarsäure und Ammoniak mittels Aspartase, wie sie von Mikroorganismen produziert wird (japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldungen Nr. 54-12553 und 57-18867). Als solche Mikroorganismen kennt man diejenigen, die zu den Gattungen Escherichia und Corynebacterium gehören, und es wurden bisher einige Versuche unternommen, mit Hilfe genetischer Rekombinations-Technologie (japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldungen Nr. 60-133883 und 5-30977) Mutanten mit hoher Aspartase-Produktivität zu erhalten.
Bei dem Verfahren zur Herstellung von Aspartase in großer Menge mit diesen Mikroorganismen der Gattungen Escherichia und Corynebacterium wird als Nährquelle die teuere Fumarsäure verwendet. Bei dem Verfahren zur Herstellung von Aspartase mit Hilfe einer Transformante mit hoher Aspartase-Produktivität, wie sie durch genetische Rekombination erhalten wird, werden Antibiotika zu den Anzuchtmedien gegeben, damit die Stabilität der Aspartase-Produktivität der Transformante gewährleistet ist.
Wenn ein Mikroorganismus vom Typ, der zur Produktion und zur Anreicherung von Aspartase zusammen mit Fumarase befähigt ist, zur Produktion von Aspartase verwendet wird, und diese Aspartase zur Herstellung von L-Asparaginsäure verwendet wird, dann werden bekanntlich aufgrund der Fumarase einige andere Nebenprodukte als L- Asparaginsäure produziert, so dass die Ausbeute der angestrebten L-Asparaginsäure gesenkt wird. Die Verringerung der Ausbeute von L-Asparaginsäure wird verhindert, indem das System nach der Produktion von Aspartase hitzebehandelt oder mit Säuren behandelt wird, so dass die Fumarase-Aktivität aus dem System entfernt wird (Kagaku Kogyo 58 (1994) 878; japanische veröffentlichte geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 3-55103).
Die Verfahren des Standes der Technik sind insofern problematisch als Verfahren, bei denen zur Produktion großer Mengen Aspartase Mikroorganismen eingesetzt werden, die Aspartase produzieren können, teure Fumarsäure als Nährquelle benötigen; Verfahren, bei denen Transformanten mit hoher Aspartase-Produktivität, wie sie durch genetische Rekombination erhalten werden, verwendet werden, erfordern, dass Antibiotika zu den Anzuchtmedien gegeben werden, damit die Stabilität der Aspartase-Produktivität der Transformante gewährleistet ist; und bei Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure mittels Mikroorganismen, die neben der gewünschten Aspartase Fumarase produzieren und anreichern können, die Produktion von Nebenprodukten außer der beabsichtigten L- Asparaginsäure unvermeidlich ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Aspartase, umfassend das Züchten eines Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört und zur Produktion von Aspartase befähigt ist, in einem Medium, bis Aspartase in der Kultur produziert und angereichert ist, und das Gewinnen der Aspartase daraus, wobei die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Medium in dem Stadium, in dem sich das Mikrobenwachstum in der mittleren und/oder späten logarithmischen Wachstumsphase befindet, im Bereich von 0 bis 1 ppm liegt; sowie ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure, umfassend das Umsetzen von Fumarsäure und Ammoniak zu L-Asparaginsäure in einem wässrigen Medium in Gegenwart einer Enzymquelle, wobei die Enzymquelle eine gemäß dem Aspartase-Produktionsverfahren hergestellte Kultur, aus dieser Kultur isolierte Zellen oder daraus verarbeitete Zellen ist, bereitgestellt.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß lässt sich jeder Mikroorganismus verwenden, so lange er zur Gattung Escherichia gehört, vorzugsweise Escherichia coli, und zur Produktion von Aspartase, insbesondere einer großen Menge Aspartase, befähigt ist.
Gewöhnlich kann Escherichia coli Aspartase produzieren und anreichern. Beispielsweise wird Escherichia coli ATCC-11303 erwähnt.
Der erfindungsgemäß verwendete geeignete Mikroorganismus kann als eine große Menge Aspartase produzierender Mutantenstrang erhalten werden, indem Aspartaseproduzierende Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia gehören, einer herkömmlichen Mutagenese unterworfen werden und die erhaltenen Mutanten gescreent werden und diejenigen ausgewählt werden, die in Minimalmedien, die L-Asparaginsäure als einzige Stickstoffquelle enthalten, schneller wachsen (Appl. Env. Microbiol. 48 (1984) 1072). Diese Mutantenstämme umfassen Escherichia coli EAPc7, Escherichia coli EAPc244, Escherichia coli EAPc28, Escherichia coli EAPc110, Escherichia coli EAPc130 (japanische veröffentlichte ungeprüfte Anmeldung Nr. 60-133883), und Escherichia coli H-9183.
Der erfindungsgemäß verwendete geeignete Mikroorganismus kann durch Verwendung der genetischen Rekombinations-Technologie als Transformante, die eine große Menge Aspartase produziert, erhalten werden. Diese Transformanten umfassen Escherichia coli TA5003, Escherichia coli TA5004 und Escherichia coli TA5005 (japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 60-133883).
Erfindungsgemäß lässt sich Aspartase produzieren, indem ein geeigneter Mikroorganismus gemäß dem nachstehend erwähnten Verfahren gezüchtet wird.
Als Medium kann irgend ein beliebiges natürliches Medium oder synthetisches Medium verwendet werden, so lange es Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Substanzen und andere für den Mikroorganismus benötigte Nährstoffe, usw. enthält, die von dem verwendeten Mikroorganismus assimiliert werden können, und der Mikroorganismus effizient darin gezüchtet werden kann.
Als Kohlenstoffquelle lassen sich Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Melassen, die diese enthalten, und sogar Stärke und Stärkehydrolysate; organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure; Milchsäure und Propionsäure; und Alkohole, wie Ethanol, Glycerin und Propanol, usw. verwenden.
Als Stickstoffquelle lassen sich Ammoniak, verschiedene anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat; Amine; andere stickstoffhaltige Verbindungen; Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Bohnenkuchen, Bohnenkuchenhydrolysat, verschiedene gezüchtete Zellen und Abbauprodukte der Zelle usw. verwenden.
Als anorganische Substanz lassen sich Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)sulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, und Calciumsulfat usw. verwenden.
Die Belüftungs- oder Rührbedingungen während der Anzucht beeinflussen das Ausmaß der Aspartaseanreicherung stark.
Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus wird unter aeroben Bedingungen bis zur frühen logarithmischen Wachstumsphase verwendet, anschließend wird er unter einer kontrollierten Belüftungsbedingung gezüchtet, bei der die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Medium von 0 bis 1 ppm reicht, wodurch die Produktion und Anreicherung von Fumarase verringert und die Produktion und Anreicherung der gewünschten Aspartase erhöht wird.
Die Anzucht erfolgt bei einer Temperatur von 20 bis 40ºC, vorzugsweise von 25 bis 37ºC. Der pH-Wert des Mediums liegt im Bereich von 5 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8. Der pH-Wert wird mit Calciumcarbonat, einer anorganischen oder organischen Säure, einer alkalischen Lösung, Ammoniak, einem pH-Puffermittel oder dergleichen eingestellt. Gewöhnlich reichert sich nach 3 bis 24-stündiger Anzucht eine große Menge Aspartase in den Zellen des Mikroorganismus an.
Nach Beendigung der Anzucht wird die Aspartase isoliert und aus der Kultur durch ein herkömmliches Verfahren gereinigt. Die Kultur wird beispielsweise zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, und die Zellen werden gewaschen und mit einem Ultraschallaufbruchgerät, einer French Press, einem Manton-Gaulin-Homogenisator, einer Dyno-Mühle oder dergleichen aufgebrochen, so dass ein zellfreier Extrakt erhalten wird. Der zellfreie Extrakt wird zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wird einem Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder dergleichen, einer Anionenaustausch-Chromatographie mit Diethylaminoethyl(DEAE)-Sepharose oder dergleichen, einer hydrophoben · Chromatographie mit Butylsepharose, Phenylsepharose oder dergleichen, einer Gelpermeation mit einem Molekularsieb oder dergleichen oder einer Elektrophorese, wie einer isoelektrischen Elektrophorese, unterworfen, wodurch ein reines Aspartaseprodukt erhalten wird.
Die Enzymaktivität von Aspartase lässt sich auf die nachstehende Weise bestimmen. Eine Probe wird 60 min bei 37ºC in einer wässrigen Lösung, die Ammoniumfumarat (160 g/Liter, pH-Wert 8,7) und MgCl&sub2; umfasst, inkubiert. Die erhaltene L-Asparaginsäure wird mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestimmt. Die Enzymaktivität von Aspartase ist in Einheiten (units) angegeben, wobei eine Einheit (U, unit) als diejenige Aktivität definiert ist, die zur Produktion von 1 umol L-Asparaginsäure in einer Minute befähigt ist.
Die Fumaraseaktivität lässt sich auf die nachstehende Weise bestimmen.
Eine Probe wird 30 min bei 37ºC in einer wässrigen Lösung, die Natriumfumarat (1 M, pH-Wert 8,0) umfasst, inkubiert. Die erhaltene Äpfelsäure wird mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestimmt. Die Aktivität der Probe, die 1 umol Äpfelsäure in einer Minute produziert ist als eine Unit (U) angegeben.
L-Asparaginsäure kann mit einer Kultur, die Aspartase in einer großen Menge enthält und im vorstehenden Aspartaseproduktionsverfahren erhalten wurde, aus der Kultur isolierten Zellen oder davon verarbeiteten Zellen, als Enzymquelle produziert werden, indem Fumarsäure und Ammoniak zu einem wässrigen Medium gegeben werden, das sich zur Enzymreaktion eignet, so dass L-Asparaginsäure darin produziert und angereichert wird, und indem die angereicherte L-Asparaginsäure daraus gewonnen wird.
Die verarbeiteten Zellen umfassen getrocknete Zellen, gefriergetrocknete Zellen, oberflächenbehandelte Zellen, enzymatisch behandelte Zellen, ultraschallbehandelte Zellen, mechanisch gemahlene Zellen, lösungsmittelbehandelte Zellen, proteinhaltige Fraktionen der Zellen sowie immobilisierte Produkte von Zellen oder verarbeiteten Zellen.
Enzym, das durch Extraktion aus den Zellen gewonnen worden ist und die Enzymaktivität von Aspartase hat, ein gereinigtes Präparat davon und immobilisierte Produkte davon können ebenfalls als verarbeitete Zellen verwendet werden.
Das wässrige Medium umfasst Wasser, Puffer, wie Phosphatbuffer, Carbonatpuffer, Acetatpuffer, Boratpuffer, Citratpuffer und Tris-Puffer und kann einen Alkohol, wie Methanol und Ethanol, einen Ester, wie Ethylacetat, ein Keton, wie Aceton, und ein Amid, wie Acetamid, enthalten.
Die bei dem vorstehenden Verfahren zur Herstellung von Aspartase erhaltene Kultur kann ebenfalls als wässriges Medium eingesetzt werden, und zwar entweder als solches oder nach 1- bis 10-facher, vorzugsweise 2- bis 6-facher Verdünnung.
Die Aktivität der Enzymquelle im Reaktionssystem kann bspw. je nach der eingesetzten Substratmenge bestimmt werden. Die Enzymaktivität im wässrigen Medium reicht gewöhnlich von 10 bis 1000 U/Liter, vorzugsweise 50 bis 300 U/Liter.
Die Fumarsäuremenge im wässrigen Medium reicht gewöhnlich von 50 bis 200 g/Liter.
Die Umsetzung von Fumarsäure mit Ammoniak in einem wässrigen Medium in Gegenwart einer Enzymquelle erfolgt gewöhnlich 0,5 bis 20 Std. bei 10 bis 50ºC und bei einem pH-Wert von 7,5 bis 9,5.
Nach Beendigung der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch mit einer Säure, wie Schwefelsäure oder Salzsäure, versetzt, um den pH-Wert auf 2,7 einzustellen, wodurch die gebildete L-Asparaginsäure auskristallisiert, und die auskristallisierte L-Asparaginsäure wird aus dem Reaktionsgemisch gewonnen.
Die vorliegende Erfindung wird eingehender anhand der nachstehenden Beispiele beschrieben, die den Rahmen der Erfindung jedoch nicht einschränken sollen.

BEISPIELE

Beispiel 1: Herstellung von Aspartase

Escherichia coli ATCC-11303 (ein Wildtyp-Stamm), die zur Produktion von Aspartase befähigt ist, und Escherichia coli H-9183, die von Escherichia coli ATCC-11303 abstammt und zur Produktion einer großen Aspartasemenge befähigt ist, wurden verwendet. Der Stamm H-9183 wurde vom Stamm ATCC-11303 gemäß dem nachstehend erwähnten Verfahren abgeleitet.
Der Stamm ATCC-11303 wurde in einer wässrigen Lösung, die N-Methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidin (0,25 mg/ml) enthielt, 30 Minuten bei 30ºC einer Mutagenese unterworfen. Durch Mutagenese wurden etwa 80000 Stämme erhalten und auf der Basis ihrer Wachstumsraten in einem Minimalmedium, das L-Asparaginsäure als einzige Stickstoffquelle enthielt, gescreent. Unter den so selektierten Stämmen wird der Stamm H- 9183, der eine hohe Wachstumsrate aufweist, als Stamm gewonnen, der eine große Menge Aspartase produzieren kann.
Die Stämme ATCC-11303 und H-9183 wurden jeweils unter aerobem Schütteln für 12 Std. bei 30ºC in einem Anzuchtmedium, das 2% Glucose, 2% Pepton, 0,3% Fleischbrühe und 0,5% Calciumcarbonat enthielt, gezüchtet. Die erhaltene Impfkultur (10 ml) wurde in 1 Liter eines Mediums, das 2% Glucose, 0,5% Maisquellwasser, 0,03% Ammoniumsulfat und 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat enthielt, in einem 2-Liter-Schüttel-Fermenter überimpft, und die Anzucht erfolgte bei 30ºC unter Rühren bei 800 U/min. Der pH-Wert des Mediums wurde während der Anzucht mit Ammoniak bei etwa 6,5 ± 0,2 gehalten, und die Anzucht erfolgte so lange, bis die Glucose im Medium vollständig verbraucht war. Die Anzucht erfolgte auf zwei Wegen; bei einem wird der Mikroorganismus aerob gezüchtet, indem das Medium über den Anzuchtzeitraum bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1 Liter/min belüftet wird, und bei dem anderen wird der Mikroorganismus gezüchtet, wobei die aerobe Bedingung bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1 Liter/min im Verlauf des Anzuchtzeitraums in eine kontrollierte Belüftungsbedingung umgewandelt wird. Die Umwandlung der aeroben Bedingung in eine kontrollierte Belüftungsbedingung erfolgte zu dem Zeitpunkt als sich das Mikrobenwachstum in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase befand. Der Belüftungsgrad des Mediums wurde gesenkt, so dass sich die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Medium wie bei der kontrollierten Belüftungsbedingung im Bereich von 0 bis 1 ppm befand.
Nach Beendigung der Anzucht wurden die Aspartaseaktivität und die Fumaraseaktivität der Zellen des Mikroorganismus bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Sowohl der Stamm ATCC-11303 als auch der Stamm H-9183, die unter den kontrollierten Belüftungsbedingungen gezüchtet worden waren, hatten höhere Aspartase- Aktivitäten bzw. niedrigere Fumarase-Aktivitäten.

Beispiel 2: Produktion von L-Asparaginsäure

Die in Beispiel 1 erhaltenen Kulturen des Stammes H-9183 wurden geeignet verdünnt, wozu Fumarsäure in einer Konzentration von 100 g/Liter gegeben wurde. Anschließend wurde der pH-Wert durch Zugabe von Ammoniak auf 8,7 eingestellt. Die Umsetzung erfolgte bei 30ºC unter leichtem Rühren.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Die Ergebnisse zeigen, dass die Produktivität von L-Asparaginsäure und die Umwandlung in das Produkt in der Kultur, wie sie unter der Bedingung einer Belüftung gefolgt von kontrollierter Belüftung erhalten wurde, erhöht waren.

Beispiel 3: Produktion von L-Asparaginsäure

Die Kultur des Stammes H-9183, wie sie unter der kontrollierten Belüftungsbedingung in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde zum Isolieren der Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden in einem Phosphatpuffer (0,01 M Kaliumphosphat; pH- Wert 7,4) suspendiert und mit Glasperlen homogenisiert, so dass diese zu einem Extrakt aufgebrochen wurden. Der Extrakt wurde durch eine Säule, die mit einem Harz, Duolite A-7, gefüllt war, geschickt, wodurch im Extrakt vorkommendes Protein durch das Harz adsorbiert wurde. Dann wurde eine wässrige Fumarsäurelösung (150 g/Liter; mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt) bei 37ºC durch die Säule geleitet, wodurch eine L- Asparaginsäurelösung (171 g/Liter) erhalten wurde. Der pH-Wert der Lösung (1 Liter) wurde mit Schwefelsäure auf 2,7 eingestellt, und es wurden 161 g L-Asparaginsäure- Kristalle erhalten.

Industrielle Anwendbarkeit

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Aspartase ist es möglich, eine große Menge Aspartase zu produzieren und gleichzeitig das Verhältnis von Fumarase/Aspartase zu senken. Mit der erfindungsgemäß derart produzierten Aspartase kann man zudem reine L-Asparaginsäure produzieren, die wenig Nebenprodukte enthält.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Aspartase, umfassend das Züchten eines Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört und zur Produktion von Apartase befähigt ist, in einem Medium, bis Aspartase hergestellt ist und sich in der Kultur anreichert, und Gewinnen der Aspartase daraus, wobei die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Medium in dem Stadium, in dem sich das mikrobielle Wachstum in der mittleren und/oder späten logarithmischen Wachstumsphase befindet, im Bereich von 0 bis 1 ppm liegt.

2. Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure, umfassend das Umsetzen von Fumarsäure und Ammoniak zu L-Asparaginsäure in einem wässrigen Medium in Gegenwart einer Enzymquelle, wobei die Enzymquelle eine gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellte Kultur, aus dieser Kultur isolierte Zellen oder daraus verarbeitete Zellen ist.