CN114947002A - 一种饲用复合微生态制剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种饲用复合微生态制剂及其制备方法，属于微生态制剂技术领域。本发明以包括复合益生菌、中药组合物和亚硒酸钠在内的原料作为制备用原料，经发酵制备得到，所述复合益生菌可大量提高中药组合物中活性成分的含量及其抗菌活性，同时产生新的活性物质，具有增强免疫、优化肠道微生态、生物夺氧、生物拮抗、改善肠道微生态平衡、提高饲料利用率等多重功效。且复合益生菌能够将亚硒酸钠转化为纳米硒，纳米硒具有多种生物活性，且毒性低、环境污染小、生物利用率高。本发明解决了目前抗生素使用中存在的药物残留、耐药性等问题以及现有补硒添加剂毒性作用强、生物利用率低、易造成环境污染的问题。
Description
技术领域
本发明属于微生态制剂技术领域，具体涉及一种饲用复合微生态制剂及制备方法。
背景技术
养殖业由于养殖数量、养殖密度的加大，疾病泛滥，养殖观念的落后，导致抗生素滥用，耐药菌株不断出现，药物的有效性下降，用量不断加大，死淘率不断上升，养殖风险加大，养殖效益下降，同时给人类的食品安全带来威胁。绿色、安全且无残留的新型绿色饲料添加剂---新型复合微生态饲料添加剂，以其改善宿主肠道菌群平衡、促进消化吸收、增强免疫力等功效正在逐步跻身于促生长饲料添加剂的行列以替代抗生素的使用。
同时，硒具有多种生理功能，是维持机体健康的必需微量元素。随着人们健康意识逐渐加强，开发富硒肉、富硒蛋、富硒奶等富硒动物产品，已成为富硒养殖业转型的大方向，发展前景广阔。目前，硒元素主要以亚硒酸钠等无机盐的形式被添加在饲料中，这些矿物质饲料添加剂毒性作用强，生物利用率低，容易造成环境污染，并且在使用过程中难以掌握其添加剂量。
可见，目前抗生素使用中存在的药物残留、耐药性等问题以及现有补硒添加剂毒性作用强和易造成环境污染的问题亟待解决。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种饲用复合微生态制剂及制备方法，所述饲用复合微生态制剂能够作为抑菌剂和补硒剂添加到饲料中，能够解决目前抗生素使用中存在的药物残留、耐药性等问题以及现有补硒添加剂毒性作用强和易造成环境污染的问题。
本发明提供了一种饲用复合微生态制剂，由复合益生菌对底物发酵制备得到，所述底物包括中药组合物和亚硒酸钠；
所述复合益生菌包括：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373、乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799和干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393；
所述中药组合物包括以下原料：党参、黄芪、白术、神曲、苦参、蒲公英和乌梅。
优选的，所述中药组合物包括以下重量份数的原料：党参9～30份、黄芪9～30份、白术6～12份、神曲6～15份、苦参4.5～9份、蒲公英9～15份和乌梅6～12份。
本发明还提供了上述方案所述的饲用复合微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将党参、黄芪、白术、神曲、苦参、蒲公英和乌梅进行粉碎，过筛后加水煎煮，得到含有中药组合物和浸提物的混合物；
2)将所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373和乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799接种于发酵培养基中，进行第一发酵；所述发酵培养基包含所述混合物；
3)在所述第一发酵后的发酵产物中接种干酪乳酸杆菌Lactobacillus caseiATCC 393，进行第二发酵；
3)在所述第二发酵后的发酵产物中加入亚硒酸钠，进行第三发酵，得到饲用复合微生态制剂；所述第三发酵于厌氧条件下进行。
优选的，所述发酵培养基中中药组合物的质量浓度为9％～11％。
优选的，所述亚硫酸钠的初始浓度为0.8～1mM。
优选的，在所述第三发酵后，还包括将所述第三发酵的发酵产物和冻干保护剂混合，进行冷冻干燥。
优选的，所述冻干保护剂包括以下质量百分含量的组分：13％～17％脱脂奶粉、8％～12％海藻糖和0.6％～1.0％乙酸钠。
本发明还提供了一种饲料，包括上述方案所述的饲用复合微生态制剂或者所述制备方法制备得到的饲用复合微生态制剂。
优选的，所述饲料中饲用复合微生态制剂的添加量占饲料质量的1％～3％。
本发明还提供了上述方案所述的饲用复合微生态制剂或者所述制备方法制备得到的饲用复合微生态制剂或所述的饲料在提高动物生长性能、提高动物生产性能、提高动物的抗氧化能力或者提高动物的免疫力中的应用。
本发明提供了一种饲用复合微生态制剂，由复合益生菌对底物发酵制备得到，所述底物包括中药组合物和亚硒酸钠。所述复合益生菌包括：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ACCC 19373、乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799和干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393；所述中药组合物包括以下原料：党参、黄芪、白术、神曲、苦参、蒲公英和乌梅。本发明中，所述复合益生菌为对动物机体有益菌种，具有促进动物机体生长发育，提高机体免疫力等的药用价值。并且，本发明以包括复合益生菌、中药组合物和亚硒酸钠在内的原料作为制备用原料，经发酵制备得到，所述复合益生菌可大量提高中药组合物中活性成分的含量及其抗菌活性，同时产生新的活性物质，降低中药组合物的毒副作用，节省中药资源，其发酵产物作为饲料添加剂，具有增强免疫、优化肠道微生态、生物夺氧、生物拮抗、改善肠道微生态平衡、提高饲料利用率等多重功效。且发酵过程中，复合益生菌能够将亚硒酸钠转化为粒径为50～100nm的纳米硒，纳米硒具有多种生物活性，且毒性低、环境污染小、生物利用率高。本发明的饲用复合微生态制剂可作为畜禽饲料添加剂用于补充硒元素，提高畜禽的抗氧化能力和免疫力，提高动物生长、生产性能，防治疾病，解决了目前抗生素使用中存在的药物残留、耐药性等问题以及现有补硒添加剂毒性作用强、生物利用率低、易造成环境污染的问题，顺应了当前畜禽养殖业注重绿色、安全和环保的主流，可在无抗养殖的新时代达到替抗减排的效果。
附图说明
图1是本发明基于复合益生菌富硒发酵中药复方制备新型复合微生态制剂的制备方法流程图。
图2是本发明实施例1中富集有纳米硒的复合益生菌的透射电镜(TEM)图像。
图3是本发明实施例2中药组合物经复合益生菌富硒发酵后的扫描电镜(SEM)图像。
具体实施方式
本发明提供了一种饲用复合微生态制剂，由复合益生菌对底物发酵制备得到，所述底物包括中药组合物和亚硒酸钠。所述复合益生菌包括：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ACCC 19373、乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799和干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393。其中枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373可降解中药中的纤维素，释放可溶性有效活性成分，且生长速度快、对营养的要求相对较低；乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799可进行高密度发酵，在饲料中能作为单细胞蛋白提供营养；干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393是国家卫生部公布的可用于食品的菌种，能够有效调节肠道微生物之间的平衡，增强机体的免疫力和抵抗力。此外，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373和乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG799生长所需条件相近，可共同发酵培养。而且以上三种菌株均可在发酵过程中将亚硒酸钠转化为纳米硒，可共同富硒发酵培养。所述中药组合物包括以下原料：党参、黄芪、白术、神曲、苦参、蒲公英和乌梅。在本发明中，根据《中国药典》2020年版的用法与用量进行配伍，所述中药组合物包括以下重量份数的原料：党参9～30份、黄芪9～30份、白术6～12份、神曲6～15份、苦参4.5～9份、蒲公英9～15份和乌梅6～12份，其中党参可健脾益肺，养血生津；黄芪可健脾补中，利水消肿，托毒生肌；白术可健脾益气，助于消化；神曲可健脾和胃，消食化积；苦参可清热燥湿，杀虫，利尿；蒲公英可清热解毒，消肿散结；乌梅可敛肺，涩肠，生津，安蛔。
综上，益生菌具有调节免疫的作用，能够产生有机酸以及抗菌化合物，产生酶以及具有局部作用和远期作用的化学小分子，和宿主以及宿主原始菌群互作，能够改善肠道屏障完整性。中药组合物具有来于自然、安全无害，资源丰富、功能多样以及无残无抗、经济环保的优势。
在本发明中，所述复合益生菌均为对动物机体有益菌种，具有促进动物机体生长发育，提高机体免疫力等的药用价值，且复合益生菌能够增强、补充或改进中药组合物和亚硒酸钠的功能。
本发明以包括复合益生菌、中药组合物和亚硒酸钠在内的原料作为制备用原料，经发酵制备得到，所述复合益生菌可大量提高中药组合物中活性成分的含量及其抗菌活性，同时产生新的活性物质，降低中药组合物的毒副作用，节省中药资源，其发酵产物作为饲料添加剂，具有增强免疫、优化肠道微生态、生物夺氧、生物拮抗、改善肠道微生态平衡、提高饲料利用率等多重功效。且发酵过程中，复合益生菌能够将亚硒酸钠转化为粒径为50～100nm的纳米硒。纳米硒具有多种生物活性，且毒性低，环境污染小、生物利用率高。可见，本发明以复合益生菌为载体，发酵中药组合物、以生物转化的方式将毒性高的亚硒酸钠转化为低毒性的纳米硒并富集在菌体内；本发明将益生菌自身的益生性、中药安全绿色无残的优势以及纳米硒的低毒性、高活性、高吸收利用率等三者特性结合、协同增效，得到了一种饲用复合微生态制剂，正顺应了当前养殖业注重绿色、安全和环保的主流，在无抗养殖的新时代达到“替抗减排”的效果。
本发明还提供了上述方案所述的饲用复合微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将党参、黄芪、白术、神曲、苦参、蒲公英和乌梅进行粉碎，过筛后加水煎煮，得到含有中药组合物和浸提物的混合物；
2)将所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373、乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799接种于发酵培养基中，进行第一发酵；所述发酵培养基包含所述混合物；
3)在所述第一发酵后的发酵产物中接种干酪乳酸杆菌Lactobacillus caseiATCC 393，进行第二发酵；
4)在所述第二发酵后的发酵产物中加入亚硒酸钠，进行第三发酵，得到饲用复合微生态制剂；所述第三发酵于厌氧条件下进行。
本发明首先将党参、黄芪、白术、神曲、苦参、蒲公英和乌梅进行粉碎，过筛后加水煎煮，得到含有中药组合物和浸提物的混合物。在本发明中，所述过筛采用的筛网的孔径优选为60目；所述水优选为蒸馏水；所述煎煮的时间优选为60～90min，更优选为70～80min。
得到混合物后，本发明将所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373和乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799接种于含有所述混合物的发酵培养基中，进行第一发酵。
在本发明中，在将所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373和乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799接种于含有所述中药组合物的发酵培养基中前，优选的还包括分别对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373和乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799依次进行活化培养和扩大培养。
在本发明中，对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373进行活化培养优选的包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373划线接种于NA固体培养基中，进行活化培养，得到枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373单菌落；所述活化培养的温度优选为29～31℃，更优选为30℃；所述活化培养的时间优选为47～49h，更优选为48h。在本发明中，所述NA固体培养基优选的包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨0.9％～1.1％、牛肉膏0.2％～0.4％、氯化钠0.4％～0.6％和琼脂1.4％～1.6％，更优选的包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨1％、牛肉膏0.3％、氯化钠0.5％和琼脂1.5％。得到枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373单菌落后，本发明将枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ACCC 19373单菌落接种于NA液体培养基进行扩大培养。在本发明中，所述NA液体培养基优选的包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨0.9％～1.1％、牛肉膏0.2％～0.4％和氯化钠0.4％～0.6％，更优选的包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨1％、牛肉膏0.3％和氯化钠0.5％。在本发明中，所述扩大培养的温度优选为29～31℃，更优选为30℃；所述扩大培养的时间优选为23～25h，更优选为24h。在本发明中，所述扩大培养的转速优选为180～200rpm。
在本发明中，对乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799进行活化培养优选的包括以下步骤：将乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799划线接种于YPD固体培养基中，进行活化培养，得到乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799单菌落；所述活化培养的温度优选为29～31℃，更优选为30℃；所述活化培养的时间优选为47～49h，更优选为48h。在本发明中，所述YPD固体培养基优选的包括以下质量百分含量的组分：酵母膏0.9％～1.1％、蛋白胨1.9％～2.1％、葡萄糖1.9％～2.1％和琼脂1.9％～2.1％，更优选的包括以下质量百分含量的组分：酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％和琼脂2％。得到乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799单菌落后，本发明将乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799单菌落接种于YPD液体培养基进行扩大培养。在本发明中，所述YPD液体培养基优选的包括以下质量百分含量的组分：酵母膏0.9％～1.1％、蛋白胨1.9％～2.1％和葡萄糖1.9％～2.1％，更优选的包括以下质量百分含量的组分：酵母膏1％、蛋白胨2％和葡萄糖2％。在本发明中，所述扩大培养的温度优选为29～31℃，更优选为30℃；所述扩大培养的时间优选为23～25h，更优选为24h。在本发明中，所述扩大培养的转速优选为180～200rpm。
在本发明中，所述发酵培养基包含含有中药组合物和浸提物的混合物；所述发酵培养基中中药组合物的质量浓度优选为9％～11％，更优选为10％。在本发明中，所述混合物的制备方法优选的包括以下步骤：对所述中药组合物进行粉碎，得到中药粉；将所述中药粉和溶剂混合后进行浸提，得到含有中药组合物和浸提物的混合物。在本发明中，所述中药粉的粒径优选为60目。在本发明中，所述溶剂优选为水，更优选为蒸馏水，所述浸提的程序优选的包括：升温至95～100℃，煮沸后转小火浸煮60～90min。在本发明中，所述发酵培养基优选的包括以下质量百分含量的组分：包含中药组合物9％～11％、酵母膏0.9％～1.1％、蛋白胨1.9％～2.1％、牛肉膏0.2％～0.4％、氯化钠0.4％～0.6％和葡萄糖1.9％～2.1％，更优选的包括以下质量百分含量的组分：包含中药组合物10％、酵母膏1％、蛋白胨2％、牛肉膏0.3％、氯化钠0.5％和葡萄糖2％。在本发明中，所述发酵培养基的制备方法优选的包括以下步骤：将所述含有中药组合物和浸提物的混合物、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、葡萄糖和水混合后，灭菌，得到发酵培养基。在本发明中，所述灭菌的方式优选为高压蒸汽灭菌。在所述灭菌后，优选的还包括冷却至20～30℃。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373的接种量优选为发酵培养基的质量的3％～8％，更优选为5％；所述乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactisGG 799的接种量优选为发酵培养基的质量的3％～8％，更优选为5％。在本发明中，所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373和乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG799的有效活菌数的比例优选为(1～2):(1～2)，更优选为1：1。
在本发明中，所述第一发酵的温度优选为28～32℃，更优选为30℃；所述第一发酵的时间优选为59～61h，更优选为60h；所述第一发酵优选的于震荡条件下进行；所述震荡的转速优选为180～200rpm。
在所述第一发酵后，本发明在所述第一发酵后的发酵产物中接种干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393，进行第二发酵。
在所述第一发酵后的发酵产物中接种干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC393，本发明优选的还包括对干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393依次进行活化培养和扩大培养。
在本发明中，所述对干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393依次进行活化培养优选的包括以下步骤：
将干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393划线接种于MRS固体培养基中，进行活化培养，得到干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393单菌落；所述活化培养于厌氧条件下进行；所述活化培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述活化培养的时间优选为47～49h，更优选为48h。在本发明中，所述MRS固体培养基优选的包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨0.9％～1.1％、牛肉膏0.9％～1.1％、酵母膏0.49％～0.51％、柠檬酸氢二铵0.19％～0.21％、葡萄糖1.9％～2.1％、乙酸钠0.49％～0.51％、磷酸二氢钾0.19％～0.21％、七水硫酸镁0.05％～0.07％、一水硫酸锰0.024％～0.026％、吐温800.09％～0.11％和琼脂1.9％～2.1％，更优选的包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、葡萄糖2％、乙酸钠0.5％、磷酸二氢钾0.2％、七水硫酸镁0.06％、一水硫酸锰0.025％、吐温800.1％和琼脂2％。得到干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393单菌落后，本发明将干酪乳酸杆菌Lactobacilluscasei ATCC 393单菌落接种于MRS液体培养基进行扩大培养。在本发明中，所述MRS液体培养基优选的包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨0.9％～1.1％、牛肉膏0.9％～1.1％、酵母膏0.49％～0.51％、柠檬酸氢二铵0.19％～0.21％、葡萄糖1.9％～2.1％、乙酸钠0.49％～0.51％、磷酸二氢钾0.19％～0.21％、七水硫酸镁0.05％～0.07％、一水硫酸锰0.024％～0.026％和吐温800.09％～0.11％，更优选的包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、葡萄糖2％、乙酸钠0.5％、磷酸二氢钾0.2％、七水硫酸镁0.06％、一水硫酸锰0.025％和吐温800.1％。在本发明中，所述扩大培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述扩大培养的时间优选为23～25h，更优选为24h；所述扩大培养于厌氧和静置条件下进行。
在本发明中，所述干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393的接种量优选为第一发酵后的发酵产物的质量的8％～12％，更优选为10％。在本发明中，所述第二发酵的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述第二发酵的时间优选为10～15h，更优选为12h；所述第二发酵优选的于厌氧和静置条件下进行。
在所述第二发酵后，本发明在所述第二发酵后的发酵产物中加入亚硒酸钠，进行第三发酵，得到饲用复合微生态制剂；所述第三发酵于厌氧条件下进行。
在本发明中，所述亚硫酸钠的初始浓度优选为0.8～1mM。在本发明中，所述第三发酵的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述第三发酵的时间优选为23～25h，更优选为24h；所述第三发酵优选的于厌氧和静置条件下进行。
本发明利用枯草芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母和干酪乳酸杆菌三种益生菌富硒发酵中药复方党参、黄芪、白术、神曲、苦参、蒲公英和乌梅。可见，本发明以复合益生菌为载体，发酵复方中药得到发酵产物的同时、以生物转化的方式将毒性的亚硒酸钠转化为低毒性的纳米硒并富集在菌体内。
在所述第三发酵后，本发明优选的还包括将所述第三发酵的发酵产物和冻干保护剂混合，进行冷冻干燥。
在本发明中，所述冻干保护剂优选的包括以下质量百分含量的组分：13％～17％脱脂奶粉、8％～12％海藻糖和0.6％～1.0％乙酸钠，更优选的包括以下质量百分含量的组分：15％脱脂奶粉、10％海藻糖和0.8％乙酸钠，此复合冻干保护剂配比经过单因素试验及正交试验所确定，冻干后复合益生菌存活率最高可达68.67％，比直接冻干提高17.8倍。在本发明中，所述第三发酵的发酵产物和冻干保护剂的质量比优选为1：4。本发明对所述混合的方式没有特殊限制，以混合均匀为准。在进行冷冻干燥前，优选的还包括将所述第三发酵的发酵产物和冻干保护剂混合后的混合料进行静置，所述静置的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；所述静置的时间优选为25～35min，更优选为30min。在本发明中，所述冷冻干燥的程序优选的包括：-79～-81℃预冷冻4～5h，更优选的包括：-80℃预冷冻5h；再置于冷冻干燥机中冷冻干燥2～4天，更优选为3.5天。
本发明经过冷冻干燥制成粉剂，创制了一种复合益生菌富硒发酵中药饲料添加剂。
在本发明中，所述饲用复合微生态制剂的使用方法优选为采用饮水或拌料的方式；所述饲用复合微生态制剂在基础饲料中按质量比为1％～3％的添加量添加、在饮水中按体积比为0.1％～1.0％的添加量添加。
本发明还提供了一种饲料，包括上述方案所述的饲用复合微生态制剂或者所述制备方法制备得到的饲用复合微生态制剂。
在本发明中，所述饲料中饲用复合微生态制剂的添加量优选的占饲料质量的1％～3％。
本发明还提供了上述方案所述的饲用复合微生态制剂或者所述制备方法制备得到的饲用复合微生态制剂或所述的饲料在提高动物生长性能、提高动物生性能、提高动物的抗氧化能力或者提高动物的免疫力中的应用。
本发明解决了目前抗生素使用中存在的药物残留、耐药性等问题以及现有补硒添加剂毒性作用强、生物利用率低、易造成环境污染，以及现有生产技术流程复杂、周期长、生产成本高的问题。这种新型的微生态制剂的研制、试用和推广应用必将为养殖业和饲料行业提供一条绿色、高效且无污染的新途径，也必将得到越来越广泛的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：
步骤一、菌株活化：
用NA固体培养基对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373菌株进行活化培养：将Bacillus subtilis ACCC 19373划线接种于NA固体培养基，于30℃培养48h；所述NA固体培养基配方如下：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％。将活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373的单菌落用NA液体培养基，30℃、180rpm培养24h；所述NA液体培养基配方如下：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％。
用YPD固体培养基对乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799菌株进行活化培养：将Kluyveromyces lactis GG 799划线接种于YPD固体培养基，于30℃培养48h；所述YPD固体培养基配方如下：酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％。将活化后的乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799的单菌落用YPD液体培养基，30℃、200rpm培养24h；所述YPD固体培养基配方如下：酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％。
用MRS固体培养基对干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393菌株进行活化培养：将Lactobacillus casei ATCC 393划线接种于MRS固体培养基，于37℃厌氧培养48h；所述MRS固体培养基配方如下：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，七水硫酸镁0.06％，一水硫酸锰0.025％，吐温800.1％，琼脂2％。将活化后的干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393的单菌落用MRS液体培养基，37℃、静置培养24h；所述MRS液体培养基配方如下：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，七水硫酸镁0.06％，一水硫酸锰0.025％，吐温800.1％。
步骤二、复合益生菌富硒发酵中药培养基的制备：
称取质量比为9：9：9：9：9：9：9的党参、黄芪、白术、神曲、苦参、蒲公英和乌梅，粉碎后过60目筛得到混合中药粉末。加入蒸馏水升温至100℃，煮沸后转小火浸煮75min；加入酵母膏1％，蛋白胨2％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％和葡萄糖2％；加蒸馏水定容至中药含量为10％；高压蒸汽灭菌后冷却至室温。
步骤三、发酵培养
将5％的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373和5％乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799菌液按1:1的比例接种到复合益生菌富硒发酵中药培养基中，在30℃、180rpm条件下发酵培养60h。
步骤四、富硒发酵培养
将10％的干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393接种到发酵培养60h后的培养基中，在37℃条件下静置发酵培养12h，此时样品颜色呈浅褐色。再向培养基中加入终浓度为1mM的亚硒酸钠，继续37℃静置厌氧富硒发酵培养24h。此时样品颜色呈暗红色。
复合益生菌合成纳米硒的结构表征
取实施例1中的第二和第三发酵产物在透射电镜(TEM)下观察复合益生菌富硒发酵前后变化。结果如图2所示：富硒发酵后复合益生菌体内产生了粒径为50～100nm的纳米颗粒，经能量色散X射线光谱(EDX)鉴定，纳米颗粒中主要元素为硒元素，证明此纳米颗粒为纳米硒。以上结果表明复合益生菌将亚硒酸钠转化为粒径为50～100nm的纳米硒并富集在菌体内。
步骤五、添加保护剂，冷冻干燥
配置含有15％脱脂奶粉、10％海藻糖和0.8％乙酸钠的复合冻干保护剂，将富硒发酵产物与冻干保护剂混合，搅拌均匀、使两者充分接触。室温下平衡30分钟后置于-80℃预冷冻5h，再置于冷冻干燥机中冷冻干燥3天。
实施例2：
步骤一、菌株活化：
用NA固体培养基对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373菌株进行活化培养：将Bacillus subtilis ACCC 19373划线接种于NA固体培养基，于30℃培养48h；所述NA固体培养基配方如下：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％。将活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373的单菌落用NA液体培养基，30℃、180rpm培养24h；所述NA液体培养基配方如下：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％。
用YPD固体培养基对乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799菌株进行活化培养：将Kluyveromyces lactis GG 799划线接种于YPD固体培养基，于30℃培养48h；所述YPD固体培养基配方如下：酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％。将活化后的乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799的单菌落用YPD液体培养基，30℃、200rpm培养24h；所述YPD固体培养基配方如下：酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％。
用MRS固体培养基对干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393菌株进行活化培养：将Lactobacillus casei ATCC 393划线接种于MRS固体培养基，于37℃厌氧培养48h；所述MRS固体培养基配方如下：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，七水硫酸镁0.06％，一水硫酸锰0.025％，吐温800.1％，琼脂2％。将活化后的干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393的单菌落用MRS液体培养基，37℃、静置培养24h；所述MRS液体培养基配方如下：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，七水硫酸镁0.06％，一水硫酸锰0.025％，吐温800.1％。
步骤二、复合益生菌富硒发酵中药培养基的制备：
称取质量比为9：9：9：9：9：9：9的党参、黄芪、白术、神曲、苦参、蒲公英和乌梅，粉碎后过60目筛得到混合中药粉末。加入蒸馏水升温至100℃，煮沸后转小火浸煮75min；加入酵母膏1％，蛋白胨2％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％和葡萄糖2％；加蒸馏水定容至中药含量为10％，；高压蒸汽灭菌后冷却至室温。
步骤三、发酵培养
将5％的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373和5％乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799菌液按1:1的比例接种到复合益生菌富硒发酵中药培养基中，在30℃、180rpm条件下发酵培养60h。
步骤四、富硒发酵培养
将10％的干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393接种到发酵培养60h后的培养基中，在37℃条件下静置发酵培养12h。再向培养基中加入终浓度为1mM的亚硒酸钠，继续37℃静置厌氧富硒发酵培养24h。
步骤五、冷冻干燥
将未发酵、发酵后及富硒发酵后样品加入冻干保护剂后置于-80℃预冷冻5h，再置于冷冻干燥机中冷冻干燥3天。
中药颗粒未发酵、发酵后及富硒发酵后形貌比较
为观察复合益生菌对中药纤维素的降解作用，采用扫描电镜(SEM)观察未发酵及富硒发酵后冻干样品的中药颗粒形貌。结果如图3所示，富硒发酵后的中药颗粒与未发酵的中药颗粒相比，中药中束状结构的纤维较明显，纤维束细胞壁得到分解，排列杂乱。表明复合益生菌在富硒发酵过程中对中药组合物的细胞壁有降解作用，有利于提高可溶性有效活性成分含量。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种饲用复合微生态制剂，由复合益生菌对底物发酵制备得到，所述底物包括中药组合物和亚硒酸钠；
所述复合益生菌包括：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373、乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799和干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC 393；
所述中药组合物包括以下原料：党参、黄芪、白术、神曲、苦参、蒲公英和乌梅。
2.根据权利要求1所述的饲用复合微生态制剂，其特征在于，所述中药组合物包括以下重量份数的原料：党参9～30份、黄芪9～30份、白术6～12份、神曲6～15份、苦参4.5～9份、蒲公英9～15份和乌梅6～12份。
3.权利要求1或2所述的饲用复合微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将党参、黄芪、白术、神曲、苦参、蒲公英和乌梅进行粉碎，过筛后加水煎煮，得到含有中药组合物和浸提物的混合物；
2)将所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 19373和乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis GG 799接种于发酵培养基中，进行第一发酵；所述发酵培养基包含所述混合物；
3)在所述第一发酵后的发酵产物中接种干酪乳酸杆菌Lactobacillus casei ATCC393，进行第二发酵；
4)在所述第二发酵后的发酵产物中加入亚硒酸钠，进行第三发酵，得到饲用复合微生态制剂；所述第三发酵于厌氧条件下进行。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基中中药组合物的质量浓度为9％～11％。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述亚硫酸钠的初始浓度为0.8～1mM。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述第三发酵后，还包括将所述第三发酵的发酵产物和冻干保护剂混合，进行冷冻干燥。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括以下质量百分含量的组分：13％～17％脱脂奶粉、8％～12％海藻糖和0.6％～1.0％乙酸钠。
8.一种饲料，包括权利要求1或2所述的饲用复合微生态制剂或者权利要求3～7任意一项所述制备方法制备得到的饲用复合微生态制剂。
9.根据权利要求8所述的饲料，其特征在于，所述饲料中饲用复合微生态制剂的添加量占饲料质量的1％～3％。
10.权利要求1或2所述的饲用复合微生态制剂或者权利要求3～7任意一项所述制备方法制备得到的饲用复合微生态制剂或者权利要求8或9所述的饲料在提高动物生长性能、提高动物生性能、提高动物的抗氧化能力或者提高动物的免疫力中的应用。
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