KR0181940B1 - 변형된 HBsAg 라아지 단백질 - Google Patents
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Abstract
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Description
제1도는 pHARS1으로부터 얻은 플라스미드 pME4의 구성. HARS1 단편은 전자(former) pHARS1의 단일 PvuⅡ 부위로 전이(transfer)되었고, 베타-락타마제 유전자 자체의 5' 말단 뿐 아니라 베타-락타마제 유전자와 HARS의 전자 위치 사이의 서열은 삭제되었다.
제2도는 a) MOX 유전자
b) FMD 유전자를 포함하는 게놈성 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) DNA 단편을 운반하는(carrying) 람다-파지의 개략도
제3도는 플라스미드 pT-24 지도. 본 플라스미드는 pUC19 다중 용도 클로닝 부위(multiple purpose cloning site)의 SmaI-부위로 클로닝된 MOX 유전자의 터미네이터로 둘러싸인 DNA 단편을 포함한다.
제4도는 각각, MOX- 또는 FMD-프로모터의 제어하에 S-유전자를 발현시키는 플라스미드 pRB-S-269 및 pRB-S-271 지도.
제5도는 플라스미드 pBC, pMS-2, pFS-9 지도. 후자 두개의 플라스미드는 MOX 프로모터 (pMS-2) 또는 FMD 프로모터 (pFS-9)를 함유하는 발현 카세트를 URA3 유전자 코딩 서열로 삽입시켜 한세눌라 폴리모르파 URA3 유전자를 함유하는 pBC로부터 유도된다.
제6도는 플라스미드 pHK2 지도. 본 플라스미드는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 ADH1-프로모터 제어하에 카나마이신 유전자(Tn5로부터 유도)를 포함한다. 이외에, 플라스미드 pHK2는 HARS1 서열을 포함한다,
제7도는 플라스미드 pRB-S-322 및 pRB-S-326 지도. 플라스미드 pHK 상에 존재하는 것과 같은 ADHI -프로모터 및 카나마이신 내성 유전자로 구성되는 기능 단위는 플라스미드 pRB-S-269 및 pRB-S-271의 HARS 부위로 삽입되었다.
제8도는 pMOX-P/T1으로부터 pMPS-22의 구성. B형 간염 바이러스의 preS 유전자를 플라스미드 pMOX-P/T1의 EcoRI 부위로 삽입시켰다. 결과 플라스미드 pMPS-22에서, preS 유전자는 MOX 프로모터에 의해 제어된다.
제9도는 플라스미드 pMPS-9 지도. 본 플라스미드 작제를 위해, pMPS-22의 perS 발현 카세트를 원래 플라스미드 pBC의 한세눌라 단편의 StuI 및 XhoI 부위 사이로 삽입시켰다.
제10도는 한세눌라 폴리모르파 URA3 유전자 및 인접 DNA-영역 지도.
제11도는 외래(foreign) 유전자 서열을 MOX 프로모터 제어하에 삽입시킬 수 있는, 플라스미드 pMPT121 구조를 예증하는 도해.
제12도는 MOX 프로모터 제어하에 L* 단백질에 대한 발현 카세트를 함유하는 플라스미드 pKL*1의 구조를 예증하는 도해.
제13도는 Gly13 결실된 L 단백질-발현 카세트, pRIT12998에 머무는 이. 콜라이 플라스미드 작제를 위한 단계를 보여주는 개략적인 도해.
제14도는 Gly13 결실된 단백질을 발현시킬 수 있는 효모 플라스미드 pRIT12979를 얻기 위한 절차를 예증하는 개략적인 도해.
제15도는 아미노산 53-132 및 146-174 결실된 L 단백질에 대한 코딩 서열을 함유하는 플라스미드 pRIT13191의 작제를 예증하는 개략적인 도해.
제16도는 각각 L*및 △ Gly L*단백질에 대한 발현 카세트를 함유하는 효모 발현 플라스미드 pRIT13192 및 pRIT13193의 작제를 예증하는 개략적인 도해.
본 발명은 메틸요구 효모 속 계열의 미생물, DNA 분자 함유 발현 카세트, 메틸요구 효모의 형질전환에 적합한 벡터, 미생물 제조방법, B형 간염 표면 항원의 생물학적 작용을 갖는 단백질의 전부 또는 일부에 상응하는 적어도 두개의 폴리펩티드를 함유하는 복합입자, 복합 입자의 제조방법에 관한 것이며, 또한 이와 같은 것을 함유하는 조성물, 백신 및 시험 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한, B형 간염 바이러스(hepatitis B virus)의 변형(modification)된 라아지 표면 단백질(large(L) surface protein)을 합성하는 미생물 균주의 작제(construction)에 관한 것으로, 이때, B형 간염 표면 항원은 이의 생물학적 작용을 변경하고 향상시키기 위해서 다양한 코딩(coding) 서열 위치에서 변형된다.
간염은 여러 요인에 의해 발병될 수 있는 만연된, 심각한 전염병이다.
한가지 중요한 인자는 약 200 염기쌍의 단일 나선 갭을 가진 3,200 염기쌍 이중-나선 DNA 써클로 구성되는, 특이 게놈을 함유하는 약 43 nm 지름의 작은 바이러스 입자인 B형 간염 바이러스(HBV)로서 규명되었다. 상기 바이러스 입자로의 감염은 급성 때때로, 치명적인 질병을 야기시킨다. 감염된 사람의 85%는 약 3개월간 앓은 후 회복되고, 약 1%는 간 조직의 급성 괴사로 고통받다가 단기간내에 사망하고, 약 10%는 질병의 재발로 고통받는다. 감염된 사람의 대략 4%는 일차 간세포 암 또는 간 경변(cirrhosis)의 증가된 위험을 가진 채 만성 보균자 상태로 발전한다.
감염은 대개, 예컨대 수혈동안 또는 오염된 주사기 또는 팁의 사용에 의해 또는 성 접촉에 의해, 전염성 바이러스 입자의 분만전후 또는 비경구적 전반(transmission)을 거쳐 일어난다. 그러므로, HBV의 검출을 위한 신뢰할만한 진단 수단 및, 만성 보균자의 결혼, 높은 HBV 풍토성 지역으로의 여행자, 만성 보균자의 신생아, 동성애, 매춘부 및 약 남용자와 같은 높은 위험의 노출에 있는 사람들을 보호하기 위한 백신에 대한 절박한 요구가 있고, 이는 낮은 가격으로 살 수 있어야 한다. 이외에, 제3세계 국가에서는, 대량 면역법 프로그램을 위해 값싼 백신을 필요로 한다.
원형, 부분적으로 이중 나선 DNA 게놈을 둘러싸는 핵(HBcAg) 및 캡시드(capsid) 또는 표면(HBsAg) 항원 단백질로 구성된 바이러스성 입자 이외에도, 감염된 개인의 혈액은 표면 항원 단백질 및 숙주 지질(lipid)을 함유하는 실질량의 HBsAg 입자를 포함할 수 있다. 이들 입자는 건강한 혈청으로부터 정제되었고, 백신으로 배합시 HBV 감염에 대한 보호를 부여하는 것으로 밝혀졌다(Szrmuness 일행,1980).
본 출원에서, 괄호안에 처음에는 저자 그리고 공개 연도가 언급된 특정출판물들이 인용된다. 알파벳 순서로 나열된 이들참고 문헌에 대한 모든 인용은 명세서의 말미에서 찾을 수 있다. 이들 출판물의 전체 공개 내역은, 기술 현황을 더욱 완전히 기술하기 위해 본 출원에 참고로 포함된다.
혈청 유도된 HBsAg로부터의 백신 제조는 감염된 혈액의 한정된 공급 및, 잠재적인 병원체의 제거 및/또는 불활성화를 확실히 하기 위한 길고 엄격한 시험을 통과해야 요구에 의해 제한을 받는다.
인간에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염은, 혈청내에서 발견되는 B형 간염 표면 항원(HBsAg)을 운반하는 다양한 구조물과 관련된다 [Tiollais 일행, Nature, 17 : 489(1985)]. 전염성 바이러스 입자 이외에, 실같고 구형인 지름 22 nm의 입자 (약 100 개의 엔벨로프 단백질을 함유)가 존재하는데, 이는 세개의 간염 표면 단백질 : 주요 (S, small), 미들(M, middle) 및 라아지(L, large) 단백질과 함께 숙주-유도 지질이 결합하여 형성된다.
이들 단백질은 S 단백질 코딩 서열로서 공지된, HBV 게놈상의 동일한 226개의 아미노산 서열을 공유한다. HBV 게놈상의 S 단백질 코딩 서열 바로 앞의 전체 아미노산 코딩 서열은 여기서 preS 코딩 서열로서 일컬어진다. preS 코딩 서열은 preS2 부위라 일컫는, S 단백질 바로 앞의 55개 아미노산 서열을 코딩하고, preS1 부위라 일컫는, preS2 부위 바로 앞의 108 또는 119 아미노산 서열을, 바이러스 아형(亞型, subtype)에 의존하여 코딩한다.
그러므로, 전체 preS 코딩 서열은 ay 아형의 경우에는 163(55 preS2+108 preS1) 아미노산을 코딩하고, 대부분의 ad 아형의 경우에는 174(55 preS2+119 preS1) 아미노산을 코딩한다. ad와 ay 분리균(isolate)의 게놈에서의 preS 코딩 서열 사이의 서열 비교는, ad 분리균의 preS1 부위의 첫번째 열한개 코돈이 ay 아형에는 존재하지 않음을 보여준다. 일반적으로 채택된 명명법에 따라, 본 출원 전체에 걸쳐서 ad 아형의 코돈 및 아미노산 번호매김이 따르는데, 즉, ay 아형의 163 아미노산 preS 부위는 12-174로 번호가 매겨지는 반면, ad 분리균의 HBV 게놈은 1-174로 번호가 매겨진 174 아미노산의 preS 부위를 코딩한다.
주요 단백질 (S)는 226 아미노산 코돈 S 유전자에 의해 코딩되고, 글리코실화 및 비-글리코실화 형태로 존재한다.
미들 단백질 (M)은 preS2 부위 및 S 단백질을 포함한다(M 단백질 : 55+226 아미노산) M 단백질은 글리코실화의 정도에 따라 두가지 형태로 존재하는 당 단백질이다. [Stibbe 일행, J. Virol., 46 : 626-628)(1983)] preS2 부위에 의해 코딩된 55 아미노산은 친수성이고, 엔벨로프 유전자(잔기 132-137)의 표면에 위치한 면역지배적(immunodominant) 에피토프를 포함한다. 상기 에피토프는 이황화물 결합-독립이고, S 단백질의 에피토프보다 더 면역원성임이 보고되었다. [Neurath 일행, Science, 224 : 392-394(1984); Neurath 일행., Nature, 315: 154-156(1985)] preS2 서열은 중합된 인간 혈청 알부민 (pHSA)에 대한 수용기도 또한 포함한다. [Machida 일행, Gastroent., 86 : 910-918(1984)]상기 수용기는 또한, 단합체(monomer) HSA에 결합할 수 있고, 또한 pHSA에 대한 수용기를 가지는 헤파토사이트에 대해 HBV의 부착을 매개할 수도 있다. 이러한 결합은 인간에서 내성(tolerance) 또는 자가-면역 반응을 이끌 수 있는 것으로 제안되었다.
라아지 단백질(L)은 preS1 부위, preS2 부위 및 S 코딩 서열 (L 단백질 : 108(또는 119)+55+226 아미노산)을 포함한다. 이는 글리코실화 및 비-글리코실화 형태로 존재한다. L 단백질은 아형에 따른 가변길이를 갖는다. 예컨대, ay 및 ad 아형에 대해 각각 389 및 400 아미노산 길이. preS1 해독(translation) 생성물은 헤파토사이트로의 HBV의 부착과도 관련된다.
S 및 M 특이 전사에 대한 프로모터가 L 단백질의 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 내에 삽입되기 때문에, L 단백질에 대한 완전한 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 DNA 로의 포유동물의 형질 전환은 모든 세개의 표면 단백질 합성을 결과시킬 수 있다. 포유 동물 세포에서는, HBsAg 입자가 분비된다. [Tiollais 일행, 앞서 인용됨] 포유 동물 시스템에서, L 단백질의 발현은 HBsAg 입자의 분비를 억제한다. [예컨대, Ou 일행, J. Virol., 61 : 782 (1987) 참고] 상기 현상은 출아 또는 분비 과정을 방해하는, N-미리스토일기의 L 단백질상의 존재와 관련된 것으로 제안되었다. [Persing 일행, Science, 234 : 1388-1391(1986); Persing 일행, J.Virol.,,61 : 1672-1677(1987)]
용이한 참고를 위해, 하기 표 1은 여기 논의된 HBV 단백질의 preS1, preS2 및 S 부위에 대한 아미노산 서열 및 DNA 코딩 서열을 제시한다. 아미노산 번호는 코돈 위의 괄호내에 있으며, 번호는 플라스미드 pRIT10616 상에 서브클로닝된 HBV adw 분리균 서열에서 발견되는 엔벨로프 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임 내 존재하는 첫번째 ATG 코돈으르부터 매겨진다. 상기 ad 서열의 첫번째 열한개 코돈은 본 출원에 기술된 임의의 발현 카세트에 존재하지 않기 때문에, 이들 서열은 표 1에 제공되지 않았다. 이. 콜라이 (E. Coli) K12 균주 600에 잠복된 플라스미드 pRIT1O616은 기탁 번호 ATCC 39131 하에 American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, U. S. A)에 기탁되었다.
해독 개시 코돈에 대해 5'에 위치한 바이러스성 전사 개시 신호는 생체내에서 preS1, preS2 및 S 단백질 각각의 발현을 조절한다. 포유 동물 세포에서 해독하는 동안, 단백질은 하기표에서 나타낸 바와 같이 표면 항원 세트를 결과시키면서, 글리코실화될 수 있다.
* : 아형 ayw; adw-아형으로부터 유도된 preS1-단백질은 약 1.0-1.5 kDa 더 크고, 이는 N-종결 말단에서 부가적인 11개 아미노산이 더 따른다(Heermann 일행, 1984)
표면 항원 코딩 부위의 DNA 서열이 공지되었기 때문에, 재조합 DNA 기술로 S 단백질을 만들기 위한 시도가 행해졌다. 이. 콜라이에서 HBsAg의 발현을 보고한 여러 다른 연구원 뿐만 아니라 Burrell 일행(1979) 및 Murray 일행(1980), Valenzuela 일행(1982)은 효모에서 HBsAg의 발현을 보고 했다. 효모 알콜 탈수소효소I 프로모터(yeast alcohol dehydrogenase I promoter) 하에 S 단백질 코딩 서열을 함유하는 벡터로 전환된 효모 세포의 파멸 후에, HBV로 감염된 개인의 혈청에서 발견된 것과 유사한, HBsAg를 함유하는 구형 입자가 관찰될 수 있었다. 유럽 특허 출원 제0 226 846호(Tschopp 일행)에서, 효소 피치아 (Pichia) 내 HBV S-단백질의 생산이 기술된다. 단백질 합성은 메탄올에 반응하는 조절 영역의 제어하에 놓여 있다.
그러나, 비록 배타적으로 S-항원 입자를 함유하는 백신이 대개 매우 보호적이라 (Szrmuness 일행,1980) 할지라도, 몇가지 숙주는 상기 제제에 열등하게 반응(response)한다. 백신 주사의 예측할 수 없는 상기 실패를 극복하기 위해, preS2-단백질 및 preS1-단백질 발현을 위한 시스템이 개발되어졌다. preS2는 S-단백질보다 훨씬 더 면역원성인 것으로 알려졌다. 예컨대, preS2 및 S-특이 에피토프를 함유하는 서브바이러스성 입자를 가진 생쥐의 면역 결과, preS2에 반응하는 항체는 항-S-반응을 초과한다 (Milich 일행, 1985). 더 나아가, preS2 함유입자로의 면역이 항-S-반응도 유도할 수 있는 것으로 관찰되었다. 면역법에서 preSl- 및 preS2- 단백질의 역할과 HBV 표면 항원 단백질의 T- 및 B- 세포 인식 특이성이 최근 보고되었다(참고; Milich,1988) Valenzuela 일행(1985)은 상응하는 바이러스성 서열을 함유하는 플라스미드로 전환된 효모내 전체 preS2-단백질 코딩 서열의 발현을 기술한다. 효소 전사에서, HBV-ORF 내 바이러스성 전사 개시 신호는 효모 전사 시스템에 의해 인식되지 않기 때문에, 개시는 개별적인 코딩 부위에 선행하는 효모 프로모터에 의해 조작되어야 함에 주목해야 한다.
Iich 일행(1986) 및 다른 사람들도 또한, 효모내 preS2-단백질의 발현 및 입자로의 어셈블리에 대해 기술한다. Dehoux 일행(1986)은 호모내 39 KD preS1-단백질의 발현을 기술하고, 이것이 입자 형태로 어셈블리된다고 기술한다. Imamura 일행에 의한 보고(1987)는, preS2-단백질 및 preS1-단백질 둘다의 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)에서의 발현에 대해 기술한다. 이들 저자들은, 라아지 단백질은 42KD 분자량의 비교적 안정한, 비-글리코실화 산물로 발견되므로, 쉽게 입자로 어셈블리되지 않는다고 기술한다.
효모 에스. 세레비지애에서 만들어진 표면 단백질의 글리코실화는 HBV로 감염된 개인으로부터 분리된 자연적으로 발생하는 입자에서 관찰된 글리코실화와는 다르다. S-단백질은 글리코실화되지 않은 반면, preS2-단백질 및 preS1-단백질은 N-결합 글리코실화 및 비-글리코실화 형태로 생성된다. O-결합된 과당류 사슬 뿐아니라, 높은 만노스 형태의 N-결합된 사슬이 확인되었다(Itch 일행,1986; Langley 일행,1988).
포유 동물 세포내에서도 HBV 표면 항원의 발현이 수행되었다. Michel 일행(1984)은 preS2-단백질 코딩 서열을 운반하는 플라스미드로 트랜스펙팅된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포내 HBsAg의 합성을 기술한다. Persing 일행(1985)은 preS2-단백질 코딩 서열로 형질전환된 생쥐 L 세포내 24,000, 27,000 및 35,000 달톤의 세개 HBsAg 관련 폴리펩티드의 발현을 기술한다. 얻어진 세개 폴리펩티드는 약 22 nm 지름의 복합 면역 반응성 HBsAg입자를 조직할 수 있다.
McLacahlan 일행 (wo 88/06185)은 척추 세포내 다양한 HBV 관련 단백질의 발현에 대해 보고했다. 그러나, 포유동물 세포내 preS-항원의 발현은 억제된 HBsAg 입자의 S-단백질 분비에 비해 preS1-단백질의 상당한 생산과잉에서 기인한다는 사실에 의해 대개 방해된다(Ou 일행,1987). 이외에, 서로 다른 S 관련 단백질의 비율은 조정될 수 없다. 결국, 동물 세포의 배양은 얻어진 생성물에 대해 고가가 결과되는 값비싼 접근이다.
비록 현재 기술되고 사용중인 백신이 높은 효능을 가졌다할지라도, 상기 백신을 받은 사람의 특성 백분율, 특히 면역절충된(immunocompromised) 사람 예컨대, 혈액 투색(hemodialysis) 환자는 무- 또는 느린 반응자이다 [예컨대, Hadler 일행, New Engl. J. Med., 315 : 209-215(1986); 및 Bruguera 일행, Post Grad. Med. J., , 63 : 155-158(1987) 참고].
그래서, HBV에 대해 부가적으로 효과적인 백신을 제조하는데 유용한 조성물 및 방법에 대한 요구가 당분야에 있다 :
본 발명이 첫번째 양상에 따라, 하기 A)-B)를 운반하는, 메틸요구 효모 속의 군중에서 선택된 미생물이 제공된다.
A) 첫번째 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (ec1)의 하나 이상의 복사(copy) 및/또는 두번째 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (ec2)의 하나 이상의 복사, 임의로 세번째 폴리펩티드를 코딩하는 하나이상의 발현 카세트 (ec3), 또는
B) 첫번째 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (ec1)의 한개 복사 및 두번째 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (ec2)의 하나이상의 복사, 임의로 이외에 세번째 폴리펩티드를 코딩하는 하나이상의 발현 카세트(ec3) 여기서, 발현 카세트는
a) 이화물질억제 탄소원의 부족 및/또는 메탄올에 반응하는 레귤론 R;
b) B형 간염 표면 항원 중 하나의 생물학적 활성을 갖는 단백질 모두 또는 부분 (또는 부분들)을 코딩하는 오픈 리딩 프레임;
c) 임의로, 전사 터미네이터 T로서 제공되는 DNA 서열로 구성되고, 여기서 R은 오픈 리딩 프레임의 전사를 제어하고, T는 생성된 mRNA 전사의 종결 및/또는 폴리아데닐화를 조절한다.
본 발명 상기 양상의 장점은, 다양한 비율의 preS2- 및 S-단백질을 함유하는 복합 입자를 얻기 위한 수단이 제공되어서 저가로 이들 복합 입자를 대량 생산하게 된다는 점이다.
본 발명은 또한, B형 간염 표면 항원이 생물학적 작용을 가진 단백질 모두 또는 일부에 상응하는 적어도 두개의 폴리펩티드를 함유하는 복합 입자를 제공하고, 여기서, 입자는 S-단백질, preS2-단백질 또는 preS1-단백질에 의해 제공된 적어도 두개의 항원결정기를 제시하고, 상기 입자는 임의로 또한 숙주 특이 지질을 포함한다.
명세서를 통해 사용된 하기 용어는 하기와 같이 정의된다 :
발현 카세트는 완전 유전자 발현 단위로서 숙주 세포에서 작용하는 DNA의 임의 분리(discrete) 영역으로서 정의된다.
완전 유전자 발현 단위는 구조유전자 및 프로모터 및 그의 전사와 해독을 위해 요구되는 조절 부위이다.
기능 DNA 코딩 영역은 S 단백질 코딩 서열과 상융합될 때, HBsAg 혼합입자의 어셈블리를 방해하지 않는 DNA 코딩 서열을 의미한다.
기능 유도체는 입자 형성을 방해 하지 않고, 면역 유전성(immunogenicity) 또는 다른 기능성을 보유하는 아미노산 변조(alteration)를 갖는 코딩 서열을 의미한다. 상기 기능 유도체는 통상적인 부위 특이 변이유발(site specific mutagenesis) 또는 다른 표준 기술에 의해 제조될 수 있다.
벡터는 예컨대, 파지 및 플라스미드를 함유하는, 본 발명의 DNA 단편을 운반하고 유지할 수 있는 DNA로서 정의된다. 이들 용어는 유전 공학분야의 기술자들에게 이해된다.
또 다른 주제로 구성되는 본 발명은 하기 설명, 실시예 및 도면에 의해 더욱 상세한 방식으로 이제 기술된다.
본 발명의 첫번째 양상에 따른 미생물은 메틸요구 효모속의 임의류일 수 있고, 이는 발현 카세트 ec1 및 임의로 하나이상의 발현 카세트, ec2 및/또는 임의로 하나이상의 발현 카세트 ec3 또는 두개이상 다른 형태의 적어도 하나의 발현 카세트의 하나이상의 복사를 운반하는 것을 조작한다. 발현 카세트는 발현될 코딩 단백질 성질에서의 차이만을 요구하고, 대개 하기 성분으로 구성된다 :
a) 이화물질 억제 탄소원의 부족 및/또는 메탄올에 반응하는 레귤론 R. 출원을 통해 사용된 바와 같은 용어 레귤론은 주어진 구조유전자의 발현 조절에 관련된 임의 시스-작용 DNA로 구성된다. 그래서, 용어는 예컨대, 전사인자 또는 전사조절에 관련된 다른 단백질에 의해 인식되는 서열 및 프로모터 같은 주어진 코딩 서열에 선행하는 서열을 포함한다. 그러므로, 용어 레귤론의 의미는 공지된 프로모터에 상응하는 서열에 제한되지는 않는다. 또한, 공지된 메탄올 유도성 유전자 레귤론과 같이 메탄올에 대한 동일한 반응을 나타내는 DNA 서열, 즉, 기능적으로 균등한 서열 모두를 포함한다.
상기 기술된 성질을 나타내는 최근의 여러 레귤론이 공지되었다. 예컨대, Ledeboer 일행(1985)은 한세눌라 폴리모르파의 메탄올 옥시다제(MOX, methanol oxidase) 구조유전자에 선행하는 조절 DNA 서열에 대해 기술한다. Unilever NV에 대한 EP 85 201 235.0에서는, 단백질 발현을 위한 시스템이 기술되었는데, 이는 생체내 메탄올 옥시다제 및 DHAS의 발현을 조절하는 프로모터의 사용과 관련된다. Rhein Biotech GmbH의 EP 87 110 417에서는, 포르메이트 탈수소효소 프로모터 (FMD, formate dehydrogenase promoter) 제어 하에 외래 단백질의 발현에 적합한 시스템이 제안되었다. Ellis 일행(1985)은 피치아 파스토리스(Pichia pastorie)로 부터의 메탄올 조절성 유전자의 분리를 기술한다. 이들 및 다른 프로모터들은 메틸요구 효모 속으로부터 얻어지거나 얻을 수 있고, 이는 잠재적으로 메탄올 이용과 관련되고, 이들 모두는 그들에 의해 조절되는 개볘 유전자의 증가된 합성에 탄소원의 부족 및/또는 메탄올 첨가에 반응한다는 데에 공통점이 있다. 또한, 동일한 반응성을 나타내는 모든 DNA 서열도 포함된다.
b) B형 간염 표면 항원 중 하나의 생물학적 작용을 가진 단백질 일부 또는 모두에 대한 오픈 리딩 프레임(ORF) 코딩. 이미 언급했듯이, 주어진 아형의 B형 간염 표면 항원은 길이와 글리코실화 패턴이 다른 약 6개의 서로다른 단백질 세트로 구성된다. 이들 단백질은 서로다른 항원결정기를 나타내고, 또한 살아있는(viable) 바이러스에 대해 서로 다른 기능을 갖는 것 같다. 단, preS 면역 반응을 유도하기 위해, 개별적인 완전 preS-서열을 제공하는 것이 반드시 필요하지는 않으며, 적절한 에피토프를 오픈 리딩 프레임 내에서 코딩하는 코돈만을 함유하는 것도 충분할 수 있다. 이외에 B형 간염표면 항원 중 하나의 생물학적 작용을 갖는 단백질은 또한, 그들의 생물학적 작용을 방해하지 않는 아미노산이 바뀌어진 단백질도 포함한다.
c) 임의로, 터미네이터 T로서 제공되는 DNA 서열. 터미네이터로서 임의 서열이 사용될 수 있고, 이는 개별적인 숙주 유기체에서 전사를 효과적으로 종결시킨다. 터미네이터는 예컨대, 전사 RNA 내 폴리아데닐화 영역 및/또는 헤어핀 구조의 형성을 제공하기 쉬운 서열일 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 동일한 유기체의 메탄올 반응 유전자 및/또는 레귤론과 동일한 유전자로부터 유도된 터미네이터가 얻어졌다.
이들 세개 성분은, 레귤론이 전사를 조절할 수 있고, 터미네이터가 그들 사이의 오픈 리딩 프레임의 전사를 종결시킬 수 있도록 하기 위해 조작될 수 있는 결합으로 배열된다.
본 발명에 따른 미생물은, 첫번째 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트의 하나 이상의 복사 및/또는 서로다른 부가적인 발현 카세트 각각이 하나이상의 복사 존재때문에, 코딩 단백질이 전사 및 해독이 매우 증가된 양으로 일어날 수 있다는 상당한 장점을 가진다. 본 발명에 따른 미생물은 세포내의 첫번째 대 두번째 폴리펩티드의 임의의 원하는 비율을 얻기 위한 가능성을 제공한다. 그러므로, 입자를 형성시키기 위한 단백질 어셈블리에서, 임의 조성의 복합 입자가 얻어질 수 있다. 더 나아가, 서로 다른 단백질이 아주 밀접하게 고량 생성되기 때문에, 이들 단백질은 당분야에 공지된 입자보다 하나 이상의 폴리펩티드 종으로 구성되는 입자를 형성시키는 것이 더 쉽다.
본 발명에 따르는 미생물은 첫번째 발현 카세트(ec1)로부터 S-단백질 모두 또는 일부를 바람직하게 발현시킨다. 왜냐하면, 이는 형성될 수 있는 임의 입자의 구조적 골격을 구성하기 때문이다. 한가지 실시양태에서, 미생물은 preSl-단백질 전부 또는 부분 예컨대, 상기 단백질의 N-종결 말단에 국재된 preS1 특이 영역 또는 preS2-단백질 전부 또는 부분을 나타내는 폴리펩티드를 발현시키는 두번째 발현 카세트(ec2)를 또한 포함한다.
다른 실시양태에서, 미생물은, S-단백질 전부 또는 부분, preS1-단백질 모두 부분 및 preS2-단백질 전부 또는 부분으로 구성되는 세개 폴리펩티드를 동시에 발현시킬 수 있는 서로 다른 형태의 발현 카세트를 포함할 수 있다.
더 나아가, 메틸 요구 효모로부터 유도된 레귤론의 사용은 탄소원의 부족 또는 첨가에 의해 또는 값싸게 구입할 수 있는 메탄올의 첨가에 의해 세포 배양의 억제, 활성화 또는 유도를 가능케 한다.
메틸요구 효모 군은 하기속(genera)의 종류로 구성된다: 칸디다(Candida), 클로엑케라(Kloeckera), 사카로마이세스(Saccharomyes), 로도토룰라(Rhodotorula), 토룰로프시스(Torulopsis) 및 피치아(Pichia), 바람직하게 한세눌라(Hansenula). 가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 미생물은 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 피치아 파스토리스 또는 한세눌라 폴리모르파로부터 유도된다. 이들 속으로부터의 효모는 당분야의 기술자들에게 잘 공지되어 있고, 그들의 일반적인 배양 및 성장 조건이 확립되었다.
바람직한 메틸요구 효모의 유용한 균주인 한세눌라는 종 한세눌라 폴리모르파의 임의 균주일 수 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 사용될 균주는 한세눌라 폴리모르파 RB 10 (DSM 5215)로 규명된 특성을 가진다. RB 10은 한세눌라 폴리모르파 ATCC 34438의 Ura 3변이체이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따르는 미생물은 탄소원으로서 글리세롤의 효과적인 이용을 가능케한다. 글리세롤은 공지된 메틸요구 효모에 의해 서로 다른 효율을 가진 에너지를 전환될 수 있는 비-이화물질에 억제 탄소원이다. 속 한세눌라의 효모 종은 고 효율로 글리세롤을 대사시킬 수 있는 반면, 에스 세레비지애는 상기 탄소원 상에서 열등하게 생장한다. 이외에, 글리세롤 상에서 한세눌라 폴리모르파의 생장은, 대규모 발효동안 문제를 일을키는 에탄올 부산물을 매우 적은 양으로 결과시킨다.
본 발명의 발현 카세트를 위해 사용된 레귤론은 상기 언급된 잘 공지된 속의 효모로부터 바람직하게 유도된다. 한세눌라 폴리모르파의 다양한 메탄올 반응 유전자 (예컨대, 메탄올 옥시다제 유전자, FMD 유전자, DAS 유전자 또는 카탈라제 유전자)로부터의 조절 부위와 같은, 상세히 특징지워진 레귤론이 바람직하다. 이들 유전자 대부분의 조절 부위는 이미 서열화되었고, 서열은 공개되었다 (예컨대, Janowics 일행,1985; Ledeboer 일행,1985, EP 87 11O 417) 이들 레귤론을 적절한 미생물로부터 분리하는 기술 과정은 각각의 DNA 서열 및 상응하는 제한 효소 패턴에 관한 지식에 의해 용이하게 수행된다.
터미네이터로서, 진핵 또는 원핵 유전자로부터 유도되는지의 여부에 관계없이 신생(nascent) mRNA를 효율적으로 종결시키는 임의 서열이 포함될 수 있다. 바람직한 터미네이터는 효모 유전자로부터 유도된다. 상기 인용된 메탄올 반응 유전자로부터 얻어지는 종결 서열의 사용이 가장 바람직하다.
본 발명에 따르는 미생물의 다른 장점은 놀랍게도 많은 수의 발현 카세트가 개별적인 숙주 세포로 도입되고 안정하게 유지될 수 있다는 점이다. 일반적으로, 특이 유전자 정보의 안정한 유지를 얻기 위한 두가지 가능성이 있다:
정보는 염색체로 코딩되거나 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 그와 유사한 것과 같을 수 있는, 자발적 복제 벡터상에 국재된다. 대개 더 높은 유전자 용량은, 높은 복사수를 가진 자발적 복제 플라스미드 또는 라이소제닉(lysogenic) 바이러스를 사용하여 바람직한 숙주 유기체에 형질전환함으로써 얻어진다. 이들 플라스미드 또는 바이러스는 당분야에 잘 공지되고, 대개 레플리콘 및, 복제와 벡터의 안정한 유지를 가능케하는 선택 마아커 유전자를 포함한다. 그러나, 바이러스는 라이틱(용균성) 사이클로의 전환에 종종 놓여지고, 플라스미드는 특정 조건하에 손실되기 쉬우며, 더 나아가 종종 연속적인 선택압을 필요로한다. 또한, 높은 복사수를 가진 플라시미드라 할지라도, 약 50-75를 넘지 않는 복사 수만이 대개 효모에서 얻어질 수 있다. 한편, 바람직한 유전자 정보 예컨대, 발현 카세트의 숙주 게놈으로서의 도입은 대개, 삽입되어질 DNA 서열의 적어도 일부 바람직하게, 상기 분자의 말단과 삽입 부위 사이에 특정 정도의 상동(homology)을 요구한다. 그래서, 주어진 분자의 상동성 재조합을 위한 잠재적인 통합 부위의 수는 대부분의 경우에 단지 하나로 제한된다. 상기 수는 다중 복사로 존재하는 유전자 또는 Ty (Jacobs 일행,1988)와 같은 트랜스포손 (transposon) 유사 구조와의 상동성 재조합에 대해 약간 더 증가한다. 통합성 재조합(integrative recombination)현상을 촉진시키기 위해, 레프리콘은 결여되나 선택성 마아커 유전자는 운반하는 벡터를 사용하는 것이 바람직한데, 마아커 유전자는 검출가능한 표현형 특성을 형질전환된 세포에 제공하여, 선택적 조건하에 확인되도록 한다.
랜덤 재조합은 대개 드물게 관찰되는 경우이다. 그러나 본 발명에 따라, 랜던 재조합에서 기인하는 삽입으로, 임의의 주어진 DNA 서열의 수 많은 복사를 게놈의 하나이상의 염색체로 도입시키는 것이 가능하다. 원하는 DNA 서열의 수백개 정도로 많은 복사물을 운반하는 형질 전환체를 얻기 위해, 형질 전환을 위해 자발적으로 복제되는 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하고, 몇가지 복사물의 통합 및 다른 것들의 복제의 동시적 현상에 의해 많은 양의 통합가능한 복사물이 제공될 수 있고, 이는 후속 세포 사이클동안 삽입된다. 놀랍게도, 많은 발현 카세트를 운반하는 메틸요구 효모 균주를 얻는 것이 가능했다.
속 한세눌라의 효모 균주같은 바람직한 효모 균주는, 바람직한 DNA 서열의 약 2-500, 바람직하게 15-200, 특히 20-150 복사물을 포함한다. 원하는 수의 통합 발현 카세트가 얻어진 경우, 다른 통합 과정은 비-선택성 배지상 생장 사이클에 의해 방해되어 잔류 플라스미드 복사물이 분리될 수 있다.
본 발명에 따르는 미생물의 특이 양상은 다합체(multimer) 통합 현상이다. 자발적으로 복제될 수 있는 벡터와의 형질전환 결과, 한세눌라 폴리모르파는 형질전환을 위해 사용된 플라스미드를 여러번 반복하여 통합시키는 것으로 밝혀졌다. 도입된 플라스미드의 약 100개까지에 이르는 복사물의 되풀이가 관찰되었다. 이는 필수 유전자로의 삽입으로 세포의 생육성을 위태롭게 하지 않은 채 외래 DNA 서열의 많은 수의 복사물 존재 및 통합을 허락한다. 놀랍게도, 다합체 DNA를 함유하는 통합체가 안정하다는 것이 보여졌다.
복합 입자를 함유하는 백신을 고안하기 위해, 상기 입자의 서로다른 폴리펩티드의 일정 비가 바람직하다. 상기 요구를 만족시키기 위해, 본 발명은 선택된 비의 서로다른 발현 카세트를 갖는 미생물을 제공한다. 예컨대, 본 발명에 따른 미생물은 S-단백질의 생물학적 작용을 갖는 단백질 모두 또는 일부를 코딩하는 발현 카세트(ec1)의 1-100 복사물 및 preS2- 또는 preS1-단백질의 생물학적 작용을 갖는 단백질을 코딩하는 발현 카세트(ec2)의 1복사 또는 여러 복사물을 운반할 수 있다.
바람직한 미생물은 ecl의 2 복사물 대 ec2의 1 복사 내지 ec1의 30 복사물 대 ec2의 1 복사 더욱 특별하게 ec1 5-10 복사물 대 ec2의 1 복사 또는 ec1의 6-8 복사물 대 ec2의 1 복사를 운반한다. 세번째 발현 카세트는 ec2 또는 ec1의 6-8 복사물 대 ec3의 1 복사와 같은 비율로 도입될 수 있다.
발현 카세트의 통합 복사물을 함유하는 균주 제조의 가능성 이외에, 자발적 복제 서열(ARS) 및 바람직한 발현 카세트로 구성되는 자발적 복제 벡터를 함유하는 미생물을 사용하는 것도 또한 가능하다. ARS를 함유하는 벡터의 존재 및 유지는 당분야에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 주제는 또한, 첫번째 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트(ecl) 및 두번째 폴리펩티드를 코딩하는 발현카세트(ec2) 및/또는 세번째 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트(ec3)를 함유하는 DNA 분자이고, 여기서 발현 카세트는,
a) 이화물질 억제 탄소원의 부족 및/또는 메탄올에 반응하는 레귤론 R;
b) B형 간염 표면 항원중 하나의 생물학적 활성을 갖는 단백질 모두 또는 부분 (또는 부분들)을 코딩하는 오픈 리딩 프레임;
c) 임의로, 터미네이터 T로서 제공되는 DNA 서열;
을 포함하고, 여기서 R은 오픈 리딩 프레임의 전사를 조절하고, T는 생성된 mRNA 전사의 종결 및/또는 폴리아데닐화를 조절한다.
레귤론, 오픈 리딩 프레임 및 터미네이터의 성질을 위해 앞서 제공된 정보를 참고 한다. 또한, 이들 분자들에 대해, 레귤론 및 터미네이터 두가지 모두가 속 칸디다, 클로엑케라(Kloeckera), 사카로마이세스, 로도로룰라, 토쿨로프시스(Torulopsis), 피치아 및 한세눌라로부터 선택된 메틸요구 효모로부터 유도되는 것이 바람직하다. 가장 바람직한 실시양태에서, 레귤론 및 터미네이터는 MOX-유전자, FMD 유전자, DAS 유전자 또는 카탈라제 유전자와 같은 메탄올 이용과 관련되는 유전자로부터 유도된다. 한세눌라 폴리모르파가 이들 유전자에 대한 원으로서 바람직한 미생물이다. ec1, ec2 및 ec3에 의해 코딩된 폴리펩티드 확인을 위해 앞서 제공된 설명을 참고한다.
본 발명에 따르는 DNA 분자는 개별적인 천연원으로부터 얻어진 단편으로 이루어질 수 있다. 임의의 B형 간염 표면 항원을 코딩하는 DNA는 본래(intact) 바이러스이 DNA로부터 분리될 수 었으며, 이는 또한 Dane 입자로 불린다. HBV 바이러스입자 DNA의 분리, 클로닝 및 서열화는 Charnay 일행(1979), Galibert 일행(1979), Sninsky 일행(1979) Valenzuela 일행(1979)에 기술된다.
클로닝 및 DNA 조작을 위한 제한 효소의 선택은 사용된 간염 바이러스의 아형 종류에 의존한다. 아형은, 길이 뿐 아니라, 통상적인 돌연변이 현상에 놓여지는 그들의 개별적인 제한 패턴(restriction pattern)에 대해서도 다르다. 예컨대, 제한 엔도뉴클레아제의 서로다른 세트를 사용하여 분리 DNA를 쪼개 원하는 코딩 영역을 운반하고, 샘플을 겔 전기영동 및 서어던 블로팅(Southern botting) 또는 동일한 방법에 놓고, 공지된 표면 유전자 서열에 상응하는 프로브를 사용하여 제한 단편을 확인하여, 당분야의 임의 기술자가 제한 단편을 확인하는 것이 가능하다. 필요하다면, DNA는 서열화되고, 원하는 크기를 갖고, 원하는 서열을 운반하고, 적절한 말단을 갖는 단편을 만들기 위해 예컨대, 엔도뉴클레아제, 생체내 변이유발, 프라이머 회복 또는 다른 공지 기술로의 처리에 의해 또한 조작될 수 있다. 당분야의 임의 기술자에게 공지되어 있듯이, 말단은 엑소뉴클레아제로의 소화(digestion), DNA-폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편으로 채워짐 및, 결합제 및 어댑터로서 합성 올리고데옥시리보 뉴클레어티드의 사용에 의한 DNA 첨가 또는 치환으로, 원하는 임의 서열을 갖도록 잘릴 수 있다.
그리고나서, 개별적인 간염 표면 항원을 코딩하는 DNA 서열은, 메틸요구 효모의 게놈으로부터 공지 기술에 의해 얻어지는, 적절한 레귤론 및/또는 터미네이터와 또한 결합될 수 있다. 따라서, 코딩 DNA 서열의 해독 종결 코돈 및 해독개시 코돈에 대한 적절한 위치에 있기 위해, 개별적인 단편이 적합하다. 공지된 절차에 따라 연결(ligation)이 또한 수행된다. 이들 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있기 때문에 더 이상의 설명은 제공되지 않는다. 분자 클로닝에 사용된 기술의 상세한 설명을 위해, Maniatis 일행에 의한 분자 클로닝(1982)이 고려될 수 있다.
개별적인 천연원으로부터 배타적으로 분리된 DNA 서열 연결 대신, 화학 합성으로 원하는 발현 카세트 일부 또는 모두를 합성시키는 것도 또한 가능하다. 화학 합성은 공지 과정에 따라 수행될 수 있다. 긴 올리고데옥시리보뉴클레도티드의 화학합성은 상업적으로 이미 제공된다. 이외에, 화학적으로 합성된 단편 및 개별적인 천연원으로부터 얻어진 단편의 조합이 본발명의 목적을 위해 적합할 것이다.
본 발명의 다른 주제는 메틸요구 효모로부터 얻어진 URA3 유전자의 제공이다. 유전자는 한세눌라 폴리모르파 제한 단편의 적절한 벡터로의 랜덤 삽입에 의해 작제된 플라스미드와의 이. 콜라이 균주 MB1000의 상응하는 pyr F 돌연변이의 상보성(complementation)에 의해 동정되었다. 플라스미드는 수용자 균주의 결핍을 상보시켜 확인되었다. 새롭게 동정된 유전자는 아가로스겔 상에서의 측정에 의하면 대략 1400 bp로 이루어진다. 그의 제한 패턴은 제10도에 보여진다.
발현 카세트의 숙주 미생물로의 도입 및 증폭, 구성을 쉽게 하기 위해, 메틸요구 효모의 형질전환에 적합한 벡터상에 이를 삽입하는 것이 적합하다. 상기 벡터는 선형 또는 원형 플라스미드 또는 바이러스일 수 있다. 소위 통합성 벡터 즉, 임의의 자발적 복제 서열(ARS)이 부족한 벡터를 사용하는 것이 가능하다. 만일 이들 벡터가 통합되지 않는다면, 그들은 후속 세포 사이클동안 손실될 것이다.
한가지 바람직한 실시양태에서, 벡터는 또한, 자발적인 복제를 수행할 수 있는 상기 ARS DNA 서열로 구성된다. 바람직하게 이들 서열은 개별적인 숙주 미생물로부터 유도된다. 메틸요구 효모의 경우에, 기술된 여러 ARS 예컨대, HARS, 및 PARS (Roggenkamp 일행,1986; Cregg 일행,1985)가 있다. 이들 서열은 숙주 세포내에 염색체의 실재로서 벡터를 안정하게 유지시키는 기능을 하는 DNA 영역을 포함한다.
형질전환된 숙주 유기체의 확인을 쉽게하기 위해, 원하는 형질전환 미생물 선별에 적합한 선택성 마아커-유전자를 제공하는 것도 또한 바람직하다. 당분야에 공지된 효모 플라스미드에서, 이들 선택성 마아카-유전자는 종종 아미노산 또는 핵산 대사와 관련된 효소에 대한 DNA 서열 코딩에 상응하여, 이는 형질전환될 수용자 숙주 유기체에는 결여되어 있다.
동일한 전략이 형질전환 메틸요구 효모의 선택을 위해 적용될 수 있다. 영양요구 사카로마이세스 세레비지애 균주의 선택에 대개 사용된 유전자는 LEU2, HIS3, TRP5, ARG4 및 URA3 유전자를 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애로부터 얻은 유전자도 또한, 메틸요구 효모의 형질전환에서 선택성 마아커로서 사용될 수 있다; 그러나, 최소영양배지상에서 이러한 형질전환체의 생장은 상당히 장애를 받을 수 있다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 정상 대사와 관련된 임의의 유전자 하나의 기능이 부족한 메틸요구 효모 균주가 야생형 동종 마아커 유전자를 운반하는 DNA 분자로 형질전환된다. 본 발명은 우선, 한세눌라 폴리모르파에서 형질전환체의 선별을 위한 동종 마아커 유전자, 예컨대, URA3 유전자를 제공한다. 상기 유전자의 특성 즉, 그의 제한 단편 패턴은 앞서 논의되었다.
형질전환체를 선택하는 대안적인 방법으로서, 항생물절 내성 유전자를 사용할 수 있다. 이는 세균성 형질전환에 대한 잘 알려진 접근이고, 에스. 세레비지애에도 적합하는 것으로 밝혀졌다.(Jimenez 및 Davies,1980)
그러나, 클로람페니콜 또는 젠타마이신 G418 같은 항생 물질과 접촉하는 동안 메틸요구 효모의 행동에 대해 이제까지 알려진 것은 없다. 따라서, 이것은 메틸요구 효모를 형질전환 과정이 따르는 선택성 농도의 생장 저해 아미노글리코시드에 형질전환된 메틸요구 효모가 놓여짐으로써 이들이 선별하게 되는 것에 대한 첫번째 보고가 될 것이라 여겨진다. 놀랍케도, Tn5로부터 유도된 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제(Grindley,1980)가 빵효모로부터 얻어진 프로모터에 의해 제어될 때 메틸요구 효모에서도 또한 활성을 가진 것으로 밝혀질 수 있다. 유전자 복사물 단지 하나 또는 두개가 세포에 존재하는 경우 즉, 유전자가 높은 복사 수를 요구하지 않는 경우 G418의 불활성화가 균주내에서 또한 효과적이다. 본 발명에 따라, 이는 메틸요구 효모에서 매우 효과적인 형질전환/선별 시스템이다.
가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 벡터는 벡터 pMS-2, pFS-9, pRB-S, pRB-S-269, pRB-S-271, pRB-S-322, pRB-S-326, pMPS22, pMPS21, pMPS9로부터 선택된다. 이들 벡터의 구성 및 사용은 이후에 더욱 자세히 기술될 것이다.
본 발명의 다른 주제는 앞서 기술된 바와 같은 미생물의 제조방법이고, 여기서, 메틸요구 효모 숙주 유기체는 발현 카세트 ec1 및/또는 ec2 및/또는 ec3을 운반하는 벡터로 전환되고, 백터의 복제중에, 적어도 일부의 발현 카세트는 효모 숙주 유기체의 염색체와의 재조합, 바람직하게 다합체 반복으로서 통합된다. 결국, 형질전환 메틸요구 유기체는 전체 게놈상에 분산된 임의의 도입된 발현 카세트의 다합체 반복물이 게놈의 한 부위에 국재된다. 상기 형태의 재조합이 특히, 한세눌라에서 일어남이 밝혀졌다. 그러나, 메틸요구 효모 숙주 유기체는 또한, 칸디다, 클로엑케라, 사카로마이세스, 로도로룰라, 토룰로프시스 및 피치아 같은 임의 다른 종의 메틸요구 효모속으로부터 선택 될 수 있다.
가장 바람직한 실시양태에서, 숙주 유기체는 한세눌라 폴리모르파 종으로부터 선택되고, 한세눌라 폴리모르파 RB10의 동정(同定) 특성을 가진 균주에 의해 예증된다. 한세눌라 폴리모르파 RB10은 1989년 2 월 17 일에 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen에 기탁되었고, 기탁 번호 DSM는 5215를 받았다. 에이치. 폴리모르파 DSM 5215은 본 발명의 다른 양상을 형성한다.
본 발명에 따르는 상기된 벡터중 임의의 하나를 사용하여 형질전환을 수행하는 것이 바람직한 반면, 다른 벡터도 또한 작제되고 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
발현 카세트(ec1)의 하나이상의 복사 및 임의로 두번째 발현 카세트(ec2)의 하나이상의 복사를 함유하는 미생물을 얻기 위해서는, 여러 단계를 포함하는 하기 과정이 가장 편리한 방법이다. 과정에 따라, 메틸요구 숙주 유기제는 a) 첫번째 벡터로 형질전환되고, 초기에 선택배지상에서 생장된 뒤, 여러 세대에 걸쳐 비-선택성 조건하에 배양되고, b) 첫번째 폴리펩티드에 대한 하나이상의 발현 카세트(ec1)를 함유하는 유사분열적으로 안정한 형질전환체가 선택되고, c) 상기 형질전환체는 잔류하는 자발적으로 복제하는 플라스미드에 의해 임의로 치유되고, d) 상기 형질전환체는 두번째 벡터로 임의로 전환되고, 다시 초기에 선택성 배지상에서 생장한 뒤, 여러 세대에 걸쳐 비-선택성 조건하에 배양되고, e) 첫번째 폴리펩티드를 코딩하는 하나이상의 발현카세트(ec1) 및 임의로 두번째 폴리펩티드를 코딩하는 하나이상의 발현카세트(ec2)를 함유하는 유사분열적으로 안정한 형질전환체가 선택되고, f) 상기 형질전환체는 잔류하는 자발적 복제 플라스미드에 의해 임의로 치유되고, 세번째 벡터의 사용으로 단계 d)-f)는 임의로 반복된다.
상기 과정에 따라, 예컨대, 세포를 전환, 선택성/비-선택성 조건하의 생장, 형질전환체의 선택의 여러 후속 사이클에 놓고, 임의로 자유 플라스미드로 치유시켜 한가지 형태의 발현 카세트의 수를 증가시키는 것이 가능하다. 대안적으로, 두개이상 형태의 발현 카세트는 두개이상의 서로다른 발현 카세트를 함유하는 단일형태의 벡터를 사용하거나, 세포를 서로다른 발현 카세트를 운반하는 상기된 사이클에 놓아(여기서, 형질전환은 서로다른 벡터를 사용하여 수행한다) 도입시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 방법은 원하는 미생물을 얻기위한 다양한 가능성을 제시한다.
본 발명의 주제는 또한, B형 간염 표면 항원중 하나의 생물학적 작용을 갖는 단백질 모두 또는 부분에 상응하는 적어도 두개의 폴리펩티드로 구성되는 복합 입자이고, 여기서 입자에는 S-단백질, preS2-단백질 또는 preS1-단백질, 임의로 숙주 특이 지질을 함유하는 상기 입자에 의해 제공된 적어도 두개의 항원 결정기(antigenic determinant)가 존재한다. 대개, 입자는 S-단백질의 항원특정을 갖는 다수의 단백질로 제조되고, 이는 또한 자연적으로 발생하는 20 nm 입자 약 80 내지 90%로 구성된다. 복합 입자는 또한, preS1-단백질 특이 영역의 항원성을 갖는 임의 단백질 즉, preSl-단백질의 N-종길 108(또는 119) 적어도 일부분에 상응하는 펩티드 또는/및 preS2 특이 영역의 항원성을 갖는 임의 단백질 즉, 55 아미노산 preS2-특이 영역의 적어도 일부분에 상응하는 펩티드로 구성될 것이다.
한 입자내에서 B형 간염 표면 항원의 생물학적 작용을 갖는 두개이상의 서로다른 단백질의 존재는 효모-유도 항-B형 간염 백신의 고안에 대한 새로운 접근이다. 이제까지의 얻어진 효모-유도 입자 또는 응집체는 S 단백질 또는 preS2-단백질 또는 preS1-단백질 즉, 세개 가능한 단백질 중 단지 하나만을 배타적으로 포함한다. preS2-단백질이 입자로 어셈블리된다는 것이 Valenzuela 일행(1985) 및 Itch 일행(1986)에 의해 밝혀진 반면, preS1-단백질은 작은 입자(지름 2 또는 3nm)의 혼합물 또는 지름 약 15-50nm의 큰 응집체의 다분산 모집단(polydisperse population)을 형성한다는 것으로 보고되었다.(Kniskern 일행, 1988; Imamura 일행, 1987).
Rutgers 일행(1988)은 preS2-단백질 및 preS1-단백질 입자 또는 응집체상에서 에피토프 코딩 S-단백질이 이들 입자들에 의해 마스킹되며, 이는 AUSRIA 검정에서 덜 반응적임을 보고한다. 이는, 동종 preS 단백질 종으로 구성된 입자가 백신 목적을 위한 면역원으로 사용될 때, S-단백질에 관한 면역 반응상에 해로운 효과를 가질것이다.
그러므로, 본 발명은 우선 B형 간염 표면 항원의 하나 이상의 종을 포함하는 복합 입자를 제공한다. 에스. 세레비지애에서 생성된 단지 하나의 단백질로 구성된 입자로 유추하여, 본 발명에 따른 입자는 대개 숙주-특이 지질을 포함할 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 복합 입자는 1% 이상의 preS1-단백질로 구성되고, 단백질이 나머지는 S-단백질 및 임의로 약간의 preS2-단백질이다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, preS1-단백질 대 S-단백질의 비는 1:1 내지 1:100, 바람직하게 1:2, 1:8 또는 1:15 이다.
본 발명에 따르는 입자는 적어도 부분적으로 글리코실화된다. 45KD, 38KD 및 39KD의 분자량을 가진 밴드의 검출에 의해 알 수 있듯이, 메틸요구 효모내 preSl-단백질의 일부는 글리코실화된다. 면역블로팅에 의해 관찰된 preS1 단백질 종의 수 및 크기에 약간의 명백한 변화가 존재할수 있음이 당분야의 기술자에 의해 이해될 것이다. 45,38 및 39KD 밴드의 검출은 특히 다른, 효모 단백질 및 면역블로팅에 사용된 과정이 효율에서의 변동을 방해하는, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동동안 그들의 분해능(resolution)에 의존할 것이다. 이외에, 조 세포 추출물의 제조를 위해 선택된 방법 및 추출을 위해 사용된 완충액의 특이 조성물도 또한 특별한 밴드의 검출에 영향을 미친다. 세개 종의 상대적 비율은 생장 조건에 따라 또한 변할 수 있다. 이외에, 분자량 평가가 또한 실험 변경에 놓이고, 이는 검정을 위해 사용된 표준에 의존한다. S-단백질의 글리코실화는 관찰되지 않았다.
상기된 복합 입자는 적절한 배치내 본 발명에 따르는 메틸요구 효모 균주의 배양에 의해 편리하게 제조된다. 조절된 발현 시스템을 사용하여, 세포 생장에 영향을 미치는 그들의 발현이 회피되도록 입자 성분의 합성을 제어 할 수 있다. 그러므로, 임의 원하는 세포 밀도에서, 메탄올 레귤론-제어된 단백질 합성은 이종 단백질의 발현을 허용하도록 활성화될 수 있다. 서로다른 형태 B형 간염 표면 항원이 밀접하게 협동적으로 발현 결과, 입자 형성이 일어난다. 이들 입자는 예컨대, 동밀도 원심분리, 크로마토그래피 및 당분야에 공지된 다른 방법과 같은 잘 알려진 기술에 의해 배양물로부터 분리될 수 있다.
적절한 균주가 사용될 때, 단지 하나의 종의 표면 항원으로 구성되는 입자 또는 응집체를 얻기 위해서도 동일한 방법이 적용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 발현 카세트에 의해 수행되는 단백질 합성은 탄소원 억제의 부족으로 시작된다. 앞서 이화물질억제에 놓였던 세포는 억제제의 희석으로 발현을 시작한다. 활성화의 효과는 메탄올 첨가에 의해 더 향상될 수 있고, 이는 메탄올 반응성 레귤론의 유도를 결과시킨다.
바람직한 실시양태에서, 배지는 탄소원으로서 글리세롤을 포함한다. 글리세롤은 최소의 이화 물질억제 효과를 갖는 탄소원이다. 0.3% 이하의 글리세롤 농도는 억제에 영향을 미치지 않는다. 그러므로, 글리세롤을 함유하는 배지를 사용할 때, 상기 탄소원은 메탄올이 임의 첨가 전에 완전하게 제거될 필요는 없다.
본 발명에 따른 메틸 요구 효모 균주의 발효는 pH 3-7, 바람직하게 pH 4-6으로 유지된 배지의 사용으로 30-40℃에서 수행된다. 배지의 예는 이후에 주어진다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 복합 입자는 이후에 일반적으로 그리고 특이하게 기술된 임의의 변형 L 단백질로 구성될 것이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 변형 L 단백질은 ad 혈청형 HB 바이러스상 ORF에 관한 잔기 12-52, 133-145 및 175-400을 함유하는 280 아미노산 폴리펩티드에 상응한다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 복합 입자는 보호의 범위가 넓어지도록 다른 아형의 B형 간염 표면항원 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 그것은 ad 아형특이성의 S-단백질 및 preS1-단백질 및/또는 변형 L 단백질 및/또는 ay 아형의 preS2-단백질이거나 반대일 수 있다.
본 발명의 주제는 또한, 본 발명에 따라 만들어진 B형 간염 표면 항원 단백질 또는 새로운 복합 인자로 구성되는 물질의 조성물이다. 발명 조성물이 다른 성분은 안정화제, 완충물질, 희석제, NaCl 같은 염, 또는 당일 수 있다.
앞서 기술한 바와 같이, 본 발명의 최초 목적은 B형 간염 바이러스에 대한 백신을 제공하는 것이다. 그러므로, 상기된 복합 입자 또는 본 발명에 따라 생성된 B형 간염 표면 항원으로 구성되는 백신은 본 출원의 다른 주제이다. 백신은 염, 안정화제, 보조제 및/또는 다른 생리학적으로 허용가능한 첨가제 같은 다른 물질을 포함할 것이다. 복합 입자로 구성된 백신은 B형간염 표면 항원의 적어도 두개의 가능한 항원결정기에 대해 항생물질 형성을 촉발한다. preS1 특이 및 preS1 특이 부위의 존재로 인해, 현재 구입가능한 백신에 대해 반응하지 않는 개인도 B형 간염에 대해 보호될 수 있다. 대개 본 발명에 따른 백신은 현재 백신보다 더 넓은 면역 반응을 일으키고, 그 위에 세포당 많은 양의 발현 및 높은 세포 밀도로 인해 저가격으로 생산될 수 있다.
본 발명은 또한, 시험 키트의 개발에 유용함이 입증되었다. 본 발명에 따르는 복합 입자로 구성된 조정물을 제공하여, 상기 입자로 감염된 개인이 항생물질 사이에 형성된 면역 복합체의 형성을 모니터하는 것이 가능하다. 시험 키트는 임의 공지 기술에 의해 라벨링된 염소/항-인간 IgG 항체 같은 검출제의 제공을 요구한다. 임의의 다른 포유 동물로부터도 또한 유도될 수 있는 항체는 예컨대, 효소에 커플링되거나 검출을 행하기 위해 방사성으로 라벨링될 수 있다. preS1 및 preS1 특이 부위에 대한 항체에 반응하는 시험 키트의 장점은 HBV 감염을 초기에 검출할 수 있다는 것이다. 왜냐하면, 항-S 항체 이전에 항-preS1 및 항-preS1 항체가 인간에서 HBV 감염동안 나타난다. 그러므로, 본 발명에 따르는 시험 키트는 상기 높은 감염성 질병의 초기 진단을 위한 편리한 수단을 제공한다.
본 발명의 다른 양상에서, B형 간염 바이러스(HBV)의 변형된 라아지 표면 단백질 (이후에는 변형 L 단백질)을 제공한다. 상기 변형 L 단백질 하나는 프로테아제에 의해 선별적으로 공격된 부위의 부재에 의해 특징지워진 L 단백질 서열을 갖는다. 이들 부위의 제거는 프로테아제에 덜 민감한 분자를 제공하고, 이는 발현중에 입자 형태로 쉽게 정제된 단백질을 생성시킨다.
본 발명의 다른 양상은 단백질의 미리스틸화를 위해 필요한 아미노산의 부재에 의해 특징지워진 변형 L 단백질이다.
본 발명의 또 다른 양상은 여러가지 유능한 글리코실화 부위의 부재에 의해 특징지워지는 변형 L 단백질을 포함한다. L 단백질의 글리코실화 제거는 효모 숙주내 발현 동안 일어나는 단백질의 글리코실화에 의한 변형되고, 차페되고 튀틀리는 에피토프의 제시를 개선시킨다. 변형되고 탈글리코실화된 L 단백질은 결과 입자의 표면상에 잘 노출된, 그들의 올바른 입체배좌에서 preS1, preS2 및 S 영역이 중요한 T에피토프 및 보호성 B 에피토프를 제시한다.
본 발명의 다른 양상은 preS2 영역 일부의 삭제에 의해 특징지워진 변형 L 단백질을 포함하는데, 이는 인간 혈청 알부민 (pHSA) 결합 부위를 포함한다. 그로써 L 단백질의 상기 변형은 preS2 영역의 주요 B 에피토프의 손실없이 pHSA 수용기 존재시 이에 결합되는 잠재적인 내성 또는 자가-면역문제를 제거한다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 비-글리코실화로서 특징지워지고, 감소된 프로테아즈 감도 및 감소된 pHSA 결합 용량을 가진 변형 L 단백질이 제공된다. 상기 단백질은 아미노산 잔기 12-52에 상응하는 preS1 영역 서열에 아미노산 잔기 133-145에 상응하는 preS2 영역 서열이 융합(fusion)되고 뒤따라서 연속적인 리딩 프레임내 S 단백질에 대한 전체 코딩 서열이 따른다.
본 발명이 변형 L 단백질은 이제까지 논의된 바와 같이 메틸요구 효모에서뿐 아니라, 세개 영역 preS1, preS2 및 S에 의해 코딩된 주요 항원 부위를 보유하는 입자로서 단백질을 생성시키는 다른 효모 발현 시스템내에서 발현될수 있다. 변형 L 단백질은 또한, 효모내에서 S-단백질과 함께 동시 발현되어 혼합된 서브유닛 조성의 입자를 형성할 수 있다. 다른 발현 시스템 예컨대, 세균, 곤충, 포유동물은 다양한 형태로 변형 L 단백질을 또한 생성시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 변형 L 단백질을 코딩하는 신규 DNA 서열이 또한 제공된다. 본 발명의 다른 양상에서, 상기 DNA 서열은 적절한 조절 서열의 제어하에 벡터내에 혼입 될 수 있다.
또다른 양상에서, 적절한 조절 서열의 제어하에 선택된 변형 L 단백질 유전자 서열을 발현시키는 효모 발현 플라스미드로 전환된 효모 세포를 배양시키고, 적절한 배양 조건을 적용하는 것을 수반하는, 상기된 바와 같은 HBV의 변형 L 단백질을 생성하기 위한 방법이 제공된다. 변형 L 단백질은 또한 S 단백질과 함께 효모 숙주에서 동시-발현될 수 있다. 결과 만들어진 L 단백질은 통상적인 기술에 의해 배양물 또는 세포 용균물로부터 분리될 수 있다. 변형 L 단백질은 S 단백질과 함께 그의 동시-발현에 의존하여 혼합 또는 동종 서브유닛 조성의 입자 형태로 분리될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세균성 발현 시스템; 곤충 세포 발현 시스템, 예컨대 배큘로바이러스 시스템; 포유 동물 세포 발현 시스템; 종두 바이러스 시스템 및 식물 발현 시스템을 포함하는 다른 발현 시스템에서 변형 L 단백질을 생성시키기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은 하나이상의 본 발명의 변형 L 단백질만으로 또는 다른 백신제 및 제약학적으로 허용가능한 백신담체 및 보조제와의 조합으로 구성되는 백신이다. 여기 기술된 변형 L 단백질로 구성되는 본 발명의 백신은 다른 펩티드 즉, S 단백질과 혼합 서브유닛 조성물 입자의 형태로도 변형 L 단백질을 포함할 수 있다.
전술한 내용으로부터, 신규 변형 라아지(L) B형 간염 표면 단백질 분자 단독 또는 다른 HBsAg 또는 HBV 성분과 함께 사용되어 HBV 감염에 대해 사람을 면역시키는데 사용하기 위한 백신제를 제공할 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명은 또한, 적절한 조절 제어하에 적절한 숙주 세포내 변형 L 단백질을 발현시키는 것과도 관련된다.
본 발명의 변형 L 단백질은 preS 영역내 다양한 아미노산 서열의 결실, 삽입 또는 변형에 의해 특징지워진다. 여기서 변형되고 발현될 L 분자는 이미 그의 첫번째 11개 아미노산이 삭제되었고, preS1 영역에 163 아미노산을 포함하는 것으로 이해될 것이다.(참고로 여기 포함된 동시계류중인 미합중국 특허 출원 SN 009,325 참고) preS 영역의 크기에서의 결과되는 감소는 숙주 세포내 입자형성을 쉽게 하고, 분자의 다양한 생물 물리학적 성질을 향상시키고, 이는 백신 제조 및 사용에 특히 바람직한 변형 L 입자를 만들 수 있다. 예컨대, 본 발명의 짧아진 preS 영역은 면역 시스템과의 상호 작용을 위해 입자상에 S 및 preS 에피토프를 더 잘 제시시키면서, 면역원성을 향상시킨다.
한가지 실시양태에서, 본 발명의 preS1 영역내 Gly 13 아미노산 잔기가 결실된 변형 L 단백질을 제공한다. 동시계류중인 미합중국 특허 출원 SN 07/009,325에 기술된 바와 같이, 효모내 발현된 L 단백질은 아미드 결합에 공유적으로 부착된 미리스틸기를 운반한다. N-말단 Gly 잔기는 단백질의 미리스틸화에 대한 근본적인 요구이다. [Towler 및 Gordon, Ann. Rev. Biochem., 57 : 69-99(1988)] 그러므로, 본 발명의 한가지 적절한 변형 L 단백질은 L 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로부터 Gly13 코돈(GGG)이 삭제된 DNA에 의해 코딩된다. 상기 삭제는 비-미리스틸화 L 단백질의 합성을 결과시킨다.
본원에서 사용되는 기호 △는 결실(deletion)을 의미한다 : 즉, 예컨대, △Gly 13 변형 L은 아미노산 잔기 13(글리신)이 부족한 변형 L 단백질을 의미한다.
본 발명의 다른 양상은 하나이상의 그의 잠재적인 글리코실화 부위가 결실된 변형 L 단백질이다. 앞서 확인된 미합중국 특허 출원 SN 009,325에 기술된 바와 같이, 효모내 발현된 L 단백질은 Asn123에서 N-결합된 과당류 사슬 및 분자의 preS1 및 preS2 영역내 Ser 및 Thr 잔기에 결합된 여러 O-결합된 만노즈 사슬을 운반한다 [또한, Rutgers 일행의 바이러스성 간염 및 간 질환 ed. A.J. Zuckerman, A. R. Liss, New York, pp. 304-308(1988) 참고] X가 임의의 아미노산일 수 있는 서열 Asn-X-(Ser 또는 Thr)에 의해 특정지워진 N-글리코실화 부위를 제거하기 위해, 아미노산 위치 123-125에서 서열은 변경된다. N-결합 글리코실화 부위는 위치 123 및 125에서 아미노산을 결실하거나 대체하고, 아미노산 124를 결실하거나 전체 123-125 서열을 결실하여 제거할 수 있다. O-결합글리코실화 부위를 파괴하기 위해, L 서열내 Ser 및 Thr 잔기 모두 또는 일부는 단백질내 다른 아미노산으로부터 결실되거나 상기 아미노산으로 대체된다. 예시되는 플라스미드 pRIT13192로부터 발현된 L-단백질은 전체 또는 부분적으로 비-글리코실화됨으로써 특징지워진다.
본 발명의 다른 변형 L 단백질은 중합된 인간 혈청 알부민 (pHSA)의 결합을 위한 preS2 영역의 아미노산 잔기 120-132에서 preS2 서열내 결실을 포함한다. [앞서 인용된 Machida 일행 참고] pHSA 결합은 상기 서열이 부족한 단백질상에서 상당히 감소된다.
본 발명에 따른 다른 변형 L 단백질은 프로테아제 민감 부위의 결실 또는 변경으로 특징지워진다. 프로테아제 민감 펩티드 결합은 preS1 영역 내 위치 100 주의 Arg 잔기 뒤 [Heermann 일행, Intervirology 28, 14-25(1987)] 및 아미노산 잔기 Arg 137, Gly 149 및 Arg 167 뒤 preS 서열 내에 존재한다.
이들 잔기에 대한 코돈 일부 또는 모두를 제거하기 위한 L 단백질의 코딩 영역에 도입된 결실 또는 다른 변경은 프로테아제 작용에 대해 덜 민감한 L 단백질을 생성시킨다.
변형 L 단백질을 형성하기 위한 L 단백질의 코딩 영역에 도입된 결실은 아미노산 21-47 및 133-145에 대한 코돈을 본래대로 바람직하게 남긴다. 이들 서열은 면역 보호와 관련된 preS-특이 항체를 유도시키는 능력을 가진 변형 단백질을 제공한다고 여겨진다 [예컨대, 상기된 Itch 일행, 참고].
Gly13 단백질을 코딩하는 예시적인 효모 발현 플라스미드 pRIT12979의 구성은 이후 실시예 F.l에 기술된다. 발현 수준에 대한 플라스미드 pRIT12979로부터의 변형 L 단백질 발현의 분석, 후속-해독 변경 및 거대분자 어셈블리는 실시예 F.2에 기술된다.
효모 글리코실화 효소에 대한 기질로서의 작용, pHSA 결합능력 및 프로테아제 민감도, 및 플라스미드 pRIT13192에 예증된 preS 영역의 아미노산 잔기 53-132 및 146-174에 대한 코돈의 제거로 인한 변형인 상기된 세개 성질 모두가 없는 다른 변형 L 단백질이 하기 실시예 F.3에 기술된다. 플라스미드 pRIT13192는 preS 영역의 잔기 12-52 및 133-145에 대한 코돈을 포함한다. 플라스미드 pRIT13192 로부터의 L 단백질 발현의 분석도 또한 여기 기술된다 (실시예 F.4). 그러므로, pRIT13192로부터 발현된 L 단백질은 상당히 감소된 pHSA 결합 능력, 개선된 프로테아제 내성 및 적은 글리코실화를 보인다.
본 발명의 또다른 예증적인 변형 L 단백질은 pRIT12979 및 pRIT13192의 L 단백질 코딩 서열에 도입된 삭제를 겸비한다. 상기 서열에 의해 발현된 L 단백질은 비-미리스틸화되고, 글리코실화가 덜되고, 감소된 pHSA 결합 능력을 가진 프로테아제에 덜 민감한 L 단백질을 코딩한다. 효모 발현 플라스미드 pRIT13193 함유 상기 변형 L 서열 삽입의 구성은 하기 실시예 F.3에 또한 상세히 기술된다.
본 발명에 사용하기 위한, 전체 S코딩 서열을 함유하는, 변형 L 단백질 코딩 서열은 통상적인 부위 특이 변이유발[예컨대, Botstein 일행 Science, 229 : 1193 (1985)참고] 또는 재조합 DNA 기술[예컨대, T. Maniatis 일행, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1982) 참고]에 의해 이들 S 및 표 1의 preS 단백질 코딩 서열로부터 제조될 수 있다. 이후에 언급된 아미노산 위치번호는 명확하게 표 1에 있는 위치 번호와 일치한다. 그리나, S 및 preS 서열의 다른 공개된 변형이 당 분야의 기술자들에 의해 본 발명의 변형 L 단백질 제조에 사용될 수 있다.
예컨대, S 단백질은, 감염된 인간 혈청내 Dance 입자로부터 추출된 DNA로부터 단일 나선 영역에서 DNA 폴리머라제, 바람직하게 내원(內原) 폴리머라제로 채우고, 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 분리시킬 수 있다. 엔도 뉴클레아제의 선택은 부분적으로 특별한 Dane 입자에 의존할 것이다. 예컨대, adw 혈청형의 특정 Dane 입자의 HBV DNA의 HBsAg 코딩 서열은 단일 BamHI 단편상에서 분리될 수 있다; ayw 혈청형의 특정 Dane 입자의 HBV DNA의 HBsAg 코딩 서열은 HhaI 단편상에서 분리될 수 있다. 동일 혈청형의 Dane 입자의 HBV DNA는 또한 서로다른 패턴의 제한 부위를 나타낼 수 있다.
본 발명의 변형 L 단백질 서열 구성은 중간 벡터의 사용으로 행해질 수 있다. 파지내 DNA 단편 클로닝을 위한 기술은 예컨대 Charnay 일행, Nature,286 : 893-895(1980) 및 Tiollais 영국 특허 출원 2,034,323에 의해 기술된다.
본 발명의 변형 L 단백질은 재조합 DNA 분자 또는 벡터내에 작제될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 조절영역에 효과적으로 결합된 본 발명의 변형 L 단백질 코딩 서열을 포함한다. 상기 벡터는 적용될 숙주 및/또는 선호에 의존하여 레프리콘을 부가적으로 또한 포함할 수 있다. 용어 레프리콘(replicon)은 상기 벡터로 전환될 진핵 또는 원핵 숙주 유기체내 재조합 벡터를 안정하게, 염색체 외적으로 유지하도록 기능하는 DNA의 최소 부위를 의미한다. 상기 레프리콘은 당분야에 잘 알려져 있다. 용어 조절영역(regulatory region)은 프로모터 영역을 포함하는 임의 DNA 서열 및 구조 유전자의 코딩 서열의 전사를 조절하는 코딩 서열의 전사에 필요한 다른 서열을 의미한다. 상기 조절 영역은 당 분야에 잘 알려져 있다.
DNA 분자가 조절 영역에 효과적으로 결합되도록, 레프리콘 및 상기 조절 영역을 이미 함유하는 벡터로 본 발명의 변형 단백질 코딩 서열을 삽입 시키는 것과 같은 통상적인 기술로, 상기 벡터를 제조할 수 있다. 상기 DNA 분자, 또는 발현 카세트 함유 변형 L 단백질 코딩 서열은, L 코딩 서열을 조절 서열로 연결시키는 것과 같은 통상적인 기술에 의해 작제될 수 있다.
본 발명에 사용된 DNA 단편을 제조하기 위한 DNA의 제한, 본 발명에 사용된 재조합 DNA 분자를 제조하기 위한 상기 단편의 연결 및 미생물의 삽입은 앞서 그리고 이후에 인용된 참고자료에 기술된 기술과 같은 공지기술에 의해 수행된다. DNA 및 효소의 변성이 피해지도록 조건이 선택된다. 본 발명을 수행하는데 사용된 제한 효소 및 리가제는 통상적으로 구입가능하고, 여기에 포함된 지시에 따라 사용되어야만 한다. T4 DNA 리가제는 바람직한 리가제이다.
변형 L 단백질의 발현을 위해 사용된 다양한 단편 및 최종 구성, 및 본 발명의 방법으로 숙주세포내 발현을 위한 이들 코딩 서열을 운반하는 벡터의 성분은 당분야의 기술자들에게 알려진 통상적인 방법으로 함께 결합될 수 있다. 많은 경우에, 유전자는 분리되어 서열화될 뿐 아니라, 제한 맵핑(restriction mapping)되었다. 어느정도까지, Bal 31로의 절제(resection), 시험관내 변이유발, 프라이머 회복 등과 같은 필요한 다른 조작을 적용하면서 유전자의 제한으로 HBV 엔벨로프 단백질 코딩 서열과 같은 관심의 서열을 선택하여 원하는 서열을 함유하고, 적절한 말단을 갖는, 원하는 크기의 단편을 제공할 수 있다. 링커 및 어댑터는 손실된 서열을 대치하는 것 뿐만 아니라 서열을 결합시키기 위해 사용될 수 있고, 여기서 적용된 제한 부위(restriction site)는 관심 영역에 대해 내부이다. 분리된 여러 단편은 전기 영동에 의해 정체되고, 전기용리되고, 다른 서열로 연결되고 클로닝되고, 재분리되고 더 조작될 수 있다.
해당 변형 L 유전자의 전사를 제어하기 위한 조절 영역의 사용은 구조 유전자를 거의 낮은 수준으로 발현시키면서 숙주 세포를 고밀도를 생장시키고 나서, 영양원, 온도등과 같은 환경 조건을 변화시켜 발현을 유도할 수 있다.
L 단백질 코딩 서열을 운반하는 벡터는 통상적인 기술에 의해 선택된 숙주 세포로 형질전환되고, 상기 세포에서 발현된다. 그리고나서, 세포는 적절한 배지 즉, 숙주가 생존할 수 있고 회수가능한 양으로 변형 L 단백질을 발현시킬수 있도록 하는 배지에서 배양된다. 예컨대, 효모 숙주세포가 선택되는 경우, 상기 사용을 위한 예증적 배지는 효모 질소 기재 최소 배지(Yeast Nitrogen Base minimal medium)이다. 적절한 배지는 방법에 적용된 특별한 숙주에 의존하여 당분야의 기술자에 의해 선택될 수 있다.
본 발명의 L 단백질 분자는 세포의 능력에 의존하여 숙주 세포 배지의 세포 용균질 또는 추출물로부터 분리되어 변형 단백질을 분비시킬수 있다. 본 발명 단백질의 회수는 통상적인 단백질 분리기술에 의해 수행된다.
본 발명의 변형 L 단백질 생성을 위해, 적절한 숙주 세포 또는 세포계가 선택될 수 있다. 적절한 세포 또는 세포계는 효모세포일 것이다. 당 분야의 기술자들에게 공지된 효모세포의 많은 균주는 본 발명의 변형 L 단백질의 발현을 위한 숙주세포로서 유용하다. 본 발명의 실시에서, 임의 종의 효모가 사용될 수 있다. 한가지 양상에서, 예로 사카로마이세스, 특히 에스. 세레비지애가 사용된다. 에스. 세레비지애의 많은 균주는 공개기탁소 및 실험실 예컨대, American Type Culture Collection, Rockyille, MD로부터 구입가능하다.
다른 양상에서, 한세눌라 폴리모르파가 사용될 수 있다.
한세눌라, 피치아, 칸디다, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)를 포함하는 다른 효모 종이 또한 제한없이 사용될 수 있다.
부가적으로, 포유동물세포(예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 3T3 세포)의 다른 종은 여기 기술된 L 단백질이 발현을 위한 진해 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 적절한 포유동물 숙주 세포의 선택 및 형질 전환, 배양 증폭, 선별법 및 생성물 생성 및 정제를 위한 방법은 당분야에 공지된다. 예컨대, Gething 및 Sambrook, Nature, 293: 620-625(1981) 또는 대안적으로 Kaufman 일행. Mol. Cell. Biol. 5(7) : 1750-1759(1985) 또는 Howley 일행의 미합중국 특허 제4,419,446호 참고. 다른 적절한 포유동물 세포계는 원숭이 COS-1 세포계 및 CV-1 세포계이다.
상기된 L 단백질 코딩 서열에 도입된 결실의 일부가 포유동물 세포내 M 및 S 특히 mRNA과의 전사 및 해독을 시작하는 내부 서열을 변경시키는 것으로 이해될 것이다. 그러므로, 변형 L 단백질 코딩 서열은 그들의 개별 발현 카세트가 머무는 포유동물 세포내 S 및 변형 L 단백질의 독립 발현을 허용한다.
본 발명에 적합한 숙주세포로서 유사하게 유용한 것은 세균 세포이다. 예컨대, 이. 콜라이의 다양한 균주(예컨대, 하기 실시예에 사용된 균주, HB101, MC1061)는 생물 공학 분야에서 숙주세포로서 잘 알려졌다. 비이. 설틸리스(B. subtilis), 슈도모나스(Pseudomonas), 다른 세균 등의 다양한 균주가 본 방법에 또한 사용될 수 있다.
부가적으로, 원하는 경우 곤충세포가 본 발명 방법에서 숙주세포로서 이용될 수 있다. 예컨대, Miller 일행, 유전공학, 8 : 277-298(Plenum Press 1986) 및 여기 인용된 참고자료를 참고하라.
배큘로바이러스 또는 백신 바이러스같은 몇가지 바이러스가 본 발명의 L 단백질을 발현시키는데 또한 사용될 수 있다. 적절한 숙주세포의 선택은, 적절한 배양 조건, 선택된 숙주세포내 발현에 적합한 배지 및 백터 성분의 선택과 같이, 당분야 기술자의 능력내에 있다.
상기되고 이후에 기술된 발현 시스템에서, 선택된 숙주 세포내 단백질 코딩 서열의 발현을 제어할 수 있는 임의 공지된 프로모터가 선택될 수 있다. 선택된 숙주세포가 효모 세포인 경우, 변형 L 단백질 카세트를 발현시키는데 유용한 프로모터는 강한 프로모터 TDH3 또는 생장배지 조성물에 의존하는 L 단백질의 수준을 조절하는 다른 연속성(constitutive) 또는 조절성 프로모터를 포함한다. 부가적으로, 예컨대, PGR, ARG3, 및 APH1은 본 발명의 벡터에 유용한 예증적인 프로모터이다.
참고로 여기 포함된 동시계류중인 미합중국 특허 출원 SN 07/368,401호에 기술되었듯이, 본 발명은 또한, 혼합 폴리펩티드 조성물의 HBsAg 입자의 일부로서 본 발명의 변형 L 단백질의 발현을 제공한다. 상기 방법은 효모세포내 첫번째 단백질 S와 두번째 단백질 X-S의 동시발현과 관련되고, 여기서 S는 실질적으로 HBV의 주요 표면 단백질이고, X는 본 발명을 위해, S 코딩 서열로 상융합된 기능 DNA 코딩 영역에 의해 코딩된 변형 preS 서열이다.
동시계류중인 미합중국 특허 출원 제07/368,401호를 참고로, 실질적으로 동일한 기술이 Jacobs 일행, Gene 80 : 279-291(1989)에서 발견되어짐을 주목해야만 한다.
본 방법에 따라 S 단백질 코딩 서열은 변형 L 단백질 아미노산 서열과 동시 발현된다. S 단백질에 대한 서열뿐 아니라 L 단백질의 코딩 영역은 상기한 바와 같이 통상적인 화학 합성 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제될 수 있다. 변형 L 단백질은 S 단백질과 함께 혼합 서브유닛 조성의 입자로 포함된다.
본 발명의 변형 L 단백질로 구성되는 X-S 단백질의 구성에서, S는 바람직하게, HBV의 전체 성숙 표면 단백질(약 226 아미노산)(표 4를 보라)이다.
대안적으로, S 단백질은 HBV 게놈의 S 단백질 코딩 서열에 의해 코딩될 수 있고, 여기서 S는 인증된 HBsAg S 단백질과 실질적으로 동일하다. 입자 어셈블리에 역효과를 미치지 않는 한, 끝이 잘린 S가 변형 L 단백질 함유 혼합 입자의 구성에 또한 사용될 수 있다.
S 단백질 코딩 서열은 효모 숙주내 S 단백질의 발현을 사용하는 통상적인 기술의 적용으로 첫번째 발현 카세트에 놓인다. S 단백질 코딩 서열 또는 그의 실질적인 부위는 preS 코딩 서열의 부위와 융합되어 적용되고, 두번째 발현 카세트에 놓여 본 발명의 변형 L 단백질의 생성을 허용한다.
S 단백질 발현 카세트를 운반하는, 상기된 통상적인 기술에 의해 구성된 벡터 및 변형 L 단백질 발현 카세트를 운반하는 하나이상의 벡터는 통상적인 기술에 의해 효모 숙주 세포로 형질전환된다.
대안적으로, S 단백질 발현 카세트 및 하나이상의 변형 L 단백질에 대한 발현 카세트는 효모 숙주 세포로 형질전환된 동일 백터상에 함께 놓인다.
사용될 수 있는 벡터는 동시계류중인 미합중국 출원 SN 386,401에 상세히 기술된 바와 같은 Ty 통합성 벡터이다. 다른 대안적인 방법은 원하는 발현 카세트를 운반하고 효모 숙주 세포를 형질 전환시키는 양립가능한 자발적 복제 벡터를 사용한다.
벡터 시스템의 예는 Mellor 일행, 효모, 2:145(1986); Boeks 일행, Cell Boeks 일행, Cell 40, 491(1985), Boeke 일행, 세포, 42:507(1985) 및 동시계류중인 미합중국 특허 출원 SN 101,463; 233,631; 368,401 및 009,325(유럽 특허 출원 공개 제 0 278 940 호)에 상세히 기술되고, 상기 출원 및 참고자료는 참고로 여기 포함된다.
부가적으로, 다른 종의 숙주 세포가 여기 기술된 혼합 폴리펩티드 조성물의 복합 HBsAg 입자의 발현을 위해 사용될 수 있다. 적절한 진핵 숙주는 포유동물 세포(예컨대 CHO 세포)와 같이, 본 발명의 변형 L 단백질의 발현을 위해 앞서 나열한 것과 동일하다. 앞서 언븐한 배클로바이러스 및 백신 바이러스 같은 바이러스 및 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 방법의 바람직한 실시양태는 S 단백질 발현 카세트를 운반하는 Ty 통합성 벡터 및 변형 L 단백질 발현 카세트를 운반하는 자발적 복제 플라스미드 벡터를 사용한다.
S 단백질 발현 카세트를 운반하는 Ty 벡터의 사용은 이들 서열이 효모 숙주 세포의 염색체로 안정하게 통합되도록 한다. 상기 통합은 낮은 절제 횟수로 인해 안정하다. 그래서, 벡터는 각 세포내 유사 비율의 단백질 합성을 허용하면서, 세포 모집단에 균일하게 분포된다.
변형 L 단백질에 대한 발현 카세트를 운반하는 자발적 복제는 플라스미드의 이들 세포로의 형질 전환은 각 세포내 한정양의 S 단백질 합성에 대해, 변형 L 단백질 합성의 수준이 세포에 존재하는 플라스미드의 복사수에 따라 변화함을 확실케한다.
다른 바람직한 실시양태에서, S 단백질 발현 카세트 및 변형 L 단백질 발현 카세트 둘다는 Ty 통합성 벡터상에 삽입되고, 반대 교배형의 효모 숙주 세포로 독립적으로 통합될 것이다. S 카세트 및 변형 L 카세트 통합 경우의 원하는 번호를 운반하는 균주는 그리고나서 교차되어 S 및 변형 L 폴리펩티드 둘다를 발현시키는 이배체 세포를 얻을 수 있다. 원한다면 두가지 형태의 발현 카세트를 운반하는 반수체(haploid) 분리개체는 상기 이배체의 포자형성에 의해 얻어질 수 있다.
세포는 적절한 배지, 즉 숙주가 혼합 서브유닛 조성의 입자내 S 단백질과 변형된 L 단백질을 회수가능한 양으로 발현시킬 수 있도록 하는 배지에서 배양할 수 있다.
결과 변형 L 단백질은 S 단백질과 함께 효모세포에서 동시에 생성될 것이고, 혼합 복합 입자로서 모일 것이다. 상기 입자는 두개이상의 폴리펩티드의 미립자 구조로의 다합체(multimer) 어셈블리로서 여기서 정의된다; 그러므로 이는 혼합 폴리펩티드 조성물의 복합 성질에 의해 특징지워진다. 서로다른 펩티드는 혼합 입자의 표면에 공간적 연합으로 배치된다. HBsAg 입자상 신규 변형 L 단백질의 존재는 네이티브 결정체(native determinant)의 인식과 관련된 것과 유사한 면역 반응을 유도할 것이다. 그로써, 본 발명은, HBV의 S, M 및 L 단백질로부터의 필수적인 항원성 부위를 포함하는 한에 있어서는 네이티브 입자를 흉내내는 효모내 HBsAg 입자의 생성을 가능케한다.
배지의 세포 용균물 또는 추출물로부터의 본 발명 혼합 입자의 분리는 통상적인 단백질 분리 기술에 의해 수행된다.
본 발명 방법의 실시에서, 형질전환, 클로닝 및 발현시스템이 유용한 임의의 효모 숙주 종은 HBsAg의 혼합 입자를 발육시키는데 적용될 수 있다.
다른 효모 속에서, Ty 서열은 존재하지 않으므로, 벡터 시스템은 기술된 혼합 입자를 생성시키기 위해 이들 속내 S 및 변형 L 단백질 코딩 서열의 동시발현을 제공하도록 고안되어야만 한다. 그러므로, 발현 카세트는 효모(예컨대, 피치아)내 ARS 기재 플라스미드와 같은 플라스미드 또는 다른 반복성 DNA 서열을 적용하고, 염색체로의 통합을 허용하여, 효모 염색체로 통합되기 위해 고안될 수 있다. 상기 적용할 수 있는 ARS 플라스미드의 예는 Cregg 일행, Mol. Cell. Biol., 5(12) : 3376(1985)에 기술된다.
예컨대, Ty 발현 시스템 및 이외의 것과 같은 상기된 발현 시스템에서, 조절 성분은 RNA 폴리머라제 결합 및 전사를 수행하는 프로모터로 구성된다. 조절가능한 즉, 유도되거나 활성가능한 프로모터도 또한 사용될 수 있다. 다양한 유용한 프로모터가 효모내 이종 폴리펩티드의 발현에 유용하다. 이들은 구리 유도성 메탈로티오네인 유전자(CUP1, metallothionein gene) 프로모터 및 글리코실 유전자의 구성 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(TDH3, glyceraldehyde-3-phosphate) 및 알콜 탈수소효소(ADH, alcohol dehydrogenase)를 포함한다. 효모내 전사 종결을 위한 영역은 임의의 여러 효모 유전자 예컨대, 이소-1-시토크롬 C (CYC1, iso-1-cytochrome)에 대한 유전자의 3' 말단으로부터 유도된다. 클루이베로마이세스에 사용하기 위한 발현 시스템은 예컨대, Hollenberg 일행의 PCT WO83/04050에 기술되고, 스키조사카로마이세스에 대한 것은 Yamomoto의 EP-A-1O7170에; 피치아에 대한 것은 Cregg 일행의 Bio/Technology 5 : 479(1987)에; 한세눌라에 대한 것은 Hollenberg 일행의 EP-A-299108에 기술된다.
본 발명의 실시예에 의해 특별하게 제공된 것은 에스. 세레비지애균주로 이는, Ty 기재 벡터에 의해 조작된 S 단백질 발현 카세트의 게놈 통합의 결과로서 S 단백질을 합성시킬 수 있다.
TDH3-S 코딩 서열을 함유하는 한개 상기 벡터, pRIT13133-L-ARG3 카세트 및 URA3 마아커는 동시 계류중인 미합중국 특허 출원 SN 368,401의 실시예 1에 기술된다.
다른 Tyl 벡터, pRIT13034-L은 동일한 발현 카세트를 포함하지만, CUP1 또는 CUP1△ 수용자 효모 균주내 부가적인 마아커로서 사용될 수 있는 CUP1 유전자 이외에 URA3 마아커를 포함한다.
바람직한 효모 균주는 통합된, 벡터의 여러 복사물을 갖는 전환체를 쉽게 선별하기 위해 기능 염색체 CUP1 유전자가 없는데, 이는 구리 독성에 민감하다. 두개의 바람직한 CUP1△ 효모 균주 EJ CUP1△3d 및 EJ CUP1△7b는 동시 계류중인 미합중국 출원 SN 368,401의 실시예 9에 기술된다.
pRIT13133-L 또는 prRIT1O347-L의 여러 통합된 복사물을 함유하는 효모 균주는 이후 실시예에 기술된다.
변형 L 단백질에 대한 발현 카세트를 운반하는 자발적 복제 효모 발현 플라스미드의 이들 효모 균주로의 형질전환은 또한 이후 실시예에 기술된다.
S 및 변형 L 발현 카세트 둘다의 여러 통합 복사물을 운반하는 이배체 효모 균주는 이후 실시예 F.10에 기술된다.
상기 변형 L 단백질만 또는 혼합 서브유닛 조성 입자로의 상기 변형 L 단백질을 생성시키기 위한 본 발명의 방법은 병원 미생물에 대한 백신 생성에 유리한 유용성을 가진다. 예컨대, 변형 L 단백질은 B형 간염 표면 항원을 포함하는 다양한 백신 제제에 기술되고, 공지 HBV 백신으로 얻어지지 않는 잇점을 제공할 것이다. 변형 L 단백질을 함유하는 혼합 서브 유닛 조성물의 HBsAg 입자는 입자 또는 필라멘트 또는 주요 단백질로부터의 에피토프 이외에 그들 표면에 노출된 preS2 및 preS1 에피토프를 함유하는 HBV 감염 인간의 혈액에 존재하는 바이러스입자를 닮았고, 또한 신규 백신 제제에 유용한 것으로 입증될 수 있다. 변형 L 단백질 및 그를 함유하는 혼합 서브유닛 조성의 혼합 입자는 S, M 및 L 단백질의 개별적인 혼합물로는 얻어지지 않는 면역원성을 가질 것이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 혼합 서브유닛 조성물의 입자는 보호의 범위를 넓히기 위해 서로다른 아형 결정인자를 가진 변형 L 단백질 및 S 단백질을 포함할 수 있다. 그것은 ay 아형 특이성의 변형 L 단백질 및 ad 아형의 S 단백질이거나 반대일 수 있다.
그러므로 본 발명은 본 발명의 변형 L 단백질을 함유하는 백신 또는 혼합(S, 변형 L) 또는 동종 (변형 L 단백질) 아단위 형태로 변형 L 단백질을 함유하는 입자를 포함한다. 상기 백신은 면역 보호량의 입자 또는 변형 L 단백질을 포함할 것이다. 즉, 충분한 단백질 또는 입자가 투여되어 심각한 부작용없이 HBV에 대한 충분한 보호 항체 반응을 유도한다. 상기 백신은 통상적인 기술로 제조될 수 있다. 예컨대, 인간에서 HBV 감염에 대한 보호를 모의 실험하기 위한 백신은 입자 및/또는 상기된 개진 L 단백질 적절한 통상적인 담체를 포함할 것이다. 입자 또는 L 단백질은 직접 사용을 위해 생리적 pH에서 완충된 수용액에 있을 것이다. 대안적으로, 단백질 또는 입자는 수산화 알루미늄 또는 인산 알루미늄 같은 통상적인 보조제로 흡수되거나 혼합될 수 있다. 또한, 상기 입자 또는 변형 L 단백질은 다른 면역원과 결합하여 조합 백신을 재조할 수 있다; 예컨대, 백신에서의 새로운 경향 및 개발(New Trends and Developments in Vaccines) Voller 일행, University Park Press, Baltimore, MD (1978) 참고.
이들 변형 L 단백질만 또는 상기된 바와 같은 혼합 또는 균질 서브유닛 조정 입자로의 상기 단백질은 HBV에 대한 항체의 스펙트럼을 넓히고, 이들 단백질은 함유하는 백신으로 접종된 인간에 의한 바이러스성 시도에 대한 빠른 반응을 제공할 수 있다. 부가적으로, 이들 변형 L 단백질을 함유하는 백신은 S 단백질에 대해 반응하지 않는 사람을 preS 반응을 개시하도록 할 수 있거나 S 반응을 증대시키거나 향상시킬 수 있다.
본 발명의 입자 및/또는 변형 단백질은 다양한 통상적인 면역 검정법에 의해 생물학적 샘플내 HBV 또는 HBV 유도된 단백질 또는 항-HBV 항체의 검출을 위해 프로브 또는 시약으로서 또한 사용될 수 있다.
여기 기술된 모든 백신은 적절한 경로 예컨대, 피하, 정맥내 또는 근육내 경로에 의해 투여될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 각 백신 투여량내 면역원의 양은 환자의 나이, 무게, 성별, 전체적인 신체조건등의 고려에 관한 의사의 배려에 의해 선택된다. 뚜렷한 역 부작용 없이 환자에서 면역 보호 반응을 유도하기 위한 양은 사용된 면역원 및 보조제의 임의 존재에 의존하여 변할 것이다. 대개, 각 투여량은 단백질 1-1000 ug, 바람직하게 1-200 ug으로 구성될 것이라 기대된다. 초기 투여 후에 임의로, 바람직하다면 반복된 부스트가 따를 것이다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따르는 보호량의 백신을 필요로 하는 환자에게 제공하는 것으로 구성되는, 인간에서 B형 간염을 치료하거나 예방하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명에 따르는 특히 바람직한 백신은 구조 (L*, S) 특히 바람직하게 여기 기술된 에스. 세레비지애 또는 에이치. 폴리모르파에 발현된 복합 입자로 구성되는 것들이고 , 여기서 L*는 이후에 정의되고, S는 B형 간염 표면 항원의 S-단백질을 부여한다.
본원에서 사용되는 기호 L*는 상기 표 1에 보여진 ad 혈청형의 HB 바이러스상 큰 오픈 리딩 프레임에 관한 잔기 12-52, 133-145 및 175-400으로 구성되는 변형 L 단백질을 의미한다. 상징 △gly L*는 잔기 12 그리고나서, 잔기 14-52 그리고나서, 잔기 l33-145 및 175-400으로 구성되는 변형 L 단백질을 유사하게 의미한다.
하기 실시예는 본 발명을 예증한다.
물질
1. 플라스미드
명세서에 언급된 플라스미드는 이후 파트A에 기술된다.
2. 효모 균주
한세눌라 폴리모르파 RB10 (ura 3)는 Roggenkamp 일행(1986)에 의해 기술된 바와 같이 근본적으로 에틸메탄설포네이트 (ENS)를 사용하는 변이 유발에 의해 얻어진 한세눌라 폴리모르파 ATCC 34438의 변이체이다.
3. 효소
제한 엔도뉴클레아제, T4 DNA 리가제 및 사용된 다른 효소는 Boehringer, Mannheim, FRG 또는 Bethesda Research Laboratories, Eggenstein, FRG로부터 얻었다. 효소는 각각의 제조자의 지시에 따라 사용했다 .
4. 면역학적 시약
a) S1.1 : preS1-단백질의 S1 도메인에 대해 특이한 생쥐 모노클론 항체 (Smithkline Biologicals, Rixensart, Belgium)
b) S2.1, S2.2 및 S2.5; B형간염 표면항원의 S2-도메인에 대해 특이한 생쥐 모노클론 항체(Smithkline Biologicals, Rixensart, Belgium)
B형 간염 표면 항원의 S1-도메인 및 S2-도메인에 대해 특이적 항체는 preS-항체로서 일컬어진다.
c) RF6 : B형 간염 표면 항원의 S 영역에 대해 특이한 생쥐 모노클론 항체 (H. Thomas, Royal Free Hospital, London)
d) RF1 : S-부위에 위치한 입체 배좌 의존 에피토프에 대해 특이한 생쥐 모노클론 항체 (H. thomas, Royal Free Hospital, London)
e) HBS1 : S-부위에 위치한, 플라스마-유도 NBsAg의 변성 및 환원 내성 에피토프에 대해 조작된 생쥐 모노클로항체 (Smithkline Biologicals Rixensart, Belgilum) 상기 모노클론은 Mab RF 6과의 결합실험에서 경쟁한다.
항체 a), b) 및 e)는 골수종세포와의 생쥐 비장세포의 융합에 의한 표준 과정에 따른 출원인에 의해 제조되었다. Kohler 및 Milstein의 방법(1975)이 참고가 된다. 방법들은 Goding, Monoclonal Antibodies, Principles and Practice, Academic Press, London 1983에 기술된다.
f) AUSRIA (Abbott Laboratories, Wiesbaden-Delkenheim, FRG 및 Louvain-La-Neuve, Belgium) : 네이티브 입체배좌 에피토프에 대해 조작된 다클론 항체를 함유하는 상업적인 키트.
g) AUSZYME (Abbott Laboratories, Wiesbaden-Delkeheim, FRG 및 Louvain-La-Neuve, Belgium) : 네이티브 입체배좌 에피토프에 대해 조작된 모노클론 항체를 함유하는 상업적 키트.
f), g) 하에 언급된 항체는 상업적으로 구입가능하다. 그들은 단합체 B형 간염 표면 항원과 반응하지 않는다.
h) AUSAB(Abbott Laboratories, Louvain-La-Neuve, Belgium) : 항HBsAg-항체의 검출을 위한 상업적 키트.
5. 배 지
배지 제조를 위해 사용된 펩톤 190, 효모 추출물, 카사미노산 및 효모 질소 베이스는 Gibco Ltd., Paisley, U.K에서 구입했다.
한천 평판 배지를 제조하기 위해, 각각의 배지를 오토클레이빙시키기전에 리터당 18g 한천(Gibco Ltd)을 첨가했다.
a) SMR : 반-영양 비-선택성 배지
메탄올 함유 SMR은 또한 Met-SMR이라 불리워진다.
b) YNB : 선택성 배지
c) YEPD : 비-선택성 영양 배지
필요하다면, 배지 1ml당 젠타마이신 G4181mg을 첨가했다.
d) S-배지
Ⅱ. 방법
1. DNA의 조작
제한 엔도뉴클레아제로의 절단, T4 DNA 리가제를 사용한 연결, DNA의 포스포릴화, 이. 콜라이로부터의 DNA의 분리, 겔 전기영동에 의한 DNA의 분리, 및 이런 적용에서 사용된 유전자 기술 영역에 속하는 모든 다른 기술들을 마니아티스 일동에 의해 1982년 기술된 대로 근본적으로 수행했다.
2. 효모의 형질전환
상기 방법(로겐캄프 일동,1986)에 의해 메틸요구 효모를 형질전환 시킨다.
완전한 냉동 세포를 사용하는 방법이 바람직하다(클레베 일동,1983)
(a) ura 3 결핍의 보충 또는 젠타마이신에 대한 저항성에 의해 형질전환된 세포를 동정한다.
25 ml 고형화된 매체를 함유하는 YEPD 플래이트상에 세포를 플래이팅시켜. 젠타마이신 G418에 대한 저항성을 조사했다. 플레이트 상에서의 6시간의 성장후에 25mg의 젠타마이신 418을 함유하는 1ml 수성 용액을 각 플래이트상에 적용시켜 2-3일동안 배양을 계속했다. 기브코 Ltd.로부터 젠타마이신 G418(상표명 Geneticin)을 얻었다.
b) 선택적인 형질전환 플래이트로부터 형질전환체를 선택하고 약 20세대(두번의 통과)동안 액체 선택 배지(1mg/ml에서 G418을 갖는 YNB 또는 YEPD)에서 성장시켜 유사분열적으로 안정한 형질전환체의 분리를 수행했다. 이 성장 기간동안 세포를 비-선택적 배지(SMR 또는 YEPD)로 배양시켜 또다른 40-60 세대(5-6 번 통과) 동안 성장시켰다. 그런다음 세포를 선택적 플레이트 (1mg/ml에서 G418을 갖는 YNB 또는 YEPD)상에 플래이팅시켰는데 여전히 선택적 마아커(marker)를 나타내는 클론을 보유하고 있었다.
3. 효모 DNA의 분리
스트룰 일동(1979)에 기술된 대로 효모로부터 총 DNA를 제조했다.
4. 효모 DNA의 분석
적절한 제한 엔도뉴클레아제로 소화시킨 다음 아가로스 겔 전기영동시켜 효모 형질전환체내 DNA의 구조를 분석했다. 그런다음 DNA 단편을 니트로셀룰로스로 트랜스퍼하여 적절한 방사능적으로 라벨링된 DNA 프로브로 하이브리드화시켰다.(서어던 1975)
5. 면역분석
웨스턴 블로트(Western Blot) 분석
a) 아머샴(Amersham)절차.
12.5% 분리, 5% 스태킹(stacking)겔을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(라엠리,1970)에 의해 조추출물 또는 구배 분획으로부터 얻은 단백질을 분리시켰다. 토우빈 일동(1979)에 의해 근본적으로 기술된 대로 니트로셀룰로스상에 단백질 밴드를 트랜스퍼하였다.
블로트와 특이 항체를 반응시켜 항원 물질을 검출했다. 필터를 비오티닐화된 항체 RPN 1001 (아머샴, 부크릴 GmbH 및 Co. Ltd., 브라운쉬바이고, FRG)과 1:300 희석으로 반응시킨 다음 페톡시다제-스트렙트아비딘-복합체 RPN 1051(아머샴)으로 배양시켰더니 항원-항체 복합체가 나타났다. 제조업자의 지시에 따라 모든 실험 단계를 수행했다.
b) 또한, 필터를 PBS 내 0.05% 트원(W/V)으로 예비배양시켰다. 제공된 모노클론 항체와의 배양후에, 0.05% 트원 20을 함유하는 1:250 희석으로 비오티닐화된 양 항-생쥐(sbeep anti-mouse) IgG (RPN 1021 아머샴), 스트렙트아비딘-비오티닐화된 양고추 냉이 라디쉬 페록시다제(horse radish peroxidase) 복합체(RPN 1051, 아머샴, 1% 젤라틴을 함유하는 PBS 내 희석1:400) 및 최종적으로 50 ml PBS 내 4-클로로-1-나프톨(3mg/ml 메탄올)을 함유하는 30㎕ H202및 10ml HRP 발색시약으로 계속적으로 배양시켜 항체결합을 검사했다. 배양 사이에 0.05% 트원20을 함유하는 PBS로 필터를 세척했다.
2-20 ug 총 세포 단백질을 함유하는 한세눌라(Hansenyla)의 조 단백질 추출물의 3-5개의 다른 희석물에 0.01-0.3 ㎍의 효모-유도 정제된 HBsAg 샘플들(스미스클라인 바이오로지칼)과 비교함으로써, 생성된 단합체 항원(S 및 perS)을 정량화했다.
바이오래드(BioRad) 단백질 분석 키트(바이오래드 무니크, FRG)를 사용하여 단백질 농도를 결정했다.
[실시예]
파트 A
플라스미드
[실시예 A.1]
파트 A
한세눌라 폴리모르파에서 단백질을 발현시킬 수 있는 플라스미드의 작제
a) 한세눌라 폴리모르파 자발적 복제 서열을 함유하는 기본 플라스미드의 작제 (pME4).
한세눌라 프로모터의 조절하에 S-유전자를 함유하는 플라스미드를 작제하는데 사용된 모(parent) 플라스미드는 M. 엑카트(1988)의 Ph. D 이론에 이미 공개된, pME4이다. pME4는 하기 변형에 의해 얻어진 YIp5(스트룰 일동,1979; 스틴크콤 일동,1980)의 유도체이다.
한세눌라 폴리모르파 자발적 복제 서열 HAPS1을 로겐켐프일동(1986)에 공개된 대로 YIp5의 SalI 위치로 클로닝시켜 pHARS를 만든다. 그런다음 440 염기 쌍 HARS1-SslI 단편을 결실시키고 같은 벡터의 PvuⅡ위치로 재삽입시켜 플라스미드 pHARS를 재구성한다. 단편의 SalⅡ 부착 말단을 연결하기 이전에 엑소뉴클레아제 VⅡ와 함께 배양시킨 다음 클레나우 폴리머라제와 반응시켜 블런트(blunt)말단화시켰다. 이런 재구성은 플라스미드의 pBR322 부분의 테트라시클린 내성 유전자 내 단일 SalI 부위를 만든다. 이렇게 얻어진 중간 플라스미드는 코딩 서열이 아래 나타낸 링커에 의해 대체되는 원래 코딩 서열이 부족한 베타-락타마제 유전자를 얻기 위해 다시 재구성된다; 자세한 것은 엑카트(1988) 참조 :
이 단계로 제1도에 나타난 바와 같은 플라스미드 pME4를 얻었다.
b) MOX 및 FMD 프로모터 단편.
에이치. 폴리모르파로부터 MOX 프로모터의 분리는 엑카트, 1988에 공개되어 있다. 본 발명의 목적을 위해 MOX 단백질의 다섯개의 첫번째 아미노산에 대한 코돈 및 MOX 유전자의 업스트림 (upstream) 조절 영역을 함유하는 1525 bp에 게놈 EcoRI-SalI 단편을 pBR 322 유도체로 클로닝시켰다. MOX-유전자의 도식적 표현은 제2도에 제공된다. EcoRI를 사용하여 이런 중간 플라스미드를 절단하고 뉴클레아제 Bal31로 처리한 다음 EcoRI 링커로 연결시켰다. 이처럼 EcoRI 3' 말단 및 SalI 5' 말단을 갖는 일련의 프로모터 단편은 제한 엔도뉴클레아제 SalI으로의 순차적인 절단에 의해 얻어졌다. 막삼 및 길버트(1977)의 방법에 따른 DNA 서열화에 의해 다양한 결실 말단점을 확보했다. 본 출원에 기술된 또 다른 실험의 목적을 위해 위치-3으로의 결실을 함유하는 pBR322-MIP를 나타내는 플라스미드 (MOX 번역 개시 코돈의 첫번째 염기가 염기+1인 경우)를 사용했다. 플라스미드 pBR322-MP는 엑카트(1988)에 기술되어있다.
FMD 프로모터의 분리 및 특성은 유럽 특허 출원 87 11O 417.0에 공개되어있다. 본 발명의 목적을 위해 약 1000bp의 엎스트림 프로모터 영역을 포함하는 1.4kb BamHI 단편을 pUC 19의 Bam HI 위치로 클로닝시켰다. 삽입물이 삽입된 단절의 3'말단에서 pUCl9의 단일 EcoRI-위치를 갖는 방식으로 배향되는, 클론을 선택했다. 그 프로모터를 포함하여 FMD 유전자를 함유하는 게놈 클론의 도식적 표현이 제2b도에 나타난다. 구조 유전자의 서열없이 프로모터를 함유하는 플라스미드를 얻기 위해 pUC19-링커안의 EcoRI 위치로부터 출발하는 일련의 뉴클레아제 Bal31 결실을 준비했다. Bal31 처리에 따라 DNA를 EcoRI 링커에 연결시키고, DNA를 BamHI로 절단시키고 BamHI-EcoRI 단편을 pBR322로 클로닝시켰다. 다양한 결실을 얻었다. 첫번째 ATG로부터 위치-5 및-9로의 결실은 나중 실험에서 가장 효율적이다. 본 출원에 기술된 또다른 실험을 위해 첫번째 ATG로부터 위치-9로의 결실을 함유하는 프로모터 단편을 운반하는 플라스미드를 사용했다.(플라스미드 pBR322-FMD-P-9) 또다른 플라스미드의 구성을 위해 사용된 MOX-및 FMD 프로모터 단편의 도식적 표현은 아래 나타낸다.
i) MOX 프로모터 단편 (-3)
ii) FMD 프로모터 단편 (-9)
c) 터미네이터
MOX 유전자로부터 전사 터미네이터의 분리는 엑카트 (1988)에 공개되어있다. MOX 유전자의 3' 영역의 도식적 표현은 아래 나타낸다 :
상기 도표에 나타난 SalI-NruI 단편을 SalI 및 NruI 위치 사이의 pBR322로 서브클로닝시킨 다음 제한 엔도뉴클레아제 Asp718을 사용하여 이 플라스미드를 절단하여 MOX 오픈 리딩 프레임(open reading frame)내 단일 Asp718 위치에 기인한 플라스미드의 선형화를 초래하고 Bal31 결실이 되게한다.
결과 형성된 단편의 DNA 서열 분석에 의해 여전히 터미네어터로서 기능하는 약 320 bp의 터미네이터 단편을 확인했다.(엑카트,1988) 이런 블런트 말단화된 터미네이터 단편(GACATACC-315bp-EcoRV)을 pUC19의 SmaI 부위에 연결시켰다. 서열 분석(막삼 및 길버트,1977)에 의해 단편의 배향을 확립했다. 결과 형성된 클론 pT-24를 제3도에 나타낸다. 아래 나타난 대로 발현 벡터를 구성하기 위해 이 클론을 사용했다.
d) 선택적 마아커 유전자
pME4(위에 기술된 제1도 참조)를 EcoRI로 절단하고 스티키 말단(sticky end)을 클레나우 폴리머라제를 충전시켰다. 플라스미드 pT-24를 EcoRI 및 Hind Ⅲ으로 소화시키고 pUC19 링커 및 MOX 터미네이터 단편으로 구성되는 단편을 분리시켰다. 이 단편의 스티키 말단을 클레나우 폴리머타제로의 처리에 의해 블런트 말단화시키고 블런트 말단하된 단편을 pME4와 연결시켰다. 결과형성된 플라스미드를 pP/T-24라 불렀다. pUCl9로부터 유도된 클로닝 부분을 또 다른 클로닝 단계를 위해 나중에 사용했다.
플라스미드 pP/T-24는 선택적 마아커로서 에스. 세레비지애 URA3 유전자를 함유한다. 또다른 선택적 마아커로서 클로람페니콜에 대한 내성을 제공하는 유전자를 유도시켰다. 이런 유전자를 1.7kb AatⅡ-ClaI 단편으로서 벡터pBR325로부터 분리시키고, 각 측면상의 약 4개의 염기쌍의 제거를 위한 짧은 Bal31 소화를 시키고, 클레나우 충전 반응을 사용하여 블런트 말단화시켰다. 순차적으로 단편을 NruI으로 절단한 다음, pP/T-24에 연결시켰다. 클로람페니콜 내성을 나타내는 결과 형성된 플라스미드를 pP/T-24-C라 불렀다.
[실시예 A.2]
한세눌라 폴리모르파 터미네이터와의 기능적인 조합으로 B형 간염 표면 항원 유전자를 함유하는 플라스미드의 작제.
한세눌라 폴리모르파에서 효율적인 터미네이터 및 B형 간염 S-유전자로 구성되는 기능적 단위를 얻기 위해 S-유전자를 상기 플라스미드의 pUC19링커 부분에 의해 제공된 플라스미드 pP/T-24C의 BamHI 위치로 683bp의 NcoI-EcoRI 단편으로서 도입시켰다. TAA 종결 코돈을 넘어 ATG 코돈(CCATGG)에서의 NcoI로부터 EcoRI로 S-단백질을 코딩하는 683 bp NcoI-EcoRI DNA 단편을 함유하는 통상적인 pUC9 기재 이. 콜라이 벡터인 pRIT 12331로부터 얻었다. 표면 항원 코딩 서열을 하포드 일동(1987)의 EP-A-0278940에 공개된 pRIT 10616으로부터 통상적인 재조합체 DNA 기술에 의해 유도시켰다. pRIT10616은 pACYC184 위에 클로닝된 adw 혈청형(serotype)의 HBV 바이러스의 게놈을 함유하며 기탁 번호 ATCC 39131 하에 1982년 6월 2일에 부다페스트 조약하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 기탁되었다.
S-유전자 단편 및 BamHI 절단된 pP/T-24C의 스티키 말단을 연결시키기 전에 충전에 의해 블런트 말단화시켰다. 적당한 배향에서의 단편의 연결은 S-유전자 코딩 영역 바로 가까이에 5' 구성에 대한 인접한 BamHI 및 NcoI 위치를 재생시킨다. 결과 형성된 플라스미드를 PRB-S라 부른다.
[실시예 A.3]
한세눌라 폴리모르파 유도 프로모터, B형 간염 표면 항원 유전자 및 한세눌라 폴리모르파 터미네이터로 구성되는 기능적 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 작제.
각각 MOX 또는 FMD를 함유하는 pBR322 유도체 pBR322-MP 및 pBR322-FMD-P-9를 EcoRI로 소화시키고 스티키 말단을 클레나우 폴리머라제를 사용하여 충전시켰다. 그런다음 플라스미드를 SalI으로 소화시켰다. MOX 프로모터를 함유하는 결과 형성된 단편은 오로지 한세눌라 폴리모르파 게놈 DNA로 구성되는 반면, FMD 프로모터로 구성되는 단편은 덧붙여 275bp의 pBR322 서열 (위치 bp 375-bp 650 pRB 322 지도)을 함유한다.
폴리스미드 pRB-S를 재생된 BamHI 위치에서 절단시키고, 이 위치를 클레나우 폴리머라제로의 충전에 의해 블런트-말단화시킨다음 플라스미드를 SalI로 소화시켰다. SaI 스티키 말단 및 블런트 말단을 갖는 프로모터 단편을 S-유전자 코딩 영역 및 한세눌라 폴리모르파 터미네이터를 함유하는 pRB-S의 큰 SalI-블런트 말단 단편에 연결시켰다. 결과형성된 플라스미드를 pRB-S-269(MOX 프로모터) 및 pRB-S-271(FMD 프로모터,-9 결실)이라 부르며 제4도에 나타난대로 한세눌라 폴리모르파 프로모터 및 터미네이터의 조절하에 S-유전자를 함유한다. 프로모터 및 S-유전자 사이의 융합을 둘러싸는 서열은 아래 도식적 표현으로 나타난다.
a) MOX-프로모터 융합 (pRB-S-269)
b) FMD-프로모터 (-9) 융합
HARS1 서열을 나르는 440bp 제한 단편의 삽입이 부족한 것을 제외하고 pRB-S-271 및 pRB-S-269에 동일하게 구성된 플라스미드를 pRB-S-269I 및 pRB-S-271I라 불렀다. 1-3 복사의 발현 카세트를 함유하는 통합체를 얻기 위해 이런 플라스미드를 사용했다.
[실시예 A.4]
S-유전자를 함유하는 통합 벡터(integrative vector)의 구성.
a) 한세눌라 폴리모르파 자발적 복제 서열 및 에이치. 폴리모르파 URA3 유전자를 함유하는 플라스미드 pBC의 작제.
사카로마이세스 세레비지애 ARS1 서열을 함유하는 플라스미드 YRp7(첨퍼 및 카본,1980)로부터 폴리스미드 pBC를 유도한다. 이런 자발적 복제 서열을 한세눌라 폴리모르파 URA3 유전자를 포함하는 5400bp BglⅡ-SphI 단편을 삽입에 의해 불활성화시켰다. 또한 한세눌라 자발적 복제 서열 1(HARS1)을 테트라시클린 내성 유전자의 SalI 위치(제5도)에 클로닝시켰다.
b) 플라스미드 pBC로의 발현 카세트의 삽입.
플라스미드 pRB-S-269를 BspMⅡ 및 SalI으로 소화시켰다.
MOX 프로모터, 헤파티티스 B 표면 항원 코딩 영역 및 터미네이터로 구성되는 발현 카세트를 함유하는 결과 형성된 단편을 블런트 말단화시키고 플라스미드 pBC에 연결시킨다음 XhoI 및 StuI로 절단시키고 XhoI 스티키 말단을 충전시켰다. 결과형성된 폴라스미드 pMS-2는 한세눌라 폴리모르파 URA3 유전자 단편의 플랭킹 (flanking)서열에 의해 둘러싸인 S-유전자 발현 카세트를 함유한다.
한세눌라 폴리모르파 게놈 플라스미드 pMS2로의 S-유전자 발현 카세트의 통합에 있어서 플라스미드 pMS2를 NheI로 절단시키고, 결과 형성된 6.1kb의 단편은 세포를 형질전환하는데 사용되었다.
발현 카세트가 FMD 프로모터를 함유하는 pRB-S-271로부터 분리되는 것을 제외하고는, 유사한 방식으로 벡터 pFS-9를 작제했다.
결과형성된 플라스미드의 자세한 설명은 제5도에 의해 제공된다.
[실시예 A.5]
S-유전자 발현 카세트 및 부가적인 선택적 마아커 유전자로 구성되는 플라스미드의 작제.
a) 기본 플라스미드 pHK2의 구성에 있어서 (제6도; 1989년 4월 27일에 기탁 번호 5328하에 DSM (DSM DEUTSCHE SAMMLUNG VON MlKROORGANISMEM UND ZELLKULTUREN GmbH)와의 부다페스트 조약하에 기탁됨) 트랜스포손(transposon) Tn5(그라인드리 및 조이세, 1980)으로부터 카나마이신 내성 유전자를 분리시켰다. 구조 유전자를 뉴클레아제 Bal31로 처리하여 불필요한 서열을 결실시켰다. 카나마이신 터미네이터를 포함하는 카나마이신 구조 유전자로 구성되는 결과형성된 단편을 사카로마이세스 세레비지애 ADH1 프로모터 (히쩨만 일동,1981)에 연결시켰다. 게다가 플라스미드로 HARS1 서열을 440bp SalI 단편으로서 도입시켰다.
b) pRB-S-269 및 pRB-S-271로부터 유도된 카나마이신 내성 균주의 작제.
카나마이신 내성 코딩 영역 (3.5kb)을 포함하는 pHK부터의 HindⅢ 단편을 플라스미드 pRB-S-269 및 pRB-S-271의 HARS1-서열에 존재하는 HindⅢ 영역에 클로닝시켰다. 결과 형성된 플라스미드를 각각 pRB-S-322 및 pRB-S-326으로 부르며 제7도에 나타낸다.
[실시예 A.6]
pre-S 단백질의 발현을 위한 모(母) 플라스미드의 작제.
MOX 프로모터, 다수의 클로닝 영역 및 MOX 터미네이터로 구성되는 일반적인 발현 카세트를 나르는 플라스미드 pMOX-P/Tl (제8도)를 얻기 위해 플라스미드 pP/T-24(실시예 A.2)를 재구성했다.
제한 엔도뉴클레아제 SalI, EcoRI, BglⅡ 및 BamHI에 대한 제한 부위를 함유하는 링커를 삽입하기 위해 상기 효소에 대한 제한 부위를 함유하는 합성 DNA에 의해 플라스미드 pP/T-24의 pUC 19 링커를 부분적으로 대체시켰다.
플라스미드 pP/T-24를 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 SalI로 절단시켰다. 이런 위치는 pUC19 링커 (BamHI)및 pME4(SalI)로부터 유래된다. SalI, EcoRI, BglⅡ 및 BamHI에 대한 제한 부위를 함유하는 링커 분자를 삽입시켰다. 결과형성된 pTl을 EcoRI 및 SalI으로 소화시키고 MOX 프로모터를 1.5 kb EcoRI-SalI 단편으로서 삽입시켜 플라스미드 pT2를 얻었다. 플라스미드 pT2의 관련된 영역은 아래 나타난다 :
게다가 플라스미드 pT2는 플라스이드 pRB-269(제3도)에서와 같이 한세눌라 폴리모르파 ARS 및 사카로마이세스 세레비지애 URA3 유전자를 함유한다.
다음 작제 단계는 한세눌라 폴리모르파로부터 유도된 URA3 유전자에 의한 사카로마이세스 세레비지애 URA3 유전자의 대체였다. 이런 유전자를 함유하는 클론을 아래 실시예 A.9에 기술된 대로 분리시켰다. URA3 유전자를 1.2kb BamHI-BglⅡ 단편으로 분리시켰다. BglⅡ 위치는 원래 게놈 위치인 반면, BamHI 부위는 게놈 라이브러리를 작제하기 위해 사용된 BamHI 부위와 Sau3A 부위를 연결시킨 결과였다. 이런 BamHI-BglⅡ 단편의 스티키 말단을 클레나우 폴리머라제에 의해 충전시키고, 또한 클레나우 폴리머라제로 충전된 pBR322의 AvaI 부위에 삽입시컸다. AvaI 위치를 연결에 의해 재생시킨 결과 형성된 플라스미드는 pURA3-P1로 나타냈다.
플라스미드 URA3-P1을 NruI 및 BspMⅡ로 소화시켰다. 이런 위치들은 pBR322, 통상적인 pBR322 지도의 위치 bp 974 및 bp 1664로부터 유래된다. 플라스미드 pT2를 NruI (pBR322의 bp 974)으로 완전히 소화시키고 BspMⅡ으로는 부분적으로 소화시켰다.
pT2에 2개의 BspMⅡ 위치가 있다 : 첫번째는 pBR322(bp 1664)에 있고, 두번째는 MOX 터미네이터에 위치한다. pT2 (1800 bp) 의 NruI-BspMⅡ단편은 사카로마이세스 세레비지애의 URA3 유전자를 함유한다. 한세눌라 폴리모르파 URA3 유전자를 나르는 URA3-P1으로부터의 NruI-BspMⅡ 단편을, 상응하는 NruI-BspMⅡ 단편 위에 위치한 에스. 세레비지애 URA3 유전자를 대체하는 pT2에 클로닝시켰다. 결과 형성된 플라스미드 pT3은 MOX 터미네이터, 링커, MOX 프로모터 및 한세눌라 폴리모르파 URA3 유전자를 함유한다. 플라스미드 pT3는 모 플라스미드 pME4에서와 같이 기능적 β-락타마제 유전자가 부족하다. EcoRI로 소화되는 기능적 유전자 pBR322에 의해 이런 검출성 β-락타마제 유전자를 대체시키기 위해, 스티키 말단을 클레나우 폴리머라제로 충전시키고 8bp Asp 718 링커에 연결된 다음 PvuI (pBR 322 지도의 위치 3738)으로 소화시켰다. 이렇게 얻은 633bp Asp 718-PvuI 단편은 β-락타마제 유전자의 원래 프로모터와 해독 개시 코돈을 갖는다.
플라스미드 pT3을 Asp718(이는 MOX 터미네이터의 말단에 위치한다)에 의해 절단시키고 PvuI을 사용하여 부분 소화시켰다. 상기와 같이 얻은 Asp718-PvuI 단편을 예비처리된 pT3에 삽입시켜 플라스미드 pMOX-P/T1를 얻었다.
폴라스미드 pMOX-P/T1를 제8도에 나타낸다. 이 플라스미드는 기능적 베타-락타마제 유전자를 함유한다.
[실시예 A.7]
pre-S 단백질을 발현하는 플라스미드의 작제.
B형 간염 바이러스의 pre S1-S2-S 단백질 (라아지 단백질)을 코딩하는 pre-S 유전자를 pRIT12816으로부터 NcoI-HindⅢ 단편으로서 얻었다. pRITl2816은 통상적인 pBR322 기재 이. 콜라이 벡터로서, 이는 ATG 코돈(CCATGG)에서의 NcoI로부터 TAA 종결 코돈 (.....AAGCTT)을 초과하는 15bp에서의 HindⅢ로 이루어지는, preS1-S2-S 단백질을 코딩하는 1185 bp NcoI-HindⅢ 단편을 함유한다. 1987년 하포드 일동의 EP-A-O278940에 공개된 pRIT 10616으로부터의 통상적인 클로닝 기술에 의해 preS1-S2-S-코딩 서열 단편을 유도시켰다. preS2-S 서열을 코딩하는 861 bp 단편은 또한 통상적인 수단에 의해 이것으로부터 회수될 수 있다. 클레나우 폴리머라제로 충전시켜 NcoI-HindⅢ 단편을 블런트 말단화시키고 또한 pMOX-P/T1의 블런트 말단화된 EcoRI 위치로 클로닝시켰다. 정확한 연결 결과로서 preS1 구조유전자 앞의 EcoRI 위치는 NcoI/EcoRI 블런트 말단화된 연결에 의해 재생된다. MOX 프로모터의 조절하에 preS-유전자를 발현하는 구성을 pMPS-22라 부른다. 이것은 제8도에 도시된다.
FMD 프로모터를 함유하는 유사한 구성을 pMPS-21이라 부른다.
[실시예 A.8]
preS 발현 카세트를 함유하는 벡터의 작제.
플라스미드 pMPS22로부터의 SalI-Asp 718 발현 카세트 충전에 의해 블런트 말단화시키고 상기 실시예 A4a에 기술된 플라스미드 pBC의 충전된 XhoI 위치 및 StuI 위치에 삽입시켰다. 결과 형성된 플라스미드를 pMPS-O라 부르고 제9도에 도시된다.
[실시예 A.9]
한세눌라 폴리모르파 URA3 유전자의 클로닝.
이. 콜라이 균주 MB 1000의 상응하는 pyrF 돌연변이의 상보(complementation)에 의해 한세눌라 폴리모르파의 URA3 유전자를 클로닝시켰다.
Sau3A로의 부분적 소화, 저융점 아가로스 겔상의 분리 및 적절한 DNA 단편의 분리를 통해 크기 6-9kbp 범위의 게놈 DNA 단편을 분리시켰다.
SalI 위치에 삽입된 한세눌라 폴리모르파의 자발적 복제 서열을 함유하는, 벡터 YRp7의 유일한 BamHI 위치에 정제된 단편을 연결시켰다. 결과 형성된 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 균주 MB 1000을 형질전환시키고 우라실 없는 최소한의 플래이트 상에서 형질전환체를 선택했다. 얻어진 형질전환체를 분석하고 플라스미드를 분리시켰다. 제10도에 도시된 서브(sub)-단편을 분리하는데, 이는 이. 콜라이, 사카로마이세스 세레비지애 및 한세눌라 폴리모르파 오로티딘 5'-모노포스페이트 데카르복실라제 돌연변이체에서 URA+표현형의 회복을 중재했다. 클로닝된 DNA의 구조는 서어던 블로팅(Southern blotting)에 의해 게놈 URA3 영역의 것과 동일한 것으로 보여졌다 . 한세눌라 폴리모르파 URA3 유전자 단편의 제한지도가 제10도에 도시된다.
파트 B
한세눌라 폴리모르파 내 B형 간염 표면 항원(HBsAg)의 발현
[실시예 B.1]
S-유전자를 함유하는 한세눌라 폴리모르파 균주의 구성
상기 플라스미드 pRB-S-269, pRB-S-269-I, pRB-S-271, pRB-S-271-I으로 한세눌라 폴리모르파 RB 10을 형질전환시켰다. 자발적 복제 플라스미드(형질전환체) 또는 통합된 외래 DNA (통합체)를 갖는 여러개의 클론을 얻었다.
그런다음 이런 형질전환체/통합체를 면역 분석을 사용하여 S-유전자를 발현에 대해 시험했다. 두가지 시험 시스템을 사용했다 : 웨스턴 블로팅 및 아우스리아 (AUSRIA) 또는 아우스자임(AUSZYME) 시험(애보트). 모노클론 RF6 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 HBsAg 단량체의 생산을 분석했다. 한세눌라에서 생산된 HBsAg 입자의 양을 계산하기 위해 제조업자의 지시에 따라 애보트의 아우스리아 또는 아우스자임 키트(kits)를 사용했다. 안정하고 높은 발현 수준을 보여주는 형질전환체를 선택하여 그 DNA를 서어던 블로팅에 뒤이은 전기 영동 분리에 의해 분석했다.
a) 형질전환체
플라스미드 pRB-S-269 및 pRB-S-271로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파로부터 자유롭게 복제하는 플라스미드를 갖는 여러개의 콜로니를 얻었다.
다른 제한 엔도뉴클레아제로 소화된, 이런 형질전환체로부터 얻은 총 DNA의 서어던 분석은 기대된 제한 패턴을 보여주었다.
b) 통합체
높은 빈도수에서 통합적 벡터 pRB-S-269-I 및 pRB-2-271-I로 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시킬 수 있다. 완전 배지(YEPD)상에서 성장한 통합체는 유사 분열적으로 안정하다. 대안적으로, 한세눌라 내 외래 DNA의 유사분열적으로 안정한 유지는 상기 절차에 의해 얻어질 수 있는데, 여기서 자발적 복제 벡터, 바람직하게는 pRB-S-269 또는 pRB-S-271과 같은 높은 복사수 플라스미드는 자발적으로 게놈내에 통합된다. 결과형성된 통합체는 또한 외래 DNA의 높은 분열적 안정성을 나타낸다.
비-선택적 완전 배지에서 S-유전자를 효율적으로 발현시키는 균주를 얻기 위해 상기 두 방법을 사용했다. 3가지 균주를 보유했다; S-유전자가 FMD-프로모터에 의해 제어되는, pRB-S-271로 형질전환된, 확인 번호 352를 갖는 균주, 및 MOX 제어된 S-유전자를 함유하는 pRB-S-269로 형질전환된, 균주번호 415 및 416을 또 다른 실험을 위해 사용했다.
[실시예 B.2]
통합체내 외래 DNA의 유사 분열적 안정성
하기 절차에 의해 재조합체 균주 352, 415 및 416의 안정성을 시험했다 : 40 세대 동안 비-선택적 SMR 배지에서 균주를 성장시켰다. 40-세대 기간 전 및 후에 배양물로부터 12개의 독립적인 콜로니를 분리시켰다.
제한 단편의 아가로스 겔 전기영동과 함께 서어던 블로트 분석 및 총 크로모좀의 펄스 필드(Pulsed Field) 구배 겔 전기 영동에 의해 분리된 클론안에서 외래 DNA의 구조 및 발현카세트의 복사 수를 조사했다. 후자 기술은 효모 크로모좀(쉬와쯔 및 켄토르,1984)의 분리 및 분석을 가능케한다.
펄스 영역 겔 전기 영동
0.7% w/v 아가로스 겔의 샘플 웰안에서 균주 415,416 및 352로부터의 세포를 약간 용균시켰다. LKB-제약업의 지시에 따라 LKB-파머시아 펄사포 플러스 (Pharmacia Pulsaphor Plus) 기구를 사용하여 즉석에서 방출된 크로모좀을 분리시켰다. PFGE에 따라 서어던(1975)의 절차에 따라 DNA를 니트로셀룰로오스로 트랜스퍼하였다. 한세눌라 폴리모르파의 MOX 및/또는 FMD 유전자 또는 URA3 유전자에 대해 특이한 32p-라벨링된 프로브를 사용하여 블로트를 하이브리드화시키는데, URA3 유전자는 게놈내 단일 복사로서 존재하는 것으로 알려져 있다.
단일 복사 유전자(고유의 마아커)의 것들과 가능한 다량체 통합체로부터 유도된 코딩들의 비교로 세포안에 존재하는 관련된 발현 카세트의 복사 수를 계산했다. PFGE에 의한 크로모좀의 분석으로 클론 415가 발현 카세트의 약 30-50개 복사를 갖는 반면, 클론 416은 약 5-6개 발현 카세트를 함유하고 클론 352는 약 10개의 발현 카세트를 보여주었다. 분석으로 외래 DNA가 한세눌라 게놈에 통합된다는 사실을 확인되었다.
서어던 분석
SMR 배지 내 40세대 동안 균주 352, 415 및 416을 성장시켰다. 12개의 독립적인 콜로니를 상기 성장 기간 전 및 후에 각 배치로부터 분리시켰다. 그런 다음 이런 서브-클론으로부터의 DNA 제제를 다양한 제한 효소로 절단시킨 후에 32p-라벨링된 DNA-프로브를 사용하여 서어던 분석하였다. 제한 패턴의 분석으로 발현 카세트가 본래 그대로이고 도입된 DNA가 유전적으로 안정하다고 확인되었다. 분석은 또한 균주 415의 게놈이 플라스미드의 여러개의 복사로 긴 반복을 갖는다고 나타냈다. 플라스미드는 머리-꼬리 방식으로 이런 반복에서 배열된다고 추론된다.
[실시예 B.3]
발현 연구
웨스턴 블로팅 및 아우스리아/아우스자임 시험에 의한 HBsAg의 존재에 대해 재조합체 균주를 통상적으로 분석했다.
a) 배양물의 성장 및 웨스턴 블로팅
격렬한 통풍(vigorous aeration)과 함께 37℃에서 200 ml SMR-글리세롤 배지내 11 플라스크 안에서 균주 352, 415 및 416을 성장시켰다. 글리세롤의 결실로 특정지워지는, 정지상의 초기에, 글리세롤이 부족한 5배 농축된 SMR 배지 50 ml/1을 메탄올과 함께 10 g/l의 최종 농도로 첨가시켰다. 10ml 부피의 샘플을 메탄을 첨가전에 배양물로부터 취한 다음 24시간에서 메탄올을 첨가시켰다. 비교 목적을 위해 30 g/l 글루코스를 함유하는 SMR 배지안에서 성장시켰다.(프로모터의 불활발(derepression)) 세포를 높은 로그-상에서 수확(harvest)했다.
수확된 세포로부터 조 단백질 추출물을 5 ml의 PE 완충액(0.5 MNaCl,0.1% 트리톤 X-100,1OmM 포스페이트 완충액 pH 7.5,2mM PMSF) 내에 약 0.lg 건조 중량에 상응하는 세포 펠릿을 현탁시킴으로써 제조했다. 혼합물이 거의 고형물이 될 때까지 거의 같은 부피의 0.45 mm 지름의 유리 비이드를 첨가시켰다. 브라운(Braun) MSK 균질화(B. 브라운 및 디에셀 바이오테크 GmbH, 멜순겐, FRG)를 사용하여 4℃에서 4분동안 혼합물을 격렬하게 흔들어 주었다. 순차적으로, 4 ml의 FE 완충액을 첨가시키고 균질체를 혼합시키고 4℃, 40,000 x g에서 5분간 원심분리시켰다. 5-25ug의 상동액의 분취량을 대조표준으로서 정제된 HBsAg (O.05-0.5ug)을 사용하여, SDS-폴리아크 릴아미드 겔 전기영동시켰다. 타우빈(Towbin)(1979)의 절차에 따라 단백질을 니트로셀룰로오스로 트랜스퍼하고 상기 방법 5a에 기술된 모노클론 항체 RF6으로의 검출에 의해 항원 물질이 확인되었다. 공지된 양의 순수한 효모-유도된 HBsAg을 기준으로 하여, 웨스턴 블로트는 클론 352, 415 및 416에서 생산된 항원의 양을 정량하게 한다.
결과를 표 1에 요약한다. 약 5g 건조 중량/l의 세포 밀도를 갖는 메탄올 유도된 플라스크-배양물(SMR 배지)에서 S-단백질은 형질전환된 균주의 총 추출된 단백질의 약 2-5%를 구성한다.
유도(메탄올), 불활발(글리세롤) 및 억제(글루코스)의 조건하에서 성장한 세포에서의 발현 비교로 MOX 및 FMD 프로모터의 매우 엄격한 조절을 예시한다. 글루코스 성장 세포안에서 발현은 완전하게 블록킹된다. 글리세롤에서, HBsAg의 합성은 유도된 세포에서 얻은 수준의 약 30%이다.
b) 한세눌라 폴리모르파에서 발현된 HBsAg의 항원성 모노클론 항체를 기준으로 에보트 아우스자임 시험을 사용하여 조 추출물내 함유된 물질의 항원성을 측정했다. 결과는 임의 유닛으로 발현되었다.(1.0ug 단백질당 492 nm에서의 흡수; 조 추출물의 희석 및 반응을 150mM NaCl,25mM 포스페이트 완충액 pH 74,0.01% BSA,0.01% 트윈 20에서 수행했다.) 아우스자임 시험과의 반응성은 서브-바이러스 입자에 대해 특징적인 구조적 에피토프의 존재를 지시한다.
c) 에이치. 폴리모르파의 조 추출물의 밀도 구배 원심분리.
상기 절차에 따라 얻은 조 추출물을 CsCl 또는 수크로스 구배를 사용하여 밀도 구배 원심분리시켰다. 100-200ug (200ul)의 조 단백질 추출물을 50mM NaCl, 2mM EDTA, 25mM NaPO, pH 7.2 내, 20-50% 수크로스 구배의 상단에 적용시켜 수크로스 평형 침전 구배 원심분리를 수행했다. 벡크만 5W 50.1로토(rotor) 내 40,000rpm에서 18시간동안 5ml의 부피를 갖는 튜브를 원심 분리시켰다.
25mM 포스페이트 완충액 pH 7.4 대 1 부피의 3M CsCl로 1부피의 조 단백질 추출물을 희석시켜 염화 세슘 구배 원심분리를 수행했다. 40시간동안 벡크만 50Ti 로토에서 4℃, 40,000rpm에서 원심 분리시켰다.
구배를 분획하고 웨스턴 블로팅에서 RF 6 항체를 사용하거나 아우스티아 및/또는 아우스자임 분석을 사용하여 다양한 분획을 시험했다. 약 1.16-1.19g/ml의 밀도를 갖는 HBsAg 물질의 피이크가 CsCl 밀도 구배안에서 형성된다고 보여질 수 있다. 이런 피이크에 존재하는 물질은 웨스턴 블로트 내 RF 6 항체 뿐만 아니라 아우스리아 및 아우스자임 분석에서 매우 잘 반응한다. 아우스티아/아우스자임 시험에서의 밀도 뿐만 아니라 반응성은 입자에 대해 특징적인 구조적 에피토프의 존재를 지시한다. 게다가, 또 다른 시험에서 이런 물질의 밀도를 사람의 혈청으로부터 분리된 서브-바이러스 입자와 비교했다. 두가지 물질은 CsCl 용액내 등밀도의 원심분리에 의해 비교가능한 밀도에서 발견된다고 보여질 수 있다.
조 추출물의 수크로스 구배 원심분리는 피이크 분획을 제공하며, 이는 아우스티아 및 아우스자임과 반응하고 아우스티아/아우스자임 및 웨스턴 블로팅과 병행하여 구배 분획의 분석에 의해 나타난대로 적어도 80%의 HBsAg를 구성했다. 물질의 잔류 20%는 구배의 상단 및 밑바닥 분획에서 주로 발견되며 이 물질이 단백질의 단량체 형태를 구성한다는 사실을 지시하는, 웨스턴피이크 분획의 분석은 또한 적어도 80%의 물질이 입자를 형성한다는 사실을 나타냈다.
한세눌라 유도 입자들은 단백질 분해에 저항성을 갖는다. 다양한 온도에서 여러 시간동안 입자들을 함유하는 조 단백질 추출물의 배양은 아우스자임 값을 시험하고 SDS-PAGE를 변성시킨 다음 웨스턴 블로트에 의해 폴리펩티드의 본성을 분석하므로써 나타낸대로 매우 작은 분해만을 나타낸다. 이 물질을 전자 현미경에 의해 더 분석했다. 전자 현미경 사진은 약 22nm의 지름을 갖는 입자들을 분명히 보여준다.
상기 결과를 모든 3가지 균주(352,415 및 416)에 대해 얻었다.
파트 C.
한세눌라 폴리모르파 내에서 preS1-S2-S 단백질의 발현
[실시예 C.1]
preS1-S2-S 유전자를 함유하는 한세눌라 폴리모르파 균주의 구성
한세눌라 폴리모르파 RB 10을, MOX 프로모터의 조절하 URA3 유전자 및 preS1 유전자를 포괄하는 pMPS-22(제8도)로부터 유래된 5570bp Pvu-Asp 718로 형질전환시켰다. FMD 프로모터(-9결실)의 조절하 preS1 유전자를 운반하는 상응하는 단편을 플라스미드 pMS-21으로부터 얻을 수 있다. 이들 형질전환으로부터 산출된 통합체는 서어던 분석에 의해 1-2개 발현 카세트를 함유하는 것으로 나타났다. MOX 프로모터의 조절하 pres1 유전자를 함유하는 통합체는 preS-AM로서 언급하며; FMD 프로모터의 조절하 preS 유전자를 함유하는 통합체는 preS-AF로서 언급한다.
여러 발현 카세트를 함유하는 통합체는, HARS 서열을 갖는 자발적 복제 플라스미드 pMPS22 및 pMPS21로 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시켜서 얻었다. 통합체는 물질 및 방법(Materials and Methods)에 기술된 바와 같은 이들 플라스미드의 자발적인 통합에 의해 형성되었다. 항목 2b. 이들 유형의 형질 전환체를 일반적 표시인 preS-BM (MOX 프로모터 및 preS-BF (FMD-프로모터)으로 나타냈다.
preS1-유전자의 발현이 MOX 프로모터에 의해 조절되는, 균주 preS-AM-405, preS-BM-402, preS-BM-403 및 preS-BM-454를 더 이상의 분석을 위해 보유했다.
2. 유사 분열 안정성
상기 실시예 C.1에서 동정된 4개 균주에 존재하는 외래 DNA의 유사 분열 안정성을 파트 B에 기술한 바와 같이 40 세대 성장 주기 전 및 후에 분리된 12개 독립 서브클론의 서어던 분석에 의해 시험했다. 분석은 통합 벡터의 유전적 안정성을 확립했다. (파트 D.3의 실시예 참조).
3. 한세눌라 폴리모르파내에서 preS 단백질의 발현
균주 preS-BM-402, preS-BM-403, preS-AM-405 및 preS-BM-454를 글리세롤을 함유하는 SMR 배지상에서 성장시키고, 파트 B에서 기술하는 바와 같이 추출적으로, 메탄을 (10g/l)로 세포를 유도했다. 메탄올의 첨가에 이어 세포를 25시간 수확하고 조추출물을 파트 B에서 기술하는 바와 같이 제조했다.
a) 12 ug 양의 균주 preS-BM-402, preS-AM-405 및 preS-BM-454를 폴리아크릴아미드 SDS-겔 전기 영동에 의해 분석하고, 방법 5(a)에 기술하는 바와 같이 모노클론 항체(S1.1, S2.2 및 S2.5)의 혼합물을 사용하여 웨스턴 블로팅시켰다. 모든 유형의 균주는 38/39 KD에서 항원성 이중 밴드를 나타냈으며, 45KD에서 부가적인 밴드를 나타냈다.
균주 preS-AM-405는, 균주 preS-BM-402 보다 39KD 물질에 비해 45KD종의 보다 낮은 함량을 나타냈다; 균주 preS-BM-454 종의 가장 높은 비교 함량을 나타냈다.
상기 균주로부터 얻은 preS-단백질의 전기영동 패턴을 인간 혈청 입자로부터 유래한 항원과 비교했다. 인간 및 효모 제조물 모두는, 웨스턴 블로트를 기초로 비교했을 때 약 38/39 KD에서 밴드를 나타냈다.
b) 상이한 균주에 대한 발현 수준에 있어서의 다양성도 또한 보인다. 이들 차이는 균주들 사이의 발현 카세트의 복사수에 있어서의 다양성을 기인하는 것으로 추측되고 있다. preS-항원을 웨스턴 블로팅에 의해 평가했으며, 표 2에 제공하는 바와 같이 상이한 preS-A 및 preS-B 균주에서 총 세포 단백질의 0.1-1.5%를 구성했다.
조 추출물도 입자의 존재에 대해 AUSZYME 분석으로 시험했다. 표 2에서 나타내는 바와 같이 결과는 A492단위/0.1 ug 단백질로서 표현된 매우 낮은 반응성을 나타낸다.
c) 글리코실화 : preS 단백질 (총세포단백질의 약 1.5%)의 높은 생성율 및 뚜렷한 45 KD 밴드를 특징으로 하는 균주 preS-BM-454를 글리코실화에 대한 부가적인 연구를 위해 선택했다. preS-BM-454로부터 얻은 preS 단백질을 EndoH 엔도글리코시다제와 함께 조 단백질 추출물을 배양시켜 분석했다. 하기 자료는 45KD 종(species)이 preS 단백질의 글리코실화 형태라는 것을 명백히 나타낸다.
제조업자(Bcehringer Mannheim, FRG)의 지시에 따라 0.5 mu EndoH 엔도글리코시다제와 함께 45 ug 조 단백질을 0.5,1.0 및 24 시간 동안 배양하면, 45 KD 밴드는 겉보기 분자량 42KD로 이동했다. 이 이동은, 45 KD 종이 약 3000 D의 1개 코어기를 갖는 preS 단백질의 N-글리코실화 형태임을 나타낸다.
N-글리코실화의 효능적인 저해제로서 공지된 투니카마이신 (Tunicamycin)은 한세눌라 폴리모르파내 preS 단백질의 글리코실화 연구에 사용되기도 한다. 균주 preS-BM-454는 글루코스(10g/l)를 함유하는 YNB 배지에서 A 600=10.0의 밀도까지 성장시켰다.
이 배양물의 10 ml를 10g/l 메탄올 및 50 ug/ml 루니카마이신을 함유하는 YNB 100ml에 접종시켰다.
배지의 pH 값을 7.2-7.5에서 일정하게 유지시켰다. 대조 실험은 투니카 마이신을 사용하지 않고 수행했다. 세포를, 투니카마이신을 함유하는 배지에 접종한 후 10, 15 및 30 시간에 수확했다.
조 단백질 추출물을 웨스턴 블로팅에 의해 분석했다. 연구들은, 투니카 마이신의 존재하에 성장한 세포에 있어서, 42KD에서 단일 밴드, 및 38/39 KD에서 이중 밴드를 볼 수 있음을 설명하고 있다. 대조 실험에서는, 42KD 밴드가 45 KD 밴드에 의해 대체되었다. 유사한 결과를 균주 preS-BM-402, preS-BM-403 및 preS-BM-405로부터 얻은 추출물로써 얻었으나, 보다 적은 양의 45KD 단백질 종(합성된 총 preS-단백질의 5-10% 이하)을 생산했다. 결과는 42KD 밴드가 preS 단백질의 O-글리코실화 형태를 나타내는 것을 제안한다.
d) 밀도 구배 원심분리
균주 preS-AM-405 및 균주 preS-BM-402, preS-BM-403, pre-BM-454로부터 얻은 조 추출물을 수크로스 및 CsCl 구배 원심분리에 의해 분석했다. 조건을 파트 B 3(c)에 기술했다. 구배 분획을 웨스턴 블로팅에 의해 및 AUSZYME 시험에 의해 시험했다.
분석은, S 항원(파트 B) 또는 preS1 및 S 항원(파트 D) 모두를 발현시키는 균주와 대조적으로, preS-균주는 서브-바이러스성 입자를 효율적으로 형성시키지 않는다. 등밀도 CsCl도 수크로스 구배 원심분리도 요구되는 밀도의 밴드의 형성을 드러내지 않는다. 또한, 이것은 조 추출물 및 구배 분획로부터 얻은 HBsAg-관련 물질이 AUSRIA 또는 AUSYME 시험과 열등하게 반응하는 사실로부터 확인되었다.
파트D
preS 및 S 항원 모두를 함유하는 복합 입자의 형성
[실시예 D.1]
균주의 작제
preS1 대 S 발현 비의 차이 및 총 발현 수준의 차이를 특징으로 하는 여러 균주가 작제되었다.
이들 차이는 게놈당 발현 카세트의 복사수의 변화에 의해 성취되었다. 부가적인 다양성이 상이한 한세눌라 프로모터의 조절하에 유전자를 배치함으로써 얻어졌다.
세가지 기본적 유형의 재조합 균주가 하기와 같이 얻어졌다 :
preS1 카세트 및 URA3 유전자를 함유하는 6.6 kb Nhe I DNA 단편을 플라스미드 pMPS 9(제9도)로부터 분리했다. S 유전자를 함유하는 NheI DNA 단편을 플라스미드 pMPS2(제5도)로부터 분리했다. 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시키고, 각 유전자의 하나의 복사물로 구성되는 결합된 단편은 아가로스겔로부터 분리했다. 이들 단편들을 사용하여 한세눌라 폴리모르파 균주 RB10을 우라실 의존성이 되도록 형질전환시켰다.
산출된 형질 전환체를 서어던 블로팅에 의해 분석하고, 각 카세트의 한개 통합 복사물을 함유하는 클론을 선택했다. 균주 preS/S-A-293를 부가적인 분석을 위해 보유했다.
b) 1개의 preS 발현 카세트 및 여러 S 발현 카세트를 함유하는 균주들 (B-균주).
한세눌라 폴리모르파를 preS1 발현 카세트를 함유하는 pMPS-22로부터 얻은 5570 bp Asp 718-Pvu I 단편으로 형질전환시켰다. 카세트의 한개 통합 복사물을 갖는 형질 전환체를 선택했다. 보유한 균주는 상기 파트 C 1에서 기술한 preS-AM-405 이다.
균주 preS-AM-405를 각각의 프로모터의 조절하 S 유전자를 함유하는 자발적 복제 플라스미드 pRB-S-326(FMD-프로모터) 또는 pRB-2-322 (MOX-프로모터)(제7도)로 형질전환시켰다. 또한, 두 플라스미드는 모두, 선택적 마아커로서 젠타마이신 G418에 대한 내성을 코딩하는 유전자를 갖는다. Kan 유전자는 상기한 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애 ADH1 프로모터(제7도)의 조절하에 있다. 형질전환시켜서, 서어던 블로트 및 PFGE 분석에 의해 나타낸 바와 같이 항상 한 개의 preS1 카세트의 복사물 및 S 유전자 함유 카세트의 다수의 통합 복사물(30-100)을 함유하는 여러 균주를 생산했다.
균주 preS/S-B-431, preS/S-B-432 및 preS/S-B-433을 부가적인 분석을 위해 보유했다. 균주 preS/S-B-431이 MOX-프로모터 조절 S-유전자를 수반하는 한편, preS/S-B-432 및 preS/S-BC-433은 FMD 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 함유한다.
c) S 및 preS 유전자 모두의 여러 발현 카세트를 함유하는 균주(C-균주).
한세눌라 폴리모르파를 pre-S1 유전자를 함유하는 자발적 복제 플라스미드 pMP-22로 형질전환시켰다. 형질전환시키면, 게놈이 통합된 다양한 수의 발현 카세트를 함유하는 여러 균주들을 생산했다. 2-20 preS1 발현 카세트를 함유하는 분리균을 서어던 블로팅에 의해 동정했다. 이들 균주들은 파트 C에서 preS-BM-402, pre-BM-403 및 pre-BM-454로서 기술하였으며, 다른 양의 preS 항원을 발현했다. 이들 preS 균주들은 S-유전자(제7도)를 갖는 자발적 복제 플라스미드 pRB-S-322(MOX-프로모터) 및 pRB-S-326(FMD-프로모터)로 다시 형질전환시켰다. G418에 대한 내성을 형질전환 마아커로써 사용했다. 안정한 통합체에 대한 선택은 각 형질전환시 여러 클론을 선택했으며 이들의 일부는 더 분석되었다. 부가적인 분석을 위해 보유된 균주는 preS/S-C-452, 균주 preS-BM-402로부터 유래된 preS/S-C-465, 균주 preS-BM-403으로부터 유래된 균주 preS/S-C-466, 균주 preS-BM-454으로부터 유래된 균주 preS/S-C-448-C4이며, 이때, S-유전자 발현 카세트는 FMD 프로모터를 포함한다. 표 3은 상기 기술된 균주의 근원 및 표시에 관한 상세한 정보를 제공한다.
* 숫자는 주어진 균주에 대해 측정된 최저 및 최고 값을 나타낸다.
[실시예 D.2]
에이치. 폴리모르파내 preS 및 S-단백질의 발현
에이치. 폴리모르파의 다른 형질전환체 균주내 preS 및 S-단백질의 발현을, 물질 및 방법 5a에서 상기 기술한 바와 같이 면역 블로팅에 의해 및 AUSZYME 분석법에 의해 시험했다. 결과 및 시험된 다양한 균주의 성질에 대한 요약을 표 3에 제공했다.
preS 및 S-단백질 모두를 제공하는 균주를 성장시키고, 30 ml 배양물 및 부피가 사용되는 것을 제외하고는, 파트 B 항목 3에서 기술한 바와 같이 제조하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용시키고, RF6 또는 S1.1 및 S2.1 모노클론 항체의 혼합물을 사용하여 웨스턴 블로팅시켰다. 균주 preS/S-A-293, preS/S-B-431, preS/S-B-432, preS/S-8-433, preS/S-C-453, preS/S-C-465, preS/S-C-466 및 preS/S-C-448-C4의 메탄올 유도된 세포로부터 얻은 조추출물의 12-15 ug 양을 검출을 위한 모노클론 RF6을 사용하며 면역블로팅시켰다. 이 분석은 preS 대 S-단백질의 비를 나타내는 균주의 스펙트럼이 얻어질 수 있음을 설명한다. 이들 및 다른 면역블로트로부터, preS 대 S-단백질의 비가 균주 preS/S-B-431 내에서 약 1:15, 균주 preS/S-C-452내에서 약 1:8 및 균주 preS/S-448-C4 내에서 약 5:3으로 평가되었다. 균주들은 표 3에 나타낸 바와 같이 AUSZYME 분석법 및 면역 블로팅 모두에 의한 그들이 생산성 수준에 있어서도 차이가 난다. 이들 균주로부터 얻은 세포 추출물도 검출을 위해 모노클론 S1.1을 사용하여 면역블로팅시켰다. 대부분의 균주에 있어서, preS 단백질은 보다 적은 양의 45KD (검출된 총 preS-단백질의 약 5% 만을 포함하는 것으로 측정됨) 밴드와 함께 38-39KD에서 이중 단백질 밴드로서 검출된다. 대조적으로, 균주 preS/S-C-448-C4는 대략 동량의 38-39KD 및 45KD 종을 나타냈다.
[실시예 D.3]
외래 DNA의 안정성
상기 기술된 preS/S 형질 전환체 및 통합체에서 외래 DNA의 안정성을 파트 B에서 기술한 바와 같이 분석했다. 연구는 재조합 클론의 매우 우수한 유사분열 안정성을 지시한다. 균주 preS/S-453 및 preS/S-431의 40 세대 발효 전 및 후에 분리된 12 독립 콜로니의 서어던 분석은, 모든 경우에 있어서, 동일한 제한 단편 패턴을 볼 수 있다는 것을 설명하고 있다. 표 3에 기록된 preS/S 균주도 펄스화 피일드 구배 전기영동에 의해 분석했다. 분리된 크로모좀을 니트로 셀룰로오스에 블로토시킨후, 다른 방사성 DNA 프로브와 하이브리드시켰다. 절차는 S-발현 카세트외 복사수의 측정을 가능케했고 이들 preS/S 균주가 통합체임을 결론적으로 증명하였다. 이들 실험의 결과는 상기 표 3에 요약했다.
[실시예 D.4]
복합체 입자의 분리 및 특성화
a) 한세눌라 폴리모르파로부터 복합체 입자의 부분정제
한세눌라 폴리모르파 균주 preS/S-B-431의 발효 배양물을 앞서의 물질 5a에서 기술한 S-배지에서 배양하고 메탄올로 78시간 유도후 원심분리에 의해 세포를 회수했다. 세포 펠릿을 0.5%(w/v) 트윈 20, 2mM EDTA, 4mM PMSF, 5%(v/v)이소프로판올 및 50mM 나트륨 포스페이트 완충제 pH9.0을 함유하는 완충제 내에 약 120g 건조 세포중량/리터 농도로 재현탁했다. 세포를 6리터/시간의 유동 속도 및 챔버내에 7분의 잔류시간으로 4회 통과시켜 0.45-0.7mm 직경 유리 비이드를 함유하는 비이드 밀(다이노밀 타입 KDL, 백코펜 AG, 바셀, 스위스랜드)로 분쇄했다.
세포 추출물을 4℃에서 16000g으로 45분 동안 원심분리시킴으로써 정제시키고 상등액을 회수했다.
그리고나서 1%(w/v) 콜로이드성 실리카(에어로실 380, 데구사, 프랑크 푸르트, FRG)를 휘저어 섞어 주면서 상등액에 첨가하고 혼합물을 HBsAg가 흡착되도록 4℃에서 하룻밤 동안 휘저어 섞어 주었다. 실리카를 4℃에서 4000g으로 30분간 원심분리시킴으로써 회수하고 펠릿의 재현탁 및 재원심분리에 의해 0.9%(w/v)NaCl로 2번 세척했다. 실리카에 흡착된 HBsAg는 10mM 피로인산나트륨 pH9.5 내에 세척된 펠릿을 재현탁시키고 일정하게 휘저어 섞어주면서 37℃에서 3시간 동안 배양함으로써 흡착된다. 첨가된 피로인산 나트륨 완충제의 부피는 초기 정제된 세포 추출물 부피의 약 1/8-1/10이다. 그리고나서 용액을 4℃에서 60분 동안 17,000g에서 원심분리시키고 상등액을 회수했다.
상등액을 1.5M로 CsC1을 사용하여 만들고 50.2Ti 로우터(스핀코 디비젼, 백크만 인스트루먼트, 팔로 알토 USA)로 45000rpm에서 70시간 동안 이소피크닉 평형까지 혼합물을 원심분리한다. 결과 CsCl 구배물을 분류하고 분획을 제조자에 의해 기술된 엘사 키트(Elisa Kit)(엔지그노스트, 베링-웨르크 AG. 마르버그, FRG)를 사용하여 HBsAg의 존재에 대해 시험한다. 피크 분획을 수집하고 10mM 나트륨/칼륨 포스페이트, 0.15M NaCl pH6.8에 대해 투석한다. 이 물질에 대해 분석한 결과, 조 세포 추출물은 48%의 전체 USTRIA 반응성 물질, 3% 이하의 전체 단백질, 0.2% 이하의 전체 당 및 2% 이하의 전체 지질이 이 절차에 의해 회수되는 것으로 확인되었다.
한세눌라 폴리모르파 균주 preS/S-C-452의 세포펠릿을 유사한 결과를 갖는 정확하게 동일한 절차로 추출한다.
preS/S-B-431 및 preS-C-452 균주로부터 부분 정제된 HBsAg 제조물의 샘플을 모노클론 HBS1 및 S1.1을 사용하여 겔 전기영동 및 면역블로팅 시킴으로써 하기 파트 D.4에서 기술되는 HBsAg 관련 단백질의 검출에 대해 시험한다.
모노클론 HBS1로의 면역흡수는 두 제조물의 24KD에서 반응성 밴드와 약 38/39KD에서 다른 밴드의 존재를 보여준다. 모노클론 S1.1 로의 면역 블로팅은 단지 두 제조물의 38/39KD에서의 preS1-단백질 관련 밴드를 검출한다.
이는 preS1-단백질 및 S-단백질 종이 콜로이드성 실리카 흡착 및 등 밀도 CsCl 밀도 구배 원심분리를 통하여 동시 정제됨을 보여준다.
b) 복합체 입자의 CsCl 밀도 구배 원심분리.
에이치. 폴리모르파 균주 preS/S-B-431의 발효 배양물을 S-배지(물질 5d)내에서 배양하고 메탄올로 73시간 유도후 수확한다. 세포 펠릿을 원심분리에 의해 수집하고, 재현탁시키고 세포추출물을 하기 기술된 프렌치 프레스(French Press)를 통하여 통과시킴으로써 제조했다. 세포 찌꺼기를 30분 동안 17000g에서 원심분리시킴으로써 조 용균물로부터 제거한다. 조 세포 추출물을 245,000g에서 1.5M CsCl, 인산염 완충된 염수 pH7.5로 평형이 되도록 원심분리한다. 구배물을 분류하고 각 분획을 HBsAg (엔지그노스트 : 베링그 웨르크 AG 마르버그, FRG0 및 preS1-단백질에 대해 특이적인 엘사 시험을 이용하여 항원성에 대해 분석한다. 엔지그노스트 시험은 단지 조립된 HBsAg 입자만을 측정하고 단백질 단량체는 측정하지 않는다. preS1-단백질 특이적 엘사 시험은 항원 포착 및 검출을 위해 쥐의 모노클론 항체를 이용하고 하기 파트 D.5에 기술된다.
HBsAg 항원성의 피크는 CsCl 구배에서 1.18-1.19g/cm3의 밀도에서 관찰된다. preS1-단백질 활성의 주요 피크는 1.26g/cm3의 밀도에서 부수적 피크와 함께 상기 동일 밀도에서 관찰된다.
구배 분획을 또한 면역 블로팅에 의해 preS1-단백질 S-단백질 존재에 대해 분석한다. Laemmli (1970)에 따라 나트륨 도데실술페이트 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동 및 Towbin 일행(1979)에 따라 니트로셀룰로우스에 대한 흡수 후, 니트로셀롤로오스 시이트를 HBsAg를 유도하는 혈청에 대항하여 증가된 토끼 폴리클론 혈청과 함께 배양한다. 항체 결합의 검출은 알칼리 포스파타제법에 의한다.
S-단백질에 상응하는 24KD에서의 주요 단백질 밴드와 38/39KD 에서 이중 밴드가 관찰된다. 모든 3개의 단백질 중에 대한 면역 블로팅의 최대 활성은 엔지그노스트 시험에서 측정된 HBsAg 활성의 피크에 상당하는 1.18-1.19g/cm3의 밀도를 갖는 CsCl 구배 분획에서이다. 이는 조 추출물내에서 대부분의 HBV 표면 항원 단백질이 HBsAg의 밀도 특성을 갖는 지방 단백질 구조로 존재함을 가리킨다.
다른 니트로셀롤로우스 시이트를 쥐 모노클론 항체 Sl.1과 함께 배양한다. 이 항체는 1.18-1.19g/cm3의 CsCl 밀도에 상응하는 분획에서 38/39KD에서 단지 단백질 밴드를 검출한다. 조 세포 추출물을 또한 수크로스 구배상에서 레이트-조날(rate-zonal)원심분리한다. 조 세포 추출물을 50mM 트리스-HCl 완충제 pH8.1로 형성된 5-20%(w/v)수크로스 구배물 위에 놓고 200분 동안 288,000g에서 원심분리했다. 구배물을 분류하고 분획을 엔지그노스트 엘사 시험에 의해 HBsAg의 존재에 대해 시험하고 preS1-단백질 특이적 Mab S1.1로의 검출 및 엔지그노스트시험으로부터 HBsAg 특이적 항체를 갖는 항원의 포착에 의해 HBsAg를 함유한 preS1-단백질의 존재에 대해 시험한다. 엔지그노스트 분석은 구배물을 통하여 HBsAg 활성 침강의 피크를 보여준다.
Mab.1.1. 엘사는 보다 높은 수크로스 밀도로 확장한 활성의 쇼울더(Shoulder)를 갖지만 엔지그노스트 분석과 같은 피크를 보인다. 보다높은 침강 효과를 갖는 물질의 이 쇼울더는 한세눌라 폴리모르파 균주 preS/S-b-431로부터 조 추출물 이 수크로스 밀도 구배원심분리에 의해 분석하기 전에 CsC1 구배로 원심분리 및 콜로이드성 실리카 상에서 흡착/탈착에 의해 부분적으로 정제된다. 이들 결과는 지방 단백질 입자의 밀도 특성을 갖는 CsCl 밀도 구배로 HBsAg 및 preSl-단백질 동시침강을 보여준다.
c) 에이치. 폴리모르파로 발현된 복합체 HBsAg 입자의 항원성
HBV 표면 항원 입자를 아이템 3a에 기술된 바와 같은 에이치. 폴리모르파 균주 preS/S-B-431의 조 추출물로부터 부분적으로 정제했다. 이 제조물을 preS1, preS2 및 표면 항원 단백질의 S 영역에 위치된 에피토프(epitopes)에 대항하는 쥐의 모노클론 항체(Mabs)와의 반응성 및 preS2 영역상에서 인간 혈청 알부민의 중합체에 대한 수용체(pHSA-수용체)의 존재에 대해 시험한다.
C1. Mab S1.1 과의 반응
HBV 표면 항원 단백질의 preS1 에피로프에 대항하는 쥐 모노클론 항체(Mab) S1.l을 엘사 분석에 의한 복합체 입자 위에 이 자리의 존재를 검출하기 위해 사용한다. Mab S1.1을 미소적정 플레이트의 웰 위를 피복하고 (면역 플레이트 I; Nunc. Gibco Europe, Ghent, 벨기에) 부분적으로 정제된 조 추출물과 함께 배양했다. 비 결합 물질을 제거하기 위해 세척한 후 반응성 입자의 포착은 윌슨 및 나카메의 방법, 1978에 의해 양고추 냉이 퍼옥시다제에 커플링된 Mab S1.1 과 함께 배양함으로써 나타난다.
두 번째 항체 결합을 나타내는 색상 현상(colour development)은 색원체로서 오르토페닐렌디아민을 사용한다. 흡수는 인텀드 이뮤노리더 (Intermed Immunoreader) NJ 2000 (Analis Ghent, 벨기에)로 490nm에서 판독한다.
에이치. 폴리모르파 균주 preS/S-B-431로부터 부분적으로 정제된 추출물은 시험에서 preS1 영역에 대해 특이적인 Mab S1.1 결합에 의한 포착을 지시하는 양의 반응성을 제공한다. 단지 에스. 세레비지애 RIT4376(Harford 일행.,1987)으로부터 정제된 S-단백질만 함유하는 표면 항원 입자는 이시험에서 반응성을 제공하지 않는다.
C2. Mab S2.5 와의 반응
쥐의 모노클론 항체 S2.5는 HBV 표면 항원의 preS2 영역에 대항하는 것이다. 이 Mab는 복합체 입자상에서 preS2 에피토프의 존재를 측정하기 위한 엘사 시험에 사용된다. Mab S2.5를 미소적정 플레이트의 웰 위에 피복시키고 에이치. 폴리모르파 preS/S-B-431로부터 부분적으로 정제된 세포추출물과 함께 배양한다. 항원 결합은 양고추 냉이 퍼옥시다제와 커플링된 Mab S2.5와 함께 배양시키고 상기한 바와 같이 색상 현상시킴으로써 나타난다. 에이치. 폴리모르파로부터 부분적으로 정제된 세포 추출물은 이 시험에서 양의 반응성을 제공하며 이것은 표면 항원 입자 위의 preS2 영역 에피토프의 존재를 지시한다. 에스. 세레비지애 RIT4376으로부터 정제된 S-단백질만 함유하는 표면 항원 입자는 이 시험에서 반응성을 제공하지 않는다.
C3. Mabr RF1 및 S1.1(HRP)와의 반응
쥐의 모노클론 항체 RF1 (H. 토마스, 로얄 프리 호스피탈, 런던, U.K)는 S 영역내에 위치된 구조 의존 에피토프에 대항하는 것이다. 이 Mab는 미소적정 플레이트의 웰을 피복하기 위해 사용하며 에이치. 폴리모르파 균주 preS/S-B-431의 부분적으로 정제된 추출물과 함께 배양한다. 입자 결합은 상기 부분 C.1에서 기술된 양고추 냉이 퍼옥시다제 커플링된 S1.1 Mab와 함께 배양함으로써 나타난다. 에이치. 폴리모르파 부터 부분적으로 정제된 추출물은 시험에서 양의 결과를 제공하는 반면 에스. 세레비지애 RIT4376으로부터 정제된 표면 항원 입자는 반응성이 없다.
C4. pHSA 수용체에 대한 분석
preS2 지역 상에 존재하는 pHSA 수용체의 검출을 위한 분석을 폰티소일행 (1983)의 절차에 따라 행한다.
중합된 인간 혈청 알부민을 미소적정 플레이트의 웰 위로 피복하고 에이치. 폴리모르파 균주 preS/S-B-431의 부분적으로 정제된 세포 추출물과 함께 배양했다. 비-결합 물질을 제거하기 위해 세척한 후 플레이트 상에 포착된 입자를 I125로 라벨링된 폴리클론 안티-HBsAg 토끼 항체 (AUSAB 키트)와 함께 배양함으로써 검출한다. 에이치. 폴리모르파로부터 부분적으로 정제된 추출물은 시험에서 양의 반응성을 제공하는 반면 에스. 세레비지애로부터 정제된 HBsAg는 시험에서 반응성을 제공하지 않는다.
상기 결과는 에이치. 폴리모르파로부터 부분적으로 정제된 추출물내에 존재하는 HBsAg 반응성 물질은 HBV 표면 항원의 preS1, preS2 및 S 영역에서 에피토프에 대한 Mabs에 의해 특이적으로 결합된 항원부위를 함유하고 이 물질은 또한 pHSA와 반응하는 부위를 함유할 수도 있음을 보여준다.
d) 복합 입자의 면역 침전
에이치. 폴리모르파 균주 preS/S-B-431의 부분적으로 정제된 추출물내에 존재하는 AUSRIA 반응성 물질이 복합 입자를 함유하는지 여부를 측정하기 위해서 preS1 단백질에 대해 특이적인 모노클론 항체를 사용한 면역 침전이 수행된다.
면역 복합체는 모노클론 항체 및 스타프 A 세포 사이의 샌드위치 항체로서 토끼 항-쥐 혈청을 사용하여 포르말린-고정된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (스타프 A) 세포(이뮤노프레시피틴, BRL, Gaithesburg; MD. USA)에 의해 포착된다. 스타프 A 세포는 공급자에 의해 권장되는바대로 예비 처리되고 마지막으로 세척되고 PBS 내 10%(w/v)에서 재현탁된다. 스타프 A 세포(10% w/v 현탁액의 120㎕의 토끼 항-쥐 혈청(RAM)과 함께 2시간 동안 실온에서 배양한다. 스타프 A-RAM 복합체를 원심분리에 의해 수집하고 0.1%(w/v)트윈 20을 함유하는 PBS로 2번 세척하고 마지막으로 0.l%(v/v)트윈 20을 함유하는 PBS 내에 약 10%(w/v)로 재현탁시켰다.
상기한 바와 같이 얻어진 2㎍ AVSRIA 반응성 물질을 500㎕로 함유하는 효모-유도된 S-단백질 HBsAg 입자 샘플(lot HB 193, 스미스 클라인 바이오로지칼스, Rixensart 벨기에) 및 에이치. 폴리모르파 균주 preS/S-B-431 입자의 부분적으로 정제된 제조물에 1㎕의 Mab S1.1(638㎍ 단백질/ml)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 항은 처리했다. 그리고나서 20㎕의 스타프 A-RAM 복합체를 첨가하고 배양을 4℃에서 하룻밤 동안 계속했다. 형성된 면역 복합체를 원심분리에 의해 수집하고, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 위한 샘플 완충제 내에서 최종 펠릿을 재현탁시키기 전에 0.1%(v/v) 트윈 20을 함유하는 PBS로 5번 세척하고 PBS로 1회 세척한다. HBsAg 단백질 종(species)의 검출을 위한 쥐 모노클론 항체 RF6(H. 토마스, 로얄 프리 호스피탈, 런던)을 사용하여 하기 면역 블로팅에 의해 면역 침강을 분석한다. 모노클론 항체 RF6는 변성 및 플라스틱 유도된 HBsAg의 에피토프에 대한 저항성 감소에 대항하는 것이며 모노클론 HBS1 과의 결합 실험에서 경쟁한다.
면역 블로트는 에이치. 폴리모르파 preS/S-B-431 입자로부터 얻어진 면역 침전물은 preS1-단백질 및 S-단백질을 함유하는 반면 사카로마이세스 유도된 HBsAg로부터의 면역 침전물은 S-단백질을 함유하지 않음을 보여준다.
이것은 혼합된 폴리펩티드 조성물의 복합 입자가 에이치. 폴리모르파 균주 preS/S-B-431 세포 추출물로부터 부분적으로 정제된 물질내에 존재함을 증명한다.
e) 전자 현미경법.
에이치. 폴리모르파 균주 preS/S-B-431로부터 부분적으로 정제된 HBsAg 입자를 전자 현미경으로 시험한다. 물질을 0.1%(w/v)소 혈청 알부민으로 20mM 트리스-HC1 완충제 pH8.2 내에서 희석시키고 우라닐 아세테이트로 염색하기전에 셀로이딘 필름으로 덮은 구리/로듐 격자로 침강시킨다. 전자 현미경에서의 시험은 평균 27nm 직경을 갖는 타원 형-구형 입자의 존재를 보여준다. 이 사이즈는 에스. 세레비지애 균주 RIT 4376(피터 J 일동, 포스트가아드. 메티칼. Supp1.2 73-81(1987))로부터 정제된 일련의 HBsAg 제조물에 대한 동일 기술에 의해 측정된 평균 입자 직경 범위 내에 있다.
[실시예 D.5]
5. 에이치. 폴리모르파 및 에스. 세레비지애에서 발현되는 복한 입자의 비교
에이치. 폴리모르파의 균주 preS/S-C-453 및 에스. 세레비지애에 균주 Y1108의 배양물을 물질 5d에서 기술된 S-배지 내에서 배양시켰다. 균주 Y1108은 Ty 벡터에 의해 게놈으로 통합된 발현 카세트로부터 preS1 및 S-단백질을 발현시키는 에스. 세레비지애의 이배체 균주이다. 균주는 preS1 발현 카세트의 5-7 복사물 및 S-발현 카세트의 3-4 복사물을 함유한다. 균주는 성장을 위해 트립토판을 필요로 한다. Ty 벡터를 사용한 그러한 발현 카세트의 구성 및 염색체 통합은 여기에 참고로 첨부한 스미스클라인 벡크만 코포레이션에 양도된 동시계류중인 VSSN 07/292 209(1988,12,30 출원)에 기술되어 있다. 1.5%(w/v)에서 글리세롤은 에이치. 폴리모르파의 배양을 위한 탄소원으로서 사용된다. 400ml 이 배지를 함유하는 일련의 2리터 애를렌마이어 플라스크를 에이치. 폴리모르파 균주 preS/S-C-453로 접종하고 약 33시간 동안 30℃에서 글리세롤이 소모될때까지 오르비탈 쉐이커 상에서 배양한다. 3개의 플라스크로부터의 세포를 원심 분리에 의해 수확하고 세포펠릿을 더 가공 처리할 때까지-70℃에서 저장한다. 100ml의 배양물 배지를 각각의 6개의 다른 플라스크로부터 옮기고 4%(w/v) 메탄올을 함유하는 신선한 배지 100ml로 다시 넣는다. 그리고 나서 배양을 계속한다. 14시간 배양을 더 한 후 3개의 배양물을 원심 분리에 의해 모으고 메탄올 존재하에 38시간 배양 후 다른 3개의 배양물을 수확한다. 세포를 원심분리에 의해 회수하고 세포 펠릿을 다른 가공 처리할때까지 -70℃에서 저장한다.
두 번째 실험에서 에스. 세레비지애 Y1108의 배양물을 상기한 바와 같이 배양하고 19.5 시간의 배양 후 수확한다. 에이치. 폴리모르파 preS/S-C-453의 배양물을 세포를 글리세롤 배지내에서 26시간 배양 후 및 메탄올 함유 배지에서 45시간 후 수확하는 것을 제외하고 상기한 바와 같이 배양했다.
한세눌라 폴리모르파의 세포 펠릿을 0.5%(w/v)트윈 20, 2mM EDTA, 4mM PMSF (페닐메틸술포닐 폴루오라이드), 5%(w/v)이소프로판올 및 50mM 나트륨 포스레이트 pH9.0을 함유하는 완충액내에 약 25% 습윤 세포 펠릿 중량/부피 농도로 재현탁시키고 이 혼합물 10ml를 20,000psi에서 프렌치 프레스로 6회 통과시켜 세포를 파괴한다. 조 세포 추출물을 4℃에서 45분 동안 17000에서 원심 분리시킴으로써 정제하고 상등액을 회수했다.
에스. 세레비지애의 세포 펠릿을 세포가 상기 완충제 부피 당 약 50% 습윤 세포 펠릿 중량의 농도로 재현탁시키는 것을 제외하고 동일하게 처리했다.
각 상등액의 단백질 함량을 로우리 일행의 방법(1951)에 의해 측정한다. 정제된 세포 추출물을 AUSRIA에 의해 HBsAg 및 엘사 분석에 의해 preS1 단백질 에피토프의 존재에 의해 분석했다. 모노클론 S1.1 엘사 분석을 다음과 같이 수행한다. 플라스틱 접시의 웰 (Nunc 이뮤노플레이트 1, Gibco Europe Ghent, 벨기에)을 50mM 중탄산 나트륨 완충제 pH9.6 내에서 S1.1 쥐 모노클론 항체로 2시간 동안 37℃에서 피복시키고 항체 용액을 제거했다. 그리고나서 웰을 1%(w/v) 소 혈청 알부민을 배양함으로써 블로킹 시켰다. PBS, 0.2%(w/v) 소 혈청 알부민내에서 제조된 세포 추출물의 일련의 2배 희석물을 웰에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 배양한다.
그리고나서 웰을 0.9%(w/v) NaCl, 0.05% (w/v) 트윈 20 으로 3회 세척한다. 항원 포착은 윌슨과 나칸의 방법 (1978)에 의해 양고추 냉이 퍼옥시다제에 커플링된 모노클론 항체 S1.1과 배양함으로써 나타난다. JPBS, 0.2%(w/v) 소 혈청 알부민 내 공역된 항체를 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 배양한다. 두 번째 항체 결합은 4mg O-페닐렌디아민 (시그마), l0ml 0.1M KH2PO4pH6.0 내에 용해된 15㎕ 과산화수소를 함유하는 100㎕의 용액을 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양함으로써 나타난다. 반응은 25㎕ 1N H2SO4를 첨가함으로써 블로킹되고 광학 밀도는 인텀드 이뮤노미터, NJ200 (Analis Ghent, 벨기에)로 49Onm에서 읽는다 (참조 여과기에 대해 620nm로) 광학 밀도 단위/mg 단백질로서 얻어지고 표현되는 광학 밀도 곡선의 선형 부분으로부터 결과를 계산한다.
에스. 세레비지애 및 에이치. 폴리모르파의 세포 추출물내에서 측정된 AUSRIA 반응성 HBsAg 및 preS1-단백질의 양을 표 4 및 5에 나타내었다.
에스. 세레비지애 균주 Y1108의 조 추출물에서 발견되는 AUSRIA 반응성 물질의 양은 메탄올내에서 38-45 시간 동안 유도된 에이치. 폴리모르파 preS/S-C-453의 추출물에서 보다 약 100 배 작다. 엘사에 의해 분석된 preS-단백질의 양은 약 3-8배 적고 이는 에스. 세레비지애 균주 Y1108이 에이치. 폴리모르파 균주 preS/S-C-453 보다 S-단백질에 대한 preS1-단백질의 보다 큰 비율을 만든다는 사실을 가리킨다.
결과는 대조물로서 균주 454 및 448-C4의 메탄올 유도된 배양물의 추출물과 함께 첫 번째 실험으로부터 추출물의 면역 블로팅에 의해 확인된다.
15μg의 단백질을 함유하는 샘플을 Laemmli (1971)의 방법에 따라 12.5% 부리, 5% 적재겔을 통하여 전기 영동시키고 검출을 위한 모노클론 HBS1을 사용하여 물질 및 방법 5a에서 상기한 바와 같이 면역 블로팅시킨다.
균주 preS/S-C-453 으로부터의 추출물은 S-단백질과 관련된 24KD 에서의 강력한 반응성 밴드 및 preS-단백질과 관련된 38-39KD에서의 밴드를 보인다. 45KD 밴드는 광범위하게 검출된다. 반대로 에스. 세레비지애 균주 Y1108 로부터의 추출물은 24KD 및 45KD에서 약한 밴드를 보인다. preS-단백질의 38-39KD 이중 밴드가 광범위하게 검출될 수 있다. 면역 흡수 결과는 에스. 세레비지애가 메탄올 유도된 에이치. 폴리모르파 보다 적은 S 및 preS-단백질을 발현하고 에스. 세레비지애에 의해 발현된 preS 단백질은 주로 글리코실화된 45KD 형태임을 증명한다.
[실시예 D.6]
에이치. 폴리모르파에서 preS 단백질의 미리스토일화
균주 LR9, 균주 452 및 453의 배양물을 2.5% v/v 글리세롤을 갖는 최소 배지상에서 진탕 플라스크내에서 24시간 동안 배양한 후 메틴올 (1%, v/v)를 첨가했다. 메탄올 첨가 6시간 후, 트리듐 라벨링된 미리스트산을 첨가하고 배양물을 16시간 더 배양했다. 세포를 수집하고 세척하고 1% SDS 및 β-메르캅토에탄올 존재하에 유리 비이드로 부수었다. 추출된 단백질을 SDS-PAGE 겔 전기 영동에 의해 분리하고 모노클론 HBS1로 면역 흡수시키고 플루오로그라피시킴으로써 가시화했다. 결과는 38/39KD preS1 단백질에 상응하는 밴드가 균주 452 및 453의 추출물에서 라벨링되지만 LR9로부터의 추출물에서 라벨링되지 않는다. 이것은 폴리펩티드의 두 번째 위치에서 글리신 잔기의 미리스토일화 및 N-말단 메티오닌의 후 해독 제거 (post translational remove)와 일치한다. (Towler 및 Gordon, Ann, Rev. Biochem., 57 : 69-99,1988).
[실시예 D.7]
에이치. 폴리모르파로부터 얻은 preS 항원의 면역성
조 단백질 추출물을 균주 452 및 454의 메탄올 배양된 배양물로부터 제조하고 1mg/ml 최종 농도에서 수산화 알루미늄 위로 흡착시킨다. 각 추출물의 preS1 에피토프 함량을 표준물로서 에스. 세레비지애로부터 부분적으로 정제된 모노클론 항체 S1.l 및 preS1 단백질을 사용하여 엘사 분석으로 측정한다. 주사용 면역 복합체는 또한 600ml의 S1.1 모노클론 항체를 1ml의 세파로스 단백질 G4 페스트플로우(Fast Flow)로 2시간 동안 4℃에서 배양함으로써 형성된다. 그리고나서 혼합물을 원심분리하고 PBS로 세척하고 펠릿을 1ml PBS로 재현탁시켰다. 이 현탁액 250ml을 각 조 세포 추출물 3.4ml에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 20℃에서 배양했다.
배양후 세파로스 단백질 G/S1.1/조 단백질 혼합물을 원심분리하고 펠릿을 10mM 인산 나트륨 완충제에 재현탁했다. 이 물질의 반을 1mg/ml 최종 농도로 수산화 알루미늄 위로 흡착시켰다.
5 마리씩의 Balb/c 쥐 군을 4개의 제조물로 복막내로 주사했다. 한달 후, 쥐는 균주 453의 메탄올 배양된 배양물로부터 흡착되고 부분적으로 정제된 입자 수산화 알루미늄 1mg의 복강내 부우스터(booster)주사액을 받는다. 쥐는 15일후 물집이 생긴다. 혈청내 항-S, 항-preS2 및 항 preS1 항체의 역가를 하기와 같은 방법으로 측정한다
표 6은 기하학적 평균 역가로서 표시된 Balb/c 쥐로 유도된 대표적 항체 역가를 보여준다.
결과는 추출물(균주 454)를 함유하는 preSl-S2-S로 또는 복합체 입자(균주 452)를 함유하는 추출물로 주사되고 복합체 입자(균주 453)으로 부우스팅될 때 항-preS 항테가 쥐에서 유도됨을 보여준다.
주의
(a) 에스. 세레비지애로부터 preS1-S2-S 항원에 비교함.
(b) 모든 쥐는 30일에서 균주 453으로부터 부분적으로 정제된 입자의 부우스터 주사액을 받음.
(c) 역가는 검정시 1.0의 OD를 제공하는 역전된 희석액으로서 표현됨.
파트 E
[실시예 E.1]
변형된 preS1-S2-S(L ) 및 단일 또는 혼합된 아형의 S 항원 모두를 함유한 복합체 입자의 발현.
(1) L (ad) 코딩 서열의 작제
한세눌라 발현 벡터 pMPT-121(제11도)상의 직접 삽입에 적합한 변형된 preS1-S2-S(L )코딩 서열을 하기와 같이 작제하였다. 하기될 pRIT13192의 플라스미드 DNA를 HindⅢ 엔도뉴클레아제로 소화시켜 선형 단편을 얻었다. 이 DNA 약 1ng를 올리고뉴클레오티드 BC74 및 BC75와 혼합시켜 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)증폭에 적용시켰다.
PCR 기술은 잘 알려져 있으며 PCR Protocols, Aguide to methods and applications; Innes 일동의 (Eds.) Academic Prees Inc., San Diego CA 1989에 공개되어 있다.
올리고뉴클레오티드 BC74 및 BC75는 아래에 보인 서열을 가지며 통상적인 포스포르아미다이트 화학에 의해 합성되었다.
BC74 5' CCC AGA TCT AAG CTT ATT AAA TGT ATA CCC A 3'
BC75 5' CCC GAA TTC AAA ATG GGG ACG AAT CTT TCT 3'
올리고뉴클레오티드 BC74는 HindⅢ 및 Bg1Ⅱ 제한 부위 확장과 함께 pRlT13192 상의 L 코딩 서열의 3' 말단에 있어 상동성을 갖는다. 올리고뉴클레오티드 BC75는 EcoRI 부위 및 확장으로 ATG 코돈앞에 짧은 리더서열과 함께 pRIT13192 상의 L 코딩 서열의 5' 말단에 있어 상동성을 갖는다. 상업적으로 입수가능한 DNA 증폭제 (Ferkin Elmer Cetus로부터의 유전자 Amp DNA 증폭제 키트; Vander Heyden, Brussels로부터 얻을 수 있음)를 사용하여 최종 부피 100㎕로 주형 pRIT13192 DNA 약 1ng을 50mM KCl, 10mM 트리스-HCl pH3.3, 1.5mM MgCl, O.01%(w/v)젤라틴, 각각 200uM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 1uM의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 2.5 단위의 Taq 폴리머라제와 혼합시켰다. 혼합물을 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer Cetus; Bander Heyden, Brussels로부터 얻을 수 있음)를 사용하여 변성(denaturation)(2분,92°), 어니일링(2분, 48°) 및 확장(2분, 72°)외 25 사이클에 적용시켰다. 그렇게 얻어진 변형되고, 증폭된 L 코딩 서열 단편 1ng을 이어 같은 조건내에서 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 두 번째 순환으로 재증폭시키고 에탄올 침전에 의해 반응 혼합물로부터 정제시켰다.
870bp 적용된 L 단편 DNA 약 25Ong의 부분 표본을 EcoRI 및 Bg1Ⅱ 엔도뉴클레아제로 소화시키고 pBR237 유도체 플라스미드의 EcoRI 및 Bg1Ⅱ부위간에 pRIT12555를 클로닝시켜 pRIT13488을 얻었다. pRIT12555는 원플라스미드의 EcoRI 와 ClaI 부위간의 링커 삽입에 의해 도입된 Bg1Ⅱ 부위를 갖는 pBR327 레프리콘으로 구성된다.
적용된 L 단편의 다른 부분 표본을 EcoRI 및 Bg1Ⅱ 엔도클레아제로 소화시키고 플라스미드 pMPT121(제11도)의 EcoRI와 Bg1Ⅱ 부위간에 삽입시켰다. 이것은 형질전환에 의해 에이치. 폴리모르파 도입하기에 적합한 발현 플라스미드 상의 MOX 프로모터와 MOX터미네이터간에 L 코딩 서열을 위치시킨다. 결과적인 플라스미드, PL -11의 DNA 서열은 L 코딩 영역 서열이 올바름을 보여주었다.
(Z) S-(ay) 코딩 서열의 구성.
pRIT13490은 pBR322 상에 클로닝된 ay 아형 B형 간염 바이러스의 완전한 게놈을 함유한 pRIT1O601로부터의 통상적인 재조합 DNA 조작에 의해 얻어진 완전한 preS2-S 코딩 서열을 함유한 pBR322 유도체 플라스미드이다. pRITl0601은 공식 승인 번호 ATCC 39132로 1982년 6월에 미네소타주 록크빌시의, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다.
아래의 조작에 있어 하기될 pRIT13490은 pRIT1060101 또한 완전한 S-(ay) 코딩 서열을 함유한 다른 클로닝된 HBV 단편으로 대치될 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다. 플라스미드를 선형화하기 위해 pRIT13490의 DNA를 HindⅢ 엔도뉴클레아제로 소화시키고 상기된 올리고뉴클레오티드 BC74 와 EcoRI 부위 및 확장으로 ATG 코돈앞에 짧은 리더 서열과 함께 pRIT13490 상의 S 코딩 서열의 5' 말단에 있어 상동성을 갖는 올리고뉴클레오티드 BC73과 혼합시켰다.
BC735' CCC GAA TTC AAA ATG GAG AAC ATC ACA TCA 3'
HindⅢ 처리된 pRIT13490 및 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 상기된 바와 같이 PCR 2순환으로 증폭시켜 EcoRI 및 Bg1Ⅲ 제한 부위에 의해 플랭킹된 700bps-(ay) 코딩 서열 단편을 생성하였다. 이 물질 약 250ng를 EcoRI 및 Bg1Ⅲ 엔도뉴클레아제로 소화시키고 pRIT12555의 EcoRI 및 Bg1Ⅱ 부위간에 클로닝시켜 pRIT13438을 얻었다. pRIT13438 상의 S-(ay) 코딩 서열의 정확성은 DNA 시퀀싱에 의해 입증되었다.
(3) L (ad/ay) 코딩 서열의 구성.
약 lng의 PCR 증폭된 단편은 pRIT13488을 작제하는데 사용되며, 더나아가 올리고뉴클레오티드 BC75(상기됨) 및 하기 서열을 갖는 BC30이 존재하는 가운데 PCR 증폭 2순환에 의해 증폭되었다.
BC30 5' ACC AGT CTA GAC TCT GCG GTA 3'
BC30은 ad 아형의 pRIT10616 HB 바이러스로부터 유도된 S 코딩 서열의 XbaI 부위 주위 지역에 상응한다. 증폭으로부터 280bp 단편을 회수하여 이것 중 약 250ng을 EcoRI 및 XbaI 엔도뉴클레아제로 소화시켰다.
올리고뉴클레오티드 BC74(상기됨) 및 하기 서열을 갖는 BC12가 존재하는 가운데, pRIT13438을 구성하는데 사용되는 PCR 증폭된 단편 약 1ng을 PCR 증폭 2 순환에 의해 더 증폭 시켰다.
BC12 5' ATG GAG AAC ATC ACA TCA 3'
BC12는 pRIT10601 및 pRIT10616 상에 클로닝된 HB 비리온의 S 코딩서열의 첫 번째 6 코돈에 상응한다. 700bp 단편의 약 250ng PCR 증폭에 이어 XbaI 및 Bg1Ⅱ 엔도뉴클레아제로 소화시켰다.
이어서 두 개의 엔도뉴클레아제로 소화되고, PCR 증폭된 단편을 EcoRI, Bg1Ⅲ 소화된 pRIT12555의 DNA와 연결시켰다.
pRIT13488을 작제하는데 사용된 단편의 PCR 증폭으로부터의 EcoRI-XbaI 단편 및 pRIT13438을 작제하는데 사용된 단편의 PCR 증폭으로부터의 XbaI-Bg1Ⅱ 단편과 함께 pRlT12555 구성되는 플라스미드. pRIT13491을 회수하였다. pRIT13491 상에 삽입된 L 코딩의 DNA 서열은 오차가 S 코딩 영역의 다섯 번째 아미노산에 도입됨을 보여주었다. 이것을 바로잡기 위해 상기 pRIT13488을 작제하는데 사용되는 PCR 증폭된 단편을 EcoRI 및 XbaI 엔도뉴클레아제로 소화시키고 오차를 함유한 pRIT13491 상의 상응하는 EcoRI-XbaI 단편을 대치시키는데 사용했다. 결과로 생성된 플라스미드 pRIT13489는 ATG 초기 코돈으로부터 XbaI 부위까지의 부분은 ad 아형 바이러스 서열로부터 유도되고 XbaI 부위로부터 말단 코돈까지의 부분은 ay 아형 바이러스 서열로부터 유도된 혼성 L 코딩 서열을 예증한다. 상응하는 폴리펩티드는 ay 아형을 가질 것이다.
이어서 혼성 L (ad-ay)코딩 서열을 함유한 pRIT13489로부터의 EcoRI-Bg1Ⅱ 단편을 플라스미드 pMPT-121 상의 EcoRI과 Bg1Ⅱ 간에 삽입시켜 에이치. 폴리모르파 발현 벡터 pL 13을 얻었다.
(4) 복합체 입자를 형성하기 위해 변형된 preS1-S2-S(L ) 및 S 항원 모두의 에이치. 폴리모르파에 있어서의 발현.
서로다른 L 및 S 발현 비율 및 서로 다른 총 발현량을 특징으로하는 몇 개의 균주를 작제하였다. 이들 차이점은 게놈당 발현 카세트의 복사수의 변화로 얻어졌다.
에이치. 폴리모르파 균주 RB10을 L (ad)-발현 카세트 함유 플라스미드 pL 11를 사용하여 상기된 바대로 형질전환시켰다. 형질전환으로 게놈내로 통합된 다양한 수의 발현 카세트를 함유한 몇 개의 균주를 얻었다. Ll3/1 및 Ll9/1로 표시된 이들 균주중 둘을 더 상세히 분석해 주었다. 서어던 블로트 분석은 이들 균주가 L (ad)-발현 카세트의 몇 개의 복사체를 함유함을 나타내었다. 이들 균주의 L (ad)-발현량을 모노클론 항체 HBS1을 사용하여 웨스턴 블로트 분석으로 평가분석하였다. L 항원에 상응하는 33KD 밴드를 검출했다. 세포를 글리세롤 배지내에서 성장시키고 이어 메탄올을 첨가시켰을 때 발현량은 총 세포 단백질의 약 0.5-2%인 것으로 측정되었다.
MOX-프로모터의 조절하에서 S(ad)-유전자를 함유한 플라스미드 pRB-S-322로 다시 L (ad)-발현균주를 형질전환시켰다. pRB-S-322는 상기된다(제7도 창조). 젠타마이신에 대한 내성을 형질전환 마아커로 사용했다. 상기된 방법을 사용하여 안정한 통합체를 얻었다. 얻어진 두 개의 균주를 더 상세히 연구했다 : 모두 수용체 균주 L13/1으로부터 유도된 균주 LMS9/1 및 균주 LMS26/2,. 서어던 블로트 분석은 이들 균주가 L (ad) 발현 카세트의 몇 개의 복사체 및 S(ad) 발현 카세트의 몇 개의 복사체를 수반함을 나타내었다.
에이치. 폴리모르파 형질전환에 있어 L 및 S 항원의 발현을 상기된 바와 같은 모노클론 항체 HBS1 및 S1.1을 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 시험하였다. 서로다른 L 대 S 항원비를 나타내는 균주의 스펙트럼을 얻었다.
HBS1 항체는 S 항원에 상응하는 24KD 단백질, 및 L 항원에 상응하는 30 및 33KD 밴드를 검출한다. S1.1 항체는 33KD 밴드 및 30KD 밴드를 검출한다. S1.1 항체는 33KD 밴드 및 30KD 밴드를 나타내는 preS1 영역을 규정한다. L /S 비율은 균주 LMS9/1에 대해 약 1:1 그리고 LMS26/2에 대해서는 약 1:10인 것으로 측정되었다. 메탄올로 유도된 조건하에서 세포가 성장 될 때 발현량은 총 세포 단백질의 약 5-6%인 것으로 측정되었다.
글리코실레이션 연구는 33KD 단백질은 L 항원의 글리코실화된 형태를 나타냄을 보여준다. 균주 LCS9/1 및 LMS26/2로부터의 조 단백질 추출물을 엔도글리코시다제 H로 배양시킬 때, 33KD 밴드는 30KD의 분명한 분자량으로 이동하였다. 30KD는 기대했던 L 항원의 분자량이다. 따라서 에이치. 폴리모르파에서 제조된 L 항원의 부분은 코어-글리코실화되고 나머지는 L 의 비글리코실화된 형태를 이룬다.
입자 형성을 시험하기 위해 균주 LMS9/1 로부터의 조 세포 추출물을 CsC1 밀도 구배 원심법에 적용시켰다. 구배 분획을 항체 HBS1을 사용한 면역 블로팅으로 분석시켰다. 24KD S 항원 및 30 및 33KD L 항원 형태를 포함한 HBsAg-반응성 물질의 피이코를 밀도 1.18g/cm 에서 관찰했다. 이 결과는 L 및 S 폴리펩티드를 동시 발현시키는 에이치. 폴리모르파 균주내에서 복합체 입지가 형성됨을 나타낸다.
본 발명의 다른 변형에 있어 상기된 균주 415를 더 형질전환시켜 L 및 S 단백질을 동시발현시키는 에이치. 폴리모르파 균주가 얻어졌다. 균주 415는 MOX 프로모터 조절하에서 50-1OOS(ad) 간의 발현 카세트를 수반하여 높은 S 항원 발현량을 특징으로 한다.
카나마이신-내성의 유전자를 함유한 L (ad) 발현 벡터를 작제했다. ADHI 프로모터 조절하에서 카나마이신-내성 유전자를 코딩하는 3.5kb NruI-단편 및 HARS 서열을 플라스미드 pHK2(제6도)로부터 분리시켰다. 플라스미드 pL 1l을 NruI 및 SalI 엔도뉴클레아제로 소화시키고 클레나우 DNA 폴리머라제로 필-인(fill-in)시켜 블런트 말단으로 만들었다. NruI/SalI-소화는 pL 11-벡터로부터 HARS 서열을 제거하였다. 이어서 pHK2로부터의 NruI-단편을 pL 11-벡터의 블런트 말단의 큰 NruI-SalI 단편에 연결시킴으로써 카나마이신-내성 유전자를 도입시키고 제거된 HARS 서열을 재-도입시킨다. 결과로 생성된 플라스미드를 카나마이신 내성 유전자 카세트의 배향에 따라 pKL 1 또는 pKL 10 으로 표시했다. pKL 1의 구조를 제12도에 나타낸다. 이들 플라스미드는 방법에 있어 상기된 바대로 형질전환 및 젠타마이신 내성에 대한 선택에 의해 에이치. 폴리모르파 내로 도입될 수 있다.
균주 415는 L (ad) 발현 카세트를 수반하는 pKL 1 및 pKL 10로 형질전환시키고 젠타마이신에 대한 내성을 위한 선택 후 안정한 형질전환체를 얻었다. 몇 개의 균주를 더 분석했다. 항체 HBS1을 사용한 웨스턴 블로트분석은 각각 L 항원의 비글리코실화되고 글리코실화된 형태에 상응하는 30 및 33KD 밴드 및 S 항원에 상응하는 24KD 단백질을 나타내었다. 이들 415 유도된 균주에 있어 L /S 비율은 균주 LMSO5-14-1에 있어 약 1:1-균주 LMSO5-12-1에 있어 약 1:20로 다양했다. 메탄올로 충분히 유도된 조건하에서 성장한 균주에 있어, L /S 항원 발현량은 총 세포 단백질의 측정된 5-6%에 달했다. pKL 1로 형질전환된 균주와 pKL 10 으로 형질전환된 균주간에 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.
(5) 혼합된 아형을 갖는 복합체 입자로 이끄는 L 및 S 항원의 동시-발현.
혼합된(ad-ay) 아형을 갖는 L /S-입자를 만들어내는 에이치. 폴리모르파 균주를 얻기 위해, L (ad-ay)발현 카세트를 함유한 플라스미드 pL 13을 에이치. 폴리모르파 RB10으로 형질전환시켰다.
L 항원 발현 안정한 클론을 얻을 수 있으며 젠타아이신 내성에 대한 선택으로 S(ad) 발현 카세트를 수반하는 플라스미드 pRB-S-322로 재형질전환시켰다. 두 번째 형질전환으로부터의 안정한 균주를 웨스턴 블로팅 및 AUSRIA 평가분석으로 분석하여 각각의 L (ad-ay) 및 S(ad) 항원의 발현량 및 표면 항원 발현의 총량을 측정했다.
S(ad)단백질 발현 균주 415를 또한 관능성 젠타마이신 내성 마아커를 수반하는 pL 13 유도체로 재형질전환시켜 ad 및 ay 아형 특수성을 모두 갖는 복합체 입자 형태인 L (ad-ay) 및 S(ad) 폴리펩티드 모두를 발현하는 안정한 형질전환체를 만들었다.
파트 F
[실시예 F.1]
비(非)-미리스틸화된 HBV 라아지 단백질을 코딩하는 플라스미드 pRIT129179의 작제
플라스미드 pRIT129179의 구성 윤곽이 제13도 및 제14도에서 보여진다. 제13도는 △Gly 13 L 단백질-발현 카셋트 pRIT12998을 정착시키는 이. 콜라이(E. Coli) 플라스미드를 작제하는 단계를 보여준다. 제14도는 △Gly 13 L 단백질을 발현할 수 있는 효모 플라스미드 pRIT129179을 얻는 과정을 예증한다.
Gly13 잔기는 표 A에서 표현된 L 단백질 코딩 서열의 두 번째 코돈에 의해 코딩된다.
이 구성을 위한 출발물질은 BamHI, SmaI, EcoRI 링커에 의해 분리된 ARG3 전사 종결 영역 [Cabezon 일행의 Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 81 : 6594-6598(1984)] 및 TDH3 프로모터 영역을 포함하는 pBR327의 유도체인 플라스미드 pRIT12863 이다. Bg1Ⅱ 부위를 포함하는 링커는 TDH3 프로모터 서열의 업스트림에 놓인다. pBR327은 Soveran 일행의 Gene, 9 : 287-305(1980)에서 기술되고 F. Bolivar(멕시코 국립대학, 분자 생물학 분야)로부터 얻어졌다. 플라스미드는 동시 계류중인 미합중국 출원 SN 009,325에서 기술된 것처럼 회수될 수 있다.
비(非)-미티스틸화된 L 단백질용 발현 카셋트는 pRIT12863의 링커 영역내에서 작제된다.
pAS1으로부터 유도된 이. 콜라이 플라스미드 [Rosenberg 일행의 Methods Enzymol., 101 : 123-164(1983)]인 플라스미드 pRIT12816은 NcoI 부위(L 단백질 코딩 서열에서 코돈 위치 12에서 ATG와 오버래핑)와 EcoRI 부위(정지코돈 다음에 위치)에 의해 플랭킹된 라아지 HBV (adw serotype) 단백질을 코딩하는 영역을 정착시킨다. 플라스미드는 통상적인 재조합 DNA 기술[T. Maniatis 일행의 상기된 것을 보라]에 의해 작제된다.
플라스미드 pRIT12816은 BstXI 및 EcoRI으로 소화되며, preS1 영역의 N-말단 부분을 코딩하는 304bp BstXI-EcoRI 단편은 회수되어 하기 합성 BamHI-BsXI 어댑터에 연결된다 :
단편은 이전에 BamHI 및 EcoRI 효소로 소화된, pRIT12863으로 삽입되어 플라스미드 pRIT12996으로 된다. BamHI-BstXI 합성 어댑터는 N-말단 preS1 영역을 정착시키나, TDH3 프로모터의 ATG 잔기에 놓여진 BamHI 부위를 가지는 정확한 리딩 프레임을 제공하지 않는다. 정확한 리딩 프레임은 BamHI 및 XbaI으로 pRIT12996을 소화시키고 나서 돌출한 확장을 제거하기 위해 뭉(mung) 콩 효소를 처리하고 연결함으로써 제공된다. 이러한 과정에 플라스미드 pRIT12997가 만들어졌다.
최종적으로, pRIT12816으로부터의 838bp EcoRI 단편을, △Gly L 단백질에 대한 완전한 코딩 서열을 회복하기 위해 정확한 배향으로 pRIT12997의 EcoRI 부위로 삽입하였다. 결과 만들어진 플라스미드 pRIT12998은 Gly13이 결실된 L 단백질을 코딩하는 발현 카셋트를 함유하며, 미리스토일 트랜스퍼라제를 위한 기질로서 공급되지 않는다.
△Gly L 단백질을 발현할 수 있는 효모 플라스미드를 작제하기 위해, 플라스미드 pRIT12998을 Bg1Ⅱ 및 SalI로 소화시켰다. 발현 카셋트로 포함하는 5822bp Bg1Ⅱ-SalI 단편을 정제하여, AmpR 유전자, 2μ서열, 이. 콜라이 레플리콘 및 선택용 LEU2 효모 마아커를 공급하는 pBR327 유도체인 통상적인 효모 벡터 pRIT1274l에 삽입하였다.
결과 플라스미드 pRIT12979는 일명 TCY1 또는 Y482로 불리는 LEU-에스. 세레비지애 균주 10S44Cir° (pep 4-3, leu 2-3, leu 2-112)를 형질전환하는데 사용되며, 상기 형질 전환전의 균주는 기탁번호 ATCC 20818로 미합중국 메릴랜드주 록크빌시 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American type culture collection)에 기탁되어있다. 형질전환후에, 결과 만들어진 LEU+효모 균주는 Y720으로 불리운다.
[실시예 F.2]
L 단백질과 △Gly L 단백질의 비교 특성
실시예 F.l의 효모 균주 Y720은 L 단백질을 발현하는 효모 균주 Y587(pRIT12845에 의해 형질전환된 TCY1)과 비교해서 △Gly L 단백질 발현에 대해 시험되었다. pRIT12845는, 1050bp TDH3 프로모터 단편의 조절하에 5' 플랭킹되고 ARG3 전사 터미네이터를 운반하는 1150bp 단편에 의해 3' 플랭킹된, L 단백질의 389 아미노산에 대한 HBV DNA로부터 유도된 코딩 서열로 구성된 3370bp 발현 카셋트를 포함한다. pRIT12845는 동시계류중인 미합중국 특허출원 SN 009,325의 실시예 16A에서 상세히 기술된다. pRIT12741로 형질전환된 TCY1인 효모 균주 Y1017은 음성 대조물로 공급된다.
A. 미리스틸화
Y720, Y587 및 Y1017로부터 얻은 세포는 동시계류중인 미합중국 특허출원 SN 009,325에서 기술된 바와 같이3H-미리스트산으로 라벨링되었다. 이들 세포의 SDS-추출물은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDA-PAGE) 및 뒤따라서, 면역블로트 및 플루오로그래피 [Towler 및 Glaser의 Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 83 : 2812-2816(1986)을 보라]에 의해 분석되었다.
동시계류중인 미합중국 특허 출원 SN 009,325에서 기술된 바와 같이 면역 블로트는 S-특이 모노클론 항체(Mab), Mab RF6 [H. Thomas, Royal Free Hospital London] 또는 Mab HBs1 [Smithkline Biologicals] 중 하나로의 검출을 수반한다. 이들 항체는 S 단백질에서 중복하는 변성 및 환원 저항 에피토프를 인식한다. 면역 블로트는 Y720 및 Y587에서 38Kd 및 45Kd의 L 단백질의 두가지 형태의 발현을 보여주었다.
플루오로그래프는 동시계류중인 미합중국 출원 SN 009,325에서 기술된 바와 같이 Y587 세포로부터 유도된 38Kd L 단백질에서3H 라벨의 존재를 보여주었다. 작은 양의 라벨이 그들로부터 유도된 45Kd L 단백질에서 관찰되었다. 반대로, Y720 세포로부터 유도된 38Kd 또는 45Kd△Gly L 단백질중 어느 하나도 라벨을 통합하지 않는다. 이것은 pRIT12979에서 글리신 코돈의 제거가 에스. 세레비지애에서 △Gly L 단백질의 미리스틸화를 없앰을 설명한다.
B. 발현 수준
Y720, Y587 및 Y1017로부터 얻은 세포는 삼각 플라스크에서 2% 글루코오스를 함유하는 아미노산 [디프코 랩] 0.675% 없이 YNB 내의 동일한 조건하에서 성장되었다. 전체 분산된 세포 및 조 추출물 모두는 동시계류중인 미합중국 출원 SN 009,325에서 기술된 정량적인 면역 블로트에 의해 분석되었다.
2배 연속 희석 샘플을 분석하고 면역 검출은 S-특이 Mabs RF6 또는 HBs1, 또는 preS1-특히 모노클론 항체, S1.a [Smithkline Biologicals]를 기본으로 하였다. 면역 블로트는 Y587에서 미리스틸화된 L 단백질보다 △Gly L 단백질 (Y720)에 대해 2-5배의 더 높은 발현 수준을 나타내었다.
추출 효율은 비-미리스틸화되고 미리스틸화된 단백질에 대해 대략 동일한 것으로 나타났다. 45Kd 글리코실화된 형태로 밝혀진 L 단백질의 비율은 미리스틸화의 제거에 의해 변화되지 않았다.
C. 지방단백질 구조
Y720 및 Y587 세포로부터의 세포 추출물을 CsCl 평형 원심분리에 적용시켰다. 구배 분획은 면역블로트, AUSRIA 분석 [어보르 랩], Mab S1.1을 사용한 preS1 에피토프에 대해 규정된 엘사(ELISA)분석에 의해 분석되고, 이때 Mab S1.1은 미소적정 플레이트 [면역 플레이트 I; 지브코유럽]의 웰 위에 코우팅되고 시험 샘플로 항온 처리되었다. 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 세척한 후에, 반응 입자의 포획은 면역형광 및 관련된 기술, W. Knapp 일행, eds., Elsevier, Amsterdam (1978)에서 Wilson 및 Nakane (1978)의 방법에 의해 양고추냉이 퍼옥시다제에 커플링된 Mab S1.l로의 항온 처리에 의해 나타났다. 두 번째 항체 결합을 나타내기 위한 색의 발원은 색원체로서 오르토페닐렌 디아민에 의해서이다. 흡광도는 NJ 2000 [Analis, Ghent, Bolgium], 인터메드 면역해독기에서 620nm 를 참조 필터로 한 490nm에서 판독되었다.
항원 및 면역 블로트 프로필은 동일하였다. 미리스틸화되고 미리스틸화 되지 않은 단백질 모두를 설명하는 약 1.25g/cm3의 밀도에서 밴딩된 △Gly L 및 야생 타입 L 단백질 모두는 조 세포 추츨물에서 지방단백질 구조로 표현된다. CsCl 평형 구배의 정제된 물질의 수크로스 구배 속도 원심 분리는 비교할만한 물리적 매개변수를 가지는 지방단백질 구조를 함유하는 미리스틸화되고 미리스틸화 되지않은 L 단백질에 대해 동일한 침강 작용을 보여주었다.
[실시예 F.3]
잠재적인-O- 및 N-글리코실화 부위, 잠재적인 pHSA 결합부위 및 잠재적인 프로테아제 감도부위가 결핍된, 변형된 HBV L 단백질을 코딩하는 플라스미드의 작제
두 개의 효소 벡터의 구성의 윤곽 : 미리스틸화된 변형 L 단백질(L*)의 발현을 코딩하는 pRIT13192 및 미리스틸화되지않은 변형 L 단백질(△Gly L*)의 발현을 코딩하는 pRIT13193이 제15도 및 제16도에서 도시된다.
ATCC 39131로 기탁된 pRIT1O616은 Bg1Ⅱ로 소화되고, 가장 큰 단편은 이전에 BamHI로 소화된 pACYC177 레플리콘[Chang 및 Cohen, J. Bacteriol, 134:1141 (1978)]에 연결된다. 얻어진 중간체 플라스미드는 EcoRI에 의해 소화되고 pRIT1O633을 얻기 위해 다시 연결되며, 이것은 pACYC184 벡터가 삭제된 불완전한 HBV 게놈을 갖는다.
플라스미드 pRIT 12331은 pUC9의 EcoRI 및 Hind Ⅲ 제한부위사이에 삽입된 정지 코돈에 인접하고 벗어난 EcoRI 부위 및 ATG 코돈을 겹치는 NcoI 부위를 가지는 S 코딩 서열을 포함하는 681 bP NcoI-EcoRI 단편에 대해 정확한 배향으로 융합된 pRIT1O779 [Cabezon 일행의 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:6594-6598(1984)]로부터의 1500 bp Hind Ⅲ-NcoI ARG3 프로모터 단편을 함유하는 pUC9 [Amersham, U.K 및 Pharmacea, Sweden]이다.
pRIT10633은 BstEⅡ 및 XbaI 효소로 소화된다. BstEⅡ 확장이 클레나우 플리머라제에 의해 채워진, 전체 preS1-preS2 영역 및 S 영역의 N-말단서열을 포함하는 648 bp BstEⅡ-XbaI 단편은 정제되고 pUC12 [Amersham] 의 SmaI 및 XbaI 부위 사이에 삽입되었다. 결과 생성된 플라스미드는 pRIT13188이다.
플라스미드 pRIT13188는 BalI 및 BamHI로 처리되고 잔기 52-133의 아미노산 확장을 코딩하는 preS1 영역이 결실되었다 [아미노산 53 및 l32는 결실내에 포함되었다]. 큰 단편은 클레나우 폴리머라제로 처리되고 연결되어 BamHI 부위가 재형성된 플라스미드 pRIT13189가 되었다.
잔기 145에서 175로 확장된 preS 아미노산 영역에 상응하는 DNA는 BamHI 및 XbaI로의 pRIT13189 소화에 의해 결실되었다. 이 벡터는 하기 합성 어댑터 :
에 연결되고 S 유전자의 N-말단 부분을 함유하는 pRIT12331로부터의 NcoI-XbaI 단편에 연결되었다. 결과 플라스미드는 pRIT13190이다.
S 유전자의 C-말단 영역, 전사 ARG3 영역의 말단화 및 LEU2 효모 유전자는 pRIT13190의 XbaI 및 SalI 부위간의 pRIT12660으로부터의 4145 bp XbaI-SalI 단편의 삽입에 의해 첨가되었다. [pRIT12660은 1050 bp TDH 프로모터 단편의 조절에 의해 5' 및 1150 bp 단편 운반 ARG3 전사 터미네이터에 의해 3'를 플랭킹한 M 단백질의 281 아미노산에 대한 HBV DNA 유도된 코딩 서열로 구성되는 3050 bp 발현 카세트를 포함한다. pRIT12660은 동시 계류중인 미합중국 특허 출원 SN 009,325에서 상세히 설명된다]. 결과 플라스미드 pRIT13191이 얻어졌다.
L*및 △Gly L*단백질용 발현 카세트를 재구성하기 위해, L 단백질에 대한 N-말단 코딩 영역 또는 Gly L 단백질에 대한 N-말단 영역중 하나에 관련된 TDH3 프로모터를 pRIT13191에 삽입하였다.
1234 염기 쌍 EcoRI-BalI 단편은 미합중국 SN 009,325에서 상기된 L 단백질 코딩 서열을 함유한 pRIT12845로부터 정제되고 1227 bp Bg1Ⅱ-Ba1I 단편은 상기된 △Gly L 단백질 코딩 서열을 함유한 pRIT12979로부터 정제되었다.
각각의 단편을 pRIT13191로부터의 큰 SacI-BamHI 단편과 혼합시키고 나서 T4 폴리머라제로 처리시키고 연결시켰다. 결과 만들어진 플라스미드는 pRIT13220 및 pRIT13222로 지정되었다. pRIT13220 내에 존재하는 발현 카셋트내에 포함되는 코딩 서열은 preS1 서열로부터의 12-52의 아미노산 잔기, preS2 서열로부터의 133-145의 아미노산 잔기 및 표 A에서 지적된 전체 S 서열을 포함하였다. pRIT13222는 Gly 13 코돈(GGG)의 결실을 제외하고 pRIT13220와 같다.
최종 단계는 L*및 △Gly L*단백질 각각에 대한 각각의 발현 카셋트를 함유하는 ClaI-C1aI 단편의 pRIT13220 및 pRIT13222로부터 제조되고, 플라스미드 pRIT12845로부터 ClaI-ClaI 단편으로 그들을 연결시켜서 각각 플라스미드 pRIT13192 및 pRIT13193을 얻는 것이었다.
이들 후자 플라스미드는 에스. 세레비지애 균주 TCY1을 형질전환시키기위해 사용되어 LEU*균주 Y1139 및 Yl140 각각을 얻었다.
[실시예 F.4]
효모에서 L*및 △Gly L*의 방법
Y587 (L 단백질), 실시예 F.3의 Y1139 및 Y1140(L*및 △Gly L*각각) 및 Y724(대조표준물 에스. 세레비지애 균주, 삽입된 발현 카세트가 없음)로 부터의 조 효모 추출물을 SDS-PAGE 및 S-특이 Mab HBsI 또는 Mab S1.1 으로 면역 블로트 검출에 적용시켰다. Y1139 및 Y1140 추출물은 preS1 및 S 규정 항체에 의해 특별히 인식되는, 약 33 및 30Kd의 추정된 분자량의 두개의 밴드를 보여주었다.
엔도글리코시다제 H [뉴우 잉글랜드 뉴클레어 또는 보에린거] 또는 글리코펩시다제 F [보에린거]로 추출물을 처리시킴으로써 33Kd 밴드가 사라지고 30Kd 밴드가 증가하였다. 이것은 33Kd 밴드가 한 개의 N-연결된 고 만노즈 타입의 글리칸을 함유하는 실시예 F.3의 L*및 △Gly L*단백질의 글리코실화 형태를 나타낸다.
3H 미리스트산으로 세로 배양물을 라벨링시키고나서, SDS-PAGE에 의해 세초 추출, 단백질 블로팅 및 플루오로그래피 또는 면역 검출에 의해 분석시킴으로써 30 kd 밴드에서 3H-라벨의 강한 존재 및 Y1139 추출물로부터 유도된 33 kd에서 3H-라벨의 약한 혼입을 보여주었다. 이들 밴드에서 3H 존재는 히디록실아민 처리에 견디었다. 3H-라벨이 혼입되지 않으면 Y1140 추출물로부터의 상응하는 단백질 밴드가 관찰되었다. 이것은 Y1139 세포에서 표현되는 L*단백질은 효모 N-머리스틸트랜스퍼라제용 기질로 공급되고 Y1140 Y1140의 Gly L*단백질에서 Gly 13 잔기의 삭제는 단백질의 미리스토일화를 막음을 보여준다.
수크로즈 속도 구배 원심분리 및 CsCl 평형에 의한 및 Y1140으로부터의 추출물의 분석은 추출물내의 지방단백질입자의 존재를 가리켰다.
[실시예 F.5]
S 단백질 발현 카셋트의 통합 복사물을 함유하는 효모 균주 Y1088 및 Y1295
게놈에서 통합된 S 발현 카셋트의 몇몇 복사물을 정착시키는 효모 균주가 작제되었다.
A. 효모 균주 Y1088
S 단백질용 발현 카셋트 (TDH3 프로모터 -S 단백질코딩 서열-ARG3 말단화 영역)을 함유하는 동시 계류중인 미합중국 특허 출원 SN 368,401에 기술된 Ty 기재된 선형 벡터 pRIT13133-L 을 동시 계류중인 미합중국 특허 출원 SN 368,401에서 기술된 에스. 세레비지애에 균주 10S69d (ura3, leu2, trpl, gall, CirO)의 메이팅 타입(mating type) 모두를 형질전환시키기 위해 사용하였다. 그들의 게놈내에 통합된 몇몇 벡터 복사를 함유하는 상이한 반수체(haploid) 형질 전환체는 반대 메이팅 타입의 반수체 균주와 교배되었다. S DNA 단편 프로브를 사용한 분리물로부터 단리된 게놈의 서어던 블로트 분석은 4분 염색체 분석에서 벡터 단편의 2/2분리를 보여준다. 벡터 pRIT13133-L의 5-7복사를 포함하는, 상기 수단에 의해 수득된 하나의 반수체 분리물은 Y957로 명명되었다. Y957의 TRP+복귀체가 얻어지고 Y1088로 명명되었다.
B. 효모 균주 Y1295
동시 계류중인 미합중국 특허 출원 SN 368,401에서 기술된 Ty 기재된 선형 벡터 pRIT13034-L은 pRIT13133-L과 동일한 S 단백질용 발현 카셋트를 함유한다. pRIT13034-L은 CUP1S또는 CUP1△ 수용체 균주에서 사용될 수 있는 부가의 마아커인 CUP1 유전자를 함유한다.
두 개의 cup1△ 에스. 세레비지애 반수체 균주(유전자의 단일 복사를 함유하는 균주내에서 분열된 CUP1 유전자)는 이러한 Ty 선형 벡터에 대한 수용체 효모 균주로 바람직하다. 이들 균주는 각각의 게놈 : EJ cup1△3d (ura3, leu2, trp1, gal1△, cup1△, α) 및 EJ cupl△7b (ura3, trp1, gal1△, cup1△, α)을 가지고 동시계류중인 미합중국 특허 출원 SN 368,401에서 기술된다.
S 단백질용 발현 카셋트를 함유하는 Ty 기재된 선형 벡터 pRIT13034-L은 에스. 세레비지애 균주 EJ cup1△3d 및 EJ cup1△7b를 형질 전환시키기 위해 사용되었다. URA3 형질전환체가 분리되고 구리 독성에 대한 내성을 위해 스크리닝되었다. 더욱더 내성의 형질전환체는 통합된 벡터의 2-5 복사를 포함하기 위해 나타났다. LEU-T게-반수체 분리물의 선택 및 이들 균주 사이의 고유의 유전자 교차는 S 발현 카셋트의 4-5 복사를 함유하는 반수체 균주가 되었다. 이 균주의 TRD+복귀체는 Y1295로 명명되었다.
[실시예 F.6]
S 및 L 항원을 동시에 표현하는 효모 균주의 작제
효모 플라스미드 pRIT12845(L 단백질), pRIT12979(△Gly L 단백질, 실시예 F.1), pRIT13192(L*단백질, 실시예 F.3), pRIT13193(△Gly L*단백질, 실시예 F.3) 및 pRIT12914(삽입된 헤파티티스 유전자가 없음)를 LEU+로 효모 균주 Y1088을 형질전환시키기 위해 사용하였다. 얻어진 결과의 효모 균주는 각각 Y1301(S, L), Y1302(S, △Gly L), Y1142(S, L*), Y1261(S, △Gly L*) 및 Y1141(S 단백질만을 발현하는 대조표준물 균주) 각각으로 지정되었다.
유사하게, pRIT12845, pRIT12979, pRIT13192, pRIT13193 및 pRIT12377(삽입된 헤파티티스 유전자 없음)은 효모 균주 Y1295로 도입되었다. 얻어진 결과 효모 균주는 Y1304(S, L), Y1305(S, △Gly L), Y1306(S, L*), Y1307(S, △Gly L*) 및 Y1308(S 단백질만을 발현하는 대조표준물 균주 각각으로 지정되었다.
S 및 L 단백질의 동시 발현은 조 세포 추출물의 면역 블로트 분석에 의해 설명되었다. S 에피토프에 대해 특이한 Mab HBs1과 블로트의 반응은 상기된 균주의 각각의 추출물에서 S 단백질에 대해 기대된 위치에서 약 23kd 이동의 추정된 분자량의 밴드를 나타내었다.
Y1301, Y1302, Y1304 및 Y1305 로부터의 추출물은 실시예 F.2 및 미합중국 출원 SN 009,325에서 이미 기술된 L 단백질의 비-글리코실화 및 글리코실화 형태처럼 이동된 23kd 밴드, 38kd 및 45kd의 밴드에 덧붙여저 보여졌다. 엔도글리코시다제 H와 추출물의 처리는 밴드를 41kd 밴드로 전환시키는 반면, 23kd 및 38kd 밴드는 수행되지 않았다.
Y1142, Y1261, Y1306 및 Y1307 로부터의 추출물은 실시예 F.4에서 기술된 L*및 Gly L*단백질의 비-글리코실화 및 글리코실화 형태처럼 이동된 30kd 및 33kd의 밴드 23kd 밴드에 덧붙여져 보여졌다. 엔도글리코다제 H와 추출물의 처리는 실시예 F.4에서 기술된 결과와 동일한 30kd 밴드로 33kd 밴드를 전환시켰다.
3H 미리스트산으로 세포의 라벨링 및 SDS-PAGE에 의한 추출물의 분석후의 면역블로트 및 플루오토그래피는 45kd (Y1301 및 Y1304 로부터의 추출물) 및 33kd (Y1142 및 Y1306 으로부터의 추출물)단백질 밴드의 단지 소량과 38kd (Y1301 및 Y1304 로부터의 추출물) 및 30kd 밴드 (Y1142 및 Y1306 으로부터의 추출물)에서 내성의 3H-라벨을 히드록실아민 처리시킴을 설명하였다. Y1302, Y1305, Y1261 및 Y1307 로부터의 추출물에서 상응하는 밴드는 검출할 수 있는3H-라벨을 포함하지 않았다.
L 및 Gly L 단백질의 38kd 및 45kd 형태는 preS1-특이 Mab의 S1.1 및 MA18/7 [W. H. Gerlich, University of Gottingen, FRG], preS2-특이 Mab의 S2.4, S2.5, S2.7, S2.8, S2.9 및 S2.10 [Smith Kline Biologico1s]에 의한 면역블로트에서 인식된다. L*및 △Gly L*단백질의 30kd 및 33kd 형태는 Mab S1.1 (아미노 서열 12-32에서 존재하는 에피토프를 인식) 및 MA18/7 (아미노산 서열 133-145에서 존재하는 에피토프를 인식)에 의해 인식된다. 모노클론 MA18/7은 간 세포 막에 대한 비리온의 결합을 억제하는 것으로 보고된다 [Pontisso P. 일행의 바이러스학, 173 : 522-530(1989)]. L*및 △Gly L*단백질의 30kd 및 33kd 형태는 ELISA 분석에서 펩타이드 120-145와 반응하지 않는 Mab의 S2.4, S2.8, S2.9 또는 아미노산 120-137에로 국부화된 에피토프를 가정적으로 인식하는 Mab의 S2.7 및 S2.10에 의해 인식되지 않는다. 모노클론 F 32-25(M-A Petit, INSERM Unite'131, Clamart, France로부터 얻어짐)은 엘사 분석에 의해 보여진 것처럼 균주 Y1307로부터 정제된 입자에 결합되었으나 S 입자에는 결합되지 않았다. 이 모노클론은 HepG2 헤파토마 세포(Neurath 일행의 세포 46 : 429-436,1986)에 대한 바이러스의 결합에 관여하기 위해 보여진 펩타이드 서열(Petit M-A 일행의 Molec. Immunol.,26 : 531-537,1989)을 인식한다. 게다가, (S. L*)입자는 Hep G2 헤파토마 세포에 결합되고 이 결합 및 HB 바이러스 입자의 결합은 모노클론 F35.15(Petit M-A 일행. The 1990 Tntl. Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease, Abstract 105. Houston, U.S.A, Apr14-8,1990)에 의해 예방될 수 있음이 밝혀진다. preS2 에피토프에 따르는 글리크실화 [Heerman 일행의 바이러스성 헤파티티스 및 간질환, Eds, A. Zuckerman 및 Alan R. Liss, Inc. New York PP. 697-700(1988)]를 인식하고 L 및 Gly L 단백질의 45kd 형과 반응하는 Mab Q19/10 [W.H. Gerlich, University of Gottingen, FRG]은 L*또는 GIy L*단백질의 30 또는 33kd 형과 반응하지 않는다. 이들 결과는 L*및 △Gly L*단백질에 도입된 아미노산 결실에 따른다.
[실시예 F.7]
S 및 L 또는 변형된 L 단백질의 동시-발현은 혼합된 서브유닛 조성의 입자의 형성을 초래한다.
실시예 F.6에서 기술된 각각의 균주로부터 만들어진 추출물은 제조자 지시[Abbott Lab.]에 따라 수행된 AUSRIA 분석에서 양성 결과에 의해 설명된 HBsAg 관련 항원성을 포함한다. 단, Y1141 및 Y1308로부터가 아닌 Y1301, Y1302, Y1142, Y1261, Y1304, Y1305, Y1306 및 Y1307로부터의 추출물은 ELlSA-S1.l 분석에서 양성 반응으로 주어진다. CsC1 평형 원심분리에 적용될 때, AUSRIA 및 ELlSA-S1.l 양성 물질은 1.2g/cm3의 밀도 근처에서 동시밴드화된다. 면역블로트는 AUSRIA 및 ELlSA-Sl.1 양성 피이크에서 공동밴딩된 조 추출물에서 밝혀진 단백질종을 보여주는 항원성 프로필로 확신되었다. CSC1 평형 구배로부터 유도된 분석된 피이크 분획의 수크로즈 속도 구배 원심분리는 AUSRIA, ELlSA-S1.l 및 면역블로트에 의해 측정된 S 및 L 단백질 또는 변형된 L 단백질의 공-침강을 보여주었다. 이것은 S 및 L 또는 변형된 L 단백질이 지방 단백질 입자로 어셈블리됨을 설명한다.
Mab S1.l 과 면역침전 반응은 S 및 L 또는 변형된 L 단백질이 물리적 실재, 즉 혼합된 서브유닛 조성의 입자로 연합됨을 설명하기 위해 사용되었다. 추출물은 S 및 L 또는 변형된 L 단백질 단독 또는 함께 표현하는 효모 균주, 예컨대 Y1139(L*단백질, 실시예 F.3), Y1141(S 단백질, 실시예 F.6) 및 Y1142(S 및 L*단백질, 실시예 F.6)으로부터 만들어졌다. CSC1 밴딩에 의한 입자의 준-정제 및 피이크 분획의 투석 후에, 입자를 Mab S1.1 과 면역 침전 반응에 적용시켰다. Y1139 및 Y1141로부터 입자의 혼합물은 부가 대조표준물로 사용되었다. L*단백질은 각각의 경우에 면역 침전되었다. L*단백질과 S 단백질의 공침전은 오직 Y1142로부터 유도된 입자와의 반응으로부터 관찰되었다.
동일한 결과는 S 및 L 또는 변형된 L 단백질 (Y1301, Y1302, Y1261, Y1304, Y1305, Y1306, Y1307)을 동시에 발현시키는 다른 효모 균주로 얻어졌다.
[실시예 F.8]
변형된 L 단백질을 함유하는 입자의 pHSA 결합 및 안정성
L*및 G1y L*단백질의 효모 프로테아제에 의한 단백질 분해에 대한 감도는 37℃에서 4시간동안 또는 4℃에서 65시간동안 Y1142 및 Y1161의 조세포 추출물을 항온처리시킴으로 분석되었다.
Y1301 및 Y1302의 추출물은 L 및 △Gly L 단백질의 비교 공급원으로 제공되었다. 항온처리 전 또는 후의 면역 블로트에 의한 추출물의 분석은 항온처리후에 L 및 △Gly L 단백질의 거의 완전히 사라짐을 보여주는 한편 L*및 △Gly L*단백질은 쉽게 검출될 수 있었다.
균주 Y1306 및 Y1307 로부터의 입자의 정제된 제제는 37℃에서 7일동안 항온처리되고 SDS-PAGE 및은 염색에 의해 시험된 결과, 폴리펩타이드를 드러냈다. L*또는 S 폴리펩타이드의 검출할 수 있는 분해가 관찰되지 않았다.
Cscl 밴딩에 의해 Y1142로부터 유도된 입자는 Pontisso 일행의 J. Virol. Methods 6, 151-159(1983)에 의해 기술된 pHSA 결합 분석의 변형에 의해 시행되었다. 마이크로플레이트 (면역플레이트 I; Nunc, Gibco Europe)는 글루타르알데히드 중합화된 인간의 혈청 알부민 (PBS 내의 5ug/ml pHSA, 2시간 37℃)에 의해 코우팅되고 플레이트 위의 비-특이 단백질 결합 부위는 1% 소의 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS로 항온처리 (1시간,37℃)시킴으로 포화되었다. 0.2% BSA 함유 PBS 내의 시험 샘플의 일련의 희석은 pHSA 코우팅된 플레이트와 상호적용하기를 허영하고 결합된 입자는 0.2% BSA 함유 PBS에서 양고추냉이 퍼옥시다제 커플링된 항-S 모노클론 항체(RF 1, H. C. Thomas, Royal Free Hospital, London)의 제한되지 않은 농도로 검출(1 시간, 37℃) 되고 기질로서 오르토페닐렌디아민 및 H2O2으로 나타났다. 항온처리 동안 플레이트는 0.05% 트윈 20함유 0.15M NaCl로 세척되었다.
Y1141로부터 유도된 입자는 음성 대조 표준물로 제공되고 pRIT12660 함유 균주 lOS44C cir°로부터의 정제된 입자는 양성 대조 표준물로 제공되었다. pHSA 결합은 pRIT12660 을 정착시키는 10S44C cir°로부터 유도된 입자에 비교해서 Y1142 유도입자(2% 잔류 활성)에서 크게 감소되었다.
pHSA 결합은 또한 균주 Y1306 및 Y1307로부터의 정제된 입자 제제로 검출될 수 없었다.
[실시예 F.9]
L*단백질 함유 입자의 면역 유전성
본 발명의 (S, L*) 입자의 면역 유전성은 Balb/c 생쥐에서 연구되었다. Y1142(S,L*) 또는 Y1141(S)로부터 유도된 입자는 Csc1 밴딩에 의해 부분적으로 정제되고 Al(OH)3상에서 흡수되었다. 8개 생쥐 군을 0 및 30 일에 각각의 항원 제제의 50 또는 5μg 전체 단백질 (AUSRIA 분석에 의한 1 또는 0.1μg 항원에 상응하는)로 주입시켰다. 생쥐의 출혈은 45일 동안 행해졌고 상이한 분석이 각각의 혈청에서 수행되었다. 항-HBs 항체는 AusAb 키트(Abbott, USA)로 측정되고 홀린거 일반식 [Hollinger 일행의 바이러스성 헤파티티스 Szum ness 일행 Franklin Institafe Press, Philadelphia PP-451-466(1982)] 을 사용하여 mIU/ml로 표현되었다.
항-preS 항체는 선택된 합성 펩타이드 (펩타이드 12-32, 펩타이드 32-47 및 펩타이드 120-145)는 마이크로플레이트(면역 플레이트 I; Nunc, Gibco Europe)의 폴리스티렌 벽으로 흡수되는 직접 엘사 분석을 사용하여 측정되었다. 흡수는 단위 벽 당 100μl 인 0.05M Na2CO3/NaHCO3완충제내에서 0.5μg/ml 펩타이드의 용액으로부터 4℃에서 밤새도록 일어났다. 플레이트위의 비-특이 부위는 37℃에서 1시간동안 PBS 내에서 5% 태아의 소 혈청 25 μl로 항온 처리시킴으로 블록되었다.
0.05% 트윈 20.1% 태아의 소 혈청 함유 PBS 내에서 생쥐 혈청의 2배 일련 희석은(웰당 100μl) 37℃에서 2시간동안 펩타이드-코우팅된 플레이트와의 반응을 허여하였다. 세척후에, 결합된 항체는 양(sheep)으로부터의 바이오티닐화된 항-생쥐 Ig (Amersham,0.05% 트윈 20.1% 태아의 소 혈청 함유 PBS 내에서 500 배 희석, 웰당 100μl,37℃에서 1시간동안 항온 처리)에 의해 검출되고나서, 웰당 100μl, 37℃에서 1시간동안 스트렙타비딘-바이오티닐화된 양고추냉이 퍼옥시다제 복합물(Amersham,0.05%트윈 20.1% 태아의 소 혈청 함유 PBS 내에서 1000배 희석)로 검출되었다.
항온 처리동안, 플레이트를 0.05% 트윈 20, 0.15M NaCl로 세척하였다. 색원체로서 오르토-페닐렌디아민 및 H2O2(웰당 100μl, pH6.0,0.1M 인산 칼슘 완충제 10ml 내의 4mg 오르토-페닐렌디아민 및 15μl H2O)에 의해 최종으로 인식되었다. 반응은 1N H2SO425μl의 부가에 의해 20분후에 정지되고 인터메드 면역 해독기, NJ 2000, Analis 로 490nm에서 흡수됨이 측정되었다. 각각의 혈청에 대한 역가는 1.00의 광학 밀도로 주어지는 최고 희석의 반비례로 계산되었다.
표 7은 기하학적 평균 역가로 표현된 Balb/c 생쥐로 유도된 각각의 항체 역가를 보여준다.
(*) 역가는 1.0의 OD에 대한 역전된 희석으로 표현되었다.
균주 Y1307(S, △Gly L ) 또는 균주 RIT4376 [Derre J 일행의 Postgrad. Med. J. 63,(suppl.2),73-81(1987)]은 Al(OH)로 흡수되고 0 및 30일 동안 10Balb/c 생쥐의 군으로 주입되었다. 생쥐는 45일 동안 출현하고 혼주된 면역 혈청을 상기된 항-S 및 항-preS 항체의 존재에 대해 시험하였다. 표 8은 Balb/c 생쥐에서 유도된 각각의 항체 역가를 보여준다.
(*) 역가는 분석에서 1.0의 OD로 주어지는, 역전된 희석으로 표현된다.
[실시예 F.10]
Ty1 매개된 동종 재조합에 의한 에스. 세레비지애 게놈에서 L 발현 카셋트의 통합
본 발명의 L 및 S 단백질 발현 카셋트를 숙주 게놈에 통합시켜 유전학적으로 안정한 균주를 제공하고 에스. 세레비지애 벡터를 기준으로 2μ으로 일반적으로 보여지는 플라스미드 없는 세포 20-30%를 피하는 것이 바람직하다.
플라스미드 pRIT13459 및 pRIT13460은 동시계류중인 미합중국 특허 출원 SN 009,325 및 Jacob 일행 (Gene 80 : 279-291,1989) 에서 벡터 pRIT13009-p에 대해 기술된 것처럼 작제되었다. 벡터 pCV9(Petes 일행, 세포 19 : 765-1980)로부터의 2200bp XhoI-SalI 단편으로 분리된 LEU2 유전자는 원래의 단편이 놓이는 pRIT12927 위의 Ty1 원소의 SalI 부위사이에 삽입되어 pRIT13144로 주어진다. 실시예 F.3에서 기술된 pRIT13220으로부터의 L 발현 카셋트 합유 3050bp Hind Ⅲ-KpnI 단편균주 XL1-블루를 사용하고 pRIT13144 위에 남아있는 T4 폴리머라제로 처리된 SalI 부위로 연결되었다. XL1-블루는, Hanahan D의 J.Mo1. Bio., 166 : 557-580(1983)에 의해 기술되고 미합중국 캘리포니아주 라졸라시 노오스토오피 파인 로오드 11099 스트라타겐으로부터 상업적으로 구입가능하다. HindⅢ-DpnI 카셋트 단편의 삽입의 배향 모두가 얻어지고; pRIT13459는 LEU2 유전자에 대한 카셋트 ARG3 터미네이터 영역 근위를 포함하고 pRIT13460은 LEU2 유전자에 대한 카셋트 TDH3 프로모터 근위를 포함한다.
pRIT13459 및 pRIT13460 모두로부터의 약 7700bp의 큰 XhoI 단편은 1% 아가로스겔로부터 정제되고 Hinnen 일행의 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 1929,1978)에 의해 류신 독립체에 균주 EJ cupl△3d (상기 실시예 F.5를 보라)를 형질전환시키기 위해 사용되었다.
LEU 형질전환체는 양쪽 단편으로 얻어지고 각각의 열로부터의 12개의 콜로니들을 L 단백질 발현을 위한 웨스턴 블로팅 및 층수의 통합된 카셋트를 위한 서어던 블로팅에 의해 분석되었다. pRIT13459로부터의 단편으로 EJ cupl△3d를 형질전환시킴으로, 균주 Y1528은 Y1306과 동일한 L 발현 정도를 보여 주고 카셋트의 3-5 복사를 포함하는 것으로 보유되었다. pRIT13460으로부터의 단편으로 EJ cupl△3d를 형질전환시킴으로, 균주 Y1529는 Y1528과 유사한 특성을 가지는 것으로 보유되었다.
Y1528 및 Y1529는 균주 Y1295 및 그의 trp-모 균주 Y1215(상기 실시예 F.5를 보라) 및 균주 Y1367과 메이팅되어 Y1528 x Y1295=Y1586, Y1528 x Y1215=Y1587, Y1528 x Y1367=Y1588, Y1529 x Y1295=Y1589, Y1529 x Y1215=Y1590, Y1529 x Y1367=Y1591, 같은 이배체를 형성하였다. 균주 Y1367은 α, Leu2, trpl 이고, 균주 Y1295 같은 동일한 S-단백질 카셋트의 6-8 복사를 포함하고 실시예 F.5에서 Y1295의 구성에서 기술된 방법 및 균주를 사용하여 얻어졌다.
상기된 이배체 균주는 상기된 방법 및 시약, 보다 특별하게 실시예 F.2 및 F.6에서 기술된 방법 및 시약을 사용하여 에피토프 규정 ELISA 시험, AUSRIA 분석 및 웨스턴 블로팅에 의해 입자에서 L 및 S 폴리펩타이드의 비 및 표면 향원 발현 정도에 대해 스크리닝된다. 통합된 발현 카셋트의 수 및 안정성은 서어던 블로팅에 의해 측정된다. 만일 원한다면, 이배체 균주는 하프로이드 분리물을 얻기 위해 홀씨형성되고나서 상기된 발현 및 유전자 안정성에 대해 스크리닝될 수 있다.
pRIT13222 및 pRlT13144으로부터의 3050bp HindⅢ-KpnI 단편의 삽입 및 상기된 과정이 수행되어 △GIy L 발현 카셋트를 가지는 에스. 세레비지애 균주 및 S,△Gly L 입자를 발현하는 균주를 얻을 수 있다.
또 다른 실시양태에서, L 발현 카셋트는 pRIT13134-p [Jacob 일행의 Gene 80 : 279-291(1989)]와 유사한 벡터위에 삽입되고 pRIT12927의 Ty1 요소내에 삽입된 선택적인 마아커로서 URA3 및 cupl 유전자를 포함한다. 그러한 벡터는 상기 요소와 약 6500bp의 Bg1Ⅲ 단편이 URA 형질 전환체에 대한 선택에 의해 적절한 효모 숙주로 통합되고 형질전환됨으로써 회수될 수 있는 pRIT13501로 확인된다. 형질전환에 따라서, 총수의 통합된 카셋트는 동시계류중인 미합중국 특허 출원 SN 07/368,401에서 공개된 구리 내성의 증가된 정도에 대한 선택에 의해 유리하게 증가될 수 있다.
[실시예 F.11]
ad 및 ay 아형 결정체로 S, L 혼합 입자의 발현
ay 아형의 L 단백질용 발현 카셋트를 가지는 통합 벡터는 ay 아형의 S-유전자로부터의 상응 단편과 ARG 전사 터미네이터의 일부분 및 ad 아형 S 단백질의 C-말단 부분을 코딩하는 XbaI-SacⅡ 단편을 교환함으로써 작제될 수 있었다. 플라스미드 pRIT13459(실시예 F.10)은 XbaI 및 SacⅡ 엔도뉴클레아제로 소화되고 가장 큰 단편은 1% 아가로스 겔로부터 정제되고 pRIT1O780으로부터 정제된 1000bp XbaI-ScaⅡ 단편으로 연결되어 pRIT13500을 얻었다. pRIT10780은 De Wilde 일행의 Develop. Biol. Standard,59 : 99-107, (1985)에서 공개된다.
pRIT13500 상의 L 코딩 서열은 XbaI 부위에 대한 ATG 코돈으로부터의 ad 특이성의 바이러스로부터 유도된 것과 동일한 서열을 가지는 DNA 및 말단화 코돈에 대한 XbaI 부위로부터의 ayw 특이성의 바이러스로부터 유도된 DNA로 구성된다. 발현된 L 폴리펩타이드는 ay 아형 결정체를 가질 것이다.
pRIT13500으로부터의 약 7700bp의 XhoI 단편은 L 폴리펩타이드가 ay 아형 및 ad 아형의 S 폴리펩타이드인 혼합된 입자를 발현하는 균주를 얻기 위해 상기된 방법에 의해 Y1295 및 Y1367 같은 균주와 메이팅된 결과 형질전환체 및 효모 게놈으로 통합될 수 있다.
상기 기술 및 실시예들은 예증적이고 본 발명을 제한하지 않는다. 예컨대, L 단백질에 대한 다양한 부가 변형은 백신 사용을 위한 적절한 조성물의 이들 변형된 L 단백질을 함유하는 혼합되거나 동종의 서브유닛 조정의 입자 및 변형된 L 단백질을 생산하기 위해 본 실시예에서 언급된 것에 덧붙여서, 여기서 만들어진 다양한 변형의 겸비 또는 예컨대, 부분적인 글리코실화가 만들어질 수 있다.
만들어진 부가적인 변형은 preS 서열의 재도입, 엔벨로프 유전자를 제외한 HBV 단백질 코딩 서열로부터 유도된 코딩 서열, 예컨대 HBV 코어 유전자로부터의 서열, 또는 다른 병원체로부터의 면역학적으로 중요한 아미노산 영역에 대한 코딩 서열의 도입을 포함할 수 있다. 부가의 공지된 벡터 성분은 특이 마아커 유전자, 프로모터 및 링커 서열 및 실시예에서 사용된 것과 유사한 것을 대체하기 위해 사용될 수 있다. 숙주 세포의 다른 타입이 사용될 수 있다. 이들 실시예에서 사용되는 숙주 세포, 벡터 및 성분은 예증적이고 당업자에 의해 변형 또는 다른 균주로 대체될 수 있다. 본 발명은 하기 특허 청구범위의 범주내의 모든 개선점 및 변형을 포함한다.
Claims (12)
- 아미노산 서열이 B형 간염 바이러스의 라이지(L) 단백질 (ad 또는 ay 아형)의 아미노산 서열의 일부로 하기와 같이 구성되는, 단백질 : (a) L단백질의 잔기 12-52, 잔기 133-145 및 잔기 175-400; 또는 (b) L 단백질의 잔기 12, 잔기 14-52, 잔기 133-145 및 잔기 175-400.
- 제1항에 따른 단백질의 다합체 어셈블리를 포함하는 입자.
- 제1항에 따른 단백질 및 B형 간염 표면 항원의 스몰(S) 단백질의 다합체 어셈블리를 포함하는 복합 입자.
- 제3항에 있어서, 상기 입자가 에스. 세레비지애 또는 에이치. 폴리모르파에 발현되는 형태로 존재하는 복합 입자.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, S 단백질은 ad 아형이고, 제4형에 따른 단백질은 ay 아형의 L 단백질로부터의 잔기로 이루어지거나, 또는 그 반대인 입자.
- 조절서열에 조작적으로 연결된, 제1항에 따른 단백질의 발현을 위한 DNA 코딩 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
- 제6항의 DNA 분자를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터.
- 제7항의 재조합 플라스미드 벡터로 형질전환된 효모 세포.
- 제8항에 있어서, 사카로마이세스, 한세눌라, 피치아, 캔디다, 클루이베로마이세스 및 스키조사카로마이세스로 구성된 효모 군 중에서 선택되는 세포.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, B형 간염 표면 항원의 S 단백질을 발현할 수 있는 재조합 DNA 벡터로 추가적으로 형질전환된 세포.
- 적절한 배양 매질에서 제8항 또는 제9항에 따른 세포를 배양한 다음, 세포 용균물 또는 상기 배양 매질의 추출물로부터 단백질을 분리시키는 것으로 이루어지는, 제1항에 따른 단백질을 생산하는 방법.
- 적절한 배양 매질에서 제10항의 세포를 배양한 다음, 세포 용균물 또는 상기 배양 매질로부터 혼합된 서브유닛 조성의 단백질 입자를 분리시키는 것으로 이루어지는, 제1항에 따른 단백질과 B형 간염 표면 항원 S 단백질을 동시적으로 생산하는 방법.
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