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CN105246914B - Fc区变体 - Google Patents

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CN105246914B CN201480031490.XA CN201480031490A CN105246914B CN 105246914 B CN105246914 B CN 105246914B CN 201480031490 A CN201480031490 A CN 201480031490A CN 105246914 B CN105246914 B CN 105246914B
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明发现了：包含抗体Fc区变体的多肽，与包含天然型IgG的Fc区的多肽相比，维持对FcγRIIb的结合活性，且减少对所有活性型FcγR、其中对FcγRIIa(R型)的结合活性，该抗体Fc区变体包含组合有EU编号第238位的氨基酸改变和其它特定的氨基酸改变的氨基酸序列。

Description

Fc区变体
技术领域
本发明涉及Fc区变体、包含该Fc区变体的多肽以及含有该多肽的药物组合物，所述Fc区变体通过在抗体的Fc区导入氨基酸改变，与包含天然型人IgG的Fc区的多肽相比时，可以维持对FcγRIIb的结合活性，同时降低对所有活性型FcγR的结合活性、特别是对FcγRIIa(R型)的结合活性。
背景技术
抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因此作为药物受到关注。其中，多数IgG型的抗体药物已经市场销售，现在仍在开发多数的抗体药物(非专利文献1和非专利文献2)。另一方面，作为可以适用于第二代抗体药物的技术开发了各种各样的技术，报道了使效应子功能、抗原结合能力、药代动力学、稳定性提高或使免疫原性风险降低的技术等(非专利文献3)。通常抗体药物的给药量非常高，因此难以制作皮下给药的制剂、制造成本高等作为课题被考虑。作为使抗体药物的给药量降低的方法，认为有使抗体的药代动力学提高的方法、将抗体与抗原的亲和性提高的方法。
作为使抗体的药代动力学提高的方法，报道了进行恒定区的人工的氨基酸取代(非专利文献4和非专利文献5)。作为使抗原结合能力、抗原中和能增强的技术，报道了亲和力成熟技术(非专利文献6)，通过对可变区的CDR区等的氨基酸导入变异可以增强与抗原的结合活性。通过增强抗原结合能力可以使体外的生物活性提高、或可以降低给药量，并且还可以使体内(生物体内)的药效提高(非专利文献7)。
另一方面，每一抗体分子可以中和的抗原量依存于亲和性，通过增强亲和性能够以较少的抗体量中和抗原，可以利用各种方法增强抗体的亲和性(非专利文献6)。并且，如果通过抗体与抗原共价键合而使亲和性无限增大，则可以利用一个分子的抗体中和一个分子的抗原(二价抗体时，中和两个分子的抗原)。但是，迄今为止的方法中，一个分子的抗体只能与一个分子的抗原(二价抗体时与两个分子的抗原)结合。另一方面，最近有报道称：通过使用对抗原pH依赖性结合的抗原结合分子，一个分子的抗原结合分子可以与多个分子的抗原结合(专利文献1、非专利文献8)。pH依赖性抗原结合分子与抗原在血浆中的中性条件下牢固结合，在内体内的酸性条件下解离抗原。并且，解离抗原之后该抗原结合分子可以通过FcRn再循环到血浆中再次与抗原结合，因此一个pH依赖性抗原结合分子能够与多个的抗原重复结合。
并且，有报道称：为在中性条件下(pH7.4)增强FcRn结合而改变的pH依赖性抗原结合分子具有可以重复与抗原结合的效果和使抗原从血浆中消失的效果，因此通过给予这样的抗原结合分子，可以使抗原从血浆中去除(专利文献2)。包含通常的IgG抗体的Fc区的pH依赖性抗原结合分子在中性条件下几乎不与FcRn结合。因此，该抗原结合分子与抗原的复合物被摄入到细胞内，被认为主要是非特异性摄入。根据该报道，为在中性条件下(pH7.4)增强FcRn结合而改变的pH依赖性抗原结合分子，与包含通常的IgG抗体的Fc区的pH依赖性抗原结合分子相比，可以进一步加速其抗原消失(专利文献2)。
抗原的血浆中滞留性，与具有FcRn介导的再循环机制的抗体相比，非常短，因此，通过将抗原与在血浆中具有该再循环机制的(其结合为非pH依赖性)抗体结合，延长通常血浆中滞留性，提高血浆中的抗原浓度。例如，血浆中抗原具有多个种类的生理机能时，被认为：假设由于抗体的结合，一种类的生理活性被阻断，该抗原的血浆中浓度由于抗体的结合，也恶化其它的生理机能成为病因的症状。根据这样的观点，报道了下述的方法：有时优选使血浆中的抗原消失，以加速抗原的消失为目的，加入对增强与上述的FcRn结合的Fc区的改变，但是，迄今为止没有关于以该以外的方法加速抗原消失的方法的报道。
此外，在几种抗体药物中，报道了来自IgG与FcγR相互作用的副作用。例如，已知在给予了抗VEGF的抗体-贝伐珠单抗的患者组中，血栓栓塞症的频率增加(非专利文献9)。另外，在抗CD40配体的抗体的临床开发试验中也同样观察到了血栓栓塞症，使得临床试验被中止(非专利文献10)。虽然在血小板的细胞上表达作为活性型Fcγ受体的FcγRIIa (非专利文献11)，但通过使用动物模型等的其后的研究暗示了：所给予的各抗体均经由与血小板上的FcγRIIa的结合使血小板凝聚，其结果形成了血栓(非专利文献12、非专利文献13)。据报道：在作为自身免疫疾病之一的系统性红斑狼疮患者中，通过FcγRIIa依赖性的机制使血小板活化，血小板的活化与症状严重程度相关(非专利文献14)。
另外，根据迄今为止使用动物模型的研究，还报道了：抗体与多价抗原的免疫复合物经由活性型FcγR诱导过敏反应(非专利文献15)。
此外，报道了：经由活性型FcγR摄入多价抗原与抗体的免疫复合物，由此提高针对其抗原的抗体效价的产生(非专利文献16、非专利文献17)。其结果，暗示了：当为识别多价抗原的抗体药物时，可以容易产生针对抗体药物自身的抗体。如果产生针对抗体药物的抗体，则被认为其血液动力学恶化、或中和抗体使药物的效果减弱。
由此认为：通过将抗体与多价抗原结合，形成免疫复合物，通过其复合物与活性型FcγR相互作用，诱导各种副作用，这使抗体作为药物的价值降低。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第WO2009/125825号；
专利文献2：国际公开第WO2011/122011号；
非专利文献
非专利文献1：Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice MReichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nat.Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078；
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发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴于上述情况作出的，其目的在于提供一种分子，该分子是通过在抗体的Fc区导入氨基酸改变，使抗原消失加速的同时，克服了来自对活性型FcγR的结合的缺陷。即，提供Fc区变体、包含该Fc区变体的多肽以及含有该多肽的药物组合物，所述Fc区变体与包含天然型IgG抗体的Fc区的多肽相比时，可以维持对FcγRIIb的结合活性，但降低对所有活性型FcγR的结合活性、其中对FcγRIIa (R型)的结合活性。
用于解决课题的手段
本发明人对Fc区变体、包含该Fc区变体的多肽进行了努力研究，所述Fc区变体通过在Fc区中导入氨基酸改变，与包含天然型IgG的Fc区的多肽相比时，可以维持对FcγRIIb的结合活性，同时降低对所有活性型FcγR、其中对FcγRIIa (R型)的结合活性。其结果，本发明人发现，通过在Fc区的EU编号第238位的氨基酸改变的Fc区变体中组合其它氨基酸改变，可以维持对FcγRIIb的结合活性，同时降低对所有活性型FcγR的结合活性、特别是对FcγRIIa (R型)的结合活性。
即，本发明涉及以下内容。
[1] Fc区变体，该Fc区变体包含Fc区的EU编号第238位的氨基酸、以及下述(a)～(k)的任一项所述的氨基酸改变，与天然型IgG的Fc区相比时，该Fc区变体对FcγRIIb的结合活性维持、且对所有活性型FcγR的结合活性减少，
(a) Fc区的EU编号第235位的氨基酸；
(b) Fc区的EU编号第237位的氨基酸；
(c) Fc区的EU编号第241位的氨基酸；
(d) Fc区的EU编号第268位的氨基酸；
(e) Fc区的EU编号第295位的氨基酸；
(f) Fc区的EU编号第296位的氨基酸；
(g) Fc区的EU编号第298位的氨基酸；
(h) Fc区的EU编号第323位的氨基酸；
(i) Fc区的EU编号第324位的氨基酸；
(j) Fc区的EU编号第330位的氨基酸；
(k) 选自(a)～(j)的至少2个氨基酸。
[2] 上述[1]所述的Fc区变体，其中，上述[1]的(k)中选择的至少2个氨基酸为下述(1)～(3)的任一项所述的氨基酸的组合：
(1) Fc区的EU编号第241位的氨基酸、第268位的氨基酸、第296位的氨基酸以及第324位的氨基酸；
(2) Fc区的EU编号第237位的氨基酸、第241位的氨基酸、第296位的氨基酸以及第330位的氨基酸；
(3) Fc区的EU编号第235位的氨基酸、第237位的氨基酸、第241位的氨基酸以及第296位的氨基酸。
[3] Fc区变体，其中，Fc区的EU编号第238位的氨基酸为Asp、且具有下述(a)～(k)的任一项所述的氨基酸，与天然型IgG的Fc区相比时，该Fc区变体对FcγRIIb的结合活性维持、且对所有活性型FcγR的结合活性减少，
(a) Fc区的EU编号第235位的氨基酸为Phe；
(b) Fc区的EU编号第237位的氨基酸为Gln或Asp；
(c) Fc区的EU编号第241位的氨基酸位Met或Leu；
(d) Fc区的EU编号第268位的氨基酸位Pro；
(e) Fc区的EU编号第295位的氨基酸位Met或Val；
(f) Fc区的EU编号第296位的氨基酸为Glu、His、Asn或Asp；
(g) Fc区的EU编号第298位的氨基酸为Ala或Met；
(h) Fc区的EU编号第323位的氨基酸为Ile；
(i) Fc区的EU编号第324位的氨基酸为Asn或His；
(j) Fc区的EU编号第330位的氨基酸为His或Tyr；
(k) 选自(a)～(j)的至少2个氨基酸。
[4] Fc区变体，其中，Fc区的EU编号第238位的氨基酸为Asp、且具有下述(1)～(3)的任一项所述的氨基酸：
(1) Fc区的EU编号第241位的氨基酸为Met、第268位的氨基酸为Pro、第296位的氨基酸为Glu以及第324位的氨基酸为His；
(2) Fc区的EU编号第237位的氨基酸为Gln或Asp、第241位的氨基酸为Met、第296位的氨基酸为Glu以及第330位的氨基酸为His；
(3) Fc区的EU编号第235位的氨基酸为Phe、第237位的氨基酸为Gln或Asp、第241位的氨基酸为Met以及第296位的氨基酸为Glu。
[5] Fc区变体，该Fc区变体包含Fc区的EU编号第238位的氨基酸和第271位的氨基酸、以及下述(a)～(h)的任一项所述的氨基酸改变，与天然型IgG的Fc区相比时，该Fc区变体对FcγRIIb的结合活性维持、且对所有活性型FcγR的结合活性减少，
(a) Fc区的EU编号第234位的氨基酸；
(b) Fc区的EU编号第235位的氨基酸；
(c) Fc区的EU编号第236位的氨基酸；
(d) Fc区的EU编号第237位的氨基酸；
(e) Fc区的EU编号第239位的氨基酸；
(f) Fc区的EU编号第265位的氨基酸；
(g) Fc区的EU编号第267位的氨基酸；
(h) Fc区的EU编号第297位的氨基酸。
[6] 上述[5]所述的Fc区变体，其中，上述氨基酸改变为下述(1)～(3)的任一项所述的氨基酸改变的组合：
(1) Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第238位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸、第268位的氨基酸以及第271位的氨基酸；
(2) Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第237位的氨基酸、第238位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸、第296位的氨基酸、第297位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第396位的氨基酸；
(3) Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第238位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸以及第296位的氨基酸。
[7] Fc区变体，其中，Fc区的EU编号第238位的氨基酸为Asp和第271位的氨基酸为Gly，且具有下述(a)～(h)的任一项所述的氨基酸，与天然型IgG的Fc区相比时，该Fc区变体对FcγRIIb的结合活性维持、且对所有活性型FcγR的结合活性减少，
(a) Fc区的EU编号第234位的氨基酸为Ala、His、Asn、Lys或Arg；
(b) Fc区的EU编号第235位的氨基酸为Ala；
(c) Fc区的EU编号第236位的氨基酸为Gln；
(d) Fc区的EU编号第237位的氨基酸为Arg或Lys；
(e) Fc区的EU编号第239位的氨基酸为Lys；
(f) Fc区的EU编号第265位的氨基酸为Lys、Asn、Arg、Ser或Val；
(g) Fc区的EU编号第267位的氨基酸为Lys、Arg或Tyr；
(h) Fc区的EU编号第297位的氨基酸为Ala。
[8] Fc区变体，其中，Fc区的EU编号第238位的氨基酸为Asp和第271位的氨基酸为Gly、且包含下述(1)～(3)的任一项所述的氨基酸：
(1) Fc区的EU编号第233位的氨基酸为Asp、第238位的氨基酸为Asp、第264位的氨基酸为Ile、第267位的氨基酸为Arg、第268位的氨基酸为Glu以及第271位的氨基酸为Gly；
(2) Fc区的EU编号第233位的氨基酸为Asp、第237位的氨基酸为Asp、第238位的氨基酸为Asp、第264位的氨基酸为Ile、第267位的氨基酸为Ala、第268位的氨基酸为Glu、第271位的氨基酸为Gly、第296位的氨基酸为Asp、第297位的氨基酸为Ala、第330位的氨基酸为Arg以及第396位的氨基酸为Met；
(3) Fc区的EU编号第233位的氨基酸为Asp、第238位的氨基酸为Asp、第264位的氨基酸为Ile、第267位的氨基酸为Arg、第268位的氨基酸为Pro、第271位的氨基酸为Gly以及第296位的氨基酸为Glu。
[9] 上述[1]～[8]的任一项所述的Fc区变体，其中，该Fc区变体进一步减少与补体的结合。
[10] 上述[9]所述的Fc区变体，其中，减少与补体的结合的Fc区变体包含Fc区的EU编号第322位的氨基酸改变，或者Fc区的EU编号第327位、第330位和第331位的氨基酸改变。
[11] 上述[9]所述的Fc区变体，其中，Fc区的EU编号第322位的氨基酸为Ala或Glu，或者，Fc区的EU编号第327位的氨基酸为Gly、第330位的氨基酸为Ser和第331位的氨基酸为Ser。
[12] Fc区变体，该Fc区变体包含Fc区的EU编号第238位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸的氨基酸改变，与天然型IgG的Fc区相比时，该Fc区变体对FcγRIIb的结合活性维持、且对所有活性型FcγR的结合活性减少。
[13] 上述[12]所述的Fc区变体，其中，进一步包含下述(a)～(e)的任一项所述的氨基酸改变：
(a) Fc区的EU编号第233位的氨基酸；
(b) Fc区的EU编号第237位的氨基酸；
(c) Fc区的EU编号第264位的氨基酸；
(d) Fc区的EU编号第267位的氨基酸；
(e) Fc区的EU编号第268位的氨基酸。
[14] 上述[13]所述的Fc区变体，其中，上述氨基酸改变为下述(1)～(4)的任一项所述的氨基酸改变的组合：
(1) Fc区的EU编号第237位的氨基酸、第238位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸；
(2) Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第237位的氨基酸、第238位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸；
(3) Fc区的EU编号第238位的氨基酸、第267位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸；
(4) Fc区的EU编号第238位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸。
[15] Fc区变体，其中，Fc区的EU编号第238位的氨基酸为Asp、第271位的氨基酸为Gly、第327位的氨基酸为Gly、第330位的氨基酸为Ser和第331位的氨基酸为Ser，与天然型IgG的Fc区相比时，该Fc区变体对FcγRIIb的结合活性维持、且对所有活性型FcγR的结合活性减少。
[16] 上述[15]所述的Fc区变体，其中，进一步具有下述(a)～(e)的任一项所述的氨基酸：
(a) Fc区的EU编号第233位的氨基酸为Asp；
(b) Fc区的EU编号第237位的氨基酸为Asp；
(c) Fc区的EU编号第264位的氨基酸为Ile；
(d) Fc区的EU编号第267位的氨基酸为Ala；
(e) Fc区的EU编号第268位的氨基酸为Asp或Glu。
[17] Fc区变体，其中，Fc区的EU编号第238位的氨基酸为Asp和第271位的氨基酸为Gly、且包含下述(1)～(4)的任一项所述的氨基酸：
(1) Fc区的EU编号第237位的氨基酸为Asp、第238位的氨基酸为Asp、第268位的氨基酸为Asp或Glu、第271位的氨基酸为Gly、第327位的氨基酸为Gly、第330位的氨基酸为Ser以及第331位的氨基酸为Ser；
(2) Fc区的EU编号第233位的氨基酸为Asp、第237位的氨基酸为Asp、第238位的氨基酸为Asp、第268位的氨基酸为Asp、第271位的氨基酸为Gly、第327位的氨基酸为Gly、第330位的氨基酸为Ser以及第331位的氨基酸为Ser；
(3) Fc区的EU编号第238位的氨基酸为Asp、第267位的氨基酸为Ala、第268位的氨基酸为Glu、第271位的氨基酸为Gly、第327位的氨基酸为Gly、第330位的氨基酸为Ser以及第331位的氨基酸为Ser；
(4) Fc区的EU编号第238位的氨基酸为Asp、第264位的氨基酸为Ile、第267位的氨基酸为Ala、第271位的氨基酸为Gly、第327位的氨基酸为Gly、第330位的氨基酸为Ser以及第331位的氨基酸为Ser。
[18] 上述[1]～[17]的任一项所述的Fc区变体，其中，对FcγRIIb的结合活性具有天然型IgG的Fc区的结合量的至少80％、对FcγRIIaR的结合活性为天然型IgG的Fc区的结合量的30％以下。
[19] 上述[1]～[18]的任一项所述的Fc区变体，其中，与包含天然型IgG的Fc区的多肽对FcγRIIb的结合活性相比的相对结合活性之比为至少0.75、对所有活性型FcγR的结合活性之比为0.2以下。
[20] 上述[19]所述的Fc区变体，其中，进一步与包含天然型IgG的Fc区的多肽对FcγRIIa R的结合活性相比的相对结合活性之比为0.1以下。
[21] 多肽，该多肽包含上述[1]～[20]的任一项所述的Fc区变体。
[22] 上述[21]所述的多肽，其中，上述包含Fc区变体的多肽为IgG抗体。
[23] 上述[21]所述的多肽，其中，上述包含Fc区变体的多肽为Fc融合蛋白质分子。
[24] 药物组合物，该药物组合物包含上述[21]～[23]的任一项所述的多肽和医学上可接受的载体。
[25] 上述[21]所述的多肽，其中，进一步包含取决于离子浓度条件对抗原的结合活性发生变化的抗原结合结构域。
[26] 上述[25]所述的多肽，其中，离子浓度条件为钙离子浓度条件。
[27] 上述[26]所述的多肽，其中，上述抗原结合结构域为在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域。
[28] 上述[25]～[27]的任一项所述的多肽，其中，离子浓度条件为pH条件。
[29] 上述[28]所述的多肽，其中，上述抗原结合结构域为在pH酸性区条件下对抗原的结合活性低于在pH中性区条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域。
[30] 上述[25]～[29]的任一项所述的多肽，其中，上述包含Fc区变体的多肽为IgG抗体。
[31] 上述[25]～[29]的任一项所述的多肽，其中，上述包含Fc区变体的多肽为Fc融合蛋白质分子。
[32] 药物组合物，该药物组合物包含上述[25]～[31]的任一项所述的多肽和医学上可接受的载体。
[33] 上述[32]所述的药物组合物，其中，药物用组合物用于促进抗原从血浆中消失，该抗原为与上述[25]～[31]的任一项所述的多肽的抗原结合结构域结合的血浆中的抗原。
[34] 上述[25]～[31]的任一项所述的多肽用于促进抗原从血浆中消失的应用，其中，该抗原为与该多肽的抗原结合结构域结合的血浆中的抗原。
[35] 通过在包含Fc区的多肽中将Fc区的EU编号第238位的氨基酸和选自Fc区的EU编号第235位的氨基酸、第237位的氨基酸、第241位的氨基酸、第268位的氨基酸、第295位的氨基酸、第296位的氨基酸、第298位的氨基酸、第323位的氨基酸、第324位的氨基酸以及第330位的氨基酸的至少一个氨基酸改变为其它氨基酸而使该多肽对FcγRIIb的结合活性维持、且降低对所有活性型FcγR的结合的方法。
[36] 上述[35]所述的方法，其中，Fc区的氨基酸的改变是EU编号第238位的氨基酸取代为Asp，第235位的氨基酸取代为Phe，第237位的氨基酸取代为Gln，第241位的氨基酸取代为Met或Leu，第268位的氨基酸取代为Pro，第295位的氨基酸取代为Met或Val，第296位的氨基酸取代为Glu、His、Asn或Asp，第298位的氨基酸取代为Ala或Met，第323位的氨基酸取代为Ile，第324位的氨基酸取代为Asn或His，第330位的氨基酸取代为His或Tyr。
[37] 通过将Fc区的EU编号第238位的氨基酸和选自Fc区的EU编号第235位的氨基酸、第237位的氨基酸、第241位的氨基酸、第268位的氨基酸、第295位的氨基酸、第296位的氨基酸、第298位的氨基酸、第323位的氨基酸、第324位的氨基酸以及第330位的氨基酸的至少一个氨基酸改变为其它氨基酸，来制备包含与改变前相比对FcγRIIb的结合活性维持、且对所有活性型FcγR的结合降低的Fc区变体的多肽的方法。
[38] 上述[37]所述的方法，其中，Fc区的氨基酸的改变是EU编号第238位的氨基酸取代为Asp，第235位的氨基酸取代为Phe，第237位的氨基酸取代为Gln，第241位的氨基酸取代为Met或Leu，第268位的氨基酸取代为Pro，第295位的氨基酸取代为Met或Val，第296位的氨基酸取代为Glu、His、Asn或Asp，第298位的氨基酸取代为Ala或Met，第323位的氨基酸取代为Ile，第324位的氨基酸取代为Asn或His，第330位的氨基酸取代为His或Tyr。
[39] 通过在包含Fc区的多肽中组合并导入对FcγRIIb的结合活性与天然型IgG的Fc区相比为2倍以上的氨基酸改变和使对所有FcγR的结合活性降低的氨基酸改变，使该多肽与天然型IgG相比相同程度地维持对FcγRIIb的结合活性、且降低对所有活性型FcγR的结合活性的方法。
[40] 上述[39]所述的方法，其中，对FcγRIIb的结合活性与天然型IgG的Fc区相比为2倍以上的氨基酸改变是表11中所记载的氨基酸改变。
[41] 上述[39]或[40]所述的方法，其中，使对所有FcγR的结合活性降低的氨基酸改变为选自Fc区的EU编号第234位的氨基酸、第235位的氨基酸、第236位的氨基酸、第237位的氨基酸、第239位的氨基酸、第265位的氨基酸、第267位的氨基酸以及第297位的氨基酸的至少一个氨基酸向其它氨基酸的改变。
[42] 上述[39]～[41]的任一项所述的方法，其中，Fc区的氨基酸的改变是：EU编号第234位的氨基酸取代为Ala、His、Asn、Lys或Arg，第235位的氨基酸取代为Ala，第236位的氨基酸取代为Gln，第237位的氨基酸取代为Arg或Lys，第239位的氨基酸取代为Lys，第265位的氨基酸取代为Lys、Asn、Arg、Ser或Val，第267位的氨基酸取代为Lys、Arg或Tyr，第297位的氨基酸取代为Ala。
[43] 上述[35]、[36]、和[39]～[42]的任一项所述的方法，其中，对FcγRIIb的结合活性维持天然型IgG的Fc区的结合量的至少80％、对FcγRIIaR的结合活性降低至天然型IgG的Fc区的结合量的30％以下。
[44] 上述[35]、[36]、和[39]～[43]的任一项所述的方法，其中，与包含天然型IgG的Fc区的多肽对FcγRIIb的结合活性相比的相对结合活性之比维持至少0.75、对所有活性型FcγR的结合活性之比降低至0.2以下。
[45] 上述[44]所述的方法，其中，进一步与包含天然型IgG的Fc区的多肽对FcγRIIa R的结合活性相比的相对结合活性之比降低至0.05以下。
[46] 通过组合并导入对FcγRIIb的结合活性与天然型IgG的Fc区相比为2倍以上的氨基酸改变和使对所有FcγR的结合活性降低的氨基酸改变，来制备包含与天然型IgG相比相同程度地维持对FcγRIIb的结合活性、且对所有活性型FcγR的结合活性降低的Fc区变体的多肽的方法。
[47] 上述[46]所述的方法，其中，对FcγRIIb的结合活性与天然型IgG的Fc区相比为2倍以上的氨基酸改变是表11中所记载的氨基酸改变。
[48] 上述[46]或[47]所述的方法，其中，使对所有FcγR的结合活性降低的氨基酸改变为选自Fc区的EU编号第234位的氨基酸、第235位的氨基酸、第236位的氨基酸、第237位的氨基酸、第239位的氨基酸、第265位的氨基酸、第267位的氨基酸以及第297位的氨基酸的至少一个氨基酸向其它氨基酸的改变。
[49] 上述[46]～[48]的任一项所述的方法，其中，Fc区的氨基酸的改变是：EU编号第234位的氨基酸取代为Ala、His、Asn、Lys或Arg，第235位的氨基酸取代为Ala，第236位的氨基酸取代为Gln，第237位的氨基酸取代为Arg或Lys，第239位的氨基酸取代为Lys，第265位的氨基酸取代为Lys、Asn、Arg、Ser或Val，第267位的氨基酸取代为Lys、Arg或Tyr，第297位的氨基酸取代为Ala。
[50] 上述[37]、[38]、和[46]～[49]的任一项所述的方法，其中，对FcγRIIb的结合活性维持天然型IgG的Fc区的结合量的至少80％、对所有活性型FcγR的结合活性降低至天然型IgG的Fc区的结合量的30％以下。
[51] 上述[37]、[38]、和[46]～[50]的任一项所述的方法，其中，与包含天然型IgG的Fc区的多肽对FcγRIIb的结合活性相比的相对结合活性之比维持至少0.75、对所有活性型FcγR的结合活性之比降低至0.2以下。
[52] 上述[51]所述的方法，其中，进一步与包含天然型IgG的Fc区的多肽对FcγRIIa R的结合活性相比的相对结合活性之比降低至0.1以下。
[53] 上述[37]、[38]、和[46]～[52]的任一项所述的方法，其中，进一步组合并导入与补体的结合减少的改变。
[54] 上述[53]所述的方法，其中，与补体的结合减少的改变为Fc区的EU编号第322位的氨基酸改变，或者Fc区的EU编号第327位、第330位和第331位的氨基酸改变。
[55] 上述[53]所述的方法，其中，与补体的结合减少的改变是：Fc区的EU编号第322位的氨基酸取代为Ala或Glu，或者Fc区的EU编号第327位的氨基酸取代为Gly、第330位的氨基酸取代为Ser以及第331位的氨基酸取代为Ser。
[56] 通过在包含Fc区的多肽中将Fc区的EU编号第238位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸，或者进一步将选自Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第237位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸以及第268位的氨基酸的至少一个氨基酸改变为其它氨基酸，使该多肽对FcγRIIb的结合活性维持、且降低对所有活性型FcγR的结合的方法。
[57] 上述[56]所述的方法，其中，Fc区的氨基酸的改变是：Fc区的EU编号第238位的氨基酸取代为Asp、第271位的氨基酸取代为Gly、第327位的氨基酸取代为Gly、第330位的氨基酸取代为Ser、第331位的氨基酸取代为Ser、第233位的氨基酸取代为Asp、第237位的氨基酸取代为Asp、第264位的氨基酸取代为Ile、第267位的氨基酸取代为Ala、第268位的氨基酸取代为Asp或Glu。
[58] 通过在包含Fc区的多肽中将Fc区的EU编号第238位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸，或者进一步将选自Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第237位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸以及第268位的氨基酸的至少一个氨基酸改变为其它氨基酸，来制备包含与改变前相比对FcγRIIb的结合活性维持、对所有活性型FcγR的结合降低、且与补体的结合降低的Fc区变体的多肽的方法。
[59] 上述[58]所述的方法，其中，Fc区的氨基酸的改变是：Fc区的EU编号第238位的氨基酸取代为Asp、第271位的氨基酸取代为Gly、第327位的氨基酸取代为Gly、第330位的氨基酸取代为Ser、第331位的氨基酸取代为Ser、第233位的氨基酸取代为Asp、第237位的氨基酸取代为Asp、第264位的氨基酸取代为Ile、第267位的氨基酸取代为Ala、第268位的氨基酸取代为Asp或Glu。
另外，本发明涉及：通过导入本发明的Fc区的氨基酸改变而维持该Fc区对FcγRIIb的结合活性且降低对所有活性型FcγR的结合活性、特别是对FcγRIIa(R型)的结合活性的方法。另外，本发明涉及：通过导入本发明的Fc区的氨基酸改变而抑制针对包含该Fc区的多肽的抗体的产生的方法。
并且，本发明涉及：通过导入有本发明的Fc区的氨基酸改变的Fc区变体；以及在血浆中以可溶型存在、对成为病因的抗原具有结合活性、包含取决于离子浓度条件该对抗原的结合活性发生变化的抗原结合结构域的多肽促进血浆中的该抗原消失的方法。另外，本发明涉及：导入有本发明的Fc区的氨基酸改变的Fc区变体；以及在血浆中以可溶型存在、对成为病因的抗原具有结合活性、包含取决于离子浓度条件该对抗原的结合活性发生变化的抗原结合结构域的多肽用于促进血浆中的该抗原消失的应用。
另外，本发明涉及包含本发明的多肽的免疫炎性疾病的治疗药或预防药。另外，本发明涉及免疫炎性疾病的治疗方法或预防方法，该方法包括将本发明的多肽给予对象的步骤。另外，本发明涉及用于本发明的免疫炎性疾病的治疗方法或预防方法的试剂盒，该试剂盒包含本发明的多肽。另外，本发明涉及本发明的多肽在制备免疫炎性疾病的治疗药或预防药中的应用。另外，本发明涉及用于本发明的免疫炎性疾病的治疗方法或预防方法的本发明的多肽。
另外，本发明涉及B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制剂，该活化抑制剂包含本发明的多肽。另外，本发明涉及B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制方法，该方法包括将本发明的多肽给予对象的步骤。另外，本发明涉及用于本发明的B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制方法的试剂盒，该试剂盒包含本发明的多肽。另外，本发明涉及本发明的多肽在制备B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制剂中的应用。另外，本发明涉及用于本发明的B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制方法的本发明的多肽。
另外，本发明涉及生物体所必需的蛋白质缺乏的疾病的治疗药，该治疗药包含本发明的多肽。另外，本发明涉及生物体所必需的蛋白质缺乏的疾病的治疗方法，该方法包括将本发明的多肽给予对象的步骤。另外，本发明涉及用于本发明的生物体所必需的蛋白质缺乏的疾病的治疗方法的试剂盒，该试剂盒包含本发明的多肽。另外，本发明涉及本发明的多肽在制备生物体所必需的蛋白质缺乏的疾病的治疗药中的应用。另外，本发明涉及用于本发明的生物体所必需的蛋白质缺乏的疾病的治疗方法的本发明的多肽。
另外，本发明涉及病毒的增殖抑制剂，该增殖抑制剂包含本发明的多肽。另外，本发明涉及病毒的增殖抑制方法，该方法包括将本发明的多肽给予对象的步骤。另外，本发明涉及用于本发明的病毒的增殖抑制方法的试剂盒，该试剂盒包含本发明的多肽。另外，本发明涉及本发明的多肽在制备病毒的增殖抑制剂中的应用。另外，本发明涉及用于本发明的病毒的增殖抑制方法的本发明的多肽。
发明效果
根据本发明提供了：与天然型IgG的Fc区相比，维持对FcγRIIb的结合活性，且对所有活性型FcγR的结合活性、特别是对FcγRIIa(R型)的结合活性降低的Fc区变体。通过使用包含该Fc区变体的多肽，使FcγRIIb介导的免疫复合物消失的性质维持在与天然型IgG相同程度，在该状态下，可以增强由FcγRIIb的ITIM的磷酸化介导的炎症性免疫反应的抑制性信号。另外，通过对Fc区赋予与FcγRIIb选择性地结合的性质，可使抗抗体的产生抑制成为可能。另外，通过降低与活性型FcγR的结合，可以避免血小板上的FcγRIIa与免疫复合物相互作用介导的血小板活化、活性型FcγR的交联而导致的树状细胞活化。
附图简述
[图1] 是显示确认人IgE与作为pH依赖性抗IgE抗体的克隆278 pH依赖性地形成较大的免疫复合物的凝胶过滤层析分析的结果的图。
[图2] 是显示人IgE单独给药组、人IgE＋克隆278抗体给药组、和人IgE＋Xolair抗体给药组的正常小鼠血浆中人IgE的浓度变化的图。
[图3] 是显示人IgE＋克隆278给药组和人IgE＋Xolair抗体给药组的正常小鼠血浆中抗体浓度变化的图。
[图4] 是显示人IgE单独给药组、人IgE＋278-IgG1抗体给药组、和人IgE＋278-F760抗体给药组的正常小鼠血浆中人IgE的浓度变化的图。
[图5] 是显示人IgE＋278-IgG1抗体给药组、和人IgE＋278-F760抗体给药组的正常小鼠抗体浓度变化的图。
[图6] 是以IL-8的表达量为指标评价基于Fc变体的DC活化的结果的图。
[图7] 是确认加入Fc变体时的洗涤血小板膜表面的CD62p (p-选择蛋白)的表达的图。实线表示添加5c8-F648且施加ADP刺激的情形，涂色区域表示添加5c8-P600且施加ADP刺激的情形。
[图8] 是确认加入Fc变体时的洗涤血小板膜表面的活性型整联蛋白(PAC-1)的表达的图。实线表示添加5c8-F648且施加ADP刺激的情形，涂色区域表示添加5c8-P600且施加ADP刺激的情形。
[图9] 是显示pH依赖性结合抗体重复与可溶型抗原结合的图。(i)抗体与可溶型抗原结合、(ii)通过胞饮作用非特异性地摄入到细胞内、(iii)在内体内抗体与FcRn结合、可溶型抗原自抗体解离、(iv)可溶型抗原移行至溶酶体被分解、(v)可溶型抗原解离的抗体通过FcRn再循环到血浆中、(vi)再循环的抗体可再次与可溶型抗原结合。
[图10] 是显示通过在中性条件下增强与FcRn的结合，进一步提高pH依赖性结合抗体可与抗原重复结合的效果的图。(i)抗体与可溶型抗原结合、(ii)经由FcRn、通过胞饮作用摄入到细胞内、(iii)在内体内可溶型抗原自抗体解离、(iv)可溶型抗原移行至溶酶体被分解、(v)可溶型抗原解离的抗体通过FcRn再循环到血浆中、(vi)再循环的抗体可再次与可溶型抗原结合。
[图11] 是显示使用Biacore获得的抗人IgA抗体在pH7.4和pH5.8、Ca2+1.2 mM和Ca2+ 3μM下与人IgA相互作用的传感图的图。
[图12] 是显示正常小鼠的GA2-IgG1和GA2-F1087的血浆中抗体浓度变化的图。
[图13] 是显示给予了hIgA单独、GA2-IgG1和GA2-F1087的正常小鼠的血浆中hIgA浓度变化的图。
[图14] 是显示将Fv4-mIgG1；对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合增强的Fv4-mIgG1的变体即Fv4-mIgG1-mF44；以及对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII结合进一步增强的Fv4-mIgG1的变体即Fv4-mIgG1-mF46给予正常小鼠时的该小鼠的血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[图15] 是显示将Fv4-mIgG1；对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合增强的Fv4-mIgG1的变体即Fv4-mIgG1-mF44；以及对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合进一步增强的Fv4-mIgG1的变体即Fv4-mIgG1-mF46给予FcγRIII缺陷小鼠时的该小鼠的血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[图16] 是显示将Fv4-mIgG1；对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合增强的Fv4-mIgG1的变体即Fv4-mIgG1-mF44；以及对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合进一步增强的Fv4-mIgG1的变体即Fv4-mIgG1-mF46给予Fc受体γ链缺陷小鼠时的该小鼠的血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[图17] 是显示将Fv4-mIgG1；对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合增强的Fv4-mIgG1的变体即Fv4-mIgG1-mF44；以及对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合进一步增强的Fv4-mIgG1的变体即Fv4-mIgG1-mF46给予FcγRIIb缺陷小鼠时的该小鼠的血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[图18] 是表示构成IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区的氨基酸残基与EU编号(本说明书中也称为EU INDEX)的关系的图。
[图19] 是示例识别单体抗原上所存在的2个以上表位、且适合形成大的免疫复合物的多特异性的pH/Ca依赖性抗体的、每1分子抗体使抗原消失的效率的图。
具体实施方式
本发明提供Fc区变体、包含该Fc区变体的多肽，所述Fc区变体与包含天然型IgG抗体的Fc区的多肽相比时，维持对FcγRIIb的结合活性，但可使对所有活性型FcγR的结合活性、其中对FcγRIIa (R型)的结合活性降低。
更具体而言，本发明提供：包含组合有EU编号第238位的氨基酸改变和其它特定的氨基酸改变的氨基酸序列的Fc区变体、以及包含该Fc区变体的多肽。并且，本发明提供：通过向Fc区导入该氨基酸改变，与包含天然型IgG抗体的Fc区的多肽相比，维持对FcγRIIb的结合活性，且降低对所有活性型FcγR的结合活性、其中对FcγRIIa (R型)的结合活性的方法；以及，本发明提供：通过向Fc区导入该氨基酸改变，来制备包含与包含天然型IgG抗体的Fc区的多肽相比维持对FcγRIIb的结合活性，且使对所有活性型FcγR的结合活性、其中对FcγRIIa (R型)的结合活性降低的Fc区变体的多肽的方法。而且，本发明提供：向Fc区导入有该氨基酸改变的Fc区变体；在血浆中以可溶型存在、对成为病因的抗原具有结合活性，且包含取决于离子浓度条件对该抗原的结合活性发生变化的抗原结合结构域的多肽；以及，通过该多肽促进血浆中的该抗原消失的方法。
本发明中的“多肽”通常指具有10个氨基酸左右以上长度的肽、以及蛋白。通常是来自生物的多肽，但没有特别限定，例如也可以是由人工设计的序列组成的多肽。另外，也可以是天然多肽或合成多肽、重组多肽等任意多肽。
作为本发明的多肽的优选例子可以举出抗体。作为更优选的例子可以举出天然型IgG、尤其是天然型人IgG。天然型IgG是指包含与天然存在的IgG相同的氨基酸序列，属于实质上由免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别的多肽。例如天然型人IgG是指天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3、天然型人IgG4等。天然型IgG也包含由此天然产生的突变体等。
抗体的轻链恒定区中存在IgK (Κ、κ链)、IgL1、IgL2、IgL3、IgL6、IgL7 (Lambda、λ链)型的恒定区，可以是任何的轻链恒定区。作为人IgK (Κ)恒定区和人IgL7 (Lambda)恒定区，由于基因多态性所致的多个同种异型序列记载于Sequences of proteins ofimmunological interest, NIH Publication No. 91-3242，本发明中可以是其中任意一种。并且，本发明中，轻链恒定区也可以是进行了氨基酸取代、添加、缺失、插入和/或修饰等改变的轻链恒定区。作为抗体的Fc区，例如存在IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM型的Fc区。本发明的抗体的Fc区可应用例如人IgG抗体的Fc区，优选人IgG1抗体的Fc区。作为本发明的Fc区，例如可以使用：来自天然型IgG的恒定区，具体而言，来自以天然型人IgG1为起源的恒定区(SEQ ID NO：31)、以天然型人IgG2为起源的恒定区(SEQ ID NO：32)、以天然型人IgG3为起源的恒定区(SEQ ID NO：33)、以天然型人IgG4为起源的恒定区(SEQ ID NO：34)的Fc区。图18显示天然型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的恒定区序列。天然型IgG的恒定区也包含由此天然产生的变体等。作为人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4抗体的恒定区，由于基因多态性所致的多个同种异型序列记载于Sequences of proteins ofimmunological interest, NIH Publication No. 91-3242，本发明中可以是其中任意一种。特别是，作为人IgG1的序列，EU编号第356-358位的氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。
Fcγ受体(本说明书中有时记为Fcγ受体、FcγR或FcgR)是指可与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区结合的受体，实质上也指由Fcγ受体基因编码的蛋白家族中的任何成员。对于人，该家族包括：包含同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；包含同种型FcγRIIa (包含同种异型H131 (H型)和R131 (R型) )、FcγRIIb (包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII (CD32)；和包含同种型FcγRIIIa (包含同种异型V158和F158)和FcγRIIIb (包含同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII (CD16)；以及任何未发现的人FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限于此。另外，对于人FcγRIIb，报道了作为剪接变体的FcγRIIb1和FcγRIIb2。另外，除此之外还报道了称为FcγRIIb3的剪接变体(J. Exp. Med, 1989, 170: 1369)。对于人FcγRIIb，除了这些剪接变体外，NCBI登录的NP_001002273.1、NP_001002274.1、NP_001002275.1、NP_001177757.1、NP_003992.3的剪接变体全部包含在内。另外，人FcγRIIb中包含已经报道的所有基因多态性，也包含FcγRIIb (Arthritis Rheum, 2003, 48: 3242-52, Hum MolGenet, 2005, 14: 2881-92、Arthritis Rheum. 2002 May; 46(5): 1242-54.)，另外，也包含今后报道的全部基因多态性。
FcγR包含来自人、小鼠、大鼠、兔和猴的FcγR，但并不限于此，可以来自任何生物体。小鼠FcγR类还包含FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、FcγRIII (CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限于此。这样的Fcγ受体的适合例子可以举出：人FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32)、FcγRIIB (CD32)、FcγRIIIA (CD16)和/或FcγRIIIB (CD16)。
FcγRI的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：35 (NM_000566.3)以及36 (NP_000557.1)；
FcγRIIA的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：37(BC020823.1)以及38 (AAH20823.1)；
FcγRIIB的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：39(BC146678.1)以及40 (AAI46679.1)；
FcγRIIIA的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：41(BC033678.1)以及42 (AAH33678.1)；以及
FcγRIIIB的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：43(BC128562.1)以及44 (AAI28563.1) (括号内表示RefSeq登录号)。
需要说明的是，FcγRIIa中存在FcγRIIa的第131位氨基酸被取代为组氨酸(H型)或精氨酸(R型)的2种类基因多态性(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990)。
包含FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI (CD64)以及包含同种型FcγRIIIa(包含同种异型V158和F158)的FcγRIII (CD16)，使和IgG的Fc部分结合的α链、与具有向细胞内转导活化信号的ITAM的共同γ链缔合。FcγRIIIb (包含同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)为GPI锚定蛋白。另一方面，包含同种型FcγRIIa (包含同种异型H131和R131)和FcγRIIc的FcγRII (CD32)的自身的胞质域中包含ITAM。这些受体在巨噬细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞等的许多免疫细胞中表达。这些受体由于与IgG的Fc部分结合而转导的活化信号，而促进巨噬细胞的吞噬能力、炎性细胞因子的产生、肥大细胞的脱顆粒、抗原呈递细胞的机能亢进。如上所述，具有转导活化信号的能力的Fcγ受体在本发明中也被称为活性型Fcγ受体。
另一方面，FcγRIIb (包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)的自身的胞质内域中包含转导抑制型信号的ITIM。B细胞中由于FcγRIIb与B细胞受体(BCR)的交联，来自BCR的活化信号被抑制，结果抑制BCR的抗体产生。巨噬细胞中由于FcγRIII与FcγRIIb的交联，抑制吞噬能力或炎性细胞因子的产生能力。如上所述，具有转导抑制化信号的能力的Fcγ受体在本发明中也被称为抑制型Fcγ受体。
本发明中“Fc区变体”是指，在未导入本发明的氨基酸改变的Fc区，本发明的至少一个氨基酸改变为其它氨基酸的Fc区。在此“至少一个氨基酸改变为其它氨基酸”包含导入了该氨基酸改变的Fc区、以及由与其相同的氨基酸序列构成的Fc区。
天然型IgG是指，包含与天然发现的IgG相同的氨基酸序列、属于通过免疫球蛋白γ基因实质上编码的抗体类别的多肽。例如，天然型人IgG是指，天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3、天然型人IgG4等。天然型IgG中也包含由此自然产生的突变体、导入有对FcγR的结合活性不产生实质性影响的改变的IgG等。
天然型IgG的Fc区是指，包含与以天然发现的IgG为起源的Fc区相同的氨基酸序列的Fc区。天然型IgG的重链恒定区示于图18 (SEQ ID NO：31～34)中，例如是指，以图18的天然型人IgG1为起源的重链恒定区中的Fc区、以天然型人IgG2为起源的重链恒定区中的Fc区、以天然型人IgG3为起源的重链恒定区中的Fc区、以天然型人IgG4为起源的重链恒定区中的Fc区。天然型IgG的Fc区中也包含由此自然产生的突变体、导入有对FcγR的结合活性不产生实质性影响的改变的Fc区等。
本发明中，本发明的包含Fc区变体的多肽或Fc区变体对各种FcγR的结合活性是否增强、或者结合活性是否维持或减少，例如可如本实施例或参考实施例所示，使用利用表面等离子体共振(SPR)现象的相互作用分析仪器BIACORE，根据由传感图谱的分析结果得到的解离常数(KD)的值是降低或是增加来判断，其中，所述传感图谱是以各种FcγR作为分析物，使其与将抗体固定到传感芯片上或者将抗体用A蛋白、L蛋白、A/G蛋白、G蛋白、抗λ链抗体、抗κ链抗体、抗原肽、抗原蛋白等捕获到传感芯片上的传感芯片相互作用而得到的。或者，也根据以下的值是降低或是增加来判断：以各种FcγR作为分析物，使其与传感芯片上固定的或者用A蛋白、L蛋白、A/G蛋白、G蛋白、抗λ链抗体、抗κ链抗体、抗原肽、抗原蛋白等捕获的传感芯片上的抗体相互作用，将相互作用前后的传感图谱上共振单位(RU)值的变化量除以将抗体固定或捕获在传感芯片上前后的共振单位(RU)的变化量而得的值。另外，可以使用将FcγR直接固定在传感芯片上或者经由抗标签抗体等固定的传感芯片，以待评价的抗体等的样品作为分析物进行相互作用得到传感图谱，根据由传感图谱的分析得到的解离常数(KD)值是降低或是增加来判断。或者，也可以待评价的抗体等的样品作为分析物，使其与将FcγR直接固定在传感芯片上或经由抗标签抗体等固定的传感芯片相互作用，根据相互作用前后的传感图谱的值的变化量是降低或是增加来判断。
具体来说，除了ELISA、FACS (荧光激活细胞分选术，fluorescence activatedcell sorting)之外，Fc区变体对Fcγ受体的结合活性还可以通过ALPHA筛选(放大发光接近匀相测定，Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)、利用表面等离子体共振(SPR)现象的BIACORE法等测定(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11):4005-4010)。
ALPHA筛选是通过使用供体和受体两种珠的ALPHA技术基于下述原理实施。与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子发生生物学相互作用，只在两种珠接近的状态时才检测出发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周边的氧转换为激发状态的单线态氧。单线态氧扩散到供体珠周边，到达相接近的受体珠，则引起珠内的化学发光反应，最终发出光。与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子不发生相互作用时，供体珠产生的单线态氧不到达受体珠，因此不引起化学发光反应。
例如，使生物素标记的多肽缔合物与供体珠结合，使谷胱甘肽S转移酶(GST)标记的Fcγ受体与受体珠结合。在竞争的包含Fc区变体的多肽缔合物不存在下，包含野生型Fc区的多肽缔合物与Fcγ受体相互作用，产生520-620nm的信号。未标记的包含突变Fc区的多肽缔合物与包含野生型Fc区的多肽缔合物竞争与Fcγ受体之间的相互作用。通过对竞争的结果所表现出的荧光的减少进行定量，可确定相对的结合活性。使用Sulfo-NHS-生物素等将抗体等的多肽缔合物生物素化是已知的。作为将Fcγ受体用GST标记的方法，可以适当采用以下方法等：将编码Fcγ受体的多核苷酸与编码GST的多核苷酸框内融合，将由此得到的融合基因保持在可表达的载体上，在细胞等中表达，使用谷胱甘肽柱纯化。所得信号例如可以使用GRAPHPAD PRISM (GraphPad，San Diego)等软件，通过拟合利用非线性回归分析的单一位点竞争(one-site competition)模型来适当分析。
将观察相互作用的物质的一方(配体)固定在传感芯片的金薄膜上，从传感芯片的背面照射光，使得在金薄膜与玻璃的界面发生全反射，反射光的一部分形成了反射强度降低的部分(SPR信号)。将观察相互作用的物质的另一方(分析物)流过传感芯片的表面，分析物与配体结合，则被固定的配体分子的质量增加，传感芯片表面的溶剂的折射率发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置发生位移(相反，如果结合解离，则信号的位置恢复)。Biacore系统是以上述位移的量，即传感芯片表面的质量变化为纵轴，以质量的时间变化作为测定数据表示(传感图谱)。可由传感图谱求出分析物与捕获到传感芯片表面的配体的结合量。另外，由传感图谱的曲线求出动力学参数：结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，由该常数之比求出解离常数(KD)。在BIACORE法中，也适合采用抑制测定法。抑制测定法的例子记载于Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010。
对FcγRIIb的结合活性维持的Fc区或包含该Fc区的多肽是指，使包含天然型IgG的Fc区的多肽(是指包含亲本Fc区的多肽或亲本多肽)和在该Fc区包含本发明的氨基酸改变的多肽(包含Fc区变体的多肽)的量实质上相同进行分析时，以和亲本多肽实质上不变化的、相同的结合活性与FcγRIIb结合的多肽。具体而言，是指包含亲本Fc区的多肽与FcgRIIb结合至少55.5%维持的Fc区变体。
另外，对活性型FcγR的结合活性减少、降低或减弱的Fc区或包含该Fc区的多肽是指，使包含天然型IgG的Fc区的多肽(是指包含亲本Fc区的多肽或亲本多肽)和在该Fc区包含本发明的氨基酸改变的多肽(包含Fc区变体的多肽)的量实质上相同进行分析时，相比包含亲本Fc区的多肽以实质上更弱的结合活性与活性型FcγR结合的Fc区变体或包含该Fc区变体的多肽。
本发明的Fc区变体是否维持天然型IgG的Fc区对FcγRIIb的结合活性，例如，可以通过比较按照上述例而求出的、包含本发明的Fc区变体的多肽对FcγRIIb的KD值与包含天然型IgG的Fc区的多肽对FcγRIIb的KD值进行判断。具体而言，与包含亲本Fc区的多肽相比，包含本发明的Fc区变体的多肽的KD值为相同或其以下的值时，可以判断为包含本发明的Fc区变体的多肽与包含亲本Fc区的多肽相比，维持了对FcγRIIb的结合活性。另外，关于本发明的Fc区变体是否较天然型IgG的Fc区对活性型FcγR的结合活性减少，例如，也同样可以通过比较按照上述例求出的、包含本发明的Fc区变体的多肽对活性型FcγR的KD值与包含天然型IgG的Fc区的多肽对活性型FcγR的KD值进行判断。具体而言，与包含亲本Fc区的多肽相比，包含本发明的Fc区变体的多肽的KD值增大时，可以判断为包含本发明的Fc区变体的多肽与包含亲本Fc区的多肽相比，对活性型FcγR的结合活性减少。特别是对FcγRIIa (R型)的结合活性相比对其它活性型FcγR的结合活性，更容易与对FcγRIIb的结合活性相关，因此发现维持对FcγRIIb的结合活性、且可减少对FcγRIIa (R型)的结合活性的氨基酸改变，在使对FcγRIIb以外的其它活性型FcγR的结合活性选择性地减少的基础上是最困难的课题。
对FcγRIIb的结合活性相同或维持是指，例如，在利用上述测定方法测定而得的KD值中，[包含亲本Fc区的多肽对FcγRIIb的KD值]/[包含Fc区变体的多肽对FcγRIIb的KD值]的KD值比具有优选至少0.75、更优选至少0.8、进一步优选至少0.9。另外，该KD值比只要为5左右即可，为了对FcγRIIb的结合活性相同或维持没有必要高于该值。
对活性型FcγR的结合活性减少、降低或减弱是指，例如，在利用上述的测定方法测定而得的KD值中，[包含亲本Fc区的多肽对活性型FcγR的KD值]/[包含Fc区变体的多肽对活性型FcγR的KD值]的KD值比优选为0.2以下、更优选为0.15以下、进一步优选为0.1以下。
特别是，FcγRIIa与FcγRIIb的胞外区的序列93%一致，结构极其类似，因此，关于维持对FcγRIIb的结合活性、且对难以使结合活性减少的FcγRIIa R的结合，[包含亲本Fc区的多肽对FcγRIIa R的KD值]/[包含Fc区变体的多肽对FcγRIIa R的KD值]的KD值比优选为0.1以下、更优选为0.05。
另外，本发明的多肽对各种FcγR的结合活性是否维持、增强或减少，这也可以通过根据上述例子求出的各种FcγR与本发明多肽的结合量的增减来判断。在此，各种FcγR与多肽的结合量是指：使作为分析物的各种FcγR与各多肽相互作用，将相互作用前后变化了的传感图谱中RU值的差除以在传感芯片上捕获多肽前后变化了的传感图谱中RU值的差而得的值。
另外，对FcγRIIb的选择性提高的Fc区或包含该Fc区的多肽、或对活性型FcγR的结合活性选择性地降低的Fc区或包含该Fc区的多肽是指，对FcγRIIb的结合活性维持、且对活性型FcγR的结合活性减少、降低、或减弱的Fc区或包含该Fc区的多肽。
另外，作为本发明的Fc区变体，对FcγRIIb和活性型FcγR的KD值(mol/L)没有特别限定，例如对FcγRIIb的值可以为7.0×10-6以下、优选为6.0×10-6以下、更优选为5.0×10-6以下，对活性型FcγR的值可以为2.5×10-9以上、优选为3.0×10-9以上、更优选为3.5×10-9以上，特别是，对FcγRIIa (R型)的值优选为2.0×10-5以上。
“Fc区”是指由抗体分子中的、铰链部或其一部分、CH2、CH3结构域构成的片段。IgG类别的Fc区是指EU编号(本说明书中也称为EU INDEX) (参照图18)、例如第226位半胱氨酸至C末端或者第230位的脯氨酸至C末端，但并不限于此。
对于Fc区，可以适合通过将IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体等用胃蛋白酶等蛋白分解酶进行部分消化，然后再洗脱吸附于蛋白A、蛋白G柱上的级分(组分)来获取。作为所述蛋白分解酶，只要是通过适当设定pH等的酶的反应条件，可以限制性地消化全长抗体，产生Fab、F(ab’)2即可，没有特别限定，例如可以示例：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。
本发明提供包含氨基酸改变的Fc区变体，所述氨基酸改变是对于人IgG (IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的Fc区，将EU编号第238位的氨基酸改变为其它氨基酸和将下述(a)～(k)的任一项所述的氨基酸改变为其他氨基酸组合而成的氨基酸改变。通过将该改变导入Fc区，可以提供与包含天然型IgG的Fc区的多肽相比，包含维持对FcγRIIb的结合活性、且对所有活性型FcγR的结合活性、其中对FcγRIIa (R型)的结合活性减少的Fc区变体的多肽，
(a) Fc区的EU编号第235位的氨基酸；
(b)Fc区的EU编号第237位的氨基酸；
(c) Fc区的EU编号第241位的氨基酸；
(d) Fc区的EU编号第268位的氨基酸；
(e) Fc区的EU编号第295位的氨基酸；
(f) Fc区的EU编号第296位的氨基酸；
(g) Fc区的EU编号第298位的氨基酸；
(h) Fc区的EU编号第323位的氨基酸；
(i) Fc区的EU编号第324位的氨基酸；
(j) Fc区的EU编号第330位的氨基酸；
(k) 选自(a)～(j)的至少2个氨基酸。
作为上述(k)中选择的至少2个氨基酸的组合，只要是与包含天然型IgG的Fc区的多肽相比，维持对FcγRIIb的结合活性、且对所有活性型FcγR的结合活性减少的组合即可，没有特别限定，优选下述(1)～(3)的组合：
(1) Fc区的EU编号第241位的氨基酸、第268位的氨基酸、第296位的氨基酸以及第324位的氨基酸；
(2) Fc区的EU编号第237位的氨基酸、第241位的氨基酸、第296位的氨基酸以及第330位的氨基酸；
(3) Fc区的EU编号第235位的氨基酸、第237位的氨基酸、第241位的氨基酸以及第296位的氨基酸。
作为改变后的氨基酸而选择的氨基酸，只要是与包含天然型IgG的Fc区的多肽相比，维持对FcγRIIb的结合活性、且对所有活性型FcγR的结合活性减少即可，没有特别限定，优选EU编号第238位的氨基酸为Asp，第235位的氨基酸为Phe，第237位的氨基酸为Gln或Asp，第241位的氨基酸为Met或Leu，第268位的氨基酸为Pro，第295位的氨基酸为Met或Val，第296位的氨基酸为Glu、His、Asn或Asp，第298位的氨基酸为Ala或Met，第323位的氨基酸为Ile，第324位的氨基酸为Asn或His，第330位的氨基酸为His或Tyr。另外，作为上述的作为(1)～(3)改变后的氨基酸而选择的氨基酸，优选：
(1) Fc区的EU编号第241位的氨基酸为Met、第268位的氨基酸为Pro、第296位的氨基酸为Glu以及第324位的氨基酸为His；
(2) Fc区的EU编号第237位的氨基酸为Gln或Asp、第241位的氨基酸为Met、第296位的氨基酸为Glu以及第330位的氨基酸为His；
(3) Fc区的EU编号第235位的氨基酸为Phe、第237位的氨基酸为Gln或Asp、第241位的氨基酸为Met以及第296位的氨基酸为Glu。
另外，本发明提供包含氨基酸改变的Fc区变体，所述氨基酸改变是对于人IgG的Fc区，将EU编号第238位的氨基酸和第271位的氨基酸改变为其它氨基酸、以及将下述(a)～(h)的任一项所述的氨基酸改变为其它氨基酸组合而成的氨基酸改变。通过将该改变导入Fc区，可以提供与包含天然型IgG的Fc区的多肽相比，包含维持对FcγRIIb的结合活性、且对所有活性型FcγR的结合活性、其中对FcγRIIa (R型)的结合活性减少的Fc区变体的多肽，
(a) Fc区的EU编号第234位的氨基酸；
(b) Fc区的EU编号第235位的氨基酸；
(c) Fc区的EU编号第236位的氨基酸；
(d) Fc区的EU编号第237位的氨基酸；
(e) Fc区的EU编号第239位的氨基酸；
(f) Fc区的EU编号第265位的氨基酸；
(g) Fc区的EU编号第267位的氨基酸；
(h) Fc区的EU编号第297位的氨基酸。
作为与EU编号第238位的氨基酸和第271位的氨基酸改变为其它氨基酸组合的氨基酸改变，除了上述(a)～(h)所述的氨基酸之外还可以组合另外的氨基酸。对这样的氨基酸组合没有特别限定，优选为选自下述(1)～(3)的改变的组合：
(1) Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第238位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸、第268位的氨基酸以及第271位的氨基酸；
(2) Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第237位的氨基酸、第238位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸、第296位的氨基酸、第297位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第396位的氨基酸；
(3) Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第238位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸以及第296位的氨基酸。
作为改变后的氨基酸而选择的氨基酸，与包含天然型IgG的Fc区的多肽相比，只要是维持对FcγRIIb的结合活性、且对所有活性型FcγR的结合活性减少即可，没有特别限定，优选EU编号第238位的氨基酸为Asp，第271位的氨基酸为Gly，第234位的氨基酸为Ala、His、Asn、Lys或Arg，第235位的氨基酸为Ala，第236位的氨基酸为Gln，第237位的氨基酸为Arg或Lys，第239位的氨基酸为Lys，第265位的氨基酸为Lys、Asn、Arg、Ser或Val，第267位的氨基酸为Lys、Arg或Tyr，第297位的氨基酸为Ala。
另外，作为在上述的(1)～(3)中作为改变后的氨基酸而选择的氨基酸，优选：
(1) Fc区的EU编号第233位的氨基酸为Asp、第238位的氨基酸为Asp、第264位的氨基酸为Ile、第267位的氨基酸为Arg、第268位的氨基酸为Glu以及第271位的氨基酸为Gly；
(2) Fc区的EU编号第233位的氨基酸为Asp、第237位的氨基酸为Asp、第238位的氨基酸为Asp、第264位的氨基酸为Ile、第267位的氨基酸为Ala、第268位的氨基酸为Glu、第271位的氨基酸为Gly、第296位的氨基酸为Asp、第297位的氨基酸为Ala、第330位的氨基酸为Arg以及第396位的氨基酸为Met；
(3) Fc区的EU编号第233位的氨基酸为Asp、第238位的氨基酸为Asp、第264位的氨基酸为Ile、第267位的氨基酸为Arg、第268位的氨基酸为Pro、第271位的氨基酸为Gly以及第296位的氨基酸为Glu。
另外，本发明提供包含下述改变的Fc区变体，其中，对于人IgG的Fc区，将EU编号第238位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸改变为其它氨基酸。本发明提供：在该变体中进一步包含组合有下述(a)～(e)的任一项所述的氨基酸向其它氨基酸的改变的氨基酸改变的Fc区变体。可以提供包含Fc区变体的多肽，所述Fc区变体通过向Fc区导入该改变，与包含天然型IgG的Fc区的多肽相比，维持对FcγRIIb的结合活性、且对所有活性型FcγR的结合活性、其中对FcγRIIa (R型)的结合活性减少，
(a) Fc区的EU编号第233位的氨基酸；
(b) Fc区的EU编号第237位的氨基酸；
(c) Fc区的EU编号第264位的氨基酸；
(d) Fc区的EU编号第267位的氨基酸；
(e) Fc区的EU编号第268位的氨基酸。
作为与EU编号第238位的氨基酸和第271位的氨基酸向其它氨基酸的改变组合的氨基酸改变，除了上述(a)～(e)所述的氨基酸之外还可以进一步组合另外的氨基酸。对这样的氨基酸的组合没有特别限定，优选选自下述(1)～(4)的改变的组合：
(1) Fc区的EU编号第237位的氨基酸、第238位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸；
(2) Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第237位的氨基酸、第238位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸；
(3) Fc区的EU编号第238位的氨基酸、第267位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸；
(4) Fc区的EU编号第238位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸。
作为改变后的氨基酸而选择的氨基酸，与包含天然型IgG的Fc区的多肽相比，只要是维持对FcγRIIb的结合活性、且对所有活性型FcγR的结合活性减少即可，没有特别限定，优选EU编号第238位的氨基酸为Asp、第271位的氨基酸为Gly、第327位的氨基酸为Gly、第330位的氨基酸为Ser、第331位的氨基酸为Ser、第233位的氨基酸为Asp、第237位的氨基酸为Asp、第264位的氨基酸为Ile、第267位的氨基酸为Ala、第268位的氨基酸为Asp或Glu。
另外，作为在上述的 (1)～(4)中作为改变后的氨基酸而选择的氨基酸，优选：
(1) Fc区的EU编号第237位的氨基酸为Asp、第238位的氨基酸为Asp、第268位的氨基酸为Asp或Glu、第271位的氨基酸为Gly、第327位的氨基酸为Gly、第330位的氨基酸为Ser以及第331位的氨基酸为Ser；
(2) Fc区的EU编号第233位的氨基酸为Asp、第237位的氨基酸为Asp、第238位的氨基酸为Asp、第268位的氨基酸为Asp、第271位的氨基酸为Gly、第327位的氨基酸为Gly、第330位的氨基酸为Ser以及第331位的氨基酸为Ser；
(3) Fc区的EU编号第238位的氨基酸为Asp、第267位的氨基酸为Ala、第268位的氨基酸为Glu、第271位的氨基酸为Gly、第327位的氨基酸为Gly、第330位的氨基酸为Ser以及第331位的氨基酸为Ser；
(4) Fc区的EU编号第238位的氨基酸为Asp、第264位的氨基酸为Ile、第267位的氨基酸为Ala、第271位的氨基酸为Gly、第327位的氨基酸为Gly、第330位的氨基酸为Ser以及第331位的氨基酸为Ser。
本发明除了这些改变之外还可以进一步加入另外的至少一个对Fc区的改变。只要是维持对FcγRIIb的结合活性、且减少对活性型FcγR的结合活性即可，没有特别限定。
作为这样的改变，例如可以举出：对补体的结合活性减少的改变。具体而言，例如可以举出：Fc区的EU编号第322位的氨基酸改变，或者Fc区的EU编号第327位、第330位和第331位的氨基酸改变的组合。作为改变后的氨基酸而选择的氨基酸，与包含天然型IgG的Fc区的多肽相比，只要是对FcγRIIb的结合活性维持、对所有活性型FcγR的结合活性减少、且对补体的结合活性减少即可，没有特别限定，优选EU编号第322位的氨基酸为Ala或Glu，第327位的氨基酸为Gly，第330位的氨基酸为Ser，第331位的氨基酸为Ser。
本发明中，本发明的包含Fc区变体的多肽或Fc区变体是否减少对补体的结合活性，可以通过与确认上述的对FcγR的结合活性是否减少的方法相同的方法进行确认。具体而言，例如，如本实施例中所示，可以使用利用表面等离子体共振(SPR)现象的相互作用分析仪器BIACORE，以补体作为分析物，使其与将待评价的抗体固定到传感芯片上或者将待评价的抗体用蛋白A、蛋白L、蛋白A/G、蛋白G、抗λ链抗体、抗κ链抗体、抗原肽、抗原蛋白等捕获到传感芯片上的传感芯片相互作用获得传感图，根据该传感图的分析结果得到的解离常数(KD)的值来判断是否增加。或者，还可以基于下述的值来判断是否增加，以补体作为分析物，使其与固定到传感芯片上的待评价的抗体或用蛋白A、蛋白L、蛋白A/G、蛋白G、抗λ链抗体、抗κ链抗体、抗原肽、抗原蛋白等捕获到传感芯片上的待评价的抗体相互作用，将所述相互作用前后的传感图上共振单位(RU)值的变化量除以将抗体固定或捕获在传感芯片上前后的共振单位(RU)的变化量而得的值。另外，还可以使用将补体直接固定在传感芯片上、或经由抗标签抗体等固定的传感芯片，以待评价的抗体等样品作为分析物进行相互作用获得传感图，根据该该传感图的分析得到的解离常数(KD)的值来判断是否增加。或者，还可以待评价的抗体等样品作为分析物，使其与将补体直接固定在传感芯片或经由抗标签抗体等固定的传感芯片相互作用，根据该相互作用前后的传感图的值的变化量来判断是否增加。或者，还可以经由抗原或向直接固定有待评价的抗体的板上添加补体，然后加入用过氧化物酶等标记的抗人C1q抗体，通过ELISA评价结合量来进行判断。
另外，本发明的包含Fc区变体的多肽中可组合为其它目的而实施的氨基酸改变。例如可以加入使对FcRn的结合活性提高的氨基酸取代(J Immunol. 2006 Jan 1; 176(1):346-56、J Biol Chem. 2006 Aug 18; 281(33): 23514-24.、Int Immunol. 2006 Dec; 18(12): 1759-69.、Nat Biotechnol. 2010 Feb; 28(2): 157-9.、WO/2006/019447、WO/2006/053301、WO/2009/086320)、用于使抗体的异质性或稳定性提高的氨基酸取代(WO/2009/041613)。或者，本发明也包括：为本发明的包含Fc区变体的多肽赋予WO2011/122011、PCT/JP2011/072550中所记载的用于促进抗原消失的性质而得的多肽、和赋予WO2009/125825、PCT/JP2011/077619所记载的用于与多个分子的抗原重复结合的性质而得的多肽。或者，本发明的包含Fc区变体的多肽中，以提高血中滞留性为目的，可组合降低恒定区的pI的氨基酸改变(WO/2012/016227)。或者，本发明的包含Fc区变体的多肽中，以对使用的其它抗原具有结合能力为目的，可在CH3中组合EP1752471、EP1772465中所记载的氨基酸改变。
本发明的包含Fc区变体的多肽为包含抗体等抗原结合结构域时，为了提高该多肽的自血浆中的抗原消失效果，可以组合取决于离子浓度条件使对抗原的结合活性发生变化的氨基酸改变。
本说明书中，“抗原结合结构域”只要是能够与目标抗原结合即可，还可以使用任意结构的结构域。作为这样的结构域的例子，例如可以适合举出：抗体的重链和轻链的可变区；生物体内存在的细胞膜蛋白即Avimer中所含的35氨基酸程度的被称为A结构域的模块(module) (国际公开WO2004/044011、WO2005/040229)；细胞膜上表达的糖蛋白即纤连蛋白中的蛋白所结合的包含结构域即10Fn3结构域的Adnectin (国际公开WO2002/032925)；将构成蛋白A的由58氨基酸组成的三螺旋束(bundle)的IgG结合结构域作为支架结构的Affibody (国际公开WO1995/001937)；在具有包含33氨基酸残基的转角、2个反向平行螺旋和环的亚单位重复堆积结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat：AR)的分子表面上暴露的区即DARPins (Designed Ankyrin Repeat proteins) (国际公开WO2002/020565)；在中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL) )等的脂质运载蛋白分子中高度保存的8个反向平行链支撑向中央方向弯曲的桶结构的片侧的4个环区即Anticalin等(国际公开WO2003/029462)；作为七鳃鳗、盲鳗等无颚类的获得性免疫系统，不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variable lymphocytereceptor (VLR) )的富亮氨酸残基的重复序列(leucine-rich-repeat (LRR) )模块重复堆积的马蹄形结构的内部的平行型片状结构的凹区(国际公开WO2008/016854)。作为本发明的抗原结合结构域的优选的例子，可以举出：包含抗体的重链和轻链的可变区的抗原结合结构域。作为这样的抗原结合结构域的例子，可以优选举出：“scFv (single chainFv)”、“单链抗体(single chain antibody)”、“Fv”、“scFv2 (single chain Fv 2)”、“Fab”或“F(ab')2”等。
本说明书中的“离子浓度”，例如可以举出金属离子浓度。“金属离子”是指，除外氢的碱金属和铜族等第I族、碱土类金属和锌族等第II族、除外硼的第III族、除外碳和硅的第IV族、铁族和铂族等第VIII族、属于V、VI和VII族的各A亚族的元素、锑、铋、钋等金属元素的离子。金属原子具有释放原子价电子形成阳离子的性质，将其称为离子化倾向。离子化倾向大的金属被视为富有化学活性。
本发明中作为适合的金属离子的例子可以举出钙离子。钙离子参与调节许多的生命现象，钙离子参与骨骼肌、平滑肌和心肌等的肌肉收缩、白细胞的运动和吞噬等的活化、血小板的变形和分泌等的活化、淋巴细胞的活化、组胺的分泌等肥大细胞的活化、儿茶酚胺α受体或乙酰胆碱受体介导的细胞应答、胞吐作用、神经元末梢递质释放、神经元的轴质流动等。作为细胞内的钙离子受体，已知具有多个的钙离子结合位点、且被认为在分子进化上来自共同起源的肌钙蛋白C、钙调蛋白、微白蛋白、肌球蛋白轻链等，其结合基序也众所周知。例如 ，众所周知的基序有：钙粘着蛋白结构域、钙调蛋白所含的EF手型、蛋白激酶C所含的C2结构域、血液凝固蛋白因子IX所含的Gla结构域、去唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的C型凝集素、LDL受体所含的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。
本发明中，金属离子为钙离子时，作为钙离子浓度条件可以举出低钙离子浓度条件和高钙离子浓度条件。取决于钙离子浓度条件结合活性发生改变是指，由于低钙离子浓度条件和高钙离子浓度条件的不同对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化。例如可以举出：在高钙离子浓度条件下对抗原的抗原结合分子的结合活性高于在低钙离子浓度条件下对抗原的抗原结合分子的结合活性的情形。另外，还可以举出：在低钙离子浓度条件下对抗原的抗原结合分子的结合活性高于在高钙离子浓度条件下对抗原的抗原结合分子的结合活性的情形。
本说明书中，高钙离子浓度不特别限定于一定的数值，适合选自100μM～10mM之间的浓度。另外，在另一方式中，还选自200μM～5 mM之间的浓度。另外，在不同的方式中，还选自400μM～3mM之间的浓度，在另外的方式中，还选自200μM～2mM之间的浓度。并且还选自400μM～1mM之间的浓度。特别适合举出：选自接近于生物体内的血浆中(血中)的钙离子浓度的500μM～2.5mM之间的浓度。
本说明书中，低钙离子浓度不特别限定于一定的数值，适合选自0.1μM～30μM之间的浓度。另外，在另一方式中，还选自0.2μM～20μM之间的浓度。另外，在不同的方式中，还选自0.5μM～10μM之间的浓度，在另外的方式中，还选自1μM～5μM之间的浓度。并且还选自2μM～4μM之间的浓度。特别适合举出：选自接近于生物体内的早期内体内的离子化钙浓度的1μM～5μM之间的浓度。
本发明中，在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性是指，抗原结合分子在选自0.1μM～30μM之间的钙离子浓度下对抗原的结合活性弱于在选自100μM～10mM之间的钙离子浓度下对抗原的结合活性。优选是指：抗原结合分子在选自0.5μM～10μM之间的钙离子浓度下对抗原的结合活性弱于在选自200μM～5mM之间的钙离子浓度下对抗原的结合活性，特别优选是指：生物体内的早期内体内的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于生物体内的血浆中的钙离子浓度下的抗原结合活性，具体而言，是指：抗原结合分子在选自1μM～5μM之间的钙离子浓度下对抗原的结合活性弱于在选自500μM～2.5mM之间的钙离子浓度下对抗原的结合活性。
取决于金属离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性是否发生变化，例如可以通过使用如上述的结合活性的项目中所述的已知测定方法进行确定。例如，为了确认与在低钙离子浓度条件下对抗原的抗原结合分子的结合活性相比，在高钙离子浓度条件下对抗原的抗原结合分子的结合活性变化大，可以比较在低钙离子浓度条件下和在高钙离子浓度条件下对抗原的抗原结合分子的结合活性。
并且，本发明中，“在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性”的表述，还可以表述为：抗原结合分子在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性高于在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性。需要说明的是，本发明中，有时也将“在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性”记载为“在低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合能力”，另外，有时也将“在低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性”记载为“在低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合能力”。
测定与抗原的结合活性时的钙离子浓度以外的条件，本领域技术人员可以适当选择，没有特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore (GE Healthcare)等进行测定。就抗原结合分子与抗原的结合活性的测定而言，抗原为可溶型抗原时，可以通过以抗原作为分析物，使其流过固定有抗原结合分子的芯片，来评价与可溶型抗原的结合活性；抗原为膜型抗原时，可以通过以抗原结合分子作为分析物，使其流过固定有抗原的芯片，来评价与膜型抗原的结合活性。
本发明的抗原结合分子中，只要是在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性弱于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性，则在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性与在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性之比没有特别限定，优选对抗原的在低钙离子浓度条件下的KD (Dissociation constant：解离常数)与在高钙离子浓度条件下的KD之比KD(Ca 3μM)/KD (Ca 2mM)的值为2以上、更优选KD (Ca 3μM)/KD (Ca 2mM)的值为10以上、进一步优选KD (Ca 3μM)/KD (Ca 2mM)的值为40以上。对KD (Ca 3μM)/KD (Ca 2mM)的值的上限没有特别限定，只要是本领域技术人员的技术中可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。
作为对抗原的结合活性的值，抗原为可溶型抗原时，可以使用KD (解离常数)，抗原为膜型抗原时，可以使用表观的KD (Apparent dissociation constant：表观的解离常数)。KD (解离常数)和表观的KD (表观的解离常数)可以利用本领域技术人员已知的方法进行测定，例如可以使用Biacore (GE healthcare)、Scatchard作图、流式细胞仪等。
另外，作为显示本发明的抗原结合分子在低钙浓度的条件下对抗原的结合活性与在高钙浓度的条件下对抗原的结合活性之比的其它指标，例如还可以适合使用解离速度常数kd (Dissociation rate constant：解离速度常数)。作为显示结合活性之比的指标，使用kd (解离速度常数)代替KD (解离常数)时，对抗原的在低钙浓度条件下的kd (解离速度常数)与在高钙浓度条件下的kd (解离速度常数)之比kd (低钙浓度的条件)/kd (高钙浓度的条件)的值，优选为2以上、更优选为5以上、进一步优选为10以上、更优选为30以上。对Kd (低钙浓度的条件)/kd (高钙浓度的条件)的值的上限没有特别限定，只要是在本领域技术人员的技术中可以制作，则可以是50、100、200等任意的值。
作为抗原结合活性的值，抗原为可溶型抗原时，可以使用kd (解离速度常数)；抗原为膜型抗原时，可以使用表观的kd (Apparent dissociation rate constant：表观的解离速度常数)。kd (解离速度常数)和表观的kd (表观的解离速度常数)可以通过本领域技术人员已知的方法进行测定，例如可以使用Biacore (GE healthcare)、流式细胞仪等。需要说明的是，本发明中，测定在不同的钙离子浓度下抗原结合分子对抗原的结合活性时，优选钙浓度以外的条件相同。
例如，本发明所提供的一个方式即在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体的筛选来获取：
(a) 获得在低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性的步骤；
(b) 获得在高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性的步骤；
(c) 选择在低钙浓度条件下的抗原结合活性低于在高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤。
并且，本发明所提供的一个方式即在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗原结合分子或它们的文库的筛选来获取：
(a) 使在高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子或它们的文库与抗原接触的步骤；
(b) 将在上述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子置于低钙浓度条件下的步骤；
(c) 将在上述步骤(b)中解离的抗原结合结构域或抗原结合分子分离的步骤。
另外，本发明所提供的一个方式即在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可以通过包括以下步骤(a)～(d)的抗原结合结构域或抗原结合分子或它们的文库的筛选来获取：
(a) 在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与抗原接触的步骤；
(b) 选择在上述步骤(a)中不与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤；
(c) 使在上述步骤(b)中选择的抗原结合结构域或抗原结合分子在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤；
(d) 将在上述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子分离的步骤。
并且，本发明所提供的一个方式即在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可以通过包括以下步骤(a)～(c)的筛选方法来获取：
(a) 在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与固定有抗原的柱接触的步骤；
(b) 将在上述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域或抗原结合分子在低钙浓度条件下从柱洗脱的步骤；
(c) 将在上述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域或抗原结合分子分离的步骤。
并且，本发明所提供的一个方式即在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获取：
(a) 在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库通过固定有抗原的柱的步骤；
(b) 回收在上述步骤(a)中不与柱结合而洗脱的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤；
(c) 使在上述步骤(b)中回收的抗原结合结构域或抗原结合分子在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤；
(d) 将在上述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子分离的步骤。
并且，本发明所提供的一个方式即在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获取：
(a) 在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与抗原接触的步骤；
(b) 获取在上述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤；
(c) 将在上述步骤(b)中获取的抗原结合结构域或抗原结合分子置于低钙浓度条件下的步骤；
(d) 将在上述步骤(c)中抗原结合活性较在上述步骤(b)中选择的基准弱的抗原结合结构域或抗原结合分子分离的步骤。
需要说明的是，上述的步骤可以重复2次以上。因此，根据本发明可以提供：上述的筛选方法中，通过进一步包括将(a)～(c)或(a)～(d)的步骤重复2次以上的步骤的筛选方法获取的在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子。对(a)～(c)或(a)～(d)步骤重复的次数没有特别限定，通常为10次以内。
上述筛选方法中，在低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性，只要是离子化钙浓度为0.1μM～30μM之间的抗原结合活性即可，没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可以举出：0.5μM～10μM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可以举出：生物体内的早期内体内的离子化钙浓度，具体而言可以举出：1μM～5μM的抗原结合活性。另外，在高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性，只要是离子化钙浓度为100μM～10mM之间的抗原结合活性即可，没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可以举出：200μM～5mM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可以举出：生物体内的血浆中的离子化钙浓度，具体而言可以举出：0.5mM～2.5mM的抗原结合活性。
另外，本发明所提供的一个方式即在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子，作为其筛选方法还可以示例WO2012/073992等(例如段落0200-0213)中所记载的方法。
抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性可以通过本领域技术人员已知的方法进行测定，关于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适当确定。抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性可以以KD (Dissociation constant：解离常数)、表观的KD (Apparent dissociation constant：表观的解离常数)、解离速度kd(Dissociation rate：解离速度常数)或表观的kd (Apparent dissociation：表观的解离速度常数)等的形式进行评价。这些可以通过本领域技术人员已知的方法进行测定，例如可以使用Biacore (GE healthcare)、Scatchard作图、FACS等。
本发明中，选择在高钙浓度条件下的抗原结合活性高于在低钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤，与选择在低钙浓度条件下的抗原结合活性低于在高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤含义相同。
只要是在高钙浓度条件下的抗原结合活性高于在低钙浓度条件下的抗原结合活性，则对在高钙浓度条件下的抗原结合活性与在低钙浓度条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选在高钙浓度条件下的抗原结合活性为在低钙浓度条件下的抗原结合活性的2倍以上，进一步优选为10倍以上，更优选为40倍以上。
通过上述的筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子可以是任意的抗原结合结构域或抗原结合分子，例如可以是将上述的抗原结合结构域或抗原结合分子进行筛选。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域或抗原结合分子，还可以筛选取代了氨基酸序列的抗原结合结构域或抗原结合分子。
例如，本发明所提供的一个方式即在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子，作为其筛选方法可以示例WO2012/073992等(例如段落0200-0213)中所记载的方法。
通过上述的筛选方法筛选的本发明的取决于钙离子浓度条件对抗原的结合活性发生变化的抗原结合结构域或抗原结合分子可以通过任意方式调制，例如，金属离子为钙离子浓度时，可以使用：预先存在的抗原结合结构域或抗原结合分子、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由得自免疫动物的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制作的抗体或文库、向这些抗体或文库导入有可螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变的抗体或文库(提高了可螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含量的文库或在特定位置导入有可螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变的文库等)等。
作为上述的取决于离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的氨基酸的例子，例如，金属离子为钙离子时，只要是形成钙结合基序的氨基酸即可，对其种类没有限定。钙结合基序是本领域技术人员周知的，并详细记载于文献中(例如Springer等人(Cell (2000) 102, 275-277)、Kawasaki和Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2,305-490)、Moncrief等人(J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562)、Chauvaux等人(Biochem.J. (1990) 265, 261-265)、Bairoch和Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456)、Davis(New Biol. (1990) 2, 410-419)、Schaefer等人(Genomics (1995) 25, 638～643)、Economou等人(EMBO J. (1990) 9, 349-354)、Wurzburg等人(Structure. (2006) 14, 6,1049-1058) )。即，ASGPR, CD23、MBR、DC-SIGN等C型凝集素等的任意的已知的钙结合基序包含在本发明的抗原结合分子中。作为这样的钙结合基序的适合的例子，除了上述的之外，还可以举出：SEQ ID NO：45中记载的抗原结合结构域所含的钙结合基序。
另外，作为本发明的抗原结合分子所含的抗原结合结构域的取决于钙离子浓度条件对抗原的结合活性发生变化的氨基酸的例子，还可以适合使用：具有金属螯合作用的氨基酸。作为具有金属螯合作用的氨基酸的例子，例如可以适合举出：丝氨酸(Ser (S) )、苏氨酸(Thr (T) )、天冬酰胺(Asn (N) )、谷氨酰胺(Gln (Q) )、天冬氨酸(Asp (D) )和谷氨酸(Glu (E) )等。
上述的氨基酸所含的抗原结合结构域的位置不限于特定的位置，只要是取决于钙离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化，则可以是形成抗原结合结构域的重链可变区或轻链可变区中的任意的位置。在非限定的一个方式中，本发明的抗原结合结构域可以从下述的文库中获取：所述文库主要由取决于钙离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的氨基酸的重链的抗原结合结构域所含的彼此序列不同的抗原结合分子构成。另外，在非限定的另一方式中，本发明的抗原结合结构域可以从下述的文库中获取：所述文库主要由该氨基酸的重链CDR3所含的彼此序列不同的抗原结合分子构成。在其它的方式中，本发明的抗原结合结构域可以从下述的文库中获取：所述文库主要由该氨基酸的重链CDR3的以Kabat编号表示的95位、96位、100a位和/或101位所含的彼此序列不同的抗原结合分子构成。
另外，在本发明的非限定的一个方式中，本发明的抗原结合结构域可以从下述的文库中获取：所述文库主要由取决于钙离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的氨基酸的轻链的抗原结合结构域所含的彼此序列不同的抗原结合分子构成。另外，在非限定的另外一个方式中，本发明的抗原结合结构域可以从下述的文库中获取：所述文库主要由该氨基酸的轻链CDR1所含的彼此序列不同的抗原结合分子构成。在其它的方式中，本发明的抗原结合结构域可以从下述的文库中获取：所述文库主要由该氨基酸的轻链CDR1的以Kabat编号表示的30位、31位和/或32位所含的彼此序列不同的抗原结合分子构成。
另外，在另外的非限定的一个方式中，本发明的抗原结合结构域可以从下述的文库中获取：所述文库主要由该氨基酸残基的轻链CDR2所含的彼此序列不同的抗原结合分子构成。在其它的非限定的一个方式中，提供主要由该氨基酸残基的轻链CDR2的以Kabat编号表示的50位所含的彼此序列不同的抗原结合分子构成的文库。
并且，在另外的方式中，本发明的抗原结合结构域可以从下述的文库中获取：所述文库主要由该氨基酸残基的轻链CDR3所含的彼此序列不同的抗原结合分子构成。在其它的方式中，本发明的抗原结合结构域可以从下述的文库中获取：所述文库主要由该氨基酸残基的轻链CDR3的以Kabat编号表示的92位所含的彼此序列不同的抗原结合分子构成。
另外，作为本发明的不同的方式，本发明的抗原结合结构域可以从下述的文库中获取：所述文库主要由该氨基酸残基的选自上述记载的轻链CDR1、CDR2和CDR3的2个或3个CDR所含的彼此序列不同的抗原结合分子构成。并且，本发明的抗原结合结构域可以从下述的文库中获取：所述文库主要由该氨基酸残基的轻链的以Kabat编号表示的30位、31位、32位、50位和/或92位的任意的一个以上所含的彼此序列不同的抗原结合分子构成。
在特别优选的实施方式中，抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的构架序列优选具有人的生殖细胞系构架序列。因此，在本发明的一个方式中，当构架序列为完全人的序列时，给予人(例如疾病的治疗)时，被认为本发明的抗原结合分子几乎或完全不引起免疫原性反应。在上述意义上，本发明中的“包含生殖细胞系的序列” 是指，本发明中的构架序列的一部分与任意的人的生殖细胞系构架序列的一部分相同。例如，当为本发明的抗原结合分子的重链FR2的序列组合多个的不同的人的生殖细胞系构架序列的重链FR2序列而得的序列时，也是本发明中的“包含生殖细胞系的序列”抗原结合分子。
作为构架的例子，例如可以适合举出：V-Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等的网站中所含的、现在已知的完全人型的构架区的序列。这些构架区的序列可以适合用作本发明的抗原结合分子所含的生殖细胞系的序列。生殖细胞系的序列可以根据其类似性进行分类(Tomlinson等人(J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798)Williams和Winter (Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461)和Cox等人(Nat.Genetics (1994) 7, 162-168) )。可以从分类为7个亚型的Vκ、分类为10个亚型的Vλ、分类为7个亚型的VH中适当选择适宜的生殖细胞系的序列。
完全人型的VH序列不仅仅限于下述的序列，例如可以适合举出：VH1亚型(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)，VH2亚型(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)，VH3亚型(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)，VH4亚型(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)，VH5亚型(VH5-51)，VH6亚型(VH6-1)，VH7亚型(VH7-4、VH7-81)的VH序列等。这些也记载于已知文献(Matsuda等人(J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975) )等中，本领域技术人员可以根据这些序列信息适当设计本发明的抗原结合分子。也可以适合使用这些以外的完全人型的构架或构架的亚区(sub-regions)。
完全人型的Vκ序列不仅限于下述的序列，例如可以适合举出：被分类为Vk1亚型的A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18，被分类为Vk2亚型的A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11，被分类为Vk3亚型的A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25，被分类为Vk4亚型的B3，被分类为Vk5亚型的B2 (本说明书中也称为Vk5-2)、被分类为Vk6亚型的A10、A14、A26等(Kawasaki等人(Eur. J. Immunol.(2001) 31, 1017-1028)、Schable和Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374,1001-1022)和Brensing-Kuppers等人(Gene (1997) 191, 173-181) )。
完全人型的Vλ序列不仅限于下述的序列，例如可以适合举出：被分类为VL1亚型的V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22，被分类为VL2亚型的V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19，被分类为VL3亚型的V3-2、V3-3、V3-4，被分类为VL4亚型的V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6，被分类为VL5亚型的V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasaki等人(Genome Res. (1997) 7, 250-261) )。
通常，这些构架序列由于一个或其以上的氨基酸残基的不同而彼此不同。这些构架序列可以与本发明中的“取决于离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基”同时使用。作为与本发明中的“取决于离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基”同时使用的完全人型的构架的例子，不仅限于这些，还可以举出： KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等(例如，上述的Kabat等人(1991)和Wu等人(J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250) )。
本发明不拘泥于特定的理论，认为使用生殖细胞系的序列的大多数个人被期待排除有害免疫反应的一个理由如下所示。通常的免疫反应中产生的亲和成熟过程的结果，在免疫球蛋白的可变区频繁产生体细胞的超突变。这些超突变主要在其序列的超可变的CDR的周边产生，但也对构架区的残基造成影响。这些构架的超突变在生殖细胞系的基因中不存在，而且成为患者的免疫原性的可能性小。另一方面，通常的人的群体(population)暴露于由生殖细胞系的基因表达的大多数构架序列，免疫耐受的结果，预想这些生殖细胞系的构架在患者中免疫原性低或为非免疫原性。为了使免疫耐受的可能性最大，编码可变区的基因可以选自普通存在的机能性生殖细胞系基因的集合。
为了制作本发明的、取决于钙离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的氨基酸包含在上述的可变区序列的序列、重链可变区或轻链可变区的序列、或CDR序列或构架序列中的抗原结合分子，可以适当采用位点特异性诱变法(Kunkel等人(Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492) )或重叠序列延伸PCR等已知的方法。
例如，可以通过组合预先包含取决于钙离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基的作为构架序列选择的轻链可变区、和作为随机化可变区序列文库制作的重链可变区来制作包含本发明的多个的彼此序列不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性的例子，离子浓度为钙离子浓度时，例如，可以适合举出：将SEQ ID NO：45 (Vk5-2)中记载的轻链可变区序列和作为随机化可变区序列文库制作的重链可变区组合而得的文库。
另外，上述的预先包含取决于钙离子浓度条件对抗原的抗原结合结构域或抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基的作为构架序列选择的轻链可变区的序列还可以设计成包含该氨基酸残基以外的各种氨基酸残基。本发明中，这样的残基被称为柔性残基。本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子对抗原的结合活性只要是取决于离子浓度条件而发生变化，则对该柔性残基的数目和位置不限于特定的方式。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列可以包含一个或其以上的柔性残基。例如，离子浓度为钙离子浓度时，作为待导入到SEQ ID NO：45 (Vk5-2)中记载的轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性的例子，可以举出：表1或表2中所记载的氨基酸残基。
[表1]
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(位置表示Kabat编号)
[表2]
Figure 83798DEST_PATH_IMAGE002
(位置表示Kabat编号)
本说明书中，柔性残基是指，当比较已知的和/或天然抗体或抗原结合结构域的氨基酸序列时，持有在其位点提示的几个不同的氨基酸的轻链和重链可变区上的氨基酸存在于多变位点的氨基酸残基的变异(多样性，variations)。多变位点通常存在于CDR区。在一个方式中，确定已知的和/或天然抗体的多变位点时，Kabat, Sequences of Proteins ofImmunological Interest (National Institute of Health Bethesda Md.) (1987年和1991年)提供的数据是有效的。另外，在互联网上的几个数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)中，提供了所收集的许多的人轻链和重链的序列及其定位，这些序列及其定位的信息对于本发明中的多变位点的确定是有用的。根据本发明，氨基酸在某位点具有优选约2～约20、优选约3～约19、优选约4～约18、优选5～17、优选6～16、优选7～15、优选8～14、优选9～13、优选10～12个的可能的不同氨基酸残基的多样性时，其位点可称之为多变。在几个的实施方式中，某氨基酸位点具有优选至少约2、优选至少约4、优选至少约6、优选至少约8、优选约10、优选约12个的可能的不同氨基酸残基的多样性。
另外，即使通过将导入有上述的取决于离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和作为随机化可变区序列文库制作的重链可变区组合，也可以制作包含本发明的多个的彼此序列不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性的例子，离子浓度为钙离子浓度时，例如可以适合举出：将SEQ IDNO：46 (Vk1)、SEQ ID NO：47 (Vk2)、SEQ ID NO：48 (Vk3)、SEQ ID NO：49 (Vk4)等生殖细胞系的特定残基取代为取决于钙离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区序列和作为随机化可变区序列文库制作的重链可变区组合而得的文库。作为该氨基酸残基的非限定的例子，可以示例：包含在轻链CDR1中的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定的例子，还可以示例：包含在轻链CDR2中的氨基酸残基。另外，作为该氨基酸残基的非限定的另外的例子，还可以示例：包含在轻链CDR3中的氨基酸残基。
如上所述，作为该氨基酸残基包含在轻链CDR1中的氨基酸残基的非限定的例子，可以举出：轻链可变区的CDR1中的EU编号所表示的30位、31位、和/或32位的氨基酸残基。另外，作为该氨基酸残基包含在轻链CDR2中的氨基酸残基的非限定的例子，可以举出：轻链可变区的CDR2中的Kabat编号所表示的50位的氨基酸残基。并且，作为该氨基酸残基包含在轻链CDR3中的氨基酸残基的非限定的例子，可以举出：轻链可变区的CDR3中的Kabat编号所表示的92位的氨基酸残基。另外，这些氨基酸残基只要是形成钙结合基序和/或取决于钙离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化，则可以单独包含这些氨基酸残基，也可以组合包含这些氨基酸的两个以上。另外，已知具有多个的钙离子结合位点、且被认为在分子进化上来自共同起源的肌钙蛋白C、钙调蛋白、微白蛋白、肌球蛋白轻链等，也可以设计成包含其结合基序的轻链CDR1、CDR2和/或CDR3。例如，为了上述目的，可以适当使用：钙粘着蛋白结构域、钙调蛋白所含的EF手性、蛋白激酶 C所含的C2结构域、血液凝固蛋白Factor IX所含的Gla结构域、去唾液酸糖蛋白受体和甘露糖结合受体所含的C型凝集素、LDL受体所含的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。
即使在将导入有上述的取决于离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和作为随机化可变区序列文库制作的重链可变区组合时，与上述同样，也可以设计成柔性残基包含在该轻链可变区的序列中。本发明的抗原结合分子对抗原的结合活性只要是取决于离子浓度条件发生变化，则该柔性残基的数目和位置不限于特定的方式。即，在重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以包含一个或其以上的柔性残基。例如，离子浓度为钙离子浓度时，作为待导入到轻链可变区序列的柔性残基的非限定的例子，可以举出：表1或表2中记载的氨基酸残基。
作为待组合的的重链可变区的例子，可以适合举出：随机化可变区文库。随机化可变区文库的制作方法可以适当组合已知方法。在本发明的非限定的一个方式中，可以适合使用：基于用特定抗原免疫的动物、感染症患者、进行疫苗接种而使血中抗体效价增加的人、癌症患者、或自身免疫疾病的来自淋巴细胞的抗体基因构建的免疫文库作为随机化可变区文库。
另外，在本发明的非限定的一个方式中，基因组DNA中的V 基因或功能重构的V基因的CDR序列用包含编码适当长度的密码子组(codon sets)的序列的合成寡核苷酸组取代而成的合成文库，也可以适合用作随机化可变区文库。此时，由于观察到重链CDR3的基因序列的多样性，因此仅取代CDR3的序列也是可能的。抗原结合分子的可变区中产生氨基酸的多样性的标准是，抗原结合分子的表面暴露位置的氨基酸残基具有多样性。表面暴露位置是指，根据抗原结合分子的结构、结构系综、和/或模型化的结构，被判断为可表面暴露、和/或可与抗原接触的位置，但通常为其CDR。优选表面暴露位置采用InsightII program(Accelrys)这样的计算机程序、使用来自抗原结合分子的三维模型的坐标进行确定。表面暴露的位置可以使用该技术领域中已知的算法(例如，Lee和Richards (J. Mol. Biol.(1971) 55, 379-400)、Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558) )进行确定。表面暴露位置的确定可以使用适于制作蛋白模型的软件和得自抗体的三维结构信息来进行。作为可用于这样的目的的软件，可以适合举出：SYBYL生物高分子模块软件(TriposAssociates)。通常，还优选：当算法需要用户输入大小参数时，计算中使用的探针的“大小”设定为半径约1.4埃以下。并且，使用个人计算机用软件的表面暴露区和面积的确定方法记载于Pacios (Comput.Chem. (1994) 18 (4), 377-386和J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53)中。
并且，在本发明的非限定的一个方式中，由来自正常人的淋巴细胞的抗体基因构建，且其所有组成成分中包含不含bias的抗体序列即天然序列的天然文库，也特别适合用作随机化可变区文库(Gejima等人(Human Antibodies (2002) 11, 121-129)和Cardoso等人(Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344) )。本发明中记载的包含天然序列的氨基酸序列是指从这样的天然文库中获取的氨基酸序列。
本发明的一个方式中，可以从通过将“取决于离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基”预先包含的作为构架序列选择的重链可变区和作为随机化可变区序列文库制作的轻链可变区组合而得的包含本发明的多个的彼此序列不同的抗原结合分子的文库中获取本发明的抗原结合结构域。作为这样的非限定性的例子，离子浓度为钙离子浓度时，例如可以适合举出：将SEQ ID NO：50 (6RL#9-IgG1)或SEQID NO：51 (6KC4-1#85-IgG1)中记载的重链可变区序列和作为随机化可变区序列文库制作的轻链可变区组合而得的文库。另外，代替作为随机化可变区序列文库制作的轻链可变区，可以通过从具有生殖细胞系的序列的轻链可变区中适当选择来进行制作。例如可以适合举出：将SEQ ID NO：50 (6RL#9-IgG1)或SEQ ID NO：51 (6KC4-1#85-IgG1)中记载的重链可变区序列和具有生殖细胞系的序列的轻链可变区组合而得的文库。
另外，还可以设计成在上述的“取决于离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基”预先包含的作为构架序列选择的重链可变区的序列中包含柔性残基。本发明的抗原结合分子对抗原的结合活性只要是取决于离子浓度条件发生变化，则对该柔性残基的数目和位置不限于特定的方式。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以包含一个或其以上的柔性残基。例如，离子浓度为钙离子浓度时，作为待导入到SEQ ID NO：50 (6RL#9-IgG1)中记载的重链可变区序列中的柔性残基的非限定性的例子，可以举出：重链CDR1和CDR2的所有氨基酸残基、以及重链CDR3的95位、96位和/或100a位以外的CDR3的氨基酸残基。或者，作为待导入到SEQ ID NO：51 (6KC4-1#85-IgG1)中记载的重链可变区序列中的柔性残基的非限定性的例子，还可以举出：重链CDR1和CDR2的所有氨基酸残基、以及重链CDR3的95位和/或101位以外的CDR3的氨基酸残基。
另外，即使将导入有上述的“取决于离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基”的重链可变区和作为随机化可变区序列文库制作的轻链可变区或具有生殖细胞系的序列的轻链可变区组合，也可以制作包含多个的彼此序列不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性的例子，离子浓度为钙离子浓度时，例如可以适合举出：将重链可变区的特定残基取代为取决于钙离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基的重链可变区序列和作为随机化可变区序列文库制作的轻链可变区或具有生殖细胞系的序列的轻链可变区组合而得的文库。作为该氨基酸残基的非限定的例子，可以示例：包含在重链CDR1中的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定的例子，可以示例：包含在重链CDR2中的氨基酸残基。另外，该氨基酸残基的非限定的另外的例子，还可以示例：包含在重链CDR3中的氨基酸残基。作为该氨基酸残基包含在重链CDR3中的氨基酸残基的非限定的例子，可以举出：重链可变区的CDR3中的Kabat编号所表示的95位、96位、100a位和/或101位的氨基酸。另外，这些氨基酸残基只要是形成钙结合基序和/或取决于钙离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化，则可以单独包含这些氨基酸残基，也可以组合包含这些氨基酸的两个以上。
即使将上述的导入有取决于离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基的重链可变区和作为随机化可变区序列文库制作的轻链可变区或具有生殖细胞系的序列的轻链可变区组合时，与上述同样，也可以设计成柔性残基包含在该重链可变区的序列中。本发明的抗原结合分子对抗原的结合活性只要是取决于离子浓度条件发生变化，则该柔性残基的数目和位置不限于特定的方式。即，在重链的CDR序列和/或FR序列中可以包含一个或其以上的柔性残基。另外，作为取决于离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的氨基酸残基以外的重链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列，还可以适合使用随机化可变区文库。使用生殖细胞系的序列作为轻链可变区时，例如可以举出：SEQ ID NO：46 (Vk1)、SEQ ID NO：47 (Vk2)、SEQ ID NO：48(Vk3)、SEQ ID NO：49 (Vk4)等的生殖细胞系的序列作为非限定的例子。
作为上述的、取决于钙离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的氨基酸，只要是形成钙结合基序即可，还可以适合使用任何的氨基酸，作为这样的氨基酸，可以具体举出：具有供电子性的氨基酸。作为这样的具有供电子性的氨基酸，可以适合示例：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。
另外，作为本发明的“离子浓度条件”，例如还可以举出“pH条件”。pH条件也可以称为氢离子浓度条件。在本发明中，质子即氢原子的原子核的浓度条件与氢指数(pH)的条件同义。若水溶液中的氢离子的活度用aH+表示，则pH定义为-log10aH+。如果水溶液中的离子强度(例如，与10-3相比)低，则aH+几乎等于氢离子强度。例如在25℃、1大气压下的水离子积为Kw=aH+aOH=10-14，因此在纯水中aH+=aOH=10-7。此时的pH=7为中性，pH小于7的水溶液为酸性，pH大于7的水溶液为碱性。
本发明中，使用pH条件作为离子浓度条件时，作为pH条件，可以举出：高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件和低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件。本发明的抗原结合分子中所含的抗原结合结构域对抗原的结合活性取决于pH条件结合活性发生变化是指，由于高氢离子浓度或低pH (pH酸性区)和低氢离子浓度或高pH (pH中性区)的条件的不同而使抗原结合分子中所含的抗原结合结构域对抗原的结合活性发生变化。例如可以举出：在pH中性区的条件下对抗原的抗原结合分子的结合活性高于在pH酸性区的条件下对抗原的抗原结合分子的结合活性的情形。另外，还可以举出：在pH酸性区的条件下对抗原的抗原结合分子的结合活性高于在pH中性区的条件下对抗原的抗原结合分子的结合活性的情形。
本说明书中，pH中性区不特别限定于一定的数值，可以适合从pH6.7～pH10.0之间选择。另外，在另外的方式中，可以从pH6.7～pH9.5之间选择。另外，在不同的方式中，可以从pH7.0～pH9.0之间选择，在其它的方式中，可以从pH7.0～pH8.0之间选择。特别适合举出：接近于生物体内的血浆中(血中)的pH的pH7.4。
本说明书中，pH酸性区不特别限定于一定的数值，可以适合从pH4.0～pH6.5之间选择。另外，在另外的方式中，可以从pH4.5～pH6.5之间选择。另外，在不同的方式中，可以从pH5.0～pH6.5之间选择，在其它的方式中，可以从pH5.5～pH6.5之间选择。特别适合举出：接近于生物体内的早期内体内的离子化钙浓度的pH5.8。
本发明中，在高氢离子浓度或低pH (pH酸性区)的条件下对抗原的结合活性低于在低氢离子浓度或高pH (pH中性区)的条件下对抗原的结合活性是指，本发明的抗原结合结构域或包含该结构域的抗原结合分子在从pH4.0～pH6.5之间选择的pH下对抗原的结合活性弱于在从pH6.7～pH10.0之间选择的pH下对抗原的结合活性。优选是指，本发明的抗原结合结构域或包含该结构域的抗原结合分子在从pH4.5～pH6.5之间选择的pH下对抗原的结合活性弱于在从pH6.7～pH9.5之间选择的pH下对抗原的结合活性，更优选是指，抗原结合分子在从pH5.0～pH6.5之间选择的pH下对抗原的结合活性弱于在从pH7.0～pH9.0之间选择的pH下对抗原的结合活性。另外，优选是指，抗原结合分子在从pH5.5～pH6.5之间选择的pH下对抗原的结合活性弱于在从pH7.0～pH8.0之间选择的pH下对抗原的结合活性。特别优选是指，在生物体内的早期内体内的pH下的抗原结合活性弱于在生物体内的血浆中的pH下的抗原结合活性，具体而言是指，抗原结合分子在pH5.8下对抗原的结合活性弱于在pH7.4下对抗原的结合活性。
取决于pH条件对抗原的抗原结合结构域或包含该结构域的抗原结合分子的结合活性是否变化，例如可以通过使用如上述的结合活性的项目中记载的已知测定方法来确定。例如，进行该测定方法时，在不同的pH条件下测定结合活性。例如，为了确认与在pH酸性区的条件下对抗原的抗原结合结构域或包含该结构域的抗原结合分子的结合活性相比在pH中性区的条件下对抗原的上述结构域或上述的结合活性变高，可以比较在pH酸性区和pH中性区的条件下对抗原的上述结构域或上述分子的结合活性。
并且，本发明中，“在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性低于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性”这样的表述也可以表述为抗原结合结构域或包含该结构域的抗原结合分子在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性高于在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性。需要说明的是，本发明中，也有将“在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性低于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性”记载为“在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性弱于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合能力”的情形，另外，也有将“使在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性低于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性”记载为“使在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性弱于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合能力”的情形。
测定对抗原的结合活性时的氢离子浓度或pH以外的条件，本领域技术人员可以适当选择，没有特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore (GE Healthcare)等进行测定。抗原结合结构域或包含该结构域的抗原结合分子与抗原的结合活性的测定，抗原为可溶型抗原时，使抗原作为分析物流过固定有抗原结合结构域或包含该结构域的抗原结合分子的芯片，由此可以评价与可溶型抗原的结合活性，抗原为膜型抗原时，使抗原结合结构域或包含该结构域的抗原结合分子作为分析物流过固定有抗原的芯片，由此可以评价与膜型抗原的结合活性。
在本发明的抗原结合分子中，只要是在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性弱于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性，则对在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性与在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性之比没有特别限定，优选对抗原的在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下的KD (Dissociation constant：解离常数)与在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下的KD之比KD (pH5.8)/KD (pH7.4)的值为2以上、进一步优选KD (pH5.8)/KD (pH7.4)的值为10以上、进一步优选KD (pH5.8)/KD (pH7.4)的值为40以上。对KD (pH5.8)/KD (pH7.4)的值的上限没有特别限定，只要是在本领域技术人员的技术中可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。
另外，作为显示本发明的抗原结合结构域或包含该结构域的抗原结合分子在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性与在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性之比的其它指标，例如还可以适合使用：作为解离速度常数的kd (Dissociation rate constant：解离速度常数)。作为显示结合活性之比的指标，代替KD (解离常数)使用kd (解离速度常数)时，对抗原的在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下的kd (解离速度常数)与在在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下的kd(解离速度常数)之比kd (在pH酸性区的条件下)/kd (在pH中性区的条件下)的值优选为2以上、进一步优选为5以上、进一步优选为10以上、更优选为30以上。对Kd (在pH酸性区的条件下)/kd (在pH中性区的条件下)的值的上限没有特别限定，只要是在本领域技术人员的技术常识中可以制作，则可以是50、100、200等任意的值。
作为抗原结合活性的值，抗原为可溶型抗原时，可以使用kd (解离速度常数)，抗原为膜型抗原时，可以使用表观的kd (Apparent dissociation rate constant：表观的解离速度常数)。Kd (解离速度常数)和表观的kd (表观的解离速度常数)可以采用本领域技术人员已知的方法进行测定，例如可以使用Biacore (GE healthcare)、流式细胞仪等。需要说明的是，本发明中，测定在不同的氢离子浓度即pH下抗原结合结构域或包含该结构域的抗原结合分子对抗原的结合活性时，优选氢离子浓度即pH以外的条件相同。
例如，本发明所提供的一个方式即在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性低于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子，可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗原结合分子的筛选来获取：
(a) 获得在pH酸性区条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性的步骤；
(b) 获得在pH中性区条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性的步骤；
(c) 选择在pH酸性区条件下的抗原结合活性低于在pH中性区条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤。
并且，本发明所提供的一个方式即在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性低于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子，可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗原结合分子或它们的文库的筛选来获取：
(a) 在pH中性区的条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子或它们的文库与抗原接触的步骤；
(b) 将在上述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子置于pH酸性区的条件下的步骤；
(c) 将在上述步骤(b)中解离的抗原结合结构域或抗原结合分子分离的步骤。
另外，本发明所提供的一个方式即在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性低于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子，可以通过包括以下步骤(a)～(d)的抗原结合结构域或抗原结合分子或者它们的文库的筛选来获取：
(a) 在pH酸性区的条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与抗原接触的步骤；
(b) 选择在上述步骤(a)中不与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤；
(c) 使在上述步骤(b)中选择的抗原结合结构域或抗原结合分子在pH中性区的条件下与抗原结合的步骤；
(d) 将在上述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子分离的步骤。
并且，本发明所提供的一个方式即在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性低于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子，可以通过包括以下步骤(a)～(c)的筛选方法来获取：
(a) 在pH中性区的条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与固定有抗原的柱接触的步骤；
(b) 将在上述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域或抗原结合分子在pH酸性区的条件下从柱中洗脱的步骤；
(c) 将在上述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域或抗原结合分子分离的步骤。
并且，本发明所提供的一个方式即在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性低于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子，可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获取：
(a) 在pH酸性区的条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库通过固定有抗原的柱的步骤；
(b) 回收在上述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤；
(c) 在pH中性区的条件下使在上述步骤(b)中回收的抗原结合结构域或抗原结合分子与抗原结合的步骤；
(d) 将在上述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子分离的步骤。
并且，本发明所提供的一个方式即在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下对抗原的结合活性低于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子，可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获取：
(a) 在pH中性区的条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与抗原接触的步骤；
(b) 获取在上述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤；
(c) 将在上述步骤(b)中获取的抗原结合结构域或抗原结合分子置于pH酸性区的条件下的步骤；
(d) 将在上述步骤(c)中抗原结合活性弱于在上述步骤(b)中选择的标准的抗原结合结构域或抗原结合分子分离的步骤。
需要说明的是，上述的步骤可以重复2次以上。因此，根据本发明，可以提供：上述的筛选方法中，通过进一步包括将(a)～(c)或(a)～(d)步骤重复2次以上的步骤的筛选方法获取的在pH酸性区的条件下对抗原的结合活性低于在pH中性区的条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子。对(a)～(c)或(a)～(d)步骤重复的次数没有特别限定，通常为10次以内。
在本发明的筛选方法中，在高氢离子浓度条件或低pH即pH酸性区下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性只要是pH为4.0～6.5之间的抗原结合活性即可，没有特别限定，作为优选的pH，可以举出：pH为4.5～6.6之间的抗原结合活性。作为另外优选的pH，可以举出：pH为5.0～6.5之间的抗原结合活性、进一步pH为5.5～6.5之间的抗原结合活性。作为更优选的pH，可以举出：生物体内的早期内体内的pH，具体而言可以举出： 在pH5.8下的抗原结合活性。另外，在低氢离子浓度条件或高pH即pH中性区下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性只要是pH为6.7～10之间的抗原结合活性即可，没有特别限定，作为优选的pH，可以举出：pH为6.7～9.5之间的抗原结合活性。作为另外优选的pH，可以举出：pH为7.0～9.5之间的抗原结合活性、进一步pH为7.0～8.0之间的抗原结合活性。作为更优选的pH，可以举出：生物体内的血浆中的pH，具体而言可以举出：在pH为7.4下的抗原结合活性。
抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性可以通过本领域技术人员已知的方法进行测定，关于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适当确定。抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性可以以KD (Dissociation constant：解离常数)、表观的KD (Apparent dissociation constant：表观的解离常数)、作为解离速度的kd(Dissociation rate：解离速度常数)、或表观的kd (Apparent dissociation：表观的解离速度常数)等形式进行评价。这些可以利用本领域技术人员已知的方法进行测定，例如可以使用Biacore (GE healthcare)、Scatchard作图、FACS等。
本发明中，选择在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下的抗原结合活性高于在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤，与选择在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下的抗原结合活性低于在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤为相同含义。
只要是在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下的抗原结合活性高于在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下的抗原结合活性，则对在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下的抗原结合活性与在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，但优选在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下的抗原结合活性为在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下的抗原结合活性的2倍以上、进一步优选为10倍以上、更优选为40倍以上。
通过上述的筛选方法筛选的本发明的取决于氢离子浓度条件对抗原的结合活性发生变化的抗原结合结构域或抗原结合分子可以采用任意方式进行调制，例如可以使用：预先存在的抗原结合分子、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由得自免疫动物的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制作的抗体或文库、将侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变导入到这些抗体或文库而得的抗体或文库(侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含量提高而得的文库、或在特定位置导入有侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的文库等)等。
作为从由得自免疫动物的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制作的抗原结合结构域或抗原结合分子获取在低氢离子浓度或高pH即pH中性区的条件下的抗原结合活性高于在高氢离子浓度或低pH即pH酸性区的条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的方法，例如可以适合举出：如国际公开WO2009/125825中记载的抗原结合结构域或抗原结合分子中的氨基酸的至少一个被取代为侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变、或抗原结合结构域或抗原结合分子中插入有侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸而得的抗原结合分子或抗原结合分子。
对待导入侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变的位置没有特别限定，只要是与取代或插入前相比使在pH酸性区下的抗原结合活性弱于在pH中性区下的抗原结合活性(KD (pH酸性区)/KD (pH中性区)的值增大、或kd (pH酸性区)/kd (pH中性区)的值增大)，则可以是任何的位点。例如可以适合举出：抗原结合分子为抗体时，抗体的可变区或CDR等。待被取代成侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的氨基酸的数目、或待插入的氨基酸的数目，本领域技术人员可以适当确定，可以被侧链pKa为4.0-8.0的一个氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸取代、可以插入侧链pKa为4.0-8.0的一个氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸、可以被侧链pKa为4.0-8.0的两个以上的多个氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸取代、可以插入侧链pKa为4.0-8.0的两个以上氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸。而且，除了取代成侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸或插入侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸以外，还可以同时进行其它氨基酸的缺失、添加、插入和/或取代等。取代成侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸或插入侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸，可以通过将本领域技术人员的已知的丙氨酸扫描的丙氨酸取代为组氨酸等的组氨酸等扫描等的方法随机地进行，可以从侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的取代或插入的突变随机导入的抗原结合结构域或抗体中选择与突变前相比KD (pH酸性区)/KD (pH中性区)或kd (pH酸性区)/kd (pH中性区)的值增大的抗原结合分子。
作为如上所述的进行了突变成其侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸、且在pH酸性区下的抗原结合活性低于在pH中性区下的抗原结合活性的抗原结合分子的优选的例子，例如可以适合举出：向其侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变后的在pH中性区下的抗原结合活性与向其侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变前的在pH中性区下的抗原结合活性相同的抗原结合分子。本发明中，其侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变后的抗原结合分子具有与其侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变前的抗原结合分子相同的抗原结合活性是指，将其侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变前的抗原结合分子的抗原结合活性设为100％时，其侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变后的抗原结合分子的抗原结合活性至少为10％以上、优选为50％以上、进一步优选为80％以上、更优选为90%以上。其侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变后的在pH7.4下的抗原结合活性可以高于其侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变前的在pH7.4下的抗原结合活性。由于其侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的取代或插入而使抗原结合分子的抗原结合活性降低时，可以通过抗原结合分子中的一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等制成抗原结合活性与其侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的取代或插入前的抗原结合活性相同。本发明中，也包含在这样的侧链pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的取代或插入后通过进行一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入而使结合活性相同的抗原结合分子。
作为本发明的一个方式，即使将导入有“取决于氢离子浓度条件对抗原的抗原结合结构域或抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基”的轻链可变区和作为随机化可变区序列文库制作的重链可变区组合，也可以制作包含本发明的多个的彼此序列不同的抗原结合结构域或抗原结合分子的文库。
作为该氨基酸残基的非限定的例子，可以示例：包含在轻链CDR1中的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定的例子，可以示例：包含在轻链CDR2中的氨基酸残基。另外，作为该氨基酸残基的非限定的另外的例子，还可以示例：包含在轻链CDR3中的氨基酸残基。
如上所述，作为该氨基酸残基包含在轻链CDR1中的氨基酸残基的非限定的例子，可以举出：轻链可变区CDR1中的Kabat编号所表示的24位、27位、28位、31位、32位和/或34位的氨基酸残基。另外，作为该氨基酸残基包含在轻链CDR2中氨基酸残基的非限定的例子，可以举出：轻链可变区CDR2中的Kabat编号所表示的50位、51位、52位、53位、54位、55位和/或56位的氨基酸残基。并且，作为该氨基酸残基包含在轻链CDR3中的氨基酸残基的非限定的例子，可以举出：轻链可变区CDR3中的Kabat编号所表示的89位、90位、91位、92位、93位、94位和/或95A位的氨基酸残基。另外，这些氨基酸残基只要是取决于氢离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化即可，可以单独包含这些氨基酸残基，也可以组合包含这些氨基酸的两个以上。
即使在将上述的导入有“取决于氢离子浓度条件对抗原的抗原结合分子的结合活性发生变化的至少一个氨基酸残基”的轻链可变区和作为随机化可变区序列文库制作的重链可变区组合时，与上述同样，也可以设计成柔性残基包含在该轻链可变区的序列中。本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子对抗原的结合活性，只要是取决于氢离子浓度条件发生变化，则对该柔性残基的数目和位置不限于特定的方式。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以包含一个或其以上的柔性残基。例如，作为待导入到轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性的例子，可以举出：表3或表4中记载的氨基酸残基。另外，作为取决于氢离子浓度条件对抗原的抗原结合结构域或抗原结合分子的结合活性发生变化的氨基酸残基或柔性残基以外的轻链可变区的氨基酸序列，可以适当使用Vk1 (SEQ ID NO：46)、Vk2 (SEQ ID NO：47)、Vk3 (SEQ ID NO：48)、Vk4 (SEQ ID NO：49)等的生殖细胞系的序列作为非限定的例子。
[表3]
Figure DEST_PATH_IMAGE003
(位置表示Kabat编号)
[表4]
Figure 938DEST_PATH_IMAGE004
(位置表示Kabat编号)
作为上述的、取决于氢离子浓度条件对抗原的抗原结合结构域或抗原结合分子的结合活性发生变化的氨基酸残基，还可以适合使用任何的氨基酸残基，作为这样的氨基酸残基，可以具体举出：侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸。作为这样的具有供电子性的氨基酸，可以适合示例：组氨酸或谷氨酸等的天然氨基酸、以及组氨酸类似物(US2009/0035836)或m-NO2-Tyr (pKa 7.45)、3,5-Br2-Tyr (pKa 7.21)或3,5-I2-Tyr (pKa 7.38)等的非天然氨基酸(Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-3768)。另外，作为该氨基酸残基的特别适合的例子，可以举出：侧链的pKa为6.0-7.0的氨基酸。作为这样的具有供电子性的氨基酸，可以适合示例：组氨酸。
作为待组合的重链可变区的例子，可以适合举出：随机化可变区文库。随机化可变区文库的制作方法可以适当组合已知的方法。在本发明的非限定的一个方式中，可以适合使用：基于用特定抗原免疫的动物、感染症患者、进行疫苗接种而使血中抗体效价增加的人、癌症患者、或自身免疫疾病的来自淋巴细胞的抗体基因构建的免疫文库作为随机化可变区文库。
另外，在本发明的非限定的一个方式中，与上述同样，基因组DNA中的V基因或功能重构的V基因的CDR序列用包含编码适当长度的密码子组(codon sets)的序列的合成寡核苷酸组取代而得的合成文库，也可以适合用作随机化可变区文库。此时，由于观察到重链CDR3的基因序列的多样性，因此仅取代CDR3的序列也是可能的。抗原结合分子的可变区中产生氨基酸的多样性的标准是抗原结合分子的表面暴露位置的氨基酸残基具有多样性。表面暴露位置是指，根据抗原结合分子的结构、结构系综、和/或模型化的结构，判断为可表面暴露、和/或可与抗原接触的位置，但通常为其CDR。优选表面暴露位置采用InsightIIprogram (Accelrys)这样的计算机程序、使用来自抗原结合分子的三维模型的坐标进行确定。表面暴露位置可以使用该技术领域中已知的算法(例如，Lee和Richards (J. Mol.Biol. (1971) 55, 379-400)、Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558))进行确定。表面暴露位置的确定可以使用适于制作蛋白模型的软件和得自抗体的三维结构信息来进行。作为可以用于这样的目的的软件，可以适合举出：SYBYL生物高分子模块软件(Tripos Associates)。通常，还优选：当算法需要用户输入大小参数时，计算中使用的探针的“大小”设定为半径约1.4埃以下。并且，使用个人计算机用软件的表面暴露区和面积的确定方法记载于Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386和J. Mol. Model.(1995) 1, 46-53)中。
并且，在本发明的非限定的一个方式中，由来自正常人的淋巴细胞的抗体基因构建、且其所有组成成分中包含不含bias的抗体序列即天然序列的天然文库，也特别适合用作随机化可变区文库(Gejima等人(Human Antibodies (2002) 11, 121-129)和Cardoso等人(Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344) )。
另外，还可以组合用于增强在pH酸性区条件下的人FcRn结合活性的氨基酸改变。更具体而言，例如，作为用于增强在pH酸性区条件下的人FcRn结合活性而使用的改变，认为可以实施：IgG抗体的EU编号所表示的428位的Met取代为Leu、434位的Asn取代为Ser的方法(Nat Biotechnol, 2010 28: 157-159.)；434位的Asn取代为Ala的方法(Drug MetabDispos. 2010 Apr; 38(4): 600-5.)；252位的Met取代为Tyr、254位的Ser取代为Thr、256位的Thr取代为Glu的方法(J Biol Chem, 2006, 281: 23514-23524)；250位的Thr取代为Gln、428位的Met取代为Leu的方法(J Immunol. 2006, 176(1): 346-56)；434位的Asn取代为His的方法(Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2): 283-290.)；以及使用如WO2010106180、WO2010045193、WO2009058492、 WO2008022152、WO2006050166、WO2006053301、WO2006031370、WO2005123780、WO2005047327、WO2005037867、WO2004035752、WO2002060919等中所记载的改变。
另外，最近报道了：对于人源化抗CD4抗体，为了在pH酸性区的条件下增强对人FcRn的结合活性、提高血浆中滞留性，由EU编号表示的434位的Asn取代为His的抗体分子结合类风湿因子(rheumatoid factor，RF) (Clin Pharmacol Ther. 2011 Feb; 89(2):283-90)。该抗体具有人IgG1的Fc区，但通过将位于FcRn结合位点的434位的Asn取代为His，显示出其结合识别该取代位点的类风湿因子。
如上所述，作为用于在pH酸性区条件下增强对人FcRn的结合活性的改变，报道了各种改变，但通过将这些改变导入Fc区中的FcRn结合位点，可增强对识别该位点的类风湿因子的结合性。
但是，通过在Fc区的该位点中导入不降低对FcRn的结合活性、仅降低对类风湿因子的结合活性的改变，可制作不存在对类风湿因子的结合性、在pH酸性区条件下增强对人FcRn的结合活性的抗原结合分子。
作为这样的、降低对类风湿因子的结合活性的改变，使用对EU编号表示的248-257、305-314、342-352、380-386、388、414-421、423、425-437、439、441-444位的改变。优选使用对387、422、424、426、433、436、438、440位的改变。特别优选使用422位的Val取代为Glu或Ser的改变、424位的Ser取代为Arg的改变、433位的His取代为Asp的改变、436位的Tyr取代为Thr的改变、438位的Gln取代为Arg或Lys的改变、440位的Ser取代为Glu或Asp的改变。这些改变可以单独使用，也可以多个位点结合使用。
或者，为了降低对类风湿因子的结合活性，可以向该位点导入N型糖链的添加序列。具体而言，作为N型糖链的添加序列，已知Asn-Xxx-Ser/Thr (Xxx是除了Pro之外的任意氨基酸)，通过将该序列导入Fc区的该位点添加N型糖链，可以抑制由于N型糖链的空间位阻引起的与RF的结合。作为用于添加N型糖链的改变，优选使用248位的Lys取代为Asn的改变、424位的Ser取代为Asn的改变、436位的Tyr取代为Asn和438位的Gln取代为Thr的改变、438位的Gln取代为Asn的改变。特别优选使用424位的Ser取代为Asn的改变。
作为本发明的包含Fc区变体的多肽的优选例子，可以举出：如IgG抗体的、包含至少一个的缔合的两个Fc区变体的多肽。使用IgG抗体作为抗体时，对其恒定区的种类没有限定，可以使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等同种型(亚类)的IgG。本发明的IgG抗体优选为人IgG，进一步优选为人IgG1、人IgG4，人IgG1和人IgG4的重链恒定区的氨基酸序列是已知的。作为人IgG1恒定区，基于基因多态性的多个同种异型序列记载于Sequences of Proteins ofImmunological Interest, NIH Publication No. 91-3242中，本发明中可以是其任一种序列。
本发明中，氨基酸改变是指取代、缺失、添加、插入或修饰的任一种或它们的组合。本发明中，氨基酸改变可与氨基酸突变互换，以相同含义使用。
取代氨基酸残基时，其目的是通过取代为另外的氨基酸残基，例如对以下(a)～(c)几点进行改变：
(a) 片层结构或螺旋结构区中的多肽的主链结构；
(b) 靶位点的电荷或疏水性；或
(c) 侧链的大小。
氨基酸残基根据一般侧链的特性，分类为以下的组：
(1) 疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2) 中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；
(3) 酸性：asp、glu；
(4) 碱性：his、lys、arg；
(5) 影响链的取向的残基：gly、pro；以及
(6) 芳香性：trp、tyr、phe。
这些各组内的氨基酸残基的取代被称为保守性取代，另一方面，在其它组彼此之间的氨基酸残基的取代被称为非保守性取代。本发明中的取代可以是保守性取代，也可以是非保守性取代，还可以是保守性取代与非保守性取代的组合。
氨基酸序列的改变通过本领域已知的各种方法进行调制。这些方法中，可以通过位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa,M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, MJ, and Smith, M. (1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW,Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNAapproach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic AcidsRes. 12, 9441-9456; Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directedconstruction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492)、PCR突变法、盒突变法等方法进行，但不限于这些方法。
本发明的氨基酸修饰中包含翻译后修饰。作为具体的翻译后修饰，可以示出糖链的添加或缺失。例如，在由SEQ ID NO: 31记载的氨基酸序列组成的IgG1恒定区中，EU编号第297位的氨基酸残基可以用糖链修饰。对待修饰的糖链结构没有限定。通常，在真核细胞中表达的抗体在恒定区中包含糖链修饰。因此，在以下细胞中表达的抗体通常是被一些糖链修饰。
・哺乳动物的抗体产生细胞；
・用包含编码抗体的DNA的表达载体转化的真核细胞。
在此示出的真核细胞包括酵母和动物细胞。例如CHO细胞和HEK293H细胞是用于用包含编码抗体的DNA的表达载体转化的代表性的动物细胞。另一方面，在该位置没有糖链修饰的恒定区也包括在本发明的恒定区中。恒定区未被糖链修饰的抗体可以是将编码抗体的基因在大肠杆菌等原核细胞中表达获得。
更具体而言，例如可以是在Fc区的糖链上添加唾液酸(MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 519-27.)。
并且，本发明提供包含上述中任一项所述的Fc区变体的抗体。
本发明中的“抗体”术语以最广泛意义使用，只要是显示所需生物学活性即可，还包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体变体、抗体片段、多特异性抗体(多重特异性抗体) (例如双特异性抗体(双重特异性抗体) )、嵌合抗体、人源化抗体等任何的抗体。
对本发明的抗体，抗原种类、抗体的来源等没有限定，可以是任何抗体。抗体的来源没有特别限定，可以举出：人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体等。
制备抗体的方法是本领域技术人员熟知的，例如单克隆抗体可以通过杂交瘤法(Kohler和Milstein, Nature 256: 495 (1975))、重组法(美国专利第4,816,567号)制备。还可以从噬菌体抗体文库中分离(Clackson等人., Nature 352: 624-628 (1991); Marks等人, J.Mol.Biol. 222: 581-597 (1991))。
人源化抗体也称为重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中得到的人源化抗体等是已知的。用于获得人源化抗体的常规基因重组方法也是已知的。具体而言，作为将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，例如重叠延伸PCR是已知的。
通过将编码3个CDR和4个FR连接而成的抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA以框内融合方式插入表达载体中，可以制作人源化抗体表达用载体。将该重组载体导入宿主，建立重组细胞，然后培养该重组细胞，使编码该人源化抗体的DNA表达，由此使该人源化抗体在该培养细胞的培养物中产生(参照欧洲专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576)。
还可以根据需要取代FR的氨基酸残基，使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位。例如，应用在将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，可以向FR中导入氨基酸序列的突变。
具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作为免疫动物，可以通过DNA免疫获取所需的人抗体。
并且，还已知使用人抗体文库，通过淘选获取人抗体的技术。例如，人抗体的V区作为单链抗体(scFv)通过噬菌体展示法在噬菌体表面表达。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对所选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体的V区的DNA序列。确定了与抗原结合的scFv的DNA序列后，使该V区序列与所需的人抗体C区的序列框内融合，然后插入适当的表达载体，由此可以制作表达载体。将该表达载体导入上述举出的优选的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，由此可以获取该人抗体。这些方法已经是已知的(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
构成本发明的抗体的可变区可以是识别任意抗原的可变区。
本说明书中，抗原没有特别限定，可以是任何抗原。作为抗原的例子，例如可以适合举出：配体(细胞因子、趋化因子等)、受体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫球蛋白和部分地包含免疫球蛋白的免疫复合物。
作为细胞因子的例子，可以举出：白细胞介素1-18、集落刺激因子(G-CSF、M-CSF、GM-CSF等)、干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、生长因子(EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、TGF、HGF等)、肿瘤坏死因子(TNF-α、TNF-β)、淋巴毒素、促红细胞生成素、瘦蛋白、SCF、TPO、MCAF、BMP。
作为趋化因子的例子，可以举出：CCL1-CCL28等CC趋化因子、CXCL1- CXCL17等CXC趋化因子、XCL1- XCL2等C趋化因子、CX3CL1等CX3C趋化因子。
作为受体的例子，例如可以举出：造血因子受体家族、细胞因子受体家族、酪氨酸激酶型受体家族、丝氨酸/苏氨酸激酶型受体家族、TNF受体家族、G蛋白偶联型受体家族、GPI锚型受体家族、酪氨酸磷酸酶型受体家族、粘着因子家族、激素受体家族等属于受体家族的受体等。这些属于受体家族的受体及其特征在很多文献中有记载，例如Cooke BA.,King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol. 18B“Hormones and their Actions Part II” 1-46页 (1988) Elsevier SciencePublishers BV.、Patthy (Cell (1990) 61 (1): 13-14)、Ullrich等人. (Cell (1990)61 (2): 203-212)、Massague (Cell (1992) 69 (6): 1067-1070)、Miyajima等人.(Annu. Rev. Immunol. (1992) 10: 295-331)、Taga等人. (FASEB J. (1992) 6, 3387-3396)、Fantl等人. (Annu. Rev. Biochem. (1993), 62: 453-481)、Smith等人. (Cell(1994) 76 (6): 959-962)、Flower DR. (Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3):207-234)等。
作为属于上述受体家族的具体受体，例如可以适合举出：人或小鼠促红细胞生成素(EPO)受体(Blood (1990) 76 (1): 31-35、Cell (1989) 57 (2): 277-285)、人或小鼠粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22):8702-8706、mG-CSFR、Cell (1990) 61 (2): 341-350)、人或小鼠血小板生成素(TPO)受体(Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12): 5640-5644、EMBO J. (1993) 12(7):2645-53)、人或小鼠胰岛素受体(Nature (1985) 313 (6005): 756-761)、人或小鼠Flt-3配体受体(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2): 459-463)、人或小鼠血小板源性生长因子(PDGF)受体(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10): 3435-3439)、人或小鼠干扰素(IFN)-α、β受体(Cell (1990) 60 (2): 225-234和Cell (1994) 77 (3):391-400)、人或小鼠瘦蛋白受体、人或小鼠生长激素(GH)受体、人或小鼠白细胞介素(IL)-10受体、人或小鼠胰岛素样生长因子(IGF)-I受体、人或小鼠白血病抑制因子(LIF)受体、人或小鼠睫状神经营养因子(CNTF)受体等。
癌抗原是伴随着细胞的恶化而表达的抗原，也称为肿瘤特异性抗原。细胞癌化时，出现在细胞表面或蛋白分子上的异常的糖链也是癌抗原，也称为癌糖链抗原。作为癌抗原的例子，例如可以适合举出：作为上述受体属于GPI锚型受体家族、在以肝癌为代表的几种癌症中表达的GPC3 (Int J Cancer. (2003) 103 (4): 455-65) )、在以肺癌为代表的多种癌症中表达的EpCAM (Proc Natl Acad Sci USA. (1989) 86 (1): 27-31)、CA19-9、CA15-3、唾液酸SSEA-1 (SLX)等。
MHC抗原主要分类为MHC I类抗原和MHC II类抗原，MHC I类抗原包含HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H，MHC II类抗原包含HLA-DR、-DQ、-DP。
分化抗原可以包含CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130。
免疫球蛋白包含IgA、IgM、IgD、IgG、IgE。另外，免疫复合物至少包含免疫球蛋白的任意成分。
作为其它的抗原，可以示例下述的分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、活化素、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、artemin、抗Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3整联蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3成骨素(Osteogenin)、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7 (OP-1)、BMP-8 (BMP-8a, OP-2)、BMPR、BMPR-IA (ALK-3)、BMPR-IB (ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II (BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、铃蟾肽、骨源性神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3 (C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80 (B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体调节因子(衰变加速因子)、des (1-3)-IGF-I (脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR (ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮缩血管肽受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸性粒细胞趋化因子1、EpCAM、ephrinB2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择蛋白、ET-1、IIa因子、VII因子、VIIIc因子、IX因子、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、血纤蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵泡刺激素、fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3 (Vgr-2)、GDF-5 (BMP-14、CDMP-1)、GDF-6 (BMP-13、CDMP-2)、GDF-7 (BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(myostatin)、GDF-9、GDF-15 (MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gp120、类肝素酶、Her2、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV) gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5 (αV)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层粘连蛋白5、LAMP、LAP、LAP (TGF-1)、潜在TGF-1、潜在TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择蛋白、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄体生成素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC (HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Muc1)、MUC18、副中肾管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-钙粘蛋白、NCA90、NCAM、NCAM、中性溶酶、神经营养蛋白-3、-4或-6、neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙粘蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、C蛋白、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞病毒(RSV) F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72 (肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如，T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性、TGF-βRI (ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D (TRAIL R4DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A (RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B (OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12 (TWEAK R FN14)、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C (BAFF R)、TNFRSF14 (HVEMATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITRAITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L (RELT)、TNFRSF1A (TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B (TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNFRIII、TNFC R)、TNFRSF4 (OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5 (CD40 p50)、TNFRSF6 (FasApo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B (DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7 (CD27)、TNFRSF8 (CD30)、TNFRSF9 (4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21 (DR6)、TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25 (DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2 配体、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A (TNF-a连接蛋白、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3 (LTb TNFC、p33)、TNFSF4 (OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5 (CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6 (Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7 (CD27配体 CD70)、TNFSF8 (CD30配体CD153)、TNFSF9 (4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA125、肿瘤相关抗原表达Lewis-Y相关糖、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙粘蛋白、VE-钙粘蛋白-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3 (flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、von Willebrand因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、前激肽释放酶、RON、TMEM16F、SOD1、嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、tau、VAP1、高分子量激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、B因子、D因子、H因子、备解素、硬化蛋白(sclerostin)、血纤蛋白原、血纤蛋白、凝血酶原、凝血酶、组织因子、V因子、Va因子、VII因子、VIIa因子、VIII因子、VIIIa因子、IX因子、IXa因子、X因子、Xa因子、XI因子、XIa因子、XII因子、XIIa因子、XIII因子、XIIIa因子、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、血栓调节蛋白、TAPI、tPA、纤溶酶原、纤溶酶、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配体聚糖-1、多配体聚糖-2、多配体聚糖-3、多配体聚糖-4、LPA、S1P以及激素和生长因子的受体。
构成可变区的氨基酸序列，只要是维持其抗原结合活性，则允许一个或多个氨基酸残基的改变。改变可变区的氨基酸序列时，待改变的部位、改变的氨基酸数目没有特别限定。例如可以将存在于CDR和/或FR的氨基酸适当改变。改变可变区的氨基酸时没有特别限定，优选维持结合活性，例如与改变前相比，优选具有50%以上、优选80%以上、进一步优选100%以上的结合活性。另外，可以通过氨基酸改变使结合活性升高，例如结合活性与改变前相比，可以是2倍、5倍、10倍等。本发明的抗体中，氨基酸序列的改变可以是氨基酸残基的取代、添加、缺失和修饰中的至少一种。
例如，可变区N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰化而修饰为焦谷氨酸，这是本领域技术人员熟知的修饰。因此，当N末端为谷氨酰胺时，本发明的抗体重链包含谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的可变区。
本发明的抗体的可变区可以是任意的序列，可以是小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体以及将这些非人抗体人源化而成的人源化抗体、以及人抗体等任何来源的抗体的可变区。“人源化抗体”也称为重构人抗体，是将来自人以外的哺乳动物的抗体、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR; complementarity determining region)移植到人抗体的CDR所得。用于鉴定CDR的方法是已知的(Kabat等人., Sequence of Proteins ofImmunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.；Chothia等人., Nature (1989) 342: 877)。另外，其常规基因重组方法也是已知的(参照欧洲专利申请公开号EP125023号公报、WO96/02576号公报)。另外，对于这些抗体的可变区，为了改善与抗原的结合、药代动力学、稳定性、抗原性，可以导入各种氨基酸取代。本发明的抗体的可变区与抗原的结合具有pH依赖性，因此可以与抗原重复结合(WO2009/125825)。
抗体的轻链恒定区中存在κ链和λ链类型的恒定区，可以是任何轻链恒定区。并且，本发明中轻链恒定区可以是进行了氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等改变的轻链恒定区。
作为本发明的抗体的重链恒定区，例如可以使用人IgG抗体的重链恒定区，优选为人IgG1抗体、人IgG4抗体的重链恒定区。
另外，本发明的Fc区变体可以与其它蛋白质、生理活性肽等结合，制成Fc融合蛋白质分子。在此，融合蛋白质是指包含在天然情况下非自然连接的至少2个不同多肽的嵌合多肽。作为其它蛋白质、生理活性肽，例如可以举出受体、粘着分子、配体、酶，但并不限于这些。
作为本发明的Fc融合蛋白质分子的优选例子，可以举出：使Fc区与结合靶标的受体蛋白融合所得的蛋白质，例如可以举出：TNFR-Fc融合蛋白质、IL1R-Fc融合蛋白质、VEGFR-Fc融合蛋白质、CTLA4-Fc融合蛋白质等(Nat Med. 2003 Jan; 9(1): 47-52、BioDrugs. 2006; 20(3): 151-60)。另外，与本发明的多肽融合的蛋白质只要是与靶分子结合即可，可以是任何分子，例如可以举出：scFv分子(WO2005/037989)、单结构域抗体分子(WO2004/058821、WO2003/002609)、抗体样分子(Current Opinion in Biotechnology2006, 17: 653-658、Current Opinion in Biotechnology 2007, 18: 1-10、CurrentOpinion in Structural Biology 1997, 7: 463-469、Protein Science 2006, 15: 14-27)、例如DARPins (WO2002/020565)、Affibody (WO1995/001937)、Avimer (WO2004/044011、WO2005/040229)、Adnectin (WO2002/032925)等。另外，抗体和Fc融合蛋白质分子还可以是与多数种类的靶分子或表位结合的多重特异性抗体。
另外，本发明的抗体中也包括抗体修饰物。作为抗体修饰物的例子，例如可以举出：与聚乙二醇(PEG)和细胞毒性物质等各种分子结合的抗体。上述抗体修饰物可以通过对本发明的抗体实施化学修饰而获得。抗体修饰方法在该领域中已经建立。
并且，本发明的抗体可以是双重特异性抗体(bispecific antibody)。双重特异性抗体是指在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体，该表位可以存在于不同分子中，也可以存在于同一分子中。
本发明的多肽可以按照本领域技术人员已知的方法制备。例如，抗体可以按照以下方法制作，但并不限于此。
表达编码抗体重链的DNA和编码抗体轻链的DNA，编码抗体重链的DNA是编码Fc区中的一个或多个氨基酸残基被取代为其它目标氨基酸的重链的DNA。编码Fc区中的一个或多个氨基酸残基被取代为其它目标氨基酸的重链的DNA例如可以如下获得：获取编码天然型重链的DNA的Fc区部分，适当导入取代，使编码该Fc区中特定的氨基酸的密码子编码其它目标氨基酸。
另外，预先设计DNA，使其编码天然型重链的Fc区中的一个或多个氨基酸残基被取代为其它目标氨基酸的蛋白，化学合成该DNA，由此也可以获得编码Fc区中的一个或多个氨基酸残基被取代为其它目标氨基酸的重链的DNA。作为氨基酸的取代部位、取代的种类，没有特别限定。另外，并不限于取代，也可以是缺失、添加、插入的任意一种或它们的组合。
另外，编码Fc区中一个或多个氨基酸残基被取代为其它目标氨基酸的重链的DNA可以分成部分DNA来制备。作为部分DNA的组合，例如可以举出：编码可变区的DNA与编码恒定区的DNA，或者编码Fab区的DNA与编码Fc区的DNA等，但并不限于这些组合。编码轻链的DNA也同样可以分成部分DNA来制备。
作为使上述DNA表达的方法，可以举出以下的方法。例如，将编码重链可变区的DNA与编码重链恒定区的DNA一起插入到表达载体中，构建重链表达载体。同样，将编码轻链可变区的DNA与编码轻链恒定区的DNA一起插入到表达载体中，构建轻链表达载体。也可以将这些重链、轻链的基因插入到单一的载体中。
将编码目标抗体的DNA插入到表达载体中时，以在表达控制区例如增强子、启动子的控制下进行表达的方式插入到表达载体中。接着，用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。此时，可以使用适当的宿主与表达载体的组合。
作为载体的例子，可以举出：M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，以cDNA的亚克隆、切除为目的时，除了上述载体之外，例如还可以使用pGEM-T、pDIRECT、pT7等。
在生产本发明的多肽的目的中使用载体时，表达载体特别有用。作为表达载体，例如在宿主为JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大肠杆菌时，具有可在大肠杆菌中高效表达的启动子是不可缺少的，例如lacZ启动子(Ward等人, Nature (1989) 341: 544-546；FASEBJ. (1992) 6: 2422-2427；其全文通过参照纳入到本说明书中)、araB启动子(Better等人,Science (1988) 240: 1041-1043，其全文通过参照纳入到本说明书中)或T7启动子等。作为这样的载体，除了上述载体之外，还可以举出：pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpresssystem” (QIAGEN公司制造)、pEGFP或pET (此时，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)等。
另外，在载体中还可以包含用于多肽分泌的信号序列。作为用于多肽分泌的信号序列，在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pelB信号序列(Lei, S. P.等人J.Bacteriol. (1987) 20 169: 4379，其全文通过参照纳入到本说明书中)。载体向宿主细胞的导入例如可以使用脂质转染法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法来进行。
除了大肠杆菌表达载体之外，例如，作为用于制备本发明的多肽的载体，可以举出：来自哺乳动物的表达载体(例如，pcDNA3 (Invitrogen)或pEGF-BOS (Nucleic Acids.Res. 1990, 18(17): p5322，其全文通过参照纳入到本说明书中)、pEF、pCDM8)，来自昆虫细胞的表达载体(例如，“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统” (Gibco-BRL公司制造)、pBacPAK8)，来自植物的表达载体(例如，pMH1、pMH2)，来自动物病毒的表达载体(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)，来自反转录病毒的表达载体(例如，pZIPneo)，来自酵母的表达载体(例如，“Pichia Expression Kit” (Invitrogen公司制造)、pNV11、SP-Q01)，来自枯草杆菌的表达载体(例如，pPL608、pKTH50)。
以在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中的表达为目的时，具有用于在细胞内表达所必需的启动子是不可缺少的，例如SV40启动子(Mulligan等人., Nature(1979) 277, 108，其全文通过参照纳入到本说明书中)、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人, Nucleic Acids Res. (1980) 18, 5322，其全文通过参照纳入到本说明书中)、CAG启动子(Gene. (1991) 108, 193，其全文通过参照纳入到本说明书中)、CMV启动子等，进一步优选具有用于筛选转化细胞的基因(例如，可通过药物(新霉素、G418等)判别的耐药性基因)。作为具有上述特性的载体，例如可以举出：pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
并且，以稳定表达基因、且扩增细胞内的基因拷贝数目为目的时，可以举出以下方法：在核酸合成途径缺失的CHO细胞中导入具有补偿该缺失的DHFR基因的载体(例如，pCHOI等)，通过氨甲蝶呤(MTX)扩增；另外，以基因的瞬时表达为目的时，可以举出以下方法：使用在染色体上具有表达SV40 T抗原的基因的COS细胞，用具有SV40的复制起点的载体(pcD等)进行转化。作为复制起点，还可以使用来自多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。并且，为了在宿主细胞体系内扩增基因拷贝数目，表达载体可以包含氨基葡糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标志物。
抗体的回收例如可以通过培养转化的细胞，然后从分子转化的细胞的细胞内或培养液分离来进行。对于抗体的分离、纯化，可以将离心、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、1q、FcRn、蛋白A、蛋白G柱、亲和柱层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法适当组合来进行。
而且，通过使用包含本发明的Fc区变体和对在血浆中以可溶型存在且成为病因的抗原具有结合活性、取决于离子浓度条件对该抗原的结合活性发生变化的抗原结合结构域的多肽，提供促进血浆中的该抗原消失的方法。
如国际公开第WO2011/122011号中所记载的那样，报道了：进一步改变pH依赖性抗原结合分子以在中性条件下(pH7.4) 增强FcRn结合而得的pH依赖性抗原结合分子，由于具有可与抗原重复结合的效果和使抗原从血浆中消失的效果，因此通过给予具有这样的抗原结合结构域的多肽可以从血浆中去除抗原(国际公开第WO2011/122011号)。但是，迄今为止，利用在中性条件下增强FcRn结合以外的方法来加速去除抗原的方法还没有报道。
在本实施例中，确认到：包含取决于pH条件对抗原的结合活性发生变化的抗原结合结构域的多肽，尽管包含不增强pH中性区的FcRn结合的来自天然型IgG1的Fc区，经由与FcγR的结合，与抗原单独时相比，加速血浆中的抗原消失。不拘泥于特定的理论，作为这种现象在克隆278等中发生的理由，示例以下的机理。
如sIL-6R等可以结合抗原结合结构域的部位为一个(即同源单体)时，两个分子的抗原与包含二价抗原结合结构域的一个分子的抗体结合，一个分子的抗sIL-6R抗体与包含二单元的抗原结合单元的两个分子的抗原分子形成复合物。因此，这样的抗原与抗体的复合物如图9所示，仅具有一个Fc区(天然型IgG1的Fc区)。该复合物经由一个Fc区与一个分子的FcγR、或两个分子的FcRn结合，因此对这些受体的亲和性与通常的IgG抗体同样，摄入到细胞内被认为大多以非特异性发生。
另一方面，当抗原如人IgE等是重链和轻链的异源复合物的二聚体、存在两处抗原结合结构域所结合的表位时，被认为：包含在一个分子抗IgE抗体中的二价的各抗原结合结构域分别与一个分子IgE分子中存在的二单元的表位结合，从表位配置等角度考虑是困难的。其结果，被认为：在一个分子抗IgE抗体中存在的二价抗原结合结构域所结合的两个分子IgE中存在的二单元的抗原结合单元中，通过结合另外的抗IgE抗体分子，形成包含至少四个分子(即，作为抗原分子的IgE的两个分子和作为包含抗原结合结构域的多肽的抗IgE抗体的两个分子)的抗原抗体复合物(免疫复合物)。
因此，包含含有两个以上可以结合抗原结合结构域的部位的抗原分子所结合的抗体等的抗原结合结构域的多肽至少形成四聚体的大的免疫复合物时，该免疫复合物可以至少经由两个以上的多价Fc区以亲合力(avidity)与FcγR、FcRn、补体受体等牢固结合。但是，可以结合抗原结合结构域的部位为一个的抗原分子时，包含抗原结合结构域的多肽与抗原分子的免疫复合物，对于这些受体的Fc区介导的亲和性，与形成上述免疫复合物时相比不充分。具体而言，该免疫复合物以高效率被摄入到表达这些受体的细胞中。
抗原分子为包含两个以上抗原结合结构域所结合的部位时，本发明的多肽通过具有取决于pH依赖性结合等的离子浓度条件对抗原的结合发生变化的抗原结合结构域，该多肽例如为抗体时，在血浆中形成由至少四个分子(两个分子的抗原和两个分子的抗体)以上构成的抗原抗体复合物(免疫复合物)，若该免疫复合物被摄入到细胞内，则其离子浓度条件与血浆中的条件不同，因此在内体内抗原从该抗体解离。因此，在摄入了该免疫复合物的细胞的内体内中，该免疫复合物的形成被解体。由于解离了的抗原在内体内不能与FcRn结合，所以转移到溶酶体后被分解。另一方面，被认为：解离了抗原的抗体在内体内与FcRn结合后再循环到血浆中。本实施例的取决于pH条件以外的离子浓度条件，同样的再循环是可能的，在参考实施例3～6中，显示出：代替pH依存的条件，使用取决于钙浓度的条件对抗原的结合活性发生变化的抗原结合结构域，可以加速血浆中的抗原消失。
因此，抗原和针对该抗原具有抗原结合结构域的多肽形成的复合物，通过使该免疫复合物对FcγR、FcRn、补体受体等具有两个以上的多价Fc区，可以加速该抗原的消失。
此外，参考实施例7～9的研究显示出：对于FcγR介导的抗原的去除，在FcγR中，作为抑制型FcγR的FcγRIIB的作用最大。即，假设降低了对FcγR的结合，只要是能够维持对FcγRIIB的结合，就可以维持抗体的FcγR介导的抗原的消失能力。
迄今为止，在几种抗体药物中，报道了来自IgG与FcγR相互作用的副作用。例如，已知在给予了抗VEGF的抗体-贝伐珠单抗的患者组中，血栓栓塞症的频率增加(J. Natl.Cancer Inst. (2007) 99 (16), 1232-1239)。另外，在抗CD40配体的抗体的临床开发试验中也同样观察到了血栓栓塞症，使得临床试验被中止(Arthritis. Rheum. (2003) 48(3), 719-727.)。虽然在血小板的细胞上表达的是作为活性型Fcγ受体的FcγRIIa而不是作为抑制型Fcγ受体的FcγRIIb (J. Exp. Med. (2006) 203 (9), 2157-2164)，但通过使用动物模型等的其后的研究暗示了：所给予的各抗体均经由与血小板上的FcγRIIa的结合使血小板凝聚，其结果形成了血栓(J. Thromb. Haemost. (2009) 7 (1), 171-181、 J.Immunol. (2010) 185 (3), 1577-1583)。据报道：在作为自身免疫疾病之一的系统性红斑狼疮患者中，通过FcγRIIa依赖性的机制使血小板活化，血小板的活化与症状严重程度相关(Sci. Transl. Med. (2010) 2 (47), 47-63)。
另外，还报道了：迄今为止，通过使用动物模型的研究，抗体和多价抗原的免疫复合物经由活性型FcγR诱导过敏反应(Bruhns P., Blood. (2012) 119(24): 5640-9.)。
此外，报道了：多价抗原和抗体的免疫复合物经由活性型FcγR被摄入，由此针对该抗原的抗体效价的产生增加(Scand J Immunol. (2006) 64(3): 177-84.; J Immunol.(1999) 163: 618-22.)。暗示了：当为识别多价抗原的抗体药物时，针对抗体药物自身的抗体具有容易产生的可能性。被认为：当产生了针对抗体药物的抗体时，其血液动力学恶化，且效果减弱。
由此认为：通过使抗体与多价抗原结合以形成免疫复合物，通过使该免疫复合物与活性型FcγR相互作用，诱导各种副作用，且作为抗体药物的价值降低。作为多价抗原(多聚体抗原)，作为例子可以举出：GDF、GDF-1、GDF-3 (Vgr-2)、GDF-5 (BMP-14、CDMP-1)、GDF-6 (BMP-13、CDMP-2)、GDF-7 (BMP-12、CDMP-3)、GDF-8 (myostatin)、GDF-9、GDF-15 (MIC-1)、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFSF10 (TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK配体 ODF、OPG配体)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR配体 AITR配体、TL6)、TNFSF1A (TNF-a连接蛋白(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3 (LTb TNFC、p33)、TNFSF4 (OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5 (CD40配体 CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6 (Fas配体 Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7 (CD27配体 CD70)、TNFSF8 (CD30配体 CD153)、TNFSF9 (4-1BB配体 CD137配体)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性、或IL-8等。
作为用于解决这些问题的方法，可以考虑对FcγR的结合减弱的方法。但是，被认为：当对所有FcγR的结合减弱时，即使使用其抗体，也无法加速FcγR介导的抗原去除。
如上所述，在抗体的FcγR介导的抗原去除中，FcγR中的FcγRIIB发挥主要的作用，来自与FcγR的相互作用的副作用起因于与活性型FcγR的相互作用，因此通过维持对FcγRIIB的结合、且选择性地减弱对其它活性型FcγR的结合，可以在不损失抗原消失能力的情形下，制作降低来自活性型FcγR的副作用的优异的抗体。
因此，通过包含本发明的Fc区变体和取决于离子浓度条件该对抗原的结合活性发生变化的抗原结合结构域的多肽，对于在血浆中以可溶型存在且成为病因的抗原从血浆中的消失，可以获得优异的促进效果。
另外，通过利用本发明的多肽，该多肽所结合的抗原即使仅具有一个可以结合抗原结合结构域的部位的抗原(单体抗原)，也可以获得同样的效果。
作为这样的例子，可以举出：使用具有抗原结合结构域的多肽混合物(cocktail)来促进单体抗原从血浆中消失的方法。
如上所述，抗原为多聚体抗原(例如，作为非限定的一个例子，IgA、IgE等免疫球蛋白，或者TNF或CD154等TNF超家族)时，被认为有形成包含两个以上抗原结合分子和两个以上抗原结合单元的大的免疫复合物的情形。另一方面，被认为：即使抗原为单体抗原时，也可以是包含与存在于该单体抗原的不同表位分别结合的适当的两个以上抗原结合结构域的多肽、且取决于(pH或Ca等)离子浓度条件对该表位的结合发生变化的多肽的混合物，也可以是形成包含两个以上抗原结合结构域的多肽和包含两个以上抗原结合结构域结合部位(单体抗原)的大的免疫复合物。本说明书中，将包含与存在于单体抗原的不同表位分别结合的适当的两个以上抗原结合结构域的多肽、且取决于(pH或Ca等)离子浓度条件对该表位的结合发生变化的抗原结合分子的混合物称为抗原结合分子混合物(cocktail)。其中，包含抗原结合结构域的多肽中，只要是形成免疫复合物的至少一个多肽(所含的抗原结合结构域)为取决于离子浓度条件对抗原的结合活性发生变化的抗原结合结构域即可。
另外，作为其它的例子，可以举出：使用包含多重特异性(multispecific)或多重补位性(multiparatopic)的抗原结合结构域的多肽来促进单体抗原从血浆中消失的方法。
另外，被认为：即使抗原为单体抗原时，也可以是具有包含抗原结合结构域的多肽所含的各抗原结合结构域与存在于该单体抗原的不同表位分别结合的特征、且包含对各抗原结合结构域的表位的结合取决于(pH或Ca等)离子浓度条件发生变化的抗原结合结构域的抗原结合分子，也可以是形成包含两个以上抗原结合结构域的多肽和包含两个以上抗原结合单元(单体抗原)的大的免疫复合物。作为上述多肽的非限定的一个方式，可以示例：包含与存在于单体抗原的彼此不同表位结合的适当可变区的多重特异性(multispecific，多特异性)抗体、或多重补位性的(multiparatopic)抗体。作为这样的多重特异性(multispecific，多特异性)抗体、或多重补位性的(multiparatopic)抗体的非限定的一个方式，被认为：其可变区可以是pH或Ca依赖性的结合抗体(如图19所示的包含识别表位A的右腕可变区和包含识别表位B的左腕可变区的双重特异性(bispecific)抗体或双重补位性(biparatopic)抗体)，也可以是形成包含两个以上抗体和两个以上抗原结合单元(单体抗原)的大的免疫复合物。
通过筛选针对单体抗原的不同表位的抗原结合结构域、对该各表位的结合活性取决于离子浓度条件而发生变化、可通过亲和力与上述受体结合的抗原结合结构域的组合，可以获取进一步加速单体抗原从血浆中消失的抗原结合分子。使多重特异性或多重补位性的抗原结合结构域对各表位的结合活性发生变化的离子浓度条件可以是相同的离子浓度条件，也可以是不同的离子浓度条件。例如，双重特异性或双重补位性的抗原结合结构域对一方的抗原结合结构域的表位的结合活性取决于pH条件、或Ca离子浓度等金属离子浓度条件而发生变化的包含双重特异性或双重补位性的抗原结合结构域的抗原结合分子，可以作为本发明的抗原结合分子的非限定的一个方式示例。并且，例如，双重特异性或双重补位性的抗原结合结构域对一方的抗原结合结构域的表位的结合活性取决于pH条件而发生变化、对另一方的抗原结合结构域的表位的结合活性取决于Ca离子浓度等金属离子浓度条件而发生变化的包含双重特异性或双重补位性的抗原结合结构域的抗原结合分子，可以作为本发明的抗原结合分子的非限定的一个方式示例。另外，双重特异性或双重补位性的抗原结合结构域对一方的抗原结合结构域的表位的结合活性取决于pH条件而发生变化、对另一方的抗原结合结构域的表位的结合活性也取决于pH条件而发生变化的包含双重特异性或双重补位性的抗原结合结构域的抗原结合分子，也可以作为本发明的抗原结合分子的非限定的一个方式示例。并且，双重特异性或双重补位性的抗原结合结构域对一方的抗原结合结构域的表位的结合活性取决于Ca离子浓度等金属离子浓度条件而发生变化、对另一方的抗原结合结构域的表位的结合活性取决于Ca离子浓度等金属离子浓度条件而发生变化的包含双重特异性或双重补位性的抗原结合结构域的多肽抗原结合分子，也可以作为本发明的抗原结合分子的非限定的一个方式示例。
作为本发明的包含多重特异性抗原结合结构域的多肽、或包含多重补位性的抗原结合结构域的多肽分子，具有其至少一个抗原结合结构域与抗原分子中的第一表位结合、其至少一个另外的抗原结合结构域与抗原分子中的第二表位结合的特征的包含至少两个抗原结合结构域的多肽，从其反应特异性的角度考虑，被称为多重特异性抗原结合分子。通过包含在一个分子抗原结合分子中的二种类抗原结合结构域而使该抗原结合分子与两个不同表位结合时，该抗原结合分子被称为双重特异性抗原结合分子。另外，通过包含在一个分子抗原结合分子中的三种类抗原结合结构域而使该抗原结合分子与三个不同表位结合时，该抗原结合分子被称为三重特异性抗原结合分子。
抗原分子中的与第一表位结合的抗原结合结构域中的补位和与第一表位结构不同的第二表位结合的抗原结合结构域中的补位，其结构彼此不同。所以，具有其至少一个抗原结合结构域与抗原分子中的第一表位结合、其至少一个另外的抗原结合结构域与抗原分子中的第二表位结合的特征的包含至少两个抗原结合结构域的抗原结合分子，从其结构特异性的角度考虑，被称为多重补位性抗原结合分子。通过包含在一个分子抗原结合分子中的二种类抗原结合结构域而使该抗原结合分子与两个不同表位结合时，该抗原结合分子被称为双重补位性抗原结合分子。另外，通过包含在一个分子抗原结合分子中的三种类抗原结合结构域而使该抗原结合分子与三个不同表位结合时，该抗原结合分子被称为三重补位性抗原结合分子。
包含一个或多个抗原结合结构域的多价的多重特异性或多重补位性抗原结合分子及其调制方法也记载于Conrath等人(J. Biol. Chem. (2001) 276 (10) 7346-7350)、Muyldermans (Rev. Mol. Biotech. (2001) 74, 277-302)和Kontermann R. E. (2011)Bispecific Antibodies (Springer-Verlag)等的非专利文献、以及国际公开WO1996/034103或WO1999/023221等的专利文献等中。通过使用上述文献中记载的多重特异性或多重补位性抗原结合分子及其调制方法，可以制作本发明的抗原结合分子。
作为上述的多重特异性或多重补位性抗原结合分子及其调制方法的一个方式，可以示例：下述的双重特异性抗体及其制作方法。双重特异性抗体是指，包含与不同表位特异性结合的二种类可变区的抗体。IgG型双重特异性抗体可以通过将产生IgG抗体的两种杂交瘤融合而产生的杂交的杂交瘤(四体瘤，quadroma)进行分泌(Milstein等人(Nature(1983) 305, 537-540)。
使用上述的抗体项目中记载的重组方法制备双重特异性抗体时，可以采用将编码包含目标的两种可变区的重链的基因导入到细胞中使它们共表达的方法。但是，即使仅考虑此类共表达方法中的重链组合，也将产生(i)包含与第一表位结合的可变区的重链和包含与第二表位结合的可变区的重链成为一对的重链组合、(ii)仅包含与第一表位结合的可变区的重链成为一对的重链组合、(iii)仅包含与第二表位结合的可变区的重链成为一对的重链组合以2：1：1的分子数的比例存在的混合物。从这三种类重链组合的混合物中难以纯化包含目标重链组合的抗原结合分子。
使用这样的重组方法来制备双重特异性抗体时，通过向构成重链的CH3结构域加入适当的氨基酸取代的改变，可以优先分泌包含异种组合的重链的双重特异性抗体。具体而言，有如下的方法：通过将在一方重链CH3结构域中存在的氨基酸侧链取代为更大侧链(knob (“突起”) )，在另一方重链CH3结构域中存在的氨基酸侧链取代为更小的侧链(hole(“空隙”) )，可将突起配置于空隙内，从而引起异种重链形成的促进和同种重链形成的抑制(国际公开WO1996/027011、Ridgway等人(Protein Engineering (1996) 9, 617-621)、Merchant等人(Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681) )。
另外，还已知：通过将多肽缔合、或由多肽构成的异种多聚体的缔合的控制方法用于重链缔合，来制作双重特异性抗体的技术。即，通过改变形成重链内的界面的氨基酸残基，抑制具有同源序列的重链缔合，来形成序列不同的两个重链的控制方法在双重特异性抗体的制作中可以采用(国际公开WO2006/106905)。
并且，还报道了：通过分别获取二种类的单克隆抗体，将它们在体外在还原剂存在下进行混合来获取双重特异性抗体的技术(国际公开WO2008/119353)。该技术是：二种类的单克隆抗体通过还原剂开裂成各自的半分子，通过将它们再缔合，以一定的比率获得双重特异性抗体的技术。另外，还报道了：通过取代存在于CH3结构域的氨基酸，控制半分子的再缔合，更有效地获得双重特异性抗体的方法(国际公开WO2011/131746)。这样的方法在制备双重特异性抗体时也可用采用。
本发明中，“促进抗原从血浆中消失”是指，当将包含抗原结合结构域的多肽(以下，也称为抗原结合分子)给予到生物体内、或抗原结合分子分泌到生物体内时，使血浆中存在的抗原从血浆中消失的能力提高。因此，给予抗原结合分子时，与给予包含抗原结合活性不取决于离子浓度而发生变化的抗原结合结构域的抗原结合分子、包含在pH酸性区条件下不具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的抗原结合分子、或包含不具有Fcγ受体选择性结合活性的Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子时相比，只要是可以加速抗原从血浆中消失即可。抗原结合分子是否增加血浆中抗原消失能力，例如，可以通过将可溶型抗原和抗原结合分子给予到生物体内，然后测定给予后的可溶型抗原的血浆中浓度进行判断。当给予包含抗原结合活性取决于离子浓度条件发生变化的抗原结合结构域、在pH酸性区条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域、以及具有Fcγ受体选择性结合活性的Fcγ受体结合结构域(选择性FcγR结合结构域)的抗原结合分子和可溶型抗原之后血浆中的可溶型抗原的浓度降低时，可以判断为抗原结合分子增加了血浆中抗原消失能力。在此，选择性FcγR结合结构域是指，对FcγRIIb的结合维持、且对活性型FcγR的结合降低的结构域。可溶型抗原可以是在血浆中与抗原结合分子结合的抗原、或者可以是不结合抗原结合分子的抗原，其浓度可以分别以“血浆中抗原结合分子结合抗原浓度”和“血浆中抗原结合分子非结合抗原浓度”的形式进行确定(后者与“血浆中游离抗原浓度”同义)。“血浆中总抗原浓度”是指，将抗原结合分子结合抗原和抗原结合分子非结合抗原合计而得的浓度、或者作为抗原结合分子非结合抗原浓度的“血浆中游离抗原浓度”，因此可溶型抗原浓度可以以“血浆中总抗原浓度”的形式进行确定。测定“血浆中总抗原浓度”或“血浆中游离抗原浓度”的各种方法如本说明书中以下所记载的那样是该技术领域中众所周知的。
本发明中，“药代动力学的提高”、“药代动力学的改善”和“优异的药代动力学”可与“血浆中(血中)滞留性的提高”、“血浆中(血中)滞留性的改善”、“优异的血浆中(血中)滞留性”、“血浆中(血中)滞留性延长”互换，这些句子以相同含义应用。
本发明中，“改善药代动力学”也包含：不仅自将抗原结合分子给予人、或小鼠、大鼠、猴、兔、狗等非人动物起，到从血浆中消失为止(例如，到在细胞内被分解等使抗原结合分子处于不可能返回到血浆中的状态为止)的时间延长，而且自给予抗原结合分子起，到由于分解而消失为止之间以可与抗原结合的状态(例如，抗原结合分子不与抗原结合的状态)滞留于血浆中的时间也延长。具有天然型Fc区的人IgG可以与来自非人动物的FcRn结合。例如，相比人FcRn，具有天然型Fc区的人IgG可以与小鼠FcRn牢固结合(Int. Immunol.(2001) 13 (12), 1551-1559)，因此以确认本发明的抗原结合分子的特性为目的，可以优选使用小鼠进行给药。作为另外的例子，原本的FcRn基因被破坏，具有与人FcRn基因相关的转基因且表达的小鼠(Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)，以下记载的以确认本发明的抗原结合分子的特性为目的，也可以用于进行给药。具体而言，“改善药代动力学”还包含：不与抗原结合的抗原结合分子(抗原非结合型抗原结合分子)到由于分解而消失为止的时间延长。抗原结合分子即使存在于血浆中，该抗原结合分子已经结合有抗原时，该抗原结合分子不能与新的抗原结合。因此，抗原结合分子不与抗原结合的时间越长，则可与新的抗原结合时间越长(可与新的抗原结合的机会增多)，可使生物体内抗原不与抗原结合分子结合的时间减少，且可使抗原与抗原结合分子结合的时间延长。如果通过给予抗原结合分子能够加速抗原从血浆中消失，则抗原非结合型抗原结合分子的血浆中浓度增加，且抗原与抗原结合分子结合的时间延长。即，本发明中的“改善抗原结合分子的药代动力学”包含：改善抗原非结合型抗原结合分子的任一者的药代动力学参数(血浆中半衰期的增加、平均血浆中滞留时间的增加、血浆中清除的降低的任一者)；或者，在抗原结合分子给予后，抗原与抗原结合分子结合的时间延長；或者，抗原结合分子加速抗原从血浆中消失。可以通过测定抗原结合分子或抗原非结合型抗原结合分子的血浆中半衰期、平均血浆中滞留时间、血浆中清除等任一者的参数(ファーマコキネティクス演習による理解(Pharmacokinetics:Understanding through practice) (南山堂) )进行判断。例如，将抗原结合分子给予小鼠、大鼠、猴、兔、狗、人等时，测定抗原结合分子或抗原非结合型抗原结合分子的血浆中浓度，计算各参数，当血浆中半衰期延长或平均血浆中滞留时间延长等时，可以说抗原结合分子的药代动力学得到改善。这些参数可以通过本领域技术人员已知的方法进行测定，例如，可以使用药代动力学分析软件WinNonlin (Pharsight)，按照附带的操作说明，进行非房室模型(Noncompartmental)分析，由此来适当评价。不与抗原结合的抗原结合分子的血浆中浓度的测定，可以利用本领域技术人员已知的方法来实施，例如可以使用Clin.Pharmacol. (2008) 48 (4), 406-417中测定的方法。
本发明中“改善药代动力学”也包含在抗原结合分子给予后抗原与抗原结合分子结合的时间得到延长的情形。抗原结合分子给予后抗原与抗原结合分子结合的时间是否得到延长，可以通过测定游离抗原的血浆中浓度，根据游离抗原的血浆中浓度或相对于总抗原浓度的游离抗原浓度的比率增加为止的时间来判断。
未与抗原结合分子结合的游离抗原的血浆中浓度、或游离抗原浓度与总抗原浓度的比率可以采用本领域技术人员已知的方法进行确定。例如，可以采用Pharm. Res.(2006) 23 (1), 95-103中所使用的方法进行确定。另外，抗原在生物体内显示某种机能时，抗原是否与中和抗原机能的抗原结合分子(拮抗分子, antagonistic molecule)结合，还可以通过其抗原机能是否被中和来进行评价。抗原的机能是否被中和可以通过测定反映抗原机能的某种生物体内标记物进行评价。抗原是否与活化抗原机能的抗原结合分子(激动分子, agonistic molecule)结合，可以通过测定反映抗原机能的某种生物体内标记物进行评价。
对游离抗原的血浆中浓度的测定、血浆中的游离抗原量与血浆中的总抗原量的比率的测定、生物体内标记物的测定等测定没有特别限定，优选自给予抗原结合分子起经过规定时间后进行测定。本发明中，对自给予抗原结合分子起经过规定时间后没有特别限定，本领域技术人员可以根据所给予的抗原结合分子的性质等确定适当的时间，例如可以举出：自给予抗原结合分子起1天经过后、自给予抗原结合分子起3天经过后、自给予抗原结合分子起7天经过后、自给予抗原结合分子起14天经过后、自给予抗原结合分子起28天经过后等。本发明中，“血浆中抗原浓度”还包含下述的概念：将抗原结合分子结合抗原和抗原结合分子非结合抗原合计而得的浓度即“血浆中总抗原浓度”、或抗原结合分子非结合抗原浓度即“血浆中游离抗原浓度”的任一者。
与给予包含抗原结合活性为离子浓度非依赖性的抗原结合结构域的抗原结合分子、或包含FcγR结合活性受损的Fc区的抗原结合分子作为抗原结合分子时相比，或与不给予本发明的抗原结合分子时相比，通过给予本发明的抗原结合分子，可以使血浆中总抗原浓度降低2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或其以上。
抗原/抗原结合分子摩尔比可以如下进行计算：
A值＝在各时间点的抗原的摩尔浓度
B值＝在各时间点的抗原结合分子的摩尔浓度
C值＝在各时间点的每抗原结合分子的摩尔浓度的抗原的摩尔浓度(抗原/抗原结合分子摩尔比)
C＝A/B。
C值越小表示每抗原结合分子的抗原消失效率越高，C值越大表示每抗原结合分子的抗原消失效率越低。
抗原/抗原结合分子摩尔比可以如上计算。
与给予包含抗原结合活性不取决于离子浓度而发生变化的抗原结合结构域的抗原结合分子、包含在pH酸性区条件下不具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的抗原结合分子、或包含不具有Fcγ受体选择性结合活性的Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子作为抗原结合分子时相比，通过给予本发明的抗原结合分子，可以使抗原/抗原结合分子摩尔比降低2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或其以上。
本发明中，作为与本发明的抗原结合分子进行比较的参照抗原结合分子，可以使用：包含抗原结合活性不取决于离子浓度而发生变化的抗原结合结构域的抗原结合分子、包含在pH酸性区条件下不具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的抗原结合分子、或包含不具有Fcγ受体选择性结合活性的Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子。
评价在pH酸性区条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的影响时，当抗原结合分子不与小鼠对应抗原(mouse counterpart antigen)发生交叉反应时，血浆中总抗原浓度或抗原/抗体摩尔比的减少，也可以采用人FcRn转基因小鼠体系32或体系276(Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)，通过抗原抗体同时注射模型或稳态抗原注入模型的任一者进行评价。当抗原结合分子与小鼠对应抗原发生交叉反应时，通过对人FcRn转基因小鼠体系32或体系276 (Jackson Laboratories)单独注射抗原结合分子也可以进行评价。在同时注射模型中，将抗原结合分子与抗原的混合物给予小鼠。在稳态抗原注入模型中，为了达到恒定的血浆中抗原浓度，向小鼠移植填充有抗原溶液的注入泵(输液泵，infusion pump)，然后对小鼠注射抗原结合分子。以同样的用量给予试验抗原结合分子。采用本领域技术人员已知的方法在适当的时间点测定血浆中总抗原浓度、血浆中游离抗原浓度和血浆中抗原结合分子浓度。
评价具有Fcγ受体选择性结合活性的Fcγ受体结合结构域的影响时，当抗原结合分子不与小鼠对应抗原发生交叉反应时，血浆中总抗原浓度或抗原/抗体摩尔比的减少，也可以采用通常所使用的C57BL/6J小鼠(Charles River Japan)，通过抗原抗体同时注射模型或稳态抗原注入模型的任一者进行评价。当抗原结合分子与小鼠对应抗原发生交叉反应时，通过对通常所使用的C57BL/6J小鼠(Charles River Japan)单独注射抗原结合分子也可以进行评价。
在同时注射模型中，将抗原结合分子与抗原的混合物给予小鼠。在稳态抗原注入模型中，为了达到恒定的血浆中抗原浓度，向小鼠移植填充有抗原溶液的注入泵，然后对小鼠注射抗原结合分子。以相同的用量给予试验抗原结合分子。采用本领域技术人员已知的方法在适当的时间点测定血浆中总抗原浓度、血浆中游离抗原浓度和血浆中抗原结合分子浓度。
在给予2天后、4天后、7天后、14天后、28天后、56天后、或84天后，测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比，可以评价本发明的长期效果。换句话说，以评价本发明的抗原结合分子的特性为目的时，长期的血浆中抗原浓度，通过在给予抗原结合分子的2天后、4天后、7天后、14天后、28天后、56天后、或84天后，测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比来确定。利用本发明中记载的抗原结合分子是否实现血浆中抗原浓度或抗原/抗原结合分子摩尔比的减少，可以通过在预先记载的任意一个或多个的时间点评价其减少来确定。
在给予15分钟后、1小时后、2小时后、4小时后、8小时后、12小时后、或24小时后，测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比，可以评价本发明的短期效果。换句话说，以评价本发明的抗原结合分子的特性为目的时，短期的血浆中抗原浓度，通过在给予抗原结合分子的15分钟后、1小时后、2小时后、4小时后、8小时后、12小时后、或24小时后，测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比来确定。
本发明的抗原结合分子的给药途径，可以从皮内注射、静脉内注射、玻璃体内注射、皮下注射、腹腔内注射、非经口注射和肌肉内注射中选择。
本发明中，优选改善人的抗原结合分子的药代动力学。当难以测定人的血浆中滞留性时，可以根据小鼠(例如，正常小鼠、人抗原表达转基因小鼠、人FcRn表达转基因小鼠等)或猴(例如，食蟹猴等)的血浆中滞留性，来预测人的血浆中滞留性。
本发明中的“抗原结合分子的药代动力学的改善、血浆中滞留性的提高”是指，将抗原结合分子给予生物体时改善任一者的药代动力学参数(血浆中半衰期的增加、平均血浆中滞留时间的增加、血浆中清除的低下、生物利用度(bioavailability)的任一者)或在给予后的适当时间提高抗原结合分子的血浆中浓度。可以通过测定抗原结合分子的血浆中半衰期、平均血浆中滞留时间、血浆中清除、生物利用度等任一者的参数(ファーマコキネティクス演習による理解(Pharmacokinetics: Understanding through practice) (南山堂) )进行判断。例如，将抗原结合分子给予小鼠(正常小鼠和人FcRn转基因小鼠)、大鼠、猴、兔、狗、人等时，测定抗原结合分子的血浆中浓度，计算各参数，当血浆中半衰期延长或平均血浆中滞留时间延长等时，可以说抗原结合分子的药代动力学得到改善。这些参数可以通过本领域技术人员已知的方法进行测定，例如，可以使用药代动力学分析软件WinNonlin (Pharsight)，按照附带的操作说明，进行非房室模型(Noncompartmental)分析，由此来适当评价。
小鼠中，迄今为止发现了FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII、FcγRIV的4种类的FcγR。就人体而言，作为与上述对应的FcγR，发现了FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb。这些FcγR中，被认为唯一抑制型的FcγRIIb在人、小鼠中均有保存。其它的FcγR，除了FcγRIIIb之外经由免疫受体酪氨酸的活化基序(Immunoreceptortyriosine-based activating motif, ITAM)转导活化信号，但FcγRIIb经由细胞内具有的免疫受体酪氨酸的抑制基序(Imunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM)转导抑制信号(Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47)。
作为FcγRIIb的剪接变体报道了FcγRIIb1和FcγRIIb2。在人和小鼠的任一者中，FcγRIIb1相比FcγRIIb2具有较长的细胞内结构域，确认到FcγRIIb1在B细胞中表达，且确认到FcγRIIb2在巨噬细胞、肥大细胞、树状细胞、嗜碱粒细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞中表达(J. Clin. Immunol. (2005) 25 (1), 1-18)。
迄今为止，报道了：人FcγRIIb的功能不全、表达降低与自身免疫疾病的发病相关联。例如，报道了：在SLE患者中，由于位于FcγRIIb的表达启动子区的基因多态性的影响使转写活化因子的结合变弱、FcγRIIb的表达降低的例子(Hum. Genet. (2005) 117, 220-227、J. Immunol. (2004) 172, 7192-7199、J. Immunol. (2004) 172, 7186-7191)。另外，报道了：在SLE患者中，FcγRIIb的第233位的氨基酸为Ile或Thr的二种类的基因多态性。还报道了：该位点存在于FcγRIIb的跨膜区，第233位的氨基酸为Thr时，与为Ile时相比，FcγRIIb难以存在于脂膜筏(lipid raft)上，结果FcγRIIb的信号转导机能降低(Nat.Med. (2005) 11, 1056-1058、Hum. Mol. Genet., (2005) 14, 2881-2892)。在小鼠中，也报道了：C57BL/6小鼠的FcγRIIb基因被破坏的敲除小鼠，呈现自身抗体的产生或肾小球肾炎等的SLE样症状(Immunity 13 (2000) 277-285、J. Exp. Med. (2002) 195, 1167-1174)。另外，迄今为止，报道了：在被认为是SLE的自然发病模型的小鼠中，也降低FcγRIIb的表达量等(Immunogenetics (2000) 51, 429-435、Int. Immunol. (1999) 11, 1685-1691、Curr. Biol. (2000) 10, 227-230、J. Immunol. (2002) 169, 4340-4346)。由此可以认为：在小鼠中也与人同样，FcγRIIb控制体液免疫。
本发明的具有Fc的抗体经由FcγRIIb使抗原消失时，被认为在FcγRIIb的机能中FcγRIIb的内吞作用(endocytosis)的机能发挥最重要的作用。如上所述，作为FcγRIIb的剪接变体存在FcγRIIb1和FcγRIIb2，但是据报道：在抗体与抗原的免疫复合物的内吞作用中主要涉及后者(J. Immunol. (1994), 152 574-585、Science (1992) 256, 1808-1812、Cell (1989) 58, 317-327)。迄今为止报道了：小鼠的FcγRIIb2被摄入到披有网格蛋白的小窝内，引起内吞作用(Cell (1989) 58, 317-327)。另外报道了：FcγRIIb2介导的内吞作用中二亮氨酸基序是必要的，人和小鼠中均保存有二亮氨酸基序(EMBO J. (1994)13 (13), 2963-2969)。由此也认为：在人中也与小鼠同样FcγRIIb2具有内吞能力。
另一方面，报道了：FcγRIIb1与FcγRIIb2不同，不引起内吞作用。FcγRIIb1存在FcγRIIb2中未发现的细胞内结构域中的插入序列。认为该序列抑制FcγRIIb1摄入到披有网格蛋白的小窝内，作为其结果，内吞作用得到抑制(J. Cell. Biol. (1992) 116, 875-888、J. Cell. Biol. (1989) 109, 3291-3302)。人也与小鼠同样，FcγRIIb1中与FcγRIIb2同样的部分存在插入序列，因此可以预想到：通过类似的机理产生FcγRIIb1与FcγRIIb2的内吞作用能力的不同。另外报道了：在人和小鼠中，均在20分钟使细胞表面上的约40%的免疫复合物摄入到细胞内(Mol. Immunol. (2011) 49, 329-337、Science (1992)256, 1808-1812)。由此可以预想到：在人中FcγRIIb2也以与小鼠同样的速度将免疫复合物摄入到细胞内。
在FcγR家族中，FcγRIIb是唯一在人和小鼠的细胞内具有ITIM、且表达细胞的分布也相同，因此推测在免疫控制中的机能也同样。而且认为：考虑到在人和小鼠中以同样的速度将免疫复合物摄入到细胞内的事实，通过使用小鼠，可以预测基于人FcγRIIb介导的抗体的抗原消失效果。实际上，在参考实施例7中显示出：将与具有 pH依赖性与可溶性抗原结合的性质的抗原结合分子mIgG1相比、具有pH依赖性与可溶性抗原结合的性质且对小鼠FcγRIIb和FcγRIII的亲和力(affinity)增强的抗原结合分子mF44和mF46给予正常小鼠时，与给予mIgG1时相比，增加了抗原的清除。
另外，在后述的参考实施例8中，使用Fc受体γ链缺陷小鼠实施了同样的实验。小鼠的情形，报道了FcγRIIb以外的FcγR仅在γ链的共存在下表达，因此Fc受体γ链缺陷小鼠仅表达FcγRIIb。通过向Fc受体γ链缺陷小鼠给予具有pH依赖性与可溶性抗原结合的性质的抗原结合分子mF44、mF46，可以考察选择性地增强了FcγRIIb结合时的加速抗原消失的效果。根据参考实施例8的结果显示出： 给予到Fc受体γ链缺陷小鼠的具有pH依赖性与可溶性抗原结合的性质的抗原结合分子mF44和mF46，与给予到同小鼠的具有pH依赖性与可溶性抗原结合的性质的抗原结合分子mIgG1相比，增加了抗原的清除。另外，根据参考实施例8的结果明确了：mF44和mF46给予Fc受体γ链缺陷小鼠时，与给予正常小鼠时相比，几乎同等程度地使抗原消失。
在参考实施例8中，使用FcγRIII缺陷小鼠实施了同样的实验。mIgG1、mF44和mF46仅与mFcγR中的FcγRIIb和FcγRIII结合，因此，通过将这些抗体给予FcγRIII缺陷小鼠，可以考察选择性地增强了FcγRIIb结合时的加速抗原消失的效果。根据参考实施例8的结果显示出：给予到FcγRIII缺陷小鼠的mF44和mF46与给予到同小鼠的mIgG1相比，增加了抗原的清除。另外，根据参考实施例8的结果明确了：mF44和mF46给予FcγRIII缺陷小鼠时，与给予正常小鼠时和给予Fc受体γ链缺陷小鼠时相比，几乎同等程度地使抗原消失。
根据这些结果，可以明确：通过不增强与活性型FcγR的结合、而仅选择性地增强与FcγRIIb的结合，可以加速抗原的消失。即，显示出：FcγR介导的免疫复合物的去除主要是由于FcγRIIb的参与，推测到：只要是对FcγR中FcγRIIb的结合维持，则其抗体的FcγR介导的免疫复合物的去除效率也得以维持。
除了先前考察的迄今为止的文献报道以外，根据上述的使用小鼠的验证结果，可以认为：在人的生物体中也与小鼠同样，发生FcγRIIb介导的免疫复合物摄入到细胞内，其结果，具有选择性地增强了与人FcγRIIb结合的Fc的抗体可以加速其抗原的消失。另外，如先前考察的那样，在小鼠和人中，认为以同样的速度发生FcγRIIb介导的免疫复合物摄入到细胞内，因此认为：与具有增强了对小鼠FcγRIIb的亲和力(affinity)的Fc的抗体加速抗原消失的效果为同等程度的效果，通过使用同等程度增强了对人FcγRIIb的亲和力(affinity)的Fc，在人的生物体内也可以实现。
而且，本发明提供：与包含亲本Fc区的多肽相比，包含对FcγRIIb的结合活性维持、且对活性型FcγR的结合活性减少的Fc区变体的多肽的制备方法，该方法包括在包含抗体Fc区变体的多肽中向该Fc区变体加入至少一个氨基酸改变。
例如可以举出：包括以下步骤的制备方法：
(a) 在包含Fc区的多肽中向该Fc区加入至少一个氨基酸改变的步骤；
(b) 测定在上述步骤(a)中已改变的多肽对FcγRIIb的结合活性和对活性型FcγR的结合活性的步骤；以及
(c) 选择与包含亲本Fc区的多肽相比，包含对FcγRIIb的结合活性维持、且对活性型FcγR的结合活性减少的Fc区变体的多肽的步骤。
作为优选的方式，是包含Fc区变体的多肽的制备方法，该方法包括下述步骤：
(a) 改变编码多肽的核酸的步骤，该多肽与包含亲本Fc区的多肽相比，对FcγRIIb的结合活性维持、且对活性型FcγR的结合活性减少；
(b) 向宿主细胞中导入该核酸并培养该宿主细胞使多肽表达的步骤；
(c) 从宿主细胞培养物中回收该多肽的步骤。
并且，通过该制备方法制备的抗体和Fc融合蛋白质分子也包含在本发明中。
而且，本发明提供：与包含亲本Fc区的多肽相比，对FcγRIIb的结合活性维持，且对所有活性型FcγR、其中对FcγRIIa (R型)的结合活性降低的方法，该方法包括在包含抗体Fc区变体的多肽中向该Fc区变体加入至少一个氨基酸改变；或者，本发明提供：本发明的包含Fc区变体的多肽的制备方法。
例如可以举出：包括以下步骤的方法：
(a) 在包含Fc区的多肽中向该Fc区加入至少一个氨基酸改变的步骤；
(b) 测定在上述步骤(a)中已改变的多肽对FcγRIIa的结合活性和对FcγRIIb的结合活性的步骤；以及
(c) 选择与包含亲本Fc区的多肽相比，包含对FcγRIIb的结合活性维持、且对FcγRIIa (R型)的结合活性减少的Fc区变体的多肽的步骤。
作为优选的方式，是包含亲本Fc区的多肽对FcγRIIb的结合活性维持，且对所有活性型FcγR、其中对FcγRIIa (R型)的结合活性降低的方法；或者，是包含Fc区变体的多肽的制备方法，该方法包括下述步骤：
(a) 改变编码多肽的核酸的步骤，该多肽与包含亲本Fc区的多肽相比，对FcγRIIb的结合活性维持、且对FcγRIIa (R型)的结合活性减少；
(b) 向宿主细胞中导入该核酸并培养该宿主细胞使多肽表达的步骤；
(c) 从宿主细胞培养物中回收该多肽的步骤。
并且，通过该制备方法制备的抗体和Fc融合蛋白质分子也包含在本发明中。
而且，本发明提供：将多肽给予生物体时，与包含亲本Fc区的多肽相比，抑制针对该多肽的抗体产生的方法，该方法包括在包含Fc区多肽中向该Fc区加入至少一个氨基酸改变；或者，本发明提供：针对该多肽的抗体产生得到抑制的多肽的制备方法。
例如可以举出：包括以下步骤的方法：
(a) 在包含Fc区的多肽中向该Fc区加入至少一个氨基酸改变的步骤；以及
(b) 将包含在上述步骤(a)中已改变的Fc区的多肽给予生物体时，与包含亲本Fc区的多肽相比，确认抗体产生得到抑制的步骤。
这样的多肽在不活化活性型FcγR的情形下可以抑制抗体的产生，因此被认为作为药物是有用的。
在上述方法中，优选对FcγRIIb的结合活性维持，且对所有活性型FcγR、其中对FcγRIIa (R型)的结合活性减少的多肽。
作为上述方法中的优选方式，例如，在人IgG的Fc区中，以导入下述改变的方式来改变该Fc区：EU编号第238位的氨基酸改变为其它氨基酸以及选自Fc区的EU编号第235位的氨基酸、第237位的氨基酸、第241位的氨基酸、第268位的氨基酸、第295位的氨基酸、第296位的氨基酸、第298位的氨基酸、第323位的氨基酸、第324位的氨基酸和第330位的氨基酸的至少一个氨基酸改变为其它氨基酸。作为与EU编号第238位的氨基酸改变组合的其它氨基酸改变，可以从上述之中选择2个以上氨基酸进行组合。作为优选的组合，可以举出下述(1)～(3)：
(1) Fc区的EU编号第241位的氨基酸、第268位的氨基酸、第296位的氨基酸以及第324位的氨基酸；
(2) Fc区的EU编号第237位的氨基酸、第241位的氨基酸、第296位的氨基酸以及第330位的氨基酸；
(3) Fc区的EU编号第235位的氨基酸、第237位的氨基酸、第241位的氨基酸以及第296位的氨基酸。
作为改变后的氨基酸而选择的氨基酸，只要与改变前相比，对FcγRIIb的结合活性维持，且对所有活性型FcγR、其中对FcγRIIa (R)的结合选择性减少即可，没有特别限定，优选：EU编号第238位的氨基酸为Asp；并且，EU编号第235位的氨基酸为Phe，第237位的氨基酸为Gln或Asp，第241位的氨基酸为Met或Leu，第268位的氨基酸为Pro，第295位的氨基酸为Met或Val，第296位的氨基酸为Glu、His、Asn或Asp，第298位的氨基酸为Ala或Met，第323位的氨基酸为Ile，第324位的氨基酸为Asn或His，第330位的氨基酸为His或Tyr。
另外，作为上述方法中的优选方式，例如，在人IgG的Fc区中，使导入有对FcγRIIb的结合活性与天然型IgG的Fc区相比为2倍以上的氨基酸改变而得的Fc区变体、与对所有FcγR的结合活性的降低的氨基酸改变组合导入来改变该Fc区。
本发明中，作为“对FcγRIIb的结合活性与天然型IgG的Fc区相比为2倍以上的氨基酸改变”，没有特别限定，例如可以举出：表11所述的氨基酸改变。
另外，本发明中，作为“对所有FcγR的结合活性降低的氨基酸改变”，没有特别限定，例如可以举出：选自Fc区的EU编号第234位的氨基酸、第235位的氨基酸、第236位的氨基酸、第237位的氨基酸、第239位的氨基酸、第265位的氨基酸、第267位的氨基酸以及第297位的氨基酸的至少一个氨基酸。
作为优选的组合，例如可以举出：对FcγRIIb的结合活性与天然型IgG的Fc区相比为2倍以上的氨基酸改变是Fc区的EU编号第238位的氨基酸和271位的氨基酸，对所有FcγR的结合活性降低的氨基酸改变是选自Fc区的EU编号第234位的氨基酸、第235位的氨基酸、第236位的氨基酸、第237位的氨基酸、第239位的氨基酸、第265位的氨基酸、第267位的氨基酸以及第297位的氨基酸的至少一个氨基酸。
具体而言，可以举出将下述(1)～(3)所述的氨基酸改变的组合作为优选的改变的组合：
(1) Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第238位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸、第268位的氨基酸以及第271位的氨基酸；
(2) Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第237位的氨基酸、第238位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸、第296位的氨基酸、第297位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第396位的氨基酸；
(3) Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第238位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸以及第296位的氨基酸。
作为改变后的氨基酸而选择的氨基酸，只要与改变前相比对FcγRIIb的结合活性维持，且对所有活性型FcγR、其中对FcγRIIa(R)的结合选择性减少即可，没有特别限定，优选：EU编号第238位的氨基酸为Asp，第271位的氨基酸为Gly；EU编号第234位的氨基酸为Ala、His、Asn、Lys或Arg，第235位的氨基酸为Ala，第236位的氨基酸为Gln，第237位的氨基酸为Arg或Lys，第239位的氨基酸为Lys，第265位的氨基酸为Lys、Asn、Arg、Ser或Val，第267位的氨基酸为Lys、Arg或Tyr，第297位的氨基酸为Ala。
另外，作为上述方法中的优选方式，例如，在人IgG的Fc区中，以导入下述改变的方式来改变该Fc区：EU编号第238位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸改变为其它氨基酸。并且，以导入下述改变的方式来改变该Fc区：选自第233位的氨基酸、第237位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸和268位的氨基酸的至少一个氨基酸改变为其它氨基酸。作为组合的其它氨基酸改变，可以从上述之中选择2个以上氨基酸进行组合。作为优选的组合，可以举出下述(1)～(4)：
(1) Fc区的EU编号第237位的氨基酸、第238位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸；
(2) Fc区的EU编号第233位的氨基酸、第237位的氨基酸、第238位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸；
(3) Fc区的EU编号第238位的氨基酸、第267位的氨基酸、第268位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸；
(4) Fc区的EU编号第238位的氨基酸、第264位的氨基酸、第267位的氨基酸、第271位的氨基酸、第327位的氨基酸、第330位的氨基酸以及第331位的氨基酸。
作为改变后的氨基酸而选择的氨基酸，只要与改变前相比对FcγRIIb的结合活性维持，且对活性型FcγR、其中对FcγRIIa (R)的结合选择性减少即可，没有特别限定，优选：EU编号第238位的氨基酸为Asp，第271位的氨基酸为Gly，第327位的氨基酸为Gly，第330位的氨基酸为Ser，第331位的氨基酸为Ser，第233位的氨基酸为Asp，第237位的氨基酸为Asp，第264位的氨基酸为Ile，第267位的氨基酸为Ala，第268位的氨基酸为Asp或Glu。
并且，本发明提供：用于制作与包含亲本Fc区的多肽相比，对FcγRIIb的结合活性维持，且对活性型FcγR、特别是对FcγRIIa(R型)的结合活性减少的多肽的、改变多肽的方法。而且，本发明提供：用于制作与包含亲本Fc区的多肽相比，对FcγRIIb的结合活性维持，且对活性型FcγR、特别是对FcγRIIa(R型)的结合活性减少的多肽的、改变多肽的方法。
另外，本发明提供：用于制作在给予生物体时与包含亲本Fc区的多肽相比，抗体的产生得到抑制的多肽的、改变多肽的方法。
作为优选的方式，例如可以举出：上述的包含对FcγRIIb的结合活性维持，且对活性型FcγR、特别是对FcγRIIa (R型)的结合活性减少的Fc区变体的多肽的制备方法中所述的氨基酸改变的组合。
另外，在上述的各种方法中，只要是与包含天然型IgG的Fc区的多肽相比对FcγRIIb的结合活性维持、且对所有活性型FcγR的结合活性减少，则可以将其它氨基酸改变组合使用。作为这样的改变，例如可以举出：对补体的结合活性减少的改变。具体而言，例如可以举出：Fc区的EU编号第322位的氨基酸改变，或者Fc区的EU编号第327位、第330位和第331位的氨基酸改变的组合。作为改变后的氨基酸而选择的氨基酸，只要是与包含天然型IgG的Fc区的多肽相比对FcγRIIb的结合活性维持、对所有活性型FcγR的结合活性减少、且对补体的结合活性减少即可，没有特别限定，优选：EU编号第322位的氨基酸为Ala或Glu、第327位的氨基酸为Gly、第330位的氨基酸为Ser、第331位的氨基酸为Ser。
并且，本发明提供编码包含Fc区变体的多肽的核酸，所述多肽为包含Fc区的多肽，至少一个氨基酸被改变，与包含亲本Fc区的多肽相比，对FcγRIIb的结合活性维持，且对活性型FcγR、特别是对FcγRIIa (R型)的结合活性减少。另外，本发明提供编码包含Fc区变体的多肽的核酸，所述多肽为包含Fc区的多肽，至少一个氨基酸被改变，与包含亲本Fc区的多肽相比，对FcγRIIb的结合活性维持、且对活性型FcγR、特别是对FcγRIIa (R型)的结合活性减少。本发明的该核酸可以是DNA、RNA等、任何的形式。
并且，本发明提供包含上述本发明的核酸的载体。对于载体的种类，根据导入载体的宿主细胞，本领域技术人员可以适当选择，例如可以使用上述的载体。
并且，本发明涉及由上述本发明的载体转化的宿主细胞。对于宿主细胞，本领域技术人员可以适当选择，例如可以使用上述的宿主细胞。具体而言，例如可以举出如下的宿主细胞。
真核细胞作为宿主细胞使用时，可以适当使用动物细胞、植物细胞、或真菌细胞。具体而言，作为动物细胞可以示例下列的细胞：
(1) 哺乳类细胞：CHO (中国仓鼠卵巢细胞系)、COS (猴肾细胞系)、骨髓瘤(Sp2/O、NS0等)、BHK (幼仓鼠肾细胞系)、Hela、Vero、HEK293 (人胚胎肾细胞系，具有已剪切的腺病毒(Ad) 5 DNA)、Freestyle 293，PER.C6细胞(人胚胎视网膜细胞系，用腺病毒5型(Ad5)E1A和E1B基因转化)等(Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit5.9, Table 5.9.1) )；
(2) 两栖类细胞：爪蟾卵母细胞等；
(3) 昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。
或作为植物细胞，已知应用普通烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属来源的细胞的抗体基因表达体系。植物细胞的转化可以适当利用愈伤组织培养的细胞。
并且，作为真菌细胞，可以利用下列细胞：
-酵母：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等的酵母(Saccharomyces)属、甲醇营养型酵母(Pichia pastoris，毕赤酵母)等的毕赤酵母(Pichia)属；
-丝状真菌：黑曲霉(Aspergillus niger) 等的曲霉菌(Aspergillus )属。
并且，本发明提供与包含亲本Fc区的多肽相比维持对FcγRIIb的结合活性，且减少对活性型FcγR、特别是对FcγRIIa (R型)的结合活性的方法，所述方法包括：在包含Fc区的多肽中在该Fc区中加入至少一个氨基酸改变。
另外，本发明提供在给予生物体时与包含亲本Fc区的多肽相比抑制针对该多肽的抗体的产生的方法，所述方法包括：在包含Fc区的多肽中在该Fc区中加入至少一个氨基酸改变。
作为优选的方式，例如可以举出：包含上述的对FcγRIIb的结合活性维持，且对活性型FcγR、特别是对FcγRIIa (R型)的结合活性减少的Fc区变体的多肽的制备方法中所述的氨基酸改变的组合。
另外，通过上述的任一方法制备的多肽也包含在本发明中。
本发明提供含有本发明的包含Fc区变体的多肽的药物组合物。
就本发明的药物组合物而言，除了本发明的上述抗体或Fc融合蛋白质分子之外，还可以导入药学上可接受的载体，按照已知的方法制成制剂。例如可以以与水或其它药学上可接受的液体的无菌溶液或混悬液剂的注射剂形式非口服地使用。例如，可以考虑将药理学上可接受的载体或介质，具体而言将无菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、助悬剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、溶媒(vehicles)、防腐剂、粘合剂等适当组合，以通常认可的制药实践所要求的单位用量形式进行混合，由此制成制剂。具体而言，载体可以举出：轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。这些制剂中的有效成分量是可以获得所指示的范围的适当用量。
对于用于注射的无菌组合物，可以使用注射用蒸馏水等的溶媒(vehicles)，按照通常的制剂实践来配制。
作为注射用的水溶液，例如可以举出：生理盐水；包含葡萄糖或其它辅料的等渗液例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇；氯化钠，也可以结合使用适当的助溶剂，例如：醇，具体而言乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇；非离子性表面活性剂，例如聚山梨酯80 (TM)、HCO-50。
作为油性液体，可以举出：芝麻油、大豆油，作为助溶剂，可以结合使用苯甲酸苄基酯、苄基醇。还可以混合缓冲剂例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液，镇痛剂例如盐酸普鲁卡因，稳定剂例如苄基醇、苯酚，抗氧化剂。所调制的注射液通常填充于适宜的安瓿中。
给药优选为非口服给药，具体而言可以举出：注射剂型、经鼻给药剂型、经肺给药剂型、经皮给药剂型等。注射剂型例如可以通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等进行全身或局部性给药。
另外，本发明的药物组合物可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。作为包含抗体或编码抗体的多核苷酸的药物组合物的给药量，例如可以是在每次每1kg体重为0.0001mg-1000mg/的范围内选择。或者，例如可在每位患者为0.001-100000mg/机体的范围内选择给药量，这些数值没有限定。给药量、给药方法根据患者的体重或年龄、症状等变化，本领域技术人员可以适当选择。
上述本发明的包含Fc区变体的多肽可用作抑制B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞活化的药物的有效成分。本发明的包含Fc区变体的多肽并不活化活性型FcγR，而是选择性地作用于FcγRIIb，可抑制B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化。B细胞的活化包括增殖、IgE产生、IgM产生、IgA产生等。上述本发明的包含Fc区变体的多肽通过使FcγRIIb与IgE交联来抑制B细胞的IgE产生，通过与IgM交联来抑制B细胞的IgM产生，通过与IgA交联来抑制IgA产生。除此之外，通过使BCR、CD19、CD79b等在B细胞上表达的、在细胞内包含ITAM结构域或者与ITAM结构域相互作用的分子与FcγRIIb直接或间接交联，可发挥与上述同样的抑制作用。另外，肥大细胞的活化包括增殖、IgE等引起的活化、脱粒等。在肥大细胞中，上述本发明的包含Fc区变体的多肽可通过使IgE受体FcεRI、DAP12、CD200R3等在肥大细胞上表达的、包含ITAM结构域或者与ITAM结构域相互作用的分子与FcγRIIb直接、间接交联，抑制增殖、IgE等引起的活化、脱粒。另外，嗜碱性粒细胞的活化包括增殖、脱粒等。在嗜碱性粒细胞中，上述本发明的包含Fc区变体的多肽可通过使FcγRIIb与细胞膜上的、在细胞内包含ITAM结构域或者与ITAM结构域相互作用的分子直接或间接交联，抑制活化、脱粒、增殖。另外，树突细胞的活化包括增殖、脱粒等。在树突细胞中，上述本发明的包含Fc区变体的多肽也可通过使细胞膜上的、在细胞内包含ITAM结构域或与ITAM结构域相互作用的分子与FcγRIIb直接或间接交联，抑制活化、脱粒、增殖。
本发明中，上述本发明的包含Fc区变体的多肽作为免疫炎性疾病的治疗药或预防药的有效成分是有用的。如上所述，本发明的包含Fc区变体的多肽可以抑制B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化，因此，其结果是，通过给予本发明的包含Fc区变体的多肽，可以治疗或预防免疫炎性疾病。“免疫炎性疾病”包括但不限于以下疾病：类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性水疱病、自身免疫性肾上腺皮质炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、巨红细胞性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性受体病、自身免疫性不孕、慢性活动性肝炎、肾小球肾炎、间质性肺纤维化、多发性硬化症、帕哲病(Paget's disease)、骨质疏松症、多发性骨髓瘤、葡萄膜炎、急性和慢性脊椎炎、痛风性关节炎、炎性肠病、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、银屑病、克罗恩病、巴塞杜氏病、青少年糖尿病、爱迪生氏病、重症肌无力、晶体性葡萄膜炎、系统性红斑狼疮、变应性鼻炎、变应性皮肤炎、溃疡性结肠炎、超敏感症、肌变性、恶病质、系统性硬皮病、局限性硬皮病、干燥综合征、白塞病、赖特综合征、I型和II型糖尿病、骨吸收障碍、移植物抗宿主反应、缺血性再灌注损伤、动脉粥样硬化、脑损伤、脑型疟、败血症、败血性休克、中毒性休克综合征、发热、染色引发的肌痛(malgias)、再生障碍性贫血、溶血性贫血、突发性血小板减少症、肺出血肾炎综合征、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、天疱疮、IgA肾病、花粉病、抗磷脂抗体综合征、多发性肌炎、韦格纳肉芽肿、结节性动脉炎、混合性结缔组织病、纤维肌痛症、哮喘、特应性皮炎、慢性萎缩性胃炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胰腺炎、大动脉炎综合征、急进性肾小球肾炎、巨幼红细胞性贫血、特发性血小板减少性紫癜、原发性甲状腺功能减退症、特发性爱迪生氏病、胰岛素依赖型糖尿病、慢性盘状红斑狼疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线状IgA大泡性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、圆形脱毛症、寻常性白斑、Sutton离心性后天性白斑、原田氏病、自身免疫性视神经病、特发性无精症、习惯性流产、低血糖症、慢性荨麻疹、强直性脊椎炎、银屑病性关节炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、韧带附着端病、过敏性肠综合征、慢性疲劳综合征、皮肌炎、包涵体肌炎、施密特综合征、格雷夫斯病、恶性贫血、类狼疮性肝炎、初老期痴呆、阿尔茨海默病、脱髓鞘疾病、肌萎缩性侧索硬化症、副甲状腺功能减退症、心肌梗死后综合征、肌无力综合征、疱疹样皮炎、脱毛症、进行性系统性硬化病、CREST综合征(钙沉着、雷诺现象、食道蠕动障碍、指端硬化、毛细血管扩张症)、结节病、风湿热、多形性红斑、库欣综合征、输血反应、麻风病、多发性大动脉炎、风湿性多发性肌痛症、颞动脉炎、巨细胞动脉炎、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、川崎病、心内膜炎、心内膜心肌纤维化症、眼内炎、胎儿成红细胞增多症、嗜酸细胞性筋膜炎、费尔蒂综合征、过敏性紫癜、移植排斥反应、流行性腮腺炎、心肌病、化脓性关节炎、家族性地中海热、穆-韦二氏综合征、高IgD综合征。
另外，上述本发明的包含Fc区变体的多肽在可认为针对自身抗原的抗体(自身抗体)的产生是疾病原因的自身免疫疾病中，抑制该自身抗体的产生，可用作治疗或预防该自身免疫疾病的药物的有效成分。有报道称，通过使用重症肌无力的自身抗原AchR与抗体的Fc部分融合所得的分子，抑制了表达识别AchR的BCR的B细胞的增殖，诱导凋亡(JNeuroimmunol, 227, 35-43, 2010)。通过使用自身抗体所识别的抗原与本发明所述的抗体Fc区的融合蛋白质，可以使表达针对该自身抗原的BCR的B细胞的BCR与FcγRIIb交联，抑制表达针对自身抗原的BCR的B细胞的增殖，诱导凋亡。上述自身免疫疾病包括格林-巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胰腺炎、大动脉炎综合征、肺出血肾炎综合征、急进性肾小球肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜氏病、桥本氏甲状腺炎、原发性甲状腺功能减退症、特发性爱迪生氏病、胰岛素依赖型糖尿病、慢性盘状红斑狼疮、局限性硬皮病、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线状IgA大泡性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、圆形脱毛症、寻常性白斑、Sutton离心性后天性白斑、原田氏病、自身免疫性视神经病、特发性无精症、习惯性流产、II型糖尿病、低血糖症、慢性荨麻疹，但不限于此。
另外，上述本发明的包含Fc区变体的多肽可用作生物体所需的蛋白质缺乏的疾病的治疗药的有效成分。对于生物体所需蛋白质缺乏的疾病，采用给予该蛋白质作为药物进行补充的治疗方法，但是患者原本就缺乏该蛋白质，因此由外部补充的该蛋白质被识别为异物，致使产生针对该蛋白质的抗体。其结果，该蛋白质容易被去除，作为药物的效果减弱。通过使用上述蛋白质与本发明所述的抗体Fc区的融合蛋白质，在识别该蛋白质的B细胞上，使BCR与FcγRIIb交联，可抑制针对该蛋白质的抗体的产生。所补充的蛋白质包括：VIII因子、IX因子、TPO、EPO、α-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、A型类肝素N-硫酸酯酶、B型α-N-乙酰葡糖胺酶、C型乙酰CoA:α-葡糖胺酶乙酰转移酶、D型N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、半乳糖6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、α-半乳糖苷酶、酸性α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶。要补充这些蛋白质的疾病包括血友病、特发性血小板减少性紫癜、肾性贫血、溶酶体病(粘多糖贮积症、法布里病、庞贝氏病、戈谢病)等。但并不限于这些。
另外，上述本发明的包含Fc区变体的多肽可用作抗病毒剂的有效成分。作为抗病毒抗体的包含本发明所述的Fc区的抗体可以抑制在抗病毒抗体中见到的抗体依赖性感染增强。抗体依赖性感染增强是指以下现象：病毒利用抗该病毒的中和抗体，被活性型FcγR介导吞噬，感染表达FcγR的细胞，由此使感染扩大。有报道称，抗登革病毒的中和抗体与FcγRIIb的结合在抑制抗体依赖性感染增强方面发挥重要的作用(Proc Natl Acad SciUSA, 108, 12479-12484, 2011)。登革病毒和抗登革病毒的中和抗体形成的免疫复合物与FcγRIIb交联，由此抑制FcγR介导的吞噬，结果抑制抗体依赖性感染增强。病毒包括登革病毒(DENV1、DENV2、DENV4)和HIV。但并仅限于这些。
另外，上述本发明的包含Fc区变体的多肽可用作动脉硬化预防药或治疗药的有效成分。包含本发明所述的Fc区的抗体是针对作为动脉硬化原因的氧化LDL的抗体，可以防止FcγRIIa依赖性的炎性细胞粘附。有报道称：抗氧化LDL抗体抑制氧化LDL与CD36的相互作用，但抗氧化LDL抗体与内皮细胞结合，单核细胞以FcγRIIa或FcγRI依赖性方式识别其Fc部分并粘附(Immunol Lett, 108, 52-61, 2007)。对于这样的抗体，可以认为，通过利用包含本发明所述的Fc区的抗体，FcγRIIa依赖性结合受到抑制，且通过FcγRIIb介导的抑制信号来抑制单核细胞粘附。
本发明中，上述本发明的包含Fc区变体的多肽可用作癌症治疗药或预防药的有效成分。如上所述，通过维持与FcγRIIb的结合、且降低对所有活性型FcγR的结合，可以维持激动性抗体的激动活性、且抑制基于FcγRIIa依赖性机制的血小板活化，降低血栓栓塞症等的风险。因此，使用本发明所述的Fc区变体的激动性抗体可用于癌症的治疗或预防。具体而言，本发明所述的Fc区变体可以增强例如抗Aliases、CD120a、CD120b、淋巴毒素β受体、CD134、CD40、FAS、TNFRSF6B、CD27、CD30、CD137、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、RANK、护骨蛋白、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、神经生长因子受体、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25、外胚层发育异常蛋白A2受体等TNF受体家族的激动性抗体的激动活性，用于癌症的治疗或预防。另外，除上述以外，针对与FcγRIIb的相互作用为其激动活性所需的分子的激动性抗体的激动活性也增强。此外，在对通过与FcγRIIb交联而抑制细胞增殖的分子如受体酪氨酸激酶(RTK)之一的Kit具有结合活性的多肽中，包含本发明的Fc区变体，对表达该分子的细胞的抑制作用可增强。癌症包括但不仅限于下述的癌症：肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺扁平上皮癌)、大肠癌、直肠癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、胆管癌、腹膜癌、间皮瘤、扁平上皮癌、子宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、食道癌、头颈癌、鼻咽癌、唾液腺肿瘤、胸腺瘤、皮肤癌、基底细胞瘤、恶性黑素瘤、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、急性髓性白血病(包括急性髓细胞白血病、急性成粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒单核细胞白血病和急性单核细胞白血病)、慢性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、蕈样肉芽肿、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、边缘带淋巴瘤、毛细胞白血病浆细胞瘤、周边T细胞淋巴瘤和成人T细胞白血病/淋巴瘤)、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、脑肿瘤(包括神经胶质瘤、星形细胞瘤、神经胶质母细胞瘤、脑膜瘤和室管膜瘤)、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤、尤文氏肉瘤、血管肉瘤、血管外皮细胞瘤。
本发明还涉及免疫炎性疾病的治疗方法或预防方法，该方法包括将本发明的包含Fc区变体的多肽或由本发明的制备方法制备的包含Fc区变体的多肽给予对象(患者)的步骤。
本发明还提供用于本发明的治疗方法或预防方法的试剂盒，该试剂盒至少包含本发明的包含Fc区变体的多肽或由本发明的制备方法制备的包含Fc区变体的多肽、或者本发明的药物组合物。除此之外，该试剂盒中还可包装有药学上可接受的载体、介质、记载使用方法的说明书等。另外，本发明涉及本发明的包含Fc区变体的多肽或由本发明的制备方法制备的包含Fc区变体的多肽在免疫炎性疾病的治疗药或预防药的制备中的用途。另外，本发明涉及用于本发明的治疗方法或者预防方法的、本发明的包含Fc区变体的多肽或者由本发明的制备方法制备的包含Fc区变体的多肽。
需要说明的是，本说明书中使用的氨基酸的3字母标记和单字母标记的对应关系如下。
丙氨酸：Ala：A
精氨酸：Arg：R
天冬酰胺：Asn：N
天冬氨酸：Asp：D
半胱氨酸：Cys：C
谷氨酰胺：Gln：Q
谷氨酸：Glu：E
甘氨酸：Gly：G
组氨酸：His：H
异亮氨酸：Ile：I
亮氨酸：Leu：L
赖氨酸：Lys：K
甲硫氨酸：Met：M
苯丙氨酸：Phe：F
脯氨酸：Pro：P
丝氨酸：Ser：S
苏氨酸：Thr：T
色氨酸：Trp：W
酪氨酸：Tyr：Y
缬氨酸：Val：V。
需要说明的是，本说明书中引用的全部现有技术文献均作为参照纳入到本说明书中。
实施例
通过以下的实施例进一步示例本发明，但并不限于下述实施例。
[实施例1] pH依赖性抗IgE抗体的获取
(1-1) 抗人IgE抗体的获取
为了获取pH依赖性抗人IgE抗体，使用FreeStyle293 (Life Technologies)使作为抗原的人IgE (重链SEQ ID NO：13、轻链SEQ ID NO：14) (可变区由抗人磷脂酰肌醇聚糖3抗体构成)表达。所表达的人IgE通过本领域技术人员所已知的普通的柱层析法进行纯化、调制。
从获取的多个抗体中选择了pH依赖性地与人IgE结合、并且形成包含两分子的抗IgE抗体和两分子的IgE以上的大的免疫复合物的抗体。使用人IgG1重链恒定区和人轻链恒定区表达、纯化了所选择的抗人IgE抗体。所制作的抗体命名为克隆278 (IgG1) (重链SEQID NO：10、轻链SEQ ID NO：11)。
(1-2) 抗人IgE抗体的结合活性和pH依赖性结合活性的评价
可以在内体内解离出抗原的抗体可通过不仅pH依赖性地与抗原结合、还Ca依赖性地结合的抗原结合来研制。于是，评价克隆278和作为对照的不具有pH依赖性IgE结合能力的Xolair (奥马珠单抗, Novartis)与人IgE (hIgE)的pH依赖性结合能力和pH/Ca依赖性结合能力。
即，使用Biacore T200 (GE Healthcare)评价了克隆278和Xolair与hIgE的结合活性(解离常数KD (M))。使用以下3种缓冲液作为运行缓冲液进行了测定。
・1.2mmol/l的CaCl2/0.05%的tween20、20mmol/l的ACES、150mmol/l的NaCl，pH7.4；
・1.2mmol/l的CaCl2/0.05%的tween20、20mmol/l的ACES、150mmol/l的NaCl，pH5.8；
・3μmol/l的CaCl2/0.05%的tween20、20mmol/l的ACES、150mmol/l的NaCl，pH5.8。
适量添加的在来自化学合成人磷脂酰肌醇聚糖3蛋白的序列(SEQ ID NO：12)的C末端所存在的Lys中添加有生物素的肽(以下记作“生物素化GPC3肽”)利用链霉亲和素与生物素的亲和性固定在传感芯片SA (GE Healthcare)上。注射适当浓度的人IgE，其被生物素化GPC3肽捕获，从而将人IgE固定在芯片上。注射适当浓度的克隆278作为分析物，使其与传感芯片上的人IgE发生相互作用。之后，注射10mmol/L的甘氨酸-HCl (pH1.5)，使传感芯片再生。相互作用均在37℃下进行测定。通过使用Biacore T200评估软件(GE Healthcare)对曲线拟合的测定结果进行分析，计算结合速度常数ka (1/Ms)和解离速度常数kd (1/s)。根据这些常数计算解离常数KD (M)。并且，计算pH5.8、1.2mM Ca条件和pH7.4、1.2mM Ca条件下的各抗体的KD比，评价了pH依赖性结合，再计算pH5.8、3μM Ca条件和pH7.4、1.2mM Ca条件下的各抗体的KD比，评价了pH/Ca依赖性结合。其结果见表5。
[表5]
Figure DEST_PATH_IMAGE005
(1-3) 评价克隆278、Xolair的免疫复合物的形成
通过凝胶过滤层析评价了：克隆278与人IgE在中性条件下(pH7.4)形成包含两分子的抗IgE抗体和两分子的IgE以上的大的免疫复合物、以及该免疫复合物在酸性条件下(pH5.8)解离。关于在100mM的NaCl中进行了透析处理的克隆278，将其作为中性条件下的样品，用20mM的Tris-HCl、150mM的NaCl、1.2mM的CaCl2的pH7.4的缓冲液进行了稀释，另将其作为酸性条件下的样品，用20mM的Bis-tris-HCl、150mM的NaCl、3μM的CaCl2的pH5.8的缓冲液进行了稀释。将100μg/mL (0.60μM)的作为人IgE的hIgE (Asp6)和克隆278以1:1、1:6的摩尔比混合，所得混合液在室温或25℃的自动进样器中放置2小时以上，之后通过凝胶过滤层析进行分析。在中性条件下使用20mM的Tris-HCl、300mM的NaCl、1.2mM的CaCl2的pH7.4的流动相，在酸性条件下使用20mM的Bis-tris-HCl、300mM的NaCl、3uM的CaCl2的pH5.8的流动相。柱使用G4000SWxl (TOSOH)，在流速为0.5mL/分钟、25℃的条件下进行了分析。其结果见图1。如图1所示，确认到克隆278和人IgE在中性条件下形成了由包含表观分子量为670kDa左右(在假定一分子的抗体为单体的情况下)的四量体及其以上的多量体构成的大的免疫复合物。并且，在酸性条件下没有确认到这样的免疫复合物，由此确认：与上述的使用Biacore的结合评价一样，这些免疫复合物pH依赖性地解离。
[实施例2] 克隆278和Xolair的体内评价
(2-1) 调制体内评价用的人IgE (hIgE (Asp6) )
由重链(SEQ ID NO：15)和轻链(SEQ ID NO：14)构成的体内评价用的人IgE即hIgE(Asp6) (可变区为抗人磷脂酰肌醇聚糖3抗体)通过与实施例1同样的方法进行调制。hIgE(Asp6)是将人IgE的6处N型糖链结合位点的天冬酰胺改变成了天冬氨酸以使人IgE的N型糖链的异质性不受作为抗原的人IgE的血浆中浓度变化的影响的分子。
(2-2) 使用正常小鼠验证克隆278和Xolair加速人IgE消失的效果
对C57BL/6J小鼠(Charles river Japan)单独给予hIgE (Asp6)、或同时给予hIgE(Asp6)和抗hIgE抗体(克隆278或Xolair)，然后评价了hIgE (Asp6)和抗人IgE抗体的体内动力学。从尾静脉以10mL/kg的量单次给予了hIgE (Asp6) (20μg/mL)或hIgE (Asp6)和抗人IgE抗体的混合溶液(浓度记载于表6中)。此时，由于相对于hIgE (Asp6)存在充分过剩的各抗体，所以认为hIgE (Asp6)几乎全部与抗体结合。在给药后5分钟、2小时、7小时、1天、2天、4天或5天、7天、14天、21天、28天由该小鼠采集血液。所采集的血液立即在4℃、15,000rpm下离心分离5分钟，获得了血浆。所分离的血浆在实施测定前保存在设定成-20℃以下的冷库中。
[表6]
Figure 452779DEST_PATH_IMAGE006
(2-3) 测定正常小鼠血浆中的hIgE (Asp6)浓度
小鼠血浆中hIgE (Asp6)浓度通过ELISA法来测定。调制了以血浆中浓度计为192、96、48、24、12、6、3ng/mL的标准曲线样品。为了使hIgE (Asp6)与抗hIgE抗体的免疫复合物变得均匀，在标准曲线和小鼠血浆测定样品中添加Xolair (Novartis)使达到10μg/mL，在室温下静置了30分钟。将静置后的标准曲线和小鼠血浆测定样品分别注入固定有抗人IgE的免疫板(MABTECH)或固定有抗人IgE(克隆107、MABTECH)的免疫板(Nunc F96微孔板(Nalge nunc International))中，在室温下静置2小时或在4℃下静置一夜。之后，使人GPC3核心蛋白(SEQ ID NO：16)、用NHS-PEG4-生物素(Thermo Fisher Scientific)进行了生物素化的抗GPC3抗体(社内调制)、链霉亲和素-PolyHRP80 (Stereospecific DetectionTechnologies)分别依次反应了1小时。通过下述方法测定小鼠血浆中浓度：利用1N-硫酸(Showa Chemical)使以TMB One Component HRP微孔底物(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应停止，之后利用酶标仪测定该显色在450nm的吸光度；或者以SuperSignal(r)ELISA Pico化学发光底物(Thermo Fisher Scientific)作为底物进行发光反应，再利用酶标仪测定发光强度。利用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)由标准曲线的吸光度或发光强度计算小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的血浆中hIgE (Asp6)浓度变化见图2。在图中，克隆278记作278-IgG1、Xolair记作Xolair-IgG1。
(2-4) 测定正常小鼠血浆中的抗人IgE抗体浓度
小鼠血浆中的抗hIgE抗体浓度通过ELISA法来测定。调制了以血浆中浓度计为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL的标准曲线样品。为了使hIgE (Asp6)与抗hIgE抗体的免疫复合物变得均匀，在标准曲线和小鼠血浆测定样品中添加hIgE (Asp6)使达到1μg/mL，之后在室温下静置了30分钟。将静置后的标准曲线和小鼠血浆测定样品分别注入固定有抗人Κappa轻链抗体(Bethyl Laboratories)的免疫板(Nunc-Immuno板,MaxiSorp (Nalge nunc International))中，在室温下静置2小时或在4℃下静置一夜。之后，使兔抗人IgG (Fc)二次抗体生物素缀合物(Pierce Biotechnology)和链霉亲和素-Poly HRP80 (Stereospecific Detection Technologies)分别依次反应了1小时。利用1N-硫酸(Showa Chemical)使以TMB One Component HRP微孔底物(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应停止，之后通过利用酶标仪测定该显色在450nm下的吸光度的方法测定了小鼠血浆中浓度。利用分析软件SOFTmax PRO (Molecular Devices)由标准曲线的吸光度计算小鼠血浆中浓度。利用该方法测定的静脉内给药后的血浆中IgE抗体浓度变化见图3。在图中克隆278记作278-IgG1、Xolair记作Xolair-IgG1。
其结果，相对于单独人IgE的消失，在同时给予人IgE和作为对照抗IgE抗体的Xolair时，人IgE的消失变慢。相对于此，在同时给予对人IgE具有pH依赖性结合活性的克隆278时，确认到了与单独人IgE相比大幅地加速了人IgE的消失。
虽然在国际公开第WO2011/122011号中使用与人IL-6受体(hsIL-6R)结合的抗体和hsIL-6R进行了同样的实验，但其结果与本实施例的结果不同。在国际公开第WO2011/122011号的实施例3中，对正常小鼠(C57BL/6J小鼠)同时给予虽然与人IL-6受体(hsIL-6R)结合但该结合不是pH依赖性的抗体(H54L28-IgG1)的IgG1抗体和抗原时，与给予单独的抗原时相比，作为抗原的人IL-6受体的消失没有加速，反倒变慢了。在同时给予pH依赖性地与抗原结合的抗体(Fv4-IgG1)和抗原时，虽然与给予H54L28-IgG1时相比抗原的消失也加速，但与单独给予抗原时相比抗原的消失变慢。认为这是由于：通过给予抗体，抗体与抗原结合，其结果，抗原通过与抗体一同行动，与抗体一样经由FcRn进行再循环，不易从血中消失。
本实施例中获得的结果如下：通过同时给予抗原和抗体，与单独给予抗原时相比，抗原的消失加速，这似乎一看起来与以往的报道矛盾。但其不同点在于：本实施中使用的作为抗原的IgE是二价抗原，而hsIL-6R是一价抗原。若在IgE中加入抗IgE抗体，则可以是两个抗体与一个抗原结合，形成如实施例(1-3)中观察到的由多个抗原和抗体构成的免疫复合物。当为单独的抗体时，虽然能够以一价(亲和力，affinity)与作为IgG的受体的FcγR结合，但在如上所述的由多个抗原和抗体形成的免疫复合物的情况下，可以以多价(亲合力，avidity)与FcγR结合。另一方面，当为hsIL-6R时，一个抗体只能与一个抗原结合，因此由该抗原和抗体形成的免疫复合物只能以一价(亲和力，affinity)与FcγR结合，与以亲合力(avidity)结合时相比，其相互作用非常弱。即，认为由IgE和其抗体形成的免疫复合物与FcγR以亲合力(avidity)进行强力结合，其结果，经由FcγR所表达的肝脏等从血中迅速去除。
并且，当抗体pH依赖性地与作为抗原的IgE结合时，抗原与抗体的免疫复合物被摄入细胞内后，抗原在内体内解离。之后，抗原没有和抗体一起经由FcRn进行再循环，已解离的抗原在溶酶体内分解。其结果，认为与抗体和抗原的结合为非pH依赖性时相比抗原迅速消失。
[实施例3] 降低了FcγR结合的克隆278和Xolair的体内评价
(3-1) 获取降低了FcγR结合的抗人IgE抗体
接下来，为了验证在实施例2中观察到的抗原消失的加速是否来自免疫复合物与FcγR的相互作用，制作了相对于pH依赖性地与人IgE结合的278-IgG1而言与小鼠FcγR的结合降低的变体。为了降低与小鼠FcγR的结合，制作了将278-IgG1的EU编号所表示的第235位的Leu取代为Arg、并将第239位的Ser取代为Lys的278-F760 (轻链SEQ ID NO：11)。利用本领域技术人员所已知的方法将编码这些基因的DNA序列插入到动物表达用质粒内。使用导入了该质粒的动物细胞，通过上述方法进行了表达的这些抗体变体的浓度在其纯化后进行了测定。
(3-2) 使用正常小鼠验证降低了FcγR结合的克隆278和Xolair加速人IgE消失的 效果
利用与(2-2)相同的方法，使用正常小鼠验证了给予降低了与小鼠FcγR的结合的278-F760 (轻链SEQ ID NO：11)时IgE的消失效果。
(3-3) 测定正常小鼠血浆中的hIgE (Asp6)浓度
利用与(2-3)相同的方法测定了正常小鼠血浆中的hIgE浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的血浆中hIgE浓度变化见图4。为了进行比较，图中还显示了给予(2-3)中获得的278-IgG1时的血浆中hIgE浓度变化。
(3-4) 测定正常小鼠血浆中的抗人IgE抗体浓度
利用与(2-4)相同的方法测定了正常小鼠血浆中的抗hIgE抗体浓度。
通过该方法测定的静脉内给药后的血浆中抗体浓度变化见图5。为了进行比较，图中还显示了(2-3)中获得的278-IgG1的血浆中抗体浓度变化。
本实施例的结果显示：通过降低抗体与FcγR的结合，在血浆中的抗体浓度变化上没有观察到大的变化，但在实施例2中观察到的给予克隆278的IgG1抗体时加速抗原消失的效果明显减弱。即，显示了：在实施例2中观察到的同时给予抗IgE抗体时所观察到的IgE消失加速来自所给予的抗体与FcγR的相互作用。
由此认为：为了使用抗体有效地除去目标抗原，需要形成由多个抗原和抗体形成的免疫复合物、该抗体的FcγR结合维持在与天然型IgG1抗体相同的程度、以及优选抗体与抗原pH依赖性地结合(在pH酸性条件下与抗原的结合低于在中性条件下的结合)。
[实施例4] 制作与FcgRIIb的结合维持在与天然型相同的程度、而与其他FcgR的结合减弱的变体
(4-1) 研究通过与P238D改变组合来维持与FcgRIIb的结合、而降低与FcgRIIaR的 结合的改变
在制作与FcgRIIb的结合维持在与天然型IgG1的结合相同的程度、同时仅选择性地降低与活性型FcgR的结合的抗体时，认为最困难的课题是：将氨基酸序列的同源性非常高的FcgRIIa和FcgRIIb区别开来，以选择性地降低结合活性。FcgRIIa中存在第131位氨基酸为Arg的基因多态性和为His的基因多态性。在FcgRIIb中该残基所对应的残基是Arg，因此FcgRIIb与FcgRIIa R的序列更类似。因此，即使在FcgRIIa中认为区别FcgRIIa R型和FcgRIIb也是特别困难的课题。作为用于提高与该FcgRIIaR所对应的FcgRIIb的结合选择性的改变，在WO2012/115241中报道了EU编号第238位的Pro取代成Asp的改变。在本研究中，目标是以包含该改变的抗体为模板，制作与FcgRIIb的结合维持在与天然型IgG1相同的程度而尽可能减弱与其他FcgR的结合的变体。
根据WO2012/115241的实施例5中获得的Fc (P238D)与FcγRIIb胞外区的复合物的X射线晶体结构分析的结果，在将EU编号第238位的Pro取代为Asp的改变Fc上向预测会对与FcγRIIb的相互作用产生影响的位点(EU编号第233位、第234位、第235位、第236位、第237位、第239位、第240位、第241位、第263位、第265位、第266位、第267位、第268位、第271位、第273位、第295位、第296位、第298位、第300位、第323位、第325位、第326位、第327位、第328位、第330位、第332位、第334位的残基)导入综合性的改变，评价与各FcγR的相互作用。
制作了WO2009/125825中公开的抗人白介素6受体的抗体的可变区即IL6R-H的可变区(SEQ ID NO：17)作为抗体H链可变区，并制作了具有除去了人IgG1的C末端的Gly和Lys的G1d的IL6R-G1d (SEQ ID NO：3)作为抗体H链恒定区。接下来，按照参考实施例1的方法，制作了将IL6R-G1d的EU编号第238位的Pro取代为Asp的IL6R-F648。作为导入综合性改变的模板H链，准备了向IL6R-F648中导入了M252Y和N434Y的IL6R-F652 (SEQ ID NO：1)和向IL6R-F648中导入了K439E的IL6R-BF648 (SEQ ID NO：2)这两种。向IL6R-F652或IL6R-BF648的上述位点导入了除了原始氨基酸和Cys之外的18种氨基酸。共同使用IL6R-L (SEQID NO：6)作为抗体L链，与各自的H链一起，按照参考实施例1的方法表达、纯化了抗体。按照参考实施例1的方法表达、纯化抗体，再通过参考实施例2的方法综合性地评价了这些变体与各FcγR(FcγRIa、 FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIa V型)的结合。
其结果，发现其中L235F、G237Q、F241M、F241L、H268P、Q295M、Q295V、Y296E、Y296H、Y296N、Y296D、S298A、S298M、V323I、S324N、S324H、A330H、A330Y通过与P238D改变组合，成为降低与FcgRIIaR的结合而不会大幅降低与FcgRIIb的结合的改变(表7和表8)。
表7和表8分别显示通过对IL6R-F652/IL6R-L和IL6R-BF648/IL6R-L进行的综合性的改变导入而发现的变体与FcgRIIaR和FcgRIIb的相对结合活性。这是用各变体与FcgRIIaR或FcgRIIb的结合量的值除以IL6R-F652/IL6R-L或IL6R-BF648/IL6R-L与各FcgR的结合量的值再扩大100倍而得到的值。
[表7]
Figure DEST_PATH_IMAGE007
[表8]
Figure 221890DEST_PATH_IMAGE008
由表7和表8所示的结果发现了：与导入改变前相比，这些改变均为与FcgRIIb的结合维持在至少55.5%以上，而与FcgRIIaR的结合降低的改变。
因此，在本研究中，通过进一步组合这些改变，研究了与FcgRIIb的结合维持在与IgG1相同的程度而尽可能降低与FcgRIIaR的结合的变体的制作。具体而言，在表7和表8中，将认为与导入改变前相比选择性地降低了与活性型FcgR的结合的改变、或将它们组合导入到了IL6R-F648中。共同使用IL6R-L (SEQ ID NO：6)作为抗体L链，与各自的H链一起，按照参考实施例1的方法表达、纯化了抗体。获得的变体与FcgRIa、FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb、FcgRIIIaV的结合按照参考实施例2的方法进行了评价。在此表9中，显示了各变体与FcgRIIaR和FcgRIIb的相对结合活性。这是用各变体与FcgRIIaR或FcgRIIb的结合量的值除以IL6R-G1d/IL6R-L与FcgRIIaR或FcgRIIb的结合量的值再扩大100倍而得到的值。
[表9]
Figure DEST_PATH_IMAGE009
在表9所示的变体中，关于与IL6R-G1d/IL6R-L的结合相比与FcgRIIb的结合维持在80%以上、且与FcgRIIaR的结合降低至30%以下的变体，其与各FcgR的KD值见表10。表中的相对结合活性是指用IL6R-G1d/IL6R-L的KD值除以各变体的KD值而得到的值，显示以IL6R-G1d/IL6R-L相对于各FcgR的KD值为1时的各变体的相对结合活性。在表中的KD值中，由于FcgR与各变体的结合微弱，判断为无法通过动力学分析正确进行分析，因此涂满灰色的值是指利用参考实施例2记载的式2计算而得的值。
[式2]
Figure 973945DEST_PATH_IMAGE010
[表10]
Figure DEST_PATH_IMAGE011
Figure 796408DEST_PATH_IMAGE012
在本研究中所导入的改变中，导入了Y296E的P589、导入了F241M的P590、导入了F241L的P594、导入了Q295V的P595、导入了Y296H的P597、导入了S298A的P600、导入了S298M的P601、导入了H268P的P718、导入了S324N的P719、导入了S324H的P720、导入了A330H的P721、导入了A330Y的P722、导入了L235F的P723、导入了G237Q的P724、导入了Y296D的P725均显示具有下述效果：与FcgRIIb的结合维持在与G1d相同的程度或其以上、而与FcgRIIaR的结合较导入改变前的F648有所降低。其中，与FcgRIIaR的结合最为降低的是导入了S298A的P600，其与FcgRIIb的结合维持在G1d的1.2倍、而与FcgRIIaR的结合降低至0.026倍。
将具有选择性地降低与活性型FcgR的结合的效果的改变彼此组合进行了研究的结果，与G1d相比与FcgRIIb的结合为1.0倍以上、且与FcgRIIaR的结合最为降低的是P727。P727与FcgRIIb的结合维持在G1d的1.1倍，而与FcgRIIaR的结合减弱至0.012倍。另外，与FcgRIa的结合减弱至G1d的0.0014倍、与FcgRIIaH的结合减弱至G1d的0.007倍、与FcgRIIIaV的结合减弱至G1d的0.005倍，P727是对FcgRIIb以外的活性型FcgR极具选择性地减弱结合的优异变体。
(4-2) 针对增强与FcgRIIb的结合的变体研究其与FcgRIIaR的结合降低
接下来，以选择性地增强与FcgRIIb的结合、而与其他FcgR的结合没有增强或降低的变体为模板，通过导入降低与还包括FcgRIIb在内的所有FcgR的结合的改变，期待着获得与FcgRIIb的结合维持在与IgG1相同的程度、而与其他FcgR的结合较IgG1有所降低的变体。
因此，首先制作了向IL6R-G1d (SEQ ID NO：3)中导入了K439E的IL6R-B3 (SEQ IDNO：4)。通过组合FcgRIIb选择性结合并导入IL6R-B3中，制作了选择性地增强与FcgRIIb的结合的变体。共同使用IL6R-L (SEQ ID NO：6)作为抗体L链，与各自的H链一起，按照参考实施例1的方法表达、纯化了抗体。所得变体与FcgRIa、FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb、FcgRIIIaV的结合按照参考实施例2的方法进行了评价。所制作的变体与各FcgR的结合活性见表11。表中的相对结合活性是指用IL6R-B3/IL6R-L的KD值除以各变体的KD值而得到的值，显示以IL6R-B3/IL6R-L相对于各FcgR的KD值为1时的各变体的相对结合活性。“KD(IIaR)/KD(IIb)”是指用各变体相对于FcgRIIaR的KD值除以各变体相对于FcgRIIb的KD值而得到的值，该值越大显示对于FcgRIIb的选择性越高。在表中的KD值中，由于FcgR与各变体的结合微弱，判断为无法通过动力学分析进行正确分析，因此涂满灰色的值是指利用参考实施例2记载的式2计算而得的值。
[式2]
Figure DEST_PATH_IMAGE013
[表11]
Figure 1124DEST_PATH_IMAGE014
Figure DEST_PATH_IMAGE015
Figure 200024DEST_PATH_IMAGE016
Figure DEST_PATH_IMAGE017
与IL6R-B3/IL6R-L相比，表11中记载的变体与FcgRIIb的结合均有所增强，其与FcgRIIb的结合的增强程度为IL6R-B3/IL6R-L的2.6倍～3090倍。另外，IL6R-B3/IL6R-L的KD(IIaR)/KD(IIb)为0.3，相对于此，表11中记载的变体的KD(IIaR)/KD(IIb)为8.7～64.4，所有变体对于FcgRIIb的选择性(KD(IIaR) /KD(IIb))均较IL6R-B3/IL6R-L有所提高。
对于针对这些FcgRIIb选择性地结合增强的变体，预测通过导入降低与所有FcgR的结合的改变，获得了与FcgRIIb的结合维持在与IgG1相同的程度、而与IgG1相比与其他活性型FcgR的结合选择性地降低的变体。于是，实际上使用导入IL6R-BP568/IL6R-L和IL6R-BP489/IL6R-L中的两种FcgRIIb选择性地结合增强的变体，确认能否获得如上述预测的变体。具体而言，使用导入了上述两种FcgRIIb选择性地结合增强的改变的变体作为模板，确认了可以获得与FcgRIIb的结合维持在与IgG1相同的程度、而与IgG1相比与其他活性型FcgR的结合选择性地降低的变体。具体而言，通过向IL6R-G1d中导入在IL6R-BP568/IL6R-L和IL6R-BP489/IL6R-L中使用的FcgRIIb结合增强的改变，制作了两种选择性地增强与FcgRIIb的结合的变体IL6R-P577和IL6R-P587。共同使用IL6R-L (SEQ ID NO：6)作为抗体L链，与各自的H链一起，按照参考实施例1的方法表达、纯化了抗体。这两种变体相对于各FcgR的KD值见表12。
[表12]
Figure 806586DEST_PATH_IMAGE018
与G1d相比，P577与FcgRIIaR的结合为21.9倍、与FcgRIIb的结合为3370.7倍。另外，与G1d相比，P587与FcgRIIaR的结合为1.4倍、与FcgRIIb的结合为255.6倍。
对于所制作的两种FcgRIIb结合增强的变体，通过导入降低与所有FcgR的结合的改变，研究了与FcgRIIb的结合维持在与天然型IgG1相同的程度、同时尽可能地减弱与其他FcgR、特别是与FcgRIIaR的结合的变体的制作。通过实施向与FcgR相互作用的残基中综合性地导入改变的研究，发现了大幅降低与FcgRIIaR的结合的改变。除了向实施例4-1中所示的IL6R-F652/IL6R-L的EU编号第234位、第235位、第236位、第237位、第239位中导入综合性改变，还实施了向FcgRIIb选择性增强变体中导入综合性改变。
向IL6R-BF648 (SEQ ID NO：2)中导入WO2012/115241中报道的FcgRIIb增强改变(E233D/G237D/H268E/P271G)，制作了IL6R-BP267 (SEQ ID NO：5)。制作了将IL6R-BP267的EU编号第265位、第266位、第267位、第269位取代为除了原始氨基酸和Cys之外的18种氨基酸的变体。共同使用IL6R-L (SEQ ID NO：6)作为抗体L链，与各自的H链一起，按照参考实施例1的方法表达、纯化了抗体。按照参考实施例1的方法表达、纯化抗体，再利用参考实施例2的方法综合性地评价了这些变体与各FcγR (FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIa V型)的结合。表13和表14分别显示了通过对IL6R-F652/IL6R-L和IL6R-BP267/IL6R-L进行综合性改变导入而发现的改变与FcgRIIaR和FcgRIIb的相对结合活性。这是用各变体与FcgRIIaR或FcgRIIb的结合量的值除以IL6R-F652/IL6R-L或IL6R-BP267/IL6R-L与各FcgR的结合量的值再扩大100倍而得到的值。
[表13]
Figure DEST_PATH_IMAGE019
[表14]
Figure 799950DEST_PATH_IMAGE020
由表13和表14的结果显示出：与导入改变前相比，这些改变与FcgRIIaR的结合降低至至少67%以下，其中还包括使该结合完全消失的改变。
接下来，将这些改变导入FcgRIIb选择性结合增强的变体中进行了研究。具体而言，按照参考实施例1的方法将表13和表14中所示的17个改变导入IL6R-P577、IL6R-P587中。另外，有报道称：通过除去Fc区的EU编号第297位的Asn中所添加的N型糖链，抗体与FcgR的结合明显降低(The Journal of Biological Chemistry, 2000, 276, 6591-6604)。因此，在本实施例中，除了导入上述的17个改变之外，还按照参考实施例1的方法将N297A导入IL6R-P577、IL6R-P587中以除去Asn297中所添加的N型糖链。共同使用IL6R-L (SEQ ID NO：6)作为抗体L链，与各自的H链一起，按照参考实施例1的方法表达、纯化了抗体。所得变体与FcgRIa、FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb、FcgRIIIaV的结合按照参考实施例2的方法进行了评价。这里，表15中显示了各变体与FcgRIIaR和FcgRIIb的相对结合活性。这是用各变体与FcgRIIaR或FcgRIIb的结合量的值除以IL6R-G1d/IL6R-L与FcgRIIaR或FcgRIIb的结合量的值再扩大100倍而得到的值。
[表15]
Figure DEST_PATH_IMAGE021
如表15所示，几乎没有确认到导入了S239K的变体P606、P607、导入了D265K的P630、P645、导入了D265R的P632、P647、导入了D265V的P634、P649与FcgRIIaR、FcgRIIb的结合。即，即使将这些改变导入与FcgRIIb的结合增强的变体中，所述变体与FcgRIIb的结合活性也会显著降低。另一方面，向P587中导入S267R而得到的P636、或向P577中导入N297A而得到的P665与FcgRIIb的结合几乎与G1d的程度相同，另一方面，与FcgRIIaR的结合大幅降低。
在表15所示的变体中，与FcgRIIb的结合维持在G1d的80%以上、而与FcgRIIaR的结合被抑制在G1d的30%以下的变体相对于各FcgR的KD见表16。表中的相对结合活性是指用IL6R-G1d/IL6R-L的KD值除以各变体的KD值而得到的值，显示了以IL6R-G1d/IL6R-L相对于各FcgR的KD值为1时的各变体的相对结合活性。在表中的KD值中，由于FcgR与各变体的结合微弱，判断为无法通过动力学分析正确进行分析，因此涂满灰色的值是指利用参考实施例2记载的式2计算而得的值。
[式2]
Figure 990497DEST_PATH_IMAGE022
[表16]
Figure DEST_PATH_IMAGE023
在这些变体中，与FcgRIIaR的结合最为降低的是向P587中导入S267R而得到的P636。P636相对于FcgRIIaR的KD是G1d的0.023倍，但P636相对于FcgRIIb的KD维持在G1d的1.8倍。另外，P636与FcgRIa的结合被抑制在G1d的0.0007倍、与FcgRIIaH的结合被抑制在G1d的0.006倍、与FcgRIIIaV的结合被抑制在G1d的0.008倍。以上的结果显示出：对于选择性地增强与FcgRIIb的结合的变体，通过向其中导入降低与所有FcgR的结合的改变，获得了与FcgRIIb的结合维持在与IgG1相同的程度、而与其他FcgR的结合较IgG1有所降低的变体。
(4-3) 研究具有降低与FcgRIIaR的结合的效果的改变的组合
将在4-1、4-2中发现的与FcgRIIb的结合维持在与G1d相同的程度、而与FcgRIIaR的结合有所降低的改变组合起来，研究了更优异的变体的制作。
表17中显示组合研究结果。表中的相对结合活性是指用IL6R-G1d/IL6R-L的KD值除以各变体的KD值而得到的值，显示以IL6R-G1d/IL6R-L相对于各FcgR的KD值为1时的各变体的相对结合活性。在表中的KD值中，由于FcgR与各变体的结合微弱，判断为无法通过动力学分析正确进行分析，因此涂满灰色的值是指利用参考实施例2记载的式2计算而得的值。
[式2]
Figure 930772DEST_PATH_IMAGE024
[表17]
Figure 454157DEST_PATH_IMAGE025
在表17所记载的变体中，与FcgRIIaR的结合最为降低的是将S267R、H268P、Y296E组合起来导入到FcgRIIb选择性的结合增强变体P587中而得到的P712，与G1d相比其与FcgRIIb的结合维持在1.5倍，而与G1d相比其与FcgRIIaR的结合降低至0.017倍。另外，与G1d相比，其与FcgRIa的结合被抑制在0.0005倍、与FcgRIIaH的结合被抑制在0.003倍、而与FcgRIIIaV的结合被抑制在0.004倍。
[实施例5] 制作与FcgRIIb的结合维持在与天然型相同的程度、而减弱与其他FcgR的结合、并且减弱与补体的结合的变体
补体依赖性细胞毒(complement-dependent cytotoxicity, CDC)与ADCC一样是引起免疫反应的效应子功能。迄今为止认为所制作的变体与FcgRIIb以外的活性型受体的结合活性均大幅降低、而ADCC活性均大幅减弱。但抗体与补体的结合位点不同于抗体与FcgR的结合位点，因此有可能维持与补体的结合活性。因此，通过评价各变体与补体的结合活性、并组合与补体的结合降低的改变，制作了与补体的结合也减弱的变体。
使用Biacore T200 (GE Healthcare)进行了抗体与人C1q的相互作用分析。运行缓冲液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，测定温度为25℃。使用了在S系列传感芯片CM4 (GEHealthcare)上通过胺偶联法固定有蛋白L (ACTIGEN或BioVision)的芯片。
将目标抗体捕获到这些传感芯片上，使其与用运行缓冲液稀释了的人补体C1q(PROSPEC或Calbiochem)相互作用，测定与抗体的结合量，在抗体之间进行了比较。但由于C1q的结合量取决于捕获的抗体量，因此用C1q的结合量除以各抗体的捕获量，用所得的校正值进行了比较。另外，通过与10mM的甘氨酸-HCl (pH1.5)反应，洗涤传感芯片上捕获的抗体，使传感芯片再生，进行重复利用。
作为降低与C1q的结合的改变，使用了现有文献(J. Immunol, 2003, 164, 4178-4184)中记载的K322A。并且，由于期待着通过将EU编号第322位的Lys取代成带有相反电荷的Glu也可降低与C1q的结合，因此还对K322E进行了研究。另据报道，与IgG1相比IgG4的CDC活性明显低，而这是由于CH2结构域C末端的序列不同的缘故(J. Exp. Med., 1991, 173,1025-1028)。因此，对通过将IgG1的EU编号第327位的Ala取代成Gly、将第330位的Ala取代成Ser、将第331位的Pro取代成Ser、并形成IgG4型序列来降低与C1q的结合也一并进行了研究。
具体而言，对增强与FcgRIIb的结合的变体、或维持与FcgRIIb的结合而降低与其他FcgR的结合的变体与人C1q的结合进行了评价。另外，制作了在其中组合了降低与C1q的结合的改变的变体，并进行了评价。另外，对于所有变体，评价了按照参考实施例2的方法制作的变体与各FcgR的结合。使用人IgG4作为与C1q的结合评价中的阴性对照。制作了具有将人IgG4的EU编号第228位的Ser取代成Pro、并除去了C末端的Gly和Lys的G4d的IL6R-G4d(SEQ ID NO：52)。共同使用IL6R-L (SEQ ID NO：6)作为抗体L链。
表18是所制作的变体与人C1q的结合的评价结果。表中的“以G1d为100时与C1q的结合量”是指，用C1q与各变体的结合量除以各变体的捕获量，再用所得的值除以用IL6R-G1d/IL6R-L与C1q的结合量除以IL6R-G1d/IL6R-L的捕获量而得到的商，再扩大100倍而得到的值。即，其显示了与IL6R-G1d/IL6R-L相比有何种程度与C1q结合。
[表18]
Figure DEST_PATH_IMAGE026
以具有天然型序列的G1d为100时，作为阴性对照的G4d是15.5。另外还可知：将降低与C1q的结合的改变导入G1d中而得到的G1dK322A、G1dK322E、G1dGSS与C1q的结合分别为20.5、2.3、15.2，与G4d相同或在其之下，与导入改变前相比与C1q的结合大幅降低。另外还明确了：导入了选择性地增强与FcgRIIB的结合的P238D改变而得到的F648即使不使用降低与C1q的结合的改变，其与C1q的结合也与G4d为相同程度。另外，向其中又导入了降低C1q结合的改变而得到的P741、P742、P743与C1q的结合能力均与G4d相同或在其之下。
在与FcgRIIb的结合维持在与天然型相同的程度、而与其他FcgR的结合能力减弱的变体即P600、P691、P727、P729、P733、P737中，P600、P691、P729、P733均具有与G4d相同程度的C1q结合活性。另一方面，虽然P727、P737与G1d相比大幅减弱，但与G4d相比显示出两倍以上的结合能力。向两个变体中共同导入了A330H的改变，认为与C1q的结合因此而增强。但在所有变体中，通过导入作为降低C1q结合的改变的K322A或K322E，与C1q的结合活性被抑制在G4d以下。
在作为与FcgRIIb的结合增强的变体的P587、P588、P769、P112、P555、P556、P559、P562、P763、P764、P765中，可知P587和P588与C1q的结合与G1d相同或在其之上。另外，虽然P769、P556、P559、P562、P763、P765与G1d相比大幅减弱，但与G4d相比显示出两倍左右的结合能力。另一方面，P112、P764具有与G4d相同程度的C1q结合活性。另外还显示出：在所有变体中，通过导入C1q结合降低的改变，与C1q的结合活性被抑制在与G4d相同或其之下。
表19中显示了各变体与FcgRIIaR和FcgRIIb的相对结合活性。这是用各变体与FcgRIIaR或FcgRIIb的结合量的值除以IL6R-G1d/IL6R-L与FcgRIIaR或FcgRIIb的结合量的值再扩大100倍而得到的值。
[表19]
Figure DEST_PATH_IMAGE028
表19所示的包含降低与补体的结合的改变的变体，与G1d相比其与FcgRIIaR的相对结合活性维持在105%以下，而与G1d相比其与FcgRIIb的相对结合活性维持在48%以上。
表20中显示了这些变体与各FcgR的结合。表中的相对结合活性是指用IL6R-G1d/IL6R-L的KD值除以各变体的KD值而得到的值，显示了以IL6R-G1d/IL6R-L相对于各FcgR的KD值为1时的各变体的相对结合活性。在表中的KD值中，由于FcgR与各变体的结合微弱，判断为无法通过动力学分析进行正确分析，因此涂满灰色的值是指利用参考实施例2记载的式2计算而得的值。
[式2]
Figure 556105DEST_PATH_IMAGE029
[表20]
Figure DEST_PATH_IMAGE030
Figure 797731DEST_PATH_IMAGE031
在比较降低C1q结合的改变对FcgRIIb结合能力的影响时，在向G1d中导入K322A而得到的G1dK322A中与G1d相比为1.0倍，在导入了K322E的G1dK322E中与G1d相比为1.1倍，在导入了A327G/A330S/P331S的G1dGSS中与G1d相比为0.9倍，所有的降低C1q结合的改变均几乎不影响与FcgRIIb的结合。向包含选择性地增强与FcgRIIb的结合的P238D改变的F648中导入K322A而得到的P741、或导入K322E而得到的P742中，与导入改变前的F648相比，与hFcgRIIb的结合几乎没有变化，相对于此，在导入了A327G/A330S/P331S的P743中，与FcgRIIb的结合能力略有降低，为G1d的0.6倍。由以上的结果可知：在与P238D改变组合时，K322A或K322E改变可减弱与C1q的结合能力而不会降低与FcgRIIb的结合能力，但A327G/A330S/P331S改变会稍微降低与FcgRIIb的结合能力。向其他的包含P238D改变的变体中导入时该结果也是一样的。例如，在向P600中导入K322A而得到的P744中，与G1d相比，其与FcgRIIb的结合为0.7倍，在导入了K322E的P745中为0.7倍，但在导入了A327G/A330S/P331S的P781中为0.2倍，略有降低。
另一方面，从免疫原性方面考虑，认为与导入K322A或K322E相比，优选导入作为天然型人IgG4的序列的A327G/A330S/P331S。因此，向导入有增强与FcgRIIb的结合的改变的变体中导入用于降低C1q结合的改变时，有时更优选A327G/A330S/P331S改变。例如在向P781中组合了E233D和G237D而得到的P787中，通过导入A327G/A330S/P331S改变使得C1q结合降低，但另一方面，与活性型FcgR的结合没有大幅增强，与FcgRIIb的结合提高0.2倍～0.5倍。
本研究中制作的增强或维持与FcgRIIb的结合、并且降低与补体的结合的变体，其与FcgRIIb的结合均被抑制在G1d的0.2倍以上，而与FcgRIIaR的结合均被抑制在G1d的1.0倍以下。另外，与FcgRIa的结合抑制在G1d的0.85倍以下，与FcgRIIaH的结合抑制在G1d的0.036倍以下，与FcgRIIIaV的结合抑制在G1d的0.012倍以下。其中，在导入了A327G/A330S/P331S改变的变体中，P756、P757、P758、P759、P760、P761、P762、P766、P767、P768、P770、P784与FcgRIIb的结合均较G1d有所增强，而与FcgRIIaR的结合均为G1d的1.0倍以下。
以上的结果显示：通过向与FcgRIIb的结合增强或与FcgRIIb的结合维持在与天然型相同的程度、而与其他FcgR的结合减弱的变体中导入降低与补体的结合的改变，可以制作对FcgRIIb的结合选择性优异、并且与C1q的结合减弱的变体。
[实施例6] Fc变体的树状细胞(DC)活化能力的评价
(6-1) Fc变体的树状细胞(DC)活化能力的评价
迄今为止，有报道称：树状细胞通过交联经由抗体的Fc部分在细胞表面上表达的活性型FcγR、特别是FcγRIIa而活化(The Journal of Clinical Investigation, 2005,115, 2914-2923, The Journal of Immunology, 2003, 170, 3963-3970)。对于实施例4中制作的选择性地降低与活性型FcγR的结合的Fc变体，验证经由抗体的Fc部分能否降低树状细胞活化能力。
(6-2) Fc变体的调制
按照参考实施例1的方法，制作了XolairH-G1d (SEQ ID NO：18)、将XolairH-G1d的EU编号第238位的Pro取代为Asp的XolairH-F648、将XolairH-G1d的EU编号第238位的Pro取代为Asp、且第298位的Ser取代为Ala的XolairH-P600。共同使用XolairL-k0 (SEQ IDNO：7)作为抗体L链，与各自的H链一起，按照参考实施例1的方法表达、纯化了抗体。各Fc变体分别记作G1d、F648、P600。
(6-3) 分离单核细胞并诱导其分化成树状细胞
将人全血与等量的RPMI培养基混合，通过聚蔗糖(ficol)分离白细胞层。使用单核细胞分离试剂盒II (Miltenyi Biotec)从白细胞层中分离了单核细胞。使用RPMI培养基(10%的FBS、100ng/ml的hIL-4 (R&D systems)、250ng/ml的hGM-CSF (R&D systems))将单核细胞调整成5×105细胞/ mL，在37度下培养7天，分化诱导成了DC。
(6-4) 平板涂布和DC的刺激
以100ul/孔向96孔板(maxisorp, nunc)中添加用PBS稀释的包含各Fc变体(G1d、F648、P600)的溶液(50ug/ml)或PBS，在室温下振荡了1小时。用PBS洗涤3次，以2×105细胞/孔接种了DC。在37度下培养4小时后回收细胞，使用RNeasy 96试剂盒(QIAGEN)提取了RNA。
(6-5) IL-8表达的评价
使用QuantiTect探针RT-PCR (QIAGEN)，通过实时PCR (Applied Biosystems7900HT快速实时PCR系统)测定了GAPDH和IL-8的mRNA表达量。IL-8的表达量通过GAPDH的表达量来校正。在该评价系统中确认到：使用作为阳性对照的G1d时，IL-8的表达量提高至8.2，而在加入PBS来代替抗体溶液时，IL-8的表达量为0.03。
在本评价系统中，比较分别加入作为Fc变体的F648和P600时的DC的IL-8表达量时，获得了图6的结果。
由该结果发现了：与F648细胞相比，P600抑制DC的IL-8表达量、即降低活化DC的性质。与F648细胞相比，P600与作为活性型FcγR的FcγRIIa的结合降低。由此认为：P600特别是与FcγRIIa的结合降低，结果降低了DC的IL-8表达量，抑制了DC的活化。
即，对于包含FcγRIIa的活性型FcγR更具选择性地降低结合的包含本发明Fc区的抗原结合分子显示出了作为克服下述问题的优异分子的可能性：激活免疫细胞而不损及迅速降低血浆中抗原浓度的天然型IgG1的性质。
[实施例7] 评价加入了增强与FcγRIIb的结合的现有改变的包含Fc区的抗体的血小板凝聚能力
(7-1) IgG1抗体的血小板活化、凝聚的背景
迄今为止，据报道，有几种IgG1抗体经由与FcγR的相互作用诱导血小板活化，并呈现出副作用。例如，已知在给予了作为抗VEGF抗体的贝伐珠单抗的患者组中，血栓栓塞症的风险增加(J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (16), 1232-1239)。另外，在抗CD40配体(CD154)的抗体的临床开发试验中也同样观察到血栓栓塞症，使得临床试验被中止(Arthritis. Rheum. (2003) 48 (3), 719-727.)。虽然在血小板的细胞上表达的是作为活性型Fcγ受体的FcγRIIa而不是作为抑制型Fcγ受体的FcγRIIb (J. Exp. Med.(2006) 203 (9), 2157-2164)，但通过使用动物模型等的其后的研究暗示了：所给予的抗体均经由与血小板上的FcγRIIa的结合使血小板凝聚，其结果形成了血栓(J. Thromb.Haemost. (2009) 7 (1), 171-181、 J. Immunol. (2010) 185 (3), 1577-1583)。据报道，在作为自身免疫疾病之一的系统性红斑狼疮患者中，通过FcγRIIa依赖性机制使血小板活化，血小板的活化与症状严重程度相关(Sci. Transl. Med. (2010) 2 (47), 47-63)。这样，即使是天然存在的IgG1抗体，也有可能将血小板活化，呈现出严重的副作用。
(7-2) 使用抗CD154抗体评价血小板活化
由于有人报道了血小板的活化来自在血小板上表达的FcγRIIa与IgG1的Fc的相互作用，因此通过使用降低IgG1与FcγRIIa的结合的抗体，验证了能否避免该血小板活化。
利用参考实施例2的方法，准备了抗CD40配体的IgG1抗体即5c8-G1d (重链SEQ IDNO：8、轻链SEQ ID NO：9)。接下来，利用参考实施例2的方法，准备了包含Fc区的抗体5c8-F648 (轻链SEQ ID NO：9)，所述Fc区是将作为降低与FcγRIIa的结合的现有技术的5c8-G1d的Fc区中的EU编号所表示的第238位的Pro取代为Asp的Fc区。此外，利用参考实施例2的方法，准备了包含Fc区的抗体5c8-P600 (轻链SEQ ID NO：9)，所述Fc区是与现有技术相比进一步降低与FcγRIIa的结合的5c8-G1d的Fc区中的EU编号所表示的第238位的Pro取代为Glu、第298位的Ser取代为Ala的Fc区。以下，5c8-G1d、5c8-F648、5c8-P600分别用G1d、F648、P600表示。评价了这些Fc变体的血小板凝聚能力。
血小板的活化通过以下的方法进行了评价。首先，将来自FcγRIIa的基因多态性(R131/R131)的供体的约50mL的全血每次按一定分量采集到包含0.5mL 3.2%的柠檬酸钠的4.5mL真空采血管中，所采集的约50mL的全血以200g的离心力离心分离15分钟，将所回收的上清用作富含血小板的血浆(PRP)。将用缓冲液A (137mM的NaCl、2.7mM的KCl、12mM的NaHCO3、0.42mM的NaH2PO4、2mM的MgCl2、5mM的HEPES、5.55mM的葡萄糖(dextrose，右旋糖)、1.5U/mL的三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)、0.35%的BSA)洗涤过的PRP再置换成缓冲液B(137mM的NaCl、2.7mM的KCl、12mM的NaHCO3、0.42mM的NaH2PO4、2mM的MgCl2、5mM的HEPES、5.55mM的葡萄糖、2mM的CaCl2、0.35%的BSA)。其结果，调制了约300,000/μL密度的洗涤血小板。向设置在血小板凝聚能力测定装置中的、包含搅拌棒的测定用比色杯中分别注入168μL洗涤血小板。在该装置内在维持在37.0℃的比色杯内，使用搅拌棒以1000rpm搅拌了血小板。向其中加入42μL调制成抗体的最终浓度为120 μg/mL、抗原的最终浓度为111 μg/mL的各抗体与抗原的免疫复合物，使血小板与该免疫复合物反应了5分钟。并且，向反应液中加入不引起二次凝聚的浓度的二磷酸腺苷(ADP、SIGMA)，确认活化是否得到增强。
血小板的活化可根据CD62p (p-选择蛋白)或活性型整联蛋白(PAC-1)的活化标记物在血小板膜表面的表达增加来测定。向利用上述方法调制的8μL洗涤血小板的洗涤血小板中添加2μL免疫复合物，在室温下反应5分钟后，进一步添加诱导轻微活化的浓度的ADP，引起活化，确认到免疫复合物增强了ADP的活化。阴性对照使用的是添加磷酸缓冲液(pH7.4) (Gibco)来代替免疫复合物的样品。通过向反应后的各样品加入PE标记抗CD62抗体(BECTON DICKINSON)、PerCP标记抗CD61抗体、FITC标记PAC-1抗体(BD bioscience)进行了染色。各染色的荧光强度使用流式细胞仪(FACS CantoII、 BD bioscience)进行了测定。在该分析系统中添加阳性对照的5c8-G1d时，确认到血小板的CD62p和PAC-1的表达亢进。
使用该分析系统比较了F648和P600的血小板活化能力。添加各Fc变体时的CD62p表达的结果见图7、活化整联蛋白表达的结果见图8。通过ADP刺激在血小板膜表面表达诱导的CD62p和活性型整联蛋白，在加入F648时观察到表达亢进，而在加入P600时未观察到表达亢进。
由这些结果明确了：与现有技术的选择性地增强与FcγRIIb的结合的Fc变体相比，包含将IgG1的Fc区的EU编号所表示的第238位的Pro取代为Asp、第298位的Ser取代为Ala且加入了降低与人FcγRIIa的结合的改变的Fc区的抗体显示出更大的抑制。
即，显示出：对FcγRIIa更具选择性地降低结合的本发明的含有Fc区的抗原结合分子有可能是克服了将血小板活化而不损及快速降低血浆中抗原浓度这样的天然型IgG1的性质的问题的优异的分子。
[参考实施例1] 抗体表达载体的制作和抗体的表达和纯化
编码抗体可变区的H链和L链的核苷酸序列的全长基因的合成是采用装配PCR等按照本领域技术人员所已知的方法制作的。氨基酸取代的导入是利用PCR等按照本领域技术人员已知的方法进行的。将所得质粒片段插入动物细胞表达载体中，制作H链表达载体和L链表达载体。所得表达载体的核苷酸序列按照本领域技术人员已知的方法来确定。将所制作的质粒瞬时导入来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen公司)或FreeStyle293细胞(Invitrogen公司)中，进行了抗体的表达。回收所得的培养上清，然后过0.22μm的过滤器MILLEX (R)-GV (Millipore)或0.45μm的过滤器MILLEX (R)-GV (Millipore)，获得了培养上清。使用rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)或Protein G Sepharose4 Fast Flow (GE Healthcare)，按照本领域技术人员已知的方法，由所得培养上清纯化了抗体。关于纯化抗体浓度，使用分光光度计测定280nm下的吸光度，采用由所得值按照PACE等方法计算的吸光系数，计算了抗体浓度(Protein Science 1995; 4: 2411-2423)。
[参考实施例2] FcγR的调制方法以及改变抗体与FcγR的相互作用分析方法
按照以下方法调制了FcγR的胞外结构域。首先，按照本领域技术人员已知的方法实施FcγR的胞外结构域的基因合成。此时，各FcγR的序列根据登录于NCBI的信息来制作。具体而言，FcγRI根据NCBI的登录号NM_000566.3的序列、FcγRIIa根据NCBI的登录号NM_001136219.1的序列、FcγRIIb根据NCBI的登录号NM_004001.3的序列、FcγRIIIa根据NCBI的登录号NM_001127593.1的序列、FcγRIIIb根据NCBI的登录号NM_000570.3的序列制作，在C末端添加了His标签。另外，已知FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb是多态性的，关于多态性位点，FcγRIIa是参考J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25来制作，FcγRIIIa是参考J.Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070来制作，而FcγRIIIb是参考J. Clin.Invest., 1989, 84, 1688-1691来制作。
将所得基因片段插入动物细胞表达载体中，制作表达载体。将所制作的表达载体瞬时导入来自人胚肾癌细胞的FreeSyle293细胞(Invitrogen公司)中，表达了目标蛋白。需要说明的是，对于在晶体结构分析中使用的FcγRIIb，在终浓度为10μg/mL的席夫碱存在下表达目标蛋白，使添加在FcγRIIb上的糖链为高甘露糖型。进行培养，回收所得的培养上清，然后过0.22μm过滤器，获得了培养上清。所得培养上清原则上通过以下的4个步骤来纯化。步骤1是实施阳离子交换柱层析(SP Sepharose FF)，步骤2是实施对His标签的亲和柱层析(HisTrap HP)，步骤3是实施凝胶过滤柱层析(Superdex200)，步骤4是实施无菌过滤。但是，对于FcγRI，在步骤1中实施了使用Q sepharose FF的阴离子交换柱层析。对于纯化的蛋白，使用分光光度计测定280nm下的吸光度，按照PACE等方法由所得值计算吸光系数，使用该吸光系数计算了纯化蛋白的浓度(Protein Science 1995; 4: 2411-2423)。
使用Biacore T100 (GE Healthcare)、Biacore T200 (GE Healthcare)、BiacoreA100、Biacore 4000，进行了各改变抗体与上述调制的Fcγ受体的相互作用分析。运行缓冲液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，测定温度为25℃。使用的芯片如下：通过胺偶联法将抗原肽、蛋白A (Thermo Scientific)、蛋白A/G (Thermo Scientific)、蛋白L (ACTIGEN或BioVision)固定于S系列传感芯片CM5 (GE Healthcare)或S系列传感芯片CM4 (GEHealthcare)上而获得的芯片；或者使预先进行了生物素化的抗原肽与S系列传感芯片SA(经验证的，certified) (GE Healthcare)相互作用并固定的芯片。
将目标抗体捕获在这些传感芯片上，与用运行缓冲液稀释的Fcγ受体相互作用，测定与抗体的结合量，在抗体之间进行了比较。但是，Fcγ受体的结合量与所捕获的抗体的量相关，因此，用各抗体的捕获量除以Fcγ受体的结合量，用所得校正值进行了比较。还用10mM甘氨酸-HCl (pH1.5)与其反应，由此洗涤捕获在传感芯片上的抗体，使传感芯片再生，重复使用。
另外，用于计算各改变抗体对FcγR的KD值的动力学分析按照以下方法来实施。首先，将目标抗体捕获在上述传感芯片上，与用运行缓冲液稀释的Fcγ受体相互作用，对于所得的传感图谱，通过Biacore评估软件(Biacore Evaluation Software)，将测定结果用1:1Langmuir结合模型(1:1 Langmuir binding model)进行全局拟合(global fitting)，计算了结合速率常数ka (L/mol/s)、解离速率常数kd (1/s)，由该值计算了解离常数KD (mol/L)。
另外，在各改变抗体与FcγR的相互作用微弱、判断为用上述动力学分析无法正确分析时，对于该相互作用，利用Biacore T100软件手册BR1006-48版本AE中记载的以下的1:1结合模型式计算了KD。
通过1:1结合模型相互作用的分子在Biacore上的行为可由下式1表示：
[式1]
Figure DEST_PATH_IMAGE032
Req：稳态结合水平相对于分析物浓度的关系
C：浓度
RI：样品中的体积折射率贡献
Rmax：表面的分析物结合能力
将该式变形，则KD可如下式2所示：
[式2]
Figure 10537DEST_PATH_IMAGE033
。
通过在该式中代入Rmax、RI、C的值，可计算KD。RI、C的值可从测定结果的传感图谱、测定条件求得。Rmax根据下列方法计算。对于其测定轮中同时评价的成为比较对象的相互作用十分强的抗体，应用上述1:1 Langmuir结合模型通过全局拟合时得到的Rmax的值除以成为比较对象的抗体在传感芯片上的捕获量，乘以待评价的改变抗体的捕获量，所得的值为Rmax。
[参考实施例3] 钙依赖性地与人IgA结合的抗体的调制
(3-1) 人IgA (hIgA)的调制
作为抗原的人IgA (以下还称作hIgA)利用如下的重组技术来调制。对于通过培养含有包含H(WT)-IgA1 (SEQ ID NO：19)和L(WT) (SEQ ID NO：20)的重组载体的宿主细胞而表达的hIgA，按照本领域技术人员已知的方法，利用离子交换层析和凝胶过滤层析进行了纯化。
(3-2) 关于钙依赖性结合抗体
国际公开WO2009/125825中记载的H54/L28-IgG1是人源化抗IL-6受体抗体，Fv4-IgG1是相对于H54/L28-IgG1而言具有pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合(在中性条件下结合、在酸性条件下解离)的特性的人源化抗IL-6受体抗体。在国际公开WO2009/125825所记载的小鼠体内试验中显示出：与给予了H54/L28-IgG1和作为抗原的可溶型人IL-6受体的混合物的组相比，在给予了Fv4-IgG1和作为抗原的可溶型人IL-6受体的混合物的组中可溶型人IL-6受体的消失大幅加速。
与普通的可溶型人IL-6受体所结合的抗体结合的可溶型人IL-6受体和抗体一起通过FcRn再循环到血浆中。相对于此，pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合的抗体在内体内的酸性条件下解离出与抗体结合的可溶型人IL-6受体。解离的可溶型人IL-6受体被溶酶体分解，所以可以大幅加速可溶型人IL-6受体从血浆中消失，并且pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合的抗体在解离出可溶型人IL-6受体后通过FcRn再循环到血浆中，再循环的抗体可以再次与可溶型人IL-6受体结合。通过重复进行上述循环(结合有抗原的抗体摄入细胞内＞抗原从抗体上解离＞抗原的分解和抗体再循环到血浆中)，一个抗体分子可以重复多次与可溶型人IL-6受体结合(图9)。
并且，如国际公开WO2011/122011所记载，H54/L28-IgG1是人源化抗IL-6受体抗体，Fv4-IgG1是相对于H54/L28-IgG1而言具有pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合(在中性条件下结合、在酸性条件下解离)的特性的人源化抗IL-6受体抗体，Fv4-IgG1-v2是相对于Fv4-IgG1在pH中性条件下与FcRn的结合增强的人源化抗IL-6受体抗体。在国际公开WO2011/122011所记载的小鼠体内试验中显示出：与给予了Fv4-IgG1和作为抗原的可溶型人IL-6受体的混合物的组相比，在给予了Fv4-IgG1-v2和作为抗原的可溶型人IL-6受体的混合物的组中，可溶型人IL-6受体的消失大幅加速。即，据报道，由于pH依赖性地与抗原结合的抗体在pH中性条件下(pH7.4)与FcRn的结合增强，因此增强的改变抗体可与抗原重复结合的效果、以及促进抗原从血浆中消失的效果进一步提高，通过给予该抗体，可以使抗原从血浆中消失(图10)。
在图9和图10所示的pH依赖性地与抗原结合的抗体的作用中，利用血浆中与内体内的环境的不同、即pH的不同(血浆中：pH7.4、内体内：pH6.0)，充分利用在血浆中与抗原强力结合、而在内体内解离出抗原的抗体的性质。为了在血浆中和内体内pH依赖性地结合的抗体与抗原的结合能力上充分利用这种差异，重要的是血浆中与内体内的环境因素的性质和其差别大。pH的不同即是氢离子浓度的不同。即，pH7.4的血浆中的氢离子浓度为约40nM，而pH6.0的内体内的氢离子浓度为约1000nM，因此作为血浆中与内体内的环境因素之一来考虑的氢离子浓度的差别为约25倍之大。
并且，为了以不同方式实现图9和图10所示的作用、或者一并实现这些方式，除了血浆中与内体内的氢离子浓度的差别之外，认为可以使用依赖于该差别大的环境因素而与抗原结合的抗体。在血浆中与内体内浓度差别大的环境因素的探索结果发现了钙。血浆中的离子化钙浓度 为1.1-1.3 mM左右，而内体内的离子化钙浓度为3μM左右，所以作为血浆中和内体内的环境因素之一来考虑的钙离子浓度的差别为约400倍之大，发现了其大小比氢离子浓度差(25倍)大。即，认为通过使用在高钙浓度条件下(1.1-1.3 mM)与抗原结合、而在低钙浓度条件下(3μM)解离出抗原的离子化钙浓度依赖性地与抗原结合的抗体，可以在与pH依赖性地与抗原结合的抗体相同或其以上的程度下在内体内从抗体中解离抗原。
(3-3) 与hIgA结合的抗体的表达和纯化
GA1-IgG1 (重链SEQ ID NO：21、轻链SEQ ID NO：22)、GA2-IgG1 (重链SEQ ID NO：23、轻链SEQ ID NO：24)是与hIgA结合的抗体。利用本领域技术人员已知的方法，将编码GA1-IgG1 (重链SEQ ID NO：21、轻链SEQ ID NO：22)和GA2-IgG1 (重链SEQ ID NO：23、轻链SEQ ID NO：24)的DNA序列插入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达通过以下的方法来进行。将来自人胚肾细胞的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)悬浮在FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen)中，将所得的细胞悬浮液以1.33×106个/mL的细胞密度在6孔板的各孔中分别接种3 mL。接下来，将通过脂质转染法调制的质粒导入到细胞中。该细胞在CO2培养箱(37℃、8%的CO2、90rpm)中培养4天，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow (AmershamBiosciences)，按照本领域技术人员已知的方法，从所分离的该培养上清中纯化了抗体。所纯化的抗体溶液的吸光度(波长：280nm)使用分光光度计来测定。使用通过PACE法计算的吸光系数，由所得的测定值计算了抗体浓度(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
(3-4) 评价所获取的抗体与hIgA的钙依赖性结合能力
使用Biacore T200 (GE Healthcare)，评价了(1-3)中分离的抗体的hIgA结合活性(解离常数KD (M) )。使用含有3μM或1.2mM的CaCl2的0.05% tween20、20 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl (pH7.4或pH5.8)；或含有0.1μM或10mM的CaCl2的0.05% tween20、20mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl (pH8.0)作为运行缓冲液进行了测定。
使抗体与通过胺偶联法适当固定有适当量的重组型蛋白A/G (ThermoScientific)的传感芯片CM5 (GE Healthcare)结合。接下来，通过注射作为分析物的适当浓度的hIgA ( (1-1)中记载)，使hIgA与传感芯片上的抗体发生了相互作用。测定在37℃下进行。测定后，通过注射10mmol/L的甘氨酸-HCl (pH1.5)，使传感芯片再生。使用BiacoreT200评估软件(GE Healthcare)，通过曲线拟合分析和平衡值分析，由测定结果计算了解离常数KD (M)。其结果见表21。另外，所获得的传感图见图11。显示出：GA2-IgG1在1.2mM的Ca2+浓度下与hIgA强力结合，而在3μM的Ca2+浓度下与hIgA微弱结合。另外还显示出：在Ca2+浓度为1.2mM的条件下，GA2-IgG1在pH7.4下与人IgA强力结合、而在pH5.8下与人IgA微弱结合。即，明确了GA2-IgG1是pH依赖性、且钙依赖性地与人IgA结合。
[表21]
Figure DEST_PATH_IMAGE034
[参考实施例4] 调制钙依赖性地与hIgA结合的抗体的变体
并且，为了进一步增大抗原(hIgA)从血浆中的消失，制作了导入N434W的氨基酸取代的GA2-N434W (轻链SEQ ID NO：24)，以相对于钙依赖性地与hIgA结合的GA2-IgG1增强与小鼠FcRn在pH7.4下的结合。另外，为了相对于GA2-IgG1使与FcγR的结合缺失，制作了导入L235R、S239K的氨基酸取代的GA2-FcγR(-) (轻链SEQ ID NO：24)。使用按照本领域技术人员已知的方法插入了编码GA2-N434W (轻链SEQ ID NO：24)和GA2-FcγR(-) (轻链SEQ IDNO：24)的DNA序列的动物表达用质粒，纯化后测定了通过上述方法表达的这些抗体变体的浓度。GA2-FcγR(-)与各种小鼠FcγR (mFcγRI、mFcγRII、mFcγRIII、mFcγRIV)的结合的评价结果，对于所有受体均未确认到结合。
[参考实施例5] 调制钙依赖性地与hIgA结合的抗体的变体
接下来，为了进一步增大抗原(hIgA)从血浆中的消失，制作了GA2-IgG1的EU编号所表示的第328位的Leu取代为Tyr的GA2-F1087，以相对于钙依赖性地与hIgA结合的GA2-IgG1增强与小鼠FcγR的结合。使用按照本领域技术人员已知的方法插入了编码GA2-F1087(轻链SEQ ID NO：24)的DNA序列的动物表达用质粒，在纯化后测定了通过上述方法表达的这些抗体变体的浓度。如参考实施例5所示，包含该改变的抗体与小鼠FcγR的结合大幅增强。
[参考实施例6] 评价在给予了Ca依赖性hIgA结合抗体的正常小鼠中对抗原的血浆中滞留性的影响
(6-1) 使用正常小鼠进行的体内试验
对正常小鼠(C57BL/6J小鼠、Charles River Japan)单独给予hIgA(人IgA：通过参考实施例(3-1)制作)、或同时给予hIgA和抗hIgA抗体后，评价了hIgA和抗hIgA抗体的体内动力学。向尾静脉以10mL/kg的用量单次给予了hIgA溶液(80μg/mL)、或hIgA和抗hIgA抗体的混合溶液。使用上述的GA2-IgG1和GA2-F1087作为抗hIgA抗体。
混合溶液中的hIgA浓度均为80μg/mL，抗hIgA抗体浓度为2.69 mg/mL。此时，由于相对于hIgA存在过剩量的抗hIgA抗体，所以认为大部分的hIgA与抗体结合。在GA-IgG1给药组中，在给药后5分钟、7小时、1天、2天、3天、7天由小鼠采血。另外，在GA-F1087给药组中，在给药后5分钟、30分钟、1小时、2小时、1天、3天、7天由小鼠采血。所采集的血液立即在4℃、12,000 rpm下离心分离15分钟，从而获得了血浆。所分离的血浆在实施测定前保存在设定为-20℃以下的冷库中。
(6-2) 利用ELISA法测定正常小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度
利用ELISA法测定了小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度。首先，将各孔中分别注入了抗体的抗人IgG (γ-链特异性) F(ab’)2片段(SIGMA)的Nunc-Immuno板, MaxiSorp (Nalgenunc International)在4℃下静置一夜，从而制作了抗人IgG固化板。将作为血浆中浓度的标准液的调制成了0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563、0.007813μg/mL的抗hIgA抗体的标准曲线样品和稀释了100倍以上的小鼠血浆测定样品分别注入上述的抗人IgG固化板中，之后将该板在25℃下培养了1小时。之后，将山羊抗人IgG (γ链特异性)生物素(BIOT)缀合物(Southern Biotechnology Associats Inc.)分别注入上述板的各孔中，之后使该板在25℃下反应了1小时。并且，将链霉亲和素-PolyHRP80 (StereospecificDetection Technologies)分别注入上述板的各孔中，之后使该板在25℃下反应了1小时。利用1N-硫酸(Showa Chemical)使以TMB One Component HRP微孔底物(BioFXLaboratories)作为底物的显色反应停止，之后使用酶标仪测定了各孔的反应液在450 nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO (Molecular Devices)，由标准曲线的吸光度计算了小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的正常小鼠中GA2-IgG1和GA2-F1087的血浆中抗体浓度变化见图12。其结果，确认到：与hIgA具有强pH和Ca依赖性结合活性的克隆GA2-IgG1虽然增强了与FcγR的结合，但其血浆中抗体浓度没有大幅降低。
(6-3) 利用ELISA法测定血浆中hIgA浓度
小鼠的血浆中hIgA浓度通过ELISA法进行了测定。首先，通过将各孔中分别注入了山羊抗人IgA抗体(BETHYL)的Nunc-Immuno板,MaxiSoup (Nalge nunc International)在4℃下静置一夜，从而制作了抗人IgA固化板。作为血浆中浓度的标准液，使用了调制成0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL的hIgA的标准曲线样品。向各100μL的标准曲线样品和稀释了100倍以上的小鼠血浆测定样品中加入200μL 500ng/mL的hsIL6R进行混合，在室温下静置了1小时。之后，将分别注入了100μL混合溶液的上述抗人IgA固化板在室温下静置了1小时。接下来，将生物素化的抗人IL-6 R抗体(R&D)分别注入上述板的各孔中，之后使该板在室温下反应了1小时。再将链霉亲和素-PolyHRP80 (StereospecificDetection Technologies)分别注入上述板的各孔中，之后使该板在室温下反应了1小时。利用1N-硫酸(Showa Chemical)使以TMB One Component HRP微孔底物(BioFXLaboratories)作为底物的显色反应停止，之后使用酶标仪测定了各孔的反应液在450 nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO (Molecular Devices)，由标准曲线的吸光度计算了小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的正常小鼠的血浆中hIgA浓度变化见图13。
其结果，相对于hIgA单独的消失，在同时给予了与hIgA具有100倍以上的Ca依赖性结合活性的GA2-IgG1的小鼠中，与hIgA单独相比hIgA的消失加速。并且，在给予了对hIgA和FcγR结合增强的GA2-F1087的小鼠的血浆中，给药一天后hIgA浓度的降低在可测范围(0.006μg/mL以上)之下，与给予了GA-IgG1的小鼠的血浆中相比hIgA的消失也大幅加速。以上结果显示出：与作为对FcγR结合增强的抗体的来源的抗体的抗原(hIgA)去除效果相比，在给予了形成免疫复合物的hIgA和抗hIgA抗体的小鼠中，与FcγR的结合增强的抗体从血浆中去除抗原(hIgA)的效果增强。
[参考实施例7] 与FcγR的结合活性比天然型小鼠IgG的Fc区的结合活性高的抗原结合分子使抗原从血浆中消失的效果
(7-1) 增强与FcγR的结合活性的小鼠抗体的抗原消失效果
按照以下所示的方法验证了：在具有小鼠FcRn的正常小鼠中具有小鼠抗体的Fc区、且具有pH依赖性地与人IL-6受体结合的性质的抗原结合分子是否具有加速该小鼠的血浆中可溶型人IL-6受体消失的效果。
(7-2) 制作增强与FcγR的结合活性的小鼠抗体
利用参考实施例1的方法制作了作为具有pH依赖性地与人IL-6受体结合的性质的小鼠IgG1抗体的作为重链的VH3-mIgG1 (SEQ ID NO：25)、作为轻链的VL3-mk1 (SEQ IDNO：26)。另外，为了增强VH3-mIgG1与小鼠FcγR的结合活性，制作了EU编号所表示的第327位的Ala取代为Asp的VH3-mIgG1-mF44。同样制作了VH3-mIgG1的EU编号所表示的第239位的Ser取代为Asp、第327位的Ala取代为Asp的VH3-mIgG1-mF46。利用参考实施例1的方法制作了包含VH3-mIgG1、VH3-mIgG1-mF44或VH3-mIgG1-mF46作为重链、并包含VL3-mk1作为轻链的Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1-mF46。
(7-3) 确认与小鼠FcγR的结合活性
利用参考实施例1的方法制作了包含VH3-mIgG1、VH3-mIgG1-mF44或VH3-mIgG1-mF46作为重链、并包含L(WT)-CK (SEQ ID NO：27)作为轻链的VH3/L(WT)-mIgG1、VH3/L(WT)-mIgG1-mF44或VH3/L(WT)-mIgG1-mF46。利用参考实施例2的方法评价了这些抗体与小鼠FcγR的结合活性。其结果见表22。另外，表23中显示了：各变体与小鼠FcγR的结合活性与加入改变前的mIgG1相比是否增强了几倍。需要说明的是，在表中将VH3/L(WT)-mIgG1记作mIgG1、将VH3/L(WT)-mIgG1-mF44记作mF44、将VH3/L(WT)-mIgG1-mF46记作mF46。
[表22]
Figure 654008DEST_PATH_IMAGE035
[表23]
Figure DEST_PATH_IMAGE036
具有天然型小鼠IgG1抗体Fc区的VH3/L(WT)-mIgG1对小鼠FcγRI和小鼠FcγRIV没有显示出结合、而只对小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII显示出结合的实施例4的研究结果暗示：对降低抗原浓度较为重要的小鼠FcγR是小鼠FcγRII和/或小鼠FcγRIII。另外，显示出：导入了认为增强VH3/L(WT)-mIgG1与FcγR的结合活性的改变的VH3/L(WT)-mIgG-mF44和VH3/L(WT)-mIgG1-mF46与小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的结合活性均增强。
(7-4) 确认正常小鼠的血浆中可溶型IL-6受体浓度的降低效果
如下验证了给予作为抗人IL-6受体抗体的Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1mF46的正常小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消失效果。
通过在正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)的背部皮下移植填充有可溶型人IL-6受体的注入泵(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)，制作了血浆中可溶型人IL-6受体浓度维持在稳态的动物模型。评价了对该动物模型给予抗人IL-6受体抗体后可溶型人IL-6受体的体内动力学。为了抑制抗可溶型人IL-6受体的抗体的产生，对尾静脉以20mg/kg单次给予了单克隆抗小鼠CD4抗体。之后，将填充有92.8μg/mL的可溶型人IL-6受体的注入泵移植到小鼠背部皮下。在移植注入泵3天后，以1mg/kg向尾静脉单次给予了抗人IL-6受体抗体。在抗人IL-6受体抗体给药后，经过15分钟、7小时、1天、2天、4天、7天、14天(或15天)、21天(或22天)后由该小鼠采血。所采集的血液立即在4℃、15,000 rpm下离心分离15分钟，从而获得了血浆。所分离的血浆在实施测定前保存在设定为-20℃以下的冷库中。
利用电化学发光法测定了血浆中可溶型人IL-6受体浓度、小鼠的血浆中hsIL-6R可溶型人IL-6受体浓度。通过将调制成2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL的hsIL-6R可溶型人IL-6受体标准曲线样品和稀释了50倍以上的小鼠血浆测定样品与用SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery)进行了钌化的单克隆抗人IL-6R抗体(R&D)和生物素化抗人IL-6 R抗体(R&D)和托珠单抗混合，使之在37℃下反应了一夜。调制托珠单抗的终浓度使达到333μg/mL。之后，将反应液分别注入MA400 PR链霉亲和素板(MesoScale Discovery)中。再于室温下反应1小时，洗涤所得的反应液，之后向其中分别注入了Read Buffer T (×4) (Meso Scale Discovery)。之后立即用SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)进行了测定。根据标准曲线的响应值，利用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)计算了hsIL-6R可溶型人IL-6受体浓度。其结果见图14。
令人惊奇的是，与给予了mIgG1的小鼠相比，在给予了导入有增强mIgG1 (天然型小鼠IgG1)与小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的结合活性的改变的mF44和mF46的小鼠中，均确认到了血浆中IL-6受体浓度的明显降低。特别是，在mF44给药后第21天，mF44给药组的血浆中IL-6受体浓度与抗体非给药组的血浆中IL-6受体浓度相比降低了约6倍、与mIgG1给药组相比降低了约10倍。另一方面，在mF46给药后第7天，mF46给药组的血浆中IL-6受体浓度与抗体非给药组的血浆中IL-6受体浓度相比明显降低了约30倍、与mIgG1给药组相比明显降低了约50倍。
以上的结果显示出：和具有人IgG1抗体Fc区的抗原结合分子与小鼠FcγR的结合活性增强的抗体一样，在给予了具有小鼠IgG1抗体Fc区的抗原结合分子与小鼠FcγR的结合活性增强的抗体的小鼠中，血浆中可溶型IL-6受体的消失也加速。虽然不拘泥于特定的理论，但这里看到的现象也可以说明如下。
对小鼠给予pH依赖性地与可溶型抗原结合、且增强与FcγR的结合活性的抗体时，其主要是积极地摄入到在细胞膜上表达FcγR的细胞中。所摄入的抗体在内体内的酸性pH条件下解离可溶型抗原后，经由FcRn再循环到血浆中。因此，作为带来这样的通过抗体使血浆中的可溶型抗原消失的效果的要素之一，可以列举该抗体与FcγR的结合活性的强度。即，认为与FcγR的结合活性越强，则越积极地摄入FcγR表达细胞中，可以使血浆中的可溶型抗原快速消失。另外，认为无论抗体中所含的Fc区的来源是人IgG1还是小鼠IgG1，只要与FcγR的结合活性增强，则同样可以验证这样的效果。即，认为即使是人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、大鼠IgG、猴IgG、兔IgG等任何动物种的Fc区，只要是给药的动物种与FcγR的结合活性增强，也均可用来进行验证。
[参考实施例8] FcγRIIb选择性地结合增强的抗体的抗原消失效果
(8-1) 选择性地增强与FcγRIIb的结合活性的抗体的抗原消失效果
FcγRIII缺陷小鼠(B6.129P2-FcgrR3tm1Sjv/J小鼠, Jackson Laboratories)表达小鼠FcγRI、小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIV而不表达小鼠FcγRIII。另一方面，Fc受体γ链缺陷小鼠(Fcer1g小鼠, Taconic, Cell (1994) 76, 519-529)只表达小鼠FcγRIIb、而不表达小鼠FcγRI、小鼠FcγRIII、小鼠FcγRIV。
在参考实施例7中显示出：对于天然型小鼠IgG1增强了其与FcγR的结合活性的mF44和mF46对于小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII选择性地结合增强。认为利用该选择性地增强的抗体的结合活性，通过对不表达小鼠FcγRIII的小鼠FcγRIII缺陷小鼠或Fc受体γ链缺陷小鼠给予mF44和mF46，可以模拟给予与小鼠FcγRIIb的结合选择性地增强的抗体的状况。
(8-2) 使用FcγRIII缺陷小鼠验证小鼠FcγRIIb选择性的结合增强的抗原消失 效果
利用与实施例5相同的方法验证了给予作为抗人IL-6受体抗体的Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1-mF46的FcγRIII缺陷小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消失效果。该小鼠的血浆中可溶型人IL-6受体浓度通过上述参考实施例(7-4)的方法来测定。其结果见图15。
令人惊奇的是，确认到：与给予mIgG1的小鼠的血浆中IL-6受体浓度相比，模拟了mIgG1 (天然型小鼠IgG1)与小鼠FcγRIIb的结合活性选择性地增强的状况且给予了mF44和mF46的FcγRIII缺陷小鼠的血浆中IL-6受体浓度均明显降低。特别是，mF44给药组的血浆中IL-6受体浓度与mIgG1给药组的该浓度相比降低约3倍左右，由抗体给药引起的抗原浓度的蓄积得到了抑制。另一方面，在给药后第3天，mF46给药组的血浆中IL-6受体浓度与抗体非给药组的血浆中IL-6受体浓度相比明显降低了约6倍、与mIgG1给药组的血浆中IL-6受体浓度相比明显降低了约25倍。该结果显示出：pH依赖性地与抗原结合的抗人IL-6受体抗体与小鼠FcγRIIb的结合活性越高，则在其给药时越能够进一步降低小鼠的血浆中IL-6受体浓度。
(8-3) 使用Fc受体γ链缺陷小鼠验证小鼠FcγRIIb选择性地结合增强的抗原消 失效果
利用与实施例6相同的方法验证了给予作为抗人IL-6受体抗体的Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1mF46的Fc受体γ链缺陷小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消失效果。该小鼠的血浆中可溶型人IL-6受体浓度按照上述参考实施例(7-4)的方法来测定。其结果见图16。
与对FcγRIII缺陷小鼠给予mF44和mF46时一样，确认到：与给予mIgG1的Fc受体γ链缺陷小鼠的血浆中IL-6受体浓度相比，模拟了只对mIgG1 (天然型小鼠IgG1)选择性地增强其与小鼠FcγRIIb的结合活性的状况且给予了mF44和mF46的Fc受体γ链缺陷小鼠的血浆中IL-6受体浓度均明显降低。特别是，与mIgG1给药组的血浆中IL-6受体浓度相比，mF44给药组的血浆中IL-6受体浓度降低约3倍左右，由抗体给药引起的抗原浓度的蓄积得到了抑制。另一方面，在给药后第3天，mF46给药组的血浆中IL-6受体浓度与抗体非给药组的血浆中IL-6受体浓度相比明显降低了约5倍、与mIgG1给药组的血浆中IL-6受体浓度相比明显降低了约15倍。
参考实施例(8-2)和(8-3)的结果显示出：pH依赖性地与可溶型抗原结合、且与小鼠FcγRIIb的结合活性选择性地增强的抗体的给药组的血浆中可溶型抗原浓度大幅降低的可能性。
[参考实施例9] FcγRIII选择性地结合增强的抗体的抗原消失效果
(9-1) 选择性地增强与FcγRIII的结合活性的抗体的抗原消失效果
FcγRIIb缺陷小鼠(Fcgr2b (FcγRII)小鼠, Taconic) (Nature (1996) 379(6563), 346-349)表达小鼠FcγRI、小鼠FcγRIII、小鼠FcγRIV、而不表达小鼠FcγRIIb。在实施例5中显示出：增强了天然型小鼠IgG1与FcγR的结合活性的mF44和mF46对于小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII选择性地结合增强。认为利用该选择性地增强的抗体的结合活性，通过对不表达小鼠FcγRIIb的小鼠FcγRIIb缺陷小鼠给予mF44和mF46，可以模拟给予与小鼠FcγRIII的结合选择性地增强的抗体的状况。
在参考实施例8中显示出：模拟了给予与小鼠FcγRIIb的结合活性选择性地增强的抗体的状况的FcγRIII缺陷小鼠的血浆中可溶型抗原浓度降低。另一方面，通过以下的试验确认模拟了给予与小鼠FcγRIII的结合活性选择性地增强的抗体的状况的FcγRIIb缺陷小鼠的血浆中可溶型抗原浓度是否降低。
(9-2) 使用FcγRIIb缺陷小鼠验证小鼠FcγRIII选择性的结合增强的抗原消失 效果
按照与实施例5相同的方法验证了对FcγRIIb缺陷小鼠给予作为抗人IL-6受体抗体的Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1mF46的FcγRIIb缺陷小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消失效果。血浆中的可溶型人IL-6受体浓度通过上述参考实施例(7-4)的方法来测定。其结果见图17。
令人惊奇的是，在模拟了mIgG1 (天然型小鼠IgG1)与小鼠FcγRIII的结合活性选择性地增强的mF44和mF46给药组中，血浆中IL-6受体浓度降低，但没有确认到如参考实施例8所示程度的明显降低。
虽然不拘泥于特定的理论，但根据参考实施例7、8和9的结果还可以考察如下。确认到：在表达给予了mIgG1 (天然型小鼠IgG1)与小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的结合活性选择性地增强的mF44和mF46的小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII双方的正常小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消失明显加快。另外，对表达小鼠FcγRIIb、而不表达小鼠FcγRIII的小鼠(FcγRIII缺陷小鼠和Fc受体γ链缺陷小鼠)给予mF44和mF46时，也确认到该小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消失明显加快。另一方面，对表达小鼠FcγRIII、而不表达小鼠FcγRIIb的小鼠(FcγRII缺陷小鼠)给予mF44和mF46时，该小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消失没有明显加快。
由以上的结果认为：mIgG1 (天然型小鼠IgG1)与小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的结合活性选择性地增强的抗体即mF44和mF46主要经由小鼠FcγRIIb摄入到表达FcγR的细胞内，从而导致与该抗体结合的血浆中的可溶型抗原消失。另一方面，认为由FcγRIII介导的抗体抗原复合物摄入FcγR表达细胞内对血浆中可溶型抗原的消失没有大的帮助。
另外，还确认到：给予了与小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的结合活性提高的Fv4-IgG1-F1087 (重链SEQ ID NO：28、轻链SEQ ID NO：29)的小鼠的血浆中可溶型IL-6受体浓度明显降低，另一方面，给予了与小鼠FcγRI和小鼠FcγRIV的结合活性提高的Fv4-IgG1-F1182的小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消失效果较Fv4-IgG1-F1087的效果小。
并且，还确认到：与给予了Fv4-IgG1的小鼠的血浆中可溶型IL-6受体浓度相比，给予了因具有低岩藻糖型糖链而与小鼠FcγRIV的结合活性大幅增强(Science (2005) 310(5753) 1510-1512)的Fv4-IgG1-Fuc (使用缺失了岩藻糖反式报道基因的CHO细胞(WO2006/067913)作为宿主细胞，通过表达Fv4-IgG1 (重链SEQ ID NO：30、轻链SEQ ID NO：29)而制作)的小鼠的血浆中可溶型IL-6受体浓度降低，但其降低的效果小为2倍左右。因此，认为由小鼠FcγRIV介导的抗体摄入FcγR表达细胞内对血浆中的可溶型抗原的消失没有大的帮助。
由此发现：在小鼠中当抗体被摄入到FcγR表达细胞中时，在存在的多个小鼠FcγR中，小鼠FcγRIIb发挥主要作用。因此，还可以认为：作为导入小鼠FcγR结合结构域中的突变，特别优选增强与小鼠FcγRIIb的结合的突变，但没有特别限定。
本研究显示出：通过给予pH依赖性地与可溶型抗原结合、对FcγR的结合活性增强了的抗原结合分子，可以加速给予了抗体的生物体血浆中的可溶型抗原的消失。该FcγR介导的血浆中可溶型抗原的消失在小鼠中显示出：FcγR之中主要由FcγRIIb介导而引起的血浆中可溶型抗原的消失。即，为了利用抗体和抗原的复合物与FcγR的相互作用加速血浆中可溶型抗原的消失，FcγR之中的FcγRIIb特别重要，只要维持与FcγRIIb的结合，即可使其消失效果得以维持。由此明确了：将pH依赖性地与可溶型抗原结合、对FcγRIIb的结合活性增强了的抗原结合分子给予到生物体内时，可以加速血浆中可溶型抗原的消失、有效地降低血浆中可溶型抗原的浓度，显示出极其有效的作用。
产业实用性
根据本发明提供了：与含有天然型IgG的Fc区的多肽相比，维持与FcγRIIb的结合活性、并且与所有活性型FcγR的结合活性、特别是与FcγRIIa(R型)的结合活性降低的Fc区变体、以及含有该Fc区变体的多肽。通过使用该多肽，可以转导由FcγRIIb的ITIM的磷酸化介导的炎症性免疫反应的抑制性信号。另外，通过对抗体的Fc赋予选择性地与FcγRIIb结合的性质，通过FcγRIIb介导的免疫抑制性作用，可以抑制抗抗体的产生。
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Claims (13)

1.人IgG1 Fc区变体，该Fc区变体包含下述(a)～(d)组成的组的氨基酸，与天然型IgG1的Fc区相比时，该Fc区变体对FcγRIIb的结合活性维持在55.5％以上、且对FcγRIIaR的结合活性相对于对FcγRIIb的结合活性降低，
(a)Fc区的EU编号第233位的氨基酸是Asp，第238位的氨基酸是Asp，第264位的氨基酸是Ile，第267位的氨基酸是Ala，第268位的氨基酸是Glu，和第271位的氨基酸是Gly；
(b)Fc区的EU编号第233位的氨基酸是Asp，第238位的氨基酸是Asp，第264位的氨基酸是Ile，第267位的氨基酸为Arg，第268位的氨基酸是Glu，和第271位的氨基酸是Gly；
(c)Fc区的EU编号第233位的氨基酸是Asp，第238位的氨基酸是Asp，第264位的氨基酸是Ile，第267位的氨基酸是Tyr，和第268位的氨基酸是Glu，第271位的氨基酸是Gly；或
(d)Fc区的EU编号第233位的氨基酸是Asp，第238位的氨基酸是Asp，第264位的氨基酸是是Ile，第267位的氨基酸是Arg，第268位的氨基酸是Pro，和第271位的氨基酸是Gly。
2.权利要求1所述的人IgG1 Fc区变体，其中，所述Fc区变体对FcγRIIb的结合活性与包含天然型IgG1的Fc区的多肽对FcγRIIb的结合活性相比的相对结合活性之比为至少0.75、所述Fc区变体对FcγRIa，FcγRIIaR，FcγRIIaH和FcγRIIIaV的结合活性与包含天然型IgG1的Fc区的多肽对FcγRIa，FcγRIIaR，FcγRIIaH和FcγRIIIaV的结合活性相比的相对结合活性之比为0.2以下。
3.权利要求2所述的人IgG1 Fc区变体，其中，进一步所述Fc区变体对FcγRIIa R的结合活性与包含天然型IgG1的Fc区的多肽对FcγRIIa R的结合活性相比的相对结合活性之比为0.1以下。
4.权利要求3所述的人IgG1 Fc区变体，其中进一步地，所述Fc区变体对FcγRIa的结合活性与包含天然型IgG1的Fc区的多肽对FcγRIa的结合活性相比的相对结合活性之比为0.1以下。
5.多肽，该多肽包含权利要求1～4的任一项所述的人IgG 1Fc区变体。
6.权利要求5所述的多肽，其中，上述包含人IgG1 Fc区变体的多肽为IgG1抗体。
7.权利要求5所述的多肽，其中，上述包含人IgG1 Fc区变体的多肽为Fc融合蛋白质分子。
8.药物组合物，该药物组合物包含权利要求5～7的任一项所述的多肽和医学上可接受的载体。
9.一种维持或增加包含人IgG1 Fc区的多肽对FcγRIIb的结合活性、且降低对FcγRIa，FcγRIIaR，FcγRIIaH和FcγRIIIaV的结合活性的方法，其特征在于所述方法包括组合并导入使对FcγRIa，FcγRIIaR，FcγRIIaH和FcγRIIIaV的结合活性降低的氨基酸改变，使该多肽与天然型IgG1相比相同程度地维持或增加对FcγRIIb的结合活性、且降低对FcγRIa，FcγRIIaR，FcγRIIaH和FcγRIIIaV的结合活性至1/5以下，其中，Fc区的氨基酸的改变是选自由以下组成的组的氨基酸置换：
(1)Fc区EU编号第233位的氨基酸为Asp、第234位氨基酸为Lys、第238位氨基酸为Asp、第264位的氨基酸为Ile、第267位的氨基酸为Ala、第268位的氨基酸为Glu和第271位的氨基酸为Gly；
(2)Fc区EU编号第233位的氨基酸为Asp、第234位的氨基酸为Arg、第238位的氨基酸为Asp、第264位的氨基酸为Ile、第267位的氨基酸为Ala、第268位的氨基酸为Glu和第271位的氨基酸为Gly；
(3)Fc区EU编号第233位氨基酸为Asp、第237位氨基酸为Lys、第238位氨基酸为Asp、第264位氨基酸为Ile、第267位氨基酸为Ala、第268位氨基酸为Glu和第271位氨基酸为Gly；
(4)Fc区EU编号第233位氨基酸为Asp、第238位氨基酸为Asp、第264位氨基酸为Ile、第265位氨基酸为Asn、第267位氨基酸为Ala、第268位氨基酸为Glu和第271位氨基酸为Gly；
(5)Fc区EU编号第233位氨基酸为Asp、第238位氨基酸为Asp、第264位氨基酸为Ile、第267位氨基酸为Arg、第268位氨基酸为Glu和第271为氨基酸为Gly；
(6)Fc区EU编号第233位氨基酸为Asp、第237位氨基酸为Asp、第238位氨基酸为Asp、第264位氨基酸为Ile、第267位氨基酸为Tyr、第268位氨基酸为Glu、第271位氨基酸为Gly、第296位氨基酸为Asp、第330位氨基酸为Arg和第396位氨基酸为Met；
(7)Fc区EU编号第233位氨基酸为Asp、第237位氨基酸为Asp、第238位氨基酸为Asp、第264位氨基酸为Ile、第267位氨基酸为Ala、第268位氨基酸为Glu、第271位氨基酸为Gly、第296位氨基酸为Asp、第297位氨基酸为Ala、第330位氨基酸为Arg和第396位氨基酸为Met；
(8)Fc区EU编号第233位氨基酸为Asp、第238位氨基酸为Asp、第264位氨基酸为Ile、第267位氨基酸为Arg、第268位氨基酸为Glu、第271位氨基酸为Gly和第296位氨基酸为Glu；
(9)Fc区EU编号第233位氨基酸为Asp、第238位氨基酸为Asp、第264位氨基酸为Ile、第267位氨基酸为Arg、第268位氨基酸为Pro和第271位氨基酸为Gly；
(10)Fc区EU编号第233位氨基酸为Asp、第238位氨基酸为Asp、第241位氨基酸为Met、第264位氨基酸为Ile、第267位氨基酸为Arg、第268位氨基酸为Glu和第271位氨基酸为Gly；和
(11)Fc区EU编号第233位氨基酸为Asp、第238位氨基酸为Asp、第264位氨基酸为Ile、第267位氨基酸为Arg、第268位氨基酸为Pro、第271位氨基酸为Gly和第296位氨基酸为Glu。
10.权利要求9所述的方法，其中，对FcγRIIb的结合活性维持天然型IgG1的Fc区的结合量的至少80％、对FcγRIIaR的结合活性降低至天然型IgG1的Fc区的结合量的30％以下。
11.权利要求9所述的方法，其中，与包含天然型IgG1的Fc区的多肽对FcγRIIb的结合活性相比的相对结合活性之比维持至少0.75、对FcγRIa，FcγRIIaR，FcγRIIaH和FcγRIIIaV的相对结合活性之比降低至0.2以下。
12.权利要求11所述的方法，其中，进一步与包含天然型IgG1的Fc区的多肽对FcγRIIaR的结合活性相比的相对结合活性之比降低至0.1以下。
13.权利要求11所述的方法，其中进一步地，与包含天然型IgG1的Fc区的多肽对FcγRIa的结合活性相比的相对结合活性之比降低至0.1以下。
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