CN103305434A - 具有益生菌和有机硒双重作用的微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及本发明涉及一种具有益生菌和有机硒双重作用的微生态制剂及其制备方法，特别是指一种具有益生菌和有机硒双重作用的微生态制剂——益生菌活体硒微生态制剂及其制备方法，属于发酵工业领域。本发明的微生态制剂包括酿酒酵母菌，沼泽红假单胞菌和植物乳杆菌；酿酒酵母菌(富硒酵母)占活菌总数的30～50％，沼泽红假单胞菌占活菌总数的10～20％，植物乳杆菌占活菌总数的30～50％；生物硒(以Se计)含量为300～4800ppm；活菌总数≥4亿/ml。本发明的具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂可广泛用于畜禽养殖、水产养殖业、种植业、林果业、食用菌生产、中草药栽培，生产有机富硒功能性食品。

Description

具有益生菌和有机硒双重作用的微生态制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有益生菌和有机硒双重作用的微生态制剂及其制备方法，特别是指一种具有益生菌和有机硒双重作用的微生态制剂----益生菌活体硒微生态制剂及其制备方法，本发明属于发酵工业领域。

背景技术

硒是人体和动物必需的微量营养元素之一，是动物体内谷胱甘肽过氧化酶的活性成分，这种酶能清除动物细胞呼吸代谢中产生的过氧化物与羟自由基，维护生物膜的完整性，从而具有提高机体免疫力，有保护肝脏和抗衰老作用。正如世界微量元素权威菲尔德博士所说：“硒像一颗原子弹，量很小很小，作用和威力却都很大，一旦被人们认识，将对建康产生深远的影响”。

随着生物医学技术的发展，微量元素硒作为一种人体必需的营养元素已引起人们的高度重视。在研究补硒时，营养需求量和中毒量之间差距很小，很容易引起中毒。人们常把硒的化合物分成有机硒和无机硒两大类，实验证明，生物方法获得的硒，能够有效地在体内同化，且毒性小，又利于在生物体内吸收，是一种比较理想的微量元素营养强化剂。

生物富硒是获取有机硒的有效途径，目前，生物富硒的方法主要是微生物转化法。用于富硒的微生物有食用菌类和益生菌类等，其中酵母菌、乳酸菌、光合菌是目前公认的最为理想的富硒载体，益生菌菌中的活体硒的生物效力是无机硒的10～20倍。

益生菌与益生元的研究，目前国内外不仅进入高潮，而且已形成强大的产业。益生菌存在于地球上的各各角落，大气、水、土壤环境里面，动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、放线菌、酵母菌、光合菌等。微生态制剂是指改善宿主微生态平衡而发挥有益作用的微生物活体，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌微生态制剂。微生态制剂与其它药物不同，它能起到“已病辅治、未病防病、无病保健”的重要作用。微生态制剂的重点是“无病保健”。

功能性微生态制剂，用于加强和改善宿主机体的各种生理功能，起到防病治病，促进发育，增进体质，延缓衰老及预期长寿的目的。益生菌具有维持肠道菌群平衡、防治胃肠道疾病，产生多种酶类、合成多种营养物质、促进生长，增强机体免疫机能等生物学功能，目前广泛应用于有机食品生产。

新型多功能性微生态制剂通过扶植正常微生物种群，调整生理平衡，发挥生物拮抗作用，从而可排除致病菌和条件致病菌侵袭，消除重金属的残留。目前广泛作为土壤改良、污水净化等污染环境微生态改善方面的功能性材料。

本发明通过采用酵母菌的富硒菌株与光合菌、乳酸菌的功能性菌株同时在含亚硒酸纳的液体培养基中复合培养，优化培养条件，促进无机硒转化为有机硒，研制一种具有益生菌和有机硒双重作用的微生态制剂----益生菌活体硒制剂。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂，其特征在于：包括酿酒酵母菌，沼泽红假单胞菌，植物乳杆菌。

一种优选技术方案，其特征在于：所述酿酒酵母菌(富硒酵母)占活菌总数的30～50％，所述沼泽红假单胞菌占活菌总数的10～20％，所述植物乳杆菌占活菌总数的30～50％(优选30～40％)。

一种优选技术方案，其特征在于：所述益生菌活体硒微生态制剂，其中，生物硒(以Se计)含量为300～4800ppm；活菌总数≥4亿/ml。

一种优选技术方案，其特征在于：所述益生菌活体硒微生态制剂为液体，其中，生物硒(以Se计)含量为300～1200ppm；活菌总数为≥4亿/ml，优选为4～8亿/ml。

一种优选技术方案，其特征在于：所述益生菌活体硒微生态制剂为固体，其中，生物硒(以Se计)含量1200～4800ppm，活菌总数为≥15亿/g，优选为15～30亿/g。

本发明的另一目的是提供上述具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂的制备方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂的制备方法，其步骤如下：

(1)酿酒酵母菌培养液的制备，得酿酒酵母菌三级种子培养液；

(2)沼泽红假单胞菌培养液的制备，得沼泽红假单胞菌种子培养液；

(3)植物乳杆菌培养液的制备，得植物乳杆菌三级种子培养液；

(4)将酿酒酵母菌、沼泽红假单胞菌、植物乳杆菌三个菌种单独培养的种子培养液，分别按10～30％的接种量接入总糖量为8～15％、亚硒酸纳浓度为0.3～1.2g/L的液体复合培养基的发酵罐中进行复合培养，在28～32℃的条件下，间歇搅拌培养24～48小时，再静止发酵48～96小时，培养制得液体益生菌活体硒微生态制剂。

一种优选技术方案，其特征在于：所述步骤(4)所得液体益生菌活体硒微生态制剂，加入占总重量18～25％的改性多孔淀粉和2～5％的斜发沸石粉，充分搅拌混匀，采用高速离心喷雾闪蒸干燥机在45～65℃条件下，进行喷雾闪蒸干燥，得固体益生菌活体硒微生态制剂。

一种优选技术方案，其特征在于：所述酿酒酵母菌(富硒酵母)占活菌总数的30～50％，所述沼泽红假单胞菌占活菌总数的10～20％，所述植物乳杆菌占活菌总数的30～50％(优选30～40％)。

制得的益生菌活体硒微生态制剂中，所述酿酒酵母菌(富硒酵母)占活菌总数的30～50％，所述沼泽红假单胞菌占活菌总数的10～20％，所述植物乳杆菌占活菌总数的30～40％。

制得的益生菌活体硒微生态制剂中，生物硒(以Se计)含量为300～4800ppm；活菌总数≥4亿/ml。所述液体益生菌活体硒微生态制剂中，生物硒(以Se计)含量为300～1200ppm；活菌总数为≥4亿/ml，优选为4～8亿/ml。所述固体益生菌活体硒微生态制剂中，生物硒(以Se计)含量1200～4800ppm，活菌总数为≥15亿/g，优选为15～30亿/g。

有益效果：

本发明在大量实验的基础上，1)选用转硒和富硒能力最强的酿酒酵母菌为主要富硒益生菌菌种；2)选用具有协调菌群平衡、营养高、产酶高、抑制有害菌生长、改善生物环境功能的沼泽红假单胞菌菌种为主要功能菌种；3)选用具有能稳定PH值、降解重金属、生物防腐剂功能的植物乳杆菌为主要功能菌种；并将其单独分批培养成为富硒酵母菌、益生菌原菌液，保藏备用。

然后再按一定比例，把酿酒酵母菌原液，沼泽红假单胞菌原液，植物乳杆菌原液，匹配复合在含亚硒酸纳的液体培养基中复合培养，控制培养条件，通过先好氧后厌氧的两段发酵法培养，培养制得益生菌活体硒原液，即一种具有益生菌和有机硒双重作用的微生态制剂产品---益生菌活体硒。

再将培养成的益生菌活体硒原液中加入占总重量18～25％的改性多孔淀粉和2～5％的斜发沸石粉，搅拌混匀，采用高速离心喷雾干燥机进行闪蒸喷雾干燥，制得益生菌活体硒粉剂。

本发明的微生态制剂益生菌活体硒制剂，对动物肠道菌群、抗氧化效应和免疫功能均有较好的影响。益生菌活体硒的生物利用率要高于无机硒，容易被动物植物吸收利用，且有机硒安全系数高，不会对人和环境造成不良影响。其应用效果以及评价其安全性可靠，用于生物预防治疗疾病和作为益生菌和有机硒的补充有着广泛的应用前景。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是以下实施例只用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容对本发明做出一些非本质的调整。

本发明的微生态制剂---益生菌活体硒的制备工艺，可随着实际生产条件做适当的增加或减少工艺的变化。

一、酵母菌(富硒酵母)培养

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。

采用市售酿酒酵母(中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCC NO.0539，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

1、发酵培养基配方：

总糖量为8～30％的水解糖；1％的淀粉；硫酸铵0.8％；磷酸0.1％；亚硒酸纳0.3～1.2g/L；培养基的pH为4.5～7.5。

可优选8％～22％总糖量的淀粉水解液，内含0.4～1.2g/L亚硒酸纳，培养基的pH为4.5～7.5。

2、发酵培养条件：

发酵培养富硒酵母菌的条件是：种子液的接种量为10～20％，在26～32℃的条件下，搅拌培养14～72小时。

3、生产工艺流程：

斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→发酵罐发酵培养→发酵菌原液→备用。

具体制备步骤如下：

(1)斜面菌种：酿酒酵母(富硒酵母)菌种接种于含有总糖含量为8～18％、亚硒酸纳浓度为0.3～0.6g/L的麦芽汁固体斜面上，在28～32℃培养24～72小时后，放入4℃冰箱保存。

(2)液体菌种：将保存的富硒酵母菌种活化后，接一环细胞于装有150ml总糖含量为8～22％、亚硒酸纳浓度为0.4～0.8g/L的麦芽汁培养基的三角瓶中，于26～32℃搅拌培养14～28小时，即为液体菌种。

(3)一级液体种子培养：将液体菌种按10～15％的接种量接入30个装有150毫升总糖含量为8～22％、亚硒酸纳浓度为0.6～1.2g/L的淀粉水解液培养基的三角瓶中，在26～32℃搅拌培养14～28小时，即为一级液体种子培养物。

(4)二级液体种子培养：将一级种子培养液按10～15％的接种量接入装有50升总糖含量为8～22％、亚硒酸纳浓度为0.6～1.2g/L的淀粉水解液培养基的发酵罐，在26～32℃搅拌培养14～48小时，即为二级液体种子培养物。

(5)三级液体种子培养：将二级种子培养液按10～15％的接种量接入装有500升总糖含量为8～22％、亚硒酸纳浓度为0.6～1.2g/L的淀粉水解液培养基的发酵罐，在26～32℃搅拌培养24～36小时，即为三级液体种子培养液。所得酿酒酵母菌三级种子培养原菌液的有效活菌数≥10⁸/ml，备用。

二、光合细菌培养：

沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris。

采用市售沼泽红假单胞菌(中国科学院微生物研究所)，其保藏号为ACCCNo.10649，保藏单位为中国农业微生物菌种保藏管理中心。

1、培养基配方

(1)种子培养基：酵母粉3.0g、蛋白胨3.0g、七水硫酸镁0.5g、氯化钙0.3g、蒸馏水1.0L，pH6.8～7.0。

(2)发酵培养基：

磷酸氢二钾0.78g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、酵母膏2.5g、氯化钠0.5g、氯化钙0.05g、硫酸铵0.05g、醋酸钠1.65g、硼酸钠0.38g、钼酸铵0.22g、水1.0L、pH6.5～7.52。

2、制备工艺：

(1)种子斜面培养：将沼泽红假单胞菌接种到固体斜面培养基上，培养温度为26～30℃之间，光照强度为3000～6000lux，厌氧培养7～10天。

(2)种子摇床培养：将斜面培养的菌种接种到液体培养基中，温度32～34度，培养36～48小时，获得种子培养液。

(3)发酵罐培养：把培养基的pH值调至为6.5～7.5，再用121℃高温灭菌20分钟，待冷却后，接入光合菌种子液5～10％，培养温度28～32℃，光照强度为3000～6000lux，密闭培养5～7天，培养液由无色变为红色，获得深红色的液体为光合细菌原菌液(有效活菌数≥10⁸/ml)。所得的沼泽红假单胞菌种子培养原液态保存备用。

三、植物乳杆菌培养

植物乳杆菌Lactobacillus Plantarum。

采用市售植物乳杆菌(中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCC NO.1.19，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

1、培养基配方：

(1)斜面保藏培养基

葡萄糖1.5％、酵母粉1％、碳酸钙1.5％、吐温-80 0.1％、琼脂2％、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液0.1％、pH6.8～7.2。

(2)种子培养基

葡萄糖0.5％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、乙酸钠0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、吐温-800.1％、磷酸二氢钾0.2％、七水合硫酸镁0.002％、水合硫酸锰0.005％、碳酸钙1％、pH6.8～7.2。

(3)发酵培养基

蔗糖2.9％、酵母粉3.1％、蛋白胨2.5％、乙酸钠0.6％、磷酸氢二钾0.2％、柠檬酸二氢铵0.2％、吐温-80 0.2％、硫酸镁0.01％、硫酸锰0.01％、pH6.5～7.5。

2、发酵培养条件：

种子液的接种量为5～30％，在32～37℃的条件下，搅拌培养20～30小时。

3、制备工艺流程：

斜面菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→发酵罐发酵培养→原液→备用。

具体制备步骤如下：

(1)斜面菌种培养：将菌种接种于培养基固体斜面上，在32～37℃培养24～36小时。

(2)一级液体种子培养：将斜面菌种1～4环接入到装有150～500毫升培养基的三角瓶中，在32～37℃培养24～36小时。

(3)二级液体种子培养：将一级种子培养液按10～20％的接种量接入装有50升培养基的发酵罐，在32～37℃培养20～30小时。

(4)三级液体种子培养：将二级种子培养液按10～20％的接种量接入装有500升培养基的发酵罐中，在32～37℃培养20～30小时。终止发酵→植物乳杆菌三级种子培养原液(有效活菌数≥10⁸/ml)，备用。

四、复合培养

复合培养基：

总糖量为8～30％水解糖液、淀粉0.1～1％、尿素0.2～0.25％、硫酸铵0.4～0.5％、磷酸二氢钾0.2～0.25％、亚硒酸纳0.3～1.2g/L、pH为6.5～7.5。

将酿酒酵母菌、沼泽红假单胞菌、植物乳杆菌三个菌种单独培养的种子培养液，按10～30％(可优选10～20％)的接种量接入装有5000升总糖量为8～15％、亚硒酸纳浓度为0.3～1.2g/L的液体复合培养基的发酵罐中进行混合复合培养，在28～32℃的条件下，间歇搅拌培养24～48小时，再静止发酵48～96小时。培养制得益生菌活体硒原液，即得一种具有益生菌和有机硒双重作用的微生态制剂成品---益生菌活体硒。

还可进一步再将培养制得的益生菌活体硒原液中加入占总重量18～25％的改性多孔淀粉和2～5％的斜发沸石粉，充分搅拌混匀，采用高速离心喷雾闪蒸干燥机在45～65℃条件下，进行喷雾闪蒸干燥，制得益生菌活体硒粉剂。

按本发明所提供的发酵方法生产的具有益生菌和有机硒双重作用的微生态制剂——益生菌活体硒液体产品：

生物硒(以Se计)含量300～1200ppm；

活菌总数≥4～8亿/ml。

固体产品(粉剂)：

生物硒(以Se计)含量1200～4800ppm；

活菌总数≥15～30亿/g。

本发明所说的“益生菌活体硒”是指利用微生物发酵法使无机硒转化为含硒的益生菌活菌体微生态制剂。该种微生物制剂集有机硒菌体蛋白、活菌体、活性酶制剂及单体状态的含硒氨基酸于一体，称为“益生菌活体硒微生态制剂”，它兼有益生菌活菌制剂、生物酶制剂、有机硒的三大功能作用，而且制造成本低廉，能够代替兽用、农用抗生素类药物和无机硒添加剂，为发展生态有机农业，开发生产有机富硒功能性保健食品打下坚实基础。

本发明研制的具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂的主要特征之一是它含有益生菌活体细胞、活性生物酶和有机硒菌体蛋白。其中益生菌包括酵母菌、乳酸菌、光合菌及其代谢产物。活性生物酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及纤维素酶。有机硒菌体蛋白为无机硒与蛋白质经微生物活体转化形成的硒代氨基酸、硒多肽、硒核酸片段的复合物。

本发明研制的具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂中活菌总数达到5亿/ml～20亿/ml，其中酿酒酵母菌(富硒酵母)占活菌总数的30～50％，沼泽红假单胞菌占活菌总数的10～20％，植物乳杆菌占活菌总数的30～50％。上述菌体比例因培养条件的变动略有变化。

本发明所提及的具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂可广泛用于畜禽养殖、水产养殖业、种植业、林果业、食用菌生产、中草药栽培，生产有机富硒功能性食品。

本发明的重要技术特征为具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂的制备方法。

本发明采用的菌种是农业部《允许使用的饲料添加剂品种目录》上登记在册的微生物菌种，包括酿酒酵母菌、沼泽红假单胞菌、植物乳杆菌三个菌种。均是从中国科学院微生物研究所购买的，其产品的稳定性、安全性可靠。该产品可直接进入市场及应用领域，易接受政府各部门的监督管理。

本发明提供的具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂，优势明显：

(一)全面替代兽用、农用抗生素类药物和无机硒添加剂，为发展生态有机农业，开发生产有机富硒功能性硒食品，给当前停滞不前的生态农业注入新的活力。

(二)本发明采用普通微生物发酵工艺，可以日光温室当厂房，发酵设备简单，投资少，原材料成本低，产品具有明显的功能性和价格优势及实用性。是农民“买得起、用得上”的创新技术产品，有利于推广、普及。

(三)本发明提供的益生菌活体硒微生态制剂，由于硒的毒性已降到接近无毒状态，因此可适当提高在农产品生产中的用量，为大批量生产有机富硒农产品即有机富硒功能性食品提供了物质保证。

(四)采用本发明提供的益生菌活体硒微生态制剂的方法：原料广泛，操作简单，发酵周期短，适合大规模生产和因陋就简小批量生产，具有广泛的实际应用前景，并具有重大的社会效益和巨大的经济效益。

本发明的效果最主要的体现在：随着具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂的推广应用，市场上的有机富硒功能性食品将逐渐丰富起来，将惠及中华民族及全球四十多个严重缺硒的国家和地区，为增进人类的健康做出积极贡献。21世纪是生物科学世纪，也是微生态制剂的辉煌时代，让微生态领域与药学领域互相渗透，相互协作，以功能因子修饰改性核心技术的研发为切入点和突破口，对推动我国功能性食品的科技进步，增强自主创新能力和产业的核心竞争力，为研制出更好更多的功能性微生态制剂作出贡献。在促进我国农业和农村经济结构战略性调整和解决“三农”问题及对发展循环经济、实现可持续发展、构建和谐社会等方面均具有十分重要的意义。

Claims (8)

1.一种具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂，其特征在于：包括酿酒酵母菌，沼泽红假单胞菌和植物乳杆菌。

2.根据权利要求1所述的具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂，其特征在于：所述酿酒酵母菌占活菌总数的30～50％，所述沼泽红假单胞菌占活菌总数的10～20％，所述植物乳杆菌占活菌总数的30～50％。

3.根据权利要求2所述的具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂，其特征在于：所述微生态制剂中，以Se计，生物硒含量为300～4800ppm；活菌总数≥4亿/ml。

4.根据权利要求3所述的具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂，其特征在于：所述微生态制剂为液体，以Se计，生物硒含量为300～1200ppm；活菌总数为4～8亿/ml。

5.根据权利要求3所述的具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂，其特征在于：所述微生态制剂为固体，以Se计，生物硒含量为1200～4800ppm，活菌总数为15～30亿/g。

6.一种具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)酿酒酵母菌培养液的制备，得酿酒酵母菌三级种子培养液；

(2)沼泽红假单胞菌培养液的制备，得沼泽红假单胞菌种子培养液；

(3)植物乳杆菌培养液的制备，得植物乳杆菌三级种子培养液；

(4)将酿酒酵母菌、沼泽红假单胞菌、植物乳杆菌三个菌种单独培养的种子培养液，按10～30％的接种量接入总糖量为8～15％、亚硒酸纳浓度为0.3～1.2g/L的液体复合培养基的发酵罐中进行复合培养，在28～32℃的条件下，间歇搅拌培养24～48小时，再静止发酵48-96小时，培养制得液体益生菌活体硒微生态制剂。

7.根据权利要求6所述的具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述液体益生菌活体硒微生态制剂，加入占总重量18～25％的改性多孔淀粉和2～5％的斜发沸石粉，充分搅拌混匀，采用高速离心喷雾闪蒸干燥机在45～65℃条件下，进行喷雾闪蒸干燥，得固体益生菌活体硒微生态制剂。

8.根据权利要求6所述的具有益生菌和有机硒双重作用的益生菌活体硒微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述酿酒酵母菌占活菌总数的30～50％，所述沼泽红假单胞菌占活菌总数的10～20％，所述植物乳杆菌占活菌总数的30～50％。