CN1080304C

CN1080304C - 生产乙肝病毒的经修饰的l蛋白的方法

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Publication number: CN1080304C
Application number: CN90107172A
Authority: CN
Inventors: 马丁·康伯巴哈; 奈杰尔·哈福德; 特里萨·卡贝肖; 阿波隆尼亚·拉特格斯; 皮埃尔·沃埃特; 艾力克·雅各布斯; 科尼利斯·P·霍林堡; 兹比纽·A·亚诺维兹; 阿明·J·默凯尔巴哈
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1989-07-25
Filing date: 1990-07-25
Publication date: 2002-03-06
Anticipated expiration: 2005-07-25
Also published as: IE902690A1; HUT57266A; AU1896897A; JPH0380083A; AU7752894A; HU904615D0; CA2021762C; ATE159031T1; PT94791B; AU5972890A; PL286209A1; AU714652B2; EP0414374B1; MA21911A1; CN1052331A; NO903285L; KR910003103A; GR3025819T3; NO304268B1; EP0414374A3

Abstract

一种至少包含两种多肽的复合颗粒，这些肽相应于完整或部分的具有一种乙肝表面抗原生物活性的蛋白质，其中，该颗粒至少有两个由S蛋白、前S2蛋白或前S1蛋白提供的抗原决定基，所述颗粒还可或有或无地包括宿主特异性脂类。本发明还提供了修饰的乙肝表面抗原L蛋白，它可以单独使用或掺入这种复合颗粒中。

在表达上述免疫原(尤其是在酵母如啤酒酵母和多形汉逊酵母中)后，则可制备出改进的乙肝疫苗。

Description

生产乙肝病毒的经修饰的L蛋白的方法

本发明涉及由甲基营养酵母属中选出的一种微生物；一个含有表达盒的DNA分子；一种适于转化甲基营养酵母的载体；一种制备微生物的方法；一种含有至少两种多肽的复合颗粒，这些多肽相应于完整的或部分的具有乙型肝炎表面抗原生物活性的蛋白质；一种制备此复合颗粒的方法；并涉及含有此复合颗粒的组合物、疫苗和检测药盒。

本发明还涉及一些微生物菌株的构建，这些菌株能合成修饰的乙肝病毒大表面蛋白，尤其是乙肝L表面抗原，其修饰作用发生在编码顺序的不同区域，从而改变和提高了其生物学活性。

肝炎是一种流行很广的严重传染性疾病，它可由多种病因导致。已发现一种重要的病因是乙肝病毒(HBV)，这是一种直径约为43nm的小病毒粒子，它含有一个特殊的基因组，由3,200碱基对的双链DNA环构成，其中有一个大约200碱基对的单链缺口。此病毒粒子的感染导致急性(有时是致命的)疾病。85％的患者在患病大约3个月后恢复，大约1％患肝组织急性坏死，从而在短期内导致死亡，大约10％的患者会再度发病。大约4％的患者变为慢性携带者，他们的初级肝细胞癌变或肝硬化的危险性增加。

感染途径主要为感染性病毒粒子的围产期(Perinatal)或肠胃外传播，例如在输血的过程中，或由于使用污染了的注射器或针头，或由于性接触而传播。因此，急需可靠的诊断手段以检测HBV，还急需一种疫苗以保护高危区的人群，例如慢性携带者的配偶、HBV严重流行区的旅行者、慢性携带者的新生儿，同性恋者、妓女和滥用药物者，而且这种疫苗应当是廉价的。在第三世界国家还需要有廉价的疫苗用于大规模的免疫计划。

除了由核心(HBcAg)和衣壳或表面(HBsAg)抗原蛋白(它包裹着部分双链的环状DNA基因组)构成的病毒颗粒以外，患者的血液中可能还含有大量含有表面抗原蛋白和宿主脂类的HBsAg颗粒。已经从人血清中纯化出这些颗粒并制成疫苗，已证明此疫苗具有针对HBV感染的预防作用(Szmuness等，1980)。

在本申请中引用了一些出版物作为参考文献，引用方式是在括号中列出第一作者和出版年份。在本说明书的最后按字母顺序列出了这些参考文献的完整出处。这些出版物的公开内容作为参考被完整地并入本申请中，以期更为详尽地描述现有技术。

由来自血清的HBsAg制备疫苗的缺陷在于，感染血液的来源有限，并需要进行长时间的严格检测，以确保去除和/或钝化潜在的感染性因子。

乙肝病毒(HBV)在人体中感染时，在血清中会伴随产生携有乙肝表面抗原(HBsAg)的各种结构(Tiollais等，Nature17：489，1985)。除了感染性病毒粒子外，还存在有丝状和直径为22nm的球状颗粒(含有大约100种被膜蛋白质)，它们通过宿主产生的脂类与3种肝炎表面蛋白相结合而形成，这三种蛋白是：主要蛋白(S)、中等蛋白(M)和大蛋白(L)。

这些蛋白质在HBV基因组上有226个氨基酸密码子的顺序相同，此顺序称为S蛋白编码顺序。紧靠在HBV基因组的S蛋白编码顺序之前的全部氨基酸编码顺序在本文中称为前S编码顺序。在前S编码顺序中，在紧靠S蛋白之前编码一个55个氨基酸的顺序，称为前S₂区；在紧靠前S₂区之前，根据不同的病毒亚型而编码一个108或119个氨基酸的顺序，称为前S₁区。

因此，在ay亚型中，整个前S编码顺序编码163个(55个前S₂＋108个前S₁)氨基酸，而在大多数ad亚型中则编码174个(55个前S2＋119个前S₁)氨基酸。比较ad和ay分离物基因组的前S编码顺序表明，在ay亚型中缺乏ad分离物的前S₁区的头11个密码子。为了与一般采用的命名法相一致，在本申请中根据ad亚型对密码子和氨基酸进行编号，即ad分离物的HBV基因组编码的前S区中的174个氨基酸编号为1至174，而ay亚型的163氨基酸的前S区编号为12至174。

主要蛋白(S)由226氨基酸密码子的S基因编码，并以糖基化和非糖基化的形式存在。

中等蛋白(M)包括前S₂区和S蛋白(M蛋白：55＋226个氨基酸)。M蛋白是一种糖蛋白，根据糖基化程度而以两种形式存在(Stibbe等，J.Virol.46：626-628，1983)。由前S2区编码的55个氨基酸是亲水的，并含有位于被膜基因表面的一个免疫显性抗原决定簇(残基132-137)。此抗原决定簇不依赖于二硫键，并且据报道比S蛋白的抗原决定簇具有更强的免疫原性(Neurath等，Science 224：392-394，1984；Neurath等，Nature315：154-156，1985)。前S₂顺序还含有聚合的人血清清蛋白(pHSA)的受体(Machida等，Gastroent.86：910-918，1984)。此受体还能与单体的HSA结合，并可能介导HBV与肝细胞的附着，肝细胞上也具有pHSA受体。有人认为，这种结合作用可在人体内导致耐性或自身免疫反应。

大蛋白(L)包括前S₁区、前S₂区和S编码顺序(L蛋白：108(或119)＋55＋226个氨基酸)。它以糖基化和非糖基化的形式存在。L蛋白的长度根据其亚型而不同，例如，ay和ad亚型的长度分别为389和400个氨基酸。前S₁转译产物也与HBV和肝细胞的附着有关。

由于S和M特异性转录本的启动子被包埋在L蛋白的开放读码中，因此，用编码L蛋白完整开放读码的DNA转化哺乳动物细胞会导致所有3种表面蛋白的合成。在哺乳动物细胞中分泌出HBsAg颗粒(Tiollais等，同上)。在哺乳动物系统中，L蛋白的表达使HBsAg颗粒的分泌受抑制(参见例如Ou等，J.Virol.61：782，1987)。有人认为，此现象与L蛋白上含有N-肉豆蔻酰基有关，它干扰了合成或分泌过程(Persing等，Science 234：1388-1391，1986；Persing等，J.Virol.61：1672-1677，1987)。

为便于参考，下面的表A给出了本文所述的HBV蛋白的前S₁、前S₂和S区的DNA编码顺序和氨基酸顺序。氨基酸编号在密码子上面的括号中，从HBV adw分离物顺序(它被亚克隆在质粒pRIT10616中)中的被膜蛋白开放读码中的第一个ATG密码子开始编号。由于本申请所述的任一个表达盒中都没有这个ad顺序中的头11个密码子，因此表A中未给出这些顺序。

质粒pRIT 10616携带于大肠杆菌K12600株中，它保藏于美国典型培养物收集中心(ATCC，Rockville，Maryland，USA)，保藏号为ATCC 39131。

表A

前S₁区NcoI(12)ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG GGA TTC TTTMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe(26)CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GCA TTC GGA GCC AAC TCA AACPro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn(40)AAT CCA GAT TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG CCAAsn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro(54)GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA TTC GGG CCA GGG CTCAla Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu(68)ACC CCT CCA CAC GGC GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCTThr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala(82)CAG GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT CCT CCT GCCGln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala(96)TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCTSer Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser(110) (119)CCA CCT CTA AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCPro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala

前S₂区(120)ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA GCT CTG CAG GATMet Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln Asp(134)CCC AGA GTC AGG GGT CTG TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGTPro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser(148)TCA GGA ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT CAC ATASer Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile(162) (174)TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG GAC CCT GTG ACG AACSer Ser Ser Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn(175)ATG GAG AAC ATC ACA TCA GGA TTC CTA GGA CCC CTG CTC GTGMet Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu ValTTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGA ATC CTC ACA ATALeu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr IleCCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTC AAT TTT CTAPro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe LeuGGG GGA TCA CCC GTG TGT CTT GGC CAA AAT TCG CAG TCC CCAGly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser ProACC TCC AAT CAC TCA CCA ACC TCC TGT CCT CCA ATT TGT CCTThr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys ProGGT TAT CGC TGG ATG TGT CTG CGG CGT TTT ATC ATA TTC CTCGly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe LeuTTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TTC TTA TTG GTT CTT CTGPhe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu LeuGAT TAT CAA GGT ATG TTG CCC GTT TGT CCT CTA ATT CCA GGAAsp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro GlyTCA ACA ACA ACC AAT ACG GGA CCA TGC AAA ACC TGC ACG ACTSer Thr Thr Thr Asn Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr ThrCCT GCT CAA GGC AAC TCT ATG TTT CCC TCA TGT TGC TGT ACAPro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys ThrAAA CCT ACG GAT GGA AAT TGC ACC TGT ATT CCC ATC CCA TCGLys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro SerTCC TGG GCT TTC GCA AAA TAC CTA TGG GAG TGG GCC TCA GTCSer Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser ValCGT TTC TCT TGG CTC AGT TTA CTA GTG CCA TTT GTT CAG TGGArg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln TrpTTC GTA GGG CTT TCC CCC ACT GTT TGG CTT TCA GCT ATA TGGPhe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile TrpATG ATG TGG TAT TGG GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATC GTG AGTMet Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val SerCCC TTT ATA CCG CTG TTA CCA ATT TTC TTT TGT CTC TGG GTAPro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

(400)TAC ATT TAATyr Ile 终止

位于转译起始密码子5′端的病毒转录起始信号控制活体中前S₁、前S₂和S蛋白的表达。这些蛋白质在哺乳动物细胞中转译后可能被糖基化，产生下表给出的一组表面抗原。蛋白质长度命名 S蛋白顺序 S₂特异性结构

(氨基酸个数) 的糖基化域的糖基化P24 226 S蛋白 - -GP27 226 S蛋白 + -GP33 281 前S₂蛋白 - +GP36 281 前S₂蛋白 + +P39^* 389 前S₁蛋白 - -GP42^* 389 前S₁蛋白 + -

^*：ayw亚型；由adw亚型产生的前S₁蛋白大约大1.0-1.5kDa，相当于N末端的额外11个氨基酸(Heermann等，1984)。

自从人们知道了表面抗原编码区的DNA顺序后，已经作出了许多努力以借助DNA重组技术产生S蛋白。Burrell等(1979)和Murray等(1980)及其他许多研究人员都报道在大肠杆菌中表达了HBsAg。Valenzuela等(1982)报道了HBsAg在酶母中的表达。将用载体转化的酵母细胞破碎后(该载体含有在酵母乙醇脱氢酶I启动子控制下的S蛋白编码顺序)，能够观察到含有HBsAg的球形颗粒，它与感染HBV者的血清中的相似。欧洲专利申请0226846(Tschopp等)公开了在毕赤酵母(Pichia)中生产HBV S蛋白。蛋白合成被置于可对甲醇响应的调控区的控制之下。

然而，尽管仅仅含有S抗原颗粒的疫苗一般具有高度的预防作用(Szmuness等，1980)，但有些宿主对这类药剂的反应很差。为了克服接种中的这种难以预见的失败，已经发展出了表达前S₂蛋白和前S₁蛋白的系统。已知前S₂甚至比S蛋白具有更强的免疫原性。例如，用携有前S₂和S特异性抗原决定簇的亚病毒颗粒对小鼠免疫，针对前S₂的抗体应答超过抗S应答(Milich等，1985)。而且还观察到，用含有前S₂的颗粒免疫也可能诱导出抗S应答。最近，有人综述了前S₁和前S₂蛋白在免疫中的作用及HBV表面抗原蛋白的T细胞和B细胞识别专一性(Milich，1988，其中有参考文献)。Valenzuela等(1985)公开了整个前S₂蛋白编码顺序在酵母中的表达，该酵母用含有相应病毒顺序的质粒进行了转化。必须注意，在酵母的转录中，必须由各编码区之前的酵母启动子指导转录的启动，因为酵母的转录系统并不识别HBV-ORF中的病毒转录起始信号。

Itoh等(1986)和其他人也公开了前S₂蛋白在酵母中表达并装配成颗粒。Dehoux等(1986)公开了39KD前S₁蛋白在酵母中的表达，并指出它被装配成颗粒形式。Imamura等(1987)的报道公开了前S₂蛋白和前S₁蛋白二者在啤酒酵母(S.cerevis-iae)中的表达。这些作者指出，发现大蛋白是一种相对稳定的、分子量为42KD的非糖基化产物，它不易装配成颗粒。

在啤酒酵母中产生的表面蛋白的糖基化作用与从感染HBV者体内分离出的天然存在颗粒的糖基化不同。S蛋白不被糖基化，而前S₂蛋白和前S₁蛋白是以N连接糖基化形式和非糖基化形式产生的。鉴定了N连接的高甘露糖型链，以及O连接的寡糖链(Itoh等，1986；Langley等，1988)。

还在哺乳动物细胞中进行了HBV表面抗原的表达。Michel等(1984)公开了HBsAg在中国仓鼠卵(CHO)细胞中的合成，该细胞用携有前S₂蛋白编码顺序的质粒进行了转染。Persing等(1985)公开了24,000、27,000和35,000道尔顿的3种HBsAg相关多肽在用前S₂蛋白编码顺序转化的小鼠L细胞中的表达。所得的3种多肽可以组装成直径约22nm的复合免疫活性HBsAg颗粒。

McLachlan等(WO88/06185)报道了各种HBV相关蛋白在脊椎动物细胞中的表达。然而，前S抗原在哺乳动物细胞中的表达一般要受到阻碍，这是因为前S₁蛋白相对于S蛋白的过量生成而使HBsAg颗粒的分泌受到抑制(Ou等，1987)。而且，无法控制不同的S相关蛋白的比例。最后，动物细胞的培养是一种昂贵的方法，此方法导致所获产物的成本太高。

尽管目前描述和使用的疫苗效力很强，仍有一定百分比的接种这些疫苗的人没有反应或反应很慢，尤其是免疫相容性(immunocom-promised)个体，例如血液透析患者(参见例如Hadler等，NewEngl.J.Med.315：209-215，1986；Bruguera等，PostGrad.Med.J.63：155-158，1987)。

因此，本领域中需要有可用于制备另一些对HBV有效的疫苗的方法和组合物。

本发明的第一方面提供一种由甲基营养酵母属中选出的微生物，它携带有：

A)一个以上拷贝的编码第一多肽的表达盒(ec1)和/或一个或一个以上拷贝的编码第二多肽的表达盒(ec2)，此外，还可以有一个或一个以上的编码第三多肽的表达盒(ec3)；或

B)一个拷贝的编码第一多肽的表达盒(ec1)和一个或一个以上拷贝的编码第二多肽的表达盒(ec2)，此外，还可以有一个或一个以上的编码第三多肽的表达盒(ec3)；

其中的表达盒包含：

a)一个调节子R，它能对甲醇和/或分解代谢产物阻遏性碳源的减少作出响应；

b)一个开放读码，它编码具有一种乙肝表面抗原生物活性蛋白的全部或其一部分(或多个部分)；

c)可有可无的一个作为转录终止区T的DNA顺序；

其中R调控开放读码的转录，T指导聚腺苷酸化和/或所产生的mRNA的转录终止。

本发明上述方面的优点在于，提供了一种获取含有不同比例前S和S蛋白的复合颗粒的方法，从而能够以低成本大规模生产这些复合颗粒。

本发明还提供一种含有至少两种多肽的复合颗粒，这两种多肽相应于具有乙肝表面抗原生物学活性的蛋白的全部或其一部分，该颗粒至少有两个由S蛋白、前S₂蛋白或前S₁蛋白提供的抗原决定簇，所述颗粒还可包含宿主特异性脂类。

本说明书所用的下列术语定义如下：

“表达盒”定义为任意一个在宿主细胞中作为完整的基因表达单位而起作用的独立DNA区。

“完整的基因表达单位”是指其转录和转译所需的结构基因、启动子和调控区。

“功能性DNA编码区”是指一个DNA编码顺序，它与S蛋白编码顺序同相融合后，不会干扰HBsAg混合颗粒的装配。

“功能性衍生物”是指氨基酸有变化的编码顺序，此变化不会干扰颗粒的形成，而且保留了免疫原性或其他功能。这种功能性衍生物可通过常规的位点特异性诱变或其他标准技术来制备。

“载体”定义为能携带和保持本发明DNA片段的DNA，包括例如噬菌体和质粒。基因工程领域的专业人员是理解这些术语的。

本发明还包括另一些主题，下面由下述叙述、实例和附图给予更详尽的描述。

图1：由pHARS1构建质粒pME4。HARS₁片段已转移至原来pHARS1的单一PvuII位点中，HARS原来位置与β-内酰胺酶基因之间的顺序及β-内酰胺酶基因本身的5′端已缺失。

图2：携有多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)基因组DNA片段的λ噬菌体的图示，该DNA片段包含：

a)MOX基因；

b)FMD基因。

图3：质粒pT-24的图谱。此质粒含有包括MOX基因终止区的DNA片段，它被克隆在pUC19的多用途克隆位点的Sma I位点中。

图4：质粒pRB-S-269和pRB-S-271的图谱，它们分别在MOX或FMD启动子的控制下表达S基因。

图5；质粒pBC、pMS-2、pFS-9的图谱。后两个质粒是由含有多形汉逊酵母URA3基因的pBC产生的，产生方法是，将含有MOX启动子(pMS-2)或FMD启动子(pFS-9)的表达盒插入URA3基因的编码顺序中。

图6：质粒pHK2的图谱。此质粒含有在啤酒酵母的ADH1启动子控制下的卡那霉素基因(得自Th5)。此外，质粒pHK2包含HARS1顺序。

图7：质粒pRB-S-322和pRB-S-326的图谱。存在预粒pHK上的由卡那霉素抗性基因和ADH1启动子构成的功能单位被插入到质粒pRB-S-269和pRB-S-271的HARS区中。

图8：由pMOX-P/T1构建pMPS-22。乙肝病毒的前S基因被插入质粒pMOX-P/T1的EcoRI位点。在产生的质粒pMPS-22中，前S基因由MOX启动子调控。

图9：质粒pMPS-9的图谱。在此质粒的构建中，将pMPS-22的前S表达盒插入原始质粒pBC的汉逊酵母片段的XhoI和StuI位点之间。

图10：多形汉逊酵母URA3基因和相邻DNA区的图谱。

图11：说明质粒pMPT121结构的简图，其中，外源基因顺序可插至MOX启动子的控制之下。

图12：说明质粒pKL*1结构的简图，该质粒含有在MOX启动子控制下的L*蛋白表达盒。

图13：显示构建大肠杆菌质粒pRIT12998各步骤的示意图，该质粒携有缺失了Gly13的L蛋白表达盒。

图14：说明获得酵母质粒pRIT12979的方法的示意图，该质粒能够表达缺失了Gly13的L蛋白。

图15：说明构建质粒pRIT13191的方法的示意图，该质粒含有缺失了氨基酸53-132和146-174的L蛋白的编码顺序。

图16：说明构建酵母表达质粒pRIT13192和pRIT13193的方法的示意图，这两个质粒分别含有L^*和ΔGly L^*蛋白的表达盒。

本发明第一方面的微生物可以是甲基营养酵母属的任一个成员，它通过操作已携有一个以上拷贝的表达盒ec1，还可携有一个或一个以上的表达盒ec2和/或一个或一个以上的表达盒ec3，或两种或两种以上不同类型的至少一个表达盒。表达盒只需要待表达的编码蛋白的性质不同，并且一般都包含下列成分：

a)调节子R，它能对甲醇和/或分解代谢产物阻遏性碳源的减少作出响应。本申请所用的术语“调节子”包括在给定结构基因的表达调控中所涉及的任何顺式作用的DNA。因此，此术语包括在所给编码顺序之前的顺序，例如启动子和由转录因子或其他与转录调控有关的蛋白所识别的顺序。因此，术语“调节子”的意义不限于相应于已知启动子的顺序，还包括这样一些DNA顺序，它们显示出与甲醇诱导性基因的已知调控子相同的甲醇反应性，也就是说，包括所有具有同等功能的顺序。

最近，已知有几种调节子显示出上面概括的性质。例如，Ledeboer等(1985)公开了多形汉逊酵母甲醇氧化酶(MOX)结构基因之前的调控DNA顺序。在Unilever NV的EP85201235.0中公开了一种蛋白表达系统，该系统利用了在活体中调控甲醇氧化酶和DHAS表达的启动子。在Rhein BiotechGmbH的EP87 110417中，提出了一种适于在甲酸脱氢酶启动子(FMD)调控下表达外源蛋白的系统。Ellis等(1985)公开了由Pichia pastoris中分离可由甲醇调控的基因。这些启动子和其他由或可由甲基营养酵母基因得到的启动子都可能与甲醇利用有关，它们有一个共同的特点，即都会对甲醇的加入和/或碳源的减少作出反应，从而增强由它们所调控的各个基因的合成。还包括所有显示同样反应性的DNA顺序。

b)一个开放读码(ORF)，它编码部分或完整的具有一种乙肝表面抗原生物学活性的蛋白。如上所述，给定亚型的乙肝表面抗原包括一组大约6种不同的蛋白，它们的长度和糖基化模式不同。这些蛋白显示出不同的抗原决定基，并且似乎在活病毒中还具有不同的功能。为了诱导前S免疫反应，并不一定需要分别提供完整的前S顺序，只要在开放读码中包括进那些编码相关抗原决定簇的密码子可能就足够了。而且，具有一种乙肝表面抗原生物学活性的蛋白还包括氨基酸有交换，但这些交换不会干扰其生物学活性的蛋白。

c)可有可无的一种作为终止区T的DNA顺序。可使用任一种顺序作为终止区，只要它能有效地终止所在宿主生物中的转录就行。例如，终止区可以是易于在转录的RNA中形成发夹结构和/或聚腺苷酸位点的顺序。在一个优选的具体方案中，终止区来自同一生物的甲醇反应性基因和/或来自得到调节子的同一基因。

这三种成分是以可操作的连接方式排列的，从而使得调节子能够调控各成分之间的开放读码的转录，而终止区则能终止其转录。

本发明的微生物具有不可估量的优点，由于存在有一个以上拷贝的编码第一多肽的表达盒和/或一个或一个以上拷贝的各种其他不同的表达盒，所编码的蛋白的转录和转译的数量可以大为增加。本发明的微生物提供了在细胞中得到任意所需比例的第一和第二多肽的可能性。因此，在蛋白质装配成颗粒时，可以得到具有任何组成的复合颗粒。而且，由于产生了靠得很紧的大量不同的蛋白，这些蛋白比技术上已知的颗粒更易于形成包含一个以上多肽分子的颗粒。

本发明的微生物优选由第一表达盒(ec1)表达完整或部分S蛋白，因为它构成任何可能形成的颗粒的结构骨架。在一个具体方案中，该微生物还含有一个第二表达盒(ec2)，它表达代表完整或部分前S₁蛋白的多肽，例如位于此蛋白N末端的前S₁特异结构域，或完整或部分前S₂蛋白。在进一步的具体方案中，该微生物可含有3种不同类型的表达盒，从而能够同时表达3种多肽，它们包括完整或部分S蛋白、完整或部分前S₁蛋白以及完整或部分前S₂蛋白。

进一步，使用来自甲基营养酵母的调节子使得能够通过加入或减少碳源或加入甲醇(这都是廉价的)而阻遏、去阻遏或诱导细胞培养物。

甲基营养酵母包括下列属的成员：假丝酵母属(Candida)、克勒克酵母属(Kloeckera)、酵母属(Saccharomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、球拟酵母属(Torulopsis)和毕赤酵母属(Pichia)，优选汉逊酵母属。在最优选的具体方案中，本发明的微生物来自Candida boidinii、Pichia pastoris或多形汉逊酵母。来自这些属的酵母是本领域专业人员公知的，它们培养和生长的一般条件也是确定的。

在优选的甲基营养酵母汉逊酵母中，可以使用多形汉逊酵母中的任何菌株。在最优选的具体方案中，所用菌株具有多形汉逊酵母RB10(DSM5215)的鉴定特征。RB10是多形汉逊酵母ATCC34438的ura3突变株。

在一个优选的具体方案中，本发明的微生物能够有效地利用甘油作为碳源。甘油是一种非分解代谢产物阻遏性碳源，它由已知的甲基营养酵母以不同的效率转化为能量。汉逊酵母属的酵母种能够高效率地代谢甘油，而啤酒酵母则在这种碳源上生长很差。此外，多形汉逊酵母在甘油上生长时只产生很少的乙醇副产物，此副产物在大规模发酵时会带来麻烦。

用于本发明表达盒的调节子优选来自上述公知的酵母。优选使用那些已经详细定性的调节子，例如来自多形汉逊酵母各种甲醇反应性基因的调控区，如甲醇氧化酶基因、FMD基因、DAS基因或过氧化氢酶基因。大多数这些基因的调控区都已被测定了顺序并已发表(如Janowicz等，1985；Ledeboer等，1985，EP87110417)。对各种DNA顺序和相应的限制酶解模式的了解，促进了由合适的微生物分离这些调节子的技术。

可以有效地用于终止新生mRNA的任何顺序都可作为终止区，不管它是来自真核还是原核基因。优选的终止区来自酵母基因。最优选的是使用来自上述甲醇反应性基因的终止顺序。

本发明微生物的另一个优点是，可以在各种宿主细胞内导入数量惊人的表达盒，并能稳定地保持下去。一般说来，有两种方式能使特异的遗传信息达到稳定的保持：

遗传信息编码在染色体中或位于自主复制的载体上，该载体可以是质粒、柯斯质粒或病毒等。一般情况下，利用高拷贝数的自主复制质粒或溶源性病毒转化所需的宿主生物，可提供更高的基因剂量。这些质粒或病毒是本领域公知的，它们一般含有复制子和选择标记基因，使得该载体能够复制和稳定地保持下去。然而，病毒通常易于转向溶菌循环，而质粒在某些条件下则易于丢失，而且常常需要连续的选择压力。而且，即使使用高拷贝数的质粒，在酵母中能得到的拷贝数通常也不高于大约50-75。另一方面，将所需的遗传信息(如表达盒)导入宿主基因组中通常要求有一定程度的同源性，至少是在部分待插入的DNA顺序(优选所述分子的末端)和插入位点之间有同源性。因此，对于给定的分子来说，潜在的同源重组整合位点的数目是有限的，在大多数情况下仅仅有一个。对于与多拷贝基因或与转座子类的结构(如Ty)的同源重组来说，此数目略有上升(Jacobs等，1988)。为了促进整合重组，优选使用缺乏复制子但携有选择标记基因的载体，它能对转化细胞赋予可检测的表型特性，并使之能够在选择条件下进行鉴定。

通常很少观察至随机重组。但根据本发明，通过由于随机重组而插入，有可能将多拷贝的任何给定的DNA顺序导入基因组的一个或多个染色体中。为了得到携有多达成百拷贝的所需DNA顺序的转化体，优选使用自主复制的质粒进行转化，通过某些拷贝的整合和其他拷贝的复制的同时进行，能够提供巨大的可整合拷贝库，这些拷贝在随后的细胞周期中被插入。意外的是，能够得到携有许多表达盒的甲基营养酵母菌株。

优选的酵母菌株，例如汉逊酵母属的酵母菌株，含有大约2-500，优选15-200，尤其是20-150拷贝的所需DNA顺序。一旦得到了所需数目的整合表达盒，就通过在非选择性培养基上的生长循环分离出剩余的质粒拷贝，从而可以阻止进一步的整合过程发生。

本发明微生物的一种特殊特征即是多体整合现象。用能够自主复制的载体进行转化后，发现多形汉逊酵母可整合多个重复的用于转化的质粒。观察到所导入的质粒有高达大约100个拷贝的重复。这使得高拷贝数的外源DNA顺序能够存在和整合，而不会由于插入到必需基因中而危及细胞的存活性。意外的是，已证实含有多体DNA的整合体是稳定的。

为了设计含有复合颗粒的疫苗，所述颗粒的不同多肽应具有恒定的比例。为了满足这一需要，本发明提供的微生物具有选定比例的不同表达盒。例如，本发明的一种微生物可携带1-100拷贝的表达盒(ec1)，它编码完整或部分的具有S蛋白生物活性的蛋白；以及1拷贝或多拷贝的表达盒(ec2)，它编码具有前S₂或前S₁蛋白生物活性的蛋白。

优选微生物的携带比例为2拷贝ec1对1拷贝ec2至30拷贝ec1对1拷贝ec2，更优选的比例为5-10拷贝的ec1对1拷贝的ec2或6-8拷贝的ec1对1拷贝的ec2。第三表达盒可以与ec2相同的比例导入，或6-8拷贝的ec1对拷贝的ec3。

除了能够制备含有整合表达盒拷贝的菌株以外，还有可能使用含有自主复制载体的微生物，该载体中包含有自主复制顺序(ARS)和所需的表达盒。含有ARS的载体的存在和保持是本领域公知的。

本发明的主题还有一些DNA分子，该分子含有编码第一多肽的表达盒(ec1)和编码第二多肽的表达盒(ec2)和/或编码第三多肽的表达盒(ec3)，其中的表达盒包含：

b)一个开放读码，它编码具有一种乙肝表面抗原生物活性的完整或一部分(或多个部分)蛋白；

c)可有可无的一个作为终止区T的DNA顺序；

对于调节子、开放读码和终止区的性质，可根据上述资料进行安排。对于这些分子来说，调节子和终止区二者都优选来自选自下列属的甲基营养酵母：假丝酵母属、克勒克酵母属、酵母属、红酵母属、球拟酵母属、毕赤酵母属和汉逊酵母属。在最优选的具体方案中，调节子和终止区都来自与甲醇利用有关的基因，例如MOX基因、FMD基因、DAS基因或过氧化氢酶基因。多形汉逊酵母是作为这些基因来源的优选微生物。对于由ec1、ec2和ec3编码的多肽的本质，根据上述说明进行安排。

本发明的DNA分子可由得自各种天然来源的片段组成。编码任一种乙肝表面抗原的DNA都可由完整病毒(也称为Dane颗粒)的DNA分离出。Charnay等(1979)、Galibert等(1979)、Sninsky等(1979)和Valenzuela等(1979)公开了HBV病毒粒子DNA的分离、克隆和顺序测定方法。

用于克隆和DNA操作的限制酶的选择根据所用肝炎病毒的亚型而定。各种亚型不仅长度不同，而且可进行常规突变的各自的限制酶解模式也不同。本领域的专业人员都能够鉴定携有所需编码区的限制片段，例如利用不同组合的限制性核酸内切酶切割分离出的DNA，对样品进行凝胶电泳和Southern杂交或等同的操作，并利用相应于已知的表面基因顺序的探针鉴定限制片段。如果需要，可测定DNA的顺序和进行进一步操作，例如用核酸内切酶处理、离体诱变、引物修复或其他已知技术，以产生一个具有所需大小、携有所需顺序并具有合适末端的片段。正如本领域的专业人员所公知的那样，可将末端修饰成具有任何所需的顺序，即用核酸外切酶消化、用DNA聚合酶I的Klenow片段填平、并用合成的寡聚脱氧核糖核苷酸作为人工接头和适配接头加入或取代DNA。

然后，编码各种肝炎表面抗原的DNA顺序可进一步与合适的调节子和/或终止区结合，调节子和终止区通过已知技术得自甲基营养酵母的基因组。将各种片段正确地连接起来，以便相对于DNA编码顺序的转译起始密码子和转译终止密码子来说都处于合适的位置。连接也是根据已知方法进行的。由于这些方法是本领域内公知的，此处不再进一步解释。分子克隆技术的详细描述可参见Maniatis等人的《分子克隆》(1982)。

如果不采用连接仅仅由各种天然来源分离的DNA顺序的方法，还可以通过化学合成法合成部分或完整的所需表达盒。化学合成可根据已知方法进行。长链寡聚脱氧核糖核苷酸的化学合成已经有了工业基础。此外，化学合成片段和来自各种天然来源的片段的任何组合对本发明的目的来说也可能是合适的。

本发明进一步的主题是提供得自甲基营养酵母的URA3基因。此基因是通过大肠杆菌MB1000株的相应pyrF突变与某些质粒的互补作用而鉴定的，所述质粒是通过将多形汉逊酵母的限制片段随机插入合适的载体中而构建的。鉴定了一个与受体株的缺陷互补的质粒。新鉴定的基因通过琼脂糖凝胶测定包含大约1400bp。其限制图谱示于后面的图10中。

为了促进表达盒的构建、扩增和导入宿主生物中，最好将其插入适于转化甲基营养酵母的载体中。此载体可以是线性或环状的质粒或病毒。可以使用所谓的整合载体，即完全缺乏自主复制顺序(ARS)的载体。如果这些载体未被整合，则它们将在随后的细胞周期中丢失。

在一个优选的具体方案中，载体还包含能够指导自主复制的ARS DNA顺序。这些顺序优选来自各宿主微生物。对于甲基营养酵母来说已记载了若干种ARS，例如HARS和PARS(Roggenkamp等，1986；Cregg等，1985)。这些顺序含有的一个DNA区能使载体作为染色体外实体稳定地保持在宿主细胞中。

为了促进转化宿主生物的鉴定，进一步的优选方案是提供适于在转化后选择所需微生物的选择标记基因。在本领域已知的酵母质粒中，这些选择标记基因常常相应于编码与氨基酸或核酸代谢有关的酶的DNA顺序，这些酶是待转化的受体宿主生物中缺乏的。

同样的方案也可用来选择转化的甲基营养酵母。通常用来选择营养缺陷型啤酒酵母株的基因包括LEU₂、HIS₃、TRP₅、ARG₄和URA₃基因。得自啤酒酵母的基因也可在甲基营养酵母的转化中用作选择标记；然而，这种转化体在基本培养基上的生长会受到很大伤害。因此，在本发明优选的具体方案中，用携有野生型同源标记基因的DNA分子转化任一种与正常代谢有关的基因的功能有缺陷的甲基营养酵母株。本发明第一次提供了选择多形汉逊酵母转化体的同源标记基因，即URA3基因。此基因的特点，即它的限制片段图谱已在上面讨论过了。

作为选择转化体的另一种方法，可以利用抗生素抗性基因。这对于细菌转化来说是一种公知的方法，并且已经证实可用于啤酒酵母(Jimenez和DaVies，1980)。

然而，关于甲基营养酵母接触抗生素如氯霉素或庆大霉素G418后有什么表现，目前还一无所知。据信这是第一次报道在转化后使转化的甲基营养酵母接触选择性浓度的抑制生长的氨基糖苷抗生素而对其进行选择。意外的是，来自Tn5(Grindley，1980)的氨基糖苷磷酸转移酶当受到得自面包酵母的启动子的调控时，也能够在甲基营养酵母中呈现出活性。当细胞中只存在有一或二拷贝的基因时，G418的失活作用在这些菌株中也是有效的，即该基因不需要高拷贝数。根据本发明，这在甲基营养酵母中是一种非常有效的转化/选择系统。

在最优选的具体方案中，本发明的载体选自载体pMS-2、pFS-9、pRB-S、pRB-S-269、pRB-S-271、pRB-S-322、pRB-S-326、pMPS22、pMPS21、pMPS9。下面将更详细地描述这些载体的构建和使用。

本发明进一步的主题是制备上述微生物的方法，即用一个载体转化甲基营养酵母宿主生物，该载体携有表达盒ec1和/或ec2和/或ec3，在载体复制后，至少有某些表达盒通过重组整合进酵母宿主生物的染色体中，最好是以多体重复的形式整合。其结果是，转化的甲基营养生物可能含有分散在整个基因组上的多拷贝的任一种导入的表达盒，但多体重复的表达盒位于基因组的一个位点上也很可能。发现这种类型的重组尤其发生于汉逊酵母中。然而，也可从甲基营养酵母属的其他任何种中选择甲基营养酵母宿主生物，例如假丝酵母属、克勒克酵母属、酵母属、红酵母属、球拟酵母属和毕赤酵母属。

在最优选的具体方案中，宿主生物选自多形汉逊酵母，其实例是具有多形汉逊酵母RB10的鉴定特征的菌株。多形汉逊酵母RB10于1989年2月17日保藏在DSM(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)，保藏号为DSM5215。多形汉逊酵母DSM5215构成了本发明的另一方面。

虽然优选使用根据本发明的上述任一种载体进行转化，但也可以构建和使用其他载体。

为了得到含有一个以上拷贝的表达盒(ec1)和可有可无的一个或一个以上拷贝的第二表达盒(ec2)的微生物，最方便的途径是采用下面包括多个步骤的方法。根据此方法，甲基营养宿主生物a)用第一载体进行转化并首先培养在选择培养基上，然后在非选择条件下培养几代；b)选择出含有一个以上编码第一多肽的表达盒(ec1)的能稳定有丝分裂的转化体；c)视需要使所述转化体去掉残留的自主复制质粒；d)视需要用第二载体转化所述转化体，并再次首先培养在选择培养基上，然后在非选择性条件下培养几代；e)选择出能稳定有丝分裂的转化体，它们含有一个以上的编码第一多肽的表达盒(ec1)和可有可无的一个或一个以上的编码第二多肽的表达盒(ec2)；f)视需要使所述转化体去掉残留的自主复制质粒。可利用第三载体重复步骤d)至f)。

此方法能够提高一种表达盒(如ec1)的数目，即，使细胞经历后续的多重循环的转化、在选择性/非选择性条件下培养、选择转化体以及视需要去掉游离质粒。另外，也可利用含有两种或更多种不同表达盒的一种类型的载体，或使细胞进行上述循环，即利用携有不同表达盒的不同载体进行转化，都可以导入两种或更多种类型的表达盒。因此，本发明的方法提供了多种获得所需的微生物的可能途径。

本发明的主题还包括一种复合颗粒，其中至少包含两种多肽，它们相应于部分或完整的具有一种乙肝表面抗原生物活性的蛋白，所述颗粒至少有两个由S蛋白、前S₂蛋白或前S₁蛋白提供的抗原决定基，所述颗粒还可含有宿主特异性脂类。一般说来，构成这种颗粒的大部分蛋白都具有S蛋白的抗原特性，它也构成大约80-90％的天然存在的20nm颗粒。复合颗粒可进一步包含具有前S₁蛋白特异性结构域的抗原性的任一种蛋白，即相应于前S₁蛋白N端108(或119)个氨基酸中至少一部分的肽；或/和具有前S₂特异性结构域的抗原性的任一种蛋白，即相应于55个氨基酸的前S₂特异性结构域中的至少一部分的肽。

在一种颗粒中包括两种或更多种具有乙肝表面抗原生物活性的不同蛋白，对于设计由酵母产生的抗乙肝疫苗来说是一种新的方法。迄今为止所得至的由酵母产生的颗粒或聚集体仅仅含有S蛋白、或前S₂蛋白或前S₁蛋白，即仅含有三种可能蛋白中的一种。虽然Valenzuela等(1985)和Itoh等(1986)已经证实前S₂蛋白被装配成颗粒，但据报道，前S₁蛋白只形成小颗粒(直径2或3nm)的混合物或直径约为15-50nm的大聚集体的多分散群体(Kniskern等，1988；Imamura等，1987)。

Rutgers等(1988)报道，在前S₂蛋白和前S₁蛋白的颗粒或聚集体上，由S蛋白编码的抗原决定簇被掩盖，因为这些颗粒在AUSRIA检测中的活性较小。利用由同源的前S蛋白分子组成的颗粒作为免疫原用作疫苗时，这种作用可能对针对S蛋白的免疫反应有不利影响。

因此，本发明首次提供了含有一种以上乙肝表面抗原的复合颗粒。与仅包含一种由啤酒酵母产生的蛋白的颗粒相似，本发明的颗粒一般包含有宿主特异性脂类。

在一个优选的具体方案中，本发明的复合颗粒包含1％以上的前S₁蛋白，其余蛋白为S蛋白以及可有可无的一些前S₂蛋白。然而，优选的颗粒含有1-50％，尤其是1-25％前S₁蛋白，其余蛋白与上述一样。在一个尤其优选的具体方案中，前S₁蛋白与S蛋白的比例在1∶1和1∶100之间，优选为1∶2、1∶8或1∶15。

本发明的颗粒至少被部分糖基化。检测分子量为45KD、38KD和39KD的条带表明，甲基营养酵母中的一部分前S₁蛋白被糖基化。本领域的专业人员将会认识到，由免疫杂交观察到的前S₁蛋白分子的数目和大小可能有某些表观差异。45、38和39KD条带的检测将特别依赖于它们在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时的分辨率、其他酵母蛋白的干扰和所用的免疫杂交法的效果差异。另外，选择用来制备细胞粗提液的方法和用于提取的缓冲液的特定组成也可能影响特定条带的检测。3种分子的相对比例也随生长条件而变。进一步，分子量测定还易受到实验误差的影响，并依赖于用来校准的标准蛋白。没有观察到S蛋白的糖基化。

在合适的培养基中培养本发明的甲基营养酵母菌株，即可方便地制得上述复合颗粒。利用一种受到调控的表达系统，可以控制各种颗粒组分的合成，以免它们的表达影响细胞生长。因此，在任何所需的细胞密度时，甲醇调节子控制的蛋白合成都可以被去阻遏而使异源蛋白得以表达。靠导很紧的不同种类的乙肝表面抗原协同表达后，便会形成颗粒。可利用公知技术由培养物中分离这些颗粒，例如用本领域内已知的等密度离心法、层析法及其他方法。

在使用合适的菌株时，也可用同样的方法获得仅包含一种表面抗原的颗粒或聚集体。

在一个优选的具体方案中，由表达盒指导的蛋白合成在减少了阻遏性碳源后开始。在此前受到分解代谢产物阻遏的细胞，在阻遏剂被稀释后开始表达。加入甲醇可进一步增强去阻遏效应，从而导致甲醇反应性调节子的诱导。加入甲醇可使异源蛋白合成增强高达10倍。

在一个优选的具体方案中，培养基用甘油作为碳源。用甘油作为碳源时分解代谢产物阻遏效应最小。高达0.3％的甘油浓度都不会产生阻遏。因此，使用含有甘油的培养基时，在视需要加入甲醇之前没有必要完全去掉此碳源。

本发明的甲基营养酵母株的发酵在30-40℃之间进行，所用培养基维持在pH3至7，优选为pH4至6。后面给出了培养基实例。

在本发明进一步优选的具体方案中，复合颗粒可以包括下文中一般性地和具体地公开的任何经修饰的L蛋白。

在一个尤其优选的具体方案中，经修饰的L蛋白是一个280个氨基酸的多肽，它相应于ad血清型乙肝病毒的开放读码的残基12-52、133-145和175-400。

在本发明进一步优选的具体方案中，复合颗粒可含有不同亚型的乙肝表面抗原多肽，从而扩宽预防范围。也就是说，S蛋白可以具有ad亚型特异性，前S₁蛋白和/或修饰的L蛋白和/或前S₂蛋白可以是ay亚型，反之亦然。

本发明进一步的主题是一种物质组合物，它包含根据本发明生产的新的复合颗粒或乙肝表面抗原蛋白。本发明组合物的其他组分可以是稳定剂、缓冲物质、稀释剂、盐(例如NaCl)、或糖。

如上所述，本发明的最初目的是提供针对乙肝病毒的疫苗。因此，本申请进一步的主题是含有根据本发明产生的上述复合颗粒或乙肝表面抗原的疫苗。疫苗中可包含其他物质，例如盐、稳定剂、佐剂和/或其他生理上可接受的添加剂。包含复合颗粒的疫苗所诱导形成的抗体至少针对乙肝表面抗原的两种可能的抗原决定基。由于存在有前S₁特异性和前S₂特异性结构域，即使不对现有疫苗产生反应的个体，也可能会产生针对乙肝感染的预防作用。一般说来，本发明的疫苗将比现有疫苗激起更宽的免疫反应，而且由于每个细胞的大量表达和细胞密度很高，使得生产成本较低。

本发明还可用于测试药盒的开发。通过提供一种含有本发明复合颗粒的组合物，有可能监测感染个体的抗体与这种颗粒形成的免疫复合物的形成过程。测试药盒需进一步提供一种检测试剂，例如，用任何已知技术标记的山羊/抗人IgG抗体。此抗体当然也可取自其他任一种哺乳动物。此抗体可与酶相偶联或进行放射性标记以便进行检测。能够对针对前S₁和前S₂特异性结构域的抗体作出反应的测试药盒的优点在于，有可能对HBV感染进行早期检测，因为在人的HBV感染期间，抗前S₁和抗前S₂抗体出现于抗S抗体之前(Petit等，1986)。因此，本发明的测试药盒提供一种方便的手段，以对这种高度传染性疾病进行早期诊断。

本发明进一步的方面提供了一种修饰的乙肝病毒(HBV)大表面蛋白(以下称为修饰的L蛋白)。一个这种修饰的L蛋白的特征在于，其L蛋白顺序中缺乏优先受至蛋白酶攻击的位点。这些位点的去除提供了一种对蛋白酶敏感性较小的分子，它在表达后产生一种易于以颗粒形式纯化的蛋白。

本发明的另一方面是一种修饰的L蛋白，其特征在于缺乏该蛋白质的肉豆蔻酰基化所必需的一个氨基酸。

本发明的另一方面包括一种修饰的L蛋白，其特征在于缺乏几个潜在的糖基化位点。L蛋白糖基化作用的去除改善了抗原决定簇的暴露，这些决定簇在酵母宿主中的表达期间，会由于蛋白质的糖基化而被遮蔽、扭曲或修饰。修饰的去糖基化的L蛋白以正确的构象提供有预防作用的B抗原决定簇以及前S₁、前S₂和S区中重要的TH抗原决定簇，它们都充分暴露在所产生颗粒的表面。

本发明进一步的方面包括一种修饰的L蛋白，其特征在于缺失了部分前S₂区，包括人血清清蛋白(pHSA)结合位点。从而，L蛋白的这种修饰作用消除了潜在的与pHSA受体的存在相关的耐受性或自身免疫问题，而没有失去前S₂区的主要的B抗原决定簇。

本发明更进一步的方面提供了一种修饰的L蛋白，其特征在于非糖基化、蛋白酶敏感性降低和pHSA结合能力降低。此蛋白含有相应于氨基酸残基12-52的前S₁区顺序，并与相应于氨基酸残基133-145的前S₂区顺序融合，其后是连续读码中的S蛋白完整编码顺序。

本发明的修饰的L蛋白不仅如迄今为止所讨论的那样可在甲基营养酵母中表达，而且可在其他酵母表达系统中表达，这些系统可产生颗粒形式的蛋白，并保留由三个结构域前S₁、前S₂和S编码的主要抗原位点。修饰的L蛋白也可在酵母中与S蛋白进行共表达以形成具有混合亚基组成的颗粒。其他表达系统，例如细菌、昆虫、哺乳类，也可以各种形式产生修饰的L蛋白。

本发明的另一方面还提供了新的DNA顺序，它们编码本发明的修饰的L蛋白。在本发明的另一方面，这种DNA顺序可掺入在合适的调控顺序控制之下的载体中。

本发明的另一方面提供了一种生产上述修饰的HBV L蛋白的方法，包括在合适的培养条件下培养用一种酵母表达质粒转化的酵母细胞，该质粒在合适的调控顺序控制下表达选定的修饰的L蛋白基因顺序。修饰的L蛋白也可在酵母宿主中与S蛋白进行共表达。产生的L蛋白可用常规技术从培养物或细胞溶解液中分离。修饰的L蛋白可以颗粒形式分离，此颗粒根据与S蛋白共表达与否而由混合的或均一的亚基组成。

本发明的另一方面提供了在其他表达系统中生产修饰的L蛋白的方法，这些表达系统包括细菌表达系统；昆虫细胞表达系统，如杆状病毒系统；哺乳动物细胞表达系统；牛痘病毒系统和植物表达系统。

本发明的另一方面是包含本发明一种或多种修饰的L蛋白的疫苗，该蛋白单独存在或与其他疫苗制剂和可药用的疫苗载体和佐剂结合存在。本发明的疫苗除了包含此处所述的修饰的L蛋白以外，还可包含具有混合亚基组成的颗粒形式的修饰的L蛋白，此颗粒由修饰的L蛋白与其他肽(即S蛋白)组成。

从上述内容可以理解，新的修饰的大(L)乙肝表面蛋白分子可以单独使用，或与其他HBsAg或HBV组分一起使用，以提供用于接种人体以预防HBV感染的疫苗制剂。本发明还包括在合适的宿主细胞中在合适的调控之下表达修饰的L蛋白。

本发明修饰的L蛋白的特征在于，前S区内有许多氨基酸顺序被缺失、插入或修饰。应当理解，此处待修饰和表达的L分子已经缺失了头11个氨基酸，并在前S1区内含有163个氨基酸(参见共同未决的美国专利申请009,325，该申请列为本文参考文献)。所造成的前S区长度的减小促进了宿主细胞中颗粒的形成，并增强了该分子的各种生物物理性质，这可能使得修饰的L颗粒特别适于疫苗的生产和使用。例如，本发明中缩短的前S区也许能够更好地暴露颗粒上的S和前S抗原决定簇，便于更好地与免疫系统相互作用，从而增强其免疫原性。

在本发明的一个具体方案中，提供了一种在前S1区缺失了GlyI3氨基酸残基的修饰的L蛋白。正如在共同未决的美国专利申请07/009,325中所公开的那样，在酵母中表达的L蛋白携有以酰胺键共价连接的肉豆蔻酰基。N端的Gly残基是蛋白质肉豆蔻酰基化的重要前提(Towler和Gordon，Ann.Rev.Biochem.57：69-99，1988)。因此，本发明中一种合适的修饰的L蛋白是由这样的DNA编码的，该DNA在其编码L蛋白的核苷酸顺序中缺失了Gly13密码子(GGG)。此缺失导致非肉豆蔻酰基化的L蛋白的合成。

本文所用的符号Δ代表缺失。例如，ΔGly13修饰的L是指缺失氨基酸残基13(甘氨酸)的修饰的L蛋白。

本发明另一个具体方案是一种缺失了一个或多个潜在糖基化位点的修饰的L蛋白。正如上面的美国专利申请009,325所述，在酵母中表达的L蛋白在Asn123处携有N连接的寡糖链，在该分于的前S₁和前S₂区中的Ser和Thr残基上都连接有几个0连接的甘露糖链(还可参见Rutgers等，《病毒性肝炎和肝病》，A.J.Zucke-rman和A.R.Liss编，New York，304-308页，1988)。为了去掉其特征在于顺序Asn-x-(Ser或Thr)的N-糖基化位点(其中X可以是任一种氨基酸)，改变123-125位氨基酸的顺序。N连接的糖基化位点可通过缺失或取代123和125位氨基酸、缺失氨基酸124或缺失整个123-125顺序而去除。为了破坏O连接的糖基化位点，从蛋白中缺失L顺序中的所有或某些Ser和Thr残基，或以蛋白中的其他氨基酸取代。由说明性质粒pRIT13192表达的L蛋白的特征在于完全或部分地非糖基化。

本发明另一种修饰的L蛋白在前S₂顺序中有缺失，即缺失前S₂区中负责结合聚合的人血清清蛋白(pHSA)的氨基酸残基120-132(参见Machida等，同上)。缺乏此顺序的蛋白其pHSA结合能力大为降低。

本发明的另一种修饰的L蛋白的特征在于缺失或改变了蛋白酶敏感位点。蛋白酶敏感肽键存在于前S顺序中，在前S₁区的大约100位处的Arg残基之后(Heermann等，Intervirology 28：14-25，1987)以及氨基酸残基Arg137、Gly149和Arg167之后。在L蛋白的编码区中导入缺失或其他修饰，以去除部分或所有这些残基的密码子，将产生对蛋白酶作用的敏感性较弱的L蛋白。

在L蛋白的编码区中导入缺失以形成修饰的L蛋白时，最好不要改变氨基酸21-47和133-145的密码子。据信这些顺序为修饰的蛋白提供了诱导与免疫预防相关的前S特异性抗体的能力(参见例如Itoh等，同上)。

在下面的实例F.1中，描述了作为例子的编码Gly13L蛋白的酵母表达质粒pRIT12979的构建。在实例F.2中，描述了对由质粒pRIT12979表达修饰的L蛋白的表达水平、转译后修饰和大分子装配的分析。

在下面的实例F.3中，通过质粒pRIT13192说明了另一种修饰的L蛋白，该蛋白去掉了上述所有的3种性质，即作为酵母糖基化酶底物的功能、pHSA结合能力和蛋白酶敏感性，并且经过修饰而去掉了前S区的氨基酸残基53-132和146-174的密码子。质粒pRIT13192含有前S区残基12-52和133-145的密码子。本文还描述了对由质粒pRIT13192表达L蛋白的分析(实例F.4)。因此，由pRIT13192表达的L蛋白显示出pHSA结合能力大大降低、蛋白酶抗性改善和糖基化作用较弱。

在本发明的另一个修饰的L蛋白实例中，结合了导入pRIT12979和pRIT13192的L蛋白编码顺序中的缺失。由此顺序表达的L蛋白编码非肉豆蔻酰基化、糖基化较少、蛋白酶敏感性较低的L蛋白，并且其pHSA结合能力也下降了。携有此修饰的L顺序插段的酵母表达质粒pRIT13193的构建也详细描述于下面的实例F.3中。

用于本发明的修饰的L蛋白编码顺序(包括完整的S编码顺序)，可通过常规的位点特异性诱变法由表A中的这些S和前S蛋白编码顺序制备(参见例如Botstein等，Science229：1193，1985)，或通过DNA重组技术制备(参见例如T.Maniatis等，《分子克隆实验手册》，冷泉港实验室，1982)。为清楚起见，下面提及的氨基酸位置编号相应于表A中的位置编号。然而，本领域的专业人员也可用已发表的其他S和前S顺序版本制备本发明修饰的L蛋白。

例如，从感染人血清中的Dane颗粒的DNA提取物中可分离出S蛋白，即用DNA聚合酶，最好是用内源性聚合酶填平单链区，然后用限制性核酸内切酶消化。核酸内切酶的选择将部分依赖于特定的Dane颗粒。例如，某些adw血清型Dane颗粒的HBV DNA的HBsAg编码顺序可从单一的BamHI片段中分离出；某些ayw血清型Dane颗粒的HBV DNA的HBsAg编码顺序可从HhaI片段中分离出。相同血清型Dane颗粒的HBV DNA也可能显示出不同的限制位点图谱。

本发明修饰的L蛋白顺序的构建可利用中间载体完成。Charnay等的Nature 286：893-895(1980)和Tiollais的英国专利申请2,034,323中公开了在噬菌体中克隆DNA片段的技术。

本发明的修饰的L蛋白可在重组DNA分子或载体中构建。本发明的重组载体包含本发明的修饰的L蛋白编码顺序，它以有效的方式与调控区连接。根据需要和/或所用的宿主，这种载体还可含有一个复制子。术语“复制子”是指能使一种重组载体在用这种载体转化的真核或原核宿主生物中稳定地保持在染色体外的最小DNA区。这种复制子是本领域所公知的。术语“调控区”是指如下的任一种DNA顺序，它含有启动子区和编码顺序的转录所必需的其他顺序，它们调控结构基因编码顺序的转录。这种调控区是本领域所公知的。

这样一种载体可用常规技术制备，例如将本发明的修饰蛋白编码顺序以一定的方式插入已经含有复制子和调控区的载体中，使得该DNA分子以有效的方式与这种调控区连接。可用常规技术构建这种DNA分子或含有修饰的L蛋白编码顺序的表达盒，例如使L编码顺序与调控顺序相连接。

限制性切割DNA以制备本发明所用的DNA片段、连接这些片段以制备用于本发明的DNA重组分子、以及将其插入微生物中，都根据已知技术，例如在前面和后面所引用的参考文献中公开的技术进行。所选择的条件要避免DNA和酶的变性。用于进行本发明的限制酶和连接酶可以买到，并应根据产品说明书使用。T4DNA连接酶是优选的连接酶。

用于表达修饰的L蛋白的各种片段和最终构建体，以及携有这些编码顺序以根据本发明方法在宿主细胞中进行表达的载体的各成分，可利用本领域专业人员已知的常规方法连接起来。在许多情况下，基因已经被分离并测定了限制图谱和顺序。在这样的情况下，可以通过限制性切割基因来选择感兴趣的顺序，例如HBV被膜蛋白编码顺序，根据需要进行进一步的操作，如利用Bal31进行再切割、离体诱变、引物修复等，以提供具有所需大小、包括所需顺序和具有合适末端的片段。在连接各顺序以及取代丢失的各顺序时可使用人工接头和适配接头，所用的限制位点是感兴趣的区域内固有的。所分离的各种片段可通过电泳纯化、还可电泳洗脱、与其他顺序连接、克隆、再分离和进行进一步的操作。

使用调控区以控制感兴趣的修饰的L基因的转录，使得能够以高密度培养宿主细胞而不表达或以低水平表达结构基因，然后，通过改变环境条件如养分、温度等而诱导表达。

用常规技术将携有L蛋白编码顺序的载体转化入选定的宿主细胞中并表达。然后在合适的培养基中培养细胞，即该培养基能使宿主生存并表达可回收量的修饰的L蛋白。例如，如果选择酵母宿主细胞，适用的培养基实例是Yeast Nitrogen Base基本培养基。合适的培养基可由本领域的专业人员根据用于该方法的特定宿主进行选择。

本发明的修饰的L蛋白分子可从细胞裂解液或宿主细胞培养基的提取液中分离，这根据细胞分泌修饰蛋白的能力而定。本发明蛋白的回收用常规的蛋白分离技术进行。

为了生产本发明的修饰的L蛋白，可以选择一个合适的宿主细胞或细胞系。合适的细胞或细胞系可以是酵母细胞。本领域专业人员已知的许多酵母细胞株都可用作宿主细胞来表达本发明的修饰的L蛋白。在实施本发明时，可以使用任一个种的酵母。在一个方面，下面的实例使用了酵母属，具体说是啤酒酵母。可以从公共保藏机构和实验室得到许多啤酒酵母菌株，例如美国典型培养物收集中心(Rockville，MD)。

在另一方面，可以使用多形汉逊酵母。

也可使用其他的酵母种，包括(但不限于)汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、Kluyveromyces和裂殖酵母属。

此外，其他种的真核宿主细胞也可用作表达本文所述的L蛋白的宿主细胞，例如哺乳类细胞，如中国仓鼠卵细胞(CHO)或3T3细胞。合适的哺乳类宿主细胞的选择以及转化、培养、扩增、筛选的方法，以及产物生产和纯化的方法都是本领域已知的。参见例如，Gething和Sambrook，Nature 293：620-625，1981；或Kaufman等，Mol.Cell.Biol，5(7)：1750-1759，1985或Howley等的美国专利4,419,446。其他合适的哺乳类细胞系有猴COS-1细胞系和CV-1细胞系。

应当认识到，上述导入L蛋白编码顺序中的某些缺失，改变了与哺乳类细胞中M和S特异性mRNA的转录和转译有关的固有顺序。因此，这样一种修饰的L蛋白编码顺序使得在携有它们各自表达盒的哺乳类细胞中独立地表达S和修饰的L蛋白成为可能。

同样适于作为本发明宿主细胞的还有细菌细胞。例如，在生物技术领域内，各种大肠杆菌株都是公知的宿主细胞(如HB101、MC1061和下列实例中所用的各菌株)。各种枯草芽孢杆菌、假单胞菌属及其他芽孢杆菌等的菌株也可用于本方法中。

此外，如果需要，昆虫细胞也可作为宿主细胞用于本发明的方法中。参见例如Miller等，Genetic Engineering 8：277-298(Plenum Press 1986)以及其中引用的参考文献。

某些病毒也可用来表达本发明的L蛋白，例如杆状病毒或牛痘病毒。合适的宿主细胞的选择在本领域专业人员的能力之内，选择合适的培养条件、培养基和适于在选定的宿主细胞中表达的各载体成分，也在本领域专业人员的能力之内。

在上面和下面实例中所述的表达系统中，可以选择能在选定的宿主细胞内调控蛋白编码顺序的表达的任何已知启动子。如果选择的宿主细胞是酵母细胞，则可用于表达修饰的L蛋白表达盒的启动子可包括强启动子TDH3，或其他组成或调控启动子，它们使得根据培养基的组成调节L蛋白的水平成为可能。此外，例如PGK、ARG3和APH1都是可用于本发明载体中的说明性启动子。

本发明还使本发明修饰的L蛋白作为由混合多肽组成的HBsAg颗粒的一部分进行表达，这一点已详细描述于共同未决的美国专利申请07/368,401中，该申请列为本文参考文献。该方法包括在酵母细胞中共表达第一蛋白S和第二蛋白X-S，其中S基本上是HBV的主要表面蛋白，而X就本发明的目的而言是一个由功能性DNA编码区编码的修饰的前S顺序，该顺序与S编码顺序相内融合。

在参考共同未决的美国专利申请07/368,401时应当注意到，基本上相同的内容也公开于Jacobs等，Gene 80：279-291(1989)。

根据本方法，S蛋白编码顺序与修饰的L蛋白氨基酸顺序进行共表达。L蛋白的编码区以及S蛋白的顺序可如上述用常规的化学合成法或DNA重组技术构建。修饰的L蛋白与S蛋白一起掺入由混合亚基组成的颗粒中。

在构建包含本发明修饰的L蛋白的X-S蛋白时，S优选为HBV的完整成熟表面蛋白(大约226个氨基酸)(见表A)。另外，S蛋白也可由HBV基因组的S蛋白编码顺序编码，其中S基本上与真正的HBsAg S蛋白相同。只要颗粒的装配不会受到不利影响，在构建含有修饰的L蛋白的混合颗粒时也可使用截短的S。

利用常规技术将S蛋白编码顺序置于第一表达盒中，从而能够在酵母宿主中表达S蛋白。将S蛋白编码顺序或其大部分与前S编码顺序的某些部分融合并置于第二表达盒中，从而能够生产本发明的修饰的L蛋白。

如上述用常规技术构建的携有S蛋白表达盒的载体，以及一个或多个携有修饰的L蛋白表达盒的载体，都用常规技术转化至酵母宿主细胞中。

另外，也可将S蛋白表达盒和一个或多个修饰的L蛋白的表达盒一起置于同一载体中，并将其转化至酵母宿主细胞中。

可以使用的载体有Ty整合载体，它详细描述于共同未决的美国专利申请386,401中。在另一种可供选择的方法中，使用携有所需表达盒的相容性自主复制载体，并将它转化至酵母宿主细胞中。

载体系统实例的详细描述参见Mellor等，Yeast 2：145(1986)；Boeke等，Cell40：491(1985)；Boeke等，Cell42：507(1985)以及共同未决的美国专利申请101,463；233,631；368,401和009,325(欧洲专利申请公开0278940)，这些申请和参考文献列为本文参考文献。

此外，也可使用其他种的宿主细胞来表达这里所述的具有混合多肽组成的复合HBsAg颗粒。合适的真核宿主与前面列举的用于表达本发明修饰的L蛋白的宿主相同，例如哺乳类细胞，如CHO细胞。也可以使用昆虫细胞和病毒，如前面提到的杆状病毒和牛痘病毒。

在本发明方法的一个优选的具体方案中，使用携有S蛋白表达盒的Ty整合载体和携有修饰的L蛋白表达盒的自主复制质粒载体。使用携有S蛋白表达盒的Ty载体使得这些顺序能够稳定地整合进酵母宿主细胞的染色体中。这种整合作用是稳定的，因为它们的切除频率很低。因此，载体均匀地分布于细胞群体中，使得每个细胞中的蛋白合成速率相似。

把携有修饰的L蛋白表达盒的自主复制质粒转化至上述细胞中，对每个细胞中一定量的S蛋白合成来说，确保了修饰的L蛋白的合成水平随细胞中存在的质粒拷贝数而变化。

在一个进一步优选的具体方案中，S蛋白表达盒和修饰的L蛋白表达盒都可插入Ty整合载体中，并分别整合到接合型相反的酵母宿主细胞中。然后，可使整合有所需数目的S表达盒和修饰的L表达盒的菌株杂交，得到表达S和修饰的L多肽二者的二倍体细胞。如果需要，可通过使这种二倍体形成孢子而得到携有两种类型表达盒的单倍体分离子。

可在合适的培养基中培养细胞，即该培养基能够使宿主以可回收量表达由混合亚基组成的颗粒中的S蛋白和修饰的L蛋白。

产生的修饰的L蛋白将在酵母细胞中与S蛋白一起同时生成，并装配成混合的复合颗粒。本文将这种颗粒定义为多装配体，它是由两种或更多种多肽组成的颗粒结构，因此其特征在于由混合多肽组成的复合性质。不同的肽以空间结合方式排布于混合颗粒的表面。HBsAg颗粒上新的修饰L蛋白的存在，将诱导出与天然决定基的识别相联系的免疫反应相似的免疫反应。因此，本发明能够在酵母中生产出类似天然颗粒的HBsAg颗粒，因为它们含有来自HBV的S、M和L蛋白的主要的抗原位点。

从细胞裂解液或培养基提取液中分离本发明的混合颗粒是按常规的蛋白分离技术进行的。

在实施本发明的方法时，在生产HBsAg的“混合颗粒”时可使用任一个种的酵母宿主，只要能得到它的转化、克隆和表达系统就行。

在其他酵母属中没有Ty顺序，因此，所设计的载体系统必须能在这些属中对S和修饰的L蛋白编码顺序进行共表达，以产生上述的混合颗粒。因此，可以采用其他的重复DNA顺序或质粒，例如酵母(如毕赤酵母)中以ARS为基础的质粒，使设计的表达盒能整合进酵母染色体中。这种适用的ARS质粒的一个实例见Cregg等，Mol.Cell.Biol.5(12)：3376(1985)。

在上述的表达系统如Ty表达系统和其他表达系统中，调控成分包括使RNA聚合酶结合和转录的启动子。也可使用可调节的启动子，即可以诱导或可以阻遏的启动子。有大量启动子可用于在酵母中表达异源多肽。这些启动子包括可由铜诱导的金属硫因基因(CUP1)启动子，以及糖酵解基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)和乙醇脱氢酶(ADH)的组成启动子。酵母中的转录终止区来自几种酵母基因中任一种的3′端，例如异-1-细胞色素C(CYC1)基因的3′端。用于Kluyveromyces中的表达系统公开于Hollenberg等的PCT WO 83/04050中；用于裂殖酵母中的表达系统公开于Yamomoto的EP-A-107170中；用于毕赤酵母中的表达系统公开于Cregg等，Bio/Technology 5：479(1987)中；用于汉逊酵母中的表达系统公开于Hollenberg等的EP-A-299108中。

本发明实例具体提供的有啤酒酵母菌株，它能合成S蛋白，这是由于发生了由Ty为基础的载体指导的S蛋白表达盒的基因组整合。

在共同未决的美国专利申请368,401的实例1中，描述了这样一种载体pRIT13133-L，它含有TDH3-S编码顺序-ARG3盒和URA3标记。

另一种Ty1载体是pRIT13034-L，它含有同样的表达盒和URA3标记，但此外它还含有CUP1基因，它能用来在CUP1s或cup1Δ受体酵母株中作为额外的标记。

优选的酵母菌株缺乏对铜毒性敏感的功能性染色体CUP1基因，这样就能方便地选择出整合了几个拷贝载体的转化体。在共同未决的美国申请368,401的实例9中，描述了两种优选的cup1Δ酵母株EJ cup1Δ3d和EJ cup1Δ7b。

在下面的实例中，描述了整合有几个拷贝的pRIT13133-L或prRIT1034-L的酵母株。

在下面的实例中，还描述了将携有修饰的L蛋白表达盒的自主复制酵母表达质粒转化至这些酵母株中的方法。

在下面的实例F.10中，描述了整合有几个拷贝的S和修饰的L表达盒的二倍体酵母株。

本发明生产这种修饰的L蛋白的方法，不论是以单独或是以具有混合亚基组成的颗粒的形式生产，都在针对病原微生物的疫苗的生产中有很好的实用性。例如，在各种疫苗制剂中所述的修饰的L蛋白都包含乙肝表面抗原，并可产生用已知的HBV疫苗所达不到的优点。含有修饰的L蛋白的由混合亚基组成的HBsAg颗粒类似于HBV感染者血液中的颗粒或丝状体或病毒粒子，它们含有暴露在其表面的前S2和前S1抗原决定簇，此外还含有来自主要蛋白的抗原决定簇，还可能证明可用于新的疫苗制剂。修饰的L蛋白或含有它们的由混合亚基组成的混合颗粒，可能具有S、M和L蛋白的各个混合物所达不到的免疫原性。

在本发明进一步的具体方案中，由混合亚基组成的颗粒可含有具有不同亚型决定基的修饰的L蛋白和S蛋白，从而扩宽了预防范围。也就是说，修饰的L蛋白可以具有ay亚型特异性，而S蛋白具有ad亚型，或反过来。

因此，本发明包括的疫苗含有本发明修饰的L蛋白或含有修饰的L蛋白的颗粒，该颗粒可以是混合(S、修饰的L)或均一(修饰的L蛋白)的亚基形式。这种疫苗将含有免疫预防量的颗粒或修饰的L蛋白，也就是说，施用足够的蛋白或颗粒以诱导足够的针对HBV的保护性抗体反应，而不产生严重的副作用。这种疫苗可用常规技术制备。例如，在人体中激发针对HBV感染的预防作用的疫苗可含有上述的颗粒和/或修饰的L蛋白和合适的常规载体。颗粒或L蛋白可以是缓冲于生理pH下的水溶液，可供直接使用。另外，蛋白或颗粒也可与常规的佐剂例如氢氧化铝或磷酸铝混合或吸附于其上。这种颗粒或修饰的L蛋白还可与其他免疫原组合以制备组合疫苗。参见例如《疫苗的新趋势和发展》(Voller等编，UniversityPark Press，Baltimore，MD，1978)。

因此，如上所述，不论是单独的还是在具有混合或均一亚基组成的颗粒中的这些修饰的L蛋白，都扩宽了针对HBV的抗体谱，并且，接种了含有这些蛋白的疫苗的人，可能对病毒感染产生更早的反应。此外，含有这些修饰的L蛋白的疫苗能够使不对S蛋白反应的人产生前S反应，或者扩大或增强S反应。

本发明的颗粒和/或修饰的L蛋白的另一种用途是作为探针或试剂，通过各种常规的免疫检测法等检测生物样品中的HBV、或HBV产生的蛋白或抗HBV抗体。

应当理解，本文所述的所有疫苗都能通过合适的途径施用。例如，通过皮下、静脉内或肌肉内途径。每个疫苗剂量中免疫原的量由主治医师来选择，这需要考虑到患者的年龄、体重、性别、总的身体状况等。患者体内诱导免疫保护性反应而不产生显著的不利副作用的量可能随所用免疫原及可能存在的佐剂而异。一般说来，预计每个剂量包含1-1000微克优选1-200微克蛋白。如果需要，在初次剂量之后可反复进行加强免疫。

因此，本发明进一步提供了一种治疗或预防人体乙肝感染的方法，包括给有此需要的患者施用预防量的本发明疫苗。

本发明尤其优选的疫苗是包含复合颗粒结构(L^*，S)的疫苗，其中L^*如下所定义，S是指乙肝表面抗原的S蛋白，最优选的是如本文所述在啤酒酵母或多形汉逊酵母中表达的S蛋白。

本文所用的符号L^*是指一种修饰的L蛋白，它包括前面表A所示的ad血清型乙肝病毒上的大开放读码中的残基12-52、133-145和175-400。同样，符号ΔGly L^*是指一种修饰的L蛋白，它包括残基12，后面是残基14-52，再后面是残基133-145和175-400。

下面的实例说明了本发明。材料

1.质粒

本说明书中提及的质粒描述于下面的A部分中。

2.酵母菌株

多形汉逊酵母RB10(ura3)是多形汉逊酵母ATCC34438的突变株，基本上根据Roggenkamp等(1986)所述的方法用甲磺酸乙酯(EMS)进行诱变而得到。

3.酶

所用的限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶和其他酶，得自Boehringer，Mannheim，FRG或Bethesda ResearchLaboratories，Eggenstein，FRG。这些酶都根据各厂商的说明书使用。

4.免疫试剂

a)S1.1：特异于前S1蛋白的S1结构域的小鼠单克隆抗体(Smith Kline Biologicals，Rixensart，Belgium)。

b)S2.1、S2.2和S2.5：特异于乙肝表面抗原的S2结构域的小鼠单克隆抗体(SmithKline Biologicals，Rixensart，Belgium)。

特异于乙肝表面抗原S1结构域和S2结构域的抗体称为“前S抗体”。

c)RF6：特异于乙肝表面抗原S结构域的小鼠单克隆抗体(H.Thomas，Royal Free Hospital，London)。

d)RF1：特异于位于S区中的依赖构象的抗原决定簇的小鼠单克隆抗体(H.Thomas，Royal Free Hospital，London)。

e)HBS1：针对来自血浆的HBsAg并位于S区的具有变性和还原抗性的抗原决定簇的小鼠单克隆抗体(SmithklineBiologicals，Rixensart，Belgium)。此单克隆抗体在结合实验中与Mab RF6竞争。

抗体a)、b)和e)是由申请人根据标准方法，通过使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合而制备的。该方法可参见Khler和Milstein(1975)。Goding的《单克隆抗体，原理与实践》(Academic Press，London 1983)公开了一些方法。

f)AUSRIA(Abbott Laboratories，Wiesbaden-Delkenheim，FRG和Louvain-La-Neuve，Belgium)：

含有针对天然构象抗原决定簇的多克隆抗体的市售药盒。

g)AUSZYME(Abbott Laboratories，Wiesbaden-Delkenheim，FRG和Louvain-La-Neuve，Belgium)：含有针对天然构象抗原决定簇的单克隆抗体的市售药盒。

在f)、g)中提到的抗体可以买到。它们不与单体的乙肝表面抗原发生反应。

h)AUSAB(Abbott Laboratories，Louvain-La-Neuve，Belgium)：检测抗HBsAg抗体的市售药盒。

5.培养基

制备培养基时所用的Pepton 190、酵母膏、酪蛋白氨基酸和酵母氮源购自Gibco Ltd.，Paisley，U.K.。

为了制备琼脂平板，在对各培养基进行高压灭菌之前，每升加入18g琼脂(Gibco Ltd.)。

a)SMR：非选择性半加富培养基

Pepton 190 2g/l

酵母膏 1g/l

酪蛋白氨基酸(Pepton 5) 3g/l

酵母氮源W/O(NH₄)₂SO₄ 1.4g/l

(NH₄)₂SO₄ 5g/l

碳源：葡萄糖 20g/l

或甘油 20g/l

或甲醇 10g/l

含有甲醇的SMR也称为Met-SMR。

b)YNB：选择性培养基

不含(NH₄)₂SO₄的酵母氮源1.4g/l

(Gibco或Difco)

(NH₄)₂SO₄ 5g/l

碳源：葡萄糖 20g/l

或甘油 20g/l

或甲醇 10g/l

c)YEPD：非选择性加富培养基

酵母膏 10g/l

Pepton 190 20g/l

葡萄糖 20g/l

如果需要，在每毫升培养基中加入1mg庆大霉素G418。

d)S培养基

成分每升中的含量

(NH₄)₂SO₄ 5g

KH₂PO₄ 4g

MgSO₄.7H₂O 2g

NaCl 0.1g

CaCl₂.2H₂O 0.4g

L-组氨酸单盐酸盐 10mg

LD-甲硫氨酸 9mg

LD-色氨酸 9mg

H₃BO₃ 2mg

CuSO₄.5H₂O 0.16mg

KI 0.4mg

FeCl₃.6H₂O 0.8mg

MnSO₄.H₂O 1.6mg

Na₂MoO₄.2H₂O 0.8mg

ZnSO₄.7H₂O 1.6mg

生物素 0.16mg

泛酸钙 32mg

叶酸 0.16mg

肌醇 160mg

烟酸 0.4mg

对氨基苯甲酸 0.2mg

吡哆醇盐酸盐 32mg

核黄素 0.2mg

硫胺素盐酸盐 32mgII.方法

1.DNA操作

用限制性核酸内切酶进行切割、用T4 DNA连接酶进行连接、DNA的磷酸化、由大肠杆菌分离DNA、通过凝胶电泳分离DNA以及所有其他的用于本申请的属于基因工程领域的技术都基本上根据Maniatis等(1982)所述进行。

2.酵母转化

根据前人所述的方法(Roggenkamp等，1986)转化甲基营养酵母。

优选使用完整冰冻细胞的方法(Klebe等，1983)。

a)利用与ura3缺陷的互补或庆大霉素抗性来鉴定转化细胞。

将细胞涂布在含有25ml固化培养基的YEPD平板上以检查对庆大霉素G418的抗性。在平板上培养6小时后，在每个平板上加入含有25mg庆大霉素G418的1ml水溶液，再继续培养2-3天。庆大霉素G418(商标为Geneticin)得自Gibco Ltd.

b)用如下方法分离稳定有丝分裂的转化体：从选择性转化平板中选择转化体，然后使它们在液体选择性培养基(YNB或YEPD，加有1mg/ml的G418)中生长大约20代(两次传代培养)。在此生长期后，将细胞接种在非选择性培养基(SMR或YEPD)上，并使之再生长40-60代(5-6次传代培养)。然后将细胞涂布在选择性平板(YNB或YEPD，加有1mg/ml的G418)上，保留仍然表达选择标记的克隆。

3.酵母DNA的分离

按Struhl等(1979)所述由酵母制备全DNA。

4.酵母DNA的分析

通过用合适的限制性核酸内切酶消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，分析酵母转化体的DNA结构。然后将DNA片段转移至硝酸纤维素膜上，与合适的放射标记的DNA探针杂交(Southern，1975)。

5.免疫分析

Western印迹分析

a)Amersham法

得自粗提物或梯度组分的蛋白通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(Laemmli，1970)，使用12.5％的分离胶，5％的浓缩胶。基本上按照Towbin等(1979)所述，将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上。

通过使印迹与特异性抗体反应来检测抗原物质。抗原-抗体复合物通过下述方法观察：使滤膜与以1∶300稀释的生物素化抗体RPN 1001(Amersham Buchler Gmb H and Co.Ltd.，Braunschweig，FRG)反应，然后与过氧化物酶-抗生蛋白链菌素复合物RPN 1051(Amersham)保温。所有实验步骤都根据厂商的说明书进行。

b)另外，可使滤膜在PBS中与0.05％吐温(W/V)预保温。与给定的单克隆抗体保温后，然后通过在50ml PBS中依次与下述物质保温而检测抗体结合：以1∶250稀释并含有0.05％吐温20的生物素化的羊抗小鼠IgG(RPN 1021，Amersham)；抗生蛋白链菌素-生物素化辣根过氧化物酶复合物(RPN1051，Amersham，在含有1％明胶的PBS中以1∶400稀释)；最后是30μl H₂O₂和含有4-氯-1-萘酚(3mg/ml甲醇)的10ml HRP是色剂。在各次保温之间，滤膜用含有0.05％吐温20的PBS洗涤。

所产生的单体抗原(S和前S)的定量方法是：将0.01-0.3μg酵母产生的纯化的HBsAg样品(SmithKlineBiologicals)与3-5个不同稀释度的汉逊酵母粗提蛋白(含有2-20μg总细胞蛋白)进行比较。

利用BioRad蛋白检测药盒(BioRad Munich，FRG)测定蛋白质浓度。实例：A部分质粒实例A.1构建能在多形汉逊酵母中表达蛋白质的质粒

a)构建含有多形汉逊酵母自主复制顺序的基本质粒(pME4)。

用来构建含有在汉逊酵母启动子控制下的S基因的质粒的亲本质粒是pME4，它已经公开于M.Eckart的博士论文中(1988)。pME4是YIP5的衍生物(Struhl等，1979；Stinchcomb等，1980)，它通过下述修饰得到：

根据Roggenkamp等(1986)所述，将多形汉逊酵母自主复制顺序HARS1克隆至YIp5的SalI位点，从而产生pHARS。质粒pHARS再如下述再构建：在同一载体的PvuII位点中去掉并再插入440碱基对的HARS1-SalI片段。该片段的SalI粘性末端在连接前已填成平末端，方法是与核酸外切酶VII保温，再与Klenow聚合酶反应。通过这样的再构建，在该质粒的pBR322部分的四环素抗性基因中产生了单一的SalI位点。这样得到的中间质粒再次进行再构建，以得到缺乏原来的信号顺序的β-内酰胺酶基因，其中的信号顺序由下面的人工接头所取代(详见Eckart，1988)：

SalI EcoRI BstEII

GTC GAC GAA TTC AAA ATG TCC GGT CAC

CAG CTG CTT AAG TTT TAC AGG CCA GTG

Met Ser Gly His

B-内酰胺酶

此步骤产生了如图1所示的质粒pME4。

b)MOX和FMD启动子片段

由多形汉逊酵母分离MOX启动子的方法由Eckart(1988)公开。为了本发明的目的，将含有MOX基因上游调控区的1525bp基因组EcoRI-SalI片段和编码MOX蛋白头5个氨基酸的密码子克隆至pBR322衍生物中。图2给出了MOX基因的示意图。用EcoRI切割此中间质粒，用核酸酶Bal31处理，然后与EcoRI人工接头连接。这样，通过随后用限制性核酸内切酶SalI切割，得到一系列具有EcoRI3′端和SalI5′端的启动子片段。根据Maxam和Gilbert(1977)的DNA测序法，确定各缺失终点的位置。为了本申请所述的进一步实验的目的，使用一种含有直到-3位缺失的称为pBR322-MP的质粒(此时MOX转译起始密码子的第一个碱基为+1碱基)。质粒pBR322-MP参见Eckart(1988)。

FMD启动子的分离和定性公开于欧洲专利申请87110417.0中。为了本发明的目的，将一个含有大约1000bp上游启动子区的1.4kbBamHI片段克隆至pUC19的BamHI位点中。选择出一个克隆，其中的插段的定位方式是使插入片段的3′端具有pUC19的单一EcoRI位点。图2B给出了含有FMD基因(包括其启动子)的基因组克隆的示意图。为了得到含有启动子而没有结构基因顺序的质粒，在pUC19人工接头由制备一系列始于EcoRI位点的核酸酶Bal31缺失。用Bal31处理之后，使DNA与EcoRI人工接头连接，用BamHI切割DNA，然后将BamHI-EcoRI片段克隆至pBR322中。得到了许多缺失。缺失至从第一个ATG算起-5和-9位的克隆可最有效地用于以后的实验中。为了本申请所述的进一步的实验，使用一种携有启动子片段的质粒，它含有的缺失延伸到从第一个ATG起的一9位(质粒pBR322-FMD-P-9)。下面给出了用于构建进一步质粒的MOX和FMD启动子片段的示意图。

i)MOX启动子片段(-3)

SalI EcoRI

-15 -3

(1500bp)----AAACTACAAAAAC GGAATTCC

人工接头

ii)FMD启动子片段(-9)

BamHI EcoRI

-14 -9

(1000 bp)----TTCATC GGAATTCC

人工接头

c)终止区

由MOX基因分离转录终止区的方法由Eckart(1988)公开。下面给出了MOX基因3′区的示意图：

Arg Phe终止

---------------------------------

AGA TTC TAA

SalI---------Asp718-----------------EcoRV------NruI

< 1477bp >< 327bp >

< 284bp >< 368bp >

将上图所示的Sall-NruI片段亚克隆至pBR322的SalI和NruI位点之间，然后用限制性核酸内切酶Asp718切割此质粒，由于MOX开放读码中只有单一的Asp718位点，使此质粒线性化，然后进行Bal31缺失。

对产生的片段进行DNA顺序分析，鉴定出一个大约320bp的终止区片段(Eckart，1988)，它仍可作为终止区起作用。将此平末端终止区片段(GACATACC--315bp-EcoRV)连接至pUC19的SmaI位点中。通过顺序分析确定该片段的定向(Maxam和Gilbert，1977)。图3显示了所产生的克隆pT-24。用此克隆构建下面所示的表达载体。

d)选择标记基因

用EcoRI切割pME4(如上述，参见图1)，用Klenow聚合酶填平粘性末端。用EcoRI和HindIII消化质粒pT-24，分离含有pUC19人工接头和MOX终止区片段的片段。通过用Klenow聚合酶处理使此片段的粘性末端变为平末端，使此平末端片段与pME4连接。产生的质粒称为pP/T-24。来自pUC19的克隆位点被用于以后进一步的克隆步骤。

质粒pP/T-24含有啤酒酵母URA3基因作为选择标记。导入赋予氯霉素抗性的基因作为进一步的选择标记。从载体pBR325中以1.7kb AatII-ClaI片段的形式分离出此基因，使之进行短时的Bal31消化以在每侧去掉大约4个碱基对，用Klenow填平反应制成平末端。然后，使此片段与已用NruI切割的pP/T-24连接。所产生的具有氯霉素抗性的质粒称为pP/T-24-C。实例A.2构建含有乙肝表面抗原基因的质粒，该基因与多形汉逊酵母终止区以有效方式结合。

为了得到含有乙肝S基因和在多形汉逊酵母中有效的终止区的功能单位，将S基因作为683bp的NcoI-EcoRI片段导入质粒pP/T-24C的BamHI位点中，该位点是由所述质粒的pUC19人工接头部分提供的。该683bp片段得自pRIT12331，它是一种以pUC9为基础的常规大肠杆菌载体，它含有编码S蛋白的683bpNcoI-EcoRI DNA片段，即从NcoI的ATG密码子(CCATGG)至TAA终止密码子之外的EcoRI(TAACGAATTC)。表面抗原编码顺序通过常规的DNA重组技术由pRIT10616中产生，该质粒由EP-A-0278940和Harford等(1987)公开。pRIT10616含有克隆在pACYC184中的adw血清型HBV病毒的基因组，它根据布达佩斯条约于1982年6月2日保藏在美国典型培养物收集中心，保藏号为ATCC 39131。

在连接之前，将S基因片段的粘性末端和BamHI切割的pP/T-24C的粘性末端填成平末端。以正确取向连接片段后，在构建体的紧接S基因编码区5′处再生了相邻的BamHI和NcoI位点。产生的质粒称为pRB-S。实例A.3含有功能性表达盒的质粒的构建，此表达盒包含有多形汉逊酵母产生的启动子、乙肝表面抗原基因和多形汉逊酵母终止区

pBR322衍生物pBR322-MP和pBR322-FMD-P-9分别含有MOX或FMD启动子，将它们用EcoRI消化，并用Klenow聚合酶填平粘性末端。然后用SalI切割质粒。所产生的含有MOX启动子的片段仅仅包含有多形汉逊酵母的基因组DNA，而含有FMD启动子的片段还含有275bp的pBR322顺序(pBR322图谱上的375bp至650bp)。

在再生出的BamHI位点处切割质粒pRB-S，用Klenow聚合酶将该位点填成平末端，然后用SalI消化质粒。使具有一个SalI粘性末端和一个平末端的启动子片段与具有SalI平末端的pRB-S大片段连接，后者含有S基因编码区和多形汉逊酵母终止区。产生的质粒称为pRB-S-269(MOX启动子)和pRB-S-271(FMD启动子，-9缺失)，如图4所示，它们含有在多形汉逊酵母启动子和终止区调控下的S基因。下面的示意图给出了启动子和S基因之间融合点附近的顺序。

a) MOX - 启动子融合 (pRB-S-269)

-3 +1

<---AAAAAC GGAATTGATCC ATG

--------->

MOX 启动子 s-基因

b) FMD - 启动子(-9)融合

-9 +1

<---TTCCATC GGAATTGATCC ATG

--------->

FMD启动子 s-基因

与pRB-S-271和pRB-S-269同样构建的质粒称为pRB-S-269I和pRB-S-271I，但它们没有携带HARS1顺序的440bp限制片段的插入。用这些质粒获得含有1-3拷贝表达盒的整合体。实例A4含有S基因的整合载体的构建

a)构建含有多形汉逊酵母自主复制顺序和多形汉逊酵母URA3基因的质粒pBC。

质粒pBC由含有啤酒酵母ARS1顺序的质粒YRp7(Tschumper和Carbon，1980)产生。通过插入5400bp的BglII-SphI片段使此自主复制顺序失活，该片段含有多形汉逊酵母URA3基因。进一步，将汉逊酵母自主复制顺序1(HARS1)克隆至四环素抗性基因的SalI位点中(图5)。

b)将表达盒插入质粒pBC中。

用BspMII和SalI消化质粒pRB-S-269。

产生的片段携有包含MOX启动子、乙肝表面抗原编码区和终止区的表达盒，用XhoI和StuI切割此片段，填平XhoI粘性末端，然后使之与质粒pBC连接。产生的质粒pMS-2含有S基因表达盒，其邻接顺序为多形汉逊酵母URA3基因片段。

为了使S基因表达盒整合进多形汉逊酵母基因组中，用NheI切割质粒pMS2，用产生的6.1kb片段转化细胞。

以类似的方式构建载体pFS-9，但从含有FMD启动子的pRB-S-271中分离表达盒。

图5详细描述了所产生的质粒。实例A.5构建含有S基因表达盒及额外的选择标记基因的质粒

a)基本质粒pHK2的构建

为了构建质粒pHK2(图6；根据布达佩斯条约于1989年4月27日保藏在DSM，保藏号为5328)，从转座子Tn5中分离卡那霉素抗性基因(Grindley和Joyce，1980)。用核酸酶Bal31处理结构基因以去掉不必要的顺序。产生的片段含有卡那霉素结构基因并包括卡那霉素终止区，将它与啤酒酵母ADH1启动子连接(Hitzeman等，1981)。进一步，将HARSI顺序作为440bp的SalI片段导入质粒中。

b)构建由pRB-S-269和pRB-S-271产生的卡那霉素抗性株。

来自pHK的HindIII片段包含卡那霉素抗性编码区(3.5kb)，将其克隆至质粒pRB-S-269和pRB-S-271的HARSI顺序的HindIII位点中。产生的质粒示于图7，分别称为pRB-S-322和pRB-S-326。实例A.6构建表达前S蛋白的亲本质粒

再构建质粒pP/T-24(实例A.2)，以便得到携有普适表达盒的质粒pMOX-P/T1(图8)，该表达盒包含MOX启动子、多重克隆位点和MOX终止区。

为了插入含有限制性核酸内切酶SalI、EcoRI、BglII和BamHI的限制位点的人工接头，用合成的DNA部分取代质粒pP/T-24中的pUC19人工接头，该合成DNA含有上述酶的限制位点。

用限制性核酸内切酶BamHI和SalI切割质粒pP/T-24。这些位点来源于pUC19人工接头(BamHI)和pME4(SalI)。插入含有SalI、EcoRI、BglII和BamHI限制位点的人工接头分子。用EcoRI和SalI消化产生的质粒pT1，将MOX启动子作为1.5kb的EcoRI-SalI片段插入，产生质粒pT2。质粒pT2的相关区域表示如下：

SalI EcoRI BglII BamHI

-1500 -3

------//---AAAAAC GGAATTC AGATCT GGATCC AGCTT----

←-------- --------→

MOX启动子终止区

此外，与质粒pRB-269一样，质粒pT2含有多形汉逊酵母ARS和啤酒酵母URA3基因(图3)。

下一个构建步骤是，用来自多形汉逊酵母的URA3基因取代啤酒酵母的URA3基因。如下面的实例A.9所述分离含有此基因的克隆。URA3基因作为1.2kb的BamHI-BglII片段分离出来。BglII位点是基因组的原有位点，而BamHI位点则是Sau3A位点与用以构建基因组文库的BamHI位点连接的结果。用Klenow聚合酶填平此BamHI-BglII片段的粘性末端，并插入pBR322的AvaI位点中，该位点也已用Klenow聚合酶填平。通过连接再生了AyaI位点，产生的质粒称为pURA3-P1。

用NruI和BspMII消化质粒URA3-P1。这些位点来自pBR322，即常规的pBR322图谱上的bp974位和bp1664位。用NruI完全消化质粒pT2(pBR322的bp974)。并用BspMII部分消化。

在pT2中有两个BspMII位点：第一个在pBR322中(bp1664)，第二个位于MOX终止区中。pT2的NruI-BspMII片段(1800bp)含有啤酒酵母的URA3基因。来自URA3-P1的NruI-BspMII片段携有多形汉逊酵母URA3基因，将其克隆至pT2中以取代位于相应的NruI-BspMII片段上的啤酒酵母URA3基因。产生的质粒pT3按顺序含有MOX终止区、人工接头、MOX启动子和多形汉逊酵母URA3基因。然而，质粒pT3缺乏象亲本质粒pME4中那样的功能性β-内酰胺酶基因。为了用功能性基因取代这种缺陷性β-内酰胺酶基因，用EcoRI消化pBR322，用Klenow聚合酶填平粘性末端，并与8bp的Asp718人工接头连接，然后用PvuI消化(pBR322图谱的3738位)。这样得到的633bpAsp718-PvuI片段携有β-内酰胺酶基因的原初启动子和转译起始密码子。

使质粒pT3进行Asp718切割(Asp718位于MOX终止区的末端)，并用PvuI进行部分消化。然后，将如上述得到的Asp718-PvuI片段插入预处理过的pT3中，产生质粒pMOX-P/T1。

质粒pMOX-P/T1示于图8中。此质粒含有功能性β-内酰胺酶基因。实例A.7 构建表达前S蛋白的质粒

编码乙肝病毒前S1-S2-S蛋白(大蛋白)的前S基因是从pRIT12816中作为NcoI-HindIII片段得到的。pRIT12816是一个常规的以pBR322为基础的大肠杆菌载体，它含有编码前S1-S2-S蛋白的1185 bp NcoI-HindIII片段，从NcoI的ATG密码子(CCATGG)一直到TAA终止密码子15bp之外的HindIII处(……AAGCTT)。通过常规的克隆技术从pRIT10616(公开于EP-A-0278940和Harford等，1987中)产生前S1-S2-S编码顺序。通过常规手段还能从中回收编码前S2-S顺序的816bp片段。用Klenow聚合酶填平NcoI-HindIII片段的末端，并克隆至pMOX-P/T1的也被填平的EcoRI位点中。作为正确连接的结果，通过NcoI/EcoRI平末端连接而在前S1结构基因之前再生出EcoRI位点。在MOX启动子调控下表达前S基因的构建体称为PMPS-22。它示于图8中。

含有FMD启动子的类似构建体称为pMPS-21。实例A.8 构建含有前S表达盒的载体

将来自质粒pMPS22的SalI-Asp718表达盒填成平末端，并插入上面实例A4a所述的质粒pBC的填平的XhoI位点和StuI位点之间。产生的质粒示于图9中，称为pMPS-9。实例A.9 多形汉逊酵母URA3基因的克隆

通过大肠杆菌MB1000株相应的pyrF突变的互补，对多形汉逊酵母的URA3基因进行克隆。

通过Sau3A的部分消化分离大小为6-9kbp范围的基因组DNA片段，在低熔琼脂糖凝胶上分离，并分离出合适的DNA组分。

将纯化的片段连接至载体YRp7的单一BamHI位点中，该载体含有插入SalI位点中的多形汉逊酵母自主复制顺序。用产生的连接混合物转化大肠杆菌MB1000株，在不含尿嘧啶的基本平板上选择转化体。分析所得到的转化体并分离质粒。分离出一个如图10所示的亚片段，它能在大肠杆菌、啤酒酵母和多形汉逊酵母的乳清酸核苷5′-单磷酸脱羧酶突变体中介导URA⁺表型的恢复。通过Southern杂交证实，克隆的DNA的结构与基因组URA3区一致。图10显示了多形汉逊酵母URA3基因片段的限制图谱。B部分

乙肝表面抗原(HBsAg)在多形汉逊酵母中的表达实例B.1

构建含有S基因的多形汉逊酵母株

用上述质粒pRB-S-269、pRB-S-269-I、pRB-S-271、pRB-S-271-I转化多形汉逊酵母RB10。得到几个携有自主复制质粒(转化体)或整合的外源DNA(整合体)的克隆。

然后用免疫检测法测定这些转化体/整合体的S基因的表达。使用两种测定系统：Western杂交法和AUSRIA或AUSZYME测定法(Abbott)。利用单克隆RF6抗体通过western杂交分析HBsAg单体的生成。Abbott的AUSRIA或AUSZYME药盒都根据厂商的说明使用，用它们测定在汉逊酵母中产生的HBsAg颗粒的量。选择出呈现稳定的高水平表达的转化体，并在电泳分离后通过Southern杂交分析其DNA。

a)转化体

在用质粒pRB-S-269和pRB-S-271转化的多形汉逊酵母中，得到几个携有自由复制质粒的集落。用不同的限制性核酸内切酶消化得自这些转化体的总DNA后进行Southern分析，结果呈现出所期望的限制图谱。

b)整合体

多形汉逊酵母可用整合载体pRB-S-269-I和pRB-S-271-I进行高频转化。在完全培养基(YEPD)上生长的整合体呈现稳定的有丝分裂。另外，用上述程序还可使外源DNA在有丝分裂时稳定地保留在汉逊酵母中，在该方法中，自主复制的载体，优选为高拷贝数质粒如pRB-S-269或pRB-S-271，自发地整合在基因组中。产生的整合体也呈现出外源DNA的高度有丝分裂稳定性。

用上述两种方法获得能在非选择性完全培养基中有效表达S基因的菌株。保留了3个菌株：编号为352的菌株，它是用pRB-S-271转化的，其中的S基因由FMD启动子调控；以及415和416号菌株，它们是用含有由MOX调控的S基因的pRB-S-269转化的，将这3个菌株用于进一步的实验中。实例B.2 外源DNA在整合体中的有丝分裂稳定性

用下列方法测定重组株352、415和416的稳定性：将菌株在非选择性SMR培养基上培养40代。在这40代期间之前和之后从培养物中分离出12个独立的集落。

通过Southern杂交分析，并结合限制片段的琼脂糖凝胶电泳和总染色体的脉冲场梯度凝胶电泳，检查分离出的克隆中的外源DNA结构及表达盒的拷贝数。后一种技术能够分离和分析酵母染色体(Schwartz和Cantor，1984)。

脉冲场凝胶电泳

使来自415、416和352菌株的细胞在0.7％W/V琼脂糖凝胶的样品孔中轻度裂解。根据LKB-Pharmacia的说明，利用LKB-Pharmacia Pulsaphor Plus装置分离原位释放的染色体。在脉冲场凝胶电泳之后，根据Southern(1975)的方法将DNA转移至硝酸纤维素膜上。利用特异于MOX和/或FMD基因或多形汉逊酵母的URA3基因(已知后者以单拷贝存在于基因组中)的32P标记的探针与印迹杂交。

对由可能的多体整合体产生的信号与单拷贝基因(内在标记)的信号进行比较，能够测定存在于细胞内的相关表达盒的拷贝数。利用脉冲场凝胶电泳分析染色体表明，克隆415大约有30-50拷贝的表达盒，而克隆416含有大约5-6个表达盒，克隆352含有大约10个表达盒。分析结果表明，外源DNA被整合在汉逊酵母基因组中。

Southern分析

将菌株352、415和416在SMR培养基中培养40代。在上述生长期之前和之后，由每一批中分离出12个独立的集落。然后，用各种限制酶切割来自这些亚克隆的DNA制备物，然后用³²P标记的DNA探针进行Southern分析。限制图谱的分析结果表明，表达盒是完整的，导入的DNA具有遗传稳定性。分析结果进一步揭示出，菌株415的基因组含有几个拷贝质粒的长重复区。推测在此重复区内质粒是以头对尾方式排列的。实例B.3表达研究

用Western杂交法和AUSRIA/AUSZYME测定法对重组菌株进行常规分析，看是否存在HBsAg。

a)培养物生长及western杂交法

将菌株352、415和416培养在1升培养瓶中，培养在200ml SMR-甘油培养基中于37℃进行，并伴以剧烈的通气。在静止期开始时(其特征是甘油的减少)，向其中加入50ml/l不含甘油的5倍浓缩的SMR培养基，并同时加入最终浓度为10g/l的甲醇。在加入甲醇之前和加入甲醇24小时后，从培养物中取出10ml样品。为了进行比较，将同样的菌株还培养在含有30g/l葡萄糖的SMR的培养基中(启动子的去阻遏)。在晚对数期收集细胞。

由收集的细胞制备蛋白粗提物，方法是：将大约相当于0.1g干重的细胞沉淀悬浮在5ml PE缓冲液中(0.5M NaCl，0.1％TritonX-100，10mM磷酸缓冲液pH7.5，2mM PMSF)。加入大约等体积的直径为0.45mm的玻璃珠，直到混合液几乎变为固体。利用Braun MSK匀浆器(B.Braunand Diessel Biotech GmbH，Melsungen，FRG)，将混合物在4℃下激烈摇动4分钟。然后加入4ml PE缓冲液，混合匀浆液，并于4℃下以40,000xg离心5分钟。取5-25μg的上清液等分试样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用纯化的HBsAg(0.05-0.5μg)作为对照。根据Towbin(1979)的方法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，并按照上面的方法5a所述用单克隆抗体RF6进行检测，从而证实了抗原物质的存在。参考已知量的由酵母产生的纯HBsAg，用Western杂交法能够测定在克隆352、415和416中产生的抗原量。

表1总结了所得结果。在细胞密度为大约5g干重/升的甲醇诱导的培养瓶中(SMR培养基)，S蛋白占转化株总提取蛋白的大约2-5％。

比较在诱导(甲醇)、去阻遏(甘油)和阻遏(葡萄糖)条件下培养的细胞的表达水平，表明MOX和FMD启动子具有非常严格的调控作用。在葡萄糖上培养的细胞中表达被完全阻断。在甘油中，HBsAg的合成相当于诱导细胞表达水平的大约30％。

b)在多形汉逊酵母中表达的HBsAg的抗原性

利用以单克隆抗体为基础的Abbott AUSZYME测定法，测定粗提物中所含物质的抗原性。结果以任意单位表示(每0.1μg蛋白在492nm处的吸光度；粗提物的稀释及反应在150mM NaCl、25mM磷酸缓冲液pH7.4、0.01％BSA、0.01％吐温20中进行)。与AUSZYME试剂的反应性表明，存在有亚病毒颗粒特有的构象抗原决定簇。

表1在表达S基因的菌株中的HBsAg生产

通过Western 通过AUSZYME检

杂交测定的测法测定的HBsAg

HBsAg(mg/100mg (任意的A₄₉₂单位菌株启动子碳源蛋白) /0.1μg蛋白)352 FMD 葡萄糖无信号 0.3

甘油 0.8-1.2 10.0

甲醇 2.5-3.0 25.0415 MOX 葡萄糖无信号 0.1

甘油 1.0-1.5 12.0

甲醇 4.0-5.0 45.0416 MOX 葡萄糖无信号无信号

甘油 0.5-0.8 5.0

甲醇 2.0-3.0 22.0

c)多形汉逊酵母粗提物的密度梯度离心

利用CsCl或蔗糖梯度，将按上述方法得到的粗提物进行密度梯度离心。蔗糖平衡沉降梯度离心如下述进行：将100-200μg(200μl)蛋白粗提物加在20-50％蔗糖梯度的顶部，该梯度含有50mM NaCl、2mM EDTA、25mM NaPO₄，pH7.2。离心管的体积为5ml，离心在Beckman SW 50.1转子中以40,000rpm进行18小时。

氯化铯梯度离心如下述进行：将1体积的蛋白粗提物用1体积的在25mM磷酸缓冲液pH7.4中的3M CsCl稀释。于4℃下在Beckman 50Ti转子中以40,000rpm离心40小时。

将梯度进行分级分离，用RF6抗体通过Western杂交法或利用AUSRIA和/或AUSZYME检测法测定各个组分。在CsCl密度梯度中可以证实，在密度大约为1.16-1.19g/ml处形成了HBsAg物质峰。此峰中的物质不仅能在Western杂交中与RF6抗体反应良好，而且在AUSRIA和AUSZYME检测法中也能良好反应。此密度和在AUSRIA/AUSZYME测定法中的反应性表明存在有颗粒特有的构象抗原决定簇。而且，在进一步的实验中，将此物质的密度与由人血清中分离的亚病毒颗粒作了比较。可以证实，在CsCl溶液中进行等密度离心时，两种物质所在的密度差不多。

粗提物的蔗糖梯度离心产生与AUSRIA和AUSZYME反应的峰组分，通过AUSRIA/AUSZYME和Western印迹法对平行的梯度组分作分析表明，这些峰组分相当于至少80％的HBsAg。剩下的20％物质主要位于梯度的顶部和底部组分，并且只在Western印迹分析中发生反应，表明此物质是蛋白质的单体形式。分析由CsCl梯度得到的峰组分也表明，至少有80％的物质形成颗粒。

汉逊酵母产生的颗粒能耐受蛋白水解作用。测定AUSZYME值和通过变性SDS-PAGE并随后进行Western印迹法分析多肽的完整性表明，含有颗粒的蛋白粗提物在不同温度下保温数小时只产生很少的降解。用电镜进一步分析了该物质。电镜照片清楚地显示出直径为大约22nm的颗粒。

所有3种菌株(352、415和416)都得到了上述结果。C部分

前S1-S2-S蛋白在多形汉逊酵母中的表达实例C.1构建含有前S1-S2-S基因的多形汉逊酵母菌株

用5570bp的PvuI-Asp718片段转化多形汉逊酵母RB10，该片段来自pMPS-22，包括在MOX启动子调控下的URA3基因和前S1基因(见图8)。进一步，由质粒pMPS-21得到携有在FMD启动子调控下的前S1基因的相应片段(-9缺失)。由Southern分析表明，由这些转化作用得到的整合体含有1-2个表达盒。含有在MOX启动子调控下的前S1基因的整合体称为前S-AM；含有在FMD启动子调控下的前S基因的整合体称为前S-AF。

通过用携有HARS顺序的自主复制质粒pMPS22和pMPS21转化多形汉逊酵母而得到了含有几个表达盒的整合体。正如在“材料和方法”的2b中所述，这些质粒通过自发整合而形成整合体。这些类型的转化体按一般方式命名为前S-BM(MOX启动子)和前S-BF(FMD启动子)。

在菌株前S-AM-405、前S-BM-402、前S-BM-403和前S-BM-454中，前S1基因的表达受MOX启动子的调控，保留这些菌株供进一步分析。实例C.2有丝分裂稳定性

通过Southern分析法测定在上述实例C.1中鉴定的四个菌株中的外源DNA的有丝分裂稳定性，如B部分所述，测定在40代生长期前后分离的12个独立的亚克隆。分析结果确定了整合载体的遗传稳定性(也可参见D.3部分中的实例)。实例C.3前S蛋白在多形汉逊酵母中的表达

完全按照B部分所述的方法，将菌株前S-BM-402、前S-BM-403、前S-AM-405和前S-BM-454培养在含有甘油的SMR培养基，然后用甲醇(10g/l)诱导细胞。加入甲醇25小时后收集细胞，按照B部分所述制备粗提物。

a)按照“方法5(a)”所述，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析12μg菌株前S-BM-402、前S-AM-405和前S-BM-454的粗提物，然后利用单克隆抗体混合物(S1.1、S2.2和S2.5)进行Westhern印迹分析。两种类型的菌株都在38/39KD处显示出抗原双条带，以及在45KD处的条带。

与菌株前S-BM-402相比，菌株前S-AM-405的45KD分子的含量相对于39KD物质较低；菌株前S-BM-454的45KD分子的相对含量最高。

将上述菌株前S蛋白的电泳图形与来自人血清颗粒的抗原进行比较。当在Westhern印迹上比较时，人和酵母制备物二者都呈现出大约38/39KD的条带。

b)还观察到不同菌株的表达水平有差异。这些差异也许是由于菌株之间表达盒的拷贝数不同。正如表2所示，通过Western印迹法测定，前S抗原在不同的前S-A和前S-B菌株中构成了细胞总蛋白的0.1-1.5％。

还用AUSZYME检测法测定了粗提物中是否存在颗粒。表2所示的结果表明，以每0.1μg蛋白的A₄₉₂单位表示的反应活性是很低的。

表2 前S在多形汉逊酵母中的表达

由Western印 AUSZYME每

迹法测定的前S 0.1μg蛋白克隆蛋白(mg前S1/ 的A₄₉₂单位

100mg)前S-AM-405 0.1-0.2 0.01前S-BM-402 0.3-0.5 0.02前S-BM-403 0.4-0.6 0.02前S-BM-454 1.2-1.5 0.1-0.2

c)糖基化：菌株前S-BM-454的特征在于前S蛋白的高水平生产(细胞总蛋白的大约1.5％)以及显著的45KD条带。选择此菌株进一步研究糖基化问题。使蛋白粗提物与EndoH内切糖苷酶保温，分析来自前S-BM-454的前S蛋白。下面的数据清楚地表明，45KD分子是一种糖基化形式的前S蛋白。

根据厂商的说明(Boehringer Mannheim，FRG)使45μg粗蛋白与0.5毫单位EndoH内切糖苷酶保温0.5、1.0和24小时，保温后，45KD条带的表观分子量变为42KD。此变化表明，45KD分子是一种N-糖基化形式的前S蛋白，它携有一个大约3000D的“核心”基团。

还用衣霉素来研究多形汉逊酵母中前S蛋白的糖基化，已知衣霉素是一种强效的N-糖基化抑制剂。在含有葡萄糖(10g/l)的YNB培养基中，将菌株前S-BM-454培养至密度为A₆₀₀＝10.0。将10ml此培养液接种在100ml含有10g/l甲醇和50μg/ml衣霉素的YNB中。培养基的pH值恒定保持在7.2-7.5。做一个不用衣霉素的对照实验。在接种含有衣霉素的培养基10、15和30小时后收集细胞。

用Western印迹法分析蛋白粗提物。研究结果表明，在衣霉素存在下培养的细胞中，可见到在42KD处的单条带和在38/39KD处的双条带。在对照实验中，42KD的条带由45KD的条带取代。用菌株前S-BM-402、前S-BM-403和前S-AM-405的提取物得到类似结果，但它们所产生的45KD蛋白分子的数量少得多(不超过所合成的总前S蛋白的5-10％)。这些结果提示，42KD条带代表O-糖基化形式的前S蛋白。

d)密度梯度离心

对菌株前S-AM-405和菌株前S-BM-402、前S-BM-403、前S-BM-454的粗提物进行蔗糖和CsCl梯度离心分析。所用条件描述于B部分3(e)中。用Western印迹法和AUSZYME测定法检测各梯度组分。

分析结果表明，与表达S抗原(B部分)或前S1和S抗原二者(D部分)的菌株相反，前S菌株不能有效地形成亚病毒颗粒。等密度CsCl或蔗糖梯度离心都未揭示出所需密度的条带的形成。下面的事实也证实了这一点：即来自梯度组分和粗提物的HBsAg相关物质对AUSRIA或AUSZYME测定的反应很差。D部分

含有前S和S抗原二者的复合颗粒的形成实例D.1

菌株的构建

构建了几个菌株，它们的特征是不同比例的前S1与S表达及不同的总表达水平。

这些差异是由于每个基因组中的表达盒拷贝数不同而产生的。将基因置于不同的汉逊酵母启动子调控下产生额外的差异。

按下述步骤得到3种基本类型的重组菌株：

a)含有一拷贝前S1基因和一拷贝S基因的菌株(A菌株)

由质粒pMPS9分离出含有前S1盒和URA3基因的6.6KbNheI DNA片段(图9)。由质粒pMPS2分离出含有S基因的NheI DNA片段(图5)。用T4DNA连接酶使片段连接，用琼脂糖凝胶分离出由一拷贝的每种基因构成的连接片段。用这些片段转化多形汉逊酵母RB10株，使之成为尿嘧啶独立株。

用Southern杂交法分析产生的转化体，选择整合有一拷贝各种表达盒的克隆。保留菌株前S/S-A-293供进一步分析。

b)含有一个前S表达盒和几个S表达盒的菌株(B菌株)

用来自pMPS-22的含有前S1表达盒的5570bp Asp 718-PvuI片段转化多形汉逊酵母。选择携有一拷贝整合的表达盒的转化体。所保留的菌株是上面C.1部分所述的前S-AM-405。

然后，用自主复制质粒pRB-S-326(FMD启动子)或pRB-S-322(MOX启动子)转化菌株前S-AM-405(图7)，所述质粒含有在各自启动子调控下的S基因。两种质粒还携有编码庆大霉素G418抗性的基因作为选择标记。如上所述，Kan基因在啤酒酵母ADH1启动子的调控下(图7)。Southern杂交和脉冲场梯度电泳分析表明，转化作用产生的几个菌株总含有一拷贝整合的前S1盒和多拷贝(30-100)整合的含有S基因的表达盒。

保留菌株前S/S-B-431、前S/S-B-432和前S/S-B-433供进一步分析。菌株前S/S-B-431携有MOX启动子控制的S基因，而前S/S-B-432和前S/S-B-433含有包含FMD启动子的表达盒。

c)含有几个S和前S基因表达盒的菌株(C菌株)

用含有前S1基因的自主复制质粒pMRS-22转化多形汉逊酵母(图8)。转化作用产生若干含有不同数目表达盒的菌株，这些表达盒都整合在基因组中。通过Southern杂交鉴定出含有2-20个前S1表达盒的分离物。这些菌株在C部分中被描述为前S-BM-402、前S-BM-403和前S-nM-454，它们表达不同数量的前S抗原。然后，用自主复制质粒pRB-S-322(MOX启动子)和pRB-S-326(FMD启动子)再次转化这些前S株，所述质粒携有S基因(图7)。用G418抗性作为转化标记。选择稳定的整合体时由每次转化都得到若干克隆，其中一些作了进一步分析。保留下来作进一步分析的菌株有来自菌株前S-BM-402的前S/S-C-452、前S/S-C-465；来自菌株前S-BM-403的菌株前S/S-C-466；来自菌株前S-BM-454的菌株前S/S-C-448-C4，其中的S基因表达盒包含FMD启动子。关于上述菌株的来源和命名，表3提供了详细资料。

表3表达前S和S蛋白二者的菌株的特性

^*数目代表由给定菌株测定的最低值和最高值。实例D.2前S和S蛋白在多形汉逊酵母中的表达

用上面的“材料和方法5a”中所述的免疫印迹法和AUSZYME检测法，测定多形汉逊酵母不同转化株前S和S蛋白的表达。在表3中，概括了所测定的各种菌株的结果和性质。

按照B.3部分所述，培养和诱导表达前S和S蛋白二者的菌株，但使用30ml培养体积。如上述制备细胞粗提物，并进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用RF6或混合的S1.1和S2.1单克隆抗体检测Western印迹。对12-15μg来自菌株前S/S-A-293、前S/S-B-431、前S/S-B-432、前S/S-B-433、前S/S-C-453、前S/S-C-465、前S/S-C-466和前S/S-C-488-C4的甲醇诱导细胞的粗提物进行免疫印迹分析，用单克隆RF6检测。此分析结果表明，可以得到一个表达不同比例的前S和S蛋白的菌株谱。由这些和其他免疫印迹法测定表明，菌株前S/S-B-431中的前S和S蛋白比例大约为1∶15，在菌株前S/S-C-452中大约为1∶8，在菌株前S/S-448-C4中大约为5∶3。如表3所示，由免疫印迹法和AUSZYME检测都发现，各种菌株的生产力水平也不相同。对这些菌株的细胞提取液也进行免疫印迹分析，用单克隆S1.1进行检测。在大多数菌株中，前S蛋白作为双蛋白带在38-39KD处被检出，而45KD条带的量较少(估计只占检测出的总前S蛋白的大约5％)。相反，菌株前S/S-C-448-C4表达大致等量的38-39KD和45KD分子。实例D.3外源DNA的稳定性

如B部分所述，分析外源DNA在上述前S/S转化体和整合体中的稳定性。研究结果表明重组克隆具有很好的有丝分裂稳定性。在菌株前S/S-453和前S/S-431发酵40代前后分离出12个独立的集落进行Southern分析，结果表明，在所有情况下都观察到相同的限制片段图谱。对表3所列的前S/S菌株也作脉冲场梯度电泳分析。将分离的染色体吸印到硝酸纤维素膜上，然后与不同的放射性DNA探针杂交。此方法能够测定出S表达盒的拷贝数，并确定地证明这些前S/S菌株是整合体。这些实验的结果概括于上面的表3中。实例D.4复合颗粒的分离和定性

a)由多形汉逊酵母部分纯化复合颗粒

使多形汉逊酵母前S/S-B-431株的发酵培养物在上述“材料5d”中所述的S培养基中生长，用甲醇诱导78小时后离心回收细胞。将细胞沉淀以大约每升120g干重细胞的浓度再悬浮于缓冲液中，缓冲液含有0.5％(W/V)吐温20、2mM EDTA、4mM PMSF、5％(V/V)异丙醇和50mM磷酸钠缓冲液pH9.0。在球磨机(Dynomill Type KDL，Bachofen AG，Basel，Switzerland)中破碎细胞，球磨机中装有直径0.45-0.7mm的玻璃珠，用每小时6升的流速通过4次，在室中的滞留时间为7分钟。

在4℃下以16000g离心45分钟使细胞提取液澄清，回收上清液。

然后，在上清液中搅拌加入1％(W/V)硅胶(Aerosil380，Degussa，Frankfurt，FRG)，混合物于4℃下搅拌过夜使HBsAg吸附。在4℃下以4000g离心30分钟而回收硅胶，并用0.9％(W/V)NaCl洗涤两次，洗涤通过沉淀的再悬浮和再离心进行。使洗涤后的沉淀再悬浮于10mM焦磷酸钠pH9.5中，并在37℃下伴以恒定搅拌保温3小时，从而使吸附在硅胶上的HBsAg解吸附。加入的焦磷酸钠缓冲液的体积大约为最初澄清的细胞提取液体积的八分之一到十分之一。然后.在4℃下以17,000g离心溶液60分钟并回收上清液。

使上清液变为1.5MCsCl的溶液，在50.2Ti转子(Spinco Division，Beckman Instruments，PaloAlto，USA)中，以45000rpm离心70小时，使混合物达到等密度平衡。分级分离所产生的CsCl梯度，利用Elisa药盒(Enzygnost，Behring-Werke AG，Marburg，FRG)按厂商说明测定各组分中是否存在HBsAg。合并峰组分，并在10mM磷酸钠/磷酸钾，0.15M NaCl pH6.8中透析。对此物质和细胞粗提液的检测结果表明，在此步骤中回收到了48％的总AUSTRIA活性物质、不到3％的总蛋白、不到0.2％的总糖和不到2％的总脂类。

用完全相同的方法还提取了多形汉逊酵母前S/S-C-452株的细胞沉淀，并得到相似的结果。

如下面的D.4部分所述，通过凝胶电泳检查由前S/S-B-431和前S/S-C-452株部分纯化的HBsAg制备物样品，并用单克隆HBS1和S1.1用免疫印迹法检测HBsAg相关蛋白。

用单克隆HBS1进行的免疫印迹表明，在24KD处有一个活性带，此外在大约38/39KD处有一个带，在两种制备物中都是这样。用单克隆S1.1进行免疫印迹分析时，在两种制备物中都只在38/39KD处检测出前S1蛋白相关条带。

此结果表明，前S1蛋白和S蛋白二者都通过硅胶吸附和等密度CsCl密度梯度离心而一起纯化出来。

b)复合颗粒的CsCl密度梯度离心

使多形汉逊酵母前S/S-B-431株的发酵培养物在S培养基(“材料”5d)中生长，用甲醇诱导73小时后收集培养物。离心回收细胞沉淀，再悬浮，然后按下述步骤通过法式压榨机来制备细胞提取液。以17000g离心30分钟，从粗裂解液中去除细胞碎片。然后，将细胞粗提液在1.5M CsCl，磷酸缓冲盐水pH7.5中以245,000g离心至平衡。分级分离梯度，利用特异于HBsAg(Enzygnost：Behringwerke AG，Marburg，FRG)和特异于前S1蛋白的ELISA检测法分析各组分的抗原性。Enzygnost检测法只检测装配好的HBsAg颗粒，而不能检测蛋白单体。前S1蛋白特异性ELISA检测法利用鼠单克隆抗体S1.1捕获和检测抗原，此方法描述于下面的D.5部分中。

在CsCl梯度的1.18-1.19g/cm³密度处，观察到了HBsAg活性峰。在相同的密度处，观察到了前S1蛋白活性的主要峰，在1.26g/cm³密度处还有一个次要峰。

还通过免疫印迹法分析梯度组分是否含有前S1蛋白S蛋白。根据Laemmli(1970)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并根据Towbin等(1979)吸印到硝酸纤维素膜上，然后使硝酸纤维素膜与针对血清HBsAg而产生的兔多克隆血清保温。用碱性磷酸酶法检测抗体结合。

在24KD处观察到了相应于S蛋白的主要蛋白条带，在38/39KD处观察到双条带。对所有3种蛋白分子来说，在免疫印迹中的最大活性位于密度为1.18-1.19g/cm³的CsCl梯度组分中，它相应于在Enzygnost检测法中检测到的HBsAg活性峰。此结果表明，粗提物中的大部分HBV表面抗原蛋白都以具有HBsAg密度特征的脂蛋白结构存在。

使另一块硝酸纤维素膜与鼠单克隆抗体S1.1保温。在相当于1.18-1.19g/cm³ CsCl密度的组分中，此抗体只检测出在38/39KD处的蛋白条带。还使细胞粗提物在蔗糖梯度上进行差速区带离心。将细胞粗提物加在在50mM Tris-HCl缓冲液pH8.1中制成的5-20％(W/V)蔗糖梯度上，以288,000g离心200分钟。将梯度分级分离，用Enzygnost ELISA检测法分析各组分中是否存在HBsAg，并用Enzygnost检测法的HBsAg特异性抗体通过抗原捕获分析是否存在含有HBsAg的前S1蛋白，用前S1蛋白特异性Mab S1.1进行检测。Enzygnost检测法显示出一个穿过梯度沉降的HBsAg活性峰。

Mab1.1 ELISA显示出与Enzygnost检测法相同的峰，但有一个活性肩峰延伸至较高的蔗糖密度中。如果在进行蔗糖密度梯度离心分析之前，先通过在硅胶上吸附/解吸附及CsCl梯度离心部分纯化多形汉逊酵母前S/S-B-431株的粗提物，则可消除这种具有较高沉降系数的物质的肩峰。这些结果表明，HBsAg和前S1蛋白在CsCl密度梯度中共沉降，二者都具有脂蛋白颗粒的密度特征。

c)在多形汉逊酵母中表达的复合HBsAg颗粒的抗原性

如上面的3a所述，由多形汉逊酵母前S/S-B-431株的粗提物部分纯化HBV表面抗原颗粒。检测此制备物与鼠单克隆抗体(Mab)的反应，这些抗体针对位于表面抗原蛋白前S1、前S2和S区上的抗原决定簇，并检测在前S2区中是否存在人血清清蛋白聚合物的受体(pHSA受体)。

C1.与Mab S1.1的反应

用针对HBV表面抗原蛋白前S1抗原决定簇的鼠单克隆抗体(Mab)S1.1，通过ELISA法来检测复合颗粒上是否存在此位点。将Mab S1.1涂复在微量滴定板(Immunoplate I；Nunc，Gibco Europe，Ghent.Belgium)的小孔上，并与部分纯化的粗提物保温。洗涤去除未结合的物质后，根据Wilson和Nakame(1978)的方法，通过与偶联于辣根过氧化物酶的MabS1.1保温而揭示活性颗粒的捕获。

用邻苯二胺作为色原通过显色揭示第二抗体的结合。利用Intermed Immunoreader，NJ 2000(Analis，Ghent，Belgium)在490nm处读取吸光度(用620nm作为参考滤光器)。

在该试验中，多形汉逊酵母前S/S-B-431株的部分纯化的提取物呈现阳性反应，表明由特异于前S1区的Mab S1.1捕获并结合。由啤酒酵母RIT4376(Harford等，1987)纯化的只含有S蛋白的表面抗原颗粒在此试验中没有反应。

C2.与Mab S2.5的反应

鼠单克隆抗体S2.5针对HBV表面抗原的前S2区。在ELISA测试中用此Mab检测复合颗粒上是否存在前S2抗原决定簇。将Mab S2.5涂复在微量滴定板的小孔上，并与多形汉逊酵母前S/S-B-431的部分纯化的细胞提取液保温。如上所述与偶联于辣根过氧化物酶的Mab S2.5保温并显色，揭示出抗原的结合。在该试验中，多形汉逊酵母前S/S-B-431的部分纯化的细胞提取液呈阳性反应，表明表面抗原颗粒上存在前S2区抗原决定簇。由啤酒酵母RIT 4376纯化的只含有S蛋白的表面抗原颗粒在此试验中没有反应。

C3.与Mab RF1和S1.1(HRP)的反应

鼠单克隆抗体RF1(H.Thomas，Royal FreeHospital，London，U.K.)针对位于S区的依赖构象的抗原决定簇，将它用于ELISA试验中。用此Mab涂复微量滴定板的小孔，并与多形汉逊酵母前S/S-B-431株的部分纯化的提取物保温。通过与前面的C.1部分所述的与辣根过氧化物酶偶联的S1.1Mab保温而揭示出颗粒结合作用。多形汉逊酵母的部分纯化的提取物在此试验中产生阳性结果，而由啤酒酵母RIT4376纯化的表面抗原颗粒没有反应。

C4.检测pHSA受体

根据Pontisso等(1983)的方法，检测前S2区中是否存在pHSA受体。

将聚合的人血清清蛋白涂复在微量滴定板的小孔上，并与多形汉逊酵母前S/S-B-431株的部分纯化的细胞提取物保温。洗涤去除未结合的物质后，通过与I¹²⁵标记的多克隆抗HBsAg兔抗体(AUSAB药盒)保温而检测滴定板上捕获的颗粒。多形汉逊酵母的部分纯化的提取物在此试验中呈现阳性反应，而由啤酒酵母RIT4376纯化的HBsAg在此试验中没有反应。

上述结果表明，存在于多形汉逊酵母部分纯化的提取物中的HBsAg反应性物质，含有由针对HBV表面抗原的前S1、前S2和S区抗原决定簇的Mab特异结合的抗原位点，并且此物质还含有与pHSA反应的位点。

d)复合颗粒的免疫沉淀

为了确定多形汉逊酵母前S/S-B-431株的部分纯化的提取物的AUSRIA活性物质中是否含有复合颗粒，用特异于前S1蛋白的单克隆抗体进行免疫沉淀分析。

用经过福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(Staph A)细胞(Immunoprecipitin，BRL，Gaithesburg，MD，USA)捕获免疫复合物，利用兔抗小鼠血清作为单克隆抗体和Staph A细胞之间的夹层抗体。Staph A细胞根据厂家的建议进行预处理，并在最后洗涤后以10％(W/V)再悬浮于PBS中。然后，使Staph A细胞(120μl 10％W/V悬浮液)与20μl兔抗小鼠血清(RAM)在室温下保温2小时。离心收集Staph A-RAM复合物，用含有0.1％(V/V)吐温20的PBS洗涤2次，最后以大约10％(W/V)再悬浮于含有0.1％(V/V)吐温20的PBS中。

在按上述步骤得到的多形汉逊酵母前S/S-B-431株的部分纯化的颗粒制备物中，以及在酵母产生的S蛋白HBsAg颗粒样品(批号HB193，Smith Kline Biologicals，Rixensart，Belgium)中，加入1μl Mab S1.1(每ml含638μg蛋白)，上面两个样品都在500μl中含有2μg AUSRIA活性物质。将混合物于室温下保温2小时。然后加入20μl Staph A-RAM复合物，在4℃下继续保温过夜。离心收集所形成的免疫复合物，用含有0.1％(V/V)吐温20的PBS洗涤5次，再用PBS洗涤一次，然后将最终的沉淀再悬浮于样品缓冲液中进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。如下述通过免疫印迹法分析免疫沉淀物，用小鼠单克隆抗体RE6(H.Thomas，Royal FreeHospital，London)检测HBsAg蛋白分子。单克隆抗体RF6是针对血浆产生的HBsAg的对变性和还原作用有抗性的抗原决定簇，并在结合实验中与单克隆HBS1竞争。

免疫印迹分析表明，由多形汉逊酵母前S/S-B-431颗粒得到的免疫沉淀物不仅含有前S1蛋白，还含有S蛋白，而由酵母产生的HBsAg的免疫沉淀物不含有S蛋白。

此事实证明、在由多形汉逊酵母前S/S-B-431株细胞提取物部分纯化的物质中，存在由混合多肽组成的复合颗粒。

e)电镜分析

用电镜检查多形汉逊酵母前S/S-B-431株的部分纯化的HBsAg颗粒。在含0.1％(W/V)牛血清清蛋白的20mMTris-HCl缓冲液pH8.2中稀释物质，使之沉降在覆盖有火棉膜的铜/铑格栅上，然后用乙酸双氧铀染色。电镜检查结果表明，存在平均直径为27nm的球形至球形颗粒。用同样的技术测定了一系列由啤酒酵母RIT4376株纯化出的HBsAg制备物，27nm正好在这一系列颗粒的平均直径范围内(Petre，J.等，Postgrad.Medical Suppl.2：73-81，1987) 。实例D.5由多形汉逊酵母和啤酒酵母表达的复合颗粒的比较

按照“材料，5d”中所述，使多形汉逊酵母前S/S-C-453株和啤酒酵母Y1108株的培养物在S培养基中生长。Y1108株是一种双倍体啤酒酵母株，它由通过Ty载体整合在基因组中的表达盒表达前S1和S蛋白。此菌株含有5-7拷贝的前S1表达盒和3-4拷贝的S表达盒。此菌株的生长需要色氨酸。利用Ty载体构建这种表达盒并整合至染色体中的方法描述于共同未决的美国申请07/292202中，该申请是于1988年12月30日提交的，并已转让给Smith Kline Beckman Coporation，该申请列为本文参考文献。用1.5％(W/V)的甘油作为多形汉逊酵母生长的碳源。用多形汉逊酵母前S/S-C-453株接种一系列装有400ml培养基的2升锥形瓶，并在轨道摇床上于30℃下保温大约33小时，直到甘油耗尽。离心收集3个锥形瓶的细胞，细胞沉淀贮存于-70℃以待进一步处理。由另外6个锥形瓶中各取出100ml培养基，用100ml含有4％(W/V)甲醇的新鲜培养基代替。然后继续保温。

在甲醇存在下再保温14小时后离心收集3份培养物，38小时保温后再收集3份培养物。离心回收细胞，细胞沉淀贮存于-70℃待进一步处理。

在第二个实验中，如上所述培养啤酒酵母Y1108的培养物，并在保温19.5小时后收集。多形汉逊酵母前S/S-C-453的培养物也如上述进行培养，不同之处在于在甘油培养基中生长26小时后收集细胞和在含有甲醇的培养基中生长45小时后收集细胞。

使多形汉逊酵母的细胞沉淀以每份体积大约25％湿重细胞沉淀的浓度再悬浮于缓冲液中，该缓冲液中含有0.5％(W/V)吐温20、2mM EDTA、4mM PMSF(苯甲磺酰氟)、5％(W/V)异丙醇和50mM磷酸钠pH9.0。使10ml此混合物在法式压榨机中以20,000磅/英寸²通过6次以破碎细胞。然后，在4℃下以17,000g离心45分钟使细胞粗提液澄清，回收上清液。将啤酒酵母的细胞沉淀进行同样的处理，但细胞的再悬浮浓度为每体积上述缓冲液中含大约50％湿重细胞沉淀。

用Lowry等(1951)的方法测定每份上清液中的蛋白含量。通过AUSRIA检测澄清的细胞提取液中的HBsAg，通过ELISA检测法检测是否存在前S1蛋白抗原决定簇。如下所述进行单克隆S1.1的ELISA检测。用在50mM碳酸氢钠缓冲液pH9.6中的S1.1小鼠单克隆抗体涂复塑料盘(Nunc Immunoplate1，Gibco Europe，Ghent，Belgium)的小孔，在37℃下涂复2小时，然后除去抗体溶液。然后，通过与含有1％(W/V)牛血清清蛋白的PBS液溶在37℃下保温1小时而阻断小孔。然后在小孔中加入以PBS、0.2％(W/V)牛血清清蛋白作2倍连续稀释的细胞提取液，并在37℃下保温1小时。

然后，将小孔用0.9％(W/V)NaCl、0.05％(W/V)吐温20洗涤3次。用Wilson和Nakane(1978)的方法通过与偶联于辣根过氧化物酶的单克隆抗体S1.1保温而显示出抗原的捕获。

在每个孔中加入在PBS、0.2％(W/V)牛血清清蛋白中的结合抗体，于37℃保温1小时。加入100μl含有4mg邻苯二胺(Sigma)、15μl溶于10ml 0.1M KH₂PO₄ pH6.0中的过氧化氢的溶液，并在室温下保温15分钟而揭示出第二抗体的结合。加入25μl 1N H₂SO₄阻断反应，利用IntermedImmunoreader，NJ200(Analis，Ghent，Belgium)在490nm处读取光密度(用620nm作为参考滤光器)。由所得到的光密度曲线的线性部分计算出结果，并表示为每mg蛋白的光密度单位。

表4和表5显示了由两个实验的啤酒酵母和多形汉逊酵母细胞提取物测定的AUSRIA反应性HBsAg和前S1蛋白的量。啤酒酵母Y1108株粗提物中的AUSRIA反应性物质的量，比在甲醇中诱导了38-45小时的多形汉逊酵母前S/S-C-453提取物少大约100倍。用ELISA法检测的前S蛋白量少大约3-8倍，这表明啤酒酵母Y1108株比多形汉逊酵母前S/S-C-453株产生的前S1蛋白与S蛋白比例更大。

表4细胞粗提液的AUSRIA检测

前S1蛋白

ELISA；细胞提取液瓶号蛋白 HBsAg(AUSRIA)％每mg蛋白

(mg/ml) 总蛋白的OD单位啤酒酵母 a 16.2 0.011 2.9Y1108 b 18.0 0.008 3.0

c 12.0 0.010 4.4多形汉逊酵母 a 6.8 0.077 2.4前S/S-C-453 b 7.4 0.123 2.3甘油培养物 c 9.2 0.143 1.7

a 5.5 1.15 9.2甲醇诱导

b 7.0 1.40 11.338小时 c 7.4 1.46 8.8表5细胞粗提液的AUSRIA检测

前S1蛋白

ELISA每细胞提取液瓶号蛋白 HBsAg(AUSRIA)％ mg蛋白的蛋白 (mg/ml) 总蛋白 OD单位啤酒酵母

a 13.3 0.009 8.3Y1108 b 15.0 0.015 9.7

c 17.1 0.013 8.9多形汉逊酵母 a 8.4 0.070 1.3前S/S-C-453 b 8.2 0.061 0.3甘油培养物 c 7.9 0.082 0.3

a 6.3 1.106 4.1甲醇诱导

b 6.5 1.314 6.845小时

c 7.7 1.688 5.1

通过免疫印迹分析证实了这些结果，即分析来自第一实验的提取物，以及作为对照的甲醇诱导的菌株454和448-C4培养物的提取物。

根据Laemmli(1971)的方法，使含有15μg蛋白的样品通过12.5％分离胶、5％浓缩胶进行电泳，并如上面的“材料和方法5a”所述，用单克隆HBS1进行检测作免疫印迹分析。

来自菌株前S/S-C-453的提取液在与S蛋白相关的24KD处显示出强活性带，还在与前S蛋白相关的38-39KD显示出一个条带。很难检测出45KD的条带。相反，啤酒酵母Y1108株的提取液在24KD和45KD处显示弱带。很难检测出前S蛋白的38-39KD双带。免疫印迹分析结果证实，啤酒酵母表达的S和前S蛋白比甲醇诱导的多形汉逊酵母表达的少，而且，由啤酒酵母表达的前S蛋白主要是糖基化形式的45KD蛋白。实例D.6

前S蛋白在多形汉逊酵母中的肉豆蔻酰基化

使菌株LR9、菌株452和453的培养物在摇瓶中生长，首先在含有2.5％V/V甘油的基本培养基中生长24小时，然后加入甲醇(1％，V/V)。加入甲醇6小时后，加入氚标记的肉豆蔻酸，将培养物再保温16小时。收集细胞，洗涤后在1％SDS和β-巯基乙醇存在下用玻璃珠破碎。提取出的蛋白用SDS-PAGE凝胶电泳法分离，用单克隆HBS1通过免疫印迹分析以及通过荧光照相来观察。结果表明，在菌株452和453的提取物中，相应于38/39KD前S1蛋白的条带被标记，而在IR9的提取物中则没有。这与转译后N端甲硫氨酸的去除及该多肽第二位的甘氨酸残基的肉豆蔻酰基化是一致的(Towler和Gordon.Ann.Rev.Biochem.57：69-99，1988)。实例D.7

多形汉逊酵母的前S抗原的免疫原性

由甲醇培养的452和454菌株培养物制备蛋白粗提物，并以1mg/ml的终浓度吸附在氢氧化铝上。用单克隆抗体S1.1以ELISA检测法测定每份提取物中的前S1抗原决定簇含量，用从啤酒酵母中部分纯化的前S1蛋白作为标准。用于注射的免疫复合物也如下所述形成：使600μl S1.1单克隆抗体与1ml SepharoseProtein G4 Fast Flow(得自Pharmacia LKB，Brussels，Belgium)于4℃下保温2小时。然后将混合物离心，用PBS洗涤，沉淀再悬浮于1ml PBS中。在3.4ml的每份细胞粗提液中加入250μl此悬浮液，将混合物于20℃下保温1小时。

保温后，将Sepharose Protein G/S1.1/粗蛋白混合物离心，沉淀再悬浮于10mM磷酸钠缓冲液中。使一半物质以1mg/ml的终浓度吸附在氢氧化铝上。

用4种制备物对以5只为一组的Balb/c小鼠进行腹膜内注射。一个月后，对小鼠腹膜内加强注射1μg吸附在氢氧化铝上的、由甲醇培养的453菌株培养物部分纯化的颗粒。小鼠在15天后放血。按照下面所述的同样方法，测定血清中的抗S、抗前S2和抗前S1抗体的滴度。

表6给出了在Balb/c小鼠中诱导出的各抗体滴度，以几何平均滴度表示。

结果表明，当小鼠用含有前S1-S2-S的提取液(菌株454)注射时，或用含有复合颗粒的提取液(菌株452)注射并用复合颗粒(菌株453)加强时，在小鼠体内诱导出抗前S抗体。

表6制备物注射抗原 α-HBS α-120-145 α12-32 α32-47

几何几何平均几何平几何平

的微克数

平均滴度(c) 均滴度均滴度

(a)(b) 滴度

(c) (c)菌株454 (mIU/m)粗提液 222 17755 688 240 612免疫沉淀 155 616 518 59 1400菌株452粗提液 48 124803 426 59 ＜100免疫沉淀 48 119903 487 64 784

注：

a)相对于来自啤酒酵母的前S1-S2-S抗原。

b)所有小鼠都在第30天加强注射由菌株453部分纯化的颗粒。

c)滴度表示为在检测中给出1.0 OD值的稀释度的倒数。E部分实例E.1含有单一或混合亚型的修饰的前S1-S2-S(L^*)和S抗原的复合颗粒的表达

(1)L^*(ad)编码顺序的构建

如下所述构建适于直接插入汉逊酵母表达载体pMPT-121(图11)的修饰的前S1-S2-S(L^*)编码顺序。用HindIII核酸内切酶消化下述的质粒pRIT 13192 DNA得到线性片段。使大约1ng的此DNA与寡核苷酸BC74和BC75混合，并进行聚合酶链反应(PCR)扩增。

PCR技术是公知的，公开于《PCR方法及应用指南》(Innes M.A.等编，Academic Press Inc.，SanDiego CA.1989)。

寡核苷酸BC74和BC75具有下面所示的顺序，它们用常规的氨基亚磷酸(Phosphoramidite)化学法合成。BC74 5′CCC AGA TCT AAG CTT ATT AAA TGT ATA CCC A 3′BC75 5′CCC GAA TTC AAA ATG GGG ACG AAT CTT TCT 3′

寡核苷酸BC74与pRIT 13192上L^*编码顺序的3′端具有同源性，还有HindIII和BglII限制位点延伸。寡核苷酸BC75与pRIT13192上L^*编码顺序的5′端具有同源性，并具有EcoRI位点和延伸至ATC密码子之前的短前导顺序。使大约1ng的pRIT 13192模板DNA与下述物质混合：50mM KCl；10mMTris-HCl pH8.3；1.5nM MgCl₂；0.01％(W/V)明胶；dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM；每种寡核苷酸引物各1μM；以及2.5单位Taq聚合酶，最终体积为100μl，使用市售的DNA扩增试剂(Gene Amp DNA AmplificationReagent药盒来自Perkin Elmer Cetus；可自得VanderHeyden，Brussels)。利用DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer Cetus；可自得Vander Heyden，Brussels)，使混合物进行25次变性(2分，92℃)、退火(2分，48℃)及延伸(2分，72℃)的循环。然后，使1ng这样得到的修饰的、扩增的L^*编码顺序片段，利用同样的寡核苷酸在同样的条件下进行第二轮再扩增，通过乙醇沉淀从反应混合液中纯化产物。

取大约250ng 870bp适配的L^*DNA片段的一份试样，用EcoRI和BglII核酸内切酶消化，并克隆在pBR327衍生质粒pRIT12555的EcoRI和BglII位点之间，从而产生pRIT13488。pRIT12555由pBR327复制子与通过插入人工接头而导入的BglII位点构成，该人工接头插在原来质粒的EcoRI和ClaI位点之间。

用EcoRI和BglII核酸内切酶消化适配的L^*片段的另一份试样，并插在质粒pMPT 121的EcoRI和BglII位点之间(图11)。这样便将L^*编码顺序置于表达质粒的MOX启动子和MOX终止区之间，该表达质粒适于通过转化导入多形汉逊酵母中。产生的质粒pL^*-11的DNA顺序分析表明L^*编码区顺序是正确的。

(2)S(ay)编码顺序的构建

pRIT13490是一个pBR322衍生质粒，它含有完整的前S2-S编码顺序，该质粒通过常规的重组DNA操作得自pRIT10601，后者含有克隆在pBR 322上的ay亚型乙肝病毒的完整基因组。pRIT 10601于1982年6月2日保藏于美国典型培养物收集中心(Rockville，MD)，保藏号为ATCC 39132。

本领域的专业人员将会理解，在下面所述的操作中，pRIT13490可由pRIT 10601或任何其他含有完整S(ay)编码顺序的克隆的HBV片段来代替。用HindIII核酸内切酶消化pRIT13490DNA使质粒线性化，并与上述的寡核苷酸BC74和寡核苷酸BC73混合，后者与pRIT 13490上的S编码顺序的5′端具有同源性，并有一个EcoRI位点及延伸至ATG密码子之前的短前导顺序。

BC73 5′CCC GAA TTC AAA ATG GAG AAC ATC ACA TCA 3′

如上所述，使经HindIII处理的pRIT 13490和寡核苷酸混合物经历2轮PCR扩增，产生由EcoRI和BglII限制位点邻接的700bp S(ay)编码顺序片段。用EcoRI和BglII核酸内切酶消化大约250ng的此物质，并克隆在pRIT 12555的EcoRI和BglII位点之间，从而产生pRIT 13438。通过DNA顺序测定确定了pRIT 13438上S(ay)编码顺序的正确性。

(3)L^*(ad/ay)编码顺序的构建

对用于构建pRIT 13488的大约1ng PCR扩增片段再进行2轮PCR扩增，此扩增在寡核苷酸BC75(见上述)和BC30的存在下进行，BC30具有如下顺序：

BC30 5′ACG AGT CTA GAC TCT GCG GTA 3′

BC30与来自ad亚型pRIT 10616 HBV克隆的S编码顺序的XbaI位点附近区域同源。从扩增反应中回收到一个280bp片段，取大约250ng此片段用EcoRI和XbaI核酸内切酶消化。

取大约1ng用以构建pRIT 13438的PCR扩增片段再进行2轮PCR扩增，此扩增在寡核苷酸BC74(见上述)和BC12的存在下进行，BC12具有如下顺序：

BC12 5′ATG GAG AAC ATC ACA TCA 3′

BC12与pRIT 10601和pRIT 10616上克隆的乙肝病毒粒子的S编码顺序的头6个密码子同源。在PCR扩增之后，取大约250ng 700bp片段用Xbal和BglII核酸内切酶消化。

经两种核酸内切酶消化的PCR扩增片段再与经EcoRI、BglII消化的pRIT 12555 DNA连接。

回收到一个质粒pRIT 13491，它由pRIT 12555与EcoRI-XbaI片段和XbaI-BglII片段组成，前一片段来自用以构建pRIT 13488的片段的PCR扩增，后一片段来自用以构建pRIT 13438的片段的PCR扩增。对pRIT 13491上的L*编码插段进行了DNA顺序分析，结果表明在S编码区的第5个氨基酸处导入了一个错误。为了改正此错误，用EcoRI和XbaI核酸内切酶消化用以构建上述pRIT 13488的PCR扩增片段，并用来取代pRIT 13491上含有此错误的相应的EcoRI-XbaI片段。产生的质粒pRIT 13489包括“杂交的”L*编码顺序，其中，由ATG起始密码子至XbaI位点的部分来自ad亚型病毒顺序，而从XbaI位点至终止密码子的部分来自ay亚型病毒顺序。相应的多肽将具有ay亚型。

来自pRIT 13489的EcoRI-BglII片段含有杂交的L^*(ad-ay)编码顺序，将它插在质粒pMPT-121的EcoRI和BglII位点之间，从而产生多形汉逊酵母表达载体pL^*13。

(4)在多形汉逊酵母中表达修饰的前S1-S2-S(L^*)和S抗原以形成复合颗粒。

构建了几个菌株，它们的特征是不同比例的L^*和S表达以及不同的总表达水平。这些差异是由每个基因组中的表达盒拷贝数不同而造成的。

如上所述用携有L^*(ad)表达盒质粒pL^*11转化多形汉逊酵母RB10株。转化作用产生几个菌株，它们的基因组中整合有不同数目的表达盒。这些菌株中有两个称为L13/1和L19/1，对它们进行更细致的分析。Southern杂交分析表明，这些菌株含有若干拷贝的L^*(ad)表达盒。利用单克隆抗体HBS1通过Western印迹分析检测了这些菌株的L^*(ad)表达水平。检测到相应于L^*抗原的33KD条带。当细胞培养在甘油培养基中然后加入甲醇时，所测定的表达水平大约为细胞总蛋白的0.5-2％。

表达L^*(ad)的菌株再用质粒pRB-S-322转化，该质粒携有在MOX启动子调控下的S(ad)基因。pRB-S-322见上述(见图7)。用庆大霉素抗性作为转化标记。利用上述方法得到了稳定的整合体。进一步详细研究所得到的两个菌株：菌株LMS9/1和菌株LMS26/2，二者都来自受体株L13/1。Southern杂交分析表明，这些菌株携有几个拷贝的L^*(ad)表达盒，以及几个拷贝的S(ad)表达盒。

如上所述，利用单克隆抗体HBS1和S1.1通过Western印迹法测定多形汉逊酵母转化体中的L^*和S抗原的表达。得到一个以不不同比例表达L^*和S抗原的菌株谱。HBS1抗体检测出相应于S抗原的24KD蛋白，以及相应于L^*抗原的30和33KD条带。特异于前S1区的S1.1抗体揭示出33KD的条带以及30KD的条带。估计菌株LMS9/1的L^*/S比例为大约1∶1，而菌株LMS26/2的大约为1∶10。当细胞在用甲醇诱导条件下培养时，估计表达水平占细胞总蛋白的大约5-6％。

糖基化研究表明，33KD蛋白代表糖基化形式的L^*抗原。使菌株LMS9/1和LMS26/2的蛋白粗提物与内切糖苷酶H保温时，33KD条带的表观分子量变为30KD。30KD是所预期的L^*抗原的分子量。因此，在多形汉逊酵母中产生的L^*抗原的一部分是“核心”糖基化的，而其余部分则是非糖基化形式的L^*。

为了测定颗粒形成，将来自LMS 9/1株的细胞粗提物进行CsCl密度梯度离心。利用抗体HBS1通过免疫印迹法分析各梯度组分。在1.18g/cm³密度处，观察到一个HBsAg反应性物质峰，其中包括24KD的S抗原和30及33KD形式的L^*抗原。此结果表明，在表达L^*和S多肽的多形汉逊酵母株中形成了复合颗粒。

在本发明进一步的变化中，通过进一步转化上述的菌株415而得到了共表达L^*和S蛋白的多形汉逊酵母株。菌株415携有50-100个S(ad)表达盒，它们都在MOX启动子的调控下，该菌株的特征是表达S抗原的水平高。

构建了一个含有卡那霉素抗性基因的L^*(ad)表达载体。由质粒pHK2中分离出一个3.5Kb的NruI片段，它编码在ADHI启动子和HARS顺序调控下的卡那霉素抗性基因(图6)。用NruI和SalI核酸内切酶消化质粒pL^*11，并用Klenow DNA聚合酶填平末端。NruI/SalI消化从pL^*11载体中去掉了HARS顺序。然后，使来自pHK2的NruI片段与pL^*11载体的平末端NruI-SalI大片段连接，从而导入卡那霉素抗性基因，并再导入了已被去掉的HARS顺序。产生的质粒称为pKL^*1或pKL^*10，这根据卡那霉素抗性基因盒的取向而定。pKL^*1的结构示于图12中。按照上面的“方法”中所述，可通过转化将这些质粒导入多形汉逊酵母中，并利用庆大霉素抗性进行选择。

菌株415用携有L^*(ad)表达盒的pKL^*1和pKL^*10进行转化，在选择庆大霉素抗性后得到稳定的转化体。进一步分析几个菌株。利用抗体HBS1进行Western印迹分析，结果显示出相应于S抗原的24KD蛋白以及分别相应于非糖基化和糖基化形式的L^*抗原的30和33KD条带。在这些由415产生的菌株中，L^*/S比例由菌株LMS05-14-1的大约1∶1至菌株LMS05-12-1的大约1∶20不等。在用甲醇进行完全诱导的条件下培养的菌株中，估计L^*/S抗原的表达水平高达细胞总蛋白的5-6％。在用pKL^*1转化的菌株和用pKL^*10转化的菌株之间没有观察到差别。

(5)L^*和S抗原的共表达产生具有混合亚型的复合颗粒。

为了得到产生具有混合亚型(ad/ay)的L^*/S颗粒的多形汉逊酵母株，用携有L^*(ad/ay)表达盒的质粒pL^*13转化多形汉逊酵母RB10。

能够得到表达L^*抗原的稳定克隆，再用携有S(ad)表达盒的质粒pRB-S-322进行转化，并选择庆大霉素抗性。通过Western印迹和AUSRIA检测分析来自第二次转化的稳定菌株，以测定L^*(ad/ay)和S(ad)抗原各自的表达水平，以及表面抗原表达的总水平。

也可用携有功能性庆大霉素抗性标记的pL^*13衍生物再转化表达S(ad)蛋白的菌株415，以产生表达L^*(ad/ay)和S(ad)多肽二者的稳定转化体，两种多肽以具有ad和ay两种亚型特异性的复合颗粒的形式表达。实例F.1构建编码非肉豆蔻酰基化的HBV大蛋白的质粒pRIT12979

图13和14概括了质粒pRIT 12979的构建。图13显示了构建携有ΔGly13L蛋白表达盒的大肠杆菌质粒pRIT 12998的步骤。图14说明了得到能够表达ΔGly13L蛋白的酵母质粒pRIT 12979的程序。

应当理解，Gly13残基是由表A所示的L蛋白编码顺序的第二个密码子编码的。

用于此构建的原料是质粒pRIT 12863，它是pBR 327的衍生物，含有TDH3启动子区和ARG3转录终止区(Cabezon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6594-6598，1984)，它们由BamHI、SmaI、EcoRI人工接头分开。将含有BglII位点的人工接头置于TDH3启动子顺序的上游。pBR 327描述于Soberon等，Gene 9：287-305(1980)中，由F.Bolivar(国立墨西哥大学分子生物学系)处得到。此质粒可根据共同未决的美国申请009,325所述的方法回收。

在pRIT 12863的人工接头区中，构建非肉豆蔻酰基化的L蛋白的表达盒。

质粒pRIT 12816是由pAS1(Rosenberg等，Methods Enzymol.101：123-164，1983)产生的大肠杆菌质粒，它携有HBV(adw血清型)大蛋白的编码区，该编码区邻接NcoI位点(重迭于L蛋白编码顺序中第12位密码子ATG)和在终止密码子之外的EeoRI位点。此质粒用常规的DNA重组技术构建(参见T.Maniatis等，同上)。

将质粒pRIT 12816用BstXI和EcoRI消化，回收编码前S1区N端部分的304bp BstXI-EcoRI片段，并与下述合成的BamHI-BstXI适配接头连接：

BamHI XbaI BstXI

GATCCCTCTAG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC C

GGAGATC TGG TTA TAA AGA CAA GGG TT.

将此片段插入预先用BamHI和EcoRI酶消化的pRIT 12863中，得到质粒pRIT 12996。合成的BamHI-BstXI适配接头携有前S1N端区，但不能提供正确的读码。而使TDH3启动子的ATG残基处存在有BamHI位点。通过下述操作提供正确的读码：用BamHI和XbaI消化pRIT 12996，然后用绿豆酶处理以去掉突出的延伸部分。然后连接。此操作产生质粒pRIT 12997。

最后，将来自pRIT 12816的839bp EcoRI片段以正确取向插入pRIT 12997和EcoRI位点中，以回收ΔGlyL蛋白的完整编码顺序。产生的质粒pRIT 12998含有编码L蛋白的表达盒，该蛋白缺失Gly13，因此不能作为肉豆蔻酰基转移酶的底物。

为了构建能够表达ΔGlyL蛋白的酵母质粒，用BglII和SalI消化质粒pRIT 12998。纯化出含有表达盒的5822bp BglII-SalI片段，并插入常规的酵母载体pRIT 12741中，此载体是一个pBR 327衍生物，它提供AmpR基因、2μ顺序、大肠杆菌复制子和LEU2酵母选择标记。

用产生的质粒pRIT 12979转化LEU-啤酒酵母10S₄₄cir°株(pep4-3，leu2-3，leu2-112)，它也称为TCY1或Y482，它保藏于美国典型培养物收集中心，保藏号为ATCC20818。转化后，产生的LEU＋酵母株称为Y720。实例F.2ΔGlyL蛋白与L蛋白的比较定性

检查实例F.1的酵母株Y720的ΔGlyL蛋白表达情况，并与表达L蛋白的酵母株Y587(用pRIT 12845转化的TCY1)作比较。pRIT 12845含有3370bp的表达盒，此表达盒由下述成分组成：由HBV DNA产生的编码L蛋白的389个氨基酸的顺序，在其5′端由1050bp的TDH3启动子片段邻接并受其调控，在其3′端由携有ARG3转录终止区的1150bp片段邻接。pRIT12845详细描述于共同未决的美国专利申请009,325的实例16A中。用酵母株Y1017作为阴性对照、它是用pRIT 12741转化TCY1产生的。

A.肉豆蔻酰基化

按照共同未决的美国专利申请009,325中所述的方法，用3H-肉豆蔻酸标记来自Y720、Y587和Y1017的细胞。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析这些细胞的SDS提取物，然后进行免疫印迹分析和荧光照像(参见例如Towler和Glaser，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2812-2816，1986)。

共同未决的美国专利申请009,325所述的免疫印迹法包括用S特异性单克隆抗体(Mab)检测，用Mab RF6(H.Thomas，Royal Free Hospital，London)或Mab HBs1(SmithKline Biologicals)都可以。这些抗体识别S蛋白中对变性和还原作用具有抗性的重迭抗原决定簇。免疫印迹结果表明，在Y720和Y587二者中，都表达了38kd和45kd两种形式的L蛋白。

荧光图象表明，在由共同未决的美国申请009,325所述的Y587细胞产生的38kd L蛋白中存在有3H标记。在由其产生的45kd L蛋白中观察到了少量标记。相反，由Y720细胞产生的38kd和45kdΔGly L蛋白都没有掺入标记。这一结果证实，在pRIT 12979中去掉甘氨酸密码子消除了ΔGly L蛋白在啤酒酵母中的肉豆蔻酰基化。

B.表达水平

将来自Y720、Y587和Y1017的细胞在同样的条件下培养在锥形瓶中，所用培养基为不含氨基酸但含有2％葡萄糖的YNB(Difco Labs)。按照共同未决的美国申请009,325所述，用定量免疫印迹法分析破碎的全细胞和粗提液。

分析2倍连续稀释的样品，以S特异性单克隆抗体RF6或HBS1，或以前S1特异性单克隆抗体S1.1(SmithKlineBiologicals)为基础进行免疫检测。免疫印迹分析表明，ΔGly L蛋白(Y720)的表达水平比Y587中的肉豆蔻酰基化的L蛋白高2-5倍。提取效率对于非肉豆蔻酰基化和肉豆蔻酰基化的蛋白似乎是大致相等的。45Kd糖基化形式的L蛋白的比例，没有因为肉豆蔻酰基化的消除而改变。

C.脂蛋白结构

对来自Y720和Y587细胞的粗提液进行CsCl平衡离心。通过免疫印迹法、AUSRIA检测法(Abbott Labs)以及利用单克隆抗体S1.1进行的特异于前S1抗原决定簇的ELISA检测法分析梯度组分，在ELISA检测法中，将单克隆抗体S1.1涂复在微量滴定板(Immunoplate I；Gibco Europe)的小孔上，并与试样保温。洗涤去除未结合的物质后，根据Wilson和Nakane(1978)的方法(《免疫荧光及相关技术》，W，Knapp等编，Elsevier，Amsterdam.1978)，通过与偶联于辣根过氧化物酶的单克隆抗体S1.1保温而显示出活性颗粒的捕获。用邻苯二胺作为色原以显色显示出第二抗体的结合。利用IntermedImmunoreader，NJ2000(Analis，Ghent，Belgium)在490nm处读取吸光度，用620nm作为参考滤光器。

抗原和免疫印迹图形是相同的。ΔGly L和野生型L蛋白的条带都位于大约1.25g/cm³密度处，表明在细胞粗提液中，肉豆蔻酰基化和非肉豆蔻酰基化的蛋白都以脂蛋白结构存在。对从CsCl平衡梯度中纯化的物质进行蔗糖梯度速度离心，结果表明含有脂蛋白结构的肉豆蔻酰基化和非肉豆蔻酰基化的L蛋白的沉降行为相同，说明这些脂蛋白结构具有相似的物理参数。实例F.3构建编码修饰的HBV L蛋白的质粒，该蛋白没有潜在的O-和N-糖基化位点，潜在的pHSA结合位点和潜在的蛋白酶敏感位点

图15和16概括了两种酵母载体的构建，即编码肉豆蔻酰基化修饰的L蛋白(L^*)的表达的pRIT 13192和编码非肉豆蔻酰基化修饰的L蛋白(ΔGly L^*)的表达的pRIT 13193。

pRIT 10616的保藏号为ATCC 39131，将它用BglII消化，将最大的片段连接在预先用BamHI消化的pAC 177复制子中(Chang和Cohen，J.Bacteriol.134：1141，1978)。用EcoRI消化所得到的中间质粒，再连接后得到pRIT 10633，它携有已切除了pACYC 184载体的不完整HBV基因组。

质粒pRIT 12331是一个pUC9(Amersham，U.K.和Pharmacea，Sweden) 的衍生物，它含有来自pRIT 10779(Cabezon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6594-6598，1984)的1500bp HindIII-NcoI ARG3启动子片段，该片段以正确取向与一个681bp NcoI-EcoRI片段融合，后一片段中含有S编码顺序，其NcoI位点重迭于ATG密码子，而EcoRI位点则在终止密码子之外并与其相邻，所述片段插在pUC9的HindIII和EcoRI限制位点之间。

用BstEn和XbaI酶消化pRIT 10633。用Klenow聚合酶填平648bp BstEII-XbaI片段中的BstEII延伸，此片段含有完整的前S1-前S2区以及S区的N端顺序。纯化此片段，并将其插在pUC12(Amersham)的SmaI和XbaI位点之间。产生的质粒是pRIT 13188。

用BalI和BamHI处理质粒pRIT 13188，使编码氨基酸残基52-133的前S1区缺失(氨基酸53和132的密码子包括在缺失中)。用Klenow聚合酶处理大片段并连接，产生重新形成了BamHI位点的质粒pRIT 13189。

用BamHI和XbaI消化pRIT 13189，使相应于残基145-175的前S氨基酸区的DNA(编码氨基酸146-174的密码子)缺失。使此载体与下述合成适配接头连接：BamHI延伸 NcoI延伸

GATCCCAGAGTCAGGGGTCTGTATTTTCCTGCTGGTGG

GGTCTCAGTCCCCAGACATAAAAGGACGACCACCGTACAspProArgValArgGlyLeuTyrPheProAlaGlyGly

135 145并与来自pRIT 12331的Ncol-XbaI片段连接，此片段含有S基因的N端部分。产生的质粒是pRIT 13190。

在pRIT 13190的XbaI和SalI位点之间插入来自pRIT12660的4145bp XbaI-SalI片段，从而加入S基因的C端区、转录终止ARG3区及LEU2酵母基因。(pRIT 12660含有由下述成分组成的3050bp表达盒：HBV DNA产生的编码M蛋白的281个氨基酸的顺序，其5′端由1050bp的TDH启动子片段邻接并在其控制之下，其3′端由携有ARG3转录终止区的1150bp片段邻接。pRIT 12660详细描述于共同未决的美国专利申请009,325中。)得到质粒pRlT 13191。

为了重新组成L^*和ΔGly L^*蛋白的表达盒，在pRIT 13191中插入与L蛋白N端编码区或ΔGly L蛋白N端编码区结合的TDH3启动子。

由pRIT 12845纯化出1234bp的EcoRI-BalI片段，它含有如上面和美国申请009,325所述的L蛋白编码顺序；由pRIT 12979中纯化出1227bp的BglII-BalI片段，它含有如上所述的ΔGly L蛋白编码顺序。

每个片段都与来自pRIT 13191的SacI-BamHI大片段混合，然后用T4聚合酶处理并连接。产生的质粒称为pRIT 13220和pRIT 13222。存在于pRIT 13220中的表达盒所含的编码顺序中，含有前S1顺序的12-52氨基酸残基，前S2顺序的133-145以及完整的S顺序(如表A所示)。pRIT 13222与pRIT13220基本相似，只是缺失了Gly13密码子(GGG)。

最后一个步骤是从pRIT 13220和pRIT 13222制备ClaI-ClaI片段，该片段分别含有L^*和ΔGly L^*蛋白的表达盒，将它们与来自质粒pRIT 12845的ClaI-ClaI片段连接，分别产生质粒pRIT 13192和pRIT 13193。

用后两个质粒转化啤酒酵母TCY1株，分别产生LEU⁺株Y1139和Y1140。实例F.4 L^*和ΔGlyL^*在酵母中的表达

将来自实例F.3的Y587(L蛋白)、Y1139和Y1140(分别为L^*和ΔGly L^*)的酵母粗提物，以及Y724(啤酒酵母对照株，没有插入表达盒)的粗提物进行SDS-PAGE，并用S特异性Mab HBs1或Mab S1.1作免疫印迹检测。Y1139和Y1140提取物显示出两个条带，估计分子量为大约33和30kd，它们由前S1和S特异性抗体二者特异识别。

用内切糖苷酶H(New England Nuclear或Boehringer)或糖肽酶F(Boehringer)处理提取物，结果使33kd条带消失，30kd条带增强。此结果表明，33kd条带代表实例F.3中糖基化形式的L^*和ΔGly L^*蛋白，这些蛋白带有一个N连接的高甘露糖型聚糖。

用³H肉豆蔻酸标记细胞培养物，然后对细胞提取液进行SDS-PAGE分析、蛋白印迹分析、以及荧光照像或免疫检测，结果表明，在来自Y1139的提取液中，在30kd条带处存在强烈的³H标记，在33kd处有较弱的³H标记掺入。存在于这些条带中的³H对羟胺处理有抗性。在来自Y1140提取物的相应蛋白条带中未观察到³H标记的掺入。此结果表明，在Y1139细胞中表达的L^*蛋白是酵母N-肉豆蔻酰基转移酶的底物，而从Y1140的ΔGly L^*蛋白中缺失了Gly13残基后，则防止了此蛋白的肉豆蔻酰基化。

对Y1189和Y1140的提取物进行CsCl平衡离心和蔗糖速度梯度离心分析，结果表明在提取物中存在有脂蛋白颗粒。实例F.5含有整合拷贝的S蛋白表达盒的酵母株Y1088和Y1295

构建在基因组中整合有几个拷贝的S表达盒的酵母株

A.酵母株Y1088

在共同未决的美国专利申请368,401中所述的以Ty为基础的线性载体pRIT 13133-L含有S蛋白的表达盒(TDH3启动子-S蛋白编码顺序-ARG3终止区)，用此载体转化两种接合型的啤酒酵母株10S69d(ura3、leu2、trp1、gal1、cir°)，此菌株描述于共同未决的美国专利申请368,401。使在其基因组中整合有几个拷贝载体的不同的单倍体转化体与相反接合型的单倍体株杂交。利用S DNA片段探针对从分离体中分离的基因组DNA进行Southern杂交分析。载体片段在四分体分析中呈现2/2分离。由此方法得到的一个单倍体分离体称为Y957，它含有5-7拷贝的载体pRIT13133-L。得到一个Y957的TRP⁺回复突变体，命名为Y1088。

B.酵母株Y1295

在共同未决的美国专利申请368,401中所述的以Ty为基础的线性载体pRIT 13034-L携有S蛋白的表达盒，此表达盒与pRIT 13133-L中的相同。pRIT 13034-L携有CUP1基因作为额外的标记，它可用于CUP1s或cup1Δ受体株中。

对于这种Ty线性载体来说，两个cup1Δ啤酒酵母单倍体株(CUP1基因在一个含有单拷贝此基因的菌株中被打断)是优选的酵母受体株。这些菌株具有各自的基因组：EJ cup1 3d(ura3，leu2，trp1，gal1Δ，cup1Δ，a)和EJ cup1Δ 7b(ura3，trp1，gal1Δ，cup1Δ，a)，这些菌株描述于共同未决的美国专利申请368,401中。

以Ty为基础的线性载体pRIT 13034-L含有S蛋白的表达盒，用它转化啤酒酵母株EJ cup1Δ 3d以及EJ cup1Δ7b。分离URA3转化体，并筛选对铜毒性的抗性。抗性较强的转化体似乎含有2-5拷贝的整合载体。对这些菌株进行传统的遗传杂交，并选择LEU-TRP-单倍体分离体，结果产生含有4-5拷贝S表达盒的单倍体株。此菌株的TRP+回复突变体命名为Y1295。实例F.6共表达S和L抗原的酵母株的构建

酵母质粒pRIT 12845(L蛋白)、pRIT 12979(ΔGlyL蛋白，实例F.1)、pRIT 13192(L^*蛋白，实例F.3)、pRIT 13193(ΔGly L^*蛋白，实例F.3)和pRIT 12914(未插入肝炎基因)都被用来转化酵母株Y1088，使之转化为LEU⁺。得到的酵母株分别命名为Y1301(S，L)、Y1302(S，ΔGlyL)、Y1142(S，L^*)、Y1261(S，ΔGly L^*)和Y1141(只表达S蛋白的对照株)。

同样，将pRIT 12845、pRIT 12979、pRIT 13192、pRIT 13193和pRIT 12377(未插入肝炎基因)导入酵母株Y1295中。得到的酵母株分别命名为Y1304(S，L)、Y1305(S，ΔGly L)、Y1306(S，L^*)、Y1307(S，ΔGly L^*)和Y1308(只表达S蛋白的对照株)。

对细胞粗提物进行免疫印迹分析证实了S和L蛋白的共表达。在上述每一种菌株的提取物中，印迹与特异于S抗原决定簇的MabHBs1的反应揭示出一个估计分子量为大约23kd的条带，它迁移至预期的S蛋白位置处。

来自Y1301、Y1302、Y1304和Y1305的提取物除了23kd条带之外，还显示出38kd和45kd条带，它们的迁移类似于美国专利申请009,325和本文的实例F.2所述的非糖基化和糖基化形式的L蛋白。用内切糖苷酶H处理提取物。使45kd条带转化成41kd条带，而23kd和38kd条带未受到影响。

来自Y1142、Y1261、Y1306和Y1307的提取物除了23kd条带之外，还显示出30kd和33kd条带，它们的迁移类似于实例F.4所述的非糖基化和糖基化形式的L^*和ΔGly L^*蛋白。用内切糖苷酶H处理提取物，使33kd条带转化成30kd条带，此结果与实例F.4所述的结果一致。

用³H肉豆蔻酸标记细胞，对提取物进行SDS-PACE分析，再进行免疫印迹和荧光照像分析，结果证实，在38kd(来自Y1301和Y1304的提取物)和30kd条带(来自Y1142和Y1306的提取物)中存在对羟胺处理有抗性的³H标记，而在45kd(来自Y1301和Y1304的提取物)和33kd(来自Y1142和Y1306的提取物)蛋白带中只有少量的³H标记。来自Y1302、Y1305、Y1261和Y1307的提取物中，相应的条带不含有可检测的³H标记。

在免疫印迹中，38kd和45kd形式的L和GlyL蛋白被前S1特异性Mab S1.1和MA 18/7(W.H.Gerlich，University of Gttingen，FRG)、前S2特异性MabS2.4、S2.5、S2.7、S2.8、S2.9和S2.10(SmithKline Biologicals)识别。30kd和33kd形式的L^*和ΔGly L^*蛋白被Mab S1.1(识别存在于氨基酸顺序12-32中的抗原决定簇)、MA 18/7(识别存在于氨基酸顺序28-47中的抗原决定簇)和S2.5(识别存在于氨基酸顺序133-145中的抗原决定簇)识别。据报道，单克隆MA 18/7抑制病毒颗粒与肝细胞膜的结合(Pontisso P.等，Virology 173：522-530，1989)。30kd和33kd形式的L^*和ΔGlyL^*蛋白不被Mab S2.4、S2.8、S2.9(它们在ELISA检测中不与肽120-145反应)识别，也不被Mab S2.7和S2.10(它们可能识别位于氨基酸120-137中的抗原决定簇)识别。ELISA检测表明，单克隆F35-25(得自M-APetit，INSERM unité131，Clamart，France)与从菌株Y1307中纯化出的颗粒结合，但不与S颗粒结合。已经证实，此单克隆识别的肽顺序(Petit M-A等，Molec.Immunol.26：531-537，1989)与病毒与Hep G2肝癌细胞的结合有关(Neurath等，Cell 46：429-436，1986)。进一步发现(S，L^*)颗粒与Hep G2肝癌细胞结合，并发现可用单克隆F35.15防止此结合及乙肝病毒颗粒的结合(PetitM-A等，《1990年国际病毒性肝炎及肝病会议论文集》摘要105。Houston，USA，1990年4月4-8日)。Mab Q 19/10(W.H.Gerlich，University of Gttingen，FRG)识别糖基化依赖性前S2抗原决定簇(Heermann等，《病毒性肝炎和肝病》，A，Zuckerman和Alan R.Liss编，Inc.NewYork，697-700页，1988)并与45kd形式的L和GlyL蛋白反应，但它不与30或33kd形式的L^*或ΔGly L^*蛋白反应。这些结果与导入L^*和ΔGly L^*蛋白中的氨基酸缺失相一致。实例F.7 S和L或修饰的L蛋白的共表达导致具有混合亚基组成的颗粒的形成

根据厂商的说明(Abbott Lab)，对实例F.6所述的每种菌株的提取物进行AUSRIA检测，所得到的阳性结果证实它们都含有与HBsAg相关的抗原性。在ELISA-S1.1检测中，来自Y1301、Y1302、Y1142、Y1261、Y1304、Y1305、Y1306和Y1307的提取物都显示阳性反应，但来自Y1141和Y1308的提取物没有阳性反应。进行CsCl平衡离心时，AUSRIA和ELISA-S1.1阳性物质同时在1.2g/cm³密度附近形成条带。免疫印迹证实了抗原性图形，表明存在于粗提物中的蛋白分子同时在AUSRIA和ELISA-S1.1阳性峰中形成条带。对来自CsCl平衡梯度的经透析的峰组分进行蔗糖速度梯度离心，结果表明由AUSRIA、ELISA-S1.1和免疫印迹法测定的S和L蛋白或修饰的L蛋白共沉降。此结果证实，S和L或修饰的L蛋白被装配成脂蛋白颗粒。

利用与Mab S1.1的免疫沉淀反应来证实S和L或修饰的L蛋白结合成一个物理实体，即具有混合亚基组成的颗粒。由单独或一起表达S和L或修饰的L蛋白的酵母株制备提取物，例如由Y1139(L^*蛋白，实例F.3)、Y1141(S蛋白，实例F.6)和Y1142(S和L^*蛋白，实例F.6)制备提取物。通过CsCl离心形成条带和峰组分的透析而半纯化出颗粒以后，使颗粒与MabS1.1进行免疫沉淀反应。用来自Y1139和Y1141的颗粒的混合物作额外的对照。L^*蛋白在每种情况下都免疫沉淀下来。仅在与来自Y1142的颗粒的反应中观察到了S蛋白与L^*蛋白的共沉淀。

其他共表达S和L或修饰的L蛋白的酵母株(Y1301、Y1302、Y1261、Y1304、Y1305、Y1306、Y1307)得到同样的结果。实例F.8含有修饰L蛋白的颗粒的稳定性和pHSA结合作用

使Y1142和Y1161的细胞粗提物在37℃下保温4小时或在4℃下保温65小时，分析L^*和ΔGly L^*蛋白对酵母蛋白酶蛋白降解作用的敏感性。

用Y1301和Y1302的提取物作为L和ΔGly L蛋白的比较源。在保温前后用免疫印迹法分析提取物，结果表明，L和ΔGly L蛋白在保温后几乎完全消失，而L^*和ΔGly L^*蛋白仍然很容易检测到。

使菌株Y1306和Y1307的纯化的颗粒制备物在37℃下保温7天，用SDS-PAGE和银染色法检查以显示多肽。没能观察到可检测的L^*或S多肽的降解。

按照修改的Pontisso等(J.Virol.Methods 6：151-159，1983)所述的pHSA结合检测法，测定通过CsCl离心形成条带而从Y1142得到的颗粒。用戊二醛聚合的人血清清蛋白(5μg/ml pHSA在PBS中，37℃2小时)涂复微量滴定板(Immunoplate I；Nunc，Gibco Europe)，通过与含有1％牛血清清蛋白(BSA)的PBS保温(37℃1小时)，使滴定板上的非特异性蛋白结合位点饱和。用含有0.2％BSA的PBS连续稀释试样，使之与经pHSA涂复的滴定板相互作用(37℃1小时)，用偶联于非限制浓度的辣根过氧化物酶的抗S单克隆抗体(RF1.H.C.Thomas，Royal Free Hospital，London)检测结合的颗粒(37℃1小时)(该抗体在含有0.2％BSA的PBS中)，并用H₂O₂和邻苯二胺作为底物进行显色。在保温之间，用含有0.05％吐温20的0.15M NaCl洗涤滴定板。

用来自Y1141的颗粒作为阴性对照，用来自含有pRIT12660的10S44C cir°株的纯化颗粒作为阳性对照。与来自携有pRIT 12660的10S44C cir°的颗粒相比较，Y1142产生的颗粒的pHSA结合能力大大下降(残余活性2％)。

来自菌株Y1306和Y1307的纯化颗粒制备物也检测不出pHSA结合。实例F.9

含有L^*蛋白的颗粒的免疫原性

在Balb/c小鼠中研究本发明的(S，L^*)颗粒的免疫原性。通过CsCl离心形成条带而部分纯化由Y1142(S，L^*)或Y1141(S)产生的颗粒，并吸附在Al(OH)₃上。在第0天和第30天，用每种抗原制备物的50或5μg总蛋白(相应于1或0.1μg由AUSRIA检测的抗原)注射各组小鼠，每组八只。在第45天对小鼠放血，利用各自的血清进行不同的检测，用AusAb药盒(Abbott，USA)测定抗HBs抗体，并利用Hollinger公式以mIU/ml表示(Hollinger等，《病毒性肝炎》，Szumness等，Franklin Institute Press，Philadelphia 451-466页，1982)。

利用直接ELISA检测法测定抗前S抗体，其中，使选定的合成肽(肽12-32、肽32-47和肽120-145)吸附在微量滴定板(Immunoplate I；Nunc，Gibco Europe)的聚苯乙烯壁上。吸附作用在4℃下过夜，每孔中有100μl的吸附溶液，其中含有0.5μg/ml肽和0.05M Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液pH9.6。使平板与250μl含有5％胎牛血清的PBS在37℃下保温1小时，从而阻断滴定板上的非特异性位点。

用含有1％小牛血清、0.05％吐温20的PBS 2倍连续稀释小鼠血清，然后使之与肽涂复的滴定板在37℃下反应2小时(每孔100μl)。洗涤后，用生物素化的羊抗小鼠Ig(Amersham，用含有1％胎牛血清、0.05％吐温20的PBS稀释500倍，每孔100μl，在37℃下保温1小时)，然后用抗生蛋白链菌素-生物素化辣根过氧化物酶复合物(Amersham，用含有1％胎牛血清、0.05％吐温20的PBS稀释1000倍，每孔100μl，在37℃下保温1小时)检测结合的抗体。

在保温之间，用0.15M NaCl、0.05％吐温20洗涤滴定板。最后用H₂O₂和邻苯二胺作为色原进行显色(15μl H₂O₂和4mg邻苯二胺在10ml 0.1M磷酸钾缓冲液pH6.0中，每孔100μl)。20分钟后加入25μl 1N H₂SO₄终止反应，用Intermed Immunoreader，NJ2000，Analis在490nm处测量吸光度。计算给出光密度1.00的最高稀释度的倒数作为每种血清的滴度。

表7显示了在Balb/c小鼠体内诱导的各抗体的滴度，以几何平均滴度表示。

表7

α-HBs几 α120- α12-32 α32-47

何平均滴度 145几几何平均几何平均

剂量 (mIU/ml) 何平均滴滴度^* 滴度^*颗粒来源(μg) 度^*Y1142 50 304000 629 5222 2255(S，L^*) 5 234000 212 1490 785Y1141 50 128000 202 211 ＜200(S) 5 29000 ＜200 203 ＜200

(^*)滴度以OD为1.0的稀释度的倒数表示。

使从菌株Y1307(S，ΔGlY L^*)或菌株RIT 4376(Petre J.等，Postgrad.Med.J.63(Suppl.2)：73-81，1987)纯化出的颗粒吸附在Al(OH)₃上，并在第0天和第30天注射各组Balb/c小鼠，每组为10只。在第45天将小鼠放血，如上所述检查合并的免疫血清中是否存在抗S和抗前S抗体。表8给出了在Balb/c小鼠中诱导的各抗体滴度。

表8

剂量 α-HBs颗粒来源 μg (mIU/nl) α12-32^* α32-47^*Y1307 1 7335 3128 658(S，ΔGly L^*)RIT4376 1 5232 ＜100 ＜100(S)

(^*)滴度以在检测中OD为1.0的稀释度的倒数表示。实例F.10

通过Ty1介导的同源重组使L^*表达盒在啤酒酵母基因组中整合

需要将本发明的L^*和S蛋白表达盒都整合至宿主基因组中，以提供遗传上稳定的菌株，并避免产生20-30％的无质粒细胞，而这一现象是用以2μ为基础的啤酒酵母载体时常见的。

按照共同未决的美国专利申请009,325和Jacobs等(Gene80：279-291，1989)对载体pRIT 13009-p所述的方法，构建质粒pRIT 13459和pRIT 13460。从载体pCV9(Petes等，Cell 19：765，1980)中分离出2200bp XhoI-SalI片段形式的LEU2基因，将其插在pRIT12927的TY1成分的两个SalI位点之间取代原来的片段，产生质粒pRIT 13144。将来自实例F.3所述的pRIT 13220的携有L^*表达盒的3050bp HindIII-KpnI片段用T4聚合酶处理，然后连接至pRIT 13144上剩余的SalI位点中(此位点已用T4聚合酶处理)，用大肠杆菌株XL1-Blue作转化受体。XL1-Blue描述于Hanahan D.，J.Mol.Biol.166：557-580(1983)中，并可从Stratagene(11099 North Torrey PinesRoad，La Jolla，California)买到。得到两种取向的HindIII-KpnI表达盒片段的插入。pRIT 13459含有的盒ARG3终止区邻近LEU2基因，而pRIT 13460含有的盒TDH3启动子邻近LEU2基因。

用Hinnen等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1929，1978)的方法，用1％琼脂糖凝胶由pRIT 13459和pRIT13460中纯化出大约7700bp的XhoI大片段，并用它将菌株EJcup1Δ3d(见上面的实例F.5)转化成亮氨酸独立型。

用两种片段都得到了LEU⁺转化体，每个系列取12个集落通过Western杂交法分析其L^*蛋白的表达，并通过Southern杂交法分析整合表达盒的数目。在用来自pRIT 13459的片段转化EJcup1Δ3d后，保留一个菌株Y1528，它显示的L^*表达水平与Y1306相等，并含有3-5拷贝的表达盒。在用来自pRIT13460的片段转化EJ cup1Δ3d后，保留一个菌株Y1529，它的性质与Y1528相似。

使Y1528和Y1529都与菌株Y1295和其trp^-亲本株Y1215(见上面的实例F.5)以及与菌株Y1367接合，从而形成下述的二倍体：Y1528×Y1295＝Y1586，Y1528×Y1215＝Y1587，Y1528×Y1367＝Y1588，Y1529×Y1295＝Y1589，Y1529×Y1215＝Y1590，Y1529×Y1367＝Y1591。利用实例F.5中构建Y1295所用的菌株和方法得到了菌株Y1367，它是α，leu2，trp1型，含有6-8拷贝的与菌株Y1295相同的S蛋白盒。

利用上述的试剂和方法，即实例F.2和F.6中的试剂和方法，通过Western杂交法、AUSRIA检测和抗原决定簇特异性ELISA测定法，由上述二倍体菌株中筛选其表面抗原表达水平以及颗粒中L^*和S多肽的比例。用Southern杂交法测定整合表达盒的数目和稳定性。如果需要，可使二倍体菌株形成孢子而得到单倍体分离体，然后可如上所述筛选其表达水平和遗传稳定性。

可将来自pRIT 13222的3050bp HindIII-KpnI片段插在pRIT 13144上，并可接上述程序继续进行，产生整合有ΔGly L^*表达盒拷贝的啤酒酵母株和表达S，ΔGly L^*颗粒的菌株。

在进一步的具体方案中，将L^*表达盒插在类似于pRIT13134-P(Jacobs等，Gene 80：279-291，1989)的载体中，此载体携有作为选择标记的URA3和CUP1基因，它们插在pRIT 12927的Ty1成分中。此载体被命名为pRIT 13501，从中可回收到带有上述成分的大约6500bp的BglII片段，它可通过选择URA⁺转化体而转化并整合至合适的酵母宿主中。转化后，根据共同未决的美国申请07/368,401中公开的方法，通过选择较高水平的铜抗性，可使整合表达盒的数目大为增加。实例F.11

具有ad和ay亚型决定基的S，L^*混合颗粒的表达

如下所述构建具有ay亚型L^*蛋白表达盒的整合载体：使编码ad亚型S蛋白C端部分和ARG转录终止区部分的XbaI-SacII片段与来自ay亚型S基因的相应片段交换。用XbaI和SacII核酸内切酶消化质粒pRIT 13459(实例F.10)，用1％琼脂糖凝胶纯化出最大的片段，并与来自pRIT 10780的纯化的1000bpXbaI-SacII片段连接，产生pRIT 13500。pRIT 10780公开于De Wilde等，Develop.Biol.Standard 59：99-107(1985)中。

pRTT 13500上的L^*编码顺序的组成为与ad特异性病毒ATG密码子至XbaI位点顺序相同的DNA，以及由ayw特异性病毒XbaI位点至终止密码子产生的DNA。表达的L^*多肽将具有ay亚型决定基。

来自pRIT 13500的大约7700bp的XhoI片段能整合进酵母基因组中，按照上述方法能使产生的转化体与Y1295和Y1367这样的菌株接合，得到表达混合颗粒的菌株，其中，L^*多肽是ay亚型的，而S多肽则是ad亚型的。

上面的描述和实例是为了说明而并非限制本发明。例如，可对L蛋白作出多种其他修饰，例如除了在实例中提及的以外，还可使L蛋白部分去糖基化或结合本文所述的各种修饰作用，从而产生修饰的L蛋白和含有合适组成的这些修饰的L蛋白的具有混合或均一亚基组成的颗粒，并用作疫苗。

可能作出的其他修饰包括再导入前S顺序；导入由非被膜基因的HBV蛋白编码顺序产生的编码顺序，如来自HBV核心基因的顺序，或来自其他病原体的免疫学上有重要作用的氨基酸区的编码顺序。可用其他的已知载体组分取代实例中所用的特异标记基因、启动子和人工接头顺序等。可以使用其他类型的宿主细胞。这些实例中所用的宿主细胞、载体和载体组分是说明性的，可由本领域的专业人员用其他菌株或修饰来代替。本发明包括下列权利要求范围所包括的所有改进和修改。本发明涉及的多形汉逊氏酵母ura3-RB10 DMS5215菌株，质粒pHK2DMS5328已于1991年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号分别为CCTCC No：M90042和CCTCC No：M90043。

参考文献Burrell et al.Nature 279，43-47(1979)Charnay et al.，Proc.Natl.Acad.

Sci. USA 76，2222-2226(1979)Cregg et al.，Mol.Cell.Biol.5，3376-3385(1985)Dehoux et al.，Gene 48，155-163(1986)Eble et al.，Mol.Cell.Biol.6，1454-63(1986)Eckart et al.，Klonierung and Charakterisierung derGene für die Dihydroxyacetonsynthase andMethanoloxidase aus der methylotrophen Hefe Hansenulapolymorpha，Ph.D.Thesis，University Düsseldorf(1988)Ellis et al.，Mol.Cell.Biol.5，1111-1121(1985)Galibert et al.，Nature 281，646-650(1979)Grindley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，7176-7180(1980)Harford et al.，Postgrad.Medical J.63，Suppl.2.65-70(1987)Heermann et al.，J.Virol.52，396-402(1984)Hitzemann et al.，Nature 293，717-722(1981)Imamura et al.，J.Virology 61.3543-3549(1987)Itoh et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.138，268(1986)Jacobs et al.，Gene 67，259-269(1988)Janowicz et al.，Nucl.Acid Res.13 3043-3062(1985)Jimenez and Davies， Nature 287，869-871(1980)Kingsman et al.，Biotech Gen.Eng.Res.3，377(1985)Klebe et al.，Gene 25，333-341(1983)Kniskern et al.，Hepatology 8，82-87(1988)Khler and Milstein，Nature 256，495-497(1975)Laemmli，Nature 227，680-685(1970)Langley et al.，Gene 67，229(1988)Ledeboer et al.，Nucleic Acid Res.13，3063-3081(1985)Lowry et al.，J.Biol.Chem.193，265-275(1951)Maniatis et al.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(1982)Maxam and Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，560-564(1977)McLachlan et al，WO88/06185(1988)Michel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，7708-7712(1984)Milich et al.，Science 228，1195-1199(1985)Milich et al.，Immunology Today 9，380-386(1988)Murray et al.，EP-A-13828(1980)Ou et al.，J.Virol.61，782(1987)Persing et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，3440-44(1985)Pontisso et al.，J.Virological Methods 6，151-159(1983)Roggenkamp et al.，Mol.Gen.Genetics，302(1986)Rutgers et al.，Viral Hepatitis and Liver Disease；Eds.A.S.Zuckermann A.R.Liss，New York 304-308(1988)Rutgers et al.，Biotech 6，1065-1070(1988)Schwartz and Cantor，Cell 37，67(1984)Sninsky et al.，Nature 279，346-348(1979)Southern，J.Mol.Biol.98，503-517(1975)Stinchcomb et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 77，4559-4563Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，1035-1039(1979)Szmuness et al.，New England J.Med 303，833-841(1980)Tschopp et al.，EP-A-0 226 846Tschumper and Carbon，Gene 10，157-166(1980)Towbin et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 76，4350-4354(1979)Valenzuela et al.，Nature 280，815-819(1979)Valenzuela et al.，Nature 298，347(1982)Valenzuela et al.，Biotech.3，317(1985)Wilson and Nakame in″Immunofluorescence and RelatedTechniques″(W.Knapp et al.，eds.，Elsevier，Amsterdam).

Claims

1.一种生产乙肝病毒的经修饰的L蛋白的方法，所述蛋白的氨基酸序列由乙肝病毒的ad或ay亚型的L蛋白的部分氨基酸序列组成，其特征在于该蛋白的氨基酸序列或者由(a)所述L蛋白的残基12-52，后面是残基133-145，后面是残基175-400组成；或者由(b)所述L蛋白的残基12，后面是残基14-52，后面是残基133-145，后面是残基175-400组成；所述方法包括：(i)制备含有编码所述蛋白，并与调控序列可操作相连的DNA序列的表达载体；(ii)用该载体转化选自酵母细胞的宿主细胞；(iii)在合适的培养基中培养该宿主细胞，从细胞裂解液中或所述培养基的提取物中分离所述蛋白。

2.根据权利要求1的方法，其中宿主细胞选自酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、Kluyveromyces和裂殖酵母属。

3.根据权利要求2的方法，其中宿主细胞选自啤酒酵母和多形汉逊酵母。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中经修饰的L蛋白以颗粒的形式表达，并同时表达乙肝表面抗原的S蛋白，该方法包括培养一种还用能够表达所述S蛋白的DNA重组载体进行了转化的酵母细胞，并从细胞裂解液或提取物中分离混合亚基组成的蛋白颗粒。

5.根据权利要求4的方法，其中具有混合亚基组成的颗粒具有(L^*，S)式，其中L^*是指乙肝病毒的经修饰的L蛋白，其氨基酸序列包括L蛋白的残基12-52，后面是残基133-145，后面是残基175-400，而S是指乙肝表面抗原的S蛋白。

6.根据权利要求4或权利要求5的方法，其中S蛋白是ad亚型的，而经修饰的L蛋白是ay亚型的，或者相反。