CN1258317A - 登革病毒基因表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域并涉及重组DNA技术,具体地,涉及在毕赤酵母属甲基营养酵母中表达编码血清型2和4登革病毒包膜蛋白的基因的方法。技术目的是开发有效表达编码血清型2和4登革病毒包膜蛋白的基因的系统以得到用于人类接种的免疫原。编码病毒蛋白E的基因序列是血清2型登革病毒的起点,来自1981年古巴登革热和出血登革热流行期间分离的毒株A15。对于血清4型登革病毒,起点是编码病毒蛋白E的基因序列,病毒来自1981年多米尼加共和国登革热流行期间分离的毒株814669。
Description
技术分支
本发明属于生物技术领域并涉及重组DNA技术,具体地,涉及在毕赤酵母属甲基营养酵母中表达编码血清型2和4登革病毒包膜蛋白的基因的方法。
现有技术
技术目的是使用称为MP-36的巴斯德毕氏酵母菌株BMK90的自养型突变株his3(欧洲专利申请EP43 8200)作为宿主来开发有效表达编码血清型2和4登革病毒包膜蛋白的基因的系统以得到用于人类接种的免疫原。
开发重组疫苗主要关心的是得到此病毒包膜蛋白的适当集合体,并且所用表达系统是此问题的最重要方面(Mason P W,Mc Ada P C,Dalrymple JM,Fournier M J y Mason T L,大肠杆菌中日本脑炎病毒抗原的表达,病毒学,1987;158:361)。
为此目的,已实施了几种表达系统以生产此黄病毒的不同重组蛋白,包括结构和非结构蛋白如C-prM-DE-NS1-NS2A-NS2B(Tolou H,Pisano MR,Deubel V y Nicloe J.Problemes et perspectives en matiere devaccination contre les Flavivirus.bull Inst Pasteur 1992;90:11-29;ZhangY M,Hayes E P,Mc Carthy T C y col.用杆状病毒重组体表达的登革病毒结构蛋白和非结构蛋白NS1免疫小鼠诱导对登革病毒脑炎的抗性,病毒学杂志1988;62:3027-3031)。为选择适当的系统因素如重组产物表达和加工的可能性、翻译后修饰、糖基化作用、蛋白水解、分泌至培养基、保留二级结构的能力以获得与天然产物相似的产品。考虑系统提供抗原产品的百分比即产量是很重要的。
用于重组黄病毒蛋白表达的第一个表达系统是细菌,特别是大杆菌。这些蛋白表达容易并且达到高产量(细胞总蛋白的10~20%),但是这种表达系统有一些局限性。主要问题是几种重组蛋白以活性不溶形式聚积形成内含体。使这样的蛋白恢复的必需的变性和重折叠技术昂贵并且复杂(Marston FAO,大肠杆菌中表达的真核动物多肽的纯化,生物化学杂志1986;240:1-12)。当表达小分子肽时出现另一困难,肽迅速降解并且以融合蛋白合成,必须在体外进行包括另一套纯化的后切割(Itakura等,1978)。然而不能进行重组产物的翻译后加工是主要的限制。虽然已认为与其它不同表达系统相比,这些蛋白作为免疫原不是非常有用的,但是一些表达蛋白表现诱导中和抗体(ACS)的同种型(Mason P W,Zogel MV,Semproni A R,Fournier MJ y Mason T L.大肠杆菌中表达的1型登革病毒包膜和NS1蛋白的抗原结构,J Gen Virol.,1990;71:2107-2114)。
昆虫细胞是获得几个病毒来源基因(包括需要蛋白水解加工、糖基化作用或分泌作用的那些基因)高水平表达的有效表达系统。此系统使用Autographa Californian核型多角体病毒(AcNPV)(Feighny R,Burrous J y Putnak R,用重组杆状病毒制备的2型登革热包膜蛋白保护小鼠免受病毒攻击,Am J Trop Med Hyg,1994,50(3〕:322-328〕。
除了用它们免疫的小鼠封闭了中和ACS,所得重组蛋白还表现与天然蛋白相似的大小、糖基化状态和抗原性(Matswra Y,Miyamoto M,soto T y col,重组杆状病毒表达的日本脑炎病毒包膜蛋白的特征鉴定,病毒学1989;173:674-682)。小鼠中的保护水平依赖于所用重组抗原的剂量,但是具有天然抗原性并含有保护性表位的重组蛋白用作免疫原时并不总是保护免受病毒感染(Shiu SYW,Reid HW y Gould EA,重组杆状病毒和痘苗病毒表达的羊跳跃病病毒包膜蛋白不能刺激保护性免疫,病毒研究1992;26:213)。用重组杆状病毒对D1(E)和日本脑炎病毒(VEJ-E)的研究表明存在抗病毒的中和Acs与保护作用之间的正相关(Zhao B,Prince G,Horswood R,Eckels K,Summer P,ChanockR,Lai C-J,由重组痘苗病毒表达登革病毒的结构蛋白和非结构蛋白,病毒学杂志1987;61:4019-4022)。因为使用不是人类病原体的昆虫病毒并具有进行真核动物蛋白正确加工的能力,此表达系统有望用于亚单位疫苗的生产。
使用哺乳动物细胞的表达系统的另一优势是通过增加抗原接触在感染期间扩增外源基因产物。因此考虑到腺病毒、疱疹病毒和痘病毒具有高潜在致癌性,它们已作为疫苗候选者用于基因构建(Green M,转化和肿瘤发生:DNA病毒,病毒学,Field,B.N编辑,Raven Press,New York,1985:183)。痘苗病毒(VV)由于其清楚定义的生物学特征及其用作免疫原的历史而成为理想选择。使用W如杆状病毒表达的蛋白是强免疫原(Behbehami AM,天花的故事:疾病的生存与死亡,Microbiol.Rev.,1983,47:455)。
然而,对于登革热,痘苗病毒中蛋白表达未得到预期的结果,因为已获得针对痘苗病毒蛋白而不是登革热蛋白的高滴度抗体。另一难点是它不产生足够量的蛋白以实现有效的纯化过程(Zhao B,Prince G,Horswood R,Eckels K,Summer P,Chanock R,Lai C-J,重组痘苗病毒表达登革病毒结构蛋白和非结构蛋白,病毒学杂志1987,61:4019-4022)。
其它一些表达系统提供用作疫苗相当潜力。先进的方法学如病毒样微粒的使用因为它能用作黄病毒抗原表位的载体而具有广阔前景,例如polyovirus缺陷微粒、表面抗原和乙型肝炎病毒核心抗原的使用(Belyaev等1992)。相似地,可以使用已用作更加针对结核的免疫原的Mycobacterium bovis减毒菌株,著名的Bacillus Calmette-Guerin(BCG)。此系统已在HIV的蛋白表达中成功地得到证实(Aldovini A yYoung R A,对肝重组BCG-HIV疫苗的体液和所有介导的免疫应答,自然,1991,351:479)。
考虑到乙型肝炎病毒和足口病病毒(FMDV)已在转基因植物系统中得到表达,用转基因植物生产低成本的疫苗已不是遥远展望(MasonH S,Lam D M y Arntzen CJ,乙型肝炎表面抗原在转基因植物中的表达,美国国家科学院院报,1992,89:11475;Usha R,Rohll JB,SpallVE y col,在植物病毒颗粒表面表达动物病毒抗原位点,病毒学1993,197:366)。目前,此系统还不是有人类中免疫原目的的蛋白表达的可选择系统,因为还没有对其基本方法的足够了解,此系统正在发展中。
发明详述
本发明的创新是使用巴斯德毕赤酵母作为D2和D4病毒蛋白E的表达系统。将此系统与其它原核系统比较时,这个系统表现一些优势,例如以高密度生长的能力因而使培养物适应连续系统(授予PhillipsPetroleum Co.的美国专利4414329)。此外,酵母可以以大于大肠杆菌的量向培养基分泌蛋白,并且用于发酵的培养基一般比细菌的更经济(Lemoine Y,“酵母中的异源表达”,第8届国际生物技术大会,巴黎,1988年7月17-22日)。这些系统也可进行翻译后修饰如在细菌系统中不存在的糖基化作用(Fiers W.“微生物中异源基因的最大工程表达”,第8届国际生物技术会,巴黎,1988年7月17-22日)并可以表明对高等生物细胞所用密码子的偏爱性,由此带来哺乳动物基因的高表达(Kigsman S M y col.,酿酒酵母中的异源基因表达,生物技术&遗传工程评论1990,(3),Russell G.E编辑)。
最近,甲基营养酵母,具体地巴斯德毕赤酵母已成功地用于克隆和表达异源基因(Phillips Petroleum Co.的专利申请581107),因为其以高细胞密度生长的能力并使用从废料得来的廉价碳源作为诱导克隆基因的底物而成为有吸引力的宿主。
除此之外,巴斯德毕赤酵母的基因表达系统比所述的酵母系统更易于调控,这对于所得产物可能引起合成它们的宿主中有害效应的情况是一个优势。
DV2的起始点是编码毒株A15的病毒蛋白E的基因序列,此毒株是1981年古巴登革热和出血登革热流行期间分离的。
将此序列用于获得酵母载体表达。使用质粒pNAO-407,启动子是巴斯德毕赤酵母醇氧化酶1(AOX)转录的启动子,终止子是酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP-T)的转录终止子,选择标记物是使酵母在组氨酸缺陷型基本培养基中生长的HIS-3和巴斯德毕赤酵母的信号3 AOX。此质粒是以前已报道的质粒pTAO-10的变更(欧洲专利申请EP 480525A2)。
对于使用质粒pNAO-407,第一步是用酶NcoI和EcoRI消化,然后用LGT方法纯化,分离编码肝炎病毒表面抗原的0.678kb条带。
然后用修饰酶Klenow处理末端以补平末端,并使末端补平以利于通过PCR克隆片段。最后用碱性磷酸酶(CIP)处理。
一旦质粒得到纯化,就在T4 DNA连接酶的参与下开始质粒pNAO-407/NcoI/EcoRI/LGT/Klenow/CIP与纯化PCR条带的连接反应。
将连接产物转化入大肠杆菌细胞菌株k-12/XL-1 Blue并在含氨卞青霉素的LB培养基上铺板;重组子的筛选通过菌落杂交方法进行。用限制性酶检测法分析阳性克隆,使用蛋白的1.485kb条带。这就是得到质粒pDE2-21的方法。
对巴斯德毕赤酵母宿主细胞进行电穿孔并根据其在基本培养基中的生长筛选重组子。对克隆进行鉴定时,选择克隆14(YDE 221-14)用于表达研究。此克隆的D2病毒蛋白E产物通过ELISA和免疫技术如DOT-ELISA和蛋白印迹观察。Robert Shope博士从编码病毒蛋白E的基因序列开始研究D4,此病毒来自1981年多米尼加共和国登革热流行期间分离的毒株814669并于1992年11月24日由美国耶鲁大学慷慨赠予。
进行已截短了其最后53个氨基酸的登革热A包膜的1202bp的扩增并用于酵母表达载体(pFAO)的克隆。此载体与以前已报导的载体pPS-7(欧洲专利申请EP 438200)基本上相同,但分泌信号是酿酒酵母α因子。
对于使用pFAO,第一步是用酶EcoRI消化,然后用LGT方法纯化。然后用修饰酶Klenow处理末端以补平末端,并使末端补平以利于通过PCR克隆片段。最后用碱性磷酸酶(CIP)处理。
一旦质粒得到纯化,就在T4 DNA连接酶的参与下开始质粒pFAO/EcoRI/LGT/Klenow/CIP与纯化PCR条带的连接反应。
将连接产物转化入大肠杆菌细胞菌株k-12/XL-1 Blue并在含氨卞青霉素的LB培养基上铺板;重组子的筛选通过菌落杂交方法进行。用限制性酶检测法分析阳性克隆,使用蛋白的1.202kb条带。这就是得到质粒pDFE4-47的方法。
在测试后,测定两种蛋白在细胞破碎液的上清中的存在,并在培养物上清中检测到更少量的D4蛋白E。可以说蛋白是以非溶解形式得到的,并且在培养基中得到的D4是作为分泌蛋白并且含量更少。
定量研究已表明,所得蛋白为总蛋白的1%至2%。
表达载体pDE2-21是得到包含截短的血清型2病毒包膜基因的酵母表达载体的起点。表达载体pDE2-21已在前面描述并且包含在甲基营养型巴斯德毕赤酵母中表达的遗传信息。
为此目的,进行包膜基因的修饰。修饰包括在1407位EcoRI位点切割基因。
如果测定修饰区序列,就可以证实EcoRI位点的缺失和在基因1407位中止密码子TTA的插入,然后包膜在79碱基对和其最后27个氨基酸处截断。用Klenow酶补平末端并最终用T4连接酶连接。将连接产物转化入大肠杆菌细胞菌株K-12/XL-1 Blue。这就是得到质粒pDE2-21DEcoRL-7的方法。
然后用10个单位的EcoRI酶消化10微克质粒以得到如所述的完整的但功能上截短的包膜。在用LGT方法纯化此片段后,将其克隆入载体以便在8.5kb的酵母pPS-7中表达(欧洲专利申请EP 438200)。此质粒包含巴斯德毕赤酵母醇氧化酶的基因启动子、随后的酿酒酵母SacarosaInvertasa(Sucll)的分泌信号、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP-T)基因转录的终止子和选择标记物HIS-3。
然后取100纳克pPS-7/Nco1/MB/CIB,在T4 DNA连接酶的参与下与30纳克pDE2-21DEcoRI-7的EcoRV条带一起温育。
这就是得到质粒pDSE2-34的方法,然后大量纯化质粒并保存以在随后的酵母电穿孔中使用。
得到此质粒后,步骤基本上按对于登革热2和登革热4所述的进行。在电穿孔和特征鉴定后,选择克隆1,2,3和4用于发酵,得到酵母克隆YDSE234-1,2,3,4。之后,将这些克隆用于表达研究。
特异重组蛋白的表达用特异免疫分析法(ELISA)检测。
实施例实施例1
如果没有特别的参考文献,遗传材料的操作按照Sambrook等,1989(Sambrook J,Frissch EF,Maniatis T.分子克隆:实验指南,第2版,纽约,冷泉港实验室,冷泉港,1989)进行。
使用1981年古巴DHF/DSS流行期间分离的菌株A15(Kouri G,MasP,Guzman MG,Soler M,Gonenechea A,Morier L.古巴登革热出血热,1981,病原体的快速诊断,Bull Pan Am Health Organ,1982,93:414-420)来分离要表达的基因。最近已公开了编码此毒株蛋白E基因的部分核苷酸序列(Guzman MG,Rosario D,Marrero M,pelegrino J,Sariol C,Kouri G.1981年DHF/DSS古巴流行期间分离的四种登革热2毒株的包膜基因接合点的部分核苷酸和氨基酸序列,Am J Trop MedHyg,1995,25(3):45-50)。此序列以m=1-5UFP/毫升于L-15培养基中在小鼠脑中繁殖四次、在AP61(Aedes pseudoscutellaris)中繁殖一次直至细胞表现大于70%的细胞病变效应并且使用超免疫腹水对D2的特异免疫荧光超过细胞的50%。
根据其他作者的方法提取感染细胞的RNA(Deubel V,Laille M,Hugnot J,Chungue E,Gueston J,Drovet Mt,Bassot S,Chevrier D,通过基因组扩增鉴定登革热序列:外周血中登革病毒血清型的快速诊断,病毒学方法杂志,1990,30:41-54)。简要地说,用TNE缓冲液冲洗细胞,并在含0.5%NP40和0.5%sodium deoxicalato的0.1×TNE中裂解细胞,于2000rpm离心10分钟沉淀核酸细胞并在1%SDS存在时用酚处理胞质提取物二次去蛋白。RNA用乙醇和乙酸铵沉淀。
cDNA合成如下进行:约使用10微升RNA(100纳克),然后加入32纳克引物,于95℃变性2分钟并放在冰中1分钟以上。然后加入5mM(1微升)dNTP混合物、10×反转录缓冲液(2微升),40单位(1微升)RNAsin,12单位(1微升)逆转录酶和水至20微升总体积,于42℃放置1个小时。
用来得到cDNA的引物的反义基因组序列是:
2421 5′GGCCTGCTCCATA GCTCC 3′2403。
根据Saiki等,1988的方法(Saiki PK,Grifand DH,Stoffel S,ScharfSJ等。用热稳定的DNA聚合酶进行DNA的引物指导的酶扩增,科学,1988,239:487-491)进行cDNA扩增。
对于PCR,使用5微升合成cDNA,终体积达50微升,包含10×TAQ聚合酶缓冲液(5微升),dNTP(5微升),320纳克每种引物(+/-)和双蒸水。引物序列是:正向引物 928 5′TCAGATATCATGCGTTGCATAGGAATATC3′956反向引物2432 5′CAGATATATCTTAAGCCTCCACCATAGCTCCC3′2403
每个引物中包含限制性内切酶(RE)EcoRV(GATATC)的切割位点,在正向引物中包括起始密码子或ATG,在反向引物中包括终止密码子或TTA。对应于核苷酸序列中位置的每个引物的数字参考以前公开的结果(Deubel V,Kinney RM,Trent DW.,牙买加2型基因型登革病毒非结构蛋白的核苷酸序列和推测的氨基酸序列:全长基因组的比较分析,病毒学,1988,165:234-244)。扩增序列有1485个碱基对,并且除了以前描述的和引物中包括的修饰外,与包膜基因序列精确匹配。
首先,DNA-cDNA杂交体于95℃变性5分钟,然后加入2.5单位TAQ聚合酶(Bohering Mamnhein)。反应在72℃保持45秒。进行30个循环的如下扩增:变性(95℃,45秒),退火(55℃,90秒),延伸(72℃,45秒)。最后一个循环后,于72℃保持10分钟。
PCR检测:取5微升每种反应混合物,加入4微升水和4微升溴酚蓝并上样到在含2微升溴乙锭(10毫克/毫升)的TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶上,用HindIII酶消化的λDNA用作标准分子量标记物。
在100微升体积中用蛋白激酶K处理扩增产物以消除先前PCR中所用的残余Taq聚合酶。然后,用酚/氯仿处理并于-70℃过夜进行乙醇沉淀。接着,在4℃于7200rpm离心(Hettich,D-7200)15分钟,用70%乙醇冲洗沉淀并以相似条件离心。将此物质重新悬浮于30微升1×0.1MTE缓冲液中,然后通过低熔点琼脂糖法(LGT)纯化。
使用10kb质粒pNAO-407以获得酵母表达载体。此质粒包含巴斯德毕赤酵母醇氧化酶1(AOX)的转录启动子、酿酒酵母甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAP-T)的转录终止子、使酵母在组氨酸缺乏的基本培养基上生长的选择标记HIS-3和巴斯德毕赤酵母的信号3 AOX。在启动子之后和终止子之前的Nco1和EcoRI位点间克隆对应于乙型肝炎病毒表面抗原的条带(欧洲专利申请E.P.480525A2)。第一步是用酶NcoI和EcoRI消化,然后用LGT方法纯化。用此方法,将载体与0.678kb条带分离。
然后用修饰酶Klenow处理末端以补平末端,制备平末端以利于PCR条带的克隆。最后用碱性磷酸酶脱磷酸。
一旦质粒得到纯化,就在T4 DNA连接酶的参与下使100纳克质粒PNAO407/NcoI/EcoRI/LGT/Klenow/CIP与300纳克先前纯化的PCR条带一起温育进行连接反应。
将连接产物转化入大肠杆菌细胞菌株k-12/XL-1 Blue(BullokWO,Fernandez TM,Shote JM.XL-Blue质粒,用β一半乳糖苷酶选择转化recA的大肠杆菌菌株的高效质粒,生物技术,1987,5:376-379),然后在含氨卞青霉素的LB培养基上生长。挑取独立生长的菌落,用杂交方法筛选重组子。选择阳性克隆进行限制性内切酶分析。对于此最后步骤,使用对应于E的1.485kb条带。用LGT法纯化条带后,用Amersham International,Amersham,英国的α-32P ATP标记。这就是得到质粒pDE2-21(见图1)的方法,然后用碱性方法纯化质粒并保存以便以后使用。
对两个基因的连接进行测序以确定条带插入在AOX启动子下。使用商用试剂盒(2.0版测序酶,DNA试剂盒,USB,USA)对纯化质粒pDE2-21进行测序。此步所用引物序列是:
1241 5′CCCCATCCTCTGTCTACCATG 3′1220
以前一些作者已用过此引物(Deubel V,Laille M,Hugnot J,Chungue E,Gueston J,Drovet MT,Bassot S,Chevrier D.,通过基因组扩增鉴定登革热序列:外周血中登革病毒血清型的快速诊断,病毒学方法杂志,1990,30:41-54)。测序结果证实了基因构建体中条带E的正确方向。
基本上根据Martinez等,1993的方法(Martinez等,1993)进行电穿孔操作。
从-70℃保存的甘油菌种重新活化巴斯德毕赤酵母后,使其在YPG培养基中生长并在于28℃培养72小时。此后在无菌条件下挑取20个3毫米的菌落并将其重新悬浮在1.5毫升Eppendorf管中的1毫升无菌蒸馏水中。细胞于4℃冷冻微量离心机(Hettich D-7200 Tuttligen,Japan)中以3200rpm离心3分钟。丢弃上清并将沉淀重新悬浮于200微升1M山梨醇中用于电穿孔并转移至0.2厘米电穿孔杯(Gene-PulserCuvette,Bio-Rad,USA)中。
每杯中加入5微升,含有500纳克用10微升酶Pvull(Amersham,UK)消化的质粒pDE2-21。在冰上操作此过程。
使用商用电穿孔仪(基因脉冲转染仪,Bio-Rad,USA)。此过程的参数是:电阻200w;电容125uf;电压2kv;放电时间3.4ms,这些条件根据生产商的说明来调整。
将电穿孔细胞重新悬浮于1毫升冷山梨醇中。取500μl体积在含2%葡萄糖无氨基酸的YNB(酵母氮基,Difco,美国)基本培养基上铺板。此板于28℃培养96小时。分离生长的菌落将其放入含2%葡萄糖的YNB新鲜平板中并于28℃再培养72小时。
按照Ferbeyre等,1993所述的进行DNA印迹分析(Ferbeyre G,Villareal A,Morales-Grillo J.从酵母制备高分子量DNA用于DNA分析的快速方法,生物技术,1993,14:386)。用EcoRV消化DNA并用2型登革病毒E基因条带作为探针(图2)。
然后,随机挑选克隆,5毫升YPG培养基中的培养物在摇床(Blanc-LaBo S.A.,Ch-1131,Switzerland)中以250rpm振荡于28℃培养16个小时。
生长的细胞在4℃于3200rpm离心3分钟(Jouan,Gr 41-11,France)并倒掉上清液。用无菌水洗后在相似条件下再离心。沉淀重新悬浮于溶解缓冲液中(annex 1)并加入25微升Zimolaze至20毫克/毫升(Seikagaku Corporation,Japan);25微升链霉蛋白酶至20毫克/毫升(Merck,Germany)和10微升Rnase至16毫克/毫升(Boehringen,Gmbh,Germany)。此混合物于37℃培养1个小时。
接着,用酚/氯仿抽提(Sambrook J,Frissch EF,Maniatis T.分子克隆:实验指南,第2版,纽约,冷泉港实验室,冷泉港,1989),收集上相并用无水乙醇(Merck,Germany)在-70℃沉淀1小时。此后样品在冷冻微量离心机中在4℃于12000rpm离心15分钟。然后用70℃乙醇冲洗抽提的DNA并在相同条件下再次离心。将DNA真空干燥(Speed-VacAlpha,Switzerland)15分钟,然后重新悬浮于100微升的TE缓冲液中,再测试抽提质量。
将20微克DNA与10单位限制性内切酶EcoRV(Amershan,UK)于37℃反应12小时以确定整合特征。
消化后进行DNA印迹。根据杂交和核酸印迹方法(Hybond-N+方法,Amersham,UK)进行杂交。以前通过LGT纯化的用限制性酶EcoRV消化质粒pDE2-21得到的条带作为探针。此探针对应于毒株A15登革病毒蛋白E的基因序列。
用限制性酶HindIII消化的λ噬菌体DNA用作分子量标记物。
从没有经过电穿孔的相同巴斯德毕赤酵母菌株提取的质粒pDE2-21和DNA分别用作阳性和阴性对照。
一旦克隆得到鉴定,挑选克隆14(YDE221-14)用于表达研究。克隆YDE221-14的表达研究
从用克隆YDE447-61的小份甘油菌种接种的YPG固体培养基平板中挑取一个菌落并用于接种10毫升盐水培养基中,然后于250rpm在30℃培养12小时。500微升此培养物用于接种装有50毫升与克隆甘油菌种相同的培养基的锥形瓶中。在摇床上于250rpm、30℃培养12小时。此体积用于接种至含2%酵母提取物的5升盐水培养基中。发酵条件如下:
于30℃、500rpm、3vvm通风条件培养24小时。当生长培养物用完作为碳源的甘油时,用甲醇(BDH,Germany)诱导AOX1启动子,当湿重达到约70克/升时通过pH升高记录生长。用以往表达HBsAg的巴斯德毕赤酵母克隆的发酵经验(欧洲专利申请EP 480525A2),考虑培养物湿重的增加来调整甲醇流量。同时振荡和通风分别增加至750rpm和5vvm。在发酵48小时时加入与培养基中相同百分含量的维生素添加剂和盐,90℃时再次补充盐但用量为先前所用百分含量的一半。在发酵120小时时通过在1升试管中于3000rpm、4℃离心30分钟收集生物质,倒掉培养基上清液。用PBS缓冲液(pH7.2)洗所得湿生物质,并称重以确定发酵过程的产量(克/升),约为170克/升。接着,将沉淀重新悬浮于得到培养物净重体积的2倍裂解缓冲液中。
通过机械研磨法进行破碎,通过纤维素膜(Dynomill,USA)过滤6次,所得物质于3000rpm离心30分钟。上清在超速离心机(HitachiCSP7OH,RP 45T转头,Japan)中于15000rpm再离心30分钟。除去沉淀并用1×裂解缓冲液洗2次。
用60克/升的抽提缓冲液(PBS,8M尿素)处理沉淀并于4℃振荡培养过夜以使蛋白溶解以便检测其中的蛋白。所得物质于15000rpm离心30分钟,除去上清液并用1×PBS缓冲液脱盐以使蛋白重折叠。通过还原条件和非还原条件下10%含SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳可微弱地观察到此蛋白(图3)。
用抗D2V超免疫小鼠腹水,通过蛋白印迹技术检测此沉淀中的D2病毒重组蛋白。检测到的蛋白大小(约38kDa)不是预期的那个。来自质粒pNAO-407转化的酵母克隆等量制品用作负对照(图4)。
抽提后对剩余沉淀进行SDS-PAGE和蛋白印迹。分子量估计表明比野生型包膜蛋白更低的蛋白大小(38kd)。用与辣根过氧化酶偶联的抗小鼠抗体作为三抗检测固定平板中作为二抗的抗DV2超免疫腹水中人血清(次级感染)Ig,通过扩增的三明治ELISA也可得到此结果。此系统在50微克脱盐提取物中检测到DV特异的活性。来自带有PNAO-407载体的酵母克隆的破碎物的等量制品用作负对照,那些O.D.大于或等于阴性对照样品O.D.的2倍的样品认为是阳性样品。实施例2
为获得D4包膜基因,起点是编码病毒蛋白E的序列,病毒来自1981年多米尼亚共和国登革热流行期间分离的菌株814669并由美国德克萨斯大学Robert Shope博士慷慨赠予。
使用菌株814669分离要表达的基因。此序列以m=1-5UFP/ml于L-15培养基中在小鼠脑中繁殖四次、在AP61(Aedes pseudoscutellaris)中繁殖一次直至细胞表现大于70%的细胞病变效应并且使用超免疫腹水对D2的特异免疫荧光超过细胞的50%。
根据其他作者的方法提取感染细胞的RNA(Deubel V,Laille M,Hugnot J,Chungue E,Gueston J,Drovet Mt,Bassot S,Chevrier D,通过基因组扩增鉴定登革热序列:外周血中登革病毒血清型的快速诊断,病毒学方法杂志,1990,30:41-54)。简要地说,用TNE缓冲液冲洗细胞,并在含0.5%NP40和0.5%sodium deoxicalato的0.1×TNE中裂解细胞,于2000rpm离心10分钟沉淀核酸细胞并在1%SDS存在时用酚处理胞质提取物二次去蛋白。RNA用乙醇和乙酸铵沉淀。
cDNA合成如下进行:约使用10微升RNA(100纳克),然后加入32纳克引物,于95℃变性2分钟并放在冰中1分钟以上。然后加入5mM(1微升)dNTP混合物、10×反转录缓冲液(2微升),40单位(1微升)RNAsin,12单位(1微升)逆转录酶和水至20微升总体积,于42℃放置1个小时。
用来得到cDNA的引物的反义基因组序列是:
5′AAACATCCTGCCAATGGA 3′
根据Saiki等,1988的方法(Saiki PK,Grifand DH,Stoffel S,ScharfSJ等。用热稳定的DNA聚合酶进行DNA的引物指导的酶扩增,科学,1988,239:487-491)进行cDNA扩增。
在其最后53个氨基酸截短的D4包膜的1202bp通过PCR进行扩增并用于克隆酵母表达载体(pFAO)。此载体基本上与先前已报导的载体pPS-7(欧洲专利申请EP 438200)相同,但它包含酿酒酵母的α因子分泌信号。这就是得到质粒pDFE4-47的方法。
根据Saiki等,1988的方法(Saiki PK,Grifand DH,Stoffel S,ScharfSJ等。用热稳定的DNA聚合酶进行DNA的引物指导的酶扩增,科学,1988,239:487-491)进行cDNA扩增,使用下列引物:正向引物:5′GGGAATTCT ATG CGA TGC TTA GGA GTA GGA 3′负向引物:5′GGGAATTCTTAAAACATCCTGCCAATGGAACT 3′
对于PCR,使用5微升合成cDNA,终体积达50微升,包含10×TAQ聚合酶缓冲液(5微升),dNTP(5微升),320纳克每种引物(+/-)。
每个引物中包含限制性内切酶(RE)EcoRV(GATATC)的切割位点,在正向引物中包括起始密码子或ATG,在反向引物中包括终止密码子或TTA。对应于核苷酸序列中位置的每个引物的数参考以前公开的结果并美国德克萨斯大学Robert Shope博士慷慨提供。
扩增序列有1202bp,并且除了以前描述的和引物中包括的修饰外,对应于在其侧翼末端截短了53个氨基酸的D4病毒包膜基因的序列。
首先,DNA-cDNA杂交体于95℃变性5分钟,然后加入2.5单位TAQ聚合酶(Bohering Mamnhein),于72℃保持45秒。进行30个循环的如下扩增:变性(95℃,45秒),退火(55℃,90秒),延伸(72℃,45秒)。最后一个循环后,于72℃保持10分钟。
PCR检测:取5微升每种反应混合物,加入4微升水和4微升染料并上样到在含2微升溴乙锭(10毫克/毫升)的TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶上,用HindIII酶消化的λDNA用作标准分子量标记物。
在100微升体积中用蛋白激酶K处理扩增产物以消除先前PCR中所用的残余Taq聚合酶。然后,用酚/氯仿处理并于-70℃过夜进行乙醇沉淀。接着,在4℃于7200rpm离心(Hettich,D-7200)15分钟,用70%乙醇冲洗沉淀并以相似条件离心。将此物质重新悬浮于30微升1×0.1MTE缓冲液中,然后用LGT纯化。
使用10kb质粒pFAO以获得酵母表达载体。此质粒包含巴斯德毕赤酵母醇氧化酶1(AOX)的转录启动子、酿酒酵母甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAP-T)的转录终止子和选择标记HIS-3。第一步是用酶EcoRI消化载体,然后用碱性磷酸酶脱磷酸。随后进行连接,在T4 DNA连接酶的参与下使用100ng质粒PFAO/EcoRI/CIP与100ng纯化的条带E一起温育。
将连接产物转化入大肠杆菌细胞Mc-1061菌株。使用条带E的1.202kb条带通过菌落杂交选择阳性克隆。这就是得到质粒pDFE4-47(图5)的方法,纯化质粒并保存以便以后使用。进行测序以确定条带插入在AOX启动子下。使用如下引物序列:
ACTATTGCCAGCATTGCT 3′1220
此引物在载体条带连接点的上游链α因子区域杂交。电穿孔
基本上根据Martinez等,1993的方法(Martinez E,Garcia C yMorales-Grillo J.,通过电穿孔快速转化非酵母,Biotech techn,1993;7:895-896)进行电穿孔过操作。
从-70℃保存的甘油菌种重新活化巴斯德毕赤酵母后,使其在YPG培养基中生长并在于28℃培养72小时。此后在无菌条件下挑取20个3毫米的菌落并将其重新悬浮在1.5毫升Eppendorf管中的1毫升无菌蒸馏水中。细胞于4℃冷冻微量离心机(Hettich D-7200 Tuttligen,Japan)中以3200rpm离心3分钟。丢弃上清并将沉淀重新悬浮于200微升1M山梨醇中用于电穿孔,然后将其转移至0.2厘米电穿孔杯(Gene-Pulser Cuvette,Bio-Rad,USA)中。
每杯中加入5微升,含有500纳克用Clal酶(Promega)和10微升SalI酶消化的质粒。
使用商用电穿孔仪(基因脉冲转染仪,Bio-Rad,USA)。此过程的参数是:电阻200w;电容125uf;电压2kv;放电时间3.4ms,这些条件根据生产商的说明来调整。
将电穿孔细胞重新悬浮于1毫升冷山梨醇中并放在含2%葡萄糖无氨基酸的YPG基本培养基平板上。此板于28℃培养96小时。
然后,随机挑选90个克隆,接种5毫升YPG培养基中的预培养物并在摇床中以250rpm旋转振荡于28℃培养16个小时。
生长的细胞在4℃于3200rpm离心3分钟(Jouan,Gr 41-11,France)并倒掉上清液。用无菌水洗后在相似条件下再离心。沉淀重新悬浮于溶解缓冲液中(annex 1)并加入25微升Zimolaze至20毫克/毫升(Seikagaku Corporation,Japan);25微升链霉蛋白酶至20毫克/毫升(Merck,Germany)和10微升Rnase至16毫克/毫升(Boehringen,Gmbh,Germany)。此混合物于37℃培养1个小时。
接着,用酚/氯仿抽提(Sambrook J,Frissch EF,Maniatis T.分子克隆:实验指南,第2版,纽约,冷泉港实验室,冷泉港,1989),收集上相并用无水乙醇(Merck,Germany)在-70℃沉淀1小时。此后样品在冷冻微量离心机中在4℃于12000rpm离心15分钟。
然后用70℃乙醇冲洗抽提的DNA并在相同条件下再次离心。将DNA真空干燥(Speed-Vac Alpha,Switzerland)15分钟,然后重新悬浮于100微升的TE缓冲液中,再测试抽提质量。
根据Amersham方法用来自D4的蛋白E作为探针进行点印迹分析以确定重组质粒。
将20微升(10微克)DNA用10单位限制性内切酶EcoRI(Amershan,UK)于37℃消化12小时以确定整合特征。用含AOX1基因、α因子和D4 E基因序列(图6)的质粒pDFE4-47的ClaI/SacI条带作为探针。克隆得到鉴定时,挑选克隆61(YDE447-61)用于表达研究。克隆YDFE447-61的表达研究
从用克隆YDE447-61的小份甘油菌种接种的YPG固体培养基平板中挑取一个菌落。用此克隆接种50毫升盐水培养基[22克/升(NH4)2SO4,18.2克/升K2HPO4,7.5克/升MgSO4·7H2O,0.5克/升CaCl2,3%甘油,400×5毫升维生素溶液,1毫升微量盐溶液,pH调节至5.0]中的预培养物,并在摇床上于30℃、250rpm培养12小时。此体积用作500毫升相同培养基中的接种物,然后此体积用作装有含20%酵母提取物的盐水培养基的5升发酵物的接种物。发酵条件是:
于28℃、500rpm、3vvm通风条件培养24小时。当生长培养物用完作为碳源的甘油时,用甲醇(BDH,Germany)诱导AOX1启动子,当湿重达到约70克/升时通过pH升高记录生长。用以往表达HBsAg的巴斯德毕赤酵母克隆的发酵经验(欧洲专利申请EP 480525A2),考虑培养物湿重的增加来调整甲醇流量。同时振荡和通风分别增加至750rpm和5vvm。在发酵48小时时加入与培养基中相同百分含量的维生素添加剂和盐,90℃时再次补充盐但用量为先前所用百分含量的一半。在发酵120小时时通过在1升试管中于3000rpm、4℃离心30分钟收集生物质,倒掉培养基上清液。用PBS缓冲液(pH7.2)洗所得湿生物质,并称重以确定发酵过程的产量(克/升),约为200克/升。接着,将沉淀重新悬浮于1倍体积裂解缓冲液中以得到40%终浓度。通过机械研磨法进行破碎,通过纤维素膜(Dynomill,USA)过滤6次,所得物质于3000rpm离心30分钟。上清在超速离心机(Hitachi CSP7OH,RP 45T转头,Japan)中于15000rpm再离心30分钟。合并两次沉淀并用裂解缓冲液洗两次。
用抗DV4超免疫鼠腹水(MIAF),通过蛋白印迹技术检测此沉淀中的DV4重组包膜蛋白。来自质粒pFAO转化的酵母克隆相似制品用作负对照(图7)。
用60克/升的抽提缓冲液(PBS,8M尿素)处理沉淀并于4℃振荡培养过夜以使蛋白溶解。所得物质于15000rpm离心30分钟,除去上清液并用1×PBS缓冲液脱盐以使蛋白复性。通过还原条件和非还原条件下10%含SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳可微弱地观察到此蛋白(图8)。
分子量估计表现60Kda大小,这是根据低分子量模式(Pharmacia,UK)在还原条件下计算的。通过使用相同的抗DV4 MIAF进行脱盐提取物的蛋白印迹分析再次证实重组蛋白的存在,使用已被登革病毒次级感染的人个体的血清也观察到此相同反应。
通过ELISA也得到这些结果。
用人类血清免疫球蛋白(二次感染)作为覆盖并与过氧化酶偶联的三明治样检测法观测到至多8微克脱盐提取物的登革热病毒特异活性。
用人血清(二次感染)免疫球蛋白作为覆盖,MIAF和小鼠单抗作为次级抗体的扩增三明治样检测方通过与过氧化酶偶联的抗小鼠抗体三抗来检测。通过用抗登革热复合物和抗血清特异型登革病毒单抗,可观测到500纳克脱盐提取物中的特异登革病毒活性。使用抗DV4和抗DV2 MIAF,可获得低敏感性。
来自带有载体pFAO的酵母克隆的裂解液沉淀的相同制品用作阴性对照。
阳性标准是根据那些阳性样品的O.D.值大于或等于阴性对照样品OD值的2倍而建立的。
通过SDS-PAGE估测重组蛋白产量,其中条带的相对浓度对应于凝胶所包含的谷氨酸脱氢酶蛋白(55.4Kda)曲线(Deubel V,Laille M,Hugnot J,Chungue E,Gueston J,Drovet Mt,Bassot S,Chevrier D,通过基因组扩增鉴定登革热序列:外周血中登革病毒血清型的快速诊断,病毒学方法杂志,1990,30:41-54);同时可根据BSA蛋白曲线由Amidoblack技术确定其浓度。
在每一次过程中,相对于从沉淀提取的蛋白总浓度,可得到产量的1.2%的重组蛋白。重组蛋白用作免疫原
每个方案中我们使用一组20只小鼠(Balb,雌性,四周龄)。使用由对照酵母获得的相同浓度提取物,检测每单位200微克和400微克的两种浓度免疫原,包括免疫接种方案中阴性对照小鼠。三周内每周向肌肉内,腹膜内和皮下注射一个剂量的免疫原和弗氏完全佐剂(I)及弗氏不完全佐剂(II和III)。通过ELISA观测小鼠血清中抗体抗DV4的水平(以前描述的扩增的三明治样系统),通过用更明确的蛋白样品在第四次用量时抗体水平提高(用50%饱和硫酸铵沉淀原提取物)。在1/500和1/1000稀释液间可得到血清反应性。蛋白印迹技术显示天然登革病毒4包膜蛋白具有特异反应性(图9)。
给小鼠施用10LD50登革病毒菌株H 241 MP-24,保护作用的第一个实验显示用400微克重组蛋白免疫接种的小鼠的保护作用为53%,这是统计学上有意义的结果p=0.0025。
在新的实验中用明确的样品所得到更好的结果。所用方案相同,在这些方案中ELISA测试的抗DV4抗体滴度较高。一些个体的血清显示haemagglutination抑制和中和抗体。与所述测试相似的保护测试达到85%的保护作用,p=0.0001。
实际上,因为从未报道过在任何表达系统中E基因作为单基因表达,所以颗粒形成是有趣的现象。一旦颗粒以此方式纯化,这应可以在激活免疫应答中起重要作用。事实上巴斯德毕赤酵母已成为引人注目的这种蛋白的表达系统。
也可以通过电镜和免疫显微镜来检测重组蛋白产量。通过这些技术,蛋白表面为两种主要形式,大的胞质内集合物(图10a)和颗粒形式(图10b)。实施例3
表达载体pDE2-21是获得含血清型2病毒包膜基因的酵母表达载体的起点。实施例1中已描述了表达载体pDE2-21并且此载体包括表达代表血清型2登革病毒的甲基营养型巴斯德毕赤酵母菌株A/15包膜基因产物的遗传信息,并且此菌株是从1981年发生在古巴的登革热流行病中分离的。
为此,对包基因进行修饰。它包括在位点1407处用EcoRI切割此处的基因。用klenow酶填补末端并最终与T4连接酶相连。将连接产物转化进大肠杆菌细胞菌株K12/XL-1 Blue,然后将其铺在含氨苄霉素的LB培养基上。随机挑取20个菌落。并通过微碱法抽提DNA(Guilles,1989)。一旦提取DNA,就开始有EcoRV和EcoRI酶进行限制性酶分析。挑取阳性克隆以证实修饰后的核苷酸序列区。为此,使用商业用试(sequenase version 2.0 DNA测序试剂盒,USB,USA)和两个引物,一个位于修饰区的5′端,另一个位于修饰区的3′端,如实施例1中所述的后者以前已用来扩增包膜条带。5′引物的序列是:2290 5′TCATGGACTATGAAAATCCT 3′23093′引物是:2432 5′CAGATATCTTAAGCCTGCAACCATAGCTCCC 3′2403如前面实施例所述的,根据以前公开的结果引物两侧序列数目对应于核苷酸序列位点((Deubel V,Kinney RM,Trent DW.,牙买加2型基因型登革病毒非结构蛋白的核苷酸序列和推测的氨基酸序列:全长基因组的比较分析,病毒学,1988,165:234-244)。
当已确定修饰区序列时,就可以证实EcoRI位点的缺失,以及基因1407位点的终止密码子TTA的插入,包膜在79碱基对和最后27个氨基酸处截断。就这样可得到质粒pDE2-21 EcoRI-7(图11),初步纯化此质粒并保存以备今后使用。
然后用10单位EcoRI酶消化10微克质粒以得到如所述的完整但功能上截短的包膜。
通过LGT方法纯化此片段后,将其在载体中克隆以便在酵母中表达8.5kb的pPS-7(欧洲专利申请EP 438200)。
此质粒包含巴斯德毕赤酵母乙醇氧化酶基因启动子,接着是用于Sacarosa invertasa(Sucll)的酿酒酵母分泌信号,酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP-T)基因转录的终止子,允许生长在组氨酸缺陷型基本培养基的选择标记物HIS-3,以及巴斯德毕赤酵母的信号3AOX。接着Sucll,Ncol位点是唯一的克隆位点。
用Mung-Bean核酸酶(Biolabs)在37℃消化10微克pPS-71小时以完成克隆。
为此,取5微克pPS-7/Nco1并在25℃与每1.14pmol的5′末端有10单位酶培养1小时。一旦末端被修饰,就用碱性磷酸酶(CIP)处理。
接着,取100纳克pPS-7/NcoI/MB/CIB并在T4 DNA连接酶存在时与30纳克的pDE2-21(EcoRI-7)的EcoRV条带一起培养(图11)。
将连接产物转化入大肠杆菌细胞菌株k-12/XL-1 Blue(BullokWO,Fernandez TM,Shote JM.XL-Blue质粒,用β一半乳糖苷酶选择转化recA的大肠杆菌菌株的高效质粒,生物技术,1987,5:376-379),然后将其铺在含氨苄霉素的LB培养基上。所有菌落独自生长利于通过菌落杂交方法来筛选重组子。挑选阳性克隆进行限制性检测分析。如实施例1所述,使用由LGT方法以前纯化的质粒pDE2-21的1.485kb条带来实行此方法。用放射性同位素32P标记此条带(32P,Amersham International,Amersham,UK)。
通过微碱法(Guilles,1989)从阳性克隆提取DNA并用EcoRI酶进行限制性分析以确定含正确条带方向的克隆。
挑选正确克隆时使用商业用试剂盒(sequenase version 2.0 DNA测序试剂盒,USB,USA)对包膜5′和Suc连接处3′端测序。此方法所用引物序列是:1241 5′CCCCATCCTCTG TCTACCATG 3′1220
就这样可得到质粒pDSE2-34(图12),此质粒经大规模纯化并保存用于今后的酵母电穿孔中。电穿孔
基本上根据Martinez等,1993的方法(Martinez E,Garcia C yMorales-Grillo J.,通过电穿孔快速转化非酵母,Biotech techn,1993;7:895-896)进行电穿孔过操作。
在重新激活-70℃甘油保存的巴斯德毕赤酵母菌株后,使其生长在YPG培养基上并于28℃培养72小时。此后,在无菌条件下选取20个3毫米大小的菌落并使其重新悬浮在1.5毫升eppendorf试管的1毫升双蒸水中。细胞在微量离心机中4℃3200rpm离心3分钟,然后溶于200微升的1M山梨醇缓冲液进行电穿孔,然后转移至0.2厘米的电穿孔杯中(Gene-Pulser Cuvettes,Bio-Rad,USA)。
每个杯中加入5微升溶液,溶液包含先前用Cla1酶和40微升SaLI酶(Amersham,UK)切割的500纳克质粒pPDSE234(图13)。此方法在低温条件下进行。使用商业用电穿孔仪(基因脉冲转染仪,Bio-Rad,USA)。此方法的参数是:电阻200w;电宣传品25μF;电压2kv;放电时间3.4ms。可根据生产商的说明书些条件。
将电穿孔细胞重新悬浮于1毫升冰山梨醇中。取500微升铺在含2%葡萄糖的无氨基酸的YNB(酵母氮基,Difco,USA)基本培养基上。28℃培养96小时。所长出的菌落被分离至含2%葡萄糖的YNB新鲜培养基平板上,28℃再培养72小时。根据Ferbeyre等1993年的方法进行DNA印迹分析(Ferbeyre G,Villareal A,Morales-Grillo J.一种快速制备用于DNA分析的高分子量酵母DNA的方法生物技术1993;14:386)。
随机挑取15个克隆,接种5毫升YPG培养基的培养物并在28℃250rpm循环摇动的摇床(Blanc-LaBo S.A.,Ch-1131,Switzerland)上培养16小时。
将生长细胞在4℃3200rpm离心32分钟(Jouan,GR 41-11,France),倒掉上清液,多面手用无菌水冲洗并在4℃次离心3分钟。沉淀重新重新悬浮于溶解缓冲液(Annex 1)中,并加入25微升Zimolaze使其浓度为20毫克/毫升(Seikagakn Corporation,Japan),加入25向升链霉蛋白酶使其浓度为16毫克/毫升(Merck,Germany)和10微升Rnasa使其浓度为16毫克/毫升(Boehringer,Gmbh,Germany)。此混合物在37℃培养1小时。接着在-70℃用无水乙醇(Merck,Germany)抽提1小时。
4℃样品在微量离心机中12000rpm离心15分钟。然后用70%乙醇冲洗抽提的DNA并在相似条件下再次离心。对溶于100微升TE的DNA真空干燥(Speed-Vac ALPHA,Switzerland)15分钟,并测试抽提质量。
37℃用10单位限制性内切酶EcoRI(图14)和15微克EcoRI和EcoRV(图15)(Amersham,UK)消化15微克DNA以确定整合特征。
消化后,根据Sambrook等1989年的方法进行DNA印迹分析(Sambrook J,Frissch EF,Maniatis T,分子克隆:实验指南,第2版,纽约,冷泉港实验室,冷泉港1989)。根据杂交和核酸印迹方法进行杂交反应(Hyubond-N+ Protocols,Amershan,UK)。先前由LGT方法的用限制性酶ClaI/SALI消化的质粒pDE2-21产物条带用作探针。此用此探针与两种酶消化的DNA进行杂交,而含AOX1启动子序列的由LGT方法纯化的质粒pPS-7的Nco1/Clal条带与用EcoRI酶切割的DNA杂交。
用限制性酶HindIII和EcoRI消化的入噬菌体DNA作为分子量标记物。
用限制性酶Clal/SALI消化的质粒pDSE2-34和实施例1中所述的酵母菌株YDE221-14作为实验的阳性对照,其中DNA被双位消化或消化两次。
没有外推(MP-36)的相同巴斯德毕赤酵母菌株提取的DNA作为阴性对照。菌株MP-36和克隆YDE221-14作为DNA印迹的对照物,其中DNA仪被EcoRI消化,入噬菌体的DNA被限制性酶HindIII消化。鉴定克隆时,选取克隆1,2,3和4,命名为YDSE234-1、2、3、4用于表达研究。克隆YDSE234的表达研究
从用克隆YDSE234-1,2,3和4的小份甘油菌种接种的YPG固体培养基平板中挑取一个菌落。用此克隆接种50毫升盐水培养基[22克/升(NH4)2SO4,18.2克/升K2HPO4,7.5克/升MgSO4·7H2O,0.5克/升CaCl2,3%甘油,400×5毫升维生素溶液,1毫升微量盐溶液,pH调节至5.0]中的预培养物,并在摇床上于30℃、250rpm培养12小时。此体积用作500毫升相同培养基中的接种物,然后此体积用作装有含20%酵母提取物的盐水培养基的5升发酵物的接种物。发酵条件是:
于28℃、500rpm、3vvm通风条件培养24小时。当生长培养物用完作为碳源的甘油时,用甲醇(BDH,Germany)诱导AOX1启动子,当湿重达到约70克/升时通过pH升高记录生长。用以往表达HBsAg的巴斯德毕赤酵母克隆的发酵经验(欧洲专利申请EP 480525A2),考虑培养物湿重的增加来调整甲醇流量。同时振荡和通风分别增加至750rpm和5vvm。在发酵48小时时加入与培养基中相同百分含量的维生素添加剂和盐,90℃时再次补充盐但用量为先前所用百分含量的一半。在发酵120小时时通过在1升试管中于3000rpm、4℃离心30分钟收集生物质,倒掉培养基上清液。用PBS缓冲液(pH7.2)洗所得湿生物质,并称重以确定发酵过程的产量(克/升),约为200克/升。接着,将沉淀重新悬浮于1倍体积裂解缓冲液中以得到40%终浓度。通过机械研磨法进行破碎,通过纤维素膜(Dynomill,USA)过滤6次,所得物质于3000rpm离心30分钟。上清在超速离心机(Hitachi CSP7OH,RP 45T转头,Japan)中于15000rpm再离心30分钟。合并两次沉淀并用裂解缓冲液洗两次。
按如下方法通过特异ELISA检测发酵上清液发现有特异反应性:扩增的三明治样检测,用人血清(二次感染)免疫球蛋白作为覆盖,MIAF作为由偶联过氧化酶的三极抗小鼠抗体观测到的二极抗体。
从这些检测中发现所有克隆都有良好反应性(图16)。所用溶液的优点
酿酒酵母由于其自身优势而传统上用作以酵母为基础的表达系统,例如易操作,突变异源蛋白的基因构建和表达,易操作原核生物与细胞结构的结合,以及生化组成与其它真核生物相近。后者允许像形成二硫键切割,ENDOPROTEOLYTICS糖基化作用和ENSAMBLAJE MULTIM*RICO的基因产物翻译后加工。此外,它们优选可引起哺乳运动基因高表达的高等生物细胞密码子。酵母通过与动物和高等植物相似的机理(Kigsman S M y col.酿酒酵母的异源基因表达生物技术和遗传工程评论1990;(3版)Russell G.E)。除了它们对人类无害外,相反它们用来制备饮料和食品及获得代谢物(Hadfield C,Raina KK,Shashi-Menon K y col.酵母克隆基因的表达和施行Mycol Res1993;97(8):897-944.16-Itakura K,Hirose T,Crea R y col.在大肠杆菌中表达化学合成的生长激素抑制素基因科学1978;198:1056-1063)。
除了已知酿酒酵母的遗传和重量知识及其优点外,有时因为所选的表达启动子是弱启动子,作为接种物不易调控或难以调控所以酵母不是蛋白表达的理想宿主(Shuster J R.酵母中异源蛋白的调控基因表达En:G G Stewart,I Russel,R D Klein y R R Hiebsch(Ed)工业酵母的生物研究1987;CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla,Vol(2):19-25)。此外,因为高糖基化作用和细胞壁的大小一起阻遏分泌产物释放到培养中,所以产物滞瘤在酵母外周胞质。酿酒酵母分泌蛋白的水平低。此外,高糖基化作用增加分泌产物的硬度,这可能影响其天然特征及生物活性(Lemoine Y“酵母的异源表达“,第8次国际生物技术大会,巴黎,1988年7月17-22日;Schultz L D,Tanner J,Hofman K J y col.来自EB病毒的400Kda包膜糖蛋白在酵母中的表达和分泌基因1987;54-113-123)。
这就是为什么近来二次生产酵母的表达系统使用甲基营养型酵母。在这些系统中,巴斯德毕赤酵母已成功地用来克隆和表达异源基因(Cregg J M,Digan M E,Tschopp J F y col.巴斯德毕赤酵母中外源基因的表达En:C L Hershberger S W Gueener y Hegeman G(Eds)工业微生物的遗传学和分子生物学1989:343-352)。由于其它优越的特征,使之比酿酒酵母更引人注目。
它具有在酵母基因组中以稳定受控的方式表达整合DNA序列的能力。它含有可以调控非常精确的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,这是一个优势,可以获得对宿主产生有害效应的产物(Cregg JM,Ischopp Jf,Stillman C y col.乙型肝炎病毒表面抗原在甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母中的高水平表达和有效组装生物技术1987;5:479-485)。
本系统的另一重要方面是具有重组子生长的方法,可发醇产生大体积、高细胞密度,无毒和无病原体,高产量异源蛋白。如盐混合物所定义的使用廉价的培养基,TRAZAS元素,生物素和廉价碳源用作克隆基因导入的底物,例如甲醇(Wegner EH.高细胞密谋时通过酵母发酵的生化转变美国专利4414329,1983)。
具体的优点是巴斯德毕赤酵母的分泌特征,尽管向培养基分泌少量天然蛋白,但是在细胞外培养基中可观测到高百分含量的异源蛋白,这一系统也允许蛋白的纯化(Cregg JM,Vedvick T y Paschke W C.巴斯德毕赤酵母中外源基因表达的最新进展Bio/Tech 1993;11:905-910)。
目前,巴斯德毕赤酵母表达系统已成功地用来获得几种商业用异源蛋白,包括乙型肝炎病毒表面抗原(EP 480525A2),破伤风毒素片段C,这些可用作免疫原(Cregg JM,Ischopp JF,Stillman C y col.乙型肝炎病毒表面抗原在甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母中的高水平表达和有效组装,生物技术1987;5:479-485)。
考虑到本发明目标是获得抗登革病毒的疫苗制品,巴斯德毕赤酵母系统由于自身的优势及以前用它得到过另一种病毒疫疫苗而成为引人注目的新系统。
附图描述
图1:质粒构建的总Sc方法
图2:已用EcoRV消化的D2酵母克隆的DNA印迹。MP-36作为阴性对照。D2包膜基因条带作为探针。所有克隆都显示1485bp附近的一条带。
图3:使用抗DV2小鼠免疫腹水(MIAF)通过蛋白印迹在沉淀中观测到DV2重组包膜蛋白。用载体pNAO转化的酵母克隆的相似制品作为阴性对照。
A:阴性对照酵母克隆的沉淀,B:酵母克隆pDYE2-14的沉淀,C:低分子量方式。
图4:使用抽提缓冲液(8M尿素,PBS),通蛋白印迹用抗DV2MIAF观测到沉淀中所溶的DV2重组包膜蛋白。A:阴性对照的可溶蛋白,B:酵母克隆pDYE2-14的可溶蛋白(还原),C:酵母克隆pDYE2-14的可溶蛋白(非还原),D:低分子量标记物。
图5:质粒pDE4-47构建总表。
图6:克隆YDFE447-61的DNA印迹。用EcoRI消化DNA并用质粒pDFE4-47的ClaI/SacI条带。在所有克隆中都观察到1.203kb条带。在MP-36中显示了预测的5.5kb条带。
图7:通过抗DV4小鼠免疫腹水(MIAF)在沉淀中用蛋白印迹观测到DV4重组包膜蛋白。用载体pFAO转化的克隆的相似制品作为阴性对照。
图8:用抽提缓冲液(8M尿素,PBS)溶解的DV4重组包膜蛋白形成沉淀,在发酵不同时间取不同样品。通过蛋白印迹用抗DV4 MIAF进行检测。
图9:用50%的饱和硫酸铵沉淀原提取物。在1/500和1/1000稀释液间可获得血清反应性。蛋白印迹技术显示登革病毒的天然包膜蛋白有特异反应性。
图10:通过免疫电镜观测的重组抗原。抗原在细胞内胞质(a)形成集合物并是以颗粒形式存在(b)。黑点标记特异的免疫检测。用箭头表示颗粒。
图11:质粒pDE2-21(EcoRI-7)构建的总表。
图12:质粒pDSE2-34构建的总表。
图13:质粒pDSE2-34的细表。
图14:克隆YDSE234-1,2,3,4的DNA印迹。用EcoRI消化DNA。用质粒pPS-7的Nco1/Clal条带作为探针。用HindIII/EcoRI消化的入噬菌体DNA作为分子量。在克隆1中两条带(11kb附近和4.6kb与4.9kb间的条带)证实可能存在多整合。在其它克隆中显示9.5kb(AOX1-SucII-Env-Gapt-His3-3′AOX和AOX1基因座两侧的基因组片段)。在MP36中显示预测的5.5kb条带。
图15:克隆YDSE234-1,2,3,4的DNA印迹。用EcoRI/EcoRV消化的DNA。质粒pDSE234的ClaI/Sal I条带作为探针。用D2包膜的同一个质粒ClaI/SalI序列作为对照。用HindIII/EcoRI消化的入噬菌体DNA作为分子量。条带从上至下是:8.1kb(AOX1-SucII-Env-Gapt-His 3-3′AOX),克隆1的3kb(由于多整合造成的未预测条带)MP36(预测),克隆1的1.1kb(如先前条带)和MP36(预测)。
图16:用人血清免疫球蛋白检测发酵上清液中DV2-包膜蛋白的扩增三明治样检测法。
序列表(1)基本信息(i)申请人:
(A)名称:CENTRO DE INGENIERIA GENETICA YBIOTECNOLOGIA
(B)街道:Ave.31 entre 158 y 190
(C)城市:Ciudad de La Habana
(E)国家:Cuba
(F)邮政编号(Zip):10600
(G)电话:53 7 218466
(H)传真:53 7 218070/336008
(A)名称:INSTITUTO DE MEDICINA TROPICALPEDRO KOURI
(B)街道:Autopista Novia del Mediodia Km 6
(C)城市:Ciudad de La Habana
(E)国家:Cuba
(F)邮政编号(Zip):11100
(G)电话:53 7 220633/220657
(H)传真:53 7 335061(ii)发明名称:登革病毒基因表达的方法(iii)序列数:12(iv)计算机可读形式:
(A)介质类型:软盘
(B)计算机:IBM PC兼容机
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:PatentIn Release#1.0,版本#1.30(EPO)(2)关于SEQ ID NO:1的信息:(i)序列特征
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(B)位置:1..1492
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(iv)反义:否
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(A)生物:登革病毒2
(B)株系:A15(ix)特征:
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(D)其它信息:/备注=“血清2型登革病毒毒株A15截短的包膜序列”(xi)序列描述:SEQ ID NO:11:ATGACAATGC GTTGCATAGG AATATCAAAT AGAGACTCTG TAGAAGGGGT TTCAGGAGGA 60AGCTGGGTTG ACATAGTCTT AGAACATGGA AGCTGTGTGA CGACGATGGC AAAAAACAAA 120CCAACATTGG ATTTTGAACT GATAAAAACA GAAGCCAAAC AACCTGCCAC TCTAAGGAAG 180TACTGTATAG AGGCAAAGCT GACCAACACA ACAACAGAAT CTCGCTGCCC AACACAAGGA 240GAACCCAGCC TAAATGAAGA GCAGGACAAA AGGTTCGTCT GCAAACACTC CATGGTAGAC 300AGAGGATGGG GAAATGGATG TGGACTATTT GGAAAAGGAG GCATTGTGAC CTGTGCTATG 360TTCACATGCA AAAAGATCAT GAAAGGAAAA GTCGTGCTGC CAGAAAACTT GGAATACACC 420ATTGTGATAA CACCTCACTC AGGGGAAGAG CATGCAGTCG GAAATGATAC AGGAAAACAT 480GGCAAGGAAA TCAAAATAAC ACCACAGAGT TCCATCACAG AAGCAGAGTT GACAGGCTAT 540GGCACTGTCA CGATGGAGTG CTCTCCGAGA ACGGGCCTCG ACTTCAATGA GATGGTGTTG 600CTGCAAATGG AAAATAAAGC TTGGCTGGTG CAAAGGCAAT GGTTCCTAGA CCTGCCGTTG 660CCATGGCTGC CCGGAGCGGA CACACAAGGA TCAAATTGGA TACAGAAAGA GACATTGGTC 720ACTTTCAAAA ATCCCCACGC GAAGAAACGA GATGTTGTTG TTTTGGGATC CCAAGAAGGG 780GCCATGCACA CAGCACTCAC AGGGGCCACA GAAATCCAGA TGTCATCAGG AAACGTACTG 840TTCACAGGAC ATCTCAAGTG CAGGCTGAGG ATGGACAAAC TACAGCTCAA AGGAATGTCA 900TACTCTATGT GCACAGGAAA GTTTAAAGTC GTGAAGGAAA TAGCAGAAAC ACAACATGGA 960ACAATAGTTA TCAGAGTACA ATATGAAGGG GACGGCTCTC CATGTAAGAT CCGTTTTGAG 1020ATAATGGATT TGGAAAAAAG ACATGTTTTA GGTCGCCTGA TTACAGTCAA CCCAATCGTA 1080ACAGGAAAAG ATAGCCCAGT CAACATAGAA GCAGAACCTC CATTCGGAGA CAGCTACATC 1140ATCATAGGAG TAGAGCCGGG ACAATTGAAG CTCAACTGGT TTAAGAAAGG AAGTTCTATC 1200GGCCAAATGT TTGCGACAAC AATGAGGGGA GCGAAGAGAA TGGCCATTTT AGGTGACACA 1260GCTTGGGATT TTGGATCCCT GGGAGGAGTG TTTACATCTA TAGGAAAGGC TCTCCACCAA 1320GTTTTCGGAG CAATCTATGG GGCTGCCTTC AGTGGGGTCT CATGGACTAT GAAAATCCTC 1380ATAGGAGTCA TTATCACATG GATAGGAATG AATTAA 1416(2)关于SEQ ID NO:12的信息:(i)序列特征
(A)长度:21个碱基对
(B)类型:核酸
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(A)描述:/desc=“对D2包膜5’-3’SUCII接合点测序所用的序列”(xi)序列描述:SEQ ID NO:12:CCCCATCCTC TGTCTACCAT G 21
Claims (24)
1.重组多核苷酸,其特征在于它们基本上具有包含至少部分黄病毒蛋白E的核苷酸序列,酵母表达载体克隆的核苷酸序列的部分。
2.重组多核苷酸,其特征在于具有或基本上是鉴定为序列表中Id.No.9的4型登革病毒毒株814669和鉴定为No.5和No.11的2型登革病毒毒株A15的蛋白E的编码序列的核苷酸序列或至少其部分。
3.根据权利要求1所述的重组多核苷酸,其特征在于它们是载体pDE2-21和pDFE4-47及pDSE2-34。
4.转化的微生物,其特征在于它们具有根据权利要求1,2,3所述的重组多核苷酸并分别表达重组的1,2,3,4型登革病毒的蛋白E。
5.根据权利要求4所述的转化的微生物,其特征在于它是带有表达载体pDE2-21的巴斯德毕赤酵母菌株MP-36。
6.根据权利要求4所述的转化的微生物,其特征在于它是用表达载体pDE4-47转化的巴斯德毕赤酵母。
7.根据权利要求4所述的转化的微生物,其特征在于它是用表达载体pDSE2-34转化的巴斯德毕赤酵母菌株MP-36。
8.根据权利要求5所述的转化的微生物,其特征在于它是表达2型登革病毒蛋白E的酵母菌株YDE2-21克隆13,14,21和22。
9.根据权利要求6所述的转化的微生物,其特征在于它是表达4型登革热病素蛋白E的酵母菌株YDFE4-47克隆61,74和75。
10.根据权利要求7所述的转化的微生物,其特征在于它是表达截短形式的2型登革病毒蛋白E的酵母菌株YDSE2-34克隆1,2,3,4。
11.蛋白酶底物,其特征在于它是根据权利要求8所述的酵母菌株YDE2-21克隆13,14,21,22的表达产物。
12.蛋白酶底物,其特征在于它来自根据权利要求9所述的酵母菌株YDEF4-47克隆61,74,75的表达。
13.蛋白酶底物,其特征在于它来自根据权利要求10所述的酵母菌株YDSE2-34克隆1,2,3,4的表达。
14.根据权利要求11所述的蛋白酶底物,其特征在于它具有或基本上是对应于通过重组方式得到的并鉴定为序列表中Id.No.5的2型登革病毒蛋白E的氨基酸序列或至少其部分的氨基酸序列。
15.根据权利要求12所述的蛋白酶底物,其特征在于它具有或基本上是对应于通过重组方式得到的并鉴定为序列表中Id.No.9的4型登革病毒蛋白E的氨基酸序列或至少其部分的氨基酸序列。
16.根据权利要求13所述的蛋白酶底物,其特征在于它具有或基本上是对应于通过重组方式得到的并鉴定为序列表中Id.No.11的2型登革病毒蛋白E的氨基酸序列或至少其部分的氨基酸序列。
17.根据权利要求11所述的微粒蛋白酶底物,其特征在于它具有或基本上是对应于通过重组方法得到的并鉴定为序列表中Id.No.5的2型登革病毒蛋白E的氨基酸序列或至少其部分的氨基酸序列。
18.根据权利要求12所述的微粒蛋白酶底物,其特征在于它具有或基本上是对应于通过重组方式得到的并鉴定为序列表中Id.No.9的4型登革病毒蛋白E的氨基酸序列或至少其部分的氨基酸序列。
19.根据权利要求13所述的微粒蛋白酶底物,其特征在于它具有或基本上是对应于通过重组方式得到的并鉴定为序列表中Id.No.11的2型登革病毒蛋白E的氨基酸序列或至少其部分的氨基酸序列。
20.含适当载体、稀释剂或佐剂的药物溶液,其特征在于它含有权利要求14,15,16,17,18和/或19的一个或几个蛋白酶底物。
21.含适当载体或稀释剂的诊断溶液,其特征在于它含有权利要求14,15,16,17,18和/或19的一个或几个蛋白酶底物。
22.制备权利要求14-19的重组蛋白酶底物的方法,其特征在于它具有用权利要求1的任何重组多核苷酸转化酵母,培养转化的微生物以获得这样的蛋白表达并纯化这样的表达产物的步骤。
23.分离和表达编码完整的或截短的2型登革病毒蛋白的E基因的方法,其特征在于使用鉴定为序列表中Id.No.1的引物从2型登革病毒毒株A15的总RNA分离编码此蛋白的基因,并且使用鉴定为序列表中Id.No.2和Id.No.3的引物从PCR反应扩增该基因,然后将其克隆以得到重组DNA,将重组DNA转化入先前所述的宿主中。
24.分离和表达编码完整的或截短的4型登革病毒蛋白的E基因及将其用于疫苗制品的方法,使用鉴定为序列表中Id.No.6和Id.No.7的探针通过按照已描述的分离编码该蛋白的基因的PCR反应从毒株814669分离编码此蛋白的基因,然后将其克隆以得到重组DNA,将重组DNA转化入先前所述的宿主中。
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