BR112015029788B1

BR112015029788B1 - HETERO-MULTÍMERO, USO E MÉTODO PARA PREPARAR DO MESMO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO PARA REDUZIR FUNÇÃO EFETORA DE UM CONSTRUTO IgG FC

Info

Publication number: BR112015029788B1
Application number: BR112015029788-9A
Authority: BR
Inventors: Eric Escobar-Cabrera
Original assignee: Zymeworks Inc
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2024-01-02
Also published as: DK3004174T3; KR20160023721A; WO2014190441A9; CA2913370A1; US11098105B2; EP3004174B1; JP6567506B2; KR102332303B1; US20160102135A1; RU2655439C2; HK1223376A1; CA2913370C; ES2736326T3; RU2015152084A; EP3004174A1; EP3004174A4; WO2014190441A1; AU2014273817B2; JP2016520598A; BR112015029788A2

Abstract

hetero-multímero, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para preparar o hetero-multímero, composição farmacêutica, uso do hetero-multímero e método para reduzir a função efetora de um construto igg fc. no presente relatório são providos construtos de hetero-multímero com função efetora reduzida ou silenciada. em uma modalidade é provido um construto de hetero-multímero compreendendo um construto igg fc tendo um primeiro e um segundo polipeptídeo fc, cada polipeptídeo fc compreendendo uma articulada inferior modificada sendo que: a região articulada inferior modificada de dito primeiro polipeptídeo fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido, a região articulada inferior modificada de dito segundo polipeptídeo fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que é diferente de pelo menos uma modificação de aminoácido de dito primeiro polipeptídeo fc, e o construto igg fc exibe ligação reduzida a todos os receptores fc(gamma) e à proteína c1q como comparada com um construto igg fc precursor correspondente. também são providos métodos para produzir tais construtos de hetero-multímero e métodos para reduzir adcc para um construto de anticorpo ao reduzir função efetora.

Description

Introdução 2.1. Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se ao campo de projeto de anticorpo terapêutico e especificamente a polipeptídeos que compreendem uma região Fc heterodimérica que foi modificada a fim de silenciar funções efetoras mediadas pela região Fc.

2.2 Fundamentos da Invenção

[002] Anticorpos terapêuticos têm sido desenvolvidos para o tratamento de várias indicações de doença. Em alguns destes casos, a eficácia dos anticorpos terapêuticos resulta, pelo menos em parte, da capacidade da região Fc do anticorpo de mediar uma ou mais funções efetoras. Estas funções efetoras resultam da interação dos anticorpos e os complexos anticorpo-antígeno com as células do sistema imune para estimular uma variedade de respostas, incluindo a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) (revisto em Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997); Ward e Ghetie, Therapeutic Immunol. 2: 77-94 (1995); Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Diversas funções efetoras de anticorpo são mediadas por receptores de Fc (FcRs), que ligam a região Fc de um anticorpo. Os FcRs são definidos pela sua especificidade para isotipos de imunoglobulinas; Receptores de Fc para anticorpos IgG são referidos como FcyR, para anticorpos IgE como Fc εR, para anticorpos IgA como Fc aR e assim por diante. A região Fc de anticorpos também intermedeia funções, tais como ligação a FcRn, que operam independentemente de ligação ao antígeno e que conferem persistência na circulação e a capacidade de ser transferidos através de barreiras celulares por transcitose (Ward e Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77- 94 (1995)).

[003] Para certas indicações de doença, no entanto, as funções efetoras mediadas pela região Fc do anticorpo pode causar efeitos adversos indesejáveis e, assim, têm sido feitos esforços para conceber anticorpos com funções efetoras reduzidas ou silenciadas.

[004] Publicações recentes descrevem estratégias que têm sido utilizadas para projetar os anticorpos com atividade reduzida efetoras ou silenciadas (veja Strohl, WR (2009), Curr Opin Biotech 20: 685-691, e Strohl, WR e Strohl LM, “Antibody Fc engineering for optimal antibody performance” In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 225-249). Estas estratégias incluem a redução da função efetora através de modificação de glicosilação, o uso de andaimes IgG2/IgG4, ou a introdução de mutações em regiões de dobradiça ou CH2 da região Fe do anticorpo.

[005] Além disso, a patente US Publicação No. 2011/0212087 (Strohl) descreve anticorpos e outras moléculas contendo Fc com variações na região Fc que reduzem a ligação a FcyRs (receptores Fc gama) e a atividade resultante e pode ser usada no tratamento de várias doenças e desordens.

[006] Publicação de Patente Internacional N° WO 2006/105338 (Xencor) descreve variantes de Fc com propriedades optimizadas, métodos para a sua geração, polipeptídeos Fc compreendendo variantes de Fc com propriedades optimizadas, e métodos para utilização de variantes de Fc com propriedades optimizadas.

[007] A Patente US Publicação No. 2012/0225058 (Xencor) descreve uma variante de Fc de um construto IgG Fc de origem, em que a referida variante de Fc exibe alterada ligação a uma ou mais FcyRs, em que a referida variante de Fc compreende pelo menos uma inserção de aminoácidos na região Fc do referido construto de origem de IgG Fc.

[008] A Patente US No. 2012/0251531 Publicação (Genentech) descreve polipeptídeos projetados compreendendo variantes de Fc e as suas utilizações, e mais especificamente, as variantes de Fc que exibem redução da função efetora. Estas variantes são também descritas como causando um benefício para um paciente que sofre de uma doença que pode ser tratada com um anticorpo para o qual é desejável reduzir a função efetora provocada por anticorpos.

[009] Estropo et al ((2012) J. Mol. Biol. 420 204-219) descrevem a introdução de mutações carregadas na região de dobradiça de núcleo e região CH3 de IgG1 e IgG2 humanos para melhorar a formação de anticorpos bi específicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] São aqui fornecidos heteromultímeros compreendendo um construto de IgG Fc possuindo um primeiro e um segundo polipeptídeo de Fc, em que cada polipeptídeo de Fc compreende uma região modificada de dobradiça inferior em que: a região de dobradiça inferior modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido, a região modificada inferior de dobradiça do referido segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que é diferente de pelo menos uma modificação de aminoácido do referido primeiro polipeptídeo Fc, e o construto de IgG Fc exibe reduzida ligação para todos os receptores de Fcy e proteína de C1q, em comparação com um correspondente construto de lgG Fc de origem.

[0011] Em certas modalidades há um heteromultímero aqui descrito, em que pelo menos uma alteração de aminoácido na região de dobradiça inferior modificada do primeiro polipeptídeo Fc aumenta a carga positiva líquida na região de dobradiça inferior modificada, e a pelo menos uma modificação de aminoácido no segundo polipeptídeo Fc aumenta o número total de cargas negativas ou é de carga neutra em relação à região de dobradiça de tipo selvagem; ou pelo menos uma modificação de aminoácido na região de dobradiça inferior modificada do primeiro polipeptídeo Fc aumenta a carga líquida negativa na região de dobradiça inferior modificada, e pelo menos uma modificação de aminoácido no segunda polipeptídeo Fc aumenta o número total de cargas positivas.

[0012] Em algumas modalidades há um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça inferior modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende duas ou mais alterações de aminoácidos.

[0013] Aqui fornecido é um heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc possuindo um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, em que cada polipeptídeo Fc compreendendo uma região de dobradiça modificada em que: a região de dobradiça modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que aumenta a carga líquida na região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc em cerca de condições de pH fisiológicas, a região de dobradiça modificada do referido segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que é diferente de pelo menos uma modificação de aminoácido do referido primeiro polipeptídeo Fc, e o construto de IgG Fc exibe ligação reduzida para todos os receptores de Fcy e proteínas de C1q, em comparação com um correspondente construto IgG Fc de origem.

[0014] Em algumas modalidades há um heteromultímero aqui descrito, em que o aumento da carga líquida é um aumento na carga positiva líquida no primeiro polipeptídeo Fc. Em algumas modalidades, o referido aumento na carga positiva líquida é um aumento no número total de aminoácidos carregados positivamente no primeiro polipeptídeo Fc, ou uma diminuição no número total de aminoácidos carregados negativamente no primeiro polipeptídeo Fc. Em certas modalidades há um heteromultímero aqui descrito, em que pelo menos uma modificação de aminoácido na região de dobradiça modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc aumenta o número total de aminoácidos carregados positivamente no referido primeiro polipeptídeo Fc, e pelo menos uma modificação de aminoácido na região de dobradiça modificada do referido segundo polipeptídeo Fc aumenta o número total de cargas negativas no referido segundo polipeptídeo Fc ou é de carga neutra.

[0015] Numa modalidade, o aumento da carga líquida é um aumento na carga negativa líquida no primeiro polipeptídeo Fc. Em certas modalidades, o aumento da carga negativa líquida é um aumento no número total de aminoácidos carregados negativamente ou uma diminuição no número total de aminoácidos carregados positivamente no primeiro polipeptídeo Fc. Em certas modalidades, quando a carga negativa líquida é um aumento no número total de aminoácidos carregados negativamente, pelo menos uma modificação de aminoácido no segundo polipeptídeo Fc aumenta o número total de cargas positivas.

[0016] Em algumas modalidades é proporcionado um heteromultímero aqui descrito, em que pelo menos uma modificação de aminoácido na região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc combinada com pelo menos uma modificação de aminoácido no segundo polipeptídeo Fc aumenta a carga positiva global do construto de IgG Fc comparado a um construto correspondente de IgG Fc de origem não compreendendo as modificações de região dobradiça.

[0017] Em algumas modalidades é fornecido um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende duas ou mais alterações de aminoácidos.

[0018] Em algumas modalidades é fornecido um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça inferior modificada dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende duas ou mais alterações de aminoácidos.

[0019] Em certas modalidades é proporcionado um heteromultímero aqui descrito, em que pelo menos uma alteração de aminoácido na região de dobradiça modificada do primeiro e segundo polipeptídeos Fc está na região de dobradiça inferior.

[0020] Proporciona-se um heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc tem um KD superior a 10 μM para FcyRIIaH, um KD superior a 10 μM para FcyRIIaR, um KD superior a 10 μM para FcyRIIB, um KD superior a 6 μM para FcyRIIIaF, um KD superior a 6 μM para FcyRIIIaV, e um KD superior a 6,5 nM para FcyRIa.

[0021] Em certas modalidades é proporcionado um heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc medeia a função efetora reduzida em comparação com um construto correspondente de IgG Fc não compreendendo as modificações de aminoácidos. Em algumas modalidades, construto de IgG Fc medeia menos do que 70%, menos do que 50%, menos de 30%, ou menos do que 10% da função efetora, conforme medido por CE50. Em algumas modalidades, o construto de IgG Fc medeia menos do que 10%, menos do que 5%, menos de 2%, ou menos do que 1% da função efetora, conforme medido por lise máxima de células. Numa modalidade, a função efetora é selecionada a partir de ADCC, ADCP, CDC ou qualquer combinação dos mesmos.

[0022] Em algumas modalidades é fornecido um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc alterações de aminoácidos em L234 e/ou L235. Em algumas modalidades, a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende modificações de aminoácidos selecionadas a partir L234K, L234R, L234A, L235K, L235R e L235A. Em uma outra modalidade, um dos ditos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende ainda uma alteração de aminoácido em E233. Em algumas modalidades, a referida modificação é selecionada a partir de E233 E233A, E233K e E233R.

[0023] Em algumas modalidades é fornecido um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de ambos os referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreendem alterações de aminoácidos em L234 e/ou L235. Em algumas modalidades, a modificação em L234 e/ou L235 é selecionada a partir L234A, L234K, L234R, L234D, L234E, L235K, L235R, L235E, L235A e L235D. Numa outra modalidade, a região de dobradiça modificada do primeiro e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende ainda uma alteração de aminoácido em E233. Em algumas modalidades, uma ou ambas as modificações de aminoácidos são independentemente E233A ou E233D.

[0024] Em certas modalidades é proporcionado um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende as modificações de aminoácidos L234K/L235K, E233A/L234R/L235R, E233K/L234R/L235R, ou E233K/L234A/L235K.

[0025] Em certas modalidades é proporcionado um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada do primeiro ou segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234A/L235A, L234D/L235E, E233A/L234D/L235E ou E233A/L234K/L235A.

[0026] Em certas modalidades é proporcionado um heteromultímero aqui descrito, em que: a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234K/L235K e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234A/L235A; a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234K/L235K e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E; a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233A/L234R/L235R e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233A/L234D/L235E; a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E; ou a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234A/L235K e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233A/L234K/L235A.

[0027] Em certas modalidades é proporcionado um heteromultímero aqui descrito, em que: o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234R/L235R/E233K; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/D265S e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/D265S; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/E269K e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/E269K; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/K322A e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/K322A; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/P329W e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/P329W; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/E269K/D265S/K322A e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322A; ou o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/E269K/D265S/K322E/E333K e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322E/E333K.

[0028] Aqui é proporcionado um heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc que tem um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, em que: o referido primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E269Q/D270N e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E269K/D270R; ou o referido primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L235K/A327K e o segundo polipeptídeo Fc não compreende uma modificação na região de dobradiça ou de dobradiça inferior; e em que o construto de IgG Fc exibe reduzida ligação para todos os receptores de Fcy e para proteína C1q como comparado a um construto de IgG Fc de origem.

[0029] Em algumas modalidades um heteromultímero é aqui descrito, em que o construto de IgG Fc é aglicosilado. Em algumas modalidades um heteromultímero é aqui descrito, em que o construto de IgG Fc é desglicosilado.

[0030] Em algumas modalidades um heteromultímero é aqui descrito, em que o início de fusão do construto de IgG Fc num termograma é maior do que ou igual a 68°C.

[0031] Em algumas modalidades um heteromultímero é aqui descrito, em que o construto de IgG Fc tem uma região CH2 com uma temperatura de fusão que é maior do que ou igual à temperatura de fusão de uma região CH2 de origem correspondente que não contém as modificações de região de dobradiça.

[0032] Numa modalidade há o heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc tem uma região CH2 com uma temperatura de fusão que é de cerca de 1 a 2°C maior do que a temperatura de fusão da região de CH2 de origem.

[0033] Numa modalidade há o heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc tem uma região CH2 com uma temperatura de fusão que é de cerca de 2 a 3°C maior do que a temperatura de fusão da região de CH2 de origem.

[0034] Numa modalidade é o heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc compreende uma região variante CH3 compreendendo as modificações de aminoácidos que promovem a formação de uma região Fc heterodimérica, em comparação com uma região Fc homodimérica, quando o referido heteromultímero é expresso. Em algumas modalidades, um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende as modificações de aminoácidos CH3 T366L/N390R/K392M/T394W e o outro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos CH3 L351Y/S400E/F405A/Y407V. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos Fc compreendem a modificação T350V de aminoácido. Numa outra modalidade, heteromultímeros compreendendo uma região Fc heterodimérica são resolvidos a partir de produtos de expressão compreendendo uma região Fc homodimérica utilizando métodos de purificação baseados em carga.

[0035] Numa modalidade há o heteromultímero aqui descrito, em que o heteromultímero compreende ainda pelo menos um constructo de ligação ao antígeno fundido como construto de IgG Fc.

[0036] Numa modalidade há o heteromultímero aqui descrito, em que pelo menos um constructo de ligação ao antígeno é selecionado a partir de um Fragmento Fab, um scFv, um sdAb, um peptídeo de ligação ao antígeno, uma proteína de fusão de Fc, ou uma proteína ou um seu fragmento capaz de se ligar ao antígeno. Em algumas modalidades há um heteromultímero aqui descrito, compreendendo um construto de ligação ao antígeno. Numa modalidade há um heteromultímero aqui descrito, compreendendo dois construtos de ligação ao antígeno.

[0037] Numa modalidade há um heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc está ligado a uma ou mais moléculas de droga tóxicas.

[0038] Numa modalidade há um heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc está ligado a um ou mais polipeptídeos heterólogos. Em algumas modalidades, um ou mais polipeptídeos heterólogos são selecionados dentre enzimas e toxinas.

[0039] Numa modalidade há um heteromultímero aqui descrito, em que IgG é IgG1.

[0040] Aqui é fornecido um ácido nucleico que codifica o primeiro ou segundo polipeptídeo Fc do heteromultímero aqui descrito. Proporciona-se uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico aqui descrito. Proporciona-se um método de preparação do heteromultímero aqui descrito, o método compreendendo os passos de: (a) cultivar a célula hospedeira aqui descrita; e (b) recuperar o heteromultímero a partir da cultura da célula hospedeira. Em certas modalidades há o método de preparação do heteromultímero, compreendendo ainda o passo de isolar o heteromultímero utilizando métodos de purificação baseados em carga. Em algumas modalidades há o método de preparação de heteromultímero aqui descrito, em que o método de purificação com base em carga é cromatografia de troca de íons.

[0041] É fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o heteromultímero aqui descrito e um carreador farmaceuticamente aceitável. Proporciona-se um método de tratamento de uma doença que compreende o fornecimento a um paciente em necessidade da mesma de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica aqui descrita. Em algumas modalidades há a utilização do heteromultímero aqui descrito na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença.

[0042] Em algumas modalidades há a utilização de um heteromultímero aqui descrito para o tratamento de uma doença num paciente em necessidade do mesmo.

[0043] Aqui é fornecido um método de reduzir a função efetora de um construto de anticorpo compreendendo: modificação da região de dobradiça inferior de um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, em que; a região de dobradiça inferior modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido, a região de dobradiça inferior modificada do referido segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que é diferente de pelo menos uma modificação de aminoácido do referido primeiro polipeptídeo Fc , e o construto de IgG Fc exibe ligação reduzida para todos os receptores de Fcy ou proteínas de C1q, em comparação com um correspondente construto de IgG Fc. Em algumas modalidades, as modificações resultam em ligação desprezável aos receptores de Fc.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0044] Estas e outras características da invenção serão mais evidentes na descrição detalhada seguinte na qual é feita referência aos desenhos anexos.

[0045] A Figura 1 descreve as regiões da região Fc que estão envolvidas em ligação de FcyR. (A) 3b/Fc estrutura cristalina (APO: 1E4K) denotando os loops e dobradiça inferior do domínio CH2 de Fc (mostrados em cinza) que estão envolvidos em ligação de FcyR (mostrada em preto). (B) Topologia do domínio CH2. As fitas são indicadas como S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 e; loops são denotados L1, L2 e L3.

[0046] A Figura 2 mostra termogramas de construtos de anticorpo exemplificativos assimétricos em relação ao anticorpo de tipo selvagem (WT). A Figura 2A mostra os termogramas para WT, e AAC2 - AAC6. A Figura 2B representa a identidade das duas transições no WT. A primeira transição corresponde ao desdobramento do domínio CH2, a segunda transição corresponde ao desdobramento de CH3+Fab. A Figura 2C ilustra a sobreposição de uma série de amostras que mostram como a transição de CH2 das variantes foi deslocada para um valor mais elevado de Tm, indicando uma estabilidade mais elevada.

[0047] A Figura 3A mostra os resultados exemplares que mostram a resolução por cromatografia de troca iônica de componentes produzidos quando construtos de anticorpo exemplificativos assimétricos são purificados. A Figura 3B descreve a separação de componentes, utilizando um gradiente de pH (painel superior), ou um gradiente de sal ou (painel inferior) utilizando variante exemplar AAC4 assimétrica.

[0048] A Figura 4 representa a capacidade de uma variante de controle (v1051) e um heteromultímero exemplar da invenção (AAC6) de mediar ADCC.

[0049] A Figura 5 representa a sequência de aminoácidos da região IgG1 Fc humana (SEQ ID NO:1); a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de trastuzumab (SEQ ID NO:2), a sequência de aminoácidos de cadeia leve de trastuzumab (SEQ ID NO: 3), a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de rituximab (SEQ ID NO:4), a sequência de aminoácidos de cadeia leve de rituximab (SEQ ID NO:5).

[0050] A Figura 6 ilustra a capacidade de variantes AAC9 - AAC12, AAC14, e AAC15 de mediar ADCC em células Daudi. A Figura 6A apresenta os resultados para AAC10 e AAC11 em comparação com os controles, incluindo rituximab disponível comercialmente; a Figura 6B apresenta os resultados para AAC12 e AAC14 em comparação com os controles, incluindo rituximab disponível comercialmente; a Figura 6C apresenta os resultados para AAC9 AAC15 em comparação com os controles, incluindo rituximab disponível comercialmente.

[0051] A Figura 7 ilustra a capacidade de variantes AAC9 - AAC12, AAC14, e AAC15 para mediar CDC em células Daudi.

[0052] A Figura 8 representa as sequências de SEQ ID NOs: 6-69 arquivadas em anexo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0053] A presente invenção proporciona um heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc. O construto de IgG Fc compreende dois polipeptídeos Fc, tendo cada um deles uma região de dobradiça modificada, em que a região de dobradiça modificada compreende modificações de aminoácidos assimétricos que reduzem ou eliminam a ligação de construto de IgG Fc a receptores de FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyFc RIIb, Fc yRIIIaF, FcyRIIIaV e FcyRIa e para complementar proteína de fator C1q. Esta redução ou eliminação desta ligação resulta na redução ou silenciamento de funções efetoras mediadas tipicamente pela região de tipo selvagem de IgG Fc. Como observado, a região de dobradiça modificada compreende modificações de aminoácidos assimétricos e, como tal, as alterações de aminoácidos na região de dobradiça de um polipeptídeo do construto de IgG Fc são diferentes daquelas na região de dobradiça do outro polipeptídeo. Em algumas modalidades, os construtos de anticorpo isolados são estáveis e capazes de se ligarem a FcRn.

[0054] Em certas modalidades, a região de dobradiça modificada de cada polipeptídeo do construto de IgG Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácidos, selecionadas de modo a aumentar a carga positiva de um polipeptídeo do construto de IgG Fc em comparação com o outro polipeptídeo do construto de IgG Fc. Em certas modalidades, a região de dobradiça modificada de cada polipeptídeo do construto de IgG Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácidos, selecionadas de modo a aumentar a carga negativa de um polipeptídeo do construto de IgG Fc em comparação com o outro polipeptídeo do construto de IgG Fc.

[0055] O heteromultímero de acordo com a invenção pode ser útil no desenvolvimento de anticorpos terapêuticos onde as funções efetoras são indesejáveis devido a efeitos secundários resultantes, tais como citotoxicidade. Em algumas modalidades, os heteromultímeros também exibem propriedades que facilitam a sua purificação, utilizando métodos à base de carga.

[0056] Aqui disponibilizados estão construtos de heteromultímero com função efetora reduzida ou silenciada. Em uma modalidade é fornecido um construto de heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc possuindo um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, cada polipeptídeo Fc compreende uma região modificada de dobradiça inferior em que: a região de dobradiça inferior modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido, a região modificada inferior de dobradiça do referido segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que é diferente de pelo menos uma modificação de aminoácido do referido primeiro polipeptídeo Fc, e o construto de IgG Fc exibe reduzida ligação para todos os receptores de Fcy e proteína de C1q, em comparação com um correspondente construto de lgG Fc de origem. Em certas modalidades, o construto de heteromultímero exibe ligação desprezável a receptores de Fcy, em comparação com um construto de lgG Fc que não têm as modificações aqui descritas. Em algumas modalidades, o construto heteromultímero exibe reduzida ligação para todos os receptores de Fcy e insignificante ligação a pelo menos um receptor de Fcy. Em certas modalidades, o construto heteromultímero aqui descrito exibe reduzida ligação a receptores de Fcy e ligação desprezável a proteínas C1q. Em certas modalidades, pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende uma modificação adicional de pelo menos um aminoácido que não está na região de dobradiça inferior. Em certas modalidades, pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende ainda a modificação de pelo menos um aminoácido o qual está na região de dobradiça. Em algumas modalidades, pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende ainda a modificação de pelo menos um aminoácido o qual está na região de CH2 ou CH3.

[0057] Aqui é fornecido um heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc possuindo um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, em que cada polipeptídeo Fc compreendendo uma região de dobradiça modificada em que: a região de dobradiça modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que aumenta a carga líquida na região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc em cerca de condições de pH fisiológicas, a região de dobradiça modificada do referido segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que é diferente de pelo menos uma modificação de aminoácido do referido primeiro polipeptídeo Fc, e o construto de IgG Fc exibe ligação reduzida para todos os receptores de Fcy e proteínas de C1q, em comparação com um correspondente construto IgG Fc de origem. Em algumas modalidades, o aumento da carga líquida é um aumento na carga positiva líquida no primeiro polipeptídeo Fc. Numa modalidade, o aumento na carga positiva líquida é um aumento no número total de aminoácidos carregados positivamente no primeiro polipeptídeo Fc. Em certas modalidades, o referido aumento na carga líquida é um aumento nas cargas negativas líquidas sobre o primeiro polipeptídeo Fc. Em uma modalidade particular, o aumento da carga negativa líquida é um aumento no número total de aminoácidos carregados negativamente no primeiro polipeptídeo Fc. Em certas modalidades, o construto de heteromultímero exibe ligação desprezável a receptores de Fcy, em comparação com um construto de lgG Fc que não têm as modificações aqui descritas. Em algumas modalidades, o construto heteromultímero exibe reduzida ligação para todos os receptores de Fcy e insignificante ligação a pelo menos um receptor de Fcy. Em uma modalidade, o construto de heteromultímero aqui descrita exibe reduzida ligação a receptores de Fcye ligação desprezável a proteínas C1q. Em certas modalidades, pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende ainda a modificação de pelo menos um aminoácido o qual está na região de dobradiça inferior. Em algumas modalidades, pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende ainda a modificação de pelo menos um aminoácido o qual está na região de CH2 ou CH3.

[0058] Em algumas modalidades há o heteromultímero aqui proporcionado, em que uma ou mais modificações de aminoácidos na região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc modifica o número de cargas negativas ou positivas na região de dobradiça, ou é de carga neutra relativo à região de dobradiça de tipo selvagem. Em algumas modalidades há o heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende duas ou mais alterações de aminoácidos. Numa modalidade é proporcionado o heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada do referido segundo polipeptídeo Fc compreende duas ou mais alterações de aminoácidos. Em certas modalidades há um construto de heteromultímero aqui descrito, em que uma ou mais modificações de aminoácidos da região de dobradiça modificada do primeiro e segundo polipeptídeos Fc está na região de dobradiça inferior (aminoácidos 16-23 de SEQ ID NO: 1, ver Figura 5).

[0059] Numa modalidade há um heteromultímero aqui descrito, em que o construto de lgG Fc tem um KD de pelo menos cerca de 10 μM para FcyRIIaH, um KD de pelo menos cerca de 10 μM para FcyRIIaR, um KD de pelo menos cerca de 10 μM para FcyRIIB, um KD de pelo menos cerca de 6 μM para FcyRIIIaF, um KD de pelo menos cerca de 6 μM para FcyRIIIaV, e um KD de pelo menos cerca de 6,5 nM para FcyRIa. Em algumas modalidades há um heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc tem um KD superior a 10 μM para FcyRIIaH, um KD maior do que 10 μM para FcyRIIaR, um KD maior do que 10 μM para FcyRIIB, um KD superior a 6 μM para FcyRIIIaF, um KD superior a 6 μM para FcyRIIIaV, e um KD de maior do que 6,5 nM para FcyRIa.

[0060] Em algumas modalidades é fornecido um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreendem alterações de aminoácidos em L234 e/ou L235. Numa modalidade é o heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende modificações de aminoácidos selecionadas a partir L234K, L234R, L234A, L235K, L235R e L235A. Numa modalidade é o heteromultímero aqui descrito, em que um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende uma alteração de aminoácido em E233. Numa modalidade é aqui proporcionado o heteromultímero, em que a referida modificação em E233 é selecionada a partir de E233A, E233K e E233R. Em algumas modalidades é fornecido um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende alterações de aminoácidos em L234 e/ou L235. Numa modalidade é o heteromultímero aqui descrito, em que a referida modificação em pelo menos um de L234 e L235 é selecionada a partir de L234A, L234K,L234R, L234D, L234E, L235K, L235R, L235E, L235A e L235D. Numa modalidade é o heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende ainda modificações de aminoácidos em E233. Numa modalidade, o primeiro ou segundo polipeptídeo Fc compreende modificações de aminoácidos selecionadas a partir de E233A ou E233D. Em certas modalidades, pelo menos um dos referidos primeiro ou segundo polipeptídeos Fc compreende ainda pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada a partir de D265S, E269K, K322A, P329W e E333K. Em algumas modalidades, os referidos polipeptídeos primeiro e segundo Fc ainda compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada a partir de D265S, E269K, K322A, P329W e E333K.

[0061] Aqui é proporcionado um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende as modificações de aminoácidos L234A/L235K, E233A/L234R/L235R, E233K/L234R/L235R, ou E233K/L234A/L235K. Em certas modalidades há um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada do primeiro ou segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234A/L235A, L234D/L235E, E233A/L234D/L235E, ou E233A/L234K/L235A.

[0062] Aqui é apresentado um heteromultímero como descrito neste documento, no qual a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido de L234K/L235K e a região de dobradiça modificada da segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido de L234A/L235K; a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido de L234K/L235K e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido de L234D/L235E; a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido de E233A/L234R/L235R e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido de E233A/L234D/L235E; a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido de E233K/L234R/L235R e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido de L234D/L235E; ou a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido de E233K/L234A/L235K e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido de E233A/L234K/L235A.

[0063] Em algumas modalidades há o heteromultímero aqui proporcionado, em que pelo menos um dos referidos primeiro ou segundo polipeptídeos Fc compreende ainda pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada a partir de D265S, E269K, K322A, P329W e E333K. Por exemplo, numa modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos de L234D/L235E e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos de L234R/L235R/E233K. Numa outra modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/D265S e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234R/L235R/D265S. Numa outra modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/E269K e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/E269K. Por exemplo, numa modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos de L234D/L235E/K322A e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos de L234R/L235R/E233K/K322A. Numa outra modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/P329W e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L233K/L235R/L265R/P329W. Numa outra modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/E269K/D265S/K322A e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322A. Numa outra modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/E269K/D265S/K322E/E333K e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322E/E333K.

[0064] Fornecido é um heteromultímero como aqui descrito, em que: o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234R/L235R/E233K; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E/D265S e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234R/L235R/D265S; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E/E269K e o segundo polipeptídeo de Fc compreende as modificações de aminoácido E233K/L234R/L235R/E269K; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidoL234D/L235E/K322A e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233K/L234R/L235R/K322A; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E/P329W e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233K/L234R/L235R/P329W; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E/E269K/D265S/K322A e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322A; ou o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E/E269K/D265S/K322E/E333K e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322E/E333K.

[0065] É proporcionado um heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc que tem um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, em que: o referido primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E269Q/D270N e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E269K/D270R; ou o referido primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L235K/A327K e o segundo polipeptídeo Fc não compreende uma modificação na região de dobradiça ou de dobradiça inferior; e em que o construto de IgG Fc exibe reduzida ligação para todos os receptores de Fcy e proteínas de C1q em comparação com um correspondente constructo de IgG Fc de origem.

[0066] Em algumas modalidades um heteromultímero é aqui fornecido, em que o construto de IgG Fc é aglicosilado. Numa modalidade é o heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc é desglicosilado.

[0067] Em algumas modalidades um heteromultímero é aqui descrito, em que o início de fusão do construto de IgG Fc num termograma é maior do que ou igual a 68ÜC. Em algumas modalidades é o heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc tem uma região CH2 com uma temperatura de fusão que é comparável à temperatura de fusão da região de CH2 de origem. Em algumas modalidades é o heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc tem uma região CH2 com uma temperatura de fusão que é maior do que ou cerca do mesmo que a temperatura de fusão da região de CH2 de origem. Numa modalidade há o heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc tem uma região CH2 com uma temperatura de fusão que é de cerca de 1 a 2 C maior do que a temperatura de fusão da região de CH2 de origem. Numa modalidade há o heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc tem uma região CH2 com uma temperatura de fusão que é de cerca de 2 a 3DC maior do que a temperatura de fusão da região de CH2 de origem. Numa modalidade há o heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc tem uma região CH2 com uma temperatura de fusão que é de cerca de 5 C maior do que a temperatura de fusão da região de CH2 de origem.

[0068] Aqui proporcionado é um construto de heteromultímero, em que o construto de IgG Fc compreende uma região variante CH3 compreendendo as modificações de aminoácidos que promovem a formação de uma região Fc de heterodímero.

[0069] Em algumas modalidades há um construto de heteromultímero aqui descrito, em que um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende as modificações de aminoácidos CH3 T366L/N390R/K392M/T394W e o outro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos CH3 L351Y/S400E/F405A/Y407V.

[0070] Numa modalidade há um construto de heteromultímero aqui descrito, em que o construto de IgG Fc compreende as modificações de aminoácidos que aumentam a estabilidade da região CH3. Numa modalidade, os primeiros e segundo polipeptídeos Fc compreendem a modificação T350V de aminoácido. Em certas modalidades, quaisquer construtos de anticorpo com construtos homodiméricos de Fc são claramente resolvidos a partir do referido heteromultímero utilizando métodos de purificação baseados em carga.

[0071] São fornecidos heteromultímeros como aqui descritos, em que o heteromultímero compreende ainda pelo menos um construto de ligação ao antígeno fundido com o construto de IgG Fc. Em certas modalidades, pelo menos um construto de ligação ao antígeno é selecionado a partir de um fragmento Fab, um scFv, um sdAb, um peptídeo de ligação ao antígeno, uma proteína de fusão de Fc, ou uma proteína ou um seu fragmento capaz de se ligar ao antígeno. Em algumas modalidades há um heteromultímero compreendendo um construto de ligação a antígeno. Em algumas modalidades há um heteromultímero compreendendo dois construtos de ligação ao antígeno. Numa modalidade há um heteromultímero em que o construto de IgG Fc está ligado a uma ou mais moléculas de droga tóxicas. Em certas modalidades, o construto de IgG Fc está ligado a um ou mais polipeptídeos heterólogos. Em algumas modalidades, um ou mais polipeptídeos heterólogos são selecionados dentre enzimas e toxinas.

[0072] Proporciona-se um heteromultímero aqui descrito, em que IgG é IgG1.

[0073] Aqui é fornecido um ácido nucleico que codifica o primeiro ou segundo polipeptídeo Fc do heteromultímero aqui descrito. Em algumas modalidades há uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico aqui descrito. Proporciona-se um método de preparação do heteromultímero aqui descrito, o método compreendendo os passos de: (a) cultivar a célula hospedeira aqui descrita; e (b) recuperar o heteromultímero a partir da cultura da célula hospedeira.

[0074] São aqui fornecidas composições farmacêuticas que compreendem o heteromultímero aqui descrito e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades há um método de tratamento de uma doença que compreende o fornecimento a um paciente em necessidade da mesma de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica aqui descrita. Em algumas modalidades há a utilização do heteromultímero aqui descrito na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença. Em algumas modalidades há a utilização de um heteromultímero aqui descrito para o tratamento de uma doença num paciente em necessidade do mesmo.

[0075] Aqui é fornecido um método de reduzir ADCC de um construto de anticorpo compreendendo: modificação da região de dobradiça inferior de um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, em que; a região de dobradiça inferior modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido, a região de dobradiça inferior modificada do referido segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que é diferente de pelo menos uma modificação de aminoácido do referido primeiro polipeptídeo Fc , e o construto de IgG Fc exibe ligação reduzida para todos os receptores de Fcy ou proteínas de C1q, em comparação com um correspondente construto de IgG Fc. Em certas modalidades é o método de redução de ADCC, em que as referidas modificações resultam em ligação desprezável para os receptores de Fc.

Definições

[0076] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual este assunto reivindicado pertence. No caso em que há uma pluralidade de definições para termos neste documento, aqueles nesta seção prevalecem. Onde a referência é feita a um URL ou outro tal identificador ou endereço, é entendido que esses identificadores podem alterar e determinada informação na internet pode ir e vir, mas informações equivalentes podem ser encontradas através de pesquisa na internet. Referência à mesma evidencia a disponibilidade e divulgação de tais informações.

[0077] Deve ser entendido que a descrição geral acima e a seguinte descrição detalhada são exemplares e explicativas apenas e não são restritivas de qualquer assunto reivindicado. Neste pedido, o uso do singular inclui o plural, a menos que especificamente indicado de outra forma.

[0078] "Domínio CH2 de origem" refere-se a um polipeptídeo de domínio CH2 de uma região Fc compreendendo uma sequência de aminoácidos que carece de uma ou mais modificações de aminoácidos na região de dobradiça do primeiro e segundo polipeptídeos Fc aqui descritos, mas que pode incluir uma ou mais modificações de dobradiça dissulfureto, dissulfuretos de CH2 adicionados, modificações de glicosilação ou diferentes estabilidades de domínio CH3, e que difere em função efetora em comparação com o domínio CH2 dos heteromultímeros da invenção. O domínio CH2 original pode compreender uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc com modificações na sequência de aminoácidos pré-existentes (tais como adições, deleções e/ou substituições).

[0079] "Anticorpos aglicosilados" refere-se a anticorpos ou heteromultímeros que não são glicosilados durante a expressão. Anticorpos aglicosilados podem ser preparados através de expressão em sistemas a que faltam uma via de glicosilação de mamífero, tais como E. coli, ou mutação de um ou mais locais de glicosilação, como N297.

[0080] "Anticorpos desglicosilados" refere-se a anticorpos ou heteromultímeros que são inicialmente glicosilados durante a expressão, mas que subsequentemente sofrem uma reação bioquímica, tais como, por exemplo, tratamento com PNGase F, que removeu o glicano.

[0081] "Aminoácido com cadeia lateral neutra" refere-se a um aminoácido que contém uma cadeia lateral que carece de uma carga em pH neutro. Todos os aminoácidos, exceto a lisina, arginina, aspartato, glutamato e histidina são considerados neutros. Em algumas concretizações, dependendo do ambiente estrutural em que é encontrada, lisina, arginina, aspartato, glutamato e histidina são também consideradas neutras. Numa modalidade, um "aminoácido com cadeia lateral neutra" refere-se a um aminoácido que contém uma cadeia lateral que não tem carga global em pH fisiológico.

[0082] "Aminoácido com cadeia lateral de carga positiva" refere-se a um aminoácido polar que contém uma cadeia lateral que é protonada e, por conseguinte, carregada positivamente em pH neutro. Estes aminoácidos são muitas vezes referidos como básicos. Exemplos de aminoácidos com cadeias laterais carregadas positivamente incluem lisina, arginina. Em algumas concretizações, dependendo do ambiente estrutural em que se encontra, histidina também pode ser protonada e têm uma cadeia lateral carregada positivamente. Numa modalidade, um "aminoácido com uma cadeia lateral carregada positivamente" refere-se a um aminoácido que contém uma cadeia lateral que está carregada positivamente em pH fisiológico.

[0083] "Aminoácido com uma cadeia lateral de carga negativa" é um aminoácido polar, cuja cadeia lateral é desprotonada e, portanto, carregada negativamente em pH neutro. Estes aminoácidos são muitas vezes referidos como básicos. Exemplos de aminoácidos com cadeias laterais carregadas negativamente incluem o ácido aspártico e ácido glutâmico. Numa modalidade, um "aminoácido com uma cadeia lateral carregada positivamente" refere-se a um aminoácido que contém uma cadeia lateral que está carregada positivamente em pH fisiológico.

[0084] "Afinidade de ligação" se refere em geral à força da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação simples de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno ou FcyR) . A afinidade de uma molécula X com seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (Kd ou KD). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos neste documento. Os anticorpos de baixa afinidade se ligam ao antígeno (ou FcyR) fracamente e tendem a dissociar-se facilmente, enquanto os anticorpos de elevada afinidade se ligam ao antigen (ou FcyR) com mais força e permanecem ligados por mais tempo.

[0085] O termo "região Fc" (ou fragmento da região cristalizável) é utilizado para definir a região C-terminal de um anticorpo. A região Fc é composta por dois fragmentos de proteínas idênticos, derivados do segundo e terceiros domínios constantes das duas cadeias pesadas do anticorpo: Cadeia A e cadeia B. O segundo e terceiro domínios constantes são conhecidos como o domínio CH2 e do domínio CH3, respectivamente. O domínio CH2 compreende uma sequência do domínio CH2 da cadeia A e uma sequência do domínio CH2 da cadeia B. O domínio CH3 compreende uma sequência do domínio CH3 de cadeia A e uma sequência do domínio CH3 de cadeia B. Tal como é aqui utilizado, inclui a região Fc da dobradiça região, tal como definido abaixo.

[0086] O termo "sequência da região Fc" é utilizado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina. A "sequência de região Fc" pode ser uma sequência de região Fc nativa ou uma sequência de região Fc variante. Embora os limites da sequência da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a sequência de região Fc de cadeia pesada de IgG humana está habitualmente definida para alongar a partir de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou desde Pro230, até ao terminal carboxil da mesma.

[0087] A "sequência de domínio CH2" de uma sequência da região IgG Fc humana (também referido como "Cy2" sequência do domínio) geralmente se estende desde cerca do aminoácido 231 até cerca do aminoácido 340. O domínio CH2 é o único em que não é estreitamente pareado com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidratos ramificadas N-ligadas são interpostas entre as duas sequências de domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Tem sido especulado que o carboidrato pode proporcionar um substituto para o emparelhamento domínio-domínio e ajudar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Molec. Immunol.22: 161-206 (1985).

[0088] A "sequência de domínio CH3" compreende o trecho de resíduos C-terminais com uma sequência de domínio CH2 em uma sequência da região Fc (ou seja, a partir de cerca de resíduo de aminoácido 341 a cerca de resíduo de aminoácido 447 de uma IgG).

[0089] Uma "região Fc funcional" possui as "funções efetoras" de uma região Fc nativa. Exemplos de "funções efetoras" incluem ligação a C1q; citotoxicidade dependente do complemento; ligação a receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular (por exemplo, receptor das células B; BCR), etc. Tais funções efetoras requerem geralmente que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas utilizando vários ensaios, tal como aqui divulgados, por exemplo.

[0090] Uma "sequência de região Fc nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região de sequência nativa humana de IgG1 Fc (não-A e A alotipos); sequência nativa de região IgG2 Fc humana; sequência nativa de região IgG3 Fc humana; e região IgG4 Fc de sequência humana nativa bem como variantes de ocorrência natural da mesma.

[0091] Uma "sequência de região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de "uma ou mais modificações de aminoácidos" tal como aqui definido. A sequência de região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação com uma sequência nativa de região Fc ou à sequência de região Fc de um polipeptídeo de origem, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferivelmente de cerca de um a cerca de cinco substituições de aminoácidos numa sequência de região Fc nativa ou sequência de região Fc do polipeptídeo de origem. Em certas modalidades, a sequência da região Fc variante aqui possui pelo menos cerca de 80% de identidade com uma sequência da região Fc nativa e/ou com uma sequência da região Fc de um polipeptídeo de origem, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade com esta, mais preferencialmente pelo menos com a mesma identidade de cerca de 95%.

[0092] Os termos "receptor de Fc" ou "FcR" são utilizados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano nativo. Além disso, em certas modalidades, o FcR é um que se liga a um anticorpo de IgG (um receptor gama, FcyR) e inclui receptores das subclasses FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), incluindo variantes alélicas e formas de splicing alternativas destes receptores. Receptores de FcyRII incluem FcyRlIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor inibidor"), que possuem sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. Receptor de ativação de Fc yRlIA contém um motivo de ativação de imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição de FcyRIIB contém um motivo de inibição de imunorreceptor baseado em tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático, (ver resenha M. em Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Os FcRs são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outros FcR, incluindo aqueles a se identificar no futuro, são englobados pelo termo "FcR" aqui. O termo "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)). O termo "FcyR "não inclui o FcRn.

[0093] "Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" e "ADCC" refere-se a uma reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam FcRs (por exemplo, Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado numa célula alvo e subsequentemente causam a lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam FcyRIII e níveis baixos de FcyRIIC, enquanto que os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991).

[0094] "Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcR e desempenham funções efetoras. Preferivelmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e executam a função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMC e as células NK sendo preferidos. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa respectiva, por exemplo, de sangue ou PBMC tal como aqui descrito.

[0095] Um heteromultímero com "bastante reduzida", "silenciada", "negligenciável" ou "ablacionada " afinidade de ligação s FcyR e afinidade de ligação a C1q é um que tem diminuída atividade de ligação a FcyR e atividade de ligação a C1q em comparação com um polipeptídeo de origem ou a um polipeptídeo compreendendo uma região Fc de sequência nativa. Em algumas modalidades, com um heteromultímero com "muito reduzida," "silenciada" negligenciável "ou "ablacionada" afinidade de ligação a FcyR e afinidade de ligação de C1q é também um heteromultímero com "muito reduzida," "silenciada" negligenciável" ou "sujeita a ablação" atividade de ADCC, ADCP e de CDC em comparação com um polipeptídeo de origem ou a um polipeptídeo compreendendo uma região Fc de sequência nativa. Um heteromultímero que "exibe diminuída ou indetectável ligação" para FcyR liga todos FcyRs com menor afinidade do que o polipeptídeo de origem. Tais variantes que exibem uma diminuição da ligação a FcyR podem possuir pouca ou nenhuma ligação apreciável a um FcyR. Numa modalidade, a variante exibe ligação a 0-20% a FcyR em comparação com uma região IgG Fc nativa, por exemplo, tal como determinado nos exemplos aqui apresentados ou tal como medido pela alteração na constante de equilíbrio. Numa modalidade, a variante exibe ligação a 0-10% a FcyR em comparação com uma região IgG Fc nativa. Numa modalidade, a variante exibe ligação 0-5% para o FcyR em comparação com uma região IgG Fc nativa. Numa modalidade, a variante exibe ligação a 0-1% para FcyR em comparação com uma região IgG Fc nativa.

[0096] Numa outra modalidade, um heteromultímero com "muito reduzida," "silenciada" negligenciável "ou" sujeita a ablação" ligação a FcyRIIaH tem um Kd para FcyRIIaH que é maior do que 5 μM como medido por SPR (ressonância de plasma de superfície). Numa outra modalidade, um heteromultímero com "muito reduzida," "silenciada" negligenciável "ou" sujeita a ablação " ligação a FcyRIIaR tem um Kd para FcyRIIaR que é maior do que 10 μM como medido por SPR (ressonância de plasma de superfície). Numa outra modalidade, um heteromultímero com "muito reduzida," "silenciada" negligenciável "ou" sujeita a ablação " ligação a FcyRIIB tem um KD de FcyRIIB que é maior do que 30 μM como medido por SPR (ressonância de plasma de superfície). Numa outra modalidade, um heteromultímero com "muito reduzida," "silenciada" negligenciável "ou" sujeita a ablação " ligação a FcyRIIIaF tem um KD de FcyRIIIaF que é maior do que 20 μM como medido por SPR (ressonância de plasma de superfície). Numa outra modalidade, um heteromultímero com "muito reduzida," "silenciada" negligenciável "ou" sujeita a ablação " ligação a FcyRIIIaV tem um KD de FcyRIIIaV que é maior do que 6 μM como medido por SPR (ressonância de plasma de superfície). Numa outra modalidade, um heteromultímero com "muito reduzida," "silenciada" negligenciável "ou" sujeita a ablação " ligação a FcyRIa tem um KD de FcyRIa que é superior a 6,5 nm, como medido por SPR (ressonância de plasma de superfície).

[0097] O heteromultímero que "medeia a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) na presença de células efetoras humanas mais eficazmente" do que um anticorpo de origem é um que, in vitro ou in vivo, é substancialmente mais eficaz na mediação de ADCC quando os valores de heteromultímero e anticorpo de origem usados no ensaio são essencialmente os mesmos. Geralmente, tais polipeptídeos serão identificados utilizando o ensaio de ADCC in vitro, tal como aqui divulgado, mas outros ensaios ou métodos para a determinação da atividade de ADCC, por exemplo, num modelo animal, etc., são contemplados. O polipeptídeo é de preferência de cerca de 1,5 vezes a cerca de 100 vezes, por exemplo, desde cerca de duas vezes a cerca de cinquenta vezes, mais eficaz na mediação de ADCC do que o original, por exemplo no ensaio in vitro aqui divulgado.

[0098] Um "anticorpo de origem", "polipeptídeo de origem," ou "polipeptídeo compreendendo uma região Fc nativa" refere-se a um construto que não compreende modificações de aminoácidos para a região de dobradiça. Numa modalidade, o anticorpo de origem é um que não compreende modificações de aminoácidos para a região de dobradiça e compreende modificações no domínio CH3 que promovem a formação de uma região Fc heterodimérica.

[0099] Uma "alteração de aminoácidos" refere-se a uma alteração na sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos predeterminada. Modificações exemplares incluem uma substituição de aminoácido, inserção e/ou deleção. Em certas modalidades a modificação de aminoácido aqui é uma substituição. Uma "alteração de aminoácidos na" posição especificada, por exemplo, da região Fc, refere-se à substituição ou deleção do resíduo especificado, ou a inserção de pelo menos um resíduo de aminoácido adjacente ao resíduo especificado. Pela inserção "adjacente" a um resíduo especificado destina-se dizer a inserção dentro de um a dois dos seus resíduos. Em certos enquadramentos, a inserção é N-terminal ou C-terminal relativamente ao resíduo especificado.

[00100] Uma "substituição de aminoácido" refere-se à substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido existente na sequência de aminoácidos predeterminada por outro resíduo de "substituição" de aminoácido diferente. O resíduo de substituição ou resíduos podem ser "resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente" (ou seja, codificados pelo código genético) e selecionado dentre o grupo que consiste em: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutâmico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); Isoleucina (Ile): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro): serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr); e valina (Val). De preferência, o resíduo de substituição não é cisteína. A substituição com um ou mais resíduos de ocorrência não natural de aminoácido é também englobada pela definição de uma substituição de aminoácido aqui. Um "resíduo de aminoácido de ocorrência não natural" refere-se a um resíduo, com exceção dos resíduos de aminoácidos de ocorrência natural listados acima, que é capaz de se ligar covalentemente a resíduos de aminoácidos adjacentes (s) em uma cadeia de polipeptídeo. Exemplos de resíduos de ocorrência não natural de aminoácido incluem norleucina, ornitina, norvalina, homosserina e outros análogos de resíduos de aminoácidos, tais como os descritos em Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991). Para gerar tais resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, os procedimentos de Noren et al. Science 244: 182 (1989) e Ellman et al., supra, podem ser usados. Brevemente, esses procedimentos envolvem ativar quimicamente um tRNA supressor com um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural, seguido por transcrição e tradução in vitro do RNA.

[00101] Uma “inserção de aminoácidos" refere-se à incorporação de pelo menos um aminoácido numa sequência predeterminada de aminoácidos. Em certas modalidades, a inserção consiste na inserção de um ou dois resíduos de aminoácidos. Em certas outras modalidades, são maiores "inserções de peptídeos", por exemplo, inserção de cerca de três a cerca de cinco ou até um máximo de cerca de dez resíduos de aminoácidos. Nestas modalidades o(s) resíduo inserido(s) são de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, como divulgado acima.

[00102] Uma “deleção de aminoácidos" refere-se à remoção de pelo menos um resíduo de aminoácido de uma sequência predeterminada de aminoácidos.

[00103] "Região de dobradiça" é geralmente definido a partir de Glu216 para Pro238 de IgG1 humana, da qual Cys226 para Pro230 formam a região 'de núcleo' da dobradiça (Burton, Molec. Immunol.22: 161-206 (1985)), enquanto que Ala231 a Pro238 formam a região de dobradiça "inferior". Glu216 para Thr225 formam a região "superior" de dobradiça. Regiões de dobradiça de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgG1 através da colocação do primeiro e último resíduos de cisteína que formam ligações S-S de inter-cadeia pesada nas mesmas posições.

[00104] "C1q" é um multímero de polipeptídeos que inclui um local de ligação para a região Fc de uma imunoglobulina. C1q juntamente com duas serina-proteases, C1r e C1s, forma o complexo C1, o primeiro componente da via de citotoxicidade dependente do complemento (CDC). C1q humano pode ser adquirido comercialmente a partir, por exemplo, de Quidel, San Diego, Califórnia.

[00105] O termo "domínio de ligação" refere-se à região de um polipeptídeo que se liga a outra molécula. No caso de um FcR, o domínio de ligação pode compreender uma porção de uma cadeia polipeptídica respectiva (por exemplo, a a cadeia respectiva) que é responsável pela ligação a uma região Fc. Um domínio de ligação útil é o domínio extracelular de uma cadeia de FcRa.

[00106] O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e especificamente cobre anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos bi específicos) e fragmentos de anticorpo desde que estes exibam a desejada atividade biológica.

[00107] "Fragmentos de anticorpo", tal como aqui definidos, compreendem uma porção de um anticorpo intacto, geralmente incluindo pelo menos um antígeno ou região de ligação variável do anticorpo intacto ou a região Fc de um anticorpo. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Em certas modalidades, os fragmentos de anticorpo retêm pelo menos parte da dobradiça e, opcionalmente, a região CH1 de uma cadeia pesada de IgG. Em algumas modalidades os fragmentos de anticorpo retêm toda a região constante de uma cadeia pesada de IgG, e incluem uma cadeia leve de IgG.

[00108] O termo "anticorpo monoclonal" usado neste documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para mutações possíveis de ocorrência natural, que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigênico. Ademais, em contraste com preparações de anticorpo (policlonal) convencionais, as quais tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método específico. Em certas modalidades os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção são produzidos pelo método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al, Nature 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Pat. N° 4.816.567). Em algumas modalidades "anticorpos monoclonais" são isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al, Nature 352:624-628 (1991) e Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por exemplo.

[00109] Os anticorpos monoclonais neste documento incluem anticorpos especificamente "quiméricos" (imunoglobinas), em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica às ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é(são) idêntica(s) às ou homóloga(s) às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencentes de outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. N° 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

[00110] Um "distúrbio" é qualquer condição que possa beneficiar de tratamento com o polipeptídeo variante. Isto inclui distúrbios ou doenças crónicas e agudas incluindo as condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Numa modalidade, o distúrbio é o câncer.

[00111] A palavra "marcador", quando aqui utilizada, refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugado direta ou indiretamente com o polipeptídeo. Em certos enquadramentos, o marcador é em si detectável (por exemplo, marcadores de radioisótopos ou marcadores fluorescentes). Em algumas outras modalidades, o marcador catalisa uma alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável. Uma modalidade exemplar compreende um marcador enzimático que catalisa uma alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável.

[00112] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada na fonte natural do ácido nucleico de polipeptídeo. Uma molécula de ácido nucleico isolada é outra que não sob a forma ou a configuração em que é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas distinguem-se, portanto, da molécula de ácido nucleico tal como existe em células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que vulgarmente expressam o polipeptídeo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização diferente da das células naturais cromossómicas.

[00113] A expressão "sequências de controle" refere-se a sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num organismo hospedeiro particular. Sequências de controle que são adequadas para procariontes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência de operador, um sítio de ligação de ribossomo, e assim por diante. Células eucarióticas são conhecidas por utilizar os promotores, os sinais de poliadenilação, e reforços.

[00114] O ácido nucleico está "operativamente ligado" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para um líder secretor ou pré-sequência está operativamente ligado ao DNA para um polipeptídeo se for expresso como uma prepoteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou potencializador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele afeta a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação do ribossomo está operativamente ligado à sequência codificadora se ela estiver posicionada de modo a permitir a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de DNA a serem ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretor, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os potenciadores não têm que ser contíguos. A ligação é conseguida por ligação em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existirem, os adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos sintéticos são utilizados de acordo com a prática convencional.

[00115] Tal como aqui utilizado, as expressões "célula", "linha celular" e "cultura de células" são utilizadas indiferentemente e todas estas designações incluem a descendência. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula sujeito primária e culturas dela derivadas, sem levar em conta o número de transferências. É também entendido que toda a descendência pode não ser exatamente idêntica em conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica, conforme triada ou selecionada na célula originalmente transformada, está incluída neste documento. Onde designações distintas são destinadas, será claro a partir do contexto.

[00116] A frase "receptor de baixa afinidade" designa um receptor que tem uma afinidade de ligação fraca para um ligante de interesse, por exemplo, com uma constante de dissociação de cerca de 50 nM ou afinidade pior. Receptores de baixa afinidade exemplificativos incluem FcyRII e FcyRIII.

[00117] Por "fusão de Fc" tal como aqui utilizado, significa- se uma proteína em que um ou mais polipeptídeos estão operacionalmente ligados a uma região Fc ou um seu derivado. Fusão de Fc é aqui destinado ser sinónimo do termo "imunoadesina", "fusão de Ig", "quimera de Ig", e "globulina de receptor" (por vezes, com travessões), como utilizado na técnica (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:. 52-60; Ashkenazi et al, 1997, Curr Opin Immunol 9: 195-200). Uma fusão de Fc combina a região Fc de uma imunoglobulina com um parceiro de fusão, que, em geral, pode ser qualquer proteína ou molécula pequena. O papel da parte não-Fc de uma fusão de Fc, isto é, o parceiro de fusão, é para mediar a ligação de alvo e, assim, é funcionalmente análogo ao das regiões variáveis de um anticorpo. Virtualmente qualquer proteína ou molécula pequena pode ser ligada a Fc para gerar uma fusão de Fc. Parceiros de fusão podem incluir proteína, mas não estão limitados à região de ligação ao alvo de um receptor, uma molécula de adesão, um ligante, uma enzima, uma citoquina, uma quimioquina, ou algum outro domínio de proteína ou proteína. Pequenos parceiros de fusão de moléculas podem incluir qualquer agente terapêutico que dirige a fusão de Fc para um alvo terapêutico. Tais alvos podem ser qualquer molécula, preferencialmente um receptor extracelular, que está implicada na doença. Duas famílias de receptores de superfície que são alvos de um certo número de drogas de moléculas pequenas aprovadas são Receptores Acoplados à Proteína G (GPCR), e os canais iônicos, incluindo canais.+, Na+, Ca+. Quase 70% de todos os medicamentos atualmente comercializados em todo o mundo tem por alvo GPCRs. Assim, as proteínas de Fc aqui descritas podem ser fundidas com uma molécula pequena que se destina, por exemplo, a um ou mais receptores de GABA, receptores purinérgicos, receptores adrenérgicos, receptores histaminérgicos, receptores de opiáceos, receptores de quimiocinas, receptores de glutamato, receptores nicotínicos, de 5HT (serotonina), e receptores de estrogénio. Um parceiro de fusão pode ser uma molécula pequena, mimética de uma proteína que tem como alvo um alvo terapeuticamente útil. Exemplos específicos de drogas específicas, que podem servir como parceiros de fusão de Fc, podem ser encontrados em L.S. Goodman et al., Eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw-Hill, Nova Iorque, 9 ed., 1996). Os parceiros de fusão incluem não apenas pequenas moléculas e proteínas que se ligam s alvos conhecidos para medicamentos existentes, mas receptores órfãos que ainda não existem como alvos de drogas. A conclusão dos projetos genoma e proteoma estão provando ser uma força motriz na descoberta de medicamentos, e esses projetos têm rendido um tesouro de receptores órfãos. Há um potencial enorme para validar estas novas moléculas como alvos de drogas, e desenvolver proteínas e pequenas moléculas terapêuticas que eles têm como alvo. Tais proteínas e pequenas moléculas terapêuticas são contempladas como parceiros de fusão de Fc que empregam os construtos de IgG Fc aqui descritos. Uma variedade de ligantes, definidos e descritos a seguir, pode ser utilizada para ligar covalentemente Fc para um parceiro de fusão para gerar uma fusão de Fc.

[00118] Por "antígeno alvo" como aqui utilizado significa-se a molécula que está especificamente ligada pela região variável de um determinado anticorpo. Um antígeno alvo pode ser uma proteína, hidrato de carbono, lipídio, ou outro composto químico.

[00119] Por "célula alvo", tal como aqui utilizado, significa- se uma célula que expressa um antígeno alvo.

[00120] Ao longo da presente especificação e reivindicações, a numeração dos resíduos de uma cadeia pesada de imunoglobulina é a do índice de EU como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (19 1), expressamente aqui incorporado por referência. O "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração dos resíduos do anticorpo IgG1 EU humano. 1. heteromultímeros compreendendo um construto de IgG Fc

[00121] Aqui disponibilizados estão construtos de heteromultímero com função efetora reduzida ou silenciada. Em uma modalidade é fornecido um construto de heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc possuindo um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, cada polipeptídeo Fc compreende uma região modificada de dobradiça em que: a região de dobradiça modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido, a região modificada de dobradiça do referido segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que é diferente de pelo menos uma modificação de aminoácido do referido primeiro polipeptídeo Fc, e o construto de IgG Fc exibe reduzida ligação para todos os receptores de Fcy e proteína de C1q, em comparação com um correspondente construto de lgG Fc de origem.

[00122] Aqui disponibilizados estão construtos de heteromultímero com função efetora reduzida ou silenciada. Em uma modalidade é fornecido um construto de heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc possuindo um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, cada polipeptídeo Fc compreende uma região modificada de dobradiça inferior em que: a região de dobradiça inferior modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido, a região modificada inferior de dobradiça do referido segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que é diferente de pelo menos uma modificação de aminoácido do referido primeiro polipeptídeo Fc, e o construto de IgG Fc exibe reduzida ligação para todos os receptores de Fcye proteína de C1q, em comparação com um correspondente construto de lgG Fc de origem. Em certas modalidades, o construto de heteromultímero exibe ligação desprezável a receptores de Fcy, em comparação com um construto de lgG Fc de origem correspondente que não têm as modificações aqui descritas. Em algumas modalidades, o construto heteromultímero exibe reduzida ligação para todos os receptores de Fcy e insignificante ligação a pelo menos um receptor de Fcy. Em certas modalidades, o construto heteromultímero aqui descrito exibe reduzida ligação a receptores de Fcy e ligação desprezável a proteínas C1q.

[00123] Aqui é fornecido um heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc possuindo um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, em que cada polipeptídeo Fc compreendendo uma região de dobradiça modificada em que: a região de dobradiça modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que aumenta a carga líquida na região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc em cerca de condições de pH fisiológicas, a região de dobradiça modificada do referido segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que é diferente de pelo menos uma modificação de aminoácido do referido primeiro polipeptídeo Fc, e o construto de IgG Fc exibe ligação reduzida para todos os receptores de Fcy e proteínas de C1q, em comparação com um correspondente construto IgG Fc de origem. Em algumas modalidades, o aumento da carga líquida é um aumento na carga positiva líquida no primeiro polipeptídeo Fc. Numa modalidade, o aumento na carga positiva líquida é um aumento no número total de aminoácidos carregados positivamente no primeiro polipeptídeo Fc. Em certas modalidades, o referido aumento na carga líquida é um aumento nas cargas negativas líquidas no primeiro polipeptídeo Fc. Em uma modalidade particular, o aumento da carga negativa líquida é um aumento no número total de aminoácidos carregados negativamente no primeiro polipeptídeo Fc. Em certas modalidades, o construto de heteromultímero exibe ligação desprezável a receptores de Fcy, em comparação com um construto de lgG Fc que não têm as modificações aqui descritas. Em algumas modalidades, o construto heteromultímero exibe reduzida ligação para todos os receptores de Fcye insignificante ligação a pelo menos um receptor de Fcy. Em uma modalidade, o construto de heteromultímero aqui descrita exibe reduzida ligação a receptores de Fcye ligação desprezável a proteínas C1q.

[00124] São fornecidos heteromultímeros compreendendo um construto de lgG Fc, o referido construto de lgG Fc tendo um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, cada polipeptídeo Fc compreendendo uma região de dobradiça modificada em que a região de dobradiça modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácidos que aumentam o número de cargas positivas na região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc, em que a região de dobradiça modificada do referido segundo polipeptídeo Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácidos diferentes de uma ou mais modificações de aminoácidos do referido primeiro polipeptídeo Fc, e em que o construto de lgG Fc não se liga a receptores de Fcy ou à proteína de C1q.

1.1 região de dobradiça e região de Fc

[00125] Os heteromultímeros compreendem um construto de lgG Fc (região Fc), que inclui a região de dobradiça. A região Fc de um anticorpo compreende tipicamente duas cadeias polipeptídicas, cada uma das quais compreende um fragmento C-terminal de um polipeptídeo de cadeia pesada de IgG. Por conseguinte, construto de lgG Fc tem dois polipeptídeos Fc, cada um derivado de um polipeptídeo de cadeia pesada de IgG e incluindo as regiões que medeiam a ligação a FcyRs, complemento, e FcRn, bem como a região de dobradiça.

[00126] Numa modalidade o heteromultímero compreende um construto de lgG Fc que é derivado de um polipeptídeo de cadeia pesada de IgG humana. Vários subtipos de polipeptídeos de cadeia pesada de IgG humana são conhecidos na técnica e incluem IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Um destes subtipos de IgG humana, IgG1, IgG2, IgG3, são conhecidos por ativar o complemento, e IgG1 e IgG3 medeiam a ADCC (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos) de função efetora mais eficazmente do que IgG2 e IgG4. Numa modalidade o heteromultímero compreende um construto de lgG Fc que é derivado de um polipeptídeo de cadeia pesada de IgG1 humana. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada de IgG1 humana é conhecida na técnica (ver, por exemplo, No. de acesso J00228 IMGT). Numa modalidade o heteromultímero compreende um construto de lgG Fc que é derivado de um polipeptídeo de cadeia pesada de IgG3 humana. A sequência da cadeia pesada de IgG3 humana é conhecida na técnica (ver, por exemplo, No. de Acesso X03604 IMGT). Numa modalidade o heteromultímero compreende um construto de lgG Fc que é derivado de um polipeptídeo de cadeia pesada de IgG4 humana. A sequência da cadeia pesada de IgG4 humana é conhecida na técnica (ver, por exemplo, No. de Acesso K01316 IMGT). A sequência de aminoácidos de uma região IgG1 Fc humana, incluindo a região de dobradiça, é mostrada na Figura 5 (SEQ ID NO:1).

[00127] Numa outra modalidade, o heteromultímero pode compreender uma região IgG Fc que é derivada de um alotipo de IgG. Alotipos de IgG são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Jefferies et al. (2009) Mabs 1(4):332-338).

[00128] Numa modalidade, a região IgG Fc é derivada de um anticorpo monoclonal humanizado com potencial terapêutico, selecionado dentre: alemtuzumab, apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bevacizumab, bivatuzumab, cantuzumab, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicina, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumabe, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, pascolizumab, pecfusituzumab, pectuzumab , pertuzumab, pexelizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resyvizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, tetraxetan tacatuzumab, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, trastuzumab, celmoleuquina tucotuzumab, tucusituzumab, umavizumab, urtoxazumab, e visilizumab.

[00129] Em outra modalidade, a região IgG Fc é derivada de um anticorpo terapêutico, tais como, por exemplo, rituximab.

[00130] Cada polipeptídeo Fc do construto de lgG Fc compreende pelo menos uma parte da região Fc do polipeptídeo de cadeia pesada de IgG, incluindo a região de dobradiça. A região Fc de polipeptídeos IgG inclui sítios de ligação para vários receptores que medeiam as funções efetoras da região Fc. Exemplos de tais receptores incluem FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIB, FcyRIIIA. A região Fc compreende adicionalmente uma região que se liga ao fator de proteína complementar C1q.

[00131] A região Fc do polipeptídeo de cadeia pesada de IgG1 humana compreende aminoácidos 216-447 da cadeia pesada de IgG1 (ver SEQ ID NO:2, Figura 5). O comprimento e a sequência da região de dobradiça de IgG humana varia com o isotipo IgG, como mostrado na Tabela 1 abaixo:

[00132] Tabela 1: Comparação de sequências de aminoácido de região de dobradiça de IgG humana

4 12 VDKRV ESKYGPP CPSCP APELLGGP

[00133] A região de dobradiça do polipeptídeo de IgG1 compreende os resíduos de aminoácidos de 216 a 238, enquanto que a região de dobradiça inferior do polipeptídeo de IgG1 humana compreende os resíduos de aminoácidos a partir de 231 para 238.

[00134] Assim, numa modalidade, cada polipeptídeo Fc do construto de lgG Fc compreende os aminoácidos 216 a 447 da cadeia pesada de IgG1 humana, em que o referido primeiro polipeptídeo Fc inclui pelo menos uma modificação na região de dobradiça que compreende os resíduos de aminoácido 216 para 238, e o referido segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido na região de dobradiça que é diferente da pelo menos uma modificação de aminoácido no primeiro polipeptídeo Fc. Numa outra modalidade, cada polipeptídeo Fc do construto de lgG Fc compreende os aminoácidos 231 a 447 da cadeia pesada de IgG1 humana, em que o referido primeiro polipeptídeo Fc inclui pelo menos uma modificação na região de dobradiça inferior compreendendo os resíduos de aminoácidos 231 para 238, e o referido segundo polipeptídeo Fc compreende pelo menos uma modificação de aminoácido na região de dobradiça inferior que é diferente da pelo menos uma modificação de aminoácido no primeiro polipeptídeo Fc.

1.1.2 Modificações de aminoácidos da região de dobradiça modificada

[00135] O primeiro e segundo polipeptídeos Fc dos construtos de lgG Fc compreendem uma região de dobradiça modificada que está modificada de forma assimétrica para gerar heteromultímeros com função efetora ablacionada ou grandemente reduzida. Os termos "primeiro" e "segundo", com referência ao polipeptídeo Fc podem ser usados alternadamente, desde que cada construto de lgG Fc compreenda um primeiro polipeptídeo Fc e um segundo polipeptídeo Fc. As modificações de aminoácidos são introduzidas na região de dobradiça do primeiro e segundo polipeptídeos Fc de uma forma assimétrica,tal como descrito em mais detalhe abaixo.

[00136] Os heteromultímeros compreendem primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreendendo modificações de núcleo de aminoácidos descritas nos parágrafos seguintes.

[00137] Em algumas modalidades é fornecido um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreendem alterações de aminoácidos em L234 e/ou L235. Numa modalidade é o heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende modificações de aminoácidos selecionadas a partir L234K, L234R, L234A, L235K, L235R e L235A. Numa modalidade é o heteromultímero aqui descrito, em que um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende ainda uma alteração de aminoácido em E233. Numa modalidade é aqui proporcionado o heteromultímero em que a referida modificação em E233 é selecionada a partir de E233A, E233K e E233R. Em algumas modalidades é fornecido um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende alterações de aminoácidos em L234 e/ou L235. Numa modalidade é o heteromultímero aqui descrito, em que a referida modificação em pelo menos um de L234 e L235 é selecionada a partir de L234A, L234K, L234R, L234D, L234E, L235K, L235R, L235E, L235A e L235D. Numa modalidade é o heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende ainda modificações de aminoácidos em E233. Numa modalidade, o primeiro ou segundo polipeptídeo Fc compreende modificações de aminoácidos selecionadas a partir de E233A ou E233D.

[00138] Aqui é proporcionado um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada de pelo menos um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende as modificações de aminoácidos L234A/L235K, L234K/L235K, E233A/L234R/L235R, E233K/L234R/L235R, ou E233K/L234A/L235K. Em certas modalidades há um heteromultímero aqui descrito, em que a região de dobradiça modificada do primeiro ou segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234A/L235A, L234D/L235E, E233A/L234D/L235E, ou E233A/L234K/L235A.

[00139] Aqui é fornecido um heteromultímero como descrito neste documento, no qual a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234K/L235K e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234A/L235K; a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234K/L235K e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234A/L235A; a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234K/L235K e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E; a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233A/L234R/L235R e a região de dobradiça modificada do polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233A/L234D/L235E; a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233K/L234R/L235R e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E; ou a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233K/L234A/L235K e a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233A/L234K/L235A.

[00140] Em algumas modalidades, o heteromultímero compreende primeiro e segundo polipeptídeos que compreendem as modificações de aminoácidos essenciais, e compreende a seguinte modificação de aminoácido adicional. Assim, em algumas modalidades há o heteromultímero aqui proporcionado, em que pelo menos um dos referidos primeiro ou segundo polipeptídeos Fc compreende ainda pelo menos uma modificação de aminoácido selecionada a partir de D265S, E269K, K322A, P329W e E333K. Por exemplo, numa modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos de L234D/L235E e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos de L234R/L235R/E233K. Numa outra modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/D265S e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234R/L235R/D265S. Numa outra modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/E269K e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/E269K. Por exemplo, numa modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos de L234D/L235E/K322A e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos de E234K/L234R/L235R/K322A. Numa outra modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/P329W e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/P329W. Numa outra modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/E269K/D265S/K322A e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322A. Numa outra modalidade há um heteromultímero tal como aqui descrito, em que o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L234D/L235E/E269K/D265S/K322E/E333K e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322E/E333K.

[00141] Fornecido é um heteromultímero como aqui descrito, em que: o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234R/L235R/E233K; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E/D265S e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234R/L235R/D265S; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E/E269K e o segundo polipeptídeo de Fc compreende as modificações de aminoácido E233K/L234R/L235R/E269K; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E/K322A e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233K/L234R/L235R/K322A; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E/P329W e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233K/L234R/L235R/P329W; o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E/E269K/D265S/K322A e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322A; ou o primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido L234D/L235E/E269K/D265S/K322E/E333K e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácido E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322E/E333K.

Primeiro polipeptídeo Fc

[00142] Cada um dos dois polipeptídeos Fc do construto de lgG Fc compreende uma região de dobradiça modificada. A região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácidos que aumentam a carga positiva da região de dobradiça modificada do referido polipeptídeo Fc. Por "aumenta a carga positiva da região de dobradiça modificada" significa-se que a região de dobradiça modificada com um ou mais modificações de aminoácidos tem uma carga global positiva que é maior do que a região de dobradiça não modificado do tipo selvagem. A região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácidos que são diferentes de uma ou mais modificações de aminoácidos de outro polipeptídeo Fc. Tal como aqui utilizado, modificações de aminoácidos assimétricos são qualquer modificação em que um aminoácido numa posição específica num polipeptídeo (por exemplo, "primeiro polipeptídeo") é diferente do aminoácido no segundo polipeptídeo (por exemplo, "segundo polipeptídeo") na mesma posição. Isto pode ser um resultado da modificação de apenas um dos dois aminoácidos ou modificação de ambos aminoácidos para os dois aminoácidos diferentes a partir do primeiro ou segundo polipeptídeo do construto de lgG Fc.

[00143] Por exemplo, se o primeiro polipeptídeo Fc compreende a modificação L235K de aminoácidos, modificações de aminoácidos que são diferentes incluiriam a modificação de outros aminoácidos na região de dobradiça, tal como L234 ou E233, ou modificação de L235 diferente de L235K, tais como L235A ou L235D. Assim, numa modalidade, a região de dobradiça modificada de um primeiro polipeptídeo Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácidos que aumentam a carga positiva da região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc, e a região de dobradiça modificada de um segundo polipeptídeo Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácidos diferentes das duas ou mais modificações de aminoácidos do referido primeiro polipeptídeo Fc. Numa modalidade, a região de dobradiça modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc compreende duas ou mais modificações de aminoácidos que aumentam a carga positiva da região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc, e a região de dobradiça modificada do referido segundo polipeptídeo Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácidos diferentes das uma ou mais modificações de aminoácidos do referido primeiro polipeptídeo Fc. Em uma modalidade alternativa, a região de dobradiça modificada do referido primeiro polipeptídeo Fc compreende duas ou mais alterações de aminoácidos que aumentam a carga positiva da região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc, e a região de dobradiça modificada do referido segundo polipeptídeo Fc compreende duas ou mais modificações de aminoácidos diferentes das duas ou mais modificações de aminoácidos do referido primeiro polipeptídeo Fc.

[00144] Numa modalidade, quando a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc do construto de lgG Fc compreende a modificação de um aminoácido, a alteração de aminoácidos é feita para substituir um aminoácido com uma cadeia lateral neutra ou carregada negativamente, com um aminoácido tendo uma cadeia lateral carregada positivamente. Por exemplo, L234 ou L235 da região de dobradiça pode ser substituída por Lys (K), Orn (O) ou Arg (R). Assim, em modalidades em que a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc do construto de lgG Fc compreende a modificação de um aminoácido, os seguintes resíduos de aminoácidos da região de dobradiça inferior de IgG1 humana podem ser substituídos por Lis, Orn, Arg ou: A231, P232, E233, L234, L235, G236, G237 ou P238.

[00145] Em concretizações em que a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende duas ou mais alterações de aminoácidos, o resultado global da combinação de modificações é um aumento na carga positiva da região de dobradiça modificada. Este aumento global na carga positiva pode resultar a partir de combinações das modificações de aminoácidos que substituem os aminoácidos com cadeias laterais neutras ou com carga negativa, com os aminoácidos com cadeias laterais carregadas positivamente ou cadeias laterais neutras. Por exemplo, numa modalidade, as duas ou mais alterações de aminoácidos que aumentam a carga positiva da região dobradiça inferior do primeiro polipeptídeo Fc de um construto de IgG 1 IgG Fc podem ser selecionadas a partir de E233K, E233R, E233A, L234K, L234R, L234A, L235K, L235R, e L235A desde que a combinação de duas ou mais modificações de aminoácidos aumente a carga positiva da região de dobradiça modificada. De modo semelhante, outras modificações de aminoácidos no interior da região de dobradiça podem ser feitas desde que elas aumentem a carga positiva da região de dobradiça.

[00146] Numa modalidade, a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc do construto de lgG Fc compreende modificações de aminoácidos em L234 ou L235 que aumentam a carga positiva da região de dobradiça modificada. Numa outra modalidade, a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc do construto de IgG Fc compreende modificações de aminoácidos em L234 e L235, que aumentam a carga positiva da região de dobradiça modificada. Numa outra modalidade, a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc do construto de IgG Fc compreende modificações de aminoácidos em L234, L235 ou E233 que aumentam a carga positiva da região de dobradiça modificada. Numa modalidade, a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc do construto de lgG Fc compreende modificações de aminoácidos em L234 e E233 que aumentam a carga positiva da região de dobradiça modificada. Numa outra modalidade, a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc do construto de IgG Fc compreende modificações de aminoácidos em L235 e E233, que aumentam a carga positiva da região de dobradiça modificada. Numa modalidade, a região de dobradiça modificada do primeiro polipeptídeo Fc do construto de lgG Fc compreende modificações de aminoácidos em L234,L235 e E233 que aumentam a carga positiva da região de dobradiça modificada.

[00147] Numa modalidade, o primeiro polipeptídeo Fc do construto de IgG Fc compreende uma região de dobradiça modificada compreendendo as modificações de aminoácidos L234A/L235K, E233A/L234R/L235R, E233K/L234R/L235R, ou E233K/L234A/L235K.

Segundo polipeptídeo Fc

[00148] Numa modalidade, a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc do construto de IgG Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácidos que são diferentes das modificações de aminoácidos do primeiro polipeptídeo Fc, e que aumentam a carga negativa da região de dobradiça modificada ou que são de carga neutra em relação à região de dobradiça de tipo selvagem. Por "aumentar a carga negativa da região de dobradiça modificada" significa-se que a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc d o construto de IgG Fc com uma ou mais alterações de aminoácidos tem uma carga negativa global que é maior do que a do a região de dobradiça não modificada de tipo selvagem. Por "carga neutra" entende-se que as modificações de um ou mais aminoácidos não resulta numa mudança na carga total da região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc do construto de lgG Fc em comparação com a da região de dobradiça de tipo selvagem. Assim, as modificações de aminoácidos do segundo polipeptídeo do construto de IgG Fc inclui combinações das modificações de aminoácidos que substituem os aminoácidos com uma cadeia lateral neutra com aminoácidos possuindo uma cadeia lateral carregada negativamente, uma cadeia lateral carregada positivamente ou uma cadeia lateral neutra diferente, e/ou modificações de aminoácidos que substituem os aminoácidos com uma cadeia lateral carregada negativamente com aminoácidos possuindo uma cadeia lateral neutra. As combinações destas modificações de aminoácidos são adequadas, desde que resultem num aumento na carga negativa da região de dobradiça modificada ou sejam de carga neutra no que diz respeito à região de dobradiça de tipo selvagem.

[00149] Numa modalidade, o segundo polipeptídeo Fc do construto de IgG Fc compreende uma alteração de aminoácido em L234 ou L235. Numa outra modalidade, o segundo polipeptídeo Fc do construto de IgG Fc compreende modificações de aminoácidos em L234 e L235. Numa modalidade, o segundo polipeptídeo Fc do construto de IgG Fc compreende modificações de aminoácidos selecionadas a partir de L234A, L234K, L234R, L234D, L234E, L235K, L235R, L235E, L235A e L235D.

[00150] Numa modalidade, o segundo polipeptídeo Fc do construto de IgG Fc compreende modificações de aminoácidos em L234 e/ou L235 e E233. Numa modalidade, o segundo polipeptídeo Fc do construto de IgG Fc compreende modificações de aminoácidos selecionada a partir de L234A, L234K, L234R, L234D, L234E, L235K, L235R, L235E, L235A,L235D, E233A e E233D.

[00151] Numa modalidade, a região de dobradiça modificada do segundo polipeptídeo Fc do construto de IgG Fc compreende as modificações de aminoácidos L234A/L235A, L234D/L235E, E233A/L234D/L235E, ou E233A/L234K/L235A.

2. Outras modificações para o construto de IgG Fc Em algumas modalidades, os heteromultímeros de acordo com a invenção compreendem modificações adicionais como descrito abaixo.

[00152] Numa modalidade da invenção, o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc compreendendo polipeptídeos Fc modificados que tenham sido modificados adicionalmente promovendo a formação de uma região Fc heterodimérica. Tais polipeptídeos Fc modificados ainda são úteis na produção de heteromultímeros no contexto de anticorpos bi específicos. Numa modalidade, os polipeptídeos Fc compreendem domínios variantes CH3 possuindo modificações de aminoácidos que promovem a formação de regiões Fc heterodiméricas. Adequados domínios variantes CH3 são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, aqueles descritos na Publicação de Patente Internacional N° WO 2012/058768, e Patentes dos Estados Unidos N°s 5.821.333. 7.695.936. Numa modalidade, o heteromultímero de acordo com a invenção compreende um construto IgG Fc em que um dos referidos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende as modificações de aminoácidos CH3 T366L/N390R/K392M/T394W e o outro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos CH3 L351Y/S400E/F405A/Y407V.

[00153] Métodos adicionais para a modificação de polipeptídeos Fc para promover a formação de Fc heterodimérica são descritos na Publicação de Patente Internacional N° WO 96/027011 (puxadores em buracos), em Gunasekaran et al. (Gunasekaran K. et al. (2010) J Biol Chem. 285, 19637-46, projeto eletrostático para alcançar heterodimerização seletiva), em Davis et al. (Davis, JH. et al. (2010) Prot Eng Des Sel; 23 (4): 195-202, tecnologia de domínio projetado de permuta de filamento (SEED)), e em Moore et al (2011) Mabs 3: 6, 546-557.

[00154] Numa modalidade, o heteromultímero compreende um construto IgG Fc compreendendo ainda modificações de aminoácidos que promovem a formação de uma região Fc heterodimérica. Numa modalidade, o heteromultímero compreende um construto IgG Fc, compreendendo ainda modificações de aminoácidos na região CH3 de cada polipeptídeo Fc que promovem a formação de uma região Fc heterodimérica.

[00155] Em algumas modalidades, o heteromultímero compreende um construto IgG Fc compreendendo ainda modificações de aminoácidos que aumentam a estabilidade do construto de lgG Fc, conforme determinado pela temperatura de fusão do domínio CH2. Modificações de aminoácidos adequadas são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, aqueles descritos em Pedido de Patente Internacional N° PCT/CA2012/050.780. Especificamente, numa modalidade, o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc compreendendo a modificação T350V de aminoácidos em ambos o primeiro polipeptídeo Fc e o segundo polipeptídeo Fc.

[00156] É proporcionado um heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc que tem um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, em que: o referido primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E269Q/D270N e o segundo polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos E269K/D270R; ou o referido primeiro polipeptídeo Fc compreende as modificações de aminoácidos L235K/A327K e o segundo polipeptídeo Fc não compreende uma modificação na região de dobradiça ou de dobradiça inferior; e em que o construto de IgG Fc exibe reduzida ligação para todos os receptores de Fcy e proteínas de C1q em comparação com um correspondente constructo de IgG Fc de origem.

[00157] Numa modalidade, o Fc é um construto de lgG Fc, e o construto de lgG2 Fc, construto de lgG3 Fc, ou um o construto de lgG4 Fc.

[00158] Em algumas modalidades, um construto de IgG Fc compreende pelo menos um domínio CH3 que tem pelo menos uma alteração de aminoácidos que promove a formação de um Fc heterodimérico com estabilidade comparável a um Fc homodimérico de tipo selvagem. Exemplos de modificações são descritos a seguir. Em algumas modalidades, os domínios dimerizados CH3 de Fc heterodimérico tem uma temperatura de fusão (Tm), como medida por calorimetria diferencial de varrimento (DSC) de cerca de 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77,5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, ou 85 ° C ou superior. Em algumas modalidades, o Fc dimérico é um heterodímero formado com uma pureza superior a cerca de 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% quando produzido; ou em que Fc é um heterodímero formado com uma pureza superior a cerca de 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% quando expresso ou quando expresso através de uma única célula.

[00159] Em alguns aspectos, Fc compreende uma ou mais modificações em pelo menos uma das sequências CH3. Em alguns aspectos, o Fc compreende uma ou mais modificações, em pelo menos uma das sequências CH2.

[00160] Em alguns aspectos, Fc é um Fc descrito nos pedidos de patente PCT/CA2011/001.238, depositado em 4 de novembro de 2011 ou PCT/CA2012/050,780, depositado em 2 de novembro de 2012, toda a divulgação de cada um dos quais sendo aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.

[00161] Em alguns aspectos, um constructo Fc aqui descrito compreende um Fc heterodimérico que compreende um domínio CH3 modificado que tenha sido modificado de forma assimétrica. O Fc heterodimérico pode compreender dois polipeptídeos de domínio constante de cadeia pesada: um polipeptídeo primeiro de cadeia pesada e um segundo polipeptídeo de cadeia pesada, que pode ser usado indiferentemente desde que Fc compreenda um polipeptídeo de cadeia pesada primeiro e um segundo polipeptídeo de cadeia pesada. Geralmente, o primeiro polipeptídeo de cadeia pesada compreende uma primeira sequência CH3 e o segundo polipeptídeo de cadeia pesada compreende uma segunda sequência CH3.

[00162] Duas sequências CH3 que compreendem uma ou mais modificações de aminoácidos introduzidos de uma forma assimétrica resultam geralmente numa heterodimérica Fc, em vez de um homodímero, quando as duas sequências CH3 dimerizam. Tal como aqui utilizado, o termo "modificações de aminoácidos assimétricos" refere-se a qualquer modificação em que um aminoácido numa posição específica numa primeira sequência CH3 é diferente do aminoácido de uma segunda sequência de CH3 na mesma posição, e a primeira e segunda sequência CH3 preferencialmente emparelham para formar um heterodímero, em vez de um homodímero. Esta heterodimerização pode ser um resultado da modificação de apenas um dos dois aminoácidos na mesma posição respectiva de aminoácidos em cada sequência; ou modificação de ambos os aminoácidos em cada sequência na mesma posição respectiva em cada uma da primeira e segunda sequências de CH3. A primeira e segunda sequência CH3 de um Fc heterodimérico pode compreender uma ou mais do que uma modificação de aminoácido assimétrica.

[00163] Tabela X fornece a sequência de aminoácidos de uma sequência de IgG1 Fc humana, que corresponde aos aminoácidos 231 a 447 de uma cadeia pesada de IgG1 humana de comprimento completo. A sequência CH3 compreende aminoácidos 341-447 da IgG1 humana de cadeia pesada de comprimento total. Tipicamente, um Fc pode incluir duas sequências de cadeia pesada contíguas (A e B) que são capazes de dimerizá-la. Em alguns aspectos, uma ou ambas as sequências de um Fc incluem uma ou mais mutações ou modificações nos seguintes locais: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400 e/ou N390, usando numeração da UE. Em alguns aspectos, um Fc inclui uma sequência mutante mostrada na Tabela X. Em alguns aspectos, um Fc inclui as mutações da variante 1 A-B. Em alguns aspectos, um Fc inclui as mutações da variante 2 A-B. Em alguns aspectos, um Fc inclui as mutações da variante 3 A-B. Em alguns aspectos, um Fc inclui as mutações da variante 4 A-B. Em alguns aspectos, um Fc inclui as mutações da variante 5 A-B.TABELA X Sequência de Fc exemplar e modificações de CH3

[00164] A primeira e segunda sequências CH3 podem compreender mutações de aminoácidos como aqui descrito, com referência aos aminoácidos 231 a 447 da cadeia pesada de IgG1 humana de comprimento completo. Numa modalidade, o Fc heterodimérico compreende um domínio CH3 modificado com uma primeira sequência CH3 possuindo modificações de aminoácidos em posições F405 e Y407, e uma segunda sequência CH3 possuindo modificações de aminoácidos em posição T394. Numa modalidade, o Fc heterodimérico compreende um domínio CH3 modificado com uma primeira sequência CH3 possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos selecionadas a partir de L351Y, F405A, e Y407V, e a segunda sequência CH3 possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos selecionadas a partir de T366L, T366I, K392L, K392M e T394W.

[00165] Numa modalidade, um construto de Fc compreende um Fc heterodimérico que compreende um domínio CH3 modificado com uma primeira sequência CH3 possuindo modificações de aminoácidos nas posições L351, F405 e Y407, e uma segunda sequência CH3 possuindo modificações de aminoácidos em posições T366, K392 e T394, e uma das primeiras ou segunda sequências CH3 compreendendo ainda modificações de aminoácidos na posição Q347, e a outra sequência de CH3, que compreende ainda a modificação de aminoácido na posição K360. Noutra modalidade, um Fc heterodimérico compreende um domínio CH3 modificado com uma primeira sequência CH3 possuindo modificações de aminoácidos nas posições L351, F405 e Y407, e uma segunda sequência CH3 possuindo modificações de aminoácidos na posição T366, K392, e T394, uma das sequências CH3 primeira ou segunda compreendendo ainda modificações de aminoácidos na posição Q347, e a outra sequência de CH3 compreende ainda a modificação de aminoácido na posição K360, e uma ou ambas das referidas sequências CH3 compreende ainda a modificação T350V de aminoácido.

[00166] Numa modalidade, um construto de Fc aqui proporcionado compreende um Fc heterodimérico que compreende um domínio CH3 modificado com uma primeira sequência CH3 possuindo modificações de aminoácidos nas posições L351, F405 e Y407, e uma segunda sequência CH3 possuindo modificações de aminoácidos em posições T366, K392, e T394 e uma das referidas sequências CH3 primeira e segunda, que compreende ainda a modificação de aminoácidos D399R ou D399K e a outra sequência CH3 compreendendo um ou mais de T411E, T411D, K409E, K409D, K392E e K392D. Noutra modalidade, um Fc heterodimérico compreende um domínio CH3 modificado com uma primeira sequência CH3 possuindo modificações de aminoácidos nas posições L351, F405 e Y407, e uma segunda sequência CH3 possuindo modificações de aminoácidos em posições T366, K392, e T394, uma das referidas sequências CH3 primeira e a segunda compreende ainda a modificação de aminoácidos D399R ou D399K e a outra sequência CH3 compreendendo um ou mais de T411E, T411D, K409E, K409D, K392E e K392D, e uma ou ambas das referidas sequências CH3 compreendendo ainda a modificação de aminoácido T350V.

[00167] Numa modalidade, um Fc heterodimérico compreende um domínio CH3 modificado com uma primeira sequência CH3 possuindo modificações de aminoácidos nas posições L351, F405 e Y407, e uma segunda sequência CH3 possuindo modificações de aminoácidos em posições T366, K392, e T394, em que uma ou ambas as referidas sequências CH3 compreendem ainda a alteração de aminoácidos T350V.

[00168] Numa modalidade, um Fc heterodimérico compreende um domínio CH3 modificado compreendendo as seguintes modificações de aminoácidos, em que "A" representa as modificações de aminoácidos para a primeira sequência de CH3, e "B" representa as modificações de aminoácidos para a segunda sequência CH3: A:L351Y_F405A_Y407V, B:T366L_K392M_T394W, A:L351Y_F405A_Y407V, B:T366L_K392L_T394W,A:T350V_L351Y_F405A_Y407V, B:T350V_T366L_K392L_T394W, A:T350V_L351Y_F405A_Y407V, B:T350V_T366L_K392M_T394W, A:T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V, e/ouB:T350V_T366L_N390R_K392M_T394W.

[00169] As modificações de um ou mais aminoácidos assimétricos pode promover a formação de um Fc heterodimérico em que o domínio CH3 heterodimérico tem uma estabilidade que é comparável a um domínio CH3 homodimérico de tipo selvagem. Numa modalidade, uma ou mais modificações assimétricas de aminoácidos promovem a formação de um domínio de Fc heterodimérico em que o domínio de Fe heterodimérico tem uma estabilidade que é comparável à de um domínio de Fc homodimérico de tipo selvagem. Numa modalidade, as uma ou mais modificações assimétricas de aminoácidos promovem a formação de um domínio de Fc heterodimérico em que o domínio de Fc heterodimérico tem uma estabilidade observada através da temperatura de fusão (Tm) em um estudo de calorimetria de varrimento diferencial, e em que a temperatura de fusão é dentro de 4°C do que a observada para o domínio de tipo selvagem de Fc homodimérica simétrico correspondente. Em alguns aspectos, o Fc compreende uma ou mais modificações, em pelo menos uma das sequências CH3 que promovem a formação de um Fc heterodimérico com estabilidade comparável a um Fc homodimérico de tipo selvagem.

[00170] Numa modalidade, a estabilidade do domínio CH3 pode ser avaliada através da medição da temperatura de fusão do domínio CH3, por exemplo, por calorimetria de varrimento diferencial (DSC). Assim, numa outra modalidade, o domínio CH3 tem uma temperatura de fusão de cerca de 68°C ou superior. Numa outra modalidade, o domínio CH3 tem uma temperatura de fusão de cerca de 70°C ou superior. Numa outra modalidade, o domínio CH3 tem uma temperatura de fusão de cerca de 72°C ou superior. Numa outra modalidade, o domínio CH3 tem uma temperatura de fusão de cerca de 73°C ou superior. Numa outra modalidade, o domínio CH3 tem uma temperatura de fusão de cerca de 70°C ou superior. Numa outra modalidade, o domínio CH3 tem uma temperatura de fusão de cerca de 7 8°C ou superior. Em alguns aspectos, as sequências dimerizadas CH3 têm uma temperatura de fusão (Tm) de cerca de 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77,5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, ou 85 ° C ou mais alto.

[00171] Em algumas modalidades um construto de Fc compreendendo um Fc heterodimérico que compreende ainda sequências CH3 modificadas pode ser formado com um grau de pureza de pelo menos cerca de 75% em comparação com Fc homodimérico no produto expresso. Em outra modalidade, o Fc heterodimérico é formado com um grau de pureza superior a cerca de 80%. Em outra modalidade, o Fc heterodimérico é formado com um grau de pureza superior a cerca de 85%. Em outra modalidade, o Fc heterodimérico é formado com um grau de pureza superior a cerca de 90%. Em outra modalidade, o Fc heterodimérico é formado com um grau de pureza superior a cerca de 95%. Em outra modalidade, o Fc heterodimérico é formado com um grau de pureza superior a cerca de 97%. Em alguns aspectos, o Fc é um heterodímero formado com uma pureza superior a cerca de 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% quando expresso. Em alguns aspectos, Fc é um heterodímero formado com uma pureza superior a cerca de 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99%, quando expresso por meio de uma única célula.

[00172] Métodos adicionais para a modificação de polipeptídeos Fc monoméricos para promover a formação de Fc heterodimérico são descritos na Publicação de Patente Internacional N° WO 96/027011 (puxadores em buracos), em Gunasekaran et al. (Gunasekaran K. et al. (2010) J Biol Chem. 285, 19637-46, projeto eletrostático para alcançar heterodimerização seletiva), em Davis et al. (Davis, JH. et al. (2010) Prot Eng Des Sel; 23(4): 195-202, tecnologia de domínio projetado de permuta de filamento (SEED)), e em Labrijn et al [Efficient generation of stable bi-specific IgG1 by controlled Fabarm exchange. Labrijn AF, Meesters JI, de Goeij BE, van den Bremer ET, Neijssen J, van Kampen MD, Strumane K, Verploegen S, Kundu A, Gramer MJ, van Berkel PH, van de Winkel JG, Schuurman J, Parren PW. Proc Natl Acad Sci US A. 2013 26 de março; 110 (13): 5145-50.

3. Características funcionais dos heteromultímeros

[00173] Os heteromultímeros de acordo com o invento exibem muito reduzida/ablacionada ligação a FcyRs e a C1q. Além disso, em certas modalidades, os heteromultímeros também exibem propriedades desejáveis adicionais tais como a estabilidade, a capacidade de se ligar ao FcRn, e propriedades que facilitam a purificação dos produtos de expressão desejados a partir de produtos não desejados ou impurezas.

[00174] Numa modalidade, a presente invenção contempla um heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc que não se liga de forma mensurável a receptores de FcyR, mas não se liga ao FcRn, o que o torna um candidato desejado para aplicações em que a semivida do anticorpo in vivo é importante embora funções efetoras (tais como CDC, ADCC e ADCP) são desnecessárias ou deletérias.

[00175] Os métodos para determinar a capacidade dos heteromultímeros compreendendo construtos de IgG Fc quer se ligam a FcyRs ou C1q são conhecidos na técnica e descritos em outra parte, aqui.

3a. Redução/ablação de ligação a FcyR e complemento

[00176] Os heteromultímeros de acordo com o invento exibem reduzida/ablacionada ligação a FcyR e C1q em comparação com o polipeptídeo de origem. Numa modalidade, o heteromultímero de acordo com a invenção apresenta KDS para FcyRs e C1q que são pelo menos 5 vezes maiores do que os KD do polipeptídeo de origem. Numa outra modalidade, o heteromultímero de acordo com a invenção apresenta KDs para FcyRs e C1q que são pelo menos 10 vezes maiores do que o do polipeptídeo de origem, tal como medido por ensaios de ligação conhecidos na técnica. Os ensaios de ligação conhecidos na técnica, incluem, mas não estão limitados a ensaios baseados em FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) e BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), AlphaScreen™ (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), Ensaio de Proximidade de Cintilação, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), SPR (Surface Plasmon Resonance, também conhecido como Biacore™), calorimetria de titulação isotérmica, calorimetria de varrimento diferencial, eletroforese em gel, e cromatografia incluindo filtração em gel. Estes e outros métodos podem tirar partido de algum parceiro de fusão ou o marcador do anticorpo. Os ensaios podem utilizar uma variedade de métodos de detecção incluindo, mas não se limitando a cromogênico, fluorescente, luminescente, marcadores isotópicos.

[00177] Numa modalidade, o heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc tem um KD maior do que 5 μM para FcyRIIaH, um KD superior a 10 μM para FcyRIIaR, um KD superior a 30 μM para FcyRIIB, um KD maior do que 20 μM para FcyRIIIaF, um KD superior a 6 μM para FcyRIIIaV, e um KD superior a 6,5 nM para FcyRIa, tal como medido por ressonância de plasma de superfície (SPR). Numa outra modalidade, o heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc tem um KD superior a 10 μM para FcyRIIaH, um KD superior a 10 μM para FcyRIIaR, um KD superior a 10 μM para FcyRIIB, um KD superior a 6 μM para FcyRIIIaF, um KD superior a 6 μM para FcyRIIIaV, um KD maior do que 30 nM para FcyRIa, e não se liga a C1q, como medido por ressonância de plasma de superfície (SPR).

[00178] Numa modalidade, os heteromultímeros compreendendo um construto de IgG Fc não exibem níveis detectáveis de ADCC, ADCP, e CDC, conforme medido por ensaios convencionais. Exemplos não limitativos de ensaios padrão para testar a função efetora incluem aqueles descritos nos exemplos fornecidos aqui.

3b. Estabilidade

[00179] As propriedades biofísicas dos heteromultímeros incluindo por exemplo a estabilidade, são avaliadas utilizando uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A estabilidade da proteína pode ser determinada medindo o equilíbrio termodinâmico entre estados dobrado e desdobrado. Por exemplo, heteromultímeros do presente invento podem ser desdobrados utilizando química desnaturante, calor, ou o pH, e esta transição pode ser monitorizada utilizando métodos incluindo, mas não se limitando a espectroscopia de Dicroísmo Circular, espectroscopia de fluorescência, espectroscopia de absorvância, espectroscopia de RMN, calorimetria e proteólise. Como será apreciado por aqueles versados técnica, os parâmetros cinéticos das transições de dobramento e desdobramento também podem ser monitorizados utilizando estas e outras técnicas. A solubilidade e a integridade estrutural global dos heteromultímero pode ser determinada qualitativamente ou quantitativamente, utilizando uma ampla variedade de métodos que são conhecidos na técnica.

[00180] Os métodos que podem ser utilizados para caracterizar as propriedades biofísicas de heteromultímeros incluem eletroforese em gel, focagem isoelétrica, eletroforese capilar, cromatografia, tal como cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, e cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa, mapeamento dos peptídeos, mapeamento de oligossacarídeos, espectrometria em massa, espectroscopia de absorção de ultravioletas, a espectroscopia de fluorescência, espectroscopia de Dicroísmo Circular, calorimetria de titulação isotérmica, calorimetria de varredura diferencial, análise de ultracentrifugação, dispersão dinâmica de luz, proteólise, e a ligação cruzada, a medição da turbidez, os ensaios de retardação de filtro, ensaios imunológicos, ensaios de ligação de corante fluorescente, ensaios proteína-colorantes, microscopia e detecção de agregados através de ELISA ou outro ensaio de ligação. A análise estrutural de raios X utilizando técnicas cristalográficas e espectroscopia de RMN podem também encontrar utilização. Numa modalidade, a estabilidade e/ou solubilidade pode ser medida pela determinação da quantidade de solução de proteína após um período de tempo definido. Neste ensaio, a proteína pode ou não ser exposta a condições extremas, por exemplo, a temperatura elevada, pH baixo, ou a presença do desnaturante. Porque a função normalmente requer uma proteína estável, solúvel e/ou bem-dobrada/estruturada, os ensaios funcionais e de ligação acima mencionados também fornecem maneiras de realizar tal medição. Por exemplo, uma solução que compreende um heteromultímero podia ser testada quanto à sua capacidade de se ligar ao antígeno alvo, em seguida, exposta a uma temperatura elevada durante um ou mais períodos de tempo definidos, em seguida, ensaiada quanto a ligação ao antígeno de novo. Como não se espera que a proteína desdobrada e agregada seja capaz de ligação ao antígeno, a quantidade de atividade restante fornece uma medida da estabilidade do anticorpo e solubilidade.

[00181] Numa modalidade, os heteromultímeros compreendendo um construto de IgG Fc são estáveis como medidos pela temperatura de fusão de um ou mais domínios do heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc. A temperatura de fusão dos heteromultímeros pode ser determinada de acordo com métodos conhecidos na técnica e descritos em mais pormenor noutra parte deste documento. Por exemplo, a temperatura de fusão dos heteromultímeros pode ser determinada por calorimetria de varredura diferencial (DSC), e um termograma do heteromultímero gerado. Numa modalidade, o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc, em que o início de fusão do construto de IgG Fc num termograma é maior do que ou igual a 65°C. Numa modalidade, o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc, em que o início de fusão do construto de lgG Fc num termograma é maior do que ou igual a 66°C. Numa modalidade, o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc, em que o início de fusão de IgG Fc construir num termograma é maior do que ou igual a 68°C. Numa modalidade, o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc, em que o início de fusão do construto de IgG Fc num termograma é maior do que ou igual a 70°C.

[00182] Numa outra modalidade, o heteromultímero compreende um construto IgG Fc, em que o construto de IgG Fc tem um domínio CH2 com uma temperatura de fusão que é maior do que ou igual à temperatura de fusão do domínio CH2 do polipeptídeo de origem ou anticorpo. Numa modalidade o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc, em que o construto de lgG Fc tem um domínio CH2 com uma temperatura de fusão que é de cerca de 1 a 2°C superior à temperatura de fusão do domínio CH2 de origem. Numa modalidade o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc, em que o construto de IgG Fc tem um domínio CH2 com uma temperatura de fusão que é de cerca de 2 a 3°C superior à temperatura de fusão do domínio CH2-mãe. Numa modalidade, o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc, em que o construto de lgG Fc tem um domínio CH2 com uma temperatura de fusão que é de cerca de 1 a 2°C superior à temperatura de fusão do domínio CH2 de origem, em que o heteromultímero compreende as modificações de aminoácidos exemplificados por AAC4 e AAC5. Numa modalidade, o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc, em que construto de lgG Fc tem um domínio CH2 com uma temperatura de fusão que é de cerca de 2 a 3°C superior à temperatura de fusão do domínio CH2 de origem, em que o heteromultímero compreende as modificações de aminoácidos exemplificados por AAC2, AAC9, AAC10, AAC11, AAC12, AAC13, AAC14 e AAC15. Numa outra modalidade, o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc, em que o construto de lgG Fc tem um domínio CH2 com uma temperatura de fusão que é de cerca de 4°C superior à temperatura de fusão do domínio CH2 de origem, em que o heteromultímero compreende as modificações de aminoácidos exemplificadas por AAC6.

3c. Ligação a FcRn

[00183] Como é conhecido na técnica, a ligação a FcRn recicla anticorpo endocitosado do endossoma de volta para a corrente sanguínea (Raghavan et al, 1996, Annu Rev celular Dev Biol. 12: 181-220; Ghetie et al, 2000, Annu Rev Immunol 18: 739-766). Este processo, juntamente com o impedimento de filtração do rim devido ao grande tamanho da molécula de comprimento completo, resulta em meias-vidas no soro de anticorpo favoráveis variando de uma a três semanas. A ligação de Fc para FcRn também desempenha um papel chave no transporte de anticorpo. Assim, numa modalidade, os heteromultímeros da invenção são capazes de se ligar ao FcRn.

4. Formato de heteromultímero 4a Os domínios de ligação ao antígeno

[00184] Numa modalidade, o heteromultímero de acordo com o invento consiste apenas de um construto de IgG Fc. Em outras modalidades, o heteromultímero de acordo com a invenção compreende um construto IgG Fc e um ou mais domínios de ligação a antígeno. Numa modalidade, o heteromultímero de acordo com a invenção compreende um construto IgG Fc e um domínio de ligação ao antígeno. Numa outra modalidade, o heteromultímero de acordo com a invenção compreende um construto IgG Fc e dois domínios de ligação ao antígeno. Numa outra modalidade, o heteromultímero de acordo com a invenção compreende um construto IgG Fc e três domínios de ligação ao antígeno. Numa outra modalidade, o heteromultímero de acordo com a invenção compreende um construto IgG Fc e quatro domínios de ligação ao antígeno. Numa outra modalidade, o heteromultímero de acordo com a invenção compreende um construto IgG Fc e até seis domínios de ligação ao antígeno.

[00185] Os domínios de ligação ao antígeno podem ser fundidos com o construto de lgG Fc de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00186] Numa modalidade, o heteromultímero de acordo com a invenção compreende um construto de IgG Fc compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, em que o pelo menos um domínio de ligação ao antígeno é selecionado a partir de um Fragmento de Fab, um scFv, um sdAb, um peptídeo de ligação ao antígeno, uma proteína de fusão de Fc, ou um domínio de proteína capaz de se ligar a um antígeno.

[00187] Numa modalidade, o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, em que o domínio de pelo menos um antígeno de ligação se liga a um antígeno alvo selecionado a partir de αcadeia (CD25) de IL-2R, beta-amiloide, EpCAM, CD3, BLyS (ou BAFF), CD11a, CD20, CD22, CD23, CD3, CD4, CD52, CD80, CTLA-4, EGFR, proteína F de RSV, G250, glicoproteína Ilb/IIIa R, HER2, receptor de HER2/neu, Hsp90, o anticorpo IgE, IL-12/IL-23, IL-lβ, IL-5, IL-6 receptor, integrina alfa-4/beta-1, mucina 16/CA-125, L RAN, TNF alfa, VEGF-A, e outros alvos terapeuticamente vantajosos.

[00188] Em uma encarnação, o heteromultímero é composto por um construto de IgG Fc com um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, cada polipeptídeo Fc constituindo uma região de dobradiça modificada, onde o heteromultímero é derivado de um anticorpo monoclonal humanizado com potencial terapêutico, selecionados a partir de: alemtuzumab, apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bevacizumab, bivatuzumab, mertansina, cantuzumab mertansina, cedelizumab, pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab,daclizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab , felvizumab, fontolizumab, Gentuzumab ozogamicina, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, teleterapia,mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, pascolizumab, pecfusituzumab, pectuzumab, Pertuzumabe, pexelizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resyvizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, tacatuzumab tetraxetan, tadocizumab, talizumab, tefibazumab,tocilizumab, toralizumab, Trastuzumabe, tucotuzumab celmoleukin, tucusituzumab, umavizumab, urtoxazumab e visilizumab.

[00189] Numa outra modalidade, o heteromultímero compreende um construto de IgG Fc derivado de um anticorpo terapêutico, tais como, por exemplo, rituximab ou trastuzumab.

4b. Conjugados de Anticorpo-droga

[00190] É ainda contemplado que o heteromultímero de acordo com a invenção pode compreender uma ou mais moléculas de droga tóxicas ligadas ao construto de IgG Fc e/ou a outros domínios do heteromultímero. Moléculas de droga tóxicas incluem substâncias que inibem ou impedem a função de células e/ou causam destruição de células. Numa modalidade, as uma ou mais moléculas de droga tóxicas podem ser ligadas a um heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc. Em outra modalidade, as uma ou mais moléculas de droga tóxicas as podem ser ligadas a um heteromultímero compreendendo um construto de IgG Fc e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno. Moléculas de droga tóxicas adequadas que podem ser ligadas ao construto de lgG Fc são selecionadas a partir de isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos, e toxinas tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem animal bacteriana, fúngica, vegetal ou, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos.

[00191] Agentes quimioterápicos apropriados que podem ser vinculados ao construto de lgG Fc são selecionados dos agentes alquilantes como tiotepa e CYTOXAN® ciclosfosfamida; perfluorooctanossulfonatos de alquila como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenefosphoramida, triethilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9- tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); Beta-lapachona; lapachol; colchicina; ácido betulínico; camptotecina (incluindo o topotecano análogo sintético (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecano, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina e aminocamptotecina- 9); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos, adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio como o clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos tais como antibióticos de endiina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma1I e caliqueamicina omegaI1 (ver, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo A dinemicina; uma esperamicina; assim como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de enediina de cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina,cromomicinis, dactinomicina, daunorrubicina, detortubicina, 6- diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo ADRIAMICINA®, morfolinos-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2- pirrolino-doxorrubicina, injeção de lipossomas de HCl doxorrubicina (DOXIL®) e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tais como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), uma epotilona, e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforçador de ácido fólico, ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; Amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinano; lonidainina; maitansinóides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2- etilhidrazida; Procarbazina; PSK ® polissacarídeo complexo (JHS Natural Products, Eugene, Oregon); razoxana; didesidrorrizoxina; sizofurano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2, 2’, 2"-triclorotrietylamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, A verracurina, A roridina e anguidina); Uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); Dacarbazina; Manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, por exemplo, o paclitaxel (TAXOL®), formulação de nanopartículas de albumina-engenharia de paclitaxel (ABRAXANE™) e doxetaxel (TAXOTERE®); cloranbucil; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como a cisplatina e carboplatina; vimblastina (VELBAN ®); platina; Etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (BACOD ®); Oxaliplatina; leucovovin; Vinorelbina (NAVELBINE®); Novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; Ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides tais como ácido retinóico; sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima tal como CHOP, uma abreviatura para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviatura para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN ™) combinado com 5- FU e leucovovina

4c. peptídeos ou polipeptídeos heterólogos

[00192] É ainda contemplado que os heteromultímeros de acordo com a invenção compreendem um construto de IgG Fc que está ligado a um ou mais peptídeos ou polipeptídeos heterólogos. O peptídeo de um ou mais polipeptídeos heterólogos ou é selecionado de, por exemplo, um marcador detectável, um membro de um par ligante-receptor, um membro de um par enzima-substrato e um membro de um par de transferência de energia de ressonância de fluorescência.

5. Métodos de preparação e purificação de heteromultímeros

[00193] Como descrito acima, o heteromultímero de acordo com a invenção compreende um construto de IgG Fc compreendendo um primeiro e um segundo polipeptídeo de Fc. Ambos os polipeptídeos Fc podem ser facilmente preparados utilizando tecnologia de DNA recombinante conhecida na técnica, quer em modalidades em que o heteromultímero compreende uma região IgG Fc isoladamente, ou em modalidades em que os heteromultímeros compreendem ainda um ou mais domínios de ligação ao antígeno ou proteínas heterólogas. O projeto de ácido nucleico que codificam tais moléculas está perfeitamente dentro do conhecimento comum daqueles versados na técnica. As técnicas convencionais, tais como, por exemplo, aquelas descritos em Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 3a ed., 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2a ed., 1989);Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., John Wiley and Sons, New York, 4a ed., 1999); e Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 2a ed., 1998) podem ser utilizadas para métodos de ácidos nucleicos recombinantes, síntese de ácido nucleico, cultura de células, a incorporação do transgene, e a expressão da proteína recombinante.

[00194] Como indicado noutras partes deste documento, as sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos dos polipeptídeos Fc derivadas da cadeia pesada de IgG são conhecidas na técnica ou podem ser prontamente determinadas utilizando métodos de sequenciação de proteínas e/ou ácido nucleico. Métodos de fundir geneticamente as proteínas heterólogas ou moléculas de droga tóxicas aqui descritas para os polipeptídeos Fc são conhecidos na técnica, e alguns são descritos abaixo e nos Exemplos.

[00195] Os vetores de expressão e células hospedeiras adequadas para expressão dos polipeptídeos Fce, onde polipeptídeos que codificam domínios necessários de ligação ao antígeno também são bem conhecidos na técnica, tal como descrito abaixo.

5.1 Vetores e células hospedeiras

[00196] A expressão recombinante de polipeptídeos do heteromultímero requer o construto de um vector de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos necessários. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo tenha sido obtido, o vetor para a produção do polipeptídeo pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. Assim, os métodos para a preparação de uma proteína pela expressão de um polinucleotídeo contendo uma sequência nucleotídica codificadora de anticorpo são descritos neste documento. Os métodos que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para construir os vetores de expressão contendo as sequências codificadoras de polipeptídeo e sinais de controle transcricionais e traducionais apropriados. Esses métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. A invenção, portanto, proporciona vetores replicáveis que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica os polipeptídeos do heteromultímero, operativamente ligado a um promotor.

[00197] O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira através de técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadas através de técnicas convencionais para produzir o polipeptídeo para o uso no método da invenção. Em modalidades específicas os polipeptídeos para uso no método são co- expressos na célula hospedeira para a expressão de uma molécula de imunoglobulina inteira, tal como detalhado abaixo.

[00198] Uma variedade de sistemas hospedeiro-vector de expressão pode ser utilizada para expressar os polipeptídeos. Tais sistemas de expressão no hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências codificadoras de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências nucleotídicas codificadoras apropriadas, expressam uma os polipeptídeos in situ. Estes incluem mas não estão limitados aos microorganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformados com DNA recombinante do bacteriófago, plasmídeo ou vetores de expressão de DNA de cosmídeo contendo as sequências de codificação de polipeptídeo; levedura (por exemplo, Saccharomyces Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinante contendo modificadas sequências de codificação de cadeia leve e pesada; sistemas de células de inseto infectados com vetores de expressão de recombinação do vírus (por exemplo, baculovirus) contendo sequências de codificação de polipeptídeo; sistemas de células de plantas infectadas com vetores de expressão recombinante do vírus (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, do plasmídeo Ti) contendo sequências de codificação de polipeptídeo; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, células COS, CHO, BHK, HEK- 293, NSO e 3T3) abrigando construtos de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor do vírus vaccinia 7,5 K). Em certas modalidades, as células bacterianas tais como Escherichia coli, ou células eucarióticas, são usadas para a expressão do polipeptídeo, que são moléculas de anticorpo ou proteína de fusão recombinante. Por exemplo, células de mamíferos, tais como as células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), em conjunto com um vetor, como o elemento do promotor do gene inicial intermediário principal do citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos; ver, por exemplo (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; e Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). Numa modalidade específica, a expressão de sequências de nucleotídeos que codificam as cadeias pesadas e leves de imunoglobulina de cada heterodímero é regulada por um promotor constitutivo, indutível ou promotor específico do tecido do promotor.

[00199] Em células hospedeiras de mamíferos, um número de sistemas de expressão com base viral pode ser utilizado. Nos casos em que um adenovírus é usado como um vetor de expressão, as sequências de codificação da cadeia pesada e leve modificadas de interesse podem ser ligadas a um complexo adenoviral de transcrição/tradução de controle, por exemplo, o promotor tardio e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico então pode ser inserido no genoma de adenovírus pela in vitro ou na recombinação de vivo. A inserção numa região não essencial do genoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) resultará num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar o polipeptídeo em hospedeiros infectados (por exemplo, ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 81: 355-359). Os sinais de iniciação específicos também podem ser necessários para a tradução eficiente das sequências que codificam anticorpos inseridos. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Além disso, o codão de iniciação deve estar em fase com o quadro de leitura da sequência de codificação desejada para assegurar a tradução de toda a inserção. Estes sinais de controle traducionais exógenos e codões de iniciação podem ser de uma variedade de origens, tanto naturais como sintéticas. A eficiência da expressão pode ser reforçada pela inclusão de elementos intensificadores da transcrição adequados, terminadores de transcrição, etc. (ver, por exemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544).

[00200] A expressão dos polipeptídeos dos heteromultímeros pode ser controlada por qualquer elemento promotor ou estimulador conhecido na técnica. Os promotores que podem ser utilizados para controlar a expressão do gene que codifica polipeptídeo incluem, mas não estão limitados à região do promotor inicial de SV40 (Bernoist e Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), o promotor contido na repetição de 3' de extensão terminal do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto, et al, 1980, Cell. 22: 787-797), o promotor da timidina- cinase da herpes (Wagner et al, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 78,1441-1445), as sequências reguladoras do gene de metalotioneína (Brinster et al, 1982, Nature 296: 39-42.), o promotor tetraciclina (Tet) (Gossen et al, 1995, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 89: 5547-5551); vectores de expressão procarióticos tais como o promotor β-lactamase (Villa-Kamaroff et al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 75: 37273731), ou o promotor tac (DeBoer et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 80: 21-25; Consulte também "Useful proteins from recombinant bacteria", em Scientific American, 1980, 242: 74-94); vetores de expressão de plantas compreendendo a região promotora da nopalina sintetase (Herrera-Estrella et al, Nature 303:. 209-213) ou o promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S do RNA (Gardner et al, 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871), e o promotor da enzima fotossintética ribulose bifosfato-carboxilase (Herrera-Estrella et al, 1984, Nature 310: 115-120); elementos promotores de levedura ou outros fungos tais como o promotor Gal 4, o promotor ADC (álcool- desidrogenase), PGK (fosfoglicerol cinase), promotor alcalino promotor da fosfatase, e as seguintes regiões de controle transcricional de animais, que exibem especificidade do tecido e têm sido utilizados em animais transgénicos: região elastase de gene I de controle que é ativa em células pancreáticas de acinar (Swift et al, 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al, 1986, Cold Spring Harbor Symp... Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); região de controle do gene da insulina que é ativa em células pancreáticas beta (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122), região de controle do gene da imunoglobulina que é ativa em células linfoides (Grosschedl et al, 1984, Cell 38: 647-658.; Adames et al, 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al, 1987, Mol... Cell. Biol. 7: 1436-1444), região de controle do vírus do tumor mamário do camundongo que é ativa em células testiculares, da mama, linfoides e mastócitos (Leder et al, 1986, Cell. 45: 485-495), região de controle do gene da albumina que é ativa no fígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devei. 1: 268-276), região do gene da alfa- fetoproteína de controle que está ativa no fígado (Krumlauf et al, 1985, Mol. Biol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al, 1987, Science 235:. 53-58; região de controle do gene da alfa-1- antitripsina que é ativa no fígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devei. 1: 161-171), região do gene da beta-globina de controle que é ativa nas células mielóides (Mogram et al, 1985, Nature 315: 338340; Kollias et al, 1986, Cell 46: 89-94; região de controle do gene da proteína básica de mielina que é ativa em células de oligodendrócitos no cérebro (Readhead et al, 1987, Cell. 48: 703-712); região de controle do gene de cadeia leve-2 de miosina que é ativa no músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); enolase específica neuronal (NSE), que é ativa em células neuronais (Morelli et al, 1999, Gen. Virol. 80: 571-83); região de controle do gene derivado do fator neurotrófico (BDNF) do cérebro que é ativa em células neuronais (Tabuchi et al., 1998, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253: 818-823); promotor de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) que é ativo em astrócitos (Gomes et al, 1999, Braz J Med Biol Res 32 (5).: 619-631; Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80: 571-83) e a região de controle gene do hormônio de liberação gonadotrópica que é ativa no hipotálamo (Mason et al, 1986, Science 234:. 1372-1378).

[00201] Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida, a qual modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processa o produto do gene da forma específica desejada. Expressão de determinados promotores pode ser elevada na presença de determinados indutores; assim, expressão da proteína de fusão projetada geneticamente pode ser controlada. Além disso, células hospedeiras diferentes possuem características e mecanismos específicos para o processamento de tradução e pós-tradução e modificação (por exemplo, a glicosilação, fosforilação de proteínas.) As linhagens celulares apropriadas ou sistemas de hospedeiro podem ser escolhidos para garantir a modificação e o processamento desejados da proteína estrangeira expressa. Por exemplo, a expressão num sistema bacteriano produzirá um produto não glicosilado e expressão em levedura produzirá um produto glicosilado. Podem ser usadas células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para o processamento apropriado do transcrito primário (glicosilação e fosforilação) do produto do gene. Tais células hospedeiras de mamífero incluem, mas não estão limitadas a, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, células HEK-293, 3T3, WI38, NSO, e em particular, linhas de células neuronais, tais como, por exemplo, neuroblastomas humanos SK-N-AS, SK-N-FI, SK-N-DZ (Sugimoto et al., 1984, J. Natl. Cancer Inst. 73: 51-57), neuroblastoma humano de SK-N-SH (Biochim. Biophys. Acta, 1982, 704: 450-460), meduloblastoma Daoy do cerebelo humano (He et al., 1992, Cancer Res. 52: 1144-1148) células DBTRG-05MG de glioblastoma (Kruse et al., 1992, In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A: 609-614), células IMR- 32 de neuroblastoma humano (Cancer Res., 1970, 30: 2110-2118), astrocitoma humano 1321 N1 (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1977, 74: 4816), astrocitoma humana MOG-G-CCM (Br J. Cancer, 1984, 49: 269), humana glioblastoma-astrocitoma U87MG (Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1968, 74: 465-486), o glioblastoma humano A172 (Olopade et al., 1992, Cancer Res. 52: 2523-2529), células de glioma de rato C6 (Benda et al, 1968, Science 161: 370-371), neuroblastoma de Neuro- 2a rato (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1970, 65: 129-136), neuroblastoma de camundongo NB41A3 (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1962, 48: 1184-1190), plexo coróide de ovelhas SCP (Bolin et al., 1994, J. Virol. Métodos 48: 211-221), G355-5, astrócitos normais de gato PG-4 (Haapala et al., 1985, J. Virol. 53 827-833), cérebro de furão Mpf (Trowbridge et al, 1982, In Vitro 18.: 952-960), e linhas celulares normais tais como, por exemplo, córtex cerebral normal CTX TNA2 de rato (Radany et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6467-6471), tais como, por exemplo, CRL7030 e Hs578Bst. Além disso, diferentes sistemas de expressão vector/hospedeiro podem efetuar reações de processamento em diferentes graus.

[00202] A longo prazo, a produção de alto rendimento de proteínas recombinantes de expressão estável é usada. Por exemplo, as linhas celulares que expressam estavelmente o polipeptídeo da invenção (por exemplo, anticorpo ou proteína de fusão) podem ser manipuladas. Ao invés de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com o DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, potenciador, sequências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e um marcador selecionável. No seguimento da introdução do DNA estrangeiro, as células manipuladas podem ser deixadas a crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido, e depois são mudadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem o plasmídeo de forma estável em seus cromossomos e cresçam para formar os foci que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares.

[00203] Um número de sistemas de seleção pode ser usado, incluindo, mas não se limitado aos genes do herpes simplex vírus timidina quinase (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), da hipoxantina- guanina fosforribosiltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) e da adenina fosforribosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) podem ser empregados em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Também, a resistência ao anti- metabólito pode ser usada como a base da seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. EUA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 78: 2072); neo, que confere resistência ao aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); e higro, que confere resistência a genes de higromicina (Santerre et al, 1984, Gene. 30: 147).

[00204] Métodos de Preparação de conjugados anticorpo-droga são conhecidos na técnica e uma descrição dos mesmos encontram-se na Patente US 2011/0200596 Publicação N°. 5.2 Purificação de heteromultímeros

[00205] Quando se utilizam técnicas recombinantes, o heteromultímero pode ser produzido intracelularmente, ou diretamente segregado no meio. Se o heteromultímero é produzido intracelularmente, como um primeiro passo, os detritos particulados, sejam células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Onde o heteromultímero é segregado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer dos passos anteriores para inibir a proteólise e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios.

[00206] A composição de heteromultímeros preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatite, eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer região Fc de imunoglobulina que esteja presente no heteromultímero. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados em Y1 humano, Y2, ou cadeias pesadas de y4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de ratinho e para Y3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). A matriz à qual o ligante de afinidade é ligado é muito frequentemente agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem caudais mais rápidos e tempos de processamento mais curtos do que pode ser conseguido com agarose. Onde os heteromultímeros compreendem um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX ™ (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteínas tais como fraccionamento numa coluna de permuta iónica, precipitação com etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografia sobre sílica, cromatografia em Sepharose™ heparina sobre uma resina de permuta aniônica ou catiônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE, e precipitação com sulfato de amónio estão também disponíveis dependendo do heteromultímero a ser recuperado.

[00207] Após qualquer um dos passos (s) de purificação preliminares, a mistura compreendendo o heteromultímero de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrófoba a pH baixo utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5-4,5, preferivelmente realizada a baixas concentrações de sal (por exemplo, a partir de cerca de 0-0,25 M de sal).

[00208] Os heteromultímeros da presente invenção compreendem modificações de aminoácidos assimétricos no primeiro e segundo polipeptídeos Fc do construto de IgG Fc. Assim, devido às propriedades inerentes dos polipeptídeos Fc, quando os polipeptídeos Fc são expressos em conjunto, os produtos que resultam incluirão homodímeros do primeiro polipeptídeo Fc, homodímeros do segundo polipeptídeo Fc, e heterodímeros do primeiro e do segundo polipeptídeo.

[00209] Numa modalidade, são heteromultímeros purificados ou isolados após expressão. Os métodos de expressão são aqui descritos noutro local. As proteínas podem ser isoladas ou purificadas em uma variedade de formas conhecidas por uma pessoa versada na técnica. Métodos padrão de purificação incluem técnicas cromatográficas, incluindo troca iónica, interação hidrófoba, filtração em gel ou de afinidade de dimensionamento, e de fase reversa, levada a cabo à pressão atmosférica ou a pressão elevada utilizando sistemas tais como FPLC e HPLC. Os métodos de purificação incluem técnicas de eletroforética, imunológica, precipitação, diálise e cromatofocagem. Técnicas de ultrafiltração e diafiltração, em conjunção com a concentração de proteínas, também são úteis. Como é bem conhecido na técnica, uma variedade de proteínas naturais e os anticorpos se ligam a Fc, e estas proteínas podem encontrar utilização na presente invenção para a purificação de heteromultímeros. Por exemplo, as proteínas bacterianas A e G ligam- se à região Fc. Do mesmo modo, a proteína bacteriana L liga-se a região Fab de alguns anticorpos, como, naturalmente, o faz o antígeno alvo do anticorpo. Purificação muitas vezes pode ser ativada por um parceiro de fusão particular. Por exemplo, os anticorpos podem ser purificados usando resina de glutationa se uma fusão de GST é empregue, cromatografia Ni+2afinidade se uma His-tag for utilizada, ou anticorpo imobilizado anti-flag se um marcador Flag é usado. Para orientação geral em técnicas de purificação adequadas, ver, por exemplo, Protein Purification: Principies and Practice, 3a Ed., Scopes, Springer-Verlag, Nova Iorque, 1994, aqui incorporado em sua totalidade por referência. O grau de purificação necessário variará dependendo da triagem ou a utilização dos anticorpos. Em alguns casos não é necessária purificação. Por exemplo, numa modalidade, se os anticorpos são segregados, a triagem pode ser efetuada diretamente a partir do meio. Como é bem conhecido na técnica, alguns dos métodos de seleção não envolvem a purificação de proteínas. Assim, por exemplo, se uma biblioteca de anticorpos é feita para uma biblioteca de apresentação de fagos, a purificação da proteína pode não ser executada.

[00210] Assim, numa modalidade, os heteromultímeros compreendendo um construto de IgG Fc, quando a expressão do referido construto de IgG Fc resulta numa mistura de construto de IgG Fc com regiões homodiméricas Fc e construtos de IgG Fc com regiões heterodiméricas Fc, construtos de IgG Fc com regiões homodiméricas Fc são claramente resolvidos a partir de construtos de IgG Fc com regiões heterodiméricas Fc utilizando métodos de purificação baseados em carga, tal como, por exemplo cromatografia de permuta iónica.

[00211] Numa modalidade adicional, heteromultímeros compreendendo um construto de IgG Fc aqui descrita podem também compreender uma região CH3 variante compreendendo as modificações de aminoácidos que promovem a formação de uma região Fc heterodimérica em vez de formação de uma região Fc homodimérica. A expressão destes heteromultímeros pode resultar numa mistura de heteromultímeros possuindo regiões Fc homodiméricas e regiões Fc heterodiméricas. Tais misturas também podem ser resolvidos utilizando métodos de purificação baseados em carga, tal como indicado acima. Exemplos de variantes que podem ser purificadas deste modo incluem AAC3, AAC4 e AAC5.

6. Ensaios de heteromultímeros 6.1 Ligação de FcyR, FcRn e C1q

[00212] Em certas modalidades, as atividades de Fc da imunoglobulina produzida são medidas para assegurar que apenas as propriedades desejadas sejam mantidas. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser realizados para confirmar a redução/depleção das atividades de CDC e/ou ADCC. Métodos de avaliação da função efetora são descritos em Jiang et al. (2011) Nature Reviews Drug Discovery 10: 101-111. Por exemplo, os ensaios de ligação do receptor de Fc (FcR) podem ser realizados para garantir que o heteromultímero careça de ligação de FCYR (consequentemente provável de carecer da atividade de ADCC), mas mantenha a capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressar FcyRIII apenas, desde que monócitos expressem FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Um exemplo de um ensaio in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse é descrito na Pat. No. 5500362 ou 5821337. As células efetoras úteis para esses ensaios incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Ensaios de ligação a C1q também podem ser realizados para confirmar que o heteromultímero é incapaz de se ligar a C1q e, consequentemente, carece da atividade de CDC. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996), pode ser realizado. Ligação de FcRn e determinações de depuração/meia-vida in vivo também podem ser realizadas utilizando métodos conhecidos na técnica.

[00213] Ligação de FcyR e C1q também pode ser medida pela Ressonância de plasma de superfície (SPR), ou métodos baseados em ELISA. Ligação de FcyR também pode ser medida por FACS (classificação de células ativadas por fluorescência). Comercialmente disponível pode também ser utilizado para medir a capacidade dos heteromultímeros de se ligar a FcyR ou C1q.

6.2 Estabilidade

[00214] A estabilidade térmica dos heteromultímeros pode ser determinada de acordo com métodos conhecidos na técnica. A temperatura de fusão do construto de IgG Fc é indicativa da sua estabilidade térmica. O ponto de fusão do construto de IgG Fc pode ser medido utilizando técnicas tais como a calorimetria de varredura diferencial (Chen et al (2003) Pharm Res 20: 1952-1960; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68: 47-52). Alternativamente, a estabilidade térmica do construto de IgG Fc pode ser medida utilizando dicroismo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40: 343-9).

[00215] A metodologia para a determinação da Tm da matriz de domínio CH2 é bem descrita na técnica (ver, por exemplo Ionescu et al (2008) J Pharm Sci 97 (4): 1414-1426). Em suma, a fusão da região IgGG1 Fc produz duas transições: uma para a fusão do domínio CH2 e um para a do domínio CH3. Estas transições são independentes de Fab presente, mas podem ser mascaradas pela transição de Fab. Tipicamente, fusão de IgGG1 Fc dá uma transição com uma Tm de 71°C para o domínio CH2 e um com uma Tm de 82°C durante o domínio CH3. A Tm do domínio CH2 é afetada pelo seu estado de glicosilação, a natureza da região de dobradiça, e a estabilidade intrínseca do domínio CH3. Aglicosilação e desglicosilação são conhecidas por diminuir a Tm do domínio CH2 em 10°C. A remoção de dissulfuretos de dobradiça são conhecidos por diminuir a Tm do domínio CH2 em mais de 10°C. As alterações no domínio CH3 que reduzem a sua estabilidade abaixo à do domínio CH2 são susceptíveis de produzir alterações na Tm do domínio CH2, mas o efeito é mais difícil de prever.

7. Composições Farmacêuticas

[00216] A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas que compreendem os heteromultímeros de acordo com a invenção. Tais composições compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade específica, o termo "farmaceuticamente aceitável", significa aprovado por uma agência reguladora do Governo Federal ou um Estado ou listados na U.S. Pharmacopeia ou outra Farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e mais particularmente em seres humanos. O termo "transportadora" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual a terapêutica é administrada. Essas transportadoras farmacêuticas podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo os de petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e afins. A água é um transportador preferencial quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Soluções salinas e soluções de glicerol e dextrose aquosa também podem ser empregadas como transportadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados também incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. A composição, se desejar, também pode conter quantidades menores de agentes umectantes ou emulsionantes, ou agentes tamponadores de pH. Estas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação sustentada e afins. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes tradicionais e transportadoras tais como triglicerídeos. A formulação oral pode incluir carreadores correntes tais como qualidades farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, de preferência na forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada da transportadora, a fim de fornecer a forma para uma boa administração ao paciente. A formulação deve adequar o modo de administração.

[00217] Em determinadas modalidades, a composição, compreendendo o heteromultímero é formulado em conformidade com os procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa para seres humanos. Normalmente, composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Sempre que necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local como lignocaína para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são também fornecidos separadamente ou misturados em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado, tal como uma ampola ou sachê, indicando a quantidade do agente ativo. Onde a composição é administrada por infusão, pode ser dispensado com um frasco de infusão contendo água de grau farmacêutico estéril ou soro fisiológico. Onde a composição é administrada por injeção, ampola de água esterilizada para injeção ou soro fisiológico pode ser fornecido para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[00218] Em determinadas modalidades, as composições aqui descritas são formuladas como formas neutras ou sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com ânions, tais como aqueles derivados de clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, ácidos tartárico, etc. e os formados com cátions tais como aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, isopropilamina hidróxido férrico, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

[00219] A quantidade da composição aqui descrita que será eficaz na inibição, tratamento e prevenção de uma doença ou distúrbio associado com expressão aberrante e/ou atividade de uma proteína terapêutica pode ser determinada por técnicas padrão clínicas. Além disso, os ensaios in vitro, opcionalmente, podem ser empregados para ajudar a identificar os intervalos de dosagem ideal. A dose exata a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e a gravidade da doença ou distúrbio e deve ser decidida de acordo com a avaliação do médico e as circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes são extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou de modelo animal.

8. Métodos de Tratamento/Usos

[00220] Os heteromultímeros gerados por qualquer um dos métodos acima descritos pode ser utilizado para diagnosticar, tratar, detectar, ou modular doenças humanas ou de patologias específicas em células, tecidos, órgãos, fluidos, ou, em geral, um hospedeiro. Tal como é aqui ensinado, a modificação da região Fc de um anticorpo, proteína de fusão Fc, ou fragmento Fc para reduzir ou causar ablação da ligação do receptor Fc gama e funções efetoras especificados, mas onde o heteromultímero retém as propriedades de segmentação originais, proporciona anticorpos e construtos de IgG Fc com um espectro de atividades superiores, propriedades biofísicas, estabilidade e capacidade de persistir no corpo de um hospedeiro.

[00221] As doenças ou patologias que possam ser passíveis de tratamento com uma composição fornecida pela invenção incluem, mas não estão limitadas a: doenças neurológicas, tais como mas não se limitando a doença de Alzheimer e incluindo a dor neuropática; doença dermatológica; doenças metabólicas; osteoartrite; e condições resultantes de queimaduras ou ferimentos; desordens cardiovasculares, incluindo mas não se limitando a enfarte do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, acidente vascular cerebral, acidente vascular cerebral isquêmico, hemorragia e; assim como desordens imunitárias mediadas geral, incluindo doenças reumáticas, psoríase, escleroderma.

[00222] Numa modalidade, os heteromultímeros de acordo com a presente invenção são utilizados no tratamento de doenças em que os anticorpos são utilizados para direcionar moléculas da superfície celular, onde a depleção destas moléculas resultantes de função efetora mediada por FcyR tem efeitos adversos.

[00223] Numa modalidade, os heteromultímeros de acordo com a presente invenção são utilizados para melhorar o índice de segurança para os anticorpos que formam complexos imunes com os seus alvos.

[00224] Strohl, WR e Strohl LM, Antibody Fc engineering for optimal antibody performance” In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 225-249, fornece uma descrição das vantagens da utilização de anticorpos que não têm funções efetoras FcyR-mediadas e complemento-mediadas para o tratamento da doença. É contemplado que heteromultímeros compreendendo os construtos de IgG Fc de acordo com a presente invenção são úteis na preparação de anticorpos que não têm funções efetoras FcyR-mediadas e complemento-mediadas para o tratamento da doença.

9. Kits

[00225] A presente invenção fornece, adicionalmente, para kits que compreendem um ou mais heteromultímeros. Os componentes individuais do kit iriam ser embalados em recipientes separados e, associado com tais recipientes, pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula o fabrico, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, aviso esse que reflete a aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda. O kit pode opcionalmente conter instruções ou orientações descrevendo o método de uso ou regime de administração para os pares de heterodímero.

[00226] Quando um ou mais componentes do kit são fornecidos como soluções, por exemplo uma solução aquosa, ou uma solução aquosa estéril, os meios de recipiente propriamente ditos podem ser um inalante, uma seringa, uma pipeta, conta-gotas, ou outros, tais como aparelhos, a partir do qual a solução pode ser administrada a um sujeito ou aplicada a e misturada com os outros componentes do kit.

[00227] Os componentes do kit podem também ser fornecida na forma seca ou liofilizada e o kit pode conter, adicionalmente, um solvente apropriado para a reconstituição dos componentes liofilizados. Independentemente do número ou tipo de recipientes, os kits da presente invenção também podem compreender um instrumento para facilitar a administração da composição a um paciente. Tal instrumento pode ser um inalante, dispositivo de pulverização nasal, seringa, pipeta, uma pinça, colher de medida, conta-gotas ou similar veículo de entrega medicamente aprovado.

[00228] Entende-se que os exemplos e modalidades aqui descritas são apenas para fins ilustrativos, e que várias modificações ou alterações na luz vão ser sugeridas para pessoas versadas na técnica e devem ser incluídos dentro do sentido e o alcance deste pedido e escopo das reivindicações acrescentadas. EXEMPLOS Os exemplos que se seguem são dados de modo a ilustrar a prática da presente invenção. Eles não se destinam a limitar ou definir todo o âmbito da presente invenção. Exemplo 1: Preparação e expressão de construtos de anticorpo (heteromultímeros) Os seguintes construtos de anticorpo foram preparados. Todos os construtos de anticorpo foram baseados na sequência de trastuzumab anticorpo anti-Her2 do tipo selvagem (consulte, Figura 5, SEQ ID NO:2 para a sequência aminoácidos de cadeia pesada de trastuzumab de tipo selvagem, a SEQ ID NO:3 sequência aminoácidos de cadeia leve de trastuzumab de tipo selvagem) com as seguintes modificações adicionadas no domínio CH3 de cadeia pesada introduzida a fim de promover a formação de um domínio de Fc heterodímero com estabilidade aumentada em comparação com um domínio CH3 que não compreendem mutações de aminoácidos: Cadeia A T350V/L351Y/S400E/F405A/Y407V, e Cadeia B: T350V/T366L/N390R/K392M/T394W

[00229] Este construto, com as modificações acima é referido como V791. Todas as sequências aqui descritas são numeradas utilizando o sistema de numeração da UE.

[00230] Variantes adicionais foram construídas com base em V791, com modificações de aminoácidos da região de dobradiça e ou domínio CH2 da cadeia pesada como mostrado na Tabela A1. Todas as variantes incluíram a sequência de cadeia leve de trastuzumab como estabelecida em SEQ ID NO: 67 (aminoácidos) e/ou SEQ ID NO: 34 (DNA).Tabela A1 construtos de anticorpo assimétricos baseados em trastuzumab 1051 é uma variante de controle descrito em Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20: 685-691. AAC1 é uma outra variante de controle que é uma versão assimétrica de 1051, na qual apenas uma das cadeias pesadas possui a mutação dupla L234/L235. AAC2-AAC8 são desenhos assimétricos.

[00231] Os anticorpos e os controles foram clonados e expressos como se segue. V791 foi preparado por mutagênese dirigida ao sítio, usando métodos padrão. O DNA final foi sub-clonado no vetor pTT5 (consulte Publicação de Patente Internacional de n° WO 2009/137911). A expressão foi realizada em ambos 2 mL ou de 50 mL ou 500 mL de células CHO 3E7. As células de CHO foram transfectadas em fase de crescimento exponencial (1,5 a 2 milhões de células/mL) com 1 mg/mL de polietilenimina aquosa de 25kDa (PEI, Polysciences) em uma razão de PEI:DNA de 2.5:1.(Raymond C. et al. Um processo simplificado de transfecção mediado por polietilenimina para aplicações em larga escala e de alto rendimento. Métodos. 55(1):44-51 (2011)). Para determinar o intervalo de concentração ideal para a formação de heterodímeros, o DNA foi transfectado na razão ideal de DNA da cadeia pesada (HC-A), cadeia leve (LC) e cadeia pesada B que permitem a formação de heterodímero (por exemplo, HC-A/HC-B/LC razões = 25:25:50%). Células transfectadas foram colhidas após 5-6 dias com meio de cultura coletadas após centrifugação a 4000 rpm e clarificadas usando um filtro de 0,45 μm.

[00232] Protocolos de purificação: O meio de cultura clarificado foi carregado em uma coluna de proteína-A MabSelect SuRe (GE Healthcare) e lavado com 10 volumes de coluna de tampão PBS com pH 7,2. O anticorpo foi eluído com 10 volumes de coluna de tampão de citrato com pH 3,6 com as frações em pool contendo o anticorpo neutralizado com TRIS com pH 11. O anticorpo purificado de proteína- A foi adicionalmente purificado por filtração em gel (SEC). Para a filtração em gel, 3,5 mg da mistura de anticorpo foi concentrada até 1,5 ml e carregado sobre uma coluna de Sephadex 200 HiLoad 16/600 200 pg (GE Healthcare) através de uma Ã KTA Express FPLC com uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Tampão de PBS com pH 7,4 foi usado em uma taxa de fluxo de 1mL/min. Frações correspondentes ao anticorpo purificado foram coletadas, concentradas a ~1mg/mL e armazenadas a -80°C.

[00233] Tabela A2 resume os rendimentos de expressão para as diferentes amostras. *n/d = não determinado

[00234] A maioria das amostras mostrou níveis de expressão semelhantes para o WT ou de controle.

Exemplo 2: Construtos de anticorpos assimétricos com base em trastuzumabe não se ligam a FcyR

[00235] A capacidade dos construtos de anticorpo assimétricos para se ligar a FcyRIIaH, FcyRIIaR, Fcy RIIB, Fc yRIIIaF, FcyRIIIaV, e FcyRIa foi avaliada por ressonância de plasma de superfície (SPR).

[00236] Afinidade de FcyRs ao anticorpo Fc foi medida por SPR utilizando um Proteon XPR36 a 25°C com 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 3,4 mM de EDTA e 0,05% de Tween 20 a pH 7,4. HER-2 recombinante foi capturado no sensorchip GLM activado por injeção de 4.0μg/mL em 10 mM de NaOAc (pH 4,5) a 25 μl/min, até aprox. 3000 unidades de ressonância (UR) terem sido imobilizadas com os grupos ativos restantes extinguidos. 40 μg/mL de anticorpos baseados em Neu/Her- 2 purificados indiretamente foram capturados quando injetados a 25 μl/min durante 240s (resultando em aprox. 500RUs) a seguir à injeção de tampão para estabelecer uma linha de base estável. FCYRS foram injetados a 60 μL/min durante 120s com uma fase de dissociação de 180s para se obter um conjunto de sensogramas de ligação. Valores kD resultantes foram determinados a partir de isotérmicas de ligação utilizando o modelo Equilibrium Fit com valores relatados como a média de duas ou três experiências independentes.

[00237] A razão Ka de ligação in vitro com respeito ao WT para cada variante, conforme determinado por SPR, é mostrada na Tabela B.TABELA B: A razão de Ka em SPR para a ligação aos receptores Fcy com relação a trastuzumab de tipo selvage *n/d = não determinado 1. O Kd de 2ah foi de 0,48 μM. Receptor foi executado em 10 μM. Baixo significa que Kd >> 10μM, NB significa Kd >> 100μM >> onde indica "muito maior do que". 2. O Kd de 2AR foi de 0,87 2AR μM. Receptor foi executado em 10 μM. Baixo significa que Kd >> 10μM, NB significa Kd >> 100μM. 3. O Kd de 2b foi de 3,4 μM. Receptor foi executado em 10 μM. Baixo significa que Kd >> 10μM, NB significa Kd >> 100μM. 4. O Kd de 3AF foi de 1,9 μM. Receptor foi executado em seis 6 μM. Baixo significa que Kd >> 6μM, NB significa Kd >> 60μM. 5. O Kd de 3av foi de 0,60 μM. Receptor foi executado em seis μM. Baixo significa que Kd >> 6μM, NB significa Kd >> 60μM. 6. O Kd de 1a foi de 0,65 nM. Receptor foi executado a 30 nM. Baixo significa que Kd >> 30 nM, NB significa Kd >> 300 nM.

[00238] Todas as variantes mostraram diminuição significativa de ligação a todos os receptores. Na maioria dos casos, a ligação era indetectável ou quantificada devido à baixa afinidade. Exemplo 3: Construtos de anticorpos assimétricos com base em trastuzumab não se ligam a C1q

[00239] A capacidade de os construtos de anticorpo assimétricos se ligarem a C1q foi testada como se segue. C1q humano foi adquirido da Genway Biotech (San Diego, CA). Imobilização de chip SPR de anticorpos foi como descrito no Exemplo 2. 30nM de C1q injetado sobre variantes de mAb capturadas numa superfície de HER2 SPR utilizando protocolos normalizados, tal como também descrito no Exemplo 2. Os resultados são mostrados na Tabela C abaixo.TABELA C: Resultados do ensaio de ligação de C1q1. C1q é um hexâmero de heterotrimeros com um potencial de estequiometria mAb: C1q de 6: 1. As cinéticas de ligação foram muito complexas, e um Kd adequado não pôde ser determinado. Receptor foi testado a 30 nM. "parcial" significa diminuição de ligação, "NB" significa nenhuma ligação detectável

[00240] Todas as variantes mostraram ligação detectável a C1q, exceto para AAC1 que mostraram diminuição, mas ligação detectável a C1q.

Exemplo 4: Construtos de anticorpo assimétricos baseados em trastuzumab se ligam a FcRn

[00241] A capacidade dos anticorpos assimétricos de se ligarem a FcRn foi testada por SPR como se segue.

[00242] Superfície de captura de chip SPR foi preparada com anticorpo de cabra anti-hlgG policlonal. Variantes foram capturados a partir de sobrenadantes na linha vertical. Um fluxo de FcRn a 1μM máximo com uma série de 3x diluições foi executado na linha horizontal. Execuções em duplicado a pH 6 produziram resultados semelhantes. Uma execução em pH 7,4 foi realizada para verificar se há falta de ligação. Os resultados são mostrados na Tabela D abaixo. Tabela D: Ligação a FcRn *n/d = não determinado 1. Ligação a FcRn foi medida a pH 6,5 e 7,4. Variantes com ligação de peso em pH 6,5 e nenhuma ligação detectável a pH 7,4 são indicadas como 'Sim'

Exemplo 5: Construtos de anticorpo assimétricos são termicamente estáveis

[00243] A estabilidade térmica dos domínios CH2 dos construtos de anticorpos assimétricos baseados foi determinada usando calorimetria de varredura diferencial conforme a seguir. Cada construto de anticorpo foi purificado conforme descrito no Exemplo 1 e diluído a 0,2 mg/mL em PBS e um total de 400 μL foi utilizado para análise de DSC com um VP-Capillary DSC (GE Healthcare). No início de cada ensaio de DSC, cinco injeções de tampão em branco foram realizadas para estabilizar a linha de base e uma injeção de tampão foi colocada antes de cada injeção de construto de anticorpo para referência. Cada amostra foi submetida a varredura de 20 a 100 °C a uma taxa de 60 °C/h, com baixo feedback, 8 seg de filtro, 5 min de preTstat e pressão de nitrogênio de 70 psi. Os termogramas resultantes foram referenciados e analisados utilizando o software Origin 7.

[00244] Curvas de desdobramento térmico para os heterodímeros testados são mostradas na Figura 2. As temperaturas de fusão dos heteromultimeros testados estão apresentados na Tabela E abaixo. TABELA E: Estabilidade térmica dos heteromultímeros *n/d = não determinado 1. Tm de início foi visualmente tida como o primeiro ponto onde o termograma na Figura 2 vai significativamente acima da linha de base. 2. A Tm de desconvolução foi medida por meio de um modelo de estado não-2 da primeira transição nos termogramas mostrados na Figura 2.

[00245] Esses resultados indicam que uma certa quantidade dos modelos teve aparição de Tm e de Tm do domínio CH2 mais elevada quando em comparação com o controle WT.

Exemplo 6: Purificação de construtos de anticorpo assimétricos baseados em trastuzumab

[00246] Construtos assimétricos de anticorpo selecionados foram expressos e purificados por IEX UPLC (Cromatografia Líquida de Desempenho Ultra - Cromatografia de troca iónica) como se segue.

[00247] Cadeia A e Cadeia B das variantes 791 (heterodímero WT), AAC3 (L234D/L235E[Cadeia A]|L234K/L235K[Cadeia B]) e AAC5 (L234D/L235E[Cadeia A]|E233K/L234K/L235K[Cadeia B]) foram expressados em razões de 1:0 (A), 1:1 (C) e 0:1 (E). Em culturas de 50 mL de CHO. As Razões A e E produziram hemodímeros da Cadeia A e Cadeia B, respectivamente. Todas as amostras foram purificadas por Proteína A e, em seguida, por Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC) utilizando uma coluna Superdex 200 16/600 em tampão PBS antes de colocá-las em UPLC IEX. UPLC IEX foi realizada sob as seguintes condições (gradiente de pH): Solventes: A, 0,1 M de NaH2PO4, pH 4,44; B, 0,1 M de Na2HPO4, pH 9,20; C, água MilliQ; D, 0,5 M de Acetado de Na, pH 9,13 (lot# 03-dez-12). Tampão inicial: 18% de A, 2% de B, 68% de C, 12% de D = 20 mM de NaPO4, 60 mM de Acetado de Na, pH ~5,9; Gradiente: a 2% de A, 18% de B, 68% de C, 12% de D = 20 mM de NaPO4, 60 mM de Acetato de Na, pH ~7,9 em 7,2 volumes de coluna. Taxa de fluxo: 0,3 ml/min. Temperatura: 30 °C. Pressão: ~4200 psi. Coluna: Agilent BioMAb, 4,6 x 50 mm, 1,7 μm de partículas, SN USDJA01061.

[00248] Os resultados são mostrados na Figura 3A. Os traços para as razões A, C e E que correspondem aos homodímeros ou heterodímeros são rotulados. As execuções de repetição, quando realizadas, também são mostradas.

[00249] A Figura 3A mostra que a introdução das cargas assimétricas na região de dobradiça inferior de uma maneira que não apenas tem um receptor de ligação inferior (Exemplo 3) e a estabilidade térmica mais elevada (Exemplo 5), mas também podem ser purificadas a partir das impurezas de homodímeros por Cromatografia de Troca Iônica.

[00250] A separação de uma variante, AAC4, foi testada sob duas condições. Eluiu-se sob um gradiente de pH tal como descrito acima ou sob um gradiente de sal conforme a seguir: Solventes: A 0,1 M de NaH2PO4, pH 4,44; B 0,1 M de Na2HPO4, pH 9,20; C água MilliQ; D 0,5 M de NaCl. Tampão inicial: 18% de A, 2% de B, 68% de C, 12% de D = 20 mM de NaPO4, 60 mM de NaCl, pH ~5,9. O gradiente de sal a 18% de A, 2% de B, 0% de C, 80% de D (= 20 mM de NaPO4, 400 mM de NaCl, pH ~5,9) em 7,2 volumes de coluna.

[00251] Os resultados são mostrados na Figura 3B. A figura mostra que a separação de homodímeros e heterodímeros com um gradiente de sal era semelhante ao de um gradiente de pH. Exemplo 7: As construções de anticorpo assimétricos baseados em trastuzumab não estimulam ADCC (citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos) em células SK-BR-3

[00252] Uma variante de exemplo foi testada quanto à sua capacidade para estimular a ADCC em células SK-BR-3 de modo a avaliar se a falta de ligação medida a FcyR traduziu-se em uma incapacidade para mediar a função de efetor conforme medido por ADCC. As células SK-BR-3 expressam HER2 em sua superfície e, portanto, ligam-se a trastuzumab, permitindo células NK mediadas por ADCC na presença de trastuzumab. A atividade de AA6 nesse ensaio foi comparada àquela variante de controle descrita na Tabela A e a trastuzumab de controle positivo.

[00253] As linhagens celulares utilizadas: linhagem celular de SK-BR-3 (ATCC#HTB-30), NK92/ CD16a(158V/V) Dispositivo de detecção: FlexStation3, Molecular Devices.Anticorpo de controle positivo: HerceptinTM (Trastuzumab).

[00254] Cultura de células. As células congeladas foram descongeladas rodando suavemente o frasco dentro de banho de água a 37 °C. Após 1-2min, o meio no frasco foi completamente descongelado. O exterior do frasco foi limpo com etanol a 70%. A suspensão de células foi então transferida para um tubo de centrífuga de 15 mL, seguido por adição de 5 mL de meio completo pré-aquecido. Após centrifugação durante 3-5min em 500 g, o sobrenadante foi aspirado. 10 ml de meio completo foi adicionado e as células foram ressuspensas por pipetagem para cima e para baixo algumas vezes. A viabilidade das células foi determinada pelo método de coloração com Trypan Blue. A suspensão de células foi então semeada em frascos. As células foram incubadas a 37 °C, CO2 a 5% durante a noite.

[00255] As células foram mantidas a 37 °C/CO2 a 5% e regularmente sub-cultivadas com meio adequado suplementado com FBS a 10% de acordo com o protocolo de ATCC.

[00256] A amostra de anticorpo e o padrão foram entregues no frasco do tipo dry shipper e armazenados a -20 ° C antes do teste. A amostra e o Padrão foram armazenados a 4 °C após serem descongelados em gelo. A amostra e o padrão foram diluídos com meio de MEM livre de Vermelho de Fenol (suplementado com FBS a 1% e Pen/Strep a 1%) e aplicados aos testes.

[00257] O tampão de ensaio ADCC foi composto por meio MEM livre de vermelho de fenol a 98%, Pen/Strep a 1% e FBS a 1%.

[00258] NK92/FcRY3a(158V/V) as células foram mantidas convencionalmente.

[00259] As células alvo foram colhidas por centrifugação a 800 rpm durante 3 minutos, lavadas uma vez com meio de ensaio e centrifugadas; o meio acima do pelete foi removido completamente. As células foram suspensas suavemente com meio de ensaio para produzir uma única solução de células. A quantidade de células alvo foi ajustada para 4x de estoque celular (10.000 células em meio de ensaio de 50 μl). Os artigos de teste foram preparados em concentrações interessadas. 50 μl de 4x de estoque de célula-alvo foram semeadas a placas de ensaio de 96 poços e 50 μl de 4x de diluentes de amostra adicionado. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 min no incubador de cultura de células. 100 μl de células efetoras (E/T = 5:1, isto é, 50.000 células efetoras por poço) foram adicionadas para iniciar a reação e misturou-se cuidadosamente por agitação cruzada. Triton X-100 foi adicionado aos controles da célula sem células efetoras e o anticorpo em uma concentração final de 1% à lise das células alvo e serviu como o controle máximo de lise; os tampões de ensaio foram adicionados dentro dos controles da célula sem células efetoras e o anticorpo e serviram enquanto o controle de liberação de LDH mínimo. As células alvo incubadas com as células efetoras sem a presença dos anticorpos foram ajustadas como o controle do fundamento da liberação não-específica de LDH quando ambas as células foram incubadas juntas. A placa foi incubada a 37 °C/CO2 a 5% incubadora durante 4-6 horas. A viabilidade celular foi ensaiada com um kit de LDH. Os dados de absorvância a OD492nm e OD650nm foram medidos no Flexstation 3.

[00260] Os dados de fundo (OD650nm) subtraído OD492nm foram analisados para estudar a liberação de LDH. As porcentagens de lise celular foram calculadas de acordo com a fórmula:% de lise celular = 100*(1-(Dados de ODAmostra - células de ODtumor mais células efetoras)/(liberação de ODMáximo - liberação de ODMínimo)).

[00261] Os resultados são apresentados na Figura 4 e indicam que o heteromultímero AA6 de exemplo é capaz de silenciar a atividade de ADCC nesse ensaio.

Exemplo 8: Preparação e expressão de construtos do anticorpo com base no anticorpo anti-CD20, Rituximab (heteromultímeros)

[00262] As seguintes construções de anticorpo foram preparadas. Todos os construtos de anticorpo foram baseados na sequência de rituximab anticorpo anti-CD20 do tipo selvagem (consulte, Figura 5, SEQ ID NO: 4 para a sequência aminoácidos de cadeia pesada de rituximab de tipo selvagem, a SEQ ID NO: 5 sequência aminoácidos de cadeia leve de rituximab de tipo selvagem) com as seguintes modificações adicionadas no domínio CH3 de cadeia pesada introduzida a fim de promover a formação de um domínio de Fc heterodímero com estabilidade aumentada em comparação com um domínio CH3 que não compreendem mutações de aminoácidos: Cadeia A T350V/L351Y/F405A/Y407V, e Cadeia B: T350V/T366L/K392L/T394W

[00263] Esse construto com as mutações acima é referido como v1261.

[00264] Variantes adicionais foram construídas com base em v1261, com modificações de aminoácidos na região de articulada ou domínio de CH2 da cadeia pesada como mostrado na Tabela F. Todas as variantes compreendem, adicionalmente, a sequência de cadeia leve conforme apresentado na SEQ ID NO: 68 (aminoácidos) e/ou SEQ ID NO: 69 (DNA).

[00265] Tabela F: Construtos de anticorpos assimétricos com base em rituximab

[00266] Os anticorpos e os controles foram clonados e expressados conforme a seguir. V1261 foi preparado por mutagênese direcionada ao local usando métodos padrões. O DNA final foi sub- clonado no vetor pTT5 (consulte Publicação de Patente Internacional de n° WO 2009/137911). A expressão foi realizada ou em 50 mL ou 250 mL de células CHO 3E7. As células de CHO foram transfectadas em fase de crescimento exponencial (1,5 a 2 milhões de células/mL) com 1 mg/mL de polietilenimina aquosa de 25kDa (PEI, Polysciences) em uma razão de PEI:DNA de 2.5:1.(Raymond C. et al. Um processo simplificado de transfecção mediado por polietilenimina para aplicações em larga escala e de alto rendimento. Métodos. 55(1):44-51 (2011)). O DNA foi transfectado em razões de DNA da cadeia pesada A (HC-A), da cadeia leve (LC) e da cadeia pesada B de razões HC-A/HC-B/LC = 30:30:40%). Células transfectadas foram colhidas após 5-6 dias com meio de cultura coletadas após centrifugação a 4000 rpm e clarificadas usando um filtro de 0,45 μm.

[00267] Protocolos de purificação: O meio de cultura clarificado foi carregado em uma coluna de proteína-A MabSelect SuRe (GE Healthcare) e lavado com 10 volumes de coluna de tampão PBS com pH 7,2. O anticorpo foi eluído com 10 volumes de coluna de tampão de citrato com pH 3,6 com as frações em pool contendo o anticorpo neutralizado com TRIS com pH 11. O anticorpo purificado de proteína- A foi adicionalmente purificado por filtração em gel (SEC). Para a filtração em gel, 3,5 mg da mistura de anticorpo foi concentrada até 1,5 ml e carregado sobre uma coluna de Sephadex 200 HiLoad 16/600 200 pg (GE Healthcare) através de uma AKTA Express FPLC com uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Tampão de PBS com pH 7,4 foi usado em uma taxa de fluxo de 1mL/min. Frações correspondentes ao anticorpo purificado foram coletadas, concentradas a ~1mg/mL e armazenadas a -80°C. Os rendimentos de expressão são os seguintes: Tabela G - Rendimentos de expressão

[00268] Considerando-se lote a lote na variabilidade no rendimento, todas as amostras bem expressadas a níveis comparáveis ao controle de WT Rituximab.

Exemplo 9: Construtos de anticorpos assimétricos com base em rituximab não se ligam a FcyR

[00269] A capacidade dos construtos de anticorpos assimétricos com base em rituximab para se ligarem a FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb, FcyRIIIaF e FcyRIIIaV foi avaliada por ressonância de plasma de superfície (SPR).

[00270] Afinidade de FcgR ao anticorpo Fc foi medida através de SPR utilizando um ProteOn XPR36 a 25 °C com PBS contendo 3,4 mM de EDTA e Tween 20 a 0,05% com pH 7,4 como tampão de corrida. Anticorpos anti-IgG de cabra policlonais foram imobilizados sobre um chip-sensor GLC ativado de NHS/EDC através de injeção de 4,0 μg/mL em 10 mM de NaOAc (pH 4,5) a 25 μL/min, até cerca de 3000 unidades de ressonância (RUs) ser alcançado, o que foi seguido pelo arrefecimento rápido dos grupos ativos restantes com etanolamina. 40 μg/mL de anticorpos com base de rituximab purificado foram capturadas indiretamente através da injeção a 25μL/min durante 240s (resultando em aprox. 500 RUs de captura) na direção ligante, seguinte a uma injeção de tampão para estabelecer uma linha de base estável na direção de analitos. FCYRS foram subsequentemente injetados em 50 μL/min durante 120s com 180s de fase de dissociação para se obter um conjunto de sensogramas de ligação. Os valores Kd resultante (afinidade) foram determinados a partir sensogramas de referência dupla usando o modelo de Equilibrium Fit no software Proteon Manager. Os valores apresentados como a média de duas ou três experiências independentes.

[00271] A razão Ka de ligação in vitro com respeito ao WT para cada variante, conforme determinado por SPR, é mostrada na Tabela H.Tabela H: A razão de Ka em SPR para a ligação aos receptors Fcy com relação a trastuzumab de tipo selvagem

[00272] As mutações de impulsionamento de heterodímero no controle WT Rituximab 1261 trouxeram marginalmente afinidade em relação aos receptores quando em comparação ao WT trastuzumab homodimérico. Os mutantes, que continham as mutações de impulsionamento heterodímero, mostraram ligação significativamente reduzida ou indetectável aos receptores Fcy.

Exemplo 10: Construtos de anticorpos assimétricos com base em rituximab são termicamente estáveis

[00273] A estabilidade térmica dos domínios CH2 dos construtos de anticorpos assimétricos baseados em rituximab foi determinada usando calorimetria diferencial de varrimento conforme a seguir. Cada construto de anticorpo foi purificado conforme descrito no Exemplo 8 e diluído a 0,2 mg/mL em PBS e um total de 400 μL foi utilizado para análise de DSC com um VP-Capillary DSC (GE Healthcare). No início de cada ensaio de DSC, cinco injeções de tampão em branco foram realizadas para estabilizar a linha de base e uma injeção de tampão foi colocada antes de cada injeção de construto de anticorpo para referência. Cada amostra foi submetida a varredura de 20 a 100 °C a uma taxa de 60 °C/h, com baixo feedback, 8 seg de filtro, 5 min de preTstat e pressão de nitrogênio de 70 psi. Os termogramas resultantes foram referenciados e analisados utilizando o software Origin 7.

[00274] As temperaturas de fusão dos heteromultimeros testados estão apresentados na Tabela I abaixo.Tabela I: Estabilidade térmica dos heteromultímeros 1. A primeira transição incluiu o desdobramento tanto do Rituximab FAB como do domínio CH2. Mediu-se Tm por deconvolução utilizando um modelo sem 2 estados da primeira transição.

[00275] Esses resultados indicam que uma certa quantidade dos modelos teve aparição de Tm e de Tm do domínio CH2 mais elevada quando em comparação com o controle WT.

Exemplo 11: Construtos de anticorpos assimétricos com base em rituximab não estimulam ADCC em células Daudi

[00276] Variantes selecionadas foram testadas quanto à sua capacidade para estimular ADCC em células Daudi, a fim de avaliar se a falta de ligação medida a FcyR traduziu-se em uma incapacidade para mediar a função de efetor conforme medido por ADCC. Células Daudi expressam CD20 na sua superfície e, portanto, ligam-se a rituximab, permitindo ADCC mediado por células NK na presença de rituximab. A atividade das variantes selecionadas nesse ensaio foi comparada com àquela da variante de rituximab de controle descrita na Tabela F e a rituximab obtido comercialmente.

[00277] As linhagens celulares utilizadas: Linhagem celular de Daudi (ATCC, Cat# CCL-213), NK92/ CD16a (158V/V) Dispositivo de detecção: FlexStation3, Molecular Devices.

Anticorpo de controle positivo: Rituximab.

[00278] Cultura de células. As células congeladas foram descongeladas rodando suavemente o frasco dentro de banho de água a 37 °C. Após 1-2min, o meio no frasco foi completamente descongelado. O exterior do frasco foi limpo com etanol a 70%. A suspensão de células foi então transferida para um tubo de centrífuga de 15 mL, seguido por adição de 5 mL de meio completo pré-aquecido. Após centrifugação durante 3-5min em 500 g, o sobrenadante foi aspirado. 10 ml de meio completo foi adicionado e as células foram ressuspensas por pipetagem para cima e para baixo algumas vezes. A viabilidade das células foi determinada pelo método de coloração com Trypan Blue. A suspensão de células foi então semeada em frascos. As células foram incubadas a 37 °C, CO2 a 5% durante a noite.

[00279] As células foram mantidas a 37 °C/CO2 a 5% e regularmente sub-cultivadas com meio adequado suplementado com FBS a 10% de acordo com o protocolo de ATCC.

[00280] A amostra de anticorpo e o Padrão (Rituximab) foram entregues no frasco do tipo dry shipper e armazenados a -20 ° C antes do teste. A amostra e o Padrão foram armazenados a 4 °C após serem descongelados em gelo. A amostra e o padrão foram diluídos com meio de MEM livre de Vermelho de Fenol (suplementado com FBS a 1% e Pen/Strep a 1%) e aplicados aos testes.

[00281] O tampão de ensaio ADCC foi composto por meio MEM livre de vermelho de fenol a 98%, Pen/Strep a 1% e FBS a 1%.

[00282] NK92/FcRY3a(158V/V) as células foram mantidas convencionalmente.

[00283] As células alvo foram colhidas por centrifugação a 800 rpm durante 3 minutos, lavadas uma vez com meio de ensaio e centrifugadas; o meio acima do pelete foi removido completamente. As células foram suspensas suavemente com meio de ensaio para produzir uma única solução de células. A quantidade de células alvo foi ajustada para 4x de estoque celular (10.000 células em meio de ensaio de 50 μl). Os artigos de teste foram preparados em concentrações interessadas. 50 μl de 4x de estoque de célula-alvo foram semeadas a placas de ensaio de 96 poços e 50 μl de 4x de diluentes de amostra adicionado. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 min no incubador de cultura de células. 100 μl de células efetoras (E/T = 5:1, isto é, 50.000 células efetoras por poço) foram adicionadas para iniciar a reação e misturou-se cuidadosamente por agitação cruzada. Triton X-100 foi adicionado aos controles da célula sem células efetoras e o anticorpo em uma concentração final de 1% ao lyze das células alvo e serviu como o controle máximo de lise; os tampões de ensaio foram adicionados dentro dos controles da célula sem células efetoras e o anticorpo e serviram enquanto o controle de liberação de LDH mínimo. As células alvo incubadas com as células efetoras sem a presença dos anticorpos foram ajustadas como o controle do fundamento da liberação não-específica de LDH quando ambas as células foram incubadas juntas. A placa foi incubada a 37 °C/CO2 a 5% incubadora durante 4-6 horas. A viabilidade celular foi ensaiada com um kit de LDH. Os dados de absorvância a OD492nm e OD650nm foram medidos no Flexstation 3.

[00284] Os dados de fundo (OD650nm) subtraído OD492nm foram analisados para estudar a liberação de LDH. As porcentagens de lise celular foram calculadas de acordo com a fórmula:% de lise celular = 100*(1-(Dados de ODAmostra - células de ODtumor mais células efetoras)/(liberação de ODMáximo - liberação de ODMínimo)).

[00285] Os resultados são mostrados na Figura 6 e indicam que todas as variantes mostraram atividade de ADCC significativamente reduzida ou não detectável.

[00286] - A tabela a seguir resume os resultados:Tabela J: Atividade de ADCC das variants *n/d = não determinado

[00287] As variantes KO apresentaram atividade lítica de ADCC significativamente reduzida e, para muitas variantes, não foi detectada qualquer atividade.

Exemplo 12: Construtos de anticorpos assimétricos com base em rituximab reduzem CDC (citotoxicidade dependente de complemento) em células Daudi

[00288] Apesar de não serem testados quanto à sua capacidade para se ligar a C1q, as variantes selecionadas foram testadas para determinar se eram capazes de mediar CDC em células Daudi. A atividade das variantes selecionadas nesse ensaio foi comparada com àquela da variante de rituximab de controle descrita na Tabela F e a rituximab obtido comercialmente.

[00289] As linhagens celulares utilizadas: Linhagem celular de Daudi (ATCC, Cat# CCL-213), NK92/ CD16a (158V/V). Dispositivo de detecção: F PHERAstarPlus, BMG Labtech. Anticorpo de controle positivo: Rituximab.

[00290] Cultura de células. As células de Daudi foram colhidas por centrifugação e paletes foram lavadas uma vez com tampão de ensaio. As células viáveis foram contadas através do corante Trypan Blue. A população celular foi permitida apenas >99% de viabilidade para o ensaio. A concentração celular foi ajustada e 5.000 células foram semeadas em 20 μl de tampão de CDC. Foram adicionados 10 μl de amostras diluídas (8 concentrações com um fator de diluição de 1:10 descendendo a partir de 600 nM, em triplicado). O controle das amostras e de Rituxan foram incubados à temperatura ambiente durante 30 min. 10 μl de NHS (10% de concentração final no volume de reação de 40 μl) foram adicionados a cada poço para iniciar o ensaio de CDC. A placa foi incubada a 37 °C/CO2 a 5% incubadora durante 2 horas. O teste de viabilidade celular foi realizado com um kit de ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo® (CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Kit). Luminescência foi interpretada em PHERAStar Plus e gravou os dados de unidade de luz relativa.

[00291] Análise de dadosA porcentagem da lise celular foi calculada com a fórmula: % de lise celular =100 x(1- (RLUamostra)/(RLUcélula+NHS), em que NHS representa soro humano normal.

[00292] Os resultados são mostrados na Figura 7 e indicam que todas as amostras apresentaram atividade de CDC significativamente inferior.

[00293] Tabela K: Atividade de CDC das variants*n/d = não determinado

[00294] As variantes KO apresentaram atividade lítica de CDC significativamente diminuída.

[00295] Os reagentes utilizados nos exemplos estão disponíveis comercialmente ou podem ser preparados usando instrumentação, métodos ou reagentes comercialmente disponíveis conhecidos na técnica. Os exemplos anteriores ilustram vários aspectos da presente invenção e a prática dos métodos da invenção. Os exemplos não se destinam a fornecer uma descrição exaustiva das muitas modalidadesdiferentes da invenção. Dessa forma, embora a invenção acima foi descrita em detalhes a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, aqueles de conhecimento comum na técnica reconhecerão prontamente que muitas mudanças e modificações podem ser feitas a mesma sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações anexas.

[00296] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionado nesta especificação são incorporadas nisto por referência na especificação na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse indicado especificamente e individualmente para ser incorporadas nisto por referência.

Claims

1. Hetero-multímero caracterizado por compreender um construto de IgG Fc tendo um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, cada polipeptídeo Fc compreendendo uma região de dobradiça inferior modificada em comparação com a sequência de região de dobradiça inferior do tipo selvagem do polipeptídeo IgG Fc de tipo selvagem correspondente, em que: a. a região de dobradiça inferior modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende substituições de aminoácidos em L234 e/ou L235 que aumentam a carga líquida positiva na região de dobradiça inferior modificada do primeiro polipeptídeo Fc em condições de pH fisiológico e a região de dobradiça inferior modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende substituições de aminoácidos em L234 e/ou L235, em que uma ou ambas as substituições de aminoácidos são diferentes das substituições de aminoácidos do primeiro polipeptídeo Fc, ou b. o primeiro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos L235K/A327K e o segundo polipeptídeo Fc não compreende uma substituição de aminoácidos na região de dobradiça inferior, em que o construto de IgG Fc é um construto humano IgG1, IgG3 ou IgG4 Fc, em que a sequência da região de dobradiça inferior do tipo selvagem é conforme estabelecido na SEQ ID NO:74, e em que o construto IgG Fc exibe ligação reduzida aos receptores FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIb e FcyRIIIa em comparação com um construto de IgG Fc parental correspondente.

2. Hetero-multímero, de acordo com a reivindicação 1a, caracterizado por: uma ou ambas as substituições de aminoácidos na região de dobradiça inferior modificada do segundo polipeptídeo Fc aumenta o número total de cargas negativas no segundo polipeptídeo Fc ou é de carga neutra, ou b. as substituições de aminoácidos na região de dobradiça inferior modificada do primeiro polipeptídeo Fc combinadas com as substituições de aminoácidos na região de dobradiça inferior modificada do segundo polipeptídeo Fc aumentam a carga positiva global do construto de IgG Fc em comparação com o construto de IgG Fc de origem.

3. Hetero-multímero, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça inferior modificada de um do primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende duas ou mais substituições de aminoácidos.

4. Hetero-multímero, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça inferior modificada de cada um dos primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende duas ou mais substituições de aminoácidos.

5. Hetero-multímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o construto de IgG Fc possui um KD superior a 10 μM para FcyRIIaH, um KD superior a 10 μM para FcyRIIaR, um KD superior de 10 μM para FcyRIIb, um KD superior a 6 μM para FcyRIIIaF, um KD superior a 6 μM para FcyRIIIaV e um KD superior a 6,5 nM para FcyRIa.

6. Hetero-multímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que: a. o construto de IgG Fc medeia a função efetora reduzida em comparação com o construto de IgG Fc de origem correspondente, opcionalmente em que a função efetora é ADCC, ADCP, CDC ou qualquer combinação dos mesmos, e/ou b. o construto de IgG Fc exibe ligação reduzida à proteína C1q em comparação com o construto de IgG Fc de origem correspondente.

7. Hetero-multímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácidos em L234 é L234K, L234R, L234A, L234D ou L234E, e a substituição de aminoácidos em L235 é L235K, L235R, L235E, L235A ou L235D.

8. Hetero-multímero, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça inferior modificada do primeiro e/ou do segundo polipeptídeo de Fc compreende ainda uma substituição de aminoácidos em E233.

9. Hetero-multímero, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as substituições de aminoácidos em E233 são independentemente E233A, E233K, E233R ou E233D.

10. Hetero-multímero, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça inferior modificada de um do primeiro e segundo polipeptídeos de Fc compreende as substituições de aminoácidos L234K/L235K, E233A/L234R/L235R, E233K/L234R/L235R, E233K/L234A/L235K, L234A/L235A, L234D/L235E, E233A/L234D/L235E ou E233A/L234K/L235A.

11. Hetero-multímero, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro e/ou o segundo polipeptídeo Fc compreende ainda uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas dentre D265S, E269K, K322A, K322E, P329W e E333K.

12. Hetero-multímero, de acordo com a reivindicação 1a, caracterizado pelo fato de que: a. a região de dobradiça inferior modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos L234K/L235K e a região de dobradiça inferior modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A/L235A; ou b. a região de dobradiça inferior modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos L234K/L235K e a região de dobradiça inferior modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos L234D/L235E; ou c. a região de dobradiça inferior modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos E233A/L234R/L235R e a região de dobradiça inferior modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos E233A/L234D/L235E; ou d. a região de dobradiça inferior modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos E233K/L234R/L235R e a região de dobradiça inferior modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos L234D/L235E; ou e. a região de dobradiça inferior modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos E233K/L234A/L235K e a região de dobradiça inferior modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos E233A/L234K/L235A; ou f. o primeiro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos E233K/L234R/L235R/D265S e o segundo polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos L234D/L235E/D265S; ou g. o primeiro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos E233K/L234R/L235R/E269K e o segundo polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos L234D/L235E/E269K; ou h. o primeiro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos E233K/L234R/L235R/K322A e o segundo polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos L234D/L235E/K322A; ou i. o primeiro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos E233K/L234R/L235R/P329W e o segundo polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos L234D/L235E/P329W; ou j. o primeiro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322A e o segundo polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos L234D/L235E/E269K/D265S/K322A; ou k. o primeiro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos E233K/L234R/L235R/E269K/D265S/K322E/E333K e o segundo polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos L234D/L235E/E269K/D265S/K322E/E333K.

13. Hetero-multímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o construto de IgG Fc é aglicosilado ou desglicosilado.

14. Hetero-multímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o construto de IgG Fc compreende uma região CH3 variante compreendendo substituições de aminoácidos que promovem a formação de uma região Fc heterodimérica em comparação com uma região Fc homodimérica.

15. Hetero-multímero, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que: a. um do primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende as substituições de aminoácidos CH3 T366L/N390R/K392M/T394W e o outro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos CH3 L351Y/S400E/F405A/Y407V; ou b. um do primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende as substituições de aminoácidos CH3 L351Y/F405A/Y407V e o outro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos CH3 T366L/K392M/T394W; ou c. um do primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende as substituições de aminoácidos CH3 L351Y/F405A/Y407V e o outro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos CH3 T366L/K392L/T394W; ou d. um do primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende as substituições de aminoácidos CH3 T350V/L351Y/F405A/Y407V e o outro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos CH3 T350V/T366L/K392L/T394W; ou e. um do primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende as substituições de aminoácidos CH3 T350V/L351Y/F405A/Y407V e o outro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos CH3 T350V/T366L/K392M/T394W; ou f. um do primeiro e segundo polipeptídeos Fc compreende as substituições de aminoácidos CH3 T350V/L351Y/S400E/F405A/Y407V e o outro polipeptídeo Fc compreende as substituições de aminoácidos CH3 T350V/T366L/N390R/K392M/T394W.

16. Hetero-multímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o hetero-multímero compreende ainda um construto de ligação ao antígeno fundido ao construto de IgG Fc, em que o construto de ligação ao antígeno é um fragmento Fab, um scFv, um sdAb, um peptídeo de ligação ao antígeno, uma proteína de fusão Fc ou uma proteína ou fragmento da mesma capaz de se ligar ao antígeno.

17. Hetero-multímero, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende um ou dois construtos de ligação ao antígeno.

18. Hetero-multímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o construto de IgG Fc está ligado a uma ou mais moléculas de droga tóxicas ou a um ou mais polipeptídeos heterólogos.

19. Método para preparação do hetero-multímero, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam o primeiro e o segundo polipeptídeos Fc do hetero-multímero, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18; e (b) recuperar o hetero-multímero da cultura de células hospedeiras.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de compreender ainda a etapa de isolar hetero-multímero usando métodos de purificação baseados em carga.

21. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o hetero-multímero conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

22. Uso do hetero-multímero, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença.

23. Método para reduzir a função efetora de um construto de IgG Fc caracterizado pelo fato de compreender um primeiro e um segundo polipeptídeo Fc, o método compreendendo: modificar a região de dobradiça inferior do primeiro e do segundo polipeptídeo Fc em comparação com a sequência da região de dobradiça inferior de tipo selvagem do polipeptídeo de IgG Fc de tipo selvagem correspondente, em que: a região de dobradiça inferior modificada do primeiro polipeptídeo Fc compreende substituições de aminoácidos em L234 e/ou L235 que aumentam a carga líquida positiva na região de dobradiça inferior modificada do primeiro polipeptídeo Fc em condições de pH fisiológico, e a região de dobradiça inferior modificada do segundo polipeptídeo Fc compreende substituições de aminoácidos em L234 e/ou L235, em que uma ou ambas as substituições de aminoácidos são diferentes das substituições de aminoácidos do primeiro polipeptídeo Fc, o construto de IgG Fc é um construto humano IgG1, IgG3 ou IgG4 Fc, a sequência da região de dobradiça inferior do tipo selvagem é conforme estabelecido na SEQ ID NO:74, e o construto de IgG Fc exibe ligação reduzida aos receptores FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIb e FcyRIIIa em comparação com um construto de IgG Fc de origem correspondente.