WO2024067474A1

WO2024067474A1 - 靶向pd-1，ctla-4和vegf的三特异性抗体及其应用

Info

Publication number: WO2024067474A1
Application number: PCT/CN2023/121074
Authority: WO
Inventors: 苏云鹏; 李勇; 尹巧汕; 庄伟亮; 宋飞; 随瑞瑞; 吴峰; 姜殿东; 奚悦; 许金玲; 杨临川; 梁绍勤
Original assignee: 上海宏成药业有限公司
Priority date: 2022-09-29
Filing date: 2023-09-25
Publication date: 2024-04-04

Abstract

一种特异性结合PD-1，CTLA-4和VEGF的三特异性抗体，还涉及包含该三特异性抗体的组合物及其在肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病或血管发生相关疾病治疗中的应用。

Description

靶向PD-1，CTLA-4和VEGF的三特异性抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向PD-1，CTLA-4和VEGF的三特异性抗体及其在肿瘤治疗中的应用。

背景技术

虽然免疫疗法显著地增强了对疾病(例如癌症)的治疗能力，但是由于疾病的复杂性，临床研究中发现，很多患者不能对单特异疗法产生足够的应答。肿瘤微环境由肿瘤细胞、免疫细胞、血管细胞等细胞以及细胞外基质中的非细胞成分组成，各个组分之间的相互作用限制了宿主的抗肿瘤免疫及对肿瘤生长的控制。研究人员期望通过开发针对不同细胞、不同靶点的联合疗法以期达到更好的治疗效果。例如阻断免疫检查点PD-1的抗体纳武单抗(Nivolumab)和阻断CTLA-4的抗体伊匹单抗(Ipilimumab)的联合使用在临床前和临床上可以激起更强的免疫反应，比阻断单个免疫检查点具有更好的治疗效果(The efficacy and safety of combined immune checkpoint inhibitors(nivolumab plus ipilimumab):a systematic review and meta-analysis,Jingjie Chen et.al.,World J Surg Oncol,2020Jul 3；18(1):150)。但是上述联合治疗同时增加了用药成本，还增加了多种副作用，具有更高的毒性，这可能与伊匹单抗对调节性T细胞(Treg)的清除有关(Safety profiles of anti-CTLA-4 and anti-PD-1 antibodies alone and in combination，Celine Boutros et.al.,Nat Rev Clin Oncol,2016 Aug；13(8):473-86)。

免疫检查点PD-1和CTLA-4在不同免疫细胞上具有不同的表达模式、二者介导的信号相互作用抑制抗肿瘤免疫，因此，同时阻断PD-1和CTLA-4可以通过多种机制促进抗肿瘤免疫(PD-L1:CD80 Cis-Heterodimer Triggers the Co-stimulatory Receptor CD28 While Repressing the Inhibitory PD-1 and CTLA-4 Pathways,Yunlong Zhao et.al.,Immunity.2019 Dec 17；51(6):1059–1073.e9)。同时靶向PD-1和CTLA-4的双特异性抗体不但可以同时阻断PD-1和CTLA-4的信号通路，还可以通过诱导PD-1的内吞导致其降解，在PD-1和CTLA-4共表达细胞上(如肿瘤微环境中的耗竭T细胞)，增强阻断CTLA-4与CD80的相互作用等机制促进抗肿瘤免疫，并且在临床上对免疫检查点抑制剂无效的病人显示出疗效(Development and Preliminary Clinical Activity of PD-1-Guided CTLA-4 Blocking Bispecific DART Molecule,Alexey Berezhnoy et al.,Cell Rep Med.2020 Dec 22；1(9):100163，Design and Efficacy of a Monovalent Bispecific PD-1/CTLA4 Antibody That Enhances CTLA-4 Blockade on PD-1⁺Activated T Cells,Dovedi SJ et al.,Cancer Discovery,08 Jan 2021,11(5):1100-1117)。

血管生成因子可以通过直接抑制抗原呈递细胞和免疫效应细胞的功能，和通过增强调节性T细胞(Treg)等免疫抑制细胞的功能来驱动免疫抑制，而免疫抑制细胞通过分泌细胞因子等促进血管生成。免疫反应和血管生成之间相互影响，均在肿瘤发生、发展中发挥重要作用。研究发现，免疫检查点抑制剂可以促进肿瘤组织中的血管正常化(The Intersection between Tumor Angiogenesis and Immune Suppression，Rahma OE et al.,Clin Cancer Res(2019)25(18):5449–5457)，抗血管生成也可以改善肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫(Antiangiogenic therapy reverses the immunosuppressive breast cancer microenvironment，Wuzhen Chen et al.,Biomark Res.2021 Jul 22；9(1):59)。抗PD-L1抗体阿替利珠单抗(atezolizumab)和贝伐单抗(bevacizumab)的联合用药在不可切除的肝癌中效果显著(Atezolizumab plus Bevacizumab in Unresectable Hepatocellular Carcinoma，Richard S Finn et al.,N Engl J Med.，2020 May14；382(20):1894-1905)，被FDA批准用于不可切除的肝癌的治疗。其他免疫检查点抑制剂(包括抗PD-1/PD-L1抗体)和抗血管生成抑制剂(包括抗VEGF抗体和其他阻断VEGF信号的小分子抑制剂)的联合使用在临床上也取得积极的效果(Combination of Anti-Angiogenics and Checkpoint Inhibitors for Renal Cell Carcinoma:Is the Whole Greater Than the Sum of Its Parts？，Eric Jonasch et al.,Cancers(Basel).2022 Jan 27；14(3):644)。同时阻断免疫检查点和血管生成的双特异性抗体在临床前动物模型中显示出比联合使用更好的药效(A Novel Bispecific Antibody Targeting PD-L1 and VEGF With Combined Anti-Tumor Activities，Xiaopei Cui，Front Immunol.2021 Dec 2；12:778978)。最近研究发现，抗PD-L1抗体阿替利珠单抗(atezolizumab)和贝伐单抗(bevacizumab)的联合用药在治疗肝癌时，Treg与效应T细胞的比例较高的病人联合用药的效果较差(Molecular correlates of clinical response and resistance to atezolizumab in combination with bevacizumab in advanced hepatocellular carcinoma.Andrew X Zhu et al.Nat Med.2022 Aug；28(8):1599-1611)。这说明同时靶向T细胞、Treg细胞和血管生成可能会给临床上提供新的治疗思路。

因此，同时靶向多个靶标的多特异性抗体，例如双特异性和三特异性抗体为临床治疗复杂疾病提供了巨大的希望。然而，本领域已经认识到，简单地将两个以上抗体或蛋白质连接在一起，通常不会引起协同效应，甚至会产生不利影响。因此双特异性或三特异性抗体，特别是三特异性抗体，在设计上面临巨大的挑战，需要考虑大量的可变因素，包括分子的相容性，抗体的亲和力、稳定性和药学特性。

本发明通过提供可以同时阻断两个主要的免疫检查点和一个主要的血管生成途径的三特异性抗体，在一定程度上解决了上述问题并满足了市场的需求。本发明提供的三特异性抗体可以在肿瘤微环境中，同时靶向PD-1、CTLA-4和VEGF，同时阻断免疫抑制和血管生成，调控肿瘤微环境中的免疫反应与血管生成，从而实现三个抗体联合使用的治疗效果。

发明内容

本发明提供了新型的同时靶向PD-1、CTLA-4和VEGF的三特异性抗体，所述三特异性抗体同时保留了各抗原结合位点的良好的抗原结合特异性、选择性并由此具有良好的生物活性。在体外药效研究中，本发明的三特异性抗体具有与抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体联合使用类似的免疫激活活性，且与贝伐单抗具有类似的阻断VEGF的活性。在体内多种肿瘤(如黑色素瘤、肺癌、结肠癌、肝癌等)的治疗中，本发明的三特异性抗体具有与抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体和贝伐单抗联合使用相当甚至更优的抗肿瘤活性。相比单一疗法和联合用药，靶向PD-1、CTLA-4和VEGF的三特异性抗体具有如下优势：

1.三特异性抗体可以协同抑制肿瘤细胞增殖，比任一单抗具有更好的治疗效果

2.针对各个靶点具有2价的抗原结合位点数，因此比具有1价抗原结合位点的多特异性抗体具有更强的亲和力；

3.改善受试者针对单克隆抗体的低免疫应答性；

4.采用没有或具有较弱ADCC功能的FC减少或降低抗CTLA-4单克隆抗体由于Treg清除导致的毒副作用；

5.通过PD-1介导的导向作用，增加三特异性抗体在肿瘤与外周分布的比例，降低CTLA-4和VEGF靶向的毒性；

6.三特异性抗体可以通过CTLA-4介导的内吞作用降解细胞表面的PD-1抗原；

7.减少给药频率和降低由联合给药造成的不适；

8.具有增加的稳定性；和

9.延长抑制肿瘤有效期。

总体而言，本发明提供的三特异性抗体分子可以识别3个靶点，与3个抗体联合使用相比可以显著降低费用；三特异性抗体分子针对每个靶标的两个相同的抗原结合位点基本上保留了相应天然2价抗体对靶点的结合能力，可以在肿瘤局部发挥协同效应。此外，本发明提供的三特异性抗体具有良好的纯度和热稳定性，都非常有利于下游的进一步开发和大规模生产。

因此，本发明主要涉及如下方面：

第一方面，本发明提供了一种同时靶向PD-1、CTLA-4和VEGF的三特异性抗体，所述抗体包含第一、第二、第三抗原结合位点，其中所述第一、第二、第三抗原结合位点结合互不相同的，彼此独立地选自PD-1，CTLA-4和VEGF的第一、第二、第三抗原。

在一个实施方案中，本发明提供的三特异性抗体包含二聚化的Fc区，所述第一、第二和第三抗原结合位点中的一个或者多个连接在二聚化Fc区的N端和/或C端。

在本发明提供的三特异性抗体的再一个实施方案中，所述第一、第二和第三抗原结合位点可以是Fab，scFv，或VHH的形式。在一个具体的实施方案中，识别抗原CTLA-4的抗原结合位点是scFv或VHH的形式。

在本发明提供的三特异性抗体的一个具体的实施方案中，结合PD-1的抗原结合位点包含如下重链CDR(HCDR)和/或轻链CDR(LCDR)：包含SEQ ID NO:1所示序列或由其组成的HCDR1，包含SEQ ID NO:2所示序列或由其组成的HCDR2和包含SEQ ID NO:3所示序列或由其组成的HCDR3；和/或包含SEQ ID NO:4所示序列或由其组成的LCDR1，包含SEQ ID NO:5所示序列或由其组成的LCDR2和包含SEQ ID NO:6所示序列或由其组成的LCDR3。

在本发明提供的三特异性抗体的一个具体的实施方案中，结合PD-1的抗原结合位点包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的序列，或包含与SEQ ID NO:7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:7所示的序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的序列，或包含与SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:8所示的序列组成。

在本发明提供的三特异性抗体的一个具体的实施方案中，结合CTLA-4的抗原结合位点包含如下HCDR和/或LCDR：包含SEQ ID NO:17所示序列或由其组成的HCDR1，包含SEQ ID NO:18所示序列或由其组成的HCDR2和包含SEQ ID NO:19所示序列或由其组成的HCDR3；和/或包含SEQ ID NO:20所示序列或由其组成的LCDR1，包含SEQ ID NO:21所示序列或由其组成的LCDR2和包含SEQ ID NO:22所示序列或由其组成的LCDR3。

在本发明提供的三特异性抗体的另一个具体的实施方案中，结合CTLA-4的抗原结合位点是VHH，并包含如下HCDR：包含SEQ ID NO:12所示序列或由其组成的HCDR1，包含SEQ ID NO:13所示序列或由其组成的HCDR2和包含SEQ ID NO:14所示序列或由其组成的HCDR3。

在本发明提供的三特异性抗体的一个具体的实施方案中，结合CTLA-4的抗原结合位点包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:15所示的序列，或包含与SEQ ID NO:15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:15所示的序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16所示的序列，或包含与SEQ ID NO:16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:16所示的序列组成。

在本发明提供的三特异性抗体的一个具体的实施方案中，结合CTLA-4的抗原结合位点包含单个VH结构域(VHH)，所述VHH包含SEQ ID NO:11所示的序列，或包含与SEQ ID NO:11具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:11所示的序列组成。

在一个本发明提供的三特异性抗体的具体的实施方案中，结合VEGF的抗原结合位点包含如下HCDR和/或LCDR：包含SEQ ID NO:26所示序列或由其组成的HCDR1，包含SEQ ID NO:27所示序列或由其组成的HCDR2和包含SEQ ID NO:28所示序列或由其组成的HCDR3；和/或包含SEQ ID NO:29所示序列或由其组成的LCDR1，包含SEQ ID NO:30所示序列或由其组成的LCDR2和包含SEQ ID NO:31所示序列或由其组成的LCDR3。

在本发明提供的三特异性抗体的一个具体的实施方案中，结合VEGF的抗原结合位点包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:24所示的序列，或包含与SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:24所示的序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25所示的序列，或包含与SEQ ID NO:25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:25所示的序列组成。

在本发明提供的三特异性抗体的一个实施方案中，所述第一、第二、第三抗原结合位点包含：

1)结合PD-1的抗原结合位点，其具有包含SEQ ID NO:1所示序列或由其组成的HCDR1，包含SEQ ID NO:2所示序列或由其组成的HCDR2和包含SEQ ID NO:3所示序列或由其组成的HCDR3；和包含SEQ ID NO:4所示序列或由其组成的LCDR1，包含SEQ ID NO:5所示序列或由其组成的LCDR2和包含SEQ ID NO:6所示序列或由其组成的LCDR3；

2)结合CTLA-4的抗原结合位点，其具有

i)包含SEQ ID NO:17所示序列或由其组成的HCDR1，包含SEQ ID NO:18所示序列或由其组成的HCDR2和包含SEQ ID NO:19所示序列或由其组成的HCDR3；和包含SEQ ID NO:20所示序列或由其组成的LCDR1，包含SEQ ID NO:21所示序列或由其组成的LCDR2和包含SEQ ID NO:22所示序列或由其组成的LCDR3；或

ii)包含SEQ ID NO:12所示序列或由其组成的HCDR1，包含SEQ ID NO:13所示序列或由其组成的HCDR2和包含SEQ ID NO:14所示序列或由其组成的HCDR3；和

3)结合VEGF的抗原结合位点，其具有包含SEQ ID NO:26所示序列或由其组成的HCDR1，包含SEQ ID NO:27所示序列或由其组成的HCDR2和包含SEQ ID NO:28所示序列或由其组成的HCDR3；和包含SEQ ID NO:29所示序列或由其组成的LCDR1，包含SEQ ID NO:30所示序列或由其组成的LCDR2和包含SEQ ID NO:31所示序列或由其组成的LCDR3。

1)结合PD-1的抗原结合位点，其包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的序列，或包含与SEQ ID NO:7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:7所示的序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的序列，或包含与SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:8所示的序列组成；

2)结合CTLA-4的抗原结合位点，其包含

i)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:15所示的序列，或包含与SEQ ID NO:15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:15所示的序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16所示的序列，或包含与SEQ ID NO:16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:16所示的序列组成；或

ii)包含SEQ ID NO:11所示的序列，或包含与SEQ ID NO:11具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:11所示的序列组成；和

3)结合VEGF的抗原结合位点，其包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:24所示的序列，或包含与SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:24所示的序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25所示的序列，或包含与SEQ ID NO:25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:25所示的序列组成。

在本发明提供的三特异性抗体的一个实施方案中，抗原结合位点包含一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合，在一个优选的实施方案中，所述取代发生在框架区(FR区)，在一个更优选的实施方案中，所述取代是重链可变区的G44C、轻链可变区的Q100C或G100C(按照Kabat编号)。

在本发明提供的三特异性抗体的一个实施方案中，包含同二聚化的Fc区或异二聚化的Fc区，所述Fc区可以是具有天然序列或变体序列的免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的Fc区。在一个优选的实施方案中，Fc区包含修饰，例如Fc区包含杵臼结构。在一个更优选的实施方案中，Fc区包含选自S228P、S354C、T366W、T366S、L368A、Y394C、Y407V、H435R、Y436F、K447A的取代(依照EU编号系统)。在一个实施方案中，Fc区衍生自SEQ ID NO:33、34或35所示的重链恒定区序列。

在本发明提供的三特异性抗体的一个实施方案中，所述第一、第二、第三抗原结合位点之间，或者所述第一、第二、第三抗原结合位点与Fc区之间通过接头/铰链区连接。在一个优选的实施方案中，所述接头包含氨基酸序列(G₄S)_n，其中n是等于或大于1的整数。在一个优选实施方案中，接头由氨基酸序列(G₄S)₃或(G₄S)₄组成。在一个优选的实施方案中，所述接头具有SEQ ID NO:9所示的序列。

一个实施方案中，本发明提供了一种三特异性抗体，其包含第一、第二、第三抗原结合位点，且由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，所述重链和轻链具有选自如下的结构：

1)重链，其从N端到C端包含VH-CH1-Fc-VHH-ScFv的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构；

2)重链，其从N端到C端包含ScFv-VH-CH1-Fc-VHH的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构；

3)重链，其从N端到C端包含VHH-VH-CH1-Fc-ScFv的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构；

4)重链，其从N端到C端包含VH-CH1-Fc-ScFv-VHH的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构；

5)重链，其从N端到C端包含VH-CH1-Fc-ScFv的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL-VHH的结构；

6)重链，其从N端到C端包含ScFv-VH-CH1-Fc-ScFv的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构；

7)重链，其从N端到C端包含VH-CH1-Fc-ScFv的结构，

轻链，其从N端到C端包含VHH-VL-CL的结构；或

8)重链，其从N端到C端包含ScFv-VHH-VH-CH1-Fc的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构；

其中Fc表示免疫球蛋白重链的Fc区，其中包含Fc区的两条重链藉由Fc区同二聚化，

其中CH1表示免疫球蛋白重链CH1结构域，CL表示免疫球蛋白轻链CL结构域，

其中VH-CH1和VL-CL相互配对形成Fab，

其中第一、第二、第三抗原结合位点为Fab、VHH和/或ScFv的形式，且分别结合互不相同的，彼此独立地的抗原PD-1，CTLA-4和VEGF。

在一个优选的实施方案中，相邻的抗原结合位点之间通过接头连接，优选地，抗原结合位点与Fc通过接头/铰链区连接。

另一个实施方案中，本发明提供了一种三特异性抗体，其包含第一、第二、第三抗原结合位点，且由具有如下结构的三条链组成：

1)第一重链，其从N端到C端包含VH-CH1-Fc-ScFv的结构，

2)第二重链，其从N端到C端包含VHH-Fc-ScFv的结构，和

3)轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构，

其中Fc为包含杵臼结构的免疫球蛋白重链的Fc区，其中包含Fc区的两条重链藉由Fc区异二聚化，

其中VH-CH1和VL-CL相互配对形成Fab，

再一个实施方案中，本发明提供了一种三特异性抗体，其包含第一、第二、第三抗原结合位点，且由具有如下结构的三条链组成：

1)第一重链，其从N端到C端包含VH-CH1-Fc-ScFv2的结构，

2)第二重链，其从N端到C端包含ScFv1-Fc-ScFv2的结构，

3)轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构，

其中VH-CH1和VL-CL相互配对形成Fab，

其中第一、第二、第三抗原结合位点为Fab、ScFv1和/或ScFv2的形式，且分别结合互不相同的，彼此独立地的抗原PD-1，CTLA-4和VEGF。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种三特异性抗体，其包含第一、第二、第三抗原结合位点，且由具有如下结构的两条链组成：

1)第一重链，其从N端到C端包含ScFv1-Fc-ScFv2的结构，

2)第二重链，其从N端到C端包含VHH-Fc-ScFv2的结构，

其中第一、第二、第三抗原结合位点为VHH、ScFv1和/或ScFv2的形式，且分别结合互不相同的，彼此独立地的抗原PD-1，CTLA-4和VEGF。

在一个优选的实施方案中，上述三特异性抗体的第一、第二、第三抗原结合位点包含：

2)结合CTLA-4的抗原结合位点，其具有

1)结合PD-1的抗原结合位点，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的序列，或包含与SEQ ID NO:7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:7所示的序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的序列，或包含与SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:8所示的序列组成；

2)结合CTLA-4的抗原结合位点，其包含

3)结合VEGF的抗原结合位点，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:24所示的序列，或包含与SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:24所示的序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25所示的序列，或包含与SEQ ID NO:25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:25所示的序列组成。

在一个优选的实施方案中，上述第一、第二、第三抗原结合位点包含在框架区(FR区)中的取代。在一个更优选的实施方案中，所述取代是重链可变区的G44C、轻链可变区的Q100C或G100C(按照Kabat编号)。

在一个优选的实施方案中，上述三特异性抗体的Fc区来自IgG1或IgG4的Fc区。在一个优选的实施方案中，Fc区包含修饰，例如Fc区包含杵臼结构。在一个更优选的实施方案中，Fc区包含选自S228P、S354C、T366W、T366S、L368A、Y394C、Y407V、H435R、Y436F、 K447A的取代(依照EU编号系统)。在一个优选的实施方案中，Fc区衍生自SEQ ID NO:33、34或35所示的重链恒定区序列。

在一个优选的实施方案中，所述接头包含氨基酸序列(G₄S)_n，其中n是等于或大于1的整数。在一个优选实施方案中，接头由氨基酸序列(G₄S)₃或(G₄S)₄组成。在一个优选的实施方案中，所述接头具有SEQ ID NO:9所示的序列。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种三特异性抗体，其包含：

1)包含SEQ ID NO:37或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:38或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；或

2)包含SEQ ID NO:39或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:40或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；或

3)包含SEQ ID NO:41或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:42或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；或

4)包含SEQ ID NO:43或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:44或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；或

5)包含SEQ ID NO:45或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:46或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；或

6)包含SEQ ID NO:47或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:48或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；或

7)包含SEQ ID NO:49或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:50或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；或

8)包含SEQ ID NO:59或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:60或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；或

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2)包含SEQ ID NO:56或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:58或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:57或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链。

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1)包含SEQ ID NO:37或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:38或由其组成的轻链；或

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1)包含SEQ ID NO:51或由其组成的第一重链，包含SEQ ID NO:53或由其组成的第二重链，和包含SEQ ID NO:52或由其组成的轻链；或

2)包含SEQ ID NO:56或由其组成的第一重链，包含SEQ ID NO:58或由其组成的第二重链，和包含SEQ ID NO:57或由其组成的轻链。

包含SEQ ID NO:54或由其组成的第一重链，和包含SEQ ID NO:55或由其组成的第二重链。

第二个方面，本发明提供了编码本发明三特异性抗体分子的多核苷酸；包含所述多核苷酸的载体；包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。

在一个实施方案中，所述载体优选是表达载体。

在一个实施方案中，所述宿主细胞可以是本领域通用的原核细胞和真核细胞。

在一个实施方案中，本发明提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明载体的宿主细胞。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。可以使用适于悬浮培养的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)、人胚肾系(HEK293或293F细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(HepG2)、CHO细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0等。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO、HEK293或NSO细胞。

第三个方面，本发明提供了一种用于产生本发明三双特异性抗体的方法，包括步骤(i)在适于表达本发明第一方面中公开的三特异性抗体的条件下培养本发明第二方面中公开的宿主细胞，任选地，(ii)回收本发明的三特异性抗体。

第四个方面，本发明提供了一种包含本发明三特异性抗体分子的药物组合物。

在一个实施方案中，本发明提供的药物组合物还包含其它治疗剂，以及任选的药用辅料；优选地，所述其它治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂等。

第五个方面，本发明提供了本发明三特异性抗体、药物组合物的用途，用于治疗、预防和/或诊断癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病或血管发生相关疾病。

在一个实施方案中，本发明提供了第一方面所述的任何抗体、第二方面所述的任何多核苷酸或载体或宿主细胞、第四方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防和/或诊断癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病或血管发生相关疾病。

在一个实施方案中，本发明提供了第一方面所述的任何抗体、第二方面所述的任何多核苷酸或载体或宿主细胞、第四方面所述的药物组合物用于治疗、预防和/或诊断。

在一个实施方案中，本发明提供了第一方面所述的任何抗体、第二方面所述的任何多核苷酸或载体或宿主细胞、第四方面所述的药物组合物用于治疗、预防和/或诊断癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病或血管发生相关疾病。

在一个实施方案中，所述癌症例如是肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、黑素瘤,结肠癌、直肠癌,卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺腺癌、基底细胞癌、食道癌、胆管癌、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌、脑癌、胃癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、睾丸癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤等实体瘤和白血病、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤)等血液瘤。

第六个方面，本发明提供了治疗、预防和/或诊断癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病或血管发生相关疾病的方法，包括将有效量的本发明的三特异性抗体，或本发明的药物组合物施用给有需要的患者。

附图说明

图1显示了本申请构建的三特异性抗体的结构示意图。

图2显示了三特异性抗体与细胞表面PD-1结合的活性。采用FACS检测三特异性抗体与293T-hPD-1细胞的结合活性，图A和图B分别为实验FACS#1和FACS#2。

图3显示了三特异性抗体与细胞表面CTLA-4结合的活性。采用FACS检测三特异性抗体与CHO-hCTLA-4细胞的结合活性，图A和图B分别为实验FACS#3和FACS#4

图4显示了三特异性抗体与活化的T细胞结合的活性。图A显示了三特异性抗体及抗PD-1抗体与T细胞的结合活性；图B显示了抗CTLA-4抗体与T细胞结合的活性。

图5显示了三特异性抗体结合293T-hPD-1-hCTLA-4细胞(共表达PD-1和CTLA-4)后与游离VEGFA的结合活性。

图6显示了三特异性抗体与活化的T细胞结合后与游离的VEGFA的结合活性。

图7显示了三特异性抗体促进SEB刺激PBMC分泌IL-2的能力。图A和B分别显示来自供者Lot#A10Z707023和Lot#A 10Z647018的PBMC经SEB和抗体处理3天后分泌IL-2的结果。

图8显示了三特异性抗体促进MLR中IL-2的分泌。MLR中加入三特异性抗体或对照抗体，4天后检测IL-2的分泌。图A：DC供者：Lot#Z0160，PBMC供者Lot#Z0177，4天后检测IL-2的分泌；图B：DC供者：Lot#Z0160，PBMC供者Lot#Z0182。

图9显示了不同浓度的三特异性抗体在含有不同比例的Treg的MLR中增加IL-2的分泌。A-C中测试抗体的浓度分别为：500、50和5nM，MLR中处理4天后检测IL-2的分泌。

图10显示了三特异性抗体抑制VEGFA诱导人脐静脉内皮细胞的增殖。

图11显示了三特异性抗体HC010-F8抑制人PBMC人源化小鼠中人黑素瘤A375的生长。

图12显示了三特异性抗体HC010-F8在人PBMC人源化人黑素瘤A375小鼠模型中不影响小鼠的体重。

图13显示了三特异性抗体结合人PD-1后与VEGFA(图A)和CTLA-4(图B)的结合。

图14显示了三特异性抗体结合细胞表面人PD-1后与VEGFA(图A)和CTLA-4(图B)的结合。

图15显示了三特异性抗体结合细胞表面人CTLA-4后与PD-1(图A)和VEGF(图B)的结合。

图16显示了三特异性抗体HC010-F8和HC010-F23抑制人PBMC人源化小鼠中人黑素瘤A375的生长。

图17显示了三特异性抗体HC010-F8和HC010-F23在人PBMC人源化人黑素瘤A375小鼠模型中不影响小鼠的体重。

图18显示了三特异性抗体抑制小鼠中人非小细胞肺癌A549细胞的活性。

图19显示了三特异性抗体抑制小鼠中人非小细胞肺癌H1299细胞的活性。

图20显示了三特异性抗体抑制小鼠中人肝癌Huh7细胞的活性。

发明详述

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。

I.定义

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质。

术语“抗原结合位点”与“抗原结合结构域”可以互换使用，表示抗体分子中与抗原实际结合的区域。抗原结合位点包括但不限于Fv、Fab片段、Fab'、Fab'-SH，F(ab')2、单链抗体分子(例如scFv)、VHH等形式。

术语“免疫球蛋白”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质，在本申请中通常可以与术语“抗体”互换使用。IgG类免疫球蛋白是由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条免疫球蛋白重链具有一个重链可变区(VH)，也称作重链可变结构域，随后是三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条免疫球蛋白轻链具有一个轻链可变区(VL)，也称作轻链可变结构域，随后是一个轻链恒定结构域(CL)。在IgG分子中，通常重链的VH-CH1与轻链的VL-CL配对形成特异性结合抗原的Fab片段。因此，一个IgG免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和两个二聚化的Fc区组成。免疫球蛋白的重链可以基于其恒定区的类型，归属5个类别之一，称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些类别可以进一步划分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链也可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。

术语抗体的“可变区”或“可变结构域”指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。抗体的可变区可以进一步再划分为超变区(即，互补决定区(CDR))和间插在超变区之间的较为保守的区域(即，构架区(FR))。在IgG类免疫球蛋白的情况下，重链可变区或轻链可变区从N端至C端依次分别包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在重链抗体(在本文中也称作纳米抗体)的情况下，例如来自骆驼科重链抗体，抗原结合位点由单个VH结构域(即，“VHH”结构域)组成。天然重链抗体的VHH与天然的IgG抗体的重链可变区一样，具有相似的结构，即包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。

术语“多特异性抗体”指具有至少两个抗原结合位点的抗体，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。

与抗体相关的表述“价”是指，抗体分子中的抗原结合位点的总数，或具有相同抗原结合特异性的抗原结合位点的数目。例如，6价抗体是指不论结合的表位是否相同，该抗体分子包含总共6个抗原结合位点，优选地，在本发明中，所述6价抗体具有三种不同的抗原结合特异性，其中针对每一种抗原结合特异性，分别存在2个相同的抗原结合位点。

“重链恒定区结构域”或“重链恒定区”指来自或获自或衍生自免疫球蛋白重链的恒定区结构域，包括从N端至C端顺序共价连接的重链恒定区CH1，CH2，CH3，和任选地重链恒定区CH4。在大多数情况下，重链恒定区CH1和CH2之间通过重链铰链区连接，但在适宜时，也可以通过柔性接头连接。在本发明的一些实施方案中，本发明抗体分子的重链恒定区包含CH1-Hinge-CH2-CH3。重链恒定区结构域可以根据抗体分子的预期功能进行选择。例如，恒定结构域可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域，尤其是人IgG的免疫球蛋白恒定结构域，例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定结构域。

在本发明的多特异性抗体中，包含Fc结构域的链为重链，而不含Fc结构域的链为轻链。在本发明的一些实施方案中，本发明的抗体分子由两条相同的重链和两条相同的轻链组成。在本发明的另一些实施方案中，本发明的抗体分子包含两条不同的重链。

术语“Fc结构域”或“Fc区”指免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然Fc区和变体Fc区。可用于本发明抗体中的Fc结构域包括但不限于，具有天然序列或变体序列的IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的Fc结构域。Fc结构域的C末端447位的赖氨酸残基(依照EU编号系统)可以存在或者缺失。除非本文中另外说明，否则Fc区或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系(也称作EU索引)进行编号。

可以利用已知的多种方法，对Fc结构域、包含Fc结构域的融合蛋白(例如抗体)进行修饰，例如以用于降低免疫原性、提高稳定性、溶解性、功能和临床益处的其他修饰。此类修饰包括但不限于下列修饰：可以通过修饰氨基酸残基K447以增加IgG稳定性，优选氨基酸取代K447A；可以通过修饰氨基酸残基S228以解决IgG4的异质性问题，优选氨基酸取代S228P；增加抗体稳定性的杵臼结构(knobs-into-holes)，其中杵(knob)可发生在氨基酸残基S354、T366处，臼(hole)可发生在氨基酸残基Y394、T366、L368、Y407处，优选杵可是如下氨基酸取代S354C、T366W，臼是如下氨基酸取代Y394C、T366S、L368A、Y407V；减少同源二聚体的臼(hole)结构，修饰可发生在氨基酸残基H435、Y436，优选氨基酸取代H435R、Y436F。

“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”，是抗体可变结构域中在序列上高度可变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。

术语“免疫检查点”意指免疫系统中存在的一类抑制性信号分子，通过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤，并参与维持对于自身抗原的耐受(Pardoll DM.,The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.Nat Rev Cancer,2012,12(4):252-264)。研究发现，肿瘤细胞能够逃避体内免疫系统而失控增殖的原因之一是利用了免疫检查点的抑制性信号通路，由此抑制了T淋巴细胞活性，使得T淋巴细胞不能有效发挥对肿瘤的杀伤效应。免疫检查点分子包括但不限于程序性死亡1(PD-1)、细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)、PD-L2、细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、LAG-3和TIM-3。

术语“PD-1”是指表达于T细胞表面的程序性细胞死亡蛋白1，其配体PD-L1或PD-L2表达于包括许多癌细胞的多种细胞类型表面。当PD-1与配体(PD-L1或PD-L2)结合后，通过募集SHP-2而抑制T细胞的活化，由此抑制T细胞增殖和效应功能，例如IFN-γ的产生和细胞毒活性。癌细胞也通过其表面的配体PD-L1或PD-L2以该机制抑制T细胞对其攻击从而产生免疫逃避。本文所用的术语“PD-1”包括人PD-1，人PD-1变体、同种型和物种同源物。

术语“人PD-1”指由野生型人PD-1基因编码的人PD-1蛋白，人PD-1例如公开在GenBank登录号NM_005018.2中。

术语“CTLA-4”，即细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，通过与配体CD80(也称为B7-1) 和CD86(也称为B7-2)结合，抑制免疫反应。CTLA-4通过多种方式抑制免疫反应：例如1)与T细胞共刺激受体CD28竞争其配体CD80和CD86，从而阻断共刺激；2)发出抑制T细胞活化的负面信号。CTLA-4抑制剂通过抑制CTLA-4分子，则能使T细胞大量增殖、攻击肿瘤细胞。本文所用的术语“CTLA-4”包括人“CTLA-4”，人CTLA-4变体、同种型和物种同源物。人CTLA-4例如公开在GenBank登录号AAB59385中。

PD-1和CTLA-4是同属于CD28家族的免疫检查点，均在活化的T细胞上表达，但两者在免疫应答的不同阶段、不同免疫细胞上表达存在一定差异。PD-1抑制剂与CTLA-4抑制剂对不同免疫细胞的活化存在差异，除了均可以活化耗竭的T细胞外，PD-1抑制剂主要活化细胞毒性T细胞和Treg，而CTLA-4抑制剂主要活化Th1效应T细胞和Tfh细胞(PMID:35241833)。与PD-1敲除和CTLA-4敲除小鼠的表型类似，PD-1抑制剂的毒性低于CTLA-4抑制剂，而CTLA-4抑制剂往往具有较大的毒性，这可能与其对外周的Treg的清除有关，例如用于治疗晚期黑素瘤的抗CTLA-4抗体伊匹单抗(Ipilimumab)由于具有严重的毒副作用，限制了其在临床上的广泛使用。

术语“VEGF”指血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor)，又称血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。VEGF是一个家族，包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE和胎盘生长因子(PGF)。

术语“VEGFA(血管内皮生长因子A)”是一种高度保守的27kDa二聚体糖蛋白，由内皮细胞以及肿瘤等多种细胞分泌。VEGFA因可变剪接产生的常见亚型有VEGFA121、VEGFA165、VEGFA189和VEGFA206，分别含有121、165、189和206个氨基酸。VEGFA包括人VEGFA，例如，登录号UniProt NO.:P15692下的人VEGFA蛋白。VEGFA是实体瘤生长过程中血管生成的关键性调节因子，因此，靶向VEGFA的治疗方案是目前肿瘤学的重点之一，贝伐单抗是首个批准上市的VEGFA抑制剂。在本申请通篇内容中，VEGF通常指VEGFA，例如VEGF165通常指VEGFA165。

术语“EC₅₀”，也被称为“半数有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的上下文中，EC₅₀的单位为“nM”。

术语“IC₅₀”，也被称为“半抑制浓度”，指某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物过程(或者是包含在此过程中的某些物质，比如酶，细胞受体或是微生物)的50％时的浓度。

术语“柔性接头”或“接头”或“连接肽”可互换使用，是指由氨基酸组成的短氨基酸序列，例如单独或组合使用的甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)和/或苏氨酸残基(T)，或来自免疫球蛋白的铰链区。

可以用于本发明中的接头可以容易地被本领域技术人员确定。例如，接头包含氨基酸序列(G₄S)_n，其中n是等于或大于1的整数。在一个优选实施方案中，连接子由氨基酸序列(G₄S)₃或(G₄S)₄组成。可以用于本发明抗体分子的接头还可以是，例如但不限于，如下氨基酸序列： (G₃S)2、(G₄S)₂、(G₃S)₃、(G₄S)₃、(G₃S)₄、(G₄S)₄、(G₃S)₅、(G₄S)₅、(G₃S)₆、(G₄S)₆、GGG、DGGGS、TGEKP、GGRR、EGKSSGSGSESKVD、KESGSVSSEQLAQFRSLD、GGRRGGGS、LRQRDGERP、LRQKDGGGSERP和GSTSGSGK PGSGEGSTKG。

如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法测定。

氨基酸序列的“同一性百分数(％)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明抗体分子的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％或更高。所述变体可以包含保守性修饰。

对于多肽序列，“保守性修饰”包括对多肽序列的置换、缺失或添加，它们导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于本发明的多态性变体、物种间同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。

术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

术语“个体”或“受试者”可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体是人。

术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。

术语“癌症”指哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。例如所述癌症是肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、黑素瘤,结肠癌、直肠癌,卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺腺癌、基底细胞癌、食道癌、胆道癌、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌、脑癌、胃癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、睾丸癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤等实体瘤和白血病、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤)等血液瘤。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括乳腺癌，胃癌，卵巢癌，胃食管交界处癌，膀胱癌，小肠癌和壶腹癌，食道癌、肺癌和宫颈癌。包括那些癌症的转移性形式。在一些实施方案中，本发明尤其提供了可用于肿瘤/癌症治疗的多特异性抗体、及其在所述肿瘤/癌症中的治疗应用。

术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。

术语“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。

术语“有效量”指本发明的抗体或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；体重、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

术语“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率、肿瘤体积等)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。

术语“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。

术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

II.本发明的抗体的生产和纯化

为了生产本发明的三特异性抗体，可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产的方法获得本发明的抗体的各个多肽链，并在适宜条件下使其装配。

在重组生产的情况下，可以将编码所述抗体的任意一条多肽链和/或多条多肽链的多核苷酸分离并插入一个或多个载体中以便随后可以在宿主细胞中进行克隆和/或表达。使用常规方法，可以轻易地分离所述多核苷酸并将其进行验证，例如通过测序的方法。在一个实施方案中，提供了编码本发明抗体三特异性的一条或多条多肽链的多核苷酸。在再一实施方案中，本发明提供了包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体，优选地表达载体。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于生产本发明三特异性抗体的方法，所述方法包括：在适于表达三特异性抗体的多肽链的条件下培养包含编码所述多肽链的宿主细胞；和在适于所述多肽链装配为所述三特异性抗体的条件下使多肽链装配产生所述抗体。

可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体。表达载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。

通过本文所述方法制备的抗体，可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。在纯化后，可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的抗体的物理/化学特性和/或生物学活性。

III.药物组合物、药物联合和试剂盒

在一个方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，所述组合物包含与可药用载体配制在一起的本文所述的抗体。如本文所用，“可药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。本发明的药物组合物适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。在一些实施方案中，本发明抗体是药物组合物中的唯一活性成分。在另一些实施方案中，药物组合物可以包含本文所述的抗体与一种以上治疗剂。

在另一方面，本发明也提供包含本文所述的抗体与一种以上治疗剂的药物联合。

本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、分散体剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。常见的优选组合物处于可注射用溶液剂或可输注溶液剂形式。

本发明的药物组合物可以包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明所述抗体。“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量等变动治疗有效量。治疗有效量是任何有毒或有害作用不及治疗有益作用的量。相对于未治疗的受试者，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约60％和仍更优选地至少约80％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价本发明的抗体抑制可度量参数(例如，肿瘤体积)的能力。“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在受试者中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量小于治疗有效量。

在另一个方面，本发明提供了包含本文所述抗体或组合物的试剂盒。试剂盒还可以包含一个或多个其他要素，例如包括：使用说明书；其他试剂，例如标记物或用于偶联的试剂；可药用载体；和用于施用至受试者的装置或其他材料等。

IV.本发明抗体和组合物的用途和治疗方法

本发明结合PD-1/CTLA-4/VEGF的三特异性抗体适于用作抗肿瘤、抗血管发生、抗自身免疫病、抗感染药物。在一些实施方案中，根据本发明的三特异性抗体用于癌症治疗，例如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、卵巢癌和脑癌。

实施例

以下实施例旨在仅对本发明进行举例说明，因此并不应被视为以任何方式限制本发明。

实施例1.抗PD-1/CTLA-4/VEGF三特异性抗体的构建、表达与纯化

1.1三特异性抗体的序列及结构

本申请基于抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VEGFA抗体构建了可以识别PD-1、CTLA-4和VEGF的三特异性抗体，其中抗PD-1抗体为自研抗体CQ1-3/1-11；抗CTLA-4抗体为已公开的纳米抗体202F1(申请号：CN202111229808.3，序列号：9)或伊匹单抗，其阻断CD80与CTLA-4的结合；抗VEGFA抗体为贝伐单抗(Bevacizumab)，其阻断VEGF与VEGFR-2(KDR)的结合，各个单抗的可变区序列见表1。在三特异性抗体中抗PD-1抗体和抗VEGFA抗体可以采用其Fab或scFv的形式，相应序列参见表1。各个抗体片段之间可以采用本领域常用的接头序列进行连接，例如采用(G₄S)₄(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:9))接头。现有技术中公开的人hIgG1或hIgG4的恒定区序列可以用于构建本申请的三特异性抗体，例如，三特异性抗体的恒定区序列为表2所示的hIgG1或hIgG4(S228P)序列。构建的三特异性抗体的结构及序列如表3所示。

表1.抗PD-1抗体CQ1-3/1-11、抗CTLA-4抗体202F1和抗VEGFA抗体贝伐单抗的可变区序列及相应ScFv结构的序列(粗体表示按照Kabat编码规则确定的CDR序列，下划线表示相应氨基酸残基的取代)

表2.hIgG1及hIgG4恒定区

表3.三特异性抗体的结构及序列(下划线表示相应氨基酸残基的取代)

1.2三特异性抗体的表达和纯化

按照表3中三特异性抗体的序列，合成相应序列的多核苷酸，并将其插入到表达载体pCDNA3.1中。测序正确后进行表达。具体方法如下：用编码如表3所示相应三特异性抗体的轻链和重链的表达质粒各100μg共转染200mL细胞密度为3×10⁶细胞/mL的expiCHO细胞(Gibco，货号：A29129)，在37℃，二氧化碳培养摇床中培养7天，离心收集上清液，并用0.22μM滤膜过滤上清液，将过滤后的上清液转移至含有2mL protein A层析填料MabSelect PrismA(cytiva，货号：17549802)的protein A层析柱(预先用5个柱体积的PBS溶液进行平衡)进行亲和层析。样品保留时间至少2分钟，然后用10-15倍柱体积的PBS溶液清洗层析柱以去除非特异性吸附的杂质，再用4mL的20mM Na-Citrate,pH3.2的洗脱液洗脱目的蛋白，最后用1M Tris调节洗脱液的pH至5.0-6.0。离心过滤后用紫外分光光度计检测蛋白质浓度，根据浓度计算相对表达量，并利用尺寸排阻层析联合高效液相色谱(Dionex,Ultimate 3000)检测蛋白质纯度。检测的各个三特异性抗体的相应表达量和纯度见表4。

关于本申请使用的对照抗体，如下构建并根据上述方法进行相应表达和纯化，针对具体抗体对具体表达和纯化的相应参数进行调整属于本领域技术人员的常规知识范畴：

将表1中抗PD-1抗体(CQ1-3/1-11)的重链可变区与表2中的hIgG4-1恒定区序列融合，得到全长重链；并将CQ1-3/1-11的轻链可变区与表2中的轻链恒定区序列融合得到全长轻链，由此获得的全长抗体命名为CQ1-3/1-11-hIgG4抗体，或简称为CQ1-3/1-11。

将表1中抗CTLA-4抗体(202F1)的重链可变区与表2中的hIgG4-1恒定区序列融合，得到全长重链；并将202F1的轻链可变区与表2中的轻链恒定区序列融合得到全长轻链，由此获得的全长抗体命名为202F1-hIgG4抗体。

将表1中抗体202F1的重链可变区与表2中的hIgG1恒定区序列融合，并与上述相应全长轻链组装得到全长抗体，命名为202F1-hIgG1。

将表1中伊匹单抗的可变区与表2中的hIgG1恒定区序列融合并与相应全长轻链组装，得到伊匹单抗。

将表1中贝伐单抗的可变区与表2中的hIgG1恒定区序列融合并与相应全长轻链组装，得到贝伐单抗。

关于本申请使用的各个抗体的相应scFv，根据表1中公开的序列按照上述方法进行相应表达和纯化，针对具体抗体对具体表达和纯化的相应参数进行调整属于本领域技术人员的常规知识范畴。

表4三特异性的表达量和纯度

实施例2.抗PD-1/CTLA-4/VEGF三特异性抗体的结合活性和理化性质分析

2.1三特异性抗体与PD-1的结合活性

分别采用酶联免疫吸附测定(ELISA)和流式细胞术(FACS)检测三特异性抗体与PD-1蛋白和细胞表面的PD-1抗原的结合活性。

ELISA测定三特异性抗体与PD-1蛋白的结合活性：分别用1μg/mL人PD-1蛋白(Acro，货号：PD1-H5221)包被高吸附96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天，PBST溶液洗板3次后用1％BSA-PBS溶液37℃封闭板1小时，同时用1％BSA-PBS溶液配制抗体3倍梯度稀释液，起始浓度为10nM，将各个梯度浓度的抗体以100μL/孔加入到封闭好的96孔酶标板中，一式三份，37℃孵育1小时。之后用0.05％PBST溶液洗板3次，100μL/孔向酶标板中加入经1:5000稀释的标记HRP的二抗(Sigma，货号：A0170)，37℃孵育1小时。0.05％PBST溶液洗板3次，TMB显色，用酶标仪检测96孔酶标板在450nm处的吸光值，利用四参数模型对OD₄₅₀值进行拟合，计算各抗体与PD-1结合的EC₅₀值，结果如表5所示。

FACS检测三特异性抗体与细胞表面PD-1抗原的结合活性：使用胰酶(Gibco，25200072)消化过表达PD-1的293T细胞(293T-hPD-1，康源博创，KC-0204)，用含2％胎牛血清(FBS)的PBS(FACS缓冲液)清洗细胞2次，重悬到FACS缓冲液中，以约1x10⁵个细胞/孔加入到96孔板中。300g离心5分钟后，舍弃上清。用FACS缓冲液3倍梯度稀释抗体，获得2个梯度系列FACS#1和FACS#2，起始浓度分别为200nM(表5，FACS#1)或100nM(表5，FACS#2，图2)。然后以100μL/孔加入96孔板中，一式三份，混匀，4℃孵育60分钟。离心并用FACS缓冲液洗板3次，100μL/孔加入经1:800稀释的AF647-anti-hIgG(H+L)(Jackson，货号：109-605-003)，4℃孵育50分钟。用FACS缓冲液洗板3次后，100μL/孔加FACS缓冲液重悬细胞，在流式细胞仪(BECKMAN COULTER cytoFLEX)上检测荧光信号。利用四参数模型对结合活性进行拟合，计算各抗体与PD-1结合的EC₅₀值，结果如表5和图2所示。

为了对比自研抗体CQ1-3/1-11与相应商用抗体的性能，申请人以相同方法检测了抗体CQ1-3/1-11-hIgG4和抗体派姆单抗与细胞表面PD-1抗原的结合活性，结果表明自研抗体CQ1-3/1-11与派姆单抗具有相当的结合细胞表面PD-1的能力，EC₅₀值分别为4.34nM和5.05nM。

表5三特异性抗体与PD-1、CTLA-4和VEGFA的结合活性(EC₅₀,nM)

N/A不适用，NT没有检测；FACS#1-#4指不同的实验批次，hIgG4(泰州市百英生物科
技有限公司，货号：B107804)为与本申请抗体无关的阴性对照。

2.2三特异性抗体与CTLA-4的结合活性

分别采用如2.1节所公开的ELISA和FACS方法检测三特异性抗体与CTLA-4蛋白和细胞表面CTLA-4抗原的结合活性。

其中采用的人CTLA-4蛋白购买自Acro，货号：CT4-H52H9，结果如表5所示。

在FACS检测中，采用过表达人CTLA-4的CHOK1细胞(CHO-hCTLA-4，吉满生物，GM-C18989)，以约2x10⁵细胞/孔加入到96孔U底板中。用FACS缓冲液3倍梯度稀释抗体，起始浓度分别为200nM。结果如表5和图3所示。

2.3三特异性抗体与VEGFA的结合活性

采用如2.1节所述的ELISA方法检测三特异性抗体与VEGFA蛋白的结合活性。其中采用的人VEGF165-his蛋白购自Acro，货号：VE5-H5248。阳性对照抗体贝伐单抗购自Roche，货号：0210008H1545，结果如表5所示。

2.4三特异性抗体与活化的T细胞的结合活性

活化的T细胞表面上调PD-1和CTLA-4的表达，采用人外周血T细胞经抗CD3和抗CD28抗体活化后检测三特异性抗体与活化后T细胞的结合活性。抗PD-1抗体派姆单抗(permbrolizumab，默沙东，货号：S028905)，纳武单抗(百英生物，货号：B6924)，信迪利单抗(sintilimab，百英生物，货号：B682101)和卡瑞利珠单抗(camrelizumab，百英生物，货号：B852001)及抗CTLA-4抗体伊匹单抗作为阳性对照。

在37℃水浴锅中快速复苏人外周血单个核细胞(PBMC，妙顺(上海)生物科技有限公司，货号：A19K154025)，使用T细胞分离液重悬细胞并计数。400g离心10分钟后去上清，用T细胞分离液重悬至5x10⁷个细胞/mL。根据T细胞分离试剂盒(Stemcell，货号：19051)的步骤分离T细胞，将得到的T细胞用培养基重悬。采用NucleoCounter NC-200对细胞计数，调整T细胞密度至约1x10⁶个细胞/mL。加入含有抗CD3和抗CD28抗体的dynabeads(Invitrogen^TM，货号：11132D)和10ng/mL的hIL-2(Peprotech，货号：200-02)，放于37℃，5％CO₂培养箱中培养3天。将活化的T细胞去掉dynabeads和上清并重悬到FACS缓冲液中，细胞密度调整为约1x10⁶个细胞/mL，将100μL细胞液加入96孔U底板中，1x10⁵细胞/孔。500g离心5分钟后，舍弃上清，加入100μL用FACS缓冲液3倍梯度稀释的本申请的三特异性抗体，起始浓度为200nM，一式三份。混匀后4℃孵育60分钟。离心并用FACS缓冲液洗3次后，100μL/孔加入PE anti-human IgG Fc(Biolegend，货号：366903)，4℃孵育50分钟。FACS缓冲液洗3次后，100μL/孔加入BV421 anti-human CD3 antibody(OKT3)(Biolegend，货号：317344)，4℃孵育50分钟。FACS缓冲液洗3次后，70μL/孔加入PBS溶液重悬细胞，在流式细胞仪(BDCelesta)上检测CD3T细胞上的荧光信号。利用四参数模型对结合活性进行拟合，计算各抗体与T细胞结合的EC₅₀值。

如图4和表6所示，商业抗PD-1抗体派姆单抗、纳武单抗、信迪利单抗和卡瑞利珠单抗均可以剂量依赖的方式结合上述活化的T细胞，此外，商业抗CTLA-4抗体伊匹单抗也以剂量依赖的方式与活化的T细胞结合，表明经本实施例方法所活化的T细胞表面表达PD-1和CTLA-4。由于伊匹单抗结合细胞表面CTLA-4的平均荧光强度(MFI)低于抗PD-1抗体与细胞表面PD-1的MFI，这可能与CTLA-4在活化的T细胞表面表达量较低有关。

如图4和表6所示，本申请制备的三特异性抗体HC010-F8和HC010-F23均能以剂量依赖的方式结合活化的T细胞，结合能力优于抗CTLA-4抗体伊匹单抗和202F1。

表6特异性抗体与活化的T细胞的结合活性

N/A不适用，hIgG1和hIgG4为与本申请抗体无关的阴性对照。

2.5三特异性抗体同时与PD-1、CTLA-4和VEGFA的结合活性

2.5.1三特异性抗体与PD-1蛋白结合后与CTLA-4或VEGFA的结合

用1μg/mL的人PD1-his(Acro，货号PD1-H5221)，包被高吸附96孔酶标板，4℃孵育过夜。PBST溶液洗板后用300μL/孔的1％BSA-PBS在37℃下封闭2小时。同时用1％BSA-PBS溶液配制抗体3倍梯度稀释液，起始浓度为20nM。洗板后，每孔100μL加入各个梯度稀释的抗体，一式三份，37℃孵育1小时。之后用0.05％PBST溶液机洗酶标板3次，一份以100μL/孔向各孔加入1μg/mL Biotinylated-hCTLA4(Acro,货号：CT4-H82E3)检测三特异性抗体与PD-1蛋白结合后与CTLA-4的结合活性；一份以100μL/孔向各孔加入1μg/mL Biotinylated-hVEGF165(Acro,货号：VE5-H82Q0)检测三特异性抗体与PD-1蛋白结合后与VEGF的结合活性。最后一份加入hIgG4作为阴性对照。37℃孵育1小时后用PBST溶液机洗酶标板3次，以100μL每孔向板中加入经1:5000稀释的Streptavidin-HRP(BD pharmingen，货号554066)，37℃孵育45分钟。PBST机洗酶标板3次，TMB显色，用酶标仪检测96孔酶标板在450nm的吸光值，利用四参数模型进行拟合，计算抗体的EC₅₀值。

结果如图13所示，三特异性抗体HC010-F8和HC010-F23与人PD1结合后仍能与人VEGF(图13A，EC₅₀分别为0.049和0.054nM)或人CTLA-4(图13B，EC₅₀分别为0.105和0.250nM)结合，且其同时结合活性具有剂量依赖性。

2.5.2三特异性抗体与细胞表面PD-1结合后同时与CTLA-4和VEGFA的结合

使用胰酶消化获得293T-hPD-1细胞，含2％FBS的PBS(FACS缓冲液)洗涤2次后调整细胞密度至约6x10⁵个细胞/ml，200μL/孔加入到96孔U底板中。300g离心5分钟后，舍弃上清后向各孔加入100μL用FACS缓冲液梯度稀释的抗体(起始浓度为200nM，3倍梯度稀释，同体积的FACS buffer作为阴性对照)，一式三份。混匀，4℃孵育60分钟。FACS缓冲液洗3次后，以100μL/孔向各孔加入由1μg/mL Biotin-hVEGF165与1μg/mL hCTLA4-mFc(DIMA BIOTECH,货号：PME100017)按1:1体积比组成的混合物，分别检测三特异性抗体与细胞表面PD-1结合后同时与CTLA-4和VEGF结合的活性。4℃孵育60分钟后FACS缓冲液洗3次，以100μL/孔向各孔加入由AF647 donkey anti-mIgG(H+L)(1:800稀释，Invitrogen，货号：A31571)与PE Streptavidin(1:800稀释，BD，货号：554061)稀释成的混合物，4℃孵育50分钟。用FACS缓冲液洗3次后，100μL/孔加入PBS溶液重悬细胞，在流式细胞仪(BECKMAN COULTER cytoFLEX)上检测荧光信号。利用四参数模型对结合活性进行拟合，计算各抗体的EC₅₀值。

结果如图14所示，三特异性抗体HC010-F8、HC010-F10、HC010-F22、HC010-F23和HC010-F24在与细胞表面的人PD-1结合后仍然能够同时与人VEGF(图14A，EC₅₀分别为1.413、2.835、2.288、2.223和9.151nM)和人CTLA-4(图14AB，EC₅₀分别为2.744、3.323、5.196、3.837和12.000nM)结合，且其同时结合活性具有剂量依赖性。

2.5.3三特异性抗体与细胞表面CTLA-4结合后同时与PD-1和VEGFA的结合

使用胰酶消化获得CHOK1-hCTLA4细胞，含2％FBS的PBS(FACS缓冲液)洗涤2次后调整细胞密度至约8x10⁵个细胞/ml，以200μL/孔加入到96孔U底板中。300g离心5分钟后，舍弃上清后加入100μL用FACS缓冲液梯度稀释的抗体(起始浓度为200nM，3倍梯度稀释，加入同体积的FACS buffer作为阴性对照)，一式三份。混匀，4℃孵育60分钟。FACS缓冲液洗3次后，以100μL/孔向各孔加入由1μg/mL hPD1-mFc(Acro,货号：PD1-H5255)与1μg/mL Biotin-hVEGF165按1:1体积比组成的混合物，分别检测三特异性抗体与细胞表面CTLA-4结合后同时与VEGF和PD-1结合的活性。4℃孵育60分钟后FACS缓冲液洗3次，以100μL/孔向各孔加入由AF647 donkey anti-mIgG(H+L)(1:800稀释)与PE Streptavidin(1:800稀释)按1:1体积比组成的混合物，4℃孵育50分钟。用FACS缓冲液洗3次后，100μL/孔加入PBS溶液重悬细胞，在流式细胞仪上检测荧光信号。利用四参数模型对结合活性进行拟合，计算各抗体的EC₅₀值。

结果如图15所示，三特异性抗体HC010-F8、HC010-F9和HC010-F10与细胞表面人CTLA-4结合后仍同时能与人PD-1(图15A，EC₅₀分别为1.919、1.533和2.734nM)和人VEGF(图15B，EC₅₀分别为1.435、1.376和1.370nM)结合，且其同时结合活性具有剂量依赖性。

2.6三特异性抗体结合PD-1和CTLA-4共表达细胞后与游离VEGFA的结合活性

在肿瘤微环境中，三特异性抗体可以通过与免疫细胞上的PD-1和CTLA-4结合，并与VEGFA结合，同时阻断免疫抑制和血管生成，调控肿瘤微环境中的免疫反应与血管生成。本实施例分别采用过表达PD-1和CTLA-4的293T细胞和活化的T细胞检测三特异性抗体结合共表达PD-1和CTLA-4的细胞后与游离VEGFA的结合活性。

2.6.1三特异性抗体结合PD-1和CTLA-4共表达细胞后与VEGFA的结合

采用过表达人PD-1和人CTLA-4的293T细胞(293T-hPD-1-hCTLA-4，吉满生物，GM-C19526)检测三特异性抗体结合共表达PD-1和CTLA-4的细胞后与VEGFA的结合活性。293T-hPD-1-hCTLA-4细胞上PD-1的表达水平高于CTLA-4。三特异性抗体通过抗PD-1和CTLA-4的臂与293T-hPD-1-hCTLA-4细胞结合后，用生物素标记的VEGFA检测293T-hPD-1-hCTLA-4细胞上结合的三特异性抗体。使用胰酶消化293T-hPD-1-hCTLA-4细胞，将分离的细胞重悬到FACS缓冲液中，调整细胞密度至约1x10⁶个细胞/mL，然后每孔200μL加入96孔U底板中，细胞密度约2x10⁵细胞/孔。300g离心5分钟，舍弃上清，加入100μL用FACS缓冲液3倍梯度稀释的三特异性抗体，起始浓度为200nM，加入同体积的FACS buffer作为阴性对照。混匀后4℃孵育60分钟。离心并用FACS缓冲液洗3次，100μL/孔加入2μg/mL Biotin-hVEGF165，4℃孵育60分钟。离心并用FACS缓冲液洗3次，100μL/孔加入经1:800稀释的PE Streptavidin(BD，货号：554061)，4℃孵育50分钟。离心并用FACS缓冲液洗3次后，100μL/孔加FACS缓冲液重悬细胞，在流式细胞仪(BECKMAN COULTER cytoFLEX)上检测荧光信号。利用四参数模型对结合活性进行拟合，计算各抗体结合的EC₅₀值。

如图5所示，三特异性抗体HC010-F8、HC010-F9和HC010-F10与PD-1和CTLA-4共表达细胞结合后仍能与游离的VEGFA结合。细胞表面的HC010-F8、HC010-F9和HC010-F10与VEGFA的结合活性的EC₅₀分别为5.057，4.204和4.904nM，表明三特异性抗体与PD-1和CTLA-4共表达细胞结合后仍与VEGFA具有较高的结合活性。

2.6.2三特异性抗体结合活化的T细胞后与游离的VEGFA的结合活性

采用2.4节中活化的T细胞，细胞密度调整为1x10⁶细胞/mL，100μL细胞加入96孔U底板中，1x10⁵细胞/孔。500g离心5分钟后舍弃上清，加入100μL用FACS缓冲液3倍梯度稀释的抗体，起始浓度为200nM，一式三份。混匀后4℃孵育60分钟。离心并用FACS缓冲液洗3次，100μL/孔加入2μg/mL Biotinylated Human VEGF165(Acro，货号：VE5-H82Q0)，4℃孵育50分钟。FACS缓冲液洗3次后，加入BV421 anti-human CD3 antibody(OKT3)(Biolegend，货号：317344)，与PE Streptavidin的混合物，100μL/孔，4℃孵育50分钟。用FACS缓冲液洗3次后，70μL/孔加入PBS重悬细胞，在流式细胞仪(BDCelesta)上检测CD3T细胞上的荧光信号。利用四参数模型对结合活性进行拟合，计算各抗体的EC₅₀值。

如图6所示，三特异性抗体HC010-F8和HC010-F23与活化的T细胞结合后仍能与游离的VEGFA结合。T细胞表面的HC010-F8和HC010-F23与VEGFA的结合活性的EC₅₀分别为0.440和0.377nM，表明三特异性抗体与PD-1和CTLA-4共表达的T细胞结合后仍与VEGFA具有较高的结合活性，可以在肿瘤微环境中同时阻断免疫检查点和血管生产。

2.7三特异性抗体与人PD-1、CTLA-4和VEGFA的亲和力测定

采用RED96e(ForteBio)检测三特异性抗体与人PD-1、CTLA-4和VEGFA的亲和力，具体方法如下：将AHC Sensor浸泡在PBST(含0.02％吐温的PBS)缓冲液中10分钟，活化Sensor。将配体(待检抗体)用PBST缓冲液稀释至5μg/mL，将分析物：人PD1(ACRO,货号：PD1-H5221)、人VEGF(ACRO,货号：VE5-H4210)和人CTLA4(ACRO,货号：CT4-H52H9)用PBST缓冲液稀释成100、50、25、12.5和6.25nM的浓度梯度，并设置中间浓度为质控点，0nM为空白对照点。分别按200μL/孔添加上述稀释后的配体和分析物至对应的板孔中，一式三份。程序参数设置：加载:180s，缔合:180s，解离:600s，再生:Gly-HCl pH1.5，30s，再生3次。使用Data Analysis11.1r软件在扣除空白(0浓度点)后使用1：1模型拟合曲线，分析计算实验结果。曲线拟合度接受标准：Full R^2≥0.95。

结果如表7所示，HC010-F8和HC010-F23分别对人PD-1、人VEGF和人CTLA-4具有高亲和力，达到10^-9的数量级。

表7三特异性抗体与人PD-1、CTLA-4和VEGFA的亲和力

NT:没有检测

实施例3.抗PD-1/CTLA-4/VEGF三特异性抗体的阻断活性

3.1三特异性抗体阻断PD-1与PD-L1的结合活性

分别采用竞争ELISA法和FACS检测三特异性抗体阻断PD-1与PD-L1的结合活性。

ELISA检测三特异性抗体阻断PD-1与PD-L1的结合活性:用1μg/mL人PD-1蛋白(Acro,PD1-H5257)包被高吸附96孔酶标板，4℃孵育过夜，第二天，PBS溶液洗板3次后用1％BSA-PBS溶液37℃封闭1小时。将1％BSA-PBST稀释液配制的抗体梯度稀释液(起始浓度为200nM，3倍梯度稀释)和1μg/mL biotin标记的PD-L1蛋白(Acro,PD1-H82F3)体积1:1进行混合获得抗体-蛋白质混合液，100μL每孔将抗体-蛋白质混合液加入到封闭好的96孔酶标板中，37℃孵育1小时。PBST洗4遍后，100μL每孔向酶标板中加入经1:5000稀释的Strep-HRP(BD，货号：554066)，37℃孵育1小时。PBST洗4遍后，TMB显色，用酶标仪检测450nm和630nm的吸光值，计算OD450-OD630，利用四参数模型对荧光强度进行拟合，计算各抗体阻断活性的IC₅₀值，结果如表8所示。

为了对比自研抗体CQ1-3/1-11与派姆单抗的性能，申请人以相同方法检测了对照自研抗体CQ1-3/1-11-hIgG4阻断细胞表面抗原PD-1结合PD-L1的活性，结果表明自研抗体CQ1-3/1-11与派姆单抗具有相当的阻断能力，IC₅₀值分别为3.190nM和3.569nM。

FACS检测三特异性抗体阻断PD-1与PD-L1的结合活性：采用过表达人PD-1的293T细胞(293T-hPD-1，康源博创，KC-0204)检测三特异性抗体对人PD-1与人PD-L1结合的阻断能力。使用胰酶消化获得293T-hPD-1细胞，含2％FBS的PBS(FACS缓冲液)清洗细胞2次，重悬到FACS缓冲液中。悬浮好的细胞溶液中加入1μg/mL biotin-human PDL1(Acro,货号：PD1-H82F3)，50μL/孔加入96孔U底板中，约1x10⁵细胞/孔。加入50μL用FACS缓冲液3倍梯度稀释的抗体，起始浓度为200nM，一式三份。混匀后4℃孵育60分钟。FACS缓冲液洗3次后，100μL/孔加入经1:800稀释的PE Streptavidin，4℃孵育50分钟。FACS缓冲液洗3次后，150μL/孔加入PBS重悬细胞，在流式细胞仪(BECKMAN COULTER cytoFLEX)上检测荧光信号。利用四参数模型对结合活性进行拟合，计算各抗体阻断活性的IC₅₀值，结果如表8所示，三特异性抗体可以有效阻断PD-L1与293T细胞表面的PD-1的结合。

表8三特异性抗体的阻断活性(IC₅₀,nM)

NT:没有检测；N/A不适用，hIgG4为阴性对照。

3.2三特异性抗体阻断CD80与CTLA-4的结合活性

3.2.1三特异性抗体阻断CD80与CTLA-4的结合活性

采用CHO-hCTLA-4细胞检测三特异性抗体对人CTLA-4与人CD80结合的阻断能力。使用胰酶消化获得CHO-hCTLA-4细胞，含2％FBS的PBS(FACS缓冲液)洗涤2次后重悬到FACS缓冲液中，200μL细胞加入96孔U底板中，约2x10⁵细胞/孔。300g离心5分钟后，舍弃上清。用FACS缓冲液溶液配制一系列抗体浓度稀释梯度(起始浓度为200nM，3倍梯度稀释)及0.6μg/mL biotin标记的人CD80蛋白(Acro，货号：B71-H82F2)。向96孔板中分别加入每孔50μL的抗体及每孔50μL的biotin-human CD80，混匀，4℃孵育60分钟。FACS缓冲液洗3次后，100μL/孔加入经1:800稀释的PE Streptavidin，4℃孵育50分钟。用FACS缓冲液洗3次后，150μL/孔加入PBS重悬细胞，在流式细胞仪(BECKMAN COULTER cytoFLEX)上检测荧光信号。利用四参数模型对结合活性进行拟合，计算各抗体阻断活性的IC₅₀值，结果如表8所示，三特异性抗体可以有效阻断人CTLA-4与人CD80的结合。

3.2.2三特异性抗体阻断CD80与PD-1和CTLA-4共表达细胞上CTLA-4的结合活性

肿瘤微环境中功能耗竭的T细胞上共表达PD-1和CTLA-4，且PD-1的表达水平高于CTLA-4。同时靶向PD-1和CTLA-4的双特异性抗体在PD-1和CTLA-4共表达的细胞上可以增强抗CTLA-4抗体的阻断功能。采用同时过表达人PD-1与人CTLA-4的293T细胞(293T-hPD-1-hCTLA-4，吉满生物，GM-C19526，也称为293T-CTLA-4-PD-1细胞)检测三特异性抗体对人CTLA-4和人CD80结合的阻断能力。使用胰酶消化获得293T-hPD-1-hCTLA-4细胞，含2％FBS的PBS(FACS缓冲液)洗涤2次后重悬到FACS缓冲液中，200μL细胞加入96孔U底板中，约1.4x10⁵细胞/孔。300g离心5分钟后，舍弃上清。用FACS缓冲液溶液配制一系列抗体浓度稀释梯度(起始浓度为400nM，3倍梯度稀释)及2μg/mL biotin标记的人CD80蛋白。向96孔板中分别加入每孔50μL的抗体及每孔50μL的biotin-human CD80，混匀，4℃孵育60分钟。FACS缓冲液洗3次后，100μL/孔加入经1:800稀释的PE Streptavidin，4℃孵育50分钟。用FACS缓冲液洗3次后，150μL/孔加入PBS重悬细胞，在流式细胞仪(BECKMAN COULTER cytoFLEX)上检测荧光信号。利用四参数模型对结合活性进行拟合，计算各抗体阻断活性的IC₅₀值。

结果如图表8所示，与母本抗体相比，三特异性抗体均显著增强对293T-hPD-1-hCTLA-4细胞上CTLA-4与CD80结合的阻断作用。

3.3三特异性抗体阻断VEGFA与KDR(VEGFR2)的结合活性

3.3.1竞争ELISA法检测三特异性抗体阻断VEGFA与KDR(VEGFR2)的结合活性

用1μg/mL的人VEGF165-His(Acro，货号：VE5-H5248)包被高吸附96孔酶标板，37℃孵育2小时。洗板后，每孔用300μL1％BSA-PBS在37℃下封闭1.5小时。向酶标板中分别每孔加入50μL梯度稀释的抗体(起始浓度为400nM，3倍梯度稀释)和50μL 1.72μg/mL的biotin-human KDR(Acro，货号KDR-H82E5)，37℃孵育1小时。用PBST溶液洗3遍后，100μL/孔向板中加入经1:5000稀释的Streptavidin-HRP(BD pharmingen，货号554066)，37℃孵育45分钟。PBST洗3遍后，TMB显色，用酶标仪检测450nm的吸光值，利用四参数模型进行拟合，计算抗体阻断活性的IC₅₀值，结果如表8所示，三特异性抗体对VEGFA结合KDR的阻断活性与贝伐单抗相当。

3.3.2报告基因法检测三特异性抗体阻断VEGF与KDR结合

采用人VEGFR2-293报告细胞系(吉满生物，GM-C09057)检测三特异性抗体对人VEGFA与人KDR结合的阻断能力。人VEGFR2-293报告细胞系是基于NFAT信号通路构建的荧光素酶(Luciferase)报告基因细胞系。当VEGF结合KDR受体后，激活NFAT信号通路，从而激活荧光素酶的表达。

使用胰酶消化获得VEGFR2-293报告细胞，300g离心5分钟后，舍弃上清。重悬到含1％FBS的DMEM培养基(测试培养基)中，细胞悬液中加入0.6μg/mL hVEGF165-His，将细胞加入96孔底透板中，约1x10⁴细胞/孔。用测试培养基配制抗体3倍稀释梯度，起始浓度为22.2nM。加入96孔板中，混匀后37℃孵育6小时。加入荧光素酶缓冲液(Promega，货号：G7940)避光孵育5分钟，在Microplate Reader(CLARIOstar Plus)上检测荧光信号。

结果如表8所示，三特异性抗体能有效地阻断人VEGF与细胞表面人KDR的结合，且其阻断效率与母本抗体贝伐单抗相当。

实施例4三特异性抗体体外激活免疫反应及抑制VEGF诱导的细胞增殖的功能

4.1三特异性抗体增强T细胞的功能

4.1.1三特异性抗体在SEB刺激PBMC下增强T细胞分泌IL-2

葡萄球菌肠毒素B(SEB)是一种超抗原，可以低浓度激活大量的T细胞，产生强免疫应答，能直接结合T细胞受体和MHC分子而无需经过处理加工成抗原肽活化T细胞。抗PD-1和抗CTLA-4抗体能够促进SEB刺激T细胞表达和分泌IL-2。

本实验检测了三特异性抗体对SEB刺激T细胞分泌IL-2的影响，以无关的、人抗HEL的hIgG4(泰州市百英生物科技有限公司，货号：B107804)为阴性对照。在37℃水浴锅中快速复苏PBMC，使用含10％FBS(胎牛血清，Gibco,货号：10091-148)和1％P/S(Pen-Strep,Gibco,货号：15140122)的RPMI 1640培养基(Gibco,货号：A10491-01)重悬细胞。调整PBMC的细胞密度为约1x10⁶细胞/mL，向细胞悬液中添加SEB(Toxin technology，货号：92815B)，使其终浓度为200ng/mL。100μL/孔将混有SEB的细胞悬液加入平底96孔板中。用培养基3倍梯度稀释抗体以及对照抗体，起始浓度为400nM，100μL/孔加入96孔板中与细胞混匀，一式三份。放于37℃，5％CO₂培养箱中培养3天。3天后取上清，根据说明书采用人IL-2检测试剂盒(CisBio，货号：62HIL02PEH)进行IL-2分泌量的检测，在CLARIOstar Plus读值。

结果如图7所示，三特异性抗体HC010-F8、HC010-F10、HC010-F22、HC010-F23和HC010-F24均能提升SEB刺激PBMC分泌IL-2。

4.1.2三特异性抗体在混合淋巴细胞反应(MLR)中增强T细胞分泌IL-2

来源于不同供体的成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)和PBMC一起孵育时，DC会通过激活PBMC(主要是T细胞)促进IL-2的表达和分泌。T细胞上PD-1和CTLA-4分别会与成熟DC上高表达的PD-L1/PD-L2和CD80/CD86结合，降低IL-2细胞因子的表达，免疫检查点抑制剂如抗PD-1抗体可以促进MLR反应中细胞因子的分泌。

本实验检测了三特异性抗体对MLR中IL-2分泌的影响。在37℃水浴锅中快速复苏DC(Allcells)和PBMC(Allcells)，使用X-VIVO15(Lonza，货号：04-418Q)培养基重悬细胞。DC和PBMC的细胞密度分别调整至1x10⁵个/mL和2x10⁶个/mL，将DC和PBMC以1：1比例的体积混合，混合后将200μL细胞混合液加入到圆底96孔板中。用X-VIVO15溶液5倍梯度稀释三特异性抗体以及对照抗体，起始浓度为1000nM，50μL/孔加入96孔板中与细胞混合，一式三份。放于37℃，5％CO₂培养箱中培养4天。4天后取上清，根据说明书采用人IL-2检测试剂盒进行IL-2分泌量的检测，在CLARIOstar Plus读值。

结果如图8所示，三特异性抗体HC010-F8、HC010-F10、HC010-F22、HC010-F23和HC010-F24均能提升MLR中IL-2的分泌表达，其活性优于母本抗CTLA-4抗体202F1-hIgG4，与抗PD-1抗体CQ1-3/1-11，202F1-hIgG4和CQ1-3/1-11联用的活性相当。

采用相同的方法比较了抗体CQ1-3/1-11和派姆单抗对MLR中IL-2分泌的影响，结果发现CQ1-3/1-11和派姆单抗具有相当的活性。

4.1.3三特异性抗体在含有Treg的混合淋巴细胞反应(MLR)中增强T细胞分泌IL-2的活性

阻断效应T细胞上的PD-1活性可以促进抗肿瘤免疫，然而由于Treg细胞上也表达较高水平的PD-1，阻断Treg上的PD-1活性却可以增加Treg的抑制功能，从而抑制抗肿瘤免疫，这可能与一些肿瘤病人经抗PD-1治疗效果欠佳有关。研究发现，抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体的联合使用或者抗PD-1和CTLA-4的双特异性抗体可以在Treg存在的情况下增加T细胞的活性。因此，本实施例采用含有不同比例Treg的MLR检测三特异性抗体在Treg存在的情况下对免疫细胞的活化性能。

复苏冻存的三个不同健康供者的PBMC(Allcells)、成熟的DC(Allcells)和活化后的Treg(Allcells)。用RPMI 1640完全培养基(Gibco,货号：61870-036)分别调整PBMC和DC细胞密度至2×10⁶个细胞/mL和0.1×10⁶个细胞/mL，分别每孔50μL放入U底96孔板中。用RPMI1640完全培养基调整Treg细胞密度至0.5×10⁶细胞/mL，并依次2倍梯度稀释成0.25×10⁶、0.125×10⁶和0.0625×10⁶个细胞/mL，将不同密度的Treg细胞每孔50μL分别放入上述96孔板中。用RPMI 1640完全培养基分别4倍梯度稀释抗体HC010-F8、HC010-F23、CQ1-3/1-11、202F1、贝伐单抗、CQ1-3/1-11和202F1-hIgG4的联合、CQ1-3/1-11和202F1-hIgG4和贝伐单抗的联合和无关同种型抗体，起始浓度为2000nM；再用培养基将梯度稀释的样本进行1:10倍稀释，每孔50μL分别放入上述96孔板中，一式三份。置37℃、5％CO₂条件下培养4天。4天后，离心取上清，根据说明书用hIL-2HTRF(Cisbio，货号：62HIL02PEH)检测IL-2的释放量。

结果如图9所示，在含有较高比例的Treg时，MLR中IL-2的释放量受到抑制。三特异性抗体HC010-F8和HC010-F23可以增加IL-2的释放，增加效果与CQ1-3/1-11和202F1-hIgG4联合使用组、贝伐单抗与CQ1-3/1-11和202F1-hIgG4联合使用组基本相当。

4.2三特异性抗体抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞的增殖

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由于表达VEGF的受体，因此受VEGF诱导而增殖，可以用来评价诸如贝伐单抗等抗VEGF的抗体抑制VEGFA的促血管生成作用。本实施例也采用 HUVEC(ATCC，CRL-1730)来检测三特异性抗体对VEGF功能的抑制。使用胰酶消化获得HUVEC细胞，重悬到含10％FBS的F-12K培养基(Gibco，货号：21127-022)中，调整细胞密度至1x10⁵个细胞/mL，将50μL细胞液加入96孔透明底板中，约5x10³细胞/孔。用测试培养基液配制梯度稀释的抗体(起始浓度为200nM，3倍梯度稀释)及0.4μg/mL人VEGFA 165蛋白，向96孔板中分别加入每孔25μL的抗体及每孔25μL的人VEGFA165，混匀，37℃孵育五天。五天后，60μL/孔加入CellTiter-Glo(Promega，货号：G7572)，在Microplate Reader(CLARIOstar Plus)上检测荧光信号。利用四参数模型进行拟合，计算抗体抑制活性的IC₅₀值。

如图10所示，三特异性抗体HC010-F8和HC010-F23均能有效地阻断VEGFA诱导的HUVEC细胞增殖，其阻断活性的IC₅₀分别为0.860和0.828nM，母本抗体贝伐单抗阻断活性的IC₅₀为0.367nM，hIgG1和hIgG 4是与本申请抗体无关的阴性对照抗体。

实施例5三特异性抗体的体内药效

5.1三特异性抗体HC010-F8诱导持久的抗肿瘤效果

人黑色素瘤A375细胞培养在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液中。当A375细胞生长密度达到60-80％时，复苏PBMC(Allcells，货号：FPB004F-C),然后用RPMI1640培养基将PBMC重悬，调整PBMC的细胞密度至3×10⁶个细胞/mL，与Mitomycin C处理后的A375细胞共培养。PBMC与A375共培养5天后，收取PBMC与新鲜消化下来的A375细胞。以PBMC5×10⁵个细胞/只小鼠，A375细胞4×10⁶个细胞/只小鼠，接种于NCG雌性小鼠(购自江苏集萃药康生物科技有限公司)右侧皮下,接种体积0.2mL/只小鼠，含50％Matrigel(BD，货号:354234)。在细胞接种当天随机分为4组(每组5只小鼠)，分别皮下注射三特异性抗体HC010-F8(1和5mg/kg)、三个单抗联合用药CQ1-3/1-11(0.65mg/kg)，伊匹单抗(0.35mg/kg)和贝伐单抗(0.65mg/kg)或阴性对照(PBS)，每周给药2次，给药3周。肿瘤体积使用游标卡尺每周两次测量，肿瘤体积计算公式为V＝0.5×a×b²，a，b分别代表肿瘤的长径和宽径。

结果如图11所示，抗体HC010-F8在1mg/kg和5mg/kg都有效地抑制了肿瘤的生长。在停止给药之后，抗体HC010-F8的两个治疗组(1和5mg/kg)和联合用药组相对于阴性对照组均延缓了肿瘤的再生，且HC010-F8(1和5mg/kg)的抑瘤效果均优于CQ1-3/1-11，伊匹单抗和贝伐单抗的联合用药组。

在本次实验中，所有给药组的小鼠均无行为异常和体重下降表现(图12)，表明荷瘤小鼠对该受试剂量下的药物具有良好的耐受性。

5.2三特异性抗体HC010-F8和HC010-F23诱导抗肿瘤效果

人黑色素瘤A375细胞培养在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液中。当A375细胞生长密度达到60-80％时，复苏PBMC，然后用RPMI1640培养基将PBMC重悬，调整PBMC 的细胞密度至3×10⁶个细胞/mL，与Mitomycin C处理后的A375细胞共培养。PBMC与A375共培养5天后，收取PBMC与新鲜消化下来的A375细胞。以PBMC 5×10⁵个细胞/只小鼠，A375细胞4×10⁶个细胞/只小鼠，接种于NCG雌性小鼠右侧皮下,接种体积0.2mL/只小鼠，含50％Matrigel。肿瘤接种后第10天，当平均肿瘤体积约为约80mm³时，将小鼠随机分为4组(每组6只小鼠)，分别皮下注射三个单抗联合用药组(0.35mg/kg的202F1-hIgG4，0.65mg/kg的CQ1-3/1-11和0.65mg/kg的bevacizumab)、HC-010F8(1mg/kg)组、HC010-F23(1mg/kg)组和阴性对照(PBS)组，每周给药2次，给药3周。肿瘤体积使用游标卡尺每周两次测量，肿瘤体积按上述公式进行计算。

结果如图16所示，相较于阴性对照组，抗体HC010-F8(1mg/kg)和HC010-F23(1mg/kg)和联合用药组都有效的抑制了肿瘤的生长。

在本次实验中，所有给药组的小鼠均无行为异常和体重下降表现(图17)，表明荷瘤小鼠对该受试剂量下的药物具有良好的耐受性。

无论在给药期还是停药期，本申请三特异性抗体对肿瘤的优异抑制性使得其在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景，其不仅可以有效抑制肿瘤，而且延长了抑瘤期。

5.3三特异性抗体在人CD34⁺HSC人源化小鼠中抑制非小细胞肺癌A549的生长

用人造血细胞hCD34⁺HSC移植到经过辐照的NCG鼠体内做免疫重建得到人CD34⁺HSC人源化小鼠(集萃药康)。人非小细胞肺癌A549细胞接种于人CD34⁺HSC人源化小鼠的右侧皮下,接种体积0.2mL/只小鼠，含30％Matrigel。当平均肿瘤体积约为约100mm³时，将小鼠随机分组，分别皮下注射三特异性抗体HC010-F8(5mg/kg)、HC010-F23(5mg/kg),对照抗体帕博利珠单抗(3.25mg/kg)和贝伐单抗(3.25mg/kg)以及阴性对照(PBS)，每周给药2次，给药4周。肿瘤体积使用游标卡尺每周两次测量，肿瘤体积按上述公式进行计算。实验终点收获肿瘤样本，用解剖实验室剪刀将其切碎，并根据制造商的说明，使用人类肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotech)结合gentleMACS解离器(Miltenyi Biotec)酶解肿瘤组织，细胞悬液通过70μm MACS智能过滤器过滤得到单细胞悬液。用流式细胞仪检测对免疫细胞亚群和功能生物标志物进行分析。

HC010-F8和HC010-F23相对于阴性对照组显著地抑制了肿瘤的生长，并且肿瘤抑制率也与帕博利珠单抗或贝伐单抗给药组相当甚至更优。在停药恢复期，本发明抗体的肿瘤抑制率优于帕博利珠单抗或贝伐单抗给药组(图18)。

5.4三特异性抗体在人PBMC人源化小鼠模型中抑制人非小细胞肺癌H1299的生长

人非小细胞肺癌H1299细胞接种于人PBMC人源化小鼠(集萃药康)右侧皮下,接种体积0.2mL/只小鼠，含30％Matrigel。当平均肿瘤体积约为约100mm³时，将小鼠随机分组，分别皮下注射三特异性抗体HC010-F8(1-10mg/kg)、HC010-F23(1-10mg/kg)、对照抗体(1-10mg/kg)和阴性对照(PBS)，每周给药2次，给药4周。肿瘤体积使用游标卡尺每周两次测量，肿瘤体积按上述公式进行计算。

HC010-F8和HC010-F23相对于阴性对照组有效地抑制了肿瘤的生长。

发明人继续将人非小细胞肺癌H1299细胞接种于人PBMC人源化小鼠(百奥赛图)右侧皮下,接种7天后，每只动物注射4.5×10⁶个/0.1mL的PBMC(人外周血单核细胞)。当平均肿瘤体积达到120mm³时，根据小鼠肿瘤体积和体重选择合适的小鼠入组，每组9只，共7组，分别为：G1：PBS、G2：帕博利珠单抗(10mg/kg)、G3：贝伐单抗(10mg/kg)、G4：HC010-F8(15mg/kg)、G5：抗PD-1/VEGFA双特异性抗体AK112(13mg/kg)、G6：Ipilimumab(10mg/kg)和G7：帕博利珠单抗(10mg/kg)+贝伐单抗(10mg/kg)+Ipilimumab(10mg/kg)。所有组均在分组当天开始进行给药，每周给药2次，各组共给药6次。给药和观察期间每周测量2次小鼠体重和肿瘤体积，计算肿瘤体积生长抑制率(TGI_TV)。

在实验结束时，G1溶媒对照组(PBS)的平均肿瘤体积为1303±188mm³，G2-G7治疗组的平均肿瘤体积分别为：640±59mm³、582±96mm³、407±72mm³、406±44mm³、603±92mm³和363±55mm³。各治疗组对应的TGI_TV分别是：57.40％、60.97％、75.70％、75.72％、59.06％和79.60％。和溶媒对照组相比，G2-G7组对肿瘤均有显著的抑制效果(P<0.001)。因此，HC010-F8单药的肿瘤抑制率明显优于帕博利珠单抗，贝伐单抗和Ipilimumab单药给药组，并且和AK112以及帕博利珠单抗+贝伐单抗+ipilimumab联合用药的药效相当(图19)。

5.5三特异性抗体在人PBMC人源化小鼠模型中抑制人非小细胞肺癌NCI-H292的生长

人非小细胞肺癌NCI-H292细胞接种于人PBMC人源化小鼠(集萃药康)右侧皮下,接种体积0.2mL/只小鼠，含30％Matrigel。当平均肿瘤体积约为约100mm³时，将小鼠随机分组，分别皮下注射三特异性抗体HC010-F8(1-10mg/kg)、HC010-F23(1-10mg/kg)、对照抗体(1-10mg/kg)和阴性对照(PBS)，每周给药2次，给药4周。肿瘤体积使用游标卡尺每周两次测量，肿瘤体积按上述公式进行计算。

5.6三特异性抗体在人PBMC人源化小鼠模型中抑制人结直肠癌HT29的生长

人直肠癌HT29细胞接种于人PBMC人源化小鼠(南模生物)右侧皮下,接种体积0.1mL/只小鼠，含30％Matrigel。当平均肿瘤体积约为约100mm³时，将小鼠随机分组，分别皮下注射三特异性抗体HC010-F8(1-10mg/kg)、HC010-F23(1-10mg/kg)、对照抗体(1-10mg/kg)和阴性对照(PBS)，每周给药2次，给药4周。肿瘤体积使用游标卡尺每周两次测量，肿瘤体积按上述公式进行计算。

之后，发明人继续检测本发明的三特异性抗体的活性以及剂量依赖性。

人直肠癌HT29细胞接种于人PBMC人源化M-NSG小鼠(南模生物)右侧皮下,接种体积0.1mL/只小鼠，含30％Matrigel。当平均肿瘤体积约为100mm³时，将小鼠随机分组，包括第 1组：PBS,i.p.,BIW*7times组(以下简称G1)、第2组：帕博利珠单抗,3.25mg/kg,i.p.,BIW*7times组(以下简称G2)、第3组：贝伐单抗,3.25mg/kg,i.p.,BIW*7times组(以下简称G3)、第4组：抗CTLA-4抗体Ipilimumab,3.25mg/kg,i.p.,BIW*7times组(以下简称G4)、第5组：HC010-F8,1mg/kg,i.p.,BIW*7times组(以下简称G5)、第6组：HC010-F8,5mg/kg,i.p.,BIW*7times组(以下简称G6)、第7组：HC010-F8,20mg/kg,i.p.,BIW*7times组(以下简称G7)、第8组：帕博利珠单抗+贝伐单抗3.25mg/kg+3.25mg/kg,i.p.,BIW*7times组(以下简称G8)、第9组：帕博利珠单抗+Ipilimumab,3.25mg/kg+3.25mg/kg,i.p.,BIW*7times组(以下简称G9)和第10组：帕博利珠单抗+Ipilimumab+贝伐单抗,3.25mg/kg+3.25mg/kg+3.25mg/kg,i.p.,BIW*7times组(以下简称G10)。

给药后的第17天结束实验，此时对照组G1平均肿瘤体积为644.77±61.57mm³，G2、G4和G9平均肿瘤体积分别为498.68±48.30mm³，638.72±70.69mm³和489.19±47.40mm³。肿瘤体积抑制率(TGI)分别为26.72％，1.03％和28.42％。与对照组比较，无统计学差异(P>0.05)。G3组的平均肿瘤体积为400.50±62.73mm³，肿瘤体积抑制率(TGI)为44.68％，与对照组比较，有统计学差异(P＜0.05)。G5、G6、G7、G8和G10的平均肿瘤体积分别为403.54±45.88mm³、312.48±38.02mm³、270.45±33.25mm³、293.13±36.08mm³和313.65±25.23mm³，肿瘤体积抑制率(TGI)分别为44.26％、60.91％、68.59％、64.42％和60.63％，与对照组比较，有显著统计学差异(P＜0.01)。结果参见表9。

表9

ns＝not significant；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

结论：在本实验条件下，1、5和20mg/kg的测试药物HC010-F8以剂量依赖的方式在PBMC人源化M-NSG小鼠的结直肠癌HT-29模型上具有显著的抗肿瘤效果。相对于溶媒对照组(PBS)，HC010-F8在1mg/kg及以上剂量就展现明显的药效。HC010-F8在5mg/kg的肿瘤抑制率(60.91％)要好于帕博利珠单抗(26.72％)，贝伐单抗(44.68％)和Ipilimumab(1.03％) 单药给药。HC010-F8在5mg/kg剂量下的抗肿瘤效果优于帕博利珠单抗+ipilimumab的双免疫联合用药。

5.7三特异性抗体在人PBMC人源化小鼠模型中抑制人肝癌HepG2的生长

人肝癌HepG2细胞接种于人PBMC人源化小鼠(南模生物)右侧皮下,接种体积0.2mL/只小鼠，含30％Matrigel。当平均肿瘤体积约为约150-200mm³时，将小鼠随机分组，分别皮下注射三特异性抗体HC010-F8(1-10mg/kg)、HC010-F23(1-10mg/kg)、对照抗体(1-10mg/kg)和阴性对照(PBS)，每周给药2次，给药4周。肿瘤体积使用游标卡尺每周两次测量，肿瘤体积按上述公式进行计算。

5.8三特异性抗体在人PBMC人源化小鼠模型中抑制人肝癌Huh7的生长

人肝细胞癌Huh7细胞接种于人PBMC人源化NCG小鼠(集萃药康)皮下，接种剂量：5×10^6cells/100μL/只(添加康宁基质胶1：1)。平均肿瘤体积达到77.20mm³时入组，将24只小鼠根据肿瘤体积随机分成3组，每组8只，分别为帕博利珠单抗(3.25mg/kg)、HC010-F8(5mg/kg)和溶媒PBS对照组(i.p.)给药，每周给药2次共6次，观测20天，根据肿瘤抑制率和体重等观察指标进行药物药效评价。

本试验在给药开始后第20天到达终点，PBS组平均肿瘤体积是2124.08mm³，帕博利珠单抗组(3.25mg/kg)平均肿瘤体积是2099.87mm³，HC010-F8(5mg/kg)平均肿瘤体积是1014.72mm³；与PBS对照组相比，HC010-F8对肿瘤生长抑制有显著性差异(P<0.0001)，而帕博利珠单抗几乎没有肿瘤抑制作用。和帕博利珠单抗相比，HC010-F8有显著的抗肿瘤作用(P<0.0001)(参见图20)。试验过程中，未出现和受试物毒性相关的动物死亡。结论：在人肝细胞癌Huh7的小鼠肿瘤模型中，HC010-F8具有显著的抗肿瘤效果,而帕博利珠单抗没有展现明显的肿瘤抑制作用。动物对HC010-F8在5mg/kg的剂量具有良好的耐受性。

5.9三特异性抗体替代抗体在人PD-1和人CTLA-4双靶点人源化小鼠肿瘤模型中的药效

三特异性抗体不识别小鼠的PD-1、CTLA-4和VEGFA，将HC010-F8和HC010-F23中抗VEGF的序列替换为(US20110159009A1和Wei-Ching Liang et al.Cross-species vascular endothelial growth factor(VEGF)-blocking antibodies completely inhibit the growth of human tumor xenografts and measure the contribution of stromal VEGF.J Biol Chem.2006Jan13；281(2):951-61.doi:10.1074/jbc.M508199200.Epub 2005 Nov 7.)中报道的抗VEGFA的序列(B20.4.1)，表达出可以识别小鼠VEGF的替代抗体。B20.4.1与HC010-F8、HC010-F23中使用的贝伐单抗具有类似的结合和阻断活性。

分别在人PD-1和人CTLA-4双靶点人源化小鼠(B-hPD-1/hCTLA4，百奥塞图)结直肠癌MC38肿瘤模型和肝癌Hepa1-6肿瘤模型中评价三特异性抗体替代抗体的抗肿瘤活性。当平均肿瘤体积约为约100mm³时，将小鼠随机分组，分别皮下注射三特异性抗体HC010-F8的替代抗体(1-10mg/kg)、HC010-F23的替代抗体(1-10mg/kg)、对照抗体(1-10mg/kg)和阴性对照(PBS)，每周给药2次，给药4周。

结果发现HC010-F8的替代抗体和HC010-F23的替代抗体在人PD-1和人CTLA-4双靶点人源化小鼠(B-hPD-1/hCTLA4，百奥塞图)结直肠癌MC38肿瘤模型和肝癌Hepa1-6肿瘤模型均具有良好的抗肿瘤活性。

实施例6三特异性抗体的稳定性研究

在抗体制备领域中，基于天然抗体改造获得的各种抗体衍生物(例如多特异性抗体)经常面临稳定性的问题，获得具有优良稳定性的抗体衍生物在抗体的制备，运输，存储等方面具有重要的意义。本实施例检测了本申请获得的三特异性抗体的稳定性，通过在升高的温度(40℃)加速下，研究了三特异性抗体的热稳定性。具体而言，分别将各个三特异性抗体置换至20mM His-HCl，pH5.5,230mM trehalose,0.01％tween 80制剂缓冲液中。然后将样本在40℃孵育0，1，2和4周后，采用高效液相色谱(Dionex,Ultimate 3000)检测尺寸排阻层析(SEC)和非还原毛细管凝胶电泳(NR-CE-SDS)。结果如表9所示，在40℃中孵育4周后，三特异性抗体HC010-F8、HC010-F22的SEC纯度变化较小，主峰(MP％)的下降均小于5％，HC010-F10、HC010-F23的主峰下降了约10％。在40℃中孵育4周后，三特异性抗体NR-CE-SDS中主峰下降了6.6％到13.2％，表明本申请构建、表达的三特异性抗体具有良好的稳定性。

表9.三特异性抗体的热稳定性研究

Claims

一种三特异性抗体，其包含第一、第二、第三抗原结合位点，其中所述第一、第二、第三抗原结合位点结合互不相同的，彼此独立地选自PD-1，CTLA-4和VEGF的第一、第二、第三抗原。
权利要求1所述的三特异性抗体，其包含第一、第二、第三抗原结合位点且由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，所述重链和轻链具有选自如下的结构：

1)重链，其从N端到C端包含VH-CH1-Fc-VHH-ScFv的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构；或

2)重链，其从N端到C端包含ScFv-VH-CH1-Fc-VHH的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构；或

3)重链，其从N端到C端包含VHH-VH-CH1-Fc-ScFv的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构；或

4)重链，其从N端到C端包含VH-CH1-Fc-ScFv-VHH的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构；或

5)重链，其从N端到C端包含VH-CH1-Fc-ScFv的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL-VHH的结构；或

6)重链，其从N端到C端包含ScFv-VH-CH1-Fc-ScFv的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构；或

7)重链，其从N端到C端包含VH-CH1-Fc-ScFv的结构，

轻链，其从N端到C端包含VHH-VL-CL的结构；或

8)重链，其从N端到C端包含ScFv-VHH-VH-CH1-Fc的结构，

轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构；

其中Fc表示免疫球蛋白重链的Fc区，包含Fc区的两条重链藉由Fc区同二聚化，

其中CH1表示免疫球蛋白重链CH1结构域，CL表示免疫球蛋白轻链CL结构域，

其中VH-CH1和VL-CL相互配对形成Fab，

其中第一、第二、第三抗原结合位点为Fab、VHH或ScFv的形式，且分别结合互不相同的，彼此独立地的抗原PD-1，CTLA-4和VEGF。
权利要求1所述的三特异性抗体，其包含第一、第二、第三抗原结合位点且由具有如下结构的三条链组成：

1)第一重链，其从N端到C端包含VH-CH1-Fc-ScFv的结构，

2)第二重链，其从N端到C端包含VHH-Fc-ScFv的结构，和

3)轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构，

其中Fc为免疫球蛋白重链的Fc区，其中包含Fc区的两条重链藉由Fc区二聚化，

其中CH1表示免疫球蛋白重链CH1结构域，CL表示免疫球蛋白轻链CL结构域，

其中VH-CH1和VL-CL相互配对形成Fab，

其中第一、第二、第三抗原结合位点为Fab、VHH或ScFv的形式，且分别结合互不相同的，彼此独立地的抗原PD-1，CTLA-4和VEGF。
权利要求1所述的三特异性抗体，其包含第一、第二、第三抗原结合位点且由具有如下结构的三条链组成：

1)第一重链，其从N端到C端包含VH-CH1-Fc-ScFv2的结构，

2)第二重链，其从N端到C端包含ScFv1-Fc-ScFv2的结构，

3)轻链，其从N端到C端包含VL-CL的结构，

其中Fc为免疫球蛋白重链的Fc区，其中包含Fc区的两条重链藉由Fc区二聚化，

其中CH1表示免疫球蛋白重链CH1结构域，CL表示免疫球蛋白轻链CL结构域，

其中VH-CH1和VL-CL相互配对形成Fab，

其中第一、第二、第三抗原结合位点为Fab、ScFv1或ScFv2的形式，且分别结合互不相同的，彼此独立地的抗原PD-1，CTLA-4和VEGF。
权利要求1所述的三特异性抗体，其包含第一、第二、第三抗原结合位点且由具有如下结构的两条链组成：

1)第一重链，其从N端到C端包含ScFv1-Fc-ScFv2的结构，

2)第二重链，其从N端到C端包含VHH-Fc-ScFv2的结构，

其中Fc为免疫球蛋白重链的Fc区，其中包含Fc区的两条重链藉由Fc区二聚化，

其中第一、第二、第三抗原结合位点为VHH、ScFv1或ScFv2的形式，且分别结合互不相同的，彼此独立地的抗原PD-1，CTLA-4和VEGF。
权利要求1-5中所述的三特异性抗体，其中所述第一、第二、第三抗原结合位点包含：

1)结合PD-1的抗原结合位点，其具有包含SEQ ID NO:1所示序列或由其组成的HCDR1，包含SEQ ID NO:2所示序列或由其组成的HCDR2和包含SEQ ID NO:3所示序列或由其组成的HCDR3；和包含SEQ ID NO:4所示序列或由其组成的LCDR1，包含SEQ ID NO:5所示序列或由其组成的LCDR2和包含SEQ ID NO:6所示序列或由其组成的LCDR3；

2)结合CTLA-4的抗原结合位点，其具有

i)包含SEQ ID NO:17所示序列或由其组成的HCDR1，包含SEQ ID NO:18所示序列或由其组成的HCDR2和包含SEQ ID NO:19所示序列或由其组成的HCDR3；和包含SEQ ID NO:20所示序列或由其组成的LCDR1，包含SEQ ID NO:21所示序列或由其组成的LCDR2和包含SEQ ID NO:22所示序列或由其组成的LCDR3；或

ii)包含SEQ ID NO:12所示序列或由其组成的HCDR1，包含SEQ ID NO:13所示序列或由其组成的HCDR2和包含SEQ ID NO:14所示序列或由其组成的HCDR3；

和

3)结合VEGF的抗原结合位点，其具有包含SEQ ID NO:26所示序列或由其组成的HCDR1，包含SEQ ID NO:27所示序列或由其组成的HCDR2和包含SEQ ID NO:28所示序列或由其组成的HCDR3；和包含SEQ ID NO:29所示序列或由其组成的LCDR1，包含SEQ ID NO:30所示序列或由其组成的LCDR2和包含SEQ ID NO:31所示序列或由其组成的LCDR3。
权利要求1-6中所述的三特异性抗体，所述第一、第二、第三抗原结合位点包含在FR区中的取代，优选地，所述取代是重链可变区的G44C、轻链可变区的Q100C或G100C(按照Kabat编号)。
权利要求1-7中所述的三特异性抗体，其中所述第一、第二、第三抗原结合位点包含：

1)结合PD-1的抗原结合位点，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的序列，或包含与SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:7所示的序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的序列，或包含与SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:8所示的序列组成；

2)结合CTLA-4的抗原结合位点，其包含

i)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:15所示的序列，或包含与SEQ ID NO:15具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:15所示的序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16所示的序列，或包含与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:16所示的序列组成；

或

ii)包含SEQ ID NO:11所示的序列，或包含与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:11所示的序列组成；

和

3)结合VEGF的抗原结合位点，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:24所示的序列，或包含与SEQ ID NO:24具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:24所示的序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25所示的序列，或包含与SEQ ID NO:25具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:25所示的序列组成。
权利要求1-8中所述的三特异性抗体，其中相邻的抗原结合位点之间通过接头连接，抗原结合位点与Fc区之间通过接头/铰链区连接。
权利要求9所述的三特异性抗体，其中所述接头包含氨基酸序列(G₄S)_n，其中n是等于或大于1的整数，优选地，接头由氨基酸序列(G₄S)₃或(G₄S)₄组成，优选所述接头具有SEQ ID NO:9所示的序列，所述铰链区为来自免疫球蛋白的铰链区，优选来自IgG的铰链区。
权利要求1-8中所述的三特异性抗体，其中所述Fc区来自免疫球蛋白IgG1或IgG4的Fc区，优选地，Fc区衍生自SEQ ID NO:33、34或35所示的重链恒定区序列，优选地，Fc区包含修饰，例如Fc区包含杵臼结构。
权利要求11所述的三特异性抗体，其中所述Fc区包含选自S228P、S354C、T366W、T366S、L368A、Y394C、Y407V、H435R、Y436F、K447A的取代(依照EU编号系统)。
权利要求1或2所述的三特异性抗体，其包含：

1)包含SEQ ID NO:37或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:38或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

2)包含SEQ ID NO:39或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:40或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

3)包含SEQ ID NO:41或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:42或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

4)包含SEQ ID NO:43或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:44或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

5)包含SEQ ID NO:45或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:46或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

6)包含SEQ ID NO:47或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:48或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

7)包含SEQ ID NO:49或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:50或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

8)包含SEQ ID NO:59或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:60或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

9)包含SEQ ID NO:61或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:62或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

10)包含SEQ ID NO:63或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:64或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

11)包含SEQ ID NO:65或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:66或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

12)包含SEQ ID NO:67或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:68或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

13)包含SEQ ID NO:69或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:70或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

14)包含SEQ ID NO:71或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:72或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

15)包含SEQ ID NO:73或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:74或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链；或

16)包含SEQ ID NO:75或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:76或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链。
权利要求3所述的三特异性抗体，其包含：

包含SEQ ID NO:51或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的第一重链，

包含SEQ ID NO:53或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的第二重链，和

包含SEQ ID NO:52或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链。
权利要求4所述的三特异性抗体，其包含：

包含SEQ ID NO:56或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的第一重链，

包含SEQ ID NO:58或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的第二重链，和

包含SEQ ID NO:57或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的轻链。
权利要求5所述的三特异性抗体，其包含：

包含SEQ ID NO:54或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的第一重链，和

包含SEQ ID NO:55或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列的第二重链。
权利要求1、2或13所述的三特异性抗体，其包含：

1)包含SEQ ID NO:37或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:38或由其组成的轻链；或

2)包含SEQ ID NO:39或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:40或由其组成的轻链；或

3)包含SEQ ID NO:41或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:42或由其组成的轻链；或

4)包含SEQ ID NO:43或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:44或由其组成的轻链；或

5)包含SEQ ID NO:45或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:46或由其组成的轻链；或

6)包含SEQ ID NO:47或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:48或由其组成的轻链；或

7)包含SEQ ID NO:49或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:50或由其组成的轻链；或

8)包含SEQ ID NO:59或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:60或由其组成的轻链；或

9)包含SEQ ID NO:61或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:62或由其组成的轻链；或

10)包含SEQ ID NO:63或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:64或由其组成的轻链；或

11)包含SEQ ID NO:65或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:66或由其组成的轻链；或

12)包含SEQ ID NO:67或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:68或由其组成的轻链；或

13)包含SEQ ID NO:69或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:70或由其组成的轻链；或

14)包含SEQ ID NO:71或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:72或由其组成的轻链；或

15)包含SEQ ID NO:73或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:74或由其组成的轻链；或

16)包含SEQ ID NO:75或由其组成的重链，和包含SEQ ID NO:76或由其组成的轻链。
权利要求1、3或14所述的三特异性抗体，其包含：

包含SEQ ID NO:51或由其组成的第一重链，

包含SEQ ID NO:53或由其组成的第二重链，和

包含SEQ ID NO:52或由其组成的轻链。
权利要求1、4或15所述的三特异性抗体，其包含：

包含SEQ ID NO:56或由其组成的第一重链，

包含SEQ ID NO:58或由其组成的第二重链，和

包含SEQ ID NO:57或由其组成的轻链。
权利要求1、5或16所述的三特异性抗体，其包含：

包含SEQ ID NO:54或由其组成的第一重链，和

包含SEQ ID NO:55或由其组成的第二重链。
多核苷酸，其编码权利要求1-20中任一项所述的三特异性抗体。
载体，其包含权利要求21的多核苷酸，优选地，所述载体是表达载体。
宿主细胞，其包含权利要求21所述的多核苷酸或权利要求22所述的载体，例如，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
用于生产权利要求1-20中任一项所述的三特异性抗体的方法，所述方法包括：

在适于表达所述抗体的多肽链的条件下培养包含编码所述多肽链的宿主细胞；和在适于所述多肽链装配为所述抗体的条件下使多肽链装配产生所述抗体。
药物组合物，其包含权利要求1-20中任一项所述的三特异性抗体和可药用载体。
根据权利要求1-20中任一项所述的多特异性抗体或权利要求25的药物组合物在制备用于在个体中治疗和/或预防癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病或血管发生相关疾病的药物中的用途，或在制备用于癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病或血管发生相关疾病诊断的试剂中的用途。
权利要求26的用途，其中所述癌症选自肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、乳腺癌、肝癌、膀胱癌,乳腺癌、黑素瘤,结肠癌、直肠癌,卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺腺癌、基底细胞癌、食道癌、胆管癌、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌、脑癌、胃癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、睾丸癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤等实体瘤和白血病、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤)等血液瘤。
一种治疗、预防和/或诊断癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病或血管发生相关疾病的方法，包括将有效量的权利要求1-20中任一项所述的三特异性抗体，或权利要求25的药物组合物施用给有需要的患者。
权利要求28的方法，其中所述癌症选自肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、乳腺癌、肝癌、膀胱癌,乳腺癌、黑素瘤,结肠癌、直肠癌,卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺腺癌、基底细胞癌、食道癌、胆管癌、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌、脑癌、胃癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、睾丸癌、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤等实体瘤和白血病、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤)等血液瘤。