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JP2023503399A - 抗tim3抗体と組み合わせて抗ox40抗体を用いるがんを治療する方法 - Google Patents

抗tim3抗体と組み合わせて抗ox40抗体を用いるがんを治療する方法 Download PDF

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Abstract

抗TIM3抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて、ヒトOX40(ACT35、CD134、またはTNFRSF4)に結合する非競合的な、アゴニスト抗OX40抗体及びその抗原結合断片による、がんを治療する方法、または免疫応答を増加、増強、もしくは刺激する方法を提供する。【選択図】なし

Description

本明細書に開示されるのは、ヒトTIM3に結合する抗体または抗原結合と組み合わせてヒトOX40に結合する抗体またはその抗原結合断片を用いるがんを治療する方法である。
OX40(ACT35、CD134、またはTNFRSF4としても知られる)は、約50KDのI型膜貫通糖タンパク質であり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)のメンバーである(Croft,2010;Gough and Weinberg,2009)。成熟ヒトOX40は、249アミノ酸(AA)残基で構成され、37AAの細胞質尾部と185AAの細胞外領域を有する。OX40の細胞外ドメインには、3つの完全なシステインリッチドメインと1つの不完全なシステインリッチドメイン(CRD)が含まれる。OX40の細胞内ドメインには1つの保存されたシグナル伝達関連QEEモチーフが含まれており、TRAF2、TRAF3、及びTRAF5を含むいくつかのTNFR関連因子(TRAF)への結合を媒介し、OX40が細胞内キナーゼに結合できるようにする(Arch and Thompson,1998;Willoughby et al.,2017)。
OX40は、活性化されたラットCD4T細胞で最初に発見され、その後、マウスとヒトの相同体がT細胞からクローニングされた(al-Shamkhani et al.,1996;Calderhead et al.,1993)。Tヘルパー(Th)1細胞、Th2細胞、Th17細胞、及び制御性T(Treg)細胞を含む活性化CD4T細胞での発現に加えて、OX40発現は活性化CD8T細胞、ナチュラルキラー(NK)T細胞、好中球、及びNK細胞の表面でも見られる(Croft,2010)。対照的に、低いOX40発現は、ナイーブなCD4及びCD8T細胞、ならびにほとんどの休止メモリーT細胞で見られる(Croft,2010;Soroosh et al.,2007)。ナイーブT細胞でのOX40の表面発現は一過性である。TCRの活性化後、T細胞でのOX40の発現は24時間以内に大幅に増加し、2~3日でピークに達し、5~6日間持続する(Gramaglia et al.,1998)。
OX40のリガンド(OX40L、gp34、CD252、またはTNFSF4としても知られる)は、OX40の唯一のリガンドである。他のTNFSF(腫瘍壊死因子スーパーファミリー)メンバーと同様に、OX40LはタイプII糖タンパク質であり、23AAの細胞内ドメインと133AAの細胞外ドメインを有する183AAを含む(Croft,2010;Gough and Weinberg,2009)。OX40Lは、細胞表面にホモマー三量体複合体を自然に形成する。リガンド三量体は、主に受容体のCRD1、CRD2、及び部分的なCRD3領域を介して、リガンドモノマー-モノマー界面でOX40の3つのコピーと相互作用するが、CRD4の関与はない(Compaan and Hymowitz,2006)。OX40Lは主に、活性化B細胞(Stuber et al.,1995)、成熟した通常型樹状細胞(DC)(Ohshima et al.,1997)、形質細胞様樹状DC(pDC)(Ito et al.,2004)、マクロファージ(Weinberg et al.,1999)、及びランゲルハンス細胞(Sato et al.,2002)を含む活性化抗原提示細胞(APC)で発現する。さらに、OX40Lは、NK細胞、マスト細胞、活性化T細胞のサブセット、ならびに血管内皮細胞、及び平滑筋細胞などの他の細胞型で発現することがわかっている(Croft,2010;Croft et al.,2009)。
三量体OX40Lによるライゲーションまたはアゴニスト抗体による二量体化を介したOX40三量体化は、アダプター分子TRAF2、TRAF3、及び/またはTRAF5の細胞内QEEモチーフへの動員及びドッキングに寄与する(Arch and Thompson,1998;Willoughby et al.,2017)。TRAF2及びTRAF3の動員及びドッキングは、T細胞の生存、分化、拡大、サイトカイン産生、及びエフェクター機能の調節に重要な役割を果たす、古典的NF-κB1経路と非古典的NF-κB2経路の両方の活性化をさらにもたらし得る(Croft,2010;Gramaglia et al.,1998;Huddleston et al.,2006;Rogers et al.,2001;Ruby and Weinberg,2009;Song et al.,2005a;Song et al.,2005b;Song et al.,2008)。
正常組織では、OX40の発現は低く、主にリンパ器官のリンパ球に見られる(Durkop et al.,1995)。しかしながら、免疫細胞でのOX40発現の上方制御は、動物モデルと、自己免疫疾患(Carboni et al.,2003;Jacquemin et al.,2015;Szypowska et al.,2014)及びがん(Kjaergaard et al.,2000;Vetto et al.,1997;Weinberg et al.,2000)などの病態を有するヒト患者(Redmond and Weinberg,2007)の両方で頻繁に観察されている。注目すべきことに、OX40の発現の増加は、結腸直腸癌及び皮膚黒色腫の患者の生存期間の延長と関連しており、遠隔転移及びより進行した腫瘍の特徴の発生と逆相関する(Ladanyi et al.,2004;Petty et al.,2002;Sarff et al.,2008)。抗OX40抗体治療は、さまざまなマウスモデルで抗腫瘍効果を引き出すことができることも示されており(Aspeslagh et al.,2016)、免疫療法の標的としてのOX40の可能性を示している。Curtiらが実施したがん患者を対象とした最初の臨床試験では、抗腫瘍効果と腫瘍特異的T細胞の活性化の証拠が、アゴニスト抗OX40モノクローナル抗体で観察され、OX40抗体が抗腫瘍T細胞応答をブーストすることにおいて有用であることを示す(Curti et al.,2013)。
抗腫瘍効果の媒介におけるアゴニスト抗OX40抗体の作用機序は、主にマウス腫瘍モデルで研究されてきた(Weinberg et al.,2000)。最近まで、腫瘍におけるアゴニスト抗OX40抗体の作用機序は、エフェクターT細胞における共刺激シグナル伝達経路を誘発するそれらの能力、ならびにTreg細胞の分化及び機能に対する阻害効果に起因していた(Aspeslagh et al.,2016;Ito et al.,2006;St Rose et al.,2013;Voo et al.,2013)。最近の研究では、動物腫瘍モデルとがん患者の両方で、腫瘍浸潤性TregがエフェクターT細胞(CD4とCD8の両方及び末梢Treg)よりも高いレベルのOX40を発現することが示されている(Lai et al.,2016;Marabelle et al.,2013b;Montler et al.,2016;Soroosh et al.,2007;Timperi et al.,2016。したがって、抗OX40抗体が抗腫瘍応答を引き起こす二次的効果は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)及び/または抗体依存性細胞食作用(ADCP)を介して腫瘍内OX40Treg細胞を枯渇させるそれらのFcを介したエフェクター機能に依存する(Aspeslagh et al.,2016;Bulliard et al.,2014;Marabelle et al.,2013a;Marabelle et al.,2013b;Smyth et al.,2014)。この研究は、Fcを介したエフェクター機能を備えたアゴニスト抗OX40抗体が、腫瘍内Tregを優先的に枯渇させ、腫瘍微小環境(TME)におけるTregに対するCD8エフェクターT細胞の比率を改善し、抗腫瘍免疫応答を改善し、腫瘍退縮の増加及び生存率の改善が可能であることを示す(Bulliard et al.,2014;Carboni et al.,2003;Jacquemin et al.,2015;Marabelle et al.,2013b)。これらの発見に基づいて、アゴニスト活性とFcを介したエフェクター機能の両方を備えたアゴニスト抗OX40抗体を開発するという満たされていない医学的必要性が存在する。
現在まで、臨床でのアゴニスト抗OX40抗体は、ほとんどがOX40-OX40L相互作用を遮断するリガンド競合抗体である(例えば、WO2016196228A1)。OX40-OX40Lの相互作用は、効果的な抗腫瘍免疫を強化するために不可欠であるため、OX40-OX40Lの遮断は、これらのリガンド競合抗体の有効性を制限する。したがって、OX40Lと相互作用するOX40を妨害せずにOX40に特異的に結合するOX40アゴニスト抗体は、がん及び自己免疫疾患の治療に有用性がある。
がん及びウイルス感染症では、TIM3シグナル伝達の活性化が免疫細胞の機能不全を促進し、がんの増殖またはウイルス感染の拡大をもたらす。腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、マクロファージ、及び腫瘍細胞におけるTIM3発現の上方制御は、肺癌(Zhuang X,et al.,Am J Clin Pathol 2012 137:978-985)、肝臓癌(Li H,et al.,Hepatology 2012 56:1342-1351)、胃癌(Jiang et al.,PLoS One 2013 8:e81799)、腎臓癌(Komohara et al.,Cancer Immunol Res.2015 3:999-1000)、乳癌(Heon EK,et al.,2015 Biochem Biophys Res Commun.464:360-6)、結腸癌(Xu et al.,Oncotarget 2015)、黒色腫(Gros A,et al.,2014 J Clin Invest.2014 124:2246-2259)、及び子宮頸癌(Cao et al.,PLoS One 2013 8:e53834)などの多くの種類のがんで報告されている。これらのがんにおけるTIM3の発現の増加は、患者の生存転帰の予後不良と相関している。TIM3シグナル伝達の上方制御は、がんに対する免疫寛容だけでなく、慢性ウイルス感染に対する免疫寛容においても重要な役割を果たす。HIV及びHCV感染中、T細胞でのTIM3の発現は、健康な人と比較して有意に高く、ウイルス量及び疾患の進行と正の相関があった(Jones RB,et al.,2008 J Exp Med.205:2763-79;Sakhdari A,et al.,2012 PLoS One 7:e40146;Golden-Mason L,et al.,2009 J Virol.83:9122-30;2012 Moorman JP,et al.,J Immunol.189:755-66)。さらに、TIM3受容体を単独で、またはPD-1/PD-L1遮断と組み合わせて遮断するとインビトロとインビボの両方で機能的に「疲弊した」T細胞を救済することができる(Dietze KK,et al.,2013 PLoS Pathog 9:e1003798;Golden-Mason L,et al.,2009 J Virol.83:9122-30)。したがって、治療薬によるTIM3シグナル伝達の調節は、免疫細胞、例えばT細胞、NK細胞、及びマクロファージを寛容から救い出し、腫瘍または慢性ウイルス感染を根絶するための効率的な免疫応答を誘導することができる。
本開示は、アゴニスト抗OX40抗体及び抗原結合断片と抗TIM3抗体及び抗原結合断片の組み合わせ、ならびにがんの治療におけるこれらの抗体の組み合わせを使用する方法に関する。
一実施形態では、本開示は、抗TIM3抗体またはその抗原結合断片と組み合わせたアゴニスト抗OX40抗体を提供する。一態様では、本開示のOX40抗体は、OX40Lと競合しないか、またはOX40のそのリガンドOX40Lへの結合を妨害しない。
本開示は、以下の実施形態を包含する。
がん治療の方法であって、前記方法は、有効量の非競合的抗OX40抗体またはその抗原結合断片を、抗TIM3抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて対象に投与することを含む、前記方法。
前記OX40抗体がヒトOX40に特異的に結合し:
(i)(a)配列番号3のHCDR(重鎖相補性決定領域)1、(b)配列番号24のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号25のLCDR(軽鎖相補性決定領域)1、(e)配列番号19のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域か、
(ii)(a)配列番号3のHCDR1、(b)配列番号18のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号6のLCDR1、(e)配列番号19のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域か、
(iii)(a)配列番号3のHCDR1、(b)配列番号13のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号6のLCDR1、(e)配列番号7のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域か、または
(iv)(a)配列番号3のHCDR1、(b)配列番号4のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号6のLCDR1、(e)配列番号7のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域を含み、
抗TIM3抗体またはその抗原結合断片と組み合わされる、
前記方法。
前記OX40抗体または抗原結合が:
(i)配列番号26を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号28を含む軽鎖可変領域(VL)か、
(ii)配列番号20を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号22を含む軽鎖可変領域(VL)か、
(iii)配列番号14を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号16を含む軽鎖可変領域(VL)か、または
(iv)配列番号9を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号11を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、
前記方法。
前記抗TIM3抗体またはその抗原結合断片が、ヒトTIM3に特異的に結合し、配列番号32のHCDR1、配列番号33のHCDR2、及び配列番号34のHCDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号35のLCDR1、配列番号36のLCDR2、及び配列番号37のLCDR3を含む軽鎖可変領域と、を含む抗体の抗原結合ドメインを含む、前記方法。
前記抗TIM3抗体が、ヒトTIM3に特異的に結合し、配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)と、を含む抗体の抗原結合ドメインを含む、前記方法。
前記抗OX40抗体または抗原結合断片が、Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、及び(Fab’)2断片からなる群から選択される抗体断片である、前記方法。
前記抗TIM3抗体または抗原結合断片が、Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、及び(Fab’)2断片からなる群から選択される抗体断片である、前記方法。
前記がんが、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、または肉腫である、前記方法。
前記乳癌が転移性乳癌である、前記方法。
前記治療が、前記治療の中止後に前記対象において持続的抗がん応答をもたらす、前記方法。
免疫応答または機能を増加、増強、または刺激する方法であって、前記方法は、有効量の非競合的抗OX40抗体またはその抗原結合断片を、抗TIM3抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて対象に投与することを含む、前記方法。
前記OX40抗体がヒトOX40に特異的に結合し:
(i)(a)配列番号3のHCDR(重鎖相補性決定領域)1、(b)配列番号24のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号25のLCDR(軽鎖相補性決定領域)1、(e)配列番号19のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域か、
(ii)(a)配列番号3のHCDR1、(b)配列番号18のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号6のLCDR1、(e)配列番号19のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域か、
(iii)(a)配列番号3のHCDR1、(b)配列番号13のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号6のLCDR1、(e)配列番号7のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域か、または
(iv)(a)配列番号3のHCDR1、(b)配列番号4のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号6のLCDR1、(e)配列番号7のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域を含み、
抗TIM3抗体と組み合わされる、
前記方法。
前記OX40抗体またはその抗原結合断片が:
(i)配列番号26を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号28を含む軽鎖可変領域(VL)か、
(ii)配列番号20を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号22を含む軽鎖可変領域(VL)か、
(iii)配列番号14を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号16を含む軽鎖可変領域(VL)か、または
(iv)配列番号9を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号11を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、
前記方法。
前記抗TIM3抗体またはその抗原結合断片が、ヒトTIM3に特異的に結合し、配列番号32のHCDR1、配列番号33のHCDR2、及び配列番号34のHCDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号35のLCDR1、配列番号36のLCDR2、及び配列番号37のLCDR3を含む軽鎖可変領域と、を含む抗体の抗原結合ドメインを含む、前記方法。
前記抗TIM3抗体が、ヒトTIM3に特異的に結合し、配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)と、を含む抗体の抗原結合ドメインを含む、前記方法。
前記抗OX40抗体または抗原結合断片が、Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、及び(Fab’)2断片からなる群から選択される抗体断片である、前記方法。
前記抗TIM3抗体または抗原結合断片が、Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、及び(Fab’)2断片からなる群から選択される抗体断片である、前記方法。
免疫応答を刺激することが、T細胞、NK細胞、及びマクロファージに関連している、前記方法。
前記免疫応答を刺激することが、抗原刺激に対する応答性の増加を特徴とする、前記方法。
前記T細胞が、サイトカイン分泌、増殖、または細胞溶解活性を増加させる、前記方法。
前記T細胞が、CD4+及びCD8+のT細胞である、前記方法。
前記投与が、前記治療の中止後に前記対象において持続的免疫応答をもたらす、前記方法。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号13、配列番号18、配列番号19、配列番号24、及び配列番号25からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する1つ以上の相補性決定領域(CDR)を含む。
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、(a)配列番号3、配列番号4、配列番号13、配列番号18、配列番号24、配列番号5、配列番号6、配列番号25、配列番号7、配列番号19、及び配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する1つ以上の相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域;及び/または(b)配列番号6、配列番号25、配列番号7、配列番号19、及び配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する1つ以上の相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域を含む。
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、(a)配列番号3のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号4、配列番号13、配列番号18、または配列番号24のアミノ酸配列を有するHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR3である、3つの相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域、及び/または(b)配列番号6または配列番号25のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号7または配列番号19のアミノ酸配列を有するLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を有するLCDR3である、3つの相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域を含む。
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、(a)配列番号3のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号4のアミノ酸配列を有するHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR3であるか、または配列番号3のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号13のアミノ酸配列を有するHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR3であるか、または配列番号3のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号18のアミノ酸配列を有するHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR3であるか、または配列番号3のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号24のアミノ酸配列を有するHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR3である、3つの相補性決定領域(HCDR)を含む重鎖可変領域、及び/または(b)配列番号6のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号7のアミノ酸配列を有するLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を有するLCDR3であるか、または配列番号6のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を有するLCDR3であるか、または配列番号25のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を有するLCDR3である、3つの相補性決定領域(LCDR)を含む軽鎖可変領域を含む。
別の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、(a)配列番号3のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号4のアミノ酸配列を有するHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号6のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号7のアミノ酸配列を有するLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変領域と、を含む。
一実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、(a)配列番号3のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号13のアミノ酸配列を有するHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号6のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号7のアミノ酸配列を有するLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変領域と、を含む。
別の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、(a)配列番号3のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号18のアミノ酸配列を有するHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号6のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変領域と、を含む。
別の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、(a)配列番号3のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号24のアミノ酸配列を有するHCDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号25のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するLCDR2、及び配列番号8のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変領域と、を含む。
一実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、(a)配列番号9、配列番号14、配列番号20、もしくは配列番号26のアミノ酸配列か、または配列番号9、配列番号14、配列番号20、もしくは配列番号26のいずれか1つに対して少なくとも95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び/または(b)配列番号11、配列番号16、配列番号22、もしくは配列番号28のアミノ酸配列か、または配列番号11、配列番号16、配列番号22、もしくは配列番号28のいずれか1つに対して少なくとも95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
別の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、(a)配列番号9、配列番号14、配列番号20、もしくは配列番号26のアミノ酸配列か、または配列番号9、配列番号14、配列番号20、もしくは配列番号26のアミノ酸配列中に1、2、もしくは3個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び/または(b)配列番号11、配列番号16、配列番号22、もしくは配列番号28のアミノ酸配列か、または配列番号11、配列番号16、配列番号22、もしくは配列番号28のアミノ酸配列中に1、2、3、4、もしくは5個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
一実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、
(a)配列番号9のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または
(b)配列番号14のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号16のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または
(c)配列番号20のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号22のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または
(d)配列番号26のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号28のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本開示の抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4アイソタイプのものである。より具体的な実施形態では、本開示の抗体は、野生型ヒトIgG1(ヒトIgG1wtまたはhuIgG1とも呼ばれる)またはIgG2のFcドメインを含む。別の実施形態では、本開示の抗体は、S228P及び/またはR409K置換(EUナンバリングシステムによる)を有するヒトIgG4のFcドメインを含む。
一実施形態では、本開示の抗体は、1×10-6M~1×10-10Mの結合親和性(K)でOX40に結合する。別の実施形態では、本開示の抗体は、約1×10-6M、約1×10-7M、約1×10-8M、約1×10-9M、または約1×10-10Mの結合親和性(K)でOX40に結合する。
別の実施形態では、本発明の抗ヒトOX40抗体は、カニクイザルOX40に対する異種間結合活性を示す。
一実施形態では、本開示の抗OX40抗体は、OX40-OX40L相互作用界面の外側のヒトOX40のエピトープに結合する。別の実施形態では、本開示の抗OX40抗体は、OX40に結合するOX40リガンドと競合しない。さらに別の実施形態では、本開示の抗OX40抗体は、OX40とそのリガンドOX40Lとの間の相互作用を遮断しない。
本開示の抗体はアゴニストであり、免疫応答を有意に増強する。本発明は、抗OX40抗体のアゴニスト能力を試験するための方法を提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおいて、初代T細胞を有意に刺激してIL-2を産生することができる。
一実施形態では、本開示の抗体は、強力なFcを介したエフェクター機能を有する。抗体は、NK細胞による制御性T細胞(Treg細胞)などのOX40Hi標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害(ADCC)を媒介する。一態様では、本開示は、異なるOX40発現レベルに基づいて、特定のT細胞サブセットの抗OX40抗体媒介性のインビトロ枯渇を評価する方法を提供する。
本開示の抗体または抗原結合断片は、OX40-OX40L相互作用を遮断しない。さらに、OX40抗体は、動物モデルで示されているように、インビボで用量依存的な抗腫瘍活性を示す。用量依存的な活性は、OX40-OX40L相互作用を遮断する抗OX40抗体の活性プロファイルとは異なる。
本開示は、抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。一実施形態では、単離された核酸は、配列番号10、配列番号15、配列番号21、または配列番号27のVHヌクレオチド配列、または配列番号10、配列番号15、配列番号21、または配列番号27に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、本開示の抗体または抗原結合断片のVH領域をコードする。代替的にまたは付加的に、単離された核酸は、配列番号12、配列番号17、配列番号23、または配列番号29のVLヌクレオチド配列、または配列番号12、配列番号17、配列番号23、または配列番号29に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、本開示の抗体または抗原結合断片のVL領域をコードする。
別の態様では、本開示は、OX40抗体またはその抗原結合断片と、任意選択で、薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物に関する。
さらに別の態様では、本開示は、OX40抗体もしくはその抗原結合断片、またはOX40抗体医薬組成物を治療有効量でそれを必要とする対象に投与することを含む、対象の疾患を治療する方法に関する。別の実施形態では、抗体または抗原結合断片によって治療される疾患は、がんまたは自己免疫疾患である。
本開示は、がんまたは自己免疫疾患などの疾患を治療するための抗体もしくはその抗原結合断片、またはOX40抗体医薬組成物の使用に関する。
OX40-mIgG2a、OX40-huIgG1、及びOX40-Hisの構築物の概略図である。OX40 ECD:OX40細胞外ドメインN:N末端C:C末端 表面プラズモン共鳴(SPR)による精製キメラ(ch445)抗OX40抗体とヒト化(445-1、445-2、445-3、及び445-3のIgG4)抗OX40抗体の親和性の決定を示す。 フローサイトメトリーによるOX40結合の決定を示す。OX40陽性HuT78/OX40細胞を、さまざまな抗OX40抗体(抗体ch445、445-1、445-2、445-3、及び445-3のIgG4)とともにインキュベートし、FACS分析を行った。結果は平均蛍光強度(MFI、Y軸)で示す。 フローサイトメトリーによるOX40抗体の結合を示す。HuT78/OX40及びHuT78/cynoOX40細胞を抗体445-3で染色し、平均蛍光強度(MFI、Y軸に示す)をフローサイトメトリーで決定した。 表面プラズモン共鳴(SPR)によるOX40野生型及び点変異体に対する445-3のFabの親和性決定を示す。 抗体445-3とOX40上のそのエピトープ間の詳細な相互作用を示す。抗体445-3とOX40は、それぞれ淡い灰色と黒色で描かれる。水素結合または塩橋、π-πスタッキング、及びファンデルワールス(VDW)の相互作用は、それぞれ破線、二重破線、及び実線で示される。 抗体445-3がOX40L結合を妨害しないことを示す。HEK293/OX40L細胞を染色する前に、OX40-マウスIgG2a(OX40-mIgG2a)融合タンパク質を、ヒトIgG(+HuIgG)、抗体445-3(+445-3)、または抗体1A7.gr1(+1A7.gr1、US 2015/0307617を参照されたい)とともに1:1のモル比でプレインキュベートした。OX40LのOX40-mIgG2a/抗OX40抗体複合体への結合は、HEK293/OX40L細胞とOX40-mIgG2a/抗OX40抗体複合体の共培養とそれに続く抗マウスIgG二次抗体との反応及びフローサイトメトリーによって決定された。結果は、重複の平均±SDで示された。統計的有意性:*:P<0.05;**:P<0.01 OX40/445-3Fabと報告されているOX40/OX40L複合体(PDBコード:2HEV)の構造アラインメントを示す。OX40Lは白色で、445-3Fabは灰色で、OX40は黒色で示される。 抗OX40抗体445-3がTCR刺激とあわせてIL-2産生を誘導することを示す。OX40陽性HuT78/OX40細胞(A)を、抗OX40抗体の存在下で人工抗原提示細胞(APC)株(HEK293/OS8Low-FcγRI)と一晩共培養し、IL-2産生をT細胞刺激の読み出し情報として使用した(B)。培養上清中のIL-2をELISAで検出した。結果は、三重の平均±SDで示される。 抗OX40抗体がMLR応答を増強することを示す。インビトロで分化した樹状細胞(DC)を、抗OX40抗体(0.1~10μg/ml)の存在下で同種異系CD4T細胞と2日間共培養した。培養上清中のIL-2をELISAで検出した。すべての試験は四重で実施され、結果は平均±SDとして示された。統計的有意性:*:P<0.05;**:P<0.01 抗OX40抗体445-3がADCCを誘導することを示す。ADCCアッセイは、抗OX40抗体(0.004~3μg/ml)または対照の存在下で、エフェクター細胞としてNK92MI/CD16V細胞を使用し、標的細胞としてHuT78/OX40細胞を使用して実施した。同数のエフェクター細胞と標的細胞を5時間共培養した後、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出を検出した。細胞傷害性のパーセンテージ(Y軸)は、実施例12に記載されているように製造業者のプロトコールに基づいて計算された。結果は、三重の平均±SDで示される。 NK細胞と組み合わせた抗OX40抗体445-3が、インビトロで活性化されたPBMCにおいて、Tregに対するCD8エフェクターT細胞の比率を増加させることを示す。ヒトPBMCはPHA-L(1μg/ml)で事前に活性化され、次いで抗OX40抗体または対照の存在下でNK92MI/CD16V細胞と共培養された。異なるT細胞サブセットのパーセンテージは、フローサイトメトリーによって決定された。CD8エフェクターT細胞とTregの比率をさらに計算した。Aは、CD8+/総T細胞の比率を示す。BはTreg/総T細胞の比率である。Cは、CD8+/Tregの比率である。データは、重複の平均±SDで示される。示された濃度での445-3と1A7.gr1の間の統計的有意性が示される。*:P<0.05;**:P<0.01 1A7.gr1ではなく抗OX40抗体445-3が、OX40ヒト化マウスのMC38結腸直腸癌同系モデルにおける用量依存的な抗腫瘍活性を明らかにすることを示す。MC38マウス結腸癌細胞(2×10)をメスのヒトOX40トランスジェニックマウスの皮下に移植した。腫瘍体積に応じて無作為化した後、示されているように、動物に抗OX40抗体またはアイソタイプ対照のいずれかを週に1回、3回腹腔内注射した。445-3抗体の用量の増加と1A7.gr1抗体の用量の増加、及び腫瘍増殖の減少を比較する。データは、群あたり6匹のマウスの平均腫瘍体積±平均の標準誤差(SEM)として示される。統計的有意性:*:P<0.05対アイソタイプ対照 1A7.gr1ではなく抗OX40抗体445-3が、OX40ヒト化マウスのMC38結腸直腸癌同系モデルにおける用量依存的な抗腫瘍活性を明らかにすることを示す。MC38マウス結腸癌細胞(2×10)をメスのヒトOX40トランスジェニックマウスの皮下に移植した。腫瘍体積に応じて無作為化した後、示されているように、動物に抗OX40抗体またはアイソタイプ対照のいずれかを週に1回、3回腹腔内注射した。その特定の用量で処理されたすべてのマウスのデータを示す。データは、群あたり6匹のマウスの平均腫瘍体積±平均の標準誤差(SEM)として示される。統計的有意性:*:P<0.05対アイソタイプ対照 OX40抗体で行われたアミノ酸改変の表である。 OX40抗体で行われたアミノ酸改変の表である。 転移性乳癌のマウスモデルにおいて、抗TIM3抗体と組み合わせたOX40抗体の有効性を示す。 抗TIM3抗体と組み合わせたOX40抗体が腎臓癌のマウスモデルで有効であることを示す。
定義
本文書のいずこかで特に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
添付の特許請求の範囲を含めて本明細書で使用される場合、「a」、「an」、及び「the」などの単数形の単語は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、それらの対応する複数形の指示対象を含む。
「または」という用語は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、「及び/または」という用語を意味するために使用され、互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「抗がん剤」という用語は、細胞毒性剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線療法剤、標的化抗がん剤、及び免疫療法剤を含むがこれらに限定されない、がんなどの細胞増殖性障害を治療するために使用できる任意の薬剤を指す。
「OX40」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである約50KDのI型膜貫通型糖タンパク質を指す。OX40は、ACT35、CD134、またはTNFRSF4としても知られている。ヒトOX40のアミノ酸配列(配列番号1)もアクセッション番号NP_003318にあり、OX40タンパク質をコードするヌクレオチド配列はアクセッション番号X75962.1である。「OX40リガンド」または「OX40L」という用語は、OX40の唯一のリガンドを指し、gp34、CD252、またはTNFSF4と互換的である。
本明細書における「投与」、「投与すること」、「治療すること」、及び「治療」という用語は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、または生体液に適用される場合、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官、または生体液に対する、外因性の医薬品、治療、診断薬、または組成物の接触を意味する。細胞の治療は、試薬の細胞への接触、ならびに流体が細胞と接触している流体への試薬の接触を含む。「投与」及び「治療」という用語はまた、試薬、診断、結合化合物、または別の細胞による、例えば細胞のインビトロ及びエクスビボ治療を意味する。本明細書における「対象」という用語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物(例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ)、そして最も好ましくはヒトを含む。あらゆる疾患または障害を治療することは、一態様では、疾患または障害を改善すること(すなわち、疾患またはその臨床症状の少なくとも1つを緩徐化するか、阻止するか、または軽減すること)を指す。別の態様では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、患者によって識別できない可能性があるものを含む、少なくとも1つの物理的パラメーターを緩和または改善することを指す。さらに別の態様では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、物理的(例えば、識別可能な症状の安定化)、生理学的(例えば、身体的パラメーターの安定化)のいずれかまたはそので、疾患または障害を調節することを指す。さらに別の態様では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾患または障害の発症または発症または進行を予防または遅延させることを指す。
本開示の文脈における「対象」という用語は、哺乳動物、例えば霊長目、好ましくは高等霊長目、例えばヒト(例えば、本明細書に記載の障害を有する、またはそれを有するリスクのある患者)である。
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、抗体と抗原との間の相互作用の強さを指す。抗原内では、抗体「アーム」の可変領域が非共有結合力を介して多数の部位で抗原と相互作用し、相互作用が多いほど、親和性は強くなる。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、対応する抗原に非共有結合的に、可逆的に、そして特異的な様式で結合することができる免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。例えば、天然に存在するIgG抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖を含む四量体である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域(本明細書において、VHと略される)と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は3つのドメインである、CH1、CH2、及びCH3から構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書において、VLと略される)と軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLからなる。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに分割される。それぞれのVH及びVLは、アミノ末端からカルボキシル末端に向けて以下の順番:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4で配置された、3つのCDR及び4つのFRから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)及び古典的補体系の第1成分(C1q)を含む宿主の組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
「抗体」という用語としては、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び抗イディオタイプ(抗Id)抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、任意のアイソタイプ/クラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、またはサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)のものであり得る。
いくつかの実施形態では、抗OX40抗体は、少なくとも1つの抗原結合部位、または少なくとも可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗OX40抗体は、本明細書に記載のOX40抗体由来の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗OX40抗体は、単離されるか、または組換え体である。
本明細書における「モノクローナル抗体」または「mAb」または「Mab」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち集団に含まれる抗体分子が、少量で存在する可能性のある天然に存在する可能性のある変異を除いて、アミノ酸配列が同一であることを意味する。対照的に、従来の(ポリクローナル)抗体調製物は、典型的には、それらの可変ドメイン、特にそれらの相補性決定領域(CDR)に異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体を含み、これらはしばしば異なるエピトープに特異的である。「モノクローナル」という修飾語は、抗体が、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという特徴を示すものであって、抗体の産生が何か特定の方法による必要があることを意図しない。モノクローナル抗体(mAb)は、当業者に知られている方法によって得ることができる。例えば、Kohler et al.,Nature 1975 256:495-497;米国特許第4,376,110号;Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992;Harlow et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold spring Harbor Laboratory 1988;及びColligan et al.,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993を参照されたい。本明細書に開示される抗体は、IgG、IgM、IgD、IgE、IgA、及びIgG1を含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにIgG2、IgG3、IgG4などのそれらの任意のサブクラスのものであり得る。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養することができる。高力価のモノクローナル抗体は、個々のハイブリドーマからの細胞を、未処理のプライミングされたBalb/cマウスなどのマウスに腹腔内注射して、高濃度の所望の抗体を含む腹水を産生するインビボ産生で得ることができる。アイソタイプIgMまたはIgGのモノクローナル抗体は、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を使用して、腹水などから、または培養上清から精製することができる。
一般に、基本的な抗体構造単位は四量体を含む。それぞれの四量体は、2つの同一のポリペプチド鎖対を含み、それぞれの対は、1つの「軽鎖」(約25kDa)と、1つの「重鎖」(約50~70kDa)とを有する。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約100~110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を画定する。典型的には、ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は典型的には、α、δ、ε、γ、またはμとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれIgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMとして定義する。軽鎖及び重鎖内では、可変領域と定常領域は約12個以上のアミノ酸の「J」領域で結合され、重鎖は約10個を超えるアミノ酸の「D」領域も含む。
各軽鎖/重鎖(VL/VH)対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、インタクトな抗体には2つの結合部位がある。二機能性または二重特異性抗体を除いて、2つの結合部位は一般に同じである。
典型的には、重鎖と軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域(FR)の間に位置する、「相補性決定領域(CDR)」とも呼ばれる3つの超可変領域を含む。CDRは通常、フレームワーク領域によって整列され、特異的なエピトープへの結合を可能にする。一般に、N末端からC末端に向けて、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメインは、FR-1(またはFR1)、CDR-1(またはCDR1)、FR-2(FR2)、CDR-2(CDR2)、FR-3(またはFR3)、CDR-3(CDR3)、及びFR-4(またはFR4)を含む。CDR及びフレームワーク領域の位置は、当該技術分野で周知の様々な定義、例えば、Kabat、Chothia、及びAbM(例えばJohnson et al.,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001);Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987);Chothia et al.,Nature,342:877-883(1989);Chothia et al.,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992);Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997))を用いて決定され得る。抗原結合部位の定義は以下でも説明されている:Ruiz et al.,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000);及びLefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001);MacCallum et al.,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996);及びMartin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272(1989);Martin et al.,Methods Enzymol.,203:121-153(1991);及びRees et al.,In Sternberg M.J.E.(ed.),Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172(1996)。KabatとChothiaを組み合わせたナンバリングスキームでは、いくつかの実施形態では、CDRは、KabatのCDR、ChothiaのCDR、またはその両方の一部であるアミノ酸残基に対応する。例えば、CDRは、VH、例えば、哺乳動物VH、例えば、ヒトVHにおけるアミノ酸残基26~35(HC CDR1)、50~65(HC CDR2)、及び95~102(HC CDR3)、ならびにVL、例えば、哺乳動物VL、例えば、ヒトVLにおけるアミノ酸残基24~34(LC CDR1)、50~56(LC CDR2)、及び89~97(LC CDR3)に対応する。
「超可変領域」という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「CDR」(すなわち、軽鎖可変領域におけるVL-CDR1、VL-CDR2及びVL-CDR3、ならびに重鎖可変ドメインにおけるVH-CDR1、VH-CDR2及びVH-CDR3)からのアミノ酸残基を含む。Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(抗体のCDR領域を配列によって定義する)を参照されたい。Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917(抗体のCDR領域を構造によって定義する)も参照されたい。「フレームワーク」または「FR」残基という用語は、本明細書でCDR残基として定義される超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン残基を意味する。
別途示されない限り、「抗原結合断片」は、抗体の抗原結合断片、すなわち、全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば、1つ以上のCDR領域を保持する断片を意味する。抗原結合断片の例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片;ダイアボディ;線形抗体;単鎖抗体分子、例えば、単鎖Fv(ScFv);抗体断片から形成されたナノボディ及び多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
抗体は標的タンパク質に「特異的に結合」し、すなわち、抗体は他のタンパク質と比較してその標的に優先的に結合するが、この特異性は絶対的な結合特異性を必要とはしない。抗体は、その結合が、例えば疑陽性などの望ましくない結果を生成することなく、試料中の標的タンパク質の存在を決定する場合、その意図された標的に対して「特異的」であるとみなされる。本開示において有用な抗体またはその抗原結合断片は、非標的タンパク質との親和性よりも、少なくとも2倍、好ましくは少なくとも10倍、より好ましくは少なくとも20倍、そして最も好ましくは少なくとも100倍大きい親和性で標的タンパク質に結合するであろう。本明細書の抗体は、その配列を含むポリペプチドに結合するが、その配列を欠くタンパク質には結合しない場合、所与のアミノ酸配列、例えばヒトOX40分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合すると言われる。
本明細書における「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。マウス、マウス細胞、またはマウス細胞由来のハイブリドーマで産生される場合、ヒト抗体はマウス糖鎖を含み得る。同様に、「マウス抗体」または「ラット抗体」は、それぞれ、マウスまたはラットの免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト(例えば、マウス)抗体ならびにヒト抗体からの配列を含む抗体の形態を意味する。そのような抗体には、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列が含まれる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインを含み、すべてまたは実質的にすべての超可変ループは非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、すべてまたは実質的にすべてのFR領域は、ヒト免疫グロブリン配列のそれらである。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部を、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。接頭辞「hum」、「hu」、「Hu」、または「h」は、ヒト化抗体を親のげっ歯類抗体と区別するために必要な場合、抗体クローンの記号表示に追加される。ヒト化形態の齧歯動物抗体は、一般に、親齧歯動物抗体と同じCDR配列を含むが、親和性の増加、ヒト化抗体の安定性の増加、翻訳後修飾の除去のために、またはその他の理由で特定のアミノ酸置換を含めることができる。
本明細書で使用される場合、「非競合的」という用語は、抗体が受容体に結合することができ、受容体へのリガンド結合を妨害しないことを意味する。
「対応するヒト生殖系列配列」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変領域配列によってコードされる他のすべての既知の可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列または部分配列と最も高い決定されたアミノ酸配列同一性を共有するヒト可変領域アミノ酸配列または部分配列をコードする核酸配列を指す。対応するヒト生殖系列配列はまた、他のすべての評価された可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列または部分配列と最も高いアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列または部分配列を指し得る。対応するヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワーク及び相補性決定領域、可変セグメント(上で定義される)、または可変領域を構成する配列または部分配列の他の組み合わせであり得る。配列同一性は、本明細書に記載の方法を用いて決定することができ、例えば、BLAST、ALIGN、または当該技術分野で知られている別の整列アルゴリズムを用いて2つの配列を整列させる。対応するヒト生殖系列の核酸またはアミノ酸配列は、参照可変領域の核酸またはアミノ酸配列と、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有し得る。
「平衡解離定数(K、M)」という用語は、解離速度定数(kd、時間-1)を会合速度定数(ka、時間-1、M-l)で割ったものを指す。平衡解離定数は、当該技術分野で知られている任意の方法を用いて測定することができる。本開示の抗体は、一般に、約10-7または10-8M未満、例えば、約10-9Mまたは10-10M未満、いくつかの態様では、約10-11M、10-12M、または10-13M未満の平衡解離定数を有するであろう。
本明細書における「がん」または「腫瘍」という用語は、当該技術分野で理解される最も広い意味を有し、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指す。本開示の文脈において、がんは特定のタイプまたは場所に限定されない。
「併用療法」という用語は、本開示に記載されている治療状態または障害を治療するための2つ以上の治療薬の投与を指す。そのような投与は、これらの治療薬の実質的に同時の方法での共投与を包含する。そのような投与はまた、それぞれの有効成分について、複数の、または別々の容器(例えば、カプセル、粉末、及び液体)での共投与を包含する。粉末及び/または液体は、投与前に再構成または所望の用量に希釈することができる。さらに、そのような投与はまた、ほぼ同時にまたは異なる時間のいずれかでの連続的な方法でのそれぞれのタイプの治療薬の使用を包含する。いずれの場合も、治療レジメンは、本明細書に記載の状態または障害を治療する際の薬物の組み合わせの有益な効果を提供するであろう。
本開示の文脈において、アミノ酸配列に言及する場合、「保存的置換」という用語は、抗体または断片の化学的、物理的及び/または機能的特性、例えば、OX40への結合親和性を実質的に変化させない新しいアミノ酸による元のアミノ酸の置換を意味する。具体的には、アミノ酸の一般的な保存的置換を次の表に示し、当該技術分野でよく知られている。
Figure 2023503399000001
配列同一性及び配列類似性のパーセントを決定するのに適したアルゴリズムの例は、それぞれ、Altschul et al,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977;及びAltschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990に記載されているBLASTアルゴリズムである。BLAST分析を実行するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センターから公開されている。このアルゴリズムでは、最初に長さの短い単語Wを識別することにより、高スコアの配列対(HSP)を識別する。データベース配列内の同じ長さの単語と整列したときに、正の値のしきい値スコアTに一致するかそれを満たすクエリ配列を得る。Tは、近傍単語スコアしきい値と呼ばれる。これらの最初の近隣単語ヒットは、それらを含むより長いHSPを見つけるための検索を開始するための値として機能する。単語ヒットは、累積アラインメントスコアを増やすことができる限り、それぞれの配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターM(一致する残基の対の報酬スコア;常に>0)及びN(不一致の残基のペナルティスコア;常に<0)を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向の単語ヒットの拡張は、次の場合に停止される。累積アラインメントスコアがその最大達成値から数量Xだけ低下する;1つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になる;または3)いずれかの配列の末端に到達した。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T、及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列の場合)は、デフォルトとして、ワード長(W)11、期待値(E)10、M=5、N=-4、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTプログラムはデフォルトとしてワード長3、期待値(E)10、及びBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff and Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915を参照されたい)アラインメント(B)50、期待値(E)10、M=5、N=-4、及び両方の鎖の比較を使用する。
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計分析を実施する(例えば、Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787,1993を参照されたい)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、最小の合計確率(P(N))であり、これは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約約0.001未満である場合、核酸は参照配列に類似しているとみなされる。
2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、PAM120重量残基テーブル、12のギャップ長ペナルティ、及び4のギャップペナルティを使用して、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれているE.Meyers and W.Miller,Comput.Appl.Biosci.4:11-17,(1988)のアルゴリズムを使用して決定することもできる。さらに、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、BLOSUM62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかで、16、14、12、10、8、6、または4のギャップウェイト、及び1、2、3、4、5、または6の長さのウェイトを使用して、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:444-453,(1970)のアルゴリズムを使用して決定することができる。
「核酸」という用語は、本明細書では「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを指す。この用語は、合成、天然に存在する、及び天然に存在しない、公知のヌクレオチド類似体または改変骨格残基または結合を含む核酸を包含し、これらは参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される。そのような類似体の例としては、非制限的に、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル-メチルホスホネート、2’-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド-核酸(PNA)が挙げられる。
核酸の文脈における「作動可能に連結された」という用語は、2つ以上のポリヌクレオチド(例えば、DNA)セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは、転写調節配列と転写された配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、適切な宿主細胞または他の発現系におけるコード配列の転写を刺激または調節する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写された配列に作動可能に連結されているプロモーター転写調節配列は、転写された配列に物理的に隣接している、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどの一部の転写調節配列は、転写が増強されるコード配列に物理的に隣接している必要はなく、近接して配置されている必要もない。
いくつかの態様において、本開示は、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤と一緒に製剤化された、本明細書に記載の抗OX40抗体を含む組成物、例えば、薬学的に許容される組成物を提供する。本明細書において使用されるとき、「薬学的に許容可能な賦形剤」は、生理学的に適合性のある任意の及びすべての溶媒、分散媒、等張剤。及び吸収遅延剤などを含む。賦形剤は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、直腸、脊髄、または表皮投与(例えば、注射または注入による)に適したものとすることができる。
本明細書に開示される組成物は、様々な形態であり得る。これらとしては、例えば、液体溶液(例えば、注射可能及び注入溶液)、分散液または懸濁液、リポソーム、及び坐剤などの液体、半固体、及び固体の剤形が挙げられる。適切な形態は、意図される投与様式及び治療用途に依存する。典型的な適切な組成物は、注射可能または注入溶液の形態である。1つの適切な投与様式は、非経口(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)である。いくつかの実施形態では、抗体は静脈内注入または注射によって投与される。特定の実施形態では、抗体は筋肉内または皮下注射で投与される。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、疾患、または疾患もしくは障害の少なくとも1つ臨床症状を治療するために対象に投与された場合、疾患、障害、または症状に対してそのような治療を行うのに十分である抗体の量を指す。「治療有効量」は、抗体、疾患、障害、及び/または疾患もしくは障害の症状、疾患、障害、及び/または疾患もしくは障害の症状の重症度、治療される対象の年齢、及び/または治療される対象の体重によって変動し得る。任意の所与の場合における適切な量は、当業者には明らかであるか、または日常的な実験によって決定することができる。併用療法の場合、「治療有効量」とは、疾患、障害、または状態の効果的な治療のための併用対象の総量を指す。
本明細書で使用される場合、「と組み合わせて」という語句は、抗TIM3抗体の投与と同時に、その前に、またはその後に、抗OX40抗体が対象に投与されることを意味する。特定の実施形態では、抗TIM3抗体は、抗OX40抗体との共製剤として投与される。
抗TIM3抗体
T細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン3(TIM3、HAVCR2、またはCD366)は、33KDのタイプI膜貫通糖タンパク質であり、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメインを含むファミリーのメンバーであり、慢性ウイルス感染と腫瘍の免疫監視からの脱出の両方におけるT細胞疲弊の促進に重要な役割を果たす(Monney et al.,2002 Nature 415:536-541;Sanchez-Fueyo A,et al.,2003 Nat Immunol.4:1093-101;Sabatos CA,et al.,2003 Nat Immunol.4:1102-10;Anderson et al.,2006 Curr Opin Immunol.18:665-669)。TIM3をコードする遺伝子とcDNAは、マウスとヒトでクローン化され、特徴づけられた(Monney et al.,2002 Nature 415:536-541;McIntire et al.,2001 Nat.Immunol.2:1109-1116)。成熟したヒトTIM3は280アミノ酸残基を含む(NCBIアクセッション番号:NP_116171.3)。その細胞外ドメインはアミノ酸残基1~181からなり、膜貫通ドメインと細胞質C末端尾部は残基182~280を含む。細胞質ドメインに見られる、免疫受容抑制性チロシンモチーフ(ITIM)及びチロシンスイッチモチーフ(ITSM)などの既知の抑制性シグナル伝達モチーフはない。
本開示の抗TIM3抗体は、WO2018/036561に見出すことができる。本明細書でまた提供されるのは、ヒトTIM3に特異的に結合する抗体抗原結合ドメインを含み、配列番号32に示されるアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号33に示されるアミノ酸配列を含むHCDR2、及び配列番号34に示されるアミノ酸配列を含むHCDR3を含む相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号35に示されるアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号36に示されるアミノ酸配列を含むLCDR2、及び配列番号37に示されるアミノ酸配列を含むLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、抗TIM3抗体である。別の実施形態では、抗TIM3抗体は、ヒトTIM3に特異的に結合し、配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)と、を含む抗体の抗原結合ドメインを含む。
抗OX40抗体
本開示は、ヒトOX40に特異的に結合する抗体、抗原結合断片を提供する。さらに、本開示は、望ましい薬物動態学的特徴及び他の望ましい属性を有する抗体を提供し、したがって、がんの可能性を低減するか、またはがんを治療するために使用することができる。本開示はさらに、がん及び関連する障害の予防及び治療のための抗体を含む医薬組成物、ならびにそのような医薬組成物を作製及び使用する方法を提供する。
本開示は、OX40に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を提供する。本開示の抗体または抗原結合断片には、以下に記載されるように生成される抗体またはその抗原結合断片が含まれるが、これらに限定されない。
本開示は、OX40に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供し、ここで、上記抗体または抗体断片(例えば、抗原結合断片)は、配列番号14、20、または26のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む(表3)。本開示はまた、OX40に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供し、ここで、上記抗体または抗原結合断片は、表3に列挙されたVH CDRのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVH CDRを含む。一態様では、本開示は、OX40に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供し、ここで、上記抗体は、表3に列挙されたVH CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のVH CDRを含む(または代替的に、それらからなる)。
本開示は、OX40に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供し、ここで、上記抗体または抗原結合断片は、配列番号16、22、または28のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む(表3)。本開示はまた、OX40に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供し、ここで、上記抗体または抗原結合断片は、表3に列挙されたVL CDRのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVL CDRを含む。特に、本開示は、OX40に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供し、上記抗体または抗原結合断片は、表3に列挙されたVL CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のVL CDRを含む(または代替的に、それらからなる)。
本開示の他の抗体またはその抗原結合断片には、変異しているが、表3に記載されている配列に示されているCDR領域と、CDR領域において少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、または99%の同一性パーセントをなおも有するアミノ酸が含まれる。いくつかの態様において、それは、表3に記載される配列に示される配列に示されるCDR領域と比較した場合、CDR領域において1、2、3、4または5個以下のアミノ酸が変異している変異アミノ酸配列を含む。
本開示の他の抗体には、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異しているが、表3に記載されている配列に対して、少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、または99%の同一性パーセントをなおも有するものが含まれる。いくつかの態様において、それは、表3に記載される配列に示される配列に示される可変領域と比較した場合、可変領域において1、2、3、4または5個以下のアミノ酸が変異しているが、一方で実質的に同じ治療活性を保持している、変異アミノ酸配列を含む。
本開示はまた、OX40に特異的に結合する抗体のVH、VL、全長重鎖、及び全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。そのような核酸配列は、哺乳動物細胞での発現のために最適化することができる。
エピトープと同じエピトープに結合する抗体の同定
本開示は、ヒトOX40のエピトープに結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。特定の態様において、抗体及び抗原結合断片は、OX40の同じエピトープに結合することができる。
本開示はまた、表3に記載されている抗OX40抗体と同じエピトープに結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。したがって、追加の抗体及びその抗原結合断片は、結合アッセイにおいて他の抗体と交差競合する(例えば、統計的に有意な様式で結合を競合的に阻害する)それらの能力に基づいて同定することができる。OX40への本開示の抗体及びその抗原結合断片の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体が、OX40への結合についてその抗体またはその抗原結合断片と競合し得ることを実証している。そのような抗体は、いずれかの理論に拘束されることなく、それが競合する抗体またはその抗原結合断片と同じまたは関連する(例えば、構造的に類似または空間的に近位の)OX40上のエピトープに結合することができる。特定の態様では、本開示の抗体またはその抗原結合断片と同じOX40上のエピトープに結合する抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。そのようなヒトまたはヒト化モノクローナル抗体は、本明細書に記載されるように調製及び単離することができる。
Fc領域のフレームワークのさらなる改変
さらに他の態様では、Fc領域は、抗体のエフェクター機能を改変するために、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによって改変される。例えば、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、1つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1成分であり得る。このアプローチは、例えば、いずれもWinterらによる米国特許第5,624,821号及び同第5,648,260号に記載されている。
別の態様では、抗体がC1q結合を変化させ、及び/または補体依存性細胞毒性(CDC)を減少または廃止するように、1つ以上のアミノ酸残基を1つ以上の異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。このアプローチは、例えばIdusogieらによる米国特許第6,194,551号に記載されている。
さらに別の態様では、1つ以上のアミノ酸残基が変更されて、それにより、補体を固定する抗体の能力が変更される。このアプローチは、例えば、BodmerらによるPCT公開WO94/29351に記載されている。特定の態様では、本開示の抗体またはその抗原結合断片の1つ以上のアミノ酸は、IgG1サブクラス及びカッパアイソタイプについて、1つ以上のアロタイプアミノ酸残基によって置き換えられる。アロタイプアミノ酸残基には、IgG1、IgG2、及びIgG3サブクラスの重鎖の定常領域、ならびにJefferis et al.,MAbs.1:332-338(2009)によって記載されているカッパアイソタイプの軽鎖の定常領域も含まれるが、これらに限定されない。
別の態様では、Fc領域は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を媒介する抗体の能力を高めるため、及び/または1つ以上のアミノ酸を改変することによってFcγ受容体に対する抗体の親和性を高めるように改変される。このアプローチは、例えば、PrestaによるPCT公開WO00/42072に記載されている。さらに、FcγRI、FcγRII、FcγRIII、及びFcRnのヒトIgG1上の結合部位がマッピングされ、結合が改善されたバリアントが記載されている(Shields et al.,J.Biol.Chem.276:6591-6604,2001を参照されたい)。
さらに別の態様では、抗体のグリコシル化が改変されている。例えば、脱グリコシル化抗体を作製することができる(すなわち、抗体は、グリコシル化を欠いているか、または低減している)。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を高めるように改変することができる。そのような糖改変は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の1つ以上の部位を改変することによって達成することができる。例えば、1つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を排除する結果となる1つ以上のアミノ酸置換を行うことができ、それにより、その部位でのグリコシル化を排除する。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。このようなアプローチは、例えば、Coらによる米国特許第5,714,350号及び同第6,350,861号に記載されている。
追加的に、または代替的に、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体または二分岐GlcNac構造が増加した抗体など、グリコシル化のタイプが変化した抗体を作製することができる。そのような変化したグリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を高めることが実証されている。そのような糖改変は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構が変化した細胞は当該技術分野で説明されており、組換え抗体を発現してそれによってグリコシル化が変化した抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、HangらによるEP1,176,195は、フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が機能的に破壊された細胞株を記載しており、そのような細胞株で発現される抗体は低フコシル化を示す。PrestaによるPCT公開WO03/035835は、Asn(297)結合糖にフコースを結合する能力が低下し、その宿主細胞で発現する抗体の低フコシル化をもたらす、バリアントCHO細胞株であるLecl3細胞について記載する(Shields et al.,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740も参照されたい)。UmanaらによるPCT公開WO99/54342は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、ベータ(1,4)-NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))を発現するように操作された細胞株を記載しており、操作された細胞株で発現される抗体は、抗体のADCC活性の増加をもたらす二分岐GlcNac構造の増加を示す(Umana et al.,Nat.Biotech.17:176-180,1999も参照されたい)。
別の態様において、ADCCの減少が望まれる場合、ヒト抗体サブクラスIgG4は、適度なADCCのみを有し、CDCエフェクター機能をほとんど持たないことが以前の多くの報告で示された(Moore G L,et al.2010 MAbs,2:181-189)。一方、天然のIgG4は、酸性緩衝液中や温度上昇下などのストレス条件では安定性が低いことが見出された(Angal,S.1993 Mol Immunol,30:105-108;Dall’Acqua,W.et al,1998 Biochemistry,37:9266-9273;Aalberse et al.2002 Immunol,105:9-19)。ADCCの低下は、FcγR結合またはC1q結合活性を低下またはヌルにするように改変の組み合わせで操作されたIgG4に抗体を作動可能に連結し、それによってADCC及びCDCエフェクター機能を低下または排除することによって達成することができる。生物学的薬剤としての抗体の物理化学的特性を考慮すると、IgG4のあまり望ましくない固有の特性の1つは、溶液中のその2つの重鎖を動的に分離して半抗体を形成し、これにより、「Fabアーム交換」と呼ばれるプロセスによりインビボで二特異性抗体の産生をもたらすことである(Van der Neut Kolfschoten M,et al.2007 Science,317:1554-157)。位置228(EUナンバリングシステム)でのセリンのプロリンへの変異は、IgG4重鎖分離を阻害するように見えた(Angal,S.1993 Mol Immunol,30:105-108;Aalberse et al.2002 Immunol,105:9-19)。ヒンジ及びγFc領域のアミノ酸残基のいくつかは、Fcγ受容体との抗体相互作用に影響を及ぼすことが報告された(Chappel S M,et al.1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9036-9040;Mukherjee,J.et al.,1995 FASEB J,9:115-119;Armour,K.L.et al.1999 Eur J Immunol,29:2613-2624;Clynes,R.A.et al,2000 Nature Medicine,6:443-446;Arnold J.N.,2007 Annu Rev immunol,25:21-50)。さらに、ヒト集団でまれにしか発生しないIgG4アイソフォームも、さまざまな物理化学的特性を引き出す可能性がある(Brusco,A.et al.1998 Eur J Immunogenet,25:349-55;Aalberse et al.2002 Immunol,105:9-19)。ADCC、CDC、及び不安定性が低いOX40抗体を生成するために、ヒトIgG4のヒンジ及びFc領域を改変し、いくつかの改変を導入することができる。これらの改変されたIgG4 Fc分子は、Liらの米国特許第8,735,553号の配列番号83~88に見出すことができる。
OX40抗体産生
抗OX40抗体及びその抗原結合断片は、抗体四量体の組換え発現、化学合成、及び酵素消化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の手段によって産生することができるが、全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組換え産生によって得ることができる。組換え発現は、当該技術分野で知られている任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などに由来し得る。
本開示はさらに、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載の相補性決定領域を含む重鎖または軽鎖の可変領域またはセグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号15、21、または27からなる群から選択されるポリヌクレオチドと、少なくとも85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の核酸配列同一性を有する。いくつかの態様において、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号17、23、または29からなる群から選択されるポリヌクレオチドと、少なくとも85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の核酸配列同一性を有する。
本開示のポリヌクレオチドは、抗OX40抗体の可変領域配列をコードすることができる。それらはまた、抗体の可変領域と定常領域の両方をコードすることができる。ポリヌクレオチド配列のいくつかは、例示された抗OX40抗体のうちの1つの重鎖と軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。他のいくつかのポリヌクレオチドは、マウス抗体の1つの重鎖及び軽鎖の可変領域にそれぞれ実質的に同一である2つのポリペプチドセグメントをコードする。
また、本開示において提供されるのは、抗OX40抗体を産生するための発現ベクター及び宿主細胞である。発現ベクターの選択は、ベクターが発現される目的の宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、抗OX40抗体鎖または抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター及び他の調節配列(例えば、エンハンサー)を含む。いくつかの態様では、誘導性プロモーターは、誘導性条件の制御下を除いて、挿入された配列の発現を防ぐために使用される。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、lacZ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物の培養物は、その発現産物が宿主細胞によってよりよく許容されるコード配列のために集団にバイアスをかけることなく、非誘導条件下で拡大することができる。プロモーターに加えて、抗OX40抗体または抗原結合断片の効率的な発現のために他の調節エレメントも必要または望まれる場合がある。これらのエレメントとしては、典型的には、ATG開始コドン及び隣接するリボソーム結合部位または他の配列が挙げられる。さらに、使用中の細胞系に適したエンハンサーを含めることにより、発現効率を増強することができる(例えば、Scharf et al.,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994;及びBittner et al.,Meth.Enzymol.,153:516,1987を参照されたい)。例えば、SV40エンハンサーまたはCMVエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞での発現を増加させることができる。
抗OX40抗体鎖を保有及び発現するための宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれかであってよい。E.coliは、本開示のポリヌクレオチドをクローニング及び発現させるのに有用な1つの原核生物宿主である。使用に適した他の微生物宿主としては、Bacillus subtilisなどのbacilli、及びSalmonella、Serratia、及び様々なPseudomonas種などの他の腸内細菌科が挙げられる。これらの原核生物宿主では、発現ベクターを作製することもでき、これは典型的には、宿主細胞と互換性のある発現制御配列(例えば、複製起点)を含む。さらに、ラクトースプロモーターシステム、トリプトファン(trp)プロモーターシステム、ベータラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージラムダ由来のプロモーターシステムなど、よく知られている様々なプロモーターがいくつも存在する。プロモーターは、典型的には、任意選択でオペレーター配列によって発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び完了するためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物もまた、抗OX40ポリペプチドを発現するために使用することができる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。
他の態様において、哺乳動物宿主細胞は、本開示の抗OX40ポリペプチドを発現及び産生するために使用される。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株、または外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞株のいずれかであってよい。これらには、正常な不死でない、または正常、または異常な不死の、動物またはヒトの細胞が含まれる。例えば、インタクトな免疫グロブリンを分泌することができる多くの適切な宿主細胞株が開発されており、これには、CHO細胞株、様々なCOS細胞株、HEK293細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたB細胞、及びハイブリドーマが含まれる。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養の使用は、例えば、Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,NY,N.Y.,1987で一般的に論じられている。哺乳動物宿主細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、及びエンハンサーなどの発現制御配列(例えば、Queen et al.,Immunol.Rev.89:49-68,1986を参照されたい)、ならびにリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などの必要な処理情報部位を含むことができる。これらの発現ベクターは通常、哺乳動物の遺伝子または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーターを含む。適切なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的、及び/または調節可能もしくは調節可能であり得る。有用なプロモーターとしては、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性MMTVプロモーター、SV40プロモーター、MRP polIIIプロモーター、構成的MPSVプロモーター、テトラサイクリン誘導性CMVプロモーター(ヒト最初期CMVプロモーターなど)、構成的CMVプロモーター、及び当該技術分野で知られているプロモーター-エンハンサーの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
検出及び診断の方法
本開示の抗体または抗原結合断片は、OX40の検出方法を含むがこれらに限定されない様々な用途において有用である。一態様では、抗体または抗原結合断片は、生物試料中のOX40の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される場合、「検出すること」という用語は、定量的または定性的な検出を包含む。特定の態様では、生体試料は、細胞または組織を含む。他の態様では、そのような組織は、他の組織と比較して高いレベルでOX40を発現する正常な組織及び/またはがん性組織を含む。
一態様では、本開示は、生物試料中のOX40の存在を検出する方法を提供する。特定の態様では、この方法は、抗原への抗体の結合を許容する条件下で生物試料を抗OX40抗体と接触させることと、抗体と抗原との間に複合体が形成されるかどうかを検出することと、を含む。生物試料としては、尿または血液試料が挙げられるが、これらに限定されない。
OX40の発現に関連する障害を診断する方法も含まれる。特定の態様では、この方法は、試験細胞を抗OX40抗体と接触させることと、OX40ポリペプチドへの抗OX40抗体の結合を検出することにより、試験細胞におけるOX40の発現レベルを(定量的または定性的に)決定することと、試験細胞における発現のレベルを、対照細胞(例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞またはOX40を発現しない細胞)におけるOX40発現のレベルと比較することと、を含み、ここで、対照細胞と比較した試験細胞におけるより高いレベルのOX40の発現が、OX40の発現に関連する障害の存在を示す。
治療方法
本開示の抗体または抗原結合断片は、OX40に関連する障害または疾患の治療方法を含むがこれらに限定されない様々な用途において有用である。一態様では、OX40に関連する障害または疾患はがんである。
一態様では、本開示は、がんを治療する方法を提供する。特定の態様では、この方法は、有効量の抗OX40抗体または抗原結合断片を必要とする患者に投与することを含む。がんとしては、非限定的に、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、及び肉腫が挙げられ得る。
本開示の抗体または抗原結合断片は、非経口、肺内、及び鼻腔内を含む任意の適切な手段によって投与することができ、局所治療が必要な場合は、病巣内投与を行うことができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下の投与を含む。投与は、任意の適切な経路、例えば、投与が短時間であるか慢性であるかに一部依存して、静脈内注射または皮下注射などの注射であってよい。本明細書では、様々な時点にわたる単回または複数回の投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図されている。
本開示の抗体または抗原結合断片は、優れた医療行為と調和する方法で製剤化され、投薬され、投与されるであろう。これに関連して考慮すべき因子は、治療される特定の傷害、治療される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、傷害の原因、剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医療従事者に知られている他の因子を含む。抗体は、そうである必要はないが、任意選択で、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている1つ以上の薬剤とともに製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療のタイプ、及び上述の他の因子に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載の同じ投与量及び投与経路で、または本明細書に記載の投与量の約1~99%で、または経験的/臨床的に適切であると決定される任意の投与量及び任意の経路で使用される。
疾患の予防または治療のために、本開示の抗体または抗原結合断片の適切な投与量は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防または治療の目的のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴及び抗体に対する応答、ならびに主治医の判断に依存するであろう。抗体は、一度にまたは一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約1μg/kg~100mg/kgの抗体が、例えば1回以上の別々の投与によるか、または連続注入によるかを問わず、患者に投与するための最初の候補投与量となり得る。1つの典型的な1日の投与量は、上述の要因に応じて、約1μg/kg~100mg/kgまで、またはそれ以上の範囲になり得る。状態にもよるが、数日以上にわたる反復投与の場合、治療は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで持続されるであろう。そのような用量は、例えば、断続的に、例えば毎週または3週間ごと(例えば、患者が約2~約20、または例えば約6回の抗体の投与を受けるように)に投与することができる。最初のより高いローディング用量、続いて1回以上のより低い用量を投与することができる。ただし、他の投与レジメンが有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって簡単にモニターできる。
併用療法
一態様では、本開示のOX40抗体は、他の治療薬、例えば、抗TIM3抗体と組み合わせて使用することができる。本開示のOX40抗体とともに使用することができる他の治療薬としては、化学療法剤(例えば、パクリタキセルまたはパクリタキセル剤;(例えば、アブラキサン(登録商標))、ドセタキセル;カルボプラチン;トポテカン;シスプラチン;イリノテカン、ドキソルビシン、レナリドマイド、5-アザシチジン、イフォスファミド、オキサリプラチン、ペメトレキセド二ナトリウム、シクロホスファミド、エトポシド、デシタビン、フルダラビン、ビンクリスチン、ベンダムスチン、クロランブシル、ブスルファン、ゲムシタビン、メルファラン、ペントスタチン、ミトキサントロン、ペメトレキセド二ナトリウム)、チロシンキナーゼ阻害剤(例えば、EGFR阻害剤(例えば、エルロチニブ)、マルチキナーゼ阻害剤(例えば、MGCD265、RGB-286638)、CD-20標的化剤(例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、RO5072759、LFB-R603)、CD52標的化剤(例えば、アレムツズマブ)、プレドニゾロン、ダルベポエチンアルファ、レナリドマイド、Bcl-2阻害剤(例えば、オブリメルセンナトリウム)、オーロラキナーゼ阻害剤(例えば、MLN8237、TAK-901)、プロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブ)、CD-19標的化剤(例えば、MEDI-551、MOR208)、MEK阻害剤(例えば、ABT-348)、JAK-2阻害剤(例えば、INCB018424)、mTOR阻害剤(例えば、テムシロリムス、エベロリムス)、BCR/ABL阻害剤(例えば、イマチニブ)、ET-A受容体アンタゴニスト(例えば、ZD4054)、TRAIL受容体2(TR-2)アゴニスト(例えば、CS-1008)、HGF/SF阻害剤(例えば、AMG 102)、EGEN-001、ポロ様キナーゼ1阻害剤(例えば、BI 672)が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される抗TIM3抗体と組み合わせた抗OX40抗体は、経口、局所、直腸、非経口、吸入スプレー、または移植されたリザーバーを介するなど、様々な既知の方法で投与することができるが、どのような場合でも、最も適した経路は、特定の宿主、及び有効成分が投与されている状態の性質と重症度に依存する。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、及び頭蓋内の注射または注入の技術を含む。
抗OX40抗体と抗TIM3抗体の組み合わせは、異なる経路で投与できる。それぞれの抗体は、他の抗体とは無関係に、皮下、皮内、静脈内、または腹腔内などの非経口的に投与することができる。
一実施形態では、抗OX40抗体または抗TIM3抗体は、患者の必要性に基づいて、1日1回(1日1回、QD)、1日2回(1日2回、BID)、1日3回、1日4回、または1日5回投与される。
医薬組成物及び製剤
また、提供されるのは、抗OX40抗体または抗原結合断片、または抗OX40抗体または抗原結合断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬製剤を含む組成物である。特定の実施形態において、組成物は、OX40に結合する1つ以上の抗体または抗原結合断片、またはOX40に結合する1つ以上の抗体または抗原結合断片をコードする配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当該技術分野でよく知られている、緩衝液を含む薬学的に許容される賦形剤などの適切な担体をさらに含むことができる。
本明細書に記載のOX40抗体または抗原結合断片の医薬製剤は、所望の純度を有するそのような抗体または抗原結合断片を1つ以上の任意の薬学的に許容される担体と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される用量及び濃度において、レシピエントに対して非毒性でありリン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール;メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸;単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);及び/またはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体としては、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質性薬物分散剤がさらに挙げられる。rHuPH20を含む特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、米国特許第7,871,607号及び同第2006/0104968号に記載される。一態様では、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載される。水性抗体製剤には、米国特許第6,171,586号及びWO2006/044908に記載されるものが含まれ、後者の製剤には、ヒスチジン-アセテート緩衝液が含まれる。
持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の適切な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、マトリックスは、成形品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に滅菌されている。そのような滅菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成できる。
実施例1:抗OX40モノクローナル抗体の生成
抗OX40モノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ融合技術(de St Groth and Sheidegger,1980 J Immunol Methods 35:1;Mechetner,2007 Methods Mol Biol 378:1)に基づいて、わずかな改変を加えて生成された。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)及び蛍光標識細胞分取(FACS)アッセイで高い結合活性を有する抗体を、さらなる特性評価のために選択した。
免疫化及び結合アッセイのためのOX40組換えタンパク質
全長ヒトOX40(配列番号1)をコードするcDNAは、GenBank配列(アクセッション番号:X75962.1)に基づいてSino Biological(Beijing,China)によって合成された。OX-40のアミノ酸(AA)1-216(配列番号2)からなるシグナルペプチド及び細胞外ドメイン(ECD)のコード領域をPCR増幅し、C末端をマウスIgG2aのFcドメイン、ヒトIgG1野生型重鎖のFcドメイン、またはHisタグに融合して、自社開発の発現ベクターにクローニングした。これにより、それぞれOX40-mIgG2a、OX40-huIgG1、及びOX40-Hisの3つの組換え融合タンパク質発現プラスミドが得られた。OX40融合タンパク質の概略図を図1に示す。組換え融合タンパク質の産生のために、OX40-mIgG2a、OX40-huIgG1、及びOX40-Hisの発現プラスミドを293G細胞に一過性にトランスフェクトし、回転式シェーカーを備えたCOインキュベーターで7日間培養した。組換えタンパク質を含む上清を収集し、遠心分離によって清澄化した。OX40-mIgG2a及びOX40-huIgG1は、プロテインAカラム(カタログ:17-5438-02、GE Life Sciences)を用いて精製した。OX40-HisはNiセファロースカラム(カタログ:17-5318-02、GE Life Science)を用いて精製した。OX40-mIgG2a、OX40-huIgG、及びOX40-Hisタンパク質をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に対して透析し、-80℃の冷凍庫に少量のアリコートで保存した。
安定発現細胞株
全長のヒトOX40(OX40)またはカニクイザルOX40(cynoOX40)を発現する安定した細胞株を生成するために、これらの遺伝子をレトロウイルスベクターpFB-Neo(カタログ:217561、Agilent,USA)にクローニングした。レトロウイルス形質導入は、以前に記載されたプロトコールに基づいて実施された(Zhang et al.,2005)。HuT78及びHEK293細胞に、それぞれヒトOX40またはcynoOX40を含むウイルスをレトロウイルスで形質導入して、HuT78/OX40、HEK293/OX40、及びHuT78/cynoOX40細胞株を生成した。
免疫化、ハイブリドーマ融合、及びクローニング
8~12週齢のBalb/cマウス(HFK BIOSCIENCE CO.,LTD,Beijing,China)を、10μgのOX40-mIgG2aとQuick-Antibody Immuno-Adjuvant(カタログ:KX0210041,KangBiQuan,Beijing,China)とを含む200μLの混合抗原によって、腹腔内で免疫化した。手順は3週間で繰り返された。2回目の免疫化の2週間後、ELISA及びFACSによってマウス血清のOX40結合を評価した。血清スクリーニングの10日後、抗OX40抗体の血清力価が最も高いマウスを、10μgのOX40-mIgG2aのi.p.注入によって追加免疫した。追加免疫の3日後、脾細胞を単離し、標準的な技術(Somat Cell Genet,1977 3:231)を用いて、マウス骨髄腫細胞株SP2/0細胞(ATCC,Manassas VA)に融合させた。
ELISA及びFACSによる抗体のOX40結合活性の評価
ハイブリドーマクローンの上清は、(Methods in Molecular Biology(2007)378:33-52)に記載されているように、いくつかの改変を加えて、ELISAによって最初にスクリーニングされた。簡潔に述べると、OX40-Hisタンパク質を96ウェルプレートに4℃で一晩コーティングした。PBS/0.05%Tween-20で洗浄した後、プレートをPBS/3%BSAで室温で2時間ブロッキングした。続いて、プレートをPBS/0.05%Tween-20で洗浄し、細胞上清とともに室温で1時間インキュベートした。HRP結合抗マウスIgG抗体(カタログ:115035-008,Jackson ImmunoResearch Inc、ペルオキシダーゼAffiniPureヤギ抗マウスIgG、Fcγ断片特異的)及び基質(カタログ:00-4201-56,eBioscience,USA)を用いて、プレートリーダー(SpectraMax Paradigm,Molecular Devices/ PHERAstar,BMG LABTECH)を使用して測定される450nmの波長の色吸光度シグナルを発色させる。陽性の親クローンは、間接ELISAによる融合スクリーニングからピックアップされた。ELISA陽性クローンは、上述のHuT78/OX40及びHuT78/cynoOX40細胞を用いるFACSによってさらに検証された。OX40発現細胞(10細胞/ウェル)をELISA陽性ハイブリドーマ上清とともにインキュベートした後、抗マウスIgGeFluor(登録商標)660抗体(カタログ:50-4010-82,eBioscience,USA)と結合させた。細胞の蛍光は、フローサイトメーター(Guava easyCyte 8HT,Merck-Millipore,USA)を用いて定量化された。
ELISAとFACSスクリーニングの両方で陽性シグナルを示したハイブリドーマからの培養上清を機能アッセイに供して、ヒト免疫細胞ベースのアッセイで良好な機能的活性を有する抗体を同定した(以下のセクションを参照されたい)。所望の機能的活性を有する抗体をさらにサブクローン化し、特性評価した。
ハイブリドーマのサブクローニング及び無血清または低血清培地への適応
上述のELISA、FACS、及び機能アッセイによる一次スクリーニングの後、陽性ハイブリドーマクローンを限界希釈によってサブクローン化し、クローン性を確保した。最上の抗体サブクローンは、機能アッセイによって検証され、3%FBSを含むCDM4MAb培地(カタログ:SH30801.02,Hyclone,USA)での増殖に適応させた。
モノクローナル抗体の発現及び精製
最上の抗体クローンを発現するハイブリドーマ細胞をCDM4MAb培地(カタログ:SH30801.02,Hyclone)で培養し、COインキュベーター内で37℃で5~7日間インキュベートした。培養上清を遠心分離により収集し、精製前に0.22μmメンブレンを通過させることにより濾過した。上清中のマウス抗体を、製造元のガイドに従ってプロテインAカラム(カタログ:17-5438-02,GE Life Sciences)に適用して結合させた。この手順では通常、90%を超える純度の抗体が得られた。プロテインAアフィニティー精製した抗体をPBSに対して透析するか、または必要に応じてHiLoad 16/60 Superdex 200カラム(カタログ:28-9893-35,GE Life Sciences)を用いてさらに精製し、凝集体を除去した。タンパク質濃度は、280nmの吸光度を測定することによって決定された。最終的な抗体調製物は、-80℃の冷凍庫にアリコートで保存された。
実施例2:抗OX40抗体のクローニング及び配列分析
マウスハイブリドーマクローンを回収し、Ultrapure RNAキット(カタログ:74104,QIAGEN,Germany)を製造業者のプロトコールに基づいて用いて、全細胞RNAを調製した。InvitrogenのcDNA合成キット(カタログ:18080-051)を用いて第1鎖cDNAを合成し、PCRキット(カタログ:CW0686,CWBio,Beijing,China)を用いてハイブリドーマ抗体のVH及びVLのPCR増幅を行った。重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)の抗体cDNAクローニングに使用されるオリゴプライマーは、以前に報告された配列(Brocks et al.2001 Mol Med 7:461)に基づいてInvitrogen(Beijing,China)によって合成された。PCR産物は、配列決定に直接使用するか、pEASY-Bluntクローニングベクター(カタログ:CB101 TransGen,China)にサブクローニングし、Genewiz(Beijing,China)によって配列決定された。VH及びVL領域のアミノ酸配列は、DNA配列決定の結果から推定された。
マウス抗体の相補性決定領域(CDR)は、Kabat(Wu and Kabat 1970 J.Exp.Med.132:211-250)システムに基づいて、配列注釈及びコンピュータープログラム配列分析によって定義された。代表的な最上のクローンMu445(VH及びVL)のアミノ酸配列を表1に示した(配列番号9及び11)。Mu445のCDR配列を表2に示した(配列番号3~8)。
Figure 2023503399000002
Figure 2023503399000003
実施例3:マウス抗ヒトOX40抗体445のヒト化
抗体ヒト化及び操作
Mu445のヒト化のために、IMGTのヒト免疫グロブリン遺伝子データベースとの配列比較により、Mu445可変領域のcDNA配列と高度な相同性を共有する配列をヒト生殖細胞系列IgG遺伝子で検索した。ヒト抗体レパートリーに高頻度で存在し(Glanville et al.,2009 PNAS 106:20216-20221)、Mu445と相同性の高いヒトIGHV及びIGKV遺伝子を、ヒト化のテンプレートとして選択した。
ヒト化はCDRグラフト化(Methods in Molecular Biology,Antibody Engineering,Methods and Protocols,Vol 248:Humana Press)によって実施され、ヒト化抗体は、自社開発の発現ベクターを使用してヒトIgG1野生型フォーマットとして操作された。ヒト化の最初のラウンドでは、フレームワーク領域のマウスからヒトのアミノ酸残基への変異は、シミュレートされた3D構造解析によって導かれ、CDRの標準構造を維持するための構造的に重要なマウスフレームワーク残基は、ヒト化抗体445の第1バージョンにおいて保持された(445-1、表3を参照されたい)。445-1の6つのCDRは、HCDR1(配列番号3)、HCDR2(配列番号13)、HCDR3(配列番号5)、及びLCDR1(配列番号6)、LCDR2(配列番号7)、及びLCDR3(配列番号8)のアミノ酸配列を有する。445-1の重鎖可変領域は、配列番号15のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号14(VH)のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号17のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号16(VL)のアミノ酸配列を有する。具体的には、Mu445のLCDR(配列番号6~8)を、2つのマウスフレームワーク残基(I44及びY71)を保持したまま(配列番号16)、ヒト生殖細胞系列可変遺伝子IGVK1-39のフレームワークに移植した。HCDR1(配列番号3)、HCDR2(配列番号13)及びHCDR3(配列番号5)を、2つのマウスフレームワーク(L70及びS72)残基を保持したまま(配列番号14)、ヒト生殖細胞系列可変遺伝子IGHV1-69のフレームワークに移植した。445のヒト化バリアント(445-1)では、シミュレートされた3D構造によると、抗原結合に重要であると予測されたのはN末端の半分だけであったため、KabatのHCDR2のN末端の半分だけがグラフトされた。
445-1は、ヒト野生型IgG1(IgG1wt)とカッパ鎖の定常領域をそれぞれ含み、容易に適応させるサブクローニングサイトを有する自社開発の発現ベクターを用いて、ヒト化全長抗体として構築された。445-1抗体は、上述の2つの構築物を293G細胞に共トランスフェクションすることにより発現させ、プロテインAカラム(カタログ:17-5438-02,GE Life Sciences)を使用して精製した。精製した抗体をPBSで0.5~10mg/mLに濃縮し、アリコートで-80℃の冷凍庫に保存した。
445-1抗体を使用して、いくつかの単一アミノ酸の変更を行い、VH及びVLのフレームワーク領域に保持されたマウス残基を、VLのI44P及びY71F、VHのL70I及びS72Aなどの対応するヒト生殖細胞系列の残基に変換した。さらに、潜在的な異性化リスクを低減し、ヒト化レベルを高めるために、CDRにいくつかの単一アミノ酸の変更が行われた。例えば、T51A及びD50Eの改変がLCDR2で行われ、D56E、G57A、及びN61Aの改変がHCDR2で行われた。すべてのヒト化の変更は、特定の位置に変異を含むプライマーと部位特異的変異導入キット(カタログ:AP231-11,TransGen,Beijing,China)を用いて行われた。所望の変更は、配列決定によって検証された。
445-1抗体のアミノ酸変更をOX40への結合及び熱安定性について評価した。配列番号3のHCDR1、配列番号18のHCDR2、配列番号5のHCDR3、配列番号6のLCDR1、配列番号19のLCDR2、及び配列番号8のLCDR3を含む抗体445-2(表3を参照されたい)は、上述の特定の変更の組み合わせから構築された。2つの抗体を比較すると、結果は、445-2と445-1の両方の抗体が同等の結合親和性を示したことを示した(以下の表4と表5を参照されたい)。
445-2抗体から出発して、結合親和性/動態をさらに改善するために、VLのフレームワーク領域でいくつかの追加のアミノ酸変更、例えば、アミノ酸G41D及びK42Gの変更を行った。さらに、免疫原性のリスクを低下させ、熱安定性を高めるために、VHとVLの両方のCDRにいくつかの単一アミノ酸の変更、例えば、LCDR1におけるS24RとHCDR2におけるA61Nを行った。得られた変更は、445-2と比較して改善された結合活性または熱安定性のいずれかを示した。
ヒト化445抗体は、CDR及びフレームワーク領域に特定のアミノ酸変化を導入することによってさらに操作され、ヒトでの治療用途のための分子的及び生物物理学的特性を改善した。考慮事項としては、結合活性を維持しながら、有害な翻訳後修飾の除去、熱安定性(T)の改善、表面の疎水性、及び等電子点(pI)が含まれていた。
配列番号3のHCDR1、配列番号24のHCDR2、配列番号5のHCDR3、配列番号25のLCDR1、配列番号19のLCDR2、及び配列番号8のLCDR3を含むヒト化モノクローナル抗体445-3は、上述の成熟プロセスから構築され、詳細に特性評価された。抗体445-3はまた、ヒトIgG2の野生型重鎖のFcドメインを含むIgG2バージョン(445-3 IgG2)と、S228P及びR409K変異を持つヒトIgG4のFcドメインを含むIgG4バージョン(445-3 IgG4)とにされた。結果は、445-3と445-2が同等の結合親和性を示したことを示した(表4と表5を参照されたい)。
Figure 2023503399000004
Figure 2023503399000005
Figure 2023503399000006
実施例4:SPRによる抗OX40抗体の結合速度論及び親和性決定
抗OX40抗体は、BIAcore(商標)T-200(GE Life Sciences)を用いたSPRアッセイにより、結合速度論及び親和性について特徴評価された。簡潔に述べると、抗ヒトIgG抗体を活性化CM5バイオセンサーチップ(カタログ:BR100530,GE Life Sciences)に固定化した。ヒトIgGFc領域を持つ抗体をチップ表面に流し、抗ヒトIgG抗体で捕捉した。次に、Hisタグ(カタログ:10481-H08H,Sino Biological)を有する組換えOX40タンパク質の段階希釈液をチップ表面に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化を分析して、会合速度(ka)及び解離速度(kd)を、1対1のラングミュア結合モデル(BIA評価ソフトウェア、GE Life Sciences)を用いることにより計算した。平衡解離定数(K)は、比kd/kaとして計算された。抗OX40抗体のSPRで決定された結合プロファイルの結果を図2及び表4にまとめる。抗体445-3(9.47nM)の平均Kとの結合プロファイルは、抗体445-2(13.5nM)及び445-1(17.1nM)よりもわずかに優れており、ch445と同様であった。445-3のIgG4の結合プロファイルは445-3(IgG1 Fcを含む)と同様であり、IgG4とIgG1の間のFcの変化が445-3抗体の特異的結合を変化させなかったことを示している。
Figure 2023503399000007
実施例5: HuT78細胞で発現したOX40に対する抗OX40抗体の結合親和性の決定
生細胞の表面に発現したOX40に結合する抗OX40抗体の結合活性を評価するために、実施例1に記載されるように、HuT78細胞にヒトOX40をトランスフェクトして、OX40発現株を作製した。生きたHuT78/OX40細胞を96ウェルプレートに播種し、さまざまな抗OX40抗体の段階希釈液とともにインキュベートした。ヤギ抗ヒトIgG-FITC(カタログ:A0556,Beyotime)を二次抗体として使用し、細胞表面への抗体の結合を検出した。ヒトOX40への用量依存的結合のEC50値は、用量反応データをGraphPad Prismを用いた4パラメーターロジスティックモデルに適合させることによって決定された。図3及び表5に示すように、OX40抗体はOX40に対して高い親和性を示した。また、本開示のOX40抗体は、フローサイトメトリーによって測定された比較的高い最高レベルの蛍光強度を有し(表5の最後の列を参照されたい)、OX40からの抗体の解離がより遅いことを示し、これはより望ましい結合プロファイルである。
Figure 2023503399000008
実施例6:抗OX40抗体の交差反応性の決定
抗体445-3のヒト及びカニクイザルOX40に対する交差反応性を評価するために、ヒトOX40(HuT78/OX40)及びカニクイザルOX40(HuT78/cynoOX40)を発現する細胞を96ウェルプレートに播種し、OX40抗体の一連の希釈とともにインキュベートした。ヤギ抗ヒトIgG-FITC(カタログ:A0556,Beyotime)を検出のための二次抗体として使用した。ヒトOX40及びカニクイザルの天然OX40への用量依存的結合のEC50値は、用量反応データをGraphPad Prismを用いた4パラメーターロジスティックモデルに適合させることによって決定された。結果を図4及び以下の表6に示す。抗体445-3は、ヒトとカニクイザルの両方のOX40と交差反応し、以下に示すように同様のEC50値を示す。
Figure 2023503399000009
実施例7:445-3FabとのOX40の共結晶化及び構造決定
本開示の抗体へのOX40の結合メカニズムを理解するために、OX40と445-3のFabの共結晶構造を解析した。残基T148及びN160での変異は、OX40のグリコシル化を遮断し、タンパク質の均一性を改善するために導入された。変異型ヒトOX40(2つの変異部位T148A及びN160Aを含む残基M1-D170)をコードするDNAを、ヘキサHisタグを含む発現ベクターにクローニングし、この構築物を37℃で7日間のタンパク質発現のために293G細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞を回収し、上清を回収し、Hisタグアフィニティー樹脂とともに4℃で1時間インキュベートした。樹脂を、20mMのTris、pH8.0、300mMのNaCl、及び30mMのイミダゾールを含む緩衝液で3回リンスした。次いで、OX40タンパク質を20mMのTris、pH8.0、300mMのNaCl、及び250mMのイミダゾールを含む緩衝液で溶出し、続いて20mMのTris、pH8.0、100mMのNaClを含む緩衝液中でSuperdex200(GE Healthcare)を用いてさらに精製した。
445-3のFabの重鎖及び軽鎖のコード配列を、重鎖のC末端にヘキサHisタグを含む発現ベクターにクローン化し、これらを37℃で7日間のタンパク質発現のために一過性に293G細胞に共トランスフェクトした。445-3のFabの精製ステップは、上述の変異型OX40タンパク質に使用したものと同じであった。
精製したOX40と445-3のFabをモル比1:1で混合し、氷上で30分間インキュベートした後、20mMのTris、pH8.0、100mMのNaClを含む緩衝液中でSuperdex200(GE Healthcare)を用いてさらに精製した。複合ピークを収集し、約30mg/mlに濃縮した。
共結晶スクリーニングは、タンパク質複合体をリザーバー溶液と1:1の体積比で混合することによって実行された。共結晶は、0.1MのHEPES、pH7.0、1%のPEG 2,000 MME、及び0.95Mのコハク酸ナトリウムを含むリザーバー溶液を用いた蒸気拡散によって20℃で培養された懸滴から得られた。
ナイロンループを使用して共結晶を回収し、結晶を20%グリセロールを添加したリザーバー溶液に10秒間浸漬した。回折データは、上海シンクロトロン放射施設BL17U1で収集され、XDSプログラムで処理された。位相は、分子置換検索モデルとしてIgGのFabの構造(PDBのチェーンC及びD:5CZX)及びOX40の構造(PDBのチェーンR:2HEV)を用いてプログラムPHASERで解明された。Phenix.refineグラフィカルインターフェイスを使用して、剛体、TLS、及びX線データに対する制限精密化を実行し、続いてCOOTプログラムで調整し、Phenix.refineプログラムでさらに精密化した。X線データの収集及び精密化の統計を表7にまとめる。
Figure 2023503399000010
Rmerge=
Figure 2023503399000011
式中、
Figure 2023503399000012
は、等価の平均強度である。
work
Figure 2023503399000013
式中、FoとFcは、それぞれ観測及び計算された構造因子の振幅である。
free
Figure 2023503399000014
試験データセットを用いて計算され、観測された反射からランダムに選択された全データの5%。
実施例8:SPRによる抗体445-3のエピトープ同定
OX40及び抗体445-3Fabの共結晶構造に導かれて、本開示の抗OX40抗体の重要なエピトープをさらに同定するために、ヒトOX40タンパク質の一連の単一変異を選択して生成した。部位特異的変異導入キット(カタログ:AP231-11,TransGen)によって、ヒトOX40/IgG1融合構築物に単一点変異を行った。所望の変異は、配列決定によって検証された。OX40変異体の発現及び調製は、293G細胞へのトランスフェクションによって達成され、プロテインAカラム(カタログ:17-5438-02,GE Life Sciences)を用いて精製された。
OX40点突然変異体の445-3のFabへの結合親和性は、BIAcore 8K(GE Life Sciences)を用いたSPRアッセイによって特徴づけられた。簡潔に述べると、OX40変異体と野生型OX40は、EDC及びNHSを用いてCM5バイオセンサーチップ(カタログ:BR100530,GE Life Sciences)に固定化された。次いで、HBS-EP+緩衝液(カタログ:BR-1008-26,GE Life Sciences)中の445-3のFabの段階希釈液を、30μl/分で180秒の接触時間と600秒の解離時間を用いてチップ表面に流した。表面プラズモン共鳴シグナルの変化を分析し、1対1のラングミュア結合モデル(BIA Evaluation Software,GE Life Sciences)を用いて、会合速度(ka)及び解離速度(kd)を計算した。平衡解離定数(K)は、比kd/kaとして計算された。変異体のKシフト倍率は、変異体のK/WTのKの比率として計算された。SPRによって決定されたエピトープ同定のプロファイルを図5及び表8にまとめる。結果は、OX40における残基H153、I165、及びE167のアラニンへの変異がOX40への抗体445-3の結合を有意に減少させ、残基T154及びD170のアラニンへの変異がOX40への抗体445-3の結合を中程度に減少させたことを示した。
抗体445-3とOX40の残基H153、T154、I165、E167、及びD170の間の詳細な相互作用を図6に示す。OX40上のH153の側鎖は、相互作用界面上の445-3の小さなポケットに囲まれ、heavyS31及びheavyG102と水素結合を形成し、heavyY101とπ-πスタッキングを形成していた。E167の側鎖はheavyY50及びheavyN52と水素結合を形成し、D170はそれぞれheavyS31及びheavyK28と水素結合及び塩橋を形成し、複合体をさらに安定化させることができる。T154とheavyY105、I165、及びheavyR59の間のファンデルワールス(VDW)相互作用は、OX40に対する抗体445-3の高い親和性に寄与していた。
結論として、OX40の残基H153、I165、及びE167は、抗体445-3と相互作用する重要な残基として同定された。さらに、OX40のアミノ酸T154及びD170も、抗体445-3の重要な接触残基である。このデータは、抗体445-3のエピトープがOX40の残基H153、T154、I165、E167、及びD170であることを示した。これらのエピトープは、
Figure 2023503399000015
(配列番号30)の配列に存在し、重要な接触残基は太字で下線が付される。
Figure 2023503399000016
実施例9: 抗OX40抗体445-3はOX40-OX40L相互作用を遮断しない。
抗体445-3がOX40-OX40L相互作用を妨害するかどうかを決定するために、細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイが確立された。このアッセイでは、抗体445-3、参照抗体1A7.gr1、対照huIgG、または培地のみを、マウスIgG2aのFc(OX40-mIgG2a)とのヒトOX40融合タンパク質とともにプレインキュベートした。次いで、抗体と融合タンパク質の複合体をOX40Lを発現するHEK293細胞に加えた。OX40抗体がOX40-OX40L相互作用を妨害しない場合、OX40抗体-OX40 mIgG2a複合体は依然として表面OX40Lに結合し、この相互作用は抗マウスFc二次抗体を使用して検出できる。
図7に示すように、抗体445-3は、高濃度であってもOX40のOX40Lへの結合を減少させず、445-3がOX40-OX40Lの相互作用を妨害しないことを示す。これは、445-3がOX40L結合部位に結合しないか、またはOX40L結合を立体的に妨げるほど近くに結合しないことを示す。対照的に、陽性対照抗体である1A7.gr1は、図7に示すように、OX40LへのOX40の結合を完全に遮断する。
さらに、図8に示すように、445-3のFabとの複合体におけるOX40の共結晶構造が解明され、OX40/OX40L複合体(PDBコード:2HEV)と整列した。OX40リガンド三量体は主にOX40のCRD1(システインリッチドメイン)、CRD2、及び部分的なCRD3領域を介してOX40と相互作用する(Compaan and Hymowitz,2006)が、抗体445-3はCRD4領域を介してのみOX40と相互作用する。要約すると、445-3抗体とOX40L三量体は、OX40のそれぞれの異なる領域に結合し、抗体445-3はOX40/OX40Lの相互作用を妨害しない。この結果は、上述の実施例に記載したエピトープマッピングデータと相関している。OX40のCRD4はアミノ酸127~167にあり、抗体445-3のエピトープはこの領域と部分的に重複している。OX40のCRD4(アミノ酸127~167)の配列を以下に示し、445-3エピトープの部分的な重複を太字で下線を付す:
Figure 2023503399000017
(配列番号31)。
実施例10: 抗OX40抗体445-3のアゴニスト活性
抗体445-3のアゴニスト機能を調べるために、OX40陽性T細胞株であるHuT78/OX40を、445-3または1A7.gr1の存在下または非存在下で、人工抗原提示細胞(APC)株(HEK293/OS8low-FcγRI)とともに一晩共培養し、IL-2産生をT細胞刺激の読み出し情報として使用した。HEK293/OS8Low-FcγRI細胞では、膜結合抗CD3抗体OKT3(OS8)(米国特許第8,735,553号に開示される)とヒトFcγRI(CD64)をコードする遺伝子がHEK293細胞に安定して共形質導入された。抗OX40抗体に誘導される免疫活性化は抗体の架橋に依存するため(Voo et al.,2013)、HEK293/OS8Low-FcγRI上のFcγRIは、OX40とFcγRIの両方に対する抗OX40抗体の二重会合での抗OX40抗体を介したOX40の架橋の基盤を提供する。図9に示すように、抗OX40抗体445-3は、0.06ng/mlのEC50で、用量依存的にTCRシグナル伝達を増強するのに非常に強力であった。参照Ab1A7.gr1のわずかに弱い活性も観察された。対照的に、対照のヒトIgG(10μg/mL)またはブランクは、IL-2産生に影響を与えなかった。
実施例11:抗OX40抗体445-3は混合リンパ球反応(MLR)アッセイで免疫応答を促進した
抗体445-3がT細胞の活性化を刺激できるかどうかを判定するために、混合リンパ球反応(MLR)アッセイを以前に記載されたように設定した(Tourkova et al.,2001)。簡潔に述べると、成熟DCは、GM-CSF及びIL-4との培養、続いてLPS刺激により、ヒトPBMC由来のCD14骨髄細胞から誘導された。次に、マイトマイシンCで処理したDCを、抗OX40 445-3抗体(0.1~10μg/ml)の存在下で同種異系CD4T細胞と2日間共培養した。共培養におけるIL-2産生は、MLR応答の読み出し情報としてELISAによって検出された。
図10に示すように、抗体445-3はIL-2産生を有意に促進し、CD4T細胞を活性化する445-3の能力を示す。対照的に、参照抗体1A7.gr1は、MLRアッセイで有意に(P<0.05)より弱い活性を示した。
実施例12: 抗OX40抗体445-3はADCC活性を示した
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出ベースのADCCアッセイは、抗体445-3がOX40Hi発現標的細胞を殺傷することができるかどうかを調査するために設定された。NK92MI/CD16V細胞株は、CD16v158(V158対立遺伝子)及びFcRγ遺伝子をNK細胞株、NK92MI(ATCC,Manassas VA)に共形質導入することによってエフェクター細胞として生成された。OX40を発現するT細胞株HuT78/OX40を標的細胞として用いた。同数(3x10)の標的細胞とエフェクター細胞を、抗OX40抗体(0.004~3μg/ml)または対照抗体の存在下で5時間共培養した。細胞毒性は、CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assayキット(Promega,Madison,WI)を使用したLDH放出によって評価された。特異的溶解は、以下に示す式によって計算された。
Figure 2023503399000018
図11に示すように、抗体445-3は、ADCCを介して用量依存的にOX40Hi標的を殺傷するのに高い効力を示した(EC50:0.027μg/mL)。抗体445-3のADCC効果は、1A7.grl対照抗体の効果と同様であった。対照的に、S228P及びR409K変異を伴うIgG4のFcフォーマットの445-3(445-3-IgG4)は、対照のヒトIgGまたはブランクと比較して、有意なADCC効果を示さなかった。結果は、IgG4のFcがADCCに対して弱いかサイレントであるという以前の発見と一致している(An Z,et al.mAbs 2009)。
実施例13:抗OX40抗体445-3は、CD4Tregsを優先的に枯渇させ、インビトロでCD8Teff/Treg比を増加させる
いくつかの動物腫瘍モデルでは、抗OX40抗体が腫瘍浸潤性OX40HiTregsを枯渇させ、CD8T細胞とTregの比率を増加することができることを示している(Bulliard et al.,2014;Carboni et al.,2003;Jacquemin et al.,2015;Marabelle et al.,2013b)。その結果、免疫応答が増強され、腫瘍の退縮と生存率の向上をもたらした。
インビトロで活性化されたか、または腫瘍内のCD4Foxp3Tregsが他のT細胞サブセットよりもOX40を優先的に発現するという事実(Lai et al.,2016;Marabelle et al.,2013b;Montler et al.,2016;Soroosh et al.,2007;Timperi et al.,2016)を考慮して、OX40Hi細胞、特にTregを殺傷する抗体445-3の能力を調査するためにヒトPBMCベースのアッセイを設定した。簡潔に述べると、PBMCはOX40発現を誘導するためにPHA-L(1μg/mL)によって1日間事前に活性化され、標的細胞として用いられた。次いで、エフェクターNK92MI/CD16V細胞(実施例12に記載、5×10)を、抗OX40抗体(0.001~10μg/mL)またはプラセボの存在下で同数の標的細胞と一晩共培養した。それぞれのT細胞サブセットのパーセンテージは、フローサイトメトリーによって決定された。図12A及び12Bに示すように、抗体445-3で処理すると、用量依存的に、CD8T細胞のパーセンテージが増加し、CD4Foxp3Tregのパーセンテージが減少した。結果として、CD8T細胞とTregの比率が大幅に改善された(図12C)。1A7.gr1処理では、より弱い結果が得られた。この結果は、CD8T細胞機能を増強するが、Tregを介した免疫寛容を制限することにより、抗腫瘍免疫を誘導する445-3の治療への応用を示す。
実施例14:抗OX40抗体445-3は、マウス腫瘍モデルにおいて用量依存的な抗腫瘍活性を発揮する
抗OX40抗体445-3の有効性は、マウス腫瘍モデルで示された。マウスMC38結腸腫瘍細胞を、ヒトOX40のトランスジェニックC57マウス(Biocytogen,Beijing China)に皮下移植した。腫瘍細胞の移植後、腫瘍体積を週に2回測定し、次の式を使用してmmで計算した:V=0.5(a×b)、式中、a及びbはそれぞれ、腫瘍の長径及び短径であった。腫瘍の平均体積が約190mmのサイズに達したとき、マウスを無作為に7つの群に割り当て、445-3または1A7.gr1抗体のいずれかを週に1回、3週間腹腔内注射した。アイソタイプ対照としてヒトIgGを投与した。部分回帰(PR)は、3回の連続測定で投与初日の開始腫瘍体積の50%未満である腫瘍体積と定義された。腫瘍成長阻害(TGI)は、次の式を使用して計算された:
Figure 2023503399000019
結果は、445-3が0.4mg/kg、2mg/kg、及び10mg/kgの用量で腹腔内注射として用量依存的な抗腫瘍効果を有することを示した。445-3の投与は、53%(0.4mg/kg)、69%(2mg/kg)、及び94%(10mg/kg)の腫瘍増殖阻害をもたらし、ベースラインからの0%(0.4mg/kg)、17%(2mg/kg)、及び33%(10mg/kg)の部分的な退行をもたらした。対照的に、抗体1A7.gr1による部分回帰は観察されなかった。インビボデータは、リガンド非遮断抗体445-3がOX40-OX40L遮断抗体1A7.gr1よりも抗腫瘍治療に適していることを示している(図13A及び13B、表9)。
Figure 2023503399000020
実施例15:抗OX40抗体のアミノ酸改変
OX40抗体の改善のための変更のためにいくつかのアミノ酸が選択された。親和性を改善するため、またはヒト化を高めるために、アミノ酸の変更が行われた。PCRプライマーセットは、適切なアミノ酸変更のために設計され、合成され、抗OX40抗体を改変するために使用された。例えば、重鎖におけるK28T及び軽鎖におけるS24Rの改変は、元の445-2抗体と比べて、FACSによって決定されるEC50の1.7倍の増加をもたらした。重鎖におけるY27G及び軽鎖におけるS24Rの改変は、元の445-2抗体と比べて、Biacoreによって決定されるKの1.7倍の増加をもたらした。これらの変更は、図14A~14Bに要約される。
実施例16:MMTV-PyMT同系マウスモデルにおける抗TIM3抗体と組み合わせたOX40抗体
MMTV-PyMTは、乳癌転移のマウスモデルであり、MMTV-LTRを使用して、乳腺でポリオーマウイルスの中間T抗原を過剰発現させている。マウスは転移性の高い腫瘍を発症し、このモデルは一般的に乳癌の進行を研究するために使用される。
メスのFVB/Nマウスに、MMTV-PyMTトランスジェニックマウスの自然発生腫瘍から生成された1×10個のMMTV-PyMT腫瘍細胞を乳房内に移植した。8日間の接種後、動物を無作為に4つの群に分け、それぞれの群に15匹の動物を入れた。次いで、マウスを陽性対照としてビヒクル(PBS)で処理した。
OX86は、WO2016/057667で以前に開示されたラット抗マウスOX40抗体であり、マウス研究で免疫原性を低下させ、Fcを介した機能を維持するために、マウスIgG2a定常領域でさらに操作された。OX86のVH及びVL領域を以下に示す。科学文献で以前に報告されたように、OX86は、OX40とOX40リガンド間の相互作用を遮断しないという点で、抗体445-3と同様の作用機序を有している(al-Shamkhani Al,et al.,Euro J.Immunol(1996)26(8);1695-9,Zhang,P.et al.Cell Reports 27,3117-3123)。
Figure 2023503399000021
マウス特異的抗TIM3抗体(RMT3-23)はBioxcell(New Hampshireカタログ番号BP0115)から購入し、腹腔内注射により週に1回3mg/kgで投与した。RMT3-23と組み合わせたOX86は、単剤療法について上述に開示されたのと同じ用量で併用療法として投与された。腫瘍体積と体重は、ノギスを使用して2次元で週に2回決定され、次の式を使用してmmで表される:V=0.5(a×b)、式中、a及びbはそれぞれ、腫瘍の長径及び短径である。データは、平均腫瘍体積±平均の標準誤差(SEM)として示される。腫瘍成長阻害(TGI)は、次の式を使用して計算される:
Figure 2023503399000022
RMT3-23と組み合わせたOX86の処理に対するMMTV-PyMT同系モデルの応答を図15及び表10に示す。21日目に、それぞれ単剤として投与されたOX86及びRTM3-23は、それぞれ31%及び-5%のTGIで腫瘍増殖を阻害した。対照的に、RTM3-23と組み合わせたOX86は、63%のTGIで抗腫瘍活性を有意に改善し、単剤として投与した場合のOX86よりも32%増加し、PBS対照と同様に作用するRTM3-23のTGIが明らかに増加した(p<0.001、併用対ビヒクル;p<0.01、併用対OX86単剤療法;及びp<0.001、併用対RMT3-23単剤療法)。
このデータは、抗TIM3抗体と組み合わせたOX40抗体が、単独で投与されたいずれかの薬剤よりも効果的であることを示した。併用療法は、研究全体を通して、どの処理群においても動物の体重に有意な影響を及ぼさなかった。
Figure 2023503399000023
実施例17:マウス腎臓癌モデルにおける抗TIM3抗体と組み合わせたOX40抗体
メスのBALB/cマウスに、100μLのPBS中の2×10個の腎臓癌(Renca)細胞を右脇腹に皮下移植した。8日間の接種後、動物を無作為に4つの群に分け、接種順序に従って、それぞれの群に15匹の動物を入れた。8日間の接種後、動物を無作為に4つの群に分け、それぞれの群に15匹の動物を入れた。次いで、マウスを対照としてビヒクル(PBS)で処理した。単剤療法として、マウス特異的抗OX40抗体(OX86)を腹腔内注射により週1回(QW)0.4mg/kg投与した。マウス特異的抗TIM3抗体(RMT3-23、上述)を腹腔内注射により3mg/kg、QWで投与した。併用療法として、RMT3-23と組み合わせたOX86抗体を、個々の抗体ごとに上述と同じ用量及び経路で投与した。マウスの腫瘍体積及び体重を週に2回調べた。
RMT3-23処理と組み合わせたOX86に対するRenca同系マウスモデルの応答を図16及び表11に示す。17日目に、OX86とRTM3-23の単剤療法はそれぞれ、それぞれ61%と2%のTGIで腫瘍増殖を阻害した。単剤としてのRTM3-23処理は、PBS対照と非常に類似していた。対照的に、RTM3-23と組み合わせたOX86による処理は、80%のTGIで有意に改善された抗腫瘍活性を示した(p<0.001、併用対ビヒクル)。このデータは、抗TIM3抗体と組み合わせたOX40抗体がこのマウス腎臓癌モデルにおいて有効であることを示した。研究全体を通して、どの処理群においても動物の体重への有意な影響は観察されなかった。
Figure 2023503399000024
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Claims (22)

  1. がん治療の方法であって、前記方法は、有効量の非競合的抗OX40抗体またはその抗原結合断片を、抗TIM3抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて対象に投与することを含む、前記方法。
  2. 前記OX40抗体がヒトOX40に特異的に結合し:
    (i)(a)配列番号3のHCDR(重鎖相補性決定領域)1、(b)配列番号24のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号25のLCDR(軽鎖相補性決定領域)1、(e)配列番号19のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域か、
    (ii)(a)配列番号3のHCDR1、(b)配列番号18のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号6のLCDR1、(e)配列番号19のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域か、
    (iii)(a)配列番号3のHCDR1、(b)配列番号13のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号6のLCDR1、(e)配列番号7のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域か、または
    (iv)(a)配列番号3のHCDR1、(b)配列番号4のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号6のLCDR1、(e)配列番号7のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域を含み、
    抗TIM3抗体またはその抗原結合断片と組み合わされる、
    請求項1に記載の方法。
  3. 前記OX40抗体または抗原結合が:
    (i)配列番号26を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号28を含む軽鎖可変領域(VL)か、
    (ii)配列番号20を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号22を含む軽鎖可変領域(VL)か、
    (iii)配列番号14を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号16を含む軽鎖可変領域(VL)か、または
    (iv)配列番号9を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号11を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、
    請求項1に記載の方法。
  4. 前記抗TIM3抗体またはその抗原結合断片が、ヒトTIM3に特異的に結合し、配列番号32のHCDR1、配列番号33のHCDR2、及び配列番号34のHCDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号35のLCDR1、配列番号36のLCDR2、及び配列番号37のLCDR3を含む軽鎖可変領域と、を含む抗体の抗原結合ドメインを含む、請求項1に記載の方法。
  5. 前記抗TIM3抗体が、ヒトTIM3に特異的に結合し、配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)と、を含む抗体の抗原結合ドメインを含む、請求項1に記載の方法。
  6. 前記抗OX40抗体または抗原結合断片が、Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、及び(Fab’)2断片からなる群から選択される抗体断片である、請求項1に記載の方法。
  7. 前記抗TIM3抗体または抗原結合断片が、Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、及び(Fab’)2断片からなる群から選択される抗体断片である、請求項1に記載の方法。
  8. 前記がんが、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、または肉腫である、請求項1に記載の方法。
  9. 前記乳癌が転移性乳癌である、請求項8に記載の方法。
  10. 前記治療が、前記治療の中止後に前記対象において持続的抗がん応答をもたらす、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
  11. 免疫応答または機能を増加、増強、または刺激する方法であって、前記方法は、有効量の非競合的抗OX40抗体またはその抗原結合断片を、抗TIM3抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて対象に投与することを含む、前記方法。
  12. 前記OX40抗体がヒトOX40に特異的に結合し:
    (i)(a)配列番号3のHCDR(重鎖相補性決定領域)1、(b)配列番号24のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号25のLCDR(軽鎖相補性決定領域)1、(e)配列番号19のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域か、
    (ii)(a)配列番号3のHCDR1、(b)配列番号18のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号6のLCDR1、(e)配列番号19のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域か、
    (iii)(a)配列番号3のHCDR1、(b)配列番号13のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号6のLCDR1、(e)配列番号7のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域か、または
    (iv)(a)配列番号3のHCDR1、(b)配列番号4のHCDR2、及び(c)配列番号5のHCDR3を含む重鎖可変領域、ならびに(d)配列番号6のLCDR1、(e)配列番号7のLCDR2、及び(f)配列番号8のLCDR3を含む軽鎖可変領域を含み、
    抗TIM3抗体と組み合わされる、
    請求項11に記載の方法。
  13. 前記OX40抗体またはその抗原結合断片が:
    (i)配列番号26を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号28を含む軽鎖可変領域(VL)か、
    (ii)配列番号20を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号22を含む軽鎖可変領域(VL)か、
    (iii)配列番号14を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号16を含む軽鎖可変領域(VL)か、または
    (iv)配列番号9を含む重鎖可変領域(VH)、及び配列番号11を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、
    請求項11に記載の方法。
  14. 前記抗TIM3抗体またはその抗原結合断片が、ヒトTIM3に特異的に結合し、配列番号32のHCDR1、配列番号33のHCDR2、及び配列番号34のHCDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号35のLCDR1、配列番号36のLCDR2、及び配列番号37のLCDR3を含む軽鎖可変領域と、を含む抗体の抗原結合ドメインを含む、請求項11に記載の方法。
  15. 前記抗TIM3抗体が、ヒトTIM3に特異的に結合し、配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)と、を含む抗体の抗原結合ドメインを含む、請求項11に記載の方法。
  16. 前記抗OX40抗体または抗原結合断片が、Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、及び(Fab’)2断片からなる群から選択される抗体断片である、請求項11に記載の方法。
  17. 前記抗TIM3抗体または抗原結合断片が、Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、及び(Fab’)2断片からなる群から選択される抗体断片である、請求項11に記載の方法。
  18. 免疫応答を刺激することが、T細胞、NK細胞、及びマクロファージに関連している、請求項11に記載の方法。
  19. 前記免疫応答を刺激することが、抗原刺激に対する応答性の増加を特徴とする、請求項18に記載の方法。
  20. 前記T細胞が、サイトカイン分泌、増殖、または細胞溶解活性を増加させる、請求項18に記載の方法。
  21. 前記T細胞が、CD4+及びCD8+のT細胞である、請求項18~20のいずれか1項に記載の方法。
  22. 前記投与が、前記治療の中止後に前記対象において持続的免疫応答をもたらす、請求項11~21のいずれか1項に記載の方法。
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