JPH0380083A - 新規な抗原物質及びその製法 - Google Patents
新規な抗原物質及びその製法Info
- Publication number
- JPH0380083A JPH0380083A JP2197578A JP19757890A JPH0380083A JP H0380083 A JPH0380083 A JP H0380083A JP 2197578 A JP2197578 A JP 2197578A JP 19757890 A JP19757890 A JP 19757890A JP H0380083 A JPH0380083 A JP H0380083A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- gene
- modified
- expression
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 title description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 227
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 136
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 99
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims abstract description 50
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 2
- 108700017737 hepatitis B virus L Proteins 0.000 claims abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 295
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 196
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 145
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 137
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims description 97
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims description 91
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 claims description 89
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 claims description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 85
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 81
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 80
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims description 79
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 77
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 75
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 68
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 66
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 57
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 47
- 239000011246 composite particle Substances 0.000 claims description 39
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 35
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 35
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 32
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 claims description 31
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 29
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 28
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 28
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 28
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 26
- 101001028244 Onchocerca volvulus Fatty-acid and retinol-binding protein 1 Proteins 0.000 claims description 22
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 20
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 17
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 17
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 12
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 11
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 10
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 claims description 10
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 8
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 7
- 101150023946 MOX gene Proteins 0.000 claims description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 5
- 101150073323 DAS gene Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims description 4
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 claims description 4
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 4
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 241001149669 Hanseniaspora Species 0.000 claims description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 claims 1
- 241000235088 Saccharomyces sp. Species 0.000 claims 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 claims 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 abstract description 126
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 167
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 167
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 148
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 73
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 45
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 40
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 40
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 40
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 39
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 35
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 30
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 28
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 24
- 108010002730 protein S precursor Proteins 0.000 description 23
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 22
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 20
- 101150115433 SLC26A5 gene Proteins 0.000 description 19
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 19
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 15
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 14
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 13
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 12
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 11
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 11
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 11
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 11
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 11
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 10
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 10
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 9
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 9
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 9
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 9
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- 101100350997 Caenorhabditis elegans parg-2 gene Proteins 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 8
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 8
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 7
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 7
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 7
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 7
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 5
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 5
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 5
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 5
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 5
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 5
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 5
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 4
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241001105470 Valenzuela Species 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 4
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 4
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical group NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 3
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008119 colloidal silica Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- YPSXFMHXRZAGTG-UHFFFAOYSA-N 4-methoxy-2-[2-(5-methoxy-2-nitrosophenyl)ethyl]-1-nitrosobenzene Chemical compound COC1=CC=C(N=O)C(CCC=2C(=CC=C(OC)C=2)N=O)=C1 YPSXFMHXRZAGTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 2
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 2
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 2
- 101710084021 Large envelope protein Proteins 0.000 description 2
- HQBOMRTVKVKFMN-WDSOQIARSA-N Leu-Trp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HQBOMRTVKVKFMN-WDSOQIARSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 101710169105 Minor spike protein Proteins 0.000 description 2
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 101150110789 RA3 gene Proteins 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 101150027674 S1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000509404 Scorpaenichthys marmoratus Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 241000274431 Synaphea polymorpha Species 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical class 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 2
- 241000514897 mixed subtypes Species 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229940018489 pronto Drugs 0.000 description 2
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 2
- BDQMCYCLZBSYJZ-BBXCZNCNSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-phenyl Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BDQMCYCLZBSYJZ-BBXCZNCNSA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150070733 81 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150051089 A3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 description 1
- JAMAWBXXKFGFGX-KZVJFYERSA-N Ala-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JAMAWBXXKFGFGX-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- ZEXDYVGDZJBRMO-ACZMJKKPSA-N Ala-Asn-Gln Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N ZEXDYVGDZJBRMO-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- IFTVANMRTIHKML-WDSKDSINSA-N Ala-Gln-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O IFTVANMRTIHKML-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N Ala-Gly-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101500018095 Apis mellifera APMGFYGTR-amide Proteins 0.000 description 1
- 101500018099 Apis mellifera ARMGFHGMR-amide Proteins 0.000 description 1
- ZEAYJGRKRUBDOB-GARJFASQSA-N Arg-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O ZEAYJGRKRUBDOB-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- BEXGZLUHRXTZCC-CIUDSAMLSA-N Arg-Gln-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)CN=C(N)N BEXGZLUHRXTZCC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ISVACHFCVRKIDG-SRVKXCTJSA-N Arg-Val-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O ISVACHFCVRKIDG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- PLTGTJAZQRGMPP-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC(N)=O PLTGTJAZQRGMPP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FMNBYVSGRCXWEK-FOHZUACHSA-N Asn-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O FMNBYVSGRCXWEK-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- IDDMGSKZQDEDGA-SRVKXCTJSA-N Asp-Phe-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IDDMGSKZQDEDGA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100063435 Caenorhabditis elegans din-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100291031 Caenorhabditis elegans gly-13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100489581 Caenorhabditis elegans par-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 229920008712 Copo Polymers 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102100028991 Cytochrome c1, heme protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101710093617 Dihydroxyacetone synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000005708 Eugenia stipitata Species 0.000 description 1
- 235000006149 Eugenia stipitata Nutrition 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102100035143 Folate receptor gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010067193 Formaldehyde transketolase Proteins 0.000 description 1
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N Gln-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- HHWQMFIGMMOVFK-WDSKDSINSA-N Gln-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O HHWQMFIGMMOVFK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- KVYVOGYEMPEXBT-GUBZILKMSA-N Gln-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O KVYVOGYEMPEXBT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- QBLMTCRYYTVUQY-GUBZILKMSA-N Gln-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QBLMTCRYYTVUQY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N Glu-Asn Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZQNCUVODKOBSSO-XEGUGMAKSA-N Glu-Trp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZQNCUVODKOBSSO-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 1
- BRFJMRSRMOMIMU-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BRFJMRSRMOMIMU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- DJTXYXZNNDDEOU-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)N DJTXYXZNNDDEOU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LXXLEUBUOMCAMR-NKWVEPMBSA-N Gly-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)O LXXLEUBUOMCAMR-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N Gly-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)CNC(=O)C[NH3+] XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- 108010009504 Gly-Phe-Leu-Gly Proteins 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FKESCSGWBPUTPN-FOHZUACHSA-N Gly-Thr-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FKESCSGWBPUTPN-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N Gly-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)CN CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027377 HBS1-like protein Human genes 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000916041 Homo sapiens Cytochrome c1, heme protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101001023202 Homo sapiens Folate receptor gamma Proteins 0.000 description 1
- 101001009070 Homo sapiens HBS1-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101000624524 Homo sapiens Leucine-tRNA ligase, cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 241000113368 Horseshoe bat hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N Ile-Leu-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N L-valyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDVZJYGNAGLPGJ-KKUMJFAQSA-N Leu-Asn-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MDVZJYGNAGLPGJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- YFBBUHJJUXXZOF-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YFBBUHJJUXXZOF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- JRJLGNFWYFSJHB-HOCLYGCPSA-N Leu-Gly-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O JRJLGNFWYFSJHB-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 1
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023339 Leucine-tRNA ligase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- PTYVBBNIAQWUFV-DCAQKATOSA-N Met-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCSC)N PTYVBBNIAQWUFV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IECZNARPMKQGJC-XIRDDKMYSA-N Met-Gln-Trp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N IECZNARPMKQGJC-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- AWGBEIYZPAXXSX-RWMBFGLXSA-N Met-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N AWGBEIYZPAXXSX-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- XYVRXLDSCKEYES-JSGCOSHPSA-N Met-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 XYVRXLDSCKEYES-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101100385237 Mus musculus Creg1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100260702 Mus musculus Tinagl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710139548 Myosin-binding protein H Proteins 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101800004916 Nuclease B Proteins 0.000 description 1
- 102100037214 Orotidine 5'-phosphate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010055012 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150071746 Pbsn gene Proteins 0.000 description 1
- ULECEJGNDHWSKD-QEJZJMRPSA-N Phe-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ULECEJGNDHWSKD-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- NPLGQVKZFGJWAI-QWHCGFSZSA-N Phe-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)O NPLGQVKZFGJWAI-QWHCGFSZSA-N 0.000 description 1
- YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N Phe-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- PBWNICYZGJQKJV-BZSNNMDCSA-N Phe-Phe-Cys Chemical compound N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PBWNICYZGJQKJV-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- AXIOGMQCDYVTNY-ACRUOGEOSA-N Phe-Phe-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 AXIOGMQCDYVTNY-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- NJJBATPLUQHRBM-IHRRRGAJSA-N Phe-Pro-Ser Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O NJJBATPLUQHRBM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MRWOVVNKSXXLRP-IHPCNDPISA-N Phe-Ser-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O MRWOVVNKSXXLRP-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- CQZNGNCAIXMAIQ-UBHSHLNASA-N Pro-Ala-Phe Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O CQZNGNCAIXMAIQ-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- ZYBUKTMPPFQSHL-JYJNAYRXSA-N Pro-Asp-Trp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O ZYBUKTMPPFQSHL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- OLTFZQIYCNOBLI-DCAQKATOSA-N Pro-Cys-Lys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O OLTFZQIYCNOBLI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YXHYJEPDKSYPSQ-AVGNSLFASA-N Pro-Leu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 YXHYJEPDKSYPSQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N Pro-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- XYSXOCIWCPFOCG-IHRRRGAJSA-N Pro-Leu-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XYSXOCIWCPFOCG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N Pro-Ser-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QUBVFEANYYWBTM-VEVYYDQMSA-N Pro-Thr-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QUBVFEANYYWBTM-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- CXGLFEOYCJFKPR-RCWTZXSCSA-N Pro-Thr-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O CXGLFEOYCJFKPR-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 101000947508 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Cytochrome c isoform 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100510861 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) LEU4 gene Proteins 0.000 description 1
- RFBKULCUBJAQFT-BIIVOSGPSA-N Ser-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O RFBKULCUBJAQFT-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N Ser-Gln-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- JFWDJFULOLKQFY-QWRGUYRKSA-N Ser-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JFWDJFULOLKQFY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- WNDUPCKKKGSKIQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Pro-Gln Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O WNDUPCKKKGSKIQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N Ser-Ser-Ser-Ser Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(O)=O JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000003622 TRPC4 Human genes 0.000 description 1
- UZJDBCHMIQXLOQ-HEIBUPTGSA-N Thr-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O UZJDBCHMIQXLOQ-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- STUAPCLEDMKXKL-LKXGYXEUSA-N Thr-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O STUAPCLEDMKXKL-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- RWAYYYOZMHMEGD-XIRDDKMYSA-N Trp-Leu-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 RWAYYYOZMHMEGD-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- VMXLNDRJXVAJFT-JYBASQMISA-N Trp-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O VMXLNDRJXVAJFT-JYBASQMISA-N 0.000 description 1
- YLHFIMLKNPJRGY-BVSLBCMMSA-N Tyr-Arg-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O YLHFIMLKNPJRGY-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- RYSNTWVRSLCAJZ-RYUDHWBXSA-N Tyr-Gln-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 RYSNTWVRSLCAJZ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- WURLIFOWSMBUAR-SLFFLAALSA-N Tyr-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N)C(=O)O WURLIFOWSMBUAR-SLFFLAALSA-N 0.000 description 1
- NUQZCPSZHGIYTA-HKUYNNGSSA-N Tyr-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N NUQZCPSZHGIYTA-HKUYNNGSSA-N 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N Val-Arg-Gly Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CCCN=C(N)N COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LHADRQBREKTRLR-DCAQKATOSA-N Val-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LHADRQBREKTRLR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DLYOEFGPYTZVSP-AEJSXWLSSA-N Val-Cys-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N DLYOEFGPYTZVSP-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N Val-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)C(C)C URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- LGXUZJIQCGXKGZ-QXEWZRGKSA-N Val-Pro-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N LGXUZJIQCGXKGZ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- QIVPZSWBBHRNBA-JYJNAYRXSA-N Val-Pro-Phe Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O QIVPZSWBBHRNBA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 description 1
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 description 1
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 description 1
- 101100004044 Vigna radiata var. radiata AUX22B gene Proteins 0.000 description 1
- 244000195452 Wasabia japonica Species 0.000 description 1
- 235000000760 Wasabia japonica Nutrition 0.000 description 1
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 description 1
- NUFNQYOELLVIPL-UHFFFAOYSA-N acifluorfen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 NUFNQYOELLVIPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 101150088826 arg1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010010430 asparagine-proline-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229910001679 gibbsite Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N leu-asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108010034507 methionyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- -1 p-Aminobenzoic acid Pyridoxine Hydrochloride Chemical compound 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 108010074082 phenylalanyl-alanyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010024654 phenylalanyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108010025826 prolyl-leucyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001472 pulsed field gradient Methods 0.000 description 1
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 1
- 101150116440 pyrF gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 108091035233 repetitive DNA sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000053632 repetitive DNA sequence Human genes 0.000 description 1
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 1
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- PVFDPMYXCZLHKY-MLLWLMKGSA-M sodium [(1R,2R,4aR,8aS)-2-hydroxy-5-[(2E)-2-[(4S)-4-hydroxy-2-oxooxolan-3-ylidene]ethyl]-1,4a,6-trimethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl sulfate Chemical compound [Na+].C([C@@H]1[C@](C)(COS([O-])(=O)=O)[C@H](O)CC[C@]11C)CC(C)=C1C\C=C1/[C@H](O)COC1=O PVFDPMYXCZLHKY-MLLWLMKGSA-M 0.000 description 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野１
本発明は、メチロトローフ酵母属の群から選ばれる微生
物、発現カセットを含むＤＮＡ分子、メチロトローフ酵
母の形質転換に適するベクター微生物の作製方法、Ｂ型
肝炎表面抗原の生物学的活性を有する蛋白の全部または
一部に相当する少なくとも２つのポリペプチドを含む複
合粒子、複合粒子の製造方法、並びにそれを含む組成物
、ワクチンおよび試験キットに関する。
物、発現カセットを含むＤＮＡ分子、メチロトローフ酵
母の形質転換に適するベクター微生物の作製方法、Ｂ型
肝炎表面抗原の生物学的活性を有する蛋白の全部または
一部に相当する少なくとも２つのポリペプチドを含む複
合粒子、複合粒子の製造方法、並びにそれを含む組成物
、ワクチンおよび試験キットに関する。
また、本発明は、Ｂ型肝炎ウィルスの修飾された大型表
面蛋白、特にその生物学的活性を変更および増強するよ
うにコード配列の種々の領域で修飾されたＢ型肝炎表面
り抗原、を脅威する微生物株の構築に関する。
面蛋白、特にその生物学的活性を変更および増強するよ
うにコード配列の種々の領域で修飾されたＢ型肝炎表面
り抗原、を脅威する微生物株の構築に関する。
［従来の技術］
肝炎は広範囲に及ぶ重大な感染症であり、いろいろな原
因物質により引き起こされる。重要な原因物質の１つは
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）であり ると同定され、これは約２００塩基対の一重鎖ギャップ
をもつ３２００塩基対の環状二重鎖ＤＮＡから成る特殊
なゲノムを含む直径約４３ｎｍの小型ピリオンである。
因物質により引き起こされる。重要な原因物質の１つは
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）であり ると同定され、これは約２００塩基対の一重鎖ギャップ
をもつ３２００塩基対の環状二重鎖ＤＮＡから成る特殊
なゲノムを含む直径約４３ｎｍの小型ピリオンである。
このピリオンへの感染は重症の、時々命にかかわる程の
症状をもたらす。感染者の８５％は約３カ月の病のあと
で回復し、約１％は肝組織の壊死により短期間内に死亡
し、そして約１０％はこの症状の再発に苦しむ。感染者
の約４％は一次肝細胞癌または肝硬変の危険性が増した
慢性のキャリア状態となる。
症状をもたらす。感染者の８５％は約３カ月の病のあと
で回復し、約１％は肝組織の壊死により短期間内に死亡
し、そして約１０％はこの症状の再発に苦しむ。感染者
の約４％は一次肝細胞癌または肝硬変の危険性が増した
慢性のキャリア状態となる。
感染は一般に感染性ピリオンの周生期または非経口伝達
により起こり、例えば輸血の間に、または汚染された注
射器の使用により、あるいは性的接触により感染する。
により起こり、例えば輸血の間に、または汚染された注
射器の使用により、あるいは性的接触により感染する。
従って、ＨＢＶを検出するための信頼できる診断手段の
必要性、並びに感染の危険性が高い人（例えば、慢性キ
ャリアの配偶者、高ＨＢＶ風土の地域への旅行者、慢性
キャリアの新生児、同性愛者、売春婦、薬物濫用者）を
防御するための安価に供給できるワクチンの必要性に迫
られている。さらに、第三世界の国々におＯ いては、集団予防注射用の安価なワクチンの必要性が存
在している。
必要性、並びに感染の危険性が高い人（例えば、慢性キ
ャリアの配偶者、高ＨＢＶ風土の地域への旅行者、慢性
キャリアの新生児、同性愛者、売春婦、薬物濫用者）を
防御するための安価に供給できるワクチンの必要性に迫
られている。さらに、第三世界の国々におＯ いては、集団予防注射用の安価なワクチンの必要性が存
在している。
環状の、部分二重鎖ＤＮＡゲノムを含むコア（ＨＢｃＡ
ｇ）およびカプシドまたは表面（ＨＴ３ｓＡｇ）抗原蛋
白から成るウィルス粒子のほかに、感染者の血液は表面
抗原蛋白と宿主脂質を含むＴ−（ＢｓＡｇ粒子をかなり
の量で含んでいる。これらの粒子はヒト血清から精製さ
れ、ワクチンとして製剤化された。このワクチンはＨＢ
Ｖ感染に対して防御を賦与することが判明した（Ｓｚｍ
ｕｎｅｓｓ ｅｔａｌ、 １９８０）。
ｇ）およびカプシドまたは表面（ＨＴ３ｓＡｇ）抗原蛋
白から成るウィルス粒子のほかに、感染者の血液は表面
抗原蛋白と宿主脂質を含むＴ−（ＢｓＡｇ粒子をかなり
の量で含んでいる。これらの粒子はヒト血清から精製さ
れ、ワクチンとして製剤化された。このワクチンはＨＢ
Ｖ感染に対して防御を賦与することが判明した（Ｓｚｍ
ｕｎｅｓｓ ｅｔａｌ、 １９８０）。
本明細書において、文献は第一著者と発行午を括弧内に
示すことにより掲載される。これらの文献の完全な引用
は本明細書の終わりにアルファベント順に列挙する。こ
れらの文献の教示内容は、技術の発達状態をより詳しく
説明するために、本明細書中に参照によりそのまま引用
されるものである。
示すことにより掲載される。これらの文献の完全な引用
は本明細書の終わりにアルファベント順に列挙する。こ
れらの文献の教示内容は、技術の発達状態をより詳しく
説明するために、本明細書中に参照によりそのまま引用
されるものである。
血清由来のＨＢｓＡｇからのワクチンの調製は、感染血
液の限られた供給と、感染性物質の除去および／または
不活性化を確実にするための長期にわたる厳密な試験を
受ける必要性と、により妨げられている。
液の限られた供給と、感染性物質の除去および／または
不活性化を確実にするための長期にわたる厳密な試験を
受ける必要性と、により妨げられている。
ヒトのＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染症では、血清中
にＢ型肝炎表面抗Ｊｉ’（ＨＢｓＡｇ）を含む様々な構
造が出現する［Ｔｉｏｌｌａｉｓ ｅｔ ａｌ、 Ｎａ
Ｌｕｒｅ。
にＢ型肝炎表面抗Ｊｉ’（ＨＢｓＡｇ）を含む様々な構
造が出現する［Ｔｉｏｌｌａｉｓ ｅｔ ａｌ、 Ｎａ
Ｌｕｒｅ。
１７：４８９ （１９８５）］ ｏ感染性ピリオンのほ
かに、宿主由来の脂質と３種類の肝炎表面蛋白：すなわ
ち主要（Ｓ）、中型（Ｍ）および大型（Ｌ ）蛋白との
結合により形成される直径２２ｎｍの糸状および球形粒
子（約１．００のエンベロープ蛋白を含む）が存在する
。
かに、宿主由来の脂質と３種類の肝炎表面蛋白：すなわ
ち主要（Ｓ）、中型（Ｍ）および大型（Ｌ ）蛋白との
結合により形成される直径２２ｎｍの糸状および球形粒
子（約１．００のエンベロープ蛋白を含む）が存在する
。
これらの蛋白は、Ｓ蛋白コード配列として知られる、Ｈ
ＢＶゲノム」二の２２６アミノ酸コドンの同一配列を共
有する。ＨＢ Ｖゲノム上でＳ蛋白コード配列のすぐ前
に位置する全アミノ酸コード配列をここではプレＳコー
ド配列と呼ぶことにする。
ＢＶゲノム」二の２２６アミノ酸コドンの同一配列を共
有する。ＨＢ Ｖゲノム上でＳ蛋白コード配列のすぐ前
に位置する全アミノ酸コード配列をここではプレＳコー
ド配列と呼ぶことにする。
プレＳコード配列は、Ｓ蛋白に先行する５５アミノ酸配
列（プレＳ２領域と呼ぶ）およびプレＳ２領域に先行す
る、ウィルス亜型に応じて、１０８または１１９アミノ
酸配列（プレＳｌ領域と呼ぶ）をコードする。
列（プレＳ２領域と呼ぶ）およびプレＳ２領域に先行す
る、ウィルス亜型に応じて、１０８または１１９アミノ
酸配列（プレＳｌ領域と呼ぶ）をコードする。
従って、全プレＳコード配列はａｙ亜型においては１６
３（５５プレＳ２＋１０８プレＳ１．）アミノ酸をコー
ドし、大部分のａｄ亜型においては１７４（５５プレＳ
２＋ｌ１９グレＳ１）アミノ酸をコードしている。ａｄ
およびａｙ単離物のゲノムのプレＳコード配列間の配列
比較は、ａｄ単離物のプレＳ ’ｌ領域の最初のＪ１コ
ドンがａｙ亜型に存在し沈いことを示した。一般的に採
用された命名法に一致して、本明細書全体を通してａｄ
亜型のコドンおよびアミノ酸の番号付けが用いられ、こ
のことはａｄ単離物のＨＢＶゲノムが１１７４と番号付
けされた１７４アミノ酸のプレＳ領域をコードし、一方
ａｙ亜型の１６３アミノ酸プレＳ領域が１２−１７４と
番号付けされることを意味する。
３（５５プレＳ２＋１０８プレＳ１．）アミノ酸をコー
ドし、大部分のａｄ亜型においては１７４（５５プレＳ
２＋ｌ１９グレＳ１）アミノ酸をコードしている。ａｄ
およびａｙ単離物のゲノムのプレＳコード配列間の配列
比較は、ａｄ単離物のプレＳ ’ｌ領域の最初のＪ１コ
ドンがａｙ亜型に存在し沈いことを示した。一般的に採
用された命名法に一致して、本明細書全体を通してａｄ
亜型のコドンおよびアミノ酸の番号付けが用いられ、こ
のことはａｄ単離物のＨＢＶゲノムが１１７４と番号付
けされた１７４アミノ酸のプレＳ領域をコードし、一方
ａｙ亜型の１６３アミノ酸プレＳ領域が１２−１７４と
番号付けされることを意味する。
主要蛋白（Ｓ）は２２６アミノ酸コドンＳ遺伝子により
コードされ、グリコシル化および非グリコシル化形態で
存在する。
コードされ、グリコシル化および非グリコシル化形態で
存在する。
３
中型蛋白（Ｍ）はプレＳ２領域とＳ蛋白を含む（Ｍ蛋白
： ５５＋２２６アミノ酸）。Ｍ蛋白はグリコシル化の
程度により２つの形態で存在する糖蛋白である［５ｔｉ
ｂｂｅ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、 ４６：６
２６−６２８ （１９８３）］。プレＳ２領域によって
コードされる５５アミノ酸は親水性であり、゛エンベロ
ープ遺伝子の表面に存在する免疫支配的エピトープ（残
基１３２−１３７）を含む。このエピトープはジスルフ
ィド結合依存性であり、Ｓ蛋白のエピトープより免疫原
性かあると報じられた［Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔａｌ、
５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２４：３９２−３９４ （１９８
４）； Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔａｌ、 Ｎａｔｕｒｅ、
３１５：１５４−１５６ （１９８５）］ 。プレＳ
２配列はさらに重合されたヒト血清アルブミン（ｐＨ５
Ａ）のレセプターを含む［Ｍａｃｈｉｄａ ｅＬ ａｌ
。
： ５５＋２２６アミノ酸）。Ｍ蛋白はグリコシル化の
程度により２つの形態で存在する糖蛋白である［５ｔｉ
ｂｂｅ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、 ４６：６
２６−６２８ （１９８３）］。プレＳ２領域によって
コードされる５５アミノ酸は親水性であり、゛エンベロ
ープ遺伝子の表面に存在する免疫支配的エピトープ（残
基１３２−１３７）を含む。このエピトープはジスルフ
ィド結合依存性であり、Ｓ蛋白のエピトープより免疫原
性かあると報じられた［Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔａｌ、
５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２４：３９２−３９４ （１９８
４）； Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔａｌ、 Ｎａｔｕｒｅ、
３１５：１５４−１５６ （１９８５）］ 。プレＳ
２配列はさらに重合されたヒト血清アルブミン（ｐＨ５
Ａ）のレセプターを含む［Ｍａｃｈｉｄａ ｅＬ ａｌ
。
Ｇａ５ＬｒｏｅｎＬ、、 ８６：９］０−９１８ （１
９８４）］ 、このレセプターは単量体ＨＳ Ａとも結
合することができ、肝細胞（ｐＨ５Ａのレセプターを有
する）へのＨＢＶの結合を仲介する。このような結合は
ヒトにおいて耐性または自己免疫反応へ導くであろうと
示唆された。
９８４）］ 、このレセプターは単量体ＨＳ Ａとも結
合することができ、肝細胞（ｐＨ５Ａのレセプターを有
する）へのＨＢＶの結合を仲介する。このような結合は
ヒトにおいて耐性または自己免疫反応へ導くであろうと
示唆された。
４
大型蛋白（Ｌ ）はプレＳ１領域、プレＳ２領域および
Ｓコード配列を含む（Ｌ蛋白：］０８（また（ま１１９
）＋５５１＝２２６アミノ酸）。これはグリコシル化お
よび非グリコシル化形態で存在する。Ｌ蛋白は亜型によ
り長さが異なり、例えばａｙＢよびａｄ亜型の場合、そ
れぞれ３８９および４００アミノ酸の鎖長である。プレ
Ｓ１翻訳産物も肝細胞へのＨＢ Ｖの結合に関与する。
Ｓコード配列を含む（Ｌ蛋白：］０８（また（ま１１９
）＋５５１＝２２６アミノ酸）。これはグリコシル化お
よび非グリコシル化形態で存在する。Ｌ蛋白は亜型によ
り長さが異なり、例えばａｙＢよびａｄ亜型の場合、そ
れぞれ３８９および４００アミノ酸の鎖長である。プレ
Ｓ１翻訳産物も肝細胞へのＨＢ Ｖの結合に関与する。
ＳおよびＭ転写物のプロモーターはＬ蛋白のオーブン・
リーディング・フレームに内包されているので、Ｌ蛋白
の完全なオーブン・リーディングフレームをコードする
ＤＮＡによる哺乳動物細胞の形質転換は、３種類すべて
の表面蛋白の合成をもたらず。哺乳動物細胞では、ＨＢ
ｓ Ａ ｇ粒子が分泌される［Ｔｉｏｌｌａｉｓ ｅ
Ｌ ａｌ、同上］。哺乳動物系において、Ｌ蛋白の発現
はＴ−Ｔ Ｂ ｓ Ａ ｇ粒子の分泌抑制を引き起こす
。［例えば、Ｏｕ ｅｔ ａｌ。
リーディング・フレームに内包されているので、Ｌ蛋白
の完全なオーブン・リーディングフレームをコードする
ＤＮＡによる哺乳動物細胞の形質転換は、３種類すべて
の表面蛋白の合成をもたらず。哺乳動物細胞では、ＨＢ
ｓ Ａ ｇ粒子が分泌される［Ｔｉｏｌｌａｉｓ ｅ
Ｌ ａｌ、同上］。哺乳動物系において、Ｌ蛋白の発現
はＴ−Ｔ Ｂ ｓ Ａ ｇ粒子の分泌抑制を引き起こす
。［例えば、Ｏｕ ｅｔ ａｌ。
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、 ６１７８２ （１９８７）を参照
されたい］。この現象はＬ蛋白にＮ−ミリス１−イル基
（分泌過程を妨害する）が存在することに関係かあると
提唱５ された［Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃ
ｅ、 ２３４＋１３８８−１３９］ （１９８６）；
Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅＬａｌ、 Ｊ４ｉｒｏ１．、６１
：］６７２−］６７７ （１９８７）］ 。
されたい］。この現象はＬ蛋白にＮ−ミリス１−イル基
（分泌過程を妨害する）が存在することに関係かあると
提唱５ された［Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃ
ｅ、 ２３４＋１３８８−１３９］ （１９８６）；
Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅＬａｌ、 Ｊ４ｉｒｏ１．、６１
：］６７２−］６７７ （１９８７）］ 。
容易に参照できるように、ここで論するＨＢＶ蛋白のプ
レＳ１、プレＳ２およびＳ領域のＤＮＡコード配列およ
びアミノ酸配列を以下の表Ａに示す。アミノ酸番号はコ
ドンの上に括弧で囲って示し、プラスミＦｐＲＩＴＩ０
６１６にザブクロニングしたＨＢＶ ａｄｗ単離物中
に存在するエンベロープ蛋白のオーブン・リーディング
・７レム中の最初のＡＴＧコドンから数える。このａｄ
配列の最初の１１コドンは本明細書に記載の発現カセッ
トのいずれにも存在しないので、これらの配列は表Ａに
載っていない。大腸菌Ｋ１２株６００に保有されるプラ
スミドｐＲＴＴ１０６１６は米国メリーランド州ロック
ビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
に受託番号ＡＴＣＣ３９］３１として寄託された。
レＳ１、プレＳ２およびＳ領域のＤＮＡコード配列およ
びアミノ酸配列を以下の表Ａに示す。アミノ酸番号はコ
ドンの上に括弧で囲って示し、プラスミＦｐＲＩＴＩ０
６１６にザブクロニングしたＨＢＶ ａｄｗ単離物中
に存在するエンベロープ蛋白のオーブン・リーディング
・７レム中の最初のＡＴＧコドンから数える。このａｄ
配列の最初の１１コドンは本明細書に記載の発現カセッ
トのいずれにも存在しないので、これらの配列は表Ａに
載っていない。大腸菌Ｋ１２株６００に保有されるプラ
スミドｐＲＴＴ１０６１６は米国メリーランド州ロック
ビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
に受託番号ＡＴＣＣ３９］３１として寄託された。
６−
をＡ
プレＳ１領域
辺＝匡
〈１２）
ＡＴＧ ＧＧＧ ＡＣＧ ＭＴ ＣＴＴ ＴＣＴ Ｇ
ＴＴ ＣＣＣＡＡＣＣＣＴ ＣＴＧ ＧＧＡ ＴＴＣ
ＴＴＴＭｅｔ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｓａ
ｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ｐｈｅ（２６） ＣＣＣＧＡＴ ＣＡＴ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＡ
ＣＣＣＴ ＧＣＡ ＴＴＣＧＧＡ ＧＣＣＭＣＴ
ＣＡ ＭＣＰｒｏ Ａｓｐ Ｈｌｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ（４０） ＭＴ ＣＣＡ ＧＡＴ ＴＧＧ ＧＡＣＴＴＣＭＣ
ＣＣＣＡＴＣＭＧ’ＧＡＣＣＡＣＴＧＧ ＣＣＡＡｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｓｎ
Ｐｒｏ工ｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｈｌｓ ’ｆ’ｒｐ
Ｐｒ。
ＴＴ ＣＣＣＡＡＣＣＣＴ ＣＴＧ ＧＧＡ ＴＴＣ
ＴＴＴＭｅｔ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｓａ
ｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ｐｈｅ（２６） ＣＣＣＧＡＴ ＣＡＴ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＡ
ＣＣＣＴ ＧＣＡ ＴＴＣＧＧＡ ＧＣＣＭＣＴ
ＣＡ ＭＣＰｒｏ Ａｓｐ Ｈｌｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ（４０） ＭＴ ＣＣＡ ＧＡＴ ＴＧＧ ＧＡＣＴＴＣＭＣ
ＣＣＣＡＴＣＭＧ’ＧＡＣＣＡＣＴＧＧ ＣＣＡＡｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｓｎ
Ｐｒｏ工ｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｈｌｓ ’ｆ’ｒｐ
Ｐｒ。
（５４）
ＧＣＡ ＧＣＣＡＡＣＣＡＧ ’ＧＴＡ ＧＧＡ ＧＴ
Ｇ ＧＧＡ ＧＣＡ ＴＴＣＧＧＧ ＣＣＡ ＧＧＧ
ＣＴＣＡｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌ
ｙ ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ（６８） ＡＣＣＣＣＴ ＣＣＡ ＣＡＣＧＧＣＧＧＴ ＡＴＴ
ＴＴＧ ＧＧＧ ＴＧＧ ＡＧＣＣＣＴ ＣＡＧ ＧＣ
ＴＴｈ、ｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｈｌｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ｇｌｎ Ａｌａ（８２） ＣＡＧ ＧＧＣＡＴＡ ＴＴＧ ＡＣＣＡＣＡ ＧＴＧ
ＴＣＡ ＡＣＡ ＡＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＣ
Ｔ ＧＣＣＧｌｎ Ｇｌｙ工１ｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔ
ｈｒ Ｖａｌ Ｓａｒ Ｔｈｒ工１ａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ
Ｐｒｏ Ａｌａｌ７ （９６） ＴＣＣＡＣＣＭＴ ＣＧＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＧＧＡ
ＡＧＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＡＣＴ ＣＣＣＡＴＣＴＣＴ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ工ｌｅ
５ａｒ（１１０）
（１１９１ＣＣＡ ＣＣＴ ＣＴＡ ＡＧＡ Ｇ
ＡＣＡＧＴ ＣＡＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＣＣＰｒｏ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｈｌｓ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ（１２０） ＡＴＧ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣＡＣＴ ＧＣ
ＣＴＴＣＣＡＣＣＭ ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＴ
Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｓｎ ！１ｌｉａｒ Ｔｈ
ｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｈｌｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ａｓｐ（１３４） ＣＣＣＡＧＡ ＧＴＣＡＧＧ ＧＧＴ ＣＴＧ ＴＡＴ
ＴＴＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣ＋Ａ
ＧＴｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌａｕ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ −Ｓｅｒ（１４８１ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＣＡ ＧＴＡ ＭＣＣＣＴ
ＧＣＴ ＣＣＧ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＣＣＴ
ＣＴ ＣＡＣＡＴＡＳａｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｎ工ｌｅ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ ）（ｉｓｌｌｅ（１６２）
（１
７４）ＴＣＧ ＴＣＡ ＡＧＣＴＣＣＧＣＧ ＡＧＧ
ＡＣＴ ＧＧＧ ＧＡＣＣＣＴ ＧＴＧ’ＡＣＧ ＡＡ
Ｃ８ｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａ
ｓｎ５張ｈ （１７５） ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＡＣＡＴＣＡＣＡ ＴＣＡ
ＧＧＡ ＴＴＣＣＴＡ ＧＧＡ ＣＣＣＣＴＧ
ＣＴＣＧＴＧ間ｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｎ工ｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＶａｌＴＴＡ ＣＡＧ ＧＣＧ Ｇ
ＧＧ ＴＴＴ ＴＴＣＴＴＧ ＴＴＧ ＡＣＡ ＡＧＡ
ＡＴＣＣＴＣＡＣＡ ＡＴＡＬｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ’ ＩｌｅＣＣＧ Ｃ
ＡＧ ＡＧＴ ＣＴＡ ＧＡＣＴＣＧ ＴＧＧ ＴＧＧ
ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＴＣＡＡＴ ＴＴＴ ＣＴＡＰｒ
ｏ Ｇｌｎ Ｓａｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓａｒ Ｔ
ｒｐ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｐｈｅ ＬｅｕＧＧＧ ＧＧＡ ＴＣＡ ＣＣＣ
ＧＴＧ ＴＧＴ ＣＴＴ ＧＧＣＣＡＡ ＡＡＴ ＴＣ
Ｇ ＣＡＧ ＴＣＣＣＣＡＧｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓ
ｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒ。
Ｇ ＧＧＡ ＧＣＡ ＴＴＣＧＧＧ ＣＣＡ ＧＧＧ
ＣＴＣＡｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌ
ｙ ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ（６８） ＡＣＣＣＣＴ ＣＣＡ ＣＡＣＧＧＣＧＧＴ ＡＴＴ
ＴＴＧ ＧＧＧ ＴＧＧ ＡＧＣＣＣＴ ＣＡＧ ＧＣ
ＴＴｈ、ｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｈｌｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ｇｌｎ Ａｌａ（８２） ＣＡＧ ＧＧＣＡＴＡ ＴＴＧ ＡＣＣＡＣＡ ＧＴＧ
ＴＣＡ ＡＣＡ ＡＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＣ
Ｔ ＧＣＣＧｌｎ Ｇｌｙ工１ｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔ
ｈｒ Ｖａｌ Ｓａｒ Ｔｈｒ工１ａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ
Ｐｒｏ Ａｌａｌ７ （９６） ＴＣＣＡＣＣＭＴ ＣＧＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＧＧＡ
ＡＧＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＡＣＴ ＣＣＣＡＴＣＴＣＴ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ工ｌｅ
５ａｒ（１１０）
（１１９１ＣＣＡ ＣＣＴ ＣＴＡ ＡＧＡ Ｇ
ＡＣＡＧＴ ＣＡＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＣＣＰｒｏ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｈｌｓ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ（１２０） ＡＴＧ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣＡＣＴ ＧＣ
ＣＴＴＣＣＡＣＣＭ ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＴ
Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｓｎ ！１ｌｉａｒ Ｔｈ
ｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｈｌｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ａｓｐ（１３４） ＣＣＣＡＧＡ ＧＴＣＡＧＧ ＧＧＴ ＣＴＧ ＴＡＴ
ＴＴＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣ＋Ａ
ＧＴｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌａｕ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ −Ｓｅｒ（１４８１ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＣＡ ＧＴＡ ＭＣＣＣＴ
ＧＣＴ ＣＣＧ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＣＣＴ
ＣＴ ＣＡＣＡＴＡＳａｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｎ工ｌｅ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ ）（ｉｓｌｌｅ（１６２）
（１
７４）ＴＣＧ ＴＣＡ ＡＧＣＴＣＣＧＣＧ ＡＧＧ
ＡＣＴ ＧＧＧ ＧＡＣＣＣＴ ＧＴＧ’ＡＣＧ ＡＡ
Ｃ８ｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａ
ｓｎ５張ｈ （１７５） ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＡＣＡＴＣＡＣＡ ＴＣＡ
ＧＧＡ ＴＴＣＣＴＡ ＧＧＡ ＣＣＣＣＴＧ
ＣＴＣＧＴＧ間ｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｎ工ｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＶａｌＴＴＡ ＣＡＧ ＧＣＧ Ｇ
ＧＧ ＴＴＴ ＴＴＣＴＴＧ ＴＴＧ ＡＣＡ ＡＧＡ
ＡＴＣＣＴＣＡＣＡ ＡＴＡＬｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ’ ＩｌｅＣＣＧ Ｃ
ＡＧ ＡＧＴ ＣＴＡ ＧＡＣＴＣＧ ＴＧＧ ＴＧＧ
ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＴＣＡＡＴ ＴＴＴ ＣＴＡＰｒ
ｏ Ｇｌｎ Ｓａｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓａｒ Ｔ
ｒｐ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｐｈｅ ＬｅｕＧＧＧ ＧＧＡ ＴＣＡ ＣＣＣ
ＧＴＧ ＴＧＴ ＣＴＴ ＧＧＣＣＡＡ ＡＡＴ ＴＣ
Ｇ ＣＡＧ ＴＣＣＣＣＡＧｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓ
ｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒ。
ＡＣＣＴＣＣＡＡＴ ＣＡＣＴＣＡ ＣＣＡ ＡＣＣＴ
ＣＣＴＧＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＡＴＴ ＴＧＴ ＣＣＴ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｈｌｓ Ｓａｒ Ｐｒｏ Ｔ
ｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ工ｌｅ Ｃｙｓ
Ｐｒ。
ＣＣＴＧＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＡＴＴ ＴＧＴ ＣＣＴ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｈｌｓ Ｓａｒ Ｐｒｏ Ｔ
ｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ工ｌｅ Ｃｙｓ
Ｐｒ。
ＧＧＴ ＴＡＴ ＣＧＣＴＧＧ ＡＴＧ ＴＧＴ ＣＴ
Ｇ ＣＧＧ ＣＧＴ ＴＴＴ ＡＴＣＡＴＡ ＴＴＣＣ
ＴＣＧｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｃｙｓ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｈｅ工１ｅ ｚｌｅ ｐ
ｈｅ ｒ、、ａｕＴＴＣＡＴＣＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＡ
ＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＡ ＴＴＧ ＧＴＴ
ＣＴＴ ＣＴＧＰｈｅ工１ａ Ｌａｕ Ｌｅｕ Ｌａｕ
Ｃｙｓ Ｌａｕ工１ｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ Ｌｅｕ ＬｅｕＧＡＴ ＴＡＴ ＣＡＡ ＧＧＴ
ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＣＣＧＴＴ ＴＧＴ ＣＣＴ Ｃ
ＴＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＧＧＡＡｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｃｙｓ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ工ｌｅ Ｐｒｏ ＧｌｙＴＣＡ ＡＣＡ
ＡＣＡ ＡＣＣＭＴ ＡＣＧ ＧＧＡ ＣＣＡ ＴＧ
ＣＡＡＡ ＡＣＣＴＧＣＡＣＧ ＡＣＴＳｅｒ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
ＣｙＳＬｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ ＴｈｒＣＣＴ
ＧＣＴ ＣＭ ＧＧＣＭＣＴＣＴ ＡＴＧ
ＴＴＴ ＣＣＣＴＣＡ ＴＧＴ ＴＧＣＴＧＴ
ＡＣＡＰｒｏ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｓａｒ Ｍａｔ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃ
ｙｓ Ｃｙｓ ＴｈｒＡＡＡ ＣＣＴ ＡＣＧ ＧＡＴ
ＧＧＡ ＭＴ ＴＧＣＡＣＣＴＧＴ ＡＴＴ ＣＣＣ
ＡＴＣＣＣＡ ＴＣＧＬｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ工ｌｅ Ｐ
ｒｏ ＩＩｓ Ｐｒｏ −ＳｅｒＴＣＣＴＧＧ ＧＣＴ
ＴＴＣＧＣＡ ＡＡＡ ＴＡＣＣＴＡ ＴＧＧ ＧＡ
Ｇ ＴＧＧ ＧＣＣＴＣＡ ＧＴＣ３ｅｒ Ｔｒｐ Ａ
ｌａ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｒ
ｐ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ ＶａｌＣＧＴ
ＴＴＣＴＣＴ ＴＧＧ ＣＴＣＡＧＴ ＴＴＡ ＣＴＡ
ＧＴＧ ＣＣＡ ＴＴＴ ＧＴＴ ＣＡＧ ＴＧＧＡ
ｔ’ｑ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ ｒＪｅｕ Ｖａｌ ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇ
ｌｎ Ｔｒｐ１９− ＴＴＣＧＴＡ ＧＧＧ ＣＴＴ ＴＣＣＣＣＣＡＣＴ
ＧＴＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＡＴＡ Ｔ
ＧＧＰｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓａｒ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ工
１ｅ ＴｒｐＡＴＧ ＡＴＧ ＴＧＧ ＴＡＴ ＴＧＧ
ＧＧＧ ＣＣＡ ＡＧＴ ＣＴＧ ＴＡＣＡＧＣＡＴ
ＣＧＴ（、ＡＧＴＭｅｔ Ｍｅｔ Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ
Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓ
ｅｒ工ｌｅ Ｖａｌ −ＳｅｒＣＣＣＴＴＴ ＡＴＡ
ＣＣＧ ＣＴＧ ＴＴＡ ＣＣＡ ＡＴＴ ＴＴＣＴＴ
Ｔ ＴＧＴ ＣＴＣＴＧＧ ＧＴＡＰｒｏ Ｐｈｅ工ｌ
ｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ工ｌｅ Ｐｈｅ
Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｖａｌ（４００） ＴＡＣＡＴＴ ＴＭ Ｔｙｒ工ｌｅ ５ｔｏｐ ２０− 翻訳開始コトンの５′側に位置するウィルス転写開始シ
グナルはｉｎ ｖｉｖｏでプレＳ１、プレＳ２およびＳ
蛋白の発現を支配する。哺乳動物細胞での翻訳の際に、
これらの蛋白（まグリコシル化され、以下の表に示すよ
うに一組の表面抗原をもたらす。
Ｇ ＣＧＧ ＣＧＴ ＴＴＴ ＡＴＣＡＴＡ ＴＴＣＣ
ＴＣＧｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｃｙｓ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｈｅ工１ｅ ｚｌｅ ｐ
ｈｅ ｒ、、ａｕＴＴＣＡＴＣＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＡ
ＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＡ ＴＴＧ ＧＴＴ
ＣＴＴ ＣＴＧＰｈｅ工１ａ Ｌａｕ Ｌｅｕ Ｌａｕ
Ｃｙｓ Ｌａｕ工１ｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ Ｌｅｕ ＬｅｕＧＡＴ ＴＡＴ ＣＡＡ ＧＧＴ
ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＣＣＧＴＴ ＴＧＴ ＣＣＴ Ｃ
ＴＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＧＧＡＡｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｃｙｓ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ工ｌｅ Ｐｒｏ ＧｌｙＴＣＡ ＡＣＡ
ＡＣＡ ＡＣＣＭＴ ＡＣＧ ＧＧＡ ＣＣＡ ＴＧ
ＣＡＡＡ ＡＣＣＴＧＣＡＣＧ ＡＣＴＳｅｒ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
ＣｙＳＬｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ ＴｈｒＣＣＴ
ＧＣＴ ＣＭ ＧＧＣＭＣＴＣＴ ＡＴＧ
ＴＴＴ ＣＣＣＴＣＡ ＴＧＴ ＴＧＣＴＧＴ
ＡＣＡＰｒｏ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｓａｒ Ｍａｔ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｃ
ｙｓ Ｃｙｓ ＴｈｒＡＡＡ ＣＣＴ ＡＣＧ ＧＡＴ
ＧＧＡ ＭＴ ＴＧＣＡＣＣＴＧＴ ＡＴＴ ＣＣＣ
ＡＴＣＣＣＡ ＴＣＧＬｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ工ｌｅ Ｐ
ｒｏ ＩＩｓ Ｐｒｏ −ＳｅｒＴＣＣＴＧＧ ＧＣＴ
ＴＴＣＧＣＡ ＡＡＡ ＴＡＣＣＴＡ ＴＧＧ ＧＡ
Ｇ ＴＧＧ ＧＣＣＴＣＡ ＧＴＣ３ｅｒ Ｔｒｐ Ａ
ｌａ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｒ
ｐ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ ＶａｌＣＧＴ
ＴＴＣＴＣＴ ＴＧＧ ＣＴＣＡＧＴ ＴＴＡ ＣＴＡ
ＧＴＧ ＣＣＡ ＴＴＴ ＧＴＴ ＣＡＧ ＴＧＧＡ
ｔ’ｑ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ ｒＪｅｕ Ｖａｌ ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇ
ｌｎ Ｔｒｐ１９− ＴＴＣＧＴＡ ＧＧＧ ＣＴＴ ＴＣＣＣＣＣＡＣＴ
ＧＴＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＡＴＡ Ｔ
ＧＧＰｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓａｒ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ工
１ｅ ＴｒｐＡＴＧ ＡＴＧ ＴＧＧ ＴＡＴ ＴＧＧ
ＧＧＧ ＣＣＡ ＡＧＴ ＣＴＧ ＴＡＣＡＧＣＡＴ
ＣＧＴ（、ＡＧＴＭｅｔ Ｍｅｔ Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ
Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓ
ｅｒ工ｌｅ Ｖａｌ −ＳｅｒＣＣＣＴＴＴ ＡＴＡ
ＣＣＧ ＣＴＧ ＴＴＡ ＣＣＡ ＡＴＴ ＴＴＣＴＴ
Ｔ ＴＧＴ ＣＴＣＴＧＧ ＧＴＡＰｒｏ Ｐｈｅ工ｌ
ｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ工ｌｅ Ｐｈｅ
Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｖａｌ（４００） ＴＡＣＡＴＴ ＴＭ Ｔｙｒ工ｌｅ ５ｔｏｐ ２０− 翻訳開始コトンの５′側に位置するウィルス転写開始シ
グナルはｉｎ ｖｉｖｏでプレＳ１、プレＳ２およびＳ
蛋白の発現を支配する。哺乳動物細胞での翻訳の際に、
これらの蛋白（まグリコシル化され、以下の表に示すよ
うに一組の表面抗原をもたらす。
グリコシル化
２４
Ｐ２７
Ｐ３３
ｐ３６
Ｐ３９＊
ＧＰ４２＊
Ｓ蛋白
Ｓ蛋白
プレＳ２蛋白
プレＳ２蛋白
プレＳ１蛋白
プレＳ１蛋白
＊：亜型ａｙｗ；ａｄｗ亜型から誘導されたプレＳ１蛋
白は約１．０〜１．５ｋＤａ大きく、これはＮ末端の追
加の１１アミノ酸と一致する（）Ｉｅｅｒｍａｎｎ ａ
ｔ ａｌ、 ＋９８４）。
白は約１．０〜１．５ｋＤａ大きく、これはＮ末端の追
加の１１アミノ酸と一致する（）Ｉｅｅｒｍａｎｎ ａ
ｔ ａｌ、 ＋９８４）。
１
表面抗原コード領域のＤＮＡ配列が明らかになったので
、組換えＤＮＡ技術を用いてＳ蛋白を生産しようとする
試みがなされた。Ｂｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ、（１９
７９）およびＭｕｒｒａｙ ｅＬ ａｌ、（１９８０）
並びに数人の他の研究者たちは、大腸菌によるＨ Ｂ
ｓ Ａ ｇの発現を報告した。Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ
６Ｌ ａｌ、（１９８２）は酵母によるＨ Ｂ ｓ Ａ
ｇの発現を報じた。酵母アルコルデヒドロゲナーゼ■
プロモーターの制御下にＳ蛋白コード配列を含むベクタ
ーで形質転換した酵母細胞を破壊した後に、ＨＢ■に感
染したヒトの血清中に存在するものと類似したＨ Ｂ
ｓ Ａ ｇ含有球形粒子が観察された。欧州特許公開第
０２２６８４６号（Ｔｓｃｈｏｐｐ ａｔ ａｌ、）に
は、酵母ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）によるＳ蛋白の生産が
開示されている。
、組換えＤＮＡ技術を用いてＳ蛋白を生産しようとする
試みがなされた。Ｂｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ、（１９
７９）およびＭｕｒｒａｙ ｅＬ ａｌ、（１９８０）
並びに数人の他の研究者たちは、大腸菌によるＨ Ｂ
ｓ Ａ ｇの発現を報告した。Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ
６Ｌ ａｌ、（１９８２）は酵母によるＨ Ｂ ｓ Ａ
ｇの発現を報じた。酵母アルコルデヒドロゲナーゼ■
プロモーターの制御下にＳ蛋白コード配列を含むベクタ
ーで形質転換した酵母細胞を破壊した後に、ＨＢ■に感
染したヒトの血清中に存在するものと類似したＨ Ｂ
ｓ Ａ ｇ含有球形粒子が観察された。欧州特許公開第
０２２６８４６号（Ｔｓｃｈｏｐｐ ａｔ ａｌ、）に
は、酵母ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）によるＳ蛋白の生産が
開示されている。
蛋白合成はメタノールに応答する調節領域の制御下に置
かれる。
かれる。
しかしながら、Ｓ抗原粒子をもっばら含むワクチンは一
般的に高度に防御的であるが （Ｓｚｍｕｎｅｓｓ ｅＬ ａｌ、 １９８０） 、一
部の宿主はこの種のワクチン製剤に対し貧弱に応答する
。この予防２ 接種の予測できない失敗を克服するために、プレＳ２蛋
白およびプレＳ１蛋白の発現系が開発された。プレＳ２
はＳ蛋白よりも免疫原性が強いことが知られている。例
えば、プレＳ２−およびＳ特異的エピトープを有するサ
ブウィルス粒子でマウスを免疫した際に、プレＳ２に対
する抗体応答は抗−５一応答に勝る（Ｍｉｌｉｃｈ ｅ
ｔ ａｌ、 １９８５）。
般的に高度に防御的であるが （Ｓｚｍｕｎｅｓｓ ｅＬ ａｌ、 １９８０） 、一
部の宿主はこの種のワクチン製剤に対し貧弱に応答する
。この予防２ 接種の予測できない失敗を克服するために、プレＳ２蛋
白およびプレＳ１蛋白の発現系が開発された。プレＳ２
はＳ蛋白よりも免疫原性が強いことが知られている。例
えば、プレＳ２−およびＳ特異的エピトープを有するサ
ブウィルス粒子でマウスを免疫した際に、プレＳ２に対
する抗体応答は抗−５一応答に勝る（Ｍｉｌｉｃｈ ｅ
ｔ ａｌ、 １９８５）。
さらに、プレＳ２含有゛粒子による免疫化は抗−５応答
をも誘発することが観察された。最近、免疫におけるプ
レＳｌおよびプレＳ２蛋白の役割、並びにＨＢＶ表面抗
原蛋白のＴおよびＢ＃ｌ胞認識の特異性が調べられた（
Ｍｉｌｉｃｈ、 １９８８）。
をも誘発することが観察された。最近、免疫におけるプ
レＳｌおよびプレＳ２蛋白の役割、並びにＨＢＶ表面抗
原蛋白のＴおよびＢ＃ｌ胞認識の特異性が調べられた（
Ｍｉｌｉｃｈ、 １９８８）。
Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅＬ ａｌ、（１９８５）は全
プレＳ２蛋白フード配列を含むプラスミドで形質転換し
た酵母による対応ウィルス配列の発現を開示している。
プレＳ２蛋白フード配列を含むプラスミドで形質転換し
た酵母による対応ウィルス配列の発現を開示している。
酵母転写系では、ウィルス転写開始シグナルが酵母転写
系によって認識されないので、転写開始はコド領域に汚
行する酵母プロモーターにより誘導されねばならないと
記載されている。
系によって認識されないので、転写開始はコド領域に汚
行する酵母プロモーターにより誘導されねばならないと
記載されている。
Ｉｔｏｈ ｅＬａｌ、（１９８６）および他の研究者た
ちは、酵母によるプレＳ２蛋白の発現および粒子への集
成を開示している。Ｄｅｈｏｕｘ ｅｔ ａｌ、（１９
８６）は酵母による３９ｋＤプレＳ１蛋白の発現を開示
しており、これは粒子形態に集成されると述べている。
ちは、酵母によるプレＳ２蛋白の発現および粒子への集
成を開示している。Ｄｅｈｏｕｘ ｅｔ ａｌ、（１９
８６）は酵母による３９ｋＤプレＳ１蛋白の発現を開示
しており、これは粒子形態に集成されると述べている。
Ｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ、（１９８７）の報告はプ
レＳ１蛋白とプレＳ２蛋白の両方のＳ．セレビシエによ
る発現を開示している。これらの著者は、大型蛋白が分
子量４２ｋＤの比較的安定した、非グリコシル化産物と
して存在し、粒子を形成しにくいと述べている。
レＳ１蛋白とプレＳ２蛋白の両方のＳ．セレビシエによ
る発現を開示している。これらの著者は、大型蛋白が分
子量４２ｋＤの比較的安定した、非グリコシル化産物と
して存在し、粒子を形成しにくいと述べている。
酵母Ｓ．セレビシエにより生産された表面蛋白のグリコ
シル化は、ＨＢＶに感染した個体から単離した天然に存
在する粒子に見られるグリコシル化と相違する。Ｓ蛋白
はグリコシル化されないが、プレＳ２蛋白とプレＳｌ蛋
白はＮ結合グリコシル化および非グリコシル化形態で生
産される。高マンノース型のＮ結合鎖が確認され、Ｏ結
合オリゴ糖鎖も確認された（ｌｔｏｈ ｅｔ ａｌ、
１９８６； Ｌａｎｇｌｅｙｅｔ ａｌ、 １９８８）
。
シル化は、ＨＢＶに感染した個体から単離した天然に存
在する粒子に見られるグリコシル化と相違する。Ｓ蛋白
はグリコシル化されないが、プレＳ２蛋白とプレＳｌ蛋
白はＮ結合グリコシル化および非グリコシル化形態で生
産される。高マンノース型のＮ結合鎖が確認され、Ｏ結
合オリゴ糖鎖も確認された（ｌｔｏｈ ｅｔ ａｌ、
１９８６； Ｌａｎｇｌｅｙｅｔ ａｌ、 １９８８）
。
哺乳動物細胞によるＨＢＶ表面抗原の発現も行われた。
Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ、（１９８４）は、プレＳ２
蛋白コード配列を保有するプラスミドでトランスフェク
トしたチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に
よるＨＢｓＡｇの合皮を開示した。
蛋白コード配列を保有するプラスミドでトランスフェク
トしたチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に
よるＨＢｓＡｇの合皮を開示した。
Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅＬａｌ、（１９８５）は、プレＳ２
蛋白コード配列で形質転換したマウスＬ細胞による２４
０００．２７０００および３５０００ダルトンの３種類
のＨＢｓＡｇ関連ポリペグチドの発現を開示した。得ら
れた３種類のポリペプチドは直系約２２ｎｍの免疫反応
性ＨＢ ｓ Ａ ｇ複合粒子に集成することができる。
蛋白コード配列で形質転換したマウスＬ細胞による２４
０００．２７０００および３５０００ダルトンの３種類
のＨＢｓＡｇ関連ポリペグチドの発現を開示した。得ら
れた３種類のポリペプチドは直系約２２ｎｍの免疫反応
性ＨＢ ｓ Ａ ｇ複合粒子に集成することができる。
ＭｃＬａｃｈｌａｎ ｅｔ ａｌ、（ＷＯ８８／ ０６
１８５ ）は、を椎動物細胞による種々のＨＢＶ関連蛋
白の発現を報告した。しかしながら、哺乳動物細胞によ
るプレＳ抗原の発現は一般に、Ｓ蛋白に対してプレＳ１
蛋白の相対的過剰生産のために、ＨＢｓＡｇ粒子の分泌
が抑制されるという事実により妨げられる（Ｏｕｅｔ
ａｌ、 １９８７） 。さらに、それぞれのＳ関連蛋白
の比はコントロールすることができない。
１８５ ）は、を椎動物細胞による種々のＨＢＶ関連蛋
白の発現を報告した。しかしながら、哺乳動物細胞によ
るプレＳ抗原の発現は一般に、Ｓ蛋白に対してプレＳ１
蛋白の相対的過剰生産のために、ＨＢｓＡｇ粒子の分泌
が抑制されるという事実により妨げられる（Ｏｕｅｔ
ａｌ、 １９８７） 。さらに、それぞれのＳ関連蛋白
の比はコントロールすることができない。
最後に、動物細胞の培養は費用のかかる手法であ５
す、その結果得られた産物のコストが高くなる。
現在使用されているワクチンは大きな効力をもっている
が、数パーセントのこの種のワクチンを接種された人、
特に免疫無防備状態の人（例えば、血液透析患者）は非
応答者または遅滞応答者である［例えば、Ｈａｄｌｅｒ
ｅｔ ａｌ、 Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、、
３１５：２０９−２１５ （１９８６）； およびＢｒ
ｕｇｕｅｒａ ｅＬ ａｌ。
が、数パーセントのこの種のワクチンを接種された人、
特に免疫無防備状態の人（例えば、血液透析患者）は非
応答者または遅滞応答者である［例えば、Ｈａｄｌｅｒ
ｅｔ ａｌ、 Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、、
３１５：２０９−２１５ （１９８６）； およびＢｒ
ｕｇｕｅｒａ ｅＬ ａｌ。
Ｐｏ５ｔ Ｇｒａｄ、Ｍｅｄ、Ｊ、、 ６３：１５５−
１５８ （１９８７）を参照されたい］。
１５８ （１９８７）を参照されたい］。
従って、当分野ではＨＢＶに対するさらに効、果的なワ
クチンを製造するのに有用な方法並びに組成物の必要性
が依然として残されている。
クチンを製造するのに有用な方法並びに組成物の必要性
が依然として残されている。
［発明の構成］
本発明の一面によれば、
Ａ）第一のポリペプチドをフードするｌより多いコピー
数の発現カセット（ｅｃ１）および／または第二のポリ
ペプチドをコードする１またはｌより多いコピー数の発
現カセット（ｅ ｃ ２） 、場合によりさらに第三の
ポリペプチドをコードする１またはｌより多い発現力セ
ラ１−（ｅｔ３）；また６ Ｂ）第一のポリペプチドをコードするｌコピー数の発現
カセット（ｅｃ１）および第二のポリペプチドをコード
する１またはｌより多いコピー数の発現カセット（ｅＣ
２）、場合によりさらに第三のポリペプチドをコードす
る１またはｌより多い発現カセット（ｅｃ３）； ［ここで、前記発現カセットは ａ）メタノールおよび／またはカタボライト抑制炭素源
の枯渇に応答するレギユロンＲ；ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原
の１つの生物学的活性を有する蛋白の全部または一部を
コードするオープン・リーディング・フレーム； Ｃ）場合により、ターミネータ−Ｔとして作用するＤＮ
Ａ配列； を含む、ただしＲはオープン・リーディング・フレーム
の転写を制御し、モしてＴは生産されたｍＲＮＡのポリ
アデニル化および／または転写終結を支配する］ を保有するメチロトローフ酵母属の群から選ばれる微生
物が提供される。
数の発現カセット（ｅｃ１）および／または第二のポリ
ペプチドをコードする１またはｌより多いコピー数の発
現カセット（ｅ ｃ ２） 、場合によりさらに第三の
ポリペプチドをコードする１またはｌより多い発現力セ
ラ１−（ｅｔ３）；また６ Ｂ）第一のポリペプチドをコードするｌコピー数の発現
カセット（ｅｃ１）および第二のポリペプチドをコード
する１またはｌより多いコピー数の発現カセット（ｅＣ
２）、場合によりさらに第三のポリペプチドをコードす
る１またはｌより多い発現カセット（ｅｃ３）； ［ここで、前記発現カセットは ａ）メタノールおよび／またはカタボライト抑制炭素源
の枯渇に応答するレギユロンＲ；ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原
の１つの生物学的活性を有する蛋白の全部または一部を
コードするオープン・リーディング・フレーム； Ｃ）場合により、ターミネータ−Ｔとして作用するＤＮ
Ａ配列； を含む、ただしＲはオープン・リーディング・フレーム
の転写を制御し、モしてＴは生産されたｍＲＮＡのポリ
アデニル化および／または転写終結を支配する］ を保有するメチロトローフ酵母属の群から選ばれる微生
物が提供される。
本発明のこの面の利点は、いろいろな比のプレＳ蛋白お
よびＳ蛋白を含む複合粒子を得るための手段が提供され
、これにより低コストでのこれらの複合粒子の大規模生
産が可能となる点である。
よびＳ蛋白を含む複合粒子を得るための手段が提供され
、これにより低コストでのこれらの複合粒子の大規模生
産が可能となる点である。
また、本発明は、Ｂ型肝炎表面抗原の生物学的活性を有
する蛋白の全部または一部に相当する少なくとも２つの
ポリペプチドを含む複合粒子を提供し、その際前記粒子
はＳ蛋白、プレＳ２蛋白またはプレＳ１蛋白により与え
られる少なくとも２つの抗原決定基を有し、場合により
宿主特異的脂質をさらに含むものである。
する蛋白の全部または一部に相当する少なくとも２つの
ポリペプチドを含む複合粒子を提供し、その際前記粒子
はＳ蛋白、プレＳ２蛋白またはプレＳ１蛋白により与え
られる少なくとも２つの抗原決定基を有し、場合により
宿主特異的脂質をさらに含むものである。
本明細書全体を通して用いられる以下の用語は次のよう
に定義される： ゛発現カセット″は宿主細胞内で完全な遺伝子発現単位
として機能ず・る別個のＤＮＡ領域と定義される。
に定義される： ゛発現カセット″は宿主細胞内で完全な遺伝子発現単位
として機能ず・る別個のＤＮＡ領域と定義される。
゛完全な遺伝子発現単位″は構造遺伝子およびその転写
および翻訳に必要なプロモーター並びに調節領域である
。
および翻訳に必要なプロモーター並びに調節領域である
。
“機能性ＤＮＡコード領域″は、Ｓ蛋白コード配列に同
調融合したときに、ＨＢ ｓ Ａ ｇ混合粒子の形成を
妨害しないＤＮＡコード配列を意味する。
調融合したときに、ＨＢ ｓ Ａ ｇ混合粒子の形成を
妨害しないＤＮＡコード配列を意味する。
パ機能性誘導体″は粒子形成を妨害せずかつ免疫原性ま
たは他の機能性を保持するアミノ酸変異を有するコード
配列を意味する。このような機能性誘導体は通常の特定
部位突然変異誘発または他の標準技法により作製できる
。
たは他の機能性を保持するアミノ酸変異を有するコード
配列を意味する。このような機能性誘導体は通常の特定
部位突然変異誘発または他の標準技法により作製できる
。
゛ベクター″は本発明のＤＮＡ断片を保有するＤＮ’Ａ
と定義され、例えばファージやプラスミドを含む。遺伝
子工学の分骨で習熟した者はこれらの用語を十分に理解
している。
と定義され、例えばファージやプラスミドを含む。遺伝
子工学の分骨で習熟した者はこれらの用語を十分に理解
している。
本発明（別の主題を含む）は以下の説明、実施例および
図面によりさらに詳述されるであろう。
図面によりさらに詳述されるであろう。
本発明の第一面による微生物はメヂロトロー７酵母属の
一員であり、１より多いコピー数の発現力センｈ ｅ
ｃ ｌおよび場合により１または１より多い発現力セン
ｈ ｅ ｃ ２および／または場合により１または１よ
り多い発現力センｈ ｅ ｃ ３または２つまたはそれ
以上の異なる型の発現カ七ノド少ｑ なくとも１つを保有するように遺伝子操作されている。
一員であり、１より多いコピー数の発現力センｈ ｅ
ｃ ｌおよび場合により１または１より多い発現力セン
ｈ ｅ ｃ ２および／または場合により１または１よ
り多い発現力センｈ ｅ ｃ ３または２つまたはそれ
以上の異なる型の発現カ七ノド少ｑ なくとも１つを保有するように遺伝子操作されている。
発現カセットは発現されるべきコード化蛋白が相違する
必要があり、−膜内に次の酸分を含む： ａ）メタノールおよび／またはカタボライト抑制炭素源
の枯渇に応答するレギユロンＲ０本明細書全体を通して
用いられる″レギユロン″なる用語は、所定の構造遺伝
子の発現の調節に関与するシス作用性ＤＮＡを含む。従
って、この用語は所定のコード配列に先行する配列、例
えばプロモータおよび転写因子または転写調節に関与す
る他の蛋白により認識される配列を包含する。こうして
、用語′″レギユロンの意味は既知プロモーターに相当
する配列に限定されない。メタノール誘導可能遺伝子の
既知レギユロンと同じメタノール応答を示すＤＮＡ配列
、すなわち機能的に等しい配列、も包含される。
必要があり、−膜内に次の酸分を含む： ａ）メタノールおよび／またはカタボライト抑制炭素源
の枯渇に応答するレギユロンＲ０本明細書全体を通して
用いられる″レギユロン″なる用語は、所定の構造遺伝
子の発現の調節に関与するシス作用性ＤＮＡを含む。従
って、この用語は所定のコード配列に先行する配列、例
えばプロモータおよび転写因子または転写調節に関与す
る他の蛋白により認識される配列を包含する。こうして
、用語′″レギユロンの意味は既知プロモーターに相当
する配列に限定されない。メタノール誘導可能遺伝子の
既知レギユロンと同じメタノール応答を示すＤＮＡ配列
、すなわち機能的に等しい配列、も包含される。
最近、上記特性を示す数種類のレギユロンが明らかにな
った。例えば、Ｌｅｄｅｂｏｅｒ ａｔ ａｌ、 （１
９８５）はハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａ０ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のメタノールオキシダーゼ（Ｍ
ＯＸ）構造遺伝子に先行する調節ＤＮＡ配列を開示して
いる。欧州特許第８５２０１２３５．０号（Ｕｎｉｌｅ
ｖｅｒ ＮＶ）には、ｉｎ ｖｉｖｏでメタノールオキ
シダーゼとＤＨＡＳの発現を調節するブロモターを用い
た蛋白発現系が開示されている。欧州特許第８７ ］
１０４１７号（Ｒｈｅｉｎ ＢｉｏＬａｃｈ ＧｍｂＨ
）では、ギ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＦＭＤ）
の制御下での外来蛋白の発現に適した系が提案されてい
る。Ｅｌｌｉｓ ｅｖ ａｔ、 （１９８５）はピキア
・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓＬｏｒｉｓ）から
のメタツル調節可能遺伝子の単離を開示している。メチ
ロトローフ酵母の遺伝子か−ら得られた、または得るこ
とのできる、これらのおよび他のプロモータ（メタノー
ル利用に関与すると思われる）はすべて、それらがメタ
ノールの添加および／または炭素源の枯渇に応答して、
それらにより調節される個々の遺伝子の合成を高めると
いう共通点がある。
った。例えば、Ｌｅｄｅｂｏｅｒ ａｔ ａｌ、 （１
９８５）はハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａ０ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のメタノールオキシダーゼ（Ｍ
ＯＸ）構造遺伝子に先行する調節ＤＮＡ配列を開示して
いる。欧州特許第８５２０１２３５．０号（Ｕｎｉｌｅ
ｖｅｒ ＮＶ）には、ｉｎ ｖｉｖｏでメタノールオキ
シダーゼとＤＨＡＳの発現を調節するブロモターを用い
た蛋白発現系が開示されている。欧州特許第８７ ］
１０４１７号（Ｒｈｅｉｎ ＢｉｏＬａｃｈ ＧｍｂＨ
）では、ギ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＦＭＤ）
の制御下での外来蛋白の発現に適した系が提案されてい
る。Ｅｌｌｉｓ ｅｖ ａｔ、 （１９８５）はピキア
・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓＬｏｒｉｓ）から
のメタツル調節可能遺伝子の単離を開示している。メチ
ロトローフ酵母の遺伝子か−ら得られた、または得るこ
とのできる、これらのおよび他のプロモータ（メタノー
ル利用に関与すると思われる）はすべて、それらがメタ
ノールの添加および／または炭素源の枯渇に応答して、
それらにより調節される個々の遺伝子の合成を高めると
いう共通点がある。
同じ応答を示ずＤＮＡ配列はずべて含まれる。
ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原の１つの生物学的活性を有する蛋
白の一部または全部をコードするオーブンリーディング
・フレーム（ＯＲＦ）。すでに述べたように、所定の亜
型のＢ型肝炎表面抗原は鎖長およびグリコシル化パター
ンが異なる約６種類の蛋白から戒っている。これらの蛋
白は異なる抗原決定基を示し、生存ウィルスに対し異な
る機能をもつと思われる。プレＳ免疫応答を誘起するた
めには、完全なプレＳ配列を必ずしも必要とせず、関係
のあるエピトープをコードするコドンのみをオーブン・
リーディング・フレームに含めることで十分であるだろ
う。さらに、Ｂ型肝炎表面抗原の１つの生物学的活性を
有する蛋白には、それらの生物学的活性を妨げないアミ
ノ酸の交換を受けた蛋白も含まれる。
白の一部または全部をコードするオーブンリーディング
・フレーム（ＯＲＦ）。すでに述べたように、所定の亜
型のＢ型肝炎表面抗原は鎖長およびグリコシル化パター
ンが異なる約６種類の蛋白から戒っている。これらの蛋
白は異なる抗原決定基を示し、生存ウィルスに対し異な
る機能をもつと思われる。プレＳ免疫応答を誘起するた
めには、完全なプレＳ配列を必ずしも必要とせず、関係
のあるエピトープをコードするコドンのみをオーブン・
リーディング・フレームに含めることで十分であるだろ
う。さらに、Ｂ型肝炎表面抗原の１つの生物学的活性を
有する蛋白には、それらの生物学的活性を妨げないアミ
ノ酸の交換を受けた蛋白も含まれる。
Ｃ）場合により、ターミネータ−Ｔとして作用するＤＮ
Ａ配列。それぞれの宿主生物において転写を効果的に終
結させる配列はどれもターミネータとして使用できる。
Ａ配列。それぞれの宿主生物において転写を効果的に終
結させる配列はどれもターミネータとして使用できる。
ターミネータ−は例えば転写ＲＮＡにおいてヘアピン構
造の形成および／またはポリアデニル化部位を与える傾
向のある配列でありうる。好適な実施態様では、ターミ
ネータはレギユロンを得た生物と同し生物のメタツル応
答性遺伝子および／またはレギユロンを得た遺伝子と同
じ遺伝子から誘導される。
造の形成および／またはポリアデニル化部位を与える傾
向のある配列でありうる。好適な実施態様では、ターミ
ネータはレギユロンを得た生物と同し生物のメタツル応
答性遺伝子および／またはレギユロンを得た遺伝子と同
じ遺伝子から誘導される。
３つの成分は、レギユロンが転写を調節できかつクーミ
不一夕一がそれらの間のオープン・リディング・フレー
ムの転写を終結できるように、機能しうる連鎖状態で配
列される。
不一夕一がそれらの間のオープン・リディング・フレー
ムの転写を終結できるように、機能しうる連鎖状態で配
列される。
本発明、による微生物は、第一のポリペプチドをコード
するＩより多いコピー数の発現カセットおよび／または
１または１より多いコピー数の異なる追加の発現カセッ
トの存在ゆえに、コード化蛋白の転写および翻訳が非常
に増大した量で起こるという、計り知れないほどの価値
をもっている。
するＩより多いコピー数の発現カセットおよび／または
１または１より多いコピー数の異なる追加の発現カセッ
トの存在ゆえに、コード化蛋白の転写および翻訳が非常
に増大した量で起こるという、計り知れないほどの価値
をもっている。
本発明微生物は細胞内で第一対第二ボリペプチドの希望
する比を与えるという可能性がある。従って、蛋白から
粒子を形成する際に、あらゆる組成の複合粒子を形成す
ることができる。さらに、異なる蛋白が非常に接近して
大量に生産されるために、これらの蛋白は当分野で知ら
れた粒子よりも３ ２以上のポリペプチド種から成る粒子を形成しやすい。
する比を与えるという可能性がある。従って、蛋白から
粒子を形成する際に、あらゆる組成の複合粒子を形成す
ることができる。さらに、異なる蛋白が非常に接近して
大量に生産されるために、これらの蛋白は当分野で知ら
れた粒子よりも３ ２以上のポリペプチド種から成る粒子を形成しやすい。
本発明歎生物は第一の発現力セラｈ（ｅｃ１）からＳ蛋
白の全部または一部を発現することが好ましい。なぜな
ら、この蛋白は形成されるあらゆる粒子の構造骨格を構
成するからである。１つの実施態様において、微生物は
プレＳｌ蛋白の全部または一部（例えば、この蛋白のＮ
末端に位置するプレＳ１特定ドメイン）、あるいはプレ
Ｓ２蛋白の全部または一部を表すポリペプチドを発現す
る第二の発現カセット（ｅ ｃ ２）をさらに含む。
白の全部または一部を発現することが好ましい。なぜな
ら、この蛋白は形成されるあらゆる粒子の構造骨格を構
成するからである。１つの実施態様において、微生物は
プレＳｌ蛋白の全部または一部（例えば、この蛋白のＮ
末端に位置するプレＳ１特定ドメイン）、あるいはプレ
Ｓ２蛋白の全部または一部を表すポリペプチドを発現す
る第二の発現カセット（ｅ ｃ ２）をさらに含む。
別の実施態様において、微生物はＳ蛋白の全部または一
部、プレＳ（蛋白の全部または一部、およびプレＳ２蛋
白の全部または一部から成る３種のポリペプチドを同時
に発現できるように、３つの異なる型の発現カセットを
含んでいてもよい。
部、プレＳ（蛋白の全部または一部、およびプレＳ２蛋
白の全部または一部から成る３種のポリペプチドを同時
に発現できるように、３つの異なる型の発現カセットを
含んでいてもよい。
さらに、メチロトローフ酵母から誘導されたレギユロン
の使用は、炭素源の添加または枯渇あるいは容易に利用
できるメタノールの添加により細胞培養の抑制、抑制解
除または誘導を可能にする。
の使用は、炭素源の添加または枯渇あるいは容易に利用
できるメタノールの添加により細胞培養の抑制、抑制解
除または誘導を可能にする。
４
メチロトローフ酵母のグループは次の属：カンジダ（Ｃ
ａｎｄ４ｄａ） ｔクロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）
、ザンカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、トルロプシ
ス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）およびピキア（Ｐｉｃｈｉ
ａ） 、好ましくはハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕ Ｉａ
）から成る。最適な実施態様では、本発明微生物はカン
ジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ）
、ピキア・バストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ
）またはハンセヌラ◆ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌ
ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）から誘導される。これらの
属の酵母は当分野でよく知られており、それらの一般的
な培養・増殖条件は確立されている。
ａｎｄ４ｄａ） ｔクロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）
、ザンカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、トルロプシ
ス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）およびピキア（Ｐｉｃｈｉ
ａ） 、好ましくはハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕ Ｉａ
）から成る。最適な実施態様では、本発明微生物はカン
ジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ）
、ピキア・バストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ
）またはハンセヌラ◆ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌ
ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）から誘導される。これらの
属の酵母は当分野でよく知られており、それらの一般的
な培養・増殖条件は確立されている。
好適なメチロトローフ酵母ハンセヌラ属の有用な菌株は
ハンセヌラ・ポリモル７７種のいずれの株であってもよ
い。最適な実施態様において、用いる株はハンセヌラパ
ポリモル７アＲＢＩＯ（ＤＳＭ５２１５）の同定特性を
もっている。ＲＢｌｏはハンセヌラ・ポリモルファＡＴ
ＣＣ３４４３８のｕｒａ３変異株である。
ハンセヌラ・ポリモル７７種のいずれの株であってもよ
い。最適な実施態様において、用いる株はハンセヌラパ
ポリモル７アＲＢＩＯ（ＤＳＭ５２１５）の同定特性を
もっている。ＲＢｌｏはハンセヌラ・ポリモルファＡＴ
ＣＣ３４４３８のｕｒａ３変異株である。
好適な実施態様では、本発明微生物は炭素源としてグリ
セロールを効率よく利用することができる。グリセロー
ルは既知のメチロトローフ酵母により異なる効率でエネ
ルギーに転換される非カタボライト抑制炭素源である。
セロールを効率よく利用することができる。グリセロー
ルは既知のメチロトローフ酵母により異なる効率でエネ
ルギーに転換される非カタボライト抑制炭素源である。
ハンセヌラ属の酵母種は高効率でグリセロールを代謝す
ることができるが、Ｓ．セレビシエはこの炭素源で十分
に増殖できない。さらに、グリセロールでのハンセヌラ
・ポリモルファの培養は極めて少ない量のエタノール副
生物（大規模発酵において諸問題を引き起こす）をもた
らす。
ることができるが、Ｓ．セレビシエはこの炭素源で十分
に増殖できない。さらに、グリセロールでのハンセヌラ
・ポリモルファの培養は極めて少ない量のエタノール副
生物（大規模発酵において諸問題を引き起こす）をもた
らす。
本発明の発現カセットで用いるレギユロンは好ましくは
上述した既知の属の酵母から誘導される。
上述した既知の属の酵母から誘導される。
十分に性状決定がなされたレギユロンが好適であり、例
えばハンセヌラ・ポリモルファの種々のメタノール応答
性遺伝子（例、メタノールオキシダーゼ遺伝子、ＦＭＤ
遺伝子、ＤＡＳ遺伝子、カタラーゼ遺伝子）からの調節
領域が好ましい。これらの遺伝子の大部分の調節領域は
すでに配列決定がなされており、それらの配列は発表さ
れている（例えば、Ｊａｎｏｖｉｃｚ ａｔ ａｌ、、
１９８５； Ｌｅｄｅｂｏｅｒ ｅｔａｌ、、 １９
８５； ＥＰ ８７１１０４１７） 。これらのレギユ
ロンを適当な微生物から単離する技術的手順は、それぞ
れのＤＮＡ配列および対応する＊Ｉ限パターンの知識に
より促進される。
えばハンセヌラ・ポリモルファの種々のメタノール応答
性遺伝子（例、メタノールオキシダーゼ遺伝子、ＦＭＤ
遺伝子、ＤＡＳ遺伝子、カタラーゼ遺伝子）からの調節
領域が好ましい。これらの遺伝子の大部分の調節領域は
すでに配列決定がなされており、それらの配列は発表さ
れている（例えば、Ｊａｎｏｖｉｃｚ ａｔ ａｌ、、
１９８５； Ｌｅｄｅｂｏｅｒ ｅｔａｌ、、 １９
８５； ＥＰ ８７１１０４１７） 。これらのレギユ
ロンを適当な微生物から単離する技術的手順は、それぞ
れのＤＮＡ配列および対応する＊Ｉ限パターンの知識に
より促進される。
ターミネータ−として、それが真核生物遺伝子から誘導
されようと、原核生物遺伝子から誘導されようと、形成
されつつあるｍ ＲＮ Ａを終結させるように効率よ〈
作用する配列はどれも使用できる。好適なターミネータ
−は酵母遺伝子から誘導される。先に挙げたメタノール
応答性遺伝子から得られた終結配列を使用することが最
も好ましい。
されようと、原核生物遺伝子から誘導されようと、形成
されつつあるｍ ＲＮ Ａを終結させるように効率よ〈
作用する配列はどれも使用できる。好適なターミネータ
−は酵母遺伝子から誘導される。先に挙げたメタノール
応答性遺伝子から得られた終結配列を使用することが最
も好ましい。
驚くほど多数の発現カセットが個々の宿主細胞に導入さ
れ、しかも安定して保持されるということは、本発明微
生物のもう１つの利点である。
れ、しかも安定して保持されるということは、本発明微
生物のもう１つの利点である。
般的に、特定の遺伝情報の安定した保持を達成するため
に、２つの可能性が存在する： その情報は染色体によりコード化されるか、または自律
複製ベクター（プラスミド、コスミド、ウィルスなどで
あり得る）の特定部位に保持される。通常、より高い遺
伝子量は目的の宿主生物を高コピー数の自律複製プラス
ミドまたは溶原姓ウィルスを使って形質転換することに
より得られる。
に、２つの可能性が存在する： その情報は染色体によりコード化されるか、または自律
複製ベクター（プラスミド、コスミド、ウィルスなどで
あり得る）の特定部位に保持される。通常、より高い遺
伝子量は目的の宿主生物を高コピー数の自律複製プラス
ミドまたは溶原姓ウィルスを使って形質転換することに
より得られる。
これらのプラスミドまたはウィルスは当分野でよ〈知ら
れており、通常ベクターの複製および安定保持を可能に
するレプリコンおよび選択マーカ遺伝子を含む。しかし
ながら、ウィルスはしばしば溶菌サイクルへの変換を受
けやすく、一方ブラスミドはある種の条件下で失われや
すく、往々にして連続した選択圧を必要とする。さらに
、高コピー数のグラスミドを用いても、一般に酵母にお
いて多くて約５０〜７５のコピー数が得られるにすぎな
い。他方、宿主ゲノムへの目的の遺伝情報（例０発現カ
セット）の導入には、挿入しようとするＤＮＡ配列の少
なくとも一部（好ましくは、その分子の両末端）と挿入
部位との間にある程度の相同が必要である。“従って、
所定の分子の相同組換えに使用できる組込み部位の数は
、大抵の場合１つに、限定される。この数は、多重コピ
ー数で存在する遺伝子またはＴＶのようなトランスポゾ
ン様構造をもつ遺伝子を用いて相同組換えを行う場合に
、わずかに増加する（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ、、
１９８８）。組込み型組換え現象を促進させるために、
レプリコンを欠くが、選択マーカー遺伝子（形質転換細
胞に検出可能な表現型特徴を（＝Ｊ与し、選択条件下で
の同定を可能にする）を保有するベクターを使用するこ
とが好ましい。
れており、通常ベクターの複製および安定保持を可能に
するレプリコンおよび選択マーカ遺伝子を含む。しかし
ながら、ウィルスはしばしば溶菌サイクルへの変換を受
けやすく、一方ブラスミドはある種の条件下で失われや
すく、往々にして連続した選択圧を必要とする。さらに
、高コピー数のグラスミドを用いても、一般に酵母にお
いて多くて約５０〜７５のコピー数が得られるにすぎな
い。他方、宿主ゲノムへの目的の遺伝情報（例０発現カ
セット）の導入には、挿入しようとするＤＮＡ配列の少
なくとも一部（好ましくは、その分子の両末端）と挿入
部位との間にある程度の相同が必要である。“従って、
所定の分子の相同組換えに使用できる組込み部位の数は
、大抵の場合１つに、限定される。この数は、多重コピ
ー数で存在する遺伝子またはＴＶのようなトランスポゾ
ン様構造をもつ遺伝子を用いて相同組換えを行う場合に
、わずかに増加する（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ、、
１９８８）。組込み型組換え現象を促進させるために、
レプリコンを欠くが、選択マーカー遺伝子（形質転換細
胞に検出可能な表現型特徴を（＝Ｊ与し、選択条件下で
の同定を可能にする）を保有するベクターを使用するこ
とが好ましい。
ランダム組換えは通常めったに観察されない現象である
。しかしながら、本発明によれば、多コピー数の所定の
ＤＮＡ配列をゲノムの１つまたはそれ以上の染色体に、
ランダム組換えによる挿入によって、導入することが可
能である。数百コピ程度のＤＮＡ配列を保有する形質転
換細胞を得るために、形質転換用の自律複製プラスミド
を使用することが好ましく、これは数コピーの同時組込
み現象および他のプラスミドの複製により、多数の組込
み可能なコピー（その後の細胞周期において挿入される
）を与えることができる。意外にも、多数の発現カセッ
トを保持するメチロトロフ酵母株を得ることができた。
。しかしながら、本発明によれば、多コピー数の所定の
ＤＮＡ配列をゲノムの１つまたはそれ以上の染色体に、
ランダム組換えによる挿入によって、導入することが可
能である。数百コピ程度のＤＮＡ配列を保有する形質転
換細胞を得るために、形質転換用の自律複製プラスミド
を使用することが好ましく、これは数コピーの同時組込
み現象および他のプラスミドの複製により、多数の組込
み可能なコピー（その後の細胞周期において挿入される
）を与えることができる。意外にも、多数の発現カセッ
トを保持するメチロトロフ酵母株を得ることができた。
９
好適な酵母株（例えば、ハンセヌラ属の酵母株）は約２
〜５００．好ましくは１５〜２００、特に２０〜１５０
コピーの目的のＤＮＡ配列を含む。
〜５００．好ましくは１５〜２００、特に２０〜１５０
コピーの目的のＤＮＡ配列を含む。
ひとたび希望の数の発現カセットが組込まれたら、非選
択培地での増殖サイクルによりそれ以上の組込みを妨げ
て、残存するプラスミドフビーを分離することができる
。
択培地での増殖サイクルによりそれ以上の組込みを妨げ
て、残存するプラスミドフビーを分離することができる
。
本発明微生物の特徴は多重組込みの現象である。
自律複製しうるベクターを用いた形質転換の際に、ハン
セヌラ・ポリモルファは形質転換に用いたプラスミドを
反復して組込むことが見りだされた。
セヌラ・ポリモルファは形質転換に用いたプラスミドを
反復して組込むことが見りだされた。
約１００コピーまでの導入プラスミドの反復が観察され
た。これは必須遺伝子への挿入により細胞の生存能力を
危険にさらすことなく、多コピー数の外来ＤＮＡ配列の
存在および組込みを可能にする。驚いたことに、多重Ｄ
ＮＡを含む組込み体は安定であることが分かった。
た。これは必須遺伝子への挿入により細胞の生存能力を
危険にさらすことなく、多コピー数の外来ＤＮＡ配列の
存在および組込みを可能にする。驚いたことに、多重Ｄ
ＮＡを含む組込み体は安定であることが分かった。
複合粒子を含むワクチンを設計するためには、それぞれ
のポリペプチドの比が一定している前記粒子が望ましい
。この要求を満たずために、木兄０ 明は選ばれた比の異なる発現カセットを含む微生物を提
供する。例えば、本発明微生物は、Ｓ蛋白の生物学的活
性を有する蛋白の全部または一部をコードする１〜１０
０コピーの発現カセット（ｅｃ１）およびプレＳ２−ま
たはプレＳｌ−蛋白の生物学的活性を有する蛋白をコー
ドする１コピーまたは数コピーの発現カセット（ｅ ｃ
２）を保持するであろう。
のポリペプチドの比が一定している前記粒子が望ましい
。この要求を満たずために、木兄０ 明は選ばれた比の異なる発現カセットを含む微生物を提
供する。例えば、本発明微生物は、Ｓ蛋白の生物学的活
性を有する蛋白の全部または一部をコードする１〜１０
０コピーの発現カセット（ｅｃ１）およびプレＳ２−ま
たはプレＳｌ−蛋白の生物学的活性を有する蛋白をコー
ドする１コピーまたは数コピーの発現カセット（ｅ ｃ
２）を保持するであろう。
好適な微生物は２コピーのｅｃｌ対ｌコピーのｅｃ２な
いし３０コピーのｅｃｌ対１コピーのｅｃ２の比、好ま
しくは５〜１０コピーのｅｃｌ対１コピーのｅＣ２、ま
たは６〜８コピーのｅｅｌ対１コピーのｅｃ２の比を保
持する。第三の発現カセットはｅＣ２と同じ比で、すな
わち６〜８コピーのｅｅｌ対１コピーのｅｃ３の比で導
入することができる。
いし３０コピーのｅｃｌ対１コピーのｅｃ２の比、好ま
しくは５〜１０コピーのｅｃｌ対１コピーのｅＣ２、ま
たは６〜８コピーのｅｅｌ対１コピーのｅｃ２の比を保
持する。第三の発現カセットはｅＣ２と同じ比で、すな
わち６〜８コピーのｅｅｌ対１コピーのｅｃ３の比で導
入することができる。
組込まれたコピー数の発現カセットを含む菌株をつくる
ことのほかに、自律複製配列（ＡＲ３）および目的の発
現カセットを含む自律複製ベクターを保持する微生物を
使用することができる。Ａ１ Ｒ３を含むベクターの存在および保持は当分時でよく知
られている。
ことのほかに、自律複製配列（ＡＲ３）および目的の発
現カセットを含む自律複製ベクターを保持する微生物を
使用することができる。Ａ１ Ｒ３を含むベクターの存在および保持は当分時でよく知
られている。
本発明の主題はさらに、第一のポリペプチドをコードす
る発現カセット（ｅｃ１）および第二のポリペプチドを
コードする発現カセット（ｅ ｃ ２）および／または
第三のポリペプチドをコードする発現力セラ１−（ｅｃ
３）を含むＤＮＡ分子であり、その場合前記発現カセッ
トは ａ）メタノールおよび／またはカタボライト抑制炭素源
の枯渇に応答するレギユロンＲ：ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原
の１つの生物学的活性を有する蛋白の一部または全部を
コードするオープン・リーディング・７レーム； Ｃ）場合により、ターミネータ−Ｔとして作用するＤＮ
Ａ配列： を含み、ここでＲはオープン・リーディング・フレーム
の転写を制御し、Ｔは生産されたｍＲＮＡのポリアデニ
ル化および／または転写終結を支配する。
る発現カセット（ｅｃ１）および第二のポリペプチドを
コードする発現カセット（ｅ ｃ ２）および／または
第三のポリペプチドをコードする発現力セラ１−（ｅｃ
３）を含むＤＮＡ分子であり、その場合前記発現カセッ
トは ａ）メタノールおよび／またはカタボライト抑制炭素源
の枯渇に応答するレギユロンＲ：ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原
の１つの生物学的活性を有する蛋白の一部または全部を
コードするオープン・リーディング・７レーム； Ｃ）場合により、ターミネータ−Ｔとして作用するＤＮ
Ａ配列： を含み、ここでＲはオープン・リーディング・フレーム
の転写を制御し、Ｔは生産されたｍＲＮＡのポリアデニ
ル化および／または転写終結を支配する。
レギユロン、オープン・リーディング・フレ２
ムおよびターミネータ−の性質については、先に示した
情報を参照されたい。この分子の場合も、レギユロンと
ターミネータ−はカンジダ、クロエケラ、ザッカロミセ
ス、ロドトルラ、トルロプシス、ピキアおよびハンセヌ
ラ属より選ばれたメチロトローフ酵母から誘導すること
が好ましい。最適な実施態様において、レギコロンとタ
ーミネータ−はメタノール利用に関与する遺伝子、例え
ばＭＯＸ遺伝子、ＦＭＤ遺伝子、ＤＡＳ遺伝子またはカ
タラーゼ遺伝子から誘導される。これらの遺伝子の供給
源として、ハンセヌラ・ポリモルファが好適な微生物で
ある。ｅｃｌ、ｅｃ２およびｅｃ３によりコードされる
ポリペプチドの性質に関しては、上記の説明を参照され
たい。
情報を参照されたい。この分子の場合も、レギユロンと
ターミネータ−はカンジダ、クロエケラ、ザッカロミセ
ス、ロドトルラ、トルロプシス、ピキアおよびハンセヌ
ラ属より選ばれたメチロトローフ酵母から誘導すること
が好ましい。最適な実施態様において、レギコロンとタ
ーミネータ−はメタノール利用に関与する遺伝子、例え
ばＭＯＸ遺伝子、ＦＭＤ遺伝子、ＤＡＳ遺伝子またはカ
タラーゼ遺伝子から誘導される。これらの遺伝子の供給
源として、ハンセヌラ・ポリモルファが好適な微生物で
ある。ｅｃｌ、ｅｃ２およびｅｃ３によりコードされる
ポリペプチドの性質に関しては、上記の説明を参照され
たい。
本発明のＤＮＡ分子はそれぞれの天然源から得られた断
片から構成される。Ｂ型肝炎表面抗原をコードするＤＮ
Ａは完全ウィルス（Ｄａｎｅ粒子とも呼ばれる）のＤＮ
Ａから分離できる。ＨＢ ＶビＩＪ 、！−７Ｄ Ｎ
Ａの分離、クローニングおよび塩基配列決定はＣｈａｒ
ｎａｙ ｅｔ ａｌ、（１９７９）、Ｇａ１ｉｂｅｒｔ
ｅＬａｌ、（１９７９）、５ｎｉｎｓｋｙ ａｔ ａ
ｌ、（］９７９）およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ａｔ
ａｌ、（１９７９）に記載されている。
片から構成される。Ｂ型肝炎表面抗原をコードするＤＮ
Ａは完全ウィルス（Ｄａｎｅ粒子とも呼ばれる）のＤＮ
Ａから分離できる。ＨＢ ＶビＩＪ 、！−７Ｄ Ｎ
Ａの分離、クローニングおよび塩基配列決定はＣｈａｒ
ｎａｙ ｅｔ ａｌ、（１９７９）、Ｇａ１ｉｂｅｒｔ
ｅＬａｌ、（１９７９）、５ｎｉｎｓｋｙ ａｔ ａ
ｌ、（］９７９）およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ａｔ
ａｌ、（１９７９）に記載されている。
クローニングおよびＤＮＡ操作用の制限酵素の選択は用
いる肝炎ウィルスの亜型の種類に左右される。亜型は鎖
長ばかりでなく、突然変異現象を受けやすいそれらの固
有の制限パターンに関しても相違する。当分野で習熟し
た者は、例えば分離したＤＮＡを異なる組の制限エンド
ヌクレアーゼを使って切断し、そのサンプルをゲル電気
泳動およびサザンブロッティングまたは類似の方法にか
け、そして既知の表面遺伝子配列に対応するプロブを使
って制限断片を同定することにより、目的のコード配列
をもつ制限断片を分離することが可能である。必要なら
ば、ＤＮＡの塩基配列を決定し、さらに例えばエンドヌ
クレアーゼによる処理、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発
、ブライマー修復または他の既知技法により遺伝子操作
を行って、目的の配列と適切な末端をもつ希望の大きさ
の断片をつくることができる。当業者には知られている
ように、末端はエンドヌクレアーゼによる消化、ＤＮＡ
ポリメラーゼ丁のＫｌｅｎｏｗ断片による修復、および
リンカ−またはアダプターとして合成オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドを使用することによるＤＮＡの付加また
は置換によって、目的の配列をもつように整えることが
できる。
いる肝炎ウィルスの亜型の種類に左右される。亜型は鎖
長ばかりでなく、突然変異現象を受けやすいそれらの固
有の制限パターンに関しても相違する。当分野で習熟し
た者は、例えば分離したＤＮＡを異なる組の制限エンド
ヌクレアーゼを使って切断し、そのサンプルをゲル電気
泳動およびサザンブロッティングまたは類似の方法にか
け、そして既知の表面遺伝子配列に対応するプロブを使
って制限断片を同定することにより、目的のコード配列
をもつ制限断片を分離することが可能である。必要なら
ば、ＤＮＡの塩基配列を決定し、さらに例えばエンドヌ
クレアーゼによる処理、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発
、ブライマー修復または他の既知技法により遺伝子操作
を行って、目的の配列と適切な末端をもつ希望の大きさ
の断片をつくることができる。当業者には知られている
ように、末端はエンドヌクレアーゼによる消化、ＤＮＡ
ポリメラーゼ丁のＫｌｅｎｏｗ断片による修復、および
リンカ−またはアダプターとして合成オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドを使用することによるＤＮＡの付加また
は置換によって、目的の配列をもつように整えることが
できる。
その後、それぞれの肝炎表面抗原をコードするＤＮＡ配
列は、メチロトローフ酵母のゲノムから既知技術により
得られた適当なレギコ、ロンおよび／またはターミネー
ターと結合される。従って、それぞれの断片は、コード
ＤＮＡ配列の翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドンに対
して適当な位置になるように、選ばれる。連結は既知方
法に従って行う。これらの方法は当分野でよく知られて
いるので、詳しい説明は省く。分子クローニングで用い
る技術の詳細な説明については、ＭａｎｉａＬｉｓｅＬ
ａｌ、（１９８２）による”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ を参照されたい。
列は、メチロトローフ酵母のゲノムから既知技術により
得られた適当なレギコ、ロンおよび／またはターミネー
ターと結合される。従って、それぞれの断片は、コード
ＤＮＡ配列の翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドンに対
して適当な位置になるように、選ばれる。連結は既知方
法に従って行う。これらの方法は当分野でよく知られて
いるので、詳しい説明は省く。分子クローニングで用い
る技術の詳細な説明については、ＭａｎｉａＬｉｓｅＬ
ａｌ、（１９８２）による”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ を参照されたい。
それぞれの天然源から単離したＤＮＡ配列を連結する代
わりに、目的の発現カセットの一部または全部を化学合
成により合成することもできる。
わりに、目的の発現カセットの一部または全部を化学合
成により合成することもできる。
５
化学台或は既知方法に従って行う。長いオリゴデオキシ
リボヌクレオチドの化学合成はすでに商業ベースで提供
されている。また、化学合成した断片と天然源から得た
断片との結合も本発明の目的に適っている。
リボヌクレオチドの化学合成はすでに商業ベースで提供
されている。また、化学合成した断片と天然源から得た
断片との結合も本発明の目的に適っている。
本発明の別の主題は、メチロトローフ酵母から得られた
ＵＲＡ３遺伝子を提供することである。
ＵＲＡ３遺伝子を提供することである。
この遺伝子は、ハンセヌラ・ポリモルファ制限断片の適
当なベクターへのランダム挿入により作製されたプラス
ミドで大腸菌ＭＢ１００Ｏ株の対応するｐｙｒ Ｆ変
異を補足することにより同定された。受容菌株の欠損を
補足するプラスミドが同定された。新たに同定された遺
伝子はアガロースゲルでの測定により約１４００ｂｐで
ある。その制限パターンを以下の第１０図に示す。
当なベクターへのランダム挿入により作製されたプラス
ミドで大腸菌ＭＢ１００Ｏ株の対応するｐｙｒ Ｆ変
異を補足することにより同定された。受容菌株の欠損を
補足するプラスミドが同定された。新たに同定された遺
伝子はアガロースゲルでの測定により約１４００ｂｐで
ある。その制限パターンを以下の第１０図に示す。
発現カセットの構築、増幅および宿主微生物への導入を
容易にするために、これをメチロトローフ酵母の形質転
換に適したベクターに挿入することが得策である。この
ベクターは線状または環状プラスミドもしくはウィルス
でありうる。いわゆ６ る組込み型ベクター、すなわち自律複製配列（ＡＲ５）
を欠くベクターを使用することが可能である。これらの
ベクターが組込まれない場合、それらはその後の細胞周
期において失われるであろう。
容易にするために、これをメチロトローフ酵母の形質転
換に適したベクターに挿入することが得策である。この
ベクターは線状または環状プラスミドもしくはウィルス
でありうる。いわゆ６ る組込み型ベクター、すなわち自律複製配列（ＡＲ５）
を欠くベクターを使用することが可能である。これらの
ベクターが組込まれない場合、それらはその後の細胞周
期において失われるであろう。
好適な実施態様では、ベクターは自律複製を導くことの
できるＡＲ５ＤＮＡ配列を含む。好ましくは、これらの
配列はそれぞれの宿主級生物から誘導される。メチロト
ローフ酵母の場合には、いくつかの既知ＡＲ３，例えは
ＨＡ ＲＳおよびＰＡＲ５が存在する（Ｒｏｇｇｅｎｋ
ａｍｐ ｅＬ ａｌ、、１９８６；Ｃｒｅｇｇ ｅｔ
ａｌ、、１９８５） 。これらの配列はベクタを宿主細
胞内に染色体外物質として安定に保持するように機能す
るＤＮＡ領域を含んでいる。
できるＡＲ５ＤＮＡ配列を含む。好ましくは、これらの
配列はそれぞれの宿主級生物から誘導される。メチロト
ローフ酵母の場合には、いくつかの既知ＡＲ３，例えは
ＨＡ ＲＳおよびＰＡＲ５が存在する（Ｒｏｇｇｅｎｋ
ａｍｐ ｅＬ ａｌ、、１９８６；Ｃｒｅｇｇ ｅｔ
ａｌ、、１９８５） 。これらの配列はベクタを宿主細
胞内に染色体外物質として安定に保持するように機能す
るＤＮＡ領域を含んでいる。
形質転換宿主生物の同定を容易にするために、形質転換
後目的微生物の選択に適する選択マーカー遺伝子を含め
ることがさらに有利である。当分野で知られた酵母プラ
スミドにおいて、これらの選択マーカー遺伝子はしばし
ばアミノ酸または核酸代謝に関与する酵素をコードする
ＤＮＡ配列に相当し、形質転換しようとする受容宿主生
物はこれらのＤＮＡ配列を欠損している。
後目的微生物の選択に適する選択マーカー遺伝子を含め
ることがさらに有利である。当分野で知られた酵母プラ
スミドにおいて、これらの選択マーカー遺伝子はしばし
ばアミノ酸または核酸代謝に関与する酵素をコードする
ＤＮＡ配列に相当し、形質転換しようとする受容宿主生
物はこれらのＤＮＡ配列を欠損している。
同じ戦略を使用して、形質転換メチロトローフ酵母を選
択することができる。栄養要求変異種サツカロミセス・
セレビシェの選択に通常用いられる遺伝子にはＬＥＵ２
、ＨＩ Ｓ ３、ＴＲＰ５、ＡＲＧ４およびＵＲＡ３遺
伝子が含まれる。サツカロミセス・セレビシェから得ら
れた遺伝子はメチロトローフ酵母の形質転換においても
選択マーカとして使用することができる；しかしながら
、最少培地でのこの種の形質転換細胞の生育はかなり損
なわれるであろう。それ故に、本発明の好適な実施態様
では、正常な代謝に関与するいずれか１つの遺伝子の機
能が欠損しているメチロトローフ酵母株が、野生型の相
同マーカー遺伝子を保有するＤＮＡ分子で形質転換され
る。本発明はハンセヌラ・ポリモルファの形質転換体を
選択するための相同マーカー遺伝子、すなわちＵＲＡ３
遺伝子を初めて提供する。この遺伝子の特徴、すなわち
その制限断片パターンは上で論じられる。
択することができる。栄養要求変異種サツカロミセス・
セレビシェの選択に通常用いられる遺伝子にはＬＥＵ２
、ＨＩ Ｓ ３、ＴＲＰ５、ＡＲＧ４およびＵＲＡ３遺
伝子が含まれる。サツカロミセス・セレビシェから得ら
れた遺伝子はメチロトローフ酵母の形質転換においても
選択マーカとして使用することができる；しかしながら
、最少培地でのこの種の形質転換細胞の生育はかなり損
なわれるであろう。それ故に、本発明の好適な実施態様
では、正常な代謝に関与するいずれか１つの遺伝子の機
能が欠損しているメチロトローフ酵母株が、野生型の相
同マーカー遺伝子を保有するＤＮＡ分子で形質転換され
る。本発明はハンセヌラ・ポリモルファの形質転換体を
選択するための相同マーカー遺伝子、すなわちＵＲＡ３
遺伝子を初めて提供する。この遺伝子の特徴、すなわち
その制限断片パターンは上で論じられる。
形質転換細胞のもう１つの選択方法として、抗生物質耐
性遺伝子が使用される。これは細菌の形質転換において
よく知られた手法であり、Ｓ．セレビシエに応用できる
ことが判明した（Ｊｉｍｅｎｅｚａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ
、 １９８０）。
性遺伝子が使用される。これは細菌の形質転換において
よく知られた手法であり、Ｓ．セレビシエに応用できる
ことが判明した（Ｊｉｍｅｎｅｚａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ
、 １９８０）。
しかしながら、メチロトローフ酵母の場合、クロラムフ
エニコールヤケンタマイシンＧ４１８のような抗生物質
と接触させた際のそれらの挙動に関して、これまで何も
知られて居ない。これは、形質転換後、選択濃度の生育
阻止アミノグリコシド抗生物質にメチロトローフ酵母を
さらすことにより形質転換メチロトローフ酵母を選択す
ることを報じた最初の記録であると考えられる。驚いた
ことに、Ｔ ｎ ５ （Ｇｒｉｎｄｌｅｙ、 １９８０
）から誘導されたアミノグリコシドホスホトランスフェ
ラーゼは、パン酵母から得られたプロモーターにより調
節される場合、メチロトローフ酵母においても活性を示
すことが分かった。Ｇ４１８の不活性化は、この遺伝子
が細胞内にたった１または２コピー数しか存在しない株
でも効果的であり、すなわちこの遺伝子は高コピー数を
必要としない。本発明によ９ れば、これはメチロ［・ローフ酵母の非常に効率のよい
形質転換／選択系である。
エニコールヤケンタマイシンＧ４１８のような抗生物質
と接触させた際のそれらの挙動に関して、これまで何も
知られて居ない。これは、形質転換後、選択濃度の生育
阻止アミノグリコシド抗生物質にメチロトローフ酵母を
さらすことにより形質転換メチロトローフ酵母を選択す
ることを報じた最初の記録であると考えられる。驚いた
ことに、Ｔ ｎ ５ （Ｇｒｉｎｄｌｅｙ、 １９８０
）から誘導されたアミノグリコシドホスホトランスフェ
ラーゼは、パン酵母から得られたプロモーターにより調
節される場合、メチロトローフ酵母においても活性を示
すことが分かった。Ｇ４１８の不活性化は、この遺伝子
が細胞内にたった１または２コピー数しか存在しない株
でも効果的であり、すなわちこの遺伝子は高コピー数を
必要としない。本発明によ９ れば、これはメチロ［・ローフ酵母の非常に効率のよい
形質転換／選択系である。
最適な実施態様では、本発明のベクターはｐＭＳ−２、
ｐＦＳ−９、ｐＲＢ−５，ｐＲＢ−３２６９、ｐＲＢ−
５−２７１ｐＲＢ−３−３２２、ｐＲＢ−５−３２６、
ｐＭＰＳ２２、ｐＭＰＳ２１、ｐＭＰＳ９から選ばれる
。これらのベクターの構築および使用は以下で詳細に説
明されるであろう。
ｐＦＳ−９、ｐＲＢ−５，ｐＲＢ−３２６９、ｐＲＢ−
５−２７１ｐＲＢ−３−３２２、ｐＲＢ−５−３２６、
ｐＭＰＳ２２、ｐＭＰＳ２１、ｐＭＰＳ９から選ばれる
。これらのベクターの構築および使用は以下で詳細に説
明されるであろう。
本発明の別の主題は上記のような微生物の作製方法であ
り、その場合メチロトローフ酵母宿主生物は発現カセッ
トｅｃｌおよび／またはｅｃ２および／またはｅｃ３を
保有するベクターで形質転換され、このベクターの複製
の際に発現カセットの少なくとも一部が酵母宿主生物の
染色体との組換えにより、好ましく、は多重反復として
、組込まれる。その結果、形質転換メチロトローフ生物
は全ゲノムに分散された数コピーの導入発現カセットを
含み、また恐らく多重反復の発現カセットがゲノムの一
個所に局在化されるであろう。この夕０ イブの組換えは特にハナセヌラにおいて起こることが分
かった。しかしながら、メチロトローフ酵母宿主生物は
メチロトローフ酵母属、例えばカンジダ、タロエケラ、
サツカロミセス、ロドトルラ、トルロプシス、およびピ
キアの他の種からも選ばれる。
り、その場合メチロトローフ酵母宿主生物は発現カセッ
トｅｃｌおよび／またはｅｃ２および／またはｅｃ３を
保有するベクターで形質転換され、このベクターの複製
の際に発現カセットの少なくとも一部が酵母宿主生物の
染色体との組換えにより、好ましく、は多重反復として
、組込まれる。その結果、形質転換メチロトローフ生物
は全ゲノムに分散された数コピーの導入発現カセットを
含み、また恐らく多重反復の発現カセットがゲノムの一
個所に局在化されるであろう。この夕０ イブの組換えは特にハナセヌラにおいて起こることが分
かった。しかしながら、メチロトローフ酵母宿主生物は
メチロトローフ酵母属、例えばカンジダ、タロエケラ、
サツカロミセス、ロドトルラ、トルロプシス、およびピ
キアの他の種からも選ばれる。
最適な実施態様において、宿主生物はハンセヌラ・ポリ
モルファＲＢＩＯの同定特性をもつ株により例示される
ハンセヌラ・ポリモルファ種から選ばれる。ハンセヌラ
・ポリモルファＲＢＩＯは１９８９年２月１７日に”Ｄ
ｅｕＬｓｃｂｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ Ｍｉｋｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒ
ｅｎ”に寄託され、受託番号ＤＳＭ５２．１５を受は取
った。ハンセヌラ・ポリモルファＤＳＭ５２１５は本発
明の別の面を構成する。
モルファＲＢＩＯの同定特性をもつ株により例示される
ハンセヌラ・ポリモルファ種から選ばれる。ハンセヌラ
・ポリモルファＲＢＩＯは１９８９年２月１７日に”Ｄ
ｅｕＬｓｃｂｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ Ｍｉｋｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒ
ｅｎ”に寄託され、受託番号ＤＳＭ５２．１５を受は取
った。ハンセヌラ・ポリモルファＤＳＭ５２１５は本発
明の別の面を構成する。
上記の本発明ベクターのいずれかを使って形質転換を行
うことが好適であるが、他のベクターを構築して、それ
を使用することもできるであろう。
うことが好適であるが、他のベクターを構築して、それ
を使用することもできるであろう。
１より多いコピー数の発現カセット（ｅｃ１）および場
合によりｌまたはｌより多いコピー数の第二発現力セラ
１〜（ｅ ｃ ２）を含む微生物を得るためには、数工
程から成る次の方法が最も便利である。この方法によれ
ば、メチロトローフ宿主生物はａ）第一ベク・ターで形
質転換し、初めに選択培地で増殖させ、次に非選択条件
下で数世代にわたってインキュベートする：ｂ）第一の
ポリペプチドをコードする発現カセット（ｅｃ１）を１
より多く含む有糸分裂時に安定した形質転換細胞を選択
する；ｃ）場合により、前記形質転換細胞を残留自律複
製プラスミドから分離する；ｄ）場合により、前記形質
転換細胞を第二ベクターで形質転換し、初めに選択培地
で増殖させ、次に非選択条件下で数世代にわたってイン
キュベートする；ｅ）第一のポリペプチドをコードする
ｌより多い発現カセット（ｅｃ１）および場合により第
二のポリペプチドをコードするｌまたは１より多い発現
力セラｈ（ｅｔ２）を含む有糸分裂時に安定した形質転
換細胞を選択する：ｆ）場合により、前記形質転換細胞
を残留自律複製プラスミドから分離する；場合により、
工程ｄ）〜ｆ）を第三ベクターを用いて繰り返す。
合によりｌまたはｌより多いコピー数の第二発現力セラ
１〜（ｅ ｃ ２）を含む微生物を得るためには、数工
程から成る次の方法が最も便利である。この方法によれ
ば、メチロトローフ宿主生物はａ）第一ベク・ターで形
質転換し、初めに選択培地で増殖させ、次に非選択条件
下で数世代にわたってインキュベートする：ｂ）第一の
ポリペプチドをコードする発現カセット（ｅｃ１）を１
より多く含む有糸分裂時に安定した形質転換細胞を選択
する；ｃ）場合により、前記形質転換細胞を残留自律複
製プラスミドから分離する；ｄ）場合により、前記形質
転換細胞を第二ベクターで形質転換し、初めに選択培地
で増殖させ、次に非選択条件下で数世代にわたってイン
キュベートする；ｅ）第一のポリペプチドをコードする
ｌより多い発現カセット（ｅｃ１）および場合により第
二のポリペプチドをコードするｌまたは１より多い発現
力セラｈ（ｅｔ２）を含む有糸分裂時に安定した形質転
換細胞を選択する：ｆ）場合により、前記形質転換細胞
を残留自律複製プラスミドから分離する；場合により、
工程ｄ）〜ｆ）を第三ベクターを用いて繰り返す。
この方法によれば、１つの型の発現カセットの数を増や
すことが可能であり、例えば細胞を数回の後続の形質転
換ザイクルにかけ、選択／非選択条件下で増殖させ、形
質転換細胞を選択し、場合により遊離のプラスミドを除
くことにより増やすことができる。また、２以上の型の
発現カセットは、２以上の異なる発現カセットを含む単
一のベクターを使うか、あるいは異なる発現カセットを
保有する異なるベクターを使って上記の形質転換ザイク
ルにかけることにより、導入できる。こうして、本発明
方法は希望の微生物を得るためにいろいろな可能性を提
供する。
すことが可能であり、例えば細胞を数回の後続の形質転
換ザイクルにかけ、選択／非選択条件下で増殖させ、形
質転換細胞を選択し、場合により遊離のプラスミドを除
くことにより増やすことができる。また、２以上の型の
発現カセットは、２以上の異なる発現カセットを含む単
一のベクターを使うか、あるいは異なる発現カセットを
保有する異なるベクターを使って上記の形質転換ザイク
ルにかけることにより、導入できる。こうして、本発明
方法は希望の微生物を得るためにいろいろな可能性を提
供する。
本発明の主題はさらに、Ｂ型肝炎表面抗原の１つの生物
学的活性を有する蛋白の一部または全部に相当する少な
くとも２つのポリペプチドから成る複合粒子であり、そ
の場合前記粒子はＳ蛋白、プレＳ２蛋白またはプレＳｌ
蛋白によりもたらされる少なくとも２つの抗原決定基を
有し、場合により宿主特異的脂質を含む。一般に、粒子
は天然５３ に存在する２０ｎｍ粒子の約８０〜９０％を占めるＳ蛋
白の抗原特性をもつ蛋白からもっばらつくられる。複合
粒子はさらにプレＳｌ蛋白特定ドメインの抗原性をもつ
蛋白、ずなわちプレＳ１蛋白のＮ末端１０８ （または
１１９）アミノ酸の少なくとも一部に相当するペプチド
、および／またはプレＳ２特定ドメインの抗原性をもつ
蛋白、すなわち５５アミノ酸プレＳ２特定ドメインの少
なくとも一部に相当するペプチドを含む。
学的活性を有する蛋白の一部または全部に相当する少な
くとも２つのポリペプチドから成る複合粒子であり、そ
の場合前記粒子はＳ蛋白、プレＳ２蛋白またはプレＳｌ
蛋白によりもたらされる少なくとも２つの抗原決定基を
有し、場合により宿主特異的脂質を含む。一般に、粒子
は天然５３ に存在する２０ｎｍ粒子の約８０〜９０％を占めるＳ蛋
白の抗原特性をもつ蛋白からもっばらつくられる。複合
粒子はさらにプレＳｌ蛋白特定ドメインの抗原性をもつ
蛋白、ずなわちプレＳ１蛋白のＮ末端１０８ （または
１１９）アミノ酸の少なくとも一部に相当するペプチド
、および／またはプレＳ２特定ドメインの抗原性をもつ
蛋白、すなわち５５アミノ酸プレＳ２特定ドメインの少
なくとも一部に相当するペプチドを含む。
１つの粒子にＢ型肝炎表面抗原の生物学的活性を有する
２種以上の異なる蛋白を存在させることは、酵母から誘
導される抗Ｂ型肝炎ワクチンの新しい設計手法である。
２種以上の異なる蛋白を存在させることは、酵母から誘
導される抗Ｂ型肝炎ワクチンの新しい設計手法である。
酵母誘導粒子または集成体はこれまでＳ蛋白、またはプ
レＳ２蛋白、もしくはプレＳ１蛋白を独占的に含み、す
なわち３種の可能な蛋白のいずれか１つだけを含む。プ
レＳ２蛋白は粒子に集合されることがＶａｌｅｎｚｕｅ
ｌａ ｅＬａｌ 、（１９８５）およびＩｔｏｈ ｅｔ
ａｌ、（１９８６）によって明示されたが、プレＳｌ
蛋白は小粒子（直径２〜３ｎｍ）の混合物、または直径
約■５〜５０ｎｍ４ の大粒子の多分散集団を形成することが報しられｆ：
（Ｋｎｉｓｋａｒｎ ｅＬ ａｌ、、１９８８；
Ｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ、、１９８７）
。
レＳ２蛋白、もしくはプレＳ１蛋白を独占的に含み、す
なわち３種の可能な蛋白のいずれか１つだけを含む。プ
レＳ２蛋白は粒子に集合されることがＶａｌｅｎｚｕｅ
ｌａ ｅＬａｌ 、（１９８５）およびＩｔｏｈ ｅｔ
ａｌ、（１９８６）によって明示されたが、プレＳｌ
蛋白は小粒子（直径２〜３ｎｍ）の混合物、または直径
約■５〜５０ｎｍ４ の大粒子の多分散集団を形成することが報しられｆ：
（Ｋｎｉｓｋａｒｎ ｅＬ ａｌ、、１９８８；
Ｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ、、１９８７）
。
Ｒｕｔｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ、（１９８８）は、プレＳ
２蛋白およびプレＳ１蛋白粒子または集成体において、
これらの粒子がＡＵＳＲＩＡ検定で反応性に乏しいこと
から、Ｓ蛋白コード化エピトープが遮蔽されると報告し
た。このことは、同種のプレＳ蛋白を含む粒子をワクチ
ン目的で免疫原として用いる場合、Ｓ蛋白に関する免疫
応答に悪影響を及ぼす。
２蛋白およびプレＳ１蛋白粒子または集成体において、
これらの粒子がＡＵＳＲＩＡ検定で反応性に乏しいこと
から、Ｓ蛋白コード化エピトープが遮蔽されると報告し
た。このことは、同種のプレＳ蛋白を含む粒子をワクチ
ン目的で免疫原として用いる場合、Ｓ蛋白に関する免疫
応答に悪影響を及ぼす。
従って、本発明は、１種より多いＢ型肝炎表面抗原を含
む複合粒子を初めて提供する。Ｓ．セレビシエにより生
産された蛋白を１種のみ含む粒子から類推して、本発明
粒子は通常宿主特異的脂質を含むであろう。
む複合粒子を初めて提供する。Ｓ．セレビシエにより生
産された蛋白を１種のみ含む粒子から類推して、本発明
粒子は通常宿主特異的脂質を含むであろう。
好適な実施態様において、本発明の複合粒子は１％より
多いプレＳ１蛋白を含み、残りの蛋白はＳ蛋白と場合に
より若干のプレＳ２蛋白である。
多いプレＳ１蛋白を含み、残りの蛋白はＳ蛋白と場合に
より若干のプレＳ２蛋白である。
しかしながら、好適な粒子は１〜５０％、特に１〜２５
％のプレＳ１蛋白を含み、残りは上記の通りである。特
に好適な実施態様では、プレＳ１蛋白対Ｓ蛋白の比はｌ
：１〜ｌ：１００１好ましくは１：２．１：８または１
：１５である。
％のプレＳ１蛋白を含み、残りは上記の通りである。特
に好適な実施態様では、プレＳ１蛋白対Ｓ蛋白の比はｌ
：１〜ｌ：１００１好ましくは１：２．１：８または１
：１５である。
本発明粒子は少なくとも部分的にグリコシル化される。
メチロトローフ酵母のプレＳｌ蛋白の部分は、分子量４
５ｋＤ、３８ｋＤおよび３９ｋＤをもつバンドの検出に
Ｊ：り示されるように、グリコシル化される。当分野で
習熟した者は、イムノブロッティングにより観察された
プレＳ１蛋白種の数および大きさに若干の見掛は上の変
動がありうることを理解するであろう。４５．３８およ
び３９ｋＤバンドの検出は、とりわけ、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動でのそれらの分離、他の酵母蛋白から
の妨害、およびイムノブロッティングに使用した方法の
効力の変化に左右されるだろう。
５ｋＤ、３８ｋＤおよび３９ｋＤをもつバンドの検出に
Ｊ：り示されるように、グリコシル化される。当分野で
習熟した者は、イムノブロッティングにより観察された
プレＳ１蛋白種の数および大きさに若干の見掛は上の変
動がありうることを理解するであろう。４５．３８およ
び３９ｋＤバンドの検出は、とりわけ、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動でのそれらの分離、他の酵母蛋白から
の妨害、およびイムノブロッティングに使用した方法の
効力の変化に左右されるだろう。
さらに、粗製細胞抽出物の調製のために選択した方法並
びに抽出に使用した緩衝液の組成も個々のバンドの検出
に影響を与える。３種の蛋白の相対割合も生育条件によ
り変化するだろう。さらに、分子量の概算は実験的変動
を受けやすく、較正用の標準品にも左右されるだろう。
びに抽出に使用した緩衝液の組成も個々のバンドの検出
に影響を与える。３種の蛋白の相対割合も生育条件によ
り変化するだろう。さらに、分子量の概算は実験的変動
を受けやすく、較正用の標準品にも左右されるだろう。
Ｓ蛋白のグリコシル化は観察されなかった。
上記の複合粒子は、本発明のメチロトローフ酵母株を適
当な培地で培養することにより有利に作られる。制御さ
れた発現系を用いることにより、粒子成分の合成はそれ
らの発現が細胞増殖に影響を及ぼさないように調節でき
る。こうして、所望の細胞密度で、メタノールレギユロ
ン制御蛋白合成を抑制解除して、異種蛋白を発現させる
ことができる。極めて接近した異なる型のＢ型肝炎表面
抗原の同時発現の際に、粒子形成が起こる。これらの粒
子は既知技術、例えば等密度遠心、クロマトグラフィー
または当分野で知られた他の方法を用いて培養物から単
離できる。
当な培地で培養することにより有利に作られる。制御さ
れた発現系を用いることにより、粒子成分の合成はそれ
らの発現が細胞増殖に影響を及ぼさないように調節でき
る。こうして、所望の細胞密度で、メタノールレギユロ
ン制御蛋白合成を抑制解除して、異種蛋白を発現させる
ことができる。極めて接近した異なる型のＢ型肝炎表面
抗原の同時発現の際に、粒子形成が起こる。これらの粒
子は既知技術、例えば等密度遠心、クロマトグラフィー
または当分野で知られた他の方法を用いて培養物から単
離できる。
この方法はまた、°適当な菌株を使用する場合、１種類
のみの表面抗原から戊る粒子または集成体を得るために
使用される。
のみの表面抗原から戊る粒子または集成体を得るために
使用される。
好適な実施態様において、発現力セントにより導かれる
蛋白合或は抑制炭素源の枯渇により開始する。カタボラ
イト抑制を受けた細胞は抑制物質７ の希釈により発現を開始する。抑制解除の効果はメタノ
ールの添加（メタノール応答性レギユロンを誘発させる
）によりさらに増強できる。メタツルの添加は異種蛋白
合成を１０倍まで上昇させる。
蛋白合或は抑制炭素源の枯渇により開始する。カタボラ
イト抑制を受けた細胞は抑制物質７ の希釈により発現を開始する。抑制解除の効果はメタノ
ールの添加（メタノール応答性レギユロンを誘発させる
）によりさらに増強できる。メタツルの添加は異種蛋白
合成を１０倍まで上昇させる。
好適な実施態様において、培地は炭素源としてグリセロ
ールを含む。グリセロールは最小カタボライト抑制効果
をもつ炭素源である。０．３％までのグリセロール濃度
は抑制を生じさせない。従って、グリセロールを含む培
地を用いる場合、メタノールの任意添加に先立ってこの
炭素源を完全に取り除く必要はない。
ールを含む。グリセロールは最小カタボライト抑制効果
をもつ炭素源である。０．３％までのグリセロール濃度
は抑制を生じさせない。従って、グリセロールを含む培
地を用いる場合、メタノールの任意添加に先立ってこの
炭素源を完全に取り除く必要はない。
本発明によるメチロトローフ酵母株の発酵はｐＨ３〜７
、好ましくはｐ Ｈ４〜６に維持した培地を用いて３０
〜４０’Ｏで行われる。培地の例は以下に示す。
、好ましくはｐ Ｈ４〜６に維持した培地を用いて３０
〜４０’Ｏで行われる。培地の例は以下に示す。
本発明の別の好適な実施態様では、複合粒子は以下に一
般的かつ特定的に説明する修飾り蛋白を含むことができ
る。
般的かつ特定的に説明する修飾り蛋白を含むことができ
る。
特に好適な実施態様において、修飾り蛋白はａ８
ｄ血清型のＨＢウィルスのＯＲＦに関して残基１２−５
２．１３３−１４５および＋７５ｉ００を含む２８０ア
ミノ酸ポリペプチドに対応する。
２．１３３−１４５および＋７５ｉ００を含む２８０ア
ミノ酸ポリペプチドに対応する。
本発明のさらに別の好適な実施態様では、複合粒子は防
御範囲を広くするために異なる亜型のＢ型肝炎表面抗原
を含む。すなわち、Ｓ蛋白はａｄ亜型で、プレＳ１蛋白
および／または修飾り蛋白および／またはプレＳ２蛋白
はａｙ亜型、またはその逆でありうる。
御範囲を広くするために異なる亜型のＢ型肝炎表面抗原
を含む。すなわち、Ｓ蛋白はａｄ亜型で、プレＳ１蛋白
および／または修飾り蛋白および／またはプレＳ２蛋白
はａｙ亜型、またはその逆でありうる。
本発明の主題はさらに、本発明によりつくられた新しい
複合粒子またはＢ型肝炎表面抗原蛋白を含む組成物であ
る。本発明組成物の他の成分は安定剤、緩衝物質、希釈
剤、・ＮａＣＩのような塩、または糖でありうる。
複合粒子またはＢ型肝炎表面抗原蛋白を含む組成物であ
る。本発明組成物の他の成分は安定剤、緩衝物質、希釈
剤、・ＮａＣＩのような塩、または糖でありうる。
先に概説したように、本発明の初期目的はＢ型肝炎ウィ
ルスに対するワクチンを提供することである。従って、
本発明によりつくられた上記複合粒子またはＢ型肝炎表
面抗原を含むワクチンは本発明の別の主題である。ワク
チンは他の物質、例えば塩類、安定剤、アジュバント、
および／または他の生理学的に許容しうる添加剤をさら
に含んでいてもよい。複合粒子を含むワクチンは、Ｂ型
肝炎表面抗原の抗原決定基の少なくとも２つに対して抗
体の形成を誘導する。プレ３１特定およびプレＳ２特定
ドメインの存在ゆえに、現在利用しうるワクチンに応答
しなかった個体でさえも、Ｂ型肝炎感染に対して防御さ
れる。一般に、本発明ワクチンは現在のワクチンよりも
広範な免疫反応を引き出し、さらに細胞あたりの発現量
および細胞密度が高いために比較的低コストで製造する
ことができる。
ルスに対するワクチンを提供することである。従って、
本発明によりつくられた上記複合粒子またはＢ型肝炎表
面抗原を含むワクチンは本発明の別の主題である。ワク
チンは他の物質、例えば塩類、安定剤、アジュバント、
および／または他の生理学的に許容しうる添加剤をさら
に含んでいてもよい。複合粒子を含むワクチンは、Ｂ型
肝炎表面抗原の抗原決定基の少なくとも２つに対して抗
体の形成を誘導する。プレ３１特定およびプレＳ２特定
ドメインの存在ゆえに、現在利用しうるワクチンに応答
しなかった個体でさえも、Ｂ型肝炎感染に対して防御さ
れる。一般に、本発明ワクチンは現在のワクチンよりも
広範な免疫反応を引き出し、さらに細胞あたりの発現量
および細胞密度が高いために比較的低コストで製造する
ことができる。
また、本発明は試験キットの開発に有用であることが判
明した。本発明の複合粒子を含む組成物を供給すること
により、感染者の抗体とこの種の粒子との間に形成され
る免疫複合体を監視することが可能である。試験キット
は別の検出薬剤、例えば既知技術により標識されたヤギ
／抗ヒＬｒｇＧ抗体、の供給を必要とする。この抗体（
もちろん、他の哺乳類から誘導されてもよい）は検出の
ために酵素に結合されるか、または放射性標識される。
明した。本発明の複合粒子を含む組成物を供給すること
により、感染者の抗体とこの種の粒子との間に形成され
る免疫複合体を監視することが可能である。試験キット
は別の検出薬剤、例えば既知技術により標識されたヤギ
／抗ヒＬｒｇＧ抗体、の供給を必要とする。この抗体（
もちろん、他の哺乳類から誘導されてもよい）は検出の
ために酵素に結合されるか、または放射性標識される。
プレＳ１およびプレＳ２特定ドメインに対する抗体に応
答する試験キットの利点は、ＨＢＶ感染の初期検出の′
可能性にある。なぜなら、抗プレＳ１および抗プレＳ２
抗体はヒトのＨＢ Ｖ感染において抗Ｓ抗体よりも早期
に現れるからである（Ｐｅｔｉｔ ｅＬａｌ、、１９８
６） 。こうして、本発明による試験キットはこの感染
症の早期診断の便利な手段を提供する。
答する試験キットの利点は、ＨＢＶ感染の初期検出の′
可能性にある。なぜなら、抗プレＳ１および抗プレＳ２
抗体はヒトのＨＢ Ｖ感染において抗Ｓ抗体よりも早期
に現れるからである（Ｐｅｔｉｔ ｅＬａｌ、、１９８
６） 。こうして、本発明による試験キットはこの感染
症の早期診断の便利な手段を提供する。
別の面において、本発明はＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）
の修飾された大型表面蛋白（以後修飾り蛋白と略記する
）を提供する。このような修飾り蛋白はプロテアーゼが
優先的に攻撃する部位の不在により特徴づけられるＬ蛋
白配列を有する。これらの部位の排除は、発現の際に粒
子形態で容易に精製される、プロテアーゼに感受性でな
い分子を提供する。
の修飾された大型表面蛋白（以後修飾り蛋白と略記する
）を提供する。このような修飾り蛋白はプロテアーゼが
優先的に攻撃する部位の不在により特徴づけられるＬ蛋
白配列を有する。これらの部位の排除は、発現の際に粒
子形態で容易に精製される、プロテアーゼに感受性でな
い分子を提供する。
本発明の他の面は、この蛋白のミリスチル化に必要なア
ミノ酸の不在により特徴づけられる修飾り蛋白を提供す
る。
ミノ酸の不在により特徴づけられる修飾り蛋白を提供す
る。
さらに別の面において、本発明はいくつかの可能なグリ
コシル化部位の不在により特徴づけられる修飾り蛋白を
含む。Ｌ蛋白のグリコシル化の排除は、酵母宿主内での
発現の際に起こるこの蛋白のグリコシル化により遮蔽、
変形または修飾されるエピトープの発現を改善する。修
飾され、脱グリコシル化されたＬ蛋白は、形成された粒
子の表面に十分に露出された、プレＳ１、プレ３２およ
びＳ領域の防御ＢエピトープおよびＴｌ＋エピトープを
それらの正しいコンホメーションで出現させる。
コシル化部位の不在により特徴づけられる修飾り蛋白を
含む。Ｌ蛋白のグリコシル化の排除は、酵母宿主内での
発現の際に起こるこの蛋白のグリコシル化により遮蔽、
変形または修飾されるエピトープの発現を改善する。修
飾され、脱グリコシル化されたＬ蛋白は、形成された粒
子の表面に十分に露出された、プレＳ１、プレ３２およ
びＳ領域の防御ＢエピトープおよびＴｌ＋エピトープを
それらの正しいコンホメーションで出現させる。
本発明の別の面は、ヒト血清アルブミン（＋） Ｈ３Ａ
）結合部位を含むプレＳ２領域の一部の欠失により特徴
づけられる修飾し蛋白を包含する。Ｌ蛋白のこの修飾は
、プレＳ２領域の主要Ｂエピトープを失うことなく、ｐ
Ｈ３Ａレセプターの存在に関連して起こりうる免疫的寛
容性または自己免疫の問題を排除する。
）結合部位を含むプレＳ２領域の一部の欠失により特徴
づけられる修飾し蛋白を包含する。Ｌ蛋白のこの修飾は
、プレＳ２領域の主要Ｂエピトープを失うことなく、ｐ
Ｈ３Ａレセプターの存在に関連して起こりうる免疫的寛
容性または自己免疫の問題を排除する。
本発明のさらに別の面において、非グリコシル化され、
プロテアーゼ感受性が減少し、ｐＨ３Ａ結合能が低下し
たことにより特徴づけられるＬ蛋白が提供される。この
蛋白はアミノ酸残基１２５２に対応するプレＳ１領域配
列、これに融合されたアミノ酸残基１３３−１４５に対
応するプレＳ２領域配列、これに続くＳ蛋白の全コード
配列を連続リーディング・７レームで含む。
プロテアーゼ感受性が減少し、ｐＨ３Ａ結合能が低下し
たことにより特徴づけられるＬ蛋白が提供される。この
蛋白はアミノ酸残基１２５２に対応するプレＳ１領域配
列、これに融合されたアミノ酸残基１３３−１４５に対
応するプレＳ２領域配列、これに続くＳ蛋白の全コード
配列を連続リーディング・７レームで含む。
本発明の修飾り蛋白は、これまで論じてきたメチロトロ
ーフ酵母ばかりでなく、３つのドメインプレＳｌ、グレ
Ｓ２およびＳによりコードされる主要抗原部位を保持す
る粒子として蛋白を生産する他の酵母発現系でも発現さ
せることができる。
ーフ酵母ばかりでなく、３つのドメインプレＳｌ、グレ
Ｓ２およびＳによりコードされる主要抗原部位を保持す
る粒子として蛋白を生産する他の酵母発現系でも発現さ
せることができる。
また、酵母により修飾り蛋白とＳ蛋白とを同時発現させ
て、混合サブユニット組成の粒子を形成させることもで
きる。他の発現系（例、細菌、昆虫、哺乳動物細胞）も
いろいろな形態の修飾り蛋白を生産しうる。
て、混合サブユニット組成の粒子を形成させることもで
きる。他の発現系（例、細菌、昆虫、哺乳動物細胞）も
いろいろな形態の修飾り蛋白を生産しうる。
別の面として、本発明はさらに本発明の修飾り蛋白をコ
ードする新規なりＮＡ配列を提供する。
ードする新規なりＮＡ配列を提供する。
本発明の他の面では、前記ＤＮＡ配列が適当な調節配列
の制御下でベクターに挿入される。
の制御下でベクターに挿入される。
さらに別の面として、上述したＨＢＶの修飾り蛋白の生
産方法が提供され、この方法は適当な調節配列の制御下
にある修飾り蛋白遺伝子配列を発現する酵母発現プラス
ミドで形質転換した酵母細胞を、適当な培養条件を用い
て、培養することを包含する。修飾り蛋白は酵母宿主内
でＳ蛋白と同時発現させてもよい。生産されたＬ蛋白は
慣用方法により培養物または細胞溶解液から分離できる
。
産方法が提供され、この方法は適当な調節配列の制御下
にある修飾り蛋白遺伝子配列を発現する酵母発現プラス
ミドで形質転換した酵母細胞を、適当な培養条件を用い
て、培養することを包含する。修飾り蛋白は酵母宿主内
でＳ蛋白と同時発現させてもよい。生産されたＬ蛋白は
慣用方法により培養物または細胞溶解液から分離できる
。
修飾り蛋白は、Ｓ？ｉ白との同時発現に応じて、混合ま
たは均質サブユニット組成の１粒子形態で単離される。
たは均質サブユニット組成の１粒子形態で単離される。
さらに別の面として、本発明は細菌発現系、昆虫細胞発
現系（例、バキュロウィルス系）、哺乳動物細胞発現系
（例、ワクシニアウィルス系）および植物発現系を含め
た、他の発現系での修飾り蛋白の生産方法を提供する。
現系（例、バキュロウィルス系）、哺乳動物細胞発現系
（例、ワクシニアウィルス系）および植物発現系を含め
た、他の発現系での修飾り蛋白の生産方法を提供する。
本発明のさらに別の面は、本発明の修飾り蛋白１種また
はそれ以上を、単独でまたは他のワクチン薬剤との組合
わせで、製剤学的に許容しうるワクチン担体およびアジ
ュバントと共に含有するワ４ ３ クチンである。修飾り蛋白を含む本発明ワクチンは、他
の蛋白（すなわち、Ｓ蛋白）との混合サブユニット組成
の粒子形態で修飾り蛋白を含んでいてもよい。
はそれ以上を、単独でまたは他のワクチン薬剤との組合
わせで、製剤学的に許容しうるワクチン担体およびアジ
ュバントと共に含有するワ４ ３ クチンである。修飾り蛋白を含む本発明ワクチンは、他
の蛋白（すなわち、Ｓ蛋白）との混合サブユニット組成
の粒子形態で修飾り蛋白を含んでいてもよい。
前述のことから、新規な修飾Ｂ型肝炎大型（Ｌ）表面蛋
白分子は単独で用いられても、あるいはＨＢｓＡｇまた
はＨＢＶ成分と共に用いられてもよいことが理解される
であろう。本発明はまた、適当な宿主細胞内で適当な調
節配列の制御下に修飾り蛋白を発現させることを包含す
る。
白分子は単独で用いられても、あるいはＨＢｓＡｇまた
はＨＢＶ成分と共に用いられてもよいことが理解される
であろう。本発明はまた、適当な宿主細胞内で適当な調
節配列の制御下に修飾り蛋白を発現させることを包含す
る。
本発明の修飾り蛋白はプレＳ領域内の種々のアミノ酸配
列の欠失、挿入または修飾により特徴づけられる。修飾
および発現されるべきＬ分子はすでにその最初の１１ア
ミノ酸を欠失しており、プレＳ領域に１６３個のアミノ
酸を含むことを理解すべきである（係属中の米国特許出
願第００９３２５号を参照されたい）。プレＳ領域の大
きさが短縮されると、宿主細胞内での粒子形成が容易と
なり、またこの分子の生物物理学的特性が高まってワク
チンの製造および使用に適するようになる。
列の欠失、挿入または修飾により特徴づけられる。修飾
および発現されるべきＬ分子はすでにその最初の１１ア
ミノ酸を欠失しており、プレＳ領域に１６３個のアミノ
酸を含むことを理解すべきである（係属中の米国特許出
願第００９３２５号を参照されたい）。プレＳ領域の大
きさが短縮されると、宿主細胞内での粒子形成が容易と
なり、またこの分子の生物物理学的特性が高まってワク
チンの製造および使用に適するようになる。
５
例えば、本発明の短縮プレＳ領域は、免疫系との相互作
用のために粒子表面でのＳおよびプレＳエピトープの良
好な露出を可能にし、これにより免疫原性を高める。
用のために粒子表面でのＳおよびプレＳエピトープの良
好な露出を可能にし、これにより免疫原性を高める。
１つの実施態様において、本発明はプレｓ１領域内のＧ
Ｉｙ１３アミノ酸残基が欠失された修飾り蛋白を提供す
る。酵母により発現されたＬ蛋白は、係属中の米国特許
出願第０７１００９３２５号に記載されるように、アミ
ド結合で共有結合されたミリスチル基を有する。Ｎ末端
Ｇｌｙ残基は蛋白のミリスチル化に不可欠である［Ｔｏ
ｗｌｅｒ ａｎｄＧｏｒｄｏｎ、 Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、、 ５７：６９−９９ （１９８８）］
。
Ｉｙ１３アミノ酸残基が欠失された修飾り蛋白を提供す
る。酵母により発現されたＬ蛋白は、係属中の米国特許
出願第０７１００９３２５号に記載されるように、アミ
ド結合で共有結合されたミリスチル基を有する。Ｎ末端
Ｇｌｙ残基は蛋白のミリスチル化に不可欠である［Ｔｏ
ｗｌｅｒ ａｎｄＧｏｒｄｏｎ、 Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、、 ５７：６９−９９ （１９８８）］
。
従って、本発明の適当な修飾り蛋白はＬ蛋白をコードす
るヌクレオチド配列からＧＩｙ１３コドン（ＧＧＧ）を
欠失させたＤＮＡによりコードされる。この欠失は非ミ
リスチル化り蛋白の合皮をもたらす。
るヌクレオチド配列からＧＩｙ１３コドン（ＧＧＧ）を
欠失させたＤＮＡによりコードされる。この欠失は非ミ
リスチル化り蛋白の合皮をもたらす。
本明細書中で用いる記号△は欠失を表す。従って、例え
ば△Ｇｌｙ１３修＠Ｔ−はアミノ酸残基１３（グリシン
）を欠く修飾り蛋白を意味する。
ば△Ｇｌｙ１３修＠Ｔ−はアミノ酸残基１３（グリシン
）を欠く修飾り蛋白を意味する。
６
本発明の別の実施態様は、１つまたはそれ以上の可能な
グリコシル化部位を欠失した修飾り蛋白である。酵母に
より発現されたＬ蛋白は、上記の米国特許出願第００９
３２５号に記載されるように、Ａｓｎ１２３にＮ結合オ
リゴ糖鎖を、そしてこの分子のプレＳ１およびプレＳ２
の両頭域内のＳｅｒとＴｈｒ残基にいくつかのＯ結合マ
ンノス鎖を有する［ＲｕＬｇｅｒｓ ｅＬ ａｌ、 ”
ＶｉｒａｌＨｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ
Ｄｉｓｅａｓｅ ｅｄ、 Ａ、Ｊ。
グリコシル化部位を欠失した修飾り蛋白である。酵母に
より発現されたＬ蛋白は、上記の米国特許出願第００９
３２５号に記載されるように、Ａｓｎ１２３にＮ結合オ
リゴ糖鎖を、そしてこの分子のプレＳ１およびプレＳ２
の両頭域内のＳｅｒとＴｈｒ残基にいくつかのＯ結合マ
ンノス鎖を有する［ＲｕＬｇｅｒｓ ｅＬ ａｌ、 ”
ＶｉｒａｌＨｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ
Ｄｉｓｅａｓｅ ｅｄ、 Ａ、Ｊ。
Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ、 Ａ、Ｒ，Ｌｉ５ｓ、 Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、 ｐ、３０４−３０８ （１９８８）を参照
されたい］。配列Ａｓｎ−Ｘ（ＳｅｒまたはＴｈ ｒ）
で表されるＮグリコシル化部位を除くために、アミノ酸
位置１２３−１２５の配列が変えられる。Ｎ結合グリコ
シル化部位は１２３位および１２５位のアミノ酸を欠失
または置換するか、アミノ酸１２４を欠失するか、ある
いは全１２３−１２５配列を欠失することにより排除で
きる。Ｏ結合グリコシル化部位を破壊するためには、Ｌ
配列中のＳｅｒおよびＴｈｒ残基の全部または一部をこ
の蛋白から欠失させるか、あるいは他のアミノ酸で置換
する。プラスミドｐＲＩ Ｔ １３ ］、 ９２から発
現されたＬｉ白は完全にまたは部分的に非グリコシル化
されている点に特徴がある。
Ｙｏｒｋ、 ｐ、３０４−３０８ （１９８８）を参照
されたい］。配列Ａｓｎ−Ｘ（ＳｅｒまたはＴｈ ｒ）
で表されるＮグリコシル化部位を除くために、アミノ酸
位置１２３−１２５の配列が変えられる。Ｎ結合グリコ
シル化部位は１２３位および１２５位のアミノ酸を欠失
または置換するか、アミノ酸１２４を欠失するか、ある
いは全１２３−１２５配列を欠失することにより排除で
きる。Ｏ結合グリコシル化部位を破壊するためには、Ｌ
配列中のＳｅｒおよびＴｈｒ残基の全部または一部をこ
の蛋白から欠失させるか、あるいは他のアミノ酸で置換
する。プラスミドｐＲＩ Ｔ １３ ］、 ９２から発
現されたＬｉ白は完全にまたは部分的に非グリコシル化
されている点に特徴がある。
本発明の他の修飾り蛋白は、重合ヒト血清アルブミン（
ｐＨ５Ａ）の結合に関与するプレＳ２領域のアミノ酸残
基１２０−１３２に欠失を含む［Ｍａｃｈｉｄａ ｅｔ
ａｌ、上記引用文献を参照］。ｐＨ３Ａ結合はこの配
列を欠く蛋白においてかなり減少する。
ｐＨ５Ａ）の結合に関与するプレＳ２領域のアミノ酸残
基１２０−１３２に欠失を含む［Ｍａｃｈｉｄａ ｅｔ
ａｌ、上記引用文献を参照］。ｐＨ３Ａ結合はこの配
列を欠く蛋白においてかなり減少する。
本発明の別の修飾り蛋白は、プロテアーゼ感受性部位の
欠失または変更により特徴づけられる。
欠失または変更により特徴づけられる。
プロテアーゼ感受性ペプチド結合はプレＳ１領域の１０
０位付近のＡｒｇ残基のあと［Ｈｅｅｒｍａｎｎｅｃ
ａｌ、、 Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８．１４−
２５ （１９８７）］ 、並びにアミノ酸残基Ａｒｇ１
３７、Ｇｌｙ１４９およびＡｒｇ１６７のあとに存在す
る。これらの残基のコドンの一部または全部を除くため
にＬ蛋白のコード領域に導入された欠失または他の修飾
は、プロテアーゼ作用にそれほど感受性でないＬ蛋白を
もたらす。
０位付近のＡｒｇ残基のあと［Ｈｅｅｒｍａｎｎｅｃ
ａｌ、、 Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８．１４−
２５ （１９８７）］ 、並びにアミノ酸残基Ａｒｇ１
３７、Ｇｌｙ１４９およびＡｒｇ１６７のあとに存在す
る。これらの残基のコドンの一部または全部を除くため
にＬ蛋白のコード領域に導入された欠失または他の修飾
は、プロテアーゼ作用にそれほど感受性でないＬ蛋白を
もたらす。
修飾り蛋白を形成するためにＬ蛋白のコード領域に導入
される欠失は、好ましくはアミノ酸２１４７および１３
３−１４５のコドンを元のまま残しておく。これらの配
列は免疫防御と関連したプレＳ特異的抗体を誘導する能
力を備えた修飾蛋白を与えると考えられる［例えば、Ｉ
Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ。
される欠失は、好ましくはアミノ酸２１４７および１３
３−１４５のコドンを元のまま残しておく。これらの配
列は免疫防御と関連したプレＳ特異的抗体を誘導する能
力を備えた修飾蛋白を与えると考えられる［例えば、Ｉ
Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ。
上記文献参照１゜
△Ｇｌｙ１３Ｌ蛋白をフードする酵母発現プラスミドｐ
ＲＩ Ｔ ｌ ２９７９の構築は以下の実施例Ｆ、１
で説明する。プラスミドｐＲＩＴ１２９７９からの修飾
り蛋白発現の発現レベル、翻訳後修飾および巨大分子の
形成に関する分析は実施例Ｆ、２で説明する。
ＲＩ Ｔ ｌ ２９７９の構築は以下の実施例Ｆ、１
で説明する。プラスミドｐＲＩＴ１２９７９からの修飾
り蛋白発現の発現レベル、翻訳後修飾および巨大分子の
形成に関する分析は実施例Ｆ、２で説明する。
上記３つの特性、すなわち酵母グリコシル化酵素に対す
る基質としての機能、ｐＨ３Ａ結合能およびプロテアー
ゼ感受性を欠き、かつプレＳ領域のアミノ酸残基５：３
−１３２および］、 ４６− ］、 ７４のコドンの欠
失により修飾された、他の修飾り蛋白は以下の実施例Ｆ
、３で説明するグラスミドｐＲＩＴ１３］９２において
例示される。プラスミドｐＲＴＴ１３１９２はプレＳ領
域の残基１２５２Ｂよび１３３−１４５のコ１！ンを含
む。プラスミＦｐＲＩＴ１３１９２からのＬ蛋白発現の
分析も以下に説明する（実施例Ｆ、４）。こうして、ｐ
ＲＩＴ１３１９２から発現されたＬ蛋白はｐＨ３Ａ結合
能の低下、プロテアーゼ抵抗性の増加およびグリコシル
化の減少を示す。
る基質としての機能、ｐＨ３Ａ結合能およびプロテアー
ゼ感受性を欠き、かつプレＳ領域のアミノ酸残基５：３
−１３２および］、 ４６− ］、 ７４のコドンの欠
失により修飾された、他の修飾り蛋白は以下の実施例Ｆ
、３で説明するグラスミドｐＲＩＴ１３］９２において
例示される。プラスミドｐＲＴＴ１３１９２はプレＳ領
域の残基１２５２Ｂよび１３３−１４５のコ１！ンを含
む。プラスミＦｐＲＩＴ１３１９２からのＬ蛋白発現の
分析も以下に説明する（実施例Ｆ、４）。こうして、ｐ
ＲＩＴ１３１９２から発現されたＬ蛋白はｐＨ３Ａ結合
能の低下、プロテアーゼ抵抗性の増加およびグリコシル
化の減少を示す。
本発明のさらに別の修飾り蛋白はｐＲＩＴｌ ２９７９
とｐＲＩＴ１３１９２のＬ蛋白コード配列に導入された
欠失を合わせ持つ。この配列により発現されるＬ蛋白は
ミリスチル化されず、グリコシル化の程度がより少なく
、プロテアーゼ感受性が低下しており、しかもｐ ＨＳ
Ａ結合能が減少している。この修飾り配列挿入物を保
有する酵母発現プラスミドｐＲＩＴＩ３１９３の構築は
以下の実施例Ｆ、３で詳述する。
とｐＲＩＴ１３１９２のＬ蛋白コード配列に導入された
欠失を合わせ持つ。この配列により発現されるＬ蛋白は
ミリスチル化されず、グリコシル化の程度がより少なく
、プロテアーゼ感受性が低下しており、しかもｐ ＨＳ
Ａ結合能が減少している。この修飾り配列挿入物を保
有する酵母発現プラスミドｐＲＩＴＩ３１９３の構築は
以下の実施例Ｆ、３で詳述する。
本発明で用いる修飾り蛋白コード配列（全Ｓコド配列を
含む）は、通常の特定部位突然変異誘発［例えば、Ｂｏ
Ｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２
９：１１９０ ３ （１９８５）参照］または組換えＤＮＡ技術〔例え
ば、Ｔ、ＭａｎｉａＬｉｓ ａｔ ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。
含む）は、通常の特定部位突然変異誘発［例えば、Ｂｏ
Ｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２
９：１１９０ ３ （１９８５）参照］または組換えＤＮＡ技術〔例え
ば、Ｔ、ＭａｎｉａＬｉｓ ａｔ ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。
Ａ ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ’Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ＋ＩａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
（１９８２）参照１により表ＡのＳおよびプレＳ蛋白
コード配列から調製できる。以下に記載のアミノ酸の位
置番号は表Ａの位置番号と一致する。しかしながら、発
表された他のＳおよびプレＳ配列の変種も本発明の修飾
り蛋白をつくる際に使用できる。
Ｓｐｒｉｎｇ ＋ＩａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
（１９８２）参照１により表ＡのＳおよびプレＳ蛋白
コード配列から調製できる。以下に記載のアミノ酸の位
置番号は表Ａの位置番号と一致する。しかしながら、発
表された他のＳおよびプレＳ配列の変種も本発明の修飾
り蛋白をつくる際に使用できる。
例えば、Ｓ蛋白は感染したヒト血゛清中のＤａｎｅ粒子
から抽出したＤＮＡの一重鎖領域をＤＮＡポリメラーゼ
（好ましくは、内因性ポリメラーゼ）で修復し、統いて
制限エンドヌクレアーゼで消化することにより単離でき
る。エンドヌクレアーゼの選択は個々のＤａｎｅ粒子に
一部依存するであろう。例えば、ａｄｗ血清型のある種
のＤａｎｅ粒子のＨＢＶ ＤＮＡのＨＢｓＡｇコード配
列は単のＢａｍＨＩ断片として単離できる；ａｙｗ血清
型のある種のＤａｎｅ粒子のＨＢＶＤＮＡのＨＢｓＡｇ
コード配列はＨｈ ａ Ｉ断片として単離できる。同し
血清型のＤａｎｅ粒子のＨＢＶ ＤＮＡであっても異な
る制限部位パターンを示すことがある。
から抽出したＤＮＡの一重鎖領域をＤＮＡポリメラーゼ
（好ましくは、内因性ポリメラーゼ）で修復し、統いて
制限エンドヌクレアーゼで消化することにより単離でき
る。エンドヌクレアーゼの選択は個々のＤａｎｅ粒子に
一部依存するであろう。例えば、ａｄｗ血清型のある種
のＤａｎｅ粒子のＨＢＶ ＤＮＡのＨＢｓＡｇコード配
列は単のＢａｍＨＩ断片として単離できる；ａｙｗ血清
型のある種のＤａｎｅ粒子のＨＢＶＤＮＡのＨＢｓＡｇ
コード配列はＨｈ ａ Ｉ断片として単離できる。同し
血清型のＤａｎｅ粒子のＨＢＶ ＤＮＡであっても異な
る制限部位パターンを示すことがある。
本発明の修飾り蛋白配列の構築は中間体ベクターの使用
により達成できる。７７−ジへのＤＮＡ断片のクローニ
ング技術は、例えばＣｈａｒｎａｙ ｅｔａｌ、 Ｎａ
ｔｕｒｅ、 ２８６：８９３−８９５ （１９８０）お
よびＴｉｏｌｌａｉｓ、英国特許第２０３４３２３号に
開示されている。
により達成できる。７７−ジへのＤＮＡ断片のクローニ
ング技術は、例えばＣｈａｒｎａｙ ｅｔａｌ、 Ｎａ
ｔｕｒｅ、 ２８６：８９３−８９５ （１９８０）お
よびＴｉｏｌｌａｉｓ、英国特許第２０３４３２３号に
開示されている。
本発明の修＃Ｌ蛋白は組換えＤＮＡ分子またはベクター
に構築される。本発明の組換えベクターは調節領域に機
能しうる状態で連結された本発明の修飾り蛋白コード配
列を含む。この種のベクターは使用するベクターおよび
／または宿主に応じてレプリコンをさらに含んでいても
よい。゛ルブリコン″なる用語は、ベクターで形質転換
された真核または原核宿主生物内に組換えベクターを安
定して染色体外に保持するように機能するＤＮＡの最小
領域を意味する。このようなレプリコンは当分野でよく
知られている。パ調節領域″なる用語は、構造遺伝子の
コード配列の転写を調節するプロモーター領域およびコ
ード配列の転写に必要な他の配列を含むＤＮＡ配列を意
味する。このような調節領域も当分野でよく知られてい
る。
に構築される。本発明の組換えベクターは調節領域に機
能しうる状態で連結された本発明の修飾り蛋白コード配
列を含む。この種のベクターは使用するベクターおよび
／または宿主に応じてレプリコンをさらに含んでいても
よい。゛ルブリコン″なる用語は、ベクターで形質転換
された真核または原核宿主生物内に組換えベクターを安
定して染色体外に保持するように機能するＤＮＡの最小
領域を意味する。このようなレプリコンは当分野でよく
知られている。パ調節領域″なる用語は、構造遺伝子の
コード配列の転写を調節するプロモーター領域およびコ
ード配列の転写に必要な他の配列を含むＤＮＡ配列を意
味する。このような調節領域も当分野でよく知られてい
る。
前記ベクターは慣用技術により、例えばレプリコンおよ
び調節領域をすでに含むベクターに本発明の修飾蛋白コ
ード配列を、このＤＮＡ分子が調節領域に機能しうる状
態で連結されるやり方で、挿入することにより作製でき
る。このＤＮＡ分子、または修飾り蛋白コード配列を含
む発現力セラ１−１はＬコード配列を調節領域に連結す
ることにより慣用技術を用いて構築できる。
び調節領域をすでに含むベクターに本発明の修飾蛋白コ
ード配列を、このＤＮＡ分子が調節領域に機能しうる状
態で連結されるやり方で、挿入することにより作製でき
る。このＤＮＡ分子、または修飾り蛋白コード配列を含
む発現力セラ１−１はＬコード配列を調節領域に連結す
ることにより慣用技術を用いて構築できる。
本発明で用いるＤＮＡ断片をつくるためのＤＮＡの制限
、本発明で用いる組換えＤＮＡ分子をつくるための前記
断片の連結、および微生物への挿入は既知技術、例えば
先に引用したまたは今後引用する文献に記載される技術
、を用いて行われる。
、本発明で用いる組換えＤＮＡ分子をつくるための前記
断片の連結、および微生物への挿入は既知技術、例えば
先に引用したまたは今後引用する文献に記載される技術
、を用いて行われる。
条件はＤＮＡおよび酵素の変性を避けるように選ばれる
。本発明を実施する際に用いる制限酵素およびリガーゼ
は市販されており、添付の使用説明３ 書に従って使用すべきである。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
が好適なりガーゼである。
。本発明を実施する際に用いる制限酵素およびリガーゼ
は市販されており、添付の使用説明３ 書に従って使用すべきである。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
が好適なりガーゼである。
修＃Ｌ蛋白発現用の種々の断片および最終構築物と、宿
主細胞による発現のためにこれらのコード配列を保有す
るベクターの諸成分とは、当分野で知られた慣用方法を
用いて一緒に連結される。
主細胞による発現のためにこれらのコード配列を保有す
るベクターの諸成分とは、当分野で知られた慣用方法を
用いて一緒に連結される。
多くの場合、遺伝子はすでに単離されており、制限地図
の作成および塩基配列決定が行われている。
の作成および塩基配列決定が行われている。
その程度まで、対象の配列（例えば、ＨＢＶエンベロー
プ蛋白コード配列）は遺伝子の制限により、必要に応じ
てＢａ１３１での切断、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発
、プライマー修復のような他の操作を用いて、選択する
ことが可能であり、これにより目的の配列を含みかつ適
当な末端をもつ所望の大きさの断片を得ることができる
。配列の連結、並びに失われた配列の修復（利用した制
限部位が対象の領域の内部にある場合）のためにリンカ
−やアダプターが用いられる。単離した種々の断片は電
気泳動で精製し、電気溶離し、他の配列に連結し、クロ
ーン化し、再度用離して、遺伝子操作を４ 行う。
プ蛋白コード配列）は遺伝子の制限により、必要に応じ
てＢａ１３１での切断、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発
、プライマー修復のような他の操作を用いて、選択する
ことが可能であり、これにより目的の配列を含みかつ適
当な末端をもつ所望の大きさの断片を得ることができる
。配列の連結、並びに失われた配列の修復（利用した制
限部位が対象の領域の内部にある場合）のためにリンカ
−やアダプターが用いられる。単離した種々の断片は電
気泳動で精製し、電気溶離し、他の配列に連結し、クロ
ーン化し、再度用離して、遺伝子操作を４ 行う。
対象の修飾り遺伝子の転写を制御する調節領域を使用す
ると、構造遺伝子の発現なしにまたは低発現レベルで宿
主細胞を高密度へ増殖させることができ、その後栄養素
、温度などの環境条件を変えることにより発現を誘発す
ることが可能である。
ると、構造遺伝子の発現なしにまたは低発現レベルで宿
主細胞を高密度へ増殖させることができ、その後栄養素
、温度などの環境条件を変えることにより発現を誘発す
ることが可能である。
Ｌ蛋白コード配列を保有するベクターは慣用技術により
所定の宿主細胞に形質転換されて、発現される。その後
、細胞は適当な培地（すなわち、宿主が生存できて、し
かも修飾し蛋白を回収可能な量で発現できる培地）で培
養する。例えば、酵母宿主細胞が選ばれる場合、使用す
る培地の例はＹｅａｓｔ Ｎ１ｔｒｏ（Ｈｅｎ Ｂａ５
ｅ最少培地である。適当な培地は用いる宿主に応じて当
分野で習熟した者により選ばれるであろう。
所定の宿主細胞に形質転換されて、発現される。その後
、細胞は適当な培地（すなわち、宿主が生存できて、し
かも修飾し蛋白を回収可能な量で発現できる培地）で培
養する。例えば、酵母宿主細胞が選ばれる場合、使用す
る培地の例はＹｅａｓｔ Ｎ１ｔｒｏ（Ｈｅｎ Ｂａ５
ｅ最少培地である。適当な培地は用いる宿主に応じて当
分野で習熟した者により選ばれるであろう。
本発明の修飾り蛋白分子は、修飾蛋白を分泌する細胞の
能力に応じて、細胞溶解液または培地抽出物から単離さ
れる。本発明蛋白の回収は通常の蛋白単離方法に従って
行われる。
能力に応じて、細胞溶解液または培地抽出物から単離さ
れる。本発明蛋白の回収は通常の蛋白単離方法に従って
行われる。
本発明の修飾り蛋白の生産のために、適当な宿５
主細胞または細胞系列が選ばれる。適当な細胞または細
胞系列は酵母細胞でありうる。当分野で知られた多くの
酵母細胞株が本発明の修飾り蛋白の発現用宿主細胞とし
て利用できる。本発明の実施に際して、どのような酵母
種を使用してもよい。
胞系列は酵母細胞でありうる。当分野で知られた多くの
酵母細胞株が本発明の修飾り蛋白の発現用宿主細胞とし
て利用できる。本発明の実施に際して、どのような酵母
種を使用してもよい。
１つの面において、以下の実施例はサツカロミセス、特
にＳ．セレビシエを使用する。Ｓ．セレビシエの多数の
株は公立の寄託所および研究所、例えばアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロッ
クビル）から入手できる。
にＳ．セレビシエを使用する。Ｓ．セレビシエの多数の
株は公立の寄託所および研究所、例えばアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロッ
クビル）から入手できる。
別の面では、ハンセヌラ・ポリモルファが使用される。
ハンセヌラ、ピキア、カンジダ、クリベロミセスおよび
シゾサツカロミセス（これらに限定されない）を含む他
の酵母種も使用される。
シゾサツカロミセス（これらに限定されない）を含む他
の酵母種も使用される。
さらに、他の種の真核宿主細胞、例えばチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞（ＣＴ（Ｏ）または３Ｔ３細胞のよう
な哺乳動物細胞もＬ蛋白発現用の宿主細胞として用いら
れる。適当な哺乳動物宿主細胞の選択、並びに形質転換
、培養、増幅、スクリニング、生産物の生産および精製
方法は当分野で知られている。例えば、ＧｅＬｈｉｎｇ
ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ。
ムスター卵巣細胞（ＣＴ（Ｏ）または３Ｔ３細胞のよう
な哺乳動物細胞もＬ蛋白発現用の宿主細胞として用いら
れる。適当な哺乳動物宿主細胞の選択、並びに形質転換
、培養、増幅、スクリニング、生産物の生産および精製
方法は当分野で知られている。例えば、ＧｅＬｈｉｎｇ
ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ。
Ｎａｔｕｒｅ、 ２９３＋６２０−６２５ （１９８］
） 、またはＫａｕｆｍａｎｅＬ ａｌ、 Ｍｏ１．Ｃ
ｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、、 ５（７）：１７５０−１７５９
（１９８５）もしくはＨｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ、米
国特許第４４１９４４６号を参照されたい。その他の適
当な哺乳動物細胞系列はサルＣＯ５−１細胞系列および
ＣＶ１細胞系列である。
） 、またはＫａｕｆｍａｎｅＬ ａｌ、 Ｍｏ１．Ｃ
ｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、、 ５（７）：１７５０−１７５９
（１９８５）もしくはＨｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ、米
国特許第４４１９４４６号を参照されたい。その他の適
当な哺乳動物細胞系列はサルＣＯ５−１細胞系列および
ＣＶ１細胞系列である。
上記のＬ蛋白コード配列に導入された欠失の一部は、哺
乳動物細胞によるＭおよびＳ特異的ｍＲＮＡの転写およ
び翻訳に関係した内部配列を変更させたことが認められ
るであろう。従って、このような修飾り蛋白コード配列
は、それらの個々の発現カセットを保有する哺乳動物細
胞によるＳおよび修飾り蛋白の独立した発現を可能にす
る。
乳動物細胞によるＭおよびＳ特異的ｍＲＮＡの転写およ
び翻訳に関係した内部配列を変更させたことが認められ
るであろう。従って、このような修飾り蛋白コード配列
は、それらの個々の発現カセットを保有する哺乳動物細
胞によるＳおよび修飾り蛋白の独立した発現を可能にす
る。
細菌細胞は本発明に適した宿主細胞どして同様に有用で
ある。例えば、種々の大腸菌株（例、ＨＢｌｏｌ、ＭＣ
１０６１，および以下の実施例で使用する株）がバイオ
テクノロジーの分野で宿主細胞として知られている。枯
草菌（Ｂ、５ｕｂｔ ｉ ］ ｉｓ）、６ シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） 、他の
細菌の種々の株も本方法で使用することができる。
ある。例えば、種々の大腸菌株（例、ＨＢｌｏｌ、ＭＣ
１０６１，および以下の実施例で使用する株）がバイオ
テクノロジーの分野で宿主細胞として知られている。枯
草菌（Ｂ、５ｕｂｔ ｉ ］ ｉｓ）、６ シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） 、他の
細菌の種々の株も本方法で使用することができる。
さらに、所望により、昆虫細胞も本発明方法において宿
主細胞として用いられる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ
ａｌ、 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ１）
、 ８：２７７−２９８（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ
１９８６）およびそこに引用された文献を参照されたい
。
主細胞として用いられる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ
ａｌ、 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ１）
、 ８：２７７−２９８（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ
１９８６）およびそこに引用された文献を参照されたい
。
また、ある種のウィルス（例えば、バキュロウィルスま
たはワクシニアウィルス）も本発明のＬ蛋白を発現させ
るために利用できる。適当な宿主細胞の選択は当分野で
習熟した者の技量の範囲内であり、適当な培養条件、培
地および所定の宿主細胞内での発現に適したベクター成
分の選択も同様である。
たはワクシニアウィルス）も本発明のＬ蛋白を発現させ
るために利用できる。適当な宿主細胞の選択は当分野で
習熟した者の技量の範囲内であり、適当な培養条件、培
地および所定の宿主細胞内での発現に適したベクター成
分の選択も同様である。
上述したまたは以下の実施例で述べる発現系において、
所定の宿主細胞による蛋白コード配列の発現を制御しう
る既知プロモーターはどれも選択できる。所定の宿主細
胞が酵母細胞である場合、修飾り蛋白カセットの発現に
有用なゾロモータには強力なプロモーターＴ Ｄ Ｔ１
３または他の構成８ 的もしくは調節プロモーター（増殖培地の組成に応じて
Ｌ蛋白のレベルを調節できる）が含まれる。
所定の宿主細胞による蛋白コード配列の発現を制御しう
る既知プロモーターはどれも選択できる。所定の宿主細
胞が酵母細胞である場合、修飾り蛋白カセットの発現に
有用なゾロモータには強力なプロモーターＴ Ｄ Ｔ１
３または他の構成８ 的もしくは調節プロモーター（増殖培地の組成に応じて
Ｌ蛋白のレベルを調節できる）が含まれる。
さらに、例えば、ＰＧＫ％ＡＲＧ３およびＡ Ｐ Ｈｌ
も本発明ベクターで使用するのに適したプロモーターで
ある。
も本発明ベクターで使用するのに適したプロモーターで
ある。
本発明はまた、係属中の米国特許出願第０７／３６８４
０１号に詳しく説明されるような、混合ポリペプチド組
成のＨＢｓＡｇ粒子の一部としての本発明の修飾り蛋白
の発現を提供する。この方法は第一蛋白Ｓおよび第二蛋
白Ｘ−Ｓ （ここで、Ｓは実質的にＨＢ Ｖの主要表面
蛋白であり、そしてＸは、本発明のために、Ｓコード配
列に同調融合された機能的なりＮＡコード領域によりコ
ードされる修飾プレＳ配列である）の酵母細胞による同
時発現を含んでいる。
０１号に詳しく説明されるような、混合ポリペプチド組
成のＨＢｓＡｇ粒子の一部としての本発明の修飾り蛋白
の発現を提供する。この方法は第一蛋白Ｓおよび第二蛋
白Ｘ−Ｓ （ここで、Ｓは実質的にＨＢ Ｖの主要表面
蛋白であり、そしてＸは、本発明のために、Ｓコード配
列に同調融合された機能的なりＮＡコード領域によりコ
ードされる修飾プレＳ配列である）の酵母細胞による同
時発現を含んでいる。
係属中の米国特許出願第０７／３６８４０１号を参照す
る場合、実質的に同じ技術内容がＪａｃｏｂｓ ｅｔ
ａｌ、、 Ｇｅｎｅ ８０：２７９−２９］ （１９８
９）に開示されていることに留意すべきである。
る場合、実質的に同じ技術内容がＪａｃｏｂｓ ｅｔ
ａｌ、、 Ｇｅｎｅ ８０：２７９−２９］ （１９８
９）に開示されていることに留意すべきである。
この方法によれば、Ｓ蛋白コード配列は修飾１９
蛋白アミノ酸配列と同時発現される。Ｌ蛋白のコード領
域およびＳ蛋白のコード配列は、通常の化学合成または
組換えＤＮＡ技術を使って上記のように構築される。修
飾し蛋白はＳ蛋白と共に混合サブユニット組成の粒子に
組み入れられる。
域およびＳ蛋白のコード配列は、通常の化学合成または
組換えＤＮＡ技術を使って上記のように構築される。修
飾し蛋白はＳ蛋白と共に混合サブユニット組成の粒子に
組み入れられる。
本発明の修＃Ｌ蛋白を含むＸ−５蛋白の構築において、
Ｓは好ましくはＨＢ Ｖの全成熟表面蛋白（約２２６ア
ミノ酸）である（表Ａ参照）。また、Ｓ蛋白はＨＢＶゲ
ノムのＳ蛋白コード配列によりコードされてもよく、こ
の場合ＳはオーセンティックＨＢｓＡｇ Ｓ蛋白と実
質的に同じである。また、Ｓの末端切断形も、粒子集合
体に悪影響を及ぼさない限り、修飾り蛋白含有混合粒子
の構築において使用できる。
Ｓは好ましくはＨＢ Ｖの全成熟表面蛋白（約２２６ア
ミノ酸）である（表Ａ参照）。また、Ｓ蛋白はＨＢＶゲ
ノムのＳ蛋白コード配列によりコードされてもよく、こ
の場合ＳはオーセンティックＨＢｓＡｇ Ｓ蛋白と実
質的に同じである。また、Ｓの末端切断形も、粒子集合
体に悪影響を及ぼさない限り、修飾り蛋白含有混合粒子
の構築において使用できる。
Ｓ蛋白コード配列は、酵母宿主によるＳ蛋白の発現を可
能にするために、慣用技法を使って第一の発現カセット
に配置される。Ｓ蛋白コード配列またはその大部分はプ
レＳフード配列の部分との融合に使用され、そして本発
明の修飾り蛋白の生産を可能にする第二の発現カセット
に配置される。
能にするために、慣用技法を使って第一の発現カセット
に配置される。Ｓ蛋白コード配列またはその大部分はプ
レＳフード配列の部分との融合に使用され、そして本発
明の修飾り蛋白の生産を可能にする第二の発現カセット
に配置される。
上記のように慣用技法を用いて構築した、Ｓ蛋白発現カ
セットを保有するベクターおよび修＃Ｌ蛋白発現カセッ
トを保有する１以上のベクターは、慣用技法により酵母
宿主細胞に形質転換される。
セットを保有するベクターおよび修＃Ｌ蛋白発現カセッ
トを保有する１以上のベクターは、慣用技法により酵母
宿主細胞に形質転換される。
これとは別に、Ｓ蛋白発現カセットと１以上の修飾り蛋
白発現カセットを同一のベクターに一緒に配置すること
ができ、このベクターは酵母宿主細胞に形質転換される
。
白発現カセットを同一のベクターに一緒に配置すること
ができ、このベクターは酵母宿主細胞に形質転換される
。
使用できるベクターは係属中の米国特許出願第３８６４
０１号に詳述される７７組込み型ベクターである。別の
方法は目的の発現カセットを保有しかつ酵母宿主細胞を
形質転換する適合性の自律複製ベクターを使用する。
０１号に詳述される７７組込み型ベクターである。別の
方法は目的の発現カセットを保有しかつ酵母宿主細胞を
形質転換する適合性の自律複製ベクターを使用する。
ベクター系の例はＭｅｌｌｏｒ ｅＬ ａｌ、、 Ｙｅ
ａｓｔ、 ２：１４５ （１９８６）； Ｂｏｅｋｅ
ｅＬａｌ、、 Ｃｅ１１．４０：４９１ （１９８５）
； Ｂｏｅｋｅ ｅｃ ａｌ、、 Ｃｅ１１．４２：５
０７ （１９８５）および係属中の米国特許出願第１０
１４６３；２３３６３１ ；３６８４０１．；００９３
２５号（欧州特許公開第０２７８９４０号）に詳しく記
載されている。
ａｓｔ、 ２：１４５ （１９８６）； Ｂｏｅｋｅ
ｅＬａｌ、、 Ｃｅ１１．４０：４９１ （１９８５）
； Ｂｏｅｋｅ ｅｃ ａｌ、、 Ｃｅ１１．４２：５
０７ （１９８５）および係属中の米国特許出願第１０
１４６３；２３３６３１ ；３６８４０１．；００９３
２５号（欧州特許公開第０２７８９４０号）に詳しく記
載されている。
さらに、ここに記載の混合ポリペグチド組成の複合ＨＢ
ｓＡｇ粒子の発現のために、他の種の宿主細胞も使用で
きる。適当な真核宿主は本発明の修飾り蛋白の発現のた
めに先に挙げたものと同じであり、例えばＣＨＯ細胞の
ような哺乳動物細胞である。昆虫細胞および先に挙げた
バキコ、ロウイルスやワクシニアウィルスのようなウィ
ルスも使用できる。
ｓＡｇ粒子の発現のために、他の種の宿主細胞も使用で
きる。適当な真核宿主は本発明の修飾り蛋白の発現のた
めに先に挙げたものと同じであり、例えばＣＨＯ細胞の
ような哺乳動物細胞である。昆虫細胞および先に挙げた
バキコ、ロウイルスやワクシニアウィルスのようなウィ
ルスも使用できる。
本発明方法の好適な実施態様は、Ｓ蛋白発現カセットを
保有する７７組込み型ベクターと、修飾り蛋白発現カセ
ットを保有する自律複製プラスミドベクターを使用する
。Ｓ蛋白発現カセットを保有するＴｙベクターを使用す
ると、これらの配列が酵母宿主細胞の染色体に安定した
状態で組み込まれる。このような組込みはそれらの切除
頻度が低いために安定している。こうして、ベクターは
細胞集団に均一に分配され、各細胞での類似した蛋白合
成速度が可能となる。
保有する７７組込み型ベクターと、修飾り蛋白発現カセ
ットを保有する自律複製プラスミドベクターを使用する
。Ｓ蛋白発現カセットを保有するＴｙベクターを使用す
ると、これらの配列が酵母宿主細胞の染色体に安定した
状態で組み込まれる。このような組込みはそれらの切除
頻度が低いために安定している。こうして、ベクターは
細胞集団に均一に分配され、各細胞での類似した蛋白合
成速度が可能となる。
修飾り蛋白発現カセットを保有する自律複製プラスミド
のこれらの細胞への形質転換は、各細胞でのＳ蛋白合成
量が限られているのに対して、細胸肉に存在するプラス
ミドのコピー数に応じて修飾り蛋白の合成レベルが変化
することを保証している。
のこれらの細胞への形質転換は、各細胞でのＳ蛋白合成
量が限られているのに対して、細胸肉に存在するプラス
ミドのコピー数に応じて修飾り蛋白の合成レベルが変化
することを保証している。
別の好適な実施態様において、Ｓ蛋白発現力セントと修
飾り蛋白発現カセットの両方はＴｙ組込み型ベクターに
挿入され、相反する接合型の酵母宿主細胞に別々に組込
まれる。その後、希望する数のＳカセットおよび修飾Ｌ
カセットを保有する酵母株は、Ｓおよび修飾Ｌポリペプ
チドの両方を発現する二倍体細胞を得るために接合させ
る。所望により、前記二倍体の胞子を形成させることに
より、両方の型の発現力セントを保有する半数体を得る
ことができる。
飾り蛋白発現カセットの両方はＴｙ組込み型ベクターに
挿入され、相反する接合型の酵母宿主細胞に別々に組込
まれる。その後、希望する数のＳカセットおよび修飾Ｌ
カセットを保有する酵母株は、Ｓおよび修飾Ｌポリペプ
チドの両方を発現する二倍体細胞を得るために接合させ
る。所望により、前記二倍体の胞子を形成させることに
より、両方の型の発現力セントを保有する半数体を得る
ことができる。
細胞は適当な培地、すなわち宿主が混合サブユニット組
成の粒子としてＳ蛋白と修飾り蛋白を回収可能な量で発
現できる培地、を用いて培養する。
成の粒子としてＳ蛋白と修飾り蛋白を回収可能な量で発
現できる培地、を用いて培養する。
修飾り蛋白は酵母細胞によりＳ蛋白と同時に生産され、
混合複合粒子として集成されるであろう。
混合複合粒子として集成されるであろう。
このような粒子はここでは２以上のポリペプチドから成
る粒状構造のマルチマー集成体として定義され、混合ポ
リペプチド組成の複雑な性質により特徴づけられる。異
なるペプチドは混合粒子の表面に空間的会合で配置され
る。新規な修飾り蛋白がＨＢ ｓ Ａ ｇ粒子に存在す
ると、天然の抗原決定基の認識により誘起される免疫応
答と類似した免疫応答が誘起されるであろう。これによ
り、本発明は、ＨＢＶのＳ、ＭおよびＬ蛋白からの不可
欠な抗原部位を含むが故に天然の粒子に似ているＨＢｓ
Ａｇ粒子の酵母による生産を可能にする。
る粒状構造のマルチマー集成体として定義され、混合ポ
リペプチド組成の複雑な性質により特徴づけられる。異
なるペプチドは混合粒子の表面に空間的会合で配置され
る。新規な修飾り蛋白がＨＢ ｓ Ａ ｇ粒子に存在す
ると、天然の抗原決定基の認識により誘起される免疫応
答と類似した免疫応答が誘起されるであろう。これによ
り、本発明は、ＨＢＶのＳ、ＭおよびＬ蛋白からの不可
欠な抗原部位を含むが故に天然の粒子に似ているＨＢｓ
Ａｇ粒子の酵母による生産を可能にする。
本発明混合粒子の細胞溶解液または培地抽出物からの単
離は、通常の蛋白分離技法を用いて行われる。
離は、通常の蛋白分離技法を用いて行われる。
本発明のこの方法の実施に際して、形質転換、クローニ
ングおよび発現系に利用しうる酵母宿主種はどれもＨＢ
ｓＡｇの゛′混合粒子′″の形成に使用できる。
ングおよび発現系に利用しうる酵母宿主種はどれもＨＢ
ｓＡｇの゛′混合粒子′″の形成に使用できる。
他の酵母属では、Ｔｙ配列が存在せず、従ってベクター
系はこれらの属によりＳおよび修飾り蛋白コード配列を
同時発現させて混合粒子を形成させるように設計されね
ばならない。こうして、発４−１ ３ 現カセットは、染色体への組込みを可能にする他の反復
ＤＮＡ配列またはプラスミド（例、ピキアのような酵母
中のＡＲ５を土台としたプラスミド）を用いて、酵母染
色体への組込みのために設計される。この種の適当なＡ
ＲＳプラスミドの例は４ Ｃｒｅｇｇ ｅＬａｌ、 Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ
、、 ５（１２）：３３７６ （１９８５）に記載され
ている。
系はこれらの属によりＳおよび修飾り蛋白コード配列を
同時発現させて混合粒子を形成させるように設計されね
ばならない。こうして、発４−１ ３ 現カセットは、染色体への組込みを可能にする他の反復
ＤＮＡ配列またはプラスミド（例、ピキアのような酵母
中のＡＲ５を土台としたプラスミド）を用いて、酵母染
色体への組込みのために設計される。この種の適当なＡ
ＲＳプラスミドの例は４ Ｃｒｅｇｇ ｅＬａｌ、 Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ
、、 ５（１２）：３３７６ （１９８５）に記載され
ている。
上記の発現系（例えば、Ｔｙ発現系と他の発現系）にお
いて、調節要素はＲＮＡポリメラーゼ結合および転写を
起こさせるプロモーターから成る。
いて、調節要素はＲＮＡポリメラーゼ結合および転写を
起こさせるプロモーターから成る。
調節可能な、すなわち誘導可能または抑制解除可能な、
プロモーターも使用できる。酵母による異種ポリペプチ
ドの発現のために、多種多様の有用なプロモーターが利
用しうる。これらには銅誘導可能なメタロチオネイン遺
伝子（ＣＵＰＩ）プロモーターおよびグルコース分解遺
伝子の構成的プロモーター、グリセロアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３，）およびアルコー
ルデヒドロゲナーゼ（Ａ Ｄ Ｈ）が含まれる。酵母で
の転写終結のための領域は、数種類の酵母遺伝子のいず
れか、例えばイソ−１−チトクロームＣ（ＣＹＣＩ）の
遺伝子、の３′末端から誘導される。
プロモーターも使用できる。酵母による異種ポリペプチ
ドの発現のために、多種多様の有用なプロモーターが利
用しうる。これらには銅誘導可能なメタロチオネイン遺
伝子（ＣＵＰＩ）プロモーターおよびグルコース分解遺
伝子の構成的プロモーター、グリセロアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３，）およびアルコー
ルデヒドロゲナーゼ（Ａ Ｄ Ｈ）が含まれる。酵母で
の転写終結のための領域は、数種類の酵母遺伝子のいず
れか、例えばイソ−１−チトクロームＣ（ＣＹＣＩ）の
遺伝子、の３′末端から誘導される。
クリベロミセス属酵母用の発現系は例えばＨｏｌｌｅｎ
ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、 ＰＣＴ ＷＯ８３／ ０４０
５０；シゾザッ力ロミセス属用は例えばＹａｍａｍｏｔ
ｏ。
ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、 ＰＣＴ ＷＯ８３／ ０４０
５０；シゾザッ力ロミセス属用は例えばＹａｍａｍｏｔ
ｏ。
５
ＥＰ−Ａ−１０７１７０；ピキア属用は例えばＣｒｅｇ
ｇ ｅｔ ａｌ、 １３ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
５：４７９ （１９８７） ；およびハンセヌラ属
用は例えばＨｏｌ Ｉｅｎｂｅｒｇ ａｔａｌ、ＥＰ−
Ａ−２９９１０８に記載されている。
ｇ ｅｔ ａｌ、 １３ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
５：４７９ （１９８７） ；およびハンセヌラ属
用は例えばＨｏｌ Ｉｅｎｂｅｒｇ ａｔａｌ、ＥＰ−
Ａ−２９９１０８に記載されている。
特に、Ｔｙを土台としたベクターに導入されたＳ蛋白発
現カセットのゲノム組込みの結果としてＳ蛋白を合成し
うるＳ．セレビシエ株が本発明の実施例により提供され
る。Ｔ Ｄ Ｈ３−Ｓコード配列−ＡＲＧ３カセットお
よびＵＲＡ３マーカーを含むこの種のベクター、ｐＲＩ
Ｔ１３１３３−Ｌ。
現カセットのゲノム組込みの結果としてＳ蛋白を合成し
うるＳ．セレビシエ株が本発明の実施例により提供され
る。Ｔ Ｄ Ｈ３−Ｓコード配列−ＡＲＧ３カセットお
よびＵＲＡ３マーカーを含むこの種のベクター、ｐＲＩ
Ｔ１３１３３−Ｌ。
は係属中の米国特許出願第３６８４０１号の実施例１に
記載されている。
記載されている。
もう１つのＴｙｌベクター、ｐＲＩＴ１３０３４−Ｌｌ
は同一の発現力セラ１−およびＵＲＡ３マカーを含むが
、さらにＣＵＰＩｓまたはｃｕｐ１△受容酵母株におい
て追加のマーカーとして使用されるＣＵＰ １遺伝子を
含む。
は同一の発現力セラ１−およびＵＲＡ３マカーを含むが
、さらにＣＵＰＩｓまたはｃｕｐ１△受容酵母株におい
て追加のマーカーとして使用されるＣＵＰ １遺伝子を
含む。
好適な酵母株は、数コピーのベクターを組込んだ形質転
換細胞を容易に選択するために、銅の毒性に感受性の染
色体ＣＵＰ ｌ遺伝子を欠いている。
換細胞を容易に選択するために、銅の毒性に感受性の染
色体ＣＵＰ ｌ遺伝子を欠いている。
２種類の好適なｃｕｐｌ△酵母株、ＥＪ ｃｕｐｌ△
３ｄおよびＥＪ ｃｕｐｌ△７ｂは係属中の米国特許
出願第３６８４０１号の実施例９に記載されている。
３ｄおよびＥＪ ｃｕｐｌ△７ｂは係属中の米国特許
出願第３６８４０１号の実施例９に記載されている。
数コピーのｐＲＩＴ１３１３３−ＬまたはｐＲｒＴ１３
０３４−Ｌを組込んだ酵母株は以下の実施例で説明する
。
０３４−Ｌを組込んだ酵母株は以下の実施例で説明する
。
修飾り蛋白の発現カセットを保有する自律複製酵母発現
プラスミドのこれらの酵母株への形質転換も以下の実施
例で説明する。
プラスミドのこれらの酵母株への形質転換も以下の実施
例で説明する。
数コピーのＳ蛋白と修飾り蛋白の両方の発現カセットを
組込んだ二倍体酵母株は以下の実施例Ｆ。
組込んだ二倍体酵母株は以下の実施例Ｆ。
１０で説明する。
修飾り蛋白を単独でまたは混合サブユニット組成の粒子
として生産する本発明方法は、病原性微生物に対するワ
クチンの製造に利用される。例えば、修飾り蛋白はＢ型
肝炎表面抗原を含む種々のワクチン製剤において使用さ
れ、既知のＨＢＶワクチンでは得られない利点をもたら
す。修飾り蛋白を含む混合サブユニット組成のＨＢｓＡ
ｇ粒子は、ＨＢＶ感染者の血液中に存在する粒子または
糸状体またはピリオン（主要蛋白からのエピトゲのほか
に表面に露出したプレＳ２およびプレＳ■エピトープを
含む）に似ており、新規なワクチン製剤に有用であると
判明した。修飾り蛋白またはそれらを含む混合サブユニ
ット組成の混合粒子はＳ、ＭおよびＬ蛋白の混合物では
得られない免疫原性特性を有する。
として生産する本発明方法は、病原性微生物に対するワ
クチンの製造に利用される。例えば、修飾り蛋白はＢ型
肝炎表面抗原を含む種々のワクチン製剤において使用さ
れ、既知のＨＢＶワクチンでは得られない利点をもたら
す。修飾り蛋白を含む混合サブユニット組成のＨＢｓＡ
ｇ粒子は、ＨＢＶ感染者の血液中に存在する粒子または
糸状体またはピリオン（主要蛋白からのエピトゲのほか
に表面に露出したプレＳ２およびプレＳ■エピトープを
含む）に似ており、新規なワクチン製剤に有用であると
判明した。修飾り蛋白またはそれらを含む混合サブユニ
ット組成の混合粒子はＳ、ＭおよびＬ蛋白の混合物では
得られない免疫原性特性を有する。
本発明の別の実施態様において、混合サブユニット組成
の粒子は、防御範囲を広くするように、異なる亜型の抗
原決定基をもつ修飾り蛋白およびＳ蛋白を含む。すなわ
ち、修飾り蛋白はａｙ亜型で、Ｓ蛋白はａｄ亜型である
か、またはその逆でありうる。
の粒子は、防御範囲を広くするように、異なる亜型の抗
原決定基をもつ修飾り蛋白およびＳ蛋白を含む。すなわ
ち、修飾り蛋白はａｙ亜型で、Ｓ蛋白はａｄ亜型である
か、またはその逆でありうる。
従って、本発明は本発明の修飾し蛋白または混合（Ｓ、
修飾Ｌ）もしくは均質（修飾り蛋白）サブユニット形態
の修飾り蛋白含有粒子を含むワクチンを提供する。この
種のワクチンは免疫防御量の粒子または修飾り蛋白を含
み、すなわち十分量の蛋白または粒子が重大な副作用を
起こすことな８ ＜ＨＢＶに対して十分な防御抗体応答を誘起すべく投与
される。前記ワクチンは慣用技術により製造される。例
えば、ヒトのＨＢＶ感染に対する防御を刺激するワクチ
ンは、上記の粒子および／または修飾り蛋白を適当な慣
用担体と共に含有する。
修飾Ｌ）もしくは均質（修飾り蛋白）サブユニット形態
の修飾り蛋白含有粒子を含むワクチンを提供する。この
種のワクチンは免疫防御量の粒子または修飾り蛋白を含
み、すなわち十分量の蛋白または粒子が重大な副作用を
起こすことな８ ＜ＨＢＶに対して十分な防御抗体応答を誘起すべく投与
される。前記ワクチンは慣用技術により製造される。例
えば、ヒトのＨＢＶ感染に対する防御を刺激するワクチ
ンは、上記の粒子および／または修飾り蛋白を適当な慣
用担体と共に含有する。
粒子または修飾り蛋白は直接使用のために生理学的ｐ
Ｈに緩衝化された水溶液でありうる。また、蛋白や粒子
は水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのよう
な慣用アジュバントと混合しても、それに吸着させても
よい。このような粒子または修飾り蛋白は混合ワクチン
を調製するために他の免疫原と組合わせることもできる
。例えば、Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、 ｅｄｓ。
Ｈに緩衝化された水溶液でありうる。また、蛋白や粒子
は水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのよう
な慣用アジュバントと混合しても、それに吸着させても
よい。このような粒子または修飾り蛋白は混合ワクチン
を調製するために他の免疫原と組合わせることもできる
。例えば、Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、 ｅｄｓ。
Ｖｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ、 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ。
Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ。
Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、 ＭＤ （１９７８）を参照され
たい。
たい。
これらの修飾し蛋白（単独または混合もしくは均質サブ
ユニット組成の粒子）はＨＢ Ｖに対する抗体スペクト
ルを広げ、これらの蛋白を含むワクチンの接種者にウィ
ルスチャレンジに対するより早期の応答を与える。さら
に、これらの修飾り蛋９ 自含有ワクチンはＳ蛋白に応答しないヒトにプレＳ応答
を与えたり、Ｓ応答を増大または増強することができる
。
ユニット組成の粒子）はＨＢ Ｖに対する抗体スペクト
ルを広げ、これらの蛋白を含むワクチンの接種者にウィ
ルスチャレンジに対するより早期の応答を与える。さら
に、これらの修飾り蛋９ 自含有ワクチンはＳ蛋白に応答しないヒトにプレＳ応答
を与えたり、Ｓ応答を増大または増強することができる
。
本発明の粒子および／または修飾り蛋白はこのほかに、
生物学的試料中のＨＢ ＶまたはＨＢ Ｖ誘導蛋白もし
くは抗ＨＢＶ抗体を通常のイムノアッセイなどで検出す
るためのプローブまたは試薬として使用される。
生物学的試料中のＨＢ ＶまたはＨＢ Ｖ誘導蛋白もし
くは抗ＨＢＶ抗体を通常のイムノアッセイなどで検出す
るためのプローブまたは試薬として使用される。
ここに記載のワクチンはすべて適当な経路で、例えば皮
下、静脈内または筋肉的経路で投与されることが理解さ
れるであろう。それぞれのワクヂン投与における免疫原
の量は、患者の年令、体重、性別、−膜内な体の調子な
どを考慮して医師か決定する。有意な副作用なしに患者
の免疫防御応答を誘発する量は、用いる免疫原およびア
ジコーバントの有無に応じて変化する。一般に、１回の
投与量は１〜ｌ０００μｇの蛋白、好ましくは１〜２０
０μｇの蛋白を含むと予想される。場合により、初期量
に続いて追加免疫を繰り返し行っ−Ｃもよい。
下、静脈内または筋肉的経路で投与されることが理解さ
れるであろう。それぞれのワクヂン投与における免疫原
の量は、患者の年令、体重、性別、−膜内な体の調子な
どを考慮して医師か決定する。有意な副作用なしに患者
の免疫防御応答を誘発する量は、用いる免疫原およびア
ジコーバントの有無に応じて変化する。一般に、１回の
投与量は１〜ｌ０００μｇの蛋白、好ましくは１〜２０
０μｇの蛋白を含むと予想される。場合により、初期量
に続いて追加免疫を繰り返し行っ−Ｃもよい。
従って、本発明はさらに、免疫防御量の本発明ワクチン
を患者に投与することから成る、ヒトにおけるＢ型肝炎
感染症の治療または予防方法を提供する。
を患者に投与することから成る、ヒトにおけるＢ型肝炎
感染症の治療または予防方法を提供する。
特に好適な本発明ワクチンは、構造（Ｌ＊、Ｓ）（ここ
で、Ｌ＊は以下で定義する通りであり、ＳはＢ型肝炎表
面抗原のＳ蛋白を表す）の複合粒子を含むものであり、
最も好ましくはＳ．セレビシエまたはＨ，ポリモルファ
により発現されたものである。
で、Ｌ＊は以下で定義する通りであり、ＳはＢ型肝炎表
面抗原のＳ蛋白を表す）の複合粒子を含むものであり、
最も好ましくはＳ．セレビシエまたはＨ，ポリモルファ
により発現されたものである。
ここで用いる記号Ｌ＊は上記表Ａに示したａｄ血清型の
ＨＢウィルスにおける大きいオープン・リーディング・
フレームに関して残基１２−５２．１３３−１４５およ
び１７５−４００から成る修飾り蛋白を表す。同様に、
記号△ｇ ｌ ｙ Ｔ−＊は残基１２に続く残基１４−
５２、これに続く残基１３３−１．４５および１７５−
４００から成る修飾り蛋白を表す。
ＨＢウィルスにおける大きいオープン・リーディング・
フレームに関して残基１２−５２．１３３−１４５およ
び１７５−４００から成る修飾り蛋白を表す。同様に、
記号△ｇ ｌ ｙ Ｔ−＊は残基１２に続く残基１４−
５２、これに続く残基１３３−１．４５および１７５−
４００から成る修飾り蛋白を表す。
以下の実施例は本発明を例示するものである。
撫粟
１、プラスミド
本明細書中で述べるプラスミドは以下のパートＡで説明
する。
する。
２、酵母株
ハンセヌラ・ポリモルファＲＢＩＯ（ｕｒａ３）は、本
質的にＲｏｇｇｅｎｋａｍｐ ｅｃ ａｌ、（１９８６
）に記載されるようなエチルメタンスルホネ−１−（Ｅ
ＭＳ）を用いる突然変異誘発により得られたハンセヌラ
・ポリモルファＡＴＣＣ３４４３８の変異体である。
質的にＲｏｇｇｅｎｋａｍｐ ｅｃ ａｌ、（１９８６
）に記載されるようなエチルメタンスルホネ−１−（Ｅ
ＭＳ）を用いる突然変異誘発により得られたハンセヌラ
・ポリモルファＡＴＣＣ３４４３８の変異体である。
３、酵素
制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガゼ、およ
び他の酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ （Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ、 Ｆ１？Ｇ）またはＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｅｇｇｅｎｓｔｅ
ｉｎ、 ＦＩ？Ｇ）から得られた。これらの酵素はそれ
ぞれの製造者の説明書に従って使用した。
び他の酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ （Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ、 Ｆ１？Ｇ）またはＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｅｇｇｅｎｓｔｅ
ｉｎ、 ＦＩ？Ｇ）から得られた。これらの酵素はそれ
ぞれの製造者の説明書に従って使用した。
４、免疫試薬
ａ）５１．１：プレＳ１蛋白のＳｌｌドメイン時異的な
マウス・モノクローナル抗体 （ＳｍｉＬｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、
Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、 Ｂｅｌｇｉｕｍ）９ ｂ）５２．１．５２．２８よびＳ２．５：Ｂ型肝炎表面
抗原の５２ドメインに特異的なマウス・モノクローナル
抗体（ＳｍｉｔｈＫＩｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ
。
マウス・モノクローナル抗体 （ＳｍｉＬｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、
Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、 Ｂｅｌｇｉｕｍ）９ ｂ）５２．１．５２．２８よびＳ２．５：Ｂ型肝炎表面
抗原の５２ドメインに特異的なマウス・モノクローナル
抗体（ＳｍｉｔｈＫＩｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ
。
Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、 Ｂｅｌｇｉｕｍ）Ｂ型肝炎表面
抗原の５１ドメインおよびＳ２ドメインに特異的な抗体
は″プレＳ抗体″と呼ぶことにする。
抗原の５１ドメインおよびＳ２ドメインに特異的な抗体
は″プレＳ抗体″と呼ぶことにする。
ｃ）ＲＦ６：Ｂ型肝炎表面抗原のＳドメインに特異的な
マウス・モノクローナル抗体（Ｈ，Ｔｈｏｍａｓ。
マウス・モノクローナル抗体（Ｈ，Ｔｈｏｍａｓ。
ＲｏｙａＩ Ｆｒｅｅ ｆＦｏｓｐｉＬａｌ、 Ｌｏｎ
ｄｏｎ）ｄ）ＲＦＩ：Ｓ領域に存在する立体配座依存性
エピドーグに特異的なマウス・モノクローナル抗体（Ｈ
，Ｔｈｏｍａｓ、 Ｒｏｙａｌ Ｆｒｅｅ Ｈｏ５ｐｉ
ｔａｌ、 Ｌｏｎｄｏｎ）ｅ）ＨＢＳＩ：Ｓ領域に存在
する血漿誘導ＨＢｓＡｇの変性および還元抵抗エピトー
プに対して誘導されたマウス・モノクローナル抗体 （
ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、 Ｒ
ｉｘｅｎｓａｒｔ、 Ｂｅｌｇｉｕｍ） 。このモノク
ローナル抗体はＭａｂＲＦ６との結合実験において競合
する。
ｄｏｎ）ｄ）ＲＦＩ：Ｓ領域に存在する立体配座依存性
エピドーグに特異的なマウス・モノクローナル抗体（Ｈ
，Ｔｈｏｍａｓ、 Ｒｏｙａｌ Ｆｒｅｅ Ｈｏ５ｐｉ
ｔａｌ、 Ｌｏｎｄｏｎ）ｅ）ＨＢＳＩ：Ｓ領域に存在
する血漿誘導ＨＢｓＡｇの変性および還元抵抗エピトー
プに対して誘導されたマウス・モノクローナル抗体 （
ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、 Ｒ
ｉｘｅｎｓａｒｔ、 Ｂｅｌｇｉｕｍ） 。このモノク
ローナル抗体はＭａｂＲＦ６との結合実験において競合
する。
抗体ａ）、ｂ）およびｅ）はマウス牌細胞とミ３
エローマ細胞との融合により標準方法に従って製造した
。この方法については、ＫＯｈｌｅｒ ａｎｄＭｉｉｓ
ｔｅｉｎ、 １９７５を参照されたい。−飲方法はＧｏ
ｄｉｎ１）、 Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ、 Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ Ｐｒａｃｔｉ
ｃｅ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｌｏｎｄｏ
ｎ １９８３に記載されている。
。この方法については、ＫＯｈｌｅｒ ａｎｄＭｉｉｓ
ｔｅｉｎ、 １９７５を参照されたい。−飲方法はＧｏ
ｄｉｎ１）、 Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ、 Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ Ｐｒａｃｔｉ
ｃｅ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｌｏｎｄｏ
ｎ １９８３に記載されている。
ｆ ） Ａ Ｕ Ｓ ＲＩ Ａ （ＡｂｂｏｔＬ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ−Ｄｅｌｋｅｎｈｅｉｍ、 ＦＲＧ
およびＬｏｕｖａｉｎ−Ｉ−ａＮｅｕｖｅ、 Ｂｅｌｇ
ｉｕｍ） ：天然立体配座エピト−プに対して誘導され
たポリクローナル抗体を含む商業的キット。
およびＬｏｕｖａｉｎ−Ｉ−ａＮｅｕｖｅ、 Ｂｅｌｇ
ｉｕｍ） ：天然立体配座エピト−プに対して誘導され
たポリクローナル抗体を含む商業的キット。
ｇ ） Ａ Ｕ Ｓ Ｚ ＹＭ Ｅ （ＡｂｂｏＬ
ｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
ｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
ｌＶｉｅｓｂａｄｅｎ−Ｄｅｌｋｅｎｈｅｉｍ、 ＦＲ
ＧおよびＬｏｕｖａｉｎ−ＬａＮｅｕｖｅ、 Ｂｅｌｇ
ｉｕｍ） ：天然立体配座エピトープに対して誘導され
たモノクローナル抗体を含む商業的キラ１−０ ｆ）およびｇ）で述べた抗体は市販されている。
ＧおよびＬｏｕｖａｉｎ−ＬａＮｅｕｖｅ、 Ｂｅｌｇ
ｉｕｍ） ：天然立体配座エピトープに対して誘導され
たモノクローナル抗体を含む商業的キラ１−０ ｆ）およびｇ）で述べた抗体は市販されている。
それらはモノマーＢ型肝炎抗原と反応しない。
ｈ ） Ａ Ｕ Ｓ Ａ Ｂ （Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ｌｏｕｖａｉｎ−Ｌａ−Ｎｅｕｖｅ、 Ｂｅ１４ｉｕｍ
） ：抗ＨＢｓＡｇ抗体検出用の商業的キット。
） ：抗ＨＢｓＡｇ抗体検出用の商業的キット。
５、培地
培地の調製に使用したペプトン１９０、酵母エキス、カ
ザミノ酸および酵母窒素塩基はＧｉｂｃ。
ザミノ酸および酵母窒素塩基はＧｉｂｃ。
社（Ｐａｉｓｌｅｙ、 Ｕ、に、）から購入した。
寒天平板をつくる場合は、それぞれの培地を第１・クレ
ープ滅菌する前に１８ｇ／ｌの寒天（Ｇｉｂｃｏ社）を
加えた。
ープ滅菌する前に１８ｇ／ｌの寒天（Ｇｉｂｃｏ社）を
加えた。
ａ）ＳＭＲ：半リッチ非選択培地
ペプトンｌ ９０ ２ｇ／ｌ酵母エキス
Ｉｇ／ｌカザミノ酸（ペプトン
５） ３ｇ／ｌ酵母窒素塩基
１．４ｇ／１（ＮＨ，）、ＳＯ，不合 （Ｎ Ｈ４） ２ＳＯ１５ｇ／ｌ 炭素源ニゲルコース ２０ｇ／］またはグリ
セロール ２０ｇ／ｌまたはメタノール
ＩＯｇ／ｌメタノール含有ＳＭＲはＭｅｔ−３
ＭＲとも呼ばれる。
Ｉｇ／ｌカザミノ酸（ペプトン
５） ３ｇ／ｌ酵母窒素塩基
１．４ｇ／１（ＮＨ，）、ＳＯ，不合 （Ｎ Ｈ４） ２ＳＯ１５ｇ／ｌ 炭素源ニゲルコース ２０ｇ／］またはグリ
セロール ２０ｇ／ｌまたはメタノール
ＩＯｇ／ｌメタノール含有ＳＭＲはＭｅｔ−３
ＭＲとも呼ばれる。
ｂ）
ＹＮＢ：選択培地
酵母窒素塩基 Ｌ４ｇ／］（Ｎ Ｈｔ
） ２ Ｓ Ｏ４不含 （Ｇ ｉ ｂｃｏ社またはＤｉｆｃｏ社）（ＭＨＩ）
ｚｓＯｔ ５ｇ／ｌ炭素源ニゲルコー
ス ２０ｇ／ｌまたはグリセロール
２０ｇ／ｌまたはメタノール １０
ｇ／１ｃ）ＹＥＰＤ ：非選択リッチ培地 酵母エキス ｌｏｇ／ｌペプトン
１９０ ２０ｇ／ｌグルコース
２０ｇ／ １必要に応じて、培地１
ｍ ｌあたり１ｍｇのゲンタマイシンＧ４１８を加えた
。
） ２ Ｓ Ｏ４不含 （Ｇ ｉ ｂｃｏ社またはＤｉｆｃｏ社）（ＭＨＩ）
ｚｓＯｔ ５ｇ／ｌ炭素源ニゲルコー
ス ２０ｇ／ｌまたはグリセロール
２０ｇ／ｌまたはメタノール １０
ｇ／１ｃ）ＹＥＰＤ ：非選択リッチ培地 酵母エキス ｌｏｇ／ｌペプトン
１９０ ２０ｇ／ｌグルコース
２０ｇ／ １必要に応じて、培地１
ｍ ｌあたり１ｍｇのゲンタマイシンＧ４１８を加えた
。
ｄ）Ｓ培地
匙盆 量／リン１−ル（ＭＨＩ）
２５０４ ５ｇＫ Ｈ２Ｆ０４４ｇ Ｍ ｇ Ｓ Ｏ＜ 、 ７ Ｈ２０２ｇＮａＣ１Ｏ，１
ｇ ６ Ｃａ Ｃｌ ｘ、 ２ ＨｚＯ Ｌ−ヒスチジン−塩酸塩 Ｌ Ｄ−メチオニン Ｌ Ｄ −１−リブ１〜７アン Ｈ３ＢＯ１ Ｃｕ Ｓ Ｏ４，５Ｈ２０ Ｔ Ｆ ｅ Ｃｌ ｓ−６Ｈ２Ｏ Ｍｎ５Ｏ，、Ｈ，Ｏ Ｎａ２ＭｏＯ（，２Ｈ２Ｏ ＺｎＳＯ４，７Ｈ，０ ビオチン Ｃａ−パントチネート 葉酸 イノシトール ナイアシン ｐ−アミノ安息香酸 ピリドキシン塩酸塩 リボフラビン チアミン塩酸塩 ０．４ｇ ０ｍｇ ｍｇ ｍｇ ｍｇ Ｏ，］６６ｍ １）、４ｍｇ ０．８ｍｇ １．６ｍｇ ０．８ｍｇ １．６ｍｇ ０．１６ｍｇ ２ｍｇ ０．１６ｍｇ ６０ｍｇ ０．４ｍｇ ０．２ｍｇ ２ｍｇ ０．２ｍｇ ２ｍｇ ７ 女迭 Ｌ ＤＮＡの取り扱い ｆｌｉｌｌｌｌｌエンドヌクレアーゼによる切断、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いる連結、ＤＮＡのリン酸化、
大腸菌からのＤＮＡの単離、ゲル電気泳動によるＤＮＡ
の分離、および遺伝子工学の分野に属する他のすべての
技術は、本質的にＭａｎｉａＬｉｓ ｅＬ ａｌ。
２５０４ ５ｇＫ Ｈ２Ｆ０４４ｇ Ｍ ｇ Ｓ Ｏ＜ 、 ７ Ｈ２０２ｇＮａＣ１Ｏ，１
ｇ ６ Ｃａ Ｃｌ ｘ、 ２ ＨｚＯ Ｌ−ヒスチジン−塩酸塩 Ｌ Ｄ−メチオニン Ｌ Ｄ −１−リブ１〜７アン Ｈ３ＢＯ１ Ｃｕ Ｓ Ｏ４，５Ｈ２０ Ｔ Ｆ ｅ Ｃｌ ｓ−６Ｈ２Ｏ Ｍｎ５Ｏ，、Ｈ，Ｏ Ｎａ２ＭｏＯ（，２Ｈ２Ｏ ＺｎＳＯ４，７Ｈ，０ ビオチン Ｃａ−パントチネート 葉酸 イノシトール ナイアシン ｐ−アミノ安息香酸 ピリドキシン塩酸塩 リボフラビン チアミン塩酸塩 ０．４ｇ ０ｍｇ ｍｇ ｍｇ ｍｇ Ｏ，］６６ｍ １）、４ｍｇ ０．８ｍｇ １．６ｍｇ ０．８ｍｇ １．６ｍｇ ０．１６ｍｇ ２ｍｇ ０．１６ｍｇ ６０ｍｇ ０．４ｍｇ ０．２ｍｇ ２ｍｇ ０．２ｍｇ ２ｍｇ ７ 女迭 Ｌ ＤＮＡの取り扱い ｆｌｉｌｌｌｌｌエンドヌクレアーゼによる切断、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いる連結、ＤＮＡのリン酸化、
大腸菌からのＤＮＡの単離、ゲル電気泳動によるＤＮＡ
の分離、および遺伝子工学の分野に属する他のすべての
技術は、本質的にＭａｎｉａＬｉｓ ｅＬ ａｌ。
１９８２に記載の通りに行った。
２、酵母の形質転換
メチロトローフ酵母は上記方法により形質転換する（Ｒ
ｏｇｇｅｎｋａｍｐ ｅｃ ａｌ、 １９８６）。
ｏｇｇｅｎｋａｍｐ ｅｃ ａｌ、 １９８６）。
完全凍結細胞を用いる方法が好適である（Ｋｌｅｂｅ
ａｔ ａｌ、 １９８３）。
ａｔ ａｌ、 １９８３）。
ａ）形質転換細胞はｕｒａ３欠損の補足またはゲンタマ
イシン耐性により同定する。
イシン耐性により同定する。
ゲンタマイシンＧ’４１８に対する耐性は、２５ｍ１固
化培地を含むＹＥＰＤ平板に細胞をまいて調べた。平板
上で６時間増殖後、２５ｍｇゲンタマイシンＧ４１８を
含む水溶液１ｍｌを加え、２〜３日間インキュベートし
ｌこ。ゲンタマイシンＧ４１８（商標名：ゲネチシン）
はＧ ｉ ｂｃｏ社から得られた。
化培地を含むＹＥＰＤ平板に細胞をまいて調べた。平板
上で６時間増殖後、２５ｍｇゲンタマイシンＧ４１８を
含む水溶液１ｍｌを加え、２〜３日間インキュベートし
ｌこ。ゲンタマイシンＧ４１８（商標名：ゲネチシン）
はＧ ｉ ｂｃｏ社から得られた。
ｂ）有糸分裂時に安定している形質転換細胞の分離は、
選択形質転換平板から形質転換細胞を選択し、それらを
２０世代（２継代）にわたって液体選択培地（］ ｍ
ｇ ／ ｍ ＩのＧ４１８を含むＹＮＢまたはＹＥＰＤ
）で増殖させることにより行った。この増殖期間後、細
胞を非選択培地（ＳＭＲまたはＹＥＰＤ）にまき、さら
に４０〜６０世代（５〜ｆ３継代）にわたって増殖させ
た。その後、細胞を選択平板（Ｉｍｇ／ｍｌのＧ４１８
を含むＹＮＢまたはＹＥＰＤ）にまき、依然として選択
マーカーを発現するクローンを維持した。
選択形質転換平板から形質転換細胞を選択し、それらを
２０世代（２継代）にわたって液体選択培地（］ ｍ
ｇ ／ ｍ ＩのＧ４１８を含むＹＮＢまたはＹＥＰＤ
）で増殖させることにより行った。この増殖期間後、細
胞を非選択培地（ＳＭＲまたはＹＥＰＤ）にまき、さら
に４０〜６０世代（５〜ｆ３継代）にわたって増殖させ
た。その後、細胞を選択平板（Ｉｍｇ／ｍｌのＧ４１８
を含むＹＮＢまたはＹＥＰＤ）にまき、依然として選択
マーカーを発現するクローンを維持した。
３、酵母ＤＮＡの分離
酵母からの全ＤＮＡは５ｔｒｕｈ１ｅｔ ａｌ、 １９
７９に記載の通りに調製した。
７９に記載の通りに調製した。
４、酵母ＤＮＡの分析
形質転換酵母中のＤＮＡの構造は、適当な制限エンドヌ
クレアーゼによる消化、その後のアガロースゲル電気泳
動により分析した。その後ＤＮＡ断片はニトロセルロー
スに移し、適当な放射性標識ＤＮＡグローブとハイブリ
ダイズさせた（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、 １９７５）。
クレアーゼによる消化、その後のアガロースゲル電気泳
動により分析した。その後ＤＮＡ断片はニトロセルロー
スに移し、適当な放射性標識ＤＮＡグローブとハイブリ
ダイズさせた（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、 １９７５）。
５、イムノアッセイ
ウェスターンプロット分析
ａ）アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）法粗製抽出物ま
たは勾配画分から得られた蛋白は、５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、 １９７０）
により１２．５％分離用、５％積層用ゲルを用いて分離
した。蛋白バンドは本質的にＴｏｗｂｉｎ ｅＬａｌ、
１９７９に記載されるようにニトロセルロースに移行
させた。
たは勾配画分から得られた蛋白は、５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、 １９７０）
により１２．５％分離用、５％積層用ゲルを用いて分離
した。蛋白バンドは本質的にＴｏｗｂｉｎ ｅＬａｌ、
１９７９に記載されるようにニトロセルロースに移行
させた。
抗原物質はそのプロントと特異的抗体との反応により検
出した。抗原−抗体複合体はフィルターをｌ：３００希
釈のビオチニル化抗体ＲＰＮＩＯ０１（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｂｕｃｈｌｅｒ ＧｍｂＨａｎｄ Ｃｏ、Ｌｔｄ、
。
出した。抗原−抗体複合体はフィルターをｌ：３００希
釈のビオチニル化抗体ＲＰＮＩＯ０１（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｂｕｃｈｌｅｒ ＧｍｂＨａｎｄ Ｃｏ、Ｌｔｄ、
。
Ｂｒａｕｎｓｃｈｖｅｉ１）、 ＦＲＧ）と反応させ、
その後ペルオキシダーゼーストレプトアビジン複合体Ｒ
ＰＮＩ０５１（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とインキュベ−１−
することｌこより視覚化した。この実験の全工程は製造
者の指０ 示に従って行った。
その後ペルオキシダーゼーストレプトアビジン複合体Ｒ
ＰＮＩ０５１（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とインキュベ−１−
することｌこより視覚化した。この実験の全工程は製造
者の指０ 示に従って行った。
ｂ）別法として、フィルクーはＰＢＳ中の０゜０５％Ｔ
ｗｅｅｎ （ｗ／ｖ）とプレインキュベートした。
ｗｅｅｎ （ｗ／ｖ）とプレインキュベートした。
所定のモノクローナル抗体とのインキュベーション後、
順次０，０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１：２５０希釈
のビオチニル化ヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＲＰＮＩ ０２
１ 、 Ａｍｅｒｓｈａｍ） 、ストレグトアビジンー
ビオチニル化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ＲＰ
Ｎ １０５ ］ 、 Ａｍｅｒｓｈａｍ、 ］％ゼ
ラチン含有ＰＢＳ中］：４００に希釈）、最後にＰＢ５
５０ｍｌ中に４−クロロ−１−ナフトール（３ｍｇ ／
ｍ ｌメタノール）を含むＨＲＰ発色試薬１０ｍＩＢ
よびＨｚｏ２３ｏμｍとインキュベートすることにより
、抗体結合を検出した。インキュベーション間にフィル
ターは０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳで洗った
。
順次０，０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１：２５０希釈
のビオチニル化ヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＲＰＮＩ ０２
１ 、 Ａｍｅｒｓｈａｍ） 、ストレグトアビジンー
ビオチニル化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ＲＰ
Ｎ １０５ ］ 、 Ａｍｅｒｓｈａｍ、 ］％ゼ
ラチン含有ＰＢＳ中］：４００に希釈）、最後にＰＢ５
５０ｍｌ中に４−クロロ−１−ナフトール（３ｍｇ ／
ｍ ｌメタノール）を含むＨＲＰ発色試薬１０ｍＩＢ
よびＨｚｏ２３ｏμｍとインキュベートすることにより
、抗体結合を検出した。インキュベーション間にフィル
ターは０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳで洗った
。
生産された七ツマー抗ＪｊＫ（ＳおよびプレＳ）の定量
化は、酵母誘導精製ＨＢ ｓ Ａ ｇ （ＳｍｉｔｈＫ
ＩｉｎｅＢｊｏｌｏｇｉｃａｌｓ） ０ 、０１−０
、３μｇのサンプルと、全細胞蛋白２〜２０μｇを含む
ハンセヌラの粗製１ 蛋白抽出物の異なる希釈物との比較により達成した。
化は、酵母誘導精製ＨＢ ｓ Ａ ｇ （ＳｍｉｔｈＫ
ＩｉｎｅＢｊｏｌｏｇｉｃａｌｓ） ０ 、０１−０
、３μｇのサンプルと、全細胞蛋白２〜２０μｇを含む
ハンセヌラの粗製１ 蛋白抽出物の異なる希釈物との比較により達成した。
蛋白濃度はＢｉｏＲａｄ蛋白検定キッｌ−（ＢｉｏＲａ
ｄＭｕｎｉｃｈ、 ＦＲＧ）を用いて測定した。
ｄＭｕｎｉｃｈ、 ＦＲＧ）を用いて測定した。
実施例：パ
−Ａ
プラスミド
実施例Ａ、 １
ａ）ハンセヌラ・ポリモルファの自律複製配列を含む基
本プラスミド（ｐＭＥ ４）の構築ハンセヌラ・プロモ
ーターの支配下にＳ遺伝子を含むプラスミドの構築に使
用した親プラスミドはｐ Ｍ Ｅ ４であり、これはＭ
、Ｅｃｋａｒｔ、 １９８８の博士論文にすでに記載さ
れている。ｐＭＥ４は次の修飾により得られたＹ Ｉ
ｐ ５ （Ｓｔｒｕｈｌ ｅＬ ａｌ、 １９７９；
Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅＬａｌ、 １９８０）の誘導
体である：ハンセヌラ・ポリモルファ自律複製配列ＨＡ
Ｒ５１はＲｏｇｇｅｎｋａｍｐ ｅＬａｌ、 ３９８
６に記載の通りに０２ ＹＩｐ５の５ａｌＩ部位ｌこクローン化してｐＨＡＲ５
をつくる。プラスミドｐ ＨＡ ＲＳはその後４４０塩
基対のＨＡＲ３Ｉ−５ａｌＩ断片を取り出し、同一ベク
ターのＰｖｕｌＴ部位に挿入することにより再構築した
。上記断片の５ａｌＩ付着末端は、連結に先立って、エ
キソヌクレアーゼ■とインキュベーｈ Ｌ、続いてＫｌ
ｅｎｏｗ断片と反応させて平滑末端とした。この再構築
はプラスミドのｐＢＲ３２２部分のテトラザイクリン耐
性遺伝子内に単一の５ａｌＩ部位を生皮させた。このよ
うにして得られた中間体グラスミドは、もとのシグナル
配列を欠くβ−ラクタマーゼ遺伝子を得るために再度再
構築した：この場合シグナル配列は以下に示すりンカー
（詳細には、Ｅｃｋａｒｔ、 １９８８を参照）゛で置
換される： ５ａｌＩ ＥｃｏＲＩ
ＢｓｔＥＩＩＧＴＣＧＡＣＧＡＡ
ＴＴＣＡＡＡ ＡＴＧ ＴＣＣＧＧＴ
ＣＡＣＢ−クク９７−（Ｚ” この工程は第１図に示すプラスミドｐ Ｍ Ｅ ４をも
Ｉこ ら し Ｉこ 。
本プラスミド（ｐＭＥ ４）の構築ハンセヌラ・プロモ
ーターの支配下にＳ遺伝子を含むプラスミドの構築に使
用した親プラスミドはｐ Ｍ Ｅ ４であり、これはＭ
、Ｅｃｋａｒｔ、 １９８８の博士論文にすでに記載さ
れている。ｐＭＥ４は次の修飾により得られたＹ Ｉ
ｐ ５ （Ｓｔｒｕｈｌ ｅＬ ａｌ、 １９７９；
Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅＬａｌ、 １９８０）の誘導
体である：ハンセヌラ・ポリモルファ自律複製配列ＨＡ
Ｒ５１はＲｏｇｇｅｎｋａｍｐ ｅＬａｌ、 ３９８
６に記載の通りに０２ ＹＩｐ５の５ａｌＩ部位ｌこクローン化してｐＨＡＲ５
をつくる。プラスミドｐ ＨＡ ＲＳはその後４４０塩
基対のＨＡＲ３Ｉ−５ａｌＩ断片を取り出し、同一ベク
ターのＰｖｕｌＴ部位に挿入することにより再構築した
。上記断片の５ａｌＩ付着末端は、連結に先立って、エ
キソヌクレアーゼ■とインキュベーｈ Ｌ、続いてＫｌ
ｅｎｏｗ断片と反応させて平滑末端とした。この再構築
はプラスミドのｐＢＲ３２２部分のテトラザイクリン耐
性遺伝子内に単一の５ａｌＩ部位を生皮させた。このよ
うにして得られた中間体グラスミドは、もとのシグナル
配列を欠くβ−ラクタマーゼ遺伝子を得るために再度再
構築した：この場合シグナル配列は以下に示すりンカー
（詳細には、Ｅｃｋａｒｔ、 １９８８を参照）゛で置
換される： ５ａｌＩ ＥｃｏＲＩ
ＢｓｔＥＩＩＧＴＣＧＡＣＧＡＡ
ＴＴＣＡＡＡ ＡＴＧ ＴＣＣＧＧＴ
ＣＡＣＢ−クク９７−（Ｚ” この工程は第１図に示すプラスミドｐ Ｍ Ｅ ４をも
Ｉこ ら し Ｉこ 。
ｂ）ＭＯＸおよびＦＭＤプロモーター断片Ｈ，ポリモル
ファからのＭＯＸプロモーターの単離はＥｃｋａｒｔ、
１９８８に記載されている。本発明のために、ＭＯＸ
遺伝子の上流調節領域を含む１５２５ｂｐのゲノムＥｃ
ｏＲＩ−５ａｌＴ断片およびＭＯＸ蛋白の最初の５アミ
ノ酸のコドンを、ｐＢＲ３２２誘導体にクローン化した
。ＭＯＸ遺伝子の模式図を第２図に示す。この中間体プ
ラスミドはＥｃｏＲＩを使って切断し、ヌクレアーゼＢ
ａ１３１で処理し、その後ＥｃｏＲＴリンカ−と連結さ
せた。こうして、ＥｃｏＲＩ３’末端と５ａｌＴ５’末
端をもつ一連のプロモーター断片が制限エンドヌクレア
ーゼ５ａｌＩで切断することにより得られた。種々の欠
失終点の位置はＭａｘａｍ ａｎｄ Ｇ１１ｂａｒｔ、
１９７７の方法によりＤＮＡの塩基配列解析を行って
確立した。本明細書で述べるその後の実験のために、−
３位１債（ＭＯＸ翻訳開始コドンの第一塩基か塩、Ｉ！
ｉ＋１である場合）ま０４ での欠失を含むｐＢＲ３２２−ＭＰとよばれるプラスミ
ドが用いられた。このプラスミドｐＢＲ３２２−ＭＰは
Ｅｃｋａｒｔ、 １９８８に記載されている。
ファからのＭＯＸプロモーターの単離はＥｃｋａｒｔ、
１９８８に記載されている。本発明のために、ＭＯＸ
遺伝子の上流調節領域を含む１５２５ｂｐのゲノムＥｃ
ｏＲＩ−５ａｌＴ断片およびＭＯＸ蛋白の最初の５アミ
ノ酸のコドンを、ｐＢＲ３２２誘導体にクローン化した
。ＭＯＸ遺伝子の模式図を第２図に示す。この中間体プ
ラスミドはＥｃｏＲＩを使って切断し、ヌクレアーゼＢ
ａ１３１で処理し、その後ＥｃｏＲＴリンカ−と連結さ
せた。こうして、ＥｃｏＲＩ３’末端と５ａｌＴ５’末
端をもつ一連のプロモーター断片が制限エンドヌクレア
ーゼ５ａｌＩで切断することにより得られた。種々の欠
失終点の位置はＭａｘａｍ ａｎｄ Ｇ１１ｂａｒｔ、
１９７７の方法によりＤＮＡの塩基配列解析を行って
確立した。本明細書で述べるその後の実験のために、−
３位１債（ＭＯＸ翻訳開始コドンの第一塩基か塩、Ｉ！
ｉ＋１である場合）ま０４ での欠失を含むｐＢＲ３２２−ＭＰとよばれるプラスミ
ドが用いられた。このプラスミドｐＢＲ３２２−ＭＰは
Ｅｃｋａｒｔ、 １９８８に記載されている。
ＦＭＤプロモーターの単離および性状決定は欧州特許出
願第８７１］、０４１７．０号に開示されている。本発
明のために、約１０００ｂｐの上流プロモーター領域を
含む］、４ｋｂ ＢａｍＨＩ断片をｐＵｃＩ９のＢａ
ｍＨＴ部位にクローン化した。挿入物がその３′末端に
ｐＵＣｌ ９の単のＥｃｏＲＩ部位をもつように方向づ
けられた１つのクローンを選択した。ＦＭＤ遺伝子とそ
のプロモーターを含むゲノムクローンの模式図を第２Ｂ
図に示す。一連のＢａ１３１欠失をＥｃｏＲ１部位から
開始させ、その後構造遺伝子の配列を含まずプロモータ
ーを含むプラスミドを得るために、ｐＵｃ１９リンカ−
を作製した。Ｂａ１３１処理後、ＤＮＡはＥｃｏＲＩリ
ンカ−に連結し、そのＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、Ｂ
ａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＲ３２２にクローン化
した。いろいろな欠失が得られた。最初のＡＴＧから−
５０５ と−９の位置に欠失を含むものかあとの実験で最も効果
的であった。本明細書で述べる後続の実験のために、最
初のＡＴＧから一９位置に欠失を含むプロモーター断片
を保有するプラスミドが用いられた（プラスミドｐＢＲ
３２２＝ＦＭＤ−Ｐ９）。以後のプラスミドの構築に用
いたＭＯＸおよびＦＭＤプロモーターの模式図を以下に
示すｉ）ＭＯＸプロモーター断片（−３） ＳａｌＩ Ｅ
ｃｏＲ工１５ −３ （１５００ｂｐｌ −−−−ＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡ
ＣＧＧＡＡＴＴＣＣ）ンカー ｉ） ＦＭＤブロモ ター断片 （ ９） ＢａｍＨ工 ＥＣＯＲ工 （１０００ｂｐ） −１４−９ 一−ＴＴＣＡＴＣ ＧＧＡＡＴＴＣＣ ’ｌン〃− Ｃ）ターミネータ− ＭＯＸ遺伝子からの転写ターミネータ−の単離はＥｃｋ
ａｒＬ、 １９８８に記載されている。ＭＯＸ遺伝子の
３′領域の模式図を以下に示ず： Ａｒｇ Ｐｈｅ ５ｔｏｐ ＡＧＡ ＴＴＣＴＡＡ ＳａｌＩ−−一−−−−−−Ａｓｐ７１８−−−−−−
−−−−一−−−−−−ＥｃｏＲＶ＜ １
４７７ｂｐ ＞＜ ３２７ｂｐ
）＜ ２８４ ｂｐ ＞＜ ３６８ｂ
ｐＮｒｕ工 」１図に示したＳａｌＩ−Ｎｒｕｌ断片は５ａｌＩとＮ
ｒｕＴ部位間のｐＢＲ３２２にサブクローン化し、その
後このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７１
８を使って切断した。Ａｓｐ７１８部位はＭＯＸオーブ
ン・リーディング・フレーム内の唯一の部位であるため
に、プラスミドは線状化され、この線状プラスミドをＢ
ａ１３１欠失にかけた。
願第８７１］、０４１７．０号に開示されている。本発
明のために、約１０００ｂｐの上流プロモーター領域を
含む］、４ｋｂ ＢａｍＨＩ断片をｐＵｃＩ９のＢａ
ｍＨＴ部位にクローン化した。挿入物がその３′末端に
ｐＵＣｌ ９の単のＥｃｏＲＩ部位をもつように方向づ
けられた１つのクローンを選択した。ＦＭＤ遺伝子とそ
のプロモーターを含むゲノムクローンの模式図を第２Ｂ
図に示す。一連のＢａ１３１欠失をＥｃｏＲ１部位から
開始させ、その後構造遺伝子の配列を含まずプロモータ
ーを含むプラスミドを得るために、ｐＵｃ１９リンカ−
を作製した。Ｂａ１３１処理後、ＤＮＡはＥｃｏＲＩリ
ンカ−に連結し、そのＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、Ｂ
ａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＲ３２２にクローン化
した。いろいろな欠失が得られた。最初のＡＴＧから−
５０５ と−９の位置に欠失を含むものかあとの実験で最も効果
的であった。本明細書で述べる後続の実験のために、最
初のＡＴＧから一９位置に欠失を含むプロモーター断片
を保有するプラスミドが用いられた（プラスミドｐＢＲ
３２２＝ＦＭＤ−Ｐ９）。以後のプラスミドの構築に用
いたＭＯＸおよびＦＭＤプロモーターの模式図を以下に
示すｉ）ＭＯＸプロモーター断片（−３） ＳａｌＩ Ｅ
ｃｏＲ工１５ −３ （１５００ｂｐｌ −−−−ＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡ
ＣＧＧＡＡＴＴＣＣ）ンカー ｉ） ＦＭＤブロモ ター断片 （ ９） ＢａｍＨ工 ＥＣＯＲ工 （１０００ｂｐ） −１４−９ 一−ＴＴＣＡＴＣ ＧＧＡＡＴＴＣＣ ’ｌン〃− Ｃ）ターミネータ− ＭＯＸ遺伝子からの転写ターミネータ−の単離はＥｃｋ
ａｒＬ、 １９８８に記載されている。ＭＯＸ遺伝子の
３′領域の模式図を以下に示ず： Ａｒｇ Ｐｈｅ ５ｔｏｐ ＡＧＡ ＴＴＣＴＡＡ ＳａｌＩ−−一−−−−−−Ａｓｐ７１８−−−−−−
−−−−一−−−−−−ＥｃｏＲＶ＜ １
４７７ｂｐ ＞＜ ３２７ｂｐ
）＜ ２８４ ｂｐ ＞＜ ３６８ｂ
ｐＮｒｕ工 」１図に示したＳａｌＩ−Ｎｒｕｌ断片は５ａｌＩとＮ
ｒｕＴ部位間のｐＢＲ３２２にサブクローン化し、その
後このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７１
８を使って切断した。Ａｓｐ７１８部位はＭＯＸオーブ
ン・リーディング・フレーム内の唯一の部位であるため
に、プラスミドは線状化され、この線状プラスミドをＢ
ａ１３１欠失にかけた。
得られた断片のＤＮＡ塩基配列解析により、約３２０ｂ
ｐのターミネータ−断片が同定され（ＥｃｋａｒＬ、
１９８８） 、これはまだターミネータ−としての機能
をもっている。この平滑末端化ターミネータ−断片（Ｇ
ＡＣＡＴＡＣＣ−−３１５ｂ ｐＥｃｏＲＶ）はｐＵｃ
１９のＳｍａ Ｔ部位に連結した。断片の向きは塩基配
列解析（Ｍａｘａｍ ａｎｄＧｉｌｂｅｒＬ、 １９７
７）により決定した。得られたクローンｐＴ−２４を第
３図に示す。このクローンは以下に示す発現ベクターの
構築に使用した。
ｐのターミネータ−断片が同定され（ＥｃｋａｒＬ、
１９８８） 、これはまだターミネータ−としての機能
をもっている。この平滑末端化ターミネータ−断片（Ｇ
ＡＣＡＴＡＣＣ−−３１５ｂ ｐＥｃｏＲＶ）はｐＵｃ
１９のＳｍａ Ｔ部位に連結した。断片の向きは塩基配
列解析（Ｍａｘａｍ ａｎｄＧｉｌｂｅｒＬ、 １９７
７）により決定した。得られたクローンｐＴ−２４を第
３図に示す。このクローンは以下に示す発現ベクターの
構築に使用した。
ｄ）選択マーカー遺伝子
ｐＭＥ４（第１図参照）をＥｃｏＲＩで切断し、付着末
端をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで修復した。プラスミド
ｐＴ−’２４はＥｃｏＲＩおよびＨｉ ｎ ｄ■で消化
し、ｐＵｃ１９リンカ−およびＭＯＸタミ不−ターター
断片成る断片を単離した。この断片の付着末端をＫ ｌ
ｅｎｏｗポリメラーゼで処理して平滑末端となし、平滑
末端化断片をｐＭＥ４と連結させた。得られたプラスミ
ドはｐ Ｐ ／ Ｔ −２４と呼はれる。ｐＵｃＩ９か
ら誘導されたクローニング部位は以後のクローニング工
程で使用され８ る。
端をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで修復した。プラスミド
ｐＴ−’２４はＥｃｏＲＩおよびＨｉ ｎ ｄ■で消化
し、ｐＵｃ１９リンカ−およびＭＯＸタミ不−ターター
断片成る断片を単離した。この断片の付着末端をＫ ｌ
ｅｎｏｗポリメラーゼで処理して平滑末端となし、平滑
末端化断片をｐＭＥ４と連結させた。得られたプラスミ
ドはｐ Ｐ ／ Ｔ −２４と呼はれる。ｐＵｃＩ９か
ら誘導されたクローニング部位は以後のクローニング工
程で使用され８ る。
プラスミＦｐＰ／Ｔ−２４は選択マーカーとしてＳ．セ
レビシエＵＲＡ３遺伝子を含む。別の選択マーカーとし
て、クロラムフェニコールに対して耐性を与える遺伝子
が導入された。この遺伝子はベクターｐＢＲ３２５から
１．７ｋｂのＡａｔＨ−ＣｌａＩ断片として単離し、そ
れぞれの末端で約４塩基対を除去するために短いＢａ１
３１消化にかけ、そしてＫｌｅｎｏｗ修復反応を用いて
平滑末端とした。その後、この断片はＮｒｕＴで切断し
たｐＰ／Ｔ−２／Ｉと連結させた。得られたプラスミド
はクロラムフェニコール耐性を示、シ、ｐＰ／Ｔ−２１
Ｃと呼ばれた。
レビシエＵＲＡ３遺伝子を含む。別の選択マーカーとし
て、クロラムフェニコールに対して耐性を与える遺伝子
が導入された。この遺伝子はベクターｐＢＲ３２５から
１．７ｋｂのＡａｔＨ−ＣｌａＩ断片として単離し、そ
れぞれの末端で約４塩基対を除去するために短いＢａ１
３１消化にかけ、そしてＫｌｅｎｏｗ修復反応を用いて
平滑末端とした。その後、この断片はＮｒｕＴで切断し
たｐＰ／Ｔ−２／Ｉと連結させた。得られたプラスミド
はクロラムフェニコール耐性を示、シ、ｐＰ／Ｔ−２１
Ｃと呼ばれた。
実施例Ａ、 ２
ハンセヌラ・ポリモル７アターミネーターと機能しうる
状態で連結されたＢ型肝炎表面抗原遺伝子を含むプラス
ミドの構築 Ｂ型肝炎Ｓ遺伝子とハンセヌラ・ポリモルファに有効な
ターミネータ−から成る機能単位を得るために、Ｓ遺伝
子を６８３ｂｐのＮｃｏＴ−Ｅｃ０９ ｏＲＴ断片として、ｐＵｃｌ、９リンカ一部分により提
供されるグラスミドｐＰ／Ｔ ２４ＣのＢａｍＨＩ部
位に導入した。６８３ｂｐ断片はｐＲｒＴ１２３３１か
ら得られ、ｐＲＩＴ１２３３］はＡＴＧ−］トンにある
Ｎｃｏ Ｉ （ＣＣＡＴＧＧ）からＴＡＡ停止コドンを
越えるＥｃｏＲＩ （ＴＡＡＣＧＡＡＴＴＣ）までのＳ
蛋白をコードする６８３ｂｐ ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＴ
ＤＮＡ断片を含むｐＵＣ９を土台とした大腸菌ベク
ターである。表面抗原コード配列は通常の組換えＤＮＡ
技術によりＥＰ−Ａ−０２７８９４０およびｌ１ａｒｆ
ｏｒｄ ｅｔａｌ、 １９８７に記載されるｐ Ｒｒ
Ｔ １０６１．６から誘導された。ｐＲＩＴＩＱ６１６
はｐＡＣＹＣ１８４にクローン化されたａｃ１ｗ血清型
のＨＢ Ｖウィルスのゲノムを含み、ブダペスト条約の
もとに１９８２年６月２日付けでアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションに受託番号ＡＴＣＣ３９１３
１として寄託された。
状態で連結されたＢ型肝炎表面抗原遺伝子を含むプラス
ミドの構築 Ｂ型肝炎Ｓ遺伝子とハンセヌラ・ポリモルファに有効な
ターミネータ−から成る機能単位を得るために、Ｓ遺伝
子を６８３ｂｐのＮｃｏＴ−Ｅｃ０９ ｏＲＴ断片として、ｐＵｃｌ、９リンカ一部分により提
供されるグラスミドｐＰ／Ｔ ２４ＣのＢａｍＨＩ部
位に導入した。６８３ｂｐ断片はｐＲｒＴ１２３３１か
ら得られ、ｐＲＩＴ１２３３］はＡＴＧ−］トンにある
Ｎｃｏ Ｉ （ＣＣＡＴＧＧ）からＴＡＡ停止コドンを
越えるＥｃｏＲＩ （ＴＡＡＣＧＡＡＴＴＣ）までのＳ
蛋白をコードする６８３ｂｐ ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＴ
ＤＮＡ断片を含むｐＵＣ９を土台とした大腸菌ベク
ターである。表面抗原コード配列は通常の組換えＤＮＡ
技術によりＥＰ−Ａ−０２７８９４０およびｌ１ａｒｆ
ｏｒｄ ｅｔａｌ、 １９８７に記載されるｐ Ｒｒ
Ｔ １０６１．６から誘導された。ｐＲＩＴＩＱ６１６
はｐＡＣＹＣ１８４にクローン化されたａｃ１ｗ血清型
のＨＢ Ｖウィルスのゲノムを含み、ブダペスト条約の
もとに１９８２年６月２日付けでアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションに受託番号ＡＴＣＣ３９１３
１として寄託された。
Ｓ遺伝子断片とＢ ａ ｍ ＨＩ切断ｐＰ／Ｔ−２４Ｃ
の付着末端は連結に先立って平滑末端に修復した。適切
な方向での断片の連結はＳ遺伝子コード領域のすぐ５′
側に隣接するＢ ａ ｍ ＨＩとＮｃ。
の付着末端は連結に先立って平滑末端に修復した。適切
な方向での断片の連結はＳ遺伝子コード領域のすぐ５′
側に隣接するＢ ａ ｍ ＨＩとＮｃ。
１部位を再形成する。得られたプラスミドはｐＲＢ−３
と呼ばれる。
と呼ばれる。
実施例Ａ、 ３
ハンセヌラ・ポリモルファ誘導プロモーター、Ｂ型肝炎
表面抗原遺伝子およびハンセヌラ・ポリモルファターミ
ネータ−から成る機能的発現カセットを含むプラスミド
の構築 ｐＢＲ３２２誘導体のｐＢＲ３２２−ＭＰおよびｐＢＲ
３２２−ＦＭＤ−Ｐ−９（それぞれＭＯＸまたはＦＭＤ
プロモーターを含む）はＥｃｏＲＩで消化し、付着末端
をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで修復した。その後このプ
ラスミドを５ａｌＴで切断した。得られたＭＯＸプロモ
ーター含有断片は排他的にハンセヌラ・ポリモルファゲ
ノムＤＮＡから成るが、ＦＭＤプロモーター含有断片は
さらに２７５ｂｐのｐＢＲ３２２配列（ｐＢＲ３２２地
図のｂｐ３７５からｂｐ６５０まで）を含む。
表面抗原遺伝子およびハンセヌラ・ポリモルファターミ
ネータ−から成る機能的発現カセットを含むプラスミド
の構築 ｐＢＲ３２２誘導体のｐＢＲ３２２−ＭＰおよびｐＢＲ
３２２−ＦＭＤ−Ｐ−９（それぞれＭＯＸまたはＦＭＤ
プロモーターを含む）はＥｃｏＲＩで消化し、付着末端
をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで修復した。その後このプ
ラスミドを５ａｌＴで切断した。得られたＭＯＸプロモ
ーター含有断片は排他的にハンセヌラ・ポリモルファゲ
ノムＤＮＡから成るが、ＦＭＤプロモーター含有断片は
さらに２７５ｂｐのｐＢＲ３２２配列（ｐＢＲ３２２地
図のｂｐ３７５からｂｐ６５０まで）を含む。
プラスミドｐＲＢ−５を再形成されたＢ ａ ｍ Ｈｒ
部位で切断し、この部位をＫｌｅｎｏｗボリメラゼで修
復して平滑末端となし、その後このプラスミドを５ａｌ
ｌで消化した。５ａｌＴ付着末端と平滑末端を有するプ
ロモーター断片は、Ｓ遺伝子コード領域とハンセヌラ・
ポリモル７アターミネーターを含むｐＲＢ−３の５ａｌ
Ｉ平滑末端断片と連結させた。得られたプラスミドはｐ
ＲＢ−３２６９（ＭＯＸプロモーター）およびｐＲＢＳ
−２７１（ＦＭＤプロモーター −９欠失）と呼ばれ、
第４図に示すようにハンセヌラ・ポリモルファプロモー
ターおよびターミネータ−の支配下にＳ遺伝子を含む。
部位で切断し、この部位をＫｌｅｎｏｗボリメラゼで修
復して平滑末端となし、その後このプラスミドを５ａｌ
ｌで消化した。５ａｌＴ付着末端と平滑末端を有するプ
ロモーター断片は、Ｓ遺伝子コード領域とハンセヌラ・
ポリモル７アターミネーターを含むｐＲＢ−３の５ａｌ
Ｉ平滑末端断片と連結させた。得られたプラスミドはｐ
ＲＢ−３２６９（ＭＯＸプロモーター）およびｐＲＢＳ
−２７１（ＦＭＤプロモーター −９欠失）と呼ばれ、
第４図に示すようにハンセヌラ・ポリモルファプロモー
ターおよびターミネータ−の支配下にＳ遺伝子を含む。
プロモーターとＳ遺伝子との融合付近の配列は以下に示
す通りである：ａ）ＭＯＸプロモーター融合 （ｐＲＢ−３−２６９） −３＋１ ＜−−−ＡＡＡＡＡｃ ＧＧＭＴＴＧＡＴＣＣＡＴ
Ｇ１２ ｂ） ＦＭＤブロモ ター （ ９）融合 −９＋１ ＜−−−ＴＴＣＣＡＴＣＧＧＭＴＴＧＡＴＣＣＡＴＧｐ
ＲＢ−３−２７１およびｐＲＢ−３−２６９と同様に構
築したが、ＨＡＲ３Ｉ配列を含む４４０ｂｐ＄ｌＩ限断
片の挿入を欠くプラスミドはｐＲＢＳ−２６９１および
ｐＲＢ−３−２７１Ｔと呼ばれた。これらのプラスミド
は１〜３コピー数の発現カセットを含む組込み体を得る
ために使用されＩこ。
す通りである：ａ）ＭＯＸプロモーター融合 （ｐＲＢ−３−２６９） −３＋１ ＜−−−ＡＡＡＡＡｃ ＧＧＭＴＴＧＡＴＣＣＡＴ
Ｇ１２ ｂ） ＦＭＤブロモ ター （ ９）融合 −９＋１ ＜−−−ＴＴＣＣＡＴＣＧＧＭＴＴＧＡＴＣＣＡＴＧｐ
ＲＢ−３−２７１およびｐＲＢ−３−２６９と同様に構
築したが、ＨＡＲ３Ｉ配列を含む４４０ｂｐ＄ｌＩ限断
片の挿入を欠くプラスミドはｐＲＢＳ−２６９１および
ｐＲＢ−３−２７１Ｔと呼ばれた。これらのプラスミド
は１〜３コピー数の発現カセットを含む組込み体を得る
ために使用されＩこ。
実施例Ａ、 ４
Ｓ遺伝子を含む組込み型ベクターの構築ａ）ハンセヌラ
・ポリモルファ自律複製配列およびＨ，ポリモルファＵ
ＲＡ３遺伝子を含むプラスミドｐＢＣの構築 プラスミドｐＢＣはザッカロミセス・セレビシェＡＲ３
Ｉ配列を含むプラスミドＹＲｐ７１３ （Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ ａｎｄ Ｃａｒｂｏｎ、 １９
８０）から誘導される。
・ポリモルファ自律複製配列およびＨ，ポリモルファＵ
ＲＡ３遺伝子を含むプラスミドｐＢＣの構築 プラスミドｐＢＣはザッカロミセス・セレビシェＡＲ３
Ｉ配列を含むプラスミドＹＲｐ７１３ （Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ ａｎｄ Ｃａｒｂｏｎ、 １９
８０）から誘導される。
この自律複製配列はハンセヌラ・ポリモルファＵＲＡ３
遺伝子を含む５４００ｂｐ ＢｇｌＨｓｐｈ Ｉ断片
の挿入により不活性化された。ざらに、ハンセヌラ自律
複製配列１（ＨＡＲ３Ｉ）はテトラザイクリン耐性遺伝
子の５ａｌｌ部位にクローン化された（第５図）。
遺伝子を含む５４００ｂｐ ＢｇｌＨｓｐｈ Ｉ断片
の挿入により不活性化された。ざらに、ハンセヌラ自律
複製配列１（ＨＡＲ３Ｉ）はテトラザイクリン耐性遺伝
子の５ａｌｌ部位にクローン化された（第５図）。
ｂ）プラスミドｐＢＣへの発現カセットの挿入プラスミ
ドｐＲＢ−３−２６９はＢｓｐＭＴＩおよび５ａｌｌで
消化した。ＭＯＸ７′ロモーターＢ型肝炎表面抗原コー
ド領域およびターミネータ−から戊る発現カセットを保
有する断片は平滑末端となし、プラスミドｐＢＣ（Ｘｈ
ｏＴおよび５ｔｕＩで切断し、ＸｈｏＩ付着末端を修復
したもの）に連結させた。得られたプラスミドｐＭＳ２
はハンセヌラ・ポリモルファＵＲＡ３遺伝子断片の隣接
配列によりはさまれたＳ遺伝子発現カセットを含む。
ドｐＲＢ−３−２６９はＢｓｐＭＴＩおよび５ａｌｌで
消化した。ＭＯＸ７′ロモーターＢ型肝炎表面抗原コー
ド領域およびターミネータ−から戊る発現カセットを保
有する断片は平滑末端となし、プラスミドｐＢＣ（Ｘｈ
ｏＴおよび５ｔｕＩで切断し、ＸｈｏＩ付着末端を修復
したもの）に連結させた。得られたプラスミドｐＭＳ２
はハンセヌラ・ポリモルファＵＲＡ３遺伝子断片の隣接
配列によりはさまれたＳ遺伝子発現カセットを含む。
ハンセヌラ・ポリモルファゲノムへのＳ遺伝子発現カセ
ットの組込みのために、プラスミドｐＭＳ−２はＮｈｅ
Ｉで切断し、得られた６、１ｋｂ断片は細胞を形質転換
すべく使用された。
ットの組込みのために、プラスミドｐＭＳ−２はＮｈｅ
Ｉで切断し、得られた６、１ｋｂ断片は細胞を形質転換
すべく使用された。
ベクターｐＦＳ−９は同様の方法で構築されたが、発現
カセットはＦＭＤプロモーターを含むｐＲＢ−３−２７
１から単離した。
カセットはＦＭＤプロモーターを含むｐＲＢ−３−２７
１から単離した。
得られたプラスミドの細部を第５図に示す。
実施例Ａ、 ５
Ｓ遺伝子発現カセｙ ｔ・および追加の選択マーカ遺伝
子を含むグラスミドの構築 ａ）基本プラスミドｐＨＫ２の構築 プラスミドｐＨＫ２ ［第６図；ブダペスト条約のもと
に１９８９年４月２７日伺１すでＤＳＭ（ＤＳＭ ＤＥ
ＵＴＳＣＩＩＥ ＳＡＭＭＬＵＮＧ ＶＯＮ ＭＩＫＲ
ＯＯＩ？ＧＡＮＩＳＭＥＮ ＵＮＤＺＥＬＬＫ ＵＬＴ
ＵＲＥＮ ＧｍｂＨ）に受託番号５３２８として寄託さ
れた］の構築のために、トランスポゾンＴ ｎ ５ （
Ｇｒｉｎｄｌｅｙ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ、 １９８０）
からカナマイシン耐性遺伝子を単離した。不必要な配列
は構造遺伝子をヌクレアーゼＢａ１３Ｌで処理して除い
た。得られたカナマイシンターミネータ−を含むカナマ
イシン構造遺伝子から成る断片は、サツカロミセス・セ
レビシェＡ Ｄ Ｈｌプロモーター（ＩｌｉＬｚｅｍａ
ｎ ｅｔ ａｌ、 １９８Ｄと連結させた。さらに、Ｈ
ＡＲ５Ｉ配列を４４０ｂｐ ５ａｉＴ断片としてこの
プラスミドに導入した。
子を含むグラスミドの構築 ａ）基本プラスミドｐＨＫ２の構築 プラスミドｐＨＫ２ ［第６図；ブダペスト条約のもと
に１９８９年４月２７日伺１すでＤＳＭ（ＤＳＭ ＤＥ
ＵＴＳＣＩＩＥ ＳＡＭＭＬＵＮＧ ＶＯＮ ＭＩＫＲ
ＯＯＩ？ＧＡＮＩＳＭＥＮ ＵＮＤＺＥＬＬＫ ＵＬＴ
ＵＲＥＮ ＧｍｂＨ）に受託番号５３２８として寄託さ
れた］の構築のために、トランスポゾンＴ ｎ ５ （
Ｇｒｉｎｄｌｅｙ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ、 １９８０）
からカナマイシン耐性遺伝子を単離した。不必要な配列
は構造遺伝子をヌクレアーゼＢａ１３Ｌで処理して除い
た。得られたカナマイシンターミネータ−を含むカナマ
イシン構造遺伝子から成る断片は、サツカロミセス・セ
レビシェＡ Ｄ Ｈｌプロモーター（ＩｌｉＬｚｅｍａ
ｎ ｅｔ ａｌ、 １９８Ｄと連結させた。さらに、Ｈ
ＡＲ５Ｉ配列を４４０ｂｐ ５ａｉＴ断片としてこの
プラスミドに導入した。
ｂ）ｐＲＢ−５−２６９およびｐＲＢ−３−２７１から
誘導されたカナマイシン耐性株の構築カナマイシン耐性
コード領域を含むｐＨＫ由来のＨｉ ｎ ｄ Ｎ断片（
３，５ｋｂ）は、プラスミドｐＲＢ−３−２６９および
ｐＲＢ−３−２７］のＨＡＲ３Ｉ配列中に存在するＨｉ
ｎｄｍ部位にクローン化した。得られたプラスミドはそ
れぞれｐＲＩ３−５−３２２およびｐＲＢ−５−３２６
と呼ばれ、第７図に示される。
誘導されたカナマイシン耐性株の構築カナマイシン耐性
コード領域を含むｐＨＫ由来のＨｉ ｎ ｄ Ｎ断片（
３，５ｋｂ）は、プラスミドｐＲＢ−３−２６９および
ｐＲＢ−３−２７］のＨＡＲ３Ｉ配列中に存在するＨｉ
ｎｄｍ部位にクローン化した。得られたプラスミドはそ
れぞれｐＲＩ３−５−３２２およびｐＲＢ−５−３２６
と呼ばれ、第７図に示される。
実施例Ａ、６
プレーＳ蛋白発現用の親プラスミドの構築ＭＯＸプロモ
ーター、多重クローニング部位およびＭＯｘターミネー
タ−から戊る普遍的発現カセットを保有するプラスミド
ｐＭＯＸ−Ｐ／”ＩＩ（第８図）を得るために、プラス
ミドｐＰ／Ｔ２４（実施例Ａ、２）を再構築した。
ーター、多重クローニング部位およびＭＯｘターミネー
タ−から戊る普遍的発現カセットを保有するプラスミド
ｐＭＯＸ−Ｐ／”ＩＩ（第８図）を得るために、プラス
ミドｐＰ／Ｔ２４（実施例Ａ、２）を再構築した。
１６
制限エンドヌクレアーゼ５ａｌｒ、ＥｃｏＲＩ、Ｂｇｌ
πおよびＢａｍＨＩの制限部位を含むリンカ−を挿入す
るために、プラスミドｐｐ／Ｔ−２４のｐＵｃ１９りン
カーを上記酵素の制限部位を含む合皮ＤＮＡで一部置き
換えた。
πおよびＢａｍＨＩの制限部位を含むリンカ−を挿入す
るために、プラスミドｐｐ／Ｔ−２４のｐＵｃ１９りン
カーを上記酵素の制限部位を含む合皮ＤＮＡで一部置き
換えた。
プラスミドｐＰ／Ｔ−２４を制限エンドヌクレアーゼＢ
ａｍＨｒおよび５ａｉＴで切断した。これらの部位はｐ
Ｕｃ１９リンカ−（ＢａｍＨＴ）およびｐＭＥ４ （Ｓ
ａ Ｉ Ｉ）に由来する。Ｓａｌ■、ＥｃｏＲＴＳＢｇ
ｌＨおよびＢ ａ ｍ ＨＩの制限部位を含むリンカ−
分子を挿入した。得られたプラスミドｐＴ１はＥｃｏＲ
ｒおよび５ａｌｌで消化し、ＭＯＸグロモーターを１．
５ｋｂＥｃｏＲＴ−３ａ ｌ Ｉ断片として挿入してプ
ラスミドｐＴ２を得た。プラスミドｐＴ２の関係のある
領域を以下に示ず： ＋１７ Ｓａｌ工 ＥｃｏＲよ りｇｌＩＩ ＢａｍＨＩ ５００ ＝３ 一−−−−−／／−−−ＡＡＡＡＡＣＧＧＭＴＴＣＡＧ
ＡＴＣＴ ＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＴ−一 く ＭＯＸ ７’口七−タ− クーミネ−２− さらに、プラスミドｐＴ２はプラスミドｐＲ８２６９（
第４図）に含まれるようなノ＼ンセヌラ・ポリモルファ
ＡＲ５およびサツカロミセス・セレビシェＵＲＡ３遺伝
子を含んでいる。
ａｍＨｒおよび５ａｉＴで切断した。これらの部位はｐ
Ｕｃ１９リンカ−（ＢａｍＨＴ）およびｐＭＥ４ （Ｓ
ａ Ｉ Ｉ）に由来する。Ｓａｌ■、ＥｃｏＲＴＳＢｇ
ｌＨおよびＢ ａ ｍ ＨＩの制限部位を含むリンカ−
分子を挿入した。得られたプラスミドｐＴ１はＥｃｏＲ
ｒおよび５ａｌｌで消化し、ＭＯＸグロモーターを１．
５ｋｂＥｃｏＲＴ−３ａ ｌ Ｉ断片として挿入してプ
ラスミドｐＴ２を得た。プラスミドｐＴ２の関係のある
領域を以下に示ず： ＋１７ Ｓａｌ工 ＥｃｏＲよ りｇｌＩＩ ＢａｍＨＩ ５００ ＝３ 一−−−−−／／−−−ＡＡＡＡＡＣＧＧＭＴＴＣＡＧ
ＡＴＣＴ ＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＴ−一 く ＭＯＸ ７’口七−タ− クーミネ−２− さらに、プラスミドｐＴ２はプラスミドｐＲ８２６９（
第４図）に含まれるようなノ＼ンセヌラ・ポリモルファ
ＡＲ５およびサツカロミセス・セレビシェＵＲＡ３遺伝
子を含んでいる。
次の構築工程はサツカロミセス・セレビシェＵＲＡ３遺
伝子をハンセヌラ・ポリモルファ由来のＵＲＡ３遺伝子
と置き換えることであった。この遺伝子を含むクローン
は以下の実施例Ａ、９で記載するように単離した。ＵＲ
Ａ３遺伝子は１．２ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＴ［断
片として単離した。
伝子をハンセヌラ・ポリモルファ由来のＵＲＡ３遺伝子
と置き換えることであった。この遺伝子を含むクローン
は以下の実施例Ａ、９で記載するように単離した。ＵＲ
Ａ３遺伝子は１．２ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＴ［断
片として単離した。
ＢｇｌＵ部位はもとのゲノム部位であるか、Ｂａｍ Ｈ
丁部位はＳａｕ３Ａｇ位とＢ ａ ｍ ＨＴ部位（ゲノ
ムライブラリーの作製に使用）との連結の結果であった
。このＢａｍＨＩ−ＢｇｌＴＩ断片の付着末端はＫｌｅ
ｎｏｗポリメラーゼで修復し、ｐＢＲ３２２のＡ ｖ
ａ Ｉ部位（これもＫｌｅｎｏｗポリメラ〜ゼで修復し
た）に挿入した。ＡｖａＩ部位はこの連結により再生さ
れ、得られたプラスミドはｐＵＲＡ３−ＰＩと命名され
た。
丁部位はＳａｕ３Ａｇ位とＢ ａ ｍ ＨＴ部位（ゲノ
ムライブラリーの作製に使用）との連結の結果であった
。このＢａｍＨＩ−ＢｇｌＴＩ断片の付着末端はＫｌｅ
ｎｏｗポリメラーゼで修復し、ｐＢＲ３２２のＡ ｖ
ａ Ｉ部位（これもＫｌｅｎｏｗポリメラ〜ゼで修復し
た）に挿入した。ＡｖａＩ部位はこの連結により再生さ
れ、得られたプラスミドはｐＵＲＡ３−ＰＩと命名され
た。
プラスミドｐＵＲＡ３−ＰｉはＮｒｕＩおよびＢｓｐＭ
ＩＩで消化した。これらの部位はｐＢＲ３２２（通常の
ｐＢＲ３２２地図のｂｐ９７４位置とｂｐ１６６４位置
）に由来する。プラスミドｐＴ２はＮｒｕ Ｉ （ｐＢ
Ｒ３２２のｂｐ９７４）で完全消化し、ＢｓｐＭＴｒで
部分消化した。ｐＴ２には２つのＢｓｐＭＨ部位が存在
する：第一の部位はｐＢＲ３２２（ｂｐ１６６４）に、
第二の部位はＭＯＸターミネータ−に存在する。ｐＴ２
のＮｒｕＩ−ＢｓｐＭＩＩ断片（１８［１０ｂｐ）はサ
ツカロミセス・セレビシェのＵＲＡ３遺伝子を含む。
ＩＩで消化した。これらの部位はｐＢＲ３２２（通常の
ｐＢＲ３２２地図のｂｐ９７４位置とｂｐ１６６４位置
）に由来する。プラスミドｐＴ２はＮｒｕ Ｉ （ｐＢ
Ｒ３２２のｂｐ９７４）で完全消化し、ＢｓｐＭＴｒで
部分消化した。ｐＴ２には２つのＢｓｐＭＨ部位が存在
する：第一の部位はｐＢＲ３２２（ｂｐ１６６４）に、
第二の部位はＭＯＸターミネータ−に存在する。ｐＴ２
のＮｒｕＩ−ＢｓｐＭＩＩ断片（１８［１０ｂｐ）はサ
ツカロミセス・セレビシェのＵＲＡ３遺伝子を含む。
ハンセヌラ・ポリモルファＵＲＡ３遺伝子を保有するＵ
ＲＡ３−ＰＬからのＮｒｕＩ−ＢｓｐＭＵ断片をｐＴ２
にクローン化して、対応するＮｒｕＩ−ＢｓｐＭＩＴ断
片に含まれるＳ．セレビシエＵＲＡ３遺伝子と置き換え
た。得られたプラスミドｐＴ３はＭＯＸターミネータ−
、リンカ−１Ｍ○Ｘプロモーターおよびハンセヌラ・ポ
リモルファＵＲＡ３遺伝子を含んでいる。しかしながら
、プラスミドｐＴ３は親プラスミドｐＭＥ４に存在する
機能的なβ−ラクタマーゼ遺伝子を欠いている。
ＲＡ３−ＰＬからのＮｒｕＩ−ＢｓｐＭＵ断片をｐＴ２
にクローン化して、対応するＮｒｕＩ−ＢｓｐＭＩＴ断
片に含まれるＳ．セレビシエＵＲＡ３遺伝子と置き換え
た。得られたプラスミドｐＴ３はＭＯＸターミネータ−
、リンカ−１Ｍ○Ｘプロモーターおよびハンセヌラ・ポ
リモルファＵＲＡ３遺伝子を含んでいる。しかしながら
、プラスミドｐＴ３は親プラスミドｐＭＥ４に存在する
機能的なβ−ラクタマーゼ遺伝子を欠いている。
この欠損β−ラクタマーゼ遺伝子を機能的な遺伝子とす
るために、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩで消化し、付着末
端をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで修復し、８ｂｐＡｓｐ
７１８リンカ−に連結して、Ｐｖｕ Ｉ （ｐＢＲ３２
２地図のｂｐ３７３８位置）で消化した。こうして得ら
れた６３３ｂｐ Ａｓｐ７１８−ＰｖｕＩ断片はβ−
ラクタマーゼ遺伝子のもとのプロモーターと翻訳開始コ
ドンを含む。
るために、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩで消化し、付着末
端をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで修復し、８ｂｐＡｓｐ
７１８リンカ−に連結して、Ｐｖｕ Ｉ （ｐＢＲ３２
２地図のｂｐ３７３８位置）で消化した。こうして得ら
れた６３３ｂｐ Ａｓｐ７１８−ＰｖｕＩ断片はβ−
ラクタマーゼ遺伝子のもとのプロモーターと翻訳開始コ
ドンを含む。
グラスミドｐＴ３はＡｓｐ７１８ （Ａｓｐ７］８はＭ
ＯＸターミネータ−の末端に存在する）で切断し、Ｐｖ
ｕ Ｉで部分消化した。その後、上で得られたＡｓｐ７
１８〜ＰｖｕＩ断片を予備処理したｐＴ３に挿入し、グ
ラスミドｐｌＶＩＯＸ−Ｐ／２０ Ｔ１を得た。
ＯＸターミネータ−の末端に存在する）で切断し、Ｐｖ
ｕ Ｉで部分消化した。その後、上で得られたＡｓｐ７
１８〜ＰｖｕＩ断片を予備処理したｐＴ３に挿入し、グ
ラスミドｐｌＶＩＯＸ−Ｐ／２０ Ｔ１を得た。
プラスミドｐ Ｍ ＯＸ −Ｐ ／ Ｔ ｌを第８図に
示す。
示す。
このプラスミドは機能的なβ−ラクタマーゼ遺伝子をも
っている。
っている。
実施例Ａ、 ７
プレーＳ蛋白を発現するプラスミドの構築Ｂ型肝炎ウィ
ルスのプレ５ｌ−５２〜Ｓ−蛋白（大型蛋白）をコード
するプレーＳ遺伝子はｐＲＩＴ１２８１６からＮｃｏＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として得られた。ｐＲＴＴ１２８
］６はＡＴＧコドンにあるＮ ｃ ｏ Ｉ （ＣＣＡ
Ｔ Ｇ Ｇ ）からＴＡＡ停止コドンを１５ｂｐ越える
Ｈ ｉ ｎ ｄ Ｎ （、、、、ＡＡＧＣＴＴ）までの
プレ５ｌ−５ｌ−３−蛋白をコードする］１８５ｂｐ
Ｎｃｏｌ−ＨｉｎｄＩｆｆ断片を含む慣用のｐＢＲ３
２２を土台とした大腸菌ベクターである。プレ５ｌ−３
２−５−コード配列断片はＥＰ−Ａ−０２７８９４０お
よび１１ａｒｆｏｒｄ ｅＬ ａ＋、 １９８７に記載
のｐＲＩＴＩ０６１６から通常のクローニング技術によ
り誘導された。
ルスのプレ５ｌ−５２〜Ｓ−蛋白（大型蛋白）をコード
するプレーＳ遺伝子はｐＲＩＴ１２８１６からＮｃｏＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として得られた。ｐＲＴＴ１２８
］６はＡＴＧコドンにあるＮ ｃ ｏ Ｉ （ＣＣＡ
Ｔ Ｇ Ｇ ）からＴＡＡ停止コドンを１５ｂｐ越える
Ｈ ｉ ｎ ｄ Ｎ （、、、、ＡＡＧＣＴＴ）までの
プレ５ｌ−５ｌ−３−蛋白をコードする］１８５ｂｐ
Ｎｃｏｌ−ＨｉｎｄＩｆｆ断片を含む慣用のｐＢＲ３
２２を土台とした大腸菌ベクターである。プレ５ｌ−３
２−５−コード配列断片はＥＰ−Ａ−０２７８９４０お
よび１１ａｒｆｏｒｄ ｅＬ ａ＋、 １９８７に記載
のｐＲＩＴＩ０６１６から通常のクローニング技術によ
り誘導された。
また、プレー２−５配列をコードする８６１ｂｐ２１
断片も慣用手段を使ってこれから回収できる。ＮｃｏＩ
−ＨｉｎｄｌｌＴ断片はＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで修
復して平滑末端となし、ｐ Ｍ ＯＸ −Ｐ ／ Ｔ
１の平滑末端化ＥｃｏＲｒ部位にクローン化した。
−ＨｉｎｄｌｌＴ断片はＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで修
復して平滑末端となし、ｐ Ｍ ＯＸ −Ｐ ／ Ｔ
１の平滑末端化ＥｃｏＲｒ部位にクローン化した。
正しい連結の結果として、プレＳ１構造遺伝子の前にＥ
ｃｏＲＴ部位がＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＴ平滑末端連結によ
り再形成される。ＭＯＸプロモータの制御下にプレーＳ
遺伝子を発現する構築物はｐ Ｍ Ｐ Ｓ −２２と呼
ばれ、第８図に示される。
ｃｏＲＴ部位がＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＴ平滑末端連結によ
り再形成される。ＭＯＸプロモータの制御下にプレーＳ
遺伝子を発現する構築物はｐ Ｍ Ｐ Ｓ −２２と呼
ばれ、第８図に示される。
ＦＭＤグロモータニを含む類似の構築物はｐＭｐＳ−２
１と呼ばれる。
１と呼ばれる。
実施例Ａ、 ８
プレＳ発現カセットを含むベクターの構築プラスミドｐ
ＭＰＳ−２２からの５ａｌＩＡｓｐ７１８発現カセット
は修復して平滑末端となし、上記の実施例Ａ４ａで述べ
たグラスミドｐＢＣの修復したＸｈｏＴ部位と５ｔｕＴ
部位の間に挿入した。得られたグラスミドはｐＭＰＳ−
９と呼ばれ、第９図に示される。
ＭＰＳ−２２からの５ａｌＩＡｓｐ７１８発現カセット
は修復して平滑末端となし、上記の実施例Ａ４ａで述べ
たグラスミドｐＢＣの修復したＸｈｏＴ部位と５ｔｕＴ
部位の間に挿入した。得られたグラスミドはｐＭＰＳ−
９と呼ばれ、第９図に示される。
実施例Ａ、 ９
ハンセヌラ・ポリモルファＵＲＡ３遺伝子のクロニング
ハンセヌラ・ポリモルファのＵＲＡ３遺伝子は大腸菌Ｍ
Ｂ１００Ｏ株の対応するｐｙｒＦ変異の補足によりクロ
ーン化した。
Ｂ１００Ｏ株の対応するｐｙｒＦ変異の補足によりクロ
ーン化した。
大きさが６〜９ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片は、５ａｕ３
Ａでの部分消化、低融点アガロースゲルでの分離、およ
び適当なりＮＡ画分の分離により単離した。
Ａでの部分消化、低融点アガロースゲルでの分離、およ
び適当なりＮＡ画分の分離により単離した。
精製した断片は、５ａｌＩ部位に挿入したハンセヌラ・
ポリモルファの自律複製配列を含むベクターＹＲｐ７の
唯一のＢａｍＨ１部位に連結した。
ポリモルファの自律複製配列を含むベクターＹＲｐ７の
唯一のＢａｍＨ１部位に連結した。
得られた連結混合物を用いて大腸菌ＭＢ１００Ｏ株を形
質転換し、形質転換ｍ胞はウラシル不合最少培地で選択
した。得られた形質転換細胞は分析し、プラスミドを単
離した。第１０図に示すようなザブ断片が単離され、こ
れは大腸菌、ザンカロミセス・セレビシェおよびハンセ
ヌラ・ポリモルファのオロチジン−５′−リン酸デカル
ボキシラ１２２ 一ゼ変異体においてＵＲＡ＋表現型の回復を仲介した。
質転換し、形質転換ｍ胞はウラシル不合最少培地で選択
した。得られた形質転換細胞は分析し、プラスミドを単
離した。第１０図に示すようなザブ断片が単離され、こ
れは大腸菌、ザンカロミセス・セレビシェおよびハンセ
ヌラ・ポリモルファのオロチジン−５′−リン酸デカル
ボキシラ１２２ 一ゼ変異体においてＵＲＡ＋表現型の回復を仲介した。
クローン化ＤＮＡの構造はサザンブロッティングにより
ゲノムＵＲＡ３領域の構造と同一であると判明した。ハ
ンセヌラ・ポリモルファＵＲＡ３遺伝子断片の制限地図
を第１０図に示す。
ゲノムＵＲＡ３領域の構造と同一であると判明した。ハ
ンセヌラ・ポリモルファＵＲＡ３遺伝子断片の制限地図
を第１０図に示す。
パートＢ
実施例８． １
Ｓ遺伝子を含むハンセヌラ・ポリモルファの構築ハンセ
ヌラ・ポリモルファＲＢＩＯは上記のプラスミドｐＲＢ
−３−２６９、ｐＲＢ−５−２６９−Ｉ、ｐＲＢ−５−
２７１、ｐＲＢ−３−２７１−Ｉで形質転換した。自律
複製プラスミド（形質転換体）または組込゛まれた外来
ＤＮＡ （組込み体）を保有するいくつかのクローンが
得られた。
ヌラ・ポリモルファＲＢＩＯは上記のプラスミドｐＲＢ
−３−２６９、ｐＲＢ−５−２６９−Ｉ、ｐＲＢ−５−
２７１、ｐＲＢ−３−２７１−Ｉで形質転換した。自律
複製プラスミド（形質転換体）または組込゛まれた外来
ＤＮＡ （組込み体）を保有するいくつかのクローンが
得られた。
これらの形質転換体／組込み体はその後イムノアッセイ
を用いてＳ遺伝子の発現について試験した。２つの試験
系：すなわち、ウェスターンブロン＝１２３ ティングおよびＡＵＳＲＩＡまたはＡＵＳＺＹＭＥ試Ｍ
Ａ （Ａｂｂｏｕ）が用いられた。ＨＢ ｓ Ａ ｇ
モノマーの生産はモノクローナルＲＦ６抗体を使ってウ
ェスターンブロッティングにより分析した。
を用いてＳ遺伝子の発現について試験した。２つの試験
系：すなわち、ウェスターンブロン＝１２３ ティングおよびＡＵＳＲＩＡまたはＡＵＳＺＹＭＥ試Ｍ
Ａ （Ａｂｂｏｕ）が用いられた。ＨＢ ｓ Ａ ｇ
モノマーの生産はモノクローナルＲＦ６抗体を使ってウ
ェスターンブロッティングにより分析した。
Ａｂｂｏｔｔ社のＡＵＳＲＩＡまたはＡＵＳＺＹＭＥキ
ットは、ハンセヌラにより生産されたＨＢｓＡｇ粒子の
量を見積もるために、製造者の説明書に従って使用した
。安定した高発現レベルを示す形質転換体が選ばれ、そ
れらのＤＮＡを電気泳動分離後サザンブロッティングに
より解析した。
ットは、ハンセヌラにより生産されたＨＢｓＡｇ粒子の
量を見積もるために、製造者の説明書に従って使用した
。安定した高発現レベルを示す形質転換体が選ばれ、そ
れらのＤＮＡを電気泳動分離後サザンブロッティングに
より解析した。
ａ）形質転換体
自律複製グラスミドを保有するいくつかのコロニーがグ
ラスミドｐＲＢ−８−２６９８よびｐＲＢ−３−２７］
で形質転換したハンセヌラ・ポリモルファから得られた
。これらの形質転換体から得られた全ＤＮＡを異なる制
限エンドヌクレアゼで消化して、サザン分析を行ったと
ころ、予期した制限パターンが得られた。
ラスミドｐＲＢ−８−２６９８よびｐＲＢ−３−２７］
で形質転換したハンセヌラ・ポリモルファから得られた
。これらの形質転換体から得られた全ＤＮＡを異なる制
限エンドヌクレアゼで消化して、サザン分析を行ったと
ころ、予期した制限パターンが得られた。
ｂ）組込み体
ハンセヌラ・ポリモルファは組込み型ベクタ９５
ｐ ＲＢ −Ｓ ２６９ １８よびｐＲＢ−５−２７
１−１により高頻度で形質転換される。完全培地（Ｙ
Ｅ Ｐ Ｄ）で増殖させた組込み体は有糸分裂の時に安
定している。また、ハンセヌラによる外来ＤＮＡの安定
した維持も上記方法によって得られ、この場合自律複製
ベクター、好ましくはｐＲＢＳ−２６９またはｐＲＢ−
５−２７１のような高コピー数プラスミドがゲノムに自
然に組込まれる。
１−１により高頻度で形質転換される。完全培地（Ｙ
Ｅ Ｐ Ｄ）で増殖させた組込み体は有糸分裂の時に安
定している。また、ハンセヌラによる外来ＤＮＡの安定
した維持も上記方法によって得られ、この場合自律複製
ベクター、好ましくはｐＲＢＳ−２６９またはｐＲＢ−
５−２７１のような高コピー数プラスミドがゲノムに自
然に組込まれる。
得られた組込み体は外来ＤＮＡの高有糸分裂安定性を示
す。
す。
上記の両方法を用いて、非選択完全培地でＳ遺伝子を効
率よく発現する株を得た。３つの株が保持された：同定
番号３５２をもつ株（ｐＲＢ−５２７１で形質転換され
、Ｓ遺伝子はＦＭＤプロモーターにより調節される）、
並びに株４１５および４１６（ＭＯＸ調節Ｓ遺伝子を含
むｐＲＢＳ−２６９で形質転換された）は以後の実験に
おいて使用された。
率よく発現する株を得た。３つの株が保持された：同定
番号３５２をもつ株（ｐＲＢ−５２７１で形質転換され
、Ｓ遺伝子はＦＭＤプロモーターにより調節される）、
並びに株４１５および４１６（ＭＯＸ調節Ｓ遺伝子を含
むｐＲＢＳ−２６９で形質転換された）は以後の実験に
おいて使用された。
６
実施例８．２
組込み体の中の外来ＤＮＡの有糸分裂安定性組換え株３
５２．４１５および４１６の安定性は次の方法により試
験した：それぞれの株を非選択ＳＭＲ培地で４０世代に
わたって増殖させた。
５２．４１５および４１６の安定性は次の方法により試
験した：それぞれの株を非選択ＳＭＲ培地で４０世代に
わたって増殖させた。
４０世代期間前および後に培養物から１２の独立したコ
ロニーを単離した。単離したクローンは外来ＤＮＡの構
造および発現カセットのコピー数を、制限断片のアガロ
ースゲル電気泳動と組合わせたザザンプロット分析およ
び全染色体のパルスフィルド勾配ゲル電気泳動により調
べた。後のほうの技術は酵母染色体の分離および分析を
可能にする（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ
、 １９８４）。
ロニーを単離した。単離したクローンは外来ＤＮＡの構
造および発現カセットのコピー数を、制限断片のアガロ
ースゲル電気泳動と組合わせたザザンプロット分析およ
び全染色体のパルスフィルド勾配ゲル電気泳動により調
べた。後のほうの技術は酵母染色体の分離および分析を
可能にする（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ
、 １９８４）。
パルスフィールドゲル電気泳動
株４１５．４１６および３５２からの細胞を０゜７％（
Ｗ／Ｖ）アガロースゲルの試料ウェル中で穏やかに溶解
した。その場で遊離した染色体はＬＫＢＰｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｐｕ１ｓａｐｈｏｒ Ｐｌｕｓ装置を使ってＬＫ
ＢＰｈａｒｍａｃｉａの説明書に従って分離した。ＰＦ
ＧＥ後ＤＮＡを５ｏｕｃｂｅｒｎ、 １９７５の方法に
従ってニトロセルロースに移行させた。プロットはハン
セヌラ・ポリモルファのＭＯＸおよび／またはＦＭＤ遺
伝子もしくはＵＲＡ３遺伝子（これはゲノム中に単一コ
ピーとして存在することが知られている）に特異的な３
２ｐ標識グローブを用いてハイブリダイゼーションを行
った。
Ｗ／Ｖ）アガロースゲルの試料ウェル中で穏やかに溶解
した。その場で遊離した染色体はＬＫＢＰｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｐｕ１ｓａｐｈｏｒ Ｐｌｕｓ装置を使ってＬＫ
ＢＰｈａｒｍａｃｉａの説明書に従って分離した。ＰＦ
ＧＥ後ＤＮＡを５ｏｕｃｂｅｒｎ、 １９７５の方法に
従ってニトロセルロースに移行させた。プロットはハン
セヌラ・ポリモルファのＭＯＸおよび／またはＦＭＤ遺
伝子もしくはＵＲＡ３遺伝子（これはゲノム中に単一コ
ピーとして存在することが知られている）に特異的な３
２ｐ標識グローブを用いてハイブリダイゼーションを行
った。
存在しうるマルチマー組込み体から得られた信号と単一
コピー遺伝子（固有マーカー）の信号との比較は、細胞
内に含まれる対象の発現カセットのコピー数の概算を可
能にした。ＰＦＧＥによる染色体の分析は、クローン４
１５が約３０〜５０コピーの発現カセットを含み、一方
クローン４１Ｇは約５〜６コピーの発現カセットを含み
、そしてクローン３５２は約１０コピーの発現カセット
を含むことを明らかにした。これらの分析は外来ＤＮＡ
がハンセヌラゲノムに組込まれることを示しＩこ。
コピー遺伝子（固有マーカー）の信号との比較は、細胞
内に含まれる対象の発現カセットのコピー数の概算を可
能にした。ＰＦＧＥによる染色体の分析は、クローン４
１５が約３０〜５０コピーの発現カセットを含み、一方
クローン４１Ｇは約５〜６コピーの発現カセットを含み
、そしてクローン３５２は約１０コピーの発現カセット
を含むことを明らかにした。これらの分析は外来ＤＮＡ
がハンセヌラゲノムに組込まれることを示しＩこ。
ザザン分析
株３５２．４１５および４１６をＳＭＲ培地で４０世代
にわたって増殖させた。上記増殖期間前＋２８ ＩＺ／ および後にそれぞれのパンチから１２の独立したコロニ
ーを単離した。その後、これらのサブクローンからのＤ
ＮＡ調製物は、種々の制限酵素での切断後、３２ｐ標識
ＤＮＡプローブを用いてザザン分析にかけた。制限パタ
ーンの分析は、発現カセットが損なわれておらず、導入
したＤＮＡが遺伝学的に安定であることを示した。これ
らの分析はさらに、株４１５のゲノムか数コピーのプラ
スミドから成る長い反復を含むことを明らかにした。プ
ラスミドは頭−尾の配列方法でこの反復中に存在してい
ると推測される。
にわたって増殖させた。上記増殖期間前＋２８ ＩＺ／ および後にそれぞれのパンチから１２の独立したコロニ
ーを単離した。その後、これらのサブクローンからのＤ
ＮＡ調製物は、種々の制限酵素での切断後、３２ｐ標識
ＤＮＡプローブを用いてザザン分析にかけた。制限パタ
ーンの分析は、発現カセットが損なわれておらず、導入
したＤＮＡが遺伝学的に安定であることを示した。これ
らの分析はさらに、株４１５のゲノムか数コピーのプラ
スミドから成る長い反復を含むことを明らかにした。プ
ラスミドは頭−尾の配列方法でこの反復中に存在してい
ると推測される。
実施例８．３
発現実験
組換え株はウェスターンブロッティングおよびＡＵＳＲ
ＴＡ／ＡＵＳＺＹＭＥ試験によりＨＢｓＡｇの存在につ
いて分析した。
ＴＡ／ＡＵＳＺＹＭＥ試験によりＨＢｓＡｇの存在につ
いて分析した。
ａ）培養物の増殖およびウェスターンブロッティング
株３５２．４１５および／１１６はＳＭＲ−グリセロー
ル培地２００ｍ１を入れた１ａフラスコ中２９ で激しく通気しながら３７℃で増殖させた。定常期（グ
リセロールの枯渇により特徴づけられる）の始めに、５
０ ｍ ｌ ／ Ｉの５倍濃縮ＳＭＲ培地（グリセロー
ル不合）を最終濃度１０ｇ／ｌのメタノールと共に加え
た。メタノールの添加前とメタノールの添加後２４時間
に培養物から１０ｍ１容量の試料を分取した。比較のた
めに、同−株を３０ｇ／ｌグルフース含有ＳＭＲ培地で
増殖させた（プロモーターの抑制）。細胞は対数期の終
わりに収穫した。
ル培地２００ｍ１を入れた１ａフラスコ中２９ で激しく通気しながら３７℃で増殖させた。定常期（グ
リセロールの枯渇により特徴づけられる）の始めに、５
０ ｍ ｌ ／ Ｉの５倍濃縮ＳＭＲ培地（グリセロー
ル不合）を最終濃度１０ｇ／ｌのメタノールと共に加え
た。メタノールの添加前とメタノールの添加後２４時間
に培養物から１０ｍ１容量の試料を分取した。比較のた
めに、同−株を３０ｇ／ｌグルフース含有ＳＭＲ培地で
増殖させた（プロモーターの抑制）。細胞は対数期の終
わりに収穫した。
収穫した細胞から、乾燥重量約０．１ｇに相当する細胞
ペレットを、ＰＥ緩衝液（０，５Ｍ Ｎａｃ！、０．１
％トリトンＸ−１００，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，
５，２ｍＭ ＰＭＳＦ）５ｍｌ中に浮遊させることによ
り、粗製蛋白抽出物を調製した。はぼ等しい容量のガラ
スピーズ（直径０．４５ｍｍ）を加えた。この混合物は
ＢｒａｕｎＭＳＫホモジナイゼーション（Ｂ、Ｂｒａｕ
ｎ ａｎｄＤｉｅｓｓｅｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｍｂｌ
ｌ、 Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、 ＦＲＧ）を使って４℃で
４分間激しく振とうした。その後ＰＥ緩衝液４ｍｌを加
え、ホモシネ−１を混合し、４°ＣＣ９４００００Ｘで
５分間遠心した。上清５〜２５μｇのアリコートを５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、対照とし
て精製ＨＢｓＡｇ（０，０５〜０．５μｇ）を使用した
。抗原物質の存在は、Ｔｏｗｂｉｎ、 １９７９の方法
に従って蛋白を一トロセルロースに移行させ、上記「方
法Ｊ５ａで述べたモノクローナル抗体ＲＦ６で検出する
ことにより証明した。ウェスターンプロットは、既知量
の酵母由来純粋ＨＢｓＡｇとの関連により、クローン３
５２．４１５および４１６により生産された抗ｙｊＣ量
の概算を可能にする。
ペレットを、ＰＥ緩衝液（０，５Ｍ Ｎａｃ！、０．１
％トリトンＸ−１００，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，
５，２ｍＭ ＰＭＳＦ）５ｍｌ中に浮遊させることによ
り、粗製蛋白抽出物を調製した。はぼ等しい容量のガラ
スピーズ（直径０．４５ｍｍ）を加えた。この混合物は
ＢｒａｕｎＭＳＫホモジナイゼーション（Ｂ、Ｂｒａｕ
ｎ ａｎｄＤｉｅｓｓｅｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｍｂｌ
ｌ、 Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、 ＦＲＧ）を使って４℃で
４分間激しく振とうした。その後ＰＥ緩衝液４ｍｌを加
え、ホモシネ−１を混合し、４°ＣＣ９４００００Ｘで
５分間遠心した。上清５〜２５μｇのアリコートを５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、対照とし
て精製ＨＢｓＡｇ（０，０５〜０．５μｇ）を使用した
。抗原物質の存在は、Ｔｏｗｂｉｎ、 １９７９の方法
に従って蛋白を一トロセルロースに移行させ、上記「方
法Ｊ５ａで述べたモノクローナル抗体ＲＦ６で検出する
ことにより証明した。ウェスターンプロットは、既知量
の酵母由来純粋ＨＢｓＡｇとの関連により、クローン３
５２．４１５および４１６により生産された抗ｙｊＣ量
の概算を可能にする。
これらの結果を表１に要約する。細胞密度約５ｇ（乾燥
重量）／１でのメタノール誘導フラスコ培養（ＳＭＲ培
地）において、Ｓ蛋白は形質転換株の全抽出蛋白の約２
〜５％を占める。
重量）／１でのメタノール誘導フラスコ培養（ＳＭＲ培
地）において、Ｓ蛋白は形質転換株の全抽出蛋白の約２
〜５％を占める。
誘導（メタノール）、抑制解除（グリセロール）および
抑制（グルコース）の条件下で増殖させた細胞における
発現レベルの比較は、ＭＯＸおよびＦＭ０７″口モータ
ーの極めて厳重な調節を示す。
抑制（グルコース）の条件下で増殖させた細胞における
発現レベルの比較は、ＭＯＸおよびＦＭ０７″口モータ
ーの極めて厳重な調節を示す。
３０
グルコース増殖細胞では発現が完全に阻止された。
グリセロールでは、ＨＢ ｓ Ａ ｇの合或は誘導細胞
により得られたレベルの約３０％である。
により得られたレベルの約３０％である。
ｂ）ハンセヌラ・ポリモルファにより発現されたＨＢｓ
Ａｇの抗原性 粗製抽出物中に含まれる物質の抗原性はモノクローナル
抗体に基づ＜ ＡｂｂｏＬｔ ＡＵＳＺＹＭＥ試験によ
り測定した。これらの結果は任意の単位として表した（
蛋白０．１／Ｚｇあたりの４９２ｎｍでの吸光度；粗製
抽出物の希釈および反応は１５０ｍＭＮａＣ１，２５ｍ
Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ７，４，０，０］％ ＢＳＡ、０
．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０を用いて行った）。ＡＵＳＺ
ＹＭＥ試験での反応性はザブ−ウィルス粒子に特徴的な
立体配座エピトープの存在を示す。
Ａｇの抗原性 粗製抽出物中に含まれる物質の抗原性はモノクローナル
抗体に基づ＜ ＡｂｂｏＬｔ ＡＵＳＺＹＭＥ試験によ
り測定した。これらの結果は任意の単位として表した（
蛋白０．１／Ｚｇあたりの４９２ｎｍでの吸光度；粗製
抽出物の希釈および反応は１５０ｍＭＮａＣ１，２５ｍ
Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ７，４，０，０］％ ＢＳＡ、０
．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０を用いて行った）。ＡＵＳＺ
ＹＭＥ試験での反応性はザブ−ウィルス粒子に特徴的な
立体配座エピトープの存在を示す。
１３＋
ブロッティング
により概算された
ＢｓＡｇ
ｍｇ／１００ｍｇ蛋白
により概算された
ＢｓＡｇ
任意のＡ。２単位
０．１μｇ蛋白
グリセロール ０．８−１．２
メタノール ２．５−３．０
１Ｏ００
２５、Ｏ
グリセロール １．０−１．５
メタノール ４．０−５．０
■２．０
４５．０
グリセロール ０．５−０．８
メタノール ２．０−３．０
５．０
２２．０
ｃ）Ｈ，ポリモルファ粗製抽出物の密度勾配遠心上記方
法により得られた粗製抽出物はＣｓＣｌまたはショ糖勾
配を使用して密度勾配遠心にかけＩこ。５０ｍＭＮａＣ
１，２ｍＭＥＤＴＡ、２５３３ ｍＭ Ｎ ａ Ｐ Ｏ，、ｐＨ７，２中の２０−５０％
ショ糖の頂部に粗製蛋白抽出物１００〜２００μｇ（２
００μ１）を重層して、ショ糖平衡沈降勾配遠心を行っ
た。５ｍｌ容量のチコーブはＢｅｃｋｍａｎ ５Ｗ５０
．１ ローターを使って４００００ｒｐｍで１８時間遠
心した。
法により得られた粗製抽出物はＣｓＣｌまたはショ糖勾
配を使用して密度勾配遠心にかけＩこ。５０ｍＭＮａＣ
１，２ｍＭＥＤＴＡ、２５３３ ｍＭ Ｎ ａ Ｐ Ｏ，、ｐＨ７，２中の２０−５０％
ショ糖の頂部に粗製蛋白抽出物１００〜２００μｇ（２
００μ１）を重層して、ショ糖平衡沈降勾配遠心を行っ
た。５ｍｌ容量のチコーブはＢｅｃｋｍａｎ ５Ｗ５０
．１ ローターを使って４００００ｒｐｍで１８時間遠
心した。
塩化セシウム勾配遠心は、１容量の粗製蛋白抽出物を１
容量の２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，４中の３ＭＣｓＣ
１で希釈することにより行った。
容量の２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，４中の３ＭＣｓＣ
１で希釈することにより行った。
遠心はＢｅｃｋｍａｎ ５０ Ｔｉ ローターを使って
４°ＣＣ９４０００Ｏｒｐで４０時間実施した。
４°ＣＣ９４０００Ｏｒｐで４０時間実施した。
勾配を分画化し、種々の画分はＲＦ６抗体を用いてウェ
スターンブロッティングまたはＡＵＳＲＴＡおよび／ま
たはＡＵＳＺＹＭＥ検定により試験した。ＣｓＣｌ密度
勾配では、ＨＢ ｓ Ａ ｇ物質のピークは約１．１６
−１．１９ｇ／ｍｌの密度のところに形成される。この
ピークに存在する物質はウェスターンプロントでＲＦ６
抗体と極めてよく反応するばかりでなく、ＡＵＳＲＴＡ
およびＡＵＳＺＹＭＥ検定でもよく反応する。この密度
およびＡＵＳＲｒＡ／ＡＵＳＺＹＭＥ試験での反応性は
、粒子に特徴的な立体配座エピト−プの存在を示す。別
の実験において、この物質の密度はヒ］・血清から単離
したサブ−ウィルス粒子（ウィルス亜粒子）と比較した
。両物質はＣｓＣ！溶液での等密度遠心において類似し
た密度に存在することが見いだされた。
スターンブロッティングまたはＡＵＳＲＴＡおよび／ま
たはＡＵＳＺＹＭＥ検定により試験した。ＣｓＣｌ密度
勾配では、ＨＢ ｓ Ａ ｇ物質のピークは約１．１６
−１．１９ｇ／ｍｌの密度のところに形成される。この
ピークに存在する物質はウェスターンプロントでＲＦ６
抗体と極めてよく反応するばかりでなく、ＡＵＳＲＴＡ
およびＡＵＳＺＹＭＥ検定でもよく反応する。この密度
およびＡＵＳＲｒＡ／ＡＵＳＺＹＭＥ試験での反応性は
、粒子に特徴的な立体配座エピト−プの存在を示す。別
の実験において、この物質の密度はヒ］・血清から単離
したサブ−ウィルス粒子（ウィルス亜粒子）と比較した
。両物質はＣｓＣ！溶液での等密度遠心において類似し
た密度に存在することが見いだされた。
粗製抽出物のショ糖勾配遠心は、ＡＵＳＲＩＡおよびＡ
ＵＳＺＹＭＥで反応しかつＨＢｓＡｇの少なくとも８０
％を含む（ＡＵ Ｓ ＲＩ Ａ／ＡＵ ＳＺＹＭＥおよ
びウェスターンブロッティングと平行して行った勾配画
分の分析により調べた）ピーク画分を与えた。この物質
の残りの２０％は主として勾配の頂部および底部画分に
存在し、ウェスターンプロット分析でのみ反応する。こ
のことはこの物質が蛋白のモノマー形態で存在すること
を示している。ＣｓＣ１勾配から得られたピーク画分の
分析はさらに、この物質の少なくとも８０％が粒子を形
成することを明らかにした。
ＵＳＺＹＭＥで反応しかつＨＢｓＡｇの少なくとも８０
％を含む（ＡＵ Ｓ ＲＩ Ａ／ＡＵ ＳＺＹＭＥおよ
びウェスターンブロッティングと平行して行った勾配画
分の分析により調べた）ピーク画分を与えた。この物質
の残りの２０％は主として勾配の頂部および底部画分に
存在し、ウェスターンプロット分析でのみ反応する。こ
のことはこの物質が蛋白のモノマー形態で存在すること
を示している。ＣｓＣ１勾配から得られたピーク画分の
分析はさらに、この物質の少なくとも８０％が粒子を形
成することを明らかにした。
ハンセヌラ誘導粒子は蛋白加水分解に対して抵抗を示す
。粒子を含む粗製蛋白抽出物をいろいろな温度で異なる
時間インキュベートしても、ごくわずかの分解が起こる
だけである（これはＡＵＳＺＹＭＥ値を試験すること、
および変性を起こす５ＤＳ−ＰＡＧＥその後のウェスタ
ーンプロットによるポリペプチドの完全性を分析するこ
とにより分かった）。この物質はさらに電子顕微鏡で親
察した。電子顕微鏡写真は直径が約２２ｎｍの粒子をは
っきりと示した。
。粒子を含む粗製蛋白抽出物をいろいろな温度で異なる
時間インキュベートしても、ごくわずかの分解が起こる
だけである（これはＡＵＳＺＹＭＥ値を試験すること、
および変性を起こす５ＤＳ−ＰＡＧＥその後のウェスタ
ーンプロットによるポリペプチドの完全性を分析するこ
とにより分かった）。この物質はさらに電子顕微鏡で親
察した。電子顕微鏡写真は直径が約２２ｎｍの粒子をは
っきりと示した。
上記の結果は３種すべての株（３５２，４１５および４
１６）について得られた。
１６）について得られた。
パートＣ
ハンセヌラ・ポリモルファＲＢＩＯは、ＵＲＡ３遺伝子
とＭＯＸプロモーターの支配下にあるプ”ｌｆｌ しＳ１遺伝子を含む、ｐＭＰＳ−２２由来の５５７０ｂ
ｐ Ｐｖｕｌ−Ａｓｐ７１８断片で形質転換した（第
８図参照）。さらに、ＦＭＤプロモーター（−９欠失）
の支配下にプレＳ１遺伝子を含む対応する断片はプラス
ミドｐＭＰＳ−２１から得られた。これらの形質転換か
ら形成された組込み体はサザン分析により１〜２個の発
現カセットを含むことが分かった。ＭＯＸプロモーター
の支配下にプレＳ１遺伝子を含む組込み体はプレＳＡＭ
と呼ばれ、ＦＭＤプロモーターの支配下にプ２しＳ遺伝
子を含む組込み体はプレ５−ＡＦと呼ばれる。
とＭＯＸプロモーターの支配下にあるプ”ｌｆｌ しＳ１遺伝子を含む、ｐＭＰＳ−２２由来の５５７０ｂ
ｐ Ｐｖｕｌ−Ａｓｐ７１８断片で形質転換した（第
８図参照）。さらに、ＦＭＤプロモーター（−９欠失）
の支配下にプレＳ１遺伝子を含む対応する断片はプラス
ミドｐＭＰＳ−２１から得られた。これらの形質転換か
ら形成された組込み体はサザン分析により１〜２個の発
現カセットを含むことが分かった。ＭＯＸプロモーター
の支配下にプレＳ１遺伝子を含む組込み体はプレＳＡＭ
と呼ばれ、ＦＭＤプロモーターの支配下にプ２しＳ遺伝
子を含む組込み体はプレ５−ＡＦと呼ばれる。
数個の発現カセットを含む組込み体は、ＨＡＲ５配列を
保持する自律複製ブラスミ＋： ｐＭ ｐ ｓ ２２お
よびｐＭＰｓ２１でハンセヌラ・ポリモルファを形質転
換することにより得られた。組込み体は「物質および方
法Ｊ２ｂで説明したようにこれらのプラスミドの自然組
込みにより形成された。これらのタイプの形質転換体に
はプレＳ−ＢＭ（ＭＯＸプロモーター）およびプレ５−
ＢＦ （ＦＭＤ３７ プロモーター）の一般名称を与えた。
保持する自律複製ブラスミ＋： ｐＭ ｐ ｓ ２２お
よびｐＭＰｓ２１でハンセヌラ・ポリモルファを形質転
換することにより得られた。組込み体は「物質および方
法Ｊ２ｂで説明したようにこれらのプラスミドの自然組
込みにより形成された。これらのタイプの形質転換体に
はプレＳ−ＢＭ（ＭＯＸプロモーター）およびプレ５−
ＢＦ （ＦＭＤ３７ プロモーター）の一般名称を与えた。
株プレＳ−ＡＭ−４０５、プレＳ、−ＢＭ−４０２、プ
レＳ−ＢＭ−４０３およびプレＳ−ＢＭ４５４（プレＳ
１遺伝子の発現がＭＯＸブロモターにより調節される）
は以後の分析のために保持しておいた。
レＳ−ＢＭ−４０３およびプレＳ−ＢＭ４５４（プレＳ
１遺伝子の発現がＭＯＸブロモターにより調節される）
は以後の分析のために保持しておいた。
２、有糸分裂安定性
実施例Ｃ，１で同定された４種の株に存在する外来ＤＮ
Ａの有糸分裂安定性は、パートＢで述べた４０世代増殖
期間の前および後に単離した１２の独立したザブクロー
ンのザザン分析により試験した。これらの分析は組込ま
れたベクターの遺伝的安定性を確信させた（パートＤ、
３の実施例を参照）。
Ａの有糸分裂安定性は、パートＢで述べた４０世代増殖
期間の前および後に単離した１２の独立したザブクロー
ンのザザン分析により試験した。これらの分析は組込ま
れたベクターの遺伝的安定性を確信させた（パートＤ、
３の実施例を参照）。
３、ハンセヌラ・ポリモルファによるプレＳ蛋白グ及里
株プレＳ−ＡＭ−４０５、プレＳ−ＢＭ−４０２、プレ
５−Ｂｌ’１ｌ−４０３およびプレＳ−ＢＭ４５４はグ
リセロールを含むＳＭＲ培地で増殖させ、その後パート
Ｂで述べたようにメタノール（ＩＯｇ／１）による細胞
の誘導を行った。細胞はメタノールの添加後２５時間で
収穫し、パー）Ｂで述べたように粗製抽出物を調製した
。
５−Ｂｌ’１ｌ−４０３およびプレＳ−ＢＭ４５４はグ
リセロールを含むＳＭＲ培地で増殖させ、その後パート
Ｂで述べたようにメタノール（ＩＯｇ／１）による細胞
の誘導を行った。細胞はメタノールの添加後２５時間で
収穫し、パー）Ｂで述べたように粗製抽出物を調製した
。
ａ）株プレＳ−ＡＭ−４０５、プレＳ−ＢＭ−４０２、
およびプレＳ−ＢＭ−４５４の粗製抽出物１２μｇは、
「方法Ｊ ５ （ａ）に記載したモノクローナル抗体（
Ｓ］、１、Ｓ２．２およびＳ２゜５）の混合物を用いて
、ポリアクリルアミド５ＤＳ−ゲル電気泳動その後のウ
ェスターンブロッティングにより分析した。両タイプの
株は３８／３９ｋＤに二重の抗原バンドおＪ：び４５ｋ
Ｄに別のバンドを示した。
およびプレＳ−ＢＭ−４５４の粗製抽出物１２μｇは、
「方法Ｊ ５ （ａ）に記載したモノクローナル抗体（
Ｓ］、１、Ｓ２．２およびＳ２゜５）の混合物を用いて
、ポリアクリルアミド５ＤＳ−ゲル電気泳動その後のウ
ェスターンブロッティングにより分析した。両タイプの
株は３８／３９ｋＤに二重の抗原バンドおＪ：び４５ｋ
Ｄに別のバンドを示した。
株プレＳ−ＡＭ−４０５は株プレＳ−ＢＭ−４０２より
も３９ｋＤ物質に対して４５ｋＤ物質のより低い含量を
示した；株プレＳ−ＢＭ−４５４は４５ｋＤ物質の最高
の相対含量を示した。
も３９ｋＤ物質に対して４５ｋＤ物質のより低い含量を
示した；株プレＳ−ＢＭ−４５４は４５ｋＤ物質の最高
の相対含量を示した。
上記株からのプレＳ蛋白の電気泳動パターンはヒ）・血
清粒子から誘導された抗原と比較された。
清粒子から誘導された抗原と比較された。
ヒトおよび酵母調製物は両方ともウェスターンブロツ１
へで比較したとき約３８ ／ ３９ ｋ Ｄにバンドを
示す。
へで比較したとき約３８ ／ ３９ ｋ Ｄにバンドを
示す。
ｂ）それぞれの株における発現レベルの変化についても
調べた。これらの差異は恐らく株間の発現カセットのコ
ピー数の相違によるものと思われた。
調べた。これらの差異は恐らく株間の発現カセットのコ
ピー数の相違によるものと思われた。
ウェスターンブロッティングにより、プレＳ抗原は表２
に示すようにそれぞれのプレＳ−ＡおよびプレＳ−８株
において全細胞蛋白の０，１〜１゜５％を占めると概算
された。
に示すようにそれぞれのプレＳ−ＡおよびプレＳ−８株
において全細胞蛋白の０，１〜１゜５％を占めると概算
された。
また、粗製抽出物は粒子の存在についてＡＵＳＺＹＭＥ
検定で調べた。表２に示す結果は極めて低い反応性（Ａ
１９２単位１０．１／Ｚｇ蛋白として表した）を示す。
検定で調べた。表２に示す結果は極めて低い反応性（Ａ
１９２単位１０．１／Ｚｇ蛋白として表した）を示す。
ウェスターン ＡＵＳＺＹＭＥクローン
ブロッティングによる ＡｌＩ３単位概算
プレＳ蛋白 ＩＯ，Ｉｊ１ｇ１１ｇ蛋白プレ
Ｍ−４０２ プレＳ−ＢＭ−４０３ ０，３−０，５ ０，４−０，６ ０，０２ ０，０２ ４０ Ｃ）グリコシル化：プレＳ蛋白の高生産（全細胞蛋白の
約１．５％）および顕著な４５ｋＤバンドにより特徴づ
けられる株プレＳ−ＢＭ−４５４はグリコシル化につい
ての次の実験のために選ばれた。プレＳ−ＢＭ−４５４
からのプレＳ蛋白は、粗製蛋白抽出物をＥｎｄｏｆ（エ
ンドグリコシダーゼと共にインキュベートすることによ
り分析した。
ブロッティングによる ＡｌＩ３単位概算
プレＳ蛋白 ＩＯ，Ｉｊ１ｇ１１ｇ蛋白プレ
Ｍ−４０２ プレＳ−ＢＭ−４０３ ０，３−０，５ ０，４−０，６ ０，０２ ０，０２ ４０ Ｃ）グリコシル化：プレＳ蛋白の高生産（全細胞蛋白の
約１．５％）および顕著な４５ｋＤバンドにより特徴づ
けられる株プレＳ−ＢＭ−４５４はグリコシル化につい
ての次の実験のために選ばれた。プレＳ−ＢＭ−４５４
からのプレＳ蛋白は、粗製蛋白抽出物をＥｎｄｏｆ（エ
ンドグリコシダーゼと共にインキュベートすることによ
り分析した。
次のデータは４５ｋＤ物質がプレＳ蛋白のグリコシル化
形態であることをはっきり示している。
形態であることをはっきり示している。
粗製蛋白４５μｇを０．５ｍＵのＥｎｄｏＨエンドグリ
コシダーゼと共に製造者（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎ
ｎｈｅｉｍ、 ＦＲＧ）の説明書に従って０．５．１゜
０および２４時間インキュベー１・すると、４５ｋＤバ
ンドは見掛は分子量４２ｋＤに移った。この移動は４５
ｋＤ物質が約３０００Ｄの１個の″コア基を有する、プ
レＳ蛋白のＮ−グリコシル化形態であることを示す。
コシダーゼと共に製造者（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎ
ｎｈｅｉｍ、 ＦＲＧ）の説明書に従って０．５．１゜
０および２４時間インキュベー１・すると、４５ｋＤバ
ンドは見掛は分子量４２ｋＤに移った。この移動は４５
ｋＤ物質が約３０００Ｄの１個の″コア基を有する、プ
レＳ蛋白のＮ−グリコシル化形態であることを示す。
Ｎ−グリコシル化の強力な阻害剤であることが知られて
いるツニカマイシンを使って、ハンセヌラ・ポリモルフ
ァによるプレＳ蛋白のグリコシル４１ 化についてさらに研究した。株プレＳ−ＢＭ−４５４は
グルコース（］Ｏｇ／Ｉ）含有ＹＮＢ培地でＡ６゜。−
１０，０の密度へ増殖させた。この培養物１０ｍ１を１
０ｇ／Ｉメタノールおよび５０μｇ ／ ｍ ｌツニカ
マイシンを含むＹＮＢ培地１００ｍ１に接種した。培地
のｐ Ｈ値は７，２〜７゜５に保った。対照実験はツニ
カマイシンを使用せずに行った。ツニカマイシン含有培
地の接種後１０．１５および３０時間に細胞を収穫した
。
いるツニカマイシンを使って、ハンセヌラ・ポリモルフ
ァによるプレＳ蛋白のグリコシル４１ 化についてさらに研究した。株プレＳ−ＢＭ−４５４は
グルコース（］Ｏｇ／Ｉ）含有ＹＮＢ培地でＡ６゜。−
１０，０の密度へ増殖させた。この培養物１０ｍ１を１
０ｇ／Ｉメタノールおよび５０μｇ ／ ｍ ｌツニカ
マイシンを含むＹＮＢ培地１００ｍ１に接種した。培地
のｐ Ｈ値は７，２〜７゜５に保った。対照実験はツニ
カマイシンを使用せずに行った。ツニカマイシン含有培
地の接種後１０．１５および３０時間に細胞を収穫した
。
粗製蛋白抽出物はウェスターンブロンティングにより分
析した。この実験により、ツニカマイシンの存在下で増
殖させた細胞では、４２ ｋ Ｄの単一バンドと３８／
３９ ｋｒ＋の二重バンドが現れることが立証された。
析した。この実験により、ツニカマイシンの存在下で増
殖させた細胞では、４２ ｋ Ｄの単一バンドと３８／
３９ ｋｒ＋の二重バンドが現れることが立証された。
対照実験では、４２ｋＤバンドの代わりに４５ｋＤバン
ドが現れた。同様の結果が株プレＳ−ＢＭ−４０２、プ
レＳ−ＢＭ−４０３およびプレＳ−ＡＭ−４０５からの
抽出物の場合にも得られた：しかしなから、これらの株
は一層少ない量の４５ｋＤ蛋白物質（脅威された全プレ
Ｓ蛋白の５〜１０％未満）を生産した。上記結果は４２
ｋ ＤバンドかプレＳ蛋白のＯ−グリコシル化形態を
表すことを示唆している。
ドが現れた。同様の結果が株プレＳ−ＢＭ−４０２、プ
レＳ−ＢＭ−４０３およびプレＳ−ＡＭ−４０５からの
抽出物の場合にも得られた：しかしなから、これらの株
は一層少ない量の４５ｋＤ蛋白物質（脅威された全プレ
Ｓ蛋白の５〜１０％未満）を生産した。上記結果は４２
ｋ ＤバンドかプレＳ蛋白のＯ−グリコシル化形態を
表すことを示唆している。
ｄ）密度勾配遠心
株プレＳ−ＡＭ−４０５および株プレＳ−ＢＭ４０２、
プレＳ−ＢＭ−４０３、プレＳ−ＢＭ４５４からの粗製
抽出物はショ糖およびＣｓＣ１勾配遠心ににる分析にか
けた。条件はパートＢ３（ｃ）に記載した。勾配画分は
ウェスターンブロッティングおよびＡＵＳＺＹＭＥ試験
により調べｌこ。
プレＳ−ＢＭ−４０３、プレＳ−ＢＭ４５４からの粗製
抽出物はショ糖およびＣｓＣ１勾配遠心ににる分析にか
けた。条件はパートＢ３（ｃ）に記載した。勾配画分は
ウェスターンブロッティングおよびＡＵＳＺＹＭＥ試験
により調べｌこ。
これらの分析により、Ｓ抗原（パートＢ）またはプレＳ
１とＳ抗原の両方（パートＤ）を発現する株どは対照的
に、プレ５株はザブ−ウィルス粒子を効率よく形成しな
いことか明らかになった。
１とＳ抗原の両方（パートＤ）を発現する株どは対照的
に、プレ５株はザブ−ウィルス粒子を効率よく形成しな
いことか明らかになった。
等密度ＣｓＣｌおよびショ糖勾配遠心はどちらも必要と
される密度のバンドの形成を示さなかった。
される密度のバンドの形成を示さなかった。
このことは、勾配画分および粗製抽出物からのＨＢｓＡ
ｇ関連物質がＡＵＳＲＩＡまたはＡＵＳＺＹＭＥ試験で
不十分に反応することからも確かめられた。
ｇ関連物質がＡＵＳＲＩＡまたはＡＵＳＺＹＭＥ試験で
不十分に反応することからも確かめられた。
パー１− Ｄ
プレＳおよびＳ抗原の両方を含む複合粒子の形成実施例
り、 １ 株の構築 プレ５１対Ｓの異なる発現比および異なる全発現レベル
により特徴づけられる数種の株を構築しｌこ。
り、 １ 株の構築 プレ５１対Ｓの異なる発現比および異なる全発現レベル
により特徴づけられる数種の株を構築しｌこ。
これらの差異はゲノムあたりの発現カセットのコピー数
の変化により達成された。更なる差異は異なるハンセヌ
ラ・プロモーターの支配下にこの遺伝子を置くことによ
り得られた。
の変化により達成された。更なる差異は異なるハンセヌ
ラ・プロモーターの支配下にこの遺伝子を置くことによ
り得られた。
３種の基本型の組換え株が次のようにして得られた：
ａ）ｌコピーのプレＳ１遺伝子およびｌコピーのＳ遺伝
子を含む株（八−株） プレ５１カセツトとＵＲＡ３遺伝子を含む６゜６ｋｂ
ＮｈｅＴ ＤＮＡ断片をプラスミドｐ Ｍ ＰＳ９
（第９図）から単離した。Ｓ遺伝子を含むＮｈｅｌ
ＤＮＡ断片をグラスミドｐＭＰＳ２（第５図）から単離
した。これらの断片はＴ４ ＤＮ４４ Ａリガーゼを使って連結し、１コピーの各遺伝子を含む
連結断片をアガロースゲルから単離した。
子を含む株（八−株） プレ５１カセツトとＵＲＡ３遺伝子を含む６゜６ｋｂ
ＮｈｅＴ ＤＮＡ断片をプラスミドｐ Ｍ ＰＳ９
（第９図）から単離した。Ｓ遺伝子を含むＮｈｅｌ
ＤＮＡ断片をグラスミドｐＭＰＳ２（第５図）から単離
した。これらの断片はＴ４ ＤＮ４４ Ａリガーゼを使って連結し、１コピーの各遺伝子を含む
連結断片をアガロースゲルから単離した。
これらの断片を用いて、ハンセヌラ・ポリモルファＲ８
１０株をウラシル非依存性へ形質転換した。
１０株をウラシル非依存性へ形質転換した。
得られた形質転換体はザザンブロンティングにより分析
し、１コピーの各カセットを組込んだクローンを選択し
た。株プレＳ／５−Ａ−２９３を以後の分析のために保
持しておいた。
し、１コピーの各カセットを組込んだクローンを選択し
た。株プレＳ／５−Ａ−２９３を以後の分析のために保
持しておいた。
ｂ）１個のプレＳ発現カセットおよび数個のＳ発現カセ
ットを含む株（Ｂ−株） ハンセヌラ・ポリモルファはプレＳ１発現カセットを含
むｐＭＰＳ−２２由来の５５７０ｂｐＡｓｐ７１８−Ｐ
ｖｕｌ断片で形質転換した。ｌコピーの上記カセットを
組込んだ形質転換体を選択した。保持された株は上記パ
ートｃ、ｉで述べたプレＳ−ＡＭ−４０５であった。
ットを含む株（Ｂ−株） ハンセヌラ・ポリモルファはプレＳ１発現カセットを含
むｐＭＰＳ−２２由来の５５７０ｂｐＡｓｐ７１８−Ｐ
ｖｕｌ断片で形質転換した。ｌコピーの上記カセットを
組込んだ形質転換体を選択した。保持された株は上記パ
ートｃ、ｉで述べたプレＳ−ＡＭ−４０５であった。
その後、株プレＳ−ＡＭ−４０５はそれぞれのプロモー
ターの支配下にＳ遺伝子を含む自律複製プラスミドｐＲ
Ｂ−３−３２６（ＦＭＤブロモター）またはｐＲＢ−５
−３２２（ＭＯＸブロモ４５ ター）（第７図）で形質転換した。両プラスミドはさら
に選択マーカーとしてゲンタマイシンＧ４１８耐性をコ
ードする遺伝子を保有する。Ｋａｎ遺伝子は」二連した
ようにザッカロミセス・セレビシェＡＤＨＩプロモータ
ー（第７図）の支配下にある。ザザンプロットおよびＰ
ＦＧＥ分析によれば、形質転換により組込まれた１コピ
ーのプレＳ１カセツトおよび数コピー（３０〜１００）
のＳ遺伝子含有カセットを常に含む数種の株が得られＩ
こ。
ターの支配下にＳ遺伝子を含む自律複製プラスミドｐＲ
Ｂ−３−３２６（ＦＭＤブロモター）またはｐＲＢ−５
−３２２（ＭＯＸブロモ４５ ター）（第７図）で形質転換した。両プラスミドはさら
に選択マーカーとしてゲンタマイシンＧ４１８耐性をコ
ードする遺伝子を保有する。Ｋａｎ遺伝子は」二連した
ようにザッカロミセス・セレビシェＡＤＨＩプロモータ
ー（第７図）の支配下にある。ザザンプロットおよびＰ
ＦＧＥ分析によれば、形質転換により組込まれた１コピ
ーのプレＳ１カセツトおよび数コピー（３０〜１００）
のＳ遺伝子含有カセットを常に含む数種の株が得られＩ
こ。
株プレＳ／５−Ｂ−４３］、プレＳ／５−Ｂ２Ｓ３およ
びプレＳ／５−Ｂ−４３３は以後の分析のために保持し
ておいた。株プレＳ／５−Ｂ４３１はＭＯＸプロモータ
ー制御Ｓ遺伝子を含み、一方プレＳ／５−Ｂ−４３２お
よびプレＳ／５Ｂ−４３３はＦＭＤプロモーターを含む
カセットを保有する。
びプレＳ／５−Ｂ−４３３は以後の分析のために保持し
ておいた。株プレＳ／５−Ｂ４３１はＭＯＸプロモータ
ー制御Ｓ遺伝子を含み、一方プレＳ／５−Ｂ−４３２お
よびプレＳ／５Ｂ−４３３はＦＭＤプロモーターを含む
カセットを保有する。
Ｃ）複数個のＳ発現力セントと複数個のプレＳ発現カセ
ットを含む株（Ｃ−株） ハンセヌラ・ポリモルファはプレＳＬ遺伝子をＩｄｌ’
ｉ 含む自律複製プラスミＦｐＭＰＳ−２２（第８図）で形
質転換した。形質転換はゲノムに組込まれた異なる数の
発現カセットを含む数種の株をもたらした。２〜２０個
のプレＳ１発現カセットを含む単離物がザザンブロット
により同定された。これらの株はパートＣでプレＳ−Ｂ
Ｍｉ０２、プレＳ−ＢＭ−４０３およびプレＳ−ＢＭ−
４５４として記載されたものであり、異なる量のプレＳ
抗原を発現する。その後、これらのプレ５株は再びＳ遺
伝子を保有する自律複製プラスミドｐＲＢＳ−３２２（
ＭＯＸ７’ロモーター）およびｐＲＢ−３−３２６（Ｆ
ＭＤプロモーター）で形質転換した（第７図）。形質転
換マーカーとしてＧ４１８耐性が使用された。安定した
組込み体の選択はいくつかのクローンをもたらし、その
うちの一部がさらに分析された。以後の分析のために保
持された株は株プレＳ−ＢＭ−４０２から誘導されたプ
レＳ／５−Ｃ−４５２、プレ３／５−Ｃ−４６５、株プ
レＳ−ＢＭ−４０３から誘導された株プレＳ／５−Ｃ−
４６６、株プレＳ−ＢＭ−４５４７ から誘導された株プレＳ／５−Ｃ−４４８−Ｃ４（この
場合Ｓ遺伝子発現カセットはＦＭＤグロモターを含む）
であった。表３は上記様についての詳細な情報を提供す
る。
ットを含む株（Ｃ−株） ハンセヌラ・ポリモルファはプレＳＬ遺伝子をＩｄｌ’
ｉ 含む自律複製プラスミＦｐＭＰＳ−２２（第８図）で形
質転換した。形質転換はゲノムに組込まれた異なる数の
発現カセットを含む数種の株をもたらした。２〜２０個
のプレＳ１発現カセットを含む単離物がザザンブロット
により同定された。これらの株はパートＣでプレＳ−Ｂ
Ｍｉ０２、プレＳ−ＢＭ−４０３およびプレＳ−ＢＭ−
４５４として記載されたものであり、異なる量のプレＳ
抗原を発現する。その後、これらのプレ５株は再びＳ遺
伝子を保有する自律複製プラスミドｐＲＢＳ−３２２（
ＭＯＸ７’ロモーター）およびｐＲＢ−３−３２６（Ｆ
ＭＤプロモーター）で形質転換した（第７図）。形質転
換マーカーとしてＧ４１８耐性が使用された。安定した
組込み体の選択はいくつかのクローンをもたらし、その
うちの一部がさらに分析された。以後の分析のために保
持された株は株プレＳ−ＢＭ−４０２から誘導されたプ
レＳ／５−Ｃ−４５２、プレ３／５−Ｃ−４６５、株プ
レＳ−ＢＭ−４０３から誘導された株プレＳ／５−Ｃ−
４６６、株プレＳ−ＢＭ−４５４７ から誘導された株プレＳ／５−Ｃ−４４８−Ｃ４（この
場合Ｓ遺伝子発現カセットはＦＭＤグロモターを含む）
であった。表３は上記様についての詳細な情報を提供す
る。
７１８
実施例り、 ２
Ｈ，ポリモルファによるプレＳおよびＳ−蛋白の遊里
Ｈ，ポリモルファの異なる形質転換株によるプレＳおよ
びＳ−蛋白の発現は「物質および方法」５ａで説明した
イムノブロッティング、およびＡＵＳＺＹＭＥ検定によ
り試験した。これらの結果の要約および試験した種々の
菌株の性質は表３に示しである。
びＳ−蛋白の発現は「物質および方法」５ａで説明した
イムノブロッティング、およびＡＵＳＺＹＭＥ検定によ
り試験した。これらの結果の要約および試験した種々の
菌株の性質は表３に示しである。
プレＳおよびＳ−蛋白の両方を発現する株は、培地を３
０ｍ１使用したことを除いて、パート８゜３で述べたよ
うに増殖させ、誘導した。粗製細胞抽出物を上記のよう
に調製し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけ、その後ＲＦ６またはＳｌ、１とＳ２．１モノクロ
一ナル抗体の混合物を用いてウェスターンブロッティン
グにより検出した。株プレＳ／５−Ａ−２９３、プレＳ
／５−Ｂ−４３１，プレＳ／Ｓ−１３−４３２、プレＳ
／５−Ｂ−４３３、プレＳ／５−Ｃ−４５３、プレＳ／
５−Ｃ−４６３、プレＳ／５−Ｃ−４６６およびプレＳ
／５−Ｃ−４４８−Ｃ４のメタノール誘導細胞からの１
２〜１５μｇ量の粗製抽出物は検出用にモノクローナル
ＲＦ６を用いてイムノプロットした。この分析により、
プレＳ対Ｓ蛋白の異なる比を発現する株が得られること
が分かった。これらおよび他のイムノプロットから、株
プレＳ／５−Ｂ−４３１におけるプレＳ対Ｓ蛋白の比は
約１：１５と概算され、株プレＳ／５Ｃ−４５２では約
１：８であり、株プレＳ／５Ｃ−４４８−Ｃ４では約５
：３であると概算された。これらの株はイムノブロッテ
ィングおよびＡＵＳＺＹＭＥ検定の両方からそれらの生
産レベルにおいても異なることが判明した。これらの株
からの細胞抽出物はまた、検出用にモノクローナルＳ１
．ｌを用いてイムノプロットシた。大部分の株では、プ
レＳ蛋白はより少ない量の４５ｋＤバンド（検出された
全プレＳ蛋白の約５％を占めるにすぎない）と共に３８
−３９ｋＤの二重蛋白バンドとして検出される。対照的
に、株プレＳ／３−Ｃ−４４８−Ｃ４はほぼ等しい量の
３８−３９ｋＤ物質と４５ｋＤ物質を発現する。
０ｍ１使用したことを除いて、パート８゜３で述べたよ
うに増殖させ、誘導した。粗製細胞抽出物を上記のよう
に調製し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけ、その後ＲＦ６またはＳｌ、１とＳ２．１モノクロ
一ナル抗体の混合物を用いてウェスターンブロッティン
グにより検出した。株プレＳ／５−Ａ−２９３、プレＳ
／５−Ｂ−４３１，プレＳ／Ｓ−１３−４３２、プレＳ
／５−Ｂ−４３３、プレＳ／５−Ｃ−４５３、プレＳ／
５−Ｃ−４６３、プレＳ／５−Ｃ−４６６およびプレＳ
／５−Ｃ−４４８−Ｃ４のメタノール誘導細胞からの１
２〜１５μｇ量の粗製抽出物は検出用にモノクローナル
ＲＦ６を用いてイムノプロットした。この分析により、
プレＳ対Ｓ蛋白の異なる比を発現する株が得られること
が分かった。これらおよび他のイムノプロットから、株
プレＳ／５−Ｂ−４３１におけるプレＳ対Ｓ蛋白の比は
約１：１５と概算され、株プレＳ／５Ｃ−４５２では約
１：８であり、株プレＳ／５Ｃ−４４８−Ｃ４では約５
：３であると概算された。これらの株はイムノブロッテ
ィングおよびＡＵＳＺＹＭＥ検定の両方からそれらの生
産レベルにおいても異なることが判明した。これらの株
からの細胞抽出物はまた、検出用にモノクローナルＳ１
．ｌを用いてイムノプロットシた。大部分の株では、プ
レＳ蛋白はより少ない量の４５ｋＤバンド（検出された
全プレＳ蛋白の約５％を占めるにすぎない）と共に３８
−３９ｋＤの二重蛋白バンドとして検出される。対照的
に、株プレＳ／３−Ｃ−４４８−Ｃ４はほぼ等しい量の
３８−３９ｋＤ物質と４５ｋＤ物質を発現する。
実施例り、 ３
外来ＤＮＡの安定性
上記プレＳ／Ｓ形質転換体および組込み体に含まれる外
来ＤＮＡの安定性はパートＢで説明した通り・に分析し
た。この実験は組換え体クローンの非常に良好な有糸分
裂安定性を示す。株プレＳ／Ｓ−４５３およびプレＳ／
Ｓ−４３１の４０世代発酵の前後に単離した１２の独立
したクローンのザザン分析は、すべての場合に同じ制限
断片パターンが現れることを立証した。また、表３に掲
げたプレ３７５株はパルスフィールド勾配電気泳動で分
析した。分離した染色体はニトロセルロース膜にプロッ
トし、その後異なる放射性ＤＮＡプロブを用いてハイブ
リダイズさせた。この方法はＳ発現カセットのコピー数
の概算を可能にし、これらのプレ３７５株が組込み体で
あることを決定的に証明した。これらの実験の結果は上
記の表３に要約しである。
来ＤＮＡの安定性はパートＢで説明した通り・に分析し
た。この実験は組換え体クローンの非常に良好な有糸分
裂安定性を示す。株プレＳ／Ｓ−４５３およびプレＳ／
Ｓ−４３１の４０世代発酵の前後に単離した１２の独立
したクローンのザザン分析は、すべての場合に同じ制限
断片パターンが現れることを立証した。また、表３に掲
げたプレ３７５株はパルスフィールド勾配電気泳動で分
析した。分離した染色体はニトロセルロース膜にプロッ
トし、その後異なる放射性ＤＮＡプロブを用いてハイブ
リダイズさせた。この方法はＳ発現カセットのコピー数
の概算を可能にし、これらのプレ３７５株が組込み体で
あることを決定的に証明した。これらの実験の結果は上
記の表３に要約しである。
５２
実施例り、 ４
複合粒子の単離および性状決定
ａ）ハンセヌラ・ポリモルファからの複合粒子の部分精
製 ハンセヌラ・ポリモル７７株フレＳ／５−Ｂ２Ｓ３の発
酵槽培養物は「物質Ｊ５ｄで述べたＳ培地を用いて増殖
させ、メタノールで７８時間誘導後遠心により細胞を回
収した。細胞ペレットは０．５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅ
ｎ ２０．２ｍＭＥＤＴＡ。
製 ハンセヌラ・ポリモル７７株フレＳ／５−Ｂ２Ｓ３の発
酵槽培養物は「物質Ｊ５ｄで述べたＳ培地を用いて増殖
させ、メタノールで７８時間誘導後遠心により細胞を回
収した。細胞ペレットは０．５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅ
ｎ ２０．２ｍＭＥＤＴＡ。
４ｍＭ ＰＭＳＦ、５％（ｖ／ｖ）インプロパツールお
よび５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９゜０を含
む緩衝液巾約１２０ｇ／ｌの乾燥細胞重量の濃度で浮遊
させた。細胞は直径０．４５〜０゜７ｍｍのガラスピー
ズを含むビーズミル（Ｄｙｎｏｍｉｌｌ ＫＤＬ型、
Ｂａｃｈｏｆｅｎ ＡＧ、 Ｂａ５ｅｌ。
よび５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９゜０を含
む緩衝液巾約１２０ｇ／ｌの乾燥細胞重量の濃度で浮遊
させた。細胞は直径０．４５〜０゜７ｍｍのガラスピー
ズを含むビーズミル（Ｄｙｎｏｍｉｌｌ ＫＤＬ型、
Ｂａｃｈｏｆｅｎ ＡＧ、 Ｂａ５ｅｌ。
５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）を使って流速６ α／時およ
び滞留時間７分で４回通過させることにより破壊した。
び滞留時間７分で４回通過させることにより破壊した。
細胞抽出物は４°０，１６０００ＸｇＴ４５分遠心して
澄明化し、上溝を回収した。
澄明化し、上溝を回収した。
その後、ｉ％（ｗ／ｖ）コロイドシリカ（Ａｅｒｏｓｉ
１５３ ３８０、 Ｄｅｇｕｓｓａ、 Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、
ＦＩ？Ｇ）を上清に撹拌しながら加え、この混合物を４
℃で一晩撹拌してＨＢｓＡｇを吸着させた。シリカは４
°０．４０００×ｇで３０分遠心して回収し、ペレット
の再懸濁および再遠心により０．９％（ｗ／ｖ） Ｎ
ａ Ｃｌで２回洗浄した。シリカに吸着されたＨ Ｂ
ｓ Ａ ｇは、洗浄ペレットを１０ｍＭピロリン酸ナト
リウムｐＨ９，５中に再懸濁し、絶えず撹拌しながら３
７℃で３時間インキュベートすることにより脱着させた
。ピロリン酸ナトリウム緩衝液の使用量は初めの澄明化
細胞抽出物の容量の約１／８〜１／１０であった。その
後、この溶液を４°０．１７０００Ｘｇで６０分遠心し
、上清を回収した。
１５３ ３８０、 Ｄｅｇｕｓｓａ、 Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、
ＦＩ？Ｇ）を上清に撹拌しながら加え、この混合物を４
℃で一晩撹拌してＨＢｓＡｇを吸着させた。シリカは４
°０．４０００×ｇで３０分遠心して回収し、ペレット
の再懸濁および再遠心により０．９％（ｗ／ｖ） Ｎ
ａ Ｃｌで２回洗浄した。シリカに吸着されたＨ Ｂ
ｓ Ａ ｇは、洗浄ペレットを１０ｍＭピロリン酸ナト
リウムｐＨ９，５中に再懸濁し、絶えず撹拌しながら３
７℃で３時間インキュベートすることにより脱着させた
。ピロリン酸ナトリウム緩衝液の使用量は初めの澄明化
細胞抽出物の容量の約１／８〜１／１０であった。その
後、この溶液を４°０．１７０００Ｘｇで６０分遠心し
、上清を回収した。
上溝はＣｓＣ１で１．５Ｍとなし、５０．２Ｔｉロータ
ー（Ｓｐｉｎｃｏ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、 Ｂｅｃｋｍａ
ｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、 Ｐａ１ｏ Ａｌｔｏ、
ＵＳＡ）を使って４５０００ｒｐｍで７０時間、等密度
平衡へ遠心した。
ー（Ｓｐｉｎｃｏ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、 Ｂｅｃｋｍａ
ｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、 Ｐａ１ｏ Ａｌｔｏ、
ＵＳＡ）を使って４５０００ｒｐｍで７０時間、等密度
平衡へ遠心した。
形成されたＣｓＣ１勾配を分画化し、画分はＥＬＩＳＡ
キット（Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ、 Ｂｅｈｒｉｎｇ−Ｗｅ
ｒｋｅ ＡＧ。
キット（Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ、 Ｂｅｈｒｉｎｇ−Ｗｅ
ｒｋｅ ＡＧ。
Ｍａｒｂ＋ｉｒ１）、 ＦＲＧ）を用いて製造者の指示
通りにＨＢｓＡｇの存在について調べた。ピーク画分を
プルし、１０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム、０゜１
５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６，８に対して透析した。
通りにＨＢｓＡｇの存在について調べた。ピーク画分を
プルし、１０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム、０゜１
５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６，８に対して透析した。
この物質および粗製細胞抽出物についての検定は、全Ａ
ＵＳＲＩＡ反応性物質の４８％、全蛋白の３％未満、全
糖の０．２％未満、および全脂質の２％未満がこの方法
により回収されたことを示した。
ＵＳＲＩＡ反応性物質の４８％、全蛋白の３％未満、全
糖の０．２％未満、および全脂質の２％未満がこの方法
により回収されたことを示した。
ハンセヌラ・ポリモルファ株プレＳ／５−Ｃ４５２の細
胞ペレットも正確に同じ方法で抽出し、類似の結果を得
た。
胞ペレットも正確に同じ方法で抽出し、類似の結果を得
た。
プレＳ／５−Ｂ−４３１およびプレＳ／５−Ｃ−４５２
株からの部分精製ＨＢｓＡｇｉＡ製物の試料は、ゲル電
気泳動および、以下のバー）Ｄ、 ／１で説明するよう
なＨＢｓＡｇ関連蛋白検出用のモノクローナルＨＢ Ｓ
ｌおよび３１．１を用いるイムノブロッティングによ
り試験した。
株からの部分精製ＨＢｓＡｇｉＡ製物の試料は、ゲル電
気泳動および、以下のバー）Ｄ、 ／１で説明するよう
なＨＢｓＡｇ関連蛋白検出用のモノクローナルＨＢ Ｓ
ｌおよび３１．１を用いるイムノブロッティングによ
り試験した。
モノクローナルＨＢＳＩによるイムノブロンティングは
、両調製物において２４ｋＤに反応性バンドの存在を、
そして約３８／３９ｋＤに別のバンドの存在を示した。
、両調製物において２４ｋＤに反応性バンドの存在を、
そして約３８／３９ｋＤに別のバンドの存在を示した。
モノクローナルＳ］、１１こよｂ４
るイムノブロッティングは両調製物において３８／３９
ｋＤにプレＳ１蛋白関連バンドのみを検出した。
ｋＤにプレＳ１蛋白関連バンドのみを検出した。
これはプレ３１蛋白とＳ蛋白物質の両方がコロイドシリ
カ吸着および等密度ＣｓＣ１密度勾配遠心により同時精
製されることを示している。
カ吸着および等密度ＣｓＣ１密度勾配遠心により同時精
製されることを示している。
ｂ）複合粒子のＣｓＣｌ密度勾配遠心
Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／Ｓ−Ｂ〜４３１の発酵槽培
養物をＳ−培地（「物質」５ｄ）で増殖させ、メタノー
ルで７３時間誘導後収穫した。遠心して細胞ペレットを
回収し、再懸濁し、以下で述べるようなフレンチプレス
（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ）を通過させて細胞抽出物
を調製した。１７０００Ｘｇで３０分遠心することによ
り粗製溶解液から細胞破片を除いた。その後、粗製細胞
抽出物は１゜５ＭＣ８Ｃ１、リン酸緩衝溶液ｐＨ７，５
中で２４５０００Ｘｇで平衡へ遠心した。勾配を分画化
し、各画分はＨＢｓＡｇに特異的なＥＬＴＳＡ試験（Ｅ
ｎｚｙｇｎｏｓｔ： Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ ＡＧ
、 Ｍａｒｂｕｒ１）、 ＦＲＧ）およびプレＳ１蛋白
に特異的なＥＬ Ｉ ＳＡ試験に５６ ＋５５ より抗原性について分析した。Ｅｎｚｙｇｎｏｓ Ｌ試
験は集合したＨ Ｂ ｓ Ａ ｇ粒子のみを検出し、蛋
白モノマーは検出しない。プレＳ１蛋白特異的Ｅ Ｌ
Ｔ ＳＡ試験は抗原の捕獲・検出用にマウス・モノクロ
ーナル抗体Ｓ１．ｌを使用し、以下のバートＤ。
養物をＳ−培地（「物質」５ｄ）で増殖させ、メタノー
ルで７３時間誘導後収穫した。遠心して細胞ペレットを
回収し、再懸濁し、以下で述べるようなフレンチプレス
（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ）を通過させて細胞抽出物
を調製した。１７０００Ｘｇで３０分遠心することによ
り粗製溶解液から細胞破片を除いた。その後、粗製細胞
抽出物は１゜５ＭＣ８Ｃ１、リン酸緩衝溶液ｐＨ７，５
中で２４５０００Ｘｇで平衡へ遠心した。勾配を分画化
し、各画分はＨＢｓＡｇに特異的なＥＬＴＳＡ試験（Ｅ
ｎｚｙｇｎｏｓｔ： Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ ＡＧ
、 Ｍａｒｂｕｒ１）、 ＦＲＧ）およびプレＳ１蛋白
に特異的なＥＬ Ｉ ＳＡ試験に５６ ＋５５ より抗原性について分析した。Ｅｎｚｙｇｎｏｓ Ｌ試
験は集合したＨ Ｂ ｓ Ａ ｇ粒子のみを検出し、蛋
白モノマーは検出しない。プレＳ１蛋白特異的Ｅ Ｌ
Ｔ ＳＡ試験は抗原の捕獲・検出用にマウス・モノクロ
ーナル抗体Ｓ１．ｌを使用し、以下のバートＤ。
５で説明する。
ＨＢ ｓ Ａ ｇ活性のピークはＣｓＣ１勾配中の１゜
１８−１．１９ｇ／ｃｍ３の密度で観測された。
１８−１．１９ｇ／ｃｍ３の密度で観測された。
プレＳｌ蛋白活性の主ピークはこの同一密度で観測され
、副ピークが１．２６ｇ／ｃｍ”の密度に観測された。
、副ピークが１．２６ｇ／ｃｍ”の密度に観測された。
さらに、勾配画分はイムノブロッティングによりプレＳ
１蛋白Ｓ蛋白の存在についても調べた。
１蛋白Ｓ蛋白の存在についても調べた。
Ｌａｅｍｍｌｉ （１９７０）によるドデシル硫酸ナト
リウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＴｏｗ
ｂｉｎ ｅｔ ａｌ、（１９７９）によるニトロセルロ
ースへのプロッティングの後、ニトロセルロースシート
は血清由来ＨＢｓＡｇに対して誘導したウサギ・ポリク
ローナル血清とインキスペードした。抗体結合はアルカ
リ性ホスファターゼ法により検出しＩ′ｉ７ ｌこ。
リウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＴｏｗ
ｂｉｎ ｅｔ ａｌ、（１９７９）によるニトロセルロ
ースへのプロッティングの後、ニトロセルロースシート
は血清由来ＨＢｓＡｇに対して誘導したウサギ・ポリク
ローナル血清とインキスペードした。抗体結合はアルカ
リ性ホスファターゼ法により検出しＩ′ｉ７ ｌこ。
Ｓ蛋白に相当する２４ｋＤの主蛋白バンドおよび３８／
３９ｋＤの二重バンドが観察された。３種すべての蛋白
についてのイムノブロッティングにおける最大活性は、
１．１８−１．１９ｇ／ｃｍ３の密度（Ｅｎｚｙｇｎｏ
ｓ を試験で測定されたＨＢｓＡｇ活性のピークに一致
する）のＣｓＣｌ勾配画分に存在していた。これは粗製
抽出物中のＨＢＶ表面抗原蛋白の大部分がＨＢ ｓ Ａ
ｇに特徴的な密度を有するリポ蛋白構造で存在するこ
とを示している。
３９ｋＤの二重バンドが観察された。３種すべての蛋白
についてのイムノブロッティングにおける最大活性は、
１．１８−１．１９ｇ／ｃｍ３の密度（Ｅｎｚｙｇｎｏ
ｓ を試験で測定されたＨＢｓＡｇ活性のピークに一致
する）のＣｓＣｌ勾配画分に存在していた。これは粗製
抽出物中のＨＢＶ表面抗原蛋白の大部分がＨＢ ｓ Ａ
ｇに特徴的な密度を有するリポ蛋白構造で存在するこ
とを示している。
別のニトロセルロースシートはマウス・モノクローナル
抗体ｓ１．ｌとインキュベートした。この抗体は１．１
８−１．１９ｇ／ｃｍ３のＣｓＣ１密度に対応する画分
において３８／３９ｋＤの蛋白バンドのみを検世した。
抗体ｓ１．ｌとインキュベートした。この抗体は１．１
８−１．１９ｇ／ｃｍ３のＣｓＣ１密度に対応する画分
において３８／３９ｋＤの蛋白バンドのみを検世した。
また、粗製細胞抽出物はショ糖勾配によるレートゾーン
遠心にかけた。
遠心にかけた。
５０ｍＭ１−リス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８，１中に形成し
た５−２０％（ｗ／ｖ）ショ糖勾配に粗製細胞抽出物を
重層し、２８８０００Ｘｇで２００分遠心した。勾配を
分画化し、各画分はＥｎｚｙｇｎｏｓＬＥＬＩＳＡ試験
でＨＢ ｓ Ａ ｇの存在について、そしてＥｎｚｙｇ
ｎｏｓｔ試験からのＨＢｓＡｇ特異的抗体による抗原の
捕獲およびプレＳ１蛋白特異的ＭａｂＳ１．ｌでの検出
によりプレＳｌ蛋白含有ＨＢ ｓＡｇの存在について分
析した。ｌｉ、ｎｚｙｇｎｏｓＬ検定は勾配を通して沈
降するＨ Ｂ ｓ Ａ ｇ活性のピークを示した。
た５−２０％（ｗ／ｖ）ショ糖勾配に粗製細胞抽出物を
重層し、２８８０００Ｘｇで２００分遠心した。勾配を
分画化し、各画分はＥｎｚｙｇｎｏｓＬＥＬＩＳＡ試験
でＨＢ ｓ Ａ ｇの存在について、そしてＥｎｚｙｇ
ｎｏｓｔ試験からのＨＢｓＡｇ特異的抗体による抗原の
捕獲およびプレＳ１蛋白特異的ＭａｂＳ１．ｌでの検出
によりプレＳｌ蛋白含有ＨＢ ｓＡｇの存在について分
析した。ｌｉ、ｎｚｙｇｎｏｓＬ検定は勾配を通して沈
降するＨ Ｂ ｓ Ａ ｇ活性のピークを示した。
Ｍａｂ Ｓｌ、ｌ ＥＬＩＳＡはＥｎｚｙｇｎｏｓ
Ｌ検定と同じピークを示したが、活性の肩部（ショルダ
ー）がより高いショ糖密度のほうへ延びていた。
Ｌ検定と同じピークを示したが、活性の肩部（ショルダ
ー）がより高いショ糖密度のほうへ延びていた。
より高い沈降係数を有するこの肩部の物質は、ハンセヌ
ラ・ポリモル７７株プレＳ／５−Ｂ−４３１からの粗製
抽出物を、ショ糖密度勾配遠心による分析に先立って、
コロイドシリカによる吸着／脱着およびＣｓＣｌ勾配で
の遠心により部分精製したときに、排除される。これら
の結果は、ＨＢｓＡｇとプレＳｌ蛋白の両方がリポ蛋白
粒子に特徴的な密度のＣｓＣｌ密度勾配中に共沈降する
ことを示している。
ラ・ポリモル７７株プレＳ／５−Ｂ−４３１からの粗製
抽出物を、ショ糖密度勾配遠心による分析に先立って、
コロイドシリカによる吸着／脱着およびＣｓＣｌ勾配で
の遠心により部分精製したときに、排除される。これら
の結果は、ＨＢｓＡｇとプレＳｌ蛋白の両方がリポ蛋白
粒子に特徴的な密度のＣｓＣｌ密度勾配中に共沈降する
ことを示している。
ｃ）Ｈ，ポリモルファにより発現された複合ＨＢＨＢＶ
表面抗原粒子は上記３ａで述べたようにＨ，ポリモルフ
ァ株プレＳ／５−Ｂ−４３１の粗製抽出物から部分精製
した。この調製物は表面抗原蛋白のプレＳｌ蛋白レＳ２
およびＳ領域に存在するエピトープに対して誘導された
マウス・モノクローナル抗体（Ｍａｂ）との反応につい
て、およびプレＳ２領域にあるヒト血清アルブミンポリ
マーのレセプター（ｐ ＨＳ Ａ−レセプター）の存在
について試験した。
表面抗原粒子は上記３ａで述べたようにＨ，ポリモルフ
ァ株プレＳ／５−Ｂ−４３１の粗製抽出物から部分精製
した。この調製物は表面抗原蛋白のプレＳｌ蛋白レＳ２
およびＳ領域に存在するエピトープに対して誘導された
マウス・モノクローナル抗体（Ｍａｂ）との反応につい
て、およびプレＳ２領域にあるヒト血清アルブミンポリ
マーのレセプター（ｐ ＨＳ Ａ−レセプター）の存在
について試験した。
Ｃ１，ＭａｂＳｌ、１との反応
ＨＢＶ表面抗原蛋白のプレＳ１エピトープに対して誘導
されたマウス・モノクローナル抗体（Ｍａｂ）Ｓｌ、ｌ
は、ＥＬ Ｉ ＳＡ検定により複合粒子におけるこの部
位の存在を検出するために使用した。ＭａｂＳｌ、１を
マイクロタイタープレー）（ＩｍｍｕｎｏｐｌａＬｅＩ
；Ｎｕｎｃ、ＧｉｂｃｏＥｕｒｏｐｅ、Ｇｂｅｎｔ。
されたマウス・モノクローナル抗体（Ｍａｂ）Ｓｌ、ｌ
は、ＥＬ Ｉ ＳＡ検定により複合粒子におけるこの部
位の存在を検出するために使用した。ＭａｂＳｌ、１を
マイクロタイタープレー）（ＩｍｍｕｎｏｐｌａＬｅＩ
；Ｎｕｎｃ、ＧｉｂｃｏＥｕｒｏｐｅ、Ｇｂｅｎｔ。
Ｂｅｌｇｉｕｍ）のウェルに被覆し、部分精製した粗製
抽出物とインキュベートした。洗浄して非結合物６０ 質を除いた後、Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｎａｋａｍｅ、
１９７８の方法を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ
結合Ｍａｂ５１．１とインキュベートすることにより、
反応性粒子の捕獲を明らかにした。
抽出物とインキュベートした。洗浄して非結合物６０ 質を除いた後、Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｎａｋａｍｅ、
１９７８の方法を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ
結合Ｍａｂ５１．１とインキュベートすることにより、
反応性粒子の捕獲を明らかにした。
第二抗体の結合を示す発色は色素原として０７二二レン
ジアミンを使用した。Ｉｎｔｅｒｍｅｄ １ｍｍｕｎｏ
ｒｅａｄｅｒ、 ＮＪ ２０００ （Ａｎａｌｉｓ、
ＧｈｅｎＬ、 Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使って４９０ｎｍ（
基準フィルターの場合は６２０ｎｍ）での吸光度を読み
取った。
ジアミンを使用した。Ｉｎｔｅｒｍｅｄ １ｍｍｕｎｏ
ｒｅａｄｅｒ、 ＮＪ ２０００ （Ａｎａｌｉｓ、
ＧｈｅｎＬ、 Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使って４９０ｎｍ（
基準フィルターの場合は６２０ｎｍ）での吸光度を読み
取った。
Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｂ−４３１からの部分
精製抽出物はこの試験において陽性反応を与え、プレ５
１領域に特異的なＭａｂＳｌ、１による捕獲および結合
を示した。Ｓ．セレビシエＲＩ Ｔ ４３７６ （Ｉｌ
ａｒｆ’ｏｒｄ ｅＬａ＋、 １９８７）から精製した
Ｓ蛋白のみを含む表面抗原粒子はこの試験において何の
反応も示さなかった。
精製抽出物はこの試験において陽性反応を与え、プレ５
１領域に特異的なＭａｂＳｌ、１による捕獲および結合
を示した。Ｓ．セレビシエＲＩ Ｔ ４３７６ （Ｉｌ
ａｒｆ’ｏｒｄ ｅＬａ＋、 １９８７）から精製した
Ｓ蛋白のみを含む表面抗原粒子はこの試験において何の
反応も示さなかった。
Ｃ２，Ｍａｂ５２．５との反応
マウス・モノクローナル抗体Ｓ２，５はＨＢ Ｖ表面抗
原のプレＳ２領域に対して誘導された。このＭａｂは複
合粒子におけるプレＳ２エピ１−一ブ６１ の存在を調べるためにＥＬ Ｉ ＳＡ試験で用いられた
。ＭａｂＳ２．５をマイクロタイタープレートのウェル
に被覆し、Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｂ−４３１
からの部分精製細胞抽出物とインキュベートした。抗原
結合は西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させたＭａｂ
３２．５とのインキュベーションおよび上記のような発
色により証明した。Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｂ
−４３１からの部分精製細胞抽出物はこの試験で陽性反
応を与え、表面抗原粒子にプレＳ２領域エピトープが存
在することを示した。Ｓ９セレビシエＲＩＴ４３７６か
ら精製したＳ蛋白のみを含む表面抗原粒子はこの試験に
おいて何の反応も示さなかった。
原のプレＳ２領域に対して誘導された。このＭａｂは複
合粒子におけるプレＳ２エピ１−一ブ６１ の存在を調べるためにＥＬ Ｉ ＳＡ試験で用いられた
。ＭａｂＳ２．５をマイクロタイタープレートのウェル
に被覆し、Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｂ−４３１
からの部分精製細胞抽出物とインキュベートした。抗原
結合は西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させたＭａｂ
３２．５とのインキュベーションおよび上記のような発
色により証明した。Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｂ
−４３１からの部分精製細胞抽出物はこの試験で陽性反
応を与え、表面抗原粒子にプレＳ２領域エピトープが存
在することを示した。Ｓ９セレビシエＲＩＴ４３７６か
ら精製したＳ蛋白のみを含む表面抗原粒子はこの試験に
おいて何の反応も示さなかった。
Ｃ３，ＭａｂＲＦｌおよびＳＬ、ｌ （ＨＲＰ）との反
応 マウス・七ツクローナル抗体ＲＦ Ｉ （）１．Ｔｈｏ
ｍａｓ。
応 マウス・七ツクローナル抗体ＲＦ Ｉ （）１．Ｔｈｏ
ｍａｓ。
Ｒｏｙａｌ Ｆｒｅｅ Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、 Ｌｏｎｄ
ｏｎ、 Ｕ、に、）はＳ領域に存在する立体配座依存性
エピトープに対して誘導され、ＥＬ Ｔ ＳＡ試験にお
いて使用された。このＭａｂをマイクロタイタープレー
トのウェルに被覆し、Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／Ｓ
−Ｂ−４３１からの部分精製細胞抽出物とインキュベ−
１・した。粒子結合は上記のセクションＣ１で述べたよ
うに西洋ワサビベルオキシダーゼと結合させたＭ ａ
ｂ Ｓ ｌ、１とのインキュベーションによす証明した
。Ｈ，ポリモルファからの部分精製細胞抽出物はこの試
験で陽性の結果を与えたが、Ｓ．セレビシエＲＩＴ４３
７６から精製した表面抗原粒子はこの試験において何の
反応も示さなかった。
ｏｎ、 Ｕ、に、）はＳ領域に存在する立体配座依存性
エピトープに対して誘導され、ＥＬ Ｔ ＳＡ試験にお
いて使用された。このＭａｂをマイクロタイタープレー
トのウェルに被覆し、Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／Ｓ
−Ｂ−４３１からの部分精製細胞抽出物とインキュベ−
１・した。粒子結合は上記のセクションＣ１で述べたよ
うに西洋ワサビベルオキシダーゼと結合させたＭ ａ
ｂ Ｓ ｌ、１とのインキュベーションによす証明した
。Ｈ，ポリモルファからの部分精製細胞抽出物はこの試
験で陽性の結果を与えたが、Ｓ．セレビシエＲＩＴ４３
７６から精製した表面抗原粒子はこの試験において何の
反応も示さなかった。
Ｃ４，ｐＨ５Ａレセプターの検定
プレＳ２領域に存在するｐＨＳ Ａレセプターを検出す
るための検定はＰｏｎｔｉｓｓｏ ｅＬ ａｌ、（１９
８３）の方法に従って行った。
るための検定はＰｏｎｔｉｓｓｏ ｅＬ ａｌ、（１９
８３）の方法に従って行った。
重合ヒト血清アルブミンをマイクロタイタープレートの
ウェルに被覆し、Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｂ−
４３１からの部分精製細胞抽出物とインキュベートした
。洗浄して非結合物質を除いた後、プレートに捕獲され
た粒子を、＋２Ｊで標識したポリクローナル抗ＨＢ ｓ
Ａ ｇウザギ抗体（ＡＵＳＡＢキット）とインキュベ
ートすることにより検出した。Ｈ，ポリモルファからの
部分精製抽出物はこの試験で陽性反応を与えたが、Ｓ。
ウェルに被覆し、Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｂ−
４３１からの部分精製細胞抽出物とインキュベートした
。洗浄して非結合物質を除いた後、プレートに捕獲され
た粒子を、＋２Ｊで標識したポリクローナル抗ＨＢ ｓ
Ａ ｇウザギ抗体（ＡＵＳＡＢキット）とインキュベ
ートすることにより検出した。Ｈ，ポリモルファからの
部分精製抽出物はこの試験で陽性反応を与えたが、Ｓ。
セレビシェＲＩＴ４３７１３から精製したＨＢｓＡｇは
この試験において何の反応も示さなかった。
この試験において何の反応も示さなかった。
上記の結果は、Ｈ，ポリモルファからの部分精製抽出物
中に存在するＨＢｓＡｇ反応性物質がＨＢＶ表面抗原の
プレＳｌ、プレ５２およびＳ領域にあるエビドーグに対
して誘導されたＭａｂＪこより特異的に結合される抗原
部位を含み、さらにこの物質がｐＨ５Ａと反応する部位
を含むことを示している。
中に存在するＨＢｓＡｇ反応性物質がＨＢＶ表面抗原の
プレＳｌ、プレ５２およびＳ領域にあるエビドーグに対
して誘導されたＭａｂＪこより特異的に結合される抗原
部位を含み、さらにこの物質がｐＨ５Ａと反応する部位
を含むことを示している。
ｄ）複合粒子の免疫沈降
Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｂ−４３１からの部分
精製抽出物中に存在するＡＵＳＲＩＡ反応性物質が複合
粒子を含むかどうか調べるために、プレＳ■蛋白に特異
的なモノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った。
精製抽出物中に存在するＡＵＳＲＩＡ反応性物質が複合
粒子を含むかどうか調べるために、プレＳ■蛋白に特異
的なモノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った。
免疫複合体はモノクローナル抗体とスタフィロコッカス
・アウレウス（ＳＬａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ；５ｔａｐｈ Ａと略記する）Ｉｍ胞間のサンド
インチ抗体としてウザギ抗マウス血清を用いて、ホルマ
リン固定５ｔａｐｈ Ａ ＭｆＩ胞（Ｉｍｍｕｎｏｐｒ
ｅｃｉｐＨ，ｉｎ、 ｉＬ。
・アウレウス（ＳＬａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ；５ｔａｐｈ Ａと略記する）Ｉｍ胞間のサンド
インチ抗体としてウザギ抗マウス血清を用いて、ホルマ
リン固定５ｔａｐｈ Ａ ＭｆＩ胞（Ｉｍｍｕｎｏｐｒ
ｅｃｉｐＨ，ｉｎ、 ｉＬ。
ＧａｉＬｈｅｂｕｒ１）、 ＭＤ、 ＵＳＡ）により捕
獲された。５ＬａｐｈＡ細胞は供給者が推薦するように
予備処理を行い、最後にＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ中１
０％（ｗ／ｖ）で再懸濁した。その後、５Ｌａｐｈ Ａ
細胞（１０％Ｗ／Ｖ懸濁体１２０μＩ）はウザギ抗マウ
ス血清（ＲＡＭ）２０μｍと室温で２時間インキュベー
トした。５ｔａｐｈ Ａ −ＲＡＭ複合体を遠心により
集め、０．１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰ
ＢＳで２回洗い、最後にＯ，１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅ
ｎ ２０を含むＰＢＳ中約１０％（ｗ／ｖ）で再懸濁し
た。
獲された。５ＬａｐｈＡ細胞は供給者が推薦するように
予備処理を行い、最後にＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ中１
０％（ｗ／ｖ）で再懸濁した。その後、５Ｌａｐｈ Ａ
細胞（１０％Ｗ／Ｖ懸濁体１２０μＩ）はウザギ抗マウ
ス血清（ＲＡＭ）２０μｍと室温で２時間インキュベー
トした。５ｔａｐｈ Ａ −ＲＡＭ複合体を遠心により
集め、０．１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰ
ＢＳで２回洗い、最後にＯ，１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅ
ｎ ２０を含むＰＢＳ中約１０％（ｗ／ｖ）で再懸濁し
た。
上記のようにして得られたＨ、ポリモルファ株プレＳ／
５−Ｂ−４３１の粒子の部分精製調製物に、および酵母
由来のＳ蛋白ＨＢｓＡｇ粒子（ロットＨＢ１９３、Ｓｍ
１ｔｈ Ｋ１１ｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ。
５−Ｂ−４３１の粒子の部分精製調製物に、および酵母
由来のＳ蛋白ＨＢｓＡｇ粒子（ロットＨＢ１９３、Ｓｍ
１ｔｈ Ｋ１１ｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ。
Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、 Ｂｅｌｇｉｕｍ）の試料に（両
方とも５００μｌ中にＡＵＳｔＡ反応性物質２μｇを含
む）、１μｍのＩＶａｂＳｌ、ｌ （６３８１１ｇ？ｆ
ｉ白／ｍ１）を加え、この混合物を室温で２時間インキ
ュベ卜した。その後２０μｍの５Ｌａｐｈ Ａ −ＲＡ
Ｍ複合体を加え、インキスベーションを４°Ｃで一晩続
けた。形成された免疫複合体を遠心により集め、０゜１
％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで５回、
ＰＢＳで１回洗い、その後ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動のために同一緩衝液中に最終ペレントを懸濁
した。免疫沈降物はＨＢ ｓ Ａ ｇ蛋白種検出用のマ
ウス・モノクローナル抗体ＲＦ６（Ｈ。
方とも５００μｌ中にＡＵＳｔＡ反応性物質２μｇを含
む）、１μｍのＩＶａｂＳｌ、ｌ （６３８１１ｇ？ｆ
ｉ白／ｍ１）を加え、この混合物を室温で２時間インキ
ュベ卜した。その後２０μｍの５Ｌａｐｈ Ａ −ＲＡ
Ｍ複合体を加え、インキスベーションを４°Ｃで一晩続
けた。形成された免疫複合体を遠心により集め、０゜１
％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで５回、
ＰＢＳで１回洗い、その後ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動のために同一緩衝液中に最終ペレントを懸濁
した。免疫沈降物はＨＢ ｓ Ａ ｇ蛋白種検出用のマ
ウス・モノクローナル抗体ＲＦ６（Ｈ。
Ｔｈｏｍａｓ、 Ｒｏｙａｌ Ｆｒｅｅ ＩＩｏｓｐｉ
Ｌａｌ、 Ｌｏｎｄｏｎ）を用いてイムノブロッティン
グにより分析した。モノクローナル抗体ＲＦ６は血漿由
来ＨＢ ｓ Ａ ｇの変性および還元抵抗エピト−プに
対して誘導され、結合実験でモノクローナルＨ１３Ｓ
ｌと競合する。
Ｌａｌ、 Ｌｏｎｄｏｎ）を用いてイムノブロッティン
グにより分析した。モノクローナル抗体ＲＦ６は血漿由
来ＨＢ ｓ Ａ ｇの変性および還元抵抗エピト−プに
対して誘導され、結合実験でモノクローナルＨ１３Ｓ
ｌと競合する。
イムノプロットにより、Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５
−Ｂ−４３１粒子から得られた免疫沈降物はプレＳ１蛋
白ばかりでなくＳ蛋白も含むが、サツカロミセス由来Ｈ
Ｂ ｓ Ａ ｇからの免疫沈降物はＳ蛋白を含まないこ
とが判明した。
−Ｂ−４３１粒子から得られた免疫沈降物はプレＳ１蛋
白ばかりでなくＳ蛋白も含むが、サツカロミセス由来Ｈ
Ｂ ｓ Ａ ｇからの免疫沈降物はＳ蛋白を含まないこ
とが判明した。
このことは、混合ポリペプチド組成の複合粒子がＨ，ポ
リモルファ株プレＳ／５−Ｂ−４３１細胞抽出物から部
分精製された物質中に存在することを確信させる。
リモルファ株プレＳ／５−Ｂ−４３１細胞抽出物から部
分精製された物質中に存在することを確信させる。
ｅ）電子顕微鏡
Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｂ−４３１からの部分
精製粒子は電子顕微鏡で観察した。物質は０．１％（Ｗ
／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含む２０ｍＭ）リスーＭＣ
Ｉ緩衝液ｐＨ８，２で希釈し、セロイジンのフィルムで
覆った銅／ロジウム格子上に７沈降させ、その後酢酸ウ
ラニルで染色した。電子顕微鏡による観察は平均直径２
７ｎｍの回転楕Ｆ３＃ないし球形の粒子の存在を示した
。この大きさはＳ．セレビシエ株ＲＩＴ４３７６（Ｐｅ
ｔｅｒ、Ｊ、 ｅｔ ａｌ、 ＰｏｓＬｇｒａｄ、Ｍｅ
ｄｉｃａｌ ５ｕｐｐ１．２゜７３−８１．１９８７）
から精製した一連のＨＢｓＡｇｉＩＩＭ製物を同一技法
で測定したときの平均粒径の範囲内である。
精製粒子は電子顕微鏡で観察した。物質は０．１％（Ｗ
／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含む２０ｍＭ）リスーＭＣ
Ｉ緩衝液ｐＨ８，２で希釈し、セロイジンのフィルムで
覆った銅／ロジウム格子上に７沈降させ、その後酢酸ウ
ラニルで染色した。電子顕微鏡による観察は平均直径２
７ｎｍの回転楕Ｆ３＃ないし球形の粒子の存在を示した
。この大きさはＳ．セレビシエ株ＲＩＴ４３７６（Ｐｅ
ｔｅｒ、Ｊ、 ｅｔ ａｌ、 ＰｏｓＬｇｒａｄ、Ｍｅ
ｄｉｃａｌ ５ｕｐｐ１．２゜７３−８１．１９８７）
から精製した一連のＨＢｓＡｇｉＩＩＭ製物を同一技法
で測定したときの平均粒径の範囲内である。
実施例り、 ５
５、Ｈ，ポリモル７７およびＳ．セレビシエにより発現
された複合粒子の比較 Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｃ−４５３８よびＳ．
セレビシエ株Ｙｌ］０８の培養物は「物質Ｊ５ｄに示し
たＳ−培地で増殖させた。Ｙｌ１０８ａはＴｙベクター
によりゲノムに組込まれた発現力セラ１−からプレＳ■
とＳ−蛋白の両方を発現するＳ．セレビシエの二倍体株
である。この株は５〜７コピーのプレＳ１発現カセット
および３〜４コピーのＳ−発現カセットを含み、増殖の
ためにトリブトファンを必要とする。この種の発現カセ
ットの構築お上びＴｙベクターによる染色体への組込み
は、Ｓｍ１ｔｈＫＩｉｎｅ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｐｏ
ｒａｔｉｏｎに譲渡された１９８８年１２月３０日付け
の係属中の米国特許出願第０７／２９２２０２号に開示
されている。Ｈ，ポリモルファの増殖のために炭素源と
して１．５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを使用した。培
地４００ ｍ ｌを入れた一連の２Ｑエルレンマイヤ−
７ラスコにＨ，ポリモル７７株プレＳ／’５−Ｃ−４５
３を接種し、グリセロールの枯渇まで振とう器上３０’
Ｏで約３３時間インキュベートした。３個のフラスコか
ら細胞を遠心により収穫し、細胞ペレットは次の処理ま
で一７０°Ｃ＋６８ で保存した。別の６個のフラスコの各々から培地１００
ｍ１を取り出し、４％（ｗ／ｖ）メタノールを含む新鮮
培地１００ｍ１と取り替えた。その後インキスベーショ
ンを続けた。
された複合粒子の比較 Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｃ−４５３８よびＳ．
セレビシエ株Ｙｌ］０８の培養物は「物質Ｊ５ｄに示し
たＳ−培地で増殖させた。Ｙｌ１０８ａはＴｙベクター
によりゲノムに組込まれた発現力セラ１−からプレＳ■
とＳ−蛋白の両方を発現するＳ．セレビシエの二倍体株
である。この株は５〜７コピーのプレＳ１発現カセット
および３〜４コピーのＳ−発現カセットを含み、増殖の
ためにトリブトファンを必要とする。この種の発現カセ
ットの構築お上びＴｙベクターによる染色体への組込み
は、Ｓｍ１ｔｈＫＩｉｎｅ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｐｏ
ｒａｔｉｏｎに譲渡された１９８８年１２月３０日付け
の係属中の米国特許出願第０７／２９２２０２号に開示
されている。Ｈ，ポリモルファの増殖のために炭素源と
して１．５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを使用した。培
地４００ ｍ ｌを入れた一連の２Ｑエルレンマイヤ−
７ラスコにＨ，ポリモル７７株プレＳ／’５−Ｃ−４５
３を接種し、グリセロールの枯渇まで振とう器上３０’
Ｏで約３３時間インキュベートした。３個のフラスコか
ら細胞を遠心により収穫し、細胞ペレットは次の処理ま
で一７０°Ｃ＋６８ で保存した。別の６個のフラスコの各々から培地１００
ｍ１を取り出し、４％（ｗ／ｖ）メタノールを含む新鮮
培地１００ｍ１と取り替えた。その後インキスベーショ
ンを続けた。
３つの培養物はさらにメタノールの存在下１４時間イン
キュベーション後遠心により収穫し、別の３つの培養物
は３８時間インキュベーション後収穫した。細胞は遠心
により回収し、細胞ペレットは次の処理まで−７０００
で保存した。
キュベーション後遠心により収穫し、別の３つの培養物
は３８時間インキュベーション後収穫した。細胞は遠心
により回収し、細胞ペレットは次の処理まで−７０００
で保存した。
第二の実験において、Ｓ．セレビシエ株Ｙｌ１０８の培
養物は上記のように増殖させ、１９，５時間インキュベ
ーション後収穫した。Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−
Ｃ−４５３の培養物も上記のように増殖させた。ただし
細胞はグリセロール培地で２６時間増殖後と、メタノー
ル含有培地で４５時間増殖後に収穫した。
養物は上記のように増殖させ、１９，５時間インキュベ
ーション後収穫した。Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−
Ｃ−４５３の培養物も上記のように増殖させた。ただし
細胞はグリセロール培地で２６時間増殖後と、メタノー
ル含有培地で４５時間増殖後に収穫した。
ハンセヌラ・ポリモルファの細胞ペレットは、０．５％
（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０．２ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ
Ｔ Ａ １４ｍＭ ＰＭＳＦ （フェニルメチルスルホ
ニルフルオリド）、５％（Ｗ／Ｖ）イングロパノールお
」：６９ び５０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ９，０を含む緩衝
液１容量あたり約２５％の湿潤細胞ペレット重量の濃度
で浮遊させ、この混合物１０ｍ１を７レンチプレスを使
って２００００ｐｓ ｉで６回通過させることにより細
胞を破壊した。その後、粗製細胞抽出物は４°０．］、
７０００Ｘｇで４５分遠心して澄明化し、上溝を回収し
た。Ｓ．セレビシエの細胞ペレットも同様に処理したが
、細胞は上記緩衝液ｌ容量あたり約５０％湿潤細胞ペレ
ッ１−重量の濃度で浮遊させた。
（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０．２ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ
Ｔ Ａ １４ｍＭ ＰＭＳＦ （フェニルメチルスルホ
ニルフルオリド）、５％（Ｗ／Ｖ）イングロパノールお
」：６９ び５０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ９，０を含む緩衝
液１容量あたり約２５％の湿潤細胞ペレット重量の濃度
で浮遊させ、この混合物１０ｍ１を７レンチプレスを使
って２００００ｐｓ ｉで６回通過させることにより細
胞を破壊した。その後、粗製細胞抽出物は４°０．］、
７０００Ｘｇで４５分遠心して澄明化し、上溝を回収し
た。Ｓ．セレビシエの細胞ペレットも同様に処理したが
、細胞は上記緩衝液ｌ容量あたり約５０％湿潤細胞ペレ
ッ１−重量の濃度で浮遊させた。
それぞれの上清の蛋白含量はＬｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ、
（１９５１）の方法で測定した。澄明化した細胞抽出物
はＡＵＳＲｒＡによりＨＢｓＡｇを、モしてＥＬＩＳＡ
によりプレ３１蛋白エピトープの存在を検定した。モノ
クローナルＳ １． １． ＥＬ Ｔ ＳＡ検定は次の
ように行った。プラスチックプレート（ＮｕｎｃＩｍｍ
ｕｎｏｐｌａｔｅ ］、 Ｇｉｂｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ、
Ｇｈｅｎｔ、 Ｂｅｌｇｉｕｍ）のウェルに５０ｍＭ
炭酸水素すトリウム緩衝液ｐＨ９，６中のＳｌ、］マウ
ス・モノクローナル抗体を３７°Ｃで２時間かけて被覆
し、その後抗体溶液を取り除いた。ウェルは１％（ｗ／
ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ溶液と３７°Ｃで
１時間インキュベートすることによりブロックした。Ｐ
ＢＳを用いて細胞抽出物の段階的２倍希釈液を調製し、
その後０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンをウェル
に加え、３７°Ｃで１時間インキコベトした。
（１９５１）の方法で測定した。澄明化した細胞抽出物
はＡＵＳＲｒＡによりＨＢｓＡｇを、モしてＥＬＩＳＡ
によりプレ３１蛋白エピトープの存在を検定した。モノ
クローナルＳ １． １． ＥＬ Ｔ ＳＡ検定は次の
ように行った。プラスチックプレート（ＮｕｎｃＩｍｍ
ｕｎｏｐｌａｔｅ ］、 Ｇｉｂｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ、
Ｇｈｅｎｔ、 Ｂｅｌｇｉｕｍ）のウェルに５０ｍＭ
炭酸水素すトリウム緩衝液ｐＨ９，６中のＳｌ、］マウ
ス・モノクローナル抗体を３７°Ｃで２時間かけて被覆
し、その後抗体溶液を取り除いた。ウェルは１％（ｗ／
ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ溶液と３７°Ｃで
１時間インキュベートすることによりブロックした。Ｐ
ＢＳを用いて細胞抽出物の段階的２倍希釈液を調製し、
その後０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンをウェル
に加え、３７°Ｃで１時間インキコベトした。
その後、ウェルは０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣＩ。
０．０５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗った
。抗原の捕獲はＷｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｎａｋａｎｅ
（１９７８）の方法により西洋ワサビペルオキシダーゼ
に結合させたモノクローナル抗体Ｓ１．Ｉとインキュベ
ートすることにより確認した。
。抗原の捕獲はＷｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｎａｋａｎｅ
（１９７８）の方法により西洋ワサビペルオキシダーゼ
に結合させたモノクローナル抗体Ｓ１．Ｉとインキュベ
ートすることにより確認した。
ＰＢＳ、０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン中の結
合抗体は各ウェルに加え、３７°Ｃで１時間インキュベ
ートした。第二抗体の結合は０−フェニレンジアミン（
Ｓｉｇｍａ） ４ ｍ ｇｓ ｌ Ｏｍ ｌのＯｌＬ
Ｍ ＫＨｚＰＯｔ ｐＨ６，０に溶解した過酸化水素１
５μｍを含む溶液１００μｍを加え、室温で１５分イン
キュベートすることにより確認した。この反応をＩ Ｎ
Ｈ２ｓ Ｏｔ ２５μｍの添加により停止させ、Ｉｎ
ｔｅｒｍｅｄ Ｉｍｍｏｎｏｒｅａｄｅｒ、 ＮＪ２０
０ （Ａｎａｌｉｓ。
合抗体は各ウェルに加え、３７°Ｃで１時間インキュベ
ートした。第二抗体の結合は０−フェニレンジアミン（
Ｓｉｇｍａ） ４ ｍ ｇｓ ｌ Ｏｍ ｌのＯｌＬ
Ｍ ＫＨｚＰＯｔ ｐＨ６，０に溶解した過酸化水素１
５μｍを含む溶液１００μｍを加え、室温で１５分イン
キュベートすることにより確認した。この反応をＩ Ｎ
Ｈ２ｓ Ｏｔ ２５μｍの添加により停止させ、Ｉｎ
ｔｅｒｍｅｄ Ｉｍｍｏｎｏｒｅａｄｅｒ、 ＮＪ２０
０ （Ａｎａｌｉｓ。
Ｇｈｅｎｔ、 Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使って光学密度を４
９０ｎｍ（基準フィルターの場合は６２０ｎｍ）で読み
取った。結果は得られた光学密度曲線の直線部分から算
出し、光学密度単位１ｍｇ蛋白として表した。
９０ｎｍ（基準フィルターの場合は６２０ｎｍ）で読み
取った。結果は得られた光学密度曲線の直線部分から算
出し、光学密度単位１ｍｇ蛋白として表した。
２つの実験からＳ．セレビシエおよびＨ，ポリモルファ
の細胞抽出物において測定されたＡＵＳＲＩＡ反応性Ｈ
Ｂ ｓ Ａ ｇおよびプレＳ１−蛋白の量は表４および
５に示す。Ｓ．セレビシエ株Ｙ１１０８の粗製抽出物中
に存在するＡＵ、５ＲＩＡ反応性物質の量は、メタノー
ルで３８〜４５時間誘導されたＨ、ポリモルファ株プレ
Ｓ／５−Ｃ−４５３の抽出物より約］００倍少ない。Ｅ
Ｌ Ｔ Ｓ Ａで検定したプレＳ−蛋白の量は約３〜
８倍少なく、このことはＳ．セレビシエ株ｙｌ１０８が
Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｃ−４５３よりも大き
い比率のプレＳ１対Ｓ−蛋白をもたらすことを示してい
る。
の細胞抽出物において測定されたＡＵＳＲＩＡ反応性Ｈ
Ｂ ｓ Ａ ｇおよびプレＳ１−蛋白の量は表４および
５に示す。Ｓ．セレビシエ株Ｙ１１０８の粗製抽出物中
に存在するＡＵ、５ＲＩＡ反応性物質の量は、メタノー
ルで３８〜４５時間誘導されたＨ、ポリモルファ株プレ
Ｓ／５−Ｃ−４５３の抽出物より約］００倍少ない。Ｅ
Ｌ Ｔ Ｓ Ａで検定したプレＳ−蛋白の量は約３〜
８倍少なく、このことはＳ．セレビシエ株ｙｌ１０８が
Ｈ，ポリモルファ株プレＳ／５−Ｃ−４５３よりも大き
い比率のプレＳ１対Ｓ−蛋白をもたらすことを示してい
る。
７２
麦（
粗製細胞抽出物のＡＵＳＲ■Ａ検定
細胞抽出物 フラスコ
番号
蛋白 ＨＢｓＡｇ（ＡＵＳＲＩＡ）％（ｍｇ／ｍ＋）
総蛋白 プレＳ１−蛋白 ＥＬＩＳＡ、○Ｄ単位 ／ｍｇ蛋白 Ｓ．セレビシエ ａ ｌＩＯ３ １６，２０，０１１ １８，００，００８ １２，００，０１０ ＋１．ポリモル フアジーＳ／Ｓ Ｃ−４５３ グリセロール 培地 ■〕 ６．８ ０．０７７ ７．４ ０．＋２３ ９．２ ０．１４３ メタノール 誘導 ５．５ １，１５ ７．０ １．４０ ７３ 或旦 和製細胞抽出物のＡＵＳＲＩＡ検検 定細胞用出物フラスコ 番号 蛋白 １１１１ｓＡｇ（ＡＵＳＲＩＡ）％（ｍｇ／ｍ
１） 総蛋白 プレＳｌ−蛋白 ＥＬＩＳＡ、 ＯＤ単位 ／ｍｇ蛋白 Ｓ．セレビシエ ａ Ｙ］Ｉ０８ ＋３．３ ０．００９ １５．０ ０．０１５ １７．１ ０．０１３ Ｈ，ポリモル フアジーＳ／Ｓ Ｃ−４５３ グリセロール 培地 １〕 ８．４ ０．０７０ ８．２ ０．０６＋ ７．９ ０．０８２ メタノール 誘導 １〕 ６．３ １．＋０６ ６．５ １．３１４ これらの結果は、第一実験からの抽出物を、対照として
の４５４株および４４８−Ｃ４株のメタノール誘導培養
物の抽出物と一緒にイムノプロットすることにより確か
めた。
総蛋白 プレＳ１−蛋白 ＥＬＩＳＡ、○Ｄ単位 ／ｍｇ蛋白 Ｓ．セレビシエ ａ ｌＩＯ３ １６，２０，０１１ １８，００，００８ １２，００，０１０ ＋１．ポリモル フアジーＳ／Ｓ Ｃ−４５３ グリセロール 培地 ■〕 ６．８ ０．０７７ ７．４ ０．＋２３ ９．２ ０．１４３ メタノール 誘導 ５．５ １，１５ ７．０ １．４０ ７３ 或旦 和製細胞抽出物のＡＵＳＲＩＡ検検 定細胞用出物フラスコ 番号 蛋白 １１１１ｓＡｇ（ＡＵＳＲＩＡ）％（ｍｇ／ｍ
１） 総蛋白 プレＳｌ−蛋白 ＥＬＩＳＡ、 ＯＤ単位 ／ｍｇ蛋白 Ｓ．セレビシエ ａ Ｙ］Ｉ０８ ＋３．３ ０．００９ １５．０ ０．０１５ １７．１ ０．０１３ Ｈ，ポリモル フアジーＳ／Ｓ Ｃ−４５３ グリセロール 培地 １〕 ８．４ ０．０７０ ８．２ ０．０６＋ ７．９ ０．０８２ メタノール 誘導 １〕 ６．３ １．＋０６ ６．５ １．３１４ これらの結果は、第一実験からの抽出物を、対照として
の４５４株および４４８−Ｃ４株のメタノール誘導培養
物の抽出物と一緒にイムノプロットすることにより確か
めた。
蛋白１５μｇを含む試料はＬａｅｍｍｌｉ （１９７］
）の方法により１２．５％分離用、５％積層用ゲル上で
電気泳動し、「物質および方法Ｊ５ａで述べたように検
出用のモノクローナルＨＢＳ］を使ってイムノブロッ］
・シた。
）の方法により１２．５％分離用、５％積層用ゲル上で
電気泳動し、「物質および方法Ｊ５ａで述べたように検
出用のモノクローナルＨＢＳ］を使ってイムノブロッ］
・シた。
株プレＳ／５−Ｃ−４５３からの抽出物は、Ｓ蛋白と関
係のある２４ｋＤに強い反応性バンドを示□し、さらに
プレＳ−蛋白と関係のある３８３９ ｋ Ｄにもバンド
を示した。４５ｋＤバンドはかろうじて検出可能である
。対照的に、Ｓ．セレビシエ株Ｙｌ］０８からの抽出物
は２４ ｋＤト／１５ｋＤに弱いバンドを示した。プレ
Ｓ−蛋白の３８−３９ｋＤ二重バンドはわずかに検出で
きた。
係のある２４ｋＤに強い反応性バンドを示□し、さらに
プレＳ−蛋白と関係のある３８３９ ｋ Ｄにもバンド
を示した。４５ｋＤバンドはかろうじて検出可能である
。対照的に、Ｓ．セレビシエ株Ｙｌ］０８からの抽出物
は２４ ｋＤト／１５ｋＤに弱いバンドを示した。プレ
Ｓ−蛋白の３８−３９ｋＤ二重バンドはわずかに検出で
きた。
イムノブロッティングの結果は、Ｓ．セレビシエがメタ
ノール誘導Ｈ，ポリモルファより少ないＳおよびプレＳ
−蛋白を発現し、Ｓ．セレビシエにより発現されるプレ
Ｓ−蛋白は主としてグリコシル化された４ ５ ｋ Ｄ
形態であることを確信させる。
ノール誘導Ｈ，ポリモルファより少ないＳおよびプレＳ
−蛋白を発現し、Ｓ．セレビシエにより発現されるプレ
Ｓ−蛋白は主としてグリコシル化された４ ５ ｋ Ｄ
形態であることを確信させる。
実施例り、６
Ｈ，ポリモルファによるプレＳ蛋白のミリストイル化
Ｌ Ｒ９株、４５２および４５３株の培養物は振とう７
ラスコ中の２．５％（Ｖ／Ｖ）グリセロール含有最少培
地で２４時間増殖させ、その後メタツル（１％、ｖ／ｖ
）を加えた。メタノール添加の６時間後、トリチウム標
識ミリスチン酸を加え、この培養物をさらに１６時間イ
ンキュベートした。
ラスコ中の２．５％（Ｖ／Ｖ）グリセロール含有最少培
地で２４時間増殖させ、その後メタツル（１％、ｖ／ｖ
）を加えた。メタノール添加の６時間後、トリチウム標
識ミリスチン酸を加え、この培養物をさらに１６時間イ
ンキュベートした。
細胞を集め、洗浄し、１％５ＤＳＢよびβ−メルカプト
エタノールの存在下にガラスピーズを使って破壊した。
エタノールの存在下にガラスピーズを使って破壊した。
抽出した蛋白は５ＤＳ−ＰＡＧＥＡル電気泳動により分
離し、モノクローナルＨＢＳ１を用いるイムノブロッテ
ィングおよびフルオログラフィーにより視覚化した。こ
れらの結果は、３８／３９ｋＤプレＳｌ蛋白に相当する
バンドか４５２および４５３株の抽出物では標識された
が、Ｌ Ｒ９からの抽出物では標識されないことを示し
７６ た。これはＮ末端メチオニンおにびポリペプチドの第二
位置のグリシン残基のミリス１−イル化の翻訳後除去と
一致する（Ｔｏｗｌｅｒ ａｎｄ ＧｏｒｄｏｎＩＡｎ
ｎ。
離し、モノクローナルＨＢＳ１を用いるイムノブロッテ
ィングおよびフルオログラフィーにより視覚化した。こ
れらの結果は、３８／３９ｋＤプレＳｌ蛋白に相当する
バンドか４５２および４５３株の抽出物では標識された
が、Ｌ Ｒ９からの抽出物では標識されないことを示し
７６ た。これはＮ末端メチオニンおにびポリペプチドの第二
位置のグリシン残基のミリス１−イル化の翻訳後除去と
一致する（Ｔｏｗｌｅｒ ａｎｄ ＧｏｒｄｏｎＩＡｎ
ｎ。
Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ５７：６９−９９．１９
８８）。
８８）。
実施例り、７
Ｈ，ポリモル７７由来のプレＳ抗原の免疫原性４５２お
よび４５４株のメタノール増殖培養物から粗製蛋白抽出
物を調製し、水酸化アルミニウムにｌ ｍ ｇ ／ ｍ
Ｉの最終濃度で吸着させた。それぞれの抽出物のプレ
Ｓ１エピトープ含量は、モノクローナル抗体５１．１お
よび標準としてＳ．セレビシエから部分精製したプレＳ
−蛋白を用いてＥＬ Ｉ ＳＡ検定により測定した。ま
た、５１．１モノクロ一ナル抗体６０ Ｑｌｌｌと５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ ４ Ｆａｓ
ｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ。
よび４５４株のメタノール増殖培養物から粗製蛋白抽出
物を調製し、水酸化アルミニウムにｌ ｍ ｇ ／ ｍ
Ｉの最終濃度で吸着させた。それぞれの抽出物のプレ
Ｓ１エピトープ含量は、モノクローナル抗体５１．１お
よび標準としてＳ．セレビシエから部分精製したプレＳ
−蛋白を用いてＥＬ Ｉ ＳＡ検定により測定した。ま
た、５１．１モノクロ一ナル抗体６０ Ｑｌｌｌと５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ ４ Ｆａｓ
ｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ。
Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、 Ｂｅｌｇｉｕｍから得られた）１
ｍ１とを４００で２時間インキュベー１・することによ
り注射用の免疫複合体を形成した。その後、この混合物
は遠心し、ＰＢＳで洗い、ペレットをＰＢＳ １ｍ中に
再懸濁した。この懸濁体２５０μｍをそれぞ＋７７ れの粗製細胞抽出物３．４ｍｌに加え、この混合物を２
０°Ｃで１時間インキュベートした。
ｍ１とを４００で２時間インキュベー１・することによ
り注射用の免疫複合体を形成した。その後、この混合物
は遠心し、ＰＢＳで洗い、ペレットをＰＢＳ １ｍ中に
再懸濁した。この懸濁体２５０μｍをそれぞ＋７７ れの粗製細胞抽出物３．４ｍｌに加え、この混合物を２
０°Ｃで１時間インキュベートした。
インキュベーション後、５ｅｐｈａｒｏｓｅ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ｃ／ＳＬ、１／粗製蛋白混合物を遠心し、ペレ
ットを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁した
。この物質の半量を水酸化アルミニウムに１ｍｇ ／
ｍ Ｉの最終濃度で吸着させた。
ｅｉｎ ｃ／ＳＬ、１／粗製蛋白混合物を遠心し、ペレ
ットを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁した
。この物質の半量を水酸化アルミニウムに１ｍｇ ／
ｍ Ｉの最終濃度で吸着させた。
１群５匹のＢａ１ｂ／ｃマウスに４種類の調製物を腹腔
内注射した。１力月後、マウスは４５３株のメタノール
増殖培養物からの水酸化アルミニウム吸着、部分精製粒
子ｌμｇの腹腔内追加免疫を受は取った。１５日後、マ
ウスの血液を採取した。
内注射した。１力月後、マウスは４５３株のメタノール
増殖培養物からの水酸化アルミニウム吸着、部分精製粒
子ｌμｇの腹腔内追加免疫を受は取った。１５日後、マ
ウスの血液を採取した。
血清中の抗Ｓ１抗プレＳ２および抗プレＳｌ抗体の力価
は以下で説明する方法で測定した。
は以下で説明する方法で測定した。
表６は幾何平均力価として表したＢａ１ｂ／ｃマウスに
より誘導されたそれぞれの抗体力価を示す。
より誘導されたそれぞれの抗体力価を示す。
これらの結果は、抗プレＳ抗体がプレＳ ］、 −５２
−３含有抽出物（４５４株）または複合粒子含有抽出物
（４５２株）を注射し、複合粒子（４５３株）で追加免
疫したときにマウスにより誘導されることを示している
。
−３含有抽出物（４５４株）または複合粒子含有抽出物
（４５２株）を注射し、複合粒子（４５３株）で追加免
疫したときにマウスにより誘導されることを示している
。
麦旦
抗原の１ｇ ＧＭＴ
（ａ）（ｂ） ｍｌＵ／ｍ
ＧＭＴ （ｃ）
ＧＭＴ （Ｃ）
ＧＭＴ （Ｃ）
４５４株
粗製
抽出物
免疫
沈降物
２２
５５
＋７７５５
１６
８８
１８
４０
９
１２
４００
４５２株
粗製
抽出物 ４８ １２４８０３ ４２６
５９ ＜１００免疫 店 （ａ）Ｓ．セレビシエからのプレ３１−３２−３抗原に
対して。
５９ ＜１００免疫 店 （ａ）Ｓ．セレビシエからのプレ３１−３２−３抗原に
対して。
（ｂ）すべてのマウスは３０日目に４５３株から部分精
製された粒子の追加免疫を受は取った。 。
製された粒子の追加免疫を受は取った。 。
（ｃ）力価は検定で１．０のＯＤを与える希釈率の逆数
として表される。
として表される。
実施例Ｅ、］
単一または混合亜型の修飾プレ５ｌ−５２−５（Ｌ＊）
およびＳ抗原の両方を含む複合粒子の発現 （１）Ｌ＊（ａｄ）コード配列の構築 ハンセヌラ発現ベクターｐＭＰＴ −］ ２１ （第
１１図）に直接挿入するのに適した修飾プレ５ＩＳ２−
８（Ｌ＊） コード配列は次のように構築した。以下で
述べるｐＲＩＴ］３１９２のプラスミドＤＮＡをＨｉ
ｎ ｄ ｍエンドヌクレアーゼで消化して線状断片を得
た。このＤＮＡ約ｌｎｇをオリゴヌクレオチドＢＣ７，
４およびＢＣ７５と混合し、ポリメラーゼ鎖反応（Ｐ
ＣＲ）増幅にかけた。
およびＳ抗原の両方を含む複合粒子の発現 （１）Ｌ＊（ａｄ）コード配列の構築 ハンセヌラ発現ベクターｐＭＰＴ −］ ２１ （第
１１図）に直接挿入するのに適した修飾プレ５ＩＳ２−
８（Ｌ＊） コード配列は次のように構築した。以下で
述べるｐＲＩＴ］３１９２のプラスミドＤＮＡをＨｉ
ｎ ｄ ｍエンドヌクレアーゼで消化して線状断片を得
た。このＤＮＡ約ｌｎｇをオリゴヌクレオチドＢＣ７，
４およびＢＣ７５と混合し、ポリメラーゼ鎖反応（Ｐ
ＣＲ）増幅にかけた。
ＰＣＲ技術はよく知られており、”ＰＣＲＰｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ、 Ａ ｇｌｌｉｄｅ ｔｏ ｍｅＬｈ
ｏｄｓ ａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 、 Ｉｎ
ｎｅｓ Ｍ、Ａ、 ａｔ ａｌ、（Ｅｄｓ、）Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ、、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ ＣＡに記載されている。
ｏｌｓ、 Ａ ｇｌｌｉｄｅ ｔｏ ｍｅＬｈ
ｏｄｓ ａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 、 Ｉｎ
ｎｅｓ Ｍ、Ａ、 ａｔ ａｌ、（Ｅｄｓ、）Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ、、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ ＣＡに記載されている。
オリゴヌクレオチドＢＣ７４８よびＢＣ７５は＋８０
以下に示す配列を有し、通常のホスホルアミダイト化学
ｌこより合皮された。
ｌこより合皮された。
ＢＣ７４５’ ＣＣＣＡＧＡ ＴＣＴ ＭＧ ＣＴＴ
ＡＴＴ ＡＡＡ ＴＧＴ ＡＴＡ ＣＣＣＡ ３ＢＣ７
５５’ ＣＣＣＧＭ ＴＴＣＡＡＡ ＡＴＧ ＧＧＧ
ＡＣＧ ＭＴ ＣＴＴ ＴＣＴ ３オリゴヌクレオチド
ＢＣ７４はＨｉｎｄｌＴおよびＢｇｌｌｌ［制限部位延
長部と共にｐＲＩＴｌｌＩ９２上のＬ＊コード配列の３
′末端に対し相同を有する。オリゴヌクレオチドＢＣ７
５は延長部としてのＥｃｏＲＩ部位およびＡＴＧコドン
の前の短いリーダー配列と共にｐＲＩＴ１３１９２上の
Ｌ＊コード配列の５′末端に対し相同を有する。
ＡＴＴ ＡＡＡ ＴＧＴ ＡＴＡ ＣＣＣＡ ３ＢＣ７
５５’ ＣＣＣＧＭ ＴＴＣＡＡＡ ＡＴＧ ＧＧＧ
ＡＣＧ ＭＴ ＣＴＴ ＴＣＴ ３オリゴヌクレオチド
ＢＣ７４はＨｉｎｄｌＴおよびＢｇｌｌｌ［制限部位延
長部と共にｐＲＩＴｌｌＩ９２上のＬ＊コード配列の３
′末端に対し相同を有する。オリゴヌクレオチドＢＣ７
５は延長部としてのＥｃｏＲＩ部位およびＡＴＧコドン
の前の短いリーダー配列と共にｐＲＩＴ１３１９２上の
Ｌ＊コード配列の５′末端に対し相同を有する。
約１ｎｇの鋳型ｐＲＪＴ１３１９２ＤＮＡは５０ｍＭＫ
ｃｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌｐＨ３゜３．１．５
ｍＭ ＭｇＣＩ□、０．０１％（ｖ／ｖ）ゼラチン、２
００μＭずつのｃｌＡＴＰ、ｄＣＴＰ。
ｃｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌｐＨ３゜３．１．５
ｍＭ ＭｇＣＩ□、０．０１％（ｖ／ｖ）ゼラチン、２
００μＭずつのｃｌＡＴＰ、ｄＣＴＰ。
ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１１Ｍずつのオリゴヌクレオ
チドブライマー、および２．５単位のＴａｑポリメラー
ゼと最終容量１００μｍにて市販のＤＮＡ増幅試薬（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＣｅＬｕ５からの８１ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット； Ｖａｎｄ
ｅｒ ｌ１ｅｙｄｅｎ。
チドブライマー、および２．５単位のＴａｑポリメラー
ゼと最終容量１００μｍにて市販のＤＮＡ増幅試薬（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＣｅＬｕ５からの８１ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット； Ｖａｎｄ
ｅｒ ｌ１ｅｙｄｅｎ。
Ｂｒｕｓｓｅｌｓから入手可能）を用いて混合した。こ
の混合物はＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ （
Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＣｅＬｕｓ； Ｖａｎｄｅｒ
Ｉ（ｅｙｄｅｎ、 Ｂｒｕｓｓｅｌｓから得られた）
を使って２５サイクルの変性（２分、９２°）、アニー
リング（２分、４８°）および伸長（２分、７２°）に
かけた。このようにして得られた１０ｇの修飾・増幅Ｌ
＊コード配列断片は同一条件で同じオリゴヌクレオチド
を用いて再増幅させ、エタノール沈澱により反応混合物
から精製した。
の混合物はＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ （
Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＣｅＬｕｓ； Ｖａｎｄｅｒ
Ｉ（ｅｙｄｅｎ、 Ｂｒｕｓｓｅｌｓから得られた）
を使って２５サイクルの変性（２分、９２°）、アニー
リング（２分、４８°）および伸長（２分、７２°）に
かけた。このようにして得られた１０ｇの修飾・増幅Ｌ
＊コード配列断片は同一条件で同じオリゴヌクレオチド
を用いて再増幅させ、エタノール沈澱により反応混合物
から精製した。
８７０ｂｐの改変Ｌ＊断片ＤＮＡの約２５００ｇのアリ
コートはＥｃｏＲＴおよびＢｇ ｌ Ｔｒエンドヌクレ
アーゼで消化し、ｐＢＲ３２７誘導体プラスミドである
ｐＲＩＴ１２５５５のＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ部位
間に部位−ン化してｐＲＩＴ１３４８８を得た。ｐＲＩ
Ｔ１２５５５はもとのプラスミドのＥｃｏＲＩとＣｌａ
Ｔ部位間へのリンカ−挿入により導入されたＢｇｌＴ［
部位を有するｐＢＲ３２７レプリコンから成る。
コートはＥｃｏＲＴおよびＢｇ ｌ Ｔｒエンドヌクレ
アーゼで消化し、ｐＢＲ３２７誘導体プラスミドである
ｐＲＩＴ１２５５５のＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ部位
間に部位−ン化してｐＲＩＴ１３４８８を得た。ｐＲＩ
Ｔ１２５５５はもとのプラスミドのＥｃｏＲＩとＣｌａ
Ｔ部位間へのリンカ−挿入により導入されたＢｇｌＴ［
部位を有するｐＢＲ３２７レプリコンから成る。
改変Ｌ＊断片の別のアリコートはＥｃｏＲＴとＢｇｌｌ
Ｔエンドヌクレアーゼで消化し、プラスミド、）ＭＰＴ
１２］（第１１図）のＥｃｏＲＴとＢｇｌｌＴ部位間に
部位−た。こうして、Ｌ＊コード配列は形質転換により
Ｈ，ポリモルファに導入するのに適した発現プラスミド
上のＭＯＸプロモーターとＭＯＸターミネータ−の間に
置かれる。得られたプラスミドｐＬ＊−１１のＤＮＡ塩
基配列決定により、Ｌ＊コード領域配列は正しいことが
分かった。
Ｔエンドヌクレアーゼで消化し、プラスミド、）ＭＰＴ
１２］（第１１図）のＥｃｏＲＴとＢｇｌｌＴ部位間に
部位−た。こうして、Ｌ＊コード配列は形質転換により
Ｈ，ポリモルファに導入するのに適した発現プラスミド
上のＭＯＸプロモーターとＭＯＸターミネータ−の間に
置かれる。得られたプラスミドｐＬ＊−１１のＤＮＡ塩
基配列決定により、Ｌ＊コード領域配列は正しいことが
分かった。
（２）Ｓ−（ａｙ）コード配列の構築
ｐＲＴＴＩ３４９０はｐＢＲ３２２にクローン化された
ａｙ亜型のＢ型肝炎ウィルスの完全ゲノムを含むｐＲＩ
Ｔ１０６０１から慣用の組換えＤＮＡ操作により得られ
た、完全プレ５２−Ｓコド配列を含むｐＢＲ３２２誘導
体プラスミドである。ｐ ＲＩ Ｔ ｌ ０６’Ｏｌは
１９８２年６月２日にアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）に受託番
号ＡＴＣＣ３９１３２として寄託された。
ａｙ亜型のＢ型肝炎ウィルスの完全ゲノムを含むｐＲＩ
Ｔ１０６０１から慣用の組換えＤＮＡ操作により得られ
た、完全プレ５２−Ｓコド配列を含むｐＢＲ３２２誘導
体プラスミドである。ｐ ＲＩ Ｔ ｌ ０６’Ｏｌは
１９８２年６月２日にアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）に受託番
号ＡＴＣＣ３９１３２として寄託された。
以下で説明する操作により、ｐ ＲＩ Ｔ １．３４９
０はｐＲＩＴ１０６０１または完全５−（ａｙ）コード
配列１を含む他のクローン化ＨＢＶ断片で置換されるこ
とが理解できるであろう。ｐＲＩＴ１３４９０のＤＮＡ
をＨｉｎｄｍ−１ンドヌクレアゼで消化してプラスミド
を線状となし、上記のオリゴヌクレオチドＢＣ７４およ
びオリゴヌクレオチドＢＣ７３（延長部としてのＥＣｏ
ＲＩ部位およびＡＴＧコドンの前の短いリーダー配列と
共にｐＲＩＴ１３４９０上のＳコード配列の５′末端に
対する相同を有する）と混合した。
０はｐＲＩＴ１０６０１または完全５−（ａｙ）コード
配列１を含む他のクローン化ＨＢＶ断片で置換されるこ
とが理解できるであろう。ｐＲＩＴ１３４９０のＤＮＡ
をＨｉｎｄｍ−１ンドヌクレアゼで消化してプラスミド
を線状となし、上記のオリゴヌクレオチドＢＣ７４およ
びオリゴヌクレオチドＢＣ７３（延長部としてのＥＣｏ
ＲＩ部位およびＡＴＧコドンの前の短いリーダー配列と
共にｐＲＩＴ１３４９０上のＳコード配列の５′末端に
対する相同を有する）と混合した。
ＢＣ７３５’ ＣＣＣＧＡＡ ＴＴＣＡＡＡ ＡＴＧ
ＧＡＧ ＡＡＣＡＴＣＡＣＡ ＴＣＡ ３Ｈｉ ｎ
ｄ ＩＩＩ処理ｐＲＩＴ１３４９０とオリゴヌクレオ
チドの混合物は上記のような２回のＰＣＲで増幅して、
ＥＣｏＲＩとＢｇｌＵ制限部位によりはさまれた７００
ｂｐの５−（ａｙ）コード配列を形成させた。この物質
約２５０μｇをＥＣｏＲＩとＢｇｌｌＴエンドヌクレア
ーゼで消化し、ｐＲＴＴ１２５５５のＥｃｏＲＴとＢｇ
ｌｌＴ部位間に部位−ン化してｐＲＩＴ１３４３８を得
た。ｐＲ８４ ＩＴ１３４３８上の５−（ａｙ）：ｌ−ド配列ノ正しさ
はＤＮＡ塩基配列決定により証明された。
ＧＡＧ ＡＡＣＡＴＣＡＣＡ ＴＣＡ ３Ｈｉ ｎ
ｄ ＩＩＩ処理ｐＲＩＴ１３４９０とオリゴヌクレオ
チドの混合物は上記のような２回のＰＣＲで増幅して、
ＥＣｏＲＩとＢｇｌＵ制限部位によりはさまれた７００
ｂｐの５−（ａｙ）コード配列を形成させた。この物質
約２５０μｇをＥＣｏＲＩとＢｇｌｌＴエンドヌクレア
ーゼで消化し、ｐＲＴＴ１２５５５のＥｃｏＲＴとＢｇ
ｌｌＴ部位間に部位−ン化してｐＲＩＴ１３４３８を得
た。ｐＲ８４ ＩＴ１３４３８上の５−（ａｙ）：ｌ−ド配列ノ正しさ
はＤＮＡ塩基配列決定により証明された。
（３）Ｌ＊ （ａｄ／ａｙ）コード配列の構築ｐＲＩＴ
１３４８８を構築するために使用したＰＣＲ増幅断片約
１ｎｇは、オリゴヌクレオチドＢＣ７５（上記）および
次の配列を有するＢｅ２Ｏの存在下に２回のＰＣＲ増幅
を行ってさらに増幅した。
１３４８８を構築するために使用したＰＣＲ増幅断片約
１ｎｇは、オリゴヌクレオチドＢＣ７５（上記）および
次の配列を有するＢｅ２Ｏの存在下に２回のＰＣＲ増幅
を行ってさらに増幅した。
Ｂｅ２Ｏ５’ ＡＣＧ ＡＧＴ ＣＴＡ ＧＡＣＴＣ
Ｔ ＧＣＧ ＧＴＡ ３ＢＣ３０はａｄ亜型のｐＲＴＴ
１０６１６ＨＢウィルスクローンから誘導されたＳコー
ド配列のＸｂａＩ部位付近の領域に相同である。−に記
の増幅から２８０ｂｐ断片を回収し、この約２５０ｎｇ
をＥｃｏＲＩとＸｂａｌエンドヌクレアーゼで消化した
。
Ｔ ＧＣＧ ＧＴＡ ３ＢＣ３０はａｄ亜型のｐＲＴＴ
１０６１６ＨＢウィルスクローンから誘導されたＳコー
ド配列のＸｂａＩ部位付近の領域に相同である。−に記
の増幅から２８０ｂｐ断片を回収し、この約２５０ｎｇ
をＥｃｏＲＩとＸｂａｌエンドヌクレアーゼで消化した
。
ｐＲＴＴ１３４３８を構築するために使用したＰＣＲ増
幅断片約１． ｎ ｇは、オリゴヌクレオチドＢＣ７４
（上記）および次の配列を有するＢＣｌ２の存在下に２
回のＰＣＲ増幅を行ってさらに増＋８５ 幅した。
幅断片約１． ｎ ｇは、オリゴヌクレオチドＢＣ７４
（上記）および次の配列を有するＢＣｌ２の存在下に２
回のＰＣＲ増幅を行ってさらに増＋８５ 幅した。
ＢＣｌ２ ５’ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＡＣＡＴＣＡＣ
Ａ ＴＣＡ ３ＢＣＩ２はｐＲｒＴｌｏｌｌｌｉｃｌ
ｌおよびｐＲＩＴ１０６Ｉ６にクローン化したＨＢウィ
ルスのＳコド配列の最初の６コドンに相同である。ＰＣ
Ｒ増幅後、約２５０ｎｇの７００ｂｐ断片をＸｂａｒと
ＢｇｌＨエンドヌクレアーゼで消化した。
Ａ ＴＣＡ ３ＢＣＩ２はｐＲｒＴｌｏｌｌｌｉｃｌ
ｌおよびｐＲＩＴ１０６Ｉ６にクローン化したＨＢウィ
ルスのＳコド配列の最初の６コドンに相同である。ＰＣ
Ｒ増幅後、約２５０ｎｇの７００ｂｐ断片をＸｂａｒと
ＢｇｌＨエンドヌクレアーゼで消化した。
その後、２つのエンドヌクレアーゼ消化・ＰＣＲ増幅断
片はｐＲＴＴ１２５５５のＥｃｏＲＩ・ＢｇｌｌＴ消化
ＤＮＡと連結させた。
片はｐＲＴＴ１２５５５のＥｃｏＲＩ・ＢｇｌｌＴ消化
ＤＮＡと連結させた。
ｐＲＩＴ１２５５５と、ｐＲＩＴ１３４８８の構築に使
用した断片のＰＣＲ増幅からのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断
片と、ｐ ＲＩ Ｔ ］、 ３４３８の構築に使用した
断片のＰ Ｃ’Ｒ増幅からのＸｂａＩ−ＢｇｌＨ断片と
、から成るプラスミドｐＲＩＴ１３４９１が回収された
。ｐＲＩＴ１３４９１上のＬ＊コード挿入物のＤＮＡ塩
基配列決定は、Ｓコド領域の５番目のアミノ酸に誤りが
導入されたことを示した。この誤りを正すためｌこ、上
記のＩ）ＲＩＴＪ３４８Ｂの構築に使用したＰＣＲ増幅
断片はＥｃｏＲＴとＸｂａｒエンドヌクレアーゼで消化
し、この誤りを含むｐＲＩＴ＋３４９１．Ｊ二のＥｃｏ
ＲＴ−Ｘｂａｒ断片と置換するために使用した。得られ
たプラスミドｐＲＩＴ１３４８９は″ハイブリッド″Ｌ
＊コード配列を含み、このコド配列のＡＴＧ開始コドン
からＸｂａｒ部位までの部分はａｄ亜型ウィルス配列か
ら誘導され、そしてＸｂａＩ部位から終結コドンまでの
部分はａｙ亜型ウィルス配列から誘導される。対応する
ポリペプチドはａｙ亜型をもつであろう。
用した断片のＰＣＲ増幅からのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断
片と、ｐ ＲＩ Ｔ ］、 ３４３８の構築に使用した
断片のＰ Ｃ’Ｒ増幅からのＸｂａＩ−ＢｇｌＨ断片と
、から成るプラスミドｐＲＩＴ１３４９１が回収された
。ｐＲＩＴ１３４９１上のＬ＊コード挿入物のＤＮＡ塩
基配列決定は、Ｓコド領域の５番目のアミノ酸に誤りが
導入されたことを示した。この誤りを正すためｌこ、上
記のＩ）ＲＩＴＪ３４８Ｂの構築に使用したＰＣＲ増幅
断片はＥｃｏＲＴとＸｂａｒエンドヌクレアーゼで消化
し、この誤りを含むｐＲＩＴ＋３４９１．Ｊ二のＥｃｏ
ＲＴ−Ｘｂａｒ断片と置換するために使用した。得られ
たプラスミドｐＲＩＴ１３４８９は″ハイブリッド″Ｌ
＊コード配列を含み、このコド配列のＡＴＧ開始コドン
からＸｂａｒ部位までの部分はａｄ亜型ウィルス配列か
ら誘導され、そしてＸｂａＩ部位から終結コドンまでの
部分はａｙ亜型ウィルス配列から誘導される。対応する
ポリペプチドはａｙ亜型をもつであろう。
ハイブリッドＬ＊（ａｄ−ａｙ）コード配列を含むｐＲ
ＩＴ１３４８９からのＥｃｏＲＩ−ＢｇＩＩＩ断片はそ
の後、プラスミドｐＭＰＴ−１２１上のＥｃｏＲＴおよ
びＢｇｌＴｒ部位間に部位上てＨ，ポリモルファ発現ベ
クターｐＬ＊１３を得た。
ＩＴ１３４８９からのＥｃｏＲＩ−ＢｇＩＩＩ断片はそ
の後、プラスミドｐＭＰＴ−１２１上のＥｃｏＲＴおよ
びＢｇｌＴｒ部位間に部位上てＨ，ポリモルファ発現ベ
クターｐＬ＊１３を得た。
（４）複合粒子を形成するための修飾プレ５ＩＳ２−５
（Ｌ＊）およびＳ抗原の両方のＨ，ポリモルファによる
発現 Ｌ＊およびＳの異なる発現比おにび異なる総発現レベル
により特徴づけられる数種類の株を構築した。これらの
差異はゲノムあたりの発現カセットのコピー数の変動に
より達成された。
（Ｌ＊）およびＳ抗原の両方のＨ，ポリモルファによる
発現 Ｌ＊およびＳの異なる発現比おにび異なる総発現レベル
により特徴づけられる数種類の株を構築した。これらの
差異はゲノムあたりの発現カセットのコピー数の変動に
より達成された。
Ｈ，ポリモル７７ＲＢ１０株はＬ＊（ａｄ）発現カセッ
トを保有するプラスミドｐＬ＊１１で上記のように形質
転換した。形質転換はゲノムに組込まれたいろいろな数
の発現カセットを含む数種類の株をもたらした。これら
の株のうち２つ、Ｌ ｌ ３／１およびＬ１９／ｌをさ
らに詳しく分析した。サザンプロット分析は、これらの
株が数コピーのＬ＊（ａｄ）−発現カセットを含むこと
を明らかにした。これらの株のＬ＊ （ａｄ）−発現レ
ベルは、モノクローナル抗体ＨＢｓ１を用いるウェスタ
ーンプロット分析により検定した。Ｌ＊抗原に対応する
３３ｋＤのバンドが検出された。
トを保有するプラスミドｐＬ＊１１で上記のように形質
転換した。形質転換はゲノムに組込まれたいろいろな数
の発現カセットを含む数種類の株をもたらした。これら
の株のうち２つ、Ｌ ｌ ３／１およびＬ１９／ｌをさ
らに詳しく分析した。サザンプロット分析は、これらの
株が数コピーのＬ＊（ａｄ）−発現カセットを含むこと
を明らかにした。これらの株のＬ＊ （ａｄ）−発現レ
ベルは、モノクローナル抗体ＨＢｓ１を用いるウェスタ
ーンプロット分析により検定した。Ｌ＊抗原に対応する
３３ｋＤのバンドが検出された。
発現レベルは、細胞をグリセロール培地で増殖させ、次
にメタノールを添加した場合に、全細胞蛋白の約０．５
〜２％であると概算された。
にメタノールを添加した場合に、全細胞蛋白の約０．５
〜２％であると概算された。
Ｌ＊（ａｄ）−発現様は、ＭＯＸプロモーターの支配下
に５（ａｄ）−遺伝子を保有するプラスミドｐＲＢ−３
−３２２で再度形質転換した。ｐＲＢ−５−３２２は上
で述べた通りである（第７図参照）。形質転換マーカー
としてゲンタマイシン耐性が用いられた。安定した組込
み体は上記方法を使って得られた。得られた株のうち２
つ、ＬＭＳ９／ｌおよびＬＭＳ２６／２株（両方とも受
容株ＬＬ３／１から誘導された）をさらに詳しく研究し
た。ザザンプロット分析は、これらの株が数コピーのＬ
＊（ａｄ）発現カセットと数コピーの５（ａｄ）発現カ
セットを保有することを明らかにした。
に５（ａｄ）−遺伝子を保有するプラスミドｐＲＢ−３
−３２２で再度形質転換した。ｐＲＢ−５−３２２は上
で述べた通りである（第７図参照）。形質転換マーカー
としてゲンタマイシン耐性が用いられた。安定した組込
み体は上記方法を使って得られた。得られた株のうち２
つ、ＬＭＳ９／ｌおよびＬＭＳ２６／２株（両方とも受
容株ＬＬ３／１から誘導された）をさらに詳しく研究し
た。ザザンプロット分析は、これらの株が数コピーのＬ
＊（ａｄ）発現カセットと数コピーの５（ａｄ）発現カ
セットを保有することを明らかにした。
Ｈ，ポリモルファ形質転換体によるＬ＊およびＳ抗原の
発現は、上記のようなモノクローナル抗体ＨＢＳＩおよ
びＳｌ、、ｌを用いるウェスターンブロッティングによ
り試験した。Ｌ＊対対抗抗原異なる比を発現するいろい
ろな株が得られた。ＨＢＳＩ抗体はＳ抗原に対応する２
４ｋＤ！白を検出し、そして３０および３３ ｋ Ｄバ
ンドはＬ＊抗原に対応する。プレＳ１領域に特異的なＳ
］、１抗体は３３ｋＤバンドと３０ｋＤバンドを生じさ
只ｑ せる。Ｌ＊／Ｓ比はＬＭＳ９／］株の場合が約１：Ｌ
ＬＭＳ２６／２株の場合が約１：１０であると概算され
た。発現レベルは、細胞をメタツルでの誘導条件下で増
殖させた場合、全細胞蛋白の約５〜６％であると概算さ
れた。
発現は、上記のようなモノクローナル抗体ＨＢＳＩおよ
びＳｌ、、ｌを用いるウェスターンブロッティングによ
り試験した。Ｌ＊対対抗抗原異なる比を発現するいろい
ろな株が得られた。ＨＢＳＩ抗体はＳ抗原に対応する２
４ｋＤ！白を検出し、そして３０および３３ ｋ Ｄバ
ンドはＬ＊抗原に対応する。プレＳ１領域に特異的なＳ
］、１抗体は３３ｋＤバンドと３０ｋＤバンドを生じさ
只ｑ せる。Ｌ＊／Ｓ比はＬＭＳ９／］株の場合が約１：Ｌ
ＬＭＳ２６／２株の場合が約１：１０であると概算され
た。発現レベルは、細胞をメタツルでの誘導条件下で増
殖させた場合、全細胞蛋白の約５〜６％であると概算さ
れた。
グリコシル化の研究は３３ｋＤ蛋白がＬ＊抗原のグリコ
シル化形態を表すことを示した。ＬＭＳ９／１およびＬ
ＭＳ２６／２株からの粗製蛋白抽出物をエンドグリコシ
ダーゼ■（とインキュベートしたとき、３３ｋＤバンド
は見掛は分子量３０ｋＤに移動した。３０ ｋ ＤはＬ
＊抗原の予想された分子量である。従って、Ｈ，ポリモ
ルファにより生産されたＬ＊抗原の一部は″コア″−グ
リコシル化されるが、残りの部分はＬ＊の非グリコシル
化形態を構成する。
シル化形態を表すことを示した。ＬＭＳ９／１およびＬ
ＭＳ２６／２株からの粗製蛋白抽出物をエンドグリコシ
ダーゼ■（とインキュベートしたとき、３３ｋＤバンド
は見掛は分子量３０ｋＤに移動した。３０ ｋ ＤはＬ
＊抗原の予想された分子量である。従って、Ｈ，ポリモ
ルファにより生産されたＬ＊抗原の一部は″コア″−グ
リコシル化されるが、残りの部分はＬ＊の非グリコシル
化形態を構成する。
粒子形成を調べるために、ＬＭＳ９／１株からの粗製細
胞抽出物はＣｓＣＩ密度勾配遠心にかけた。勾配画分は
抗体Ｔ（Ｂ Ｓ ］を用いるイムノブロッティングによ
り分析した。２４ｋＤ Ｓ抗原と３０および３３ｋＤ
Ｌ＊抗原形態を含むＨＢｓＡｇ反応性物質のピークは１
．１８ｇ／ｃｍ３の密度に観察された。この結果は、ｒ
、＊およびＳポリペプチドを同時発現するＨ、ポリモル
ファ株により複合粒子が形成されたことを示している。
胞抽出物はＣｓＣＩ密度勾配遠心にかけた。勾配画分は
抗体Ｔ（Ｂ Ｓ ］を用いるイムノブロッティングによ
り分析した。２４ｋＤ Ｓ抗原と３０および３３ｋＤ
Ｌ＊抗原形態を含むＨＢｓＡｇ反応性物質のピークは１
．１８ｇ／ｃｍ３の密度に観察された。この結果は、ｒ
、＊およびＳポリペプチドを同時発現するＨ、ポリモル
ファ株により複合粒子が形成されたことを示している。
本発明の別の形態では、Ｌ＊およびＳ蛋白を同時発現す
るＨ、ポリモル７７株は上記の４１５株を形質転換する
ことにより得られた。４１５株はＭＯＸプロモーターの
支配下に５０〜１００個の５（ａｄ）発現カセットを保
有し、Ｓ抗原の高発現レベルにより特徴づけられる。
るＨ、ポリモル７７株は上記の４１５株を形質転換する
ことにより得られた。４１５株はＭＯＸプロモーターの
支配下に５０〜１００個の５（ａｄ）発現カセットを保
有し、Ｓ抗原の高発現レベルにより特徴づけられる。
カナマイシン耐性遺伝子を含むＬ＊（ａｄ）発現ベクタ
ーが構築された。ＨＡ ＲＳ配列およびＡＤＨＩプロモ
ーターの支配下にカナマイシン耐性遺伝子をコードする
３、５ｋｂＮｒｕＴ断片をプラスミドｐＨＫ２（第６図
）から単離した。プラスミドｐＬ＊１１をＮｒｕＴおよ
び５ａｌＩ−ｒ−ンドヌクレアーゼで消化し、Ｋｌｅｎ
ｏｗ ＤＮＡポリメラーゼで修復して平滑末端化した。
ーが構築された。ＨＡ ＲＳ配列およびＡＤＨＩプロモ
ーターの支配下にカナマイシン耐性遺伝子をコードする
３、５ｋｂＮｒｕＴ断片をプラスミドｐＨＫ２（第６図
）から単離した。プラスミドｐＬ＊１１をＮｒｕＴおよ
び５ａｌＩ−ｒ−ンドヌクレアーゼで消化し、Ｋｌｅｎ
ｏｗ ＤＮＡポリメラーゼで修復して平滑末端化した。
Ｎ ｒ ｕ Ｉ ／５ａｌＴ消化はｐＬ＊］ｌベクター
からト丁ＡＲ３配列を除いた。その後、ｐＨＫ２からの
ＮｒｕＴ断片をｐＬ＊ｌｌベクターの平滑末端化大型Ｎ
ｒｕＩ−３ａｌｌ断片に連結させ、こうしてカナマイシ
ン耐性遺伝子を導入し、除去されたＨＡＲ５配列を再導
入した。得られたプラスミドはカナマイシン耐性遺伝子
カセットの方向に応じてｐＫＬ＊１またはｐＫＬ＊１０
と呼ばれる。ｐＫＬ＊１の構造を第１２図に示す。これ
らのプラスミドは「方法」で上述したように形質転換お
よびゲンタマイシン耐性による選択によりＨ，ポリモル
ファに導入することができる。
からト丁ＡＲ３配列を除いた。その後、ｐＨＫ２からの
ＮｒｕＴ断片をｐＬ＊ｌｌベクターの平滑末端化大型Ｎ
ｒｕＩ−３ａｌｌ断片に連結させ、こうしてカナマイシ
ン耐性遺伝子を導入し、除去されたＨＡＲ５配列を再導
入した。得られたプラスミドはカナマイシン耐性遺伝子
カセットの方向に応じてｐＫＬ＊１またはｐＫＬ＊１０
と呼ばれる。ｐＫＬ＊１の構造を第１２図に示す。これ
らのプラスミドは「方法」で上述したように形質転換お
よびゲンタマイシン耐性による選択によりＨ，ポリモル
ファに導入することができる。
４１５株はＬ＊ （ａｄ）発現カセットを保有するｐＫ
Ｌ＊ｌおよびｐ Ｋ Ｔ−＊ ｌ Ｏで形質転換し、ゲ
ンタマイシン耐性について選択した後安定した形質転換
体を得た。数種の株をさらに分析した。
Ｌ＊ｌおよびｐ Ｋ Ｔ−＊ ｌ Ｏで形質転換し、ゲ
ンタマイシン耐性について選択した後安定した形質転換
体を得た。数種の株をさらに分析した。
抗体ＨＢ Ｓ １を用いるウェスターンプロット分析は
、Ｓ抗原に対応する２４ｋＤ蛋白およびそれぞれＬ＊抗
原の非グリコシル化およびグリコシル化形態に対応する
３０および３３ｋＤバンドを示した。これらの４１５誘
導株において、Ｌ＊／Ｓ比はＬＭＳＯ５−１４−１株の
場合の約１＝１から９２ ＬＭＳ０５−１２−１の場合の約１＝２０までの間で変
化した。メタノール誘導条件下で増殖させた株では、Ｌ
＊／Ｓ抗原の発現レベルは全細胞蛋白の約５〜６％に達
した。ｐＫＬ＊ｌで形質転換した株とｐ Ｋ Ｌ ＊
ｌ Ｏで形質転換した株には差異が全く観察されなかっ
た。
、Ｓ抗原に対応する２４ｋＤ蛋白およびそれぞれＬ＊抗
原の非グリコシル化およびグリコシル化形態に対応する
３０および３３ｋＤバンドを示した。これらの４１５誘
導株において、Ｌ＊／Ｓ比はＬＭＳＯ５−１４−１株の
場合の約１＝１から９２ ＬＭＳ０５−１２−１の場合の約１＝２０までの間で変
化した。メタノール誘導条件下で増殖させた株では、Ｌ
＊／Ｓ抗原の発現レベルは全細胞蛋白の約５〜６％に達
した。ｐＫＬ＊ｌで形質転換した株とｐ Ｋ Ｌ ＊
ｌ Ｏで形質転換した株には差異が全く観察されなかっ
た。
（５）混合亜型の複合粒子へ導くＬ＊およびＳ抗原の同
時発現 混合（ａｄ／ａｙ）亜型のＬ＊／Ｓ粒子を生産するＨ、
ポリモルファ株を得るために、Ｌ＊（ａｄ ／ ａ ｙ
）発現カセットを保有するプラスミドｐＬ＊１３でＨ
，ポリモルファＲ８１０株を形質転換した。
時発現 混合（ａｄ／ａｙ）亜型のＬ＊／Ｓ粒子を生産するＨ、
ポリモルファ株を得るために、Ｌ＊（ａｄ ／ ａ ｙ
）発現カセットを保有するプラスミドｐＬ＊１３でＨ
，ポリモルファＲ８１０株を形質転換した。
Ｌ＊抗原を発現する安定したクローンを作製し、５（ａ
ｄ）発現カセットを保有するプラスミドｐＲＢ−３−３
２２で形質転換して、ゲンタマイシン耐性について選択
することができる。２回目の形質転換からの安定した株
はウェスターンブロッティングおよびＡＵＳＲＴＡ検定
により分析して、Ｌ＊（ａｄ／ａｙ）および５（ａｄ）
抗原のそれ＋９３ ぞれの発現レベル並びに表面抗原の総発現レベルを求め
る。
ｄ）発現カセットを保有するプラスミドｐＲＢ−３−３
２２で形質転換して、ゲンタマイシン耐性について選択
することができる。２回目の形質転換からの安定した株
はウェスターンブロッティングおよびＡＵＳＲＴＡ検定
により分析して、Ｌ＊（ａｄ／ａｙ）および５（ａｄ）
抗原のそれ＋９３ ぞれの発現レベル並びに表面抗原の総発現レベルを求め
る。
また、５（ａｃｔ）蛋白を発現する４１５株は、機能的
なゲンタマイシン耐性マーカーを含むｐｒ−＊１３の誘
導体で再形質転換し、ａｄとａｙ亜型の両方の特異性を
有する複合粒子の形をしたＬ＊（ａｄ／ａｙ）および５
（ａｄ）ポリペプチドを発現する安定した形質転換体を
形成させることもできる。
なゲンタマイシン耐性マーカーを含むｐｒ−＊１３の誘
導体で再形質転換し、ａｄとａｙ亜型の両方の特異性を
有する複合粒子の形をしたＬ＊（ａｄ／ａｙ）および５
（ａｄ）ポリペプチドを発現する安定した形質転換体を
形成させることもできる。
実施例Ｆ、 １
プラスミドｐＲＩＴ１２９７９の構築の概要を第１３お
よび１４図に示す。第１３図は、△Ｇｌｙ１３ Ｌ蛋
白発現力セラ］・を含む大腸菌プラスミドを構築するた
めの諸工程を示す。第１４図は、△Ｇｌｙ１３ Ｌ蛋
白を発現しうる酵母シラスミドＩＩ）ＲＩＴ１２９７９
を得るための手順を例示する。
よび１４図に示す。第１３図は、△Ｇｌｙ１３ Ｌ蛋
白発現力セラ］・を含む大腸菌プラスミドを構築するた
めの諸工程を示す。第１４図は、△Ｇｌｙ１３ Ｌ蛋
白を発現しうる酵母シラスミドＩＩ）ＲＩＴ１２９７９
を得るための手順を例示する。
Ｇ］ｙ１３残基は表Ａで表されるＬ蛋白コード配列の第
二コドンによりコードされることか理解される。
二コドンによりコードされることか理解される。
この構築のための出発物質は、ＢａｍＨＩ、Ｓｍａｒ、
ＥｃｏＲＩリンカ−により分離された、Ｔ Ｄ Ｈ３プ
ロモーター領域およびＡｒ１Ｇ３転写終結領域［Ｃａｂ
ｅｚｏｎ ｅＬ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ鈷、 ８１：６５９４〜６５９８ （
１９８４）］を含むｐＢＲ３２７の誘導体、グラスミド
ｐ ＲＩ Ｔ ］、 ］誘８６３である。
ＥｃｏＲＩリンカ−により分離された、Ｔ Ｄ Ｈ３プ
ロモーター領域およびＡｒ１Ｇ３転写終結領域［Ｃａｂ
ｅｚｏｎ ｅＬ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ鈷、 ８１：６５９４〜６５９８ （
１９８４）］を含むｐＢＲ３２７の誘導体、グラスミド
ｐ ＲＩ Ｔ ］、 ］誘８６３である。
Ｂｇｌｌ［部位を含むリンカ−をＴＤＨ３プロモーター
配列の上流に配置する。ｐＢＲ３２７は５ｏｂｅｒｏｎ
ｅｔ ａｌ、 Ｇｅｎｅ、 ９：２８７−３０５ （
１９８０）に記載されており、Ｆ、Ｂｏｌｉｖａｒ （
国立メキシコ大学、分子生物学部）から得られた。この
プラスミドは係属中の米国特許出願第００９３２５号に
記載の通りに回収される。
配列の上流に配置する。ｐＢＲ３２７は５ｏｂｅｒｏｎ
ｅｔ ａｌ、 Ｇｅｎｅ、 ９：２８７−３０５ （
１９８０）に記載されており、Ｆ、Ｂｏｌｉｖａｒ （
国立メキシコ大学、分子生物学部）から得られた。この
プラスミドは係属中の米国特許出願第００９３２５号に
記載の通りに回収される。
非ミリスチル化り蛋白のための発現カセットはｐＲＩＴ
１２８６３のリンカ−領域内に構築される。
１２８６３のリンカ−領域内に構築される。
ｐ Ａ Ｓ １ ［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ
、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ。
、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ。
度：］１２３−１６４（１９８３）］から誘導された大
腸菌プラスミドである、プラスミドｐＲｒＴ１２８１６
はＮｃｏＴ部位（Ｌ蛋白コード配列中のコドン位置１２
のＡＴＧと重なる）と停止コドンを越えるＥｃｏＲＩ部
位ではさまれた大型ＨＢＶ（ａｄｗ血清型）蛋白のコー
ド領域を保有する。このプラスミドは慣用の組換えＤＮ
Ａ技術により構築される［Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅＬ
ａ＋、上記文献参照］。
腸菌プラスミドである、プラスミドｐＲｒＴ１２８１６
はＮｃｏＴ部位（Ｌ蛋白コード配列中のコドン位置１２
のＡＴＧと重なる）と停止コドンを越えるＥｃｏＲＩ部
位ではさまれた大型ＨＢＶ（ａｄｗ血清型）蛋白のコー
ド領域を保有する。このプラスミドは慣用の組換えＤＮ
Ａ技術により構築される［Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅＬ
ａ＋、上記文献参照］。
プラスミドｐＲＩＴ１２８１６はＢｓｔＸＩとＥｃｏＲ
Ｉで消化し、プレＳｌ領域のＮ末端部分をコードする３
Ｑ４ｂｐ ＢｓｔＸＩ−ＥｃｏＲ■断片を回収し、次
の合成ＢａｍＨＴ−ＢｓｔＸＩアダプターに連結する： Ｂａｍ１（工 ＸｂａＩ
ＢｓｔＸＩＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＧ
ＡＣＧ ＭＴ ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＣＣＡＡ
ＣＣＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧ ＴＴＡ ＴＡＡ ＡＧＡ
ＣＭ ＧＧＧ ＴＴ。
Ｉで消化し、プレＳｌ領域のＮ末端部分をコードする３
Ｑ４ｂｐ ＢｓｔＸＩ−ＥｃｏＲ■断片を回収し、次
の合成ＢａｍＨＴ−ＢｓｔＸＩアダプターに連結する： Ｂａｍ１（工 ＸｂａＩ
ＢｓｔＸＩＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＧ
ＡＣＧ ＭＴ ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＣＣＡＡ
ＣＣＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧ ＴＴＡ ＴＡＡ ＡＧＡ
ＣＭ ＧＧＧ ＴＴ。
この断片は、予めＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ酵素で消化し
たｐｔＴ１２８６３に挿入して、プラスミドｐＲＩＴ２
２９９６を得る。ＢａｍＨＴ −ＢｓｔＸＴ合成アダプ
ターはＮ末端プレＳ１領域を９６ 含むが、ＴＤＨ３プロモーターのＡＴＧ残基に置かれた
ＢａｍＨＴ部位に正しいリーディング・フレームを与え
ない。正しいリーディング・７レムはｐＲＩＴ１２９９
６をＢａｍＨＴとＸｂａＴで消化し、続いてヤエナリ（
ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）の酵素で処理して突出する延長部
を除き、連結することにより得られる。この方法はプラ
スミドｐＲＩＴ１２９９７をもたらした。
たｐｔＴ１２８６３に挿入して、プラスミドｐＲＩＴ２
２９９６を得る。ＢａｍＨＴ −ＢｓｔＸＴ合成アダプ
ターはＮ末端プレＳ１領域を９６ 含むが、ＴＤＨ３プロモーターのＡＴＧ残基に置かれた
ＢａｍＨＴ部位に正しいリーディング・フレームを与え
ない。正しいリーディング・７レムはｐＲＩＴ１２９９
６をＢａｍＨＴとＸｂａＴで消化し、続いてヤエナリ（
ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）の酵素で処理して突出する延長部
を除き、連結することにより得られる。この方法はプラ
スミドｐＲＩＴ１２９９７をもたらした。
最後に、ｐ ＲＩ Ｔ １２８ ］、 ６からの８３９
ｂｐＥｃｏＲＩ断片は、△Ｇｌｙ Ｌ蛋白の完全なコ
ード配列を回復するために、ｐＲＩＴ１２９９７のＥｃ
ｏＲｒ部位に正しい方向で挿入した。得らレタプラスミ
ドｐＲｒＴ１２９９８ＬＬＧＩｙ１３が欠失されてミリ
ストイルトランスフェラーゼの基質になり得ないＬ蛋白
をコードする発現カセットを含んでいる。
ｂｐＥｃｏＲＩ断片は、△Ｇｌｙ Ｌ蛋白の完全なコ
ード配列を回復するために、ｐＲＩＴ１２９９７のＥｃ
ｏＲｒ部位に正しい方向で挿入した。得らレタプラスミ
ドｐＲｒＴ１２９９８ＬＬＧＩｙ１３が欠失されてミリ
ストイルトランスフェラーゼの基質になり得ないＬ蛋白
をコードする発現カセットを含んでいる。
ΔＧｌｙ Ｌ蛋白を発現しうる酵母プラスミドを構築
するために、プラスミドｐＲＩＴ１２９９８はＢｇｌｌ
［および５ａｌＩで消化した。発現カセットを含む５８
２２ｂｐ ＢｇｌＴＩ−３ａｌＩ］９７ 断片を精製し、通常の酵母ベクターｐＲＩＴ］ ２７４
１（Ａｍｐｌ′遺伝子、２μ配列、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｌ−
プリコンおよびＬＥＵ２酵母選択マーカーを供給するｐ
ＢＲ３２７誘導体である）に挿入した。
するために、プラスミドｐＲＩＴ１２９９８はＢｇｌｌ
［および５ａｌＩで消化した。発現カセットを含む５８
２２ｂｐ ＢｇｌＴＩ−３ａｌＩ］９７ 断片を精製し、通常の酵母ベクターｐＲＩＴ］ ２７４
１（Ａｍｐｌ′遺伝子、２μ配列、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｌ−
プリコンおよびＬＥＵ２酵母選択マーカーを供給するｐ
ＢＲ３２７誘導体である）に挿入した。
得られたグラスミドｐＲＩＴ１２９７９を用いて、ＴＣ
Ｙ ｌまたはＹ４８２と呼ばれるＬＥＵＳ．セレビシエ
株１０Ｓ４４Ｃｉ ｒ （ｐｅｐ４３、Ｉｅｕ２−３
．１ｅｕ２−１．１２）（米国メリーランド州ロックヒ
ル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
受託番号ＡＴＣＣ２０８１８として寄託）を形質転換し
た。形質転換後、得られたＬ Ｅ Ｕ＋酵母株はＹ７２
０と呼ばれる。
Ｙ ｌまたはＹ４８２と呼ばれるＬＥＵＳ．セレビシエ
株１０Ｓ４４Ｃｉ ｒ （ｐｅｐ４３、Ｉｅｕ２−３
．１ｅｕ２−１．１２）（米国メリーランド州ロックヒ
ル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
受託番号ＡＴＣＣ２０８１８として寄託）を形質転換し
た。形質転換後、得られたＬ Ｅ Ｕ＋酵母株はＹ７２
０と呼ばれる。
実施例Ｆ、２
△Ｇｒｙ Ｌ蛋白とＬ蛋白の比較特性決定実施例Ｆ、
］の酵母７７２０株は、Ｌ蛋白を発現する酵母７５８７
株（ｐＲＩＴ１２８４５で形質転換したＴＣＹＩ）と比
較して、△ＧＩｙＬ蛋白の発現について調べた。ｐＲＩ
Ｔ１２８４５はＨＢＶ ＤＮＡ由来のＬ蛋白の３８９ア
ミノ酸のコード配列と、その５′側の１０５０ｂｐ
ＴＤＩ〜１３プロモーター断片（Ｌ蛋白コード配列はこ
のブロモ−ターの支配下にある）と、その３′側のＡＲ
Ｇ３転写ターミネータ−を保有する１１５０ｂｐ断片と
、から成る３３７０ｂｐ発現力セントを含む。ｐＲＩＴ
１２８４５は係属中の米国特許出願第００９３２５号の
実施例１６Ａに詳しく記載されている。ｐＲＩＴ↓２７
４１で形質転換されたＴＣＹｌである酵母Ｙ ］、 ０
１７株は陰性対照として役立つ。
］の酵母７７２０株は、Ｌ蛋白を発現する酵母７５８７
株（ｐＲＩＴ１２８４５で形質転換したＴＣＹＩ）と比
較して、△ＧＩｙＬ蛋白の発現について調べた。ｐＲＩ
Ｔ１２８４５はＨＢＶ ＤＮＡ由来のＬ蛋白の３８９ア
ミノ酸のコード配列と、その５′側の１０５０ｂｐ
ＴＤＩ〜１３プロモーター断片（Ｌ蛋白コード配列はこ
のブロモ−ターの支配下にある）と、その３′側のＡＲ
Ｇ３転写ターミネータ−を保有する１１５０ｂｐ断片と
、から成る３３７０ｂｐ発現力セントを含む。ｐＲＩＴ
１２８４５は係属中の米国特許出願第００９３２５号の
実施例１６Ａに詳しく記載されている。ｐＲＩＴ↓２７
４１で形質転換されたＴＣＹｌである酵母Ｙ ］、 ０
１７株は陰性対照として役立つ。
Ａ、ミリスチル化
Ｙ７２０、Ｙ５８７およびＹ１０１７からの細胞は係属
中の米国特許出願第００９３２５号に記載されるように
３Ｈ−ミリスチン酸で標識した。
中の米国特許出願第００９３２５号に記載されるように
３Ｈ−ミリスチン酸で標識した。
これらの細胞の５ＤＳ−抽出物はＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、その後のイム
ノプロットおよびフルオログラフィ［例えば、Ｔｏｗｌ
ｅｒ ａｎｄ Ｇｌａｓｅｒ、 Ｐｒｏｃ、ＮａＬＩ。
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、その後のイム
ノプロットおよびフルオログラフィ［例えば、Ｔｏｗｌ
ｅｒ ａｎｄ Ｇｌａｓｅｒ、 Ｐｒｏｃ、ＮａＬＩ。
係属中の米国特許出願第００９３２５号に記載されるよ
うなイムノプロットは、Ｓ−特異的モツクローナル抗体
（Ｍａ ｂ） 、Ｍａ ｂ ＲＦ ６ ［Ｈ。
うなイムノプロットは、Ｓ−特異的モツクローナル抗体
（Ｍａ ｂ） 、Ｍａ ｂ ＲＦ ６ ［Ｈ。
Ｔｈｏｍａｓ、 Ｒｏｙａｌ Ｆｒｅｅ Ｈｏ５ｐｉｔ
ａｌ、 Ｌｏｎｄｏｎ］ またはＭ ａ ｂ ＨＢ ｓ
ｌ ［Ｓｍ１ｔｈＫＩｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓｌのいずれかによる検出を伴う。これらの抗体はＳ蛋
白における重複する変性および還元抵抗エピドブを認識
する。イムノプロットはＹ７２０とＹ５８７の両方にお
いて３８ｋＤと４５ｋＤのＬ蛋白の２つの形態の発現を
明らかにした。
ａｌ、 Ｌｏｎｄｏｎ］ またはＭ ａ ｂ ＨＢ ｓ
ｌ ［Ｓｍ１ｔｈＫＩｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓｌのいずれかによる検出を伴う。これらの抗体はＳ蛋
白における重複する変性および還元抵抗エピドブを認識
する。イムノプロットはＹ７２０とＹ５８７の両方にお
いて３８ｋＤと４５ｋＤのＬ蛋白の２つの形態の発現を
明らかにした。
フルオログラフは、係属中の米国特許出願第００９３２
５号に記載されるように、Ｙ５８７細胞から誘導された
３８ｋＤ Ｌ蛋白に３Ｈ標識が存在することを示した
。これから誘導された４５ｋＤＬ蛋白にも少量の標識が
観測された。対照的に、Ｙ７２０細胞から誘導された３
８ｋＤおよび４５ｋＤ △Ｇｒｙ Ｌ蛋白はどちらも
標識を取り込んでいなかった。このことは、ｐＲＩＴ１
２９７９においてグリシンコドンが除かれたことにより
、Ｓ．セレビシエによるΔＧｌｙ Ｌ蛋白のミリス０
０ チル化が阻止されたことを立証している。
５号に記載されるように、Ｙ５８７細胞から誘導された
３８ｋＤ Ｌ蛋白に３Ｈ標識が存在することを示した
。これから誘導された４５ｋＤＬ蛋白にも少量の標識が
観測された。対照的に、Ｙ７２０細胞から誘導された３
８ｋＤおよび４５ｋＤ △Ｇｒｙ Ｌ蛋白はどちらも
標識を取り込んでいなかった。このことは、ｐＲＩＴ１
２９７９においてグリシンコドンが除かれたことにより
、Ｓ．セレビシエによるΔＧｌｙ Ｌ蛋白のミリス０
０ チル化が阻止されたことを立証している。
Ｂ１発現レベル
Ｙ７２０．Ｙ５８７およびＹ１０］７からの細胞はエル
レンマイヤーフラスコに入れた２％グルコースを含むア
ミノ酸不含Ｙ Ｎ Ｂ ［Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｓｌで同
一条件下に増殖させた。全破壊細胞と粗製抽出物は共に
係属中の米国特許出願第００９３２５号に記載されるよ
うな定量的イムノプロットにより分析した。
レンマイヤーフラスコに入れた２％グルコースを含むア
ミノ酸不含Ｙ Ｎ Ｂ ［Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｓｌで同
一条件下に増殖させた。全破壊細胞と粗製抽出物は共に
係属中の米国特許出願第００９３２５号に記載されるよ
うな定量的イムノプロットにより分析した。
試料の２倍段階的希釈物が分析され、免疫検出はＳ−特
異的ＭａｂＲＦ６またはＨＢｓｌ、もしくはプレＳ１−
特異的上ノクローナル抗体Ｓｌ。
異的ＭａｂＲＦ６またはＨＢｓｌ、もしくはプレＳ１−
特異的上ノクローナル抗体Ｓｌ。
１ ［Ｓｍ１ＬｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓｌ に基づいていた。
ｓｌ に基づいていた。
イムノプロットはミリスチル化り蛋白（Ｙ５８７）より
も△Ｇｌｙ Ｌ蛋白（Ｙ７２０）の発現レベルの方が
２〜５倍高いことを示した。抽出効率は非ミリスチル化
蛋白とミリスチル化蛋白とではほぼ等しいように思われ
た。４５ｋＤグリコシル化形態で存在す゛るＬ蛋白の割
合はミリスチル化の排除により変化しなかった。
も△Ｇｌｙ Ｌ蛋白（Ｙ７２０）の発現レベルの方が
２〜５倍高いことを示した。抽出効率は非ミリスチル化
蛋白とミリスチル化蛋白とではほぼ等しいように思われ
た。４５ｋＤグリコシル化形態で存在す゛るＬ蛋白の割
合はミリスチル化の排除により変化しなかった。
０１
Ｃ，リポ蛋白構造
Ｙ７２０およびＹ５８７細胞からの粗製抽出物はＣｓＣ
Ｉ平衡遠心にかけた。勾配画分はイムノプロット、ＡＵ
ＳＲＩＡ検定［ＡｂｂｏｔＬ Ｌａｂｓｌ、ＭＡｂＳｌ
、］を用いるプレＳｌエピトープに特異的なＥＬ ｒ
ＳＡ検定により分析した。ＭＡ ｂ ３１．１はマイク
ロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎ。
Ｉ平衡遠心にかけた。勾配画分はイムノプロット、ＡＵ
ＳＲＩＡ検定［ＡｂｂｏｔＬ Ｌａｂｓｌ、ＭＡｂＳｌ
、］を用いるプレＳｌエピトープに特異的なＥＬ ｒ
ＳＡ検定により分析した。ＭＡ ｂ ３１．１はマイク
ロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎ。
ｐｌａｔｅ Ｉ； Ｇｉｂｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ）のウェ
ルに被覆し、被験試料とインキュベートした。洗浄して
非結合物質を除いた後、Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｎａｋ
ａｎｅ （１９７８）の方法［“１ｍｍｕｎｏｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅ１ａｔｅｄＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ 、 Ｗ、Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ、、ｅｄ
ｓ、、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。
ルに被覆し、被験試料とインキュベートした。洗浄して
非結合物質を除いた後、Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｎａｋ
ａｎｅ （１９７８）の方法［“１ｍｍｕｎｏｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅ１ａｔｅｄＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ 、 Ｗ、Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ、、ｅｄ
ｓ、、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９７８）］ を用いて、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合させたＭａｂＳｌ、、１と
インキスペードすることにより反応性粒子の捕獲を証明
した。第二抗体の結合を示す発色は色素原として０フエ
ニレンジアミンを用いて行った。吸光度はＩｎｔｅｒｍ
ｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｄｅｒ、ＮＪ２０００ ［Ａ
ｎａｌｉｓ、 Ｇｈｅｎｔ。
サビペルオキシダーゼに結合させたＭａｂＳｌ、、１と
インキスペードすることにより反応性粒子の捕獲を証明
した。第二抗体の結合を示す発色は色素原として０フエ
ニレンジアミンを用いて行った。吸光度はＩｎｔｅｒｍ
ｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｄｅｒ、ＮＪ２０００ ［Ａ
ｎａｌｉｓ、 Ｇｈｅｎｔ。
Ｂｅｌｇｉｕｍ］ を使って４９０ ｎ ｍ （基準フ
ィルターは６２０ｎｍ）で読み取った。
ィルターは６２０ｎｍ）で読み取った。
抗原およびイムノプロットのプロフィールは同様であっ
た。△ＧＩｙ Ｌおよび野生型り蛋白は両方とも約１．
．２５ｇ／ｃｍρの密度にバンドを形成し、これはミリ
スチル化および非ミリスチル化蛋白が共に粗製細胞抽出
物中でリポ蛋白構造として存在することを示している。
た。△ＧＩｙ Ｌおよび野生型り蛋白は両方とも約１．
．２５ｇ／ｃｍρの密度にバンドを形成し、これはミリ
スチル化および非ミリスチル化蛋白が共に粗製細胞抽出
物中でリポ蛋白構造として存在することを示している。
ＣｓＣＩ平衡勾配精製した物質のショ糖勾配速度遠心は
、リポ蛋白構造を含むミリスチル化および非ミリスヂル
化り蛋白の同様の沈降挙動を示し、これらのリポ蛋白構
造が似通った物理的パラメーターを有することを明らか
にした。
、リポ蛋白構造を含むミリスチル化および非ミリスヂル
化り蛋白の同様の沈降挙動を示し、これらのリポ蛋白構
造が似通った物理的パラメーターを有することを明らか
にした。
実施例Ｆ、３
２つの酵母ベクター：すなわち、ミリスチル化修飾り蛋
白（Ｌ＊）の発現をコードするｐＲＩＴｌ、 ３ ］
９２および非ミリスチル化修飾り蛋白（△ＧｌｙＬ＊）
の発現をコードするｐＲＩＴ１３１９３、の構築の概要
は第１１および１６図に示しである。
白（Ｌ＊）の発現をコードするｐＲＩＴｌ、 ３ ］
９２および非ミリスチル化修飾り蛋白（△ＧｌｙＬ＊）
の発現をコードするｐＲＩＴ１３１９３、の構築の概要
は第１１および１６図に示しである。
ｐＲｒＴ１０６１６ （ＡＴＣＣ３９１３］として寄託
）をＢｇｌｌＴで消化し、最大の断片を予めＢａｍＨＴ
で消化しておいたｐＡＣＹＣＬ ７７レプリコン［Ｃｈ
ａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、 １３４：１１４１（１９７８）］に連結した。得
られた中間体プラスミドはＥｃｏＲｒで消化し、再連結
して、不完全なＨＢ Ｖゲノム（ｐＡｃＹｃ１８４ベク
ターが切除された）を保有するｐＲＩＴｌ ０６３３を
得た。
）をＢｇｌｌＴで消化し、最大の断片を予めＢａｍＨＴ
で消化しておいたｐＡＣＹＣＬ ７７レプリコン［Ｃｈ
ａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、 １３４：１１４１（１９７８）］に連結した。得
られた中間体プラスミドはＥｃｏＲｒで消化し、再連結
して、不完全なＨＢ Ｖゲノム（ｐＡｃＹｃ１８４ベク
ターが切除された）を保有するｐＲＩＴｌ ０６３３を
得た。
プラスミドｐＲＩＴ１２３３１は、ｐＵＣ９［Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ、Ｕ、に、ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅａ、 Ｓ
ｗｅｄｅｎｌのＨｌｎｄｌｆｆおよびＥｃｏＲＴ制限部
位に挿入された、６８１ｂｐ ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲｒ
断片（５コ一ド配列と、ＡＴＧコドンと重なるＮｃｏ１
部位と、停止コドンに隣接してそれを越えるＥｃｏＲ１
部位を含む）に正しい方向で融合されたｐＲＴＴｌｏ
７７９ ［Ｃａｂｅｚｏｎ ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ。
ｓｈａｍ、Ｕ、に、ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅａ、 Ｓ
ｗｅｄｅｎｌのＨｌｎｄｌｆｆおよびＥｃｏＲＴ制限部
位に挿入された、６８１ｂｐ ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲｒ
断片（５コ一ド配列と、ＡＴＧコドンと重なるＮｃｏ１
部位と、停止コドンに隣接してそれを越えるＥｃｏＲ１
部位を含む）に正しい方向で融合されたｐＲＴＴｌｏ
７７９ ［Ｃａｂｅｚｏｎ ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ。
ＵＳＡ、 ８１：６５９４−６５９８ （１９８４）］
由来の１５００ｂｐＨｉｎｄｎＴ−ＮｃｏＴ ＡＲ
Ｇ３プロモーター断０断 片０４むｐＵＣ９誘導体である。
由来の１５００ｂｐＨｉｎｄｎＴ−ＮｃｏＴ ＡＲ
Ｇ３プロモーター断０断 片０４むｐＵＣ９誘導体である。
ｐ ＲＩ Ｔ Ｉ Ｏ６３３をＢｓ ＬＥＦＴおよびＸ
ｂａ工酵素で消化した。全プレｓｔ−プレＳ２領域およ
びＳ領域のＮ末端配列を含む６４８ｂｐ ＢｓｔＥＩ
Ｉ−Ｘｂａｌ断片（ＢｓｔＥＴｒ延長部はＫｌｅｎｏｗ
ポリメラーゼで修復した）を精製し、ｐＵＣｌ ２ ［
Ａｍｅｒｓｈａｍ］のＳｍａ ＩとＸｂａ１部位間に挿
入した。得られたプラスミドはｐＲＩＴ１３１８８であ
る。
ｂａ工酵素で消化した。全プレｓｔ−プレＳ２領域およ
びＳ領域のＮ末端配列を含む６４８ｂｐ ＢｓｔＥＩ
Ｉ−Ｘｂａｌ断片（ＢｓｔＥＴｒ延長部はＫｌｅｎｏｗ
ポリメラーゼで修復した）を精製し、ｐＵＣｌ ２ ［
Ａｍｅｒｓｈａｍ］のＳｍａ ＩとＸｂａ１部位間に挿
入した。得られたプラスミドはｐＲＩＴ１３１８８であ
る。
プラスミドｐＲＴＴ１３１８８はＢａ１ＴおよびＢａｍ
ＨＩで処理し、残基５２から１３３まで延びるアミノ酸
をコードするプレＳｌ領域を除いた［アミノ酸５３およ
び１３２のコドンは欠失中に含まれる］。大きい断片を
Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理し、連結して／ラスミ
ドｐＲＩＴ１３１８９（ＢａｍＨＩ部位が再形成される
）を得た。
ＨＩで処理し、残基５２から１３３まで延びるアミノ酸
をコードするプレＳｌ領域を除いた［アミノ酸５３およ
び１３２のコドンは欠失中に含まれる］。大きい断片を
Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理し、連結して／ラスミ
ドｐＲＩＴ１３１８９（ＢａｍＨＩ部位が再形成される
）を得た。
残基１４５から１７５まで延びるプレＳアミノ酸領域に
相当するＤＮＡ ［アミノ酸１４６−１７４のコドン］
はｐ ＲＩ Ｔ ｌ ３ ］、 ８９をＢ ａ ｍ Ｈ
ＴおよびＸｂａｌで消化して除いた。このベクター０５ は次の合成アダプター二 ＡｓｐＰｒｏＡｒｇＶａｌＡｒｇＧ１ｙＬｅｕＴｙｒＰ
ＷｅＰｒｏＡ１ａＧ１ｙＧ１ｙ１３５
１４５およびＳ遺
伝子のＮ末端部分を含むｐＲＩＴ１２３３１由来のＮｃ
ｏＩ−ＸｂａＴ断片に連結した。
相当するＤＮＡ ［アミノ酸１４６−１７４のコドン］
はｐ ＲＩ Ｔ ｌ ３ ］、 ８９をＢ ａ ｍ Ｈ
ＴおよびＸｂａｌで消化して除いた。このベクター０５ は次の合成アダプター二 ＡｓｐＰｒｏＡｒｇＶａｌＡｒｇＧ１ｙＬｅｕＴｙｒＰ
ＷｅＰｒｏＡ１ａＧ１ｙＧ１ｙ１３５
１４５およびＳ遺
伝子のＮ末端部分を含むｐＲＩＴ１２３３１由来のＮｃ
ｏＩ−ＸｂａＴ断片に連結した。
得られたプラスミドはｐＲＩＴ１３１９０である。
Ｓ遺伝子のＣ末端領域、転写ＡＲＧ３領域およびＬＥＵ
２酵母遺伝子は、ｐＲＩＴ１３１９０のＸｂａｌおよび
５ａｌ１部位間にｐＲＩＴ１２６６０由来の４１４５ｂ
ｐ ＸｂａＴ−３ａｉｌ断片を挿入することにより加
えた。［ｐＲＩＴ１２６６０はＭ蛋白の２８１アミノ酸
のＨＢＶ ＤＮＡ誘導コード配列、その５′側の１０５
０ｂｐＴ Ｄ Ｈプロモーター断片（コード配列はこの
プロモーターの支配下にある）、およびその３′側のＡ
ＲＧ３転写ターミネータ−を保有する１１５０ｂｐ断片
を含む。ｐ ＲＴ Ｔ １．２６６０は係属中の米国特
許出願第００９３２５号に詳しく記載されている。］得
られたプラスミドはｐＲＴＴＩ３１９１であった。
２酵母遺伝子は、ｐＲＩＴ１３１９０のＸｂａｌおよび
５ａｌ１部位間にｐＲＩＴ１２６６０由来の４１４５ｂ
ｐ ＸｂａＴ−３ａｉｌ断片を挿入することにより加
えた。［ｐＲＩＴ１２６６０はＭ蛋白の２８１アミノ酸
のＨＢＶ ＤＮＡ誘導コード配列、その５′側の１０５
０ｂｐＴ Ｄ Ｈプロモーター断片（コード配列はこの
プロモーターの支配下にある）、およびその３′側のＡ
ＲＧ３転写ターミネータ−を保有する１１５０ｂｐ断片
を含む。ｐ ＲＴ Ｔ １．２６６０は係属中の米国特
許出願第００９３２５号に詳しく記載されている。］得
られたプラスミドはｐＲＴＴＩ３１９１であった。
Ｌ＊および△ＧｌｙＬ＊蛋白のための発現カセットを構
築するために、Ｌ蛋白のＮ末端コード領域または△Ｇｌ
ｙＬ蛋白のＮ末端コード領域に結合したＴ Ｄ Ｈ３プ
ロモーターをｐｔＴ１３１９１に挿入した。
築するために、Ｌ蛋白のＮ末端コード領域または△Ｇｌ
ｙＬ蛋白のＮ末端コード領域に結合したＴ Ｄ Ｈ３プ
ロモーターをｐｔＴ１３１９１に挿入した。
１２３４ｂｐ ＥｃｏＲＩ−Ｂａｌｌ断片はＬ蛋白コ
ード配列を含む上記のｐＲＴＴ１２８４５（米国特許出
願第００９３２５号）から精製し、そして１２２７ｂｐ
Ｂｇｌｒｒ−Ｂａｌｌ断片は上記のような△Ｇｌｙ
Ｌ蛋白コード配列を含むｐＲＩＴｌ ２９７９から
精製した。
ード配列を含む上記のｐＲＴＴ１２８４５（米国特許出
願第００９３２５号）から精製し、そして１２２７ｂｐ
Ｂｇｌｒｒ−Ｂａｌｌ断片は上記のような△Ｇｌｙ
Ｌ蛋白コード配列を含むｐＲＩＴｌ ２９７９から
精製した。
各断片はｐ Ｒ，Ｔ Ｔ ］ ３１９ ］由来の大きい
ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片と混合し、Ｔ４ポリメラーゼ
で処理し、連結した。得られたプラスミドはｐＲＩＴＩ
３２２０およびｐＲＩＴｌ３２２２と名付けられた。ｐ
ＲＩ Ｔ ］、 ３２２０中に存在する発現カセット
に含まれるコード配列は、表Ａに示すようなプレＳ１配
列からのアミノ酸残基１２−５２、プレＳ２配列からの
１３３−１４５、および全Ｓ配列を含む。ｐＲＩＴ１３
２２２はＧｌｙ１３コドン（ＧＧＧ）の欠失を除いてｐ
ＲＴＴ＋ ３２２０と同一である。
ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片と混合し、Ｔ４ポリメラーゼ
で処理し、連結した。得られたプラスミドはｐＲＩＴＩ
３２２０およびｐＲＩＴｌ３２２２と名付けられた。ｐ
ＲＩ Ｔ ］、 ３２２０中に存在する発現カセット
に含まれるコード配列は、表Ａに示すようなプレＳ１配
列からのアミノ酸残基１２−５２、プレＳ２配列からの
１３３−１４５、および全Ｓ配列を含む。ｐＲＩＴ１３
２２２はＧｌｙ１３コドン（ＧＧＧ）の欠失を除いてｐ
ＲＴＴ＋ ３２２０と同一である。
最後の工程は、Ｌ＊および△ＧｌｙＬ＊蛋白のためのそ
れぞれの発現カセットを含むＣ１ａＩＣ１ａＩ断片をｐ
ＩＩＩＴ１３２２０およびｐＲＩＴ１３２２２から調製
すること、それらをプラスミドｐＲＩＴ１２８４５由来
のＣ１ａｌ−Ｃ１ａｌ断片に連結することであり、それ
ぞれプラスミドｐＲＩＴ１３１９２およびｐＲＩＴ１３
１９３をもたらした。
れぞれの発現カセットを含むＣ１ａＩＣ１ａＩ断片をｐ
ＩＩＩＴ１３２２０およびｐＲＩＴ１３２２２から調製
すること、それらをプラスミドｐＲＩＴ１２８４５由来
のＣ１ａｌ−Ｃ１ａｌ断片に連結することであり、それ
ぞれプラスミドｐＲＩＴ１３１９２およびｐＲＩＴ１３
１９３をもたらした。
これらの後者のプラスミドはＳ９セレビシ工ＴＣＹＩ株
を形質転換するために使用し、それぞれＬＥＵ＋株Ｙ１
１３９およびＹＩＩ４０を得た。
を形質転換するために使用し、それぞれＬＥＵ＋株Ｙ１
１３９およびＹＩＩ４０を得た。
実施例Ｆ、４
酵母によるＬ＊および△ＧＩ’ｙＬ＊の発現Ｙ５８７（
Ｌ蛋白）、実施例Ｆ、３のＹ１１３９およびＹｌ１４０
（それぞれＬ＊および△Ｇ１０８ ｙ Ｌ＊）、およびＹ７２４（対照Ｓ．セレビシエ株、
挿入された発現カセットｔし）からの粗製酵母抽出物は
５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳ−特異的Ｍ ａ ｂ ＨＢ
ｓ ｌまたはＭａｂＳｌ、１を用いるイムノプロット検
出にかけた。Ｙｌ］３９およびＹ１１４０抽出物は、プ
レＳ１およびＳ−特異的抗体の両方によって認識された
見掛は分子置駒３３および３０ｋｃｌの２本のバンドを
示した。
Ｌ蛋白）、実施例Ｆ、３のＹ１１３９およびＹｌ１４０
（それぞれＬ＊および△Ｇ１０８ ｙ Ｌ＊）、およびＹ７２４（対照Ｓ．セレビシエ株、
挿入された発現カセットｔし）からの粗製酵母抽出物は
５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳ−特異的Ｍ ａ ｂ ＨＢ
ｓ ｌまたはＭａｂＳｌ、１を用いるイムノプロット検
出にかけた。Ｙｌ］３９およびＹ１１４０抽出物は、プ
レＳ１およびＳ−特異的抗体の両方によって認識された
見掛は分子置駒３３および３０ｋｃｌの２本のバンドを
示した。
エンドグリコシダーゼＨ［Ｎ８Ｗ ＥｎｇｌａｎｄＮｏ
ｃｌｅａｒまたはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ］ またはグリ
コペプシダーゼＦ ［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ］による抽
出物の処理は、３３ ｋ ｄバンドの消失と３０ ｋ
ｄバンドの増加をもたらした。これは３３ｋｄバンドが
１つのＮ結合高マンノース型グリカンを有する実施例Ｆ
、３のＬ＊および△ＧＩｙＬ＊ｉ白のグリコシル化形態
を表すことを示している。
ｃｌｅａｒまたはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ］ またはグリ
コペプシダーゼＦ ［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ］による抽
出物の処理は、３３ ｋ ｄバンドの消失と３０ ｋ
ｄバンドの増加をもたらした。これは３３ｋｄバンドが
１つのＮ結合高マンノース型グリカンを有する実施例Ｆ
、３のＬ＊および△ＧＩｙＬ＊ｉ白のグリコシル化形態
を表すことを示している。
！Ｈミリスチン酸での細胞培養物の標識付け、その後の
細胞抽出物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ、蛋白プロッティング、
およびフルオログラフィーまたは免疫検出による分析は
、Ｙ１１３９抽出物から誘０９ 導された３ ０ ｋ ｄバンドに３Ｈ−ラベルの強い存
＆ｆ、３３ｋｄバンドに３Ｈ−ラベルの弱い取込みを示
した。これらのバンドに存在する３Ｈはヒドロキシルア
ミン処理に抵抗した。Ｙ１１４０抽出物からの対応する
蛋白バンドには、３Ｈ−ラベルの取込みが全く観察され
なかった。これはＹ１１３９細胞により発現されたＬ＊
蛋白が酵母Ｎミリスチルトランスフェラーゼの基質とし
て作用し、Ｙｌ １４０の△ＧｌｙＬ＊蛋白中のＧｌｙ
１３残基の欠失がこの蛋白のミリストイル化を妨げるこ
とを示している。
細胞抽出物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ、蛋白プロッティング、
およびフルオログラフィーまたは免疫検出による分析は
、Ｙ１１３９抽出物から誘０９ 導された３ ０ ｋ ｄバンドに３Ｈ−ラベルの強い存
＆ｆ、３３ｋｄバンドに３Ｈ−ラベルの弱い取込みを示
した。これらのバンドに存在する３Ｈはヒドロキシルア
ミン処理に抵抗した。Ｙ１１４０抽出物からの対応する
蛋白バンドには、３Ｈ−ラベルの取込みが全く観察され
なかった。これはＹ１１３９細胞により発現されたＬ＊
蛋白が酵母Ｎミリスチルトランスフェラーゼの基質とし
て作用し、Ｙｌ １４０の△ＧｌｙＬ＊蛋白中のＧｌｙ
１３残基の欠失がこの蛋白のミリストイル化を妨げるこ
とを示している。
Ｙｌ１８９およびＹ１１４０からの抽出物のＣ５ｃｌ平
衡およびショ糖速度勾配遠心による分析は、抽出物中の
リポ蛋白粒子の存在を明らかにしＩこ。
衡およびショ糖速度勾配遠心による分析は、抽出物中の
リポ蛋白粒子の存在を明らかにしＩこ。
実施例Ｆ、５
ゲノムに組込まれたＳ発現力セントを数コピ含む酵母株
が構築された。
が構築された。
Ａ、酵母株Ｙ１０８８
Ｓ蛋白のための発現カセット（ＴＤＨ３プロモーター−
５蛋白コ一ド配列−ＡＲＧ３終結領域）を含むＴｙを土
台とした線ベクターｐＲＴ７１３１．３３−Ｌ（係属中
の米国特許出願第３６８４０１号に記載される）を用い
て、再接合型のＳ．セレビシエ株１０ｓ６９ｄ （ｕ
ｒａ３、Ｉｅｕ２、ｔｒｐｌ、ｑａｌＬ ｃｉｒ’）（
係属中の米国特許出願第３６８４０１号に記載される）
を形質転換した。ゲノムに組込まれた数コピーのベクタ
を保有する異なる半数体形質転換株は反対の接合型の半
数体様と交配させた。Ｓ ＤＮＡ断片プローブを用い
て分離したゲノムＤＮＡのザザンブロット分析は、四分
子分析においてベクター断片の２／２分離を示す。この
方法により得られた、５〜７コピーのベクターｐ ＲＩ
Ｔ １３１３３−Ｌを含む１つの半数体様はＹ９５７
と命名された。
５蛋白コ一ド配列−ＡＲＧ３終結領域）を含むＴｙを土
台とした線ベクターｐＲＴ７１３１．３３−Ｌ（係属中
の米国特許出願第３６８４０１号に記載される）を用い
て、再接合型のＳ．セレビシエ株１０ｓ６９ｄ （ｕ
ｒａ３、Ｉｅｕ２、ｔｒｐｌ、ｑａｌＬ ｃｉｒ’）（
係属中の米国特許出願第３６８４０１号に記載される）
を形質転換した。ゲノムに組込まれた数コピーのベクタ
を保有する異なる半数体形質転換株は反対の接合型の半
数体様と交配させた。Ｓ ＤＮＡ断片プローブを用い
て分離したゲノムＤＮＡのザザンブロット分析は、四分
子分析においてベクター断片の２／２分離を示す。この
方法により得られた、５〜７コピーのベクターｐ ＲＩ
Ｔ １３１３３−Ｌを含む１つの半数体様はＹ９５７
と命名された。
Ｙ９５７のＴＲＰ４復帰変異体が得られ、Ｙ２Ｏ２Ｓと
命名された。
命名された。
Ｂ、酵母株Ｙ１２９５
係属中の米国特許出願第３６８４０１に記載されるＴｙ
を土台とした線ベクターｐＲＴＴ１３０３４−ＬはｐＲ
ＴＴ］、３１３３−Ｌと同じｓｉ白の発現カセットを保
有する。ｐＲＴＴ］３０３４ＬはＣＵＰＩｓまたはｃｕ
ｐｌ△受容株において使用しうる追加のマーカーとして
ＣＵＰ ｌ遺伝子をもっている。
を土台とした線ベクターｐＲＴＴ１３０３４−ＬはｐＲ
ＴＴ］、３１３３−Ｌと同じｓｉ白の発現カセットを保
有する。ｐＲＴＴ］３０３４ＬはＣＵＰＩｓまたはｃｕ
ｐｌ△受容株において使用しうる追加のマーカーとして
ＣＵＰ ｌ遺伝子をもっている。
２つ（７）ｃｕｐｌ△Ｓ．セレビシエ半数体様（１コピ
ーのＣＵＰ ｌ遺伝子を含む株においてＣＵＰｌ遺伝子
が破壊されている）はこのＴｙ線ベクタの受容酵母株と
して適している。これらの株はそれぞれのゲノム：ＥＪ
ｃｕｐｌ△３ｄ（ｕｒａ３．１ｅｕ２、ｔｒｐｌ、
ｇａｌｌ△、ｃｕｐｌ△、ａ）およびＥＪ ｃｕｐｌ
△７ｂ（ｕｒａ３、ｔｒｐｌＳｇａ１１△、ｃｕｐｌ△
、ａ）を有し、係属中の米国特許出願第３６８４０１号
に記載されている。
ーのＣＵＰ ｌ遺伝子を含む株においてＣＵＰｌ遺伝子
が破壊されている）はこのＴｙ線ベクタの受容酵母株と
して適している。これらの株はそれぞれのゲノム：ＥＪ
ｃｕｐｌ△３ｄ（ｕｒａ３．１ｅｕ２、ｔｒｐｌ、
ｇａｌｌ△、ｃｕｐｌ△、ａ）およびＥＪ ｃｕｐｌ
△７ｂ（ｕｒａ３、ｔｒｐｌＳｇａ１１△、ｃｕｐｌ△
、ａ）を有し、係属中の米国特許出願第３６８４０１号
に記載されている。
Ｓ蛋白の発現カセットを含むＴｙを土゛台とした線ベク
ターｐ ＲＩ Ｔ ｌ ３０３４− ＬはＳ、セレビ１
２ シエ株ＥＪ ｃｕｐｌ△３ｄおよびＥＪ ｃｕｐｌ
△７ｂを形質転換するために使用した。ＵＲＡ３形質転
換体が単離され、銅の毒性に対する耐性についてスクリ
ーニングした。耐性がより強い形質転換体は２〜５コピ
ーの組込みベクターを含むように思われた。これらの株
間の古典的な遺伝的交雑およびＬＥＵ−ＴＲＰ−半数体
様の選択は、４〜５コピーのＳ発現カセットを含む半数
体様をもたらした。この株のＴＲＰ＋復帰変異体はＹ１
２９５と命名された。
ターｐ ＲＩ Ｔ ｌ ３０３４− ＬはＳ、セレビ１
２ シエ株ＥＪ ｃｕｐｌ△３ｄおよびＥＪ ｃｕｐｌ
△７ｂを形質転換するために使用した。ＵＲＡ３形質転
換体が単離され、銅の毒性に対する耐性についてスクリ
ーニングした。耐性がより強い形質転換体は２〜５コピ
ーの組込みベクターを含むように思われた。これらの株
間の古典的な遺伝的交雑およびＬＥＵ−ＴＲＰ−半数体
様の選択は、４〜５コピーのＳ発現カセットを含む半数
体様をもたらした。この株のＴＲＰ＋復帰変異体はＹ１
２９５と命名された。
実施例Ｆ、６
ＳおよびＬ抗原を同時発現する酵母株の構築酵母プラス
ミドｐＲｒＴ１２８４５（Ｌ蛋白）、１）ＲＩＴＩ ２
９７９ （△Ｇｌｙ Ｌ蛋白、実施例Ｆ、１）、ｐＲＩ
Ｔ１３１９２ （Ｌ＊蛋白、実施例Ｆ、３）、ｐＲＩＴ
１３１９３ （△Ｇｌｙ Ｌ＊蛋白、実施例Ｆ、３）、
およびｐ ＲＴ Ｔ １．２９１４（挿入された肝炎遺
伝子なし）は酵母株ｙｔ０８８をＬＥＵ＋へ形質転換す
るために使用した。
ミドｐＲｒＴ１２８４５（Ｌ蛋白）、１）ＲＩＴＩ ２
９７９ （△Ｇｌｙ Ｌ蛋白、実施例Ｆ、１）、ｐＲＩ
Ｔ１３１９２ （Ｌ＊蛋白、実施例Ｆ、３）、ｐＲＩＴ
１３１９３ （△Ｇｌｙ Ｌ＊蛋白、実施例Ｆ、３）、
およびｐ ＲＴ Ｔ １．２９１４（挿入された肝炎遺
伝子なし）は酵母株ｙｔ０８８をＬＥＵ＋へ形質転換す
るために使用した。
得られた酵母株はそれぞれＹＩ３０１ （Ｓ、Ｌ）、１
３ ＹＩ３０２（Ｓ、 △ＧＩｙＬ）、Ｙｌ １４２
（Ｓ。
３ ＹＩ３０２（Ｓ、 △ＧＩｙＬ）、Ｙｌ １４２
（Ｓ。
Ｌ＊） 、Ｙｌ ２６１ （Ｓ、△ＧＩｙＬ＊）、お
よびＹ］１４１（Ｓ蛋白のみを発現する対照株）と呼ば
れた。
よびＹ］１４１（Ｓ蛋白のみを発現する対照株）と呼ば
れた。
同様に、ｐＲＩＴ１２８４５、ｐＲＩＴ１２９７９、ｐ
ＲＩＴ１３１９２、ｐＲＩＴ１３１９３、およびｐＲＩ
Ｔｌ、２３７７（挿入された肝炎遺伝子なし）は酵母株
Ｙ１２９５に導入された。得られた酵母株はそれぞれＹ
１３０４ （Ｓ、Ｌ） 、Ｙｌ、３０５（Ｓ、△ＧＩｙ
Ｌ）、Ｙ１３０６ （Ｓ。
ＲＩＴ１３１９２、ｐＲＩＴ１３１９３、およびｐＲＩ
Ｔｌ、２３７７（挿入された肝炎遺伝子なし）は酵母株
Ｙ１２９５に導入された。得られた酵母株はそれぞれＹ
１３０４ （Ｓ、Ｌ） 、Ｙｌ、３０５（Ｓ、△ＧＩｙ
Ｌ）、Ｙ１３０６ （Ｓ。
Ｌ＊） 、ｙｌ、３０７ （Ｓ、△ＧｌｙＬ＊）、およ
びｙ１３０８（Ｓ蛋白のみを発現する対照株）と呼ばれ
た。
びｙ１３０８（Ｓ蛋白のみを発現する対照株）と呼ばれ
た。
ＳおよびＬ蛋白の同時発現は粗製細胞抽出物のイムノプ
ロット分析により証明した。プロットとＳエピトープに
特異的なＭａｂＨＢｓｌとの反応は、上記様のそれぞれ
の抽出物において、Ｓ蛋白と予想される位置に移動する
見掛は分子魚釣２３ｋｄのバンドをもたらした。
ロット分析により証明した。プロットとＳエピトープに
特異的なＭａｂＨＢｓｌとの反応は、上記様のそれぞれ
の抽出物において、Ｓ蛋白と予想される位置に移動する
見掛は分子魚釣２３ｋｄのバンドをもたらした。
Ｙ１３０１、ｙｌ ３０２、ＹＩ３０４、およびＹ１３
０５からの抽出物は、２３ｋｄバンドのほかに、米国特
許出願第００９３２５号および本明細書中の実施例Ｆ、
２に記載されるＬ蛋白の非グリコシル化およびグリコシ
ル化形態のように移動する３８ｋｃ＋と４５ｋｄのバン
ドを示した。この抽出物をエンドグリコシダーゼＨで処
理すると、４５ｋｄバンドは４１ｋｄバンドに変わった
が、２３ｋｄと３８ｋｄバンドは影響をうけなかった。
０５からの抽出物は、２３ｋｄバンドのほかに、米国特
許出願第００９３２５号および本明細書中の実施例Ｆ、
２に記載されるＬ蛋白の非グリコシル化およびグリコシ
ル化形態のように移動する３８ｋｃ＋と４５ｋｄのバン
ドを示した。この抽出物をエンドグリコシダーゼＨで処
理すると、４５ｋｄバンドは４１ｋｄバンドに変わった
が、２３ｋｄと３８ｋｄバンドは影響をうけなかった。
Ｙｌ１４２、Ｙ１２６１．Ｙ１３０６、およびＹ１３０
７からの抽出物は、２３ｋｄバンドのほかに、実施例Ｆ
、４に記載されるＬ＊および△ＧｌｙＬ＊蛋白の非グリ
コシル化およびグリコシル化形態のように移動する３０
ｋｄと３３ｋｄのバンドを示した。この抽出物をエンド
グリコシダーゼＨで処理すると、３３ ｋ ｄバンドは
３ Ｑ ｋ ｄバンドに変わり、実施例Ｆ、４で述べた
結果ど同である。
７からの抽出物は、２３ｋｄバンドのほかに、実施例Ｆ
、４に記載されるＬ＊および△ＧｌｙＬ＊蛋白の非グリ
コシル化およびグリコシル化形態のように移動する３０
ｋｄと３３ｋｄのバンドを示した。この抽出物をエンド
グリコシダーゼＨで処理すると、３３ ｋ ｄバンドは
３ Ｑ ｋ ｄバンドに変わり、実施例Ｆ、４で述べた
結果ど同である。
３Ｈミリスチン酸での細胞の標識付け、および抽出物の
５ＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のイムノプロットおよびフル
オログラフィーによる分析は、３８ｋｄ（Ｙ１３０１お
よびＹｌ ３０４からの抽出物）および３０ｋｄ（Ｙ１
１４２およびＹ１３０６からの抽出物）バンドにヒドロ
キシルアミン処理抵抗性３Ｈ−ラベルが存在し、４５ｋ
ｄ（Ｙ１３０１およびＹ１３０４からの抽出物）および
３３ｋｄ（Ｙ１１４２およびＹ１３０６からの抽出物）
蛋白バンドにほんの少量の３Ｈ−ラベルが存在すること
を示した。Ｙ１３０２、Ｙ１３０５、Ｙ１２６１および
Ｙ１３０７からの抽出物における対応バンドは検出可能
な３Ｈ−ラベルを含んでいなかった。
５ＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のイムノプロットおよびフル
オログラフィーによる分析は、３８ｋｄ（Ｙ１３０１お
よびＹｌ ３０４からの抽出物）および３０ｋｄ（Ｙ１
１４２およびＹ１３０６からの抽出物）バンドにヒドロ
キシルアミン処理抵抗性３Ｈ−ラベルが存在し、４５ｋ
ｄ（Ｙ１３０１およびＹ１３０４からの抽出物）および
３３ｋｄ（Ｙ１１４２およびＹ１３０６からの抽出物）
蛋白バンドにほんの少量の３Ｈ−ラベルが存在すること
を示した。Ｙ１３０２、Ｙ１３０５、Ｙ１２６１および
Ｙ１３０７からの抽出物における対応バンドは検出可能
な３Ｈ−ラベルを含んでいなかった。
ＬおよびＧＩｙＬ蛋白の３８ｋｄおよび４５ｋｄ形態は
、イムノプロットにおいてプレＳ１特異的ＭａｂＳ１．
１およびＭＡ １８／７ ［Ｗ、Ｈ。
、イムノプロットにおいてプレＳ１特異的ＭａｂＳ１．
１およびＭＡ １８／７ ［Ｗ、Ｈ。
Ｇｅｒｌｉｃｈ、 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇ５
ｔｔｉｎｇｅｎ、 ＦＲＧ］ 、プレＳ２−特異的Ｍａ
ｂＳ２．４、Ｓ２．５、Ｓ２゜７、Ｓ２．８、Ｓ２．９
およびＳ２’、１０［Ｓｍ１Ｌｈ Ｋ１１ｎｅ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌｓ］により認識される。
ｔｔｉｎｇｅｎ、 ＦＲＧ］ 、プレＳ２−特異的Ｍａ
ｂＳ２．４、Ｓ２．５、Ｓ２゜７、Ｓ２．８、Ｓ２．９
およびＳ２’、１０［Ｓｍ１Ｌｈ Ｋ１１ｎｅ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌｓ］により認識される。
Ｌ＊および△Ｇｌｙ Ｌ＊蛋白の３０ ｋ ｄおよび
３３ｋｄ形態は、ＭａｂＳｌ、１．ｌ （アミノ酸１６ 配列１２−３２に存在するエピト−プを認識する）、Ｍ
Ａ１８／７（アミノ酸配列２８−４７に存在するエピト
ープを認識する）、および５２．５ （アミノ酸配列１
３３−１４５に存在するエピトープを認識する）により
認識される。モノクローナルＭＡ１８／７は肝細胞膜へ
のピリオンの結合を阻害すると報告された［ＰｏｎＬｉ
５ｓｏ Ｐ、 ｅＬ ａｌ、。
３３ｋｄ形態は、ＭａｂＳｌ、１．ｌ （アミノ酸１６ 配列１２−３２に存在するエピト−プを認識する）、Ｍ
Ａ１８／７（アミノ酸配列２８−４７に存在するエピト
ープを認識する）、および５２．５ （アミノ酸配列１
３３−１４５に存在するエピトープを認識する）により
認識される。モノクローナルＭＡ１８／７は肝細胞膜へ
のピリオンの結合を阻害すると報告された［ＰｏｎＬｉ
５ｓｏ Ｐ、 ｅＬ ａｌ、。
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 １７３：５２２−５３０ （１９
８９）コ。Ｌ＊およびΔＧｌｙ Ｌ＊蛋白の３０ｋｄ
および３３ｋｄ形態は、ＥＬ Ｉ ＳＡ検定でペプチド
１．２０−１４５と反応しないＭａｂＳ２．４、Ｓ２．
８、Ｓ２．９により認識されず、またアミノ酸１２０−
１３７に存在するエピトープを恐らく認識するＭ ａ
ｂ ３２．７および３２．１０によっても認識されない
。
８９）コ。Ｌ＊およびΔＧｌｙ Ｌ＊蛋白の３０ｋｄ
および３３ｋｄ形態は、ＥＬ Ｉ ＳＡ検定でペプチド
１．２０−１４５と反応しないＭａｂＳ２．４、Ｓ２．
８、Ｓ２．９により認識されず、またアミノ酸１２０−
１３７に存在するエピトープを恐らく認識するＭ ａ
ｂ ３２．７および３２．１０によっても認識されない
。
モノクローナルＦ ３５−２５ （Ｍ−Ａ ＰｅＬｉｔ
。
。
ＩＮＳＥＲＭ ｕｎｉＬ６１３１． ＣＩａｍａｒＬ、
Ｆｒａｎｃｅから入手）は、ＥＬ Ｉ ＳＡ検定から
明らかなように、株Ｙ１３０７から精製した粒子と結合
するが、Ｓ粒子とは結合しない。このモノクローナルは
ＩＩｅｐＧ２肝癌細胞へのウィルスの結合に関与するこ
とが分かつ２＋７ た（ＮｅｕｒａＬｈ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ ４６
：４２９−４３６．１９８６）ペプチド配列（Ｐｅｔｉ
ｔ Ｍ−Ａ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ１ｅｃ。
Ｆｒａｎｃｅから入手）は、ＥＬ Ｉ ＳＡ検定から
明らかなように、株Ｙ１３０７から精製した粒子と結合
するが、Ｓ粒子とは結合しない。このモノクローナルは
ＩＩｅｐＧ２肝癌細胞へのウィルスの結合に関与するこ
とが分かつ２＋７ た（ＮｅｕｒａＬｈ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ ４６
：４２９−４３６．１９８６）ペプチド配列（Ｐｅｔｉ
ｔ Ｍ−Ａ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ１ｅｃ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 ２６：５３１−５３７．１９８９
）を認識する。さらに、（Ｓ、Ｌｉ）粒子はＨｅｐＧ２
肝癌細胞と結合し、この結合およびＨＢウィルス粒子の
結合はモノクローナルＦ３５．１５により妨げられるこ
とが判明したＣＰｅｔｒＬ Ｍ−Ａ ａＬａｌ、、肝炎
ウィルスおよび肝臓病に関する１９９０年国際シンポジ
ウム。
）を認識する。さらに、（Ｓ、Ｌｉ）粒子はＨｅｐＧ２
肝癌細胞と結合し、この結合およびＨＢウィルス粒子の
結合はモノクローナルＦ３５．１５により妨げられるこ
とが判明したＣＰｅｔｒＬ Ｍ−Ａ ａＬａｌ、、肝炎
ウィルスおよび肝臓病に関する１９９０年国際シンポジ
ウム。
Ａｂｓｔｒａｃｔ １０５− Ｈｏｕｓｔｏｎ、 ＵＳ
Ａ、 Ａｐｒｉｌ ４−８．１９９０）。グリコシル化
依存性プレＳ２エピドーグ（Ｈｅｅｒｍａｎｎ ｅｔ
ａｌ、、”肝炎ウィルスおよび肝臓病” Ｅｄｓ、Ａ。
Ａ、 Ａｐｒｉｌ ４−８．１９９０）。グリコシル化
依存性プレＳ２エピドーグ（Ｈｅｅｒｍａｎｎ ｅｔ
ａｌ、、”肝炎ウィルスおよび肝臓病” Ｅｄｓ、Ａ。
Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ ａｎｄ Ａｌａｎ Ｒ，Ｌｉ５ｓ
、 Ｉｎｃ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｐｐ、６９７−７００
（１９８８）］を認識しかつＬおよびＧｌｙ Ｌ蛋
白の４５ ｋ ｄ形態と反応するＭ ａ ｂ Ｑ ｌ
９ ／ ＩＱ ［Ｗ、Ｈ，Ｇｅｒｌｉｃｈ、 Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ ｏｆ にＯｔＬｉｎｇｅｎ、 ＦＲＧ］
は、Ｌｉおよび△ＧｌｙＬ＊蛋白の３０および３３ｋｄ
形態と反応しない。これらの結果はＬｉおよび△Ｇｌｙ
Ｌ＊蛋白に導入されたアミノ酸欠失と一致する。
、 Ｉｎｃ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｐｐ、６９７−７００
（１９８８）］を認識しかつＬおよびＧｌｙ Ｌ蛋
白の４５ ｋ ｄ形態と反応するＭ ａ ｂ Ｑ ｌ
９ ／ ＩＱ ［Ｗ、Ｈ，Ｇｅｒｌｉｃｈ、 Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ ｏｆ にＯｔＬｉｎｇｅｎ、 ＦＲＧ］
は、Ｌｉおよび△ＧｌｙＬ＊蛋白の３０および３３ｋｄ
形態と反応しない。これらの結果はＬｉおよび△Ｇｌｙ
Ｌ＊蛋白に導入されたアミノ酸欠失と一致する。
実施例Ｆ、７
実施例Ｆ、６で述べたそれぞれの株からの抽出物は、製
造者［Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂ、］の説明書に従って行っ
たＡＵＳＲＴＡ検定で陽性の結果を示したように、ＨＢ
ｓ Ａ ｇ関連抗原を含んでいる。ＹＩ３０１、Ｙ１
３０２、Ｙ１１４２、Ｙ１２６］、Ｙ１３０４、Ｙｌ
３０５、Ｙ１３０６およびＹ ］、 ３０７からの抽出
物はＥＬＴＳＡ−５１，］検定で陽性反応を与えるが、
Ｙ Ｉ ］、 ４１およびＹ１３０８からの抽出物は与
えない。ＣｓＣＩ平衡遠心にかけタトき、ＡＵＳＲｒＡ
およびＥ Ｌ ｌ５Ａ−５１，１陽性物質は約１゜２ｇ
／ｃｍ３の密度でハンドを形成した。イムノプロットは
抗原性プロフィールをさらに確信させ、粗製抽出物に存
在する蛋白種がＡＵＳＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ−５Ｌ、
１陽性ピークとしてバンドを形成することを示した。
造者［Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂ、］の説明書に従って行っ
たＡＵＳＲＴＡ検定で陽性の結果を示したように、ＨＢ
ｓ Ａ ｇ関連抗原を含んでいる。ＹＩ３０１、Ｙ１
３０２、Ｙ１１４２、Ｙ１２６］、Ｙ１３０４、Ｙｌ
３０５、Ｙ１３０６およびＹ ］、 ３０７からの抽出
物はＥＬＴＳＡ−５１，］検定で陽性反応を与えるが、
Ｙ Ｉ ］、 ４１およびＹ１３０８からの抽出物は与
えない。ＣｓＣＩ平衡遠心にかけタトき、ＡＵＳＲｒＡ
およびＥ Ｌ ｌ５Ａ−５１，１陽性物質は約１゜２ｇ
／ｃｍ３の密度でハンドを形成した。イムノプロットは
抗原性プロフィールをさらに確信させ、粗製抽出物に存
在する蛋白種がＡＵＳＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ−５Ｌ、
１陽性ピークとしてバンドを形成することを示した。
ＣｓＣ１平衡勾配から誘導された透析ピーク画分のショ
糖速度勾配遠心は、ＡＵＳＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ−３Ｌ、
Ｉおよびイムノプロットで測定して、Ｓ蛋白とＬ蛋白ま
たは修飾り蛋白の共沈を示した。
糖速度勾配遠心は、ＡＵＳＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ−３Ｌ、
Ｉおよびイムノプロットで測定して、Ｓ蛋白とＬ蛋白ま
たは修飾り蛋白の共沈を示した。
これはＳ蛋白とＬまたは修飾Ｌｉ白が集合してリポ蛋白
粒子を形成することを立証するものである。
粒子を形成することを立証するものである。
ＭａｂＳｌ、ｌを用いる免疫沈降反応を利用して、Ｓ蛋
白とＬまたは修飾り蛋白が１つの物体、すなわち混合サ
ブユニット組成の粒子、に会合することを証明した。Ｓ
蛋白およびＬまたは修飾り蛋白を単独でまたは一緒に発
現する酵母株、例えばＹｌ１３９（Ｔ−＊蛋白、実施例
Ｆ、３）、Ｙ１１４１（Ｓ蛋白、実施例Ｆ、６）および
Ｙ１１４２（ＳおよびＬ＊蛋白、実施例Ｆ、６）から抽
出物を調製した。ＣｓＣｌバンド形成およびピーク画分
の透析による粒子の半精製後、粒子をＭａｂＳｌ、１．
１との免疫沈降反応にかけた。Ｙｌ１３９およびＹ１１
４１からの粒子混合物は別の対照として用いた。Ｌ＊蛋
白はそれぞれの場合に免疫沈降した。Ｓ蛋白とＬ＊蛋白
との共沈はＹｌ１４２由来の粒子との反応からのみ観察
された。
白とＬまたは修飾り蛋白が１つの物体、すなわち混合サ
ブユニット組成の粒子、に会合することを証明した。Ｓ
蛋白およびＬまたは修飾り蛋白を単独でまたは一緒に発
現する酵母株、例えばＹｌ１３９（Ｔ−＊蛋白、実施例
Ｆ、３）、Ｙ１１４１（Ｓ蛋白、実施例Ｆ、６）および
Ｙ１１４２（ＳおよびＬ＊蛋白、実施例Ｆ、６）から抽
出物を調製した。ＣｓＣｌバンド形成およびピーク画分
の透析による粒子の半精製後、粒子をＭａｂＳｌ、１．
１との免疫沈降反応にかけた。Ｙｌ１３９およびＹ１１
４１からの粒子混合物は別の対照として用いた。Ｌ＊蛋
白はそれぞれの場合に免疫沈降した。Ｓ蛋白とＬ＊蛋白
との共沈はＹｌ１４２由来の粒子との反応からのみ観察
された。
Ｓ蛋白とＬまたは修飾り蛋白を同時発現する他２０
の酵母株（Ｙ１３ＱＩ、Ｙｌ ３０２、ＹＩ２６］、Ｙ
１３０４、Ｙ１３０５、Ｙｌ ３０６、Ｙ１３０７）
の場合にも同一の結果が得られた。
１３０４、Ｙ１３０５、Ｙｌ ３０６、Ｙ１３０７）
の場合にも同一の結果が得られた。
合性
Ｌｉおよび△Ｇｌｙ Ｌ＊蛋白の酵母プロテアーゼに
よる加水分解に対する感受性は、Ｙ１１４２およびＹ１
１６１の粗製細胞抽出物を３７℃で４時間または４°Ｃ
で６５時間インキュベー１・することにより調べた。
よる加水分解に対する感受性は、Ｙ１１４２およびＹ１
１６１の粗製細胞抽出物を３７℃で４時間または４°Ｃ
で６５時間インキュベー１・することにより調べた。
Ｙ１３０１およびＹ１３０２の抽出物はＬおよび△Ｇｌ
ｙ Ｌ蛋白の比較供給源として用いた。
ｙ Ｌ蛋白の比較供給源として用いた。
インキュベーション前および後でのイムノプロットによ
る抽出物の分析は、インキュベーション後のＬおよび△
ｃ＋ｙｒ−蛋白のほとんど完全な消失を示したが、Ｌｉ
および△ＧＩｙＬ＊蛋白は依然として容易に検出可能で
あった。
る抽出物の分析は、インキュベーション後のＬおよび△
ｃ＋ｙｒ−蛋白のほとんど完全な消失を示したが、Ｌｉ
および△ＧＩｙＬ＊蛋白は依然として容易に検出可能で
あった。
株Ｙｌ ３０６およびＹ１３０７からの精製した粒子調
製物は３７℃で７日間インキュベートし、２１ ５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により調べてポリペプチ
ドを明らかにした。Ｌ＊またはＳポリペプチドの検出可
能な分解は全く観察されなかった。
製物は３７℃で７日間インキュベートし、２１ ５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により調べてポリペプチ
ドを明らかにした。Ｌ＊またはＳポリペプチドの検出可
能な分解は全く観察されなかった。
ＣｓＣｌバンド形成によりＹ１１４２から誘導された粒
子は、Ｐｏｎｔｉｓｓｏ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｖｉｒ
ｏｌ。
子は、Ｐｏｎｔｉｓｓｏ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｖｉｒ
ｏｌ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：１５Ｊ−１５９（１９８３）に記
載されるｐＨ５Ａ結合検定の変法により試験した。マイ
クロプレト （Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ ｒ； Ｎ
ｕｎｃ、 Ｇｉｂｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ） にグル
タルアルデヒド重合ヒト血清アルブミンを被覆しくＰＢ
Ｓ中５μｇ／ｍｌ ｐＨ３Ａ、２時間３７°Ｃ）、プ
レート上の非特異的蛋白結合部位を１％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳどのインキュベーション（１
時間３７°Ｃ）により飽和させた。０．２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ中の被験試料の段階的希釈物はｐ ＨＳ Ａ被覆
プレートと相互作用させ（１時間３７°Ｃ）、結合粒子
を０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中の無制限濃度の西洋ワサ
ビベルオキシダーゼ結合抗Ｓモノクローナル抗体（ＲＦ
ｌ、Ｈ，Ｃ：、Ｔｈｏｍａｓ、 Ｒｏｙａｌ Ｆｒｅｅ
Ｆｒｏｓｐｉｔａｌ、 Ｌｏｎｄｏｎ）で検出しく１
時間３７°Ｃ）、基質としての０−フェニレンジアミン
およびＨ２Ｏ２により発色させた。
載されるｐＨ５Ａ結合検定の変法により試験した。マイ
クロプレト （Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ ｒ； Ｎ
ｕｎｃ、 Ｇｉｂｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ） にグル
タルアルデヒド重合ヒト血清アルブミンを被覆しくＰＢ
Ｓ中５μｇ／ｍｌ ｐＨ３Ａ、２時間３７°Ｃ）、プ
レート上の非特異的蛋白結合部位を１％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳどのインキュベーション（１
時間３７°Ｃ）により飽和させた。０．２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ中の被験試料の段階的希釈物はｐ ＨＳ Ａ被覆
プレートと相互作用させ（１時間３７°Ｃ）、結合粒子
を０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中の無制限濃度の西洋ワサ
ビベルオキシダーゼ結合抗Ｓモノクローナル抗体（ＲＦ
ｌ、Ｈ，Ｃ：、Ｔｈｏｍａｓ、 Ｒｏｙａｌ Ｆｒｅｅ
Ｆｒｏｓｐｉｔａｌ、 Ｌｏｎｄｏｎ）で検出しく１
時間３７°Ｃ）、基質としての０−フェニレンジアミン
およびＨ２Ｏ２により発色させた。
インキュベーション間にプレー］・は０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ ２０含有０．１５ＭＮａＣｌで洗った。
ｅｎ ２０含有０．１５ＭＮａＣｌで洗った。
Ｙ１１４１から誘導した粒子は陰性対照として使用し、
ｐ ＲＩ Ｔ １２６．６０を含む株１０５４４Ｃｃｉ
ｒ’からの精製粒子は陽性対照として使用した。ｐＨ３
Ａ結合は、ｐＲＩＴ１２６６０を保有するｌ０５４４Ｃ
ｃｊｒ’から誘導した粒子と比べて、Ｙ１１４２誘導粒
子（残留活性２％）では非常に減少していた。
ｐ ＲＩ Ｔ １２６．６０を含む株１０５４４Ｃｃｉ
ｒ’からの精製粒子は陽性対照として使用した。ｐＨ３
Ａ結合は、ｐＲＩＴ１２６６０を保有するｌ０５４４Ｃ
ｃｊｒ’から誘導した粒子と比べて、Ｙ１１４２誘導粒
子（残留活性２％）では非常に減少していた。
また、ｐＨＳ Ａ結合は株Ｙ１３０６およびＹ１３０７
からの精製粒子調製物においても検出できなかった。
からの精製粒子調製物においても検出できなかった。
実施例Ｆ、９
Ｌ＊蛋白含有粒子の免疫原性
本発明の（Ｓ、Ｌ＊）粒子の免疫原性はＢａ ］ ｂ／
Ｃマウスを使って研究した。Ｙｌ ｌ ４２ （Ｓ、
Ｌ＊）またはＹｌ１４１（Ｓ）から誘導した粒子をＣｓ
ＣＩバンド形成によＶ部分精製し、Ａｌ（ＯＨ）３に吸
着させた。１群８匹のマウスに各抗原調製物の５０また
は５μｇ全蛋白（ＡＵＳＲＩＡ検定によりｌまたはＯ，
１１１ｇ抗原に相当する）を０日目と３０日目に注射し
た。マウスの採血を４５日目に行い、各血清に対して異
なる検定を実施した。抗ＨＢｓ抗体はＡｕ５Ａｂキツト
（ＡｂｂｏｔＬ。
Ｃマウスを使って研究した。Ｙｌ ｌ ４２ （Ｓ、
Ｌ＊）またはＹｌ１４１（Ｓ）から誘導した粒子をＣｓ
ＣＩバンド形成によＶ部分精製し、Ａｌ（ＯＨ）３に吸
着させた。１群８匹のマウスに各抗原調製物の５０また
は５μｇ全蛋白（ＡＵＳＲＩＡ検定によりｌまたはＯ，
１１１ｇ抗原に相当する）を０日目と３０日目に注射し
た。マウスの採血を４５日目に行い、各血清に対して異
なる検定を実施した。抗ＨＢｓ抗体はＡｕ５Ａｂキツト
（ＡｂｂｏｔＬ。
ＵＳＡ）を使って測定し、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ式［１１
ｏ１ ｌｉｎｇｅｒｅｔ ａｌ、、”Ｖｉｒａｌ Ｈｅ
ｐａｔｉｔｉｓ” Ｓｚｕｍｎｅｓｓ ｅＬ ａｌ。
ｏ１ ｌｉｎｇｅｒｅｔ ａｌ、、”Ｖｉｒａｌ Ｈｅ
ｐａｔｉｔｉｓ” Ｓｚｕｍｎｅｓｓ ｅＬ ａｌ。
Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ Ｐｒｅｓｓ、
Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ ｐｐ、４５１−４６６
（１９８２）］ を用いてｍ Ｉ Ｕ ／ ｍ ｌで表
した。
Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ ｐｐ、４５１−４６６
（１９８２）］ を用いてｍ Ｉ Ｕ ／ ｍ ｌで表
した。
抗プレＳ抗体は、所定の合成ペプチド（ペプチド１２−
３２、ペプチド３２−４７およびペプチド１２Ｃ１−１
４５）をマイクログレート（７ｍｍｕｎ。
３２、ペプチド３２−４７およびペプチド１２Ｃ１−１
４５）をマイクログレート（７ｍｍｕｎ。
ｐｌａｔｅ Ｉ； Ｎｕｎｃ、 Ｇｉｂｃｏ Ｅｕｒｏ
ｐｅ）のポリスチレン壁に吸着させて、直接ＥＬ Ｉ
ＳＡ検定により測定した。吸着はウェルあたり０．０５
Ｍ Ｎａ、ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３緩衝液ｐＢ９．６．１
００μｍ中の０．５μｇ ／ ｍ ｌペプチドの溶液が
ら４°Ｃで一晩行った。プレート上の非特異的結合部位
はＰＢＳ中の５％ウシ胎児血清２５０μＩと３７°Ｃで
１時間インキュベートすることによりブロックした。
ｐｅ）のポリスチレン壁に吸着させて、直接ＥＬ Ｉ
ＳＡ検定により測定した。吸着はウェルあたり０．０５
Ｍ Ｎａ、ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３緩衝液ｐＢ９．６．１
００μｍ中の０．５μｇ ／ ｍ ｌペプチドの溶液が
ら４°Ｃで一晩行った。プレート上の非特異的結合部位
はＰＢＳ中の５％ウシ胎児血清２５０μＩと３７°Ｃで
１時間インキュベートすることによりブロックした。
２４
１％ウシ胎児血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む
ＰＢＳ中のマウス血清の２倍段階的希釈物は、ペプチド
被覆プレートと３７℃で２時間反応させた（１００μｍ
／ウェル）。洗浄後、結合抗体はヒツジからのビオチニ
ル化抗マウスＴｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、 １％ウシ胎
児血清、０，０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ中の
５００倍希釈物、１００μｌ／ウエル、３７°Ｃで１時
間インキュベーション）と反応させ、次にストレプトア
ビジンビオチニル化西洋ワサビベルオキシダーゼ複合体
（Ａｍｅｒｓｈａｍ、 １％ウシ胎児血清、０，０５
％Ｔｗｅｅｎ ２Ｑを含むＰＢＳ中の］、 ０００倍希
釈物、１００μｌ／ウエル、３７°Ｃで１時間インキュ
ベション）と反応させて検出した。
ＰＢＳ中のマウス血清の２倍段階的希釈物は、ペプチド
被覆プレートと３７℃で２時間反応させた（１００μｍ
／ウェル）。洗浄後、結合抗体はヒツジからのビオチニ
ル化抗マウスＴｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、 １％ウシ胎
児血清、０，０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ中の
５００倍希釈物、１００μｌ／ウエル、３７°Ｃで１時
間インキュベーション）と反応させ、次にストレプトア
ビジンビオチニル化西洋ワサビベルオキシダーゼ複合体
（Ａｍｅｒｓｈａｍ、 １％ウシ胎児血清、０，０５
％Ｔｗｅｅｎ ２Ｑを含むＰＢＳ中の］、 ０００倍希
釈物、１００μｌ／ウエル、３７°Ｃで１時間インキュ
ベション）と反応させて検出した。
インキュベーション間に、プレートは０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗った。
Ｃｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗った。
最後に、■■２０２および色素原としての。−フェニレ
ンジアミン（０，１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐ Ｈ６，
０，１０ｍ１中の］、 ５ ｐ Ｉ Ｈｘｏ ２８よ
び４ｍｇ ｏ ｙ工＝レンジアミン、１００μｌ／
ウェ２５ ル）により発色させた。この反応はＩＮＨ，５Ｏ４２５
μＩの添加により２０分後に停止させ、４９０ｎｍでの
吸光度をＩｎＬｅｒｍｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｄｅｒ
。
ンジアミン（０，１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐ Ｈ６，
０，１０ｍ１中の］、 ５ ｐ Ｉ Ｈｘｏ ２８よ
び４ｍｇ ｏ ｙ工＝レンジアミン、１００μｌ／
ウェ２５ ル）により発色させた。この反応はＩＮＨ，５Ｏ４２５
μＩの添加により２０分後に停止させ、４９０ｎｍでの
吸光度をＩｎＬｅｒｍｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｄｅｒ
。
ＮＪ ２０００． Ａｎａｌｉｓで測定した。それぞれ
の血清の力価は１．００の光学密度を与える最大希釈の
逆数として算出した。
の血清の力価は１．００の光学密度を与える最大希釈の
逆数として算出した。
表７は幾何平均力価として表した、Ｂａ１ｂ／ｃマウス
により誘導されたそれぞれの抗体価を示す。
により誘導されたそれぞれの抗体価を示す。
求ヱ
誘導様 １ｇ ＧＭＴ ＧＭＴ＊
ＧＩＪＴ＊ ＧＭＴ＊（Ｓ 、 Ｌ＊） ３４０００ ２＋２ ４９０ ８５ （Ｓ） ９０００ 〈２００ ０３ 〈２００ （＊） 力価は１．０のＯＤを与える希釈の逆数として表した。
ＧＩＪＴ＊ ＧＭＴ＊（Ｓ 、 Ｌ＊） ３４０００ ２＋２ ４９０ ８５ （Ｓ） ９０００ 〈２００ ０３ 〈２００ （＊） 力価は１．０のＯＤを与える希釈の逆数として表した。
株Ｙ］３０７（ｓ、△ｇ＋ｙｒ−＊）または株ＲＩ Ｔ
４３７６ ［Ｐｅｔｒｅ Ｊ、ｅｔ ａｌ、、Ｐｏ
ｓｔｇｒａｄ。
４３７６ ［Ｐｅｔｒｅ Ｊ、ｅｔ ａｌ、、Ｐｏ
ｓｔｇｒａｄ。
Ｍｅｄ、Ｊ、 ６３． （Ｓｕｐｐ１２）、 ７３−８
１ （１９８７）］から精製した粒子はＡｔ（ＯＨ）、
に吸着させ、１群１０匹のＢａ１ｂ／ｃマウスに０日日
と３０日目に注射した。４５日目にマウスから採血し、
集めた免疫血清は上記のように抗Ｓおよび抗プレＳ抗体
の存在について試験した。表８はＢａ１ｂ／ｃマウスに
より誘導されたそれぞれの抗体価を示す。
１ （１９８７）］から精製した粒子はＡｔ（ＯＨ）、
に吸着させ、１群１０匹のＢａ１ｂ／ｃマウスに０日日
と３０日目に注射した。４５日目にマウスから採血し、
集めた免疫血清は上記のように抗Ｓおよび抗プレＳ抗体
の存在について試験した。表８はＢａ１ｂ／ｃマウスに
より誘導されたそれぞれの抗体価を示す。
衣旦
誘導様 １ｇ ｍｌＵ／ｍ１（Ｓ、ΔｇｌＹ
ｒ−＊） （木） 力価は検定で１゜ ０のＯＤを与える希釈の逆数として表した。
ｒ−＊） （木） 力価は検定で１゜ ０のＯＤを与える希釈の逆数として表した。
２６
遺伝的に安定した株を得るために、また２μを土台とし
たＳ．セレビシエベクターによく見られる２０〜３０％
のプラスミドレス細胞を避けるために、宿主ゲノムに本
発明のＬ＊およびＳ蛋白発現カセットの両方を組込むこ
とが望ましい。
たＳ．セレビシエベクターによく見られる２０〜３０％
のプラスミドレス細胞を避けるために、宿主ゲノムに本
発明のＬ＊およびＳ蛋白発現カセットの両方を組込むこ
とが望ましい。
プラスミドｐＲＩＴ］３４５９およびｐＲＩＴ１３４６
０は、係属中の米国特許出願第００９３２５号およびＪ
ａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ、（Ｇｅｎｅ ８０：２７９−
２９１゜１９８９）でベクターｐＲＴＴ１３００９
ｐについて述べたように構築した。ベクターｐＣＶ９（
Ｐｅｔｅｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ １９ニア６５
，１９８０）から２２００ｂｐ Ｘｈｏｌ−３ａｌｌ
断片として単離したＬＥＵ２遺伝子を、ｐ、ＲＩＴ１２
９２７上のＴｙｌ要素の５ａｌＩ部位間に挿入し、もと
の断片と置き換えて、ｐＲＩＴ１３１４４を得た。実施
例Ｆ、３で述べたｐＲＩＴ１３２２０からのＬ＊発現カ
セットを含む３０５０ｂｐ Ｈｉｎｄｍ−に２７ ｐｎＩ断片はＴ４ポリメラーゼで処理し、ｐＲ■Ｔ１３
１４４ｔこ残存するＴ４ポリメラーゼ処理５ａ１１部位
に連結した。形質転換受容様としては大腸菌株ＸＬＩ
Ｂｌｕｅを使用した。ＸＬＩ−ＢｌｕｅはＨａｎａｈ
ａｎ Ｄ、、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、 １６６：５
５７５８０ （１９８３）に記載されており、ＳＬｒａ
ｔａｇｅｎｅ （１１０９９Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ
Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、 Ｌａ Ｊｏｌｌａ、 Ｃａ
１ｉｆ。
０は、係属中の米国特許出願第００９３２５号およびＪ
ａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ、（Ｇｅｎｅ ８０：２７９−
２９１゜１９８９）でベクターｐＲＴＴ１３００９
ｐについて述べたように構築した。ベクターｐＣＶ９（
Ｐｅｔｅｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ １９ニア６５
，１９８０）から２２００ｂｐ Ｘｈｏｌ−３ａｌｌ
断片として単離したＬＥＵ２遺伝子を、ｐ、ＲＩＴ１２
９２７上のＴｙｌ要素の５ａｌＩ部位間に挿入し、もと
の断片と置き換えて、ｐＲＩＴ１３１４４を得た。実施
例Ｆ、３で述べたｐＲＩＴ１３２２０からのＬ＊発現カ
セットを含む３０５０ｂｐ Ｈｉｎｄｍ−に２７ ｐｎＩ断片はＴ４ポリメラーゼで処理し、ｐＲ■Ｔ１３
１４４ｔこ残存するＴ４ポリメラーゼ処理５ａ１１部位
に連結した。形質転換受容様としては大腸菌株ＸＬＩ
Ｂｌｕｅを使用した。ＸＬＩ−ＢｌｕｅはＨａｎａｈ
ａｎ Ｄ、、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、 １６６：５
５７５８０ （１９８３）に記載されており、ＳＬｒａ
ｔａｇｅｎｅ （１１０９９Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ
Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、 Ｌａ Ｊｏｌｌａ、 Ｃａ
１ｉｆ。
ｒｎｉａ）から市販されている。ＨｉｎｄｌＴｒ−Ｋｐ
ｎ■カセット断片の両方の挿入方向が得られた；ｐＲＩ
Ｔ１３４５９はＬＥＵ２遺伝子に近接してカセットＡＲ
Ｇ３ターミネーター領域を含み、ｐＲＩＴ１３４６０は
ＬＥＵ２遺伝子に近接してカセットＴＤＨ３プロモータ
ーを含む。
ｎ■カセット断片の両方の挿入方向が得られた；ｐＲＩ
Ｔ１３４５９はＬＥＵ２遺伝子に近接してカセットＡＲ
Ｇ３ターミネーター領域を含み、ｐＲＩＴ１３４６０は
ＬＥＵ２遺伝子に近接してカセットＴＤＨ３プロモータ
ーを含む。
ｐＲＴＴ１３４５９およびｐＲＴＴ１３４６０の両方か
らの約７７００ｂｐＸｈｏｌ断片は１％アガロースゲル
から精製し、旧ｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ。
らの約７７００ｂｐＸｈｏｌ断片は１％アガロースゲル
から精製し、旧ｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ。
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、
７５：１９２９．１９７８）の方法により株ＥＪ ｃｕ
ｐｌΔ３ｄ（上記実施例Ｆ、５参照）をロイシン非依存
性へ形質転換するために使用した。
７５：１９２９．１９７８）の方法により株ＥＪ ｃｕ
ｐｌΔ３ｄ（上記実施例Ｆ、５参照）をロイシン非依存
性へ形質転換するために使用した。
Ｌ Ｅ Ｕ ４形質転換株か両方の断片から得られ、そ
れぞれの系列からの１２のコロニーをＬ＊＊白発現につ
いてウェスターンブロッティングで、組込まれたカセッ
トの数についてサザンブロツテイングで分析した。ｐＲ
ＴＴ１３４５９由来の断片でのＥＪ ｃｕｐｌ△３ｄの
形質転換から、Ｙ１３０６に等しいＬ＊＊現レベルを示
し、３〜５コピーのカセットを含む株Ｙ１５２８が保持
された。ｐＲＴＴ１３４６０由来の断片でのＥＪ ｃｕ
ｐｌΔ３ｄの形質転換から、Ｙ１５２８と似通った性質
の株Ｙ１５２９が保持された。
れぞれの系列からの１２のコロニーをＬ＊＊白発現につ
いてウェスターンブロッティングで、組込まれたカセッ
トの数についてサザンブロツテイングで分析した。ｐＲ
ＴＴ１３４５９由来の断片でのＥＪ ｃｕｐｌ△３ｄの
形質転換から、Ｙ１３０６に等しいＬ＊＊現レベルを示
し、３〜５コピーのカセットを含む株Ｙ１５２８が保持
された。ｐＲＴＴ１３４６０由来の断片でのＥＪ ｃｕ
ｐｌΔ３ｄの形質転換から、Ｙ１５２８と似通った性質
の株Ｙ１５２９が保持された。
Ｙ１５２８およびＹ１５２９は株ｙ１２９５およびその
ｔｒｐ〜親株Ｙ］、２１５（ｕ二記実施例Ｆ。
ｔｒｐ〜親株Ｙ］、２１５（ｕ二記実施例Ｆ。
５参照）と、および株Ｙ１３６７と交配して、次のよう
な二倍体株をつくった：Ｙ１５２８ＸＹ１２９５＝Ｙ１
５８６、Ｙ１５２８ＸＹ１２１５＝Ｙ１５８７、Ｙ１５
２８ＸＹ１３６７＝Ｙ１５８８、Ｙ］、５２９ＸＹ１２
９５＝Ｙ］５８９、Ｙ１５２９ｘＹ１２］５＝Ｙ１５９
０、Ｙ］５２９ＸＹ１３６７＝Ｙ１５９１ｏ株Ｙ１３６
７はａ１１ｅｕ２、ｔｒｐｌであり、株Ｙ１２９５と同
しＳ−蛋白カセットを６〜８コピー含み、実施例Ｆ。
な二倍体株をつくった：Ｙ１５２８ＸＹ１２９５＝Ｙ１
５８６、Ｙ１５２８ＸＹ１２１５＝Ｙ１５８７、Ｙ１５
２８ＸＹ１３６７＝Ｙ１５８８、Ｙ］、５２９ＸＹ１２
９５＝Ｙ］５８９、Ｙ１５２９ｘＹ１２］５＝Ｙ１５９
０、Ｙ］５２９ＸＹ１３６７＝Ｙ１５９１ｏ株Ｙ１３６
７はａ１１ｅｕ２、ｔｒｐｌであり、株Ｙ１２９５と同
しＳ−蛋白カセットを６〜８コピー含み、実施例Ｆ。
５でＹ１２９５の構築に関して記載した株および方法を
用いて得られた。
用いて得られた。
上記の二倍体株はウェスターンブロッティング、ＡＵＳ
ＲＩＡ検定およびエピトープ特異的Ｅ Ｔ−ＩＳＡ試験
により、特に実施例Ｆ、２およびＦ、６に記載した試薬
および方法を用いて、それらの表面抗原発現レベルおよ
び粒子のＬ＊対全Ｓポリペプチド比についてスクリーニ
ングした。組込まれた発現カセットの数および安定性は
ザザンプロッティングにより調べた。所望により、二倍
体株は胞子を形成させて半数体を得てもよく、その後半
数体は上記のように発現および遺伝的安定性についてス
クリーニングされる。
ＲＩＡ検定およびエピトープ特異的Ｅ Ｔ−ＩＳＡ試験
により、特に実施例Ｆ、２およびＦ、６に記載した試薬
および方法を用いて、それらの表面抗原発現レベルおよ
び粒子のＬ＊対全Ｓポリペプチド比についてスクリーニ
ングした。組込まれた発現カセットの数および安定性は
ザザンプロッティングにより調べた。所望により、二倍
体株は胞子を形成させて半数体を得てもよく、その後半
数体は上記のように発現および遺伝的安定性についてス
クリーニングされる。
ｐＲ丁Ｔ１３２２２由米の３０５０ｂｐＨｉｎｄｍ−Ｋ
ｐｎＩ断片のｐＲＩＴ１３１４４への挿入およびこれに
続く上記方法を行うことにより、数コピーの△ｇ Ｉ
ｙ Ｌ ＊発現カセットを組込んだＳ．セレビシエ株お
よびＳ、Δｇ Ｉ ＶＬ＊粒子を発現する株を得ること
ができる。
ｐｎＩ断片のｐＲＩＴ１３１４４への挿入およびこれに
続く上記方法を行うことにより、数コピーの△ｇ Ｉ
ｙ Ｌ ＊発現カセットを組込んだＳ．セレビシエ株お
よびＳ、Δｇ Ｉ ＶＬ＊粒子を発現する株を得ること
ができる。
別の実施態様において、Ｌ＊＊発現カセットｐＲＩＴ１
２９２７のＴｙｌ要素要素内挿入されたＵＲＡ３および
ＣＵＰ ｌ遺伝子を選択マーカーとして保有する、ｐ
ＲＩ Ｔ １３１３４− Ｐ ［Ｊａｃｏｂｓｅｔ ａ
ｌ、、 Ｇｅｎｅ ８０：２７９−２９１ （１９８９
）］に類似したベクターに挿入される。このようなベク
ターはＩ）ＲｒＴｌ ３５０１として同定され、このベ
クターから上記要素を含む約６５００ｂｐのＢｇｌｌ断
片を回収して、適当な酵母宿主への形質転換・組込みを
行い、ＵＲＡ＋形質転換体を選択することができる。形
質転換後、組込まれたカセットの数は、係属中の米国特
許出願第０７／３６８４０１号に記載されるように、銅
抵抗度の増加について選択することにより有利に増やす
ことができる。
２９２７のＴｙｌ要素要素内挿入されたＵＲＡ３および
ＣＵＰ ｌ遺伝子を選択マーカーとして保有する、ｐ
ＲＩ Ｔ １３１３４− Ｐ ［Ｊａｃｏｂｓｅｔ ａ
ｌ、、 Ｇｅｎｅ ８０：２７９−２９１ （１９８９
）］に類似したベクターに挿入される。このようなベク
ターはＩ）ＲｒＴｌ ３５０１として同定され、このベ
クターから上記要素を含む約６５００ｂｐのＢｇｌｌ断
片を回収して、適当な酵母宿主への形質転換・組込みを
行い、ＵＲＡ＋形質転換体を選択することができる。形
質転換後、組込まれたカセットの数は、係属中の米国特
許出願第０７／３６８４０１号に記載されるように、銅
抵抗度の増加について選択することにより有利に増やす
ことができる。
金粒子の発現
ａｙ亜型のＬ＊蛋白の発現カセットを有する組込み型ベ
クターは、ａｃｔ亜型Ｓ蛋白のＣ末端部分３２ とＡＲＧ転写ターミネータ−の部分をコードするＸｂａ
Ｉ−３ａｃｌｒ断片を、ａｙ亜型のＳ遺伝子からの対応
断片と交換することにより構築された。
クターは、ａｃｔ亜型Ｓ蛋白のＣ末端部分３２ とＡＲＧ転写ターミネータ−の部分をコードするＸｂａ
Ｉ−３ａｃｌｒ断片を、ａｙ亜型のＳ遺伝子からの対応
断片と交換することにより構築された。
プラスミド、）ＲＩＴ１３４５９ （実施例Ｆ、］０）
をＸｂａＴおよび５ａｃＴＩエンドヌクレアーゼで消化
し、最も大きい断片を１％アガロースゲルから精製し、
ｐＲＩＴ１０７８０からの精製１０００ｂｐ Ｘｂａ
Ｔ−５ａｃｌＴ断片と連結させてｐｔＴｌ ３５００を
得た。ｐＲＩＴ１０７８０はＤｅ Ｗｉｌｄｅ ｅｔ
ａｌ、、 Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｂｉｏｌ、５Ｌａｎｄａｒ
ｄ、 ５９：９９−１０７ （１９８５）に記載されて
いる。
をＸｂａＴおよび５ａｃＴＩエンドヌクレアーゼで消化
し、最も大きい断片を１％アガロースゲルから精製し、
ｐＲＩＴ１０７８０からの精製１０００ｂｐ Ｘｂａ
Ｔ−５ａｃｌＴ断片と連結させてｐｔＴｌ ３５００を
得た。ｐＲＩＴ１０７８０はＤｅ Ｗｉｌｄｅ ｅｔ
ａｌ、、 Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｂｉｏｌ、５Ｌａｎｄａｒ
ｄ、 ５９：９９−１０７ （１９８５）に記載されて
いる。
ｐＲＩＴ１３５００上のＬ＊コード配列は、ＡＴＧコド
ンからＸｂａＩ部位までのａｄ特異性のウィルス由来の
ＤＮＡと同じ配列をもつＤＮＡ。
ンからＸｂａＩ部位までのａｄ特異性のウィルス由来の
ＤＮＡと同じ配列をもつＤＮＡ。
およびＸｂａ、Ｉ部位から終結コドンまでのａｙｗ特異
性のウィルス由来のＤＮＡから戊っている。
性のウィルス由来のＤＮＡから戊っている。
発現されたＬ＊ポリペプチドはａｙ亜型の抗原決定基を
もつであろう。
もつであろう。
ｐＲＩＴ１３５００からの約７７００ｂｐのＸｈｏＴ断
片を酵母ゲノムに組込み、得られた形質３３ 転換体をＹ１２９５やＹ１３６７のような株と上記方法
により交配して、混合粒子（Ｌ＊ポリペブチじがａｙ亜
型で、Ｓポリペプチドがａｄ亜型である）を発現する株
を得ることができる。
片を酵母ゲノムに組込み、得られた形質３３ 転換体をＹ１２９５やＹ１３６７のような株と上記方法
により交配して、混合粒子（Ｌ＊ポリペブチじがａｙ亜
型で、Ｓポリペプチドがａｄ亜型である）を発現する株
を得ることができる。
上記の説明および実施例は本発明を例示するものであっ
て、限定するものではない。修１ｓＬ蛋白および混合ま
たは均一サブユニット組成の粒子（ワクチン用途に適し
た組成の修飾り蛋白を含む）を生成するために実施例で
挙げたもののほかに、例えば、Ｌ蛋白に対する他の修飾
（例えば、部分脱グリコシル化、またはここで述べたい
ろいろな修飾の組合わせ）が可能であるだろう。
て、限定するものではない。修１ｓＬ蛋白および混合ま
たは均一サブユニット組成の粒子（ワクチン用途に適し
た組成の修飾り蛋白を含む）を生成するために実施例で
挙げたもののほかに、例えば、Ｌ蛋白に対する他の修飾
（例えば、部分脱グリコシル化、またはここで述べたい
ろいろな修飾の組合わせ）が可能であるだろう。
他の修飾としては、プレＳ配列の再導入、エンベロープ
遺伝子以外のＨＢ Ｖ蛋白コード配列から誘導されたコ
ード配列の導入、例えば、ＨＢｖコア遺伝子からの配列
、または他の病原体からの免疫学的に重要なアミノ酸領
域をコードする配列の導入が含まれる。実施例で用いた
特定のマーカ遺伝子、プロモーターおよびリンカ−配列
などの代わりに、別の既知ベクター成分を使用してもよ
い。他の型の宿主細胞も使用できる。これらの実施例で
用いた宿主細胞、ベクターおよびベクター成分は単なる
例示であって、当分野で習熟した者は他の株または修飾
と置き換えることができる。
遺伝子以外のＨＢ Ｖ蛋白コード配列から誘導されたコ
ード配列の導入、例えば、ＨＢｖコア遺伝子からの配列
、または他の病原体からの免疫学的に重要なアミノ酸領
域をコードする配列の導入が含まれる。実施例で用いた
特定のマーカ遺伝子、プロモーターおよびリンカ−配列
などの代わりに、別の既知ベクター成分を使用してもよ
い。他の型の宿主細胞も使用できる。これらの実施例で
用いた宿主細胞、ベクターおよびベクター成分は単なる
例示であって、当分野で習熟した者は他の株または修飾
と置き換えることができる。
本発明は特許請求の範囲に含まれるすべての改良および
修飾を包含するものである。
修飾を包含するものである。
第１図：ｐＨＡＲ３］からのプラスミドｐＭＥ４の構築
。ＨＡＲ５Ｉ断片はもとのｐＨＡＲ３ｌの単一のＰｖｕ
Ｈ部位に移され、ＨＡＲ５のもとの位置とβ−ラクタ
マーゼ遺伝子の間の配列およびβ−ラクタマーゼ遺伝子
それ自体の５′末端は欠失された。 第２図：ａ）ＭＯＸ遺伝子 ｂ）ＦＭＤ遺伝子 ヲ含むハンセヌラ・ポリモルファゲノムＤＮ／’１片を
保有するラムダ−ファージの模式図。 第３図ニブラスミドｐＴ−２４の地図。このプラスミド
はｐＵｃ１９多重目的クローニング部位のＳｍａ ｒ部
位にクローン化されたＭＯＸ遺伝子のターミネータ−を
含むＤＮＡ断片を保有する。 第４図：それぞれＭＯＸ−またはＦＭＤ−プロモーター
の支配下にＳ−遺伝子を発現するプラスミドｐＲＢ−５
−２６９およびｐＲＢ−３−２７１の地図。 第５図ニブラスミドｐＢＣ，ｐＭＳ−２、Ｉ）ＦＳ−９
の地図。後のほうの２つのプラス式ドは、ＭＯＸプロモ
ーター（ｐＭＳ−２）またはＦＭＤプロモーター（ｐＦ
Ｓ−９）を含む発現力セントをＵＲＡ３遺伝子コード配
列に挿入することにより、ハンセヌラ・ポリモルファＵ
ＲＡ３遺伝子を含むｐＢＣから誘導される。 第６図ニブラスミドル ＨＫ ２の地図。このプラスミ
ドはザッカロミセス・セレビシェのＡＤＨ１プロモータ
ーの支配下にカナマイシン遺伝子（Ｔｎ５から誘導）を
含む。 第７図：プラスミＦ ｐ ＲＢ −Ｓ−３２２１ｉよび
ｐＲＢ−５−３２６の地図。プラスミドｐＨＫに存在す
るカナマイシン耐性遺伝子およびＡ Ｄ Ｈ１３６ プロモーターから成る機能単位がプラスミドｐＲ１３−
５−２６９およびｐＲＢ−５−２７１のＨＡＲ５領域に
挿入された。 第８図： Ｊ）ＭＯＸ−Ｐ／ＴｌからのｐＭＰＳ２２の
構築。Ｂ型肝炎ウィルスのプレＳ遺伝子がプラスミドｐ
Ｍ ＯＸ −Ｐ ／ Ｔ ｌのＥｃｏＲＴ部位に挿入
された。得られたプラスミドｐＭＰＳ−２２において、
プレＳ遺伝子はＭＯＸプロモーターにより調節される。 第９図ニブラスミドルＭＰＳ−９の地図。このプラスミ
ドの構築のために、ｐＭＰＳ−２２のプレＳ発現カセッ
トかもとのプラスミドｐＢＣのハンセヌラ断片のＸｈｏ
Ｉと５ｔｕＩ部位の間に挿入された。 第１０図：ハンセヌラ・ポリモルファＵＲＡ３遺伝子お
よび隣接ＤＮＡ領域の地図。 第１１図：外来遺伝子配列をＭＯＸプロモータの支配下
に挿入できるプラスミドｐＭＰＴＩ２１の構造を示す模
式図。 第１２図：ＭＯＸグロモーターの支配下にＬ＊３７ 蛋白の発現カセットを含むプラスミドｐＫＬ＊ ］の構
造を示す模式図。 第１３図：Ｇｌｙ１３欠失り蛋白発現力セラ１−を保有
する大腸菌プラスミド、ｐＲＩＴ１２９９８を構築する
工程を示す模式図。 第１４図：ＧＩｙ１３欠失り蛋白を発現しうる酵母プラ
スミドｐＲＩＴ１２９７９を構築する手順を示す模式図
。 第１５図ニアミノ酸５３−１３２および１４６１７４を
欠失したＬ蛋白のコード配列を含むプラスミドｐＲＩＴ
１３１９１の構築を示す模式図。 第１６図：それぞれＬ＊および△ＧｌｙＬ＊蛋白の発現
カセン１−を含む酵母発現プラスミドｐＲｒＴ］３１９
２およびｐＲＩＴ１３１９３（７）構築を示す模式図。 大匙 Ｂｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ２７
９．４３−４７ （１９７９）Ｃｈａｒｎａｙ ｅＬ
ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ７６、 ２２２２−２２２６ （］９７９） Ｃｒｅｇｇ ｅＬ ａｌ、、 Ｍｏ１．Ｃ：ｅｌｌ、Ｂ
ｉｏｌ、 ５．３３７６−３３８５ （１９８５） Ｄｅｈｏｕｘ ｅｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ ４８． １
５５−１６３ （１９８６）Ｅｂｌｅ ｅｔ ａｌ、、
Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、 ６． １４５４−６
３ （１９８６）Ｅｃｋａｒｔ ｅＬ ａｌ、、メチロ
トローフ酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏ Ｉ ｙｍｏｒｐ
ｈａからのジヒドロキシアセトンシンタゼおよびメタノ
ールオキシダーゼ遺伝子のタロニングおよび特性決定、
博士論文、デュツセルドル７大学（１９８８） Ｊｉｍｅｎｅｚ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ、 Ｎａｔ
ｕｒｅ ２旦ヱ、 １８７１ （１９８０）Ｋｉ
ｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｅｎ
、Ｅｎ１）、Ｒｅｓ、旦、３７７ （１９８５）Ｋｌ
ｅｂｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ ２５． ３３３−
３４１ （１９８３）Ｋｎｉｓｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ
−、、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ Ｆｉ、 ８２−８７
（１９８８）Ｋ５ｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ、 Ｎａｊ：ｕｒｅ ２５６． ４９５−４９７
（１９７５１Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ ２２７
． ６８０−６８５ （１９７０）Ｌａｎｇｌｅｙ
ａｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ ６７、２２９ （１９８
８１Ｌｅｄｅｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 １３． ３０６３−３０８
１ （１９８５）Ｌｏｗｒｙ ａｔ ａｌ、、 Ｊ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 １９３． ２６５−２７
５ （１９５１）Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、
、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏｌｄｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
（１９８２）ＭａＸａｍ ａｎｄ Ｇ１１ｂａｒｔ、ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ ７４
゜５６０−５６４ （１９７７） ＭｃＬａｃｈｌａｎ ｅｔ ａｌ、Ｗ○８８１０６１８
５ （１９８８１Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ、、ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８１，７
７０８−７７１２（１９８４） Ｍｉｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ ２２８
．１１９５−１１９９ （１９８５）Ｍｉｌｉｃｈ
ｅｔ ａｌ、、 工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
９，３８０−３８６ （１９８Ｂ）Ｍｕｒｒａｙ ｅ
ｔ ａｌ、、 ＥＰ−Ａ−１３８２８（１９８０１０ｕ
ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６１． ７
８２ ＋１９８７）Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
ＳＡ ８２． ３４４０−４４＋１９８５１ Ｐｏｎｔｉｓｓｏ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｉｃａｌ ｘｅｔｈｏｄｓ ６Ｌ、 １５１−１
５９１ｌ５１− １５９１９８３）Ｒｏ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ１． Ｇ
ｅｎ、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 ３０２ （１９８６１Ｒ
ｕｔｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａ
ｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ；Ｅ
ｄｓ、Ａ、Ｓ、ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ Ａ、Ｒ，Ｌｉ５
ｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ３０４−３０８ （１９８８
）Ｒｕｔｇｅｒｓ ａｔ： ａｌ、、 Ｂｉｏｔｅｃｈ
６．１０６５−１０７０ （１９８８１Ｓｃｈｗａｒ
ｔｚ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ、 Ｃｅ１ｌ ３’し ６
７ （１９８４）Ｓｎｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ、、
Ｎａｔｕｒｅ ２７９． ３４６−３４８ （１９７９
）Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９８，５
０３−５１７ （１９７５）Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ
ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、（ＩＳＡ ７’し４５５９−４５６３ Ｓｔｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
７６、 １０３５−１１０３５−１０３９ （１９７９）Ｓｚ ｅｔ ａｌ、、 Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａ？＋ｄ Ｊ、 Ｍｅｄ ３０３． ８３３−８４
１ （１９８０）Ｔｓｃｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ、、
ＥＰ−Ａ−０２２６８４６Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ ａｎ
ｄ Ｃａｒｂｏｎ、 Ｇｅｎｅ １０．’ １５７−
１６６ （１９８０）Ｔｏｗｂｉｎ ａｔ ａｌ、、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ７６、 ４３５０−４３５４（１９７９） Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ
２８０，８１５−８１９ （１９７９）Ｖａｌｅｎｚ
ｕｅｌａ ａｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ２９８．
３４７ （１９Ｂ２１Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ
ａｌ、、 Ｂｉｏｔｅｃｈ、 ３． ３１７ （１
９８５１Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｃｌ Ｎａｋａｍｅ
ｉｎ ” 工ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｒｅ１ａｔｅｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ｗ、Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ、、ｅｄｓ、、Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。 代諜人弁理士秋沢政、光 ４１
。ＨＡＲ５Ｉ断片はもとのｐＨＡＲ３ｌの単一のＰｖｕ
Ｈ部位に移され、ＨＡＲ５のもとの位置とβ−ラクタ
マーゼ遺伝子の間の配列およびβ−ラクタマーゼ遺伝子
それ自体の５′末端は欠失された。 第２図：ａ）ＭＯＸ遺伝子 ｂ）ＦＭＤ遺伝子 ヲ含むハンセヌラ・ポリモルファゲノムＤＮ／’１片を
保有するラムダ−ファージの模式図。 第３図ニブラスミドｐＴ−２４の地図。このプラスミド
はｐＵｃ１９多重目的クローニング部位のＳｍａ ｒ部
位にクローン化されたＭＯＸ遺伝子のターミネータ−を
含むＤＮＡ断片を保有する。 第４図：それぞれＭＯＸ−またはＦＭＤ−プロモーター
の支配下にＳ−遺伝子を発現するプラスミドｐＲＢ−５
−２６９およびｐＲＢ−３−２７１の地図。 第５図ニブラスミドｐＢＣ，ｐＭＳ−２、Ｉ）ＦＳ−９
の地図。後のほうの２つのプラス式ドは、ＭＯＸプロモ
ーター（ｐＭＳ−２）またはＦＭＤプロモーター（ｐＦ
Ｓ−９）を含む発現力セントをＵＲＡ３遺伝子コード配
列に挿入することにより、ハンセヌラ・ポリモルファＵ
ＲＡ３遺伝子を含むｐＢＣから誘導される。 第６図ニブラスミドル ＨＫ ２の地図。このプラスミ
ドはザッカロミセス・セレビシェのＡＤＨ１プロモータ
ーの支配下にカナマイシン遺伝子（Ｔｎ５から誘導）を
含む。 第７図：プラスミＦ ｐ ＲＢ −Ｓ−３２２１ｉよび
ｐＲＢ−５−３２６の地図。プラスミドｐＨＫに存在す
るカナマイシン耐性遺伝子およびＡ Ｄ Ｈ１３６ プロモーターから成る機能単位がプラスミドｐＲ１３−
５−２６９およびｐＲＢ−５−２７１のＨＡＲ５領域に
挿入された。 第８図： Ｊ）ＭＯＸ−Ｐ／ＴｌからのｐＭＰＳ２２の
構築。Ｂ型肝炎ウィルスのプレＳ遺伝子がプラスミドｐ
Ｍ ＯＸ −Ｐ ／ Ｔ ｌのＥｃｏＲＴ部位に挿入
された。得られたプラスミドｐＭＰＳ−２２において、
プレＳ遺伝子はＭＯＸプロモーターにより調節される。 第９図ニブラスミドルＭＰＳ−９の地図。このプラスミ
ドの構築のために、ｐＭＰＳ−２２のプレＳ発現カセッ
トかもとのプラスミドｐＢＣのハンセヌラ断片のＸｈｏ
Ｉと５ｔｕＩ部位の間に挿入された。 第１０図：ハンセヌラ・ポリモルファＵＲＡ３遺伝子お
よび隣接ＤＮＡ領域の地図。 第１１図：外来遺伝子配列をＭＯＸプロモータの支配下
に挿入できるプラスミドｐＭＰＴＩ２１の構造を示す模
式図。 第１２図：ＭＯＸグロモーターの支配下にＬ＊３７ 蛋白の発現カセットを含むプラスミドｐＫＬ＊ ］の構
造を示す模式図。 第１３図：Ｇｌｙ１３欠失り蛋白発現力セラ１−を保有
する大腸菌プラスミド、ｐＲＩＴ１２９９８を構築する
工程を示す模式図。 第１４図：ＧＩｙ１３欠失り蛋白を発現しうる酵母プラ
スミドｐＲＩＴ１２９７９を構築する手順を示す模式図
。 第１５図ニアミノ酸５３−１３２および１４６１７４を
欠失したＬ蛋白のコード配列を含むプラスミドｐＲＩＴ
１３１９１の構築を示す模式図。 第１６図：それぞれＬ＊および△ＧｌｙＬ＊蛋白の発現
カセン１−を含む酵母発現プラスミドｐＲｒＴ］３１９
２およびｐＲＩＴ１３１９３（７）構築を示す模式図。 大匙 Ｂｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ２７
９．４３−４７ （１９７９）Ｃｈａｒｎａｙ ｅＬ
ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ７６、 ２２２２−２２２６ （］９７９） Ｃｒｅｇｇ ｅＬ ａｌ、、 Ｍｏ１．Ｃ：ｅｌｌ、Ｂ
ｉｏｌ、 ５．３３７６−３３８５ （１９８５） Ｄｅｈｏｕｘ ｅｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ ４８． １
５５−１６３ （１９８６）Ｅｂｌｅ ｅｔ ａｌ、、
Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、 ６． １４５４−６
３ （１９８６）Ｅｃｋａｒｔ ｅＬ ａｌ、、メチロ
トローフ酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏ Ｉ ｙｍｏｒｐ
ｈａからのジヒドロキシアセトンシンタゼおよびメタノ
ールオキシダーゼ遺伝子のタロニングおよび特性決定、
博士論文、デュツセルドル７大学（１９８８） Ｊｉｍｅｎｅｚ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ、 Ｎａｔ
ｕｒｅ ２旦ヱ、 １８７１ （１９８０）Ｋｉ
ｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｅｎ
、Ｅｎ１）、Ｒｅｓ、旦、３７７ （１９８５）Ｋｌ
ｅｂｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ ２５． ３３３−
３４１ （１９８３）Ｋｎｉｓｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ
−、、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ Ｆｉ、 ８２−８７
（１９８８）Ｋ５ｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ、 Ｎａｊ：ｕｒｅ ２５６． ４９５−４９７
（１９７５１Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ ２２７
． ６８０−６８５ （１９７０）Ｌａｎｇｌｅｙ
ａｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ ６７、２２９ （１９８
８１Ｌｅｄｅｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 １３． ３０６３−３０８
１ （１９８５）Ｌｏｗｒｙ ａｔ ａｌ、、 Ｊ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 １９３． ２６５−２７
５ （１９５１）Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、
、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏｌｄｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
（１９８２）ＭａＸａｍ ａｎｄ Ｇ１１ｂａｒｔ、ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ ７４
゜５６０−５６４ （１９７７） ＭｃＬａｃｈｌａｎ ｅｔ ａｌ、Ｗ○８８１０６１８
５ （１９８８１Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ、、ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８１，７
７０８−７７１２（１９８４） Ｍｉｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ ２２８
．１１９５−１１９９ （１９８５）Ｍｉｌｉｃｈ
ｅｔ ａｌ、、 工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
９，３８０−３８６ （１９８Ｂ）Ｍｕｒｒａｙ ｅ
ｔ ａｌ、、 ＥＰ−Ａ−１３８２８（１９８０１０ｕ
ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６１． ７
８２ ＋１９８７）Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ、、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
ＳＡ ８２． ３４４０−４４＋１９８５１ Ｐｏｎｔｉｓｓｏ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｉｃａｌ ｘｅｔｈｏｄｓ ６Ｌ、 １５１−１
５９１ｌ５１− １５９１９８３）Ｒｏ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ１． Ｇ
ｅｎ、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 ３０２ （１９８６１Ｒ
ｕｔｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａ
ｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ；Ｅ
ｄｓ、Ａ、Ｓ、ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ Ａ、Ｒ，Ｌｉ５
ｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ３０４−３０８ （１９８８
）Ｒｕｔｇｅｒｓ ａｔ： ａｌ、、 Ｂｉｏｔｅｃｈ
６．１０６５−１０７０ （１９８８１Ｓｃｈｗａｒ
ｔｚ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ、 Ｃｅ１ｌ ３’し ６
７ （１９８４）Ｓｎｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ、、
Ｎａｔｕｒｅ ２７９． ３４６−３４８ （１９７９
）Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９８，５
０３−５１７ （１９７５）Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ
ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、（ＩＳＡ ７’し４５５９−４５６３ Ｓｔｒｕｈｌ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
７６、 １０３５−１１０３５−１０３９ （１９７９）Ｓｚ ｅｔ ａｌ、、 Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａ？＋ｄ Ｊ、 Ｍｅｄ ３０３． ８３３−８４
１ （１９８０）Ｔｓｃｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ、、
ＥＰ−Ａ−０２２６８４６Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ ａｎ
ｄ Ｃａｒｂｏｎ、 Ｇｅｎｅ １０．’ １５７−
１６６ （１９８０）Ｔｏｗｂｉｎ ａｔ ａｌ、、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ７６、 ４３５０−４３５４（１９７９） Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ
２８０，８１５−８１９ （１９７９）Ｖａｌｅｎｚ
ｕｅｌａ ａｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ２９８．
３４７ （１９Ｂ２１Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ
ａｌ、、 Ｂｉｏｔｅｃｈ、 ３． ３１７ （１
９８５１Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｃｌ Ｎａｋａｍｅ
ｉｎ ” 工ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｒｅ１ａｔｅｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ｗ、Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ、、ｅｄｓ、、Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。 代諜人弁理士秋沢政、光 ４１
Claims (27)
- （１）、次の配列：すなわち、プロテアーゼ消化に感受
性の配列、ミリスチル化に必要な配列、Ｎ−結合グリコ
シル化に必要な配列、Ｏ−結合グリコシル化に必要な配
列、およびヒト血清アルブミンの結合に必要な配列のう
ち少なくとも１つが修飾されたことにより特徴づけられ
るＬ蛋白をコードするアミノ酸配列から成る、修飾Ｂ型
肝炎ウィルス大型表面蛋白。 - （２）、その第二位置においてグリシン残基を欠失して
いる一次翻訳アミノ酸配列から成る、請求項１記載の修
飾蛋白。 - （３）、Ａｓｎ−Ｘ−ＴｈｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ
（Ｘはアミノ酸）の配列がＡｓｎの欠失または置換、Ｔ
ｈｒまたはＳｅｒの欠失または置換、もしくはＸの欠失
により改変される、請求項１記載の修飾蛋白。 - （４）、Ｌ蛋白の残基１２−５２、または残基１２に続
く残基１４−５２、これに続く残基１３３−１４５、こ
れに続く残基１７５−４００から成るアミノ酸配列を有
する、請求項１または２記載の修飾蛋白。 - （５）、請求項１〜４のいずれか１項記載の修飾Ｌ蛋白
のマルチマー集成体から成る粒子。 - （６）、Ｂ型肝炎表面抗原の１つの生物学的活性を有す
る蛋白の全部または一部に相当する少なくとも２つのポ
リペプチドを含む複合粒子であって、該粒子はＳ−蛋白
、プレＳ２−蛋白またはプレＳ１−蛋白により与えられ
る少なくとも２つの抗原決定基を有し、場合により宿主
特異的脂質をさらに含む、上記複合粒子。 - （７）、ＨＢｓＡｇのＳ蛋白と請求項１〜４のいずれか
１項記載の修飾Ｌ蛋白とのマルチマー集成体から成る、
請求項６記載の粒子。 - （８）、式（Ｌ＊、Ｓ）の複合粒子であって、ここでＬ
＊はＬ蛋白の残基１２−５２、これに続く残基１３３−
１４５、これに続く残基１７５−４００から成るアミノ
酸配列を有するＢ型肝炎ウィルスの修飾Ｌ蛋白を表し、
そしてＳはＢ型肝炎表面抗原のＳ−蛋白を表し、Ｓ．セ
レビシエ （Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはＨ．ポリモルファ
（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）内で発現された形態であ
る、上記複合粒子。 - （９）、Ｓ蛋白はａｄ亜型で、修飾Ｌ蛋白はａｙ亜型で
あるか、またはその逆である、請求項７または８記載の
粒子。 - （１０）、免疫防御量の請求項１〜４のいずれか１項記
載の修飾Ｌ蛋白または請求項５〜９のいずれか１項記載
の粒子を含むワクチン。 - （１１）、調節配列に機能しうる状態で連結された、請
求項１〜４のいずれか１項記載の修飾Ｌ蛋白の発現のた
めのＤＮＡコード配列を含む組換えＤＮＡ分子。 - （１２）、請求項１１記載のＤＮＡ分子を含む組換えベ
クター。 - （１３）、請求項１２記載の組換えベクターで形質転換
された宿主細胞。 - （１４）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア
属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、
クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およ
びシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ）より成る群から選ばれる、請求項１３記
載の細胞。 - （１５）、Ｓ．セレビシエまたはハンセヌラ・ポリモル
ファである、請求項１４記載の細胞。 - （１６）、ＨＢＶのＳ蛋白を発現しうる組換えＤＮＡベ
クターでさらに形質転換される、請求項１３〜１５のい
ずれか１項記載の宿主細胞。 - （１７）、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の宿主
細胞を適当な培地で培養し、細胞溶解液または前記培地
の抽出物から蛋白を単離することから成る、請求項１〜
４のいずれか１項記載の修飾Ｌ蛋白の生産方法。 - （１８）、請求項１６記載の宿主細胞を培養し、細胞溶
解液または前記培地の抽出物から混合サブユニット組成
の蛋白粒子を単離することから成る、修飾Ｌ蛋白とＳ蛋
白の同時生産方法。 - （１９）、Ａ）第一のポリペプチドをコードする１より
多いコピー数の発現カセット（ｅｃ１）および／または
第二のポリペプチドをコードする１または１より多いコ
ピー数の発現カセット（ｅｃ２）、場合によりさらに第
三のポリペプチドをコードする１または１より多い発現
カセット（ｅｃ３）；または Ｂ）第一のポリペプチドをコードする１コピー数の発現
カセット（ｅｃ１）および第二のポリペプチドをコード
する１または１より多いコピー数の発現カセット（ｅｃ
２）、場合によりさらに第三のポリペプチドをコードす
る１または１より多い発現カセット（ｅｃ３）； 〔ここで、前記発現カセットは （ａ）メタノールおよび／またはカタボライト抑制炭素
源の枯渇に応答するレギュロンＲ； （ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原の１つの生物学的活性を有する
蛋白の全部または一部をコードするオープン・リーディ
ング・フレーム； （ｃ）場合により、ターミネーターＴとして作用するＤ
ＮＡ配列； を含む、ただしＲはオープン・リーディング・フレーム
の転写を制御し、そしてＴはポリアデニル化および／ま
たは生産されたｍＲＮＡの転写終結を支配する〕 を保有するメチロトローフ酵母属の群から選ばれる微生
物。 - （２０）、第一のポリペプチドがＳ−蛋白の全部または
一部を表し、第二のポリペプチドがプレＳ１−蛋白の全
部または一部を表し、そして任意の第三のポリペプチド
がプレＳ２−蛋白の全部または一部を表すか、または第
二のポリペプチドがプレＳ２−蛋白の全部または一部を
表す、請求項１９記載の微生物。 - （２１）、メチロトローフ酵母はカンジダ属（Ｃａｎｄ
ｉｄａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、サッ
カロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ロドト
ルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、トルロプシス属（
Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、
またはハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の種から選
ばれる、請求項２０記載の微生物。 - （２２）、微生物はハンセヌラ属、好ましくはハンセヌ
ラ・ポリモルファ、最も好ましくはハンセヌラ・ポリモ
ルファＲＢ１０（ＤＳＭ５２１５）の同定特性を有する
株から誘導される、請求項１９〜２１のいずれか１項記
載の微生物。 - （２３）、レギュロンはメタノール利用に関与する遺伝
子、好ましくはＭＯＸ遺伝子、ＦＭＤ遺伝子、ＤＡＳ遺
伝子またはカタラーゼ遺伝子から誘導され、その際前記
遺伝子は最も好ましくはハンセヌラ・ポリモルファから
誘導される、請求項１９記載の微生物。 - （２４）、ＤＳＭ５２１５株の同定特性を有するメチロ
トローフ酵母。 - （２５）、第一のポリペプチドをコードする発現カセッ
ト（ｅｃ１）および／または第二のポリペプチドをコー
ドする発現カセット（ｅｃ２）および／または第三のポ
リペプチドをコードする発現カセット（ｅｃ３） ［ここで、前記発現カセットは ａ）メタノールおよび／またはカタボライト抑制炭素源
の枯渇に応答するレギュロンＲ； ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原の１つの生物学的活性を有する蛋
白の全部または一部をコードするオープン・リーディン
グ・フレーム； ｃ）場合により、ターミネーターＴとして作用するＤＮ
Ａ配列； を含む、ただしＲはオープン・リーディング・フレーム
の転写を制御し、そしてＴはポリアデニル化および／ま
たは生産されたｍＲＮＡの転写終結を支配する］ を含むＤＮＡ分子。 - （２６）、ＵＲＡ３遺伝子がハンセヌラ・ポリモルファ
から誘導されることを特徴とする、ＵＲＡ３遺伝子を含
むＤＮＡ分子。 - （２７）、請求項２５または２６記載のＤＮＡ分子を含
むことを特徴とする、メチロトローフ酵母の形質転換に
適するベクター。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US38534289A | 1989-07-25 | 1989-07-25 | |
| US385342 | 1989-07-25 | ||
| US38918489A | 1989-08-03 | 1989-08-03 | |
| US389184 | 1989-08-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0380083A true JPH0380083A (ja) | 1991-04-04 |
| JP3069907B2 JP3069907B2 (ja) | 2000-07-24 |
Family
ID=27010975
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2197578A Expired - Lifetime JP3069907B2 (ja) | 1989-07-25 | 1990-07-25 | 新規な抗原物質及びその製法 |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0414374B1 (ja) |
| JP (1) | JP3069907B2 (ja) |
| KR (1) | KR0181940B1 (ja) |
| CN (1) | CN1080304C (ja) |
| AT (1) | ATE159031T1 (ja) |
| AU (3) | AU5972890A (ja) |
| CA (1) | CA2021762C (ja) |
| DE (1) | DE69031556T2 (ja) |
| DK (1) | DK0414374T3 (ja) |
| ES (1) | ES2109921T3 (ja) |
| FI (1) | FI903721A0 (ja) |
| GR (1) | GR3025819T3 (ja) |
| HK (1) | HK1003032A1 (ja) |
| HU (1) | HU216013B (ja) |
| IE (1) | IE902690A1 (ja) |
| IL (1) | IL95153A0 (ja) |
| MA (1) | MA21911A1 (ja) |
| NO (1) | NO304268B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ234615A (ja) |
| PL (1) | PL168597B1 (ja) |
| PT (1) | PT94791B (ja) |
| SG (1) | SG48175A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06172392A (ja) * | 1991-04-29 | 1994-06-21 | Merck & Co Inc | 粒子を形成する多重ｂ型肝炎ウイルス表層タンパク質 |
| JP2008536515A (ja) * | 2005-04-18 | 2008-09-11 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド | ワクチンの調製のためのｂ型肝炎ウイルス表面抗原の発現 |
Families Citing this family (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3856496T2 (de) * | 1987-06-22 | 2002-06-27 | Medeva Holdings B.V., Amsterdam | Hepatitis-B-Oberflächenantigen enthaltendes Peptid |
| PL168408B1 (pl) * | 1989-08-03 | 1996-02-29 | Smithkline Beecham Biolog | Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL |
| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| IL101651A0 (en) * | 1991-04-29 | 1992-12-30 | Merck & Co Inc | Hepatitis b virus surface proteins with reduced host carbohydrate content |
| MY111880A (en) * | 1992-03-27 | 2001-02-28 | Smithkline Beecham Biologicals S A | Hepatitis vaccines containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid a |
| US6620414B2 (en) | 1992-03-27 | 2003-09-16 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A |
| DE69334297D1 (de) | 1992-05-23 | 2009-11-12 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Kombinierte Impfstoffe, die Hepatitis B oberfläche Antigen und andere Antigenen enthalten |
| ATE188613T1 (de) | 1992-06-25 | 2000-01-15 | Smithkline Beecham Biolog | Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung |
| US5776468A (en) * | 1993-03-23 | 1998-07-07 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine compositions containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid A |
| CA2129156A1 (en) * | 1993-07-30 | 1995-01-31 | Friedrich Dorner | High level expression of polypeptide that contains modified pres1 region of hepatitis b virus large antigen |
| US6488934B1 (en) | 1995-02-25 | 2002-12-03 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Hepatitis B vaccine |
| GB9503863D0 (en) * | 1995-02-25 | 1995-04-19 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine compositions |
| US5658579A (en) * | 1995-07-31 | 1997-08-19 | The Procter & Gamble Company | Cosmetic powder compositions having improved skin coverage |
| GB9623233D0 (en) | 1996-11-07 | 1997-01-08 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
| KR100372233B1 (ko) * | 1997-03-12 | 2003-06-11 | 주식회사 코리아나화장품 | 미백 파우더, 그의 제조방법 및 그를 함유하는 메이크업 미백 화장료 |
| CN100558401C (zh) | 1998-10-16 | 2009-11-11 | 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 | 佐剂系统及疫苗 |
| PL349347A1 (en) * | 1999-01-12 | 2002-07-15 | Smithkline Beecham Biolog | Novel treatment |
| FR2803599B1 (fr) * | 2000-01-06 | 2004-11-19 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveau virus mute de l'hepatite b, ses constituants nucleiques et proteiques et leurs applications |
| GB0109297D0 (en) | 2001-04-12 | 2001-05-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| JP4842128B2 (ja) | 2003-07-21 | 2011-12-21 | トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム | 新規多機能性サイトカイン |
| EP1654283B1 (en) | 2003-08-13 | 2011-07-13 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Improved method of purifying tfpi and tfpi analogs |
| GB0522765D0 (en) * | 2005-11-08 | 2005-12-14 | Chiron Srl | Combination vaccine manufacture |
| TWI457133B (zh) | 2005-12-13 | 2014-10-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 新穎組合物 |
| AU2007293672B2 (en) | 2006-09-07 | 2013-06-27 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine |
| US20090181078A1 (en) | 2006-09-26 | 2009-07-16 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| PL2468300T3 (pl) | 2006-09-26 | 2018-04-30 | Infectious Disease Research Institute | Kompozycja szczepionki zawierająca syntetyczny adiuwant |
| PL2086582T3 (pl) | 2006-10-12 | 2013-04-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Kompozycja zawierająca adiuwant w postaci emulsji typu olej w wodzie |
| WO2008043774A1 (en) | 2006-10-12 | 2008-04-17 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine comprising an oil in water emulsion adjuvant |
| US9452209B2 (en) | 2007-04-20 | 2016-09-27 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Influenza vaccine |
| AR066376A1 (es) | 2007-05-02 | 2009-08-12 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vacuna |
| US8722064B2 (en) | 2009-06-05 | 2014-05-13 | Infectious Disease Research Institute | Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants |
| CN102038948B (zh) * | 2009-10-10 | 2013-04-10 | 复旦大学 | 一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗 |
| WO2011046218A1 (ja) * | 2009-10-16 | 2011-04-21 | 株式会社カネカ | 抗体を生産するハンゼヌラ・ポリモルファ、それを用いた抗体の生産方法、およびそれにより得られる抗体 |
| BR112012026227A2 (pt) | 2010-04-13 | 2020-08-04 | Celldex Therapeutics, Inc. | anticorpo monoclonal humano ou humanizado, molécula biespecífica, vetor de expressão, célula transformada, composição, e, usos de um anticorpo |
| GB201105981D0 (en) | 2011-04-08 | 2011-05-18 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel process |
| AU2012243039B2 (en) | 2011-04-08 | 2017-07-13 | Immune Design Corp. | Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses |
| CN103087933B (zh) * | 2011-11-08 | 2015-07-22 | 北京生物制品研究所 | 一种重组多形汉逊酵母菌及其制备方法 |
| EP2811981B1 (en) | 2012-02-07 | 2019-05-08 | Infectious Disease Research Institute | Improved adjuvant formulations comprising tlr4 agonists and methods of using the same |
| CN102643349B (zh) * | 2012-04-17 | 2013-12-18 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 携带乙肝病毒抗原表位的重组嵌合蛋白及其制备 |
| ES2787455T3 (es) | 2012-05-16 | 2020-10-16 | Immune Design Corp | Vacunas para el VHS-2 |
| EP2912069B1 (en) | 2012-10-23 | 2019-07-31 | Emory University | Gm-csf and il-4 conjugates, compositions, and methods related thereto |
| US8957047B2 (en) | 2013-04-18 | 2015-02-17 | Immune Design Corp. | GLA monotherapy for use in cancer treatment |
| US9463198B2 (en) | 2013-06-04 | 2016-10-11 | Infectious Disease Research Institute | Compositions and methods for reducing or preventing metastasis |
| IL246456B2 (en) | 2013-12-31 | 2024-06-01 | Access To Advanced Health Inst | Formulations will be assembled into a single vial |
| WO2016145085A2 (en) | 2015-03-09 | 2016-09-15 | Celldex Therapeutics, Inc. | Cd27 agonists |
| CN105797151A (zh) * | 2016-03-25 | 2016-07-27 | 汪和睦 | 一种基于重组汉逊酵母的高剂量乙型肝炎疫苗 |
| BR112018071307A2 (pt) | 2016-04-18 | 2019-02-26 | Celldex Therapeutics, Inc. | anticorpos agonistas que ligam cd40 humana e usos dos mesmos |
| CN109310773B (zh) | 2016-05-16 | 2022-04-26 | 传染病研究所 | 含有tlr激动剂的配制品和使用方法 |
| CN109562057A (zh) | 2016-05-16 | 2019-04-02 | 传染病研究所 | 聚乙二醇化脂质体和使用方法 |
| IL311086A (en) | 2016-06-01 | 2024-04-01 | Access To Advanced Health Inst | Nanoalum particles containing a fixing factor |
| WO2018232257A1 (en) | 2017-06-15 | 2018-12-20 | Infectious Disease Research Institute | Nanostructured lipid carriers and stable emulsions and uses thereof |
| WO2019051149A1 (en) | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Infectious Disease Research Institute | LIPOSOMAL FORMULATIONS COMPRISING SAPONIN AND METHODS OF USE |
| CA3097369A1 (en) | 2018-04-17 | 2019-10-24 | Celldex Therapeutics, Inc. | Anti-cd27 and anti-pd-l1 antibodies and bispecific constructs |
| WO2020123444A1 (en) | 2018-12-11 | 2020-06-18 | Celldex Therapeutics, Inc. | Methods of using cd27 antibodies as conditioning treatment for adoptive cell therapy |
| US20220249646A1 (en) | 2019-05-25 | 2022-08-11 | Infectious Disease Research Institute | Composition and method for spray drying an adjuvant vaccine emulsion |
| WO2022051022A1 (en) | 2020-09-04 | 2022-03-10 | Infectious Disease Research Institute | Co-lyophilized rna and nanostructured lipid carrier |
| IL307519A (en) | 2021-04-09 | 2023-12-01 | Celldex Therapeutics Inc | Antibodies against ILT4, anti-ILT4\PD-L1 bispecific antibody and their uses |
| WO2023077521A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Celldex Therapeutics, Inc | Anti-ilt4 and anti-pd-1 bispecific constructs |
| WO2024052882A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-14 | Access To Advanced Health Institute | Immunogenic vaccine composition incorporating a saponin |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0288198A3 (en) * | 1987-04-20 | 1989-03-29 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production of peptide |
-
1990
- 1990-07-19 DE DE69031556T patent/DE69031556T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-19 AT AT90307900T patent/ATE159031T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-07-19 ES ES90307900T patent/ES2109921T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-19 EP EP90307900A patent/EP0414374B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-19 SG SG1996007620A patent/SG48175A1/en unknown
- 1990-07-19 DK DK90307900.2T patent/DK0414374T3/da active
- 1990-07-23 MA MA22181A patent/MA21911A1/fr unknown
- 1990-07-23 CA CA002021762A patent/CA2021762C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-23 PT PT94791A patent/PT94791B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-07-23 AU AU59728/90A patent/AU5972890A/en not_active Abandoned
- 1990-07-23 NZ NZ234615A patent/NZ234615A/xx unknown
- 1990-07-23 IL IL95153A patent/IL95153A0/xx unknown
- 1990-07-24 KR KR1019900011386A patent/KR0181940B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-07-24 NO NO903285A patent/NO304268B1/no not_active IP Right Cessation
- 1990-07-24 FI FI903721A patent/FI903721A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1990-07-24 IE IE269090A patent/IE902690A1/en unknown
- 1990-07-25 JP JP2197578A patent/JP3069907B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-25 HU HU4615/90A patent/HU216013B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-07-25 PL PL90286209A patent/PL168597B1/pl unknown
- 1990-07-25 CN CN90107172A patent/CN1080304C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-10-28 AU AU77528/94A patent/AU7752894A/en not_active Abandoned
-
1997
- 1997-04-18 AU AU18968/97A patent/AU714652B2/en not_active Ceased
- 1997-12-30 GR GR970403469T patent/GR3025819T3/el unknown
-
1998
- 1998-03-13 HK HK98102133A patent/HK1003032A1/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06172392A (ja) * | 1991-04-29 | 1994-06-21 | Merck & Co Inc | 粒子を形成する多重ｂ型肝炎ウイルス表層タンパク質 |
| JP2008536515A (ja) * | 2005-04-18 | 2008-09-11 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド | ワクチンの調製のためのｂ型肝炎ウイルス表面抗原の発現 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0380083A (ja) | 新規な抗原物質及びその製法 | |
| CA1341642C (en) | Synthesis of hepatitis b virus surface antigen by yeast | |
| AP56A (en) | Hepatitis B virus surface antigens and hybrid antigehs containing them. | |
| EP0522030B1 (en) | Hepatitis b vaccine | |
| US6306625B1 (en) | Method for obtaining expression of mixed polypeptide particles in yeast | |
| US6475489B1 (en) | Synthesis of human virus antigens by yeast | |
| FI104639B (fi) | Hepatiitti B:n S- ja PreS2 -proteiinien ilmentäminen metylotrooppisissa hiivoissa | |
| US6103519A (en) | Antigens and methods therefor | |
| US5851823A (en) | Hepatitis B vaccine | |
| CZ226993A3 (en) | Set of surface proteins of particle-forming hepatitis b virus | |
| Kniskern et al. | The application of molecular biology to the development of novel vaccines | |
| WO1994001132A1 (en) | VACCINE COMPRISING MIXED preS1+preS2+S AND CORE PARTICLE | |
| EP0340806B1 (en) | Synthesis of human virus antigens by yeast | |
| AU642729C (en) | Hepatitis B vaccine | |
| CA2078358A1 (en) | Multivalent hepatitis b virus vaccine | |
| US5989865A (en) | Hepatitis B vaccine | |
| IE67139B1 (en) | Synthesis of human virus antigens by yeast |