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BR112015008251B1 - Pirrolobenzodiazepinas, conjugados destas, composição e composição farmacêutica compreendendo os conjugados, uso dos conjugados para o tratamento de uma doença proliferativa e método para preparar os conjugados - Google Patents

Pirrolobenzodiazepinas, conjugados destas, composição e composição farmacêutica compreendendo os conjugados, uso dos conjugados para o tratamento de uma doença proliferativa e método para preparar os conjugados Download PDF

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BR112015008251B1
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Abstract

pirrolobenzodiazepinas e conjugados destas. o presente pedido se refere a um composto que é selecionado dentre a: b: e c: e sais e solvatos destes, assim como conjugados deste com agentes de ligação celular.

Description

[001]A presente invenção refere-se a pirrolobenzodiazepinas (PBDs), em particular pirrolobenzodiazepinas tendo um grupo de proteção de C2 lábil na forma de um ligador a um agente de ligação celular.
Fundamentos da invenção Pirrolobenzodiazepinas
[002]Algumas pirrolobenzodiazepinas (PBDs) têm a capacidade de reconhe-cer e ligar-se a sequências específicas de DNA; a sequência preferida é PuGPu. O primeiro antibiótico antitumoral de PBD, antramicina, foi descoberto em 1965 (Leim- gruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793 - 5795 (1965); Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791 - 5793 (1965)). Desde então, várias PBDs que ocorrem natural-mente foram relatadas, e mais de 10 vias sintéticas foram desenvolvidas para uma variedade de análogos (Thurston, et al., Chem. Rev. 1994, 433 - 465 (1994); Antonow, D. e Thurston, D.E., Chem. Rev. 2011 111 (4), 2815 - 2864). Membros da família incluem abeimicina (Hochlowski, et al., J. Antibiotics, 40, 145 - 148 (1987)), quicami- cina (Konishi, et al., J. Antibiotics, 37, 200 - 206 (1984)), DC-81 (Patente Japonesa 58-180 487; Thurston, et al., Chem. Brit., 26, 767 - 772 (1990); Bose, et al., Tetrahedron, 48, 751 - 758 (1992)), mazetramicina (Kuminoto, et al., J. Antibiotics, 33, 665 - 667 (1980)), neotramicinas A e B (Takeuchi, et al., J. Antibiotics, 29, 93 - 96 (1976)), porotramicina (Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366 - 1373 (1988)), protracarcina (Shimizu, et al, J. Antibiotics, 29, 2492 - 2503 (1982); Langley e Thurston, J. Org. Chem., 52, 91 - 97 (1987)), sibanomicina (DC-102) (Hara, et al., J. Antibiotics, 41, 702 - 704 (1988); Itoh, et al., J. Antibiotics, 41, 1281 - 1284 (1988)), sibiromicina (Leber, et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992 - 2993 (1988)) e tomamicina (Arima, et al., J. Antibiotics, 25, 437 - 444 (1972)). PBDs são da estrutura geral:
[003]Elas diferem no número, tipo e posição dos substituintes, tanto em seus anéis A aromáticos quanto anéis C de pirrolo, e no grau de saturação do anel C. No anel B existe uma imina (N=C), uma carbinolamina (NH-CH(OH)), ou um éter metílico de carbinolamina (NH-CH(OMe)) na posição N10-C11 que é o centro eletrofílico res-ponsável por alquilar o DNA. Todos os produtos naturais conhecidos têm uma confi-guração (S) na posição C11a quiral que os fornece com uma rotação no sentido ho-rário quando observada do anel C para o anel A. Isto fornece a estes a forma tridi-mensional apropriada para iso-helicidade com a ranhura menor do DNA de forma B, levando a um ajuste compacto no sítio de ligação (Kohn, Em Antibiotics III. Springer-Verlag, Nova Iorque, páginas 3 - 11 (1975); Hurley e Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230 - 237 (1986)). Sua capacidade de formar um aduto na ranhura menor, permite que eles interfiram com o processamento de DNA, consequentemente seu uso como agentes antitumorais.
[004]Um composto de pirrolobenzodiazepina particularmente vantajoso é descrito por Gregson et al. (Chem. Commun. 1999, 797 - 798) como composto 1, e por Gregson et al. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161 - 1174) como composto 4a. Este com-posto, também conhecido como SG2000, é mostrado abaixo:
[005]WO 2007/085930 descreve a preparação de compostos de PBD diméri- cos tendo grupos ligadores para conexão a um agente de ligação celular, tal como um anticorpo. O ligador está presente na ponte ligando as unidades de PBD monoméricas do dímero.
[006]Os presentes inventores descreveram compostos de PBD diméricos tendo grupos ligadores para conexão a um agente de ligação celular, tal como um anticorpo, em WO 2011/130613 e WO 2011/130616. O ligador nestes compostos é ligado ao núcleo de PBD via a posição C2, e é geralmente clivado pela ação de uma enzima no grupo ligador.
Conjugados de anticorpo-fármaco
[007]Terapia com anticorpo foi estabelecida para o tratamento direcionado a pacientes com câncer, transtornos imunológicos e angiogênicos (Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343 - 357). O uso de conjugados de anticorpo-fármaco (ADC), isto é, imunoconjugados, para a distribuição local de agentes citotóxicos ou citostáticos, isto é fármacos para matar ou inibir células tumorais no tratamento de câncer, direciona a distribuição da porção do fármaco a tumores e o acúmulo intracelular nesta, ao passo que a administração sistêmica destes agentes medicamentosos não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade a células normais (Xie et al (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281 - 291; Kovtun et al (2006) Cancer Res. 66(6):3214 - 3121; Law et al (2006) Cancer Res. 66(4):2328 - 2337; Wu et al (2005) Nature Biotech. 23(9):1137 - 1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543 - 549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087 - 1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207 - 212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immu- nother. 52:328 - 337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605 - 614).
[008]A eficácia máxima com toxicidade mínima é procurada desse modo. Es-forços para projetar e refinar ADC focaram na seletividade dos anticorpos monoclonais (mAbs) assim como mecanismo de ação do fármaco, ligação do fármaco, razão de fármaco/anticorpo (carga) e propriedades de liberação de fármaco (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925 - 932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721 - 2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel. 19(7): 299 - 307; Doronina et al (2006) Bioconj. Chem. 17:114 - 124; Erickson et al (2006) Cancer Res. 66(8):1 - 8; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843 - 852; Jeffrey et al (2005) J. Med. Chem. 48:1344 - 1358; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063 - 7070). Porções de fármaco podem comunicar seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos incluindo ligação de tubulina, ligação de DNA, inibição de proteassoma e/ou topoisomerase. Alguns fármacos citotóxicos tendem a ser inativos ou menos ativos quando conjugados a anticorpos grandes ou ligandos do receptor de proteína.
[009]Os presentes inventores desenvolveram dímeros de PBD com grupos de ligação para a formação de conjugados de PBD com agentes e ligação celular, e em particular conjugados de PBD e anticorpo.
Sumário da Invenção
[010]Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um composto que é selecionado de A: e sais e solvatos destes.
[011]A WO 2011/130615 divulga o composto 26:que é o composto precursor de A. O Composto A compreende este PBD com um ligador para ligação a um agente de ligação celular. O agente de ligação celular fornece várias porções etileno glicol para fornecer solubilidade que é útil na síntese de conjugados. A WO 2010/043380 e WO 2011/130613 divulgam o composto 30:
[012]A WO 2011/130613 também divulga o composto 51:
[013]O Composto B difere do composto 30 por ter apenas uma cadeia (CH2)3 entre as porções PBD ao invés de uma cadeia (CH2)5, que reduz a lipofilicidade do dímero de PBD liberado. O grupo de ligação é ligado ao grupo C2-fenila na posição para ao invés da posição meta.
[014]A WO 2011/130613 divulga o composto 93:
[015]O composto C difere deste em dois aspectos. O agente de ligação cellular fornece um número aumentado de porções etileno glicol para fornecer solubilidade que é útil na síntese de conjugados, e o substituinte de fenila fornece dois ao invés de um átomo de oxigênio, que também auxilia na solubilidade. A estrutura do composto C também pode significar que ela liga mais fortemente na ranhura menor.
[016]Os compostos A, B e C têm dois centros sp2 em cada anel C, que podem levar em consideração a ligação mais forte na ranhura menor de DNA, do que para compostos com apenas um centro sp2 em cada anel C.
[017]Um segundo aspecto da presente invenção fornece um composto da fór- mula ConjA: onde CBA representa um agente de ligação celular. A ligação à porção mostrada é via um S livre (tiol ativo) no agente de ligação celular.
Descrição Detalhada da Invenção
[018]A presente invenção fornece um dímero de PBD com um ligador conec-tado através da posição C2 em uma das porções PBD adequadas para formar um dímero de PBD conjugado via o ligador a um agente de ligação celular.
[019]A presente invenção é adequada para o uso em fornecer um composto de PBD a um sítio preferido em um indivíduo. O conjugado permite a liberação de um composto de PBD ativo que não retém qualquer parte do ligador. Não existe nenhum resto presente que possa afetar a reatividade do composto de PBD. Assim ConjA li-beraria o composto RelA: ConjB liberaria o composto RelB: E ConjC liberaria o composto RelC:
[020]Um outro aspecto da presente invenção são os compostos RelB, e sais e solvatos destes
[021]Um outro aspecto da presente invenção são os compostos RelC, e sais e solvatos destes.
[022]A ligação específica entre o dímero de PBD e o agente de ligação celular, na presente invenção é preferivelmente estável extracelularmente. Antes de transportar ou liberar em uma célula, o conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) é preferivelmente estável e permanece intacto, isto é o anticorpo permanece ligado à porção do fármaco. Os ligadores são estáveis fora da célula alvo e podem ser clivados em alguma taxa eficaz dentro da célula. Um ligador eficaz: (i) manterá as propriedades de ligação específicas do anticorpo; (ii) permitirá a distribuição intracelular do conjugado ou porção do fármaco; (iii) permanecerá estável e intacto, isto é, não clivado, até que o conjugado fosse liberado ou transportado ao seu sítio alvejado; e (iv) manterá um efeito de morte celular, citotóxico ou um efeito citostático da porção do fármaco de PBD. A estabilidade do ADC pode ser medida por técnicas analíticas padrão tais como espectroscopia de massa, HPLC, e a técnica de separação/análise LC/MS.
[023]A distribuição dos compostos das fórmulas RelA, RelB ou RelC é obtida no sítio de ativação desejado dos conjugados das fórmulas ConjA, ConjB ou ConjC pela ação de uma enzima, tal como catepsina, no grupo de ligação, e em particular na porção de dipeptídeo de valina-alanina.
Agente de ligação celular
[024]Um agente de ligação celular pode ser de qualquer tipo, e incluir peptí- deos e não peptídeos. Estes podem incluir anticorpos ou um fragmento de um antico- ropo que contém pelo menos um sítio de ligação, linfocinas, hormônios, miméticos de hormônio, vitaminas, fatores de crescimento, moléculas de transporte de nutriente, ou qualquer outra molécula ou substância de ligação celular.
Peptídeos
[025]Em uma forma de realização, o agente de ligação celular é um peptídeo linear ou cíclico compreendendo 4 a 30, preferivelmente 6 a 20, resíduos de aminoá- cido contíguos. Nesta forma de realização, é preferido que um agente de ligação ce-lular seja ligado a um composto de pirrolobenzodiazepina monomérico ou dimérico.
[026]Em uma forma de realização o agente de ligação celular compreende um peptídeo que liga integrina αvβ6. O peptídeo pode ser seletivo para αvβ6 em XYS.
[027]Em uma forma de realização o agente de ligação celular compreende o polipeptídeo A20FMDV-Cys. O A20FMDV-Cys tem a sequência: NAVPNLRGDLQVLAQKVARTC. Alternativamente, uma variante da sequência de A20FMDV-Cys pode ser usada em que um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez resíduos de aminoácido são substituídos com um outro resíduo de ami- noácido. Além disso, o polipeptídeo pode ter a sequência NAVXXXXXXXXXXXXXXXRTC.
Anticorpos
[028]O termo “anticorpo” aqui é usado no sentido mais amplo e especifica-mente inclui anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, dímeros, multímeros, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada, (Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854 - 4861). Anticorpos podem ser de murino, humanos, humanizados, quiméricos, ou derivados de outras espécies. Um anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imune que é capaz de reconhecer e ligar a um antígeno específico. (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, Nova Iorque). Um antígeno alvo geralmente tem numerosos sítios de ligação, também chamados epítopos, reconhecidos por CDRs em anticorpos múltiplos. Cada anticorpo que especificamente liga-se a um epítopo diferente tem uma estrutura diferente. Assim, um antígeno pode ter mais do que um anticorpo correspondente. Um anticorpo inclui um molécula de imunoglobulina de tamanho natural ou uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina de tamanho natural, isto é, uma molécula que contém um sítio de ligação ao antígeno que imunoespecificamente liga um antígeno de um alvo de interesse ou parte deste, tais alvos incluindo mas não limitados a, célula ou células do câncer que produzem anticorpos autoimunes associados com uma doença autoimune. A imunoglobulina pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou ou subclasse de molécula de imunoglo- bulina. As imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer espécie, incluindo origem humana, de murino, ou coelho.
[029]“Fragmentos de anticorpo” compreendem uma porção de um anticorpo de tamanho natural, geralmente a ligação ao antígeno ou região variável deste. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, e scFv; dia- corpos; anticorpos lineares; fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), CDR (região determinante de complementaridade), e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um do acima que imunoes- pecificamente liga-se a antígenos de célula do câncer, antígenos virais ou antígenos microbianos, moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.
[030]O termo “anticorpo monoclonal” como usado aqui refere-se a um anti-corpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para mu-tações que ocorrem naturalmente possíveis que podem estar presentes em quantida-des menores. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário de preparações de anticorpo policlonal que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no an- tígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos em que eles podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser fabricados pelo método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al (1975) Nature 256:495, ou pode ser fabricado por métodos de DNA recombinante (ver, US 4816567). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas em Clackson et al (1991) Nature, 352:624 - 628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581 - 597 ou de camundongos transgênicos que carregam um sistema de imunoglobulina completamente humana (Lonberg (2008) Curr. Opinion 20(4):450 - 459).
[031]Os anticorpos monoclonais aqui especificamente incluem anticorpos “quiméricos” em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou ho-móloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie par-ticular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico com ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencendo a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (US 4816567; e Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 - 6855). Anticorpos quiméricos incluem anticorpos “pri- matizados” compreendendo sequências de ligação a antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Macacos do Velho Mundo ou Símios) e sequências de região constante humanas.
[032]Um “anticorpo intacto” aqui é um compreendendo domínios VL e VH, assim como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variante da sequência de aminoácido destes. O anticorpo intacto pode ter uma ou mais “funções efetoras” que referem-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de variante da sequência de aminoácido) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem ligação de C1q; citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC); fagocitose; e infrarregulação de receptores de superfície celular tais como receptor de célula B e BCR.
[033]Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser designados a diferentes “classes.” Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e vários destes podem ser divididos ainda em “subclasses” (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são chamados α, δ, ε, Y, e μ, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
Humanização
[034]Técnicas para reduzir a imunogenicidade in vivo de um anticorpo não humano ou fragmento de anticorpo incluem aquelas denominadas “humanização”.
[035]Um “anticorpo humanizado” refere-se a um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção de uma região variável modificada de um anticorpo humano em que uma porção da região variável, preferivelmente uma porção substancialmente menor do que o domínio variável humano intacto, foi substituída pela sequência correspondente de uma espécie não humana e em que a região variável modificada é ligada a pelo menos uma outra parte de uma outra proteína, preferivelmente a região constante de um anticorpo humano. A expressão “anticorpos humanizados” inclui anticorpos humanos em que um ou mais resíduos de aminoácido de região determi-nante de complementaridade (“CDR”) e/ou um ou mais resíduos de aminoácido de região de estrutura (“FW” ou “FR”) são substituídos por resíduos de aminoácido de sítios análogos em roedor ou outros anticorpos não humanos. A expressão “anticorpo humanizado” também inclui uma variante da sequência de aminoácido de imunoglo- bulina ou fragmento desta que compreende uma FR tendo substancialmente a sequência de aminoácido de uma imunoglobulina humana e uma CDR tendo substancialmente a sequência de aminoácido de uma imunoglobulina não humana.
[036]Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, de murino) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imuno- globulina não humana. Ou, considerado de um outro modo, um anticorpo humanizado é um anticorpo humano que também contém sequências selecionadas de anticorpos não humanos (por exemplo, de murino) no lugar das sequências humanas. Um anticorpo humanizado pode incluir substituições de aminoácido conservativas ou resíduos não naturais da mesma espécie ou diferente que não significantemente alteram sua atividade de ligação e/ou biológica. Tais anticorpos são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulinas não humanas.
[037]Existe uma faixa de técnicas de humanização, incluindo ‘enxerto de CDR’, ‘seleção guiada’, ‘desimunização’, ‘recapeamento’ (também conhecido como ‘laminação’), ‘anticorpos compósitos’, ‘Otimização de Conteúdo da Cadeia Humana ’ e rearranjo de estrutura.
Enxerto de CDR
[038]Nesta técnica, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas huma-nas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do anticorpo receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, camelo, bovino, cabra, ou coelho tendo as propriedades desejadas (em vigor, as CDRs não humanas são ‘enxertadas’ sobre a estrutura humana). Em alguns exemplos, resíduos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes (isto pode acontecer quando, por exemplo, um resíduo de FR particular tem efeito significante sobre a ligação ao antígeno).
[039]Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas sequências de CDR ou es-trutura importadas. Estas modificações são feitas para refinar e maximizar ainda o desempenho de anticorpo. Assim, em geral, um anticorpo humanizado compreenderá todos de pelo menos um, e em um aspecto dois, domínios variáveis, em que todas ou todas as sequências hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imuno- globulina, ou aquela de uma imunoglobulina humana.
Seleção guiada
[040]O método consiste em combinar o domínio VH ou VL de um anticorpo não humano dado específico para um epítopo particular com uma biblioteca de VH ou VL humana e domínios V humanos específicos são selecionados contra o antígeno de interesse. Este VH humano selecionado depois é combinado com uma biblioteca de VL para gerar uma combinação de VHxVL completamente humana. O método é descrito em Nature Biotechnology (N.Y.) 12, (1994) 899 - 903.
Anticorpos compósitos
[041]Neste método, dois ou mais segmentos de sequência de aminoácido de um anticorpo humano são combinados dentro da molécula de anticorpo final. Eles são construídos combinando-se segmentos de sequência de VH e VL humanos múltiplos em combinações que limitam ou evitam epítopos de célula T humanos nas regiões V de anticorpo compósito final. Onde necessário, epítopos de célula T são limitados ou evitados trocando-se segmentos da região V que contribuem para ou que codificam um epítopo de célula T com segmentos alternativos que evitam os epítopos de célula T. Este método é descrito em US 2008/0206239 A1.
Desimunização
[042]Este método envolve a remoção de epítopos de célula T humanos (ou outra espécie secundária) das regiões V do anticorpo terapêutico (ou outra molécula). A sequência da região V de anticorpos terapêuticos é analisada quanto à presença de motivos de inibição de MHC classe II, por exemplo, por comparação com bases de dados de motivos de ligação de MHC (tal como a base de dados de “motivos” hospedada em www.wehi.edu.au). Alternativamente, motivos de ligação de MHC classe II podem ser identificados usando métodos de processamento computacionais tais como aqueles desenvolvidos por Altuvia et al. (J. Mol. Biol. 249 244 - 250 (1995)); nestes métodos, peptídeos de sobreposição consecutivos das sequências de região V estão testando quanto às suas energias de ligação a proteínas de MHC classe II. Estes dados depois podem ser combinados com informação em outras características de sequência que referem-se a peptídeos apresentados com êxito, tais como anfipa- ticidade, motivos de Rothbard, e sítios de clivagem para catepsina B e outras enzimas de processamento.
[043]Uma vez que epítopos de célula T de espécie secundária potenciais (por exemplo, humanos) foram identificados, eles são eliminados pela alteração de um ou mais aminoácidos. Os aminoácidos modificados estão usualmente dentro do epítopo de célula T propriamente dito, mas também podem ser adjacentes ao epítopo em termos da estrutura primária ou secundária da proteína (e portanto, podem não ser adjacentes na estrutura primária). O mais tipicamente, a alteração é por via de substituição mas, em algumas circunstâncias a adição ou supressão de aminoácido será mais apropriada.
[044]Todas as alterações podem ser realizadas por tecnologia de DNA recombinante, de modo que a molécula final possa ser preparada por expressão de um hospedeiro recombinante usando métodos bem estabelecidos tais como Mutagê- nese Sítio Dirigida. Entretanto, o uso de química de proteína ou qualquer outro meio de alteração molecular também é possível.
Recapeamento
[045]Este método envolve: (a) determinar a estrutura conformacional da região variável do anticorpo não humano (por exemplo, de roedor) (ou fragmento deste) construindo-se um modelo tridimensional da região variável de anticorpo não humano; (b) gerar alinhamentos de sequência usando distribuições de acessibilidade relativas de estruturas cristalográficas de raio X de um número suficiente de cadeias pesadas e leves de região variável de anticorpo não humano e humano para fornecer um conjunto de posições de estrutura de cadeia pesada e leve em que as posições de alinhamento são idênticas em 98 % do número suficiente de cadeias pesadas e leves de anticorpo não humano; (c) definir quanto ao anticorpo não humano a ser humanizado, um conjunto de resíduos de aminoácido expostos à superfície de cadeia pesada e leve usando o conjunto de posições de estrutura geradas na etapa (b); (d) identificar a partir das sequências de aminoácido de anticorpo humano um conjunto de resíduos de aminoácido expostos à superfície de cadeia pesada e leve que é o mais estritamente idêntico ao conjunto de resíduos de aminoácido expostos à superfície definidos na etapa (c), em que a cadeia pesada e leve do anticorpo humano são ou não são naturalmente emparelhadas; (e) substituir, na sequência de aminoácido do anticorpo não humano a ser humanizado, o conjunto de resíduos de aminoácido expostos à superfície de cadeia pesada e leve definido na etapa (c) com o conjunto de resíduos de aminoácido expostos à superfície de cadeia pesada e leve identificado na etapa (d); (f) construir um modelo tridimensional da região variável do anticorpo não humano que resulta da substituição especificada na etapa (e); (g) identificar, comparando-se os modelos tridimensionais construídos nas etapas (a) e (f), quaisquer resíduos de aminoácido dos conjuntos identificados nas etapas (c) ou (d), que estão dentro de 5 Angstroms de qualquer átomo de qualquer resíduo das regiões determinantes de complementaridade do anticorpo não humano a ser humanizado; e (h) mudar quaisquer resíduos identificados na etapa (g) do resíduo de amino- ácido humano para o resíduo de aminoácido não humano original para desse modo definir um conjunto de humanização de anticorpo não humano de resíduos de amino- ácido expostos à superfície; com a condição de que a etapa (a) não precisa ser conduzida primeiro, mas deve ser conduzida antes da etapa (g). Super-humanização
[046]O método compara a sequência não humana com o repertório de gene de linhagem germinativa humana funcional. Aqueles genes humanos que codificam estruturas canônicas idênticas ou estritamente relacionadas às sequências não hu-manas são selecionados. Aqueles genes humanos selecionados com homologia mais alta dentro das CDRs são escolhidos como doadores de FR. Finalmente, as CDRs não humanas são enxertadas sobre essas FRs humanas. Este método é descrito na patente WO 2005/079479 A2.
Otimização de Conteúdo da Cadeia Humana
[047]Este método compara a sequência não humana (por exemplo, de ca-mundongo) com o repertório de genes de linhagem germinativa humana e as diferenças são registrada como Conteúdo da Cadeia Humana (HSC) que quantifica uma sequência no nível de epítopos de MHC/célula T potenciais. A sequência alvo depois é humanizada maximizando-se seu HSC ao invés de usar uma medida de identidade global para gerar variantes humanizadas diversas múltiplas (descritas em Molecular Immunology, 44, (2007) 1986-1998).
Rearranjo de estrutura
[048]As CDRs do anticorpo não humano são fundidas em estrutura a misturas de cDNA abrangendo todas as estruturas de gene de linhagem germinativa humana de cadeia pesada e leve conhecidas. Anticorpos humanizados depois são selecionados por exemplo, por movimentação da biblioteca de anticorpo exibida em fago. Isto é descrito em Methods 36, 43 - 60 (2005).
[049]Exemplos de agentes de ligação celular incluem aqueles agentes descritos para uso na WO 2007/085930 que é incorporada aqui.
[050]Antígenos associados a tumor e anticorpos cognatos para uso nas for-mas de realização da presente invenção são listados abaixo. ANTÍGENOS ASSOCIADOS A TUMOR E ANTICORPOS COGNATOS (1) BMPR1B (receptor de proteína morfogênica óssea-tipo IB) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_001203 N° da versão no Genbank NM_001203.2 GI:169790809 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Set. de 2012 02:06 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_001194 N° da versão no Genbank NP_001194.1 GI:4502431 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Set. de 2012 02:06 PM Referências cruzadas ten Dijke,P., et al Science 264 (5155): 101 - 104 (1994), Oncogene 14 10 (11):1377 - 1382 (1997)); WO2004/063362 (Reivindicação 2); WO2003/042661 (Rei-vindicação 12); US2003/134790-A1 (Página 38 a 39); WO2002/102235 (Reivindicação 13; Página 296); WO2003/055443 (Página 91 a 92); WO2002/99122 (Exemplo 2; Página 528 a 530); WO2003/029421 (Reivindicação 6); WO2003/024392 (Reivindicação 2; Fig 112); WO2002/98358 (Reivindicação 1; Página 183); WO2002/54940 (Página 100 a 101); WO2002/59377 (Página 349 a 350); WO2002/30268 (Reivindicação 27; Página 376); 15 WO2001/48204 (Exemplo; Fig 4); receptor de proteína morfogênica óssea NP_001194, tipo IB/pid=NP_001194,1.; MIM:603248; AY065994 (2) E16 (LAT1, SLC7A5) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_003486 N° da versão no Genbank NM_003486.5 GI:71979931 Dados de atualização de registro no Genbank: 27 de Jun. de 2012 12:06 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_003477 N° da versão no Genbank NP_003477.4 GI:71979932 Dados de atualização de registro no Genbank: 27 de Jun. de 2012 12:06 PM Referências cruzadas Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283 - 288 (1999), Nature 395 (6699): 288 - 291 (1998), Gaugitsch, H.W., et 20 al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16): 11267 - 11273); WO2004/048938 (Exemplo 2); WO2004/032842 (Exemplo IV); WO2003/042661 (Rei-vindicação 12); WO2003/016475 (Reivindicação 1); WO2002/78524 (Exemplo 2); WO2002/99074 (Reivindicação 19; Página 127 - 129); WO2002/86443 (Reivindicação 27; Páginas 222, 393); WO2003/003906 (Reivindicação 10; Página 293); WO2002/64798 (Reivindicação 33; Página 93 a 95); WO2000/14228 (Reivindicação 5; Página 133 a 136); US2003/224454 (Fig 3); WO2003/025138 (Reivindicação 12; Página 150); carregador de soluto NP_003477 família 7 (transportador de aminoácido catiônico, y+sistema), membro 5/pid=NP_003477,3 - Homo sapiens; MIM:600182;; NM_015923. (3) STEAP1 (antígeno epitelial de seis domínios de transmembrana da prós-tata) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_012449 N° da versão no Genbank NM_012449.2 GI:22027487 Dados de atualização de registro no Genbank: 9 de Set. de 2012 02:57 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_036581 N° da versão no Genbank NP_036581.1 GI:9558759 Dados de atualização de registro no Genbank: 9 de Set. de 2012 02:57 PM Referências cruzadas Cancer Res. 61 (15), 5857 - 5860 (2001), Hubert, R.S., et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25): 14523 - 14528); WO2004/065577 (Reivindicação 6); WO2004/027049 (Fig 1L); EP1394274 (Exemplo 11); WO2004/016225 (Reivindicação 2); WO2003/042661 (Reivindicação 12); US2003/157089 (Exemplo 5); US2003/185830 (Exemplo 5); US2003/064397 (Fig 2); WO2002/89747 (Exemplo 5; Página 618 a 619); WO2003/022995 (Exemplo 9; Fig 13A, 35 Exemplo 53; Página 173, Exemplo 2; Fig 2A); antígeno epitelial de seis domínios de transmembrana da próstata; MIM:604415. (4) 0772P (CA125, MUC16) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank AF361486 N° da versão no Genbank AF361486.3 GI:34501466 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 07:56 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAK74120 N° da versão no Genbank AAK74120.3 GI:34501467 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 07:56 AM Referências cruzadas J. Biol. Chem. 276 (29):27371 - 27375 (2001)); WO2004/045553 (Reivindica-ção 14); WO2002/92836 (Reivindicação 6; Fig 12); WO2002/83866 (Reivindicação 15; Página 116 a 121); US2003/124140 (Exemplo 16); GI:34501467; (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potenciação de megacariócito, mesote- lina) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_005823 N° da versão no Genbank NM_005823.5 GI:293651528 Dados de atualização de registro no Genbank: 2 de Set. de 2012 01:47 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_005814 N° da versão no Genbank NP_005814.2 GI:53988378 Dados de atualização de registro no Genbank: 2 de Set. de 2012 01:47 PM Referências cruzadas Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805 - 808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531 - 11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 10 (1):136 - 140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984 - 21990 (1995)); WO2003/101283 (Rei-vindicação 14); (WO2002/102235 (Reivindicação 13; Página 287 a 288); WO2002/101075 (Reivindicação 4; Página 308 a 309); WO2002/71928 (Página 320 a 321); WO94/10312 (Página 52 a 57); IM:601051. (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, carregador de soluto família 34 (fos-fato de sódio), membro 2, transportador de fosfato dependente de sódio tipo II 3b) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_006424 N° da versão no Genbank NM_006424.2 GI:110611905 Dados de atualização de registro no Genbank: 22 de Jul. de 2012 03:39 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_006415 N° da versão no Genbank NP_006415.2 GI:110611906 Dados de atualização de registro no Genbank: 22 de Jul. de 2012 03:39 PM Referências cruzadas J. Biol. Chem. 277 (22):19665 - 19672 (2002), Genomics 62 (2):281 - 284 (1999), Feild, J.A., et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578 - 582); WO2004/022778 (Reivindicação 2); EP1394274 (Exemplo 11); WO2002/102235 (Rei-vindicação 13; Página 20 326); EP0875569 (Reivindicação 1; Página 17 a 19); WO2001/57188 (Reivindicação 20; Página 329); WO2004/032842 (Exemplo IV); WO2001/75177 (Reivindicação 24; Página 139 a 140); MIM:604217. (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm,42015, SEMA5B, SEMAG, Semafo- rina 5b Hlog, 25 domínio sema, sete repetições de trombospondina (tipo 1 e semelhante ao tipo 1), domínio de transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank AB040878 N° da versão no Genbank AB040878.1 GI:7959148 Dados de atualização de registro no Genbank: 2 de Agosto de 2006 05:40 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank BAA95969 N° da versão no Genbank BAA95969.1 GI:7959149 Dados de atualização de registro no Genbank: 2 de Agosto de 2006 05:40 PM Referências cruzadas Nagase T., et al (2000) DNA Res. 7 (2):143 - 150); WO2004/000997 (Reivindicação 1); WO2003/003984 (Reivindicação 1); WO2002/06339 (Reivindica-ção 1; Página 50); WO2001/88133 (Reivindicação 1; Página 41 a 43, 48 a 58); WO2003/054152 (Reivindicação 20); WO2003/101400 (Reivindicação 11); Acesso: 30 Q9P283; Genew; HGNC:10737 (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA gene 2700050C12) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank AY358628 N° da versão no Genbank AY358628.1 GI:37182377 Dados de atualização de registro no Genbank: 1 de Dez de 2009 04:15 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAQ88991 N° da versão no Genbank AAQ88991.1 GI:37182378 Dados de atualização de registro no Genbank: 1 de Dez de 2009 04:15 AM Referências cruzadas Ross et al (2002) Cancer Res. 62:2546 - 2553; US2003/129192 (Reivindica-ção 2); US2004/044180 (Reivindicação 12); US2004/044179 35 (Reivindicação 11); US2003/096961 (Reivindicação 11); US2003/232056 (Exemplo 5); WO2003/105758 16 (Reivindicação 12); US2003/206918 (Exemplo 5); EP1347046 (Reivindicação 1); WO2003/025148 (Reivindicação 20); GI:37182378. (9) ETBR (Receptor tipo B de endotelina) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank AY275463 N° da versão no Genbank AY275463.1 GI:30526094 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 02:26 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAP32295 N° da versão no Genbank AAP32295.1 GI:30526095 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 02:26 AM Referências cruzadas Nakamuta M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34 - 39, 1991; Og-awa Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248 - 255, 1991; Arai H., et al Jpn. Circ. J. 56, 1303 - 1307, 1992; Arai H., et al J. Biol. Chem. 268, 3463 - 3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656 - 663, 1991; Elshourbagy N.UM., et al J. Biol. Chem. 268, 3873 - 3879, 1993; Haendler B., et al J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al Gene 228, 43 - 49, 1999; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.UM. 99, 16899 - 16903, 2002; Bourgeois C., et al J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116 - 3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol. Chem. 272, 21589 - 21596, 1997; Verheij J.B., et al Am. J. Med. Genet. 108, 223 - 225, 2002; Hofstra R.M.W., et al Eur. J. Hum. Genet. 5, 180 - 185, 1997; Puffenberger E.G., et al Cell 79, 1257 - 1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407 - 2409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Genet. 5:351 - 354, 1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Genet. 5, 355 - 357, 1996; Hofstra R.M.W., et al Nat. Genet. 12, 445 - 447, 1996; Svensson P.J., et al Hum. Genet. 103, 145 - 148, 1998; Fuchs S., et al Mol. Med. 7, 115 - 124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum. Genet. 111, 198 - 206; WO2004/045516 (Reivindicação 1); WO2004/048938 (Exemplo 2); WO2004/040000 (Reivindicação 151); WO2003/087768 (Reivindicação 1); 20 WO2003/016475 (Reivindicação 1); WO2003/016475 (Reivindicação 1); WO2002/61087 (Fig 1); WO2003/016494 (Fig 6); WO2003/025138 (Reivindicação 12; Página 144); WO2001/98351 (Reivindicação 1; Página 124 a 125); EP0522868 (Reivindicação 8; Fig 2); WO2001/77172 (Reivindicação 1; Página 297 a 299); US2003/109676; US6518404 (Fig 3); US5773223 (Reivindicação 1a; Col 31 a 34); WO2004/001004. (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_017763 N° da versão no Genbank NM_017763.4 GI:167830482 Dados de atualização de registro no Genbank: 22 de Jul. de 2012 12:34 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_060233 N° da versão no Genbank NP_060233.3 GI:56711322 Dados de atualização de registro no Genbank: 22 de Jul. de 2012 12:34 AM Referências cruzadas WO2003/104275 (Reivindicação 1); WO2004/046342 (Exemplo 2); WO2003/042661 (Reivindicação 12); WO2003/083074 (Reivindicação 14; Página 61); WO2003/018621 (Reivindicação 1); WO2003/024392 (Reivindicação 2; Fig 93); WO2001/66689 (Exemplo 6); LocusID:54894. (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado ao câncer de próstata, proteína 1 associada ao câncer de próstata, antígeno epitelial de seis domínios de transmembrana da próstata 2, proteína de seis domínios de transmembrana da próstata) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank AF455138 N° da versão no Genbank AF455138.1 GI:22655487 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 01:54 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAN04080 N° da versão no Genbank AAN04080.1 GI:22655488 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 01:54 AM Referências cruzadas Lab. Invest. 82 (11):1573 - 1582 (2002)); WO2003/087306; US2003/064397 (Reivindicação 1; Fig 1); WO2002/72596 (Reivindicação 13; Página 54 a 55); WO2001/72962 (Reivindicação 1; Fig 4B); 35 WO2003/104270 (Reivindicação 11); WO2003/104270 (Reivindicação 16); US2004/005598 (Reivindicação 22); WO2003/042661 (Reivindicação 12); US2003/060612 (Reivindicação 12; Fig 10); WO2002/26822 (Reivindicação 23; Fig 2); WO2002/16429 (Reivindicação 12; Fig 10); GI:22655488. (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de cátion potencial de receptor transitório, subfamília M, membro 4) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_017636 N° da versão no Genbank NM_017636.3 GI:304766649 Dados de atualização de registro no Genbank: 29 de Jun de 2012 11:27 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_060106 N° da versão no Genbank NP_060106.2 GI:21314671 Dados de atualização de registro no Genbank: 29 de Jun de 2012 11:27 AM Referências cruzadas Xu, X.Z., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692 - 10697 (2001), Cell 109 (3):397 - 407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813 - 30820 (2003)); US2003/143557 (Reivindicação 4); WO2000/40614 (Reivindicação 14; Página 100 a 103); WO2002/10382 (Reivindicação 1; Fig 9A); WO2003/042661 (Reivindicação 12); WO2002/30268 (Reivindicação 27; Página 391); US2003/219806 (Reivindicação 4); WO2001/62794 (Reivindicação 10 14; Fig 1A-D); MIM:606936. (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento deri-vado de teratocarcinoma) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_003212 N° da versão no Genbank NM_003212.3 GI:292494881 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Set. de 2012 02:27 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_003203 N° da versão no Genbank NP_003203.1 GI:4507425 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Set. de 2012 02:27 PM Referências cruzadas Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7):1987 - 1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555 - 565 (1991)); US2003/224411 (Reivindicação 1); WO2003/083041 (Exem-plo 1); WO2003/034984 (Reivindicação 12); WO2002/88170 (Reivindicação 2; Página 52 a 53); WO2003/024392 (Reivindicação 2; Fig 58); WO2002/16413 (Reivindicação 1; Página 94 a 95, 105); WO2002/22808 (Reivindicação 2; Fig 1); US5854399 (Exemplo 2; Col 17 - 18); US5792616 (Fig 2); MIM:187395. (14) CD21 (CR2 (Receptor de complemento 2) ou C3DR (receptor de vírus C3d/Epstein Barr) ou Hs.73792) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank M26004 N° da versão no Genbank M26004.1 GI:181939 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:47 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA35786 N° da versão no Genbank AAA35786.1 GI:181940 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:47 AM Referências cruzadas Fujisaku et al (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118 - 2125); Weis J.J., et al J. Exp. Med. 167, 1047 - 1066, 1988; Moore M., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194 - 9198, 1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35, 1025 - 1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639 - 5643, 1986; Sinha S.K., et al (1993) J. Immunol. 150, 5311 - 5320; WO2004/045520 (Exemplo 4); US2004/005538 (Exemplo 1); WO2003/062401 (Reivindicação 9); WO2004/045520 (Exemplo 4); WO91/02536 (Fig 9.1 - 9.9); WO2004/020595 (Reivindicação 1); Acesso: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786,1. (15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (beta imunoglobulina-associado), B29) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank NM_000626 N° da versão no Genbank NM_000626.2 GI:90193589 Dados de atualização de registro no Genbank: 26 de Jun de 2012 01:53 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_000617 N° da versão no Genbank NP_000617.1 GI:11038674 Dados de atualização de registro no Genbank: 26 de Jun de 2012 01:53 PM Referências cruzadas Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068 - 3076, Muller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625); WO2004/016225 (reivindicação 2, Fig 140); WO2003/087768, US2004/101874 (rei-vindicação 1, página 102); WO2003/062401 (reivindicação 9); WO2002/78524 (Exem-plo 2); US2002/150573 (reivindicação 35 5, página 15); US5644033; WO2003/048202 (reivindicação 1, páginas 306 e 309); WO 99/58658, US6534482 (reivindicação 13, Fig 17A/B); WO2000/55351 (reivindicação 11, páginas 1145 a 1146); MIM:147245 (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína 1a de âncora de fosfatase contendo domínio SH2), SPAP1B, SPAP1C) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank NM_030764 N° da versão no Genbank NM_030764.3 GI:227430280 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Jun de 2012 12:30 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_110391 N° da versão no Genbank NP_110391.2 GI:19923629 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Jun de 2012 12:30 AM Referências cruzadas AY358130); Genome Res. 13 (10):2265 - 2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87 - 95 (2002), Blood 99 (8):2662 - 2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772 - 9777 (2001), Xu, M.J., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768 - 775; WO2004/016225 (Reivindicação 2); WO2003/077836; WO2001/38490 (Reivindicação 5; Fig 18D-1 - 18D-2); WO2003/097803 (Reivindicação 12); 10 WO2003/089624 (Reivindicação 25);: MIM:606509. (17) HER2 (ErbB2) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank M11730 N° da versão no Genbank M11730.1 GI:183986 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:47 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA75493 N° da versão no Genbank AAA75493.1 GI:306840 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:47 AM Referências cruzadas Coussens L., et al Science (1985) 230(4730):1132 - 1139); Yamamoto T., et al Nature 319, 230 - 234, 1986; Semba K., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497 - 6501, 1985; Swiercz J.M., et al J. Cell Biol. 165, 869- 15 880, 2004; Kuhns J.J., et al J. Biol. Chem. 274, 36422 - 36427, 1999; Cho H.-S., et al Nature 421, 756 - 760, 2003; Ehsani UM., et al (1993) Genomics 15, 426 - 429; WO2004/048938 (Exemplo 2); WO2004/027049 (Fig 1I); WO2004/009622; WO2003/081210; WO2003/089904 (Reivindicação 9); WO2003/016475 (Reivindicação 1); US2003/118592; WO2003/008537 (Reivindicação 1); WO2003/055439 (Reivindicação 29; Fig 1A-B); WO2003/025228 (Reivindicação 37; Fig 5C); 20 WO2002/22636 (Exemplo 13; Página 95 a 107); WO2002/12341 (Reivindicação 68; Fig 7); WO2002/13847 (Página 71 a 74); WO2002/14503 (Página 114 - 117); WO2001/53463 (Reivindicação 2; Página 41 a 46); WO2001/41787 (Página 15); WO2000/44899 (Reivindicação 52; Fig 7); WO2000/20579 (Reivindicação 3; Fig 2); US5869445 (Reivindicação 3; Col 31 a 38); WO9630514 (Reivindicação 2; Página 56 a 61); EP1439393 (Reivindicação 7); WO2004/043361 (Reivindicação 7); WO2004/022709; WO2001/00244 25 (Exemplo 3; Fig 4); Acesso: P04626; EMBL; M11767; AAA35808,1. EMBL; M11761; AAA35808,1 ANTICORPOS Abbott: US20110177095 Por exemplo, um anticorpo compreendendo CDRs tendo geralmente pelo menos 80 % de identidade de sequência a CDRs tendo sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 3 (CDR-H1), SEQ ID NO: 4 (CDR-H2), SEQ ID NO: 5 (CDR-H3), SEQ ID NO: 104 e/ou SEQ ID NO: 6 (CDR-L1), SEQ ID NO: 7 (CDR-L2), e SEQ ID NO: 8 (CDR-L3), em que o anticorpo anti-HER2 ou fragmento de ligação anti-HER2 tem imu- nogenicidade reduzida quando comparado a um anticorpo tendo um VH da SEQ ID NO: 1 e um VL da SEQ ID NO: 2. Biogen: US20100119511 Por exemplo, números de acesso na ATCC: PTA-10355, PTA-10356, PTA- 10357, PTA-10358 Por exemplo, uma molécula de anticorpo purificada que liga-se a HER2 com-preendendo um total de seis CDR’s de um anticorpo selecionado do grupo consistindo em BIIB71F10 (SEQ ID NOs: 11, 13), BIIB69A09 (SEQ ID NOs: 15, 17); BIIB67F10 (SEQ ID NOs: 19, 21); BIIB67F11 (SEQ ID NOs: 23, 25), BIIB66A12 (SEQ ID NOs: 27, 29), BIIB66C01 (SEQ ID NOs: 31, 33), BIIB65C10 (SEQ ID NOs: 35, 37), BIIB65H09 (SEQ ID NOs: 39, 41) e BIIB65B03 (SEQ ID NOs: 43, 45), ou CDRs que são idênticas ou que têm não mais do que duas alterações das ditas CDRs. Herceptina (Genentech)- US6.054.297; N° de acesso na ATCC CRL-10463 (Genentech) Pertuzumabe (Genentech) US20110117097 por exemplo, ver SEQ IDs No. 15 & 16, SEQ IDs No. 17 & 18, SEQ IDs No. 23 & 24 & números de acesso na ATCC HB-12215, HB-12216, CRL 10463, HB-12697. US20090285837 US20090202546 por exemplo, números de acesso na ATCC: HB-12215, HB-12216, CRL 10463, HB-12698. US20060088523 por exemplo, números de acesso na ATCC: HB-12215, HB-12216 por exemplo, um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácido variáveis leves e variáveis pesadas nas SEQ ID NOs. 3 e 4, respectivamente. por exemplo, um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácido de cadeia leve selecionada das SEQ ID NOs. 15 e 23, e uma sequência de aminoácido de cadeia pesada selecionada das SEQ ID NOs. 16 e 24 US20060018899 por exemplo, números de acesso na ATCC: (7C2) HB-12215, (7F3) HB- 12216, (4D5) CRL-10463, (2C4) HB-12697. por exemplo, um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido na SEQ ID NO. 23, ou uma variante desamidada e/ou oxidada deste. US2011/0159014 por exemplo, um anticorpo tendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo as regiões hipervariáveis da SEQ ID NO: 1”. Por exemplo, um anticorpo tendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo as regiões hipervariáveis da SEQ ID NO: 2. US20090187007 Glycotope: anticorpo TrasGEX http://www.glycotope.com/pipeline Por exemplo, ver International Joint Cancer Institute e Changhai Hospital Cancer Cent: HMTI-Fc Ab - Gao J., et al BMB Rep. 31 de Out. de 2009; 42(10):636 - 41. Symphogen: US20110217305 Union Stem Cell & Gene Engineering, China - Liu HQ., et al Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. Maio de 2010;26(5):456 - 8. (18) NCA (CEACAM6) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank M18728 N° da versão no Genbank M18728.1 GI:189084 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:48 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA59907 N° da versão no Genbank AAA59907.1 GI:189085 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:48 AM Referências cruzadas Barnett T., et al Genomics 3, 59 - 66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Bi-ophys. Res. Commun. 150, 89 - 96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899 - 16903, 2002; WO2004/063709; EP1439393 (Reivindicação 7); WO2004/044178 (Exemplo 4); WO2004/031238; WO2003/042661 (Reivindicação 12); WO2002/78524 (Exemplo 2); WO2002/86443 (Reivindicação 27; Página 427); WO2002/60317 (Reivindicação 2); Acesso: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915,1. EMBL; M18728. (19) MDP (DPEP1) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank BC017023 N° da versão no Genbank BC017023.1 GI:16877538 Dados de atualização de registro no Genbank: 6 de Mar. de 2012 01:00 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAH17023 N° da versão no Genbank AAH17023.1 GI:16877539 Dados de atualização de registro no Genbank: 6 de Mar. de 2012 01:00 PM Referências cruzadas Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899 - 16903 (2002)); WO2003/016475 (Reivindicação 1); WO2002/64798 (Reivindicação 33; Página 85 a 87); JP05003790 (Fig 6 a 8); WO99/46284 (Fig 9); MIM:179780. (20) IL20R-alfa (IL20Ra, ZCYTOR7) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank AF184971 N° da versão no Genbank AF184971.1 GI:6013324 Dados de atualização de registro no Genbank: 10 de Mar. de 2010 10:00 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAF01320 N° da versão no Genbank AAF01320.1 GI:6013325 Dados de atualização de registro no Genbank: 10 de Mar. de 2010 10:00 PM Referências cruzadas Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265 - 2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805 - 811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9 - 19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545 - 3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517 - 47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) 10 Biochemistry 42:12617 - 12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol. 172, 2006 - 2010; EP1394274 (Exemplo 11); US2004/005320 (Exemplo 5); WO2003/029262 (Página 74 a 75); WO2003/002717 (Reivindicação 2; Página 63); WO2002/22153 (Página 45 a 47); US2002/042366 (Página 20 a 21); WO2001/46261 (Página 57 a 59); WO2001/46232 (Página 63 a 65); WO98/37193 (Reivindicação 1; Página 55 a 59); Acesso: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320,1. (21) Brevican (BCAN, BEHAB) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank AF229053 N° da versão no Genbank AF229053.1 GI:10798902 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 12:58 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAG23135 N° da versão no Genbank AAG23135.1 GI:10798903 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 12:58 AM Referências cruzadas Gary S.C., et al Gene 256, 139 - 147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265 - 2270, 2003; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899 - 16903, 2002; US2003/186372 (Reivindicação 11); US2003/186373 (Reivindicação 11); US2003/119131 (Reivindicação 1; Fig 52); US2003/119122 (Reivindicação 1; 20 Fig 52); US2003/119126 (Reivindicação 1); US2003/119121 (Reivindicação 1; Fig 52); US2003/119129 (Reivindicação 1); US2003/119130 (Reivindicação 1); US2003/119128 (Reivindicação 1; Fig 52); US2003/119125 (Reivindicação 1); WO2003/016475 (Reivindicação 1); WO2002/02634 (Reivindicação 1) (22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank NM_004442 N° da versão no Genbank NM_004442.6 GI:111118979 Dados de atualização de registro no Genbank: 8 de Set. de 2012 04:43 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_004433 N° da versão no Genbank NP_004433.2 GI:21396504 Dados de atualização de registro no Genbank: 8 de Set. de 2012 04:43 PM Referências cruzadas Chan,J. e Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057 - 1061 (1991) Oncogene 10 (5):897 - 905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309 - 345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177 - 244 (2000)); WO2003042661 (Reivindicação 12); WO200053216 (Reivindi-cação 1; Página 41); WO2004065576 (Reivindicação 1); WO2004020583 (Reivindicação 9); WO2003004529 (Página 128 - 132); WO200053216 (Reivindicação 1; Página 42); MIM:600997. (23) ASLG659 (B7h) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank AX092328 N° da versão no Genbank AX092328.1 GI:13444478 Dados de atualização de registro no Genbank: 26 de Jan. de 2011 07:37 AM Referências cruzadas US2004/0101899 (Reivindicação 2); WO2003104399 (Reivindicação 11); WO2004000221 (Fig 3); US2003/165504 (Reivindicação 1); US2003/124140 (Exem-plo 2); US2003/065143 (Fig 60); WO2002/102235 (Reivindicação 13; Página 299); US2003/091580 (Exemplo 2); WO2002/10187 (Reivindicação 6; Fig 10); WO2001/94641 (Reivindicação 12; Fig 7b); WO2002/02624 (Reivindicação 13; Fig 1A-1B); US2002/034749 (Reivindicação 54; Página 45 a 46); WO2002/06317 (Exem-plo 2; Página 320 a 321, Reivindicação 34; Página 321 a 322); WO2002/71928 (Pá-gina 468 a 469); WO2002/02587 (Exemplo 1; Fig 1); WO2001/40269 (Exemplo 3; Páginas 190 a 192); WO2000/36107 (Exemplo 2; Página 205 a 207); WO2004/053079 (Reivindicação 12); WO2003/004989 (Reivindicação 1); WO2002/71928 (Página 233 a 234, 452 a 453); WO 01/16318. (24) PSCA (Precursor de antígeno de célula tronco da próstata) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank AJ297436 N° da versão no Genbank AJ297436.1 GI:9367211 Dados de atualização de registro no Genbank: 1 de Fev. de 2011 11:25 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank CAB97347 N° da versão no Genbank CAB97347.1 GI:9367212 Dados de atualização de registro no Genbank: 1 de Fev. de 2011 11:25 AM Referências cruzadas Reiter R.E., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735 - 1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288 - 1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783 - 788; WO2004/022709; EP1394274 (Exemplo 11); US2004/018553 (Rei-vindicação 17); WO2003/008537 (Reivindicação 1); WO2002/81646 (Reivindicação 1; Página 164); WO2003/003906 (Reivindicação 10; Página 288); WO2001/40309 (Exemplo 1; Fig 17); US2001/055751 (Exemplo 1; Fig 1b); WO2000/32752 (Reivindi-cação 18; Fig 1); WO98/51805 (Reivindicação 17; Página 97); WO98/51824 (Reivin-dicação 10; Página 94); WO98/40403 (Reivindicação 2; Fig 1B); Acesso: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607,1 (25) GEDA Nucleotídeo n° de acesso no Genbank AY260763 N° da versão no Genbank AY260763.1 GI:30102448 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 02:24 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAP14954 N° da versão no Genbank AAP14954.1 GI:30102449 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 02:24 AM Referências cruzadas AP14954 lipoma HMGIC fusion-partnerlike protein/pid=AAP14954,1 - Homo sapiens (human); WO2003/054152 (Reivindicação 20); WO2003/000842 (Reivindica-ção 1); WO2003/023013 (Exemplo 3, Reivindicação 20); US2003/194704 (Reivindica-ção 45); GI:30102449; (26) BAFF-R (Receptor do fator de ativação de célula B, receptor 3 de BLyS, BR3) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank AF116456 N° da versão no Genbank AF116456.1 GI:4585274 Dados de atualização de registro no Genbank: 10 de Mar. de 2010 09:44 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAD25356 N° da versão no Genbank AAD25356.1 GI:4585275 Dados de atualização de registro no Genbank: 10 de Mar. de 2010 09:44 PM Referências cruzadas BAFF receptor/pid=NP_443177,1 - Homo sapiens: Thompson, J.S., et al Sci-ence 293 (5537), 2108 - 2111 (2001); WO2004/058309; WO2004/011611; WO2003/045422 (Exemplo; Página 32 a 33); WO2003/014294 (Reivindicação 35; Fig 6B); WO2003/035846 (Reivindicação 70; Página 615 a 616); WO2002/94852 (Col 136 - 137); WO2002/38766 25 (Reivindicação 3; Página 133); WO2002/24909 (Exemplo 3; Fig 3); MIM:606269; NP_443177,1; NM_052945_1; AF132600 (27) CD22 (Isoforma de CD22-B do receptor de célula B, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank AK026467 N° da versão no Genbank AK026467.1 GI:10439337 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Set. de 2006 11:24 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank BAB15489 N° da versão no Genbank BAB15489.1 GI:10439338 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Set. de 2006 11:24 PM Referências cruzadas Wilson et al (1991) J. Exp. Med. 173:137 - 146; 30 WO2003/072036 (Reivin-dicação 1; Fig 1); IM:107266; NP_001762,1; NM_001771_1. (27a) CD22 (Molécula de CD22) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank X52785 N° da versão no Genbank X52785.1 GI:29778 Dados de atualização de registro no Genbank: 2 de Fev. de 2011 10:09 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank CAA36988 N° da versão no Genbank CAA36988.1 GI:29779 Dados de atualização de registro no Genbank: 2 de Fev. de 2011 10:09 AM Referências cruzadas Stamenkovic I. et al., Nature 345 (6270), 74 - 77 (1990)?? Outra informação Símbolo oficial: CD22 Outros nomes: SIGLEC-2, SIGLEC2 Outras Designações: receptor de célula B CD22; molécula de adesão de célula de linfócito B; BL-CAM; antígeno de CD22; antígeno de superfície de célula T Leu-14; lectina 2 semelhante a Ig de ligação de ácido siálico; lectina 2 semelhante a Ig de ligação de ácido siálico ANTICORPOS G5/44 (Inotuzumab): DiJoseph JF.,et al Cancer Immunol Immunother. Jan. de 2005;54(1):11 - 24. Epratuzumabe- Goldenberg DM., et al Expert Rev Anticancer Ther. 6(10): 1341 - 53, 2006. (28) CD79a (CD79A, CD79alfa), alfa imunoglobulina-associada, uma proteína específica de célula B que covalentemente interage com Ig beta (CD79B) e forma um complexo na superfície com moléculas de Ig M 35, transduz um sinal envolvido na diferenciação de célula B), pI: 4,84, MW: 25028 TM: 2 [P] Cromossomo do gene: 19q13,2). Nucleotídeo n° de acesso no Genbank NM_001783 N° da versão no Genbank NM_001783.3 GI:90193587 Dados de atualização de registro no Genbank: 26 de Jun de 2012 01:48 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_001774 N° da versão no Genbank NP_001774.1 GI:4502685 Dados de atualização de registro no Genbank: 26 de Jun de 2012 01:48 PM Referências cruzadas WO2003/088808, US2003/0228319; WO2003/062401 (reivindicação 9); US2002/150573 (reivindicação 4, páginas 13 - 14); WO99/58658 (reivindicação 13, Fig 16); WO92/07574 (Fig 1); US5644033; Ha et al (1992) J. Immunol. 148(5):1526 - 1531; Müller et al (1992) Eur. J. Immunol.. 22:1621 - 1625; Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4):287 - 295; Preud’homme et al (1992) Clin. Exp. 5 Immunol. 90(1):141 - 146; Yu et al (1992) J. Immunol. 148(2) 633 - 637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457 - 3464 (29) CXCR5 (receptor 1 de linfoma de Burkitt, um receptor acoplato a proteína G que é ativado pela quimiocina CXCL13, funciona na migração do linfócito e defesa humoral, desempenha um papel na infecção por HIV-2 e talvez o desenvolvimento de AIDS, linfoma, mieloma, e leucemia); 372 aa, pI: 8,54 MW: 41959 TM: 7 [P] Cromossomo do gene: 11q23,3, Nucleotídeo n° de acesso no Genbank NM_001716 N° da versão no Genbank NM_001716.4 GI:342307092 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:49 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_001707 N° da versão no Genbank NP_001707.1 GI:4502415 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:49 PM Referências cruzadas WO2004/040000; WO2004/015426; US2003/105292 (Exemplo 2); US6555339 (Exemplo 2); WO2002/61087 (Fig 1); WO2001/57188 (Reivindicação 20, página 269); WO2001/72830 (páginas 12 - 13); WO2000/22129 (Exemplo 1, páginas 152 - 153, 15 Exemplo 2, páginas 254 - 256); WO99/28468 (reivindicação 1, página 38); US5440021 (Exemplo 2, col 49 - 52); WO94/28931 (páginas 56 - 58); WO92/17497 (reivindicação 7, Fig 5); Dobner et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795 - 2799; Barella et al (1995) Biochem. J. 309:773 - 779 (30) HLA-DOB (subunidade beta de molécula de MHC classe II (antígeno Ia) que liga peptídeos e os apresenta a linfócitos T CD4+); 273 aa, pI: 6,56, MW: 30820.TM: 1 [P] Cromossomo do Gene: 6p21,3) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank NM_002120 N° da versão no Genbank NM_002120.3 GI:118402587 Dados de atualização de registro no Genbank: 8 de Set. de 2012 04:46 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_002111 N° da versão no Genbank NP_002111.1 GI:4504403 Dados de atualização de registro no Genbank: 8 de Set. de 2012 04:46 PM Referências cruzadas Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4(11):2839 - 2847; Jonsson et al (1989) Immu-nogenetics 29(6):411 - 413; Beck et al (1992) J. Mol. Biol. 228:433 - 441; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899- 16903; Servenius et al (1987) J. Biol. Chem. 262:8759 - 8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol. 25 255:1 - 13; Naruse et al (2002) Tissue Antigens 59:512 - 519; WO99/58658 (reivindicação 13, Fig 15); US6153408 (Col 35 - 38); US5976551 (col 168 - 170); US6011146 (col 145 - 146); Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30(1):66 - 68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111 - 14119 (31) P2X5 (canal iônico ativado por ligado de P2X de receptor purinérgico 5, um canal iônico ativado por ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogênese, deficiência pode contribuir para a fisiopatologia de instabili-dade de detrusor idiopático); 422 aa), pI: 7,63, MW: 47206 TM: 1 [P] Cromossomo do gene: 17p13,3). Nucleotídeo n° de acesso no Genbank NM_002561 N° da versão no Genbank NM_002561.3 GI:325197202 Dados de atualização de registro no Genbank: 27 de Jun. de 2012 12:41 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_002552 N° da versão no Genbank NP_002552.2 GI:28416933 Dados de atualização de registro no Genbank: 27 de Jun. de 2012 12:41 AM Referências cruzadas Le et al (1997) FEBS Lett. 418(1 - 2):195 - 199; WO2004/047749; WO2003/072035 (reivindicação 10); Touchman et al (2000) Genome Res. 10:165 - 173; WO2002/22660 (reivindicação 20); WO2003/093444 (reivindicação 1); WO2003/087768 (reivindicação 1); WO2003/029277 (página 82) (32) CD72 (antígeno CD72 de diferenciação de célula B, Lyb-2); 359 aa, pI: 8,66, MW: 40225, TM: 1 5 [P] Cromossomo do gene: 9p13,3). Nucleotídeo n° de acesso no Genbank NM_001782 N° da versão no Genbank NM_001782.2 GI:194018444 Dados de atualização de registro no Genbank: 26 de Jun de 2012 01:43 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_001773 N° da versão no Genbank NP_001773.1 GI:4502683 Dados de atualização de registro no Genbank: 26 de Jun de 2012 01:43 PM Referências cruzadas WO2004042346 (reivindicação 65); WO2003/026493 (páginas 51 - 52, 57 - 58); WO2000/75655 (páginas 105 - 106); Von Hoegen et al (1990) J. Immunol. 144(12):4870 - 4877; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899 - 16903. (33) LY64 (Antígeno linfocítico 64 (RP105), proteína de membrana tipo I da família de repetição rica em leucina (LRR), regula a ativação de célula B e apoptose, perda de função é associada com atividade da doença aumentada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico); 661 aa, pI: 6,20, MW: 74147 TM: 1 [P] Cromossomo do gene: 5q12). Nucleotídeo n° de acesso no Genbank NM_005582 N° da versão no Genbank NM_005582.2 GI:167555126 Dados de atualização de registro no Genbank: 2 de Set. de 2012 01:50 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_005573 N° da versão no Genbank NP_005573.2 GI:167555127 Dados de atualização de registro no Genbank: 2 de Set. de 2012 01:50 PM Referências cruzadas US2002/193567; WO97/07198 (reivindicação 11, páginas 39 - 42); Miura et al (1996) 15 Genomics 38(3):299 - 304; Miura et al (1998) Blood 92:2815 - 2822; WO2003/083047; WO97/44452 (reivindicação 8, páginas 57 - 61); WO2000/12130 (páginas 24 - 26). (34) FcRH1 (proteína 1 semelhante a receptor Fc, um receptor putativo para o domínio Fc de imunoglobulina que contém domínos ITAM e semelhantes a Ig do tipo C2, pode ter um papel na diferenciação de linfócito B); 429 aa, pI: 5,28, MW: 46925 TM: 1 [P] Cromossomo do gene: 1q21 - 1q22) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank NM_052938 N° da versão no Genbank NM_052938.4 GI:226958543 Dados de atualização de registro no Genbank: 2 de Set. de 2012 01:43 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_443170 N° da versão no Genbank NP_443170.1 GI:16418419 Dados de atualização de registro no Genbank: 2 de Set. de 2012 01:43 PM Referências cruzadas WO2003/077836; WO2001/38490 (reivindicação 6, Fig 18E-1 - 18-E-2); Davis et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772 - 9777; WO2003/089624 (reivindicação 8); EP1347046 (reivindicação 1); WO2003/089624 (reivindicação 7). (35) IRTA2 (Translocação do receptor da superfamília de imunoglobulina as-sociado 2, um imunorreceptor putativo com papéis possíveis no desenvolvimento de célula B e linfomagênese; desregulação do gene por translocação ocorre em algumas malignidades de célula B); 977 aa, pI: 6,88, MW: 106468, TM: 1 [P] Cromossomo do gene: 1q21) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank AF343662 N° da versão no Genbank AF343662.1 GI:13591709 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 01:16 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAK31325 N° da versão no Genbank AAK31325.1 GI:13591710 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 01:16 AM Referências cruzadas AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Mouse: AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571,1; WO2003/024392 (reivindicação 2, Fig 97); Nakayama et al (2000) Bio- chem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124 - 127; WO2003/077836; WO2001/38490 (reivindicação 3, Fig 18B-1 - 18B-2). (36) TENB2 (TMEFF2, tomorregulina, TPEF, HPP1, TR, proteoglicano de transmembrana putativo, relacionado à família de EGF/heregulina de fatores de cres-cimento e follistatina); 374 aa) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank AF179274 N° da versão no Genbank AF179274.2 GI:12280939 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 01:05 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAD55776 N° da versão no Genbank AAD55776.2 GI:12280940 Dados de atualização de registro no Genbank: 11 de Mar. de 2010 01:05 AM Referências cruzadas Acesso NCBI: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; gene NCBI: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; AY358907, CAF85723, CQ782436; WO2004/074320; JP2004113151; WO2003/042661; WO2003/009814; EP1295944 (páginas 69 - 70); WO2002/30268 (página 329); WO2001/90304; US2004/249130; US2004/022727; WO2004/063355; US2004/197325; US2003/232350; 5 US2004/005563; US2003/124579; Horie et al (2000) Genomics 67:146 - 152; Uchida et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593 - 602; Liang et al (2000) Cancer Res. 60:4907 - 12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Câncer. 15 de Out.; 94(2):178 - 84. (37) PSMA - FOLH1 (Folato hidrolase (antígeno de membrana específico da próstata) 1) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank M99487 N° da versão no Genbank M99487.1 GI:190663 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:48 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA60209 N° da versão no Genbank AAA60209.1 GI:190664 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:48 AM Referências cruzadas Israeli R.S., et al Cancer Res. 53 (2), 227 - 230 (1993) Outra informação Símbolo oficial: FOLH1 Outros nomes: GIG27, FGCP, FOLH, GCP2, GCPII, NAALAD1, NAALAdase, PSM, PSMA, mGCP Outras Designações: Dipeptidase ácida alfa-ligada N-acetilada 1; Dipeptidase ácida alfa-ligada N-acetilada I; NAALADase I; proteína de gene 27 de inibição de crescimento celular; folilpoli-gama-glutamato carboxipeptidase; glutamato carboxilase II; glutamato carboxipeptidase 2; glutamato carboxipeptidase II; glutamato carboxipeptidase de membrana; variante de antígeno F membrana específica da próstata; pteroil- poli-gama-glutamato carboxipeptidase ANTICORPOS US 7.666.425: Anticorpos produzidos por Hibridomas tendo as referências de ATCC seguin-tes: com N° de acesso na ATCC HB-12101, com N° de acesso na ATCC HB-12109, com N° de acesso na ATCC HB-12127 e com N° de acesso na ATCC HB-12126. Proscan: um anticorpo monoclonal selecionado do grupo consistindo em 8H12, 3E11, 17G1, 29B4, 30C1 e 20F2 (US 7,811,564; Moffett S., et al Hibridoma (Larchmt). Dez de 2007;26(6):363 - 72). Cytogen: anticorpos monoclonais 7E11-C5 (com N° de acesso na ATCC HB 10494) e 9H10-A4 (com N° de acesso na ATCC HB11430) - US 5.763.202 GlycoMimetics: NUH2 - com N° de acesso na ATCC HB 9762 (US 7.135.301) Human Genome Science: HPRAJ70 - com N° de acesso na ATCC 97131 (US 6.824.993); Sequência de aminoácido codificada pelo clone de cDNA (HPRAJ70) depositado como American Type Culture Collection (“ATCC”) Depósito N° 97131 Medarex: anticorpos anti-PSMA que carecem de resíduos de fucosila - US 7.875.278 Anticorpos anti-PSMA de camundongo incluem os 3F5,4G6, 3D7,1,1, 4E10- 1,14, 3E11, 4D8, 3E6, 3C9, 2C7, 1G3, 3C4, 3C6, 4D4, 1G9, 5C8B9, 3G6, 4C8B9, e anticorpos monoclonais. Hibridomas secretando 3F5,4G6, 3D7,1,1, 4E10-1,14, 3E11, 4D8, 3E6, 3C9, 2C7, 1G3, 3C4, 3C6, 4D4, 1G9, 5C8B9, 3G6 ou 4C8B9 foram publicamente depositados e são descritos na Pat. U.S. N° 6.159.508. Hibridomas relevantes foram publicamente depositados e são descritos na Pat. U.S. N° 6.107.090. Além disso, anticorpos anti-PSMA humanizados, incluindo uma versão humanizada de J591, são descritos em mais detalhe na Publicação PCT WO 02/098897. Outros anticorpos de PSMA anti-humanos de camundongo foram descritos na técnica, tais como mAb 107-1A4 (Wang, S. et al. (2001) Int. J. Cancer 92:871 - 876) e mAb 2C9 (Kato, K. et al. (2003) Int. J. Urol. 10:439 - 444). Exemplos de anticorpos monoclonais anti-PSMA humanos incluem os anticorpos 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 e 1C3, isolados e estruturalmente caracterizados como originalmente descrito em Publicações PCT WO 01/09192 e WO 03/064606 e na Publicação Provisória U.S. Ser. N° 60/654.125, intitulada “Human Monoclonal Antibodies to Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA)”, depositado em 18 de Fev. de 2005. As sequências de aminoácido V.sub.H de 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 e 1C3 são mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 9, respectivamente. As sequências de aminoácido V.sub.L de 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 e 1C3 são mostradas nas SEQ ID NOs: 10 a 18, respectivamente. Outros anticorpos anti-PSMA humanos incluem os anticorpos divulgados na Publicação PCT WO 03/034903 e Pedido US N° 2004/0033229. NW Biotherapeutics: Uma linhagem de célula de hibridoma selecionada do grupo consistindo em 3F5,4G6 tendo número de acesso na ATCC HB12060, 3D7-1.I. tendo número de acesso na ATCC HB12309, 4E10-1.14 tendo número de acesso na ATCC HB12310, 3E11 (ATCC HB12488), 4D8 (ATCC HB12487), 3E6 (ATCC HB12486), 3C9 (ATCC HB12484), 2C7 (ATCC HB12490), 1G3 (ATCC HB12489), 3C4 (ATCC HB12494), 3C6 (ATCC HB12491), 4D4 (ATCC HB12493), 1G9 (ATCC HB12495), 5C8B9 (ATCC HB12492) e 3G6 (ATCC HB12485) - ver US 6.150.508 PSMA Development Company/Progenics/Cytogen - Seattle Genetics: mAb 3.9, produzido pelo hibridoma depositado sob N° de acesso na ATCC PTA-3258 ou mAb 10.3, produzido pelo hibridoma depositado sob N° de acesso na ATCC PTA-3347 - US 7.850.971 PSMA Development Company- Composições de anticorpos de PSMA (US 20080286284, Tabela 1) Este pedido é uma divisão do Pedido de Patente U.S. Ser. N° 10/395.894, depositado em 21 de Mar. de 2003 (US 7.850.971) University Hospital Freiburg, Alemaha - mAbs 3/A12, 3/E7, e 3/F11 (Wolf P., et al Prostate. 1 de Abr. de 2010;70(5):562 - 9). (38) SST (Receptor de Somatostatina; note que existem 5 subtipos) (38,(1) SSTR2 (receptor 2 de somatostatina) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank NM_001050 N° da versão no Genbank NM_001050.2 GI:44890054 Dados de atualização de registro no Genbank: 19 de Agosto de 2012 01:37 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_001041 N° da versão no Genbank NP_001041.1 GI:4557859 Dados de atualização de registro no Genbank: 19 de Agosto de 2012 01:37 PM Referências cruzadas Yamada Y., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (1), 251 - 255 (1992); Susini C., et al Ann Oncol. 2006 Dec;17(12):1733 - 42 Outra informação Símbolo oficial: SSTR2 Outras Designações: SRIF-1; SS2R; receptor tipo 2 de somatostatina (38,(2) SSTR5 (receptor 5 de somatostatina) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank D16827 N° da versão no Genbank D16827.1 GI:487683 Dados de atualização de registro no Genbank: 1 de Agosto de 2006 12:45 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank BAA04107 N° da versão no Genbank BAA04107.1 GI:487684 Dados de atualização de registro no Genbank: 1 de Agosto de 2006 12:45 PM Referências cruzadas Yamada,Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 195 (2), 844 - 852 (1993) Outra informação Símbolo oficial: SSTR5 Outros nomes: SS-5-R Outras designações: Receptor subtipo 5 de somatostatina; receptor tipo 5 de somatostatina (38,(3) SSTR1 (38,4)SSTR3 (38,(5) SSTR4 AvB6 - Ambas as subunidades (39+40) (39) ITGAV (Integrina, alfa V; Nucleotídeo n° de acesso no Genbank M14648 J02826 M18365 N° da versão no Genbank M14648.1 GI:340306 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:56 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA36808 N° da versão no Genbank AAA36808.1 GI:340307 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:56 AM Referências cruzadas Suzuki S., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (22), 8614 - 8618 (1986) Outra informação Símbolo oficial: ITGAV Outros nomes: CD51, MSK8, VNRA, VTNR Outras designações: antígeno identificado por anticorpo monoclonal L230; in- tegrina alfa-V; integrina alfaVbeta3; integrina, alfa V (receptor de vitronectina, alfa polipeptídeo, antígeno CD51); subunidade alfa do receptor de vitronectina (40) ITGB6 (Integrina, beta 6) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank NM_000888 N° da versão no Genbank NM_000888.3 GI:9966771 Dados de atualização de registro no Genbank: 27 de Jun. de 2012 12:46 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_000879 N° da versão no Genbank NP_000879.2 GI:9625002 Dados de atualização de registro no Genbank: 27 de Jun. de 2012 12:46 AM Referências cruzadas Sheppard D.J., et al Biol. Chem. 265 (20), 11502 - 11507 (1990) Outra informação Símbolo oficial: ITGB6 Outras designações: integrina beta-6 ANTICORPOS Biogen: US 7.943.742 - Clones de hibridoma 6,3G9 e 6,8G6 foram deposita-dos com os números de acesso na ATCC, ATCC PTA-3649 e -3645, respectivamente. Biogen: US7.465.449 - Em algumas formas de realização, o anticorpo com-preende as mesmas sequências de polipeptídeo de cadeia pesada e leve como um anticorpo produzido pelo hibridoma 6,1A8, 6,3G9, 6,8G6, 6,2B1, 6,2B10, 6,2A1, 6,2E5, 7,1G10, 7,7G5, ou 7,1C5. Centocor (J & J): US7.550.142; US7.163.681 Por exemplo em US 7.550.142 - um anticorpo tendo regiões variáveis de ca-deia pesada humana e cadeia leve humana compreendendo as sequências de ami- noácido mostradas em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8. Seattle Genetics: 15H3 (Ryan MC., et al Cancer Res 15 de Abril de 2012; 72(8 Supplement): 4630) (41) CEACAM5 (molécula de adesão de célula 5 relacionada a antígeno car- cino-embrionário) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank M17303 N° da versão no Genbank M17303.1 GI:178676 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:47 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAB59513 N° da versão no Genbank AAB59513.1 GI:178677 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:47 AM Referências cruzadas Beauchemin N., et al Mol. Cell. Biol. 7 (9), 3221 - 3230 (1987) Outra informação Símbolo oficial: CEACAM5 Outros nomes: CD66e, CEA Outras designações: antígeno de mecônio 100 ANTICORPOS AstraZeneca-MedImmune:US 20100330103; US20080057063; US20020142359 por exemplo um anticorpo tendo regiões determinantes de complementari-dade (CDRs) com as sequências seguintes: cadeia pesada; CDR1 - DNYMH, CDR2 - WIDPENGDTE YAPKFRG, CDR3 - LIYAGYLAMD Y; e cadeia leve CDR1 - SASSSVTYMH, CDR2 - STSNLAS, CDR3 - QQRSTYPLT. Hibridoma 806.077 depositado como European Collection of Cell Cultures (ECACC) depósito n° 96022936. Research Corporation Technologies, Inc.:US5.047.507 Bayer Corporation: US6.013.772 BioAlliance: US7.982.017; US7.674.605 US 7.674.605 um anticorpo compreendendo a sequência de região variável de cadeia pe-sada da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, e a sequência de região variável de cadeia leve da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. um anticorpo compreendendo a sequência de região variável de cadeia pe-sada da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5, e a sequência de região variável de cadeia leve da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6. Celltech Therapeutics Limited: US5.877.293 The Dow Chemical Company: US5.472.693; US6.417.337; US6.333.405 US5.472.693 - por exemplo, ATCC N° CRL-11215 US6.417.337 - por exemplo, ATCC CRL-12208 US6.333.405 - por exemplo, ATCC CRL-12208 Immunomedics, Inc: US7.534.431; US7.230.084; US7.300.644; US6.730.300; US20110189085 um anticorpo tendo CDRs da região variável de cadeia leve compreendem: CDR1 compreende KASQDVGTSVA (SEQ ID NO: 20); CDR2 compreende WTSTRHT (SEQ ID NO: 21); e CDR3 compreende QQYSLYRS (SEQ ID NO: 22); e as CDRs da região variável de cadeia pesada do dito anticorpo anti-CEA compreendem: CDR1 compreende TYWMS (SEQ ID NO: 23); CDR2 compreende EIHPDSSTINYAPSLKD (SEQ ID NO: 24); e CDR3 compreende LYFGFPWFAY (SEQ ID NO: 25). US20100221175; US20090092598; US20070202044; US20110064653; US20090185974; US20080069775. (42) MET (met proto-oncogene; receptor do fator de crescimento de hepató- cito) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank M35073 N° da versão no Genbank M35073.1 GI:187553 Dados de atualização de registro no Genbank: 6 de Mar. de 2012 11:12 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA59589 N° da versão no Genbank AAA59589.1 GI:553531 Dados de atualização de registro no Genbank: 6 de Mar. de 2012 11:12 AM Referências cruzadas Dean M., et al Nature 318 (6044), 385 - 388 (1985) Outra informação Símbolo oficial: MET Outros nomes: AUTS9, HGFR, RCCP2, c-Met Outras designações: receptor de HGF; receptor de HGF/SF; receptor de SF; receptor do fator de crescimento de hepatócito; met proto-oncogene tirosina cinase; proto-oncogene c-Met; receptor do fator de dispersão; tirosina-proteína cinase Met ANTICORPOS Abgenix/Pfizer: US20100040629 por exemplo, o anticorpo produzido pelo hibridoma 13,3,2 tendo número de acesso da American Typo Culture Collection (ATCC) PTA-5026; o anticorpo produzido pelo hibridoma 9,1,2 tendo número de acesso na ATCC PTA-5027; o anticorpo produzido pelo hibridoma 8,70,2 tendo número de acesso na ATCC PTA-5028; ou o anticorpo produzido pelo hibridoma 6,90,3 tendo número de acesso na ATCC PTA-5029. Amgen/Pfizer: US20050054019 por exemplo, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada tendo as se-quências de aminoácido apresentadas na SEQ ID NO: 2 onde X2 é glutamato e X4 é serina e uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 4 onde X8 é alanina, sem as sequências de sinal; um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada tendo as sequências de aminoácido apresentadas na SEQ ID NO: 6 e uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 8, sem as sequências de sinal; um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada tendo as sequências de aminoácido apresentadas na SEQ ID NO: 10 e uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12, sem as sequências de sinal; ou um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada tendo as sequências de aminoácido apresentadas na SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 16, sem as sequências de sinal. Agouron Pharmaceuticals (Now Pfizer): US20060035907 Eli Lilly: US20100129369 Genentech: US5.686.292; US20100028337; US20100016241; US20070129301; US20070098707; US20070092520. US20060270594; US20060134104; US20060035278; US20050233960; US20050037431 US 5.686.292 - por exemplo, ATCC HB-11894 e ATCC HB-11895 US 20100016241 - por exemplo, ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3,3,13) ou HB-11895 (hibridoma 5D5,11,6) National Defense Medical Center, Taiwan: Lu RM., et al Biomaterials. Abril de 2011;32(12):3265 - 74. Novartis: US20090175860 por exemplo, um anticorpo compreendendo as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada 4687, em que as sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia pesada 4687 são resíduos 26 - 35, 50 - 65, e 98 - 102, respectivamente, da SEQ ID NO: 58; e as sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve 5097, em que as sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve 5097 são resíduos 24 - 39,55 - 61, e 94 - 100 da SEQ ID NO: 37. Pharmacia Corporation: US20040166544 Pierre Fabre: US20110239316, US20110097262, US20100115639 Sumsung: US 20110129481 - por exemplo um anticorpo monoclonal produ-zido de uma célula de hibridoma tendo número de acesso KCLRF-BP-00219 ou nú-mero de acesso de CLRF-BP-00223. Samsung: US 20110104176 - por exemplo um anticorpo produzido por uma célula de hibridoma tendo Número de Acesso: KCLRF-BP-00220. University of Turin Medical School: DN-30 Pacchiana G., et al J Biol Chem. 12 de Nov de 2010;285(46):36149 - 57 Van Andel Research Institute: Jiao Y., et al Mol Biotechnol. Set. de 2005;31(1):41 - 54. (43) MUC1 (Mucin 1, associado à superfície celular) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank J05581 N° da versão no Genbank J05581.1 GI:188869 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:48 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA59876 N° da versão no Genbank AAA59876.1 GI:188870 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:48 AM Referências cruzadas Gendler S.J., et al J. Biol. Chem. 265 (25), 15286 - 15293 (1990) Outra informação Símbolo oficial: MUC1 Outros nomes: RP11 - 263K19,2, CD227, EMA, H23AG, KL-6, MAM6, MUC- 1, MUC-1/SEC, MUC-1/X, MUC1/ZD, PEM, PEMT, PUM Outras designações: antígeno de DF3; antígeno de H23; antígeno de DF3 associado a carcinoma de mama; mucina associada a carcinoma; episialina; krebs von den Lungen-6; mucina 1, transmembrana; mucina-1; mucina urinária reativa em amendoim; mucina epitelial polimórfica; mucina epitelial associada a tumor; antígeno de membrana epitelial associado a tumor; mucina associada a tumor ANTICORPOS AltaRex- Quest Pharma Tech: US 6,716,966 - por exemplo um anticorpo Alt- 1 produzido pelo hibridoma ATCC N° PTA-975. AltaRex- Quest Pharma Tech: US7.147.850 CRT: 5E5 - S0rensen AL., et al Glycobiology vol. 16 no. 2 páginas 96-107, 2006; HMFG2 - Burchell J., et al Cancer Res., 47, 5476-5482 (1987) Glycotope GT-MAB: GT-MAB 2,5-GEX (Website: http://www.glyco- tope.com/pipeline/pankomab-gex) Imunógeno: US7.202.346 por exemplo, anticorpo MJ-170: linhagem de célula de hibridoma MJ-170 N° de acesso na ATCC PTA-5286Anticorpo monoclonal MJ-171: linhagem de célula de hibridoma MJ-171 N° de acesso na ATCC PTA-5287; anticorpo monoclonal MJ-172: linhagem de célula de hibridoma MJ-172 N° de acesso na ATCC PTA-5288; ou anti-corpo monoclonal MJ-173: linhagem de célula de hibridoma MJ-173 N° de acesso na ATCC PTA-5302 Immunomedics: US 6.653.104 Ramot Tel Aviv Uni: US7.897.351 Regents Uni. CA: US 7.183.388; US20040005647; US20030077676. Roche GlycArt: US8.021.856 Russian National Cancer Research Center: Imuteran- Ivanov PK., et al Bio- technol J. 2007 Jul;2(7):863 - 70 Technische Univ Braunschweig: (IIB6, HT186-B7, HT186-D11, HT186-G2, HT200 - 3A-C1, HT220-M-D1, HT220-M-G8)- Thie H., et al PLoS A. 14 de Jun de 2011;6(1):e15921 (44) CA9 (anidrase carbônica IX) Nucleotídeo n° de acesso no Genbank . X66839 N° da versão no Genbank X66839.1 GI:1000701 Dados de atualização de registro no Genbank: 2 de Fev. de 2011 10:15 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank CAA47315 N° da versão no Genbank CAA47315.1 GI:1000702 Dados de atualização de registro no Genbank: 2 de Fev. de 2011 10:15 AM Referências cruzadas Pastorek J., et al Oncogene 9 (10), 2877 - 2888 (1994) Outra informação Símbolo oficial: CA9 Outros nomes: CAIX, MN Outras designações: CA-IX; P54/58N; antígeno G250 RCC-associado; proteína G250 RCC-associada; carbonato desidratase IX; anidrase carbônica 9; desi- dratase carbônica; antígeno de membrana MN; pMW1; antígeno G250 associado a carcinoma de células renais ANTICORPOS Abgenix/Amgen: US20040018198 Affibody: moléculas Anti-CAIX Affibody (http://www.affibody.com/en/Product-Portfolio/Pipeline/) Bayer: US7,462,696 Bayer/Morfosys: 3ee9 mAb - Petrul HM., et al Mol Cancer Ther. Fev de 2012;11(2):340 - 9 Harvard Medical School: Anticorpos G10, G36, G37, G39, G45, G57, G106, G119, G6, G27, G40 e G125. Xu C., et al PLoS A. Mar de 2010 10;5(3):e9625 Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences (Bayer)- US5.955.075 por exemplo, M75- N° de acesso na ATCC HB 11128 ou MN12 - N° de acesso na ATCC HB 11647 Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences: US7.816.493 por exemplo o anticorpo monoclonal M75 que é secretado do hibridoma VU- M75, que foi depositado na American Type Culture Collection sob ATCC No. HB 11128; ou o anticorpo monoclonal V/10 secretado do hibridoma V/10-VU, que foi de-positado no International Depository Authority of the Belgian Coordinated Collection of Microorganisms (BCCM) at the Laboratorium voor Moleculaire Bioloqie-Plasmidencol- lectie (LMBP) at the Universeit Gent in Gent, Belgium, sob Acesso No. LMBP 6009CB. Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences US20080177046; US20080176310; US20080176258; US20050031623 Novartis: US20090252738 Wilex: US7.691.375 - por exemplo o anticorpo produzido pela linhagem de célula de hibridoma DSM ASC 2526. Wilex: US20110123537; Rencarex: Kennett RH., et al Curr Opin Mol Ther. Fev. de 2003;5(1):70 - 5 Xencor: US20090162382 (45) EGFRvIII (Receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), variante 3 do transcrito, Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_201283 N° da versão no Genbank NM_201283.1 GI:41327733 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:47 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_958440 N° da versão no Genbank NP_958440.1 GI:41327734 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:47 PM Referências cruzadas Batra SK., et al Cell Growth Differ 1995;6:1251-1259. ANTICORPOS: US7.628.986 e US7.736.644 (Amgen) Por exemplo, uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pe-sada selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 142 e variantes & uma se-quência de aminoácido de região variável de cadeia leve selecionada do grupo con-sistindo em: SEQ ID NO: 144 e variantes. US20100111979 (Amgen) Por exemplo, um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácido de cadeia pesada compreendendo: CDR1 consistindo em uma sequência selecionado do grupo consistindo nas sequências de aminoácido para a região CDR1 de anticorpos 13,1,2 (SEQ ID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQ ID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), e 333 (SEQ ID NO: 17); CDR2 consistindo em uma sequência selecionado do grupo consistindo nas sequências de aminoácido para a região CDR2 dos anticorpos 13,1,2 (SEQ ID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQ ID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), e 333 (SEQ ID NO: 17); e CDR3 consistindo em uma sequência selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácido para a região CDR3 de anticorpos 13,1,2 (SEQ ID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQ ID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), e 333 (SEQ ID NO: 17). US20090240038 (Amgen) Por exemplo, um anticorpo tendo pelo menos um dos polipeptídeos de cadeia pesada ou leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90 % idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, e qualquer combinação destas. US20090175887 (Amgen) Por exemplo, um anticorpo tendo uma sequência de aminoácido de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo na sequência de aminoácido de cadeia pesada do anticorpo 13,1,2 (SEQ ID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQ ID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), e 333 (SEQ ID NO: 17). US20090156790 (Amgen) Por exemplo, anticorpo tendo polipeptídeo de cadeia pesada e um polipeptídeo de cadeia leve, em que pelo menos um dos polipeptídeos de cadeia pesada ou leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90 % idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, e qualquer combinação destas. US20090155282, US20050059087 e US20050053608 (Amgen) Por exemplo, uma sequência de aminoácido de cadeia pesada de anticorpo selecionada do grupo consistindo na sequência de aminoácido de cadeia pesada do anticorpo 13,1,2 (SEQ ID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQ ID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), e 333 (SEQ ID NO: 17). MR1-1 (US7.129.332; Duke) Por exemplo, um anticorpo variante tendo a sequência da SEQ ID NO. 18 com as substituições S98P-T99Y nos CDR3 VH, e F92W em CDR3 VL. L8A4, H10, Y10 (Wikstrand CJ., et al Cancer Res. 15 de Jul de 1995;55(14):3140 - 8; Duke) US20090311803 (Harvard University) Por exemplo, SEQ ID NO: 9 para região variável de cadeia pesada de anti-corpo, e SEQ ID NO: 3 para sequências de aminoácido de região variável de cadeia leve US20070274991 (EMD72000, também conhecido como matuzumabe; Har-vard University) Por exemplo, SEQ ID NOs: 3 & 9 para cadeia leve e cadeia pesada respecti-vamente US6.129.915 (Schering) Por exemplo, SEQ. ID NOs: 1,2, 3, 4, 5 e 6. mAb CH12 - Wang H., et al FASEB J. Jan de 2012;26(1):73 - 80 (Shanghai Cancer Institute). RAbDMvIII - Gupta P., et al BMC Biotechnol. 7 de Out. de 2010;10:72 (Stan-ford University Medical Center). mAb Ua30 - Ohman L., et al Tumour Biol. Mar. a Abr. de 2002;23(2):61 - 9 (Uppsala University). Han DG., et al Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. Jan de 2010;30(1):25 - 9 (Xi’um Jiaotong University). (46) CD33 (molécula de CD33) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank M_23197 N° da versão no Genbank NM_23197.1 GI:180097 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:47 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA51948 N° da versão no Genbank AAA51948.1 GI:188098 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:47 AM Referências cruzadas Simmons D., et al J. Immunol. 141 (8), 2797 - 2800 (1988) Outra informação Símbolo oficial: CD33 Outros nomes: SIGLEC-3, SIGLEC3, p67 Outras designações: antígeno de CD33 (gp67); gp67; antígeno CD33 de su-perfície de mielócito; lectina 3 semelhante a Ig de ligação de ácido siálico; lectina se-melhante a Ig de ligação de ácido siálico ANTICORPOS H195 (Lintuzumab)- Raza A., et al Leuk Linfoma. Agosto de 2009;50(8):1336 - 44; US6,759,045 (Seattle Genetics/Immunomedics) mAb OKT9: Sutherland, D.R. et al. Proc Natl Acad Sci USA 78(7): 4515 - 4519 1981, Schneider,C., et al J Biol Chem 257, 8516 - 8522 (1982) mAb E6: Hoogenboom,H.R., et al J Immunol 144, 3211 - 3217 (1990) US6,590,088 (Human Genome Sciences) Por exemplo, SEQ ID NOs: 1 e 2 e N° de acesso na ATCC 97521 US7.557.189 (Imunógeno) Por exemplo, um anticorpo ou fragmento deste compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende três CDRs tendo as sequências de ami- noácido das SEQ ID NOs: 1 a 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo três CDRs tendo as sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 4 a 6. (47) CD19 (molécula de CD19) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_001178098 N° da versão no Genbank NM_001178098.1 GI:296010920 Dados de atualização de registro no Genbank: 10 de Set de 2012 12:43 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_001171569 N° da versão no Genbank NP_001171569.1 GI:296010921 Dados de atualização de registro no Genbank: 10 de Set de 2012 12:43 AM Referências cruzadas Tedder TF., et al J. Immunol. 143 (2): 712-7 (1989) Outra informação Símbolo oficial: CD19 Outros nomes: B4, CVID3 Outras designações: Antígeno de linfócito B CD19; Antígeno superfície de lin- fócito B B4; antígeno de superfície de célula T Leu-12; antígeno de diferenciação CD19 ANTICORPOS Imunógeno: HuB4 - Al-Katib AM., et al Clin Cancer Res. 15 de Jun de 2009;15(12):4038 - 45. 4G7: Kügler M., et al Protein Eng Des Sel. Mar de 2009;22(3):135 - 47 Por exemplo, sequências na Fig. 3 de Knappik, A. et al. J Mol Biol Fev de 2000;296(1):57 - 86 AstraZeneca/MedImmune: MEDI-551 - Herbst R., et al J Pharmacol Exp Ther. Out. de 2010;335(1):213 - 22 Glenmark Pharmaceuticals: GBR-401 - Hou S., et al Mol Cancer Ther 10 de Novembro de 2011 (Meeting Abstract Supplement) C164 US7.109.304 (Immunomedics) Por exemplo, um anticorpo compreendendo a sequência de hA19Vk (SEQ ID NO: 7) e a sequência de hA19VH (SEQ ID NO: 10) US7,902,338 (Immunomedics) Por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que compreende as sequências de região determinante de complementaridade CDR de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 16 (KASQSVDYDGDSYLN); CDR2 da SEQ ID NO: 17 (DASNLVS); e CDR3 da SEQ ID NO: 18 (QQSTEDPWT) e as sequências de CDR de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 19 (SYWMN); CDR2 da SEQ ID NO: 20 (QIWPGDGDTNYNGKFKG) e CDR3 da SEQ ID NO: 21 (RETTTVGRYYYAMDY) e também compreende estrutura de anticorpo humano (FR) e sequências de região constante com um ou mais resíduos de aminoácido de região de estrutura substituídos das sequências de região de estrutura correspondentes do anticorpo de murino precursor, e em que os ditos resíduos de FR substituídos compreendem a substituição de serina no lugar de fenilalanina no resíduo 91 de Kabat da região variável de cadeia pesada. Medarex: MDX-1342 - Cardarelli PM., et al Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):257 - 65. MorfoSys/Xencor: MOR-208/XmAb-5574 - Zalevsky J., et al Blood. 16 de Abril de 2009;113(16):3735 - 43 US7.968.687 (Seattle Genetics) Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 24. 4G7 chim - Lang P., et al Blood. 15 de Maio de 2004;103(10):3982 - 5 (Uni-versity of Tübingen) Por exemplo, fig. 6 e SEQ ID No: 80 de US20120082664 Zhejiang University School of Medicine: 2E8 - Zhang J., et al J Target Drug. Nov de 2010;18(9):675 - 8 (48) IL2RA (receptor de Interleucina 2, alfa); Sequência de Referência de NCBI: NM_000417,2); Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_000417 N° da versão no Genbank NM_000417.2 GI:269973860 Dados de atualização de registro no Genbank: 09 de Set. de 2012 04:59 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_000408 N° da versão no Genbank NP_000408.1 GI:4557667 Dados de atualização de registro no Genbank: 09 de Set. de 2012 04:59 PM Referências cruzadas Kuziel W.A., et al J. Invest. Dermatol. 94 (6 SUPPL), 27S-32S (1990) Outra informação Símbolo oficial: IL2RA Outros nomes: RP11 - 536K7,1, CD25, IDDM10, IL2R, TCGFR Outras designações: subunidade alfa do receptor de FIL-2; IL-2-RA; subuni- dade alfa de IL-2R; IL2-RA; antígeno de TAC; subunidade alfa do receptor de inter- leucina-2; p55 ANTICORPOS US6.383.487 (Novartis/UCL: Baxilisimab [Simulect]) US6.521.230 (Novartis/UCL: Baxilisimab [Simulect]) Por exemplo, um anticorpo tendo um sítio de ligação ao antígeno compreende pelo menos um domínio que compreende CDR1 tendo a sequência de aminoácido na SEQ. ID. NO: 7, CDR2 tendo a sequência de aminoácido na SEQ. ID. NO: 8, e CDR3 chaving a sequência de aminoácido na SEQ. ID. NO: 9; ou a dita CDR1, CDR2 e CDR3 tomadas na sequência como um todo compreendem uma sequência de amino- ácido que é pelo menos 90 % idêntica às SEQ. ID. NOs: 7, 8 e 9 tomadas na sequência como um todo. Daclizumabe - Rech AJ., et al Ann N Y Acad Sci. Set. de 2009;1174:99 - 106 (Roche) (49) AXL (tirosina cinase do receptor AXL) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank M76125 N° da versão no Genbank M76125.1 GI:292869 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:53 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA61243 N° da versão no Genbank AAA61243.1 GI:29870 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:53 AM Referências cruzadas O’Bryan J.P., et al Mol. Cell. Biol. 11 (10), 5016 - 5031 (1991); Bergsagel P.L., et al J. Immunol. 148 (2), 590 - 596 (1992) Outra informação Símbolo oficial: AXL Outros nomes: JTK11, UFO Outras designações: oncogene de AXL; sequência/gene transformantes de AXL ; oncogene AXL; receptor UFO de tirosina-proteína cinase ANTICORPOS YW327,6S2 - Ye X., et al Oncogene. 23 de Set. de 2010;29(38):5254 - 64. (Genentech) BergenBio: BGB324 (http://www.bergenbio.com/BGB324) (50) CD30 - TNFRSF8 (Superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, membro 8) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank M83554 N° da versão no Genbank M83554.1 GI:180095 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:53 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA51947 N° da versão no Genbank AAA51947.1 GI:180096 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:53 AM Referências cruzadas Durkop H., et al Cell 68 (3), 421 - 427 (1992) Outra informação Símbolo oficial: TNFRSF8 Outros nomes: CD30, D1S166E, Ki-1 Outras designações: CD30L receptor; Ki-1 antígeno; citocina receptor CD30; lymphocyte ativação antígeno CD30; receptor do fator de necrose tumoral superfamily membro 8 (51) BCMA (antígeno de maturação de célula B)- TNFRSF17 (superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, membro 17) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank Z29574 N° da versão no Genbank Z29574.1 GI:471244 Dados de atualização de registro no Genbank: 02 de Fev de 2011 10:40 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank CAA82690 N° da versão no Genbank CAA82690.1 GI:471245 Dados de atualização de registro no Genbank: 02 de Fev de 2011 10:40 AM Referências cruzadas Laabi Y., et al Nucleic Acids Res. 22 (7), 1147 - 1154 (1994) Outra informação Símbolo oficial: TNFRSF17 Outros nomes: BCM, BCMA, CD269 Outras designações: antígeno de maturação de célula B; fator de maturação de célula B; proteína de maturação de célula B; superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, membro 17 (52) CT Ags - CTA (Antígenos de Câncer Testicular) Referências cruzadas Fratta E., et al. Mol Oncol. Abril de 2011;5(2):164 - 82; Lim SH., at al Am J Blood Res. 2012;2(1):29 - 35. (53) CD174 (Lewis Y)- FUT3 (fucosiltransferase 3 (galactosideo 3(4)-L-fuco- siltransferase, grupo sanguíneo de Lewis) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM000149 N° da versão no Genbank NM000149.3 GI:148277008 Dados de atualização de registro no Genbank: 26 de Jun de 2012 04:49 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_000140 N° da versão no Genbank NP_000140.1 GI:4503809 Dados de atualização de registro no Genbank: 26 de Jun de 2012 04:49 PM Referências cruzadas Kukowska-Latallo,J.F., et al Genes Dev. 4 (8), 1288 - 1303 (1990) Outra informação Símbolo oficial: FUT3 Outros nomes: CD174, FT3B, FucT-III, LE, Les Outras designações: Lewis FT; alfa-(1,3/1,4)-fucosiltransferase; alfa-4-fucosil- transferase do grupo sanguíneo de Lewis; fucosiltransferase III; galactosideo 3(4)-L- fucosyltransferase (54) CLEC14A (família do domínio de lectina do tipo C 14, membro A; N° de acesso no Genbank NM175060) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM175060 N° da versão no Genbank NM175060.2 GI:371123930 Dados de atualização de registro no Genbank: 01 de Abril de 2012 03:34 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_778230 N° da versão no Genbank NP_778230.1 GI:28269707 Dados de atualização de registro no Genbank: 01 de Abril de 2012 03:34 PM Outra informação Símbolo oficial: CLEC14A Outros nomes: UNQ236/PRO269, C14orf27, CEG1, EGFR-5 Outras designações: membro A da família 14 do domínio de lectina do tipo C; proteína contendo domínio semelhante a ClECT e EGF; receptor de fator de cresci-mento epidérmico 5 (55) GRP78 - HSPA5 (proteína de choque térmico de 70 kDa 5 (proteína re-gulada por glicose, 78 kDa) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM005347 N° da versão no Genbank NM005347.4 GI:305855105 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:42 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_005338 N° da versão no Genbank NP_005338.1 GI:16507237 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:42 PM Referências cruzadas Ting J., et al DNA 7 (4), 275 - 286 (1988) Outra informação Símbolo oficial: HSPA5 Outros nomes: BIP, GRP78, MIF2 Outras designações: proteína regulada por glicose de 78 kDa; proteína grp78 de ligação de Ca(2+) referente ao lúmen do retículo endoplasmático; proteína de liga-ção à cadeia pesada de imunoglobulina (56) CD70 (molécula de CD70 ) L08096 Nucleotídeo N° de acesso no Genbank L08096 N° da versão no Genbank L08096.1 GI:307127 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2012 08:54 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA36175 N° da versão no Genbank AAA36175.1 GI:307128 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2012 08:54 AM Referências cruzadas Goodwin R.G., et al Cell 73 (3), 447 - 456 (1993) Outra informação Símbolo oficial: CD70 Outros nomes: CD27L, CD27LG, TNFSF7 Outras designações: ligando de CD27; CD27-L; antígeno de CD70; antígeno de Ki-24; antígeno CD70 de superfície; superfamília do fator de necrose tumoral (li-gando), membro 7; membro 7 da superfamília do ligando do fator de necrose tumoral ANTICORPOS MDX-1411 contra CD70 (Medarex) h1F6 (Oflazoglu, E., et al, Clin Cancer Res. 1 de Out. de 2008;14(19):6171 - 80; Seattle Genética) Por exemplo, ver US20060083736 SEQ ID NOs: 1, 2, 11 e 12 e Fig. 1. (57) Antígenos específicos de célula tronco. Por exemplo: ■ 5T4 (ver entrada (63) abaixo) ■ CD25 (ver entrada (48) acima) ■ CD32 ■ Polipeptídeo ■ N° de acesso no Genbank ABK42161 ■ N° da versão no Genbank ABK42161.1 GI:117616286 ■ Dados de atualização de registro no Genbank: 25 de Jul de 2007 03:00 PM ■ LGR5/GPR49 ■ Nucleotídeo ■ N° de acesso no Genbank NM_003667 ■ N° da versão no Genbank NM_003667.2 GI:24475886 ■ Dados de atualização de registro no Genbank: 22 de Jul. de 2012 03:38 PM ■ Polipeptídeo ■ N° de acesso no Genbank NP_003658 ■ N° da versão no Genbank NP_003658.1 GI:4504379 ■ Dados de atualização de registro no Genbank: 22 de Jul. de 2012 03:38 PM ■ Prominin/CD133 ■ Nucleotídeo ■ N° de acesso no Genbank NM_006017 ■ N° da versão no Genbank NM_006017.2 GI:224994187 ■ Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:47 PM ■ Polipeptídeo ■ N° de acesso no Genbank NP_006008 ■ N° da versão no Genbank NP_006008.1 GI:5174387 ■ Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:47 PM (58) ASG-5 Referências cruzadas (Smith L.M., et.al AACR 2010 Annual Meeting (abstract #2590); Gudas J.M., et.al. AACR 2010 Annual Meeting (abstract #4393) ANTICORPOS Anticorpo Anti-AGS-5: M6,131 (Smith, L.M., et al AACR 2010 Annual Meeting (abstract #2590) (59) ENPP3 (pirofosfatase/fosfodiesterase 3 de ectonucleotídeo) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank AF005632 N° da versão no Genbank AF005632.2 GI:4432589 Dados de atualização de registro no Genbank: 10 de Mar. de 2010 09:41 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAC51813 N° da versão no Genbank AAC51813.1 GI:2465540 Dados de atualização de registro no Genbank: 10 de Mar. de 2010 09:41 PM Referências cruzadas Jin-Hua P., et al Genomics 45 (2), 412 - 415 (1997) Outra informação Símbolo oficial: ENPP3 Outros nomes: RP5-988G15,3, B10, CD203c, NPP3, PD-IBETA, PDNP3 Outras designações: E-NPP 3; dJ1005H11,3 (fosfodiesterase I/nucleotídeo pi- rofosfatase 3); dJ914N13,3 (fosfodiesterase I/nucleotídeo pirofosfatase 3); membro 3 da família de ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase; gp130RB13-6; fosfodiesterase I beta; fosfodiesterase I/nucleotídeo pirofosfatase 3; fosfodiesterase-I beta (60) PRR4 (Prolina rica 4 (lacrimal)) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_007244 N° da versão no Genbank NM_007244.2 GI:154448885 Dados de atualização de registro no Genbank: 28 de Jun de 2012 12:39 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_009175 N° da versão no Genbank NP_009175.2 GI:154448886 Dados de atualização de registro no Genbank: 28 de Jun de 2012 12:39 PM Referências cruzadas Dickinson D.P., et al Invest. Oftalmol. Vis. Sci. 36 (10), 2020 - 2031 (1995) Outra informação Símbolo oficial: PRR4 Outros nomes: LPRP, PROL4 Outras designações: proteína rica em prolina lacrimal; proteína 4 rica em pro-lina associada a carcinoma nasofaríngeo; polipeptídeo 4 rico em prolina; proteína 4 rica em prolina (61) GCC-GUCY2C (guanilato ciclase 2C (receptor de enterotoxina estável em calor) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_004963 N° da versão no Genbank NM_004963.3 GI:222080082 Dados de atualização de registro no Genbank: 02 de Set. de 2012 01:50 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_004954 N° da versão no Genbank NP_004954.2 GI:222080083 Dados de atualização de registro no Genbank: 02 de Set. de 2012 01:50 PM Referências cruzadas De Sauvage F.J., et al J. Biol. Chem. 266 (27), 17912 - 17918 (1991); Singh S., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 179 (3), 1455 - 1463 (1991) Outra informação Símbolo oficial: GUCY2C Outros nomes: DIAR6, GUC2C, MUCIL, STAR Outras designações: GC-C; receptor de STA; guanilil ciclase C; hSTAR; re-ceptor de enterotoxina estável em calor; guanilato ciclase intestinal (62) Liv-1-SLC39A6 (família 39 de carregador de soluto (transportador de zinco), membro 6) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank U41060 N° da versão no Genbank U41060.2 GI:12711792 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Nov. de 2009 04:35 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA96258 N° da versão no Genbank AAA96258.2 GI:12711793 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Nov. de 2009 04:35 PM Referências cruzadas Taylor KM., et al Biochim Biophys Acta. 1 de Abril de 2003;1611(1 - 2):16 - 30 Outra informação Símbolo oficial: SLC39A6 Outros nomes: LIV-1 Outras designações: proteína LIV-1, regulada por estrógeno; ZIP-6; proteína LIV-1 regulada por estrógeno; família 39 de carregador de soluto (transportador de íon metálico), membro 6; membro 6 da família 39 de carregador de soluto; transportador de zinco ZIP6; proteína 6 semelhante a zrt e Irt (63) 5T4, glicoproteína de Trofoblasto, TPBG-TPBG (glicoproteína de trofo- blasto) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank AJ012159 N° da versão no Genbank AJ012159.1 GI:3805946 Dados de atualização de registro no Genbank: 01 de Fev de 2011 10:27 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank CAA09930 N° da versão no Genbank CAA09930.1 GI:3805947 Dados de atualização de registro no Genbank: 01 de Fev de 2011 10:27 AM Referências cruzadas King K.W.,et al Biochim. Biophys. Acta 1445 (3), 257 - 270 (1999) Outra informação Símbolo oficial: TPBG Outros nomes: 5T4, 5T4AG, M6P1 Outras designações: antígeno oncofetal 5T4; glicoproteína de trofoblasto on-cofetal 5T4; glicoproteína de oncotrofoblasto 5T4 (64) CD56 - NCMA1 (molécula 1 de adesão de célula neural) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_000615 N° da versão no Genbank NM_000615.6 GI:336285433 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Set. de 2012 02:32 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_000606 N° da versão no Genbank NP_000606.3 GI:94420689 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Set. de 2012 02:32 PM Referências cruzadas Dickson,G., et al, Cell 50 (7), 1119 - 1130 (1987) Outra informação Símbolo oficial: NCAM1 Outros nomes: CD56, MSK39, NCAM Outras designações: antígeno reconhecido por anticorpo monoclonal 5,1H11; molécula de adesão de célula neural, NCAM ANTICORPOS Imunógeno: HuN901 (Smith SV., et al Curr Opin Mol Ther. Agosto de 2005;7(4):394 - 401) Por exemplo, ver humanizado a partir de anticorpo N901 de murino. Ver Fig. 1b e 1e de Roguska, M.A., et al. Proc Natl Acad Sci USA Fev de 1994;91:969 - 973. (65) CanAg (antígeno CA242 associado ao tumor) Referências cruzadas Haglund C., et al Br J Cancer 60:845 - 851, 1989;Baeckstrom D., et al J Biol Chem 266:21537 - 21547, 1991 ANTICORPOS huC242 (Tolcher AW et al., J Clin Oncol. 15 de Jan de 2003;21(2):211 - 22; Imunógeno) Por exemplo, ver US20080138898A1 SEQ ID NO: 1 e 2 (66) FOLR1 (Receptor 1 de folato) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank J05013 N° da versão no Genbank J05013.1 GI:182417 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:47 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA35823 N° da versão no Genbank AAA35823.1 GI:182418 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:47 AM Referências cruzadas Elwood P.C., et al J. Biol. Chem. 264 (25), 14893 - 14901 (1989) Outra informação Símbolo oficial: FOLR1 Outros nomes: FBP, FOLR Outras designações: FR-alfa; FBP de células KB; proteína de ligação de folato adulta; proteína de ligação de folato; receptor alfa de folato; receptor de folato, adulto; antíeno MOv18 associado a tumor ovariano ANTICORPOS M9346A - Whiteman KR., et al Cancer Res 15 de Abril de 2012; 72(8 Supple-ment): 4628 (Imunógeno) (67) GPNMB (Glicoproteína (transmembrana) nmb) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank X76534 N° da versão no Genbank X76534.1 GI:666042 Dados de atualização de registro no Genbank: 02 de Fev de 2011 10:10 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank CAA54044 N° da versão no Genbank CAA54044.1 GI:666043 Dados de atualização de registro no Genbank: 02 de Fev de 2011 10:10 AM Referências cruzadas Weterman M.A., et al Int. J. Câncer 60 (1), 73 - 81 (1995) Outra informação Símbolo oficial: GPNMB Outros nomes: UNQ1725/PRO9925, HGFIN, NMB Outras designações: glicoproteína NMB; proteína semelhante à glicoproteína nmb; osteoativina; glicoproteína de transmembrana HGFIN; glicoproteína de trans- membrana NMB ANTICORPOS Celldex Therapeutics: CR011 (Tse KF., et al Clin Cancer Res. 15 de Fev de 2006;12(4):1373 - 82) Por exemplo, ver EP1827492B1 SEQ ID NO: 22, 24, 26, 31, 33 e 35 (68) TIM-1 - HAVCR1 (receptor celular 1 do vírus da hepatite A) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank AF043724 N° da versão no Genbank AF043724.1 GI:2827453 Dados de atualização de registro no Genbank: 10 de Mar. de 2010 06:24 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAC39862 N° da versão no Genbank AAC39862.1 GI:2827454 Dados de atualização de registro no Genbank: 10 de Mar. de 2010 06:24 PM Referências cruzadas Feigelstock D., et al J. Virol. 72 (8), 6621 - 6628 (1998) Outra informação Símbolo oficial: HAVCR1 Outros nomes: HAVCR, HAVCR-1, KIM-1, KIM1, TIM, TIM-1, TIM1, TIMD-1, TIMD1 Outras designações: domínio de imunoglobina de célula T e proteína 1 de domínio de mucina; proteína 1 da membrana de célula T; molécula 1 de lesão renal (69) RG-1/Mindin alvo do tumor da próstata - Mindin/RG-1 Referências cruzadas Parry R., et al Cancer Res. 15 de Set de 2005;65(18):8397 - 405 (70) B7-H4 - VTCN1 (domínio V-set contendo inibidor 1 de ativação de célula T Nucleotídeo N° de acesso no Genbank BX648021 N° da versão no Genbank BX648021.1 GI:34367180 Dados de atualização de registro no Genbank: 02 de Fev de 2011 08:40 AM Referências cruzadas Sica GL., et al Immunity. Jun de 2003;18(6):849 - 61 Outra informação Símbolo oficial: VTCN1 Outros nomes: RP11 - 229A19,4, B7-H4, B7H4, B7S1, B7X, B7h,5, PRO1291, VCTN1 Outras designações: membro da família B7, H4; membro 1 da superfamília B7; molécula B7x de coestimulatória de célula T; molécula B7x coestimulatória de célula T; inibidor 1 de ativação de célula T contendo domínio V-set; proteína B7-H4 coestimulatória imune (71) PTK7 (PTK7 proteína tirosina cinase 7) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank AF447176 N° da versão no Genbank AF447176.1 GI:17432420 Dados de atualização de registro no Genbank: 28 de Nov de 2008 01:51 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAL39062 N° da versão no Genbank AAL39062.1 GI:17432421 Dados de atualização de registro no Genbank: 28 de Nov de 2008 01:51 PM Referências cruzadas Park S.K.,et al J. Biochem. 119 (2), 235 - 239 (1996) Outra informação Símbolo oficial: PTK7 Outros nomes: CCK-4, CCK4 Outras designações: cinase 4 de carcinoma de cólon; tirosina-proteína cinase 7 inativa; receptor 7 de pseudo tirosina cinase; 7 semelhante a tirosina-proteína cinase (72) CD37 (molécula de CD37) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_001040031 N° da versão no Genbank NM_001040031.1 GI:91807109 Dados de atualização de registro no Genbank: 29 de Jul. de 2012 02:08 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_001035120 N° da versão no Genbank NP_001035120.1 GI:91807110 Dados de atualização de registro no Genbank: 29 de Jul. de 2012 02:08 PM Referências cruzadas Schwartz-Albiez R., et al J. Immunol. 140 (3), 905 - 914 (1988) Outra informação Símbolo oficial: CD37 Outros nomes: GP52 - 40, TSPAN26 Outras designações: antígeno de CD37; antígeno 37 de diferenciação celular; antígeno CD37 de leucócito; antígeno CD37 da superfície de leucócito; tetraspanin- 26; tspan-26 ANTICORPOS Boehringer Ingelheim: mAb 37,1 (Heider KH., et al Blood. 13 de Out. de 2011;118(15):4159 - 68) Trubion: CD37-SMIP (G28-1 scFv-Ig) ((Zhao X., et al Blood. 2007;110: 2569 - 2577) Por exemplo, ver US20110171208A1 SEQ ID NO: 253 Imunógeno: K7153A (Deckert J., et al Cancer Res 15 de Abril de 2012; 72(8 Supplement): 4625) (73) CD138 - SDC1 (sindecano 1) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank AJ551176 N° da versão no Genbank AJ551176.1 GI:29243141 Dados de atualização de registro no Genbank: 01 de Fev de 2011 12:09 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank CAD80245 N° da versão no Genbank CAD80245.1 GI:29243142 Dados de atualização de registro no Genbank: 01 de Fev de 2011 12:09 PM Referências cruzadas O’Connell FP., et al Am J Clin Pathol. 2004 Feb;121(2):254 - 63 Outra informação Símbolo oficial: SDC1 Outros nomes: CD138, SDC, SYND1, syndecan Outras designações: antígeno de CD138; receptor do fator de crescimento de fibroblasto de proteoglicano de sulfato de heparana; sindecano proteoglicano 1; sin- decano-1 ANTICORPOS Biotest: MAb quimerizado (nBT062)-(Jagannath S., et al Poster ASH #3060, 2010; Pedido de Patente WIPO WO/2010/128087) Por exemplo, ver US20090232810 SEQ ID NO: 1 e 2 Imunógeno: B-B4 (Tassone P., et al Blood 104_3688 - 3696) Por exemplo, ver US20090175863A1 SEQ ID NO: 1 e 2 (74) CD74 (molécula de CD74, complexo de histocompatibilidade principal, cadeia invariante de classe II) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_004355 N° da versão no Genbank NM_004355.1 GI:343403784 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Set. de 2012 02:30 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_004346 N° da versão no Genbank NP_004346.1 GI:10835071 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Set. de 2012 02:30 PM Referências cruzadas Kudo,J., et al Nucleic Acids Res. 13 (24), 8827 - 8841 (1985) Outra informação Símbolo oficial: CD74 Outros nomes: DHLAG, HLADG, II, Ia-GAMA Outras designações: antígeno de CD74 (polipeptídeo invariante de complexo de histocompatibilidade principal, associado a antígeno de classe II); cadeia de antí- geno gama de histocompatibilidade de classe II de HLA; cadeia invariante associada a antígenos de HLA-DR; HLA-DR-gama; cadeia invariante associada a Ia; cadeia gama de HLA-DR de MHC; cadeia gama de antígenos da classe II; p33 ANTICORPOS Immunomedics: hLL1 (Milatuzumabe,)- Berkova Z., et al Expert Opin Investig Fármacos. 2010 Jan;19(1):141 - 9) Por exemplo, ver US20040115193 SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23 e 24 Genmab: HuMax-CD74 (ver website) (75) Claudins - CLs (Claudins) Referências cruzadas Offner S., et al Cancer Immunol Immunother. Maio de 2005; 54(5):431 - 45, Suzuki H., et al Ann N Y Acad Sci. Jul de 2012;1258:65 - 70) Em seres humanos, 24 membros da família foram descritos - ver referência de literatura. (76) EGFR (Receptor de fator de crescimento epidérmico) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_005228 N° da versão no Genbank NM_005228.3 GI:41927737 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:47 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_005219 N° da versão no Genbank NP_005219.2 GI:29725609 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:47 PM Referências cruzadas Dhomen NS., et al Crit Rev Oncog. 2012;17(1):31 - 50 Outra informação Símbolo oficial: EGFR Outros nomes: ERBB, ERBB1, HER1, PIG61, mENA Outras designações: homólogo de oncogene de leucemia viral eritroblástica aviária (v-erb-b); proteína 40 de inibição do crescimento celular; proteína 61 de indu-ção da proliferação celular; proto-oncogene c-ErbB-1; tirosina-proteína cinase erbB-1 do receptor ANTICORPOS BMS: Cetuximabe (Erbitux)- Broadbridge VT., et al Expert Rev Anticancer Ther. 2012 May;12(5):555 - 65. Por exemplo, ver US6217866 - depósito em ATTC N° 9764. Amgen: Panitumumabe (Vectibix)- Argiles G., et al Future Oncol. 2012 Apr;8(4):373 - 89 Por exemplo, ver US6235883 SEQ ID NOs: 23 a 38. Genmab: Zalutumumabe - Rivera F., et al Expert Opin Biol Ther. Maio de 2009;9(5):667 - 74. YM Biosciences: Nimotuzumabe - Ramakrishnan MS., et al MAbs. Jan a Fev de 2009;1(1):41 - 8. Por exemplo, ver US5891996 SEQ ID NOs: 27 a 34. (77) Her3 (ErbB3) - ERBB3 (hómologo 3 de oncogene de leucemia viral eri- troblástica de v-erb-b2 (aviária)) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank M34309 N° da versão no Genbank M34309.1 GI:183990 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:47 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA35979 N° da versão no Genbank AAA35979.1 GI:306841 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:47 PM Referências cruzadas Plowman,G.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (13), 4905 - 4909 (1990) Outra informação Símbolo oficial: ERBB3 Outros nomes: ErbB-3, HER3, LCCS2, MDA-BF-1, c-erbB-3, c-erbB3, erbB3- S, p180-ErbB3, p45-sErbB3, p85-sErbB3 Outras designações: proteína c-ErbB-3 semelhante a proto-oncogene; tiro-sina-proteína cinase erbB-3 do receptor; receptor HER3 de superfície célular do tipo tirosina cinase ANTICORPOS Merimack Pharma: MM-121 (Schoeberl B., et al Cancer Res. 15 de Mar de 2010;70(6):2485 - 2494) Por exemplo, ver US2011028129 SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8. (78) RON - MST1R (receptor 1 estimulante de macrófago (tirosina cinase c- met-relacionada)) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank X70040 N° da versão no Genbank X70040.1 GI:36109 Dados de atualização de registro no Genbank: 02 de Fev de 2011 10:17 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank CCA49634 N° da versão no Genbank CCA49634.1 GI:36110 Dados de atualização de registro no Genbank: 02 de Fev de 2011 10:17 PM Referências cruzadas Ronsin C., et al Oncogene 8 (5), 1195 - 1202 (1993) Outra informação Símbolo oficial: MST1R Outros nomes: CD136, CDw136, PTK8, RON Outras designações: receptor de MSP; variante RON30 de MST1R; MST1R variante RON62; proteína tirosina cinase 8 de PTK8; variante E2E3 de RON; tirosina cinase c-met-relacionada; receptor de proteína estimulante de macrófago; p185-Ron; variante 1 de RON solúvel; variante 2 de RON solúvel; variante 3 de RON solúvel; variante 4 de RON solúvel (79) EPHA2 (receptor A2 de EPH) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank BC037166 N° da versão no Genbank BC037166.2 GI:33879863 Dados de atualização de registro no Genbank: 06 de Mar. de 2012 01:59 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAH37166 N° da versão no Genbank AAH37166.1 GI:22713539 Dados de atualização de registro no Genbank: 06 de Mar. de 2012 01:59 PM Referências cruzadas Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899 - 16903 (2002) Outra informação Símbolo oficial: EPHA2 Outros nomes: ARCC2, CTPA, CTPP1, ECK Outras designações: receptor 2 do tipo A de efrina; proteína tirosina cinase do receptor de célula epitelial; variante 1 de EPHA2 solúvel; receptor ECK de tirosina- proteína cinase ANTICORPOS Medimmune: 1C1 (Lee JW., et al Clin Cancer Res. Maio de 2010 1;16(9):2562 - 2570) Por exemplo, ver US20090304721A1 Fig. 7 e 8. (80) CD20 - MS4A1 (4 domínios de transposição de membrana, subfamília A, membro 1) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank M27394 N° da versão no Genbank M27394.1 GI:179307 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Nov. de 2009 11:16 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA35581 N° da versão no Genbank AAA35581.1 GI:179308 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Nov. de 2009 11:16 AM Referências cruzadas Tedder T.F., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1), 208 - 212 (1988) Outra informação Símbolo oficial: MS4A1 Outros nomes: B1, Bp35, CD20, CVID5, LEU-16, MS4A2, S7 Outras designações: Antígeno de linfócito B CD20; B-lymphocyte célula-su-perfície antígeno B1; antígeno de CD20; receptor de CD20; antígeno Leu-16 de su-perfície de leucócito ANTICORPOS Genentech/Roche: Rituximabe - Abdulla NE., et al BioDrugs. 2012 Apr 1;26(2):71 - 82. Por exemplo, ver US5736137, depósito em ATCC N° HB-69119. GSK/Genmab: Ofatumumabe - Nightingale G., et al Ann Pharmacother. Out. de 2011;45(10):1248 - 55. Por exemplo, ver US20090169550A1 SEQ ID NOs: 2, 4 e 5. Immunomedics: Veltuzumabe - Goldenberg DM., et al Leuk Linfoma. Maio de 2010;51(5):747 - 55. Por exemplo, ver US7919273B2 SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 e 6. (81) Tenascin C - TNC (Tenascin C) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_002160 N° da versão no Genbank NM_002160.3 GI:340745336 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Set. de 2012 02:33 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_002151 N° da versão no Genbank NP_002151.2 GI:153946395 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Set. de 2012 02:33 PM Referências cruzadas Nies D.E., et al J. Biol. Chem. 266 (5), 2818 - 2823 (1991); Siri A., et al Nucleic Acids Res. 19 (3), 525 - 531 (1991) Outra informação Símbolo oficial: TNC Outros nomes: 150 - 225, GMEM, GP, HXB, JI, TN, TN-C Outras designações: GP 150 - 225; citotactina; antígeno de matriz extracelular associado a glioma; hexabraquiona (tenascin); antígeno miotendinoso; neuronectina; tenascina; isoforma de tenascina-C 14/AD1/16 ANTICORPOS Philogen: G11 (von Lukowicz T., et al J Nucl Med. 2007 Apr;48(4):582 - 7) e F16 (Pedretti M., et al Lung Cancer. Abril de 2009;64(1):28 - 33) Por exemplo, ver US7968685 SEQ ID NOs: 29, 35, 45 e 47. (82) FAP (proteína de ativação de fibroblasto, alfa) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank U09278 N° da versão no Genbank U09278.1 GI:1888315 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 09:22 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAB49652 N° da versão no Genbank AAB49652.1 GI:1888316 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 09:22 AM Referências cruzadas Scanlan,M.J.,et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (12), 5657 - 5661 (1994) Outra informação Símbolo oficial: FAP Outros nomes: DPPIV, FAPA Outras designações: gelatinase ligada a membrana de melanoma de 170 kDa; serina protease de membrana integral; seprase (83) DKK-1 (homólogo de Dickkopf 1 (Xenopus laevis) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_012242 N° da versão no Genbank NM_012242.2 GI:61676924 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:48 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_036374 N° da versão no Genbank NP_036374.1 GI:7110719 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:48 PM Referências cruzadas Fedi P. et al J. Biol. Chem. 274 (27), 19465 - 19472 (1999) Outra informação Símbolo oficial: DKK1 Outros nomes: UNQ492/PRO1008, DKK-1, SK Outras designações: proteína-1 relacionada a dickkopf; semelhante a dick- kopf-1; proteína 1 semelhante a dickkopf-1; proteína 1 relacionada a dickkopf-1; hDkk- 1 ANTICORPOS Novartis: BHQ880 (Fulciniti M., et al Blood. 2009 Jul 9;114(2):371 - 379) Por exemplo, ver US20120052070A1 SEQ ID NOs: 100 e 108. (84) CD52 (molécula de CD52) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_001803 N° da versão no Genbank NM_001803.2 GI:68342029 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:48 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_001794 N° da versão no Genbank NP_001794.2 GI:68342030 Dados de atualização de registro no Genbank: 30 de Set. de 2012 01:48 PM Referências cruzadas Xia M.Q., et al Eur. J. Immunol. 21 (7), 1677 - 1684 (1991) Outra informação Símbolo oficial: CD52 Outros nomes: CDW52 Outras designações: antígeno de CAMPATH-1; antígeno de CD52 (antígeno de CAMPATH-1); antígeno de CDW52 (antígeno de CAMPATH-1); antígeno de pato-logia de cambridge 1; proteína secretória epidídima E5; he5; proteína 5 específica de epidídimo humano ANTICORPOS Alemtuzumabe (Campath)- Skoetz N., et al Cochrane Database Syst Rev. 15 de Fev de 2012;2:CD008078. Por exemplo, ver Drugbank Acc. No. DB00087 (BIOD00109, BTD00109) (85) CS1 - SLAMF7 (membro 7 da família de SLAM) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank NM_021181 N° da versão no Genbank NM_021181.3 GI:1993571 Dados de atualização de registro no Genbank: 29 de Jun de 2012 11:24 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank NP_067004 N° da versão no Genbank NP_067004.3 GI:19923572 Dados de atualização de registro no Genbank: 29 de Jun de 2012 11:24 AM Referências cruzadas Boles K.S., et al Immunogenetics 52 (3 - 4), 302 - 307 (2001) Outra informação Símbolo oficial: SLAMF7 Outros nomes: UNQ576/PRO1138, 19A, CD319, CRACC, CS1 Outras designações: proteína de 19A24; subconjunto 1 de CD2; células cito- tóxicas ativadoras de receptor semelhante a CD2; células citotóxicas ativadoras de receptor semelhante a CD2; proteína de membrana FOAP-12; nova proteína seme-lhante a LY9 (antígeno linfocítico 9); proteína 19A ANTICORPOS BMS: elotuzumab/HuLuc63 (Benson DM., et al J Clin Oncol. 2012 Jun 1;30(16):2013 - 2015) Por exemplo, ver US20110206701 SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e 16. (86) Endoglin - ENG (Endoglin) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank AF035753 N° da versão no Genbank AF035753.1 GI:3452260 Dados de atualização de registro no Genbank: 10 de Mar. de 2010 06:36 PM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAC32802 N° da versão no Genbank AAC32802.1 GI:3452261 Dados de atualização de registro no Genbank: 10 de Mar. de 2010 06:36 PM Referências cruzadas Rius C., et al Blood 92 (12), 4677 - 4690 (1998) Símbolo oficial: ENG Outra informação Outros nomes: RP11 - 228B15,2, CD105, END, HHT1, ORW, ORW1 Outras designações: antígeno de CD105 (87) Anexina A1 - ANXA1 (Anexina A1) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank X05908 N° da versão no Genbank X05908.1 GI:34387 Dados de atualização de registro no Genbank: 02 de Fev de 2011 10:02 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank CCA29338 N° da versão no Genbank CCA29338.1 GI:34388 Dados de atualização de registro no Genbank: 02 de Fev de 2011 10:02 AM Referências cruzadas Wallner B.P.,et al Nature 320 (6057), 77 - 81 (1986) Outra informação Símbolo oficial: ANXA1 Outros nomes: RP11 - 71A24,1, ANX1, LPC1 Outras designações: anexina I (lipocortina I); anexina-1; calpactina II; calpac- tina-2; cromobindina-9; lipocortina I; p35; proteína inibitória de fosfolipase A2 (88) V-CAM (CD106)- VCAM1 (Molécula 1 de acessão de célula vascular) Nucleotídeo N° de acesso no Genbank M60335 N° da versão no Genbank M60335.1 GI:340193 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:56 AM Polipeptídeo N° de acesso no Genbank AAA61269 N° da versão no Genbank AAA61269.1 GI:340194 Dados de atualização de registro no Genbank: 23 de Jun de 2010 08:56 AM Referências cruzadas Hession C., et al J. Biol. Chem. 266 (11), 6682 - 6685 (1991) Outra informação Símbolo oficial VCAM1 Outros nomes: CD106, INCAM-100 Outras designações: CD106 antígeno; proteína 1 de adesão de célula vascu-lar Sequências de Anticorpo Anti-Integrina αvβ6 RHAB6,2 QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGFAFTDSYMHWVRQAPGQGLEWMG WIDPENGDTEYAPKFQGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCTRGTPTAVPN LRGDLQVLAQKVAGPYPFDYWGQGTLVTVSS RHCB6,2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIDSYMHWVRQAPGQRLEWMG WIDPENGDTEYAPKFQGRVTITTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTPTAVP NLRGDLQVLAQKVAGPYPFDYWGQGTLVTVSS RHF QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFIDSYMHWVRQAPGQRLEWM GWIDPENGDTEYAPKFQGRVTFTTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCNEGTPTGP YYFDYWGQGTLVTVSS RHFB6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFIDSYMHWVRQAPGQRLEWM GWIDPENGDTEYAPKFQGRVTFTTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCNEGTPTAV PNLRGDLQVLAQKVAGPYYFDYWGQGTLVTVSS RHAYIOObP QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGFAFTDSYMHWVRQAPGQGLEWMG WIDPENGDTEYAPKFQGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCTRGTPTGPYP FDYWGQGTLVTVSS RKF ENVLTQSPGTLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTS NLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRSSYPLTFGGGTKVEIK RKFL36L50 ENVLTQSPGTLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWLQQKPGQAPRLLIYLTS NLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRSSYPLTFGGGTKVEIK RKC EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYSTS NLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRSSYPLTFGGGTKVEIK Anti-CD33 CD33 Hum195 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWIG YIYPYNGGTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDY WGQGTLVTVSS CD33 Hum195 VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLL IYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTK VEIK Anti-CD19 CD19 B4 recapeada VH QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQRPGQGLEWIG EIDPSDSYTNYNQNFKGKAKLTVDKSTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCARGSNPYYY AMDYWGQGTSVTVSS CD19 B4 recapeada VK EIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSGVNYMHWYQQKPGTSPRRWIYDT SKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEPEDAATYYCHQRGSYTFGGGTKLEIK Anti-Her2 Cadeia VH de Herceptina EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVAR IYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA MDYWGQGTLVTVSS Cadeia VL de Herceptina DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA SFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK Anti-CD25 Simulect VK (também conhecido como Basiliximab) QIVSTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSRSYMQWYQQKPGTSPKRWIYDT SKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYTFGGGTKLEIK Simulect VH QLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYSFTRYWMHWIKQRPGQGLEWIGAI YPGNSDTSYNQKFEGKAKLTAVTSASTAYMELSSLTHEDSAVYYCSRDYGYYFDF WGQGTTLTVSS Anti-PSMA VH ‘1 Desimunizado EVQLVQSGPEVKKPGATVKISCKTSGYTFTEYTIHWVKQAPGKGLEWIGNI NPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAGWNFDYWG QGTLLTVSS VK ‘1 Desimunizado DIQMTQSPSSLSTSVGDRVTLTCKASQDVGTAVDWYQQKPGPSPKLLIYW ASTRHTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCQQYNSYPLTFGPGTKVDIK VH1 ‘5 Desimunizado EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWV AEIRSQSNNFATHYAESVKGRVTISRDDSKSIVYLQMNNLRAEDTGVYYCTRRWNN FWGQGTTVTVSS VH2 ‘5 Desimunizado EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWV AEIRSQSNNFATHYAESVKGRVTISRDDSKSIVYLQMNNLRAEDTAVYYCTRRWNN FWGQGTTVTVSS VH3 ‘5 Desimunizado 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[051]O anticorpo precursor também pode ser uma proteína de fusão compre-endendo uma sequência de peptídeo de ligação de albumina (ABP) (Dennis et al. (2002) “Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins” J Biol Chem. 277:35035 - 35043; WO 01/45746). Anticorpos da invenção incluem proteínas de fusão com sequências de ABP mostradas por: (i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035 - 35043 nas Tabelas III e IV, página 35038; (ii) US 2004/0001827 em [0076]; e (iii) WO 01/45746 nas páginas 12 a 13, e todos os quais são incorporados aqui por referência.
[052]Em uma forma de realização, o anticorpo foi elevado ao alvo específico para o antígeno αvβ6.
[053]Um agente de ligação celular pode ser rotulado, por exemplo para auxi-liar na detecção ou purificação do agente antes da incorporação como um conjugado, ou coo parte do conjugado. O rótulo pode ser um rótulo de biotina. Em uma outra forma de realização, o agente de ligação celular pode ser rotulado com um radioisó- topo.
[054]Formas de realização da presente invenção incluem ConjA em que o agente de ligação celular é selecionado de um anticorpo para qualquer um dos antí- genos debatidos acima.
[055]Formas de realização da presente invenção incluem ConjB em que o an- tígeno de ligação cleular é selecionado de um anticorpo para qualquer um dos antíge- nos debatidos acima.
[056]Formas de realização da presente invenção incluem ConjA em que o agente de ligação celular é selecionado de qualquer um dos anticorpos debatidos acima.
[057]Formas de realização da presente invenção incluem ConjB em que o agente de ligação celular é selecionado de qualquer um dos anticorpos debatidos acima.
[058]A presente invenção também pode referir-se a conjugados onde o agente de ligação celular é selecionado de um anticorpo para qualquer um dos antígenos debatidos acima e qualquer um dos anticorpos debatidos abaixo ligados a fármacos diferentes.
[059]A carga de fármaco é o número médio de fármacos de PBD por agente de ligação celular, por exemplo, agente de ligação celular. Onde os compostos da invenção são ligados a cisteínas, a carga de fármaco pode variar de 1 a 8 fármacos (D) por agente de ligação celular, isto é onde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, e 8 porções de fármaco são covalentemente ligadas ao agente de ligação celular. Composições de conjuga-dos incluem coleções de agente de ligação celulars, conjugados com uma faixa de fármacos, de 1 a 8. Onde os compostos da invenção são ligados a lisinas, a carga de fármaco pode variar de 1 a 80 fármacos (D) por agente de ligação celular, embora um limite superior de 40, 20, 10 ou 8 possa ser preferido. Composições de conjugados incluem coleções de agente de ligação celulars, conjugados com uma faixa de fárma- cos, de 1 a 80, 1 a 40, 1 a 20, 1 a 10 ou 1 a 8.
[060]O número médio de fármacos por anticorpo em preparações de ADC de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais tais como UV, HPLC de fase reversa, HIC, espectroscopia de massa, ensaio ELISA, e eletrofo-rese. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p também pode ser determi-nada. Por ELISA, o valor ponderado de p em uma preparação particular de ADC pode ser determinado (Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063 - 7070; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843 - 852). Entretanto, a distribuição de valores de p (fármaco) não é discernível pela ligação do anticorpo ao antígeno e limitação de detecção de ELISA. Também, ensaio ELISA para a detecção de conjugados de anti- corpo-fármaco não determina onde as porções de fármaco são ligadas ao anticorpo, tais como os fragmentos de cadeia pesada ou cadeia leve, ou os resíduos de amino- ácido particulares. Em alguns exemplos, separação, purificação, e caracterização de ADC homogêneo onde p é um certo valor de ADC com outras cargas de fármacos podem ser obtidas por meios tais como HPLC de fase reversa ou eletroforese. Tais técnicas também são aplicáveis a outros tipos de conjugados.
[061]Para alguns conjugados de anticorpo-fármaco, p pode ser limitado pelo número de sítios de fixação no anticorpo. Por exemplo, um anticorpo pode ter apenas um ou vários grupos tiol de cisteína, ou pode ter apenas um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais um ligador pode ser ligado. Carga de fár- maco mais alta, por exemplo, p > 5, pode causar agregação, insolubilidade, toxicidade, ou perda de permeabilidade celular de certos conjugados de anticorpo-fármaco.
[062]Tipicamente, menos do que a máxima teórica de porções de fármaco são conjugados a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, muitos resíduos de lisina que não reagem com o intermediário de fármaco-ligador (D-L) ou reagente de ligador. Apenas os grupos lisina mais reativos podem reagir com um reagente de ligador reativo em amina. Também, apenas os grupos cisteína tiol mais reativos podem reagir com um reagente de ligador reativo em tiol. Geralmente, anticorpos não contêm muitos, se alguns, grupos cisteína tiol livres e reativos que podem ser ligados a uma porção do fármaco. A maioria dos resíduos de cisteína tiol nos anticorpos dos compostos existe como pontes de dissulfeto e deve ser reduzida com um agente redutor tal como ditiotreitol (DTT) ou TCEP, sob condições de redução parcial ou total. A carga (razão de fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada em várias maneiras diferentes, incluindo: (i) limitar o excesso molar do intermediário de fármaco-ligador (D-L) ou reagente de ligador em relação ao anticorpo, (ii) limitar o tempo ou temperatura da reação de conjugação, e (iii) condições redutivas parciais ou limitantes para modificação de cisteína tiol.
[063]Certos anticorpos têm dissulfetos intercadeia reduzíveis, isto é pontes de cisteína. Anticorpos podem ser feitos reativos para conjugação com reagentes de li- gador por tratamento com um agente redutor tal como DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteína assim formará, teoricamente, dois nucleófilos de tiol reativos. Grupos nu- cleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos através da reação de lisi-nas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) resultando na conversão de uma amina em um tiol. Grupos tiol reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmento deste) engendrando-se um, dois, três, quatro, ou mais resíduos de cisteína (por exemplo, preparando anticorpos mutantes compreendendo um ou mais resíduos de amino- ácido cisteína não reativos). US 7521541 mostra a engenharia de anticorpos por introdução de aminoácidos cisteína reativos.
[064]Aminoácidos cisteína podem ser engenheirados em sítios reativos em um anticorpo e que não formam ligações dissulfeto intracadeia ou intermoleculares (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925 - 932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721 - 2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249). Os tióis de cisteína engenheirados podem reagir com reagentes de ligador ou os reagentes de ligador de fármaco da presente invenção que têm grupos eletrofílicos reativos em tiol tais como maleimida ou alfa-halo amidas para formar ADC com anticorpos engenhei- rados com cisteína e as porções de fármaco de PBD. O local da porção do fármaco assim pode ser projetado, controlado e conhecido. A carga de fármaco pode ser con-trolada visto que os grupos cisteína tiol engenheirados tipicamente reagem com rea-gentes de ligador reativos em tiol ou reagentes de ligador de fármaco em rendimento alto. A engenharia de um anticorpo de IgG para introduzir um aminoácido cisteína por substituição em um único sítio na cadeia pesada ou leve fornece duas novas cisteínas no anticorpo simétrico. Uma carga de fármaco perto de 2 pode ser obtida com homogeneidade aproximada do produto de conjugação ADC.
[065]Onde mais do que um grupo nucleofílico ou eletrofílico do anticorpo re-age com um intermediário de fármaco-ligador, ou reagente de ligador seguido por porção do reagente de fármaco, então o produto resultante é uma mistura de compostos de ADC com uma distribuição de porções de fármaco ligadas a um anticorpo, por exemplo, 1, 2, 3, etc. Métodos de cromatografia líquida tais como fase reversa poli- mérica (PLRP) e interação hidrofóbica (HIC) podem separar os compostos na mistura pelo valor da carga de fármaco. Preparações de ADC com um único valor da carga de fármaco (p) podem ser isoladas, entretanto, estes ADCs de valor de carga único ainda podem ser misturas heterogêneas porque as porções de fármaco podem ser ligadas, por intermédio do ligador, em sítios diferentes no anticorpo.
[066]Assim as composições de conjugado de anticorpo-fármaco da invenção incluem misturas de compostos de conjugado de anticorpo-fármaco onde o anticorpo tem uma ou mais porções de fármaco de PBD e onde as porções de fármaco podem ser ligadas ao anticorpo em vários resíduos de aminoácido.
[067]Em uma forma de realização, o número médio de grupos pirrolobenzodi- azepina diméricos por agente de ligação celular está na faixa de 1 a 20. Em algumas formas de realização a faixa é selecionada de 1 a 8, 2 a 8, 2 a 6, 2 a 4, e 4 a 8.
[068]Em algumas formas de realização, existe um grupo pirrolobenzodiaze- pina dimérico por agente de ligação celular.
Inclui Outras Formas
[069]A menos que de outro modo especificado, incluídas no acima são as formas iônicas, salinas, de solvato e protegidas bem conhecidas destes substituintes. Por exemplo, uma referência a ácido carboxílico (-COOH) também inclui a forma aniô- nica (carboxilato) (-COO-), um sal ou solvato desta, assim como formas protegidas convencionais. Similarmente, uma referência a um grupo amino inclui a forma protonada (-N+HR1R2), um sal ou solvato do grupo amino, por exemplo, um sal de cloridreto, assim como formas protegidas convencionais de um grupo amino. Similarmente, uma referência a um grupo hidroxila também inclui a forma aniônica (-O-), um sal ou solvato desta, assim como formas protegidas convencionais.
Sais
[070]Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar, e/ou manejar um sal correspondente do composto ativo, por exemplo, um sal farmaceuticamente-acei- tável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são debatidos em Berge, et al., J. Pharm. Sci., 66, 1 - 19 (1977).
[071]Por exemplo, se o composto for aniônico, ou tiver um grupo funcional que pode ser aniônico (por exemplo, -COOH pode ser -COO-), então um sal pode ser formado com um cátion adequado. Exemplos de cátions inorgânicos adequados incluem, mas não são limitados a, íons de metal alcalino tais como Na+ e K+, cátions alcalinos terrosos tais como Ca2+ e Mg2+, e outros cátions tais como Al+3. Exemplos de cátions orgânicos adequados incluem, mas não são limitados a, íon amônio (isto é NH4+) e íons amônios substituídos (por exemplo, NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+). Exemplos de alguns íons amônios substituídos adequados são aqueles derivados de: etilamina, di- etilamina, dicicloexilamina, trietilamina, butilamina, etilenodiamino, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, colina, meglumina, e trome- tamina, assim como aminoácidos, tais como lisina e arginina. Um exemplo de um íon amônio quaternário comum é N(CH3)4+.
[072]Se o composto for catiônico, ou tiver um grupo funcional que pode ser catiônico (por exemplo, -NH2 pode ser -NH3+), então um sal pode ser formado com um ânion adequado. Exemplos de ânions inorgânicos adequados incluem, mas não são limitados, àqueles derivados dos ácidos inorgânicos seguintes: clorídrico, bromídrico, iodídrico, sulfúrico, sulfuroso, nítrico, nitroso, fosfórico, e fosforoso.
[073]Exemplos de ânions orgânicos adequados incluem, mas não são limita-dos, àqueles derivados dos ácidos orgânicos seguintes: 2-acetioxibenzoico, acético, ascórbico, aspártico, benzoico, canforsulfônico, cinâmico, cítrico, edético, etanodissul- fônico, etanossulfônico, fumárico, glicoeptônico, glicônico, glutâmico, glicólico, hidro- ximaleico, hidroxinaftaleno carboxílico, isetiônico, láctico, lactobiônico, láurico, ma- leico, málico, metanossulfônico, múcico, oleico, oxálico, palmítico, pamoico, pantotê- nico, fenilacético, fenilsulfônico, propiônico, pirúvico, salicílico, esteárico, succínico, sulfanílico, tartárico, toluenossulfônico, ácido trifluoroacético e valérico. Exemplos de ânions orgânicos poliméricos adequados incluem, mas não são limitados, àqueles derivados dos ácidos poliméricos seguintes: ácido tânico, carboximetil celulose.
Solvatos
[074]Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar, e/ou manejar um solvato correspondente do composto ativo. O termo “solvato” é usado aqui no sentido convencional para referir-se a um complexo de soluto (por exemplo, composto ativo, sal de composto ativo) e solvente. Se o solvente for água, o solvato pode ser conve-nientemente referido como um hidrato, por exemplo, um mono-hidrato, um di-hidrato, um tri-hidrato, etc.
[075]A invenção inclui compostos onde um solvente se junta através da liga-ção de imina da porção PBD, que é ilustrada abaixo onde o solvente é água ou um álcool (RAOH, onde RA é alquila C1-4):
[076]Estas formas podem ser chamadas as formas de carbinolamina e éter de carbinolamina do PBD (como descrito na seção referem-se a R10 acima). O balance-amento destes equilíbrios depende das condições em que os compostos são encontrados, assim como da natureza da porção propriamente dita.
[077]Estes compostos particulares podem ser isolados na forma sólida, por exemplo, por liofilização.
Isômeros
[078]Certos compostos da invenção podem existir em uma ou mais formas geométricas, ópticas, enantioméricas, diastereoméricas, epiméricas, atrópicas, este- reoisoméricas, tautoméricas, conformacionais, ou anoméricas particulares, incluindo mas não limitadas a, formas cis e trans; formas E e Z; formas c, t, e r; formas endo e exo; formas R, S, e meso; formas D e L; formas d e l; formas (+) e (-); formas ceto, enol, e enolato; formas sin e anti; formas sinclinais e anticlinais; formas α e β; formas axiais e equatoriais; formas de bote, cadeira, trança, envelope, e meia-cadeira; e combinações destes, em seguida coletivamente referidos como “isômeros” (ou “formas isoméricas”).
[079]O termo “quiral” refere-se a moléculas que têm a propriedade de capacidade de não superposição do parceiro de imagem idêntica, enquanto o termo “aquiral” refere-se a moléculas que são superponíveis em seu parceiro de imagem idêntica.
[080]O termo “estereoisômeros” refere-se a compostos que têm constituição química idêntica, mas diferem quanto ao arranjo dos átomos ou grupos no espaço.
[081]“Diastereômero” refere-se a um estereoisômero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens idênticas entre si. Diastereô- meros têm propriedades físicas diferentes, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espectrais, e reatividades. Misturas de diastereômeros podem separar sob procedimentos analíticos de alta resolução tais como eletroforese e cro- matografia.
[082]“Enantiômeros” referem-se a dois estereoisômeros de um composto que são imagens idênticas não superponíveis uma da outra.
[083]Definições estereoquímicas e convenções usadas aqui geralmente seguem S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw- Hill Book Company, Nova Iorque; e Eliel, E. e Wilen, S., “Stereochemistry of Organic Compounds”, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, 1994. Os compostos da invenção podem conter centros assimétricos ou quirais e, portanto, existir em formas estere- oisoméricas diferentes. É intencionado que todas as formas estereoisoméricas dos compostos da invenção, incluindo mas não limitadas a, diastereômeros, enantiômeros e atropisômeros, assim como misturas destes tais como misturas racêmicas, formam parte da presente invenção. Muitos compostos orgânicos existem em formas optica- mente ativas, isto é, eles têm a capacidade de girar o plano da luz polarizada no plano. Em descrever um composto opticamente ativo, os prefixos D e L, ou R e S, são usados para denotar a configuração absoluta da molécula sobre seu(s) centro(s) quiral(is). Os prefixos d e l ou (+) e (-) são utilizados para designar o sinal de rotação da luz polarizada no plano pelo composto, com (-) ou l significando que o composto é levógiro. Um composto prefixado com (+) ou d é dextrorrotatório. Para uma estrutura química dada, estes estereoisômeros são idênticos exceto que eles são imagens idênticas entre si. Um estereoisômero específico também pode ser referido como um enantiômero, e uma mistura de tais isômeros é frequentemente chamada uma mistura enantiomérica. Uma mistura a 50:50 de enantiômeros é referida como uma mistura racêmica ou um racemato, que podem ocorrer onde não houve nenhuma estereosseleção ou estereo- especificidade em uma reação química ou processo. Os termos “mistura racêmica” e “racemato” referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, destituídas de atividade óptica.
[084]Note que, exceto como debatido abaixo para formas tautoméricas, espe-cificamente excluídos do termo “isômeros”, como usado aqui, são isômeros estruturais (ou constitucionais) (isto é, isômeros que diferem nas conexões entre átomos ao invés de meramente pela posição de átomos no espaço). Por exemplo, uma referência a um grupo metóxi, -OCH3, não deve ser interpretada como uma referência ao seu isô- mero estrutural, um grupo hidroximetila, -CH2OH. Similarmente, uma referência a orto- clorofenila não deve ser interpretada como uma referência ao seu isômero estrutural, meta-clorofenila. Entretanto, uma referência a uma classe de estruturas pode incluir satisfatoriamente formas estruturalmente isoméricas que caem dentro desta classe (por exemplo, alquila C1-7 inclui n-propila e iso-propila; butila inclui n-, iso-, sec-, e terc- butila; metoxifenila inclui orto-, meta-, e para-metoxifenila).
[085]A exclusão acima não pertence a formas tautoméricas, por exemplo, formas de ceto, enol, e enolato, como, por exemplo, nos pares tautoméricos seguintes: ceto/enol (ilustrado abaixo), imina/enamina, amida/imino álcool, amidina/amidina, ni- troso/oxima, tiocetona/enetiol, N-nitroso/hiroxiazo, e nitro/aci-nitro.
[086]O termo “tautômero” ou “forma tautomérica” refere-se a isômeros estruturais de energias diferentes que são interconversíveos via uma barreira de energia baixa. Por exemplo, tautômeros de próton (também conhecidos como tautômeros pro- totrópicos) incluem interconversões via migração de um próton, tais como isomeriza- ções de ceto-enol e imina-enamina. Tautômeros de valência incluem interconversões por reorganização de alguns dos elétrons de ligação.
[087]Note que especificamente incluídos no termo “isômero” são compostos com uma ou mais substituições isotópicas. Por exemplo, H pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 1H, 2H (D), e 3H (T); C pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 12C, 13C, e 14C; O pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 16O e 18O; e semelhantes.
[088]Exemplos de isótopos que podem ser incorporados em compostos da invenção incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fosforoso, flúor, e cloro, tais como, mas não limitados a 2H (deutério, D), 3H (trítio), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl, e 125I. Vários compostos isotopicamente rotulados da presente invenção, por exemplo aqueles em que isótopos radioativos tais como 3H, 13C, e 14C são incorporados. Tais compostos isotopicamente rotulados podem ser úteis em estudos metabólicos, estudos cinéticos de reação, técnicas de detecção ou ima- geamento, tais como tomografia de emissão positrônica (PET) ou tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT) incluindo ensaios de distribuição de fármaco ou tecido de substrato, ou em tratamento radioativo de pacientes. Os compostos terapêuticos rotulados com deutério ou substituídos da invenção podem ter propriedades de DMPK melhoradas (metabolismo do fármaco e farmacocinética), referem-se à distribuição, metabolismo, e excreção (ADME). A substituição com isótopos mais pesados tal como deutério pode fornecer certas vantagens terapêuticas que resultam de maior estabilidade metabólica, por exemplo meia-vida in vivo aumentada ou necessidades de dosagem reduzidas. Um composto rotulado com 18F pode ser útil para estudos de PET ou SPECT. Compostos isotopicamente rotulados desta invenção e pró-fármacos destes geralmente podem ser preparados realizando-se os procedimentos divulgados nos esquemas ou nos exemplos e preparações descritos abaixo substituindo-se um reagente isotopicamente rotulado prontamente disponível no lugar de um reagente não isotopicamente rotulado. Além disso, a substituição com isótopos mais pesados, particularmente deutério (isto é, 2H ou D) pode fornecer certas vantagens terapêuticas que resultam de maior estabilidade metabólica, por exemplo meia-vida in vivo aumentada ou necessidades de dosagem reduzidas ou uma melhora no índice terapêutico. É entendido que deutério neste contexto é considerado como um substituinte. A concentração de um tal isótopo mais pesado, especificamente deu- tério, pode ser definida por um fator de enriquecimento isotópico. Nos compostos desta invenção qualquer átomo não especificamente designado como um isótopo particular é significado como representando qualquer isótopo estável deste átomo.
[089]A menos que de outro modo especificado, uma referência a um composto particular inclui todas as tais formas isoméricas, incluindo (inteiramente ou parcialmente) racêmicas e outras misturas destas. Métodos para a preparação (por exemplo, síntese assimétrica) e separação (por exemplo, cristalização parcial e meios cromato- gráficos) de tais formas isoméricas são conhecidos na técnica ou são facilmente obtidos adaptando-se os métodos mostrados aqui, ou métodos conhecidos, em uma maneira conhecida.
Atividade biológica Ensaios de proliferação celular in vitro
[090]Geralmente, a atividade citotóxica ou citostática de um conjugado de an- ticorpo-fármaco (ADC) é medida: expondo-se células mamíferas tendo proteínas re-ceptoras, por exemplo HER2, ao anticorpo do ADC em um meio de cultura celular; cultivando-se as células por um período de cerca de 6 horas a cerca de 5 dias; e medindo-se a viabilidade celular. Ensaios in vitro com base em célula são usados para medir a viabilidade (proliferação), citotoxicidade, e indução de apoptose (ativação de caspase) de um ADC da invenção.
[091]A potência in vitro de conjugados de anticorpo-fármaco pode ser medida por um ensaio de proliferação celular. O Ensaio de Viabilidade de Célula Lumines- cente CellTiter-Glo® é um método de ensaio homogêneo comercialmente disponível (Promega Corp., Madison, WI) com base na expressão recombinante de luciferase de Coleoptera (Patentes US Nos 5583024; 5674713 e 5700670). Este ensaio de proliferação celular determina o número de células viáveis em cultura com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81 - 88; US 6602677). O ensaio CellTiter-Glo® é conduzido em formato de 96 reservatórios, tornando-o receptivo à triagem de alta produtividade automática (HTS) (Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398 - 404). O procedimento de ensaio homogêneo envolve adicionar o único reagente (Reagente CellTi- ter-Glo®) diretamente às células cultivadas em meio suplementado com soro. Lavagem de célula, remoção do meio e etapas de pipetação múltiplas não são necessárias. O sistema detecta apenas 15 células/reservatório em um formato de 384 reservatórios em 10 minutos depois de adicionar o reagente e misturar. As células podem ser tratadas continuamente com ADC, ou elas podem ser tratadas e separadas de ADC. Geralmente, células tratadas brevemente, isto é 3 horas, mostraram os mesmos efeitos de potência como células continuamente tratadas.
[092]O formato homogêneo de “adicionar-misturar-medir” resulta em lise celular e geração de um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. A quantidade of ATP é diretamente proporcional ao número de células presentes em cultura. O Ensaio CellTiter-Glo® gera um sinal luminescente do “tipo incandescente”, produzido pela reação de luciferase, que tem uma meia-vida geralmente maior do que cinco horas, dependendo do tipo de célula e meio usados. Células viáveis são refletidas em unidades de luminescência relativas (RLU). O substrato, Beetle Luciferina, é oxidativamente descarboxilado por luciferase de vaga-lume recombinante com conversão concomitante de ATP a AMP e geração de fótons.
[093]A potência in vitro de conjugados de anticorpo-fármaco também pode ser medida por um ensaio de citotoxicidade. Células aderentes cultivadas são lavadas com PBS, separadas com tripsina, diluídas em meio completo, contendo 10 % de FCS, centrifugadas, recolocadas em suspensão em meio fresco e contadas com um hemo- citômetro. Culturas em suspensão são contadas diretamente. suspensões de célula monodispersas adequadas para contagem podem requerer agitação da suspensão por aspiração repetida para quebrar grupos de células.
[094]A suspensão celular é diluída à densidade de semeadura desejada e dis-pensada (100 μl por reservatório) em placas de 96 reservatórios pretas. Placas de linhagens de célula aderentes são incubadas durante a noite para permitir a aderência. Culturas de célula em suspensão podem ser usadas no dia da semeadura.
[095]Uma solução de estoque (1 ml) de ADC (20 μg/ml) é fabricada no meio de cultura celular apropriado. Diluições seriais de 10 vezes de ADC de estoque são feitas em tubos de centrífuga de 15 ml transferindo-se serialmente 100 μl a 900 μl de meio de cultura celular.
[096]Quatro reservatórios replicados de cada diluição de ADC (100 μl) são dispensados em placas pretas de 96 reservatórios, previamente plaqueadas com sus-pensão celular (100 μl), resultando em um volume final de 200 μl. Reservatórios de controle recebem o meio de cultura celular (100μl).
[097]Se o tempo de duplicação da linhagem celular for maior do que 30 horas, a incubação de ADC é por 5 dias, de outro modo uma incubação de quatro dias é feita.
[098]No final do período de incubação, a viabilidade celular é avaliada com o ensaio Alamar blue. AlamarBlue (Invitrogen) é dispensado sobre a placa inteira (20 μl por reservatório) e incubado por 4 horas. A fluorescência de Alamar blue é medida a excitação de 570 nm, emissão de 585 nm no leitor de placa instantâneo Varioskan. A porcentagem de sobrevivência celular é calculada da fluorescência média nos reservatórios tratados com ADC comparada à fluorescência média nos reservatórios de controle.
Eficácia in vivo
[099]A eficácia in vivo de conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) da invenção pode ser medida por estudos de xenoenxerto de tumor em camundongos. Por exemplo, a eficácia in vivo de um ADC anti-HER2 da invenção pode ser medida por um modelo de camundongo explante transgênico de expressão alta de HER2. Um aloen- xerto é propagado do camundongo transgênico Fo5 mmtv que não responde a, ou responde deficientemente a, terapia com HERCEPTIN®. Os indivíduos são tradados uma vez com ADC em certos níveis de dose (mg/kg) e exposição a fármaco de PBD (μg/m2); e controle de tampão de placebo (veículo) e monitorados durante duas semanas ou mais para medir o tempo para duplicação do tumor, morte de célula log, e encolhimento do tumor.
Uso
[0100]Os conjugados da invenção podem ser usados para fornecer um composto de PBD em um local alvo.
[0101]O local alvo é preferivelmente uma população de célula proliferativa. O anticorpo é um anticorpo para um antígeno presente em uma população de célula proliferativa.
[0102]Em uma forma de realização o antígeno é ausente ou presente em um nível reduzido em uma população de célula não proliferativa comparado à quantidade de antígeno presente na população de célula proliferativa, por exemplo uma população de célula tumoral.
[0103]No local alvo o ligador pode ser clivado de modo a liberar um composto RelA ou RelB. Assim, o conjugado pode ser usado para fornecer seletivamente um composto RelA ou RelB ao local alvo.
[0104]O ligador pode ser clivado por uma enzima presente no local alvo.
[0105]O local alvo pode ser in vitro, in vivo ou ex vivo.
[0106]Os compostos de conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) da invenção incluem aqueles com utilidade para atividade anticâncer. Em particular, os compostos incluem um anticorpo conjugado, isto é covalentemente ligado por um ligador, a uma porção do fármaco de PBD, isto é toxina. Quando o fármaco não é conjugado a um anticorpo, o fármaco de PBD tem um efeito citotóxico. A atividade biológica da porção do fármaco de PBD é assim modulada por conjugação a um anticorpo. Os conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) da invenção seletivamente liberam uma dose eficaz de um agente citotóxico ao tecido tumoral como maior seletividade, isto é uma dose eficaz mais baixa, pode ser obtida.
[0107]Assim, em um aspecto, a presente invenção fornece um composto de conjugado como descrito aqui para o uso em terapia.
[0108]Em um outro aspecto a mesma também fornece um composto de conjugado como descrito aqui para o uso no tratamento de uma doença proliferativa. Um segundo aspecto da presente invenção fornece o uso de um composto de conjugado na fabricação de um medicamento para tratar uma doença proliferativa.
[0109]Uma pessoa de habilidade comum na técnica é facilmente capaz de determinar se ou não um conjugado candidato trata uma condição proliferativa para qualquer tipo de célula particular. Por exemplo, ensaios que podem ser convenientemente usados para avaliar a atividade oferecida por um composto particular são descritos nos exemplos abaixo.
[0110]O termo “doença proliferativa” pertence a uma proliferação celular inde- sejada ou descontrolada de células excessivas ou anormais que é indesejada, tal como, crescimento neoplástico ou hiperplástico, se in vitro ou in vivo.
[0111]Exemplos de condições proliferativas incluem, mas não são limitados a, proliferação celular benigna, pré-maligna, e maligna, incluindo mas não limitadas a, neoplasmas e tumores (por exemplo, histocitoma, glioma, astrocitoma, osteoma), can- ceres (por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer gastrointestinal, câncer colorretal, câncer de cólon, carcinoma de mama, carcinoma de ovário, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de fígado, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer cerebral, sarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma), linfomas, leucemias, psoríase, doenças ósseas, transtornos fibroproliferativos (por exemplo, de tecidos conjuntivos), e aterosclerose. Canceres de interesse particular incluem, mas não são limitados a, leucemias e canceres ovaria- nos.
[0112]Qualquer tipo de célula pode ser tratado, incluindo mas não limitado a, pulmão, gastrointestinal (incluindo, por exemplo, intestino, cólon), mama (mamário), ovário, próstata, fígado (hepático), rim (renal), bexiga, pâncreas, cérebro, e pele.
[0113]Em uma forma de realização, o tratamento é de um câncer pancreático.
[0114]Em uma forma de realização, o tratamento é de um tumor tendo αvβ6 inte- grina na superfície dacélula.
[0115]É considerado que os conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) da presente invenção podem ser usados para tratar várioas doenças ou transtornos, por exemplo, caracterizados pela superexpressão de um antígeno de tumor. Condições exemplares ou transtornos hiperproliferativos incluem tumores benignos ou malignos; leucemia, hematologia, e malignidades linfoides. Outros incluem transtornos neuronais, gliais, as- trocitais, hipotalâmicos, glandulares, macrofágicos, epiteliais, estromais, blastocélicos, in-flamatórios, angiogênicos e imunológicos, incluindo autoimunes.
[0116]Geralmente, a doença ou transtorno a serem tratados é uma doença hiper- proliferativa tal como câncer. Exemplos de câncer a ser tratado aqui incluem, mas não são limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais particulares de tais canceres incluem câncer de célula escamosa (por exemplo, câncer de célula escamosa epitelial), câncer de pulmão incluindo câncer de pul-mão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepa-toma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de reto, câncer colorretal, carcinoma en-dometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer do rim ou renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma pe- niano, assim como câncer de cabeça e pescoço.
[0117]Doenças autoimunes para as quais os compostos de ADC podem ser usados no tratamento incluem transtornos reumatológicos (tais como, por exemplo, artrite reumatoide, síndrome de Sjogren, esclerodermia, lúpus tais como SLE e nefrite por lúpus, polimiosite/dermatomiosite, crioglobulinemia, síndrome do anticorpo antifosfolipídico, e artrite psoriática), osteoartrite, transtornos gastrointestinais e hepáticos autoimunes (tais como, por exemplo, doenças inflamatórias intestinais (por exemplo, colite ulcerativa e do-ença de Crohn), gastrite autoimune e anemia perniciosa, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, e doença celíaca), vasculite (tal como, por exemplo, vasculite associada a ANCA, incluindo vasculite de Churg-Strauss, granuloma- tose de Wegener, e poliarteriite), transtornos neurológicos autoimunes (tais como, por exemplo, esclerose múltipla, síndrome de opsoclonia mioclonia, miastenia grave, neu- romielite óptica, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, e polineuropatias autoimu- nes), transtornos renais (tais como, por exemplo, glomerulonefrite, síndrome de Good-pasture, e doença de Berger), transtornos dermatológicos autoimunes (tais como, por exemplo, psoríase, urticária, pênfigo vulgar, penfigoide bolhoso, e lúpus eritematoso cu-tâneo), transtornos hematológicos (tais como, por exemplo, púrpura trombocitopênica, púrpura trombocitopênica trombótica, púrpura pós-transfusão, e anemia hemolítica autoi- mune), aterosclerose, uveíte, doenças auditivas autoimunes (tais como, por exemplo, do-ença do ouvido interno e perda auditiva), doença de Behcet, síndrome de Raynaud, trans-plante de órgão, e transtornos endócrinos autoimunes (tais como, por exemplo, doenças autoimunes relacionadas a diabéticos tais como diabete melito insulino-dependente (IDDM), doença de Addison, e doença da tireoide autoimune (por exemplo, doença de Graves e tireoidite)). Tais doenças mais preferidas incluem, por exemplo, artrite reuma- toide, colite ulcerativa, vasculite associada a ANCA, lúpus, esclerose múltipla, síndrome de Sjogren, doença de Graves, IDDM, anemia perniciosa, tireoidite, e glomerulonefrite.
Métodos de Tratamento
[0118]Os conjugados da presente invenção podem ser usados em um método de terapia. Também fornecido é um método de tratamento, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de conjugado da invenção. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade suficiente para mostrar benefício a um paciente. Tal benefício pode ser pelo menos melhora de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada, e taxa e curso de tempo da administração, dependerá da natureza e severidade do que está sendo tratado. Prescrição do tratamento, por exemplo, decisões na dosagem, está dentro da responsibilidade de médicos de clínica geral e outros médicos.
[0119]Um composto da invenção pode ser administrado sozinho ou em combi-nação com outros tratamentos, simultaneamente ou sequencialmente dependendo da condição a ser tratada. Exemplos de tratamentos e terapias incluem, mas não são limita-dos a, quimioterapia (a administração de agentes ativos, incluindo, por exemplo, fárma- cos, tais como quimioterapêuticos); cirurgia; e terapia de radiação.
[0120]Um “agente quimioterapêutico” é um composto químico útil no tratamento de câncer, não obstante do mecanismo de ação. Classes de agentes quimioterápicos incluem, mas não são limitados a: agentes alquilantes, antimetabólitos, alcaloides de plantas de veneno antifuso, antibióticos citotóxicos/antitumor, inibidores de topoisome-rase, anticorpos, fotossensibilizadores, e inibidores de cinase. Agentes quimioterápicos incluem compostos usados em “terapia alvejada” e quimioterapia convencional.
[0121]Exemplos de agentes quimioterápicos incluem: erlotinibe (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), docetaxel (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (fluorouracila, 5-fluorouracila, CAS N° 51-21-8), gencitabina (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS N° 391210-10-9, Pfizer), cisplatina (cis-diamina, dicloroplatina(II), CAS N° 15663-27-1), car-boplatina (CAS N° 41575-94-4), paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumabe (HERCEPTIN®, Genentech), temozolomida (4-metil-5- oxo-2,3,4,6,8-pentazabiciclo [4,3,0] nona-2,7,9-trieno-9-carboxamida, CAS N° 85622-931, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoxifeno ((Z)-2-[4-(1,2-difenilbut-1- enil)fenóxi]-N,N-dimetiletanamina, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®), e doxorrubicina (ADRIAMYCIN®), Akti-1/2, HPPD, e rapamicina.
[0122]Mais exemplos de agentes quimioterápicos incluem: oxaliplatina (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomibe (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatinibe (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (inibidor de Mek, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY- 886 (inibidor de Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (inibidor de PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (inibidor de PI3K, Novartis), XL-147 (inibidor de PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), leucovorin (ácido folínico), rapamicina (sirolimo, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinibe (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnibe (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenibe (NEXAVAR®, BAY43 - 9006, Bayer Labs), gefitinibe (IRESSA®, AstraZeneca), irinotecano (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipi- farnibe (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (isento de Cremophor), formulações de nanopartícula engendradas em albumina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il), vandetanibe (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), clorambucil, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimo (TORISEL®, Wyeth), pazopanibe (GlaxoSmithKline), canfosfamida (TELCYTA®, Te- lik), tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN®, NEOSAR®); sulfonatos de alquila tais como busulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, car- boquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altreta- mina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilome- lamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o topotecano análogo sintético); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodicti- ina; espongistatina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridreto de óxido de me- cloretamina, melfalano, novembiquina, fenosterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosoureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lo- mustina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, caliqueamicina gama1I, caliqueamicina ômegaI1 (An- gew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183 - 186); dinemicina, dinemicina A; bisfosfona- tos, tais como clodronato; uma esperamicina; assim como cromóforo de neocarzinos- tatina e cromóforos de antibiótico de cromoproteína enediina relacionados), aclacinomi- sinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, car- minomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6- diazo-5-oxo-L-norleucina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirro- lino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, nemor- rubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, noga- lamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubi- cina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti- metabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos such como calusterona, propionato de dromostano- lona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracila; ansacrina; bestrabucil; bisan- treno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; um epotilona; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidainina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitrae- rina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2”-tri- clorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e an- guidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobro- mano; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; 6-tioguanina; mercapto- purina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vimblastina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NAVELBINE®); no-vantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®, Roche); ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tais como ácido retinoico; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos e derivados de qualquer um do acima.
[0123]Também incluídos na definição de “agente quimioterapêutico” são: (i) agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação do hormônio em tumores tais como anti-estrógenos e moduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX®; citrato de ta- moxifeno), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, e FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógeno nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano; Pfizer), formestanie, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis), e ARIMIDAX® (anastro- zol; AstraZeneca); (iii) anti-andrógenos tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, e goserelina; assim como troxacitabina (um análogo de citosina de nucleo- sídeo de 1,3-dioxolano); (iv) inibidores de proteína cinase tais como inibidores de MEK (WO 2007/044515); (v) inibidores de lipídeo cinase; (vi) oligonucleotídeos anti-sentido, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em vias de sinalização implicadas na proliferação de célula aberrante, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras, tal como oblimerseno (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimas tais como inibidores da expressão de VEGF (por exemplo, ANGIOZYME®) e inibidores da expressão de HER2; (viii) vacinas tais como vacinas de terapia genética, por exemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN®, e VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inibidores de topoisomerase 1 tais como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) agentes anti-angiogêni- cos tais como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos e derivados de qualquer um do acima.
[0124]Também incluídos na definição de “agente quimioterapêutico” são anticor-pos terapêuticos tais como alemtuzumabe (Campath), bevacizumabe (AVASTIN®, Ge- nentech); cetuximabe (ERBITUX®, Imclone); panitumumabe (VECTIBIX®, Amgen), rituxi- mabe (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), ofatumumabe (ARZERRA®, GSK), pertuzu- mabe (PERJETATM, OMNITARG™, 2C4, Genentech), trastuzumabe (HERCEPTIN®, Ge- nentech), tositumomabe (Bexxar, Corixia), e o conjugado de anticorpo e fármaco, gem- tuzumab ozogamicina (MYLOTARG®, Wyeth).
[0125]Anticorpos humanizados monoclonais com potencial terapêutico como agentes quimioterápicos em combinação com os conjugados da invenção incluem: alem- tuzumabe, apolizumabe, aselizumabe, atlizumabe, bapineuzumabe, bevacizumabe, bi- vatuzumabe mertansina, cantuzumabe mertansina, cedelizumabe, certolizumabe pegol, cidfusituzumabe, cidtuzumabe, daclizumabe, eculizumabe, efalizumabe, epratuzumabe, erlizumabe, felvizumabe, fontolizumabe, gentuzumabe ozogamicina, inotuzumabe ozo- gamicina, ipilimumabe, labetuzumabe, lintuzumabe, matuzumabe, mepolizumabe, mota- vizumabe, motovizumabe, natalizumabe, nimotuzumabe, nolovizumabe, numavizumabe, ocrelizumabe, omalizumabe, palivizumabe, pascolizumabe, pecfusituzumabe, pectuzu- mabe, pertuzumabe, pexelizumabe, ralivizumabe, ranibizumabe, reslivizumabe, reslizu- mabe, resivizumabe, rovelizumabe, ruplizumabe, sibrotuzumabe, siplizumabe, sontuzu- mabe, tacatuzumabe tetraxetano, tadocizumabe, talizumabe, tefibazumabe, tocilizu- mabe, toralizumabe, trastuzumabe, tucotuzumabe celmoleucina, tucusituzumabe, umavizumabe, urtoxazumabe, e visilizumabe.
[0126]Composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para o uso de acordo com a presente invenção, podem compreender, além do ingrediente ativo, isto é um composto de conjugado, um excipiente farmaceuticamente aceitável, carregador, tampão, estabilizador ou outros materiais bem conhecidos àquelas habilitados na técnica. Tais materiais não devem ser tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do carregador ou outro material dependerá da via de administração, que pode ser oral, ou por injeção, por exemplo, cutânea, subcutânea, ou intravenosa.
[0127]Composições farmacêuticas para administração oral podem estar na forma de tablete, cápsula, pó ou líquido. Um tablete pode compreender um carregador sólido ou um adjuvante. Composições farmacêuticas líquidas geralmente compreendem um carregador líquido tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeo ou glicóis tais como etileno glicol, propileno glicol ou polietilenoglicol podem ser incluídos. Uma cápsula pode compreender um carregador sólido tal como gelatina.
[0128]Para injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea, ou injeção no sítio de aflição, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parenteralmente acei-tável que é isenta de pirógeno e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Aquelas de habilidade relevante na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotônicos tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactato. Preservantes, estabilizadores, tampões, antioxidan- tes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme necessário.
Formulações
[0129]Embora seja possível que o composto de conjugado seja usado (por exemplo, administrada) sozinho, é frequentemente preferível apresenta-lo como uma composição ou formulação.
[0130]Em uma forma de realização, a composição é uma composição farma-cêutica (por exemplo, formulação, preparação, medicamento) compreendendo um composto de conjugado, como descrito aqui, e um carregador, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
[0131]Em uma forma de realização, a composição é uma composição farma-cêutica compreendendo pelo menos um composto de conjugado, como descrito aqui, junto com um ou mais outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos àquelas habilitados na técnica, incluindo, mas não limitados a, carregadores, diluentes, excipientes, adjuvantes, enchedores, tampões, preservantes, anti-oxidan- tes, lubrificantes, estabilizadores, solubilizadores, tensoativos (por exemplo, agentes umectantes), agentes de mascaramento, agentes corantes, agentes flavorizantes, e agentes adoçantes farmaceuticamente aceitáveis.
[0132]Em uma forma de realização, a composição compreende ainda outros agentes ativos, por exemplo, outros agentes terapêuticos ou profiláticos.
[0133]Carregadores, diluentes, excipientes, etc. adequados podem ser encon-trados em textos farmacêuticos padrão. Ver, por exemplo, Handbook of Pharmaceutical Additives, 2a Edição (eds. M. Ash e I. Ash), 2001 (Sinapse Information Resources, Inc., Endicott, Nova Iorque, USA), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20a edição, pub. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edition, 1994.
[0134]Um outro aspecto da presente invenção pertence a métodos de fabricar uma composição farmacêutica compreendendo misturar pelo menos um conjugado [11C]-radiorrotulado ou composto semelhante a conjugado, como definido aqui, junto com um ou mais outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos àquelas habilitados na técnica, por exemplo, carregadores, diluentes, excipientes, etc. Se formulada como unidades separadas (por exemplo, tabletes, etc.), cada unidade contém uma quantidade predeterminada (dosagem) do composto ativo.
[0135]O termo “farmaceuticamente aceitável,” como usado aqui, pertence a compostos, ingredientes, materiais, composições, formas de dosagem, etc., que são, dentro do escopo do julgamento médico sólido, adequado para o uso em contato com os tecidos do indivíduo em questão (por exemplo, ser humano) sem toxicidade, irritação, resposta alérgica excessivas, ou outro problema ou complicação, comensurável com um razão de risco/benefício razoável. Cada carregador, diluente, excipiente, etc. também devem ser “aceitáveis” no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação.
[0136]As formulações podem ser preparadas por quaisquer métodos bem co-nhecidos na técnica de farmácia. Tais métodos incluem a etapa de levar em associação o composto ativo com um carregador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas uniformemente e intimamente levando-se em associação o composto ativo com carregadores (por exemplo, carregadores líquidos, carregador sólido finamente dividido, etc.), e depois formando o produto, se necessário.
[0137]A formulação pode ser preparada para levar em consideração a liberação rápida ou lenta; liberação imediata, retardada, regulada, ou sustentada; ou uma combinação destas.
[0138]Formulações adequadas para administração parenteral (por exemplo, por injeção), incluem líquidos aquosos ou não aquosos, isotônicos, isentos de pirógeno, es-téreis (por exemplo, soluções, suspensões), em que o ingrediente ativo é dissolvido, co-locado em suspensão, ou de outro modo fornecido (por exemplo, em um liposome ou outro microparticulado). Tais líquidos podem conter adicionalmente outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como antioxidantes, tampões, preservantes, estabili-zadores, bacteriostatos, agentes de suspensão, agentes espessantes, e solutos que tor-nam a formulação isotônica com o sangue (ou outro fluido corpóreo relevante) do receptor intencionado. Exemplos de excipientes incluem, por exemplo, água, álcoois, polióis, glicerol, óleos vegetais, e semelhantes. Exemplos de carregadores isotônicos adequados para o uso em tais formulações incluem injeção de cloreto de sódio, solução de Ringer, ou injeção de Ringer lactato. Tipicamente, a concentração do ingrediente ativo no líquido é de cerca de 1 ng/ml a cerca de 10 μg/ml, por exemplo de cerca de 10 ng/ml a cerca de 1 μg/ml. As formulações podem ser apresentadas em recipientes vedados de dose unitária ou doses múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos, e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizada) que requer apenas a adição do carregador líquido estéril, por exemplo água para injeções, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões para injeção extemporânea podem ser preparadas a partir de pós, grânulos, e tabletes estéreis.
Dosagem
[0139]Será avaliado por uma pessoa de habilidade na técnica que dosagens apropriadas do composto de conjugado, e composições compreendendo o composto de conjugado, podem variar de paciente para paciente. Determinar a dosagem ideal geralmente envolverá o balanceamento do nível de benefício terapêutico contra qualquer risco ou efeitos colaterais deletérios. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores incluindo, mas não limitados, à atividade do composto particular, à via de administração, ao tempo de administração, à taxa de excreção do composto, à duração do tratamento, outros fármacos, compostos, e/ou materiais usados em combinação, à severidade da condição, e à espécie, sexo, idade, peso, condição, saúde geral, e história médica anterior do paciente. A quantidade de composto e via de administração basicamente estará no critério do médico, veterinário, ou clínico, embora geralmente a dosagem será selecionada para obter concentrações locais no sítio de ação que obtém o efeito desejado sem causar efeitos colaterais prejudiciais ou deletérios substanciais.
[0140]A administração pode ser efetuada em uma dose, continuamente ou intermitentemente (por exemplo, em doses divididas em intervalos apropriados) por todo o curso de tratamento. Métodos de determinar os meios mais eficazes e dosagem de administração são bem conhecidos àquelas de habilidade na técnica e variarão com a formulação usada para terapia, o propósito da terapia, a(s) célula(s) alvo(s) sendo tratada(s), e o indivíduo sendo tratado. Administrações únicas ou múltiplas podem ser realizadas com o nível de dose e padrão sendo selecionados pelo médico, veterinário, ou clínico do tratamento.
[0141]Em geral, uma dose adequada do composto ativo está na faixa de cerca de 100 ng a cerca de 25 mg (mais tipicamente cerca de 1 μg a cerca de 10 mg) por quilograma de peso corporal do indivíduo por dia. Onde o composto ativo é um sal, um éster, uma amida, um pró-fármaco, ou semelhantes, a quantidade administrada é calculada na base do composto precursor e de modo que o peso real a ser usado é aumentado proporcionalmente.
[0142]Em uma forma de realização, o composto ativo é administrado a um paciente humano de acordo com o regime de dosagem seguinte: cerca de 100 mg, 3 vezes ao dia.
[0143]Em uma forma de realização, o composto ativo é administrado a um paciente humano de acordo com o regime de dosagem seguinte: cerca de 150 mg, 2 vezes ao dia.
[0144]Em uma forma de realização, o composto ativo é administrado a um paciente humano de acordo com o regime de dosagem seguinte: cerca de 200 mg, 2 vezes ao dia.
[0145]Entretanto em uma forma de realização, o composto de conjugado é administrado a um paciente humano de acordo com o regime de dosagem seguinte: cerca de 50 ou cerca de 75 mg, 3 ou 4 vezes ao dia.
[0146]Em uma forma de realização, o composto de conjugado é administrado a um paciente humano de acordo com o regime de dosagem seguinte: cerca de 100 ou cerca de 125 mg, 2 vezes ao dia.
[0147]As quantidades de dosagem descritas acima podem aplicar-se ao con-jugado (incluindo a porção PBD e o ligador ao anticorpo) ou à quantidade eficaz de composto de PBD fornecido, por exemplo a quantidade de composto que é liberável depois da clivagem do ligador.
[0148]Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um ADC da invenção dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, da severidade e curso da doença, se a molécula é administrada para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, da história clínica do paciente e resposta ao anticorpo, e do critério do médico atendente. A molécula é adequadamente administrada ao paciente de uma vez ou em uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 a 20 mg/kg) de molécula é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Uma dosagem exemplar de ADC a ser administrado a um paciente está na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de peso do paciente. Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até que uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorra. Um regime de dosagem exemplar compreende um curso de administrar uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por doses adicionais a cada semana, duas semanas, ou três semanas de um ADC. Outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
Tratamento
[0149]O termo “tratamento” como usado aqui no contexto de tratar uma condição, pertence geralmente ao tratamento e terapia, se de um ser humano ou um animal (por exemplo, em aplicações veterinárias), em que algum efeito terapêutico desejado é obtido, por exemplo, a inibição do progresso da condição, e inclui uma redução na taxa de progresso, uma parada na taxa de progresso, regressão da condição, melhora da condição, e cura da condição. Tratamento como uma medida profilática (isto é, profilaxia, prevenção) também é incluído.
[0150]O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” como usado aqui, pertence àquela quantidade de um composto ativo, ou um material, composição ou dosagem de compreender um composto ativo, que é eficaz para produzir algum efeito terapêutico desejado, comensurável com uma razão de risco/benefício razoável, quando administrado de acordo com um regime de tratamento desejado.
[0151]Similarmente, o termo “quantidade profilaticamente eficaz” como usado aqui, pertence àquela quantidade de um composto ativo, ou um material, composição ou dosagem de compreender um composto ativo, que é eficaz para produzir algum efeito profilático desejado, comensurável com uma razão de risco/benefício razoável, quando administrado de acordo com um regime de tratamento desejado.
Preparação de conjugados de fármaco
[0152]Conjugados de anticorpo e fármaco, assim como conjugados com outros agentes de ligação celular, podem ser preparados por várias vias, utilizando reações, condições, e reagentes da química orgânica conhecidos àqueles habilitados na técnica, incluindo reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo ou agente de ligação celular com um reagente de ligador de fármaco. Este método pode ser utilizado com uma variedade de anticorpos e agentes de ligação celular para preparar os conjugados de anticorpo-fármaco da invenção.
[0153]Grupos nucleofílicos em anticorpos incluem, mas não são limitados a grupos tiol de cadeia lateral, por exemplo, cisteína. Grupos tiol são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em porções ligadoras tais como aquelas da presente invenção. Certos anticorpos têm dissul- fetos intercadeia reduzíveis, isto é, pontes de cisteína. Anticorpos podem ser feitos reativos para conjugação com reagentes de ligador por tratamento com um agente redutor tal como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol) ou TCEP cloridreto de (tris(2- carboxietil)fosfina; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73 - 80; Soltec Ventures, Beverly, MA). Cada ponte de dissulfeto de cisteína assim formará, teoricamente, dois nucleófilos de tiol reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos através da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) resultando na conversão de uma amina em um tiol.
O Indivíduo/Paciente
[0154]O indivíduo/paciente pode ser um animal, mamífero, um mamífero pla- centário, um marsupial (por exemplo, canguru, fascólomo), um monotrêmato (por exemplo, ornintorrinco), um roedor (por exemplo, um porquinho-da-índia, um hamster, um rato, um camundongo), murino (por exemplo, um camundongo), um lagomorfo (por exemplo, um coelho), aviário (por exemplo, uma ave), canino (por exemplo, um cão), felino (por exemplo, um gato), equino (por exemplo, um cavalo), porcino (por exemplo, um porco), ovino (por exemplo, uma ovelha), bovino (por exemplo, uma vaca), um primata, símio (por exemplo, um macaco ou símio), um macaco (por exemplo, sagui, babuíno), um símio (por exemplo, gorila, chimpanzé, orangotango, gibão), ou um ser humano.
[0155]Além disso, o indivíduo/paciente pode ser qualquer um de suas formas de desenvolvimento, por exemplo, um feto. Em uma forma de realização preferida, o indivíduo/paciente é um ser humano.
[0156]Em uma forma de realização, o paciente é uma população onde cada paciente tem um tumor tendo αvβ6 integrina na superfície da célula.
Exemplos Métodos Experimentais Gerais
[0157]As rotações ópticas foram medidas em um polarímetro ADP 220 (Bellingham Stanley Ltd.) e concentrações (c) são dadas em g/100 mL. Os pontos de fusão foram medidos usando um aparelho de ponto de fusão digital (Electrothermal). Os espectros de IR foram registrados em um Espectrômetro Perkin-Elmer Spectrum 1000 FT IR. Os espectros de RMN de 1H e 13C foram adquiridos a 300 K usando um espec- trômetro de RMN Avance Bruker a 400 e 100 MHz, respectivamente. Os desvios químicos são relatados em relação a TMS (δ = 0,0 ppm), e os sinais são designados como s (singleto), d (dubleto), t (tripleto), dt (duplo tripleto), dd (dubleto de dubletos), ddd (duplo dubleto de dubletos) ou m (multipleto), com acoplamento constante dado em Hertz (Hz). Os dados de espectroscopia de massas (MS) foram coletados usando um instrumento ZQ Micromass Waters acoplado a um HPLC 2695 Waters com um PDA 2996 Waters. Os parâmetros de ZQ Micromass Waters usados foram: Capilar (kV), 3,38; Cone (V), 35; Extrator (V), 3,0; Temperatura fonte (°C), 100; Temperatura de Dessolvatação (°C), 200; Taxa de fluxo cone (L/h), 50; Taxa de fluxo de dessolva- tação (L/h), 250. Dados de espectroscopia de massas de alta resolução (HRMS) foram registrados em um Waters Micromass QTOF Global em modo W positivo usando pontas de vidro de borossilicato revestidas com metal para introduzir as amostras no instrumento. Cromatografia de Camada Fina (TLC) foi realizada em placas de alumínio em gel de sílica (Merck 60, F254), e cromatografia flash utilizou gel de sílica (Merck 60, malha 230 - 400 ASTM). Exceto para HOBt (NovaBiochem) e reagentes suportados em sólidos (Argonaut), todos os outros produtos químicos e solventes foram adquiridos a partir da Sigma-Aldrich e foram usados como fornecidos sem purificação adicional. Os solventes de anidro foram preparados por destilação sob uma atmosfera de nitrogênio seca na presença de um agente de secagem apropriado, e foram armazenados sobre peneiras moleculares 4A ou fios de sódio. Éter de petróleo refere-se à fração em ebulição entre 40 a 60 °C.
Condições de LC/MS gerais: Método 1 (método padrão, usado a menos que de outro modo estabelecido)
[0158]A HPLC (Waters Alliance 2695) foi conduzida usando uma fase móvel de água (A) (ácido fórmico 0,1 %) e acetonitrila (B) (ácido fórmico 0,1 %). Gradiente: composição inicial 5 % de B mantida ao longo de 1,0 min, em seguida, aumento de 5 % de B a 95 % de B ao longo de um período de 3 min. A composição foi mantida por 0,1 min a 95 % de B, em seguida, voltou a 5 % de B em 0,03 min e permaneceu por 0,87 min. Tempo de gradiente de total conduzido igual a 5 minutos.
Método 2
[0159]A HPLC (Waters Alliance 2695) foi conduzida usando uma fase móvel de água (A) (ácido fórmico 0,1 %) e acetonitrila (B) (ácido fórmico 0,1 %). Gradiente: composição inicial 5 % de B mantida ao longo de 1,0 minuto, em seguida, aumento de 5 % de B a 95 % de B ao longo de um período de 2,5 minutos. A composição foi mantida por 0,5 minutos a 95 % de B, em seguida, voltou a 5 % de B em 0,1 min e permaneceu por 0,9 min. Tempo de gradiente de total conduzido igual a 5 minutos.
Para ambos os métodos
[0160]Taxa de fluxo 3,0 mL/min, 400 μL foram divididos via uma peça em T de volume morto nulo que passa no espectrômetro de massas. Faixa de detecção de comprimento de onda: 220 a 400 nm. Tipo de função: arranjo de diodos (535 varreduras). Coluna: Phenomenex Onyx Monolithic C18 50 x 4,60 mm.
[0161]As condições de purificação instantânea de fase reversa foram como segue: O sistema de purificação instantânea (Varian 971-Fp) foi conduzido usando uma fase móvel de água (A) e acetonitrila (B). Gradiente: composição inicial 5 % de B ao longo de 20 C.V. (Volume de Coluna), em seguida, 5 % de B a 70 % de B dentro de 60 C.V. A composição foi mantida por 15 C.V. a 95 % de Be, em seguida, voltou a 5 % de B em 5 C.V. e mantida a 5 % de B por 10 C.V. Tempo de gradiente total conduzido igual a 120 C.V. Taxa de fluxo 6,0 mL/min. Faixa de detecção de comprimento de onda: 254 nm. Coluna: Agilent AX1372-1 SF10-5.5gC8.
[0162]HPLC preparativa: Cromatografia líquida de desempenho ultra-alto de fase reversa (UPLC) foi realizada em colunas Phenomenex Gemini NX 5μ C-18 nas dimensões seguintes: 150 x 4,6 mm para análise, e 150 x 21,20 mm para trabalho pre-parativo. Todos os experimentos de UPLC foram realizados com condições de gradiente. Os eluentes usados foram solvente A (H2O com ácido fórmico a 0,1 %) e solvente B (CH3CN com ácido fórmico a 0,1 %). As taxas de fluxo usadas foram 1,0 ml/min para analítica, e 20,0 ml/min para HPLC preparativa. A detecção foi a 254 e 280 nm.Síntese de Intermediário 12(a) 1’,3’-Bis[2-metóxi-4-(metoxicarbonil)fenóxi]propano (3)
[0163]Azodicarboxilato de di-isopropila (71,3 mL, 73,2 g, 362 mmol) foi adici-onado, às gotas, ao longo de um período de 60 min a uma solução agitada por cima de vanilato de metila 2 (60,0 g, 329 mmol) e Ph3P (129,4 g, 494 mmol) em THF anidro (800 mL) entre 0 a 5 °C (gelo/acetona) sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação foi deixada agitar entre 0 a 5 °C por mais 1 hora após um tempo em que uma solução de 1,3-propanediol (11,4 mL, 12,0 g, 158 mmol) em THF (12 mL) foi adicio-nada, às gotas, ao longo de um período de 20 min. A mistura de reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada por 5 dias. O precipitado branco resul-tante 3 foi coletado por filtração a vácuo, lavado com THF e seco em um dessecador a vácuo até peso constante. Rendimento = 54,7 g (84 % com base em 1,3-propane- diol). Pureza satisfatória por LC/MS (3,20 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 427 ([M + Na]+., 10); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,64 (dd, 2H, J = 1,8, 8,3 Hz), 7,54 (d, 2H, J = 1,8 Hz), 6,93 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 4,30 (t, 4H, J = 6,1 Hz), 3,90 (s, 6H), 3,89 (s, 6H), 2,40 (p, 2H, J = 6,0 Hz).(b) 1’,3’-Bis[2-metóxi-4-(metoxicarbonil)-5-nitrofenóxi]propano (4)
[0164]Cu(NO3)2.3H2O sólido (81,5 g, 337,5 mmol) foi adicionado lentamente a uma pasta fluida agitada por cima do bis-éster 3 (54,7 g, 135 mmol) em anidrido acético (650 mL) entre 0 a 5 °C (gelo/acetona). A mistura de reação foi deixada agitar por 1 hora entre 0 a 5 °C e, em seguida, deixada aquecer até a temperatura ambiente. Uma exotermia suave (ca. 40 a 50 °C), acompanhada por um espessamento da mistura e evolução de NO2 foi observada neste estágio. Anidrido acético adicional (300 mL) foi adicionado e a mistura de reação foi deixada agitar por 16 horas na temperatura ambiente. A mistura de reação foi vertida sobre gelo (~ 1,5 L), agitada e deixada retornar até a temperatura ambiente. O precipitado amarelo resultante foi coletado por filtração a vácuo e seco em um dessecador para se obter o composto bis-nitro desejado 4 como um sólido amarelo. Rendimento = 66,7 g (100 %). Pureza satisfatória por LC/MS (3,25 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 517 ([M + Na]+., 40); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,49 (s, 2H), 7,06 (s, 2H), 4,32 (t, 4H, J = 6,0 Hz), 3,95 (s, 6H), 3,90 (s, 6H), 2,45 - 2,40 (m, 2H).(c) 1’,3’-Bis(4-carbóxi-2-metóxi-5-nitrofenóxi) propano (5)
[0165]Uma pasta fluida do éster metílico 4 (66,7 g, 135 mmol) em THF (700 mL) foi tratada com NaOH 1N (700 mL) e a mistura de reação foi deixada agitar vigo-rosamente na temperatura ambiente. Após 4 dias de agitação, a pasta fluida torna-se uma solução de cor escura que foi submetida à evaporação rotativa sob pressão re-duzida para remover THF. O resíduo aquoso resultante foi acidificado ao pH 1 com HCl concentrado e o precipitado incolor 5 foi coletado e seco completamente em um forno a vácuo (50 °C). Rendimento = 54,5 g (87 %). Pureza satisfatória por LC/MS (2,65 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 489 ([M + Na]+., 30)); RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,62 (s, 2H), 7,30 (s, 2H), 4,29 (t, 4H, J = 6,0 Hz), 3,85 (s, 6H), 2,30 - 2,26 (m, 2H).(d) 1,1’-[[(Propano-1,3-di-il)dióxi]bis[(5-metóxi-2-nitro-1,4-fenileno)carbonil]]- bis[(2S,4R)-metil-4-hidroxipirrolidino-2-carboxilato] (6)
[0166]Cloreto de oxalila (24,5 mL, 35,6 g, 281 mmol) foi adicionado a uma suspensão agitada do ácido nitrobenzoico 5 (43 g, 92,3 mmol) e DMF (6 mL) em DCM anidro (600 mL). Após a efervescência inicial, a suspensão de reação torna-se uma solução e a mistura foi deixada agitar na temperatura ambiente por 16 horas. A conversão ao cloreto de ácido foi confirmada tratando uma amostra da mistura de reação com MeOH e o éster bis-metílico resultante foi observado por LC/MS. A maioria de solvente foi removida por evaporação sob pressão reduzida; a solução concentrada resultante foi redissolvida em uma quantidade mínima de DCM seco e triturada com éter dietílico. O precipitado amarelo resultante foi coletado por filtração, lavado com éter dietílico frio e seco por 1 hora em um forno a vácuo a 40 °C. O cloreto de ácido sólido foi adicionado, às porções, ao longo de um período de 25 min a uma suspensão agitada de cloridreto de (2S,4R)-metil-4-hidroxipirrolidino-2-carboxilato (38,1 g, 210 mmol) e TEA (64,5 mL, g, 463 mmol) em DCM (400 mL) a -40 °C (gelo seco/CH3CN). Imediatamente, a reação foi concluída como julgada por LC/MS (2,47 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 721 ([M + H]+., 100). A mistura foi diluída com DCM (200 mL) e lavada com HCl 1N (300 mL), NaHCO3 saturado (300 mL), salmoura (400 mL), seca (MgSO4), filtrada e o solvente evaporado a vácuo para se obter o produto 6 puro como um sólido laranja (66,7 g, 100 %). [α]22D = -46,1° (c = 0,47, CHCl3); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) (rotâmeros) δ 7,63 (s, 2H), 6,82 (s, 2H), 4,79 - 4,72 (m, 2H), 4,49 - 4,28 (m, 6H), 3,96 (s, 6H), 3,79 (s, 6H), 3,46 - 3,38 (m, 2H), 3,02 (d, 2H, J = 11,1 Hz), 2,48 - 2,30 (m, 4H), 2,29 - 2,04 (m, 4H); RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) (rotâmeros) δ 172,4,166,7, 154,6, 148,4, 137,2, 127,0, 109,7, 108,2, 69,7, 65,1, 57,4, 57,0, 56,7, 52,4, 37,8, 29,0; IR (ATR, CHCl3) 3410 (br), 3010, 2953, 1741, 1622, 1577, 1519, 1455, 1429, 1334, 1274, 1211, 1177, 1072, 1050, 1008, 871 cm-1; MS (ES+) m/z (intensidade rela-tiva) 721 ([M + H]+., 47), 388 (80); HRMS [M + H]+. teórica C31H36N4O16 m/z 721,2199, encontrada (ES+) m/z 721,2227. (e) 1,1’-[[(Propano-1,3-di-il)dióxi]bis(11aS,2R)-2-(hidróxi)-7-metóxi- 1,2,3,10,11,11a-hexa-hidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-diona] (7)
[0167]Método A: uma solução do nitro-éster 6 (44 g, 61,1 mmol) em MeOH (2,8 L) foi adicionada ao níquel Raney® recentemente adquirido (~ 50 g de uma pasta fluida ~ 50 % em H2O) e grânulos reguladores de ebulição em um frasco de fundo redondo de 3 pescoços de 5L. A mistura foi aquecida a refluxo e, em seguida, tratada, às gotas, com uma solução de hidrato de hidrazina (21,6 mL, 22,2 g, 693 mmol) em MeOH (200 mL) no ponto em que uma efervescência vigorosa foi observada. Quando a adição foi concluída (~ 45 min), níquel Raney® adicional foi adicionado cuidadosamente até que a efervescência foi cessada e a cor amarela inicial da mistura de reação foi descarregada. A mistura foi aquecida a refluxo durante mais 5 min no ponto em que a reação foi considerada concluída por TLC (CHCl3/MeOH 90:10 v/v) e LC/MS (2,12 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 597 ([M + H]+., 100)). A mistura de reação foi filtrada a quente imediatamente através de um funil sinterizado contendo celite com sucção a vácuo. O filtrado foi reduzido em volume por evaporação a vácuo no ponto em que um precipitado incolor se formou, o qual foi coletado por filtração e seco em um dessecador a vácuo para fornecer 7 (31 g, 85 %). [α]27D = +404° (c = 0,10, DMF); RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,2 (s, 2H, NH), 7,26 (s, 2H), 6,73 (s, 2H), 5,11 (d, 2H, J = 3,98 Hz, OH), 4,32 - 4,27 (m, 2H), 4,19 - 4,07 (m, 6H), 3,78 (s, 6H), 3,62 (dd, 2H, J = 12,1, 3,60 Hz), 3,43 (dd, 2H, J = 12,0, 4,72 Hz), 2,67 - 2,57 (m, 2H), 2,26 (p, 2H, J = 5,90 Hz), 1,99 - 1,89 (m, 2H); RMN de 13C (100 MHz, DMSO-d6) δ 169,1, 164,0, 149,9, 144,5, 129,8, 117,1, 111,3, 104,5, 54,8, 54,4, 53,1, 33,5, 27,5; IR (ATR, puro) 3438, 1680,1654, 1610, 1605, 1516, 1490, 1434, 1379, 1263, 1234, 1216, 1177, 1156, 1115, 1089, 1038, 1018, 952, 870 cm-1; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 619 ([M + Na]+., 10), 597 ([M + H]+., 52), 445 (12), 326 (11); HRMS [M + H]+. teórica C29H32N4O10 m/z 597,2191, encontrada (ES+) m/z 597,2205.
[0168]Método B: Uma suspensão de Pd a 10 %/C (7,5 g, 10 % p/p) em DMF (40 mL) foi adicionada a uma solução do nitro-éster 6 (75 g, 104 mmol) em DMF (360 mL). A suspensão foi hidrogenada em um aparelho de hidrogenação Parr ao longo de 8 horas. O progresso da reação foi monitorado por LC/MS depois da absorção de hidrogênio ser interrompida. Pd/C sólido foi removido por filtração e o filtrado foi con-centrado por evaporação rotativa sob vácuo (abaixo de 10 mbar) a 40 °C para se obter um óleo escuro contendo traços de DMF e carvão residual. O resíduo foi digerido em EtOH (500 mL) a 40 °C em um banho de água (banho de evaporador rotatório) e a suspensão resultante foi filtrada através de celite e lavada com etanol (500 mL) para se obter um filtrado claro. Hidrato de hidrazina (10 mL, 321 mmol) foi adicionado à solução e a mistura de reação foi aquecida a refluxo. Após 20 minutos, a formação de um precipitado branco foi observada e o refluxo foi deixado continuar durante mais 30 minutos. A mistura foi deixada arrefecer até a temperatura ambiente e o precipitado foi recuperado por filtração, lavado com éter dietílico (volume 2:1 de precipitado) e seco em um dessecador a vácuo para fornecer 7 (50 g, 81 %). Dados analíticos para o Método B: Idênticos àqueles obtidos para o Método A (rotação óptica, RMN de 1H, LC/MS e TLC).(f) 1,1’-[[(Propano-1,3-di-il)dióxi]bis(11aS,2R)-2-(terc-butildimetilsililóxi)-7-metóxi- 1,2,3,10,11,11a-hexa-hidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-diona] (8)
[0169]TBSCl (27,6 g, 182,9 mmol) e imidazol (29,9 g, 438,8 mmol) foram adi-cionados a uma solução turva da tetralactama 7 (21,8 g, 36,6 mmol) em DMF anidro (400 mL) a 0 °C (gelo/acetona). A mistura foi deixado agitar sob uma atmosfera de nitrogênio por 3 horas depois do tempo da reação ser considerado completo como julgado por LC/MS (3,90 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 825 ([M + H]+., 100). A mistura de reação foi vertida sobre gelo (~ 1,75 L) e deixada aquecer até a tempera-tura ambiente com agitação. O precipitado branco resultante foi coletado por filtração a vácuo, lavado com H2O, éter dietílico e seco no dessecador a vácuo para fornecer 8 puro (30,1 g, 99 %). [α]23D = +234° (c = 0,41, CHCl3); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,65 (s, 2H, NH), 7,44 (s, 2H), 6,54 (s, 2H), 4,50 (p, 2H, J = 5,38 Hz), 4,21 - 4,10 (m, 6H), 3,87 (s, 6H), 3,73 - 3,63 (m, 4H), 2,85 - 2,79 (m, 2H), 2,36 - 2,29 (m, 2H), 2,07 - 1,99 (m, 2H), 0,86 (s, 18H), 0,08 (s, 12H); RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) δ 170,4, 165,7, 151,4, 146,6, 129,7, 118,9, 112,8, 105,3, 69,2, 65,4, 56,3, 55,7, 54,2, 35,2, 28,7, 25,7, 18,0, - 4,82 e -4,86; IR (ATR, CHCl3) 3235, 2955, 2926, 2855, 1698, 1695, 1603, 1518, 1491, 1446, 1380, 1356, 1251, 1220, 1120, 1099, 1033 cm-1; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 825 ([M + H]+., 62), 721 (14), 440 (38); HRMS [M + H]+ teórica C41H60N4O10Si2 m/z 825,3921, encontrada (ES+) m/z 825,3948.(g) 1,1’-[[(Propano-1,3-di-il)dióxi]bis(11aS,2R)-2-(terc-butildimetilsililóxi)-7- metóxi-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)-1,2,3,10,11,11a-hexa-hidro-5H-pirrolo[2,1- c][1,4]-benzodiazepin-5,11-diona] (9)
[0170]Uma solução de n-BuLi (68,3 mL de uma solução 1,6 M em hexano, 109 mmol) foi adicionada, às gotas, a uma suspensão agitada da tetralactama 8 (30,08 g, 36,4 mmol) em THF anidro (600 mL) a -30 °C (gelo seco/etileno glicol) sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação foi deixada agitar nesta temperatura por 1 hora (agora uma cor laranja avermelhada) no ponto em que uma solução de SEMCl (19,3 mL, 18,2 g, 109 mmol) em THF anidro (120 mL) foi adicionada às gotas. A mistura de reação foi deixada aquecer lentamente até a temperatura ambiente e foi agitada por 16 horas sob uma atmosfera de nitrogênio. A reação foi considerada completa como julgado por TLC (EtOAc) e LC/MS (4,77 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1085 ([M + H]+., 100). O THF foi removido por evaporação a vácuo e o resíduo resultante dissolvido em EtOAc (750 mL), lavado com H2O (250 mL), salmoura (250 mL), seco (MgSO4), filtrado e evaporado a vácuo para fornecer a tetralactama 9 bruta protegida por N10-SEM como um óleo (maxm 39,5 g, 100 %). Produto carregado atra-vés da próxima etapa sem purificação. [α]23D = +163° (c = 0,41, CHCI3); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,33 (s, 2H), 7,22 (s, 2H), 5,47 (d, 2H, J = 9,98 Hz), 4,68 (d, 2H, J = 9,99 Hz), 4,57 (p, 2H, J = 5,77 Hz), 4,29 - 4,19 (m, 6H), 3,89 (s, 6H), 3,79 - 3,51 (m, 8H), 2,87 - 2,81 (m, 2H), 2,41 (p, 2H, J = 5,81 Hz), 2,03 - 1,90 (m, 2H), 1,02 - 0,81 (m, 22H), 0,09 (s, 12H), 0,01 (s, 18H); RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) δ 170,0, 165,7, 151,2, 147,5, 133,8, 121,8, 111,6, 106,9, 78,1, 69,6, 67,1, 65,5, 56,6, 56,3, 53,7, 35,6, 30,0, 25,8, 18,4, 18,1, - 1,24, -4,73; IR (ATR, CHCl3) 2951, 1685, 1640, 1606, 1517, 1462, 1433, 1360, 1247, 1127, 1065 cm-1; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1113 ([M + Na]+., 48), 1085 ([M + H]+., 100), 1009 (5), 813 (6); HRMS [M + H]+. teórica C53H88N4O12Si4 m/z 1085,5548, encontrada (ES+) m/z 1085,5542.(h) 1,1’-[[(Propano-1,3-di-il)dióxi]bis(11aS,2R)-2-hidróxi-7-metóxi-10-((2-(tri- metilsilil)etóxi)metil)-1,2,3,10,11,11a-hexa-hidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin- 5,11-diona] (10)
[0171]Uma solução de TBAF (150 mL de uma solução 1,0 M em THF, 150 mmol) foi adicionada a uma solução agitada do éter bis-silílico 9 bruto [84,0 g (maxm 56,8 g), 52,4 mmol] em THF (800 mL) na temperatura ambiente. Depois de agitação por 1 hora, a análise da mistura de reação por TLC (CHCl3/MeOH 95:5 v/v) revelou a conclusão da reação. O THF foi removido por evaporação sob pressão reduzida na temperatura ambiente e o resíduo resultante dissolvido em EtOAc (500 mL) e lavado com NH4Cl (300 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com sal-moura (60 mL), secas (MgSO4), filtradas e evaporadas sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto. Purificação por cromatografia flash (eluição por gradiente: CHCl3 a 100 %para CHCl3/MeOH 96:4 v/v) forneceu a tetralactama 10 pura como uma espuma branca (36,0 g, 79 %). LC/MS 3,33 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 879 ([M + Na]+., 100), 857 ([M + H]+., 40); [α]23D = +202° (c = 0,34, CHCl3); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,28 (s, 2H), 7,20 (s, 2H), 5,44 (d, 2H, J = 10,0 Hz), 4,72 (d, 2H, J = 10,0 Hz), 4,61 - 4,58 (m, 2H), 4,25 (t, 4H, J = 5,83 Hz), 4,20 - 4,16 (m, 2H), 3,91 - 3,85 (m, 8H), 3,77 - 3,54 (m, 6H), 3,01 (br s, 2H, OH), 2,96 - 2,90 (m, 2H), 2,38 (p, 2H, J = 5,77 Hz), 2,11 - 2,05 (m, 2H), 1,00 - 0,91 (m, 4H), 0,00 (s, 18H); RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) δ 169,5, 165,9, 151,3, 147,4, 133,7, 121,5, 111,6, 106,9, 79,4, 69,3, 67,2, 65,2, 56,5, 56,2, 54,1, 35,2, 29,1, 18,4, -1,23; IR (ATR, CHCl3) 2956, 1684, 1625, 1604, 1518, 1464, 1434, 1361, 1238, 1058, 1021 cm-1; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 885 ([M + 29]+., 70), 857 ([M + H]+., 100), 711 (8), 448 (17); HRMS [M + H]+. teórica C41H60N4O12Si2 m/z 857,3819, encontrada (ES+) m/z 857,3826.(i) 1,1’-[[(Propano-1,3-di-il)dióxi]bis(11aS)-7-metóxi-2-oxo-10-((2-(trimetilsilil)- etóxi)metil)-1,2,3,10,11,11a-hexa-hidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-di- ona] (11)
[0172]Diol 10 (25,6 g, 30 mmol, 1 eq.), NaOAc (6,9 g, 84 mmol, 2,8 eq.) e TEMPO (188 mg, 1,2 mmol, 0,04 eq.) foram dissolvidos em DCM (326 mL) sob Ar. Este foi esfriado a -8 °C (temperatura interna) e TCCA (9,7 g, 42 mmol, 1,4 eq.) foi adicionado, às porções, ao longo de 15 minutos. TLC (EtOAc) e LC/MS [3,60 min. (ES+) m/z (intensidade relativa) 854,21 ([M + H]+., 40), (ES-) m/z (intensidade relativa) 887,07 ([M - H + Cl]-., 10)] depois de 30 minutos indicou que a reação foi concluída. DCM frio (200 mL) foi adicionado e a mistura foi filtrada através de uma almofada de Celite antes de lavar com uma solução de hidrogenocarbonato de sódio saturado/ti- ossulfato de sódio (1:1 v/v; 200 mL x 2). A camada orgânica foi seca com MgSO4, filtrada e o solvente removido a vácuo para se obter uma esponja amarela/laranja (25,4 g, 99 %). LC/MS [3,60 min. (ES+) m/z (intensidade relativa) 854,21 ([M + H]+., 40); [α]20D = +291° (c = 0,26, CHCl3); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,32 (s, 2H), 7,25 (s, 2H), 5,50 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,75 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,60 (dd, 2H, J = 9,85, 3,07 Hz), 4,31 - 4,18 (m, 6H), 3,89 - 3,84 (m, 8H), 3,78 - 3,62 (m, 4H), 3,55 (dd, 2H, J = 19,2, 2,85 Hz), 2,76 (dd, 2H, J = 19,2, 9,90 Hz), 2,42 (p, 2H, J = 5,77 Hz), 0,98 - 0,91 (m, 4H), 0,00 (s, 18H); RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) δ 206,8, 168,8, 165,9, 151,8, 148,0, 133,9, 120,9, 111,6, 107,2, 78,2, 67,3, 65,6, 56,3, 54,9, 52,4, 37,4, 29,0, 18,4, -1,24; IR (ATR, CHCl3) 2957, 1763, 1685, 1644, 1606, 1516, 1457, 1434, 1360, 1247, 1209, 1098, 1066, 1023 cm-1; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 881 ([M + 29]+., 38), 853 ([M + H]+., 100), 707 (8), 542 (12); HRMS [M + H]+. teórica C41H56N4O12Si2 m/z 853,3506, encontrada (ES+) m/z 853,3502.(j) 1,1’-[[(Propano-1,3-di-il)dióxi]bis(11aS)-7-metóxi-2-[[(trifluorometil)sulfonil]- óxi]-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)-1,10,11,11a-tetra-hidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-ben- zodiazepin-5,11-diona] (12)
[0173]2,6-Lutidina anidra (5,15 mL, 4,74 g, 44,2 mmol) foi injetada em uma porção para uma solução vigorosamente agitada de bis-cetona 11 (6,08 g, 7,1 mmol) em DCM seco (180 mL) a -45 °C (gelo seco/acetonitrila) sob uma atmosfera de nitro-gênio. Anidrido tríflico anidro, tomado a partir de uma ampola aberta recentemente (7,2 mL, 12,08 g, 42,8 mmol), foi injetado rapidamente às gotas, enquanto mantendo a temperatura a -40 °C ou abaixo. A mistura de reação foi deixada agitar a -45 °C por 1 hora no ponto em que TLC (n-hexano/EtOAc 50/50 v/v) revelou o consumo completo do material de partida. A mistura de reação fria foi imediatamente diluída com DCM (200 mL) e, com agitação vigorosa, lavada com água (1 x 100 mL), solução de ácido cítrico a 5 % (1 x 200 mL), NaHCO3 saturado (200 mL), salmoura (100 mL) e seca (MgSO4). A filtração e evaporação do solvente sob pressão reduzida proporcionou o produto bruto que foi purificado por cromatografia em coluna flash (eluição por gradiente: n-hexano/EtOAc 90:10 v/v para n-hexano/EtOAc 70:30 v/v) para se obter triflato de bis-enol 12 como uma espuma amarela (5,5 g, 70 %). LC/MS 4,32 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1139 ([M + Na]+., 20); [α]24D = +271° (c = 0,18, CHCl3); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,33 (s, 2H), 7,26 (s, 2H), 7,14 (t, 2H, J = 1,97 Hz), 5,51 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,76 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,62 (dd, 2H, J = 11,0, 3,69 Hz), 4,32 - 4,23 (m, 4H), 3,94 - 3,90 (m, 8H), 3,81 - 3,64 (m, 4H), 3,16 (ddd, 2H, J = 16,3, 11,0, 2,36 Hz), 2,43 (p, 2H, J = 5,85 Hz), 1,23 - 0,92 (m, 4H), 0,02 (s, 18H); RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) δ 167,1, 162,7, 151,9, 148,0, 138,4, 133,6, 120,2, 118,8, 111,9, 107,4, 78,6, 67,5, 65,6, 56,7, 56,3, 30,8, 29,0, 18,4, -1,25; IR (ATR, CHCl3) 2958, 1690, 1646, 1605, 1517, 1456, 1428, 1360, 1327, 1207, 1136, 1096, 1060, 1022, 938, 913 cm-1; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1144 ([M + 28]+., 100), 1117 ([M + H]+., 48), 1041 (40), 578 (8); HRMS [M + H]+. teórica C43H54N4O16Si2S2F6 m/z 1117,2491, en-contrada (ES+) m/z 1117,2465.(a) Trifluorometanossulfonato de (S)-8-(3-(((S)-2-(4-aminofenil)-7-metóxi- 5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pir- rolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsi- lil)etóxi)metil)-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-ila (13)
[0174]Pd(PPh3)4 (116,9 mg, 0,101 mmol) foi adicionado a uma mistura agitada do triflato de bis-enol 12 (5,65 g, 5,06 mmol), éster pinacólico de ácido 4-aminofenil- borônico (1 g, 4,56 mmol), Na2CO3 (2,46 g, 23,2 mmol), MeOH (37 mL), tolueno (74 mL) e água (37 mL). A mistura de reação foi deixada agitar a 30 °C sob uma atmosfera de nitrogênio por 24 horas após o tempo em que todo o éster borônico foi consumido. A mistura de reação depois foi evaporada à secura antes do resíduo ser retomado em EtOAc (150 mL) e lavado com H2O (2 x 100 mL), salmoura (150 mL), seco (MgSO4), filtrado e evaporado sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto. Purificação por cromatografia flash (eluição por gradiente: Hexano/EtOAc 80:20 v/v para He- xano/EtOAc 60:40 v/v) proporcionou o produto 13 como uma espuma amarelada (2,4 g, 45 %). LC/MS 4,02 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1060,21 ([M + H]+., 100); RMN de 1H: (CDCl3, 400 MHz) δ 7,40 (s, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,27 (bs, 3H), 7,24 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 7,15 (t, 1H, J = 2,0 Hz), 6,66 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 5,52 (d, 2H, J = 10,0 Hz), 4,77 (d, 1H, J = 10,0 Hz), 4,76 (d, 1H, J = 10,0 Hz), 4,62 (dd, 1H, J = 3,7, 11,0 Hz), 4,58 (dd, 1H, J = 3,4, 10,6 Hz), 4,29 (t, 4H, J = 5,6 Hz), 4,00 - 3,85 (m, 8H), 3,80 - 3,60 (m, 4H), 3,16 (ddd, 1H, J = 2,4, 11,0, 16,3 Hz), 3,11 (ddd, 1H, J = 2,2, 10,5, 16,1 Hz), 2,43 (p, 2H, J = 5,9 Hz), 1,1 - 0,9 (m, 4H), 0,2 (s, 18H). RMN de 13C: (CDCl3, 100 MHz) δ 169,8, 168,3, 164,0, 162,7, 153,3, 152,6, 149,28, 149,0, 147,6, 139,6, 134,8, 134,5, 127,9, 127,5, 125,1, 123,21, 121,5, 120,5, 120,1, 116,4, 113,2, 108,7, 79,8, 79,6, 68,7, 68,5, 67,0, 66,8, 58,8, 58,0, 57,6, 32,8, 32,0, 30,3, 19,7, 0,25.(b) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-ciclopropil-7-metóxi-5,11-dioxo-10-((2- (trimetilsilil)etóxi)metil)-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin- 8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepino-5,11(10H,11aH)-diona (14)
[0175]Trifenilarsina (0,24 g, 0,8 mmol), óxido de prata (I) (1,02 g, 4,4 mmol), ácido ciclopropilborônico (0,47 g, 5,5 mmol) e material de partida 13 (1,15 g, 1,1 mmol) foram dissolvidos em dioxano (30 mL) sob uma atmosfera de argônio. Fosfato de potássio tribásico (2,8 g, 13,2 mmol) foi moído com um pilão e almofariz e adicionado rapidamente à mistura de reação. A mistura de reação foi despejada e fluxada com argônio 3 vezes e aquecida a 71 °C. Bis (cloreto de benzonitrila) de paládio (II) (84 mg, 0,22 mmol) foi adicionado e o vaso de reação foi esvaziado e fluxado com argônio 3 vezes. Após 10 minutos, uma pequena amostra foi tomada para análise por TLC (acetato de etila/hexano 80:20 v/v) e LC/MS. Após 30 minutos, a reação se completou (análise de LC/MS indicou o consumo completo do material de partida) e a reação foi filtrada através de celite e a almofada do filtro lavada com acetato de etila (400 mL). O filtrado foi lavado com água (2 x 200 mL) e salmoura (2 x 200 mL). A camada orgânica foi seca com MgSO4, filtrada e o solvente removido a vácuo. Purificação por cro- matografia em coluna de gel de sílica (Hexano/Acetato de etila 30:70 v/v) proporcionou o produto 14 como um sólido laranja/amarelo (0,66 g, 63 %). Método 1, LC/MS (3,85 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 952,17 ([M + H]+., 100). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,36 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,30 (s, 1H), 7,25 - 7,19 (m, 4H), 6,68 (s, 1H), 6,62 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 5,49 (dd, 2H, J = 5,6, 10,0 Hz), 4,73 (app. t, 2H, J = 10,8 Hz), 4,54 (dd, 1H, J = 3,2, 10,4 Hz), 4,40 (dd, 1H, J = 3,2, 10,4 Hz), 4,29 - 4,23 (m, 4H), 3,91 - 3,85 (m, 7H), 3,80 - 3,71 (m, 2H), 3,70 - 3,61 (m, 2H), 3,38 - 3,32 (m, 1H), 3,12 - 3,01 (m, 1H), 2,50 - 2,69 (m, 1H), 2,40 (q, 2H, J = 5,6 Hz), 1,50 - 1,43 (m, 1H), 0,99 - 0,71 (m, 6H), 0,54 - 0,59 (m, 2H), 0,00 (s, 18H) ppm.(c) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-ciclopropil-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di-hidro- 1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-1H-benzo[e]pir- rolo[1,2-a][1,4]diazepin-5(11aH)-ona (15)
[0176]SEM dilactama 14 (0,66 g, 0,69 mmol) foi dissolvida em THF (23 mL) e esfriado a -78 °C sob uma atmosfera de argônio. Solução de Super-Hidreto® (1,7 mL, 1 M em THF) foi adicionada, às gotas, ao longo de 5 minutos enquanto monitorando a temperatura. Após 20 minutos, uma pequena amostra foi tomada e lavada com água para análise de LC/MS. Água (50 mL) foi adicionada e o banho frio foi removido. A camada orgânica foi extraída e lavada com salmoura (60 mL). As camadas aquosas combinadas foram lavadas com CH2Cl2/MeOH (90/10 v/v) (2 x 50 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas com MgSO4, filtradas e o solvente removido a vácuo. O produto bruto foi dissolvido em MeOH (48 mL), CH2Cl2 (18 mL) e água (6 mL) e gel de sílica suficiente foi adicionado para se obter uma suspensão espessa. Após 5 dias de agitação, a suspensão foi filtrada através de um funil sinterizado e lavada com CH2Cl2/MeOH (9:1) (~ 200 mL) até o produto cessado ser eluído. A ca-mada orgânica foi lavada com salmoura (2 x 70 mL), seca com MgSO4, filtrada e o solvente removido a vácuo. Purificação por cromatografia em coluna de gel de sílica (CHCl3 a 100 % para CHCl3/MeOH 96/4 v/v) proporcionou o produto 15 como um só-lido amarelo (302 mg, 66 %). Método 1, LC/MS (2,42 min (ES+) m/z (intensidade rela-tiva) 660,74 ([M + H]+., 30). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,86 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,78 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,58 - 7,44 (m, 3H), 7,34 - 7,20 (m, 3H), 6,88 - 6,66 (m, 4H), 4,35 - 4,15 (m, 6H), 3,95 - 3,75 (m, 7H), 3,39 - 3,22 (m, 1H), 3,14 - 3,04 (m, 1H), 2,93 - 2,85 (m, 1H), 2,46 - 2,36 (m, 2H), 1,49 - 1,41 (m, 1H), 0,80 - 0,72 (m, 2H), 0,58 - 0,51 (app. s, 2H) ppm.(d) ((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-Ciclopropil-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di-hidro- 1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di-hidro- 1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3- metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de alila (16)
[0177]Em um frasco de fundo redondo desgaseificado enchido com argônio, HO-Ala-Val-alloc (149,6 mg, 0,549 mmol) e EEDQ (135,8 mg, 0,549 mmol) foram dis-solvidos em uma mistura 9:1 de CH2Cl2/MeOH seco (5 mL). O frasco foi envolto em papel-alumínio e a mistura de reação foi deixada agitar na temperatura ambiente por 1 hora antes do material de partida 15 (302 mg, 0,457 mmol) ser adicionado. A mistura de reação foi deixada agitar durante mais 40 horas na temperatura ambiente antes dos voláteis serem removidos por evaporação rotativa sob pressão reduzida (a reação foi seguida por LC/MS, RT do material de partida 2,32 min, (ES+ 660,29 ([M + H]+.,100)). O produto bruto foi diretamente purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (CHCl3 a 100 % a CHCl3/MeOH 90/10 v/v) para se obter o produto (16) puro em 42 % de rendimento (174 mg). Método 2 LC/MS (2,70 min (ES+) m/z (inten-sidade relativa) 914,73 ([M + H]+., 60), 660,43 (60), 184,31 (100)). (e) (2S)-2-amino-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciclopropil-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di- hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di- hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)-3-me- tilbutanamida (17)
[0178]O material de partida 16 (170 mg, 0,185 mmol) foi dissolvido em CH2Cl2 seco (5 mL) em um frasco de fundo redondo enchido com argônio, antes de pirrolidina (41 μL, 0,21 mmol) ser adicionada. O frasco foi purgado/enchido novamente três vezes com argônio antes de Pd(PPh3)4 (14 mg, 0,084 mmol) ser adicionado e a operação de descarga repetida. Após 1 hora, o consumo completo do material de partida foi observado (a reação foi seguida por LC/MS) e Et2O (50 mL) foi adicionado à mistura de reação que foi deixada agitar até todo o produto sair da solução. O sólido foi filtrado através de um funil sinterizado e lavado duas vezes com Et2O (2 x 25 mL). O frasco de coleta foi substituído e o sólido isolado foi dissolvido em CHCl3 (100 mL ou até todo o produto passar através do funil sinterizado). Os voláteis foram então removidos por evaporação rotativa sob pressão reduzida para se obter o produto 17 bruto que foi usado diretamente na próxima etapa (168 mg). LC/MS Método 2 (2,70 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 830,27 ([M + H]+., 50), 660,13 (80), 171,15 (100)).(f) N-((R)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-ciclopropil-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di-hi- dro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di- hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2- il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-1-(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propana- mido)-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxa-heptacosan-27-amida (18)
[0179]Material de partida 17 (154 mg, 0,185 mmol) e EDCI.HCl (110 mg, 0,185 mmol) foram solubilizados em CH2Cl2 seco (5 mL) em um frasco de fundo redondo purgado e enchido com argônio. A mistura foi deixada agitar na temperatura ambiente por 1 hora antes de PEG8-maleimida (35,6 mg, 0,185 mmol) ser adicionado e a mistura de reação agitada durante mais 16 horas (ou até a reação ser concluída, monitorada por LC/MS). A solução de reação foi diluída com CH2Cl2 (50 mL) e os orgânicos foram lavados com H2O (50 mL) e salmoura (50 mL) antes de serem secos com MgSO4, filtrados e o solvente removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida para se obter o produto bruto. Purificação em cromatografia em coluna de gel de sílica (CHCl3 a 100 % para CHCl3/MeOH 85/15 v/v) forneceu o produto desejado (135 mg), entretanto, os traços remanescentes de PEG8-maleimida não reagida foram observados (por LC/MS, 2,21 min, Método 2). A cromatografia de gel de sílica de fase reversa automatizada (H2O/CH3CN) (veja a informação geral para as condições) removeu com êxito a impureza proporcionando o produto final puro (18,37 mg de produto puro partindo de 110 mg, 33 %). Rendimento global = 17 %. Método 2 LC/MS (2,58 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1404,03 ([M + H]+., 20), 702,63 (100)). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,91 (t, J = 3,5 Hz, 1H), 7,80 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,54 - 7,50 (m, 2H), 7,45 (s, 1H), 7,39 - 7,31 (m, 2H), 6,87 (d, J = 10,5 Hz, 2H), 6,76 (s, 1H), 6,72 - 6,68 (m, 2H), 4,74 - 4,62 (m, 1H), 4,45 - 4,17 (m, 7H), 3,95 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 3,67 - 3,58 (m, 34H), 3,54 (m, 2H), 3,42 (dd, J = 10,2, 5,2 Hz, 2H), 3,16 - 3,07 (m, 1H), 2,92 (dd, J = 16,1, 4,1 Hz, 1H), 2,62 - 2,49 (m, 4H), 2,48 - 2,39 (m, 2H), 2,37 - 2,25 (m, 1H), 1,92 (s, 1H), 1,52 - 1,44 (m, 3H), 1,10 - 0,93 (m, 6H), 0,79 (dd, J = 9,2, 5,3 Hz, 2H), 0,57 (dd, J = 9,2, 5,3 Hz, 2H), NH não foram observados.Exemplo 2 (a) ácido (R)-2-((R)-2-((((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonil)amino)-3-metilbuta- namido)propanóico (20b)
[0180]HO-Ala-Val-H 20a (350 mg, 1,86 mmol) e Na2CO3 (493 mg, 4,65 mmol) foram dissolvidos em H2O destilada (15 mL) e a mistura foi esfriada a 0 °C antes de dioxano (15 mL) ser adicionado (precipitação parcial do sal de aminoácido ocorreu). Uma solução de Fmoc-Cl (504 mg, 1,95 mmol) em dioxano (15 mL) foi adicionada, às gotas, com agitação vigorosa ao longo de 10 minutos. A mistura resultante foi agitada a 0 °C por 2 horas antes do banho de gelo ser removido e a agitação foi mantida por 16 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida e o resíduo dissolvido em água (150 mL). O pH foi ajustado de 9 a 2 com HCl 1N e a camada aquosa foi subsequentemente extraída com EtOAc (3 x 100 mL). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura (100 mL), secos com MgSO4, filtrados e os voláteis removidos por evaporação rotativa sob pressão reduzida para se obter HO-Ala-Val-Fmoc 20b puro (746 mg, 97 % de rendimento). LC/MS 2,85 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 410,60; RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,79 (d, J = 7,77 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 7,77 Hz, 2H), 7,43 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,34 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 6,30 (bs, 1H), 5,30 (bs, 1H), 4,71 - 7,56 (m, 1H), 4,54 - 4,36 (m, 2H), 4,08 - 3,91 (m, 1H), 2,21 - 2,07 (m, 1H), 1,50 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 1,06 - 0,90 (m, 6H).(b) ((S)-3-metil-1-oxo-1-(((S)-1-oxo-1-((4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaboro- lan-2-il)fenil)amino)propan-2-il)amino)butan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metila (20)
[0181]Éster pinacólico de ácido 4-aminofenilborônico (146,9 mg, 0,67 mmol) foi adicionado a uma solução de HO-Ala-Val-Fmoc 20b (330 mg, 0,8 mmol), DCC (166 mg, 0,8 mmol) e DMAP (5 mg, cat.) em DCM seco (8 mL) previamente agitada por 30 minutos na temperatura ambiente em um frasco fluxado com argônio. A mistura de reação depois foi deixada agitar na temperatura ambiente durante a noite. A reação foi seguida por LCMS e TLC. A mistura de reação foi diluída com CH2Cl2 e os orgânicos foram lavados com H2O e salmoura antes de serem secos com MgSO4, filtrados e o solvente removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida. O produto bruto foi carregado a seco em uma cromatografia em coluna de gel sílica (Hexano/EtOAc, 6:4) e produto 20 puro foi isolado como um sólido branco em 88 % de rendimento (360 mg).(c) trifluorometanossulfonato de 8-(3-((2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9- il)metóxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)fenil)-7-metóxi-5,11-dioxo- 10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)- 5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-ila (21)
[0182]Bis-triflato 12 (2,03 g, 1,81 mmol), éster borônico pinacólico (1 g, 1,63 mmol) e Na2CO3 (881 mg, 8,31 mmol) foram dissolvidos em uma mistura de tolu- eno/MeOH/H2O, 2:1:1 (40 mL). O frasco de reação foi purgado e enchido com argônio três vezes antes de tetracis(trifenilfosfino)paládio(0) (41 mg, 0,035 mmol) ser adicionado e a mistura de reação aquecida a 30 °C durante a noite. Os solventes foram removidos sob pressão reduzida e o resíduo foi retomado em H2O (100 mL) e extraído com EtOAc (3 x 100 mL). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura (100 mL), secos com MgSO4, filtrados e os voláteis removidos por evaporação rotativa sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (Hexano/EtOAc, 8:2 a 25:75) para se obter 21 puro em 33 % de rendimento (885 mg). LC/MS 3,85 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1452,90; RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,78 - 7,16 (m, 17H), 7,13 (s, 1H), 6,51 - 6,24 (m, 1H), 5,51 (dd, J = 10,0, 5,1 Hz, 2H), 5,36 - 5,11 (m, 1H), 4,74 (dd, J = 10,1, 4,4 Hz, 2H), 4,70 - 4,53 (m, 2H), 4,47 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 4,37 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,27 (m, 4H), 4,20 - 4,14 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,89 (s, 3H), 3,77 (ddd, J = 16,7, 9,0, 6,4 Hz, 3H), 3,71 - 3,61 (m, 2H), 3,24 - 2,91 (m, 3H), 2,55 - 2,33 (m, 2H), 2,22 - 2,07 (m, 1H), 1,52 - 1,37 (m, 3H), 1,04 - 0,86 (m, 10H), 0,00 (s, 18H).(d) (9H-fluoren-9-il)metil((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciclopropil-7-metóxi- 5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pir- rolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin- 2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato (22)
[0183]Trifenilarsina (42 mg, 0,137 mmol) foi adicionada a uma mistura de PBD-triflato 21 (250 mg, 0,172 mmol), ácido ciclopropilborônico (73,9 mg, 0,86 mmol), óxido de prata (159 mg, 0,688 mmol) e fosfato de potássio tribásico (438 mg, 2,06 mmol) em dioxano seco (10 mL) sob uma atmosfera de argônio. A reação foi fluxada com argônio 3 vezes e cloreto de bis(benzonitrila)paládio(II) (13,2 mg, 0,034 mmol) foi adicionado. A reação foi fluxada com Argônio 3 vezes mais antes de ser aquecida a 75 °C e agitada por 10 minutos. A mistura de reação foi filtrada através de uma almofada de celite que foi subsequentemente enxaguada com acetato de etila. O solvente foi removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna flash (gel de sílica; metanol a 1 %/clorofórmio). As frações puras foram coletadas e combinadas, e o excesso de eluente foi removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida para se obter o produto 22 desejado (132 mg, 50 % de rendimento). LC/MS 3,83 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1345,91; RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,88 - 7,14 (m, 17H), 6,69 (s, 1H), 6,45 - 6,25 (m, 1H), 5,57 - 5,41 (m, 2H), 5,34 - 5,14 (m, 1H), 4,78 - 4,67 (m, 2H), 4,62 - 4,55 (m, 1H), 4,50 - 4,45 (m, 2H), 4,51 - 4,44 (m, 1H), 4,31 - 4,21 (m, 4H), 4,16 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,86 (s, 3H), 3,82 - 3,71 (m, 2H), 3,66 (m, 3H), 3,40 - 3,28 (m, 1H), 3,07 (m, 1H), 2,70 - 2,57 (m, 1H), 2,47 - 2,36 (m, 2H), 2,15 (m, 1H), 1,51 - 1,40 (m, 3H), 1,03 - 0,87 (m, 11H), 0,77 - 0,71 (m, 2H), 0,60 - 0,54 (m, 2H), 0,00 (t, J = 3,0 Hz, 18H).(e) (9H-fluoren-9-il)metil((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciclopropil-7-metóxi-5- oxo-5,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5- oxo-5,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopro- pan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato (23)
[0184]Uma solução de Super-Hidreto® (0,5 mL, 1M em THF) foi adicionada, às gotas, a uma solução de SEM dilactama 22 (265 mg g, 0,19 mmol) em THF (10 mL) a -78 °C sob uma atmosfera de argônio. A adição foi concluída ao longo de 5 minutos de modo a manter a temperatura interna da mistura de reação constante. Após 20 minutos, uma alíquota foi resfriada rapidamente com água para análise de LC/MS, que revelou que a reação foi concluída. Água (20 mL) foi adicionada à mistura de reação e o banho frio foi removido. A camada orgânica foi extraída com EtOAc (3 x 30 mL) e os orgânicos combinados foram lavados com salmoura (50 mL), secos com MgSO4, filtrados e o solvente removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida. O produto bruto foi dissolvido em MeOH (12 mL), CH2Cl2 (6 mL), água (2 mL) e gel de sílica suficiente para formar uma suspensão de agitação espessa. Após 5 dias, a suspensão foi filtrada através de um funil sinterizado e lavada com CH2Cl2/MeOH (9:1) (200 mL) até a eluição do produto ser concluída. A camada orgânica foi lavada com salmoura (2 x 70 mL), seca com MgSO4, filtrada e o solvente removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida. Purificação por cromatografia em coluna de gel de sílica (CHCl3 a 100 % para CHCl3 a 96 %/MeOH a 4 %) proporcionou o produto 23 como um sólido amarelo (162 mg, 78 %). LC/MS 3,02 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1052,37.(f) (2S)-2-amino-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciclopropil-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di-hi- dro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di- hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)-3-me- tilbutanamida (17)
[0185]Piperidina em excesso foi adicionada (0,2 mL, 2 mmol) a uma solução de SEM-dilactama 23 (76 mg, 0,073 mmol) em DMF (1 mL). A mistura foi deixada agitar na temperatura ambiente por 20 min, no ponto em que a reação tinha ido para a conclusão (como monitorada por LC/MS). A mistura de reação foi diluída com CH2Cl2 (75 mL) e a fase orgânica foi lavada com H2O (3 x 75 mL) até concluir a remoção de piperidina. A fase orgânica foi seca sobre MgSO4, filtrada e o excesso de solvente removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida para se obter o produto 17 bruto que foi usado como tal na próxima etapa. LC/MS 2,32 min (ES+) m/z (intensi-dade relativa) 830,00.(g) N-((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciclopropil-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di-hidro- 1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di-hidro- 1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3- metil-1-oxobutan-2-il)-1-(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)- 3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxa-heptacosan-27-amida (18)
[0186]Cloridreto de EDCI (14 mg, 0,0732 mmol) foi adicionado a um suspen-são de Maleimida-PEG8-ácido (43,4 mg, 0,0732 mmol) em CH2Cl2 seco (5 mL) sob atmosfera de argônio. A mistura foi agitada por 1 hora na temperatura ambiente antes de PBD 17 (60,7 mg, 0,0732 mmol) ser adicionado. A agitação foi mantida até a reação ser concluída (usualmente 5 horas). A reação foi diluída com CH2Cl2 e a fase orgânica foi lavada com H2O e salmoura antes de ser seca sobre MgSO4, filtrada e o excesso de solvente removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida. O produto foi purificado por cromatografia de gel de sílica cuidadosa (eluição lenta iniciando com CHCl3 a 100 % até CHCl3/MeOH 9:1) seguido por cromatografia de fase reversa para remover maleimida-PEG8-ácido não reagido. O produto 18 foi isolado em 17,6 % (21,8 mg). LC/MS 2,57 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1405,30; RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,91 (t, J = 3,5 Hz, 1H), 7,80 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,54 - 7,50 (m, 2H), 7,45 (s, 1H), 7,39 - 7,31 (m, 2H), 6,87 (d, J = 10,5 Hz, 2H), 6,76 (s, 1H), 6,72 - 6,68 (m, 2H), 4,74 - 4,62 (m, 1H), 4,45 - 4,17 (m, 7H), 3,95 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 3,67 - 3,58 (m, 34H), 3,54 (m, 2H), 3,42 (dd, J = 10,2, 5,2 Hz, 2H), 3,16 - 3,07 (m, 1H), 2,92 (dd, J = 16,1, 4,1 Hz, 1H), 2,62 - 2,49 (m, 4H), 2,48 - 2,39 (m, 2H), 2,37 - 2,25 (m, 1H), 1,92 (s, 1H), 1,52 - 1,44 (m, 3H), 1,10 - 0,93 (m, 6H), 0,79 (dd, J = 9,2, 5,3 Hz, 2H), 0,57 (dd, J = 9,2, 5,3 Hz, 2H), NH não foram observados.Exemplo 3(a) Trifluorometanossulfonato de (S)-7-metóxi-8-(3-(((S)-7-metóxi-2-(4-(4-me- tilpiperazin-1-il)fenil)-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)-5,10,11,11a-tetra-hi- dro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)propóxi)-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsi- lil)etóxi)metil)-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-ila (24)
[0187]Pd(PPh3)4 (20,6 mg, 0,018 mmol) foi adicionado a uma mistura agitada do triflato de bis-enol 12 (500 mg, 0,44 mmol), éster borônico de N-metil piperazina (100 mg, 0,4 mmol), Na2Co3 (218 mg, 2,05 mmol), MeoH (2,5 mL), tolueno (5 mL) e água (2,5 mL). A mistura de reação foi deixada agitar a 30 °C sob uma atmosfera de nitrogênio por 24 horas após o tempo em que todo o éster borônico foi consumido. A mistura de reação depois foi evaporada à secura antes do resíduo ser retomado em EtoAc (100 mL) e lavada com H2o (2 x 50 mL), salmoura (50 mL), seca (MgSo4), filtrada e evaporada sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto. Purificação por cromatografia flash (eluição por gradiente: Hexano/EtOAc 80:20 v/v para He- xano/EtOAc 60:40 v/v) proporcionou o produto 24 como uma espuma amarelada (122,6 mg, 25 %). LC/MS 3,15 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1144 ([M + H]+., 20 %).(b) ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-metóxi-8-(3-(((S)-7-metóxi-2-(4-(4-metilpiperazin- 1-il)fenil)-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-pir- rolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)propóxi)-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)- metil)-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1- oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metila (25)
[0188]PBD-triflato 24 (359 mg, 0,314 mmol), éster borônico pinacólico 20 (250 mg, 0,408 mmol) e trietilamina (0,35 mL, 2,51 mmol) foram dissolvidos em uma mistura de tolueno/MeOH/H2O, 2:1:1 (3 mL). O vaso de micro-ondas foi purgado e enchido com argônio três vezes antes de tetracis(trifenilfosfino)paládio(0) (21,7 mg, 0,018 mmol) ser adicionado e a mistura de reação colocada no micro-ondas a 80 °C por 10 minutos. Subsequentemente, CH2Cl2 (100 mL) foi adicionado e os orgânicos foram lavados com água (2 x 50 mL) e salmoura (50 mL) antes de serem secos com MgSO4, filtrados e os voláteis removidos por evaporação rotativa sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (CHCl3/MeOH, 100 % a 9:1) para se obter 25 puro (200 mg, 43 % de rendimento). LC/MS 3,27 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1478 ([M + H]+., 100 %).(c) ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-metóxi-8-(3-(((S)-7-metóxi-2-(4-(4-metilpiperazin- 1-il)fenil)-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)propóxi)-5- oxo-5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan- 2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metila (26)
[0189]Uma solução de Super-Hidreto® (0,34 mL, 1M em THF) foi adicionada, às gotas, a uma solução de SEM-dilactama 25 (200 mg, 0,135 mmol) em THF (5 mL) a -78 °C sob uma atmosfera de argônio. A adição foi concluída ao longo de 5 minutos de modo a manter a temperatura interna da mistura de reação constante. Após 20 minutos, uma alíquota foi resfriada rapidamente com água para análise de LC/MS, que revelou que a reação foi concluída. Água (20 mL) foi adicionada à mistura de reação e o banho frio foi removido. A camada orgânica foi extraída com EtOAc (3 x 30 mL) e os orgânicos combinados foram lavados com salmoura (50 mL), secos com MgSO4, filtrados e o solvente removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida. O produto bruto foi dissolvido em MeOH (6 mL), CH2Cl2 (3 mL), água (1 mL) e gel de sílica suficiente para formar uma suspensão de agitação espessa. Após 5 dias, a suspensão foi filtrada através de um funil sinterizado e lavada com CH2Cl2/MeOH (9:1) (100 mL) até a eluição do produto ser concluída. A camada orgânica foi lavada com salmoura (2 x 50 mL), seca com MgSO4, filtrada e o solvente removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida. Purificação por cromatografia em coluna de gel de sílica (CHCl3 a 100 % a 96 % CHCl3/MeOH a 4 %) proporcionou o produto 26 como um sólido amarelo (100 mg, 63 %). LC/MS 2,67 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1186 ([M + H]+., 5 %).(d) (S)-2-amino-N-((S)-1-((4-((R)-7-metóxi-8-(3-(((R)-7-metóxi-2-(4-(4-metilpi- perazin-1-il)fenil)-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8- il)óxi)propóxi)-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)- amino)-1-oxopropan-2-il)-3-metilbutanamida (27)
[0190]Piperidina em excesso foi adicionada (0,1 mL, 1 mmol) a uma solução de PBD 26 (36,4 mg, 0,03 mmol) em DMF (0,9 mL). A mistura foi deixada agitar na temperatura ambiente por 20 min, no ponto em que a reação tinha ido para a conclu-são (como monitorada por LC/MS). A mistura de reação foi diluída com CH2Cl2 (50 mL) e a fase orgânica foi lavada com H2O (3 x 50 mL) até concluir a remoção de piperidina. A fase orgânica foi seca sobre MgSO4, filtrada e o excesso de solvente removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida para se obter o produto bruto 27 que foi usado como tal na próxima etapa. LC/MS 2,20 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 964 ([M + H]+., 5 %).(e) 6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-metóxi- 8-(3-(((S)-7-metóxi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H-pir- rolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)propóxi)-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2- il)hexanamida (28)
[0191]Cloridreto de EDCI (4,7 mg, 0,03 mmol) foi adicionado a uma suspen-são de ácido 6-maleimido-hexanóico (6,5 mg, 0,03 mmol) em CH2Cl2 seco (3 mL) sob atmosfera de argônio. A mistura foi agitada por 1 hora na temperatura ambiente antes de PBD 27 (34 mg, bruto) ser adicionado. A agitação foi mantida até a reação ser concluída (6 horas). A reação foi diluída com CH2Cl2 e a fase orgânica foi lavada com H2O e salmoura antes de ser seca sobre MgSO4, filtrada e o excesso de solvente removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida. O produto foi purificado por cromatografia de gel de sílica cuidadosa (eluição lenta iniciando com CHCl3 a 100 % até CHCl3/MeOH 9:1) seguido por cromatografia de fase reversa para remover malei- mida-PEG8-ácido não reagido. O produto 28 foi isolado em 41 % ao longo de duas etapas (14,6 mg). LC/MS 2,40 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1157 ([M + H]+., 5 %)
[0192]Exemplo 4 - síntese alternativa de composto 25
[0193]PBD-triflato 21 (469 mg, 0,323 mmol), éster borônico pinacólico (146,5 mg, 0,484 mmol) e Na2CO3 (157 mg, 1,48 mmol) foram dissolvidos em uma mistura de tolueno/MeOH/H2O, 2:1:1 (10 mL). O frasco de reação foi purgado com argônio três vezes antes de tetracis(trifenilfosfino)paládio(0) (7,41 mg, 0,0064 mmol) ser adi-cionado e a mistura de reação aquecida a 30 °C durante a noite. Os solventes foram removidos sob pressão reduzida e o resíduo foi retomado em H2O (50 mL) e extraído com EtOAc (3 x 50 mL). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura (100 mL), secos com MgSO4, filtrados e os voláteis removidos por evaporação rotativa sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (CHCl3 a 100 % para CHCl3/MeOH a 95 %:5 %) para se obter 25 puro em 33 % de rendimento (885 mg). LC/MS 3,27 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1478 ([M + H]+., 100 %).Exemplo 5 (a) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metóxi-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]ben- zodiazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepina-5,11(10H,11aH)-diona (29)
[0194]Ácido 3,4-(metilenodióxi)fenil borônico (356 mg, 2,1 mmol, 1,3 equiv.), TEA (1,8 mL, 12,9 mmol, 8 equiv.) e triflato/anilina 13 (1,75 g, 1,7 mmol, 1 equiv.) foram dissolvidos em uma mistura de etanol (7 mL), tolueno (13 mL) e água (2 mL) sob uma atmosfera de Ar. A mistura de reação foi despejada e fluxada com Ar 3 vezes, antes da adição de tetracis(trifenilfosfino)paládio(0) (114 mg, 0,1 mmol, 0,06 equiv.). O frasco foi novamente esvaziado e fluxado com Ar 3 vezes e aquecido em um microondas a 80 °C por 8 minutos com tempo de pré-agitação de 30 segundos. Análise por TLC (acetato de etila/hexano 80:20 v/v) indicou o consumo completo do material de partida. A mistura de reação foi diluída com diclorometano (50 mL) e lavada com água (50 mL). A camada orgânica foi seca com MgSO4, filtrada e o solvente removido a vácuo. Purificação por cromatografia em coluna de gel de sílica (hexano/acetato de etila 60:40 a 20:80 v/v) proporcionou o produto 29 como um sólido amarelo (1,21 g, 71 %). LC/MS (3,92 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1032,44 ([M + H]+., 100).(b) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metóxi-5-oxo- 5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-1H-pir- rolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5(11aH)-ona (30)
[0195]SEM dilactama 29 (0,25 g, 0,24 mmol, 1 equiv.) foi dissolvida em THF (8 mL) e esfriada a -78 °C sob uma atmosfera de Ar. Super-Hidreto® (0,6 mL, 1 M em THF, 2,5 equiv.) foi adicionado, às gotas, ao longo de 5 minutos enquanto monitorando a temperatura. Após 20 minutos, uma pequena amostra foi tomada e trabalhada por análise de LCMS. Água (50 mL) foi adicionada, o banho frio foi removido e a solução lavada com acetato de etila (50 mL). A camada orgânica foi extraída e lavada com salmoura (60 mL), seca com MgSO4, filtrada e o solvente removido a vácuo. O produto bruto foi dissolvido em EtOH (15 mL), CH2Cl2 (7,5 mL) e água (2,5 mL) e gel de sílica suficiente foi adicionado até ele se tornar uma suspensão espessa. Após 5 dias de agitação, foi filtrada através de um funil sinterizado e lavada com CH2Cl2/MeOH (9:1) (100 mL) até o produto cessado ser eluído. A camada orgânica foi lavada com salmoura (2 x 50 mL), seca com MgSO4, filtrada e o solvente removido a vácuo. Purificação por cromatografia em coluna de gel de sílica (CHCl3 com gradiente de MeOH 1 % a 4 %) proporcionou o produto 30 como um sólido amarelo (94 mg, 53 %). LC/MS (2,53 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 739,64 ([M]+., 70).(c) ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metóxi-5-oxo- 5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5-oxo- 5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2- il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de alila (31)
[0196]Sob uma atmosfera de Ar, Alanina-Valina-Alloc (180 mg, 0,66 mmol, 1,2 equiv.) foi agitado com EEDQ (163 mg, 0,66 mmol, 1,2 equiv.) em CH2Cl2 anidro(21 mL) e metanol (1 mL) por 1 hora. O PBD 30 (407 mg, 0,55 mmol, 1 equiv.) foi dissolvido em CH2Cl2 anidro (21 mL) e metanol (1 mL) e adicionado à reação. LC/MS após 5 dias de agitação na temperatura ambiente mostrou a maioria da formação do produto. O solvente foi removido a vácuo antes da purificação por cromatografia em coluna (CH2Cl2 com gradiente de MeOH 1 % a 6 %) para se obter o produto 31 como um sólido amarelo (184 mg, 34 %). LC/MS (2,95 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 994,95 ([M + H]+., 60).(d) (S)-2-Amino-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metóxi- 5-oxo-5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5- oxo-5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2- il)-3-metilbutanamida (32)
[0197]A imina 31 (100 mg, 0,1 mmol, 1 equiv.) foi dissolvida em DCM anidro (10 mL) (com o auxílio de uma gota de metanol para auxiliar a dissolução) sob uma atmosfera de Ar. Pirrolidina (30 μL, 0,15 mmol, 1,5 equiv.) foi adicionada, às gotas, antes do frasco ser esvaziado e fluxado com Ar três vezes. Pd(PPh3)4(7 mg, 6 μmol, 0,06 equiv.) foi adicionado e o frasco foi esvaziado e fluxado com Ar três vezes. A análise de LC/MS depois de 1 hora indicou a formação do produto e perda completa do material de partida. Et2O (60 mL) foi adicionado à mistura de reação e foi deixado agitar até todo o produto sair da solução. O precipitado foi filtrado através de um funil sinterizado e lavado duas vezes com Et2O (2 x 20 mL). O frasco de coleta foi substituído e o sólido isolado foi dissolvido e lavado através de um sinterizador com CHCl3 (100 mL). O solvente foi removido a vácuo para se obter o produto 32 bruto como um sólido amarelo que foi usado diretamente na próxima etapa. LC/MS (1,14 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 910,40 ([M + H]+., 67).(e) N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(Benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metóxi-5- oxo-5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5- oxo-5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan- 2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-1-(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propa- namido)-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxa-heptacosan-27-amida (33)
[0198]A imina 32 (92 mg, 0,1 mmol, 1,1 equiv.) foi dissolvida em CHCl3 (6 mL) com uma gota de MeOH anidro para auxiliar a dissolução. Maleimida-PEG8-ácido (53 mg, 0,09 mmol, 1 equiv.) foi adicionado seguido por EEDQ (33 mg, 0,14 mmol, 1,5 equiv.). Este foi deixado agitar vigorosamente na temperatura ambiente sob Ar por 4 dias até a análise de LC/MS mostrar a maioria da formação do produto. O solvente foi removido a vácuo e o produto bruto foi parcialmente purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (CHCl3 com gradiente de MeOH 1 % a 10 %) fornecendo 33 (81mg). O material foi purificado ainda por HPLC preparativa para se obter 33 como um sólido amarelo (26,3 mg, 18 %). Rodada Fast Formic: LC/MS (1,39 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1485,00 ([M + H]+., 64).Exemplo 6(a) ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metóxi-5,11- dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)metil)-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]ben- zodiazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etóxi)-metil)- 5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxo- propan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de 9H-fluoren-9-il)metila (34)
[0199]O triflato 21 (0,5 g, 0,35 mmol, 1 equiv.), ácido 3,4-(metilenodióxi)fenil borônico (75 mg, 0,45 mmol, 1,3 equiv.) e Na2CO3 (0,17 g, 1,6 mmol, 4,5 equiv.) foram dissolvidos em tolueno (11 mL), EtOH (5,5 mL) e água (5,5 mL) sob uma atmosfera de Ar. O frasco foi esvaziado e fluxada com Ar três vezes. Pd(PPh3)4 (24 mg, 0,02 mmol, 0,06 equiv.) foi adicionado e novamente o frasco foi esvaziado e fluxado com Ar três vezes. Este foi aquecido a 30 °C e deixado agitar durante a noite. Análise por LC/MS mostrou a perda completa do material de partida. O solvente foi removido a vácuo e o resíduo dissolvido em água (60 mL) antes de lavar com acetato de etila (60 mL x 3). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (50 mL), secas com MgSO4, filtradas e o solvente removido a vácuo. Purificação por cromatografia em coluna (hexano/acetato de etila 50:50 a 25:75 v/v) proporcionou o produto 34 como um sólido amarelo (310 mg, 64 %). LC/MS (1,44 min (ES-) m/z (intensidade relativa) 1423,35 ([M - H]-., 79).(b) ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metóxi-5-oxo- 5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5-oxo- 5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2- il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metila (35)
[0200]SEM dilactama 34 (0,31 g, 0,22 mmol, 1 equiv.) foi dissolvida em THF (10 mL) e esfriada a -78 °C sob uma atmosfera de Ar. Super-Hidreto® (0,5 mL, 1 M em THF, 2,5 equiv.) foi adicionado, às gotas, ao longo de 5 minutos enquanto monitorando a temperatura. Após 30 minutos, uma pequena amostra foi tomada e trabalhada para análise de LC/MS. Água (50 mL) foi adicionada, o banho frio foi removido e a solução lavada com acetato de etila (50 mL). A camada orgânica foi extraída e lavada com salmoura (60 mL), seca com MgSO4, filtrada e o solvente removido a vácuo. O produto bruto foi dissolvido em EtOH (13,2 mL), CH2Cl2 (6,6 mL) e água (2,2 mL) e gel de sílica suficiente foi adicionado até ele se tornar uma suspensão espessa. Após 5 dias de agitação, foi filtrada através de um funil sinterizado e lavada com CH2Cl2/MeOH (9:1) (100 mL) até o produto cessado ser eluído. A camada orgânica foi lavada com salmoura (2 x 50 mL), seca com MgSO4, filtrada e o solvente removido a vácuo. Purificação por cromatografia em coluna de gel de sílica (CHCl3 com gradiente de MeOH 1 % a 4 %) proporcionou o produto 35 puro como um sólido amarelo (185 mg, 75 %). LC/MS (1,70 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1132,85 ([M + H]+., 60).(c) (S)-2-Amino-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metóxi- 5-oxo-5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5- oxo-5,11a-di-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2- il)-3-metilbutanamida (32)
[0201]A imina 35 (82 mg, 0,07 mmol, 1 equiv.) foi dissolvida em DMF (1 mL) antes de piperidina (0,2 mL, 2 mmol, excesso) ser adicionada lentamente. Esta solução foi deixada agitar na temperatura ambiente por 20 minutos até a análise de LC/MS mostrar o consumo completo do material de partida. A mistura de reação foi diluída com CH2Cl2 (50 mL), lavada com água (50 mL x 4), seca com MgSO4, filtrada e o solvente removido a vácuo. O produto 33 foi usado sem purificação adicional na próxima etapa. LC/MS (1,15 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 910,60 ([M + H]+., 58).
Métodos Experimentais Gerais para o Exemplo 7
[0202]O progresso da reação foi monitorado por cromatografia de camada fina (TLC) usando gel de sílica Merck Kieselgel 60 F254, com indicador de fluorescência em placas de alumínio. Visualisação de TLC foi obtida com luz UV ou vapor de iodo a menos que de outro modo estabelecido. Cromatografia flash foi realizada usando gel de sílica Merck Kieselgel 60 F254. Os solventes de extração e cromatografia foram adquiridos e usados sem purificação adicional a partir de Fisher Scientific, U.K. Todos os produtos químicos foram adquiridos a partir de Aldrich, Lancaster ou BDH.
[0203]Os espectros de RMN de 1H e 13C foram obtidos em um espectrômetro Bruker Avance 400. Constantes de acoplamento são citadas em hertz (Hz). Os desvios químicos são registrados em partes por milhão (ppm) a partir de tetrametilsilano. Multiplicidades de rotação são descritas como s (singleto), bs (amplo singleto), d (dubleto), t (tripleto), q (quarteto), p (pentupleto) e m (multipleto). Os espectros de IR foram registrados em um espectrofotômetro Perkin-Elmer FT/IR paragon 1000 por aplicação da amostra em uma solução de clorofórmio usando o sistema “golden gate” ATR. Rotações ópticas foram medidas na temperatura ambiente usando um polarímetro ADP 220 Bellingham e Stanley. Espectrometria de massas foi realizada em um ThermoQuest Navigator de Thermo Elétron, espectros de Electrospray (ES) foram obtidos entre 20 a 30 V. Medições exatas de massa foram realizadas usando Micromass Q-TOF global tandem. Todas as amostras foram conduzidas sob o modo de ionização por Electrospray usando aceto- nitrila a 50 % em água e ácido fórmico a 0,1 % como um solvente. Amostras foram conduzidas em modo W que fornece uma resolução típico de 19000 em FWHH. O instrumento foi calibrado com [Glu]-Fibrinopeptídeo B imediatamente antes da medição.
LCMS
[0204]LC/MS (Shimazu LCMS-2020) usando uma fase móvel de água (A) (ácido fórmico 0,1 %) e acetonitrila (B) (ácido fórmico 0,1 %).
[0205]Gradiente: composição inicial 5 % de B mantida ao longo de 0,25 min, em seguida, aumento de 5 % de B a 100 % de B ao longo de um período de 2 min. A composição foi mantida por 0,50 min a 100 % de B, em seguida, voltou a 5 % de B em 0,05 minutos e permaneceu por 0,05 min. Tempo total de gradiente conduzido igual a 3 min. Taxa de fluxo 0,8 mL/min. Faixa de detecção de comprimento de onda: 190 a 800 nm. Temperatura do forno: 50 °C. Coluna: Waters Acquity UPLC BEH Shield RP18 1,7 μm 2,1 x 50 mm.HPLC preparativa
[0206]As condições para a HPLC preparativa foram como seguem: a HPLC (Shimadzu UFLC) foi conduzida usando uma fase móvel de água (ácido fórmico a 0,1 %) A e acetonitrila (ácido fórmico a 0,1 %) B.
[0207]Faixa de comprimento de onda detecção: 254 nm.
[0208]Coluna: Phenomenex Gemini 5μ C18 150 x 21 a 20 mm.
[0209]Gradiente: .
[0210]Tempo total de gradiente conduzido é de 20 min; taxa de fluxo 20,00 mL/min.Exemplo 7 (a) (S)-5-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)-1-(5-metóxi-2-nitro-4-((tri-isopropilsi-lil)óxi)benzoil)-4,5-di-hidro-1 H-pirrol-3-il trifluorometanossulfonato (37)
[0211]2,6-Lutidina anidra (16,06 mL, 0,137 mol) foi injetada em uma porção para uma solução vigorosamente agitada de cetona 36 (20 g, 0,034 mol) em CH2Cl2 seco (350 mL) a -45 °C (gelo seco/acetonitrila) sob uma atmosfera de argônio. Ani- drido tríflico anidro, tomado de um frasco recentemente aberto (17,37 mL, 0,1 mol), foi injetado rapidamente, enquanto mantendo a temperatura a -40 °C ou abaixo. A mis-tura de reação foi deixada agitar a -45 °C por 1 hora no ponto em que TLC (He- xano/EtOAc; 95/5) revelou o consumo completo do material de partida. A mistura de reação fria foi imediatamente diluída com CH2Cl2 (400 mL) e, com agitação vigorosa, lavada com água gelada (1 x 200 mL), solução gelada de ácido cítrico a 5 % (1 x 300 mL), NaHCO3 saturado (300 mL), salmoura (200 mL). Os orgânicos foram secos sobre MgSO4, filtrados e o solvente evaporado sob pressão reduzida. O material bruto foi purificado por cromatografia de gel de sílica (Hexano/EtOAc; 100 % a 90:10) para se obter enol-triflato 37 como uma espuma amarela (22,06 g, 89 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,72 (s, 1H), 7,26 (s, 1H), 6,75 (s, 1H), 60,6 (bm, 1H), 5,75 (d, J = 5,7Hz, 0,5H), 4,78 (m, 1H), 4,59 (d, J = 8,2 Hz, 0,5H), 3,92 (s, 3H), 3,18 (dd, J = 15,2, 3,2 Hz, 4H), 2,99 (dd, J = 15,7, 3,2 Hz, 4H), 1,36 - 1,22 (m, 3H), 1,11 (d, J = 7,3 Hz, 18H), 0,92 (s, 9H), 0,12 (s, 6H); ES+ = 2,39 min, m/z 1447,05 [2M + Na]+.(b) (11S)-8-(3-bromopropóxi)-11-((terc-butildimetilsilil)óxi)-2-ciclopropil-7-me- tóxi-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato de terc-butila (45)(i) (S)-(2-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)-4-ciclopropil-2,3-di-hidro-1H-pirrol-1- il)(5-metóxi-2-nitro-4-((tri-isopropilsilil)óxi)fenil)metanona (38)
[0212]Trifenilarsina (0,343 g, 1,12 mmol), óxido de prata (I) (1,3 g, 5,6 mmol), ácido ciclopropilborônico (0,6 g, 7,01 mmol) e triflato 37 (1 g, 1,4 mmol) foram dissol-vidos em dioxano (20 mL) sob uma atmosfera de argônio. Fosfato de potássio tribásico (3,6 g, 16,8 mmol) foi moído com um pilão e almofariz e adicionado rapidamente à mistura de reação. A mistura de reação foi despejada e fluxada com argônio três vezes e aquecida a 71 °C. Cloreto de bis(benzonitrila)paládio(II) (107 mg, 0,28 mmol) foi adicionado e o vaso de reação foi esvaziado e fluxado com argônio três vezes. Após 10 minutos, uma pequena amostra foi tomada para análise por TLC (Hexano/EtOAc; 80:20) revelando a reação completa. A mistura de reação foi filtrada através de celite e a almofada do filtro lavada com EtOAc (200 mL). O filtrado foi lavado com água (200 mL) e salmoura (200 mL). A camada orgânica foi seca com MgSO4, filtrada e o solvente removido a vácuo. Purificação por cromatografia de gel de sílica (He- xano/EtOAc; 100 % a 80:20) proporcionou o produto 38 como um sólido amarelo (0,663 g, 78 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,70 (s, 1H), 7,33 (s, 1H), 6,77 (s, 1H), 4,64 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,70 (s, 2H), 2,64 (dd, J = 16,2, 2,42 Hz, 1H), 2,42 (dd, J = 16,2, 2,4 Hz, 1H), 1,35 - 1,22 (m, 3H), 1,19 (m, 1H), 1,10 (d, J = 7,3 Hz, 18H), 0,91 (s, 9H), 0,61 (m, 2H), 0,40 (dd, J = 7,2, 3,4 Hz, 2H), 0,10 (d, J = 1,9 Hz, 6H).); ES+ = 2,39 min, m/z 605,30 [M + H]+.(ii) (S)-(2-amino-5-metóxi-4-((tri-isopropilsilil)óxi)fenil)(2-(((terc-butildimetilsi- lil)óxi)metil)-4-ciclopropil-2,3-di-hidro-1H-pirrol-1-il)metanona (39)
[0213]Em um frasco de fundo redondo de dois pescoços seco previamente fluxado com argônio e adaptado com um termômetro, nitrofenila 38 (3,03 g 5 mmol) foi solubilizada em uma solução de ácido fórmico a 5 % em metanol (25 mL). Zinco (1,64 g, 25 mmol) foi rapidamente vertido na solução. A temperatura instantaneamente elevou a 45 °C e novamente resfriada lentamente até a temperatura ambiente no ponto em que a reação é completa («15 min, reação monitorada por LCMS). A mistura de reação depois foi filtrada através de celite e a almofada ainda lavada com EtOAc (2 x 100 mL). Os orgânicos combinados foram subsequentemente lavados com NaHCO3(aq) saturado (100 mL), H2O (100 mL) e salmoura (100 mL), antes de serem secos sobre MgSO4, filtrados e os voláteis removidos a vácuo. O material bruto foi purificado cromatografia de gel de sílica (Hexano/EtOAc; 100 % a 80:20) e produto puro 39 foi isolado como um óleo incolor claro (1,35 g, 47 % de rendimento). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,26 (s, 2H), 6,71 (s, 1H), 4,61 (bs, 1H), 4,22 (s, 2H), 3,88 (s, 1H), 3,77 (s, 1H), 3,71 (s, 3H), 2,60 (dd, J = 16,5, 3,7 Hz, 1H), 2,43 (dd, J = 16,5, 3,7 Hz, 1H), 1,35 (m, 1H), 1,22 (m, 3H), 1,09 (d, J = 7,2 Hz, 18H), 0,89 (s, 9H), 0,68 - 0,58 (m, 2H), 0,48 - 0,36 (m, 2H), 0,05 (d, J = 5,8 Hz, 6H). ES+ = 2,40 min, m/z 575,30 [M + H]+.(iii) (S)-(2-(2-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)-4-ciclopropil-2,3-di-hidro-1H-pir- rol-1-carbonil)-4-metóxi-5-((tri-isopropilsilil)óxi)fenil)carbamato de terc-butila (40)
[0214]Amina 39 (770 mg, 1,34 mmol) e Boc2O (350 mg, 1,6 mmol) foram aquecidos juntos a 70 °C em um frasco de fundo redondo. Para ajudar com a solubilidade, CHCl3 (3 mL) foi adicionado e a mistura deixada agitar até a reação ser concluída (seguido por LCMS). A solução bruta espessa foi deixada esfriar até a temperatura ambiente antes de ser diretamente carregada em uma cromatografia em coluna de gel de sílica (Hexano/EtOAc; 100 % a 95:5). Produto 40 foi isolado como uma espuma incolor (741 mg, 82 % de rendimento). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,73 (s, 1H), 7,26 (s, 2H), 6,73 (s, 1H), 4,64 (s, 1H), 3,91 (s, 1H), 3,78 (s, 1H), 3,74 (s, 3H), 2,61 (dd, J = 16,2, 3,0 Hz, 1H), 2,45 (dd, J = 16,2, 3,0 Hz, 1H), 1,47 (s, 9H), 1,36 (m, 1H), 1,33 - 1,23 (m, 3H), 1,11 (d, J = 7,3 Hz, 18H), 0,89 (s, 9H), 0,64 (m, 2H), 0,43 (m, 2H), 0,05 (d, J = 7,2 Hz, 6H); ES+ = 2,56 min, m/z 675,30 [M + H]+.(iv) (S)-(2-(4-ciclopropil-2-(hidroximetil)-2,3-di-hidro-1H-pirrol-1-carbonil)-4- metóxi-5-((tri-isopropilsilil)óxi)fenil)carbamato de terc-butila (41)
[0215]Éter silílico 40 (741 mg, 1,1 mmol) foi solubilizado em uma mistura 7:2:1:1 de AcOH/H2O/MeOH/THF (11 mL) e a mistura foi agitada na temperatura am-biente até a reação ser concluída (~ 3 horas). Os voláteis foram removidos a vácuo e o resíduo foi retomado em EtOAc (50 mL). A fase orgânica foi lavada com NaHCO3(aq) saturado (50 mL), H2O (50 mL) e salmoura (50 mL), antes de ser seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada a vácuo. O material bruto foi purificado por cromatografia de gel de sílica (Hex/EtOAc; 100 % a 60:40) e produto 41 puro foi isolado como uma espuma incolor (521 mg, 84 % de rendimento). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,94 (s, 1H), 7,65 (s, 1H), 6,75 (s, 1H), 6,17 (s, 1H), 4,71 (s, 1H), 4,60 (s, 1H), 3,82 (t, J = 8,7 Hz, 1H), 3,76 (s, 3H), 3,72 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 2,76 (ddd, J = 16,4, 10,2, 1,6 Hz, 1H), 2,08 (dd, J = 16,3, 4,4 Hz, 1H), 1,48 (s, 9H), 1,42 - 1,33 (m, 1H), 1,33 - 1,23 (m, 3H), 1,11 (d, J = 7,3 Hz, 18H), 0,67 (dd, J = 5,0, 3,1 Hz, 2H), 0,46 - 0,39 (m, 2H); ES+ = 2,25 min, m/z 561,45 [M + H]+.(v) (11S)-2-ciclopropil-11-hidróxi-7-metóxi-5-oxo-8-((tri-isopropilsilil)óxi)- 11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato de terc- butila (42)
[0216]DMSO (163 μL, 2,29 mmol) foi adicionado a uma solução esfriada de cloreto de oxalila (93 μL, 1,1 mmol) em CH2Cl2 (2 mL) a -78 °C. Depois de 15 minutos, uma solução de álcool 41 (515 mg, 0,91 mmol) em CH2Cl2 (5 mL) foi adicionada, às gotas, à mistura oxidante. A reação foi deixada agitar a -78 °C por 1 hora antes de NEt3 (640 μL, 4,59 mmol) ser adicionado e a mistura deixada aquecer até a tempera-tura ambiente. Após a conclusão, a mistura de reação foi diluída com CH2Cl2 (40 mL) e a solução foi lavada com HCl(aq.) 0,1M (50 mL), H2O (50 mL), NaHCO3(aq.) saturado (50 mL) e salmoura (50 mL). Os orgânicos foram secos com MgSO4, filtrados e os voláteis removidos a vácuo. O material bruto foi purificado por cromatografia de gel de sílica (Hexano/EtOAc; 100 % a 60:40) para fornecer 42 puro como uma espuma branca (350 mg, 68 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,17 (s, 1H), 6,74 (s, 1H), 6,67 (s, 1H), 5,65 (dd, J = 8,6, 2,3 Hz, 1H), 3,85 (s, 3H), 3,77 (dt, J = 13,2, 6,7 Hz, 1H), 3,38 (s, 1H), 2,88 (dd, J = 17,7, 9,2 Hz, 1H), 2,52 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 1,46 (m, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,31 - 1,19 (m, 3H), 1,10 (dd, J = 7,4, 2,1 Hz, 18H), 0,77 - 0,70 (m, 2H), 0,56 - 0,48 (m, 2H); ES+ = 1,89 min, m/z 559,45 [M + H]+.(vi) (11S)-11-((terc-butildimetilsilil)óxi)-2-ciclopropil-7-metóxi-5-oxo-8-((tri-iso- propilsilil)óxi)-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxi- lato de terc-butila (43)
[0217]Álcool 42 (350 mg, 0,62 mmol) foi solubilizada em CH2Cl2 seco (5 mL) em um frasco de fundo redondo vedado previamente fluxado três vezes com argônio. a solução foi esfriada a 0 °C antes de lutidina (0,3 mL, 2,5 mmol) e TBS-OTf (0,43 mL, 1,8 mmol) ser subsequentemente adicionada. A mistura de reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada até concluir (monitorada por LCMS). Após a conclusão, a solução foi diluída com CH2Cl2 (50 mL), lavada com NH4Cl(aq.) saturado (50 mL), H2O (50 mL), NaHCO3(aq.) saturado (50 mL) e salmoura (50 mL). Os orgânicos foram seco com MgSO4, filtrados e os voláteis removidos a vácuo. O material bruto foi purificado por cromatografia de gel de sílica (Hexano/EtOAc; 100 % a 80:20) para fornecer 43 puro como um óleo incolor (397,3 mg, 94 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,16 (s, 1H), 6,69 (s, 1H), 6,63 (s, 1H), 5,78 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,65 (td, J = 10,1, 3,7 Hz, 1H), 2,82 (ddd, J = 16,8, 10,3, 2,6 Hz, 1H), 2,30 (dd, J = 16,8, 2,6 Hz, 1H), 1,45 - 1,37 (m, 1H), 1,32 (s, 9H), 1,25 (dd, J = 14,1, 8,0 Hz, 3H), 1,09 (dd, J = 7,4, 4,1 Hz, 18H), 0,85 (s, 9H), 0,74 - 0,67 (m, 2H), 0,55 - 0,49 (m, 1H), 0,47 - 0,40 (m, 1H), 0,25 (s, 3H), 0,20 (s, 3H); ES+ = 2,39 min, m/z 695,55 [M + Na]+.(vii) (11S)-11-((terc-butildimetilsilil)óxi)-2-ciclopropil-8-hidróxi-7-metóxi-5-oxo- 11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato de terc- butila (44)
[0218]Monômero 43 (518,8 mg, 0,77 mmol) foi solubilizado em DMF úmida (5 mL + 0,1 mL de H2O) antes de LiOAc (78,5 mg, 0,77 mmol) ser adicionado e a mistura deixada agitar na temperatura ambiente até concluir (seguido por LCMS). A mistura foi subsequentemente diluída com EtOAc (50 mL), resfriada rapidamente com ácido cítrico(aq.) (pH = 3, 40 mL), em seguida, lavada com H2O (50 mL) e salmoura (50 mL). A camada orgânica foi seca sobre MgSO4, filtrada e os voláteis removidos a vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia de gel de sílica (Hexano/EtOAc; 100 % a 60:40) e produto 44 puro foi isolado como um sólido branco (351 mg, 88 % de ren-dimento). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,20 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 6,68 (s, 1H’), 5,79 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,70 (td, J = 10,1, 3,7 Hz, 1H), 2,82 (ddd, J = 16,9, 10,3, 2,0 Hz, 1H), 2,31 (dd, J = 16,9, 2,0 Hz, 1H), 1,44 - 1,37 (m, 1H), 1,32 (s, 9H), 0,86 (s, 9H), 0,75 - 0,68 (m, 1H), 0,57 - 0,49 (m, 1H), 0,46 (m, 1H), 0,23 (d, J = 6,9 Hz, 6H); ES+ = 1,82 min, m/z 517,35 [M + Na]+.(viii) (11S)-8-(3-bromopropóxi)-11-((terc-butildimetilsilil)óxi)-2-ciclopropil-7- metóxi-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxi- lato de terc-butila (45)
[0219]Em um frasco de fundo redondo seco previamente fluxado três vezes com argônio, álcool 44 (300 mg, 0,58 mmol) foi solubilizado em DMF seca (5 mL). K2CO3 (123 mg, 0,58 mmol) e 1,3-dibromopropano (0,3 mL, 2,9 mmol) foram subse-quentemente adicionados. A mistura de reação foi aquecida a 70 °C e deixada agitar até concluir (~1 hora, seguido por LCMS). A reação foi diluída com EtOAc (50 mL), lavada com H2O (75 mL) e salmoura (50 mL) antes de ser seca sobre MgSO4, filtrada e os voláteis removidos a vácuo. O material bruto foi purificado por cromatografia de gel de sílica (Hexano/EtOAc; 100 % a 70:30) e produto 45 puro foi isolado como uma espuma incolor (311 mg, 84 % de rendimento). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,21 (s, 1H), 6,69 (s, 1H), 6,63 (s, 1H), 5,82 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,14 (t, J = 5,9 Hz, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,69 (ddd, J = 10,2, 9,0, 3,7 Hz, 1H), 3,63 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,84 (ddd, J = 16,7, 10,4, 1,9 Hz, 1H), 2,38 (p, J = 6,1 Hz, 2H), 2,31 (dd, J = 16,5, 2,1 Hz, 1H), 1,45 - 1,37 (m, 1H), 1,33 (s, 9H), 0,87 (s, 9H), 0,77 - 0,69 (m, 2H), 0,57 - 0,49 (m, 1H), 0,49 - 0,42 (m, 1H), 0,24 (d, J = 5,4 Hz, 6H); ES+ = 2,16 min, m/z 638,95 [M + Na]+.(c) (11S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonil)amino)-3-metil- butanamido)propanamido)fenil)-11-(( terc- butildimetilsilil)óxi)-8-hidróxi-7-metóxi-5- oxo-11,11 a-di-hidro-1 H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5 H )-carboxilato de terc- butila (53)(i) (S)-(4-(4-aminofenil)-2-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)-2,3-di-hidro-1H-pir- rol-1-il)(5-metóxi-2-nitro-4-((tri-isopropilsilil)óxi)fenil)metanona (46)
[0220]Pd(PPh3)4 (609 mg, 0,52 mmol) foi adicionado a uma mistura agitada de triflato 37 (18,8 g, 26,3 mmol), éster pinacólico de ácido 4-aminofenilborônico (8,64 g, 39,4 mmol), Na2CO3 (12,78 g, 120 mmol), MeOH (80 mL), tolueno (160 mL) e água (80 mL). A mistura de reação foi deixada agitar a 30 °C sob uma atmosfera de nitrogênio por 24 horas após o tempo em que todo o éster borônico foi consumido. A mistura de reação depois foi evaporada à secura antes do resíduo ser retomado em EtOAc (100 mL) e lavada com H2O (100 mL), salmoura (100 mL), seca (MgSO4), filtrada e evaporada sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto. Purificação por cromatografia de gel de sílica (Hexano/EtOAc; 100 % a 70:30) proporcionou o produto 46 como uma espuma amarelada (11,06 g, 64 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,74 (s, 1H), 7,00 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 6,81 (s, 1H), 6,58 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 6,06 (s, 1H), 4,77 (bm, 1H), 3,91 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 3,68 (bs, 2H), 3,13 (bm, 1H), 2,97 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 1,36 - 1,21 (m, 3H), 1,12 (d, J = 7,3 Hz, 18H), 0,89 (s, 10H), 0,10 (s, 6H).); ES+ = 2,27 min, m/z 698 [M + CH3CN]+.(ii) ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-5-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)-1-(5-metóxi-2-ni- tro-4-((tri-isopropilsilil)óxi)benzoil)-4,5-di-hidro-1H-pirrol-3-il)fenil)amino)-1-oxopro- pan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metila (47)
[0221]A um frasco de fundo redondo seco previamente fluxado com argônio foi adicionada anilina 46 (10,05 g, 15,3 mmol), o dipeptídeo (6,3 g, 15,3 mmol) e CH2Cl2 seco (500 mL). O frasco depois foi purgado três vezes com argônio antes de EEDQ (3,79 g, 15,3 mmol) ser adicionado e a mistura deixada agitar na temperatura ambiente. A reação foi seguida por LCMS e depois de 3,5 horas a reação foi concluída. A reação foi resfriada rapidamente com H2O (200 mL) e extraída duas vezes com CH2Cl2 (250 mL). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura (150 mL), secos sobre MgSO4, filtrados e o solvente removido a vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia de gel de sílica (Hexano/EtOAc; 100 % a 55:45) para se obter o produto 47 puro (13,821 g, 86 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,26 (s, 1H), 7,64 (s + d, J = 4,9 Hz, 3H), 7,43 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,36 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,28 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,19 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,71 (s, 1H), 6,27 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 6,08 (s, 1H), 5,11 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 4,69 (bs, 1H), 4,52 (bm, 1H), 4,36 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 4,08 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 3,89 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,11 - 2,97 (bm, 1H), 2,88 (bd, J = 15,2 Hz, 1H), 2,03 (bs, 1H), 1,33 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 1,24 - 1,11 (m, 3H), 1,01 (d, J = 7,4 Hz, 18H), 0,86 - 0,79 (m, 6H), 0,77 (s, 9H), 0,00 (s, 6H); ES+ = 2,37 min, nenhuma massa.(iii) ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-1-(2-amino-5-metóxi-4-((tri-isopropilsilil)óxi)benzoil)- 5-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)-4,5-di-hidro-1H-pirrol-3-il)fenil)amino)-1-oxopropan- 2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metila (48)
[0222]Em um frasco de fundo redondo de dois pescoços seco previamente fluxado com argônio e adaptado com um termômetro, nitrofenila 47 (2,97g, 2,8 mmol) foi solubilizada em uma solução de ácido fórmico a 5 % em metanol (50 mL). Zinco (1,85 g, 28 mmol) foi rapidamente vertido na solução. A temperatura instantaneamente eleveou a 40 °C e novamente resfriada lentamente até a temperatura ambiente no ponto em que a reação é conluída («15 minutos, reação monitorada por LCMS). A mistura de reação depois foi filtrada através de celite e a almofada ainda lavada com EtOAc (2 x 150 mL). Os orgânicos combinados foram subsequentemente lavados com NaHCO3(aq) saturado (100 mL), H2O (100 mL) e salmoura (100 mL), antes de serem secos sobre MgSO4, filtrados e os voláteis removidos a vácuo. O material bruto foi purificado cromatografia de gel de sílica (Hexano/EtOAC 75:25 a 50:50) e produto 48 puro foi isolado como um óleo amarelo claro (2,291 g, 79 % de rendimento). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,37 (s, 1H), 7,74 (s+d, J = 4,9 Hz, 3H), 7,53 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,46 (d, J = 11,3 Hz, 2H), 7,39 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 7,28 (t, J = 11,3 Hz, 2H), 7,09 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 6,38 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 6,18 (s, 1H), 5,21 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 4,81 (bs, 1H), 4,72 - 4,57 (m, 1H), 4,47 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 4,19 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 4,00 - 3,94 (m, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,23 - 3,07 (m, 1H), 2,98 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 2,15 (s, 1H), 1,43 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 1,36 - 1,18 (m, 3H), 1,12 (d, J = 7,4 Hz, 18H), 0,97 - 0,89 (m, 6H), 0,88 (s, 9H), 0,10 (s, 6H). ES+ = 2,37 min, m/z nenhuma massa.(iv) ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-1-(2-((terc-butoxicarbonil)amino)-5-metóxi-4-((tri- isopropilsilil)óxi)benzoil)-5-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)-4,5-di-hidro-1H-pirrol-3- il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-flu- oren-9-il)metila (49)
[0223]Amina 48 (14,913 g, 14,6 mmol) e Boc2O (3,83 g, 17,5 mmol) foram aquecidos juntos a 70 °C em um frasco de fundo redondo. Para ajudar com a solubi-lidade, CHCl3 (25 mL) foi adicionado e a mistura deixada agitar até a reação ser con-cluída (seguido por LCMS). A solução bruta espessa foi deixada esfriar até a tempe-ratura ambiente antes de ser diretamente carregada em uma cromatografia em coluna de gel de sílica (Hexano/EtOAc; 100 % a 65:35). Produto 49 foi isolado como uma espuma creme (13,2 g, 80 % de rendimento). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,40 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,74 (d, J = 7,8 Hz, 3H), 7,54 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 7,48 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,38 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,31 - 7,25 (m, 3H), 7,14 (d, J = 6,7 Hz, 2H), 6,84 (bs, 1H), 6,80 (s, 1H), 6,50 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 5,28 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,77 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 4,70 - 4,58 (m, 1H), 4,47 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 4,19 (t, J = 6,1 Hz, 1H), 4,00 (m, 2H), 3,88 (bs, 1H), 3,73 (s, 3H), 3,05 (m, 1H), 2,98 (dd, J = 15,4, 3,3 Hz, 1H), 2,15 (bm, 1H), 1,46 (s, 9H), 1,43 (d, J = 11,7 Hz, 3H), 1,36 - 1,22 (m, 3H), 1,12 (d, J = 7,4 Hz, 18H), 1,00 - 0,89 (m, 6H), 0,84 (s, 9H), 0,05 (d, J = 6,0 Hz, 6H)); ES+ = 2,53 min, nenhuma massa.(v) ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-1-(2-((terc-butoxicarbonil)amino)-5-metóxi-4-((tri-iso- propilsilil)óxi)benzoil)-5-(hidroximetil)-4,5-di-hidro-1H-pirrol-3-il)fenil)amino)-1-oxopro- pan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metila (50)
[0224]Éter silílico 49 (13,2 g, 11,8 mmol) foi solubilizado em uma mistura 7:2:1:1 de AcOH/H2O/MeOH/THF (220 mL) e a mistura foi agitada na temperatura ambiente até a reação ser concluída (deixada durante a noite). Os voláteis foram re-movidos a vácuo e o resíduo foi retomado em EtOAc (400 mL). A fase orgânica foi lavada com NaHCO3(aq) saturado (200 mL), H2O (200 mL) e salmoura (10 mL) antes de ser seca sovre MgSO4, filtrada e concentrada a vácuo. O material bruto foi purifi-cado por cromatografia de gel de sílica (Hex/EtOAc; 50:50 a 0:100) e produto 50 puro foi isolado como (11,168 g, 94 % de rendimento). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,45 (s, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,74 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,64 (s, 1H), 7,52 (dd, J = 17,9, 8,9 Hz, 4H), 7,39 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,33 - 7,26 (m, 3H), 7,13 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 6,81 (s, 1H), 6,45 (s, 1H), 5,26 (s, 1H), 4,84 (s, 1H), 4,69 - 4,58 (m, 1H), 4,47 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 4,43 (s, 1H), 4,17 (d, J = 14,2 Hz, 1H), 3,99 (s, 1H), 3,89 (s, 2H), 3,74 (s, 3H), 3,30 - 3,17 (m, 1H), 2,64 (d, J = 16,9 Hz, 1H), 2,23 - 2,09 (m, 1H), 1,44 (s, 9H), 1,44 (d, J = 10,9 Hz, 2H), 1,29 (ddd, J = 14,3, 13,0, 7,4 Hz, 3H), 1,12 (d, J = 7,4 Hz, 18H), 0,92 (m, 6H); ES+ = 2,23 min, nenhuma massa.(vi) (11S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonil)amino)-3-metil- butanamido)propanamido)fenil)-11-hidróxi-7-metóxi-5-oxo-8-((tri-isopropilsilil)óxi)- 11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato de terc- butila (51)
[0225]DMSO (1,55 L, 21,9 mmol) foi adicionado a uma solução esfriada de cloreto de oxalila (0,89 mL, 10,5 mmol) em CH2Cl2 (50 mL) a -78 °C. Depois de 15 minutos, uma solução de álcool 50 (8,8 mg, 8,76 mmol) em CH2Cl2 (100 mL) foi adici-onada, às gotas, à mistura oxidante. A reação foi deixada agitar a -78 °C por 1 hora antes de NEt3 (6,11 mL, 43,8 mmol) ser adicionado e a mistura deixada aquecer até a temperatura ambiente. Após a conclusão, a mistura de reação foi diluída com CH2Cl2 (100 mL) e a solução foi lavada com HCl(aq.) 0,1M (250 mL), H2O (250 mL), NaHCO3(aq.) saturado (250 mL) e salmoura (200 mL). Os orgânicos foram secos com MgSO4, filtrados e os voláteis removidos a vácuo. O material bruto foi purificado por cromatografia de gel de sílica (CH2Cl2/EtOAc; 100 % a 50:50) para fornecer 51 puro como um óleo amarelo (8,8 mg, 100 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,71 (s, 1H), 7,74 (t, J = 8,4 Hz, 3H), 7,52 (d, J = 7,4 Hz, 5H), 7,43 - 7,33 (m, 4H), 7,23 - 7,17 (m, 2H), 6,69 (s, 1H), 6,42 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 5,78 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 5,62 (s, 1H), 5,23 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 4,84 - 4,69 (m, 1H), 4,65 (d, J = 22,5 Hz, 1H), 4,45 - 4,29 (m, 2H), 3,91 (dd, J = 11,3, 8,1 Hz, 1H), 3,86 (s, 3H), 3,28 (q, J = 11,9 Hz, 1H), 2,98 (t, J = 12,6 Hz, 1H), 2,14 (dd, J = 12,9, 10,0 Hz, 1H), 1,52 - 1,42 (m, 3H), 1,38 (s, 9H), 1,26 (m, 3H), 1,16 - 1,05 (m, 18H), 0,93 (d, J = 6,0 Hz, 6H); ES+ = 2,19 min, nenhuma massa.(vii) (11S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonil)amino)-3- metilbutanamido)propanamido)fenil)-11-((terc-butildimetilsilil)óxi)-7-metóxi-5-oxo-8- ((tri-isopropilsilil)óxi)-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)- carboxilato de terc-butila (52)
[0226]Álcool 51 (8,8 g, 8,78 mmol) foi solubilizado em CH2Cl2 seco (150 mL) em um frasco de fundo redondo vedado previamente fluxado três vezes com argônio. A solução foi esfriada a 0 °C antes de lutidina (4 mL, 35,1 mmol) e TBS-OTf (6 mL, 26,3 mmol) ser subsequentemente adicionados. A mistura de reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada até concluir (monitorada por LCMS). Após a conclusão, a solução foi diluída com CH2Cl2 (100 mL), lavada com NH4Cl(aq.) saturado (150 mL), H2O (100 mL), NaHCO3(aq.) saturado (100 mL) e salmoura (100 mL). Os orgânicos foram secos com MgSO4, filtrados e os voláteis removidos a vácuo. O material bruto foi purificado por cromatografia de gel de sílica (Hexano/EtOAc : 100 % a 80:20) para fornecer 52 puro como um óleo incolor (6,18 mg, 70 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,40 (s, 1H), 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,55 (dd, J = 13,0, 6,7 Hz, 4H), 7,40 (t, J = 7,3 Hz, 4H), 7,33 - 7,27 (m, 3H), 7,21 (s, 1H), 6,67 (s, 1H), 6,49 (s, 1H), 5,87 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 5,30 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,71 - 4,59 (m, 1H), 4,48 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 4,20 (t, J = 6,7 Hz, 1H), 4,04 - 3,96 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 3,84 - 3,77 (m, 1H), 3,25 (m, 1H), 2,79 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 2,26 - 2,11 (m, 1H), 1,46 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 1,33 (s, 9H), 1,27 (dd, J = 17,1, 9,7 Hz, 3H), 1,11 (dd, J = 7,4, 4,0 Hz, 18H), 0,93 (s, 6H), 0,89 (s, 9H), 0,27 (s, 3H), 0,22 (s, 3H); ES+ = 2,55 min, m/z 116,30 [M + H]+.(viii) (11S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonil)amino)-3-me- tilbutanamido)propanamido)fenil)-11-((terc-butildimetilsilil)óxi)-8-hidróxi-7-metóxi-5- oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato de terc-butila (53)
[0227]Monômero 52 (1 g, 0,89 mmol) foi solubilizado em DMF úmida (5 mL +0,5 mL H2O) antes de LiOAc (91 mg, 0,89 mmol) ser adicionado e a mistura deixada agitar na temperatura ambiente até concluir («3h, seguido por LCMS). A mistura foi subsequentemente diluída com EtOAc (50 mL), resfriada rapidamente com ácido cí- trico(aq.) (pH = 3, 40 mL), em seguida, lavada com H2O (50 mL) e salmoura (50 mL). A camada orgânica foi seca sobre MgSO4, filtrada e os voláteis removidos a vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia de gel de sílica (Hexano/EtOAc/MeOH; 60:40:0 a 60:30:10) e produto 53 puro foi isolado como um creme sólido (675 mg, 78 % de rendimento). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,36 (s, 1H), 7,76 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,55 (dd, J = 16,0, 7,5 Hz, 4H), 7,40 (t, J = 7,4 Hz, 4H), 7,30 (ddd, J = 14,7, 7,4, 1,1 Hz, 3H), 7,24 (s, 1H), 6,72 (s, 1H), 6,38 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 5,87 (s, 1H), 5,23 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 4,69 - 4,57 (m, 1H), 4,49 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 4,20 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 4,04 - 3,96 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,87 (dd, J = 10,1, 3,5 Hz, 1H), 3,29 (dd, J = 18,0, 8,5 Hz, 1H), 2,80 (d, J = 19,4 Hz, 1H), 2,24 - 2,08 (m, 1H), 1,46 (d, J = 10,5 Hz, 3H), 1,33 (s, 9H), 1,00 - 0,91 (m, 6H), 0,90 (s, 9H), 0,25 (d, J = 8,6 Hz, 6H).; ES+ = 2,08 min, m/z 960,35 [M + H]+.(d) N-((2S)-1-(((2S)-1 -((4-(8-(3-((2-ciclopropil-7-metóxi-5-oxo-5,11 a-di-hidro- 1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5-oxo-5,11 a-di-hidro- 1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3- metil-1-oxobutan-2-il)-1-(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1 H-pirrol-1-il)propanamido)- 3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxa-heptacosan-27-amida (18)(i) (11S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)propanamido)fenil)-8-(3- (((11S)-10-(terc-butoxicarbonil)-11-((terc-butildimetilsilil)óxi)-2-ciclopropil-7-metóxi-5- oxo-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)- 11-((terc-butildimetilsilil)óxi)-7-metóxi-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilatode terc-butila (54)
[0228]Em um frasco de fundo redondo seco previamente fluxado três vezes com argônio, monômero 45 (310 mg, 0,48 mmol), monômero 53 (513 mg, 0,53 mmol), K2CO3 (103 mg, 0,48 mmol) e TBAI (18 mg, 0,048 mmol) foram solubilizados em DMF seca (5 mL) e a mistura foi aquecida a 60 °C. A reação foi deixada agitar até concluir (seguido por LCMS), antes de ser diluída com EtOAc (50 mL), lavada com H2O (75 mL) e salmoura (50 mL). Os orgânicos foram secos sobre MgSO4, filtrados e os volá-teis removidos a vácuo. O material bruto foi purificado por cromatografia de gel de sílica (CHCl3/MeOH; 100 % a 98:2) e produto 54 puro foi isolado como um sólido branco (280,3 mg, 46 % de rendimento). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,93 (s, 1H), 7,85 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,40 (s, 1H), 7,28 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,19 (s, 2H), 6,69 (s, 1H), 6,63 (s, 1H), 6,61 (s, 1H), 5,90 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 5,81 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,60 (p, J = 7,1 Hz, 1H), 4,20 (dd, J = 15,9, 11,1 Hz, 4H), 3,88 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,84 (dd, J = 6,3, 4,5 Hz, 1H), 3,68 (td, J = 10,2, 3,7 Hz, 1H), 3,38 - 3,22 (m, 2H), 2,89 - 2,73 (m, 2H), 2,48 - 2,26 (m, 4H), 1,47 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,42 (m, 1H), 1,30 (s, 18H), 1,02 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 0,89 (s, 9H), 0,86 (s, 10H), 0,84 (s, 6H), 0,72 (dd, J = 8,1, 3,3 Hz, 2H), 0,57 - 0,50 (m, 1H), 0,45 (m, 1H), 0,28 - 0,20 (m, 12H); ES+ = 2,16 min, m/z 1297,55 [M + Na]+.(ii) (11S)-8-(3-(((11S)-10-(terc-butoxicarbonil)-11-((terc-butildimetilsilil)óxi)-2- (4-((2S,5S)-37-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-5-isopropil-2-metil-4,7,35-trioxo- 10,13,16,19,22,25,28,31-octaoxa-3,6,34-triaza-heptatriacontanamido)fenil)-7-metóxi- 5-oxo-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)- 11-((terc-butildimetilsilil)óxi)-2-ciclopropil-7-metóxi-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato de terc-butila (55)
[0229]Em um frasco de fundo redondo seco previamente fluxado três vezes com argônio, dímero 54 (270 mg, 0,021 mmol) foi solubilizado em CH2Cl2 seco (6 mL). Cloridreto de EDCI (40 mg, 0,021 mmol) e maleimida-PEG8-OH (123 mg, 0,021 mmol) foram subsequentemente adicionados à solução que foi deixada agitar na temperatura ambiente até concluir (~1 hora, seguido por LCMS). Após a conclusão, a reação foi diluída com CH2Cl2 (50 mL) e a fase orgânica foi lavada com H2O (50 mL) e salmoura (50 mL) antes de ser seca sobre MgSO4, filtrada e os voláteis removidos por evapo-ração rotativa sob pressão reduzida. O material bruto foi purificado por cromatografia de gel de sílica (CHCl3/MeOH 100 % a 97:3) e produto 55 puro foi isolado como uma espuma amarela clara (318,8 mg, 82 % de rendimento). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 8,64 (s, 1H), 7,69 (d, J = 15,0 Hz, 2H), 7,39 (s, 1H), 7,28 (d, J = 15,0 Hz, 2H), 7,26, (s, 1H), 7,22 (s, 1H), 7,20 (s, 1H),7,03 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,69 (s, 2H), 6,65 (s, 1H), 6,63 (s, 1H), 6,37 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 5,89 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 5,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,67 (p, J = 7,2 Hz, 1H), 4,27 - 4,12 (m, 5H), 3,88 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,84 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 3,73 - 3,56 (m, 46H), 3,53 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,41 (dd, J = 10,3, 5,2 Hz, 1H), 3,35 - 3,22 (m, 1H), 2,90 - 2,74 (m, 1H), 2,67 (ddd, J = 13,6, 9,2, 4,1 Hz, 1H), 2,52 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 2,48 - 2,45 (m, 1H), 2,45 - 2,37 (m, 1H), 2,37 - 2,22 (m, 1H), 2,02 (t, J = 9,0 Hz, 1H), 1,45 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 1,42 - 1,37 (m, 1H), 1,30 (s, 9H), 0,99 (s, 6H), 0,89 (s, 9H), 0,86 (s, 9H), 0,78 - 0,67 (m, 2H), 0,58 - 0,49 (m, 1H), 0,48 - 0,42 (m, 1H), 0,28 - 0,20 (m, 12H); ES+ = 2,15 min, m/z 1891,60 [M + Na]+.(iii) N-((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciclopropil-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di-hidro- 1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)propóxi)-7-metóxi-5-oxo-5,11a-di-hidro- 1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3- metil-1-oxobutan-2-il)-1-(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)- 3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxa-heptacosan-27-amida (18)
[0230]Dímero 55 (318 mg, 0,017 mmol) foi solubilizado em H2O seca (160 μL) e a pasta fluida foi esfriada a 0 °C antes de TFA (4 mL) ser adicionado e a mistura deixada agitar até concluir («20 minutos, seguido por LCMS). Após a conclusão, a reação foi diluída com CH2Cl2 (50 mL) e a fase orgânica foi lavada com NaHCO3 ge-lado (2 x 50 mL), H2O (50 mL) e salmoura (50 mL) antes de serem secos sobre MgSO4, filtrada e os voláteis removidos a vácuo. O material bruto foi diretamente purificado por HPLC preparativa de fase reversa (H2O/CH3CN, veja condições abaixo) e produto 18 puro foi isolado como um sólido amarelo (61 mg, 26 % de rendimento). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,76 (s, 1H), 7,88 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,51 - 7,48 (m, 2H), 7,43 (s, 1H), 7,33 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,20 (s, 1H), 7,15 (s, 1H), 6,86 (s, 1H), 6,84 (s, 1H), 6,74 (s, 1H), 6,68 (s, 2H), 6,62 (s, 1H), 4,69 (p, J = 7,1 Hz, 1H), 4,41 - 4,24 (m, 5H), 4,24 - 4,16 (m, 2H), 3,93 (s, 3H), 3,92 (s, 3H), 3,83 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 3,67 - 3,56 (m, 33H), 3,55 - 3,49 (m, 1H), 3,39 (dt, J = 14,0, 7,0 Hz, 1H), 3,10 (dd, J = 15,0, 11,6 Hz, 1H), 2,89 (dd, J = 16,9, 3,6 Hz, 1H), 2,75 - 2,64 (m, 1H), 2,51 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,48 - 2,44 (m, 1H), 2,44 - 2,38 (m, 1H), 2,28 (dt, J = 13,3, 6,8 Hz, 1H), 1,47 (s, 1H), 1,46 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 1,02 (dd, J = 10,7, 6,9 Hz, 6H), 0,82 - 0,72 (m, 2H), 0,55 (q, J = 5,2 Hz, 2H). ES+ = 1,39 min, m/z 1404,45 [M + H]+ Exemplo 8: Atividade de compostos liberados Ensaio de K562
[0231]Células K562 de leucemia mielóide crônica humana foram mantidas em meio RPM1 1640 suplementado com soro fetal de vitelo a 10 % e glutamina 2 mM a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5 % CO2 e foram incubadas com uma dose specífica de fármaco por 1 hora ou 96 horas a 37 °C no escuro. A incubação foi terminada por centrifugação (5 min, 300 g) e as células foram lavadas uma vez com meio livre de fármaco. Após o tratamento de fármaco apropriado, as células foram transferidas a placas microtituladoras de 96 poços (104 células por poço, 8 poços por amostra). As placas foram então mantidas no escuro a 37 °C em uma atmosfera umi- dificada contendo CO2 a 5 %. O ensaio é fundamentado na capacidade de células viáveis reduzir um sal de tetrazólio solúvel amarelo, brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT, Aldrich-Sigma), a um precipitado de formazana púrpura insolúvel. Após a incubação das placas por 4 dias (para permitir as células controle aumentar em número por aproximadamente 10 vezes), 20 μL de solução de MTT (5 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato) foram adicionados a cada poço e as placas ainda incubadas por 5 h. As placas foram então centrifugadas por 5 min a 300 g e a maior parte do meio pipetado a partir de sedimento de células deixando 10 a 20 μL por poço. DMSO (200 μL) foi adicionado a cada poço e as amostras agitadas para medir a mistura completa. A densidade óptica depois foi lida em um comprimento de onda de 550 nm em um leitor de placa ELISA Titertek Multiscan, e uma curva de dose-resposta foi construída. Para cada curva, um valor IC50 foi lido como a dose necessária para reduzir a densidade óptica final a 50 % do valor de controle.
[0232]Composto RelC tem uma IC50 menor do que 0,1 pM neste ensaio. Exemplo 9: Formação de conjugados Procedimento de conjugação de anticorpo geral
[0233]Anticorpos são diluídos entre 1 a 5 mg/mL em um tampão de redução (exemplos: solução salina tamponada com fosfato PBS, tampão de histidina, tampão de borato de sódio, tampão de TRIS). Uma solução recentemente preparada de TCEP (cloridreto de tris(2-carboxietil)fosfina) é adicionada a pontes de dissulfeto de cisteína seletivamente reduzidas. A quantidade de TCEP é proporcional ao nível alvo de redução, dentro de 1 a 4 equivalentes molares por anticorpo, gerando 2 a 8 tióis reativos. Depois da redução por várias horas a 37 °C, a mistura é resfriada até a temperatura ambiente e excesso de fármaco-ligante (A, B, C) adicionado como uma solução de DMSO diluída (teor de DMSO final de até 10 % de volume/volume de mistura de reação). A mistura foi suavemente agitada a 4 °C ou temperatura ambiente por um tempo apropriado, geralmente 1 a 3 horas. O excesso de tióis reativos pode ser reagido com um ‘reagente de capeamento de tiol’ como N-etil maleimida (NEM) no final da conjugação. Os conjugados anticorpo-fármaco são concentrados usando filtros de rotação centrífuga com um peso molecular de corte de 10 kDa ou mais alto, em seguida, purificados por filtração de fluxo tangencial (TFF) ou Cromatografia Líquida de Proteínas Rápida (FPLC). Os conjugados anticorpo-fármaco correspondentes podem ser determinados por análise por Cromatografia Líquida de Alto-Desempenho (HPLC) ouCromatografia Líquida de Ultra-Alto-Desempenho (UHPLC) para avaliar a razão de fármaco-por-anticorpo (DAR) usando cromatografia de fase reversa (RP) ou Croma- tografia de Interação Hidrofóbica (HIC), acoplada com detecção por UV-Visível, Fluo-rescência ou Espectrômetro de Massas; nível global e pureza de monômero podem ser analisados por HPLC ou UHPLC usando cromatografia de exclusão de tamanho acoplada com detecção por UV-Visível, Fluorescência ou Espectrômetro de Massas. A concentração de conjugado final é determinada por uma combinação de ensaio es- pectroscópico (absorvância a 280, 214 e 330 nm) e bioquímico (ensaio de ácido bicin- cônico BCA; Smith, P.K., et al. (1985) Anal. Biochem. 150 (1): 76-85; usando um anticorpo de IgG de concentração conhecida como referência). Os conjugados anticorpo- fármaco são geralmente estéreis filtrados usando filtros de 0,2 μm sob condições assépticas, e armazenados a +4 °C, -20 °C ou -80 °C.
[0234]Exemplos de conjugações particulares são descritos abaixo. ADC1A
[0235]Anticorpo 1 (15 mg, 100 nanomoles) é diluído em 13,5 mL de um tam-pão de redução contendo borato de sódio 10 mM pH 8,4, EDTA 2,5 mM e uma con-centração final de anticorpo de 1,1 mg/mL. Uma solução de 20 mM de TCEP é adici-onada (2 equivalentes molares/anticorpo, 200 nanomoles, 10 μL) e a mistura redução aquecida a 37 °C por uma hora em uma incubadora orbital. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, A é adicionado como uma solução de DMSO (5 equivalentes molares/anticorpo, 510 nanomoles, em DMSO 1,2 mL). A solução é misturada 3 horas na temperatura ambiente e, em seguida, resfriada rapidamente por adição de N-etil- maleimida (NEM, 10 equivalentes molares, 1000 nanomoles, 100 μL a 10 mM), em seguida, transferida em um filtro de rotação Amicon Ultracell 50KDa MWCO de 15 mL, concentrada a ca. 2,0 mL e injetada em um AKTA™FPLC usando uma coluna GE Healthcare XK16/70 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com 1,5 mL/min de solução salina tamponada com fosfato estéril-filtrada (PBS). Frações correspondentes a pico de monômero de ADC1A são agrupadas, analisadas e estéril-filtradas. O ensaio de BCA fornece uma concentração de ADC1A final a 1,25 mg/mL em 10,0 mL, obtida em massa é 12,5 mg (83 % de rendimento). A análise de UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Agilent PLRP-S 1000 A 8um 150 x 2,1 mm eluindo com um gradiente de água e acetonitrila em uma amostra reduzida de ADC1A a 280 nm e 330 nm (ligante específico ao fármaco) mostra uma mistura de cadeias leves e pesadas ligada a várias moléculas de A, compatível com um razão fármaco- por-anticorpo (DAR) de 2,5 moléculas de um por anticorpo. Análise de SEC em um AKTA™FPLC usando uma coluna GE Healthcare XK16/70 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com solução salina tamponada com fosfato estéril-filtrada (PBS) em uma amostra de ADC1A a 280 nm mostra uma pureza de monômero de 99,4 % com 0,6 % agregados.ADC1B
[0236]Anticorpo 1 (15 mg, 100 nanomoles) é diluído em 13,5 mL de um tam-pão de redução contendo borato de sódio 10 mM pH 8,4, EDTA 2,5 mM e uma con-centração final de anticorpo de 1,1 mg/mL. Uma solução de 10 mM de TCEP é adici-onada (3 equivalentes molares/anticorpo, 300 nanomoles, 30 μL) e a redução de mistura foi aquecida a 37 °C para duas horas em uma incubadora orbital. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, B é adicionado como uma solução de DMSO (7 equivalentes molares/anticorpo, 700 nanomoles, em DMSO 1,0 mL). A solução é misturada 3 horas na temperatura ambiente, em seguida, transferida em um filtro de rotação Amicon Ultracell 50KDa MWCO de 15 mL, concentrada a ca. 2,0 mL e injetada em um AKTA™FPLC usando uma coluna GE Healthcare XK16/70 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com 1,5 mL/min de solução salina tamponada com fosfato estéril- filtrada (PBS). Frações correspondentes a pico de monômero de ADC1B são agrupadas, analisadas e estéril-filtradas. O ensaio de BCA fornece uma concentração de ADC1B final a 1,57 mg/mL em 6,3 mL, a massa obtida é 9,9 mg (66 % de rendimento).Análise de UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando um coluna Agilent PLRP-S 1000 A 8um 150 x 2,1 mm eluindo com um gradiente de água e acetonitrila em uma amostra reduzida de ADC1B a 280 nm e 330 nm (ligante específico ao fár- maco) mostra uma mistura de cadeias leves e pesadas ligada a várias moléculas de B, compatível com uma razão fármaco-por-anticorpo (DAR) de 2,8 moléculas de B por anticorpo. A análise de SEC em um AKTA™FPLC usando uma coluna GE Healthcare XK16/70 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com solução salina tamponada com fosfato estéril-filtrada (PBS) em uma amostra de ADC1B a 280 nm mostra uma pureza de monômero de 96,6 % com 3,4 % de agregados.ADC1C
[0237]Anticorpo 1 (1,0 mg, 6,7 nanomoles) é diluído em 0,9 mL de um tampão de redução contendo borato de sódio 10 mM pH 8,4, EDTA 2,5 mM e uma concentração final de anticorpo de 1,1 mg/mL. Uma solução 1 mM de TCEP é adicionada (3 equivalentes molares/anticorpo, 300 nanomoles, 30 μL) e a redução de mistura é aquecida a 37 °C por 1,5 h em uma incubadora orbital. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, C é adicionado como uma solução de DMSO (10 equivalentes mola- res/anticorpo, 67 nanomoles, em DMSO 0,1 mL). A solução é misturada por 3 horas na temperatura ambiente, em seguida, resfriada rapidamente por adição de N-etilma- leimida (NEM, 37 equivalentes molares, 250 nanomoles, 10 μL a 25 mM), em seguida, injetada em uma coluna AKTA™FPLC usando um GE Healthcare XK16/70 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com 1,5 mL/min de solução salina tamponada com fosfato estéril-filtrada (PBS). Frações correspondentes a pico de monômero de ADC1C são agrupadas, transferidas em um filtro de rotação Amicon Ultracell 50KDa MWCO de 15 mL, concentradas a ca. 1,0 mL, analisadas e estéril-filtradas. O ensaio de BCA fornece uma concentração de final ADC1C a 0,63 mg/mL em 1,0 mL, a massa obtida é 0,63 mg (63 % de rendimento). A análise de UHPLC em um sistema Shi- madzu Prominence usando uma coluna Agilent PLRP-S 1000 A 8um 150 x 2,1 mm eluindo com um gradiente de água e acetonitrila em uma amostra reduzida de ADC1C a 280 nm e 330 nm (ligante específico ao fármaco) mostra uma mistura de cadeias leves e pesadas ligada a várias moléculas de C, compatível com um razão fármaco- por-anticorpo (DAR) de 2,9 moléculas de C por anticorpo. Análise de SEC em um AKTA™FPLC usando uma coluna GE Healthcare XK16/70 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com solução salina tamponada com fosfato estéril-filtrada (PBS) em uma amostra de ADC1C a 280 nm mostra uma pureza de monômero de 99,0 % com 1,0 % de agregados.ADC2A
[0238]Anticorpo 2 (15 mg, 100 nanomoles) é diluído em 13,5 mL de um tam-pão de redução contendo borato de sódio 10 mM pH 8,4, EDTA 2,5 mM e uma con-centração final de anticorpo de 1,1 mg/mL. Uma solução 40 mM de TCEP é adicionada (3 equivalentes molares/anticorpo, 300 nanomoles, 7,5 μL) e a redução de mistura aquecida a 37 °C por uma hora em uma incubadora orbital. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, A é adicionado como uma solução de DMSO (7 equivalentes molares/anticorpo, 700 nanomoles, em DMSO 1,0 mL). A solução é misturada 2,5 horas na temperatura ambiente, em seguida, é resfriada rapidamente por adição de N-etilmaleimida (NEM, 30 equivalentes molares, 3000 nanomoles, 100 μL a 30 mM), em seguida, transferida em um filtro de rotação Amicon Ultracell 50KDa MWCO de 15 mL, concentrada a ca. 2,0 mL e injetada em um AKTA™FPLC usando uma coluna GE Healthcare XK16/70 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com 1,5 mL/min de solução salina tamponada com fosfato estéril-filtrada (PBS). Frações correspondentes a pico de monômero de ADC2A são agrupadas, concentradas usando um filtro de rotação Amicon Ultracell 50KDa MWCO 15 mL, analisadas e estéril-filtradas. O ensaio de BCA fornece uma concentração de final ADC2A a 3,94 mg/mL em 2,7 mL, massa obtida é 10,6 mg (71 % de rendimento). Análise UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Agilent PLRP-S 1000 A 8um 150 x 2,1 mm eluindo com um gradiente de água e acetonitrila em uma amostra reduzida de ADC2A a 280 nm e 330 nm (ligante específico ao fármaco) mostra uma mistura de cadeias leves e pesadas ligada a várias moléculas de A, compatível com um razão fármaco-por-anti- corpo (DAR) de 2,4 moléculas de um por anticorpo. Análise de UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Waters Acquity UPLC BEH200 SEC 1,7 um 4,6 x 150 mm eluindo com solução salina tamponada com fosfato estéril-filtrada (PBS) em uma amostra de ADC2A a 280 nm mostra uma pureza de monômero de 97,5 % com 1,9 % de agregados.
[0239]Como usado aqui, “Anticorpo 1” é um anticorpo anti-Her2 compreen-dendo um domínio VH tendo a sequência de acordo com a SEQ ID NO. 1 e um domí-nio VL tendo a sequência de acordo com a SEQ ID NO. 2.
[0240]Como usado aqui, “Anticorpo 2” é um anticorpo anti-CD25 (“Simulect”) compreendendo um domínio VH tendo a sequência de acordo com a SEQ ID NO. 3 e um domínio VL tendo a sequência de acordo com a SEQ ID NO. 4.Exemplo 10: Estudos de eficácia de ADC in vitro
[0241]A citotoxicidade de ADC2A foi avaliada em um ensaio de citotoxicidade como descrito acima, e os resultados são mostrados na Figura 1. o representa a linhagem celular que expressa o antígeno (células SU-DHL-1 a partir da Coleção Alemã Leibniz Institute DSMZ de Micro-organismos e Culturas Celulares.), e ▲ representa o antígeno linhagem celular qeu não-expressa (células Daudi a partir da Coleção de Cultura do Tipo Americana), e as barras de erro indicam ± desvio padrão.Exemplo 11: Estudos de eficácia de ADC in vivo
[0242]Os camundongos CB.17 SCID, da idade de 8 a 12 semanas, são inje-tados com 1 mm3 de fragmentos de tumor derivados de linhagem de células BT-474 subcutaneamente no flanco. Quando os tumores atingem um tamanho médio de 100 a 150 mg, o tratamento é iniciado. Os camundongos são pesados duas vezes por semana. Tamanho de tumor é medido duas vezes por semana. Animais são monitorados individualmente. O ponto de extremidade do experimento é um volume de tumor de 1000 mm3 ou 60 dias, o que ocorrer primeiro. Respondedores podem ser seguidos mais.
[0243]Os grupos de 10 camundongos xenoenxertados são injetados i.v. com 0,2 mL de conjugado anticorpo-fármaco (ADC), ou anticorpo nu, em solução salina tamponada com fosfato (veículo) ou com 0,2 mL de veículo sozinho. A concentração de ADC é ajustada para se obter, por exemplo, 0,3 ou 1,0 mg ADC/kg de peso corpó-reo em uma única dose. Três doses idênticas podem ser dadas a cada camundongo em intervalos de, por exemplo, 1 semana.
[0244]A Figura 2 mostra o efeito em volume médio de tumor em grupos de 10 camundongos doseados com ADC1A a 0,3 (amarelo) ou 1,0 mg/kg (roxo) comparado a veículo (preto) ou anticorpo nu (azul) de controles.
[0245]A Figura 3 mostra o efeito em volume médio de tumor em grupos de 10 camundongos doseados com ADC1B a 0,3 (cinza) ou 1,0 mg/kg (roxo) comparado a veículo (preto) ou Ig nu (azul) de controles.
[0246]Todos os documentos e outras referências mencionados acima estão aqui incorporados como referência. Abreviações Ac - acetila Ac - macetamidometila Alloc - aliloxicarbonila Boc - dicarbonato de di-terc-butila t-Bu - terc-butila Bzl - benzila, onde Bzl-OMe é metoxibenzila e Bzl-Me é metilbenzeno Cbz ou Z - benzilóxi-carbonila, onde Z-Cl e Z-Br são cloro- e bromobenzilóxi carbonila respectivamente DMF - N,N-dimetilformamida Dnp - dinitrofenila DTT - ditiotreitola Fmoc - 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonila imp - grupo de proteção imina N-10: 3-(2-metoxietóxi)propanoato-Val-Ala-PAB MC-OSumaleimidocaproil-O-N-succinimida Moc - metoxicarbonila MP - maleimidopropanamida Mtr - 4-metóxi-2,3,6-trimetilbenzenossulfonila PAB - para-aminobenziloxicarbonila PEG - etileno-óxi PNZ - carbamato de p-nitrobenzila Psec - 2-(fenilsulfonil)etoxicarbonila TBDMS - terc-butildimetilsilila TBDPS - terc-butildifenilsilila Teoc - 2-(trimetilsilil)etoxicarbonila Tos - tosila Troc - cloreto de 2,2,2-tricloretoxicarbonila Trt - tritila Xan - xantila SEGUÊNCIAS SEQ ID NO. 1 (Her VH): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVAR IYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA MDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 2 (Her VL): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA SFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK SEQ ID NO. 3 (Simulect VH): QLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYSFTRYWMHWIKQRPGQGLEWIGAI YPGNSDTSYNQKFEGKAKLTAVTSASTAYMELSSLTHEDSAVYYCSRDYGYYFDF WGQGTTLTVS SEQ ID NO. 4 (Simulect VL): QIVSTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSRSYMQWYQQKPGTSPKRWIYDT SKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYTFGGGTKLEIK

Claims (16)

1. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que é A: e sais e solvatos deste.
2. Conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que é da fórmula ConjA: em que CBA representa um agente de ligação celular.
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de ligação celular é um anticorpo ou um fragmento ativo deste.
4. Conjugado, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo ou fragmento de anticorpo para um antígeno associado ao tumor.
5. Conjugado, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo que se liga a um ou mais antígenos associados ao tumor ou receptores de superfície celular selecionados a partir de (1)-(88): (1) BMPR1B; (2) E16; (3) STEAP1; (4) 0772P; (5) MPF; (6) Napi3b; (7) Sema 5b; (8) PSCA hlg; (9) ETBR; (10) MSG783; (11) STEAP2; (12) TrpM4; (13) CRIPTO; (14) CD21; (15) CD79b; (16) FcRH2; (17) HER2; (18) NCA; (19) MDP; (20) IL20R-alfa; (21) Brevican; (22) EphB2R; (23) ASLG659; (24) PSCA; (25) GEDA; (26) BAFF-R; (27) CD22; (28) CD79a; (29) CXCR5; (30) HLA-DOB; (31) P2X5; (32) CD72; (33) LY64; (34) FcRH1; (35) IRTA2; (36) TENB2; (37) PSMA - FOLH1; (38) SST; (1) .1) SSTR2; (2) .2) SSTR5; (3) .3) SSTR1; (4) .4) SSTR3; (5) .5) SSTR4; (39) ITGAV; (40) ITGB6; (41) CEACAM5; (42) MET; (43) MUC1; (44) CA9; (45) EGFRvIII; (46) CD33; (47) CD19; (48) IL2RA; (49) AXL; (50) CD30 - TNFRSF8; (51) BCMA - TNFRSF17; (52) CT Ags - CTA; (53) CD174 (Lewis Y) - FUT3; (54) CLEC14A; (55) GRP78 - HSPA5; (56) CD70; (57) Antígenos específicos à célula tronco; (58) ASG-5; (59) ENPP3; (60) PRR4; (61) GCC - GUCY2C; (62) Liv-1 - SLC39A6; (63) 5T4; (64) CD56 - NCMA1; (65) CanAg; (66) FOLR1; (67) GPNMB; (68) TIM-1 - HAVCR1; (69) RG-1/Tumor de próstata alvo Mindin - Mindin/RG-1; (70) B7-H4 - VTCN1; (71) PTK7; (72) CD37; (73) CD138 - SDC1; (74) CD74; (75) Claudins - CLs; (76) EGFR; (77) Her3; (78) RON - MST1R; (79) EPHA2; (80) CD20 - MS4A1; (81) Tenascin C - TNC; (82) FAP; (83) DKK-1; (84) CD52; (85) CS1 - SLAMF7; (86) Endoglin - ENG; (87) Anexina A1 - ANXA1; (88) V-CAM (CD106) - VCAM1.
6. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um an-ticorpo engenheirado com cisteína.
7. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o carregamento de fármaco (p) de fármacos (D) para anticorpo (Ab) é um número inteiro de 1 a cerca de 8.
8. Conjugado, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que p é 1, 2, 3 ou 4.
9. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma mistura de compostos conjugados de fármacos, como definidos em qualquer uma das reivindicações 2 a 8, em que o carregamento médio de fármaco por anticorpo na mistura de compostos de conjugado anticorpo-fármaco é cerca de 1 a cerca de 8.
10. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8, ou composição, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso em terapia.
11. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8, ou composição, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença proliferativa em um indivíduo.
12. Conjugado ou composição, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença é câncer.
13. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compre-ende o conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 8, ou composição, como definida na reivindicação 9, e um diluente, veículo ou excipiente farma- ceuticamente aceitável.
14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um agente quimioterapêutico.
15. Uso do conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 8, ou da composição, como definida na reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma do-ença proliferativa em um indivíduo.
16. Método para preparar um conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de reagir um agente de ligação celular com o composto A, como definido na reivindicação 1.
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