MXPA05010492A

MXPA05010492A - Aparato y metodos para propocionar esperma animal clasificado por sexo.

Info

Publication number: MXPA05010492A
Application number: MXPA05010492A
Authority: MX
Inventors: Niraj V Nayak
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-29
Publication date: 2006-05-25
Also published as: DK2305832T3; WO2004088283A2; EP3511693A1; BR122017017790B1; EP2298231A2; EP2309245A2; EP2305171B1; MX345105B; EP2305172A3; CN102818761B; US20130224726A1; US20140220620A1; JP5632648B2; CN102818760A; US8206988B2; CN104862273A; US20130224727A1; US20130224734A1; EP2357464B1; CA2952056A1

Abstract

Aparatos y metodos para analizar particulas, incluyendo aparatos y metodos para un procedimiento de clasificacion de esperma que incluye: recolectar esperma de un animal 30; seleccionar condiciones de coloracion 47a; tenir el esperma con colorante fluorescente selectivo de ADN 48; clasificar las celulas de esperma de conformidad con el contenido de cromosomas sexuales 55; y crioconservar una poblacion de esperma clasificado 61 hasta utilizarse para inseminacion artificial; una modalidad incluye de aparato 1001 y metodos para utilizar una pluralidad de unidades de citometria de flujo 9 compartiendo una plataforma integrada para clasificar celulas de esperma; en una modalidad, la clasificacion citometrica de flujo incluye utilizar el siguiente aparato y metodos: una boquilla de orientacion que tiene un deflector 101; un sistema optico de epi-iluminacion 109; un analisis de division de regiones de ADN localizadas dentro de los nucleos celulares 225; procesamiento de senal digital, que incluye muestreo sincronizado de senales de salida analogas 701, forma de onda de impulso 497 presenta la extraccion de una aproximacion de un derivado de primer orden de una onda de forma de impulso 497 en un punto del impulso, cualquiera de varias estrategias de clasificacion; y un sistema de calibracion de clasificacion automatizado 4201; en una modalidad, el procesamiento de senal digital incluye senales de salida analogas de muestreo 701 en tiempos relativos a la emision de impulsos desde un laser de iluminacion; otras modalidades son substancialmente diferentes de las anteriores, incluyendo modalidades dirigidas a pasos individuales o sistemas que pueden utilizarse para cualquiera de las varias aplicaciones que implican el analisis de particula.

Description

APARATO Y METODOS PARA PROPORCIONAR ESPERMA ANIMAL CLASIFICADO POR SEXO ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta invención corresponde en general al equipo y a los métodos para la recolección de semen animal y más específicamente al equipo y a los métodos que utilizan diversas técnicas, incluida la citometría de flujo, para producir poblaciones de esperma enriquecidas con espermatozoides que tengan una o más características deseadas, como las poblaciones viables de espermatozoides separados según las características del ADN para usar en la industria de producción pecuaria, para preseleccionar el sexo de la cría de los animales. La fecundación de los animales por medio de inseminación artificial (IA) y el trasplante de embriones después de la fecundación in vitro es una práctica establecida. En la industria de producción pecuaria, la capacidad de influir en el resultado reproductivo con el objetivo de que la cría posea una o más características convenientes tiene ventajas obvias. A modo de ejemplo, seleccionar previamente la descendencia a favor del sexo femenino tendría beneficios económicos en la industria láctea, al asegurar la producción de vacas lecheras. Se han realizado esfuerzos para alcanzar este objetivo mediante el uso de citometría de flujo para separar los espermatozoides que posean el cromosoma X de los que posean el cromosoma Y, como lo demuestran las publicaciones en las patentes de los EE.UU. N° 6,357,307 (Buchanan, et al.); 5,985,216 (Rens, et al.), y 5,135,759 (Johnson). Sin embargo, ninguno de estos esfuerzos ha dado lugar a la introducción de un sistema de alto rendimiento capaz de producir volúmenes de producción de espermatozoides sexados relativamente puros, con motüidad suficiente para una fecundación eficaz. En consecuencia, la industria de producción pecuaria tiene actualmente la necesidad de implementar un sistema viable de alta velocidad para aislar eficazmente los espermatozoides sobre la base de una característica específica del ADN (u otras características), para producir cantidades de dichas células que se puedan usar a escala comercial. También se necesita un sistema de manejo del esperma que conserve la viabilidad de dicho esperma aislado a medida que sea procesado por el sistema de aislamiento y que permita su conservación hasta el momento en que se encuentre listo para usar. La invención actual aborda estas necesidades. Esta invención también se puede aplicar a mejoras en el campo de la citometría de flujo sobre una base más general. La citometría de flujo se puede definir de manera amplia como la determinación de las características de partículas individuales a medida que pasan, generalmente en fila india, en una corriente de líquido a través de un dispositivo de medición que, habitualmente, proporciona información para clasificar las partículas de acuerdo a las características seleccionadas. Opcionalmente, las partículas pueden separarse después en poblaciones mediante diversas técnicas, inclusive la separación de gotitas, la separación por interferencia de gotitas y la desviación de líquidos. Otra opción es destruir selectivamente las partículas no deseadas, por ejemplo mediante fotoablación. En un sistema de citometría de flujo basado en la óptica, se usan dispositivos ópticos para dirigir y centrar un haz de luz (por ejemplo, luz visible o luz ultravioleta) en el flujo que contiene las partículas y a recoger las emisiones de las partículas, inclusive las emisiones de luz dispersada y/o fluorescencia de las partículas. En un sistema óptico común, por ejemplo, un haz de luz (por ejemplo, un rayo láser) se enfoca en la corriente de líquido y las emisiones son recogidas por un par de unidades de recolección, una colocada adelante del rayo láser para recoger las emisiones de luz dispersada y la otra colocada ortogonalmente con respecto ai flujo y al rayo láser para recoger las emisiones de fluorescencia. Cada unidad de recolección incluye un fotodetector individual, que aumenta el costo del sistema. Aún más, en los sistemas ópticos tradicionales los fotodetectores convierten las emisiones recogidas en señales eléctricas, que se analizan mediante sistemas analógicos para clasificar las partículas según sus características seleccionadas. Los sistemas análogos tienen un costo relativamente bajo, pero sólo se puede obtener información limitada de las señales. Otros han tratado de desarrollar tecnologías que se puedan emplear para procesar espermatozoides de modo de obtener poblaciones enriquecidas con espermatozoides que tengan el cromosoma sexual deseado. Sin embargo, la tecnología existente es deficiente con respecto a las tecnologías originales que se describen aquí. Por ejemplo, Johnson et al. (patente de los Estados Unidos N° 5,135,759) describe la separación de poblaciones de espermatozoides que tienen los cromosomas X e Y intactos, según el contenido de ADN, utilizando citometría de flujo /separador celular en poblaciones enriquecidas de esperma con los cromosomas X e Y. Según se describe, el esperma se combina con un colorante selectivo para ADN a una temperatura de 30 a 39° C durante un período de 1 hora (39° C) a 1.5 horas (30° C). Después se usa un citómetro de flujo para medir la cantidad de luz fluorescente emitida mientras el esperma pasa a través de un rayo láser que excita al colorante. Debido a que el esperma que lleva el cromosoma X contiene más ADN que el esperma que lleva el cromosoma Y, con una diferencia de alrededor del 3 al 5% en la mayoría de las especies de mamíferos, el esperma que tiene el cromosoma X emite más luz fluorescente que el esperma que tiene el cromosoma Y. Para poder explicar el hecho de que la medición de fluorescencia puede variar según la orientación rotacional de los espermatozoides, se usan dos fotodetectores. El primero determina si los espermatozoides están adecuadamente orientados, en tanto el segundo toma una medición que se usa para clasificar los espermatozoides según tengan un cromosoma X o Y. Se usa un oscilador para hacer que el flujo que contiene el esperma se rompa en gotitas corriente abajo del lugar donde el esperma pasa por el rayo láser.

A las gotitas que contienen únicamente esperma de una intensidad fluorescente predeterminada se les administra una carga y se desvían electrostáticamente dentro de los recipientes de recolección. La población recolectada de esperma, enriquecida sexualmente, se usa después para microinyección, fecundación in vitro, o inseminación artificial. Seidel et al. (WO 02/43574) también describen la separación de esperma en poblaciones enriquecidas sexualmente con espermatozoides que tienen los cromosomas X e Y mediante citometría de flujo. Seidel et al. describen la tinción de células a una temperatura entre 30° C y 40° C. La publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos N° 2003/0157475 A1 (Schenk, 21 de agosto de 2003) describe un método de crioconservación de espermatozoides separados según contengan el cromosoma X o el Y. Según se advierte allí, es aconsejable agregar un crioprotector a los espermatozoides antes de que sean sometidos a la crioconservación para protegerlos durante este proceso. Por ejemplo, el glicerol es un crioprotector que se agrega habitualmente a los espermatozoides bovinos antes de la crioconservación. Sin embargo, para que el crioprotector pueda ofrecer mejor protección, es conveniente esperar a que el crioprotector se equilibre con los espermatozoides antes de someterlos a temperaturas inferiores a 0o C. Durante el período de equilibración, el crioprotector penetra la membrana celular para proporcionar protección intracelular además de la protección extracelular que éste ofrece. Por lo tanto, los métodos de crioconservación descritos en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos N° 2003/0157475 A1 especifican que se agregue a los espermatozoides un diluyente que contenga giicerol después de que se hayan enfriado a aproximadamente hasta 5o C. Luego se deja que los espermatozoides y el giicerol se equilibren a 5° C entre 1 y 18 horas antes de someter a los espermatozoides a temperaturas inferiores. La divulgación de la información recomienda un período de equilibración de entre tres y seis horas para obtener los mejores resultados. Lamentablemente, el tiempo y el gasto que requiere un período de equilibración de 3 a 6 horas tienen una repercusión negativa sobre la rentabilidad de un proceso comercial de separación de esperma. Además, en el contexto de un proceso comercial de separación de esperma, se cree que la sanidad del esperma generalmente mejora al reducir el tiempo entre su recolección y la crioconservación (con otros factores sucede lo mismo). Desde este punto de vista también, sería aconsejable tener acceso a tecnología de crioconservación que no requiera un período de equilibración largo para obtener los beneficios óptimos de un crioprotector. Es más, se señala que la tecnología de crioconservación conocida tiene una repercusión perjudicial sobre la motilidad del esperma, lo que indica la disminución de la fecundidad. Por lo tanto, es necesario que surjan técnicas de crioconservación superiores a las convencionales para conservar la sanidad del esperma.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Esta invención está orientada a la obtención de un mejor sistema (métodos y equipo) para analizar, clasificar y separar partículas sobre la base de una o más características deseadas; la provisión de tal sistema que, en una materialización, emplea citometría de flujo para aislar y separar con exactitud células por el contenido de ADN; la provisión de tal sistema que, en determinadas materializaciones, incorpora protocolos de separación que permiten que el resultado del sistema sea controlado como una función de uno o más factores, inclusive la pureza de la población de partículas separadas deseadas, la velocidad a la que la población deseada de partículas se recoge, la pérdida de las partículas deseadas no separadas en la población deseada y otros factores; la provisión de tal sistema que, en una materialización, funciona a gran velocidad para proporcionar esperma separado por sexo para uso comercial en la industria de producción pecuaria; la provisión de tal sistema que se pueda usar para separar células sin tener un efecto perjudicial considerable sobre las mismas, incluso sobre la motilidad de los espermatozoides; la provisión de un sistema que se puede usar para conservar a los espermatozoides separados hasta que se necesiten con el mínimo efecto perjudicial sobre las células, inclusive sobre su motilidad; la provisión de tal sistema que, como se relaciona con la producción de esperma sexado, incorpora técnicas que aumentan la velocidad y la precisión de la clasificación y separación de los espermatozoides; la provisión de un sistema de citometría de flujo que usa dispositivos ópticos de epiluminación para detectar diversas características de las partículas a analizar y, opcionalmente, separar; la provisión de tal sistema de citometría de flujo de epiluminación que es económico de fabricar; la provisión de un sistema que, en una materialización, incorpora unidades de citometría de flujo múltiples que comparten una plataforma integrada para la clasificación y (opcionalmente) la separación de partículas, como las células en general y los espermatozoides en particular, a altas velocidades de producción; la provisión de tal sistema multicanal que comparte componentes y sistemas comunes para reducir las variaciones entre los canales para lograr un funcionamiento más eficaz; y la provisión de tal sistema de separación que, en una materialización, incorpora protocolos que permiten que una muestra se analice rápidamente para determinar la calidad de la misma a fin de evaluar la rentabilidad de la separación adicional. Además, esta invención está dirigida a la obtención de un mejor sistema (métodos y equipo) para procesar digitalmente las señales que representan fluorescencia; la provisión de tal sistema digital, en una materialización, para detectar pulsos analógicos a pulsos convertidos digitalmente como una función de las características de fondo; la provisión de tal sistema digital, en una materialización, para inicializar los parámetros de discriminación; la provisión de tal sistema digital, en una materialización, para detectar información digital correspondiente a pulsos de onda; la provisión de tal sistema digital, en una materialización, para el análisis de información digital inclusive la extracción de características; la provisión de tal sistema digital, en una materialización, para clasificar pulsos y definir límites de decisiones; la provisión de tal sistema digital, en una materialización, que emplea un sensor de rotura de gotitas para controlar la amplitud del transductor; y la provisión para el uso de tal sistema digital, en una materialización, para distribuir y recoger células para la comercialización. Aún más, esta invención está dirigida a obtener un mejor sistema integral (equipo y métodos) para el procesamiento comercial de semen animal desde el momento en que se recoge una muestra de semen de un animal macho, mediante crioconservación de una muestra de esperma que contiene un porcentaje mayor de esperma con una característica cromosómica deseada que exista en el semen recogido; la provisión de tal sistema, en una materialización, que permite el procesamiento eficaz de cantidades comerciales de esperma viable enriquecido con espermatozoides separados por sexo; la provisión de tal sistema que permite, en una materialización, el ajuste del sistema para contrarrestar las variaciones diarias y entre animales en las características del semen; la provisión de tal sistema que, en una materialización, permite la producción de esperma enriquecido en aproximadamente 18000000 de espermatozoides sexados por hora mediante una sola unidad de citometría de flujo a una pureza de 85%; y la provisión de tal sistema que permite, en una materialización, el procesamiento completo de un lote de semen (por ejemplo, la cantidad de semen recogido de un animal macho) para producir muestras de esperma viable con las características sexuales deseadas a una pureza de 85% con menos de 10% de pérdida del esperma recogido con la característica sexual deseada en aproximadamente 1 hora de procesamiento. En general, esta invención está dirigida al equipo y métodos establecidos en las reclamaciones de esta solicitud. Otros propósitos y características de esta invención serán en parte evidentes y en parte señalados más adelante.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIAGRAMAS La fig. 1 es un diagrama de flujo de trabajo para un ejemplo de proceso de separación de esperma de la invención actual; La fig. 2 es un diagrama esquemático de una materialización de un sistema de separación de gotitas por citometría de flujo de la invención actual; La fig. 3 es una vista lateral de una porción de una materialización de un equipo de citometría de flujo de la invención actual para la separación de gotitas que muestra un conjunto óptico de epiluminación que enfoca un haz de excitación en una corriente ascendente de líquido generada por un sistema de boquilla; La fig. 4 es una vista de un corte transversal de una materialización de una boquilla y el soporte de la boquilla de la invención actual; La fig. 5 es un diagrama esquemático de un espermatozoide arrastrado en una corriente de líquido que se observa con un haz luminoso de sección transversal elíptica de acuerdo a una materialización de la invención actual; La fig. 6 es un diagrama esquemático de un espermatozoide arrastrado en una corriente de líquido que se observa con un haz luminoso de sección transversal elíptica de acuerdo a una materialización de la invención actual; La fig. 7 es un diagrama esquemático que muestra la envolvente angular para la orientación deseada de un espermatozoide en la cual el haz luminoso del sistema óptico entrará en contacto con una de las caras anchas de la célula por lo general por el lado ancho; La fig. 8 es una vista de un corte transversal de una materialización de un cuerpo de la boquilla de la invención actual; La fig. 9 es una vista lateral del cuerpo de la boquilla mostrado en la fig. 7 que muestra una serie de planos de corte (A-A hasta H-H y J-J hasta K-K) a través del cuerpo de la boquilla; Las figuras 9A-9J son vistas de los cortes del cuerpo de la boquilla que se muestran en las figuras 7 y 8 a lo largo de los planos correspondientes (A-A hasta H-H y J-J hasta K-K) de la fig. 9; La fig. 10 es una vista en perspectiva de un corte transversal de una materialización de un sistema de boquilla que tiene un deflector orientador en la boquilla; La fig. 11 es una vista de un corte transversal del sistema de boquilla mostrado en la fig. 10; La fig. 12 es una vista ampliada de un corte transversal parcial del sistema de boquilla mostrado en las figuras 10 y 11; La fig. 13 es un corte transversal parcial ampliado similar a la vista mostrada en la fig. 12, pero tomado desde una dirección perpendicular a la dirección visualizada en la fig. 12; La fig. 14 es una vista lateral de una materialización del soporte del deflector que sostiene una placa deflectora; La fig. 15 es una vista superior del soporte del deflector y la placa deflectora mostrada en la fig. 14; La fig. 6 es una vista superior de una materialización de un soporte de deflector rotacionalmente orientado en una boquilla de modo que los tramos de la placa deflectora se cruzan en una línea paralela al eje mayor de la elipse D en la boquilla; La fig. 17 es una vista superior de una materialización de un soporte de deflector rotacionalmente orientado en una boquilla de modo que los tramos de la placa deflectora se cruzan en una línea perpendicular al eje mayor de la elipse D en la boquilla; La fig. 18 es una vista lateral de un corte transversal de una materialización de un sistema de boquilla que incluye un deflector que muestra una serie de planos de corte (A— A hasta E — E) a través de la boquilla y el deflector; Las figuras 18A-18E muestran los cortes transversales de las áreas de flujo en diversos puntos en el sistema de boquilla mostrado en la fig. 18; La fig. 19 es una vista de un corte transversal similar a la fig. 18 tomada a través de una boquilla que tiene una placa deflectora perpendicular al eje longitudinal de la boquilla; La fig. 20 es una vista de un corte transversal de la boquilla mostrada en la fig. 19 tomada a través del plano de corte 20-20 mostrado en la fig. 19; La fig. 21 es una vista de un corte transversal similar a la vista del corte transversal de la fig. 18 que muestra un sistema de boquilla que tiene un conducto de introducción de muestra en una ubicación lateral; La fig. 22 es una vista en perspectiva de una materialización de un sistema de boquilla montado en un soporte de boquilla de la invención actual; La fig. 23 es un diagrama esquemático de varios espermatozoides orientados rotacionalmente cuando pasan a través de la pieza del orificio de la invención actual hacia el sitio de interrogación; La fig. 24 es un diagrama esquemático que muestra el sitio de división de la gotita después de la boquilla según una materialización de la invención actual; La fig. 25 es un diagrama esquemático de una materialización de un sistema sensor de división de la invención actual; La fig. 26 es una vista en perspectiva ampliada de un sistema de separación de gotitas y el sensor de división de gotitas de un citómetro de flujo de la invención actual; La fig. 27 es una vista lateral del sistema óptico de epiluminación mostrado en la fig. 26; La fig. 28 es un diagrama esquemático de una materialización de un sistema óptico de epiluminación de la invención actual; La fig. 29 es una vista en perspectiva de una materialización de un sistema óptico de epiluminación de la invención actual; La fig. 30 es una vista lateral del sistema óptico de epiluminación mostrado en la fig. 26; La fig. 31 es una vista superior del sistema óptico de epiluminación mostrado en las figs. 29 y 30; La fig. 32 es una vista de un corte del sistema óptico de epiluminación a lo largo del plano 32-32 de la fig. 30; La fig. 33 es una vista de un corte de una porción del sistema óptico de epiluminación a lo largo del plano 33-33 de la fig. 31; La fig. 34 es una vista en perspectiva que muestra sólo elementos del sistema de filtrado óptico que se encuentran detrás del filtro dicroico del sistema óptico de epiluminación mostrado en la fig. 29; La fig. 35 es una vista en perspectiva de un sistema óptico de epiluminación que tiene una lente cilindrica montada para inclinación traslacional y en dos ejes; La fig. 36 es un diagrama esquemático de un sitio de interrogación de una materialización de la invención actual que muestra un haz láser enfocado en una corriente de líquido corriente abajo de la boquilla con un ángulo de incidencia oblicuo; La fig. 37 es una gráfica que ¡lustra una corriente de pulsos de ondas de una salida del fotodetector que detecta los pulsos fluorescentes de células que fluyen a una velocidad de 10000 células/segundo; La fig. 38 es una vista desarrollada de la fig. 37 que ilustra la corriente de una salida del fotodetector que detecta tres pulsos fluorescentes de tres células que fluyen a una velocidad promedio de 10000 células/segundo; una onda cuadrada de un oscilador de gotitas de 00 MHz ha sido superpuesta en la ilustración para mostrar la sincronización entre los tres pulsos y los pulsos de la onda cuadrada del oscilador de gotitas; La fig. 39 es un diagrama funcional de una materialización de un analizador digital de células (DCA) y el controlador del procesador según la invención. La fig. 40 es un diagrama esquemático de una materialización de un separador multicanal de la invención actual que muestra dos canales; La fig. 41 es un diagrama de flujo de trabajo de una materialización de un separador multicanal de la invención actual que muestra cuatro canales; La fig. 42 es un diagrama funcional de una materialización de un analizador de células analógico (ACA) según la invención; La fig. 43 es una gráfica que ilustra una corriente de pulsos de ondas de una salida del fotodetector que detecta los pulsos fluorescentes de células que fluyen a una velocidad de 10000 células/segundo; La fig. 44 es una vista desarrollada de la fig. 37 que ilustra la corriente de una salida del fotodetector que detecta tres pulsos fluorescentes de tres células que fluyen a una velocidad promedio de 10000 células/segundo; una onda cuadrada de un oscilador de gotitas de 100 MHz ha sido superpuesta en la ilustración para mostrar la sincronización entre los tres pulsos y los pulsos de la onda cuadrada del oscilador de gotitas; Las figs. 45-48 ¡lustran el movimiento de una célula en relación con un haz láser angosto; La fig. 49 es una ilustración que ejemplifica la información digital correspondiente a una salida analógica que varía en el tiempo desde un fotodetector que detecta un único pulso de fluorescencia con base en 122 muestras a una velocidad de muestreo continua de 105 MHz; La fig. 50 es un diagrama esquemático que ilustra la relación de sincronización entre los pulsos láser, la emisión de fluorescencia de una célula que resulta de los pulsos láser y las muestras digitales de la salida del fotodetector; La fig. 51 es un diagrama esquemático que ilustra cómo las muestras digitales mostradas en la fig. 50 forman un pulso de ondas; La fig. 52 es un diagrama esquemático de un pulso de ondas de un espermatozoide X sincronizado con el pulso de ondas de un espermatozoide Y que muestra un pico mayor de intensidad en el pulso de ondas del espermatozoide X; La fig. 53 es un diagrama esquemático de un pulso de ondas que muestra un umbral y la ventana de integración que se pueden usar para el análisis de pulsos; La fig. 54 es un histograma de una muestra que contiene espermatozoides X e Y que muestra la alta resolución que se logra con técnicas de exploración de rendija; La fig. 55 es un histograma de una muestra que contiene espermatozoides X e Y que muestra la resolución relativamente deficiente lograda con iluminación estándar; Las figs. 56-59 ilustran histogramas del área de pulso de fluorescencia correspondientes gráficos de dispersión del área de pulso con respecto a la altura máxima del pulso para los núcleos y las células vivas teñidas con Hoechst 33342; Las figs. 60-61 ilustran un modelo de cuatro componentes de un histograma de intensidad de fluorescencia para espermatozoides; Las figs. 62-63 ilustran un modelo de tres componentes de un histograma de intensidad de fluorescencia para espermatozoides; La fig. 64 ilustra la naturaleza no lineal de la característica CSD; el panel superior muestra los trazados M promedio para espermatozoides X e Y; el panel central muestra una gráfica de los primeros derivados de estos trazados M promedio (es decir M') para los valores de amplitud de señal menores que la altura de los puntos máximos del pulso de emisión de fluorescencia promedio para los espermatozoides Y; y el panel inferior ilustra se encuentra la diferencia entre los primeros derivados (?'?-?'?) como una función de la amplitud de señal; La fig. 65 ilustra una materialización en la cual la característica CSD es la pendiente computada de una línea que pasa a lo largo de dos puntos en el pulso de emisión de fluorescencia; estos puntos son el primer cruce de umbrales de CSD y la altura de los puntos máximos de pulso; el umbral de CSD se mantiene en un punto donde la altura máxima de un 25% de las células vivas, alineadas cae en el umbral o por debajo del mismo; Las figs. 66-69 ilustran una ventaja de la característica CSD cuando se usa para discriminar espermatozoides portadores de X o Y. La fig. 70 es una captura de pantalla que ilustra una región de separación de dos variables fijada en un gráfico de dispersión de CSD con respecto a la dispersión del área de pulso; La fig. 71 ilustra una materialización de un re análisis de citometría de flujo para una prueba en la cual el panel izquierdo corresponde a la estrategia de separación de alta recuperación/aceptación de coincidentes (estrategia de interrupción en no coincidentes) y el panel derecho corresponde a la estrategia de separación de alta pureza/rechazo de coincidentes (estrategia de interrupción en coincidentes); La fig. 72 es un diagrama de flujo de trabajo de una materialización del procesamiento de señales digitales de la invención actual; La fig. 73 es un ejemplo de una estrategia del agrupamiento k-means que puede emplearse según una materialización de la invención actual; La fig. 74 es una ilustración conceptual y representación gráfica de la aplicación de una regla de decisión de Error mínimo de Bayes a los datos de pulso de característica como se pueden emplear de acuerdo a una materialización de la invención actual; La fig. 75 es una representación gráfica de los resultados obtenidos usando una regla de decisión de Error mínimo de Bayes y el umbral de distancia de Mahalonobis como puede emplearse de acuerdo con una materialización de la invención actual; La fig. 76 es una ilustración conceptual de la estadística de ventana móvil para proporcionar "olvido" como puede emplearse de acuerdo con una materialización de la presente invención; La fig. 77 es una representación gráfica de compensación de variaciones como puede emplearse de acuerdo con una materialización de la invención actual; La fig. 78 ilustra una corriente de líquido que contiene un ejemplo de distribución de partículas; La fig. 79 es una gráfica que muestra la pureza en función de la velocidad de ingreso de líquido con una estrategia de separación con aceptación de coincidentes; La fig. 80 es una gráfica que muestra el porcentaje de partículas deseadas separadas exitosamente en la población utilizable en función de la velocidad de ingreso de líquido con una estrategia de separación con aceptación de coincidentes; La fig. 81 es una gráfica que muestra la relación inversa entre el porcentaje de gotitas coincidentes aceptadas al separar una población de las partículas deseadas en comparación con el porcentaje de gotitas coincidentes rechazadas al separar en esa población; La fig. 82 es un diagrama de flujo de decisión que muestra la operación general de una materialización de un aparato de separación de la invención actual; La fig. 83 es una vista plana lateral de un citómetro orientado para producir una corriente de gotitas con un componente horizontal de velocidad y un sistema de recolección para recoger las gotitas; La fig. 84 es una vista ampliada en perspectiva del sistema de recolección mostrado en la fig. 56 que se muestra en relación al sistema de boquilla y las placas deflectoras; La fig. 85 es un diagrama esquemático de una materialización de un sistema de recolección de la invención actual; La fig. 86 es una vista plana frontal de un dispositivo interceptor del sistema de recolección mostrado en la fig. 56; La fig. 87 es una vista plana lateral de un dispositivo interceptor del sistema de recolección mostrado en la fig. 56; Las figuras 88-95 muestran los resultados gráficos de varios experimentos de centrifugación de esperma; Las figuras 96-98 son diagramas esquemáticos que ilustran los pasos en una materialización de un método de filtración de la invención actual; La fig. 99 es un diagrama esquemático de una materialización de un sistema de filtración usado para filtrar espermatozoides; La fig. 100 es un diagrama esquemático de otro sistema de filtración usado para filtrar espermatozoides; Las figuras 101 y 102 muestran los resultados gráficos de los experimentos de filtración de espermatozoides; La fig. 103 es un diagrama de flujo de trabajo para una materialización de un método de crioconservación de la invención actual; La fig. 104 muestra los resultados gráficos para un experimento de crioconservación de espermatozoides; La fig. 105 es un diagrama de flujo de trabajo para una materialización de un método de procesamiento de espermatozoides según la invención actual; La fig. 106 es una vista en perspectiva de una materialización de un separador de partículas multicanal de la invención actual donde se desglosan las piezas para mostrar las características internas del separador; La fig. 107 es una vista en perspectiva de un sistema de distribución que puede usarse para el ingreso de líquido en el separador de partículas multicanal de la fig. 06; La fig. 108 es una vista en perspectiva del sistema de distribución de la fig. 107 donde se ha eliminado parte del sistema para mostrar sólo las conexiones internas de líquido del sistema de distribución; La fig. 109 es una : vista en perspectiva del separador de partículas mostrado en la fig. 106 donde se han eliminado total o parcialmente los elementos adicionales para mostrar mejor las características internas del separador; La fig. 110 es una vista plana frontal del separador de partículas mostrado en la fig. 106; La fig. 111 es una vista plana lateral del separador de partículas mostrado en la fig. 106 sin la pared lateral de la cubierta para mostrar las características internas del separador; La fig. 112 es un plano lateral del separador de partículas mostrado en la fig. 106 (tomado del lado opuesto al de la fig. 111) sin la pared lateral de la cubierta para mostrar las características internas del separador; La fig. 113 es una vista en perspectiva del separador de partículas mostrado en la Fig. 106 tomada desde un ángulo detrás del separador y sin la cubierta trasera para mostrar las características internas del separador; La fig. 114 es una vista en perspectiva de una porción del separador de partículas que se muestra en la fig. 106 donde se observa el montaje de múltiples sistemas de boquilla a una barra transversal; La fig. 115 es una vista en perspectiva de una porción del separador de partículas mostrado en la fig. 106 que muestra las posiciones relativas del sistema de recolección y otras partes del separador de partículas; La fig. 116 es un diagrama esquemático de una materialización de un sistema dispensador de líquido para un separador multicanal de la invención actual; Las figs. 117 y 118 son diagramas esquemáticos de dos diferentes sistemas divisores de haz láser; Las figs. 119 y 120 muestran un sistema multicanal; Las figs. 121-134 muestran los resultados gráficos de varios experimentos; La fig. 135 es un diagrama esquemático de una materialización alternativa para un sistema de boquilla de la invención actual donde la boquilla dirige la corriente de líquido a través de un tubo capilar; La fig. 136 es un diagrama esquemático de una materialización de un sistema de separación por fotoablación de la presente invención; La fig. 137 es un diagrama esquemático de un sistema alternativo de separación basado en el cambio de líquidos que puede usarse en un equipo empleando la tecnología de la presente invención; y La fig. 138 es un diagrama esquemático de un sistema alternativo de separación basado en una corriente de interferencia de gotitas de gran velocidad que desvía los segmentos discretos elegidos de la corriente de líquido que lleva las partículas analizadas. Las partes correspondientes se designan por números de referencia correspondientes en todos los diagramas. A continuación se detalla una lista de partes con números de referencia asociados para cada parte. La lista de partes se proporciona con títulos de sección generalmente correspondientes a los títulos de sección en la especificación para facilitar el uso de la lista de partes. En general, cada sección de la lista de partes proporciona una referencia numérica para las partes que se presentan por primera vez en la sección correspondiente de la Descripción Detallada.

Lista de partes con números de referencia asociados para cada parte Resumen general 39 Recolección de semen 41 Etiquetado del semen 41A Adición de solución amortiguadora 43 Control de calidad 47 Lavado 48 Líquido de tinción 49 Tinción 51 Incubación 53 Carga en el dispositivo de introducción de muestras del citómetro de flujo 54 Adición del líquido envolvente a la citometría de flujo 55 Separación 57 Recolección de espermatozoides separados 58A Adición del líquido de recolección 58B Espermatozoides concentrados 58C Adición de criodiluyente 59 Carga de los espermatozoide separados en pajillas 61 Crioconservación 63 Empaque en nitrógeno líquido 65 Distribución 67 Ventas 69 Almacenamiento 71 Inseminación artificial Citometría de fluio 1 Sistema (general) 3 Suministro de líquido de transporte 7 Suministro de líquido envolvente 9 Equipo de citometría de flujo con capacidad de separación 15 Sistema dispensador de líquido 17 Líquido de transporte 19 Líquido envolvente 21 Corriente de líquido 23 Corriente de partículas 25 Haz de radiación electromagnética 31 Emisión de radiación electromagnética desde partículas 33 Gotitas 35 Partículas contenidas en las gotitas Eauioo de citometría de flujo (monocanal) 101 Sistema de boquilla 103 Orificio de la boquilla 105 Transductor 107 División de gotitas 109 Sistema óptico 115 Sitio de interrogación 117 Fotodetector 119 Sistema de separación 123 Primer grupo o población diferente de gotitas 125 Segundo grupo o población diferente de gotitas 2201 Sistema de recolección 131 Procesador Sistema de boquilla 133 Cuerpo de flujo cilindrico 135 Orificio longitudinal central 137 Boquilla 139 Cuerpo de !a boquilla en forma de embudo 141 Pasaje a través del cuerpo de la boquilla 145 Perforación roscada por dentro 149 Proyección o perno roscado 55 Junta tórica 157 Conducto (aguja tubular) 167 Espacio anular (separación) 173 Orificio radial en el cuerpo de flujo (líquido envolvente) 183 Segundo orificio radial (líquido envolvente adicional) 189 Núcleo de líquido portador 191 Envoltura exterior coaxial de líquido Orientación de las células 201 Espermatozoide bovino 205 Cabeza en forma de paleta 207 Caras opuestas anchas y planas 209 Bordes angostos 211 Ecuador del espermatozoide 213 Núcleo 215 Cola 217 Longitud del núcleo 219 Longitud de la cabeza 221 Ancho de la cabeza 223 Longitud total 225 Región localizada dentro del núcleo 227 Dirección del flujo de la corriente 229 Envolvente angular en la cual el haz de luz ilumina la cara ancha R1 Intervalo angular P Plano Diseño de la boquilla 231 Interior del cuerpo de la boquilla 233 Superficie interna del cuerpo de la boquilla 235 Primera región con inclinación axial 237 Segunda región con inclinación axial 239 Tercera región con inclinación axial 247 Eje longitudinal de la boquilla 249 Cuarta región interior de la boquilla 251 Longitud axial de la cuarta región 255 Pieza del orificio 257 Orificio con rosca interna en el extremo frontal de la boquilla 259 Primera zona de torsión 261 Segunda zona de torsión 263 Superficie de la primera zona de torsión 267 Superficie de la segunda zona de torsión 271 Fuerzas de torsión 273 Longitud axial de la primera zona de torsión 275 Longitud axial de primera región con inclinación axial 277 Longitud axial de segunda región con inclinación axial 279 Longitud axial de la segunda zona de torsión 309 Superficie cónica corriente arriba de la pieza del orificio 315 Superficie cilindrica corriente abajo de la pieza del orificio 317 Longitud axial de la superficie cónica corriente arriba 327 Longitud axial de la superficie corriente abajo Deflector orientador 2001 Deflector orientador 2003 Placa deflectora 2005 Soporte del deflector 2007 Tramo ascendente 2009 Tramo descendente 2015 Línea de intersección 2017 Eje central del cuerpo de la boquilla 2019 Borde curvo del tramo ascendente 2025 Distancia que el tramo descendente se extiende corriente abajo 2027 Longitud total del soporte del deflector 2029 Diámetro externo del soporte del deflector 2031 Diámetro interno del soporte del deflector 2033 Distancia entre la línea de la intersección y el centro de la boquilla 2035 Extremo corriente arriba del deflector 2037 Superficie inclinada del soporte del deflector 2039 Bordes laterales del tramo descendente 2041 Borde corriente abajo del tramo descendente 2049 Separación entre la placa deflectora y el soporte del deflector 2051 Superficie interna del soporte del deflector 2053 Volumen detrás de la placa deflectora 2055 Volumen interior de la boquilla 2057 Eje longitudinal del soporte cilindrico del deflector 2059 Línea a través del eje mayor de la elipse D 2061 Distancia entre la aguja de inyección y el deflector 2067 Extremo corriente abajo del soporte del deflector 2069 Puntos de contacto entre el soporte del deflector y la boquilla 2071 Juntas tóricas 2077 Extremo corriente abajo del soporte de la boquilla (saliente) 2079 Diámetro interno de la saliente 2081 Porción del líquido envolvente entre el núcleo de la corriente y la superficie de la boquilla 2087 Corte transversal corriente arriba (A) 2089 Corte transversal en el deflector (B) 2091 Corte transversal en el deflector (C) 2093 Corte transversal en el deflector (D) 2094 Corte transversal corriente abajo del deflector (E) 2097 Sistema deflector perpendicular 2095 Burbuja de aire 2099 Placa deflectora perpendicular 2101 Borde curvo de la placa deflectora perpendicular 2103 Borde recto de la placa deflectora perpendicular 2105 Junta tórica 2107 Saliente anular (cornisa) en la boquilla 2109 Diámetro externo de la aguja de inyección de muestras (conducto) 2151 Sistema de boquilla con un conducto de introducción de muestras desplazado Montaje y ajuste de boquillas 331 Soporte de la boquilla 333 Primera plataforma lineal 337 Segunda plataforma lineal 339 Eje X 341 Eje Y 343 Tercera plataforma rotacional 345 Eje Z 347 Pieza fija de la primera plataforma (no se muestra) 349 Marco para la pieza fija de la primera plataforma 355 Pieza móvil de la primera plataforma 357 Accionador (tornillo micrométrico) para la primera plataforma 359 Pieza fija de la segunda plataforma 361 Pieza móvil de la segunda plataforma 363 Accionador (tornillo micrométrico) para la segunda plataforma 365 Pieza fija de la tercera plataforma 371 Pieza móvil de la tercera plataforma 373 Accionador (tornillo micrométrico) para la tercera plataforma 375 Dirección generalmente ascendente de la corriente que contiene las células 377 Ángulo de la dirección ascendente Transductor y formación de gotitas 379 Anillo 381 Elemento piezoeléctrico (no mostrado) 383 Terminales D Diámetro de la corriente Sensor de división 389 Sensor de división 391 Microprocesador 393 Fuente de luz 395 Arreglo de diodos lineal (fotodiodos) 401 Lente para el sensor de división de gotitas 405 Circuitos de amplificadores operacionales corriente a voltaje 407 Amplificadores de seguimiento/control 409 Generador de onda sinusoidal (Señal de seguimiento/control) 411 Convertidor A/D 412 Sistema de cámara 413 Estroboscopio 414A Máscara 414B Rendija en la máscara Sistema óptico de epiluminación 415 Sistema de epiluminación 417 Instrumento de epiluminación 419 Eje óptico longitudinal 425 Haz de luz 427 Eje del haz de iluminación enfocado 429 Base rectangular 431 Filtro reflector 435 Láser o lámpara de arco 437 Conjunto de lentes de acondicionamiento 439 Abertura 441 Pared lateral de una cámara dicroica 443 Cámara dicroica 445 Retén anular 447 Filtro de densidad neutra 449 Lentes cilindricas 455 Soporte de lente 457 Contratuerca 459 Corte transversal elíptico del haz de luz 461 Sujetadores del filtro reflector 463 Soporte del filtro 465 Cara angular del soporte del filtro 467 Aberturas del soporte del filtro 469 Plataforma lineal para el soporte del filtro 471 Eje X 473 Soporte de plano fijo 475 Accionador para la plataforma lineal 477 Filtro dicroico 479 Sujetadores del filtro dicroico 485 Marco del filtro dicroico 487 Dirección de avance 489 Eje óptico longitudinal del instrumento óptico 491 Conjunto de lentes de enfoque 497 Pulso de ondas fluorescente o señal emitida por la 501 Adaptador para microscopio 503 Abertura en la pared frontal de la cámara dicroica 505 Pared frontal de la cámara dicroica 507 Cilindro de enfoque 509 Cilindros de montura de la lente 511 Lente de enfoque 513 Dirección de retroceso 515 Ajuste del enfoque telescópico 517 Luz colimada emitida 519 Sistema de filtrado 521 Filtro de emisión 523 Soporte del filtro de emisión 525 Abertura en la pared trasera de la cámara dicroica 527 Pared trasera de la cámara dicroica 529 Conjunto de películas de alineación 531 Deslizador de la película de alineación 533 Riel para los componentes del conjunto de filtros 535 Soporte del filtro para la película de alineación 539 Filtro de película 541 Sujetadores para asegurar el filtro al soporte del filtro 543 Ángulo para la película de alineación en relación con los ejes ópticos 545 Sujetadores para asegurar el deslizador a la base 547 Ranuras paralelas en la base 549 Lente asférica 551 Soporte para la lente asférica 553 Marco para la lente asférica 557 Sujetadores para la lente asférica 559 Filtro espacial 561 Placas de la abertura 563 Marco para las placas del filtro espacial 567 Ranura vertical 571 Ranura horizontal 573 Abertura 575 Dimensión vertical 577 Dimensión horizontal 579 Volumen recolectado 583 Soporte de la placa 587 Sujetadores para el soporte de la placa 589 Pieza de respaldo para las placas de la abertura 498 Función espacial de excitación 449A Conjunto de montaje ajustable 449B Ranuras 449C Ranuras 450 Epiiuminación que refleja emisiones de fluorescencia 451 Filtro dicroico Fotodetector 591 Placa de montura para el fotodetector 595 Sujetadores para el fotodetector Ángulo de incidencia del haz 605 Distancia entre el sitio de interrogación y el orificio de la boquilla 609 Eje del haz A Ángulo de incidencia Haz de luz enfocada L1 Longitud a lo largo del eje mayor W1 Ancho a lo largo del eje menor Sistema de separación 627 Dispositivo de carga 629 Placas cargadas del deflector 631 Elemento cargador 633 Abertura en el elemento cargador 635 Fuente de energía para las placas deflectoras Conjunto de montaje aiustable 5001 Conjunto de montaje ajustable 5003 Tabla de ajuste del conjunto de montaje 5005 Respaldo del conjunto de montaje 5007 Sujetadores 5009 Ranuras 50 1 Eje de traslación 5013 Eje de traslación 5015 Tabla de ajuste del conjunto de montaje 5017 Sujetadores 5019 Ranuras 5021 Soporte fijo 5023 Sujetadores 5025 Resorte Sistema de calibración automático 4201 Sistema de calibración automatizado 4203 Sensor de epiluminación 4205 Cable de fibra óptica 4207 Filtro dicroico 4209 Sistema de lente 4211 Emisiones fluorescentes por parte de las partículas de las gotitas 4213 Fotodetector 4221 Soporte para placas deflectoras 4223 Orificios para sensores de epiluminación 4225 1a corriente de gotitas separadas 4227 2a corriente de gotitas separadas 4229 3a corriente de gotitas separadas Corrección de falla del sistema de separación 5047 Sistema de eliminación de desechos para el elemento cargador 5049 Sistema de eliminación de desechos para las placas deflectoras 5051 Soporte para el elemento cargador 5053 Pasaje de vacío 5055 Línea de vacío 5057 Apertura adyacente al elemento cargador 5058 Conexión 5059 Línea de gas comprimido 5061 Distribuidor 5063 Pasajes de aire 5064 Aperturas 5065 Conexión 5066 Lado de la placa deflectora Protección de la muestra separada 4033 Recipiente de recolección 4041 Mecanismo de prevención de contaminación 4043 Accionador neumático 4045 Brazo oscilante 4047 Extremo del brazo oscilante Sistema dispensador de líquido 645 Bomba de jeringa 647 Línea de flujo de la bomba al suministro del líquido de transporte 649 Recipiente para contener el suministro del líquido de transporte 651 Línea de la bomba a la aguja de inyección 657 Línea de suministro de la bomba de jeringa a la aguja 659 Motor de velocidad variable 661 Segundo recipiente: para suministro del líquido envolvente 667 Línea de suministro para la conexión del líquido envolvente al orificio radial de la boquilla 669 Válvula de control en la línea de suministro 671 Sistema de presión de gas para el líquido envolvente 675 Fuente de gas presurizado 679 Línea de aire para el gas presurizado 681 Regulador para controlar la presión proporcionada al tanque del líquido envolvente 683 Válvula de dos vías en la línea de aire Control 689 Convertidor A/D 693 Intensidad relativa del haz que experimenta un punto que se mueve a través del haz de luz 695 Intensidad relativa del pulso emitido por el espermatozoide que atraviesa el haz de luz d Distancia entre la boquilla y el sitio de formación de gotitas Procesamiento de la señal 701 Señal de salida del fotodetector 703 Señales del oscilador de generación de gotitas 705 Procesamiento de señales digitales (analizador digital de células) 707 Señal digital del A/D 735 Terminal/PC 737 Reloj maestro (128 x señal del oscilador) 739 Adquisición de datos (??1') 741 Inicialización de los parámetros de detección (HH1) 745 Inicialización de los parámetros de discriminación (HH2) 747 Detección de pulsos digitales (HH3) 749 Análisis de pulsos digitales: Extracción de características 753 Área del pulso (HH5) 755 Pico del pulso (HH6) 757 Discriminación de pulsos (HH7) 759 Separación (HH8) 761 Análisis de dispersión (HH9) 763 Límite de decisión para reglas de Bayes 769 Inicializar 771 Verificación del sistema 773 Interacción del usuario 775 Reintentar (hasta tres veces) 777 Enjuague 779 Control de calidad con cuentas o núcleos 781 Aspirar muestra 783 Control de calidad con la muestra 785 Iniciar muestra 787 Separación activada 789 Muestra completada 791 Continuar muestra 793 Separación desactivada 795 Discriminación X/Y óptima 797 Ajustar discriminación X/Y 799 Discriminación OK 801 Velocidad óptima 803 Ajustar velocidad de la jeringa 805 Velocidad OK 807 Verificación del sistema 809 Reinicio del sistema 811 Sistema OK 813 Ejemplo de flujo operativo general 825 Integrador 827 Comparador de ancho/área 829 Calculadora del umbral dinámico 831 Discriminación de pulsos 833 Puerto JTAG de l/O 837 Comparador de ventana (área) 839 Ancho de pulso y lógica desencadenante 841 Decisión de separación 843 Controladores de entrada/salida 845 Controladores esclavos 847 Tablero controlador de separación 849 USB 851 SDRAM de la placa DSP 853 Señal de separación 854 Filtro de paso bajo 855 SDRAM de una placa l/O 857 l/O del procesador 859 Bus periférico de l/O 861 Generador de pulsos de separación 863 Procesador de administración de datos 865 Procesador de detección de pulsos 867 Procesador de extracción de características 873 Procesador de separación 875 RAM de la placa DSP OL Relación inversa entre gotitas coincidentes en la población utilizable comparada con gotitas coincidentes en la población inutilizable P1 Punto en la línea OL correspondiente al 85% de pureza LL Punto en la línea OL correspondiente al 60% de recolección de partículas deseadas OR Intervalo operativo (segmento de OL entre P1 y LL) 6000 Datos sin procesar 6001 1a población de células no alineadas 6003 2a población de células no alineadas 6005 Población de espermatozoides Y alineados 6007 Población de espermatozoides X alineados 6010 Datos sin procesar 6011 Población de células no alineadas 6015 Población de espermatozoides Y alineados 6017 Población de espermatozoides X alineados Sistema multicanal 1001 Sistema multicanal 1003 Unidades de citometría de flujo 1005 Suministro común de partículas 1007 Fuente común de radiación electromagnética 1009 Cubierta común 011 Entrada común para el control 1019 Salida común 1021 Sistema común dispensador de líquido 1023 Sistema común de control de temperatura 1025 Fuente común de energía 1027 Sistema común de recuperación de desechos 1029 Sistema común de placa deflectora 1031 Sistema común de limpieza Cubierta común 1069 Base 1071 Dos paredes laterales 1073 Par de salientes inferiores 1075 Panel de la cubierta inferior 1077 Frente de la cubierta 1081 Par de salientes superiores 1083 Panel de la cubierta superior 1085 Parte trasera de la cubierta 1087 Marco para montar múltiples unidades de citometría 1089 Barra transversal fijada a las paredes de la cubierta (para adjuntar los soportes de las boquillas) 1093 Placa de montaje en ángulo que se extiende entre las paredes laterales Suministro común de líquido 1105 Bomba para el líquido de transporte 1107 Suministro común de líquido de transporte 1 15 Sistema de gas a presión para el líquido envolvente 1117 Suministro común de líquido envolvente 1121 Sistema distribuidor 1123 Recipiente que contiene el suministro común del líquido de transporte 1125 Soporte para el recipiente 1133 Bloque de soporte 35 Cavidad para el recipiente receptor 1137 Segunda cavidad para la solución amortiguadora 1 39 Recipiente para la solución amortiguadora 1141 Bomba de jeringa 1147 Línea de suministro de la bomba de jeringa al distribuidor 1149 Válvula de tres vías que controla el líquido de transporte y el líquido amortiguador 1155 Recipiente para el suministro común del líquido de envolvente 1157 Línea de suministro del recipiente de líquido envolvente al distribuidor 1161 Fuente de gas presurizado 1163 Línea de gas 1165 Regulador en la línea de gas 1167 Válvula de dos vías para la línea de gas entre la fuente de gas y el tanque de líquido envolvente 1169 Línea de gas para presurizar un suministro de solución de limpieza 1173 Tanque para la solución de limpieza 1175 Válvula de dos vías para la línea de gas para la solución de limpieza 1177 Distribuidor 1179 Bloque laminado 1181 Conductos 1185 Circuito de flujo de líquido 1189 Entradas conectadas a la bomba de jeringa 1191 Entradas conectadas al suministro del líquido envolvente 193 Salidas para el líquido de transporte y líquido envolvente V1-V6 Válvulas para el control del flujo a través de los conductos del distribuidor 1203 Pieza del marco (para sujetar el bloque del distribuidor) 1205 Conexiones roscadas dentro del bloque 1207 Depósito de muestra V1A-V1 D Válvulas de dos vías (para controlar el flujo del líquido de muestra a las boquillas) 1217 Aguja del depósito de muestra 1221 Sistema de desechos 1223 Tanque de desechos (recipiente) 1225 Mecanismo como una bomba de vacío (para generar vacío) 1227 Líneas de desechos (conectan las válvulas V1A-V1D al tanque de desechos) 1233 Filtro hidrofobico (en la línea que conecta el tanque de desechos con la bomba de vacío) 1235 Circuito de líquido para el líquido envolvente V2A-V2D Válvulas de dos vías (para controlar el flujo de líquido envolvente a las boquillas) 1241 Línea de suministro de líquido envolvente 1247 Líneas de desecho que conectan el sistema de circuitos de flujo de líquido envolvente al tanque de desechos Fuente de energía y controles comunes 1249 Fuente común de energía 1251 Sistemas comunes de suministro de energía 1253 Entrada común (GUI) 1255 Salida común (al microprocesador) Control común de temperatura 1257 Sistema de control de temperatura 1259 Circuito de flujo de líquido (para control de temperatura) 1263 Conductos para líquido (para control de temperatura en el bloque de soporte) 1265 Unidad de control 1269 Conductos para líquido (para control de temperatura en el distribuidor) V6 Válvula de cierre Haz de luz y sistema de división del haz de luz comunes 1270 Divisor del haz 1270A Primer haz del divisor de haz 1270B Segundo haz del divisor de haz 1271 Segundo divisor de haz 1271A Primer haz del segundo divisor de haz 1271 B Segundo haz del segundo divisor de haz 1272 Tercer divisor de haz 1272A Primer haz del tercer divisor de haz 1272B Segundo haz del tercer divisor de haz 1273 Sistema de orientación del haz 1279 Conjunto de filtros inferior 1281 Conjunto de espejos superior 1285 Base (para el conjunto de filtros inferior) 1289 Plataforma (para conjunto de filtros inferior) 1291 Mecanismo para mover la plataforma (tornillo micrométrico) 293 Placa basculante en la plataforma 1295 Espejo (en la placa) 1297 Base (para el conjunto de espejos superior) 1299 Plataforma (para el conjunto espejos superior) 1301 Placa basculante (para el conjunto de espejos superior) 1303 Espejo (para el conjunto de espejos superior) 1305 Mecanismo para mover la plataforma superior 1309 Placas del objetivo (fijadas a la pared lateral de la cubierta) 1311 Orificios alineados verticalmente (en las placas del objetivo) 1315 Primer filtro reflector 1317 Segundo filtro reflector 1319 Tercer filtro reflector 1321 Cuarto filtro reflector Placas deflectoras comunes 1331 Dos placas deflectoras comunes 1333 Marco (para instalar las placas deflectoras comunes en la cubierta) Sistema de boquilla del tubo capilar 1335 Sistema de boquilla del tubo capilar 1337 Tubo capilar 1341 Cámara llena con un medio que transmite luz Sistemas alternativos de separación 1351 Sistema de separación por fotoablación 1353 Segundo láser 1355 Recipiente de recolección 1357 Sistema de desviación del líquido 1359 Dispositivo de desviación del líquido 1361 Derivación capilar al primer recipiente de recolección 1365 Derivación capilar al segundo recipiente de recolección 1367 Transductor (para crear ondas de presión para controlar selectivamente la dirección del flujo de líquido) 369 Tubo capilar en el extremo de la boquilla 1371 Sistema de separación por interferencia de corriente de gotitas 1373 Corriente de interferencia de gotitas de gran velocidad 1375 Sistema de generación de gotitas para una corriente de gotitas de gran velocidad 1377 Sistema de boquilla de gran velocidad 1379 Corriente de líquido de gran velocidad 1381 Transductor para la generación de una corriente de interferencia de gotitas 1383 Gotitas de gran velocidad 1387 Placa deflectora eléctrica para la deflexión de gotitas de gran velocidad 1389 Gotitas sin carga 1391 Gotitas cargadas 397 Segmento desviado de la corriente de líquido 1399 Intersección de la corriente de gotitas de gran velocidad con la corriente coaxial de líquido 1403 Capilares de recolección Sistema de recolección 2201 Sistema de recolección 2203 Dispositivo interceptor 2205 Superficie de impacto 2207 Recipiente de recolección 221 Vía de entrada de la gotita 22 3 Ampolla de la pipeta 2215 Pipeta 2217 Pared interna de la pipeta 2225 Tubo guía 2227 Marco del sistema de recolección 2229 Soporte circular 2231 Tornillo de fijación para la altura del dispositivo interceptor 2233 Placa de montaje 2235 Tornillos de fijación para el ajuste lateral 2241 Ranura lateral 2243 Bandeja para sostener los recipientes de recolección 2245 Ventana de salida 2247 Primer dispositivo interceptor 2249 Segundo dispositivo de interceptor 2265 Gotitas dispersas Líquido de recolección 2301 Líquido de recolección Filtración 2401 Filtro 2403 Recipiente de recolección para la filtración 2405 Suspensión concentrada que contiene espermatozoides 2409 Mecanismo de jeringa 2411 Filtro de la cánula 2413 Líquido de resuspensión 2419 Segundo recipiente 2421 Jeringa para experimento de filtración 2423 Muestra para experimento de filtración 2425 Filtro para experimento de filtración 2427 Bomba de vacío para experimento de filtración 2431 Jeringa para experimento de filtración II 2433 Muestra para experimento de filtración II 2435 Filtro para experimento de filtración II 2437 Soporte del filtro para experimento de filtración II Crioconservación 2501 Ajusfar concentración 2503 Agregar crioprotector 2505 Agregar fuente de proteína 2507 Cargar en pajillas 2509 Enfriar a temperatura de mantenimiento 2511 Mantener a temperatura de mantenimiento 2513 Enfriar a temperatura cercana a la zona crítica 2515 Enfriar en el intervalo de formación de cristales de 2517 Sumergir en nitrógeno líquido Sistema común de recolección 2801 Sistema común de recolección 2803 Marco común para dispositivos interceptores 2805 Canal de desechos 2807 Bandeja para recipientes de recolección Sistema de láser de pulsos 3001 Láser de pulsos 3003 Sensor de láser de pulsos 3005 Pulso láser 3007 Caída temporal del pulso de fluorescencia 3009 Muestra digital DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MATERIALIZACIONES Las materializaciones que se describen a continuación se relacionan con la recolección y el procesamiento de semen de origen animal, en particular con el procesamiento de semen de un animal doméstico para separar los espermatozoides según una característica específica del ADN (por ejemplo, el contenido de cromosomas X o Y para preseleccionar el sexo de las crías). Se combinan varias tecnologías originales para lograr los resultados que se describen a continuación. Sin embargo, se comprenderá que las tecnologías originales aquí descritas se pueden destinar a otras aplicaciones sin desviarse del alcance de esta invención.

Resumen general La Figura 1 es un diagrama de flujo de trabajo que proporciona un resumen de los pasos en un proceso que ejemplifica la invención actual. El proceso comienza con la recolección de muestras de semen puras de uno o más animales machos (por ejemplo, toros) en el paso 39. Las muestras de semen se rotulan para su identificación en el paso 41 , se ponen en contacto con un amortiguador en el paso 41A y se transportan a una planta de tratamiento. Además del amortiguador, en el paso 41 A también se pueden agregar aditivos, incluidos por ejemplo, una fuente de energía, una fuente proteica, un antibiótico y/o una preparación que regule las reacciones de oxidación/reducción dentro de la células o del medio celular. En el paso 43 se puede llevar a cabo una prueba de control de calidad opcional para garantizar que la calidad de cada muestra (por ejemplo, la motilidad del esperma) es adecuada para indicar que el producto final es idóneo para satisfacer los criterios mínimos de calidad. En el paso 47 se puede llevar a cabo un paso opcional de lavado. En el paso 47A se selecciona el protocolo de tinción que se usará para el tratamiento, utilizando diversos protocolos de tinción para teñir alícuotas de la muestra y después analizar la idoneidad de separación de cada alícuota para identificar el protocolo de tinción conveniente para esa muestra particular. En el paso 49 se lleva a cabo la tinción según el protocolo de tinción seleccionado, agregando un líquido de tinción 48 que contiene un colorante químico (por ejemplo, un colorante fluorescente selectivo para ADN) a cada muestra. Además del líquido de tinción, en el paso 48 también se pueden agregar aditivos, incluidos, por ejemplo, una fuente de energía, una fuente proteica, un antibiótico y/o una preparación que regula las reacciones de oxidación/reducción dentro de la célula o del medio celular. En el paso 51 se incuban las muestras para permitir que el esperma absorba el colorante. Después se carga una muestra en el dispositivo de introducción de muestras de un citómetro de flujo en el paso 53. El líquido de la muestra se introduce en el citómetro de flujo junto con un líquido envolvente en el paso 54. Además del líquido envolvente, en el paso 54 se pueden agregar aditivos, que incluyen, por ejemplo, una fuente de energía, una fuente proteica, un antibiótico y/o una preparación que regula las reacciones de oxidación/reducción dentro de la célula o del medio celular. En el paso 55 el citómetro de flujo separa los espermatozoides según una característica específica del ADN, como se describirá a continuación. Cuando los espermatozoides separados son recogidos por el sistema de recolección del citómetro de flujo en el paso 57, se agregan a un recipiente de recolección que contiene un líquido de recolección o criodiluyente en el paso 58A. Además del líquido de tinción, en el paso 58A también se pueden agregar aditivos, incluidos, por ejemplo, una fuente de energía, una fuente proteica, un antibiótico y/o una preparación que regula las reacciones de oxidación/reducción dentro de la célula o del medio celular. En este momento los espermatozoides están en una solución que ha sido diluida por los diversos líquidos agregados durante todo el procedimiento. En consecuencia, la población de espermatozoides que tienen la característica de ADN deseada es concentrada en el paso 58B para su uso en inseminación artificial comercial. En el paso 58C se agrega un criodiluyente a los espermatozoides separados concentrados. Además del criodiluyente, en el paso 58C también se pueden agregar aditivos, incluidos, por ejemplo, una fuente de energía, una fuente proteica, un antibiótico y/o una preparación que regula las reacciones de oxidación/reducción dentro de la célula o del medio celular. Los espermatozoides después se envasan en recipientes tubulares (que en la industria de cría se conocen como "pajillas") en el paso 59 y se someten a la crioconservación en el paso 61. En el paso 63 el esperma crioconservado se envasa en nitrógeno líquido para el almacenamiento. Después el esperma crioconservado se distribuye mediante un sistema de distribución comercial en el paso 65 y se vende a los criadores de animales en el paso 67. Los criadores pueden almacenar el esperma crioconservado en el paso 69 hasta que lo necesiten para inseminar artificialmente a una hembra (por ejemplo, una vaca) en el paso 71. Como se tratará a continuación, una materialización de la invención actual requiere el control de la temperatura prácticamente durante todo el proceso. Asimismo, la finalización de los diversos pasos dentro de límites de tiempo definidos es un aspecto de otra materialización de la invención actual. Este proceso general es sólo un ejemplo de cómo la invención actual se puede usar y se comprenderá que alguno de los pasos ya mencionados se pueden suprimir y/o se pueden agregar otros. Los espermatozoides separados también se pueden usar para microinyección u otro tipo de fecundación in vitro, seguida por el trasplante de embriones a una hembra receptora. Los pasos del proceso general que incorporan los avances de la invención actual se describen detalladamente a continuación. Aunque un proceso particular descrito está dentro del contexto de clasificación de esperma de animales (por ejemplo, esperma bovino), se comprenderá que los diversos aspectos de esta invención en general son más aplicables a cualquier tipo de esperma (equinos, porcinos y otros), aún más en general a cualquier tipo de células y aún más en general a cualquier tipo de partículas, orgánicas e inorgánicas, entre las que se incluyen partículas de látex, partículas magnéticas, cromosomas, elementos subcelulares, protoplastos y partículas de almidón. En general el tamaño de estas partícula varía entre 0.5 y 200 micrómetros, pero la tecnología de esta invención no se limita a este intervalo.

Recolección y dilución de muestras La muestra de esperma que se va a separar puede ser una muestra recientemente recogida de una fuente animal, como bovinos, equinos, porcinos u otros mamíferos, o una muestra previamente crioconservada, descongelada. Es más, la muestra puede ser una sola eyaculación, múltiples eyaculaciones combinadas del mismo mamífero o múltiples eyaculaciones combinadas de dos o más animales.

Si la muestra de esperma es una muestra recién recogida, es preferible que el esperma se recoja o se transfiera rápidamente a un recipiente aislado para evitar un cambio rápido de temperatura desde las temperaturas fisiológicas (habitualmente en el entorno de los 35° C a los 39° C). Se conocen varios métodos de recolección e incluyen el método de mano con guante, el uso de una vagina artificial y la electro eyaculación). La eyaculación habitualmente contiene aproximadamente de 0.5 a 15 mil millones de espermatozoides por mililitro, dependiendo de la especie y del animal en particular. Si la muestra de esperma es una muestra descongelada previamente crioconservada, es preferible que el esperma se descongele inmediatamente antes de la tinción. En general, se puede colocar una pajilla u otro recipiente de crioconservación que contenga el esperma congelado en un baño María cuya temperatura sea al menos la temperatura de transición vitrea de la membrana celular de los espermatozoides (es decir, aproximadamente 17° C), pero no tan alta que pueda provocar un efecto adverso sobre la viabilidad de los espermatozoides. Por ejemplo, el esperma congelado se puede descongelar sumergiendo el recipiente de crioconservación en un baño María mantenido a una temperatura de aproximadamente 17° C a aproximadamente 40°C durante un período de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 90 segundos. Antes de la tinción, se puede extraer una alícuota de la muestra de esperma y se pueden evaluar diversas características, como por ejemplo, la concentración de espermatozoides, su motilidad, la motilidad progresiva de los espermatozoides, el pH de la muestra, la integridad de la membrana de los espermatozoides y la morfología de los mismos. Esto datos se pueden obtener del examen del esperma utilizando, por ejemplo, el analizador de motilidad Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con los procedimientos estándar y bien conocidos (consultar, por ejemplo, Farrell et al. Theríogenology (1998) 49(4): 871-9; y las patentes de EE.UU. N°. 4,896,966 y 4,896,967). Antes de la tinción, la muestra de esperma se puede combinar con un amortiguador (en la forma de un sólido o una solución) para formar una suspensión de esperma. Entre otras cosas, el amortiguador puede mejorar la viabilidad de los espermatozoides al amortiguar la suspensión contra cambios importantes en el pH y la presión osmótica. En general, un amortiguador no resulta tóxico para las células y es compatible con el colorante que se usa para teñirlas. Algunos ejemplos de amortiguadores comprenden fosfatos, difosfatos, citratos, acetatos, lactatos y combinaciones de éstos. Los amortiguadores que se prefieren actualmente incluyen TCA, TES, TEST, citrato de sodio, ácido cítrico monohidratado, TL, HEPES, HEPEST, PBS, PBS de Dulbecco y combinaciones de éstos. En una materialización, el amortiguador hace que los espermatozoides emulen a los espermatozoides del epidídimo de un mamífero, como por ejemplo un toro, mediante la simulación del entorno líquido del epidídimo o del conducto epididimal del toro. Es decir, el amortiguador reduce o inhibe la motilidad y la actividad metabólica de los espermatozoides. Entre los amortiguadores de este tipo se encuentran los amortiguadores a base de carbonato, como por ejemplo los que se divulgan en Salisbury & Graves, J. Reprod. Fértil., 6:351-359 (1963), que se incorpora aquí como referencia. En otra materialización, la muestra de semen se diluye con una solución amortiguada que contiene 3% de TRIS como base, 2% de ácido cítrico monohidratado, y 1 % de fructosa (p/v) en agua con un pH de aproximadamente 7.0. En otra materialización, la muestra de semen se diluye con una solución amortiguada que contiene 0.204 g de NaHCOs, 0.433 g de KHCO3, y 0.473 g C6H8C H20 en 25 mL de agua purificada (es decir, 0.097 moles/L de NaHCOs, 0.173 moles/L de KHCO3, 0.090 moles/L de En otras materializaciones, la muestra de semen se diluye con una o más soluciones amortiguadoras que se identifican en el cuadro I.

O n s? CUADRO I Amortiguadores 65 Además del amortiguador, la solución de esperma también puede contener una variedad de aditivos que son beneficiosos para la viabilidad y motilidad de los espermatozoides. Alguno ejemplos de aditivos incluyen fuentes de energía, fuentes proteicas, antibióticos y preparaciones que regulan las reacciones de oxidación/reducción dentro de la célula o del medio celular. Uno o más de estos aditivos se pueden combinar con el amortiguador o solución amortiguadora antes de que el amortiguador sea combinado con la muestra de esperma, o, como alternativa, puede ser introducido por separado a la suspensión de esperma. Se puede agregar una o más fuentes de energía para reducir al mínimo o impedir la oxidación de los fosfolípidos intracelulares y otros componentes celulares de los espermatozoides. Entro los ejemplos de fuentes de energía están los monosacáridos, como fructosa, glucosa, galactosa y mañosa y los disacáridos como sacarosa, lactosa, maltosa y trehalosa, al igual que otros polisacáridos. En cualquier caso, la suspensión de esperma resultante en general contendrá aproximadamente 1 % (p/v) hasta aproximadamente 4% (p/v) de la fuente o fuentes de energía. En una materialización de elección, la fuente de energía es la fructosa en una cantidad de aproximadamente 2.5% (p/v). Para minimizar el choque provocado por la dilución, proporcionar sustento a las células y dispersar las células por toda la suspensión, también se puede combinar una fuente proteica con el amortiguador antes de que el amortiguador se combine con la muestra de esperma o se puede introducir 66 por separado a la suspensión de esperma. Entre los ejemplos de fuentes proteicas se encuentran la yema de huevo, el extracto de yema de huevo, la leche (incluida la leche homogeneizada por calor y la descremada, el extracto lácteo, la proteína de soja, el extracto de proteína de soja, la albúmina de suero, la albúmina de suero bovino, el complemento sustituto de suero humano y combinaciones de éstos. Las que se prefieren son la albúmina y más particularmente la albúmina de suero bovino (BSA). Por ejemplo, la solución amortiguadora o amortiguada puede contener BSA en una cantidad menor que aproximadamente 5.0% (p/v), mejor si es menor que aproximadamente 2% (p/v), mejor aún si es menor que aproximadamente 1 % (p/v), y todavía mejor aún si se encuentra en una cantidad de aproximadamente 0.1 % (p/v). Además, se puede agregar a la solución amortiguadora o a la suspensión amortiguada una fuente proteica o sustituto proteico alternativo, para proporcionar el beneficio adicional de evitar o disminuir la capacitación prematura de los espermatozoides. Dichas preparaciones incluyen, por ejemplo, el complemento sustituto de suero humano (SSS) (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) y un alcohol polivinílico, como por ejemplo, un alcohol polivinílico de viscosidad baja a media, generalmente con un peso molecular entre aproximadamente 30000 y aproximadamente 60000. La fuente proteica o sustituto proteico alternativos se pueden usar solos o en combinación con otras fuentes o sustitutos proteicos. En general, estas preparaciones están presentes en las mismas cantidades que se indicaron anteriormente con 67 respecto a la BSA. En ningún caso el contenido total de albúmina del amortiguador o solución amortiguada excede en general el 5.0% aproximadamente (p/v). Se puede agregar un antibiótico para reducir la proliferación bacteriana, ya que una proliferación importante puede amenazar la viabilidad de los espermatozoides y puede aumentar el riesgo de infección de la hembra huésped fecundada. La selección de un antibiótico apropiado depende de varias consideraciones, como la especie de la que se obtuvo el esperma, los procedimientos que se utilizaron para obtener y manipular el esperma y los microorganismos que son el objetivo. Algunos antibióticos apropiados son, por ejemplo, tilosina, gentamicina, lincomicina, espectinomicina, Linco-Spectin® (clorhidrato de lincomicina -espectinomicina), penicilina, estreptomicina, ticarcilina y cualquier combinación de éstos. Los antibióticos pueden estar presentes en una concentración de aproximadamente 50 pg a aproximadamente 800 pg por mi de semen, independientemente de si el semen es puro, amortiguado o contiene otras sustancias, como por ejemplo, cualquiera de los aditivos mencionados aquí. Los Servicios de Semen Certificado (CSS) y la Asociación Nacional de Criadores de Animales (NAAB) han promulgado normas con respecto al uso de antibióticos en lo que se refiere a la recolección y el uso del esperma. Estas normas se incorporan aquí como referencia. Estas normas divulgan, por ejemplo, la adición de sulfato de gentamicina en una concentración de aproximadamente 500 pg por mi de semen, la adición de tilosina en una concentración de aproximadamente 100 68 pg por mi de semen y la adición de linco/Spectin® en una concentración de aproximadamente 300/600 pg por mi de semen. Además se puede incluir una preparación que regule las reacciones de oxidación/ reducción dentro de la .célula o el medio celular. Dichas preparaciones tienen un efecto protector sobre los espermatozoides, como por ejemplo mantener la viabilidad y la motilidad progresiva de los espermatozoides. Dichas preparaciones incluyen, por ejemplo, piruvato, vitamina K, ácido lipoico, glutatión, flavinas, quinonas, superóxido dismutasa (SOD), y SOD artificial. Las preparaciones pueden estar presentes en la solución amortiguadora o suspensión amortiguadora en concentración suficiente para afectar el efecto protector sin afectar de manera perjudicial la viabilidad de los espermatozoides. Habitualmente, las preparaciones están presentes en el amortiguador o suspensión amortiguadora en una concentración que varía entre aproximadamente 10 µ? a aproximadamente 20 mM, dependiendo de factores tales como la preparación particular que se utilice y la concentración de espermatozoides en el amortiguador o solución amortiguadora. Por ejemplo, el piruvato puede estar presente en el amortiguador o suspensión amortiguadora en una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, mejor si es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM, y mejor aún si es de aproximadamente 10 mM. La vitamina K puede estar presente en el amortiguador o la suspensión amortiguadora en una concentración de aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 100 µ?, mejor si es de 69 aproximadamente 10 µ? a aproximadamente 100 µ?, y mejor aún si es de aproximadamente 100 µ?. El ácido lipoico puede estar presente en el amortiguador o suspensión amortiguadora en una concentración de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 1 mM, mejor si es de aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 1 mM, y mejor aún si es de aproximadamente 1 mM.

Tinción de las células a clasificar En general, los espermatozoides se tiñen con uno o más colorantes selectivos para ADN, excitables por la luz UV o por la luz visible, como se describió previamente en la patente de los EE.UU. 5,135,759 y WO 02/4 906. Entre los ejemplos de colorantes selectivos, excitables por la luz UV o la luz visible se encuentran los colorantes Hoechst 33342 y Hoechst 33258, comercializados por Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Entre los ejemplos de colorantes excitables por la luz visible se encuentran SYBR-14, comercializado por Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) y el conjugado bisbenzimida-BODIPY® ("BBC") descrito en WO 02/41906. Cada uno de estos colorantes se puede usar solo o combinado; como alternativa se pueden usar otros colorantes excitables a la luz UV y a la luz visible a los que la célula es permeable, solos e en combinación con los colorantes antes mencionados, siempre que el colorante no afecte de manera perjudicial la viabilidad de los espermatozoides hasta un grado inaceptable cuando se usa en concentraciones que permiten la separación como se describió en otra parte. 70 Habitualmente, los espermatozoides se tiñen combinando una fuente de espermatozoides con una fuente de colorante para formar una mezcla de tinción. La fuente de espermatozoides puede ser simplemente semen puro o, como alternativa, puede ser una suspensión obtenida de ahí, es decir, una suspensión que contiene espermatozoides formada por la combinación de semen puro con un amortiguador, una fuente de energía, un antibiótico, una preparación que regula las reacciones de oxidación/reducción dentro de la célula o el medio celular y/o plasma seminal. De manera similar, la fuente de colorante puede estar en forma de un sólido o un líquido concentrado o diluido; además, la fuente de colorante puede contener opcionalmente un amortiguador, una fuente de energía, un antibiótico, una preparación que regula las reacciones de oxidación/reducción dentro de la célula o el medio celular y/o plasma seminal. De este modo, por ejemplo, la mezcla de tinción puede estar formada por la combinación de semen puro con Hoechst 33248. Como alternativa, la mezcla de tinción puede estar formada por la combinación de semen puro con un amortiguador o solución amortiguadora y Hoechst 33342. En otra materialización, la mezcla de tinción puede estar formada por la combinación de semen puro con un amortiguador o solución amortiguadora, Hoechst 33342, y una preparación que regula las reacciones de oxidación/reducción dentro de la célula o del medio celular. La concentración de elección del colorante selectivo de DNA en la mezcla de tinción es una función de una gama de variables que incluyen la permeabilidad de las células al colorante seleccionado, la temperatura de la 71 mezcla de tinción, el tiempo necesario para que se produzca la tinción y el grado de enriquecimiento deseado en el paso posterior de separación. En general, es preferible que el colorante tenga una concentración suficiente para obtener el grado deseado de tinción en un período razonablemente corto sin afectar sustancialmente de manera perjudicial la viabilidad de los espermatozoides. Por ejemplo, la concentración de Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14, o BBC en la mezcla de tinción en general es de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 1.0 M, mejor si es de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 700 µ?, y mejor aún si es de aproximadamente 00 µ? a aproximadamente 200 µ?. En consecuencia, de acuerdo con una serie de condiciones de tinción, la concentración de Hoechst 33342 es preferentemente de aproximadamente 100 µ?. De acuerdo con otra serie de condiciones de tinción, la concentración de Hoechst 33342 es de aproximadamente 150 µ?. De acuerdo con otra serie de condiciones de tinción, la concentración es preferentemente de aproximadamente 200 µ?. Se puede usar una variedad de amortiguadores, provistos ya sea como parte de la fuente de esperma, de la fuente de colorante o por separado a la mezcla de tinción, compatibles desde el punto de vista biológico. Entre los ejemplos de soluciones amortiguadores se encuentran, TCA, TEST, citrato de sodio, TL, HEPES, amortiguadores a base de carbonato, como por ejemplo las que se divulgan en Salisbury & Graves, J. Reprod. Fértil., 6:351-359 (1963) y se tratan detalladamente antes con respecto a la recolección y dilución de las muestras, y combinaciones, derivados y análogos de éstos. 72 Otros ejemplos de soluciones amortiguadoras incluyen las que se indican en el cuadro I. Por ejemplo, entre los amortiguadores que se pueden usar está la solución amortiguadora TCA que consta de 3% de base TRIS, 2% de ácido cítrico monohidratado y 1% de fructosa en agua con un pH de aproximadamente 7.0, y una solución amortiguadora a base de carbonato que consta de 0.204g NaHC03, 0.433g KHC03 y 0.473g C6H8O7-H20 en 25mL de agua purificada (es decir, 0.097 moles/L de NaHCO3, 0.173 moles/L de KHCO3, 0.090 moles/L C5H8OrH2 en agua). Además del amortiguador, en la mezcla de tinción se pueden incluir otros aditivos para aumentar la viabilidad de los espermatozoides, provistos como parte de la fuente de esperma, la fuente de colorante o por separado en la mezcla de tinción. Dichos aditivos incluyen fuentes de energía, antibióticos y plasma seminal; los dos primeros se trataron anteriormente con respecto a la recolección y dilución de las muestras y el último se trata a continuación con referencia a la recolección de líquidos. Dichos aditivos se pueden agregar cuando se realizan las técnicas de tinción de acuerdo con eso. En particular, se ha observado que la adición a la mezcla de tinción de una preparación que regule las reacciones de oxidación/reducción dentro de la célula o del medio celular, puede ayudar a mantener la viabilidad de los espermatozoides a concentraciones elevadas de colorante, en períodos de tinción más prolongados, o a cualquier combinación de éstos. Anteriormente se trataron ejemplos de esas preparaciones y de su uso con 73 respecto a los amortiguadores y los diluyentes. Dichas preparaciones se pueden agregar cuando se realizan las técnicas de tinción de acuerdo con eso. La temperatura de la mezcla de tinción en general se encuentra dentro del intervalo de aproximadamente 4° C a aproximadamente 50° C. En una materialización, la temperatura es de aproximadamente 4o C a aproximadamente 30° C. En otra materialización, la temperatura es de aproximadamente 20° C a aproximadamente 30° C. En otra materialización, la temperatura de tinción es de aproximadamente 25° C a aproximadamente 30° C. En otra materialización, la temperatura es de aproximadamente 28° C. En otra materialización alternativa, la temperatura es de aproximadamente 30° C a aproximadamente 39° C. En otra materialización, la temperatura es de aproximadamente 40° C a aproximadamente 50° C. En otra materialización, la temperatura es de aproximadamente 40° C a aproximadamente 45° C. En otra materialización más, la temperatura es de aproximadamente 40° C a aproximadamente 43° C. En otra materialización más, la temperatura es de aproximadamente 41 °C. La selección de una temperatura preferida generalmente depende de una gama de variables, incluidas, por ejemplo, la permeabilidad de las células al colorante o colorantes que se usen, la concentración del colorante o colorantes en la mezcla de tinción, el tiempo que las células se van a mantener en la mezcla de tinción, y el grado de enriquecimiento deseado en el paso de separación. Se permite que los espermatozoides absorban el colorante en la 74 mezcla de tinción durante un período suficiente para obtener el grado de tinción del ADN deseado. Habitualmente ese período es un período suficiente para permitir que el colorante se una al ADN de los espermatozoides, de modo tal que los espermatozoides con cromosomas X e Y se puedan separar. sobre la base de la intensidad de fluorescencia diferente y medible entre los dos. En general, no es superior a aproximadamente 160 minutos, mejor si no es superior a aproximadamente 90 minutos, aún mejor si no es superior a aproximadamente 60 minutos, y todavía mejor si es de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 40 minutos. En consecuencia, en una materialización, se forma una mezcla de tinción que consta de espermatozoides y un colorante en una concentración de aproximadamente 100 µ? a aproximadamente 200 µ?, y la mezcla de tinción se mantiene durante un período a una temperatura de aproximadamente 41° C. En otra materialización, la mezcla de tinción además consta de piruvato en una concentración de aproximadamente 10 mM, vitamina K en una concentración de aproximadamente 100 µ?, o ácido lipoico en una concentración de aproximadamente 1 mM. En una materialización más, se forma una mezcla de tinción que consta de espermatozoides, un colorante en una concentración de aproximadamente 100 µ? a aproximadamente 200 µ?, y la mezcla de tinción se mantiene durante un período a una temperatura de aproximadamente 28° C. En otra materialización, la mezcla de tinción consta de piruvato en una concentración de aproximadamente 10 mM, vitamina K en una concentración 75 de aproximadamente 100 µ?, o ácido lipoico en una concentración de aproximadamente 1 mM. En otro ejemplo más, se forma una mezcla de tinción que consta de espermatozoides, un amortiguador que consta de 0.204g NaHC03, 0.433g KHC03, y 0.473g CeHeOyFkO en 25mL de agua purificada (es decir, 0.097 moles/L de NaHC03, 0.173 moles/L de KHCO3, 0.090 moles/L C6H807-H20 en agua), y un colorante en una concentración de aproximadamente 100 µ a aproximadamente 200 µ?, y la mezcla de tinción se mantiene durante un período a una temperatura de aproximadamente 28° C. En otra materialización, la mezcla de tinción se mantiene durante un período a una temperatura de aproximadamente 4 0 C.

Líquido envolvente La mezcla de tinción se introduce a continuación como el líquido de muestra en un citómetro de flujo para separar los espermatozoides como se describió anteriormente. Las personas que están familiarizadas con la citometría de flujo sabrán que el líquido de muestra en un citómetro de flujo está habitualmente rodeado por un líquido envolvente. El líquido envolvente también hace que los espermatozoides del líquido de muestra sean extraídos en una fina fila india como se trató antes. El líquido envolvente junto con los espermatozoides es recogido por el sistema de recolección del citómetro de flujo y por lo tanto forma parte del entorno posterior a la separación de los espermatozoides. De este modo, es deseable que el líquido envolvente 76 proporcione un efecto protector a las células al contacto de éstas con el líquido envolvente. El líquido envolvente en general comprende un amortiguador. Antes se dieron ejemplos de amortiguadores y concentraciones ilustrativas de los mismos que se pueden usar en el líquido envolvente en relación con la recolección y dilución de la muestra de esperma. Más aún, en el cuadro I se indican soluciones amortiguadas de ejemplo. En una materialización particular, el líquido envolvente contiene 0.96 % (p/v) de solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco y 0.1 % (p/v) de BSA, en agua a un pH de aproximadamente 7.0. Opcionalmente, el líquido envolvente puede también contener una diversidad de aditivos que son beneficiosos para la viabilidad y la motilidad de los espermatozoides. Entre dichos aditivos se encuentran, por ejemplo, una fuente de energía, una fuente proteica, un antibiótico, una preparación que regula las reacciones de oxidación/reducción dentro de la célula o del medio celular y alcohol polivinílico. Cada uno de esos aditivos, y ejemplos de los mismos, se tratan antes en relación con la recolección y dilución de muestras. Dichos aditivos se pueden agregar al líquido envolvente de acuerdo con eso. Opcionalmente se puede filtrar el líquido envolvente antes del paso de separación. Los contaminantes que puedan estar presentes en el líquido envolvente, tales como partículas insolubles, pueden interferir con las condiciones ideales de separación. Por lo tanto, se puede filtrar el líquido 77 envolvente antes de su introducción en un citómetro de flujo. Dichos filtros y métodos para usarlos son bien conocidos en la profesión. Generalmente, el filtro es una membrana de aproximadamente 0.1 micrometros a aproximadamente 0.5 micrometros, mejor si es de aproximadamente 0.2 micrometros a aproximadamente 0.3 micrometros, y mejor aún si es de aproximadamente 0.2 micrometros. La mezcla de tinción se puede introducir en el líquido envolvente en cualquier momento posterior a la tinción. Habitualmente, una corriente de la mezcla de tinción se inyecta en una corriente de líquido envolvente dentro del equipo de separación. Inicialmente, no hay un contacto importante entre el líquido de tinción y el líquido envolvente debido al flujo laminar de los líquidos, como se trata en más detalle a continuación. Es deseable que la mezcla de tinción y el líquido envolvente permanezcan sustancialmente como corrientes que fluyen de manera discreta hasta después de que se hayan analizado las partículas (p. ej., espermatozoides) de la mezcla de tinción. En algún punto, sin embargo, el líquido envolvente y el líquido de tinción entran en contacto uno con el otro. Por ejemplo, en un citómetro de flujo de separación de gotitas (que se trata a continuación) el líquido envolvente y la mezcla de tinción comienzan a entrar en contacto uno con la otra a medida que las gotitas se forman corriente abajo en el sitio de interrogación. En el momento de la introducción de la mezcla de tinción y el líquido envolvente, tanto uno como la otra pueden estar a una temperatura entre aproximadamente 4° C y aproximadamente 50° C. El líquido envolvente 78 y la mezcla de tinción pueden estar a la misma temperatura o a diferentes temperaturas, y cualquiera de los dos puede estar a mayor temperatura que el otro. Por consiguiente, en una materialización, en el momento de la introducción de la mezcla de tinción y del líquido envolvente, ambos están a la misma temperatura, por ejemplo, entre aproximadamente 40° C y aproximadamente 43° C o entre aproximadamente 25° C y aproximadamente 30° C. En otra materialización, en el momento de la introducción de la mezcla de tinción y del líquido envolvente, la mezcla de tinción está a mayor temperatura que el líquido envolvente, por ejemplo, la mezcla de tinción está entre aproximadamente 40° C y aproximadamente 43° C y el líquido envolvente está aproximadamente a temperatura ambiente. En aún otra materialización, en el momento de la introducción de la mezcla de tinción y del líquido envolvente, la mezcla de tinción está a menor temperatura que el líquido envolvente.

Citometría de flujo Una materialización de la invención actual emplea tecnologías originales en citometría de flujo para analizar y separar espermatozoides. Con referencia a las figuras 2 y 3, una materialización de un sistema de citometría de flujo de la invención actual se designa en su totalidad por la referencia número 1. Como se mostrará, el sistema de citometría de flujo 1 sirve para clasificar y separar partículas, tales como espermatozoides, de acuerdo con las características elegidas. En general, el sistema 1 consta de un suministro 79 3 de líquido de transporte 17 con las partículas a separar, un suministro 7 de líquido envolvente 19, el equipo de citometría de flujo con capacidad de separación, designado en forma general 9 y un sistema dispensador de líquido 15 que agrega a, presión los líquidos de transporte 17 y envolvente 19 de sus recipientes respectivos 3, 7 al equipo de citometría de flujo 9. El equipo de citometría de flujo 9 está adaptado para recibir a los líquidos de transporte 17 y envolvente 19, para combinarlos y crear una corriente de líquido a presión 21, para dirigir la corriente 21 que transporta las partículas a través de un haz enfocado de radiación electromagnética 25 (por ejemplo, un láser ultravioleta) y para analizar la radiación electromagnética 31 emitida (por ejemplo, luz fluorescente) por las partículas que pasan a través del haz enfocado 25. El equipo 9 también sirve para dividir la corriente 21 en gotitas 33 que contienen las partículas a evaluar y para separar las gotitas 33 basándose en las mediciones antes mencionadas según una o más características de las partículas contenidas en las gotitas 33. Aunque esta invención se puede usar para analizar y preferentemente separar cualquier tipo de partícula, la aplicación particular es la separación de células según una o más características deseadas (por ejemplo, tamaño, contenido de ADN, forma, densidad, secuencia genética, etc.). Esta invención es especialmente adecuada para separar espermatozoides animales para uso comercial en la industria de la producción pecuaria para inseminación artificial in vivo o in vitro, como se discute con más detalle más adelante. 80 Método v equipo de separación monocanal Equipo de citometría de flujo El equipo de citometría de flujo que se muestra en la figura 3 consta de un sistema de boquillas, designado en forma general 101, para dispensar una corriente de líquido 21 que contiene las partículas (por ejemplo, espermatozoides teñidos) a presión a través del orificio de la boquilla 03 con las células prácticamente en fila india y, en el caso de espermatozoides, con las cabezas asimétricas de los espermatozoides prácticamente en la orientación deseada, como se describirá. Como en los sistemas convencionales de separación de gotitas por citometría de flujo, se coloca un transductor 105 opuesto al orificio de la boquilla 03 para introducir energía acústica en la corriente de líquido 21 que hace que la corriente 21 se divida en gotitas 33 que contienen una célula cada una, en un sitio de "división de gotitas" 107 separado del orificio de la boquilla 103. El sistema 1 también incluye un sistema óptico, designado en forma general 109, para enfocar un haz de radiación electromagnética 25 (por ejemplo, luz láser ultravioleta o visible de 350 a 700 nm) en la corriente de líquido 21 en un sitio de "interrogación" 115 que, en la materialización descrita, se encuentra entre el orificio de la boquilla 103 y el sitio de división de gotitas 107. Por lo tanto, la materialización descrita es un sistema de chorro en aire. En otras materializaciones, el sitio de interrogación 107 podría estar dentro el orificio de la boquilla 103 o antes del orificio 103. De todas maneras, las células se 81 adaptan para pasar a través del haz de luz 25 en el sitio de interrogación 107, lo que ocasiona la excitación de un colorante químico (u otro medio indicador) en las células que causa la emisión de fluorescencia 31 con una longitud de onda diferente a la del haz 25 (por ejemplo, si el haz incidente 25 tiene una longitud de onda de entre 350 y 370 nm, la emisión de fluorescencia 31 puede tener una longitud de onda cercana a 460 nm). Hay un fotodetector 117 que sirve para detectar estas emisiones 31 y convertirlas en señales eléctricas que se procesan y se usan para clasificar las células según las características seleccionadas, como por ejemplo el contenido de cromosoma X o Y de los espermatozoides. El equipo de citometría de flujo 9 además contiene un sistema de separación, designado en forma general 119, para separar las gotitas 33 en diferentes grupos o poblaciones (por ejemplo, dos poblaciones 123, 125) de acuerdo con la clasificación de las células contenidas en las gotitas 33 y un sistema de recolección, designado en forma general 2201 (fig. 2), para recoger las gotitas 33 y mantener la separación de las diferentes poblaciones 123, 25. El funcionamiento del sistema 1 está controlado por un procesador 131, como por ejemplo un microprocesador u otro control y/o procesador digital o analógico, o combinaciones de ellos, que controla las diversas funciones de los componentes del sistema 1 de una forma que se describirá. Resulta importante destacar, que el procesador 131 también recibe la información del análisis de partículas para controlar la salida del sistema 1 basándose en estrategias de control y separación escogidas que incluyen 82 diferentes parámetros, incluida la pureza deseada de una de las poblaciones de partículas separadas, la cantidad aceptable (o porcentaje) de partículas deseadas en una de las poblaciones comparada con la cantidad (o porcentaje) de partículas deseadas en una o más de las otras poblaciones y otros parámetros que se tratarán más adelante. Los diversos componentes del sistema 1 se describen en detalle a continuación.

Sistema de boquilla Con referencia a la figurs 4 y 5, el sistema de boquilla 101 consta, en una materialización de ejemplo, de un cuerpo de flujo por lo general cilindrico 133 con orificio longitudinal central 135 y una boquilla 137 en el cuerpo de flujo 133 que tiene un cuerpo de boquilla en forma de embudo 139. A través del cuerpo de la boquilla 139 se extiende un pasaje 141 coaxial con el orificio 135 en el cuerpo de flujo 133 y termina en el orificio de la boquilla antes mencionado 103 en el extremo delantero de la boquilla 137. El cuerpo de la boquilla 139 tiene una perforación roscada por dentro 145 en su extremo posterior donde cabe la proyección o perno roscado 149 que está en el extremo delantero del cuerpo de flujo 33 y sirve para conectar en forma desmontable la boquilla 137 al cuerpo de flujo 133, dicha conexión se sella con una junta tórica 55. Se entenderá que la boquilla puede conectarse en forma desmontable al cuerpo de flujo de otras maneras o, alternativamente, las partes podrían conformar íntegramente una sola pieza. 83 Las partículas son dispensadas a la boquilla 137 mediante un conducto 157 ubicado coaxialmente con el orificio 135 del cuerpo de flujo 133. El diámetro externo del conducto 157 es menor que el diámetro interno del orificio 135 de manera que se forma el espacio anular 167 alrededor del conducto 157. En una materialización particular, el conducto 157 es una aguja tubular (por ejemplo, una aguja 16-GA. con un diámetro interno de 0.01 pulgadas (0.0254 cm)) con un extremo frontal que se extiende dentro del orificio 145 en la parte trasera de la boquilla 137. El extremo posterior del conducto 157 está conectado al sistema dispensador de líquido 15 para el ingreso del líquido de transporte 15 (por ejemplo, una mezcla de tinción que contiene espermatozoides) al conducto 157. El espacio anular 167 que rodea al conducto 157 se conecta mediante un orificio radial 173 en el cuerpo de flujo 133 al sistema dispensador de líquido 15 para el ingreso del líquido envolvente 19 al espacio anular 167. Como se muestra en las figuras 3 y 5, puede existir un segundo orificio radial opcional 183 en el cuerpo de flujo 133 que conecta el espacio anular 167 con otra línea (que no se muestra) para el ingreso de más líquido envolvente 19 a la boquilla 137. Como en los sistemas convencionales de citometría de flujo, el líquido envolvente 19 se introduce en el espacio anular 167 que rodea el conducto 157. La velocidad del líquido envolvente 19, a medida que fluye por la punta del conducto 157, es mucho mayor que la velocidad del líquido de transporte 17 que sale del conducto 157, de manera que el líquido de transporte 17 y las células (por ejemplo, espermatozoides) ahí contenidas son 84 aceleradas por el líquido envolvente 19 hacia el orificio 103 de la boquilla 137. Esta aceleración sirve para espaciar las células por lo general en una disposición de fila india para el análisis por separado con el sistema óptico 109. El líquido envolvente 19 rodea el líquido de transporte 17, lo que da como resultado que la corriente de líquido 21 tenga un núcleo central 189 de líquido de transporte 17 y una envoltura exterior coaxial 191 de líquido envolvente 19 que rodea al núcleo central 189 (ver la figura 6). Según será comprendido por los técnicos en citometría de flujo, el flujo laminar y el enfoque hidrodinámico del núcleo central 189 tiende a confinar las partículas en el centro 189, con poca mezcla entre el líquido envolvente 19 y el líquido de transporte 17 en la boquilla 137. Además, el núcleo central 189 permanece esencialmente intacto dentro de la envoltura 191 a medida que la corriente 21 se mueve a través del sistema de boquilla 101 , hasta que se forman las gotitas 33 en el sitio de división 107. Este tipo de flujo coaxial es particularmente conveniente para citometría de flujo, ya que las partículas a analizar quedan confinadas en el núcleo relativamente estrecho 189 de la corriente. Como resultado, un haz de luz 25 enfocado en el centro o núcleo 189 de la corriente 21 iluminará las partículas de manera que pueden analizarse prácticamente una por una. Al encerrar el núcleo 189 en un diámetro suficientemente estrecho, se puede obtener una iluminación más uniforme de las partículas que están en el líquido del núcleo 189. Para obtener buenos resultados analíticos, el diámetro recomendado del núcleo que contiene las partículas debe estar en un intervalo de 7 a 20 micrómetros y mejor si está en un intervalo de 7 a 14 85 micro-metros. El diámetro de la corriente central 189 puede aumentar o disminuir si se ajusta la velocidad de ingreso del liquido de transporte 17 respecto a la velocidad de ingreso del líquido envolvente 19.

Orientación de las células Para optimizar los resultados analíticos, es conveniente que las partículas que tienen forma asimétrica estén en la orientación deseada cuando pasan a través del haz de luz del sistema óptico. Como saben los técnicos de la profesión, la emisión de fluorescencia de las partículas asimétricas tiende a ser anisotrópica (es decir, la intensidad de la emisión no es uniforme en todas las direcciones). Como se usa aquí, el término "orientación deseada" significa una orientación que permite que el sistema de procesamiento discrimine entre células que tienen diferentes características con una exactitud en un intervalo entre 70% y 100%, mejor si es en un intervalo entre 80% y 00%, mejor aun en un intervalo entre 90% y 100% y lo mejor es que sea, de 95% o mayor. Para ilustrar el punto, en las figuras 6 y 7 se muestra un espermatozoide bovino 201. Habitualmente, la célula tiene una cabeza en forma de paleta 205 con caras opuestas anchas y relativamente planas 207 y bordes estrechos 209, un núcleo 2 3 en la cabeza 205 que contiene la masa de ADN cromatínico de la célula y una cola 215 que se extiende desde la cabeza 205 y proporciona la motilidad necesaria para una fecundación efectiva. El espermatozoide bovino promedio 201 tiene una cabeza 219 de 86 cerca de 8 pm de longitud y aproximadamente 4 µ?t? de ancho 221 y una longitud total 223 desde el extremo de la cabeza hasta la punta de cola de aproximadamente 100 \sm. En el espermatozoide bovino promedio 201 , el núcleo 213 ocupa la mayor parte del volumen de la cabeza y es apenas más pequeño que ésta 205. De manera que la longitud del núcleo 217 es casi igual a la de la cabeza 219, cerca de 8 µ?t? de longitud. Se ha observado que en el bovino, el cromosoma X o Y del espermatozoide 201 se ubica en la región del núcleo 225 (fig. 6), debajo e inmediatamente adyacente a la línea media longitudinal o ecuador 211 o centro de la cabeza 205. Más específicamente, esta región subecuatorial 225 se extiende no más de aproximadamente 20% de la longitud del núcleo 217 en la mitad inferior (hacia la cola 215) del núcleo 213, aún más específicamente no más de aproximadamente entre 10 y 15% de la longitud del núcleo 217 en la mitad inferior del núcleo 213 y todavía más específicamente a no más de aproximadamente 1.0 a 1.5 µ?? debajo del ecuador 21 1 del núcleo 213. Cuando los espermatozoides pasan a través del haz de excitación 25, es conveniente que las células formen prácticamente una sola fila y que la cabeza 205 de cada célula 201 esté orientada en forma similar para reducir la variabilidad de orientación entre una célula y otra y así proporcionar una medida más uniforme de las células. También se desea que las células tengan una orientación que permita la discriminación exacta entre las células X y las Y. Es recomendable que esta orientación sea una donde el largo del espermatozoide 201 esté alineado de forma general con la dirección 87 del flujo 227 (la cabeza hacia adelante (se muestra en la fig. 6) o la cabeza hacia a atrás) y donde la cabeza 205 del espermatozoide 201 rote en su eje longitudinal de manera que la cabeza 205 caiga dentro de la envolvente angular 229 en el cual la iluminará el haz de luz 25 del sistema óptico 109 en una de las caras anchas 207 de la célula 201 en general por el lado ancho, como se muestra esquemáticamente en la figura 7, más que en el borde angosto 209 de la célula. Preferentemente, la envolvente 229 que define la orientación deseada se genera por la rotación de un espermatozoide 201 en un intervalo R1 relativo al plano P que es perpendicular al haz de luz incidente 25, como se ve en una sección transversal respecto a la corriente 21. El intervalo R1 está preferentemente entre 0 y 90 grados, mejor si está entre 0 y 60 grados y aún mejor si está entre 0 y 30 grados. La boquilla de la invención actual está configurada para lograr esta orientación deseada con una exactitud de hasta 90% o más. La tolerancia para la orientación del espermatozoide (es decir, el tamaño de la envolvente 229 definido por el intervalo angular R1) está relacionada con la abertura numérica de la lente usada para captar la emisión de fluorescencia 31 de los espermatozoides. En la materialización mostrada en la figura 7, por ejemplo, el sistema óptico 109 tiene un volumen de detección 579 para la emisión de fluorescencia 31 definido por un ángulo sólido de 55 grados. Cuando la orientación rotacional de una cabeza de espermatozoide 205 está fuera de la envolvente 229 definida por R1 cuando el espermatozoide pasa a través del haz 25, se obtendrá una emisión de 88 fluorescencia relativamente más intensa 31 de un borde 209 de la cabeza del espermatozoide 205 en el sistema óptico 109, y esto impedirá que el procesador 131 pueda correlacionar la intensidad de la emisión de fluorescencia 31 con el contenido de cromosomas X o Y del espermatozoide 201. Sin embargo, el sistema óptico 109 no capta las emisiones de fluorescencia 31 relativamente más intensas del borde angosto 209 de la cabeza del espermatozoide 205 si la orientación rotacional de la cabeza del espermatozoide 205 está dentro de la envolvente 229 cuando pasa por el sitio de interrogación 115. Por lo tanto, en la materialización mostrada en la figura 7, la orientación del espermatozoide no produce la detección de las emisiones de fluorescencia relativamente más intensas de los bordes en tanto los bordes estrechos 209 de la cabeza del espermatozoide 205 se encuentren dentro del ángulo R1. El ángulo sólido del volumen de detección 579 puede disminuirse si se usa una lente con una abertura numérica más pequeña, lo que aumenta el ángulo R1 y la tolerancia sobre la orientación del espermatozoide. Sin embargo, esto también disminuye el número de fotones que alcanzan el sistema óptico 109, lo que puede repercutir en la medida de la emisión de fluorescencia 31 ya que reduce la intensidad de las emisiones 31 detectadas por el fotodetector. Asimismo, si el sistema óptico 109 capta la emisión de fluorescencia 31 con una lente de abertura numérica mayor para obtener mayor intensidad de la emisión de fluorescencia detectada por el fotodetector, entonces la tolerancia sobre la orientación del espermatozoide disminuye. Por lo tanto, al diseñar un sistema de la invención actual, se necesita lograr un 89 equilibrio entre la tolerancia sobre la orientación de los espermatozoides y la abertura numérica de la lente. El equilibrio óptimo dependerá de la capacidad de orientación y la sensibilidad óptica del sistema. En una materialización recomendada, por ejemplo, se usa una lente con una abertura numérica de 0.65.

Diseño de la boquilla En una materialización, como se muestra en las figuras 8 y 9, el interior 231 del cuerpo de la boquilla 139 corriente debajo de la perforación 145 tiene una superficie interna 233 que comprende la primera, la segunda y la tercera región 235, 237, 239 con inclinación axial que aceleran progresivamente la velocidad de la corriente de líquido 21 en la dirección corriente abajo hacia el orificio de la boquilla 103. Como se señaló anteriormente, esta aceleración sirve para espaciar las partículas (por ejemplo, células) en la corriente 21 de manera que adquieran una formación general de fila india para que se puedan analizar prácticamente una por una. Al menos dos de estas regiones y preferentemente las tres 235, 237, 239, tienen en general secciones transversales elípticas (ovales) tomadas en ángulo recto respecto al eje longitudinal 247 de la boquilla 137, como se muestra en las figuras 9A-9J. La superficie interna 233 del cuerpo de la boquilla 139 tiene también una cuarta región 249, no estrechada, corriente abajo después de las tres primeras regiones 235, 237, 239 e inmediatamente corriente arriba del orificio de la boquilla 103 que, en una materialización, está 90 formada en un orificio de otra pieza 255 asegurada con una rosca interna 257 en el frente del cuerpo de la boquilla 139. En una materialización, las formas transversales en general elípticas de la primera 235 y segunda 237 regiones están orientadas básicamente en la misma dirección para definir una primera zona de torsión 259 y la forma transversal por lo general elíptica de la tercera región 239, que conforma la segunda zona de torsión 261 , está orientada con un ángulo (por ejemplo, aproximadamente 90 grados) respecto a las secciones transversales en general elípticas de las regiones primera 235 y segunda 237. La orientación es tal que la superficie interna 233 del cuerpo de la boquilla 139 aplica fuerzas de torsión a la corriente de líquido 21 y de ese modo tiende a orientar los espermatozoides 201 en la orientación antes descrita a medida que pasan a través del orificio de la boquilla 103. Preferentemente, la primera zona de torsión 259 tiene una longitud axial 273 de 3.0 a 4.5 mm, preferentemente cerca de 3.6 mm y las regiones estrechadas primera 235 y segunda 237 que conforman la zona 259 tienen aproximadamente las mismas longitudes axiales 275, 277 (por ejemplo, cerca de 1.8 mm). La segunda zona de torsión 261 tiene una longitud axial 279 de 3.5 a 5.0 mm, preferentemente cerca de 4.45 mm. La cuarta región 249 tiene preferentemente una forma en general cilindrica. Cada una de las secciones transversales en general elípticas A-D (fig. 8) en los límites de las regiones primera 235, segunda 237 y tercera 239, tienen unas dimensiones de ejemplo de eje mayor y eje menor que se muestran en la figura 8 y en el cuadro 1 a continuación. 91 CUADRO 1 Se entenderá que las dimensiones anteriores son ejemplos y que otras dimensiones y formas también podrían ser apropiadas. Funcionalmente, los cambios en el cociente entre los diámetros mayor y menor y las diferentes orientaciones de las formas elípticas de las regiones, crean fuerzas laterales que actúan sobre cada célula 201 y aplican una fuerza de torsión 271 que tiende a rotar la célula 201 sobre su eje longitudinal para que sus caras anchas 207 se alineen con el eje menor en la primera zona de torsión 259 y a medida que la célula gira levemente (por ejemplo, 90 grados) se alinee con el eje menor de la segunda zona de torsión 261. Cada una de las superficies estrechadas 235, 237, 239 sirve también para acelerar la corriente 21 (y las células) que fluye a través de la boquilla 101. En una materialización, la aceleración aumenta más gradualmente en la primera 235 y tercera 239 región y más rápidamente en la segunda 237. Nuevamente a modo de ejemplo, el estrechamiento de la primera región 235 puede ser entre aproximadamente 11 y 14 grados; el estrechamiento de la segunda región 237 puede ser entre aproximadamente 42 y 48 grados; y el estrechamiento de la tercera región 239 puede ser entre aproximadamente 8 y 12 grados. El cuerpo 92 de la boquilla 139 está formado con un material adecuado como puede ser plástico moldeado (ABS) o metal. La pieza del orificio 255 (fig. 8) está formada con un material preferentemente duro y resistente al desgaste, como el zafiro, que se puede trabajar a máquina o formar de otro modo con dimensiones precisas. La propia pieza del orificio 255 tiene, en una materialización, una superficie cónica corriente arriba 309 de sección transversal por lo general circular cuyo diámetro disminuye de aproximadamente 0.92 mm a aproximadamente 0.060 mm y tiene una longitud axial 317 de aproximadamente 0.54 mm y un ángulo de estrechamiento de aproximadamente 39 grados. La pieza del orificio 255 también tiene corriente abajo una superficie por lo general cilindrica 315 con un diámetro de aproximadamente 0.060 mm y una longitud axial 327 de aproximadamente 0.36 mm. Estas dimensiones son sólo ejemplos, y se comprenderá que la pieza del orificio 255 puede tener otros tamaños y formas. Por ejemplo, la forma de la superficie corriente arriba 309 puede tener por lo general una sección transversal elíptica (oval) y el diámetro del orificio 103 en el extremo corriente abajo de la boquilla 137 puede tener entre 40 y 100 micrómetros o más. Se recomienda que el tamaño del orificio 103 sea tal, que las células salgan de la boquilla 101 básicamente en fila india dentro del núcleo 189 de la corriente 21 y prácticamente en la orientación deseada, como ya se describió. Por ejemplo, en el caso de los espermatozoides, se ha encontrado que es adecuado un orificio 103 con un diámetro de aproximadamente 60 a 62 micrómetros en el extremo corriente abajo. 93 Preferentemente, el orificio de la boquilla 103 sirve para acelerar aún más la corriente 21 y para darle forma y tamaño a la corriente 21 para obtener los valores óptimos de espaciamiento de las células, orientación de las células y formación de gotitas 33, como se describirá. La velocidad de las células cuando salen la boquilla 137 dependerá de diversos factores, incluida la presión con la que se introduce el líquido envolvente 19 en el sistema de la boquilla 101. A una presión de 20 psi (1.406 kg/cm2), las células saldrán del orificio de la boquilla 103 de la materialización anterior a una velocidad de aproximadamente 16.6 m/s como una corriente por lo general cilindrica 21 que contiene células sustanclalmente orientadas de manera similar en el núcleo 189 de la corriente 21. A una presión del líquido envolvente de 30 psi (2.109 kg/cm2), la velocidad de las células será aproximadamente 20.3 m/s. A diferentes presiones del líquido envolvente 19 varía la velocidad de la corriente 21.

Introducción del corriente central en la zona de torsión Se puede obtener una orientación mejorada de las partículas si se altera el flujo de la corriente de líquido 21 a través de una boquilla orientadora de manera que la corriente central 189 que contiene las partículas a orientar (por ejemplo, espermatozoides) se dirija a lo largo de un camino del flujo, que está al menos en parte desplazado respecto al centro de la boquilla para que las partículas sean sometidas a las fuerzas hidrodinámicas orientadoras generadas por una boquilla mientras se encuentran en una 94 ubicación desplazada respecto al centro de la boquilla. Dirigir la corriente central 189 a lo largo de un camino de flujo desplazado también puede mejorar la orientación de las partículas en una boquilla convencional (es decir, una sin zonas de torsión). En muchas boquillas, se puede determinar que una posición dada está desplazada del centro de la boquilla porque no se encuentra sobre el eje longitudinal de la boquilla. También se puede detectar que una posición particular está desplazada respecto al centro de una boquilla porque está fuera del centro geométrico de la sección transversal de la boquilla a través del cual fluye la corriente de líquido. Se pueden usar varias técnicas para dirigir la corriente central 189 a lo largo de un camino de flujo desplazado respecto al centro de la boquilla. Por ejemplo, puede colocarse un deflector orientador en la boquilla para desviar la corriente central hacia un lado de la boquilla. De igual manera, el conducto 157 que introduce la corriente central 189 que contiene las partículas de la muestra puede reubicarse desde la posición convencional en el centro de la boquilla a una posición desplazada. Además, se considera que se puede usar un conducto desplazado 157 para introducir la muestra en combinación con un deflector orientador. Las materializaciones de ejemplo del uso de un deflector orientador y un conducto desplazado para introducir la muestra se tratan a continuación. La orientación mejorada de las partículas (por ejemplo, espermatozoides) que se logra mediante el uso de un deflector orientador y/o un conducto desplazado para introducir la muestra 157 puede deberse a 95 varios factores. Un factor es que la deflexión de la corriente central 189 y/o un cambio en el tamaño y la forma de la sección transversal del área de flujo aplican fuerzas hidrodinámicas que tienden a orientar partículas asimétricas. (Kachel, et al., Histochemistry and Cytochemistry, 25(7): 774-80 (1977)). Otro factor es que se ha encontrado que las partículas asimétricas (en particular espermatozoides) tienden a orientarse cuando fluyen en una corriente de líquido en la proximidad de una superficie sólida. Por lo tanto, si se dirige la corriente central 189 de forma que pase cerca de la superficie interna de una boquilla o un deflector, se puede obtener una orientación mejorada de las partículas. Además, se puede usar un deflector y/o conducto de introducción de muestras junto con una boquilla orientadora que aplica fuerzas orientadoras adicionales (por ejemplo, fuerzas de torsión) a las partículas asimétricas. En ese caso, el deflector puede servir para dirigir la corriente de líquido de forma que la corriente central que contiene las partículas a orientar fluya a lo largo de un camino desplazado respecto al centro de la boquilla mientras las partículas están sometidas a las fuerzas de torsión generadas por una o más de las zonas de torsión.

Deflector orientador Las figuras 10 a 13 muestran un ejemplo de deflector orientador, designado en forma general 2001, colocado en la boquilla orientadora 137 ya descrita. Sin embargo, el deflector 2001 se podría usar junto con una boquilla diferente, incluso con una boquilla no orientadora, sin apartarse del alcance de 96 esta invención. El deflector 2001 se coloca en la boquilla corriente arriba del orificio 03 y corriente abajo de la aguja de inyección de muestras 157. Con referencia a las figuras 14 y 15, el deflector comprende una placa def lectora 2003 que se mantiene en posición mediante el soporte del deflector 2005. En la materialización mostrada, la placa deflectora 2003 tiene por lo general forma de L y está construida con un material sustancialmente rígido, duradero y resistente a la corrosión (por ejemplo, acero inoxidable). La placa en forma de L 2003 tiene un tramo ascendente 2007 y un tramo descendente 2009, que se recomienda sean prácticamente perpendiculares entre sí (por ejemplo, dentro de 5 grados de la perpendicularidad). En la materialización del ejemplo que se muestra en los diagramas, los dos tramos 2007, 2009 de la placa en forma de L 2003 se cruzan en una línea 2015 que es perpendicular al eje longitudinal 2017 de la boquilla 137 (fig. 11). Como se muestra en la figura 14, la línea de intersección 2015 también está separada por una corta distancia 2033 (por ejemplo, aproximadamente 0.3 mm) del eje longitudinal 2057 del soporte del deflector 2005. El tramo ascendente 2007 de la placa en forma de L 2003 se extiende desde la línea de intersección 2015 hacia afuera del eje longitudinal 2017 de la boquilla 137 hasta el borde del soporte del deflector 2005, como se muestra en la figura 15. Por lo tanto, el tramo ascendente 2007 presenta un borde curvo 2019 que se adapta a la forma del soporte del deflector 2005. Como se muestra en la figura 14, el tramo ascendente 2007 está inclinado con un ángulo AA de aproximadamente 15 a 25 grados respecto a la perpendicular del eje longitudinal 2057 del soporte del deflector 97 2005. El tramo descendente 2009 de la placa en forma de L 2007 se extiende corriente abajo desde la línea de la intersección 2015 entre los dos tramos 2007, 2009 a una distancia 2025 de aproximadamente 2.0 a 2.5 mm en un ángulo BB de entre aproximadamente 60 y 80 grados respecto a la perpendicular al eje longitudinal 2057 del soporte del deflector 2005. El soporte del deflector 2005 tiene la forma y el tamaño para calzar dentro de la boquilla 137, como se muestra en las figuras 10 a 13. El soporte del deflector 2005 se fabrica preferentemente de un material moldeable (por ejemplo, polipropileno) aunque el soporte del deflector 2005 puede construirse con otros materiales sin apartarse del alcance de la invención actual. El soporte del deflector 2005 que se usa en la materialización del ejemplo, que se muestra en las figuras 14 y 15, generalmente tiene la forma de un caparazón cilindrico de aproximadamente 4.0 a 4.5 mm de largo total 2027. El soporte del deflector 2005 tiene un diámetro extemo 2029 de aproximadamente 5 a 6 mm y un diámetro interno 2031 de aproximadamente 2.5 a 3.5 mm. Si el soporte del deflector 2005 se moldeara, puede proporcionarse un trazado menor (no mostrado) en las superficies del soporte 2005 (por ejemplo, para permitir que el soporte del deflector se extraiga fácilmente de una máquina de moldeo por inyección). El extremo corriente arriba 2035 del soporte del deflector del ejemplo 2005 tiene una superficie inclinada 2037 que tiene el mismo ángulo AA de inclinación que el tramo ascendente 2007 de la placa en forma de L 2003. El tramo ascendente 2007 de la placa en forma de L 2003 se adosa y está apoyada en 98 la superficie inclinada 2037 del soporte del deflector 2005. Los bordes laterales 2039 (figura 15) del tramo descendente 2009 de la placa en forma de L 2003 están parcialmente embutidos (por ejemplo, sostenidos en ranuras) en el soporte del deflector 2005 para mantener la placa deflectora 2003 en una posición en la que el tramo descendente 2009 se extiende por lo general de un lado al otro del soporte del deflector 2005. El borde corriente abajo 2041 del tramo descendente 2009 en la materialización de ejemplo forma una línea recta que es por lo general perpendicular al eje longitudinal 2057 del soporte del deflector 2057. Hay una separación 2049 (figura 14) entre el borde corriente abajo 2041 del tramo descendente 2009 y la superficie cilindrica interna 2051 del soporte del deflector 2005. La separación 2049 proporciona comunicación para el líquido entre el volumen 2053 definido por los tramos 2007 y 2009 de la placa en forma de L 2003 y la superficie cilindrica interna 2051 del soporte del deflector 2003 y el resto del volumen interior 2055 de la boquilla 137. Se recomienda que el soporte del deflector 2005 se coloque dentro de la boquilla con el eje longitudinal 2057 del soporte del deflector 2005 alineado en general con el eje longitudinal 2017 de la boquilla 137 para que placa en forma de L 2003 se mantenga en la posición antes descrita. Es recomendable que la placa deflectora 2003 del ejemplo esté rotacionalmente orientada para que la línea de intersección 2015 entre los dos tramos 2007 y 2009 de la placa 2003 sea paralela a una línea 2059 que corre por el eje mayor de la elipse D, como se muestra en la figura 16. Sin embargo, el 99 deflector 2001 del ejemplo también funciona bien cuando la intersección 2015 entre los dos tramos 2007 y 2009 de la placa en forma de L 2003 es perpendicular a la línea 2059 que corre por el eje mayor de la elipse D, como se muestra en la figura 17. Además, el deflector puede tener cualquier orientación rotacional sin apartarse del alcance de esta invención. Como se muestra en la figura 12, la aguja de inyección de la muestra 157 de la materialización del ejemplo está a una distancia 2061 aconsejada de aproximadamente 0.25 a 1.0 mm corriente arriba del extremo corriente arriba 2035 del deflector 2001. Es mejor si, la aguja de inyección de la muestra 157 está aproximadamente entre 0.55 a 0.65 mm corriente arriba del extremo corriente arriba 2035 del deflector 2001. El soporte del deflector 2005 puede mantenerse en una posición deseada respecto a la boquilla de varias maneras. Con referencia a la figura 14, el extremo corriente abajo 2067 del soporte del deflector 2005 es dentado de manera que se ajusta más adelante corriente abajo en la boquilla 137. El extremo dentado corriente abajo 2067 del soporte 2005 es de forma circular y se adosa a la superficie interna de forma elíptica 233 de la boquilla 137. De manera que el contacto entre la superficie interna 233 de la boquilla 137 y el soporte del deflector 2005 se limita por lo general a dos puntos 2069, como lo muestra la figura 13. Alrededor del soporte del deflector 2005 entre la boquilla 137 y la proyección roscada 149 del cuerpo de flujo 133 (figuras 11 a 13) se colocan dos juntas tóricas 2071 que sellan el sistema de boquilla 101 contra fugas. Las juntas tóricas 2071 pueden ser de Viton® u otro material similar. 100 Las dos juntas tóricas 2071 se comprimen cuando se atornilla la boquilla 137 sobre la proyección roscada 149 para brindar un cierre estanco. En la materialización del ejemplo se usan dos juntas tóricas 2071 porque una sola junta no puede comprimirse dentro del espacio que está entre la boquilla 137 y el cuerpo de flujo 133 debido a la longitud 2027 del soporte del deflector 2005. Podría usarse cualquier número de juntas tóricas o un tipo diferente de sello sin apartarse del alcance de la invención actual, siempre que el número de juntas tóricas u otro tipo de sello se haya elegido para proporcionar un cierre estanco cuando la boquilla 37 se atornilla sobre el cuerpo de flujo 133. Esto dependerá de varios factores, incluido el tamaño y la forma de la boquilla 137, el cuerpo de flujo 133, el soporte del deflector 2005 y las juntas tóricas 2071 , así como del tipo de sello. Las juntas tóricas 2071 también ayudan a sujetar el soporte del deflector 2005 en la posición deseada. Las juntas tóricas 2071 ocupan el espacio alrededor del soporte del deflector 2005, y por lo tanto restringen el movimiento lateral del soporte del deflector 2005 dentro de la boquilla 137. Las fuerzas de fricción entre las juntas tóricas 2071 y el soporte del deflector 2005 también se oponen al movimiento rotacional del soporte del deflector 2005. Cuando la boquilla 37 se ajusta al cuerpo de flujo 133 como se muestra en la figura 12, el extremo corriente abajo 2077 de la proyección roscada 149 del cuerpo de flujo 133, en forma de saliente en esta materialización, está aproximadamente a la misma altura que el extremo corriente arriba 2035 del deflector 2001. Como resultado, el soporte del 101 deflector 2005 queda axialmente cautivo entre el cuerpo de flujo 133 (en el extremo corriente arriba 2035 del soporte del deflector 2005) y la superficie interna 233 de la boquilla 137 (en el extremo corriente abajo 2067 del soporte del deflector 2005). Se pueden usar otros mecanismos de sujeción. En la materialización mostrada en los diagramas, el diámetro interno de la saliente 2079 (figura 12) en el extremo corriente abajo de la proyección roscada 149 es aproximadamente igual al diámetro interno 2031 del soporte del deflector 2005. Los técnicos de la profesión se darán cuenta que el flujo a través del sistema de boquilla 101 permanece laminar a pesar del deflector 2001 dado que la pequeña área transversal por la que deben fluir los líquidos da lugar a un bajo número de Reynolds para el flujo. Como se muestra en la figura 11, el deflector desvía la corriente central 189 y la corriente envolvente 191 fuera del eje longitudinal central 2017 de la boquilla 37 y hacia una superficie interna 233 de la boquilla 137. En una materialización, la corriente central 189 también fluye muy cerca de la superficie interna 233 de la boquilla 137 cuando la corriente central 189 pasa por la transición entre la primera 259 y la segunda 261 zona de torsión. Sin embargo, una fracción 2081 de la corriente de líquido envolvente 191 permanece entre la corriente central 189 y la superficie interna 233 de la boquilla 137 de forma que las partículas de la corriente central 189 no choquen ni entren en contacto con la superficie interna 233 de la boquilla 37. Más lejos corriente abajo en la boquilla 137, las fuerzas hidrodinámicas empujan la corriente central 189 de nuevo hacia el 102 centro de la boquilla 137 (por ejemplo, alineada con el eje longitudinal 20 7 de la boquilla 137). En referencia a las figuras 18A a 18E, el deflector 2001 cambia la forma y reduce el tamaño de la sección transversal de flujo en la boquilla 137. (Por motivos de claridad, las figuras 18A a 18E no muestran la estructura de la boquilla corriente abajo desde el deflector. El área de flujo en cada una de las figuras 18A a 18E se dibuja con línea más gruesa para que se vea claramente.) Corriente arriba desde el deflector 2001 (figura 18A), el área transversal de flujo 2087 es por lo general circular o elíptica. En el extremo corriente arriba 2035 del deflector 2001, el área de flujo empieza a cambiar de una forma circular a una forma por lo general semicircular 2089 en la intersección 2015 de los tramos 2007 y 2009 de la placa deflectora 2003 (figura 18B), aunque otras formas pueden ser adecuadas. Allí, el área transversal del flujo 2089 es más pequeña que el área del flujo 2087 corriente arriba desde el deflector. La figura 18C ilustra el área del flujo 2091 cuando el líquido fluye a través de una parte del soporte del deflector 2005, y la figura 8D ilustra el área del flujo 2093 más adelante corriente abajo en el extremo 2041 del tramo descendente 2009 de la placa deflectora 2003. Se observa que el área del flujo 2093 es un poco más grande que el área del flujo 2091 debido a la orientación angular del tramo descendente 2009 de la placa deflectora 2003. Corriente abajo desde la placa deflectora 2003 (figura 8E) el área de flujo 2094 a través del deflector corresponde con la forma de la superficie interna 2051 del soporte del deflector 2005, que es circular en la 103 materialización que se ilustra. (Otras formas pueden resultar adecuadas.) Corriente abajo desde el soporte del deflector 2005 las zonas de torsión 259 y 261 de la boquilla 137 proporcionan las fuerzas de torsión recomendadas como ya se discutió. Como se muestra en la figura 11, se ha observado que una o más burbujas de aire 2095 pueden quedar atrapadas en el volumen 2053 entre el tramo descendente 2009 de la placa en forma de L 2003 y el soporte del deflector 2005. Además, una parte de una burbuja 2095 puede extenderse a través de la separación 2049 entre el borde 2041 del tramo descendente 2009 y el soporte del deflector 2005. De forma que la burbuja o burbujas de aire 2095 pueden ocupar una parte del área transversal del flujo corriente abajo del tramo descendente 2009 de la placa en forma de L 2003 y quizás afecten el flujo del líquido a través de la boquilla 137. Se ha encontrado que el deflector 2001 del ejemplo funciona bien con o sin burbuja(s) de aire 2095. Por lo tanto, se puede usar un deflector para orientar los espermatozoides sin que participen burbujas y sin apartarse del alcance de la invención actual. Otro deflector orientador de ejemplo, designado en forma general 2097, se muestra en las figuras 19 y 20. El deflector 2097 comprende una placa deflectora 2099 plana y en general semicircular en la boquilla orientadora 137 ya discutida. La placa deflectora 2099 se ubica en la boquilla 137 corriente abajo del conducto de introducción de la muestra 57 y por lo general perpendicular al eje longitudinal 2017 de la boquilla 137. La placa deflectora 2099 tiene un borde curvo 2101 que por lo general se adapta a la 104 curvatura de la superficie interna 233 de la boquilla 137 de manera que no haya una gran separación entre el borde curvo 2101 de la placa deflectora 2099 y la superficie interna 233 de la boquilla 137. La placa deflectora 2099 también tiene un borde recto 2103 que se extiende una corta distancia más allá del eje longitudinal 2017 de la boquilla 137 de manera que se alinea aproximadamente con el diámetro externo 2109 del conducto de introducción de la muestra 157. La placa deflectora 2099 se mantiene en posición por la fricción resultante de la compresión de la placa deflectora 2099 entre una junta tórica 2105, que es similar a las juntas tóricas 2071 descritas anteriormente en relación con el deflector en forma de L 2001 y una saliente o cornisa anular 2107 formada en el interior de la boquilla 137. Como se muestra en la figura 19, el deflector orientador 2099 funciona desviando la corriente de líquido de manera que la corriente central 189 que contiene las partículas a analizar se desplace del eje longitudinal central 2017 de la boquilla 137 durante una parte de su recorrido. Por ejemplo, la corriente central 189 puede dirigirse por un recorrido desplazado respecto al eje longitudinal 2017 de la boquilla 137 cuando fluye a través de la primera zona de torsión 259, así como también al menos una parte de la segunda zona de torsión 261. En consecuencia, las partículas (por ejemplo, espermatozoides) están sometidas a fuerzas de torsión generadas por las zonas de torsión 259 y 261 mientras están en una ubicación desplazada respecto al eje longitudinal central 2017 de la boquilla 137. Los técnicos de la profesión encontrarán que se pueden hacer 105 cambios sustanciales a los deflectores 2001 y 2097 del ejemplo antes descrito sin apartarse del alcance de la invención actual. Todo lo que se necesita es que el deflector se configure para desviar la corriente central 189 y la corriente envolvente 191 hacia una superficie interna de la boquilla o hacer que la corriente central 189 y la corriente envolvente 191 fluyan a través de un área transversal que cambie de tamaño y/o forma. Además, se entiende que la estructura orientadora del deflector puede formar una sola pieza con la boquilla o una sola pieza con la boquilla y el cuerpo de flujo sin apartarse del alcance de la invención actual.

Conducto desplazado de introducción de la muestra La corriente central 189 puede dirigirse por un recorrido desplazado respecto al eje longitudinal central 2017 de la boquilla 137 si se reubica el conducto de introducción de la muestra 157 de su posición convencional en el centro de la boquilla 137 a una posición desplazada. Por ejemplo, la fig. 21 muestra un ejemplo de un sistema de introducción de muestra con la boquilla desplazada 2151 que tiene un conducto de introducción de muestra descentrado 157. Excepto por esto, el sistema de boquilla 2151 es esencialmente igual al sistema de boquilla 101 que se muestra en la fig. 5. La diferencia importante es que el conducto de introducción de la muestra 157 está desplazado respecto al centro de la boquilla 137 de manera que ya no se alinea con el eje longitudinal de la boquilla 2017. De este modo, la corriente central 189 se dirige hacia las zonas 106 de torsión 259 y 261 de la boquilla orientadora 137 por un recorrido desplazado respecto al eje longitudinal 2017. Aunque el ejemplo de sistema de boquilla 2151 mostrado en la figura 21 usa la boquilla orientadora 137 del ejemplo antes descrito, se contempla que el conducto de introducción de la muestra descentrado 157 podría usarse con una boquilla orientadora diferente o con una boquilla no orientadora para orientar las partículas en la corriente central 189.

Montaje y ajuste de boquillas El cuerpo de flujo 133 y la boquilla 137 están montados con una orientación y posición seleccionadas por medio de un soporte de boquilla, designado en forma general 331. En una materialización (figura 22), el soporte 331 comprende múltiples plataformas, incluidas las plataformas lineales primera y segunda 333 y 337 que proporcionan el ajuste lineal del cuerpo de flujo 133 y la boquilla 137 a lo largo de los ejes X e Y 339 y 341, respectivamente; y una tercera plataforma rotatoria 343 que proporciona el ajuste rotacional alrededor de un eje Z 345 que corresponde al eje longitudinal 2017 del cuerpo de flujo 133 y la boquilla 137. Estas plataformas 333, 337 y 343 pueden tener un diseño convencional, hay plataformas adecuadas que se pueden adquirir, por ejemplo, en Newport Corporation de Irvine, CA. En particular, la primera plataforma de movimiento lineal 333 comprende una pieza fija de la primera plataforma (no se muestra) montada en un marco 349, una pieza móvil de la primera plataforma 355 deslizable sobre la primera 107 plataforma fija a lo largo del eje X 339 y un accionador 357, por ejemplo, un tornillo micrométrico, para mover con precisión la pieza móvil de la primera plataforma 355 a una posición seleccionada sobre el eje X. La segunda plataforma de movimiento lineal 337 comprende una pieza fija de la segunda plataforma 359 montada sobre la pieza móvil de la primera plataforma 355, una pieza móvil de la segunda plataforma 361 deslizable sobre la pieza fija de la segunda plataforma 359 a lo largo del eje Y 341 y un accionador 363, por ejemplo, un tornillo micrométrico, para mover con precisión la pieza móvil de la segunda plataforma 361 a una posición seleccionada sobre el eje Y. La plataforma rotatoria (tercera) 343 comprende una pieza fija de la tercera plataforma 365 montada sobre la pieza móvil de la segunda plataforma 316, una pieza móvil de la tercera plataforma 371 montada en forma giratoria sobre la pieza fija de la tercera plataforma 365 para que rote alrededor del eje Z 345 y un accionador 373, por ejemplo, un tomillo micrométrico, para rotar con precisión la pieza móvil de la tercera plataforma 371 a una posición angular seleccionada relativa al eje Z 345. El ajuste en tres dimensiones que brindan estas plataformas 333, 337 y 343 permite que la boquilla 137 y la corriente de líquido 21 que sale del orificio de la boquilla 103 se puedan ubicar con exactitud respecto al sistema óptico 109. La rotación de la boquilla 137 alrededor del eje Z 345 resulta particularmente útil ya que permite que la corriente 21 que sale de la boquilla 137 se rote poner las células (por ejemplo, espermatozoides) orientadas con la boquilla 137 en una posición en la que el haz de luz 25 del sistema óptico 109 caiga en la superficie deseada de las 108 células (por ejemplo, las caras planas 207 de la cabeza del espermatozoide 205), como se ilustra esquemáticamente en la figura 23. Pueden ser adecuados otros soportes de la boquilla. Por ejemplo, también se puede usar un sistema de soporte de boquillas de 4 ejes, que proporcione ajuste lineal a lo largo de los ejes X, Y y Z y ajuste rotacional alrededor del eje Z. Además, puede ser aconsejable usar una o más plataformas con alineación automatizada, como una plataforma de microtraslación controlada por un servomotor o un motor paso a paso (por ejemplo, el número de parte M-110.2DG de Polytech Pl Inc. de Aubum, Michigan). En una materialización que se muestra esquemáticamente en la figura 36, por ejemplo, la boquilla 137 está orientada para dirigir una corriente 21 que contiene células a analizar en una dirección generalmente ascendente. El ángulo 377 entre la dirección de la corriente de líquido 21 y la horizontal está preferentemente en el intervalo entre 5 y 85 grados, mejor si está en el intervalo entre 15 y 75 grados, mejor aún si está aproximadamente entre 30 y 65 grados, todavía mejor si está aproximadamente entre 45 y 60 grados y mejor aún si está aproximadamente entre 50 y 55 grados. Esta orientación es ventajosa ya que el aire atrapado en el sistema de boquilla 101 se puede extraer fácilmente. Además, la velocidad de la corriente de líquido 21 disminuye gradualmente por la fuerza de la gravedad antes que se recolecten las gotitas 33. Se piensa que una desaceleración más gradual de las gotitas 33 es más suave para las células que se analizan y que, en el caso de los espermatozoides, puede tener como resultado una mayor motilidad de los 109 espermatozoides separados después de la recolección. Desde luego, en otras materializaciones de la invención actual, la boquilla 101 se coloca de manera que la corriente de líquido 21 tenga una velocidad principalmente hacia abajo al salir del orificio 103 como es convencional en los citómetros de chorro en aire. Opcíonalmente, los componentes del sistema de boquilla 101 como el cuerpo de flujo 133 y la boquilla 137 se recubren con un material no reflejante y no emisivo (por ejemplo, una pintura oscura opaca o resina epóxica que no emite luz cuando se somete a un láser UV) para reducir cualquier reflejo y/o luz emitida por estos elementos 133, 137 que de otro modo podrían causar ruido en la señal o tener otros efectos adversos en el sistema óptico 109.

Transductor v formación de gotitas El transductor 105 que introduce la energía en la corriente de líquido 21 comprende, en una materialización, un anillo 379 que contiene un elemento piezoeléctrico (no se muestra) fijo alrededor del cuerpo de flujo 133 del sistema de boquilla 101 (figuras 3 y 5). El transductor es de diseño convencional, como el que puede adquirirse en Beckman Coulter, Inc. como la parte N° 6858368. El transductor tiene terminales 383 para conectarlo con una fuente adecuada de energía acústica para que la energía llegue a la corriente de líquido 21 con una frecuencia que cause su división en gotitas 33 en el sitio de división 107 corriente abajo de la boquilla 137 a una distancia d 110 (figura 24). Como comprenderán los técnicos en citometría de flujo, las características de la formación de gotitas están gobernadas por la Ecuación 1 : (V = ??) Ecuación 1 donde V es la velocidad de la corriente 21; f es la frecuencia aplicada a la corriente de líquido 21 a través de la boquilla 137; y ? es la "longitud de onda" o la distancia entre las gotitas 33. Es un principio conocido de la citometría de flujo que las gotitas 33 se formarán con un patrón regular y que la distancia entre gotitas 33 será 4.54 veces el diámetro de la corriente 21. Dado que el diámetro D de la corriente 21 cerca de la boquilla 137 corresponde por lo general al diámetro del orificio de la boquilla 103 en su extremo corriente abajo, la frecuencia en que la corriente 21 (y la boquilla 137) deben vibrar para formar las gotitas 33 se puede calcular fácilmente con la Ecuación 2: (f = V/4.54 D) Ecuación 2 El transductor 105 se puede hacer funcionar para generar en el intervalo de 30000 a 10000 gotitas 33 por segundo. Por ejemplo, el transductor 105 puede generar entre 50000 y 55000 gotitas por segundo. Si se supone que la frecuencia es de 55000 ciclos por segundo (55 kHz), y además se supone que la concentración de células en la corriente 21 es tal que las células salen de la boquilla 137 a una velocidad prácticamente igual de 55000 células por segundo, entonces, habrá en promedio una célula por gotita 33. (En realidad, algunas gotitas 33 no contendrán ninguna célula, algunas contendrán una célula y algunas contendrán más de una célula.) Desde luego, se pueden cambiar diversos factores para variar este promedio, 111 incluido un cambio en la frecuencia (f), el diámetro de la corriente 21 (orificio 103) (D) y la velocidad de la corriente 21 (V). En condiciones ideales, estos factores deben ajustarse para reducir la tensión a la que se somete a las células durante el transcurso del proceso, especialmente en el caso de los espermatozoides donde la preservación de la motilidad es importante.

Sensor de división Con referencia a la figura 2, se puede usar un sensor de división 389 para determinar la ubicación en la cual la corriente 21 comienza a formar gotitas libres 33 (es decir, el sitio de división 107). Dado que la carga de una gotita 33 será la misma carga de la corriente 21 inmediatamente antes de que la gotita 33 se desprenda de la corriente de líquido 21 , el procesador 131 controla la separación de gotitas 33 al aplicar selectivamente cargas eléctricas a la corriente 21, controlando de ese modo selectivamente la carga de cada gotita 33. Es deseable que la ubicación del sitio de división de gotitas 107 sea conocida y estable de modo que la carga aplicada por el procesador 131 en respuesta a la clasificación de las partículas de la corriente 21 coincida con la llegada de dichas partículas al sitio de división de gotitas. La ubicación y estabilidad del sitio de división 107 variará dependiendo de varios factores incluidos la viscosidad de la corriente 21 , la tensión superficial del líquido y la amplitud de vibración del transductor 105. Se presenta un análisis detallado de las variables que afectan a la ubicación y estabilidad del sitio de división de 112 gotitas en "Estabilidad del sitio de división en un separador celular de alta velocidad," de Petersen y van den Engh, Cytometry 56A: 63-70 (Diciembre 2003), que se incorpora aquí en su totalidad como referencia. Se puede variar la amplitud del transductor 05 monitoreando el sitio de división 107 o hacer otros ajustes para mantener el sitio de división 107 dentro de un tramo dado. De forma que, como se muestra en las figs. 26 y 27, se puede proporcionar una cámara de video 412 y un estroboscopio 413 para monitorear el sitio de división 107. Se recomienda colocar el estroboscopio 413 detrás de una máscara 414A (por ejemplo, una cubierta con una pequeña apertura en forma de rendija 414B) para limitar la cantidad de luz producida por el estroboscopio 413 que ingresa al sistema óptico 109. El método tradicional para controlar el sitio de división 107 incluye un operador humano que visualice una imagen del sitio de división de gotitas 107 en la pantalla de un televisor y ajuste manualmente la amplitud del transductor u otras variables del sistema para controlar la ubicación del sitio de división de gotitas 07. En general, se usa un sensor de división de la invención actual con cualquier corriente continua de líquido que se divida en gotitas en un sitio de división. (En la materialización de la fig. 2, el sensor de división 389 está ubicado más allá de la boquilla 137 y del sitio de interrogación 15.) En la fig. 25 se muestra esquemáticamente un ejemplo de sensor de división 389. Se coloca una fuente de luz 393 en un lado de la corriente 21 para iluminar la corriente 21 dentro del tramo determinado en el que se mantendrá el sitio de 113 división 107. Un arreglo de fotodiodos lineal 395 colocado del otro lado de la corriente 21 se adapta para orientarse a lo largo de un eje prácticamente paralelo a la corriente 21. Como resultado, el arreglo de fotodiodos 395 detecta la luz de la fuente de luz 393 que pasa a través de las gotitas 33 y produce señales de salida que corresponden a la luz detectada. Las señales de salida se procesan para determinar la posición del sitio de división 107. Por ejemplo, se pueden digitalizar las señales de salida e ingresarse en el procesador 131 para su procesamiento. Alternativamente, como se muestra en ia fig. 25, la fuente de luz 393 puede ser un LED u otra fuente que emita en una región de! espectro visible cercana al infrarrojo. La luz que pasa entre las gotitas 33 se aumenta con una lente 401 y se dirige hacia un arreglo de fotodiodos lineal 395 de 8 por 1. Cada fotodiodo genera una corriente proporcional a la intensidad de la luz que incide sobre él. Esta corriente se introduce en 8 circuitos amplificadores operacionales de corriente-voltaje 405. El voltaje de salida de los amplificadores operacionales se acopla mediante CA en 8 amplificadores de seguimiento/control 407. La señal de seguimiento/control 409 usada por los amplificadores se toma del transductor 105. La salida del amplificador de seguimiento/control se introduce al convertidor AID 411 de un microprocesador (MPU) 391. Los valores digitales calculados por el MPU 391 se proporcionarán al microprocesador de control del sistema 131. El microprocesador de control del sistema 131 puede usar una tabla de revisión y/o un algoritmo para convertir entre el sitio de división 107 el ajuste de la 114 desviación y el voltaje en el transductor 105. Alternativamente, la salida del PU 391 puede ser una señal analógica como un voltaje de CD con una amplitud correspondiente a un cambio en la amplitud de vibración del transductor 105. El voltaje de CD se puede aplicar a la entrada del amplificador de alto voltaje que maneja el transductor de gotitas 105 para variar la amplitud de la vibración. De esta forma, el procesador 391 constituirá un control para recibir la señal de salida del arreglo de fotodiodos 395 y proporcionar una señal de ubicación correspondiente a la ubicación del sitio de división 107. Dicho procesador 391 también constituirá un control para recibir la señal de salida que indica la posición del sitio de división 107 de las gotitas 33 y variar la operación del transductor 105 como una función de la posición del sitio 107.

Sistema óptico de epiluminación El sistema óptico 109 está adaptado para enfocar un haz de radiación electromagnética 25 (por ejemplo, un haz láser) en la corriente de líquido 21 como un haz fino, para que las células a analizar pasen a través del haz. El haz 25 puede ser luz láser de la parte visible o ultravioleta del espectro, por ejemplo, con una longitud de onda de aproximadamente 350 a 700 nm, aunque se pueden usar otras longitudes de onda. La longitud de onda de la luz láser se puede seleccionar de manera que excite un fluoróforo particular usado para analizar las partículas. Por ejemplo, si el sistema óptico 109 se usa para analizar espermatozoides teñidos con Hoechst 33342, la longitud de 115 onda se puede elegir en el intervalo de aproximadamente 350 a 370 nm. La potencia de salida del láser puede variar entre 50 y 300 mW. Por ejemplo, los espermatozoides se pueden analizar con un láser de 200 mW, Con referencia a las figs. 28 a 34, el sistema 109 es un sistema de epiluminacion 415 que comprende un instrumento, designado en general 417, que tienen un eje óptico longitudinal 419. Como se emplea aquí, el término "epiluminacion" significa un sistema óptico donde al menos una parte de la emisión de fluorescencia de las células que pasan a través del haz de luz se dirige de vuelta a través del instrumento óptico a lo largo del mismo eje que el haz enfocado 25, pero en dirección opuesta. Este tipo de sistema es ventajoso ya que se necesita un solo sistema óptico, que incluye un sólo fotodetector 117, a diferencia de los sistemas convencionales que detectan fluorescencia hacia adelante y lateral y que usan dos o más fotodetectores. Sin embargo, se entiende que aunque se prefiere un sistema de epiluminacion, muchos aspectos de esta invención se pueden aplicar independientemente del tipo de sistema óptico que se use. En una materialización, el instrumento de epiluminacion 417 comprende una base rectangular 429 donde se apoyan los diferentes elementos ópticos. Estos elementos ópticos se describen más adelante, con ejemplos específicos de las dimensiones pertinentes, distancias focales y los números de parte. Como comprenderán los técnicos de la profesión, esta información es sólo un ejemplo y los elementos ópticos alternativos se pueden usar sin apartarse del alcance de esta invención. 116 En referencia a las figs. 28 a 34, los elementos ópticos incluyen un filtro reflector 431 que refleja un haz colimado 25 de luz de un láser o una lámpara de arco 435, por ejemplo, mediante un conjunto de lentes de acondicionamiento 437 montados en una abertura 439 en la pared lateral 441 de una cámara dicroica 443 que se extiende desde la base 429. En esta materialización particular, el conjunto de lentes de acondicionamiento 437 comprende un retén anular 445, un filtro de densidad neutra 447, una lente cilindrica 449, un soporte de la lente 455 y una contratuerca 457. La lente cilindrica 449 introduce una divergencia unidimensional en el haz 225 y lo dirige hacia elementos ópticos (descritos más adelante) que configuran el haz para darle la sección transversal deseada 459, preferentemente por lo general elíptica. A modo de ejemplo, la lente cilindrica 449 puede ser una lente planoconvexa que tiene una distancia focal de 16 mm. Opcionalmente se puede instalar un expansor de haz (no mostrado) en el instrumento 417 para permitir el ajuste de la forma del haz elíptico 459. El filtro reflector 431 está montado con sujetadores 461 en la cara angular 465 de un soporte del filtro 463 que tiene aberturas 467 en él para permitir que el haz 25 se refleje en el filtro 431 hacia la óptica del instrumento 417. El soporte 463 está sujeto a una plataforma lineal 469 móvil a lo largo del eje X 471 respecto a un soporte de plano fijo 473 asegurado a la base 429 y a la cámara dicroica 443, la plataforma 469 es móvil por los medios adecuados 475 (por ejemplo, un tornillo micrométrico) para ubicar con exactitud el soporte 463 y el filtro reflector 431 para reflejar el haz 25 en el 117 instrumento 417 en la posición adecuada. Un filtro dicroico 477 se sostiene con sujetadores 479 en un marco 485 montado en la cámara dicroica 443 y sirve para reflejar el haz configurado 25 hacia adelante 487 a lo largo de un eje 489 que, en esta materialización particular, corresponde al eje óptico longitudinal 419 del instrumento. El haz 25 pasa a través del conjunto de lentes de enfoque 491 que enfoca el haz 25 en la corriente de líquido 21 como un haz estrecho con la ya mencionada sección transversal generalmente elíptica 459 (fig. 6) con el eje mayor de la elipse colocado por lo general perpendicular a la dirección del flujo 227 de la corriente 21. A medida que cada célula pasa a través del haz 459, el colorante fluorescente (u otro agente indicador) de la célula se activa para emitir la luz fluorescente 31 (fig. 23). En el caso de espermatozoides teñidos con un colorante fluorescente selectivo de ADN, las células X tienen más ADN que las células Y, incluyen más colorante fluorescente y emiten una señal más intensa que las células Y (por ejemplo, 3.8%), lo que proporciona una base para discriminar y separar células, como se describirá. El conjunto de lentes de enfoque 491 incluye, en una materialización, un adaptador para microscopio 501 montado en una abertura 503 en la pared frontal 505 de la cámara dicroica 443, un cilindro de enfoque 507, un par de cilindros de montura de la lente 509 y la propia lente 511, que puede ser una lente plano-convexa de 12.5 mm de diámetro con una distancia focal de 16 mm, que se puede adquirir en Oriel Corporation con el número de parte 41209 y tiene una cubierta antirreflejo para luz con longitud de onda en el intervalo de 340 a 550 nm. La lente 511 puede estar hecha de sílice 118 fundido. Puede haber otras lentes de enfoque adecuadas, como un objetivo de microscopio de fluorescencia con corrección infinita. El conjunto de lentes de enfoque 491 tiene ajuste de enfoque telescópico convencional 515 para enfocar el haz de forma elíptica 459 en el núcleo 189 de la corriente 2 . La luz fluorescente de salida 31 emitida por las células al pasar a través del haz 459 es de una longitud de onda diferente (mayor, debido al principio de desplazamiento de Stoke) que el láser incidente 25. Una parte de la emisión de fluorescencia 31 se transmite hacia atrás 513 a lo largo del eje del haz incidente y de regreso a través de la lente de enfoque 5 1 que recoge y colima la emisión de fluorescencia 31. La emisión colimada de fluorescencia 517 pasa de regreso desde la lente 5 al filtro dicroico 477, que transmite la emisión de fluorescencia 517. A modo de ejemplo, el filtro dicroico 477 puede ser un filtro que se puede obtener de Omega Optical con el número de parte XF2001. 400DCLP. El sistema óptico 415 incluye un sistema de filtro 519 colocado detrás del filtro dicroico 477 a lo largo del eje óptico 4 9 del instrumento 417. En una materialización, el sistema de filtro 519 incluye un filtro de emisión 521 en un soporte 523 montado en una abertura 525 en la pared posterior 527 de la cámara dicroica 443. El filtro de emisión 521 atenúa la luz del láser dispersada u otra radiación electromagnética no deseada que se transmita a través del filtro dicroico 477. A modo de ejemplo y no como una limitación, el filtro de emisión 521 puede ser un filtro de película delgada y paso largo adaptado para transmitir más del 90% de la luz con longitud de onda mayor 119 que 408 nm, como el que puede adquirirse en Omega Optical con el número de parte XF3097. Detrás del filtro de emisión y a lo largo del eje óptico 419 se coloca a espacios regulares un conjunto de películas de alineación 529. Este conjunto incluye un deslizador 531 que se mueve sobre un riel 533 extendido a lo largo de la base 429 paralelo al eje óptico longitudinal 419 del instrumento 417, un soporte del filtro 535 asegurado al deslizador 531 , un filtro de película 539 y los sujetadores 541 que aseguran el filtro de película 539 al soporte del filtro 535 en un ángulo 543 respecto al eje óptico 419 del instrumento 417. El filtro de película 539 tiene el mismo espesor que el filtro dicroico 477 y sirve para trasladar la emisión colimada de fluorescencia 517 de regreso al eje óptico 419 del instrumento 417. Los sujetadores 545 que se extienden hacia arriba a través de ranuras paralelas 547 en la base 429 a ambos lados del riel 533 aseguran el deslizador 531 a la base 429 en la posición deseada a lo largo del eje óptico 419. Detrás de la parte trasera del conjunto de alineación por película 529 hay una lente asférica 549 sostenida por un soporte 551 montado en un marco 553 que también se desliza sobre el riel 533 y está asegurado en la posición seleccionada por los soportes adecuados 557. La lente asférica 549 enfoca la emisión colimada de fluorescencia 517 sobre un filtro espacial, designado en forma general 559, que filtra el reflejo o la emisión de otras fuentes que no sean las células a ser analizadas. La lente asférica 549 puede ser, por ejemplo, una lente asférica de 12.5 mm de diámetro con una distancia focal de 15 mm, como la que puede adquirirse en Oriel Corporation. La lente 549 tiene preferentemente una cubierta antirreflejo para 120 las longitudes de onda de emisión visibles pero está hecha de un material (por ejemplo, vidrio flint) que atenúa aún más la transmisión de la dispersión del láser. Como se muestra en la fig. 34, el filtro espacial 559 comprende, en una materialización, un par de placas de abertura 561 sostenidas en forma desprendible en un marco 563 montado sobre la base 429 del instrumento 417. Cada una de las placas 561 tiene una rendija 567, 571 en ella, se recomienda que la rendija 567 sea por lo general vertical y se recomienda que la otra 571 sea por lo general horizontal, de forma que las rendijas 567, 571 se cruzan para formar una abertura 573. En una materialización, la abertura 573 es por lo general de forma rectangular y tiene una dimensión vertical 575 de 100 micrómetros y una dimensión horizontal 577 de 500 micrómetros. El tamaño y la forma de la abertura 573 pueden variar (o incluso ajustarse por el cambio de las placas de la abertura), siempre que sirva para eliminar reflejos y luz que no provenga del volumen de interrogación 579. El marco 563 que sostiene las placas de la abertura 561 tiene preferentemente dos partes, a saber, un soporte de la placa 583 que se puede deslizar por el riel 533 de la base 429 y está asegurado en la posición seleccionada por los sujetadores 587 y una pieza de respaldo 589 para asegurar las placas de la abertura 461 en posición sobre el soporte de la placa 583. En una materialización, la dimensión más pequeña (vertical) 575 de la abertura 573 en el filtro espacial 559 tiene un tamaño (o se ajusta) para poder usar una técnica de "exploración de rendija" para evaluar la célula. Esta 121 técnica se describe con más detalle en la sección "Haz de luz enfocada" de esta especificación. En una materialización, la dimensión más pequeña (vertical) 575 de la apertura 573 en el filtro espacial 559 tiene un tamaño (o se ajusta) para poder usar una técnica de "exploración de rendija" para evaluar la célula. Esta técnica se describe con más detalle en la sección "Haz de luz enfocada" de esta especificación. En la fig. 35 se muestra otra materialización de un sistema óptico de epiluminación, designado en general 450. Esta materialización es prácticamente igual que la materialización mostrada en las figs. 28-34, excepto como se indica. Una diferencia significativa es que el filtro dicroico 477 fue reemplazado por un filtro dicroico diferente 451 que transmite (más que refleja) el haz luminoso 25 y refleja (más que transmite) las emisiones de fluorescencia 31. Asimismo, debido a que las emisiones de fluorescencia 31 son reflejadas por el filtro dicroico 451 más que transmitidas, no hay necesidad de una película de alineación 539 en esta materialización de un sistema óptico de epiluminación 450. De este modo, el sistema de epiluminación 450 es sólo un ejemplo de cómo se puede reconfigurar el sistema óptico, si se desea, sin apartarse del alcance de esta invención. Además, la lente cilindrica 449 está montada en un conjunto de montaje ajustable 449A. El conjunto de montaje 449A permite el movimiento traslacional en dos ejes de la lente cilindrica 449 en un plano perpendicular al haz luminoso 25. Los sujetadores que se pueden aflojar (p. ej., tornillos (no se muestran)) se extienden a través de los orificios en forma de ranura 449B 122 (sólo uno de los cuales es visible en la fig 35). Aflojar los sujetadores permite el movimiento trasiacional de la lente 449 en una primera dirección perpendicular al haz 25. Sujetadores similares (no se muestran) se extienden a través de los orificios en forma de ranura 449C, permitiendo el movimiento trasiacional de la lente 449 en una segunda dirección perpendicular a la primera dirección. Esto permite el ajuste fino de las posiciones relativas de la lente cilindrica 449 y el haz 25 de forma que la intersección del haz 25 y la lente 449 se pueda mover sobre la superficie de la lente 449 y así generar cambios leves en el enfoque que proporciona la lente cilindrica 449. Una vez que la lente 449 está en la posición deseada, los sujetadores se pueden ajusfar para mantenerla allí.

Fotodetector La fluorescencia emitida que pasa a través del filtro espacial 559 cae sobre un fotodetector 1 7 sujeto a una placa de montura 591 deslizable sobre el riel 533 de la base 429 detrás del instrumento de epiluminación 417 y que se puede asegurar en una posición fija con los sujetadores 595 (fig. 32). El fotodetector 117 detecta la emisión de fluorescencia 31 y la convierte en una señal eléctrica que puede procesarse para analizar las características deseadas de las células, como se describirá en más detalle después. El fotodetector 117 puede ser un dispositivo convencional, como un fotodetector que se puede adquirir de Hamamatsu. El fotodetector 117 incluye preferentemente un pre-amplificador y una ganancia de PMT que se optimiza 123 para la intensidad de emisión producida por el sistema de epiluminación para las células teñidas específicas que se analizan. En general, la ganancia del PMT se optimiza cuando se aplican entre aproximadamente 200 y 2000 voltios al tubo de vacío. Por ejemplo, en el caso de detectar emisión de fluorescencia de Hoechst 33342, la ganancia del PMT se optimiza cuando se aplican entre aproximadamente 400 y 800 voltios al tubo de vacío. Un fotodetector particularmente recomendable incluye un PMT con un intervalo espectral de 185 a 830 nm (pico a 530 nm), una corriente anódica máxima promedio de 0.01 mA, una sensibilidad radiante catódica típica de 70 mA W, una sensibilidad luminosa catódica de 140 µ?/lm una sensibilidad luminosa anódica de 300 A lm, corriente oscura máxima anódica de 1 nA (0.1 nA típico) y un tiempo de respuesta de 1.4 nanosegundos. El PMT tiene amplificación acoplada a CD con una ganancia plana hasta >37 MHz, con una salida máxima de 1 V en una carga de 50 O y un tiempo de recuperación de menos de 400 nanosegundos. También es recomendable que el amplificador permita el ajuste del alto voltaje para compensar las variaciones de eficiencia del PMT sin disminuir la relación señal-ruido a menos de 800 dB. Ángulo de incidencia del haz La fig. 36 ¡lustra esquemáticamente una orientación recomendada de la intersección del haz de luz y la corriente de líquido. Deben considerarse varios puntos. Como se muestra, el haz de luz 25 está enfocado 124 en la corriente 21 en una ubicación 115 que está a corta distancia 605 del orificio de salida 103 de la boquilla 37, preferentemente menos de 1.0 mm, o incluso dentro de la boquilla 137, de manera que las células pasen a través del haz 459 mientras todavía están prácticamente en la orientación deseada, como ya se describió. Esto es particularmente importante para células que se mueven en la corriente de líquido 21, incluidos los espermatozoides. Otro punto a considerar es que el haz 25 de esta materialización puede dirigirse a la corriente de líquido 21 a lo largo de un eje del haz 609 que cruza la corriente de líquido 21 con un ángulo de incidencia A que es oblicuo (no de 90 grados) respecto al eje longitudinal de la corriente de líquido 21, como se ve desde un lado de la corriente 21 (ver la fig. 36). Cuando se separan ciertas partículas, se ha encontrado que se obtiene una mejor discriminación de los diferentes tipos de partículas si se ilumina la corriente 21 con un ángulo de incidencia diferente de 0o. Por ejemplo, el ángulo de incidencia A recomendado para la iluminación de núcleos de espermatozoides está en el intervalo de 5 a 45 grados, mejor en el intervalo de 15 a 30 grados y mejor aún en el intervalo de 18 a 24 grados. Otras partículas (por ejemplo, espermatozoides vivos) son más fáciles de observar cuando el haz de luz 25 es por lo general perpendicular a la corriente de líquido 21 (es decir, cuando ángulo A es cercano a 0o). De esta manera, se contempla que el ángulo A pueda ser cualquier ángulo sin apartarse del alcance de esta invención. La selección adecuada del ángulo A tiene como resultado una mejor discriminación señal-ruido en ciertas partículas y por lo tanto una 125 discriminación más exacta basada en diferentes características de dichas partículas (por ejemplo, espermatozoides con núcleos con cromosomas X e Y). Esta mejora puede deberse a varios factores, incluida la menor cantidad de láser dispersado que entra a la lente de enfoque 511. Dado que el haz enfocado 459 es preferentemente más ancho que la corriente 21 , se genera un patrón de difracción en la intersección 115 del haz 25 y la corriente 21. Cuando el ángulo A es mayor que aproximadamente 12 grados, el patrón de difracción reflejada no pasa por la lente 511. Otro factor puede ser que el ángulo oblicuo A permite que el haz 25 se enfoque muy cerca del orificio de la boquilla 103, de manera que el cuerpo de la boquilla 139 no interñera con la lente 511. En relación con esto, las células están alineadas más uniformemente cuanto más cerca de la boquilla 137, de manera que enfocar el haz 459 más cerca de la boquilla 137 proporciona una mejor señal. Además, el perfil más "frontal" que presentan las célula a la lente 511 (haz 25) con el ángulo oblicuo A reduce la variación de intensidad de fluorescencia total causada por una mala alineación de las células. En este sentido, en el caso de los espermatozoides es preferible que el haz 25 caiga en una de las caras anchas 207 de cada espermatozoide 201, como ya se discutió y que la boquilla 101 y el sistema óptico 109 se coloquen para lograr este resultado. Aunque se piensa que un ángulo de incidencia A oblicuo es beneficioso para separar algunas partículas, se considera que el ángulo de intersección entre los ejes del haz y la corriente puede ser 90 grados o cualquier ángulo oblicuo sin apartarse del alcance de esta invención. También 126 se espera que el ángulo óptimo de incidencia pueda variar mucho según las propiedades de las partículas particulares a analizar.

Haz de luz enfocada Con referencia a la fig. 6, se muestra que la sección transversal del haz enfocado de una materialización tiene una forma por lo general elíptica (oval) 459 con una longitud L1 a lo largo de un eje mayor que está en general perpendicular respecto a la dirección del flujo de la corriente de líquido 227 y un ancho W1 a lo largo del eje menor que está generalmente paralelo a la dirección del flujo de la corriente de líquido 227. En una materialización, el ancho W1 es menor que la longitud de la cabeza del espermatozoide 219 y mejor si es menor que la longitud de la región 225 que contiene la masa de ADN cromatínico de la célula, que en el caso de un espermatozoide bovino 201 tiene una longitud menor que aproximadamente 1 pm. Para una corriente 21 con una corriente envolvente 191 con cerca de 60 pm de diámetro y una corriente central 189 que contiene los espermatozoides bovinos 201 , un ejemplo de longitud L1 es aproximadamente 80 pm y un ejemplo de ancho W1 es aproximadamente 1.5 pm. Si se enfoca el haz de luz 459 en un ancho W1 menor que la longitud de la cabeza 205 del espermatozoide 201 , o cualquier otras célula o partícula a analizar y mejor si es menor que el diámetro de la región del ADN 225 de la cabeza 205 del espermatozoide 201 , se logra una mayor resolución de la señal, como comprenderán quienes estén familiarizados con técnicas de "exploración de rendija". Esta es una técnica 127 por la cual un haz 25 se estrecha para tener un ancho menor que la longitud de una célula (es decir, la dimensión de la célula en la dirección del flujo de la corriente) de manera que a medida que la célula pasa a través del haz estrecho, las emisiones de fotones 31 de la célula se miden sobre la longitud de la célula, como se tratará más adelante. De esta forma, se puede obtener información acerca de variaciones en la estructura, incluido el material genético (ADN), en el largo de la célula. La técnica de exploración de rendija también es útil para identificar las células "coincidentes", o sea, células que se superponen o están muy cerca. Como ya se mencionó, la exploración de rendija puede realizarse si se cambia el tamaño la abertura 573 del filtro espacial 559 para que tenga una dimensión vertical 575 tal que sólo una porción de la luz emitida de una célula, correspondiente a una fracción de la longitud de la célula en (a dirección del flujo de la corriente, pase a través de la abertura al fotodetector 17. Además, la resolución de la señal se puede optimizar si se ajusta el ancho del haz y/o el tamaño de la abertura del filtro espacial y que en conjunto proporcionen un ancho de haz con la forma adecuada para la exploración de rendija. Una manera de ajusfar la forma de la sección transversal del haz 459 es cambiar a una lente cilindrica diferente y/o mediante un ajuste a un expansor de haz en el sistema óptico 109. Cualquier otro método para configurar el haz 25 para formar una sección transversal del haz de forma elíptica 459 se considera como dentro del alcance de la invención actual. 128 También se pueden usar secciones transversales de otras formas y tamaños y se consideran como dentro del alcance de esta invención.

Sistema de separación La fig. 2 ilustra una materialización de ejemplo del sistema de separación 119. El sistema de separación 119 comprende un dispositivo de carga electrostática 627 para cargar y/o no cargar las gotitas 33 de acuerdo con la clasificación de las partículas contenidas en las gotitas 33 (por ejemplo, el contenido de cromosoma X o Y de los espermatozoides) y un par de placas del deflector cargadas electrostáticamente 629 para separar las gotitas 33 en diferentes grupos 123, 125, de acuerdo con su carga. Se recomienda recubrir las placas del deflector 629 con un revestimiento opaco y de escasa emisión (por ejemplo, resina epóxica o pintura) para limitar la luz reflejada o emitida por las placas del deflector 629. Las placas del deflector 629 pueden estar cargadas con cualquier fuente de energía adecuada 635. Por lo general se aconseja que el potencial eléctrico entre las dos placas del deflector 629 cargadas al máximo esté entre 2000 y 4000 voltios. Sin embargo, el potencial eléctrico entre las placas del deflector 629 puede tener cualquier valor entre aproximadamente 1000 y 6000 voltios. El dispositivo de carga 627 comprende un elemento cargador 631 que tiene una apertura 633 por la que pasa la corriente 21 en un sitio cercano al sitio de división de gotitas 107 (por ejemplo, a cinco longitudes de gotita o menos). Se recomienda montar el elemento cargador 631 con un 129 mecanismo que facilite el ajuste de la posición del elemento cargador 631 con respecto al sitio de división de gotitas 107. Como se muestra en las figs. 26 y 27, por ejemplo, el elemento cargador 631 y las placas def lectoras 629 pueden estar unidos a un conjunto de montaje ajustable 5001 que permite la traslación en tres ejes y el ajuste inclinado del elemento cargador 631 y de las placas deflectoras 629 con respecto al sistema de boquilla 101. Para la traslación a lo largo de un eje 5011 paralelo a la corriente 21 , el conjunto de montaje 5001 incluye una placa 5003 asegurada a un respaldo 5005 mediante sujetadores que se pueden aflojar 5007 que pasan a través de ranuras 5009 de la placa 5003, las ranuras 5009 están en general orientadas paralelas al eje 501 . Para la traslación en un eje 5013 perpendicular a la corriente 21 , se asegura una segunda placa 5015 a la primera placa 5003 mediante sujetadores que se pueden aflojar 5017 que pasan a través de ranuras 5019 de la segunda placa de ajuste 5015, las ranuras 5019 están en general orientadas paralelas al eje 5013. El elemento cargador 631 y las placas deflectoras 629 están aseguradas a la segunda placa de ajuste 5015. De este modo, aflojando los sujetadores 5007 y/o 5017, se puede ajustar la posición del elemento cargador 631 y de las placas deflectoras en relación con el sistema de boquilla 101 en un plano paralelo a la corriente de líquido 21 y después ajustar los sujetadores 5007 y/o 5017 para asegurar el conjunto de montaje 5001. Para la traslación a lo largo de un tercer eje perpendicular a los dos primeros ejes 5011 y 5013, el respaldo 5005 se sujeta a un soporte fijo 130 5021 mediante sujetadores ajustables 5023 (p. ej., pernos roscados atornillados en orificios roscados en el soporte fijo 5021). En una materialización, cada sujetador ajustable 5023 pasa a través de un resorte 5025 colocado entre el respaldo 5005 y el soporte fijo 5021. La compresión de cada resorte 5025 se puede ajustar apretando o aflojando los sujetadores respectivos 5023. Ajustar la compresión de todos los resortes 5025 en la misma medida da como resultado la traslación a lo largo del tercer eje. El conjunto de montaje=5001 se puede inclinar en virtualmente cualquier dirección cambiando la compresión relativa de uno o más resortes 5025 con respecto a uno o más de los otros resortes 5025. En esta materialización de ejemplo, las posiciones relativas del elemento cargador 631 y de las placas=deflectoras 629 permanecen fijas una con respecto a la otra porque están todas aseguradas a la misma placa de ajuste 5015. Esto evita que el ajuste del conjunto de montaje 5001 afecte a la alineación del elemento cargador 631 con respecto a las placas deflectoras 629. El elemento cargador 631 está conectado a un circuito eléctrico adecuado (por ejemplo, un circuito de 90 voltios de carga selectiva) controlado por el procesador 131 y acoplado a una fuente de energía para aplicar una carga eléctrica al elemento cargador 631. El circuito se usa para cargar o no cargar la corriente 21 inmediatamente antes de la formación de una gotita 33 en el sitio de división 07 dependiendo de si la gotita 33 contiene una partícula con las características deseadas (por ejemplo, al menos un espermatozoide 131 vivo con cromosoma X). El elemento cargador 631 se coloca electrostáticamente cerca de la corriente 21 o cerca de las gotitas 33 formadas de la corriente 21 para proporcionar una referencia eléctrica respecto a la polaridad electrostática de la corriente 2 . Las gotitas 33 tienen la misma carga que la corriente 21 en el instante en que la gotita 33 se divide de la corriente 21. Las gotitas cargadas o no cargadas 33 pasan luego entre las placas del deflector 629 y se separan por carga en los recipientes de recolección 2207 del sistema de recolección 2201. Aunque la separación produce dos grupos o poblaciones de gotitas 123, 125 en la fig. 2, las partículas pueden separarse en un número cualquiera de poblaciones de 1 a N separadas por la colocación de diferentes cargas en las gotitas 33 de los grupos respectivos y colocando el número apropiado de recipientes de recolección, cada uno colocado para recoger una población diferente de gotitas.

Calibración automatizada de demora de las gotas En el sistema de separación 119 descrito anteriormente, el procesador 131 debe estimar el tiempo que le toma a una partícula desplazarse desde el sitio de interrogación 15 al sitio de división de gotitas 107 de modo que la carga (o falta de carga) que se va a aplicar a la gotita 33 que contiene esa partícula se aplique cuando la partícula está en la última gotita unida 33 en el sitio de división 107. Si la regulación de retardo utilizada por el procesador 131 no es correcta, las gotitas 33 no se separarán de 132 acuerdo con sus contenidos. De manera similar, si la aplicación de cargas eléctricas a las gotitas 33 está incluso ligeramente desfasada con la formación de gotitas 33 esto puede distorsionar la separación debido a que ninguna de las gotitas 33 se cargará por completo y las gotitas 33 que son supuestamente neutras llevarán una pequeña carga eléctrica positiva o negativa. Esto alterará los recorridos de las gotitas 33 a través del campo eléctrico entre las placas deflectoras 629. La mejor manera de verificar que el procesador 131 está usando la regulación de demora apropiada o de ajustar la regulación de demora de gotas (es decir, calibrar la regulación de demora de gotas del sistema 9), es separar una cantidad de gotitas 33 y examinar los resultados. Variando de manera incremental la regulación de demora y monitoreando los resultados, se puede elegir la regulación de demora óptima. Tradicionalmente, esta calibración de separación se lleva a cabo manualmente. Recientemente, se han diseñado sistemas de calibración automatizada para tomar muestras o examinar el contenido de las gotitas en las corrientes de gotitas separadas y ajustar automáticamente la regulación de demora sin intervención humana. Por ejemplo las patentes de los Estados Unidos N° 6,372,506 (Norton) y 5,643,796 (van den Engh), las que se incorporan aquí como referencia, divulgan sistemas de calibración de separación automatizados. Las supuestas ventajas de estos sistemas son que requieren menos uso intensivo de mano de obra y que son capaces de verificar la regulación de demora a lo largo de todo el proceso de separación en vez de hacerlo únicamente durante 133 la configuración inicial. Los inconvenientes son que son voluminosas e incómodas y que requieren innecesariamente espacio valioso. (i) Sensores de epi-íluminación Con referencia a la fig. 37, un sistema de calibración continua automatizado 4201 de la invención actual para un sistema de citometría de separación de gotitas activado por fluorescencia consta de uno o más sensores de epiluminación 4203 ubicados de modo de detectar el contenido de las gotitas 33 para verificar la regulación de demora a fin de cargar las gotitas. Con referencia a la fig. 38, cada sensor de epiluminación incluye una fuente de luz (no se muestra), un cable de fibra óptica 4205, un filtro dicroico 4207, un sistema de lente 4209, un fotodetector 4213 y un sistema de control. En una materialización de ejemplo, el procesador 131 sirve como el sistema de control, pero se pueden usar en su lugar otros procesadores o controles. La fuente de luz puede ser un láser sólido de baja energía dedicado exclusivamente al sistema de calibración automatizado. Alternativamente, se puede usar un divisor del haz (no se muestra) para desviar una porción (p. ej., aproximadamente 5 %) de la energía del haz 25 utilizada para interrogar a las partículas de la corriente de líquido 21 a uno o más sensores de epiluminación 4203. De manera similar, el cable de fibra óptica 4209 se puede ubicar en un tope del haz 4215 (Fig. 26) para recoger la luz del haz 25 después que pasa a través del sitio de interrogación 115. La luz proveniente de la fuente de luz debe incluir luz de una longitud de onda 134 capaz de excitar moléculas fluorescentes de las partículas que se están separando, provocando de este modo emisiones de fluorescencia 4211 por parte de las partículas. Si las partículas están teñidas con colorante Hoechst 33342, por ejemplo, la fuente de luz puede proporcionar luz de una longitud de onda de aproximadamente 350 nm, aproximadamente 407 nm o cualquier otra longitud de onda capaz de excitar las moléculas del colorante Hoechst 33342. El cable de fibra óptica 4205 se extiende desde la fuente de luz hasta una ubicación corriente abajo del sitio de interrogación 115. Por ejemplo, en la materialización de ejemplo, el cable de fibra óptica 4205 conduce a una ubicación adyacente a la trayectoria de una de las corrientes de gotitas a medida que se desplaza a través del campo eléctrico entre las placas deflectoras 629. El filtro dicroico 4207 se coloca en frente del extremo del cable de fibra óptica 4205. El filtro dicroido 4207 transmite luz que tiene las características espectrales de la luz conducida por el cable de fibra óptica 4205, pero refleja luz que tiene las características espectrales de las emisiones de fluorescencia 4211. De este modo, el filtro dicroico 4207 puede tener las mismas especificaciones que el filtro dicroico 477 descrito antes en relación con el instrumento óptico de epiluminación 417. La distancia focal del sistema de lente 4209 se selecciona sobre la base de la distancia esperada del sensor 4203 desde las gotitas 33 de modo que el volumen de iluminación/detección de cada sensor 4203 sea aproximadamente igual al volumen de las gotitas 33. Con referencia a la materialización de ejemplo que se muestra 135 en la fig. 37, un sensor de epiluminacion 4203 se coloca adyacente a la trayectoria de cada una de las tres corrientes de gotitas separadas 4225, 4227 y 4229 para detectar el contenido de las gotitas 33 en la respectiva corriente. El sistema de citó-metro 9 incluye un soporte eléctricamente aislado 4221 para montar las dos placas deflectoras 629. El soporte tiene tres orificios 4223, uno adyacente a la trayectoria de cada corriente de gotitas separadas 4225, 4227 y 4229. Un sensor de epiluminacion 4203 se coloca en cada orificio 4223 para observar gotitas 33 en una de las corrientes de gotitas 4225, 4227 y 4229 a través del orificio respectivo 4223. Esta configuración compacta ocupa relativamente poco espacio y mantiene a los componentes del sistema de calibración 4201 fuera del camino, proporcionando mejor acceso a otras partes del citómetro 9. Si una gotita que contiene una partícula fluorescente pasa a través del volumen de iluminación/detección del sensor 4203, esto provocará un destello de emisiones de fluorescencia 4211 , algunas de las cuales serán recogidas por el sistema de lente 4209 y salir rebotadas del filtro dicroico 4207 al fotodetector 4213. El fotodetector 4213 envía señales al procesador 131. Sobre la base de las señales recibidas de los fotodetectores 4213, el procesador 131 puede determinar el contenido de las gotitas 33 en cada una de las corrientes de gotitas separadas 4225, 4227 y 4229. Si un sensor 4203 no detecta un destello de emisión de fluorescencia 4211 cuando el procesador 131 espera que una gotita 33 que contiene una partícula fluorescente pase por ese sensor 4203, el procesador 136 131 puede usar esa información para ajustar la regulación de demora o ajustar la ubicación del sitio de división de gotitas 107. De manera similar, el procesador 131 puede hacer un ajuste si un sensor 4203 detecta una emisión fluorescente 4211 cuando el procesador 131 no espera que una gotita 33 que contiene una partícula pase por el sensor 4203. Aún más, el procesador puede comparar la frecuencia relativa de las emisiones fluorescentes 42 de las corrientes de gotitas separadas 4225, 4227 y 4229 para ver si la frecuencia de las emisiones fluorescentes detectadas 4211 corresponden a la frecuencia esperada. El procesador 131 también puede ajustar la amplitud de la carga aplicada al elemento cargador 631 para aumentar o disminuir la cantidad por la cual una corriente separada 4225, 4229 es desviada para maximizar la intensidad de las emisiones de fluorescencia detectadas 4211. Esto mantendrá la alineación de la trayectoria de las corrientes de gotitas desviadas 4225, 4229 de modo que las gotitas pasen directamente por el volumen de recolección del sensor de epiluminación. Debido a que los sensores 4203 están colocados para observar las corrientes 4225, 4227 y 4229 a medida que se desplazan a través del campo eléctrico entre las placas deflectoras 629, el sistema de calibración tiene un tiempo de respuesta más corto que el que tendría si observara las corrientes 4225, 4227 y 4229 en la zona de caída libre corriente abajo de las placas deflectoras. 137 (ii) Corriente de prueba de qotitas vacías Se puede organizar una indicación sensible de la calidad de la calibración creando y monitoreando una corriente de prueba de calibración que contenga prácticamente sólo gotitas 33 vacías. Con referencia al sistema de calibración de separación 4201 que se muestra en la fig. 37, las gotitas 33 que contienen las partículas deseadas se separan en la corriente 4225 y las gotitas 33 que contienen cualquier otra partícula y la mayoría de las gotitas 33 vacías se separan en la corriente 4229 (es decir, la corriente de desecho). La corriente de prueba 4227 se crea aplicando una carga neutra a por lo menos una fracción (p. ej., 1 de cada 10) de las gotitas 33 vacías. Muchas gotitas 33 que se consideran "vacías" a los efectos de la separación tradicional son en realidad gotitas 33 que tienen una baja probabilidad de contener una partícula, sobre la base del tiempo de llegada de las partículas al sitio de interrogación 1 5 y los límites de formación de gotitas estimados en la corriente de líquido 21. Estas gotitas "vacías" no se deben separar en la corriente de prueba 4227 porque esto daría inevitablemente como resultado la detección de algunas partículas en la corriente de prueba 4227. En cambio, para la corriente de prueba 4227 el procesador 131 debe seleccionar sólo gotitas 33 que el procesador 131 crea que tienen prácticamente probabilidad cero de contener una partícula a fin de crear una corriente de prueba 4227 prácticamente sin partículas. Se sabe que la probabilidad de que cualquier gotita 33 elegida al azar contenga una célula es aproximadamente el promedio de la velocidad de análisis de las células 138 dividido entre la velocidad de generación de gotitas. Esto quiere decir que monitoreando la frecuencia de mala distribución en la corriente de prueba 4227 es posible estimar el ajuste fraccional de la relación de fase de carga de gotitas necesaria para igualar la fase de formación de gotitas 33. Por ejemplo el procesador 131 puede elegir gotitas que estima que tienen aproximadamente un 15 % o menos de probabilidad de contener una partícula, aproximadamente un 10 % o menos de probabilidad de contener una partícula, aproximadamente un 5 % o menos de probabilidad de contener una partícula, aproximadamente un 1 % o menos de probabilidad de contener una partícula, aproximadamente un 0.1 % o menos de probabilidad de contener una partícula, aproximadamente un 0.01 % o menos de probabilidad de contener una partícula, aproximadamente un 0.001 % o menos de probabilidad de contener una partícula, o aproximadamente un 0.0001 % o menos de probabilidad de contener una partícula. El límite de probabilidad para la probabilidad prácticamente cero se puede elegir sobre la base de la velocidad de separación, la tolerancia a la impureza, u otros parámetros, con el límite incluyendo mayores probabilidades de que una gotita contenga una partícula para separación a alta velocidad o cuando hay más tolerancia a la impureza. El fracaso del procesador 131 para crear una corriente de prueba 4227 prácticamente sin partículas (es decir, una corriente de prueba 4227 en la que la relación de gotitas 33 que contienen partículas con respecto a la cantidad total de gotitas 33 está de acuerdo con el límite de probabilidad 139 utilizado para elegir gotitas 33 para la corriente de gotitas 4227), como lo indica la detección de una cantidad superior al umbral de gotitas 33 que contienen partículas en la corriente de prueba 4227, es una indicación definitiva de separación por debajo de la óptima y hace que el procesador 131 ajuste la regulación de demora de gotas. El nivel del umbral se determina en relación con el límite de probabilidad utilizado para elegir gotitas 33 para la corriente de prueba 4227 y la cantidad total de gotitas 33 elegidas para la corriente de prueba 4227. Idealmente, algunas gotitas 33 se pueden elegir para la corriente de prueba 4227 aunque una o más partículas de la corriente de líquido 21 estén relativamente cerca de un límite de formación estimado para la gotita 33 respectiva para hacer al sistema 4201 más sensible a regulaciones de demora de gota ligeramente por debajo de la óptima. Por supuesto, el sistema de calibración de separación puede aplicar una carga que no sea neutra y desviar gotitas elegidas para la corriente de prueba, sin apartarse del alcance de esta invención. El orden relativo de las corrientes 4225, 4227 y 4229 puede ser reorganizado sin apartarse del alcance de esta invención, aunque interponer la corriente de prueba 4227 entre la corriente de desecho 4225 y la corriente de las partículas deseadas 4229 (como se muestra en la materialización de ejemplo) reduce el riesgo de contaminación cruzada de la muestra separada por parte de la corriente de desecho. Es más, si las partículas no emiten luz fluorescente, se pueden usar sensores diferentes para detectar cualquier luz dispersada causada por partículas de la corriente de prueba sin apartarse del alcance de 140 esta invención. (¡ii) Sistema de calibración de separación por impacto En una materialización de la invención, el sistema de calibración automatizado 4201 se puede operar para determinar y establecer automáticamente la relación de fase entre la formación de gotitas y la carga de gotitas en un entorno del 5 % de la fase óptima (es decir, dentro de aproximadamente +/- 18 grados). En otra materialización el sistema 4201 se puede operar para determinar y establecer automáticamente la relación de fase en un entorno de aproximadamente el 1 % de la fase óptima (es decir, dentro de +/- aproximadamente 3.6 grados). En otra materialización, el sistema de calibración 4201 se puede operar para monitorear continuamente un sistema de separación de gotitas de alta velocidad y mantener automáticamente la relación de fase dentro del 0 % de la fase óptima (es decir, dentro de aproximadamente +/- 36 grados). En aún otra materialización, el sistema de calibración 4201 se puede operar para monitorear continuamente un sistema de separación de gotitas de alta velocidad y mantener automáticamente la relación de fase en un entorno del 3 % de la fase óptima (es decir, dentro de aproximadamente +/- 10.8 grados).

Corrección de falla del sistema de separación Cada tanto, una gotita 33 se desviará de su trayectoria normal y golpeará el elemento cargador 631 o las placas deflectoras 629. Si una o más 141 gotitas 33 golpean el elemento cargador 631 , el elemento cargador 631 puede no ser capaz de cargar gotitas 33 adecuadamente. Es más, la trayectoria normal de la gotita 33 a través del elemento cargador 631 puede obstruirse haciendo que más gotas 33 se acumulen en el elemento cargador 631. También, si las gotas 33 desviadas golpean una placa deflectora 629, pueden distorsionar o perturbar de otra manera las líneas del campo eléctrico entre las placas deflectoras 629, cambiando de esa manera la trayectoria de las corrientes 123 y 125 de gotitas separadas. De este modo, es deseable tener un sistema de eliminación de desechos para retirar desechos del elemento cargador 631 y/o de las placas deflectoras 629. En una materialización de ejemplo, que se muestra en las figs. 26 y 27, el sistema 9 incluye un sistema de eliminación de desechos 5047 para el elemento cargador 631 y un sistema de eliminación de desechos 5049 para las placas deflectoras 629. Con referencia a la fig. 27, el elemento cargador 631 se mantiene en posición mediante un soporte 5051 asegurado a la tabla 5015 del conjunto de montaje ajustable 5001. Un pasaje de vacío 5053 (se muestra con tramos de línea) se extiende a través del soporte 5051 a una apertura 5057 adyacente al elemento cargador 631. El pasaje de vacío 5053 se conecta a una fuente de vacío adecuada (no se muestra) mediante una línea de vacío 5055 unida a una conexión 5058 en el soporte 5051. Se provee de controles adecuados para aplicar selectivamente un vacío en el pasaje 5053 para aspirar todo el material indeseable (p. ej., gotitas 33 desviadas) fuera del 142 elemento cargador 631 y restaurar el funcionamiento adecuado del elemento cargador 631. Relacionado con esto, como se muestra en la fig. 27, un distribuidor 5061 asegurado al conjunto de montaje 5001 tiene una red de pasajes de aire 5063 en él (que se muestra con trazos de línea) conectada a través de una línea de aire 5059 y una conexión 5065 a una fuente de aire comprimido u otro gas (no se muestra). Los pasajes 5063 tienen aperturas 5064 colocadas a lo largo de un lado 5066 de cada placa deflectora 629 y las porciones 5067 de los pasajes 5063 que conducen a las aperturas 5065 están orientadas de modo que el aire comprimido soplado a través del distribuidor 5061 purgue cualquier gotita 33 desviada u otro desecho de las placas deflectoras 629. Cualquier material purgado de las placas deflectoras 629 golpeará un panel de la cubierta (no se muestra) y drenará en un dispositivo de recolección adecuado (no se muestra). En una materialización, si el procesador u otro sensor determina que las gotitas 33 desviadas golpearon el elemento cargador 631 o las placas deflectoras 629, como lo indica el sistema de calibración de separación antes descrito, por ejemplo, el procesador puede iniciar automáticamente un procedimiento o modo de corrección de falla, que puede consistir en aplicar vacío a un pasaje 5053 para aspirar material del elemento cargador 631 y/o enviar gas comprimido a través de los pasajes 5067 para purgar material de las placas deflectoras 629. 143 Protección de la muestra separada durante el modo de falla Una materialización del sistema 9 también incluye un mecanismo de prevención de contaminación 4041 (Fig. 26), que se puede activar mediante el procesador 131 para limitar o prevenir la contaminación de la muestra separada cada vez que el sistema de separación está en el modo de falla. El mecanismo de prevención de la contaminación incluye un accionador neumático 4043 que se puede operar para mover selectivamente un brazo oscilante 4045 entre una posición de protección (que se muestra en la fig. 26) y una posición de no protección (que no se muestra). En la posición de protección, el extremo 4047 del brazo oscilante 4045 cubre la apertura del recipiente de recolección 4033, evitando de esa manera la recolección de gotitas 33 por el recipiente de recolección 4033. En la posición de no protección, el recipiente de recolección 4033 no está cubierto. Normalmente, el brazo oscilante 4045 está en la posición de no protección, pero el procesador 131 hace que el accionador 4043 mueva el brazo oscilante 4045 a la posición de protección cada vez que el procesador 31 determina que hay riesgo de contaminación (p. ej., el sistema de boquilla 101 se obstruye, el sitio de división de gotitas 107 se vuelve inestable, o las gotitas 33 desviadas golpearon el elemento cargador 631 o las placas deflectoras 629). El extremo 4047 del brazo oscilante 4045 tiene forma de canal para drenar cualquier líquido recogido por el brazo oscilante 4045 en el recipiente de desechos 4035. 144 Sistema dispensador de líquido El sistema 1 ya descrito es capaz de producir efectivamente cantidades de partículas (por ejemplo, espermatozoides X) separados por características seleccionadas. La velocidad de producción puede aumentar o disminuir si se varían las velocidades a las que el sistema dispensador de líquido 15 (fig. 2) inyecta el líquido de transporte 17 y el líquido envolvente 19 a la boquilla 137. En una materialización, el sistema dispensador de líquido incluye una bomba de jeringa 645, por ejemplo la bomba ICROLAB® modelo PSD/3 que se puede adquirir en Hamilton Company. La bomba 645 funciona para inyectar el líquido de transporte 17 a la boquilla 137 a una velocidad de aproximadamente 20 µ?/min. En general, la bomba 645 debería funcionar para inyectar el líquido de la muestra 17 a la boquilla 137 a una velocidad en el intervalo de 10 a 50 µ?/min. La bomba 645 está conectada por una línea de flujo 647 al suministro 3 del líquido de transporte 17, que puede ser un recipiente adecuado 649 que contenga un volumen de material para analizar y separar. En el caso de que la temperatura de las partículas a analizar sea un factor, como en el caso de los espermatozoides, por ejemplo, la temperatura del recipiente 649 puede estar controlada por un sistema adecuado de control de temperatura, como un baño termostatizado (no mostrado). La bomba de la jeringa 645 se mueve de un tiempo de ingreso para aspirar el líquido de transporte del recipiente de suministro a un tiempo de descarga para dispensar el líquido de transporte 17 a través de una línea de suministro 651 a la aguja de inyección 157 del sistema de boquilla 101. La 145 bomba 645 se impulsa preferentemente con un motor de velocidad variable (no mostrado) controlado por el procesador 131. A modo de ejemplo, la bomba 645 puede estar impulsada por un motor paso a paso que opera a velocidades selectivamente variables para bombear el líquido de transporte 17 a la aguja 159 a la velocidad necesaria para obtener la producción deseada. Se puede usar otro tipo de dispositivos de inyección de líquido en lugar de una bomba de jeringa. Para dar sólo un ejemplo, el recipiente 649 puede estar presurizado por una fuente presurizada de gas sin apartarse del alcance de la invención. Además, se aconseja mantener las líneas 647, 651 tan cortas como sea posible en la práctica ya que el ambiente de la línea no ayuda a la salud de células sensibles (por ejemplo, espermatozoides) que pueden estar en el líquido de transporte 17. El suministro 7 del líquido envolvente 19 comprende un segundo recipiente 661 , por ejemplo, un tanque en la fig. 2, que contiene un volumen adecuado de líquido envolvente 19 conectado al orificio radial 173 del cuerpo de flujo 133 del sistema de boquilla 101 por una línea de suministro 667 con una válvula de control 669 en ella. En la materialización de la fig. 1 , el recipiente del líquido envolvente 661 está presurizado por un sistema de presión de gas 671 que comprende una fuente 675 de gas presurizado (por ejemplo, aire u otro gas, como nitrógeno) que se comunica con el tanque 661 a través de una línea de aire 679 con un regulador 681 para controlar la presión suministrada al tanque 661. Una válvula de dos vías 683 en la línea de aire 679 puede moverse entre una primera posición, que comunica el 146 tanque 661 y el suministro de gas 675, y una segunda posición que sirve para liberar la presión del tanque 661. El regulador de presión de gas 681 es un regulador convencional preferentemente controlado por el procesador 131. Si se controla la presión del tanque 661, también se puede controlar la presión a la que se inyecta el líquido envolvente 19 al cuerpo de flujo 33. Esta presión puede estar entre 16 y 100 psi (1.1248 y 7.03 kg/cm2), mejor entre 10 a 50 psi (0.703 a 3.515 kg/cm2), mejor aún entre 15 a 40 psi (1.0545 a 2.812 kg/cm2) o todavía mejor entre aproximadamente 20 a 30 psi (1.406 a 2.109 kg/cm2). El control de la presión a la que se suministra el líquido envolvente 9 al cuerpo de flujo 33 puede realizarse de otras maneras sin apartarse del alcance de la invención. En una materialización, que se muestra en la fig. 26, el sistema dispensador de líquido 15, incluye un tanque de líquido envolvente (no se muestra) y una estación de muestra 4051. La estación de muestra incluye un recipiente a presión de dos partes 4053 adaptado para sostener un tubo de muestra 4055. La sección inferior 4057 del recipiente a presión se puede mover hacia arriba y abajo con respecto a la sección superior 4059 del recipiente a presión 4053 entre una posición abierta (se muestra en la fig. 26), en la que el tubo de muestra 4055 se puede cargar o descargar, y una posición cerrada (no se muestra) en la que las dos partes 4057, 4059 del recipiente a presión 4053 se juntan para formar un precinto para contener gas presurizado que se usa para bombear líquido de transporte 17 desde el tubo de muestra 4055 hasta el sistema de boquilla 101. 147 Cuando el recipiente a presión se abre, un brazo oscilante con resorte tangencial 4071 se desplaza a una posición por debajo de la línea 651 que dispensa líquido de transporte 17 al sistema de boquilla 101 (ver también la fig. 119 N° 4071'). El brazo oscilante 4071 tiene forma de canal y está adaptado para recoger líquido de retrolavado a través de la línea 651 y drenar el líquido de retrolavado hasta el recipiente de desechos a través del puerto 4073. A medida que el recipiente a presión 4053 cambia de su posición abierta a su posición cerrada, un disco de leva 4075 unido a la sección inferior 4057 del recipiente a presión 4053 mueve el brazo oscilante 4071 contra su resorte para despejar el área entre las dos secciones 4057, 4059 y permitir que el recipiente a presión 4053 se cierre.

Control Con referencia nuevamente a la fig. 2, el microprocesador 131 (u otro control y/o procesador digital o analógico, o sus combinaciones) controla la operación del sistema 1. Como se advierte más adelante respecto a la fig. 39, el microprocesador puede implementarse como un procesador de control del sistema y cuatro procesadores para manejar el procesamiento de señales. Alternativamente, algunas o todas las funciones se pueden integrar en uno o más procesadores. Por ejemplo, el microprocesador de control del sistema (ver la fig. 36) se puede implementar mediante el uso de uno de los cuatro procesadores de procesamiento de señales. Además, como se advierte más adelante el procesamiento de señales se puede realizar con un circuito 148 analógico (por ejemplo, un analizador analógico de células como el que se muestra en la fig. 39) o una combinación de circuitos analógicos y digitales. El microprocesador 131 proporciona señales de salida para controlar el sistema dispensador de líquido 15 (se menciona más adelante) en respuesta a señales de entrada recibidas del sistema de epiluminación 415, proporciona señales de salida para controlar los transductores 105 en respuesta a señales de entrada recibidas de los sensores de división 389 y proporciona señales de salida para controlar el sistema de separación 119 (se menciona más adelante) en respuesta a señales de entrada recibidas del sistema de epiluminación 415. El microprocesador 131 puede proporcionar señales de salida a otras partes del sistema de citometría 9 como se indica en otra parte. Además, el microprocesador 131 puede estar adaptado para procesar información y suministrar señales de salida en tiempo real. Hablando en general, el término "tiempo real" se refiere a operaciones en las cuales el funcionamiento del procesador 131 coincide con la percepción humana del tiempo o aquellas en las que la velocidad de funcionamiento del procesador 131 coincide con la velocidad de procesos físicos o externos importantes. En un contexto, el término "tiempo real" puede indicar que el sistema reacciona a eventos antes de que los eventos se vuelvan obsoletos. En general, las señales eléctricas del sistema de epiluminación 415 se convierten en información digital con un convertidor A/D 689 que suministra la información digital correspondiente al microprocesador 131. En respuesta a la información, el microprocesador 131 controla un sistema de 149 separación 119 y un sistema dispensador de líquido 15, ambos ya descritos. La salida de señales eléctricas del fotodetector 117 del sistema de epiluminación 415 son señales de voltaje analógico que varían con tiempo e indican la amplitud de la fluorescencia emitida 31 a cualquier tiempo generada por cada célula cuando se ilumina con el haz láser 25. De forma que las señales analógicas (también denominadas salida analógica) tienen forma de pulsos de ondas que varían con el tiempo 497 como se ilustra esquemáticamente en las figs. 52 y 53. En general un pulso de ondas 497 se define como una onda o una parte de una onda que contiene uno o más pulsos o alguna parte de un pulso. Por lo tanto, la amplitud de cada pulso de ondas 497 en cualquier instante del tiempo representa la tasa relativa de emisión de fotones 31 de cada célula a ese instante del tiempo cuando pasa a través del haz láser 25. Los espermatozoides bovinos con cromosoma X tienen mayor contenido de ADN que los espermatozoides bovinos con cromosoma Y (por ejemplo, aproximadamente 3.8%). Como resultado, las células X vivas marcadas con una tinción fluorescente como se mencionó antes producirán un pulso de ondas 497 diferente al pulso de cualquier otra célula marcada. Si se analizan los pulsos 497 como se menciona más adelante (ver Procesamiento de señales, Exploración de rendija y Diferencia crítica de pendiente), cada célula puede identificarse como una célula X o no identificarse como una célula X (~X). Por lo general, como se emplea aquí, célula X se refiere a células X vivas, células Y se refiere a células Y vivas y las células ~X se refiere a la combinación de células Y vivas y células que 150 producen una emisión de fluorescencia 31 detectable pero que no puede identificarse con una probabilidad razonable como células X vivas. El tiempo de cada pulso de ondas 497 indica la posición de cada célula en la corriente 21. Ya que la velocidad a la que el líquido envolvente 19 sale de la boquilla 137 permanece constante y ya que la distancia d (en la fig. 24) entre la boquilla 137 y el sitio de formación de gotitas 107 es conocida, se conoce la posición de cada gotita 33 y se conocen las células, si las hubiera, dentro de cada gotita 33. De forma que el microprocesador 131 puede calcular el instante en que cada gota en formación pasa a través del anillo cargador 631 y puede controlar la polaridad del anillo 631 y así controlar si una gotita 33 se carga para poder desviarse con los elementos cargadores 631 del sistema de separación 119. Dado que el microprocesador 131 conoce la velocidad de formación de las gotitas e identifica las células dentro de cada gotita como X o ~X, el microprocesador 131 conoce el contenido de células de cada gotita 33 y lleva un registro (o enumera) del número de células en cada población 23, 125. Según la estrategia de separación, ver más adelante, el microprocesador 131 determina cuáles gotitas 33 se cargan para desviarse y cuáles gotitas 33 no se cargan para que no se desvíen.

Procesamiento de la señal A. Introducción de muéstreos digitales Como ya se describió, la interacción entre el haz láser 25 y la 151 partícula produce un pulso de emisión de fotones 31 (por ejemplo, emisión de fluorescencia) que se captura con la lente recolectora 511 del sistema óptico 109 y se conduce a fotodetector 117. El fotodetector 117 convierte la energía fotónica a cualquier tiempo en una salida de voltaje analógico con una amplitud que varía en el tiempo. Esta salida es una serie de pulsos de ondas 497 (figs. 43 y 44) que contienen muchas características que se pueden usar para discriminar entre las poblaciones de partículas. Entre estas características está la emisión de fotones total, la velocidad de emisión de fotones en función del tránsito espacial de la partícula a través del haz láser, la velocidad máxima de emisión de fotones durante el tránsito, la velocidad promedio de emisión de fotones durante el tránsito y el tiempo necesario para el tránsito. La combinación de la geometría del haz láser 459, el tamaño de la partícula, la distribución de la fuente de emisión en el volumen de la partícula y la velocidad de la partícula determina el espectro de frecuencias del pulso de ondas 497. Para el sistema 1 usado con semen de bovino ya descrito se ha determinado que cada célula 201 produce un pulso de ondas 497 de entre 800 y 1200 ns de duración. También se ha determinado que en función de la frecuencia, más del 97% de la energía en el pulso de ondas 497 se libera a frecuencias por debajo de 30 MHz. Este espectro de frecuencias se tratará más adelante ya que se relaciona con el teorema del muestreo de Nyquist. Tomados juntos estos pulsos de ondas 497 forman una señal de salida 701 del fotodetector 117 que es una señal continua, variable en el tiempo y que representa el tránsito de la corriente de partículas a través del equipo. 152 Además de las características de cada uno de los pulsos que se usan para discriminar entre poblaciones, la señal variable en el tiempo proporciona un registro preciso respecto al espaciamiento relativo (tiempo y posición) de cada partícula que pasa a través del equipo y la velocidad relativa de las partículas que se mueven a través del equipo. Este registro preciso de tiempo, posición y velocidad puede sincronizarse con las señales del oscilador de generación de gotitas 703 como se muestra en la fig. 44 para determinar qué partículas son parte de una gotita 33 particular formada por el equipo de generación de gotitas 105. Esta información se puede usar como base para determinar la "coincidencia" o la presencia de una partícula deseada y no deseada en una única gotita 33. La capacidad para determinar con exactitud el número y la clasificación de cada partícula en una gotita 33 permite la separación exacta y eficiente. El procesamiento de señales digitales 705 como se ilustra en la fig. 72 se puede usar para analizar la detección de pulsos de fluorescencia 31 como se indica mediante señales de salida 701 del fotodetector 117 muestreadas en sincronía. Este procesamiento se implementaría en un software de análisis de pulsos que emplea instrucciones y/o algoritmos, como se advierte aquí. La salida analógica variable en el tiempo 701 del fotodetector 117 se lleva a un convertidor A/D (analógico/digital) 689 que la muestrea en sincronía. El muestreo en sincronía significa un muestreo para producir información digital correspondiente a la salida analógica. El muestreo en sincronía también se refiere a que la adquisición de muestras es continua. 153 Como se señala más adelante la velocidad de muestreo depende del espectro de frecuencias de la salida analógica. El convertidor 689 proporciona una salida que incluye la información digital 707 que ingresa al microprocesador 131 u otro dispositivo de análisis digital que ejecuta el software de análisis de pulsos para analizar la información digital 707. En general, el software de análisis de pulsos incluiría detección de pulso digital HH3, extracción de características de pulso HH4 y discriminación de pulso HH7.

B. Frecuencia de muestreo y espectro de frecuencia de señal La señal de salida 701 del PMT 117 se captura con un convertidor analógico-digital (ADC) de alta velocidad 689 que muestrea la salida 701 en forma continua a una frecuencia de 05 MHz. Se entiende bien que cuando se muestrea una señal que varía con el tiempo es necesario que la frecuencia de muestreo sea al menos dos veces la frecuencia máxima contenida en la señal que se muestrea. Esto se conoce como el teorema del muestreo de Nyquist. Por este motivo la señal de salida 701 del PMT 117 se envía primero a través de un filtro de paso bajo de 40 MHz 854 (ver la fig. 39) para asegurar que la frecuencia máxima contenida en la señal 701 está bajo el límite de 52.5 MHz impuesto por la velocidad de muestreo. Es importante advertir que los sistemas ópticos 109, de fluidos 15 y de detección del equipo 1 se han ajustado para producir un pulso de ondas 497 con características de 154 frecuencia óptimas para muestrear a una velocidad de 105 MHz. La velocidad de muestreo puede variar entre aproximadamente 25 y 200 MHz sin apartarse del alcance de la invención actual.

C. Procesamiento del pulso El procesamiento del pulso se realiza en cuatro (4) procesadores TigerSharc DSP que comparten la memoria y están conectados entre sí por puertos paralelos de alta velocidad. Como se ilustra en la fig. 39, los cuatro procesadores son: 1) un procesador de administración de datos 863 que recibe datos de un ADC de alta velocidad 689 que digitaliza las señales de salida 701 del fotodetector 117; 2) un procesador de detección de pulso 865 que detecta los pulsos de ondas 497 representados por la información digital; 3) procesador de extracción y discriminación de características 867 que extrae las características de los pulsos detectados 497 y discrimina los pulsos 497 con base en las características extraídas; y 4) un procesador de separación 873 que determina una clasificación para separación para cada pulso 497 con base en las características extraídas y la discriminación, que determina las decisiones de separación para las células y las gotitas correspondientes 33 y que está sincronizado con la formación de gotitas 105. En general un procesador 863, 865, 867, 873 completa una tarea y establece un "indicador" para que los procesadores que los acompañan sepan que hay datos disponibles para procesar. Cada procesador 863, 865, 867, 873 se ejecuta 155 independientemente de los otros, lo que maximiza la eficiencia general porque no se interrumpen entre sí. De forma que, cualquier procesador 863, 865, 867, 873 puede ser capaz de cumplir cualquier función y uno o más procesadores o funciones pueden combinarse en un único procesador o distribuirse en varios procesadores. Las etiquetas 863, 865, 867, 873 de los procesadores como se usaron antes en esta solicitud se usan sólo por comodidad y no están concebidos para limitar de ninguna manera. Los cuatro procesadores 863, 865, 867, 873 están conectados a una SDRAM de una placa DSP 851 para intercambiar información y están conectados a una entrada/salida (l/O) del procesador 857 para la sincronización y comunicación con un bus periférico de l/O 859 conectado a la PC 735 y al generador de pulsos de separación 861. El procesador l/O 857 puede implementarse con dos o más procesadores SharcFIN l/O conectados por un enlace de comunicaciones. Las señales de separación 853 se proporcionan a la PC 735 mediante el bus periférico de l/O 857 y se usan para controlar el generador de pulso de separación 861 que controla la carga de las gotitas 33. El procesador de l/O 857 recibe la salida 707 del convertidor analógico/digital (ADC) 689, por ejemplo, Bitware Corp. 105MHz/2-canales, 14 bit que soporta 105MHz/1 -canal. El ADC 689 está conectado a la salida del fotodetector 117 para convertir sus señales de salida analógica y variables en el tiempo 701 en información digital 707 y también está conectado a una SDRAM de una placa de l/O 855 para almacenar los bloques de información 156 digital del ADC 689. En general, las señales analógicas de salida 701 del fotodetector 1 17 indican la característica A o la característica B (por ejemplo, X o ~X). El convertidor A D 689 convierte las señales analógicas de salida 701 del fotodetector 117 del sistema de citometría de flujo 1 en la información digital correspondiente 707. Los procesadores 863, 865, 867, 873 analizan y clasifican la información digital 707 y proporcionan una señal de separación al sistema de separación 1 9 en función de la información digital detectada y clasificada.

D. Captura de datos Como se estableció antes, la salida de la señal 701 del fotodetector 117 se captura con un convertidor analógico digital (ADC) de alta velocidad 689 que muestrea continuamente la salida a una frecuencia de 105 MHz. Los datos (la información digital 707) se transfieren de inmediato a bloques de memoria de alta velocidad (SDRAM de una placa de l/O) 855 que sirven para almacenar en el búfer la entrada de datos. Estos bloques de memoria 855 se organizan de forma que mantengan la integridad y secuencia del flujo de datos 707. Los procesadores de procesamiento de señales digitales (DSP) 863, 865, 867, 873 también tienen acceso a estos bloques de memoria 855 por acceso directo a memoria (DMA). De esta manera los procesadores 863, 865, 867, 873 pueden acceder a los datos de entrada 707 sin interrumpir al ADC 689. Esto facilita la transferencia eficiente de datos 707 157 a estos procesadores 863, 865, 867, 873 para la extracción de características, el análisis y la clasificación de separación. A lo largo de todo este proceso, el procesador de administración de datos 863 mantiene las muestras de pulso 707 en orden y con un índice de tiempo (respecto al reloj maestro 737, que tiene una frecuencia 128 veces mayor que la de las gotitas 33) para conservar su referencia al "tiempo real" o el tiempo al que la célula pasó a través del haz láser 25. El ADC 689 oscila alternativamente entre dos entradas, muestrea continuamente las señales de salida analógicas y variables en el tiempo 701 incluidos los pulsos de ondas 497 y los convierte en información digital 707 que se ingresa en bloques 855 al SDRAM de la placa de l/O bajo el control del procesador de administración de datos 863. El procesador 863 reúne la información 707 en una corriente continua.

E. Inicialización de los parámetros de detección Para distinguir eficazmente respecto al ruido de fondo, el software de detección de pulsos digitales 747 debe recibir información que indique la estadística de segundo orden de la señal de fondo, es decir, el conocimiento del comportamiento de la señal de voltaje de salida 701 del fotodetector 117 cuando no hay pulso de fluorescencia 497. El software puede aprender estas estadísticas para inicializar los parámetros de detección 741 de una manera no supervisada durante el período de inicialización que sigue inmediatamente al arranque del sistema 1. En general, un pulso puede definirse como 2 ó 3 desviaciones estándar respecto al nivel de fondo. 158 Debido a la posibilidad de que la introducción del líquido de transporte 17 en la corriente del líquido envolvente 191 pueda causar un cambio en la emisión de fluorescencia de fondo, el líquido de transporte 17 debe estar presente para la inicialización de los parámetros de detección. El cálculo sencillo de la estadística de segundo orden de una secuencia temporal de valores de la señal de voltaje de salida puede sobreestimar la desviación estándar del fondo (debido a la posible presencia de pulsos de fluorescencia 497 en la secuencia). Por consiguiente se prefiere un procedimiento iterativo para eliminar gradualmente este efecto. El software de detección de pulsos 747 realiza esto al calcular la estadística de la señal total 701 (fondo + pulsos), usa estos valores para aplicar lógica de detección de pulsos, recalcula la estadística de la señal sin las muestras detectadas en los pulsos y repite este procedimiento hasta que los cálculos estadísticos del fondo convergen (o se llega a un número máximo de iteraciones fijado). Al evaluar la señal de fondo con células presentes, se puede determinar una indicación más exacta de la amplitud correcta de pulso 497 esperada. El cuadro II resume el procedimiento de inicialización de detección para determinar los parámetros de detección que usará el software de detección de pulsos. [el resto de la página en blanco] 159 Algoritmo: Inicialización de los parámetros de detección Entrada: vector de números de coma flotante PMTvolts; número de coma flotante statWindowSize, número entero maxlteratíons Salida: número de coma flotante bckgrndMean; número de coma flotante bckgrndSTD Procedimiento: Inicializar el vector de fondo bckgrnd para que dure statWindowSize muestras del vector PMTvolts y numlterations, y lastSampleMean, lastSampíeSTD a cero: bckgrnd = PMTvolts[l to statWindowSize] lastSampleMean = 0 lastSampíeSTD = 0 numlterations = 0 Calcular el promedio de la muestra y desviación estándar de la muestra de bckgrnd y aumentar el contador de iteraciones: s\vta(bckgrnd) sampleMean^ statWindowSize sv¡m(bckgrnd - sampleMean)2) sampleSTD = statWindowSize numlterations = numlterations + 1 Verificar la convergencia o exceso de máximo número de iteraciones: exitFlag = ( {sampleMean - lastSampleMean) < eps ? (sampleStd - lastSampleStd < eps)) v (numlterations > maxlteratíons) Si exitFlag es cierto, ir al paso 6 (si no seguir con el paso 4). Aplicar el algoritmo de detección de pulsos, obtener los vectores de las muestras de pulsos y el nuevo valor de muestras fondo estimado: [pulse,bckgrnd] =pulse_detect(bckgrnd, sampleMean, sampleSTD) Registrar las estimaciones estadísticas de esta iteración y repetir lastSampleMean = sampleMean lastSampíeSTD = sampleSTD Ir al paso 2. Establecer la estadística de fondo calculada a la estadística de muestras y salir: bckgrndMean = sampleMean bckgrndSTD = sampleSTD 160 CUADRO ll Parámetros del algoritmo de inicialización de la detección de pulsos.

En general, el convertidor AJO 689 convierte las señales analógicas de salida 701 del fotodetector 117 en la información digital correspondiente 707 que indica la característica A o la característica B (por ejemplo, X o ~X). El procesador de señales digitales 865 determina las características de fondo de las señales de salida variables en el tiempo 701 a partir de la información digital 707 correspondiente a ella, detecta los pulsos de ondas 497 a partir de la información digital 707 en función de las características de fondo determinadas y proporciona una señal de separación 853 al sistema de separación 1 19 en función de los pulsos detectados 497.

F. Parámetros de discriminación inicial Igual que los parámetros de detección (y después de su inicialización como se muestra en el cuadro II), los parámetros a usar en un algoritmo de discriminación pueden inicializarse de forma no supervisada. Sin embargo, a diferencia de los parámetros del algoritmo de detección, no es necesario un procedimiento iterativo. En este caso, el software para inicializar los parámetros de discriminación 745 detecta un número prefijado (por ejemplo, 00000) de pulsos de fluorescencia 497, calcula las características a usar para discriminar cada pulso 497 detectado y usa un procedimiento del agrupamiento (ver en el cuadro III un resumen de procedimientos de 161 agrupamiento de candidatos) para asignar estos pulsos 497 a poblaciones de interés (por ejemplo, X, -X). [el resto de la página en blanco] CUADRO III Resumen de los abordajes de agrupamiento considerados para usar la inicialización de parámetros del algoritmo de discriminación.

La fig. 73 contiene un ejemplo de los resultados de la aplicación de un procedimiento de agrupamiento k-means para definir la población 1 y la población 2 con base en la estadística de la distribución. La estadística de segundo orden de estas poblaciones se usa luego para establecer los parámetros necesarios para la discriminación (los coeficientes de una función 162 de decisión polinomial de 1er o 2do grado). El cuadro IV resume el procedimiento de inicialización de discriminación. [el resto de la página en blanco] 163 Algoritmo: Inicialización de los parámetros de discriminación Entrada: Matriz de números de coma flotante detectedPulseData, vector de números de coma flotante popPríorProbabilities Para cada clase de población /: matriz de números de coma flotante W¡, vector de números de coma flotante w¡, número de coma flotante w,-o Procedimiento: Calcular los valores de característica a partir de los pulsos detectados (n valores por pulso, donde n es la dimensionalidad del espacio de características): featureValues = fQa.tuae_extract(detectedPu!seData) Agrupar los valores de característica en el espacio de características para obtener miembros de poblaciones populations - Calcular la estadística de 2do orden de las poblaciones: (para / = 1 hasta m, donde m es el número de poblaciones o clases) (para j = 1 hasta n, donde n es la dimensionalidad del espacio de características) r ... sum( featureValuesípopul tionSi, ]]) popMean,[j] = - '-^ # of samples in populations ¡ (para k = 1 hasta n, donde n es la dimensionalidad del espacio de características) tmpVal[j,k] · { eatxireValues_populations - populationMean¡ \¿ ) „ . sum(tmpVal[j, kJ) popCovanance¡ [j, k] = —— — — #of samples m populations ¡ Calcular los coeficientes del discriminante de la función polinomial: (para / = 1 hasta m, donde m es el número de poblaciones 164 CUADRO IV Inicialización de los parámetros del algoritmo de discriminación.

En general, el convertidor A/D 689 convierte las señales analógicas de salida 701 del fotodetector 117 en la información digital correspondiente 707 que indica la característica A o la característica B (por ejemplo, X o ~X). El procesador de la señal digital 867 genera parámetros iniciales de discriminación correspondientes a la información digital 707, discrimina la información digital en función de los parámetros iniciales de discriminación y proporciona una señal de separación 853 al sistema de separación 119 en función de la información digital discriminada.

G. Detección de pulso digital El primer paso del procesamiento es la detección de pulsos que realiza el procesador de detección de pulsos 865 para determinar si una forma de onda particular es un pulso de ondas 497 correspondiente a la emisión de fluorescencia 31 de una célula. El procesador 865 ejecuta un algoritmo de detección de pulsos que identifica conjuntos de muestras con probabilidad de representar a las partículas buscadas para separar o a las partículas a evitar porque son contaminantes potenciales de una población. En el caso de la separación de espermatozoides bovinos, se agrega un colorante para apagar la emisión 31 de las células no viables, lo que hace que las intensidades asociadas a sus pulsos sean ~1/3 de la intensidad de una célula viva. Las 165 células no viables no se consideran como blancos de separación ni como contaminación potencial. No se consideran como pulsos 497 detectados. Los pulsos 497 de las células vivas se detectan mediante el seguimiento de la intensidad de muestras para un número sucesivo de muestras que sobresalen de los niveles de fondo. Una vez que este nivel cruza un umbral determinado estadísticamente, el procesador 865 salta a un tiempo posterior que es aproximadamente 75% del ancho de pulso esperado 497 para una célula viva. Si el nivel está todavía por encima del umbral, la serie de muestra se considera como un pulso 497. Las muestras de los pulsos detectados 497 se trasfieren a un bloque de memoria usada por el procesador de extracción de características 867. Una materialización que se puede emplear para el software de detección de pulsos digitales 747 es un abordaje de detección de anomalías estadísticas, aunque se considera que se pueden usar otros abordajes para identificar y/o aislar los pulsos digitalizados 497. Esencialmente, las muestras digitales 707 de las señales de voltaje de salida 701 del fotodetector 117 que detecta la fluorescencia que resultan estadísticamente anómalas respecto al fondo se consideran como parte de un pulso 497. Para tener una robustez adicional (para reducir al mínimo la detección de ruido), se pueden incluir criterios temporales adicionales. La detección de pulso procede del siguiente modo. Cuando la señal de salida de voltaje 701 del fotodetector 117 no es un pulso, se calcula la distancia de Mahalanobis respecto al fondo de las muestras entrantes 707 166 de la señal 701 y se compara con un umbral prefijado. Si la distancia de una muestra dada excede el umbral, se considera como el comienzo potencial de un pulso 497 y el software de detección de pulsos empieza a almacenar en el búfer las muestras entrantes. Si el siguiente número predeterminado de muestras (por ejemplo, 25) también supera el umbral, se considera que ha comenzado un pulso 497 y el almacenamiento en el búfer continúa hasta que se satisfacen los criterios de final de pulso; de otro modo, el búfer se vacía y continúa la búsqueda del comienzo de un pulso. Mientras se detecta un pulso 497, si una muestra está por debajo del umbral, se considera como el final potencial de un pulso y se registra la ubicación del búfer (pero se continúa almacenando en el búfer la información de la muestra). Si el siguiente número predeterminado de muestras (por ejemplo, 25) también está por debajo del umbral, se considera que el pulso 497 ha terminado y el pulso 497 comprende las muestras almacenadas en el búfer hasta la ubicación registrada. El cuadro V resume el algoritmo de detección de pulsos, y la fig. 49 proporciona una ilustración de los resultados de la detección de pulsos en un pulso de fluorescencia 497 adquirido dig ¡talmente. 167 Algoritmo: Detección de pulso de fluorescencia digital vector de números de coma flotante digSamples, número de coma flotante bkgrndMean, número de coma flotante bkgrndSigma, número de coma flotante pulseStartThresh, número de coma flotante pulseEndThresh, número entero numStartSamples, número entero numEndSamples vector de números de coma flotante pulseBuffer Procedimiento: Inicializar inPulseFlag = 0, pulseStartCount - 0, pulseEndCount = 0 Para cada muestra en digSamples, calcular la distancia de ahalanobis respecto al fondo: mhD 'si[i] - (dígSampl í\ - bkgrndMearj) bkgrndSigmu Si inPulseFlag no está fijado, ir al paso 4, si no ir al paso 6. Si mhDist > pulseStartThresh, colocar la muestra en pulseBuffer, aumentar pulseStartCount, e ir al paso 5; si no fijar pulseStartCount=Q, ir al paso 2. Si pulseStartCount > numStartSamples, fijar inPulseFlag e ir al paso 2. Si mhDist < pulseEndThresh, colocar la muestra en pulseBuffer, fijar lastPulseSample en la posición actual del búfer, aumentar pulseEndCount, e ir al paso 7; si no fijar pulseEndCount a cero e ir al paso 2. Si pulseEndCount es mayor que numEndSamples, regresar pulseBuffer[\ a lastPulseSample] y salir.

CUADRO V Resumen de la detección de pulso digital de fluorescencia.

En general, el convertidor A/D 689 convierte las señales analógicas de salida 701 del fotodetector 117 en la información digital correspondiente 707 que indica la característica A o la característica B (por ejemplo, X o ~X). El procesador de la señal digital 865 analiza la información digital y el procesador 873 proporciona una señal de separación 853 al sistema de separación 119 en función de la información digital detectada. 168 H. Extracción y discriminación de características El siguiente paso de procesamiento es la extracción de características realizada mediante el procesador de extracción y discriminación de características 867. Este procesador responde a los indicadores establecidos por el procesador de detección de pulsos 865. Las muestras de los pulsos detectados se colocan en la memoria compartida con el procesador de extracción de características 867. Para cada pulso 497 se determinan las características tales como el área, el ancho del pulso, la altura del pulso, el coeficiente de correlación gaussiana y/u otras características. En algunos casos los pulsos 497 son determinados como "dobletes" o inválidos y las características no se extraen. Para el caso espermatozoides bovinos 201 sólo se extraen las características para los pulsos 497 que tienen la amplitud y el ancho general de una célula viva X o Y. De manera característica, la amplitud del pulso para un espermatozoide vivo se encuentra entre aproximadamente 700 y 900 mV, aunque este intervalo ser tan amplio como de 500 a 1000 mV. Una vez que se extraen las características, éstas se comparan con los espacios de características definidos para la población o poblaciones seleccionadas para separar. Si las características coinciden con los espacios de características identificadas para la separación, entonces el procesador 867 establece un indicador que señala un comando de separación positivo para el procesador de separación 873. En general, la clasificación de una célula particular la realiza el procesador de discriminación 867 y la decisión de separación la realiza el procesador de separación 873. 169 La información digital 707 que representa la emisión de fluorescencia 31 (y por lo tanto las características de las células correspondientes que las crearon) la discrimina el software 757 con base en características específicas que muestran un comportamiento estadístico marcadamente diferente en el espacio de características (el espacio ortogonal n-dimensiona! formado por n ejes de características) para las diferentes poblaciones de interés. Por consiguiente, el primer paso al analizar la información digital 707 para la discriminación es el cálculo de estas características, un proceso llamado extracción de características que realiza el software de análisis de pulsos 749 ejecutado por el procesador 867. El cuadro VI enumera las diversas características posibles que el software 749 puede usar para esta solicitud. Se seleccionarán una o más de estas características para formar el espacio de características para la clasificación. Debe señalarse que hay características adicionales que proporcionan una mejor separación y por lo tanto esta lista es sólo un ejemplo, no es integral. Por ejemplo, el software 749 puede emplear una subrutina 753 para determinar el área de pulso 497 y/o puede emplear una subrutina 755 para determinar el pico de pulso 497. 170 CUADRO VI Resumen de las características posibles que se está considerando para usar en un análisis de pulso digital en relación con la extracción de características.

I. Exploración de rendija En general, el haz elíptico 459 proporcionado por el sistema de iluminación 109 mide las diferencias relativas de contenido de ADN en las células. La resolución puede mejorarse aún más al analizar la fracción del pulso 497 de la emisión de fluorescencia 31 detectada por el fotodetector 1 7 171 que es más probable que contenga las características que están siendo evaluadas. Un fenómeno biológico de ciertas células (por ejemplo, espermatozoides bovinos) es la localización de los cromosomas X e Y en la región subecuatorial 225 que está inmediatamente adyacente a la línea media longitudinal o ecuador o centro del núcleo 213 de la célula 201 y que tiene una longitud de aproximadamente 1 µ??. (Ver la fig. 6). En realidad, los cromosomas X/Y no están necesariamente centrados en el núcleo 213. Por lo tanto, la resolución puede mejorarse al convertir la salida analógica variable en el tiempo 701 del fotodetector 117 en información digital 707 y analizar una porción de la información digital correspondiente a la fracción del pulso 497 de la emisión de fluorescencia 31, por ejemplo, correspondiente a la luz emitida desde la región circumecuatorial 225 tal como 20-60% y en particular 20-30% del pulso de ondas centrado alrededor del pico del pulso 497. Como se señaló anteriormente, se puede emplear la exploración de rendija para obtener la medición de fluorescencia de una porción de la cromatina de cada célula en lugar de obtenerla de la cromatina en su totalidad. El haz elíptico 459 proporcionado por el sistema de epiluminacíón 415 como se mencionó antes mide las diferencias relativas del contenido de ADN en las células en secciones específicas de la cromatina, para mejorar la resolución de las células X y las células ~X en relación entre sí. Como se señaló anteriormente, la técnica de medición de exploración de rendija es un enfoque de medición de fluorescencia que enfoca el haz de excitación 25 de modo que la dimensión del tamaño del haz enfocado 459 es mucho menor 172 que el diámetro de una célula, como se muestra en la fig. 6. De esta forma, el haz láser 25 explora la célula 201 a medida que la célula pasa a través del haz de forma elíptica 459. El pulso de ondas 497 resultante producido por el fotodetector 117 en la salida 701 que detecta la emisión de fluorescencia 31 que resulta de la iluminación de la exploración de rendija contiene información acerca de la localización de la fluorescencia a lo largo de la longitud de la célula 201. Según se muestra en las figs. 45-48, a medida que la célula 201 atraviesa el haz de forma elíptica 459, los pulsos de ondas que varían con el tiempo 497 (línea roja/anaranjada) son la convolución de la intensidad relativa del haz (línea azul) y la intensidad relativa del pulso emitido (que corresponde a la emisión de fluorescencia de la tinción excitada por el haz elíptico a medida que la célula atraviesa el haz y que varía debido a que la distribución de la fluorescencia a lo largo del eje de la célula varía). Al iluminar sólo una fracción de la cromatina de la célula en un momento, la salida analógica resultante que varía con el tiempo 701 del fotodetector 117 contiene información específica de la localización de la fluorescencia dentro de la cromatina a lo largo del eje longitudinal de la célula 201. Aunque la emisión de fluorescencia 31 detectada de la exploración de rendija es menor que la emisión 31 detectada de la exploración realizada por un haz 25 con un ancho de haz equivalente al diámetro de la célula, lo que da como resultado pulsos de onda 497 de la exploración de rendija con una amplitud de pulso inferior, la mayor parte de la diferencia entre las células con cromosoma X y las células con cromosoma Y aparece en el centro 20-30% a 173 20-60% del pulso de ondas 497. S¡ sólo se considera el área rectangular 725 en la fig. 53 para discriminar los espermatozoides X-Y, entonces se puede medir una diferencia relativa mayor entre la variación localizada en el contenido de ADN dentro de la sección de la cromatina que corresponde a la región rectangular 725 debido a la presencia de los cromosomas X e Y dentro de esa región comparado con el contenido total de ADN de las células. Por ejemplo, los espermatozoides bovinos X e Y tienen una diferencia en contenido de ADN total de cerca de 3.8%. La emisión de fluorescencia 31 de los cromosomas X e Y estará contenida en la región rectangular 725. Si esta región rectangular 725 representa el 20% del pulso de ondas 497 total correspondiente a una emisión de fluorescencia 31, entonces existirá una diferencia de 14% en el contenido de ADN relativo dentro de la región. Al medir las diferencias relativas de contenido de ADN de secciones específicas de la cromatina, se mejora la resolución de la diferenciación de los espermatozoides X e Y (por ejemplo, de 3.8% a 14%). La fig. 54 ¡lustra la resolución que se puede alcanzar usando iluminación de exploración de rendija y procesando las áreas de sólo el 20% central del pulso 497 (es decir, la región rectangular 725 de la fig. 53). El histograma de la fig. 54 permite identificar un porcentaje muy alto (por ejemplo, 98%) de espermatozoides que tienen el cromosoma X y espermatozoides que tienen el cromosoma Y con un alto grado de confianza (por ejemplo, 95%). En comparación, el histograma de la fig. 44, que ilustra la resolución que se puede obtener cuando se utilizan técnicas de iluminación estándar, muestra que la exploración de rendija ofrece 174 una mejora significativa con respecto a los resultados obtenidos usando técnicas ordinarias de iluminación. Dos enfoques que se pueden emplear para obtener el área 725 de la porción central del pulso de ondas 497 como se ¡lustra en la fig. 53 son el procesamiento de las señales digitales (DSP) del fotodetector digitalizado 117 de salida analógica con que varía en el tiempo 701 , como y se trató en esta sección, o la integración analógica usando un umbral analógico desencadenante, como se detalla a continuación. Según se observa aquí, el procesamiento del DSP implica un muestreo continuo de la salida analógica que varía en el tiempo 701 del fotodetector 117 para obtener información digital 707 correspondiente a la salida 701 y aplicar algoritmos DSP a la información digital 707 para extraer las características, como por ejemplo el tamaño del área, de la información digital correspondiente a la porción central 725 del pulso de ondas 497 que corresponde a la diferencia en el contenido de ADN como resultado de la presencia de un cromosoma X o Y en diferentes células 201. Como un ejemplo sencillo, el 20% del centro del área total de cada pulso de ondas 497 se determinaría al analizar la información digital 707 correspondiente a ello. El análisis se usaría para generar un histograma como el que se ilustra en la fig. 54.

J. Exploración de láser de pulsos En una materialización, se contempla que el sistema 1 incluye un láser de pulsos para ¡luminar las células. En esta materialización, la 175 exploración de rendija (como se describe anteriormente) puede emplearse o no. Por ejemplo, se puede usar un láser de estado sólido de modo cerrado, para emitir una serie de pulsos electromagnéticos con un ancho de pulso (duración) de 1 a 100 picosegundos a una frecuencia de pulso de cerca de 50 a 150 MHz y a una potencia de salida promedio de aproximadamente 100 a 500 milivatios. Un láser apropiado es un láser Vanguard 250 de estado sólido de modo cerrado (disponible de Spectra-P ysics, Mountain View, CA 94039), que puede funcionar para emitir una serie de pulsos cerca de 12 picosegundos en ancho (duración) a una frecuencia de cerca de 85 millones de pulsos por segundo y a una potencia promedio de cerca de 350 milivatios. Dado que los 350 mW de potencia se liberan en descargas sumamente cortas de sólo 12 picosegundos, la potencia de salida máxima de dicho láser es varios cientos de veces (por ejemplo, cerca de 800 veces) mayor que la potencia promedio. La salida de un láser de esas características puede describirse como una onda cuasi continua porque, para muchas aplicaciones, la velocidad de repetición de pulso es suficientemente rápida como para aproximarse a una salida de onda continua. En efecto es posible operar el sistema como se describe anteriormente con un láser de onda cuasi continua prácticamente de la misma forma que como uno operaría con un láser de onda continua. Esto proporciona ciertas ventajas porque los láser de estado sólido habitualmente funcionan de manera más eficiente, requieren sistemas de enfriamiento menos extensos y requieren menos mantenimiento que la mayoría de los 176 demás láser. Un láser de estado sólido de pulsos de onda cuasi continua también puede proporcionar relaciones señal ruido significativamente mejores usando las técnicas de procesamiento de señales digitales. Se puede incluir un circuito de sincronización y se puede operar para producir una señal de temporización indicativa de la llegada de los pulsos láser al sitio de interrogación 1 5 (es decir, el área donde el haz láser 25 ilumina la corriente 21). Por ejemplo, el circuito de sincronización puede ser un sensor de pulso láser 3003 como se muestra en la fig. 40 para detectar luz correspondiente al pulso láser incluyendo la luz dispersa generada por la interacción de cada pulso láser con la corriente de líquido 21 y/o incluyendo la luz de los pulsos láser. Alternativamente, para láser que se pueden disparar, se puede proporcionar una señal activadora al microprocesador 131 y/o al convertidor A/D 689 para sincronizar cualquiera o ambos pulsos láser, como se observa a continuación con respecto a la fig. 50. En cualquiera de las materializaciones, la sincronización del pulso láser proporcionaría una señal del oscilador para el sistema. Con referencia a la fig. 50, un diagrama de sincronización ilustra la relación de sincronización entre los pulsos láser LP, la emisión de fluorescencia FE desde una célula como resultado de la excitación repetida por los pulsos láser LP a medida que la célula pasa a través del haz de luz 459 y las muestras digitales DS de la salida del fotodetector 701. Según se muestra en las figuras 45-49, a medida que una célula pasa a través del haz 177 láser 459 la emisión de fluorescencia 31 varía según la cantidad de iluminación de la porción de la célula que genera la emisión de fluorescencia 31. La fig. 50 ilustra veinte pulsos láser (20) LP1-LP20 que inciden sobre una célula a medida que la célula pasa por la zona de interrogación 5 de un citómetro de flujo 1. Cada pulso láser LP1-LP20 corresponde a una emisión de fluorescencia FE1-FE20, respectivamente, la cual decae exponencialmente después de la excitación prácticamente instantánea por parte del pulso láser. En una materialización, el microprocesador 131 controla el convertidor A/D 689 (ver fig. 40) para que el convertidor 689 muestree la señal de salida 701 del fotodetector 117 en el pico o cercano a éste de cada emisión de fluorescencia FE1-FE20, como se indica por las muestras digitales DS1-DS20, respectivamente. En otras palabras, el circuito de sincronización sincroniza la velocidad de muestreo del convertidor A/D 689 con la emisión de fluorescencia FE1-FE20. La señal digital resultante producida por el pasaje de una partícula a través de la zona de interrogación 5 es el equivalente funcional de la señal digital que se habría producido por la digitalización de pulsos de ondas 497 de un láser de onda continua. Como se muestra en la fig. 51, por ejemplo, al considerar sólo la intensidad de fluorescencia durante las muestras digitales DS1-DS20 y sin tener en cuenta la caída de intensidad de fluorescencia entre los pulsos láser LP1-LP20, la intensidad de fluorescencia como una función del tiempo es un pulso de ondas 497. Esto permite la extracción de características por parte del microprocesador 131 a partir de la señal digital 707 generada por el láser de pulsos para analizar la 178 célula que proporciona la emisión de fluorescencia FE1-FE20. En una materialización, se puede usar un fotodetector más sensible con un tiempo de respuesta relativamente rápido, de aproximadamente unos 2000 picosegundos para detectar con mayor precisión la emisión de fluorescencia. Por lo tanto, el láser de pulsos proporciona ventajas en un sistema de citometría de flujo 1 en que es posible usar un láser de pulsos de menor potencia para obtener sustancialmente el mismo análisis que se obtendría con un láser de onda continua que funcionara a una potencia promedio mucho mayor que la potencia promedio del láser de pulsos. Aún más, la potencia máxima de un láser de pulsos tiende a saturar los fluoróforos de modo que la emisión de fluorescencia se maximiza reduciendo así la relación señal ruido de las señales de salida del fotodetector. En otras palabras, al usar un pulso láser que contiene mucho más energía de la que se requiere para saturar el fluoróforo, las variaciones en la salida del láser no dan como resultado variaciones en la emisión de fluorescencia 31. Los técnicos de la profesión reconocerán que hay muchas maneras de hacer que un láser emita una serie de pulsos. Se entiende que se podrían usar otros láser de pulsos, incluyendo otros láser de modo cerrado, láser de conmutación de Q y de vaciado de cavidad, en lugar del láser de modo cerrado discutido anteriormente, sin apartarse del alcance de esta invención. De igual manera, muchas otras maneras de controlar el tiempo del muestreo digital y procesar la información resultante serán evidentes basándose en la descripción previa. Por ejemplo, el muestreo digital se 179 podría cronometrar para que haya un retraso diferente (o ningún retraso) entre un pulso láser y una muestra digital sin alejarse del alcance de la invención. Asimismo, el número de muestras digitales por pulso o el número de pulsos que transcurren entre el muestreo digital también se puede variar sin apartarse del alcance de esta invención.

K. Estimación de las características de la población Como se señaló anteriormente, la citometría de flujo se puede usar para discriminar los espermatozoides bovinos portadores de X de los espermatozoides bovinos portadores de Y basándose en su diferencia relativa de 3.8% en el contenido de ADN. La discriminación se logra mediante el análisis de las características de la señal que varía en el tiempo 701 que es producida por el fotodetector 7 usado para registrar la emisión de fluorescencia 31 a medida que las células teñidas pasan a través del sitio de interrogación 115. Esta interacción se ilustra en las figuras 45-48. Figuras 45-48 ilustra cómo se genera un pulso de ondas 497 por la emisión de fluorescencia 31 resultante de la interacción entre el haz láser 25 y un espermatozoide teñido 201. El pulso de emisión 497 es el integral de convolución de la función espacial de excitación y la función espacial de emisión de la célula 201. Las características del pulso de ondas 497 de fluorescencia se usan para clasificar una célula como X, Y o indeterminada. En una materialización, la discriminación X-Y depende de dos características de pulso: la altura del pico del pulso y el área del pulso. 180 Estas características se ilustran en el pulso de ejemplo que aparece en las figuras 52 y 53. Las figuras 52 y 53 son los ejemplos de los pulsos 497 de espermatozoides portadores de X y portadores de Y. Los pulsos 497 fueron generados a partir de un modelo de computadora que tomó la iluminación de excitación con un haz láser 25 que tenía un haz de luz de forma elíptica 459 con una cintura de haz gaussiano W1 de 2 pm (Fig. 6) y donde la diferencia de contenido de ADN estaba distribuida uniformemente a través del 20 por ciento central de la célula 201. Estas suposiciones son representativas de la iluminación de exploración de rendija de los espermatozoides bovinos 201 con una diferencia localizada de ADN según se trató en más detalle anteriormente. La integración de los pulsos 497 da como resultado una diferencia promedio de 3.8% entre el área del pulso 497 para un espermatozoide X y el área del pulso 497 para un espermatozoide Y. Es posible generar gráficos de dispersión e histograma del pico del pulso 497 y las características del área para las células y los núcleos teñidos. Las figuras 56-59 contienen histogramas de la característica del área para los núcleos y las células vivas teñidos, además de gráficos de dispersión del área del pulso 497 y las características del pico para los núcleos y las células vivas teñidos. Algunos de los elementos que pueden limitar la discriminación de las células vivas y en último término la velocidad de separación de las células son evidentes en estos gráficos. En particular, el histograma de células vivas de la fig. 57 y en menor grado el histograma de los núcleos (fig. 56), tienen un borde izquierdo que es característico de los 181 histogramas de intensidad de fluorescencia para las células de espermatozoides de mamíferos. Se ha determinado que el borde izquierdo es generado por una o más poblaciones de las células levemente desalineadas (es decir, células que generan emisiones de fluorescencia relativamente más débiles debido a las desviaciones leves de la alineación óptima, pero que no están tan lejos de la alineación como para causar la emisión de fluorescencia relativamente más brillante 31 del borde estrecho 209 de la cabeza del espermatozoide 205 a ser recogido por el sistema óptico 109). Sólo cerca de la mitad de los espermatozoides X pueden identificarse fácilmente en el histograma del área de células vivas. El resto se superpone con la población de espermatozoides Y y las poblaciones de células no alineadas. Aun cuando se agrega la altura del pico del pulso, como se muestra en los gráficos de dispersión en las figuras 56-59, la clasificación de los espermatozoides portadores de X puede estar significativamente limitada. Las figs. 60-61 ilustran la superposición de las distribuciones de poblaciones X e Y. En las figs. 60-61, se aplicó un modelo de computadora de cuatro componentes a los datos sin procesar 6000 (Fig. 60) para estimar la estadística de población para dos poblaciones de espermatozoides no alineados (6001 , 6003), espermatozoides Y vivos y alineados (6005) y espermatozoides X vivos y alineados (6007). (Fig. 61). Es aconsejable discriminar las poblaciones X e Y como una función del coeficiente de la variación (CV) de las poblaciones X e Y. Por ejemplo, es aconsejable reducir al mínimo el coeficiente de variación (CV) de las poblaciones X e Y para 182 mejorar la discriminación. En particular, cuando se desea una población de espermatozoides X separados, es aconsejable que el CV de la población de espermatozoides X sea menor que 1.5%, mejor cerca de 1.3% y mejor aún menor que .3%. Tradicionalmente, el CV de una distribución de intensidad de fluorescencia de espermatozoides fue considerado con respecto a las funciones de distribución para sólo dos poblaciones (X e Y). El control de calidad en lo que se refiere al CV ha sido limitado a la estimación subjetiva sin procesar del CV de las poblaciones X e Y para decidir si vale la pena continuar con el análisis o la separación. De acuerdo a una materialización de la invención actual, una función del microprocesador 131 es proporcionar una estimación automatizada del CV de la población X usando el modelo de cuatro componentes ilustrado en las figs. 60-61. Para realizar un cálculo estimativo de los CVs de las poblaciones presentes en una distribución de características (por ejemplo, área de pulso), es necesario calcular las estadísticas de segundo orden de las distribuciones de población. Esto puede lograrse aplicando un modelo de una forma conocida y buscando el mejor ajuste de ese modelo a los datos observados. Dada que se esperan datos con una distribución normal, se ha elegido un enfoque compuesto por una estimación de densidad no paramétrica de ventana de Parzen (utilizando una función kernel gaussiana) seguida de la aplicación de un modelo paramétrico de mezcla gaussiana. Específicamente, el modelo de cuatro componentes ilustrado en las figs. 60- 183 61 constan de una suma (o mezcla) de cuatro distribuciones gaussianas de una variable y estos cuatro componentes son las distribuciones de características correspondientes a espermatozoides X alineados, espermatozoides Y alineados y una población de espermatozoides no alineados de dos componentes. De este modo los parámetros que caracterizan el modelo son las medias de población (promedios) (4), desviaciones/variaciones estándar de población (4) y las probabilidades a priori (% esperado de la distribución general) (4). Estos 12 parámetros luego se pueden variar para lograr un mejor ajuste del modelo al histograma de datos observados. Con los parámetros del componente modelo así calculados, un cálculo del CV de una población de interés (en particular, espermatozoides X) se puede determinar a partir de la desviación estándar y el promedio de la población calculada: _ desviación estándar JQQ^ promedio Para reducir la complejidad computacional, las limitaciones se han colocado en el modelo para reducir la magnitud del paramétrico. En particular, las desviaciones estándar de los modelos componentes correspondientes a las poblaciones alineadas X y las alineadas Y se han limitado para que sean iguales. Además, los componentes alineados X y alineados Y se han limitado para conformar el mismo porcentaje de la mezcla total, por lo tanto las poblaciones no alineadas se suponen 50% de espermatozoides X y 50% de espermatozoides Y. 184 La estimación de densidad no paramétrica se aplica antes de la adaptación del modelo para obtener un mejor cálculo de la función total de densidad (que la suma de las densidades de los componentes) en la que se basan los datos sin procesar del histograma. La técnica específica aplicada se conoce como "ventana de Parzen" (Duda, Hart y Stork, 2001), aquí utiliza una función de kernel o ventana gaussiana debido a la naturaleza supuesta de suma-de-Gauss de la densidad subyacente. La desviación estándar del kernel gaussiano se elige para que sea un 1% del número de clases pobladas del histograma; este valor se ha observado en forma empírica para proporcionar un suavizado adecuado pero no excesivo del histograma. Cada punto de datos en el histograma contribuye así con una función del kernel centrada en la clase del histograma que contiene el punto de datos. El cálculo de densidad se obtiene luego como la suma de las funciones del kernel. La metodología elegida para la variación de los parámetros del modelo para lograr el mejor ajuste a los datos se conoce como Maximización de Expectativas (Vea Duda R.O., Hart, P.E., y Stork, D.G., 2001 , Pattern Classification 2nd Ed, John Wiley & Sons; y Moore, A., "Very Fast EM-based Mixture Model Clustering using Multiresolution kd-trees," en M. Keams y D. Cohn, Eds., Advances in Neural Information Processing Systems, páginas 543-549, 1999, Morgan Kaufman). La implementación algorítmica específica utilizada es la siguiente: Se fijan las condiciones iniciales para los parámetros del modelo. Los dos máximos locales superiores en el cálculo de densidad de Parzen se 185 usan como los sitios X e Y promedios (la amplitud inicial de los máximos para ambas poblaciones X e Y que se están calculando como la amplitud del pico derecho. Se calcula la variación inicial de la población X e Y como la variación de los datos a la derecha del mínimo local que tiene lugar entre los picos izquierdo y derecho en relación con el sitio del pico derecho. Además, las probabilidades iniciales a priori de la población X e Y se fijan como el porcentaje de todos los puntos que caen a la derecha de este mínimo local. Los estimados iniciales de la densidad gaussiana de la población X e Y luego se calculan usando estos parámetros y se restan del cálculo total de la densidad de Parzen. El promedio y la variación de los restantes puntos de datos luego se calculan y se usan para inicializar el modelo de población no alineado de dos componentes del siguiente modo. Los dos promedios de población se suponen (arbitrariamente) como que están a una separación de un 5% (2.5% arriba y abajo del promedio no alineado general). Dada una suposición (inicial) de previos iguales y variaciones iguales, entonces, las variaciones del componente se dan como: donde s2 es la varianza y µ es el promedio de la población respectiva. 1) Los cálculos actualizados de la estadística de población del componente (medias, desviaciones estándar y previos) se calculan usando el cálculo de densidad de Parzen. La ubicación de cada clase del histograma se 186 pondera en los cálculos estadísticos por el estimado de densidad de Parzen en ese intervalo. Además, cada punto de datos contribuye a todos los cálculos estadísticos de población del componente ponderados por el grado al cual se considera que ese punto pertenece a una población dada, basándose en los parámetros de población del componente actual. Este grado de miembros se determina como la razón de un valor dado de densidad de probabilidad (gaussiana) de población del componente a la suma de todos los valores de densidad de probabilidad de población del componente en el punto de datos. Por lo tanto tenemos (para todos los puntos de datos x en el histograma, las poblaciones cp^{cx,cy,c^, y el vector del parámetro de población ??=[µ?,s?,??]) miembros del componente de población usados en el cálculo de los estimados del parámetro actualizados dados por: ?(?? \ ?, ??) pertenenciaic 0 \ x, 9 ) = -=¡ — CálculoDensidadParzen x) ??(?? \ ?,?„) n?p Los promedios y las variaciones actualizadas luego se calculan usando los valores del cálculo de densidad de Parzen ponderados por estos valores de pertenencia, con los previos actualizados dados por la pertenencia promedio para cada población del componente sobre todos los puntos de datos. 2) El procedimiento de actualización del parámetro sigue hasta 187 que todos los parámetros alcanzan un estado estacionario (es decir, dejan de cambiar en forma significativa de una iteración de actualización a la siguiente (o hasta que tiene lugar un número máximo permitido de iteraciones)). Como ya se mencionó las poblaciones X e Y alineadas están limitadas en este procedimiento para tener la misma variación y probabilidad a priori. Esta limitación se logra al usar el promedio de la variación X e Y y los valores previos calculados a través del procedimiento anterior en cada iteración. Alternativamente, un enfoque de modelo similar puede aplicarse a un modelo de tres componentes (Figs. 62-63) en el cual las células que comprenden a las dos poblaciones no alineadas 6001 , 6003 en el modelo de cuatro componentes se consideran como una única distribución gaussiana 60 1 en lugar de dos subpoblaciones diferentes. Las células no alineadas pueden modelarse como tercera distribución gaussiana (mostrada en la fig. 63) que tiene una desviación media y estándar determinada por un mejor ajuste del reborde izquierdo y el pico principal izquierdo de los datos sin procesar 6010 (se muestran en la fig. 62). El modelo de tres poblaciones también ha estimado datos estadísticos para la población Y alineada 6015 y la población X alineada 6017. Una ventaja del modelo de tres componentes es que requiere sólo un espacio de parámetros de 9 dimensiones (en comparación con el espacio de parámetros de 12 dimensiones necesario para el modelo de cuatro componentes). Sin embargo, se ha encontrado que el modelo de cuatro componentes da lugar de manera característica a una 188 función de densidad calculada que coincide mejor con los datos sin procesar. Los técnicos de la profesión reconocerán que se puede usar una amplia variedad de técnicas estadísticas para calcular las características de las poblaciones alineadas X y las alineadas Y. Por lo tanto, el modelo de cuatro componentes, el modelo de tres componentes u otros modelos pueden ser implementados por cualquier algoritmo de computadora paramétrico o no paramétrico para calcular las características de las poblaciones de espermatozoides X alineados y/o las poblaciones de espermatozoides Y alineados sin apartarse del alcance de esta invención.

L. Selección de las condiciones de tinción con base en el CV Varios factores afectan a la eficiencia de separación de células teñidas de una población en subpoblaciones enriquecidas de células. Entre estos factores se encuentra la cantidad de fluorescencia diferencial entre las diversas subpoblaciones de células dentro de una población teñida. La fluorescencia diferencial es afectada por la absorción de colorante, la que varía dependiendo de factores de tinción, como por ejemplo, la concentración del colorante, la duración del período de tinción, la temperatura a la que se produce la tinción, y la cantidad y concentración de todos los aditivos que pueden estar incluidos con el colorante o agregados a la mezcla de tinción. Por consiguiente, se pueden hacer ajustes a cualquiera o a todos esos factores para aumentar la eficiencia de separación (la velocidad a la que las células se pueden separar en al menos una subpoblación enriquecida de 189 células con cierto grado de pureza y/o una pérdida mínima de las células deseadas) de la población de células teñidas. Aún más, se puede aumentar la eficiencia de un sistema de separación de múltiples muestras ajustando uno o más de esos factores para cada muestra, contrarrestando de ese modo cualquier variación entre muestras. En el contexto de la separación de esperma bovino, por ejemplo, se puede mejorar la eficiencia de separación ajustando uno o más de los factores de tinción anteriores de una muestra de semen a la siguiente para contrarrestar las variaciones entre toros o las variaciones entre muestras de un mismo toro. La determinación del coeficiente de variación ("CV") para una característica de emisión de fluorescencia dada de una población de células a ser separadas es una manera de determinar si se pueden hacer ajustes a las condiciones de tinción para alcanzar la eficiencia de separación deseada. Por ejemplo, se pueden ajustar las condiciones de tinción como una función del CV de cualquier característica extraída del pulso de onda generado por el desplazamiento de una célula a través del sitio de interrogación, tal como cualquier característica indicativa de la intensidad de fluorescencia total o la intensidad de fluorescencia pico (incluidas la intensidad de fluorescencia total y la intensidad de fluorescencia pico). Como se discutió con más detalle anteriormente, el CV es un indicador de la homogeneidad o uniformidad de una distribución de una propiedad o característica medibles de una población, como por ejemplo una característica de emisión de fluorescencia de una subpoblación particular de una población dada. El CV se puede determinar 190 dividiendo la desviación estándar de la característica medida de una muestra entre el valor promedio de la muestra. El CV también se puede determinar automáticamente mediante el sistema de citometría de flujo 9, tal como mediante la implementación del algoritmo de estimación del CV iterativo que se trató en detalle antes. Cuanto menor es el CV mayor es la homogeneidad o la uniformidad de la distribución de la característica medida. Al igual que con la tinción y separación de espermatozoides, el CV de una característica de emisión de fluorescencia particular para una muestra de espermatozoides que tienen cromosomas X e Y puede ser afectado por las condiciones de tinción. La concentración del colorante, la duración del período de tinción, la temperatura de la mezcla de tinción, y/o la cantidad y concentración de aditivos afectan al CV de una característica de emisión de fluorescencia dada. Aumentar la concentración del colorante, la duración del período de tinción, y la temperatura de la mezcla de tinción y/o reducir la cantidad o la concentración de aditivos generalmente disminuirá el CV. Dichas condiciones se pueden alterar individualmente o combinadas. Además, si uno de esos factores es tal que tendiera a aumentar el CV de una característica de emisión de fluorescencia, tal como por ejemplo, acortar el período de tinción, entonces cualquiera o más de las otras condiciones se podrían ajustar de modo de contrarrestar el efecto de la primera, tal como por ejemplo, aumentar la concentración de colorante, siendo el resultado general una disminución en el CV de la característica de emisión de fluorescencia a un nivel suficiente para alcanzar la eficiencia de separación deseada. Por 191 consiguiente, manipulando cualquier factor o cualquier combinación de dichos factores de este modo, el CV de una característica de emisión de fluorescencia de poblaciones que tienen cromosomas X e Y se puede disminuir hasta un valor que permita la separación de la muestra de esperma en una subpoblación de semen enriquecido por sexo, que comprenda un porcentaje de pureza deseado de células que contienen cromosomas X. Desafortunadamente, los cambios que tienden a disminuir el CV del esperma que contiene cromosomas X pueden tener consecuencias negativas como el incremento del costo o la disminución en la motilidad o fertilidad del esperma. Por ejemplo, en igualdad de condiciones de otros aspectos es deseable utilizar menores concentraciones de colorante y períodos de tinción más cortos para minimizar el efecto nocivo del proceso de tinción sobre el esperma. Teniendo esto en mente, se puede predeterminar un CV al cual se pueda alcanzar una eficiencia de separación aceptable. A partir de entonces, una fracción de la muestra de células a ser separada se tiñe y se somete a análisis de citometría de flujo. Se determina una característica de emisión de fluorescencia de la fracción, y la fracción se clasifica en subpoblaciones sobre la base de esa característica. Se determina el CV de la característica de fluorescencia con respecto a las células de una de las subpoblaciones (una subpoblación enriquecida). Si el CV de la característica de emisión de fluorescencia de las células de la subpoblación enriquecida es igual a o menor que el CV predeterminado al cual se produce la separación, entonces la muestra de células restante se tiñe de acuerdo con 192 las condiciones según las cuales se tiñó la fracción. A partir de entonces la muestra se separa, por ejemplo, según los métodos divulgados aquí. Si el CV de la característica de emisión de fluorescencia particular de las células de la subpoblación enriquecida es mayor que el CV predeterminado al cual se produce la separación, entonces se analiza otra fracción de la misma muestra de manera similar, pero según condiciones de tinción que se cree que alcanzarán un CV aún menor. En tal situación, el CV se puede disminuir mediante, por ejemplo, el incremento de la duración del período de tinción, el incremento de la concentración del colorante, el incremento de la temperatura a la que se tiñe la fracción o cualquier combinación de éstos. Esta serie de pasos (es decir, la eliminación de una fracción de la muestra a separar, el ajuste de las condiciones de tinción, y la determinación del CV) se repite hasta que se determine que el CV de la característica de emisión de fluorescencia particular de las células de la subpoblación enriquecida es igual a o menor que el CV predeterminado. A partir de entonces, el resto de la muestra se tiñe consecuentemente y se puede separar, por ejemplo, según los métodos divulgados aquí. En una materialización particular de la invención, la muestra de células está compuesta por una muestra de semen, y las células de la subpoblación enriquecida están compuestas por espermatozoides que tienen cromosomas X. Por consiguiente, una materialización de la invención es un proceso para evaluar una serie de condiciones de tinción de una población de células a separar, la población consta de un primer tipo de células y de un 193 segundo tipo de células. El proceso consiste en (a) teñir una fracción de la población de células con un colorante fluorescente de acuerdo con una serie de condiciones de tinción; (b) exponer las células teñidas a radiación electromagnética a medida que las células teñidas se hacen pasar a través de un sitio de interrogación de un citómetro de flujo a una velocidad, R; (c) determinar una característica de emisión de fluorescencia de las células expuestas; (d) usar la característica de emisión de fluorescencia para clasificar las células en dos o más subpoblaciones, siendo una de las subpoblaciones una subpoblación enriquecida del primer tipo de células; (e) determinar un coeficiente de variación para la característica de emisión de fluorescencia de las células de la subpoblación enriquecida; y (f) determinar si es necesario modificar alguna de las condiciones de tinción según las cuales las células se van a teñir o la velocidad, R, a la que las células teñidas se hacen pasar a través del sitio de interrogación del citómetro de flujo. En otra materialización, otra fracción de la población de células se tiñe de acuerdo con una serie diferente de condiciones de tinción y se repiten los pasos de (b) a (e) con esa fracción. Este proceso se puede llevar a cabo en dos, tres, cuatro o cualquier número de fracciones adicionales. En otra materialización, se extraen múltiples fracciones de células de la muestra al mismo tiempo. Cada fracción puede ser teñida simultáneamente, o cada fracción puede ser teñida subsiguientemente a la fracción previa que se hizo pasar por el citómetro de flujo. En el caso anterior, cada fracción se puede teñir según su propia y única serie de condiciones de tinción y el paso (f) puede consistir en usar los 194 CV respectivos para determinar una serie de condiciones de tinción a ser utilizadas para teñir otras células. En el último caso, se pueden alterar las condiciones de tinción de las fracciones teñidas subsiguientemente de acuerdo con la determinación del paso (f) con respecto a una fracción analizada previamente. En una materialización el proceso se repite hasta que se determina que el CV es igual a o menor que un CV específico (p. ej., 1.3 %). Alternativamente, una vez que se predeterminó un CV al que se puede obtener una eficiencia de separación aceptable, se puede teñir toda la muestra de células. Una fracción de la muestra de células se retira y se somete al análisis por citometría de flujo. Se determina una característica de emisión de fluorescencia de la fracción y se utiliza para clasificar las células en dos o más subpoblaciones. El CV de la característica de fluorescencia se determina con respecto a las células de una subpoblación enriquecida. Si el CV de la característica de emisión de fluorescencia de las células de la subpoblación enriquecida es igual a o menor que el CV predeterminado al que se produce la separación, entonces el resto de la muestra de células se separa después de eso. Si el CV de la característica de emisión de fluorescencia particular de las células de la subpoblación enriquecida es mayor que el CV predeterminado al que se va a producir la separación, entonces se analiza de manera similar una segunda fracción de la misma muestra y se determina el CV de la característica de fluorescencia. El CV de la segunda fracción se puede disminuir, por ejemplo, incrementando la 195 duración del período de tinción, incrementando la concentración del colorante o mediante cualquier combinación de éstos. Esta serie de pasos (es decir, el retiro de una fracción de muestra a separar y una determinación del CV) se repite hasta que se determine que el CV de la característica de emisión de fluorescencia particular de las células de la subpoblacion enriquecida es igual a o menor que el CV predeterminado. Después de eso, el resto de la muestra se puede separar, por ejemplo, de acuerdo con los métodos divulgados aquí. En una materialización particular de la invención, la muestra de células está compuesta por una muestra de semen, y las células de la subpoblacion enriquecida están compuestas por células que llevan el cromosoma X. En consecuencia, otra materialización de la invención es un proceso para evaluar una serie de condiciones para teñir una población de células a separar; la población consta de un primer tipo de células y de un segundo tipo de células. El proceso consiste en (a) teñir una fracción de la población de células con un colorante fluorescente de acuerdo con una serie de condiciones de tinción; (b) exponer las células teñidas a radiación electromagnética a medida que las células teñidas se hacen pasar a través de un sitio de interrogación de un citómetro de flujo a una velocidad, R; (c) determinar una característica de emisión de fluorescencia de las células expuestas; (d) usar la característica de emisión de fluorescencia determinada para clasificar las células en dos o más subpoblaciones, siendo una de las subpoblaciones una subpoblacion enriquecida del primer tipo de células; (e) determinar un coeficiente de variación para la característica de emisión de 196 fluorescencia de las células de la subpoblación enriquecida; (f) determinar si es necesario modificar alguna de las condiciones de tinción según las cuales se va a teñir la fracción de células o la velocidad, R, a la que las células teñidas se hacen pasar a través del sitio de interrogación del citómetro de flujo; y (g) aplicar la condición de tinción modificada al resto de la población de células. En otra materialización, se repiten los pasos de (a) a (f) al menos una vez con al menos otra fracción de la población de células. Los pasos de (a) a (f) se pueden repetir una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces o una mayor cantidad de veces. En otra materialización, se extraen múltiples fracciones de células de la muestra al mismo tiempo. Cada fracción puede ser teñida simultáneamente, o cada fracción puede ser teñida subsiguientemente a la fracción previa que se hizo pasar por el citómetro de flujo. En el último caso, se puede alterar la subsiguiente tinción de las fracciones de acuerdo con la determinación del paso (f) con respecto a una fracción analizada previamente. En otra materialización, el proceso comprende además, antes del paso (g), seleccionar la condición de tinción modificada que dé como resultado el coeficiente de variación más bajo para la característica de emisión de fluorescencia. En otra materialización, el proceso comprende la repetición de los pasos de (a) a (e) hasta que el coeficiente de variación de la característica de emisión de fluorescencia de al menos una de las fracciones sea de aproximadamente 1.3% o menor. En otra materialización de la invención, el proceso comprende además, antes del paso (g), seleccionar la condición de tinción modificada que dé como 197 resultado un coeficiente de variación de aproximadamente 1.3 o menor. Además de llevar a cabo dicho análisis antes de separar la muestra entera como se detalló anteriormente, se puede realizar un análisis similar durante el proceso de tinción y separación de la muestra en un esfuerzo por asegurar el mantenimiento de la eficiencia de separación. En consecuencia, en otra materialización, el CV de una característica de emisión de fluorescencia de las células de una subpoblación enriquecida de una fracción de una muestra que ha sido teñida previamente, una porción de la cual está en el proceso de separación, se determina como se describió antes. Los ajustes a las condiciones de tinción según las cuales se tiñó esta muestra, se hacen de acuerdo con los métodos tratados anteriormente con respecto a los ajustes previos a la separación La selección de un CV predeterminado que permita obtener una eficiencia de separación aceptable se basa en varios factores, entre los que se incluyen, por ejemplo, el tipo de células que se van a separar, la velocidad de separación y el grado de pureza deseado con respecto a la separación de la población en subpoblaciones enriquecidas. En general, se selecciona un CV que permita la separación que logre el porcentaje de pureza deseado de la subpoblación enriquecida, a la vez que minimice la cantidad de tiempo necesaria para lograr esto; como por ejemplo, obtener un grado de pureza de la subpoblación enriquecida del 85% en tanto la duración del período de tinción se reduce al mínimo. Teniendo en cuenta estos factores, el CV de la característica de emisión de fluorescencia de las células de una subpoblación 198 enriquecida se encuentra generalmente entre aproximadamente 2.0% y aproximadamente 1.0%, mejor si es entre aproximadamente 1.5% y aproximadamente .0%, mejor aún si es de aproximadamente 1.4%, y todavía mejor si es de aproximadamente 1.3%.

M. Extracción de características por diferencia crítica de pendientes El microprocesador 131' con procesamiento de señales digitales (DSP) ilustrado en la fig. 40 que se emplea como parte de un separador de células permite extraer las características del pulso de emisión de fluorescencia de resolución temporal, en particular las características que no se pueden obtener fácilmente o económicamente usando tecnología analógica. En particular, una característica de pulso que presenta propiedades no lineales y que mejora significativamente la separación y por lo tanto la resolución de las partículas A y B (por ejemplo, mejora la discriminación de espermatozoides vivos, y espermatozoides X alineados) es una característica a la que se le llama diferencia crítica de pendientes (CSD). La CSD es una cuantificación de la pendiente del pulso de emisión de fluorescencia a una amplitud de señal donde la diferencia entre la primera derivada de un pulso producido por la partícula A (por ejemplo, un espermatozoide portador de X) y la primera derivada de un pulso producido por la partícula B (por ejemplo, un espermatozoide portador de Y) se acerca a un máximo. 199 Las funciones que describen los pulsos de emisión de fluorescencia pueden expresarse en términos de la amplitud de la señal como una función de tiempo: y = x(t). Dentro del contexto de detección de las características de la CSD, se puede definir una función que describa los pulsos de emisión de fluorescencia en términos del tiempo de duración del pulso en función de la amplitud de la señal. Esta función puede denominarse una función de . La función de M se obtiene al transponer la función de pulso de emisión de fluorescencia según se muestra a continuación.

Función de pulso de emisión de fluorescencia: v=x(t) Función de M: t = M(y) t = duración del pulso y = amplitud de la señal La comparación de las funciones M para espermatozoides bovinos X e Y característicos ilustra el poder de discriminación de la característica de CSD. El panel superior de la fig. 64 muestra los trazados M promedio para los espermatozoides portadores de X y los espermatozoides portadores de Y. El panel central en la fig. 64 muestra una gráfica de las primeras derivadas de estos trazados promedio (es decir M') para los valores de amplitud de señal menores que la altura de los picos del pulso de emisión de fluorescencia promedio para los espermatozoides portadores de Y. En este trazado se puede observar que a medida que la amplitud de la señal se aproxima a la altura de los picos promedio del pulso de los portadores de 200 Y, la diferencia entre las primeras derivadas (?? y ?'?) aumenta en forma significativa. Representado gráficamente en el panel inferior de la figura 64 se encuentra la diferencia entre las primeras derivadas (?'? - ??) como una función de la amplitud de la señal; la característica de CSD cuantifica la pendiente de M (?') para un pulso individual cerca de la región donde ocurre la máxima diferencia entre las primeras derivadas (o la pendiente en un punto correspondiente en la función del pulso de emisión de fluorescencia). Para discriminar los espermatozoides portadores de X y los espermatozoides portadores de Y, se determina la CSD para cada pulso en el punto donde el borde principal del pulso corta el umbral de CSD, como se muestra en las figs. 60-61. En algunas materializaciones, la CSD puede depender de las características del haz de iluminación como el ancho del haz ya sea que el haz sea continuo o de pulsos. A continuación se trata un algoritmo para determinar la CSD con respecto a la fig. 65. La figura 65 ilustra que en algunos casos la característica de CSD tiene una naturaleza no lineal, como en el caso de la separación de las poblaciones de espermatozoides X e Y. La diferencia entre las derivadas (?'? - ?'?) aumenta a medida que el umbral de CSD se acerca el pico del pulso Y. La característica no lineal de esta diferencia coloca el valor promedio de las células Y no alineadas y alineadas a un 45% por debajo del valor promedio de las células X alineadas en el espacio de característica de CSD. La desviación estándar en el espacio de característica de CSD de las células X alineadas mayormente no se ve afectado (es decir similar al observado en los espacios 201 del pico o de la característica del área). Es esta naturaleza de alta ganancia no lineal de la característica CSD la que aumenta el número de células X alineadas que pueden ser discriminadas con exactitud. Un método computacionalmente eficaz para determinar el valor de CSD para un pulso dado se ilustra en la figura 65. Un umbral de CSD puede determinarse como una función de una altura del pico de los pulsos de emisión de fluorescencia. En particular, se puede determinar basándose en la altura máxima promedio de los pulsos de emisión de fluorescencia. El umbral de CSD se mantiene en un punto donde aproximadamente un 25% de los picos de pulso de células vivas, alineadas cae dentro de umbral o por debajo de éste. Por consiguiente, el umbral de CSD se ajusta dinámicamente durante la separación basándose en una distribución en proceso de alturas de los picos (es decir, en relación con un promedio de altura de los picos). Por ejemplo, el umbral puede basarse en un promedio en proceso ponderado de alturas de pico (donde se otorga más peso a las mediciones más recientes que a las más antiguas). El valor de CSD es la pendiente de una línea que pasa a lo largo de dos puntos en el pulso. Estos puntos son el umbral de pulso de CSD y el pico de pulso. Por lo tanto, en esta materialización el valor de CSD es sólo una aproximación de la pendiente del pulso de ondas 497 en la intersección del borde principal del pulso y el umbral de CSD. Sin embargo, otros métodos de computación del valor de CSD para un pulso dado son fácilmente evidentes, algunos de los cuales pueden proporcionar valores de CSD más precisos si se desea. 202 En otra materialización, el umbral de la CSD se ajusta dinámicamente como una función del CV de la extracción de características de CSD para una subpoblación de partículas. En el caso de separación de espermatozoides, por ejemplo, aumentando el umbral de la CSD desde un nivel relativamente bajo (es decir, el umbral de detección de pulsos) el umbral de la CSD alcanzará un nivel que dará como resultado un aumento importante en el CV de la CSD de los espermatozoides Y pero que todavía es suficientemente bajo de modo que el aumento en el CV de la CSD de los espermatozoides X es significativamente más bajo en comparación con el aumento del CV en los espermatozoides Y. Este efecto se puede observar en la distribución de la CSD como un desplegamiento en abanico de una subpoblación en la distribución general de la CSD. Se puede obtener una buena discriminación de la característica de CSD manteniendo el umbral de la CSD en este nivel. Debe señalarse que el poder discriminatorio de la característica de CSD se mejora usando el enfoque de exploración de rendija para la citometría de flujo. La forma del haz de luz 459 puede influir sobre la forma del pulso de ondas 497. Por ejemplo, al usar un haz de luz 459 que tiene un ancho relativamente pequeño W1, una diferencia de fluorescencia localizada en una partícula de muestra (por ejemplo, la diferencia de intensidad de fluorescencia localizada resultante de la localización del cromosoma X o Y en la región central 225 de un núcleo de espermatozoide 213) tiene una mayor influencia sobre la primera derivada del pulso de ondas. En consecuencia, una 203 materialización de la invención actual incluye usar las técnicas de exploración de rendija en combinación con extracción de características de CSD. Por el contrario, el uso de un haz láser con una cintura de haz que es demasiado grande (por ejemplo, igual o mayor, que el diámetro de las partículas) puede evitar el uso eficaz de la característica de CSD para discriminar las partículas. Para el ancho de la cintura del haz, el intervalo aceptable del haz de iluminación enfocado dependerá de varios factores incluido el tamaño y la forma de las partículas, la distribución del colorante dentro de las partículas que se están analizando y la cantidad de la diferencia entre los pulsos de ondas característicos para las partículas a discriminar. En el caso de espermatozoides, la extracción de características CSD de los pulsos de ondas 497 generados mediante la excitación de los espermatozoides bovinos 201 con un haz láser que presenta una cintura de haz de menos de 3 pm ha funcionado bien como se indica a continuación. Desde luego, se considera que la extracción de características de CSD con cualquier forma de exploración de rendija como se trata en la sección de exploración de rendija se encuentra dentro del alcance de este aspecto de la invención. El uso de la característica de la CSD aumenta sustancialmente el rendimiento del sistema, en particular en el caso de la separación de poblaciones de espermatozoides X-Y porque permite la recolección de muchos más espermatozoides X alineados. Debido a la superposición en las poblaciones definida en pico con respecto al área o el aumento en el tiempo con respecto o en los espacios aumento en el tiempo con respecto a 204 característica del área, no más de cerca del 70% de espermatozoides X alineados pueden ser discriminados con una certidumbre de aproximadamente 85% o más. Cuando se usa la característica de la CSD, puede discriminarse el 95% o más de los espermatozoides X alineados, lo que aumenta significativamente el porcentaje de espermatozoides X vivos que se pueden recoger sin reducir la pureza de la población de los espermatozoides X recogidos por debajo de un nivel deseado de pureza. Esto se observa gráficamente en los datos de células vivas mostrados en las figuras 66-69. La naturaleza no lineal de la característica de CSD permite que los espermatozoides X sean aislados para la separación. La selección bruta en CSD aplicada en el gráfico de dispersión que se muestra en la Fíg. 68 da como resultado un área de población de espermatozoides X 70% pura.= Cuando la discriminación de separación bivariable se aplica en los espacios de área y de característica CSD (Fig. 68), > 95% de los espermatozoides X alineados pueden ser discriminados para la separación. Los datos en las Figs.=66-69 se obtuvieron sobre una producción total de células de cerca de 22000 células vivas por segundo en un canal de un sistema de citometría de cuatro canales (ver el comentario del sistema multicanal más adelante). Aun habilitando la detección de coincidencias (pureza alta), se recogieron más de 6000 espermatozoides X por segundo a un nivel de pureza de al menos 85% de pureza. Las figuras 66-69 ¡lustran una ventaja de la característica de CSD cuando se usa para discriminar espermatozoides portadores de X y 205 espermatozoides portadores de Y. Las figuras 66 y 67 son histogramas de la característica del área de los pulsos de emisión de fluorescencia para el espacio de características definidú en los gráficos de dispersión que se muestran en las figs. 68 y 69. En la fig. 68, la característica de CSD ha movido la mayoría de los espermatozoides Y alineados y no alineados completamente fuera de la pantalla del gráfico de dispersión. JEsto deja una población X con una pureza del 70% en el marco del gráfico de dispersión, que es lo que se muestra en el histograma del área del pulso en la fig. 66. La discriminación no CSD se muestra en el gráfico de dispersión del área de pulso/aumento en el tiempo que se indica en la fig. 69. Los espermatozoides X alineados constituyen cerca del 30% del histograma del área correspondiente (Fig. 67). Más del 95% de los espermatozoides X alineados puede recogerse a una pureza > 85% usando la característica de CSD para la discriminación. En comparación, no se puede discriminar más del 70% de los espermatozoides X alineados utilizando el espacio de característica a la derecha tradicional. Se han completado varias separaciones de células vivas usando la técnica de discriminación bivariable del CSD con respecto al área de pulso. La figura 70 es un ejemplo de cómo se puede usar una región de separación fijada en este espacio bidimensionai de características para excluir los espermatozoides no alineados y los espermatozoides Y. La figura 70 ilustra una región de separación bivariable fijada en un gráfico de dispersión de CSD con respecto a la dispersión del área de pulso. Obsérvese cómo la región de separación baja más en la característica del área para los valores altos de 206 CSD (CSD aumenta de izquierda a derecha y el área aumenta de abajo hacia arriba) y se mueve más alto en la característica del área mientras la CSD disminuye a valores más bajos. La región de separación bivariable establecida en el gráfico anterior de dispersión de CSD con respecto al área de pulso se usó para separar espermatozoides X a una velocidad de decisión de separación > 6000 espermatozoides X por segundo con una velocidad de entrada de células vivas de 26000 células por segundo. La pureza basada en un reanálisis de citometría de flujo fue de 87%. La característica de CSD permite una estrategia de separación de alto rendimiento, interrupción en no coincidentes (es decir, aceptación de coincidentes o alta recuperación). En algunas materializaciones, una característica de pulso podría proporcionar una separación muy cercana a la línea de base y por lo tanto una clasificación exacta de 100% de espermatozoides X e Y vivos. Esta condición permitiría separar las células a velocidades razonablemente altas sin descartar las gotitas que contienen las dos, una célula clasificada como X y una como no-X (ya sea desconocida o Y). Esta estrategia de separación se conoce como estrategia de alta recuperación o aceptación de coincidentes. Se realizó un experimento para probar esto usando la característica de CSD. Se realizaron las separaciones de aceptación de coincidentes con una velocidad de entrada de 12000 células X vivas por segundo en un canal de un citómetro de flujo de cuatro canales. 77% de las células X se alinearon adecuadamente, haciendo que 4600 células X por segundo estuvieran potencialmente disponibles para la separación. En 207 estas condiciones, se separaron 4300 células por segundo en la población de células X. Un análisis de pureza posterior indicó una pureza de esta separación de > 87% sin corrección para células muertas y un 89% con corrección para células muertas. Inmediatamente después se realizó una separación de detección de pureza elevada, de rechazo de coincidentes en las mismas condiciones. Se observó una velocidad de recolección de 3200 3500 células por segundo. El análisis de pureza indicó una pureza de un 92% sin corrección para células muertas y una pureza de un 94% con corrección para células muertas. Los resultados del experimento anterior indican que a una velocidad de entrada de 12000 células vivas por segundo, > 92% de células X alineadas se pueden recoger a una pureza > 85%. Esta es una indicación de que la característica de CSD proporciona una clasificación con una precisión del 95% de todas las células X alineadas. En estas circunstancias, el rendimiento del separador de células está limitado principalmente por la alineación correcta de las células. La figura 71 ilustra una materialización de un nuevo análisis de citometría de flujo para una prueba en la cual el panel izquierdo corresponde a la estrategia de separación de aceptación de alta recuperación/coincidencia (estrategia de interrupción en no coincidentes) y el panel derecho corresponde a la estrategia de separación de rechazo de pureza elevada/coincidencia (estrategia de interrupción en coincidentes). El panel izquierdo (87% puro) es de una velocidad de salida de 4400 células X por segundo de interrupción en 208 no coincidentes. El panel derecho es de una separación completada en las mismas condiciones excepto que las gotitas que contenían células contaminantes fueron interrumpidas. La pureza para esta separación fue de aproximadamente 92%. Estas separaciones demuestran que las separaciones de alta recuperación, interrupción en no coincidentes son posibles cuando se usa la característica de CSD para la discriminación. El uso de la característica de CSD no está limitado a la separación de espermatozoides o a una especie particular de espermatozoides. Como los técnicos de la profesión apreciarán de la descripción anterior, la característica de CSD puede adaptarse para mejorar la discriminación entre cualquier grupo de partículas que generen pulsos de señal que tengan características diferentes de derivadas de primer orden independientemente de la causa de la diferencia.

N. Discriminación Una vez las características de los pulsos han sido extraídas por el software de análisis de pulsos 749, la discriminación (por ejemplo, clasificación) de pulsos la realiza el software de discriminación de pulsos 757 ejecutado por procesador 867 empleando una aplicación de lógica como puede ser la regla de decisión de Riesgo mínimo de Bayes. Esta regla es una modificación de una regla de decisión de Error mínimo de Bayes que permite la asignación (y el ajuste) de costos dispares asociados con la toma de diferentes decisiones de clasificación (por ejemplo, discriminación) erróneas. 209 El Error mínimo de Bayes calcula el límite de decisión 763 o la superficie de decisión como la superficie de igual probabilidad a posteríori entre poblaciones en el espacio de características. Para el caso de las distribuciones de probabilidad gaussianas (supuestas) esta superficie es en general cuadrática, aunque en ciertas condiciones puede ser lineal (o puede aproximarse en forma cercana por un hiperplano). La decisión de clasificación (por ejemplo, discriminación) se lleva a cabo calculando primero las probabilidades a posteríori para un punto dado en el espacio de características (en general en las densidades de probabilidad condicional de clase y las probabilidades conocidas/supuestas de población a priorí usando la Regla de Bayes) y eligiendo luego la etiqueta de la clase como la de la población que tiene la mayor probabilidad a posteríori. El Riesgo mínimo de Bayes incluye un factor para permitir el ajuste del límite de la decisión 763 en el caso deseado para asignar diferentes costos por hacer diferentes errores de clasificación (por ejemplo, puede ser más costoso clasificar células "Y" como células "X" que viceversa). En esta aplicación, esto permite una compensación entre la pureza y la recuperación de la muestra separada. En esta regla de decisión, el "riesgo" de asignar cada etiqueta de clase posible a un punto en el espacio de características se calcula como la suma de las probabilidades a posteríori de pertenencia a cada población multiplicada por el costo asociado con clasificarlas como la población actual dada la pertenencia verdadera a la otra población. El cuadro 6 resume el procedimiento para la clasificación de Error mínimo de Bayes. Se 210 debe tener en cuenta que para las densidades gaussianas de múltiples variables, la evaluación de la regla de Bayes para obtener las probabilidades a posteriorí puede reducirse a la evaluación de la función cuadrática vista en el cuadro VII, dado que los coeficientes W, w, y w0 son como los calculados en el procedimiento de inicialización de parámetros del algoritmo de discriminación dado en el cuadro II. La fig. 74 muestra un ejemplo gráfico de la clasificación por este procedimiento. La ilustración de la izquierda es una ilustración esquemática de las dos poblaciones 1 y 2 y el límite de decisión 763 que separa las poblaciones. El histograma a la derecha muestra dos conjuntos concéntricos de elipses que definen las regiones X e Y, donde el límite de la decisión 763 es una línea definida por la intersección de las elipses.

Algoritmo: Clasificación de pulso de fluorescencia de Error Mínimo de Bayes (discriminación) vector de números de coma flotante pulseFeatures, para cada población de clase ;': matriz de números de coma flotante W¡, vector de números de coma flotante w¡, número de coma flotante w¡0 número entero classLabel Procedimiento: Para cada clase/población /, calcular el valor del discriminante de la función g¡. g¡ - pulseFeatures1 · W¡ · pulseFeatures + wt' · pulseFeatures + wiQ Para cada clase/población /', calcular el valor del riesgo de la función riskf. lnicializar risk¡=0, luego para cada clase/población j: riski = mfc¡ + cost¡j * gj Buscar j s.t. risk¡ = mmjrískj) V /. Regresar classLabel=j y salir. 211 CUADRO VII Resumen de la clasificación (discriminación) de pulso digital de fluorescencia por la regla de decisión de Error mínimo de Bayes.

Para tener una robustez adicional, se lleva a cabo un paso adicional en la clasificación de pulsos digitales de fluorescencia. Se calcula la distancia de Mahalanobis de un pulso en el espacio de característica de la población asignada por el Error mínimo de Bayes, y si es mayor que un umbral, el pulso se rotula como "no clasificado" o alguna otra indicación apropiada de que no es probable que sea un miembro de alguna población conocida. La fig. 75 ilustra el efecto de este paso adicional, usando nuevamente las características calculadas de los datos de pulso de fluorescencia adquiridos en forma digital. En general, el convertidor A/D 689 convierte las señales analógicas de salida 701 del fotodetector 117 en la información digital correspondiente 707 que indica la característica A o la característica B (por ejemplo, X o ~X). El procesador de la señal digital 865 extrae características de la información digital y el procesador 873 proporciona una señal de separación 853 al sistema de separación como una función de las características extraídas. 212 O. Clasificación de separación y sincronización de gotitas El cuarto procesador de separación 873 administra la clasificación de gotitas, ejecuta la estrategia de separación y ingreso un pulso desencadenante de separación 853 que está sincronizado con la gotita seleccionada para la separación. Este procesador 873 recibe información de clasificación de células del procesador de discriminación 867 y relaciona esa información al oscilador de generación de gotitas 703 (es decir alinea la posición de partículas clasificadas para separación en una población con la formación de gotitas). Determina si hay coincidencia dentro de una gotita y maneja esa coincidencia basándose en estrategias de separación predeterminadas. Mantiene un FIFO de todas las clasificaciones de células y decisiones de separación de gotitas que establece el retraso correcto entre el momento en el que la partícula fue observada en tiempo real y el momento en el que la partícula llega a la última gotita unida. Producirá un pulso de salida adecuadamente cronometrado 853 de la polaridad y la amplitud apropiada para cada gotita seleccionada para separar. En general, el convertidor A D 689 convierte las señales analógicas de salida 701 del fotodetector 17 en la información digital correspondiente 707 que indica la característica A o la característica B (por ejemplo, X o ~X). El procesador de la señal digital 867 discrimina la información digital 707 que indica la característica A o que indica la característica B (por ejemplo, X o ~X) y proporciona una señal de separación 853 al sistema de separación 9 en función de la información digital 213 discriminada. En general, los procesadores de la señal digital 863, 865, 867, 873 incluyen instrucciones para detectar pulsos de ondas representados por la información digital, las instrucciones para extraer las características en los pulsos detectados y las instrucciones para discriminar los pulsos detectados como una función de sus características extraídas. Además, los procesadores incluyen instrucciones para definir un límite de decisión 763 que discrimina entre las características extraídas que representan las características A y las características extraídas que representan la característica B. Aún más, los procesadores 863, 865, 867, 873 pueden ajustar optativamente la ubicación relativa del límite de decisión 763 con respecto a las características extraídas que representan la característica A y con respecto a las características extraídas que representan la característica B como una función de al menos uno de lo siguiente: (1) la pureza de al menos una población con respecto ya sea a las partículas con la característica A o a las partículas con la característica B, y (2) la cantidad de las partículas con la característica A y las partículas con la característica B en al menos una población en relación a la cantidad total de partículas con la característica A y de partículas con la característica B en la corriente. Por ejemplo, el procesador puede mover el límite de decisión 763 para incluir menos de la población 1 y más de la población 2, o viceversa, con base en la salida de una muestra particular o con base en la salida deseada (por ejemplo, como se detalló anteriormente en lo que se refiere a la regla de decisión de Riesgo mínimo de Bayes para 214 ajustar el límite de decisión para costos dispares).

P. Compensación de la dispersión Dado que con el transcurso del tiempo los pulsos de onda correspondientes a la emisión de fluorescencia pueden variar o presentar dispersión con el transcurso del tiempo (por ejemplo, debido a variaciones de tinción, cambios de temperatura, tiempo de la muestra y/u otros factores) el sistema puede emplear optativamente software de análisis de dispersión 761 (Fig. 72) que definen umbrales dinámicos que varían para compensar cualquier efecto de dispersión. En particular, los umbrales de detección de pulsos empleados por el software 747 pueden ajustarse para cualquier variación lenta en las características de fondo de la señal, y el algoritmo de discriminación del software 757 puede ajusfar el límite de decisión 763 (Fig. 74) para responder a cualquier dispersión en las poblaciones en el espacio de características. En el caso del algoritmo o algoritmos empleados por el software de detección de pulsos 747, el software de compensación de dispersión 761 logra la compensación de la dispersión actualizando las estimaciones de desviación estándar y media de fondo basándose en estimaciones estadísticas de muestras calculados dentro de una ventana móvil de un largo dado de muestras (por ejemplo, 0-100 muestras) finalizando con la muestra actual. Dada la tasa dispersión lenta (supuesta) en relación con la frecuencia de adquisición de datos, las estadísticas de fondo no necesitan actualizarse 215 con cada muestra; mejor, las actualizaciones de estadísticas de fondo pueden ocurrir periódicamente (por ejemplo, cada 6 segundos; ver el carácter de referencia 795 y la fig. 82). Además, la ventana puede contener una ponderación menor que la unidad para permitir un índice de "olvido" para restar peso a las muestras anteriores con respecto a las muestras más recientes en los cálculos estadísticos. La fig. 76 ilustra el concepto del cálculo estadístico (promedio) dentro de una ventana móvil sin y con un índice de "olvido". Similar a la compensación de dispersión del algoritmo de detección, el o los algoritmos de discriminación empleados por el software de discriminación de pulsos 757 logran una compensación de dispersión mediante actualizaciones periódicas de las estadísticas de segundo orden de las poblaciones en el espacio de características. En este caso, sin embargo, sólo aquellos valores de la característica de los pulsos asignados a una población dada se usan para actualizar las estadísticas de esa población. Nuevamente, la ponderación no unitaria se puede usar para incluir un índice de "olvido". La fig. 77 muestra una ilustración conceptual de los efectos de aplicar esta técnica a las poblaciones en el espacio de características. La fig. 77 ilustra un ejemplo de la compensación de dispersión para las estadísticas de población en el espacio de características. El amarillo denota a la población 1 (X), el verde a la población 2 (Y), los rombos a los cálculos promedio de la clase (con una ilustración exagerada de dispersión) y las flechas de bloque a los cambios en los cálculos de covarianza de la población 216 reflejados en la deformación de las elipses de slgma constante. En general, el procesador de la señal digital 863 emplea un umbral de detección para analizar la información digital, donde el umbral es una función de un cálculo promedio de fondo y una desviación estándar de las señales muestreadas de salida que varían con el tiempo calculadas dentro de una ventana móvil de muestras que finalizan con la muestra actual.

Q. Ventaja de técnicas completamente digitales sobre técnicas analógicas Una de las ventajas principales para usar un sistema totalmente digital para la separación es que no hay ningún "tiempo muerto" asociado con la detección y el análisis de un pulso. Con sistemas analógicos siempre hay un "tiempo de conmutación" finito requerido para los componentes electrónicos se reinicien después de que ocurre y se detecta un pulso. Este tiempo generalmente se encuentra en el orden de al menos un microsegundo. Como el sistema digital capta una corriente continua realmente no tiene ningún tiempo muerto. Otra ventaja de un sistema digital es la capacidad de mirar hacia adelante y hacia atrás en el tiempo en torno a un pulso clasificado para separar. En general, el procesamiento de señales digitales requiere cerca de cinco (5) períodos de gotitas para el análisis. Preferentemente, el retraso de tiempo entre la iluminación de las gotitas 115 y la formación de las gotitas 107 es aproximadamente de siete (7) períodos de gotitas. Esto permite al sistema 217 clasificar una partícula específica basándose en la probabilidad de que contaminará a la población utilizable según se indica por las características de la partícula específica y basándose en la proximidad de la partícula específica a otra partícula clasificada. Como un ejemplo, el procesador de separación 873 puede rechazar una partícula visualizada como que tiene una probabilidad de 50% de ser una célula X viva mientras que el procesador de separación 873 puede aceptar una partícula visualizada como que tiene una probabilidad de 50% de ser una célula X viva cuando la partícula es coincidente con una segunda partícula visualizada como que tiene una probabilidad de 95% de ser una célula X viva.

R. Análisis analógico de células También se contempla que las señales de salida que varían en el tiempo, provenientes del fotodetector, pueden ser procesadas por circuitos analógicos 819, como por ejemplo un arreglo de puertas programable de campo, que puede ser menos costoso que un analizador de células digital. La fig. 42 es un diagrama funcional de una materialización de un analizador analógico de células que puede ser empleado como parte del sistema de acuerdo con la invención. La fig. 53 ilustra gráficamente el análisis analógico. Se fija un umbral para producir un factor desencadenante basado en la altura del pulso. El umbral abre una ventana de integración que controla un integrador analógico para acumular carga. La ventana permanece abierta ya sea durante un período fijo o hasta que la amplitud del pulso cae por debajo 218 del umbral desencadenante. De esta forma, sólo el área de la porción del pulso dentro de la ventana de integración se usa para las mediciones relativas de fluorescencia. Con referencia a la fig. 42, la salida 701 del fotodetector 117 se alimenta a un integrador 825 que integra la señal de salida 701 en sincronía con el oscilador de gotitas 703. La señal integrada se alimenta a un comparador de ancho/área 827 para comparar el nivel de la señal integrada con un nivel de umbral que define un pulso (por ejemplo, un pulso puede definirse como una señal integrada con 40% de certeza a un umbral determinado). Una calculadora del umbral dinámico A 829 funciona de forma similar a la compensación de dispersión observada anteriormente en que sigue el nivel de señal integrada y varía el nivel del umbral que utiliza el comparador de ancho/área como una función de las variaciones en el nivel de señal integrada promedio. La señal discriminada por el pulso se alimenta a un comparador de ventana 837 para confirmar que el área de pulso está dentro de un intervalo aceptable. La señal discriminada por pulsos también se alimenta a un circuito de ancho de pulso y lógica desencadenante 839 para confirmar que el ancho de pulso está dentro de un intervalo aceptable. Si el área y el ancho son aceptables, la lógica proporciona una señal desencadenante a un controlador l/O 843 que indica la decisión de separación 841. Por lo tanto, el comparador de la ventana 837 y el ancho de pulso y lógica desencadenante 839 toman la decisión sobre si una célula debe ser clasificada como una 219 célula X o una célula ~X. El controlador l/O 843 proporciona la decisión de separación 841 al tablero del controlador de separación 847 en forma de una señal X o ~X. El controlador l/O 843 también incluye una interfaz de Bus Serial Universal (USB) 849 para conectar a la PC 735 y puede tener un puerto l/O para conectar a los controladores esclavos 845 de los otros canales. El analizador analógico de células también incluye un puerto de Grupo de Acceso de Prueba Conjunta (JTAG) 833 para programar el comparador de ancho/área, el comparador de ventana y el ancho de pulso y lógica desencadenante. También se contempla que el analizador analógico de células puede emplearse simultáneamente con el analizador digital de células 705. Por ejemplo, el analizador analógico se puede usar para ajustar los umbrales de voltaje usados por el analizador digital. Por otro lado, el analizador digital se puede usar para identificar diversas características del pulso y esta información de características se puede usar para configurar el analizador analógico de células, en particular si se implementa con un arreglo de puertas.

Estrategias de control En general, el microprocesador 131 se programa para implementar estrategias de control y de separación que tienen el propósito de optimizar la eficiencia del sistema 1 en cuanto a la producción y/o la pérdida de las partículas deseadas para afrontar cualquier requisito de costo del producto separado. Esto puede incluir, por ejemplo, equilibrar la necesidad de 220 pureza elevada de al menos una población recolectada y la necesidad de recuperar al menos un porcentaje mínimo de partículas deseadas de la muestra que se está separando. Lograr tal equilibrio es importante, en particular en el contexto de las aplicaciones comerciales donde el costo y la rentabilidad son consideraciones importantes. Con este fin, el microprocesador 131 ¡mplementa una estrategia de control que es una serie de instrucciones y/o algoritmos que controlan las variables del sistema como por ejemplo la velocidad de ingreso de líquido y/o los parámetros de separación. El microprocesador también ¡mplementa una estrategia de separación que define el proceso de decisión para determinar cómo se separa cada partícula o grupo de partículas. Cada estrategia de control específica puede emplear una o más estrategias de separación. Se pueden usar diversas estrategias de separación en factores tales como la estrategia de control seleccionada, el sistema de detección de partículas y/o la información relacionada con la distribución de partículas en la corriente de líquido. Con respecto a la distribución de partículas, la fig. 78 ilustra una corriente de líquido que contiene un ejemplo de distribución de partículas. En este ejemplo específico, la corriente está formada por una boquilla similar a la boquilla descrita anteriormente y contiene una mezcla de partículas que tienen diferentes características A y B, por ejemplo, espermatozoides X e Y. Según se muestra, por lo general las células se ubican una detrás de otra en una serie que puede considerarse como que conforman conjuntos secuenciales de 221 partículas. Estos conjuntos incluyen los conjuntos de primera partícula donde cada uno está formado por una o más partículas que tienen una característica A (por ejemplo, indican que tienen un espermatozoide X vivo), los conjuntos de segunda partícula donde cada uno está formado por una o más partículas que tienen una característica B (por ejemplo, indican que tienen un espermatozoide Y o, más en general, un espermatozoide que no es una célula X viva (~X), como por ejemplo una célula Y o una célula X o Y muerta) y los conjuntos de tercera partícula donde cada uno está formado por dos o más partículas con menos espacio entre sí donde al menos una de ellas tiene la característica A y al menos una de ellas tiene la característica B (por ejemplo, uno o más espermatozoides X y uno o más espermatozoides ~X). Los conjuntos de tercera partícula también se denominan de aquí en adelante como conjuntos de partículas "coincidentes". Que una partícula específica se considere como que conforma un conjunto en sí misma o una parte de otro conjunto dependerá principalmente de su posición espacial y/o de la separación en relación con las partículas adyacentes. Por ejemplo, en un sistema de separación de gotitas, los diversos conjuntos de partículas serán definidos por las partículas en las gotitas. En un sistema de separación de fotoablación donde se usa un haz láser para destruir (matar o dañar de otro modo) los conjuntos de partículas seleccionadas con el fin de proporcionar una población recogida que tenga un contenido deseado, según lo tratado a continuación en la sección de "Separación por fotoablación", los diversos conjuntos de partículas 222 serán definidos por la proximidad espacial de las partículas, es decir, si la separación espacial entre las partículas es suficiente como para permitir la clasificación precisa de las partículas y/o la destrucción de una o más partículas no deseadas usando el haz láser sin destruir también una o más partículas deseadas. De igual manera, en un sistema de separación por conmutación de líquidos donde las porciones de la corriente que contienen las partículas seleccionadas se desvían para proporcionar una población recogida con un contenido deseado, como se trata a continuación en el sistema de "Separación por desviación del líquido", los diversos conjuntos de partículas serán definidos por la proximidad espacial de las partículas, es decir, si la separación espacial entre las partículas es suficiente como para permitir la clasificación precisa de las partículas y/o la desviación de las partículas seleccionadas. Se observará de lo anterior que la decisión de separación aplicada a los diferentes conjuntos de partículas puede variarse, según el resultado o la producción deseada del sistema. Por ejemplo, en un sistema de separación de gotitas, la estrategia de separación usada puede depender del tratamiento de gotitas "coincidentes", es decir, las gotitas que contienen los conjuntos de tercera partícula. En el manejo de los espermatozoides bovinos en un sistema y método de separación de gotitas por citometría de flujo como se describe aquí, por ejemplo, para mejorar el número de espermatozoides X en al menos una población recogida, puede ser aconsejable usar una estrategia donde cada gotita coincidente que contenga un espermatozoide X 223 se acepte y se separe como si contuviera sólo espermatozoides X, aunque la gotita también pueda contener un espermatozoide ~X (estrategia de aceptación de coincidentes). Por otro lado, para mejorar la pureza de los espermatozoides X recogidos en la población establecida, es posible que sea aconsejable rechazar cada gotita coincidente que contenga un espermatozoide ~X aunque la misma gotita también pueda contener un espermatozoide X (estrategia de rechazo de coincidentes). En general, según se señalará a continuación, hay muchas estrategias de control que pueden emplearse para maximizar la producción de partículas y hay muchas estrategias de separación que pueden emplearse con cada estrategia de control en particular. Las estrategias pueden aplicarse a diversas técnicas de separación usando la citometría de flujo, como la separación de gotitas, la separación por fotoablación y la separación por conmutación de líquido. Aún más, las estrategias anteriores se pueden usar para separar cualquier tipo de partícula de acuerdo a cualquier característica o características deseadas de la partícula. Según una materialización, el microprocesador controla la velocidad a la cual el sistema dispensador de líquido ingreso el líquido que contiene las partículas como una función de otras variables del sistema. Por ejemplo, el microprocesador puede controlar la velocidad de ingreso de líquido como una función de un resultado de producción deseado. Ya que el microprocesador determina la identidad de cada partícula y determina si ésta es dirigida al menos a una población recogida, el microprocesador puede 224 determinar y controlar el resultado de producción mediante la variación de la estrategia de control y/o mediante la variación de la estrategia de separación. Un resultado deseado de producción en general puede definirse como al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de al menos una población recogida con respecto a las partículas con la característica A o a las partículas con la característica B ("alta recuperación"), y (2) la cantidad de partículas con la característica A en la población establecida en relación con la cantidad total de partículas con la característica A en la corriente o la cantidad de partículas con la característica B en la población establecida con relación a la cantidad total de partículas con la característica B en la corriente ("pureza elevada"). Como otro ejemplo, el sistema puede emplear una velocidad de ingreso de líquido sustancialmente constante y el microprocesador puede controlar los parámetros de separación como una función de un resultado deseado de producción. En este último ejemplo, el resultado deseado de producción en general puede definirse como una combinación de (1) la pureza de las partículas en al menos una población recogida y (2) la cantidad de partículas deseadas disponibles en la corriente pero no incluidas en la población establecida ("velocidad de flujo constante"). En general, se puede asumir que cuando se separan dos poblaciones una célula identificada podría tener una probabilidad de 50/50 de formar parte de una población o de la otra. Sin embargo, también se contempla que una célula no identificada en realidad puede tener una probabilidad diferente a la de 50/50 de formar a parte de una población o de la 225 otra. Esta otra probabilidad puede determinarse mediante un análisis empírico o por otras características con respecto a la muestra que está siendo separada. A continuación se tratan en más detalle varias estrategias diferentes de control.

A. Estrategia de control de alta recuperación Un tipo de estrategia de control puede denominarse como una estrategia de control de "alta recuperación". El objetivo de esta estrategia es maximizar el número de partículas deseadas separadas en la población de las partículas deseadas siempre que la pureza de esa población se encuentre en un nivel de pureza aceptable o por encima de éste. De acuerdo con esta estrategia, los conjuntos de primera partícula descritos anteriormente se clasifican en la población de las partículas deseadas porque cada uno de estos conjuntos contiene una o más partículas que tienen una característica A deseada. Los conjuntos de tercera partícula también se separan en la población de partículas deseadas (aceptación de coincidentes) porque cada uno de estos conjuntos también contiene a una o más partículas que tienen una característica A deseada, aunque esté acompañada de una partícula más que tenga la característica B. Por otra parte, se rechazan los conjuntos de segunda partícula (es decir, no separados en la población de partículas deseadas) porque no contienen una partícula que tenga la característica deseada. Para optimizar la producción usando esta 226 estrategia, el microprocesador aumenta la velocidad de ingreso de líquido siempre que la pureza de la población recogida se encuentre en un nivel aceptable o por encima de éste. Dicho de otra forma, la velocidad de ingreso de líquido se aumenta siempre que el nivel probable de la contaminación de la población de las partículas deseadas se encuentre en un nivel aceptable o por debajo de éste. Como un ejemplo, se puede considerar el uso de una estrategia de control de alta recuperación para la separación de los espermatozoides X e Y en la corriente de líquido de la fig. 78. El resultado deseado puede ser separar todas las células X en una población de células X siempre que la población permanezca en un nivel de pureza aceptable o por encima de éste, por ejemplo, siempre que X/(X+Y) sea mayor que 85% o algún otro nivel aceptable. Para obtener este resultado, los conjuntos de primera partícula son separados en una población de células X porque contienen sólo una o más células X. Los conjuntos de tercera partícula también son separados en la población de células X porque también contienen una o más células X, aunque también pueden contener una célula Y (o ~X). Los conjuntos de segunda partícula son separados en alguna otra población porque no contienen una o más células X. En este ejemplo, la velocidad a la cual el sistema dispensador de líquido ingreso el líquido que contiene las células a la boquilla seguiría aumentando siempre que la pureza de la población de células X sea mayor que 85%. Por el contrario, si la pureza de la población de células X desciende debajo de un 85%, se reduce la velocidad de ingreso de 227 líquido. En el contexto de un sistema de separación de gotitas, se conoce que de acuerdo a la ecuación de Poisson para cualquier velocidad dada de generación de gotitas, el número de gotitas de varias células aumentará a medida que aumente la velocidad de ingreso de células. En otras palabras, el aumento de la velocidad de ingreso de líquido que contiene las células aumentará el número de gotitas de varias células. Por consiguiente, si se usa la estrategia de separación de aceptación de coincidentes y las gotitas coincidentes que contienen conjuntos de tercera partícula son separadas en la población de las partículas deseadas, el aumento de la velocidad de ingreso de líquido dará lugar a una disminución en la pureza de la población recogida porque a velocidades mayores de ingreso de líquido se generan y se recogen más gotitas coincidentes. La figura 79 ilustra este resultado para un liquido de 2 (dos) partículas de modo que se captura el 100% de las partículas deseadas. Como se muestra, a velocidades muy bajas de ingreso de líquido (velocidad de ingreso de líquido en el eje x), la pureza (eje y) de la población resultante recogida es muy alta porque se están generando y recogiendo muy pocas gotitas coincidentes que contienen conjuntos de tercera partícula. A medida que aumenta la velocidad de ingreso de líquido (la velocidad de ingreso de líquido aumenta hacia la derecha en el eje x), el porcentaje de gotitas coincidentes generado aumenta dando como resultado la recolección de más gotitas coincidentes y reduciendo la pureza de la población utilizable (a lo largo del eje y). En el ejemplo específico ilustrado, la velocidad de 228 ingreso de líquido es de 30K partículas/segundo a una pureza de aproximadamente 80%. Los resultados de usar una estrategia de alta recuperación pueden ser notables, como se ilustra por medio de un ejemplo sencillo dónde los espermatozoides X e Y se separan usando un proceso de separación de gotitas. Supongamos, por ejemplo, que las gotitas se generan a una velocidad de 60K/segundo y que los espermatozoides ingresan al sitio de interrogación a una velocidad de 30K/seg. Según la ecuación de Poisson, si todas las gotitas que contienen células X son separadas en la población de células X, incluyendo gotitas coincidentes que contienen células X e Y, se recogerán aproximadamente 15000 células X cada segundo. La población recogida incluirá cerca de 2600 células Y, reduciendo la pureza de la población con respecto a las células X a cerca de 85.2%. Sin embargo, el número de células X recogidas (15000) representa un aumento sustancial respecto a una estrategia donde las gotitas coincidentes no se recogen, como en la estrategia o modalidad de pureza elevada que se analiza a continuación. En la modalidad de pureza elevada, la operación a una frecuencia de gotitas de 40 7segundo y a una velocidad de ingreso de células de 40K/segundo (10K células/segundo más que en el ejemplo anterior de la modalidad de alta recuperación), sólo se recogen cerca de 11800 células X cada segundo o cerca de 3800 células X menos que en la estrategia de alta recuperación. Aún más, cuando se usa la estrategia de pureza elevada, se pierden o se desechan cerca de 9200 células X porque las gotitas coincidentes no son 229 separadas en la población de células X. Por consiguiente, si es aceptable menos del 100% de pureza, quizá sea aconsejable usar la modalidad de alta recuperación para aumentar el número de células X recogidas o, dicho de otra forma, para disminuir el número de células X perdidas. En resumen, en la estrategia de control de alta recuperación usando la estrategia de separación de aceptación de coincidentes, la velocidad de ingreso de partículas está relacionada inversamente con la pureza de la población recogida de las partículas deseadas (denominada en ocasiones como la población "utilizable").

B. Estrategia de control de pureza elevada Un segundo tipo de estrategia de control puede denominarse como una estrategia de control de "pureza elevada". El objetivo de esta estrategia es mantener en un alto nivel la pureza de la población recogida en lo que se refiere a las partículas que tienen una característica deseada, siempre que la cantidad de partículas deseadas en la población recogida en relación con el número total de partículas deseadas disponibles en la corriente se encuentre en una cantidad aceptable o por encima de ésta (es decir, siempre que la cantidad de partículas deseadas en la corriente que no sean recogidas permanezca por debajo de una cantidad aceptable). De acuerdo con esta estrategia, los conjuntos de primera partícula descritos anteriormente se separan en la población de las partículas deseadas porque cada uno de estos conjuntos contiene a una o más partículas que tienen una característica 230 deseada A y porque estos conjuntos no contienen ninguna partícula contaminante. Por otro lado, los conjuntos de segunda y tercera partícula se separan en una o más poblaciones "inutilizables" (rechazo de coincidentes) porque contienen partículas contaminantes (es decir, partículas con la característica B). Para optimizar la producción usando esta estrategia de "pureza elevada", el microprocesador aumenta la velocidad de ingreso de líquido siempre que la cantidad de partículas deseadas que se separan en la población utilizable en relación con el número total de partículas deseadas disponibles en la corriente permanezca en una cantidad aceptable o por encima de ésta. Como un ejemplo, se puede considerar el uso de una estrategia de control de pureza elevada para la separación de los espermatozoides X e Y en la corriente de líquido de la fig. 78. El resultado deseado puede ser separar todas las células X en una población de células X siempre que la cantidad de células X recogidas de la corriente permanezca en una cantidad aceptable o por encima de ésta, por ejemplo, al menos 60%. Para obtener este resultado, los conjuntos de primera partícula son separados en la población utilizable porque contienen sólo una o más células X. Por otro lado, los conjuntos de segunda y tercera partícula se separan en una o más poblaciones inutilizables porque contienen una o más partículas contaminantes células (~X). En este ejemplo, la velocidad a la cual el sistema dispensador de líquido entrega el líquido que contiene las células a la boquilla seguiría aumentando siempre que la cantidad de células X que se recoge en 231 la población utiiizable como un porcentaje de la cantidad disponible total de células X que han sido separadas permanezca en un 60% o más. Por el contrario, si la cantidad de células X que no se recogen en la población utiiizable aumenta por encima de un 40% del número total de disponible células X que se han separado, la velocidad de ingreso de líquido disminuye. Según se observa anteriormente en el contexto de un sistema de separación de gotitas, se sabe que el aumento de la velocidad de ingreso de líquido aumentará el número de gotitas con varias células, y por lo tanto el número de gotitas coincidentes que contienen conjuntos de tercera partícula. Ya que las gotitas coincidentes no se separan dentro de la población de células X recogidas cuando se usa una estrategia de separación de rechazo de coincidentes, esto significa que el aumento de la velocidad de ingreso de líquido dará lugar a un aumento en la cantidad de células X vivas perdidas a la población ¡nutilizable. Figura 80 ilustra este resultado para un líquido de dos (2) partículas para que la población utiiizable tenga un 100% de pureza de las partículas deseadas. Según se muestra, a velocidades muy bajas de ingreso de líquido (velocidad de ingreso de en el eje x), el porcentaje de partículas deseadas en la población utiiizable es muy alto porque se están generando y rechazando muy pocas gotitas coincidentes. A medida que aumenta la velocidad de ingreso de líquido (la velocidad de ingreso de líquido aumenta a la derecha en el eje x), el porcentaje de gotitas coincidentes que contienen conjuntos de tercera partícula aumenta y más conjuntos de ese tipo se 232 rechazan. Esto reduce la cantidad de partículas deseadas que se separan en la población utilizable en relación con la cantidad total de partículas deseadas disponibles en la corriente (es decir, el porcentaje de partículas deseadas de la corriente que se recogen en la población utilizable). En el ejemplo específico ilustrado, la velocidad de ingreso de líquido es de aproximadamente 40K partículas/segundo y cerca de 75% de las partículas deseadas se separan hacia la población utilizable. En resumen, en la estrategia de control de pureza elevada que implementa la estrategia de separación de rechazo de coincidentes, la velocidad de ingreso de partículas está relacionada inversamente con el porcentaje de partículas deseadas en la población recogida (es decir, pureza elevada de partículas deseadas en la población utilizable).

C. Estrategia de control de velocidad de flujo constante Un tercer tipo de estrategia de control puede denominarse como una estrategia de control de velocidad de flujo constante. En esta estrategia, el microprocesador mantiene la velocidad de ingreso de líquido constante (o dentro de un intervalo constante) y varía el porcentaje de gotitas coincidentes recogidas (o rechazadas) siempre que la pureza de al menos una población recogida se encuentre en un nivel aceptable o por encima de éste y siempre que la cantidad de partículas deseadas en esa población se encuentre en una cantidad aceptable en relación con una cantidad total de partículas deseadas que han sido procesadas. Dicho de otro modo, la velocidad de ingreso de 233 líquido es constante y el porcentaje de gotitas coincidentes aceptadas (o rechazadas) varía siempre que el nivel probable de contaminación de la población utilizable se encuentre en un nivel aceptable de pureza o por debajo de éste y siempre que la cantidad probable de partículas deseadas que se pierde a una población diferente de la población establecida (utilizable) esté en una cantidad aceptable o por debajo de ésta. Como ejemplo, considere el uso de una estrategia de control de velocidad de flujo constante para la separación de la corriente de líquido que se muestra en la fig. 78. El resultado deseado puede ser separar los espermatozoides X en una población utilizable que tenga una pureza de al menos 85% y recoger al menos 60% de las células X que se encuentran en la corriente para que no más de 40% de las células X se separen en la población inutilizable. En este ejemplo, se mantendría constante la velocidad a la cual el sistema dispensador de líquido hace ingresar las partículas y se variaría el porcentaje de recolección o rechazo de conjuntos de tercera partícula (conjuntos coincidentes) siempre que la pureza de la población utilizable en lo que se refiere a las células X sea igual o mayor que 85% y siempre que el porcentaje de células X separadas en la población inutilizable sea menor que 40% de modo que el porcentaje de partículas deseadas separadas en la población utilizable sea igual o mayor que 60% (estrategia de separación de aceptación de coincidentes variable). A medida que aumenta el porcentaje de los conjuntos de tercera partícula aceptados, la pureza de la población utilizable disminuye, pero la cantidad de partículas deseadas (por ejemplo, 234 células X) que son separadas en la población inutilizable disminuye. Por el contrario, a medida que disminuye el porcentaje de los conjuntos de tercera partícula aceptados, la pureza de la población utilizable aumenta, pero la cantidad de partículas deseadas (por ejemplo, células X) que son separadas en la población inutilizable aumenta. Como se señaló anteriormente, se conoce a partir de la ecuación de Poisson que el número de gotitas de varias células (y por lo tanto el número de gotitas coincidentes que contienen conjuntos de tercera partícula) es constante para una velocidad constante de ingreso de líquido (célula). Como el número de gotitas coincidentes es constante en esta estrategia de control, el porcentaje de gotitas coincidentes clasificadas en la población utilizable repercutirá tanto en la pureza de la población utilizable como en la cantidad de células X que se desechan por ser separadas hacia la población inutilizable. Esto es porque el porcentaje de células Y (o ~X) no deseadas en gotitas coincidentes que se aceptan y son separadas hacia la población inutilizable recogida está inversamente relacionado con el porcentaje de células X en gotitas coincidentes que son rechazadas y por lo tanto no son separadas dentro de la población utilizable recogida. La figura 81 ilustra la estrategia de control de velocidad de ingreso de líquido constante en un sistema y método de clasificación de gotitas de citometría de flujo según se describe aquí implementando una estrategia de separación de rechazo de coincidentes variable para un líquido de 2 (dos) partículas. Como se muestra, la línea OL ilustra la relación inversa 235 entre el porcentaje de gotitas coincidentes rechazadas (eje x) comparado con el porcentaje de gotitas coincidentes aceptadas (eje y). Cuando hay un porcentaje muy bajo de gotitas coincidentes aceptadas, hay un porcentaje muy alto de gotitas coincidentes rechazadas. Por el contrario, cuando hay un porcentaje muy alto de gotitas coincidentes aceptadas, hay un porcentaje muy bajo de gotitas coincidentes rechazadas. La línea OL ilustra esta relación inversa y representa la línea de operación de la estrategia de separación de aceptación de coincidentes variable a una determinada velocidad constante de flujo de la partícula. En el punto P en la fig. 81 sobre la línea de operación OL, la pureza de la población utilizable es un porcentaje dado que depende de la velocidad de flujo de la partícula, por ejemplo, 85% de pureza. A medida que aumenta el porcentaje de gotitas coincidentes aceptadas (a la izquierda y arriba) sobre la línea de operación OL, el número de partículas no deseadas que se separan hacia la población utilizable aumenta y la pureza disminuye por debajo de un 85%, que puede que sea inaceptable. A medida que disminuye el porcentaje de gotitas coincidentes aceptadas (a la derecha y abajo) a lo largo de la línea de operación OL, la pureza supera el 85% y es aceptable. En el punto LL sobre la línea de operación OL, se rechaza el 75% de las gotitas coincidentes (es decir, se separan hacia la población inutilizable) de modo que el porcentaje de partículas deseadas que se desecha por separarse hacia la población inutilizable es un porcentaje dado basado en la velocidad de ingreso de partículas, por ejemplo, 40%. A medida 236 que aumenta el porcentaje de gotitas coincidentes rechazadas (a la derecha y abajo) sobre la línea de operación OL, el porcentaje de partículas deseadas que se separa hacia la población utilizable disminuye (por ejemplo, a <60%), lo que puede llegar a ser inaceptable. A medida que disminuye el porcentaje de gotitas coincidentes rechazadas (a la izquierda y arriba) sobre la línea de operación OL, el porcentaje de partículas deseadas separadas hacia la población utilizable aumenta (por ejemplo, a >60%) y es aceptable. Por lo tanto, según este aspecto de la invención para una estrategia de control de velocidad de flujo constante que implementa una estrategia de separación de aceptación de coincidentes variable, el microprocesador puede dirigir el sistema para que el porcentaje de gotitas coincidentes aceptadas y rechazadas varíe en un intervalo operativo entre el punto P1 y LL como se indica con la flecha OR. Se debe tener en cuenta que el intervalo operativo OR puede abarcar más, o menos de la línea de operación, según el nivel de tolerancia para la impurezas y la pérdida de las partículas deseadas hacia la población inutilizable. En resumen, en la estrategia de control de velocidad de flujo constante usando la estrategia de separación de aceptación de coincidentes variable, el porcentaje de conjuntos de tercera partícula que se acepta está inversamente relacionado con la pureza de la población utilizable e inversamente relacionado con la cantidad de partículas deseadas desechadas por ser separadas hacia una población inutilizable. D. Resumen de estrategias de control 237 El cuadro siguiente resume las estrategias de control observadas anteriormente. [el resto de la página en blanco] 238 ESTRATEGIA ALTA PUREZA VELOCIDAD DE FLUJO DE RECUPERACION ELEVADA CONSTANTE CONTROL Parámetro Velocidad de Velocidad de Parámetros de separación controlado ingreso de líquido ingreso de líquido Parámetro de Pureza de la Cantidad de Pureza de la población Y control: población partículas cantidad de partículas deseadas en la deseadas en la población población Estrategia de Aceptación de Rechazo de Aceptación de coincidentes separación coincidentes coincidentes variable Estrategia de Recolección de Recolección de Recolección de gotitas X; separación gotitas X y gotitas gotitas X; rechazo varía el porcentaje de gotitas X/Y de X+~X; rechazo de gotitas X+~X y recogidas X+~X; rechazo de de gotitas ~X de gotitas ~X gotitas ~X Definición La velocidad de La velocidad de El porcentaje de las gotitas ingreso de líquido ingreso de líquido coincidentes en la población se aumenta aumenta mientras aumenta siempre que la siempre que la ía cantidad de pureza de la población con pureza de la partículas respecto a las partículas X se población con deseadas en la encuentre en un nivel respecto a las población utilizable aceptable o por encima de partículas X se con relación a la éste; para continuar la encuentre en un cantidad total de operación, la cantidad de nivel aceptable o partículas X en la partículas deseadas en la por encima de corriente se población utilizable en éste. encuentre en una relación a la cantidad de cantidad aceptable partículas X en la corriente o por encima de debe ser igual a la cantidad ésta. aceptable o estar por encima de ésta. Definición La velocidad de La velocidad de La velocidad de ingreso de inversa ingreso de líquido ingreso de líquido líquido se aumenta siempre se aumenta se aumenta que la probabilidad de siempre que la siempre que la contaminación de la probabilidad de probabilidad de población utilizable se contaminación de pérdida de la encuentre en un nivel la población cantidad de aceptable de pureza o por utilizable esté en partículas debajo de éste Y siempre que un nivel aceptable deseadas hacia la probabilidad de pérdida de de pureza o por una población la cantidad de partículas debajo de éste. inutilizable esté en deseadas hacia la población una cantidad inutilizable esté en una aceptable o por cantidad aceptable o por debajo de ésta. debajo de ésta. Resultado > la pureza > la cantidad > la pureza mínima aceptable deseado mínima aceptable; mínima aceptable; y > la cantidad mínima por ejemplo, >85% por ejemplo, >60% aceptable; por ejemplo, >85% de pureza de partículas de pureza y >60% de deseadas partículas deseadas capturadas (<40% capturadas (<40% de de partículas partículas deseadas deseadas perdidas) perdidas) 239 Con relación a esto, una muestra separada obtenida usando una de las estrategias de control anteriores se puede combinar con una segunda muestra para obtener una muestra final (por ejemplo, comercial) que presente las características deseadas. Por ejemplo, una muestra separada según la estrategia de pureza elevada para producir a una población 100% pura se puede combinar con una población del mismo volumen separada a una pureza de 80% para producir una muestra final que tenga una pureza de 90%. O en el caso de espermatozoides separados a una pureza elevada, una cantidad de la alícuota de los espermatozoides separados puede combinarse con una cantidad de la alícuota de espermatozoides sin separar para producir una muestra final de la pureza deseada a un costo más bajo que si se separara toda la cantidad de espermatozoides usando cualquiera de los métodos de separación anteriores. La descripción anterior de las estrategias de control supone la identificación y separación precisa de cada gotita incluyendo cada gotita coincidente. En la práctica, la exactitud de 100% no es posible por diversas razones. Por consiguiente, para reducir al mínimo la contaminación, quizá sea aconsejable rechazar las partículas que no pueden clasificarse con certidumbre como pertenecientes a la población deseada. Por otro lado, si ciertas partículas pueden identificarse y clasificarse como que pertenecen a la población deseada dentro de una cierta probabilidad seleccionada (por ejemplo, mayor que 50% en el caso de espermatozoides), quizá sea aconsejable clasificar las partículas como pertenecientes a la población 240 deseada para que no se pierdan hacia la población inutilizable. Por lo tanto, según se trató previamente, partículas tales como espermatozoides pueden aceptarse o rechazarse para separarlas en una población de las células deseadas con base en la probabilidad de que tales partículas pertenezcan a la población utilizable. Los términos "utilizable" e "inutilizable" como se utilizan en el cuadro anterior y en esta solicitud se usan por comodidad únicamente y no pretenden ser limitantes de ninguna manera. Por lo tanto, una población "utilizable" incluye cualquier "primera" población, independientemente de cómo se utilizará o de si se utilizará y una población "inutilizable" incluye cualquier "segunda" población diferente de la población utilizable, independientemente de cómo se utilizará o de si se utilizará. De igual manera, una población "deseada" significa cualquier población que se separa según las características de la partícula seleccionada. El microprocesador y su software de procesamiento de señales constituyen un sistema para procesar las señales eléctricas del fotodetector para clasificar las partículas (por ejemplo, partículas en general y partículas de espermatozoides en particular) según las características de las partículas y para obtener información relacionada con la distribución de las partículas como se describe anteriormente con respecto a la fig. 78. Además, el microprocesador constituye un sistema de control que responde al software de procesamiento señalado para variar la velocidad a la cual el sistema dispensador de líquido ingreso las partículas al sistema de la boquilla como 241 una función de ia información obtenida en relación con la distribución de las partículas. Además, el microprocesador constituye un sistema de control de respuesta al software de procesamiento de señales para variar la estrategia de separación como una función de la información obtenida en relación con la distribución de las partículas. En general, el microprocesador constituye un sistema de control que responde a la información recibida del aparato de citometría de flujo para controlar el sistema de separación con el fin de variar su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido. En otras palabras, el microprocesador es capaz de operar en una primera modalidad para variar la estrategia de separación, es capaz de operar en una segunda modalidad para controlar el sistema dispensador de líquido, es capaz de operar en una tercera modalidad para variar la estrategia de separación y para controlar el sistema dispensador de líquido y puede ser capaz de operar en otras modalidades. Cuando opera en la primera o tercera modalidad, el microprocesador es capaz de variar la velocidad a la cual se ingreso el líquido como una función de al menos una de las siguientes: (1) la pureza de al menos una población con respecto a ya sea partículas con ia característica A o partículas con la característica B y (2) la cantidad de partículas con la característica A o partículas con la característica B en al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en la corriente. 242 Sistema de recolección Se necesita un sistema de recolección para recoger las gotitas después de que pasan entre las placas del deflector. El sistema de recolección para un citómetro convencional puede estar formado tan solo por recipientes de recolección dispuestos para atrapar las gotitas en las diferentes corrientes de gotitas después de que pasan entre las placas del deflector. Se pueden usar sistemas similares de recolección convencionales en algunas materializaciones de la invención actual. Sin embargo, es posible que sea difícil usar un sistema de recolección convencional en las materializaciones de la invención actual donde la boquilla esté orientada para dirigir la corriente de líquido en un ángulo ascendente, lo que da un componente horizontal a la velocidad de las gotitas. Un asunto es que las gotitas se desplazarían cierta distancia horizontal a lo largo de sus trayectorias curvas antes de comenzar el movimiento descendente que sería apropiado para llegar a un recipiente de recolección. Por ejemplo, si la boquilla está apuntada hacia arriba entre 45° y 60° y las gotitas salen a una velocidad de entre 5 m/s y 20 m/s, las gotitas estarán a una distancia horizontal de varios metros de la boquilla antes de alcanzar el ápice de sus trayectorias y comenzar un movimiento descendente. Por lo tanto, las corrientes de gotitas ocuparían un gran espacio de laboratorio. Además, en un intervalo de varios metros también podría ser difícil asegurar que las gotitas llegaran a los recipientes de recolección adecuados. Las trayectorias de las corrientes de gotitas pueden cambiar cuando cambian 243 una o más condiciones de funcionamiento para el citómetro (por ejemplo, ajuste de la velocidad de ingreso de líquido que da como resultado un cambio en la velocidad del líquido en el orificio de la boquilla). Los cambios en las trayectorias de las corrientes de gotitas se verán magnificados por la distancia que recorren las gotitas. Por lo tanto, los cambios en las trayectorias que no provocan un cambio apreciable en la ubicación de las gotitas en un punto relativamente próximo a la boquilla podrían provocar un cambio significativo en la ubicación de las gotitas en un sitio que esté más lejos de la boquilla. Según se trata anteriormente, algunas materializaciones de la invención actual emplean la retroalimentación a la formación de gotitas y/o sistemas dispensadores de líquido de la muestra que podrían dar lugar a corrientes de gotitas que alteren constantemente sus trayectorias. También es posible que se desee variar la presión a la cual el líquido envolvente se hace ingresar a la boquilla. Las corrientes de aire, las variaciones de temperatura y las variaciones de humedad también podrían alterar las trayectorias de las corrientes de gotitas. Cualquier factor que pueda cambiar la trayectoria de las corrientes de gotitas también podría requerir la reubicación de los recipientes de recolección para que las gotitas sean recibidas en los recipientes apropiados de recolección. Por contraste, las trayectorias de las corrientes de gotitas en un citómetro convencional que tenga una boquilla que apunte hacia abajo son menos susceptibles a la variación. Por ejemplo, el hecho de que las corrientes de gotitas tienen una velocidad inicial sustancialmente descendente significa que la variación en la velocidad del líquido en el orificio no da como 244 resultado ninguna variación significativa en las trayectorias. Además, los recipientes de recolección están relativamente cerca de la boquilla lo que hace que el sistema de recolección sea más tolerante a las variaciones de trayectorias en las corrientes de gotitas. Las figs. 83-85 muestran una materialización de un sistema de recolección, designado en forma general 2201, que se pueden usar para recoger las gotitas separadas en un sistema de la invención actual. El sistema de recolección es particularmente adecuado para la recolección de gotitas 33 cuando el sistema de boquilla del citómetro 101 está orientado a dirigir la corriente de líquido 21 en un ángulo ascendente o cualquier otro ángulo que tenga un componente horizontal. A medida que las gotitas pasan entre las placas del deflector 629, son separadas en corrientes de varias gotitas 123, 125 (por ejemplo, dos) que tienen diferentes trayectorias curvas. Como se muestra en las figs. 84 y 85, la trayectoria de cada corriente de gotitas conduce a uno de dos dispositivos interceptores de gotitas 2203. Si las gotitas se separan en más de dos corrientes de gotitas, se deberá proporcionar otro dispositivo interceptor para cada corriente de gotitas adicional. Por lo tanto, el número de dispositivos interceptores en un sistema de recolección de la invención actual dependerá del número de corrientes en las que se están separando las gotitas. Cada dispositivo interceptor 2203 en el sistema de recolección de ejemplo tiene una superficie de impacto 2205 ubicada para cubrir la trayectoria de una de las corrientes de gotitas para desviar las gotitas que 245 avanzan por esa trayectoria hacia un recipiente de recolección 2207 colocado debajo de cada dispositivo interceptor. Las superficies de impacto están fabricadas preferentemente de un material flexible. Sin limitarse a una teoría particular, se cree que los materiales flexibles amortiguan el impacto de las gotitas que chocan contra la superficie del dispositivo interceptor, reduciendo así el daño a las partículas (por ejemplo, espermatozoides) en las gotitas. Por ejemplo, los dispositivos interceptores pueden estar fabricados de polipropileno, polietileno u otros polímeros similares. Con referencia a las figs. 86 y 87, los dispositivos interceptores 2203 se han fabricado cortando una entrada para las gotitas 2211 (por ejemplo, una ventana rectangular) en un lado de la ampolla 2213 de una pipeta 2215. Por lo tanto, una porción de la pared interior 2217 de la ampolla opuesta a la entrada de la gotita forma una superficie de impacto curva 2205 que cubre la trayectoria de la corriente de gotitas respectiva. Convenientemente, el tubo de la pipeta sirve de guía 2225 para dirigir el líquido desde la superficie de impacto al recipiente de recolección. Con referencia a la fig. 84, los dispositivos interceptores están sujetos a un marco del sistema de recolección 2227, que los mantiene en su lugar. Para tener en cuenta la variabilidad en las trayectorias de las corrientes de gotitas, es aconsejable permitir el ajuste de las posiciones de los dispositivos interceptores. Por ejemplo, la altura vertical de cada dispositivo interceptor puede ajustarse deslizando el tubo guía hacia arriba y hacia abajo en un orificio circular a través de un soporte 2229. Cuando el dispositivo 246 interceptor está a la altura deseada, puede ajustarse un tornillo de fijación 2231 para sostenerlo a esa altura. El soporte puede adjuntarse a una placa de montaje 2233 que está adjuntada al marco del sistema de recolección, por ejemplo por tornillos de fijación 2235 (por ejemplo, dos tornillos de fijación). Los tornillos de fijación 2235 pasan a través de una ranura horizontal 2241 en la placa de montaje para permitir el ajuste lateral del dispositivo interceptor. Después del ajuste, los tornillos de fijación pueden ajustarse para mantener al soporte circular en la ubicación deseada. Los técnicos de la profesión reconocerán que se podría usar una variedad de otros dispositivos de sujeción para ajustar la posición del dispositivo interceptor sin apartarse del alcance de la invención actual. Los recipientes de recolección 2207 se mantienen debajo de los dispositivos interceptores en las ranuras 2241 en una bandeja 2243 para sostener los recipientes de recolección. Por lo tanto, se puede mover cada recipiente de recolección dentro de una ranura respectiva según sea necesario para que se mantenga en posición debajo del dispositivo interceptor respectivo. Además, si se desea se puede proporcionar un baño de agua (no se muestra) alrededor del recipiente de recolección para controlar la temperatura de los contenidos del recipiente de recolección. Refiriéndose a la fig. 85, en una materialización de la invención actual se ha cortado una ventana de salida 2245 (por ejemplo, una ventana rectangular) en la parte trasera de uno de los dispositivos interceptores 2247 para permitir que una o más corrientes de gotitas pase a través del dispositivo interceptor. Se coloca un segundo dispositivo interceptor 2249 detrás de la 247 ventana de salida para interceptar las gotitas que pasan por esta ventana. Por ejemplo, una ventana de entrada para el segundo dispositivo interceptor puede ser aproximadamente del mismo tamaño que la ventana de la salida del ejemplo del primer dispositivo interceptor. Por razones que serán evidentes, se aconseja que la ventana de salida sea significativamente más pequeña que la ventana de entrada para el primer dispositivo interceptor. Por ejemplo, un ejemplo de una ventana de entrada para el primer dispositivo interceptor es cerca de 5/8 pulg. de alto y cerca de 3/8 pulg. de ancho (1.58cm alto y 0.952cm ancho). Por contraste, un ejemplo de una ventana de salida puede ser de 1/8 pulg. (0.317cm) de alto y 5/16 pulg. (0.792cm) de ancho. Durante el funcionamiento del citómetro, el sistema de recolección funciona para interceptar las gotitas en las corrientes separadas. Las gotitas interceptadas luego bajan a través de los tubos de guía 2225 de los dispositivos interceptores 2203 y a los recipientes de recolección 2207. En un caso en el cual un citómetro tiene una boquilla de citómetro ascendente que dirige las corrientes de gotitas a lo largo de las trayectorias curvas, por ejemplo, los dispositivos interceptores permiten que las gotitas sean interceptadas en un punto de su trayectoria que está significativamente más cercano a la boquilla en comparación con el punto en el cual se recogerían las gotitas mediante un sistema de recolección convencional (es decir, un sistema de recolección sin dispositivos interceptores). La interceptación de las corrientes de gotitas en un punto relativamente cercano a lo largo de sus trayectorias arqueadas (por ejemplo, mientras están todavía moviéndose 248 hacia arriba) reduce la cantidad de variación en la ubicación de las gotitas al momento en que las gotitas se encuentran por primera vez con el sistema de recolección. En consecuencia, el sistema de recolección puede tolerar más variación en las trayectorias de las corrientes de gotitas que las que podría tolerar un sistema de recolección convencional. De igual manera, las gotitas tienen menor probabilidad de estar sometidas a corrientes de aire gracias a sus recorridos más breves hacia el sistema de recolección. Se debe establecer un equilibrio entre mover los dispositivos interceptores 2203 más cerca de la boquilla 101 para aumentar la tolerancia para las variaciones de trayectorias y mover los dispositivos interceptores más lejos del orificio de la boquilla para reducir o minimizar la fuerza del impacto cuando las gotitas golpean contra los dispositivos interceptores, como por ejemplo colocar los dispositivos interceptores para que intercepten las corrientes de gotitas prácticamente en el ápice de sus trayectorias. En consecuencia, la mejor ubicación para los dispositivos interceptores dependerá de la durabilidad de las partículas (por ejemplo, espermatozoides) a separar, las velocidades de las gotitas, y la magnitud esperada de la variación en las trayectorias de la corriente de gotitas. En el caso de gotitas que contengan espermatozoides bovinos que tengan una velocidad en el orificio de la boquilla de cerca de 16 a 20 m/s, por ejemplo, los dispositivos interceptores pueden colocarse en el intervalo de 4-6 pulgadas (10.16-15.24cm) del orificio de la boquilla. En la materialización en la cual un primer dispositivo interceptor tiene una ventana de salida y se coloca un segundo 249 dispositivo interceptor detrás del primer dispositivo interceptor, por ejemplo, el primer dispositivo interceptor puede estar en un intervalo de cerca de 4 y 5 pulgadas (10.16 y 12.7cm) de la boquilla. Mejor, si el primer dispositivo interceptor está aproximadamente a 4.5 pulgadas (11.43cm) de la boquilla. El segundo dispositivo interceptor puede estar en el intervalo de aproximadamente 5 a 6 pulgadas (12.7 a 15.24cm) de la boquilla. Mejor aún, si el segundo dispositivo interceptor está aproximadamente a 5.5 pulgadas (13.97cm) de la boquilla. La configuración en la cual se coloca un dispositivo interceptor 2203 para interceptar las gotitas que pasan a través de una ventana de salida de otro dispositivo interceptor es particularmente ventajosa cuando no es primordial la pureza de una de las poblaciones separadas (por ejemplo, espermatozoides portadores del cromosoma Y en el caso de espermatozoides separados para usar en la cría de vacas lecheras). Los técnicos de la profesión sabrán que el citómetro puede producir una cantidad de gotitas dispersas 2265 (por ejemplo, una nube de gotitas dispersas) que tengan un contenido desconocido además de las gotitas en las corrientes separadas según se muestra en la fig. 85. El primer dispositivo interceptor se debe colocar de modo que la corriente de gotitas que se está separando para la población con mayor tolerancia a las impurezas, golpee la superficie de impacto 2205 del primer dispositivo interceptor, y la corriente para la cual la pureza es sumamente crítica pase a través de la ventana de salida 2245 y golpee la segunda superficie de impacto del segundo dispositivo interceptor. 250 De esta manera la mayoría de las gotitas dispersas se recoge en el recipiente de recolección 2207 que contiene la población para la cual la pureza no es tan importante, como se muestra en la fig. 85 y no contaminará a la población para la cual la pureza es crítica. También al interceptar y recoger las gotitas dispersas, se evita la necesidad de limpiar tan a menudo como en el caso de que las gotitas dispersas se salieran del sistema de recolección. En contraposición al primer dispositivo interceptor, el segundo dispositivo interceptor sólo desvía las gotitas que pasan por la ventana más pequeña de salida. Esto facilita el mantenimiento de la pureza de la población recogida por el segundo dispositivo interceptor. Los técnicos de la profesión reconocerán que el sistema de recolección del ejemplo podría modificarse fácilmente de varias maneras sin salirse del alcance de la invención actual. Por ejemplo, sería posible construir un dispositivo interceptor de gotitas que tenga debajo de éste un recipiente de recolección moldeado incorporado (o adjunto de otro modo), sin salirse del alcance de esta invención. De igual manera, aunque los dispositivos interceptores de la materialización que se muestra en las figs. 83-87 son pipetas modificadas, se comprende que los dispositivos interceptores 2203 pueden ser de una gran variedad de formas sin salirse del alcance de esta invención. Por ejemplo, cada dispositivo interceptor puede estar compuesto por una lámina plana o curva, una cuchara, un cuenco u otra forma similar. El único requisito es que el dispositivo interceptor funcione correctamente para interceptar las gotitas que avanzan por una trayectoria respectiva de una 251 corriente de gotitas y para desviar las gotitas interceptadas en un recipiente de recolección. Sin embargo, una ventaja de construir los dispositivos interceptores tomando productos fácilmente de obtener y de un costo relativamente bajo, como por ejemplo una pipeta, es que quizá sea más económico reemplazar y eliminar los dispositivos interceptores usados después de pasar cada muestra, en lugar de limpiar los dispositivos interceptores cada vez que se pasa una muestra. Esto podría ayudar a reducir los costos de la operación del sistema de recolección.

Líquido de recolección Como se indicó previamente, los espermatozoides separados se recogen en un recipiente que contiene un líquido de recolección 2301 (Fig. 83 y 84). En general, el objetivo del líquido de recolección incluye amortiguar el impacto de los espermatozoides con el recipiente de recolección y proporcionar un soporte líquido para las células. De acuerdo con estas consideraciones, el líquido de recolección puede contener un amortiguador y una fuente proteica. Antes se dieron ejemplos de amortiguadores que se pueden usar en el líquido de recolección con relación a la recolección y dilución de muestras. Habitualmente, estos amortiguadores tendrán una concentración entre aproximadamente 0.001 M y aproximadamente 1.0 M y tendrán un pH entre aproximadamente 4.5 y aproximadamente 8.5; preferentemente de aproximadamente 7.0. En el cuadro I se presentan ejemplos de soluciones 252 amortiguadoras. En una materialización, el amortiguador contiene 0.96 % (p/v) de PBS de Dulbecco a un pH de aproximadamente 7.0. En otra materialización, la solución amortiguadora contiene 0.204 g de NaHC03; 0.433 g de KHCO3 y 0.473 g C6H807-H20 en 25 ml_ de agua purificada (es decir, 0.097 moles/L de NaHC03; 0.173 moles/L de KHC03 y 0.090 moles/L de C6H807-l-l20 en agua). Se puede agregar una fuente proteica para proporcionar sustento a las células y para amortiguar el contacto de las células con el recipiente de recolección. La fuente proteica puede ser cualquier fuente proteica que no interfiera con la viabilidad de los espermatozoides, y sea compatible con el amortiguador o solución amortiguada particular que se utilice. Algunos ejemplos de fuentes proteicas comunes son la leche (incluso la homogeneizada por calor y la descremada), el extracto lácteo, la yema de huevo, el extracto de yema de huevo, la proteína de soja y el extracto de proteína de soja. Dichas proteínas se pueden encontrar en una concentración entre aproximadamente 1 % (v/v) y aproximadamente 30 % (v/v), preferentemente entre aproximadamente 10 % (v/v) y aproximadamente 20 % (v/v), y mejor si es de aproximadamente 10 % (v/v). Aunque la leche se puede usar en combinación con un amortiguador o solución amortiguada, en general se usa a falta de éstos, ya que la leche misma es una solución que se puede utilizar para los mismos fines que un amortiguador o solución amortiguada. En tales casos, el líquido de recolección contendría entre aproximadamente 80 % (v/v) y aproximadamente 90 % (v/v) de leche. 253 Además o en lugar de la fuente proteica, el líquido de recolección también puede contener plasma seminal. El plasma seminal presenta ambos beneficios el de mejorar la viabilidad y motilidad de los espermatozoides y el de estabilizar la membrana de éstos (evitando de esa manera la capacitación de los espermatozoides durante la recolección y el almacenamiento). Maxwell et al., Reprod. Fert. Dev. (1998) 10: 433-440. Los métodos para obtener plasma seminal son bien conocidos por los técnicos de la profesión, como queda demostrado en la publicación de Maxwell et al. El plasma seminal puede provenir del mismo mamífero del que se obtuvo la muestra de semen, de un mamífero diferente de la misma especie o de un mamífero de diferente especie. Habitualmente, el porcentaje de plasma seminal estará en el intervalo entre aproximadamente 0.5 % (v/v) y aproximadamente 10 % (v/v). Si se usa en combinación con una fuente proteica, como por ejemplo yema de huevo o leche, el porcentaje total de plasma seminal y fuente proteica estará en el intervalo entre aproximadamente 1 % (v/v) y aproximadamente 30 % (v/v). En dichas circunstancias, el porcentaje de plasma seminal será inversamente proporcional al porcentaje de fuente proteica. Por consiguiente, en una materialización, el líquido de recolección está compuesto por plasma seminal. En otra materialización, el líquido de recolección contiene plasma seminal en una cantidad entre aproximadamente 0.5 % (v/v) y aproximadamente 10 % (v/v), preferentemente en una cantidad entre aproximadamente 4 % (v/v) y aproximadamente 6 % (v/v), y mejor si es en una cantidad de aproximadamente 5 % (v/v). En otra materialización, el 254 líquido de recolección contiene una fuente proteica y plasma seminal. Aún en otra materialización, el líquido de recolección está compuesto por plasma seminal y yema de huevo, el porcentaje de ambos totaliza entre aproximadamente 1 % (v/v) y aproximadamente 30 % (v/v). Opcionalmente, el líquido de recolección puede también contener una diversidad de aditivos que son beneficiosos para la viabilidad y la motilidad de los espermatozoides. Entre dichos aditivos se encuentran, por ejemplo, una fuente proteica, un antibiótico y una preparación que regula las reacciones de oxidación/reducción dentro de la célula o del medio celular, cada uno de los cuales se trata antes con relación a la recolección y dilución de muestras. Dichos aditivos se pueden agregar al líquido de recolección de acuerdo con eso. Además puede haber presentes en el líquido de recolección componentes adicionales beneficiosos para la viabilidad y la motilidad de los espermatozoides. Dentro de los elementos de esta lista se incluyen, por ejemplo: glicerol, reductasas, lauril sulfato de sodio y lauril sulfato de trietanolamina, pentoxifilina, AMPc y ATP. Dichos componentes se agregan en una concentración o cantidad adecuada para obtener el efecto deseado proporcionado por el componente específico o la combinación de componentes. En consecuencia, en una cierta materialización, el líquido de recolección está compuesto por 0.96 % (p/v) de PBS de Dulbecco, 1 % (p/v) de fructosa, 0 % (v/v) de yema de huevo en agua, siendo el pH del líquido de 255 recolección de aproximadamente 7.0. Aún en otra materialización, el líquido de recolección contiene además 10 mM de piruvato, 100 µ? de vitamina K o 1 rriM de ácido lipoico. Alternativamente, y en lugar de usar un líquido de recolección, las células separadas se pueden recoger en un recipiente que contiene un criodiluyente utilizado en los pasos posteriores de crioconservación que se describe con más detalle a continuación. En consecuencia, en una materialización particular, el líquido de recolección es el criodiluyente. En otra materialización, el líquido de recolección es el diluyente que está compuesto por agua, Triladyl® (Minitube, Verona, Wl), yema de huevo y ácido pirúvico. Todavía en otra materialización, el líquido de recolección es el criodiluyente que está compuesto por 25 g de Triladyl®, 25 g de yema de huevo y 10 mM de ácido pirúvico en 75 mL de agua. Se debe entender que las concentraciones porcentuales de proteína en el líquido de recolección divulgadas aquí son las previas al agregado de los espermatozoides separados por flujo. El agregado de las células separadas por flujo diluirá la concentración final del líquido de recolección en aproximadamente 1/20 de la concentración previa al agregado de las células separadas por flujo. Por lo tanto, en donde, por ejemplo, el líquido de recolección contiene aproximadamente 10 % (v/v) de yema de huevo, una vez que las células separadas por flujo son recogidas en el recipiente de recolección que contiene el líquido de recolección, la concentración final de yema de huevo se reducirá a aproximadamente 0.5 % 256 (v/v). Pre-tratamiento de los dispositivos interceptores y/o recipientes de recolección A fin de minimizar el posible daño a las partículas (p. ej., espermatozoides) que se pueden separar de acuerdo con la invención actual, los dispositivos interceptores 2203 y/o recipientes de recolección 2207 (Figs. 83-87) se pueden tratar antes de su uso. Dicho tratamiento previo puede consistir en, por ejemplo, poner en contacto o sumergir los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección en un baño que contenga una preparación que sirva para minimizar el impacto entre la partícula y el dispositivo interceptor. Después de retirar los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección del baño, una cierta cantidad de la preparación permanecerá en los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección y servirá como agente amortiguador para las partículas de las gotitas. La preparación, por lo tanto, debe tener las características adecuadas para proporcionar el efecto amortiguador deseado. Además, la preparación también debe ser compatible con la partícula o célula que se va a separar, el líquido envolvente y el líquido de recolección. De acuerdo con estas consideraciones, la preparación usada para tratar los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección puede contener un amortiguador, un líquido envolvente, un líquido de recolección, un criodiluyente, cualquier componente del líquido envolvente, del líquido de recolección y del criodiluyente, o cualquier combinación de éstos. Los 257 amortiguadores, los líquidos envolventes y los líquidos de recolección utilizados para la tinción y separación de los espermatozoides de acuerdo con los métodos de la invención actual se describieron anteriormente. Por consiguiente, en una materialización, los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección están en contacto (p. ej., sumergidos o frotados con) líquido envolvente. En otra materialización, los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección están en contacto con el líquido de recolección. Aún en otra materialización, los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección están en contacto con un criodiluyente que se describe a continuación. El contacto o inmersión de los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección con la preparación debe producirse durante un período suficiente para permitir que la preparación se adhiera a las superficies de los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección. Tal período es generalmente menor de aproximadamente 90 minutos, preferentemente menor de aproximadamente 60 minutos, mejor si es entre aproximadamente 30 y aproximadamente 60 minutos, y mejor aún si es de aproximadamente 60 minutos. Todavía en otra materialización, los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección están solamente en contacto con la preparación antes de su uso. En lugar del contacto o en combinación con el contacto de los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección con la preparación antes descrita, los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección 258 también se pueden poner en contacto con componentes específicos contenidos en el líquido envolvente, el líquido de recolección, y/o el criodiluyente, como por ejemplo, BSA, SSS, yema de huevo, extracto de yema de huevo, leche (incluso leche homogeneizada por calor y descremada), extracto de leche, proteína de soja, y extracto de proteína de soja. En consecuencia, en una materialización, los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección se ponen en contacto con líquido envolvente y a continuación con 0.1 % (v/v) de albúmina de suero bovino. En otra materialización, los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección se ponen en contacto con líquido envolvente y a continuación con 10 % (v/v) de yema de huevo. En otra materialización, los dispositivos interceptores y los recipientes se sumergen en líquido de recolección y a continuación se ponen en contacto con 0.1 % (v/v) de albúmina de suero bovino. En otra materialización, los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección se sumergen en líquido de recolección y a continuación se ponen en contacto con 10 % (v/v) de yema de huevo. A pesar de que los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección reciben el mismo tratamiento previo en cada materialización descrita anteriormente, es posible utilizar diferentes protocolos de tratamiento previo para los dispositivos interceptores y los recipientes de recolección sin apartarse del alcance de esta invención. Asimismo, alguno de los dispositivos interceptores o recipientes de recolección puede recibir un tratamiento previo y otros de los dispositivos interceptores o recipientes de recolección pueden 259 recibir un tratamiento previo diferente sin apartarse del alcance de esta invención. Ciertas ventajas del tratamiento previo pueden incluso obtenerse mediante el tratamiento previo sólo de los dispositivos interceptores o sólo de los recipientes de recolección, nuevamente sin apartarse del alcance de esta invención.

Concentración Como se señaló anteriormente, el esperma separado recogido por el citómetro de flujo se ha diluido mediante la adición de diversas soluciones amortiguadoras y diluyentes, el líquido de tinción, el líquido envolvente y el líquido de recolección. De manera característica, la concentración de espermatozoides después de la separación mediante citometría de flujo como se describió anteriormente, se encuentra dentro del intervalo de 0.7-1.4 x 106 espermatozoides/ml aproximadamente. Por consiguiente, es importante concentrar los espermatozoides separados para reducir al mínimo el choque por la dilución del esperma y lograr la concentración adecuada del esperma con fines de crioconservación e inseminación artificial. Una práctica generalizada en la industria de cría, por ejemplo, es llevar a cabo la inseminación artificial con esperma con una concentración de aproximadamente 20 x 106 o aproximadamente 40 x 106 espermatozoides/ml. Una manera de concentrar los espermatozoides es centrifugar el líquido recogido por el citómetro. Otra manera de concentrar el esperma es pasar el líquido recogido por el citómetro a través de un sistema 260 de filtración. Estos métodos se tratan con mayor detalle a continuación. A. Centrifugación Para concentrar el esperma se puede usar cualquier centrífuga convencional. Sin embargo en una actividad comercial es preferible usar una centrífuga que tenga la capacidad de centrifugar un lote grande de espermatozoides de una vez. Durante la centrifugación la mayoría de los espermatozoides se comprimirán formando un sedimento en el fondo del tubo de centrífuga como consecuencia de la fuerza centrífuga que actúa sobre ellos. La magnitud de la fuerza centrífuga se establece convencionalmente como la cantidad de veces que la fuerza centrífuga sobrepasa la fuerza gravitacional. Dado que la fuerza centrífuga es el parámetro crítico y debido a que la magnitud de la fuerza centrífuga a cualquier velocidad dada (velocidad angular) variará dependiendo de la longitud del radio de curvatura, la velocidad de centrifugación se especifica habitualmente estableciendo la magnitud de la fuerza centrífuga. Por ejemplo, una fuerza de 600 g significa que la velocidad angular de la centrífuga se selecciona para que la fuerza centrífuga resultante sea 600 veces la fuerza de gravedad. La mayoría de los líquidos y todos los espermatozoides que no hayan sido centrifugados para formar el sedimento quedan en el sobrenadante. En general, se extrae el sobrenadante y los espermatozoides del sedimento se resuspenden para su procesamiento adicional según se describe más adelante. Es importante maximizar el porcentaje de esperma concentrado en el sedimento, reduciendo al mínimo al mismo tiempo el daño a los espermatozoides. 261 Según un método de la invención actual, un tubo de centrífuga que contiene aproximadamente 10 x 106 espermatozoides separados se coloca en una centrífuga. Para facilitar la concentración, los tubos de centrífuga se pueden usar como los recipientes de recolección en el sistema de recolección del citómetro. Esto evita la necesidad de transferir los espermatozoides separados a un tubo de centrífuga antes de la centrifugación. El tubo se centrifuga a una velocidad determinada y por un tiempo suficiente para permitir que se forme el sedimento de espermatozoides concentrados en el fondo del tubo. La velocidad y la duración de la centrifugación se seleccionan convenientemente teniendo en cuenta diversos factores, como por ejemplo: el hecho de que los espermatozoides son frágiles y la centrifugación a una velocidad excesiva los puede dañar; el tamaño del tubo de la centrífuga influye en el tiempo necesario para que los espermatozoides se muevan hacia el fondo el tubo; y hay mayor probabilidad de que los espermatozoides resulten dañados al ser centrifugados a una velocidad determinada cuanto más dure la centrifugación. Por lo tanto, en una materialización de la invención actual el tubo de centrífuga se centrifuga a 550-800 g durante 6 - 10 minutos aproximadamente. Según otra materialización de la invención actual, el tubo de centrífuga se centrifuga a 650-750 g durante 6- 0 minutos aproximadamente. En otra materialización, el tubo de la centrífuga se centrifuga a 700g durante 6-10 minutos aproximadamente. En otra materialización más, el tubo de centrífuga se centrífuga a 700 g durante 7 minutos aproximadamente. 262 Como se demuestra en los siguientes experimentos, la velocidad de la centrífuga y la duración de la centrifugación pueden afectar al porcentaje de espermatozoides recuperados y la motilidad de los mismos. Los experimentos se llevaron a cabo sin separar los espermatozoides efectivamente. En cambio, se agregaron a las muestras de semen diversos líquidos como soluciones amortiguadoras, diluyentes, líquidos de recubrimiento y un líquido de tinción para simular el proceso de separación. Las muestras después se centrifugaron para intentar concentrar los espermatozoides.

EJEMPLO I DE CENTRIFUGACION En el ejemplo I de centrifugación se recogió semen bovino y se evaluó como se describió anteriormente. La muestra de semen se diluyó con una cantidad de ácido cítrico - Tris ("TCA") con un pH de 7.3 para obtener una concentración de 150 x 106 espermatozoides/ml. Los espermatozoides se tiñeron con Hoechst 33342 (100 µ?) a 41° C durante veinte minutos. Se habían preparado dos tubos de 15 mi con soluciones amortiguadoras para la simulación. El tubo 1 estaba parcialmente lleno con 750 µ? de solución salina amortiguada con fosfato ("PBS") con 10% de yema de huevo y 14.25 mi de PBS con 0.1% de albúmina sérica bovina ("BSA"). El tubo 2 estaba parcialmente lleno con 750 ul de TCA con yema de huevo al 10% y 14.25 mi de PBS con BSA al 0.1%. Cada uno de los dos tubos recibió 100 ul de la 263 solución que contenía los espermatozoides teñidos, que luego se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación los dos tubos se dividieron en dos alícuotas de 7 mi cada una. Se centrifugó una alícuota de cada tubo a 2250 rpm (aproximadamente 540 g) durante 7 minutos en una centrifuga de rotor de ángulo fijo. La otra alícuota de cada uno de los dos tubos se centrifugó a 2500 rpm (aproximadamente 660 g) durante 7 minutos. Inmediatamente después de la centrifugación, se utilizaron pipetas de 10 mi para extraer y guardar el sobrenadante de cada alícuota. Los sedimentos se resuspendieron en 200 ul de TCA con yema de huevos al 10% (pH 7.0). Se observó la motilidad de los espermatozoides previa y posteriormente a la centrifugación con un microscopio de contraste de fase. Se agregaron 50 ul de un fijador (0.1% de glutaraldehído en citrato de sodio al 3.4%) a cada sedimento y sobrenadante para inmovilizar el esperma para determinar la concentración con un hemocitómetro. La cantidad total de espermatozoides se calculó sobre la base del volumen usado/recuperado multiplicado por la concentración correspondiente de esperma determinada por el hemocitómetro. La tasa de recuperación se calculó como la cantidad total de esperma en el sedimento dividido por la suma de la cantidad total de esperma en el sedimento y la cantidad total de esperma en el sobrenadante. Los resultados, como se muestra en las figuras 88 y 89 demuestran que la variación de la velocidad de la centrífuga causa pocas diferencias en la motilidad de los espermatozoides. Los resultados también indican que la motilidad fue algo mejor al usar TCA en comparación con PBS. 264 EJEMPLO II DE CENTRIFUGACION En el ejemplo II de centrifugación se recogieron y evaluaron muestras de semen de tres toros como se describió anteriormente. Una de las muestras se descalificó por no cumplir con las normas de control de calidad iniciales. Las otras dos muestras de semen se diluyeron con una cantidad de TCA que tenía un pH de 7.3 para obtener un esperma con una concentración de 150 x 106 espermatozoides/ml. Los espermatozoides se tiñeron con Hoeschst 33342 10 µ? a 41° C durante veinte minutos. A cada uno de los tubos se agregó una solución amortiguadora simulada que contenía 1500 µ? de PBS con 10% de yema de huevo y 28.3 mi de PBS con 0.1% de BSA. A cada tubo se agregaron 200 µ? de espermatozoides teñidos (30 x 106 espermatozoides) y se incubaron a temperatura ambiente durante veinte minutos. Se tomaron tres alícuotas de 9 mi de la mezcla de semen de cada uno de los dos tubos para la centrifugación. Una alícuota de cada una de las dos muestras se centrifugó durante siete minutos en un tubo de centrífuga de 15 mi a cada una de las velocidades siguientes: 550 g; 650 g; y 750 g. Durante la centrifugación la temperatura fue de 22° C. Inmediatamente después de la centrifugación se extrajo el sobrenadante con una pipeta de 10 mi, dejando aproximadamente 200-300 pl del sobrenadante en el sedimento. Los sedimentos se resuspendieron con 200 pl de TCA con 10% (v/v) de yema de huevo que tenía un pH de 7.0. Se observó la motilidad del esperma previa y posteriormente a la separación con un microscopio de 265 contraste de fase. En las muestras de uno de los dos toros posteriormente a la centrifugación se observó un grado importante de aglutinación del esperma. Se agregaron 50 µ? de un fijador (0.1% de glutaraldehído en citrato de sodio al 3.4%) al sobrenadante y al sedimento para inmovilizar al esperma para determinar su concentración. La tasa de recuperación se determinó de acuerdo a la fórmula establecida en el experimento I de centrifugación. Los resultados se muestran en la fig. 90. Los resultados indican que hay una mejor tasa de recuperación de espermatozoides a 650 g que a 550 g. Sin embargo, hubo poca diferencia en la tasa de recuperación entre 650 g y 750 g. No hubo ninguna diferencia significativa en la motilidad de los espermatozoides causada por la variación de la velocidad de la centrífuga.

EJEMPLO III DE CENTRIFUGACION Para el ejemplo III de centrifugación, se repitió básicamente el procedimiento del ejemplo II de centrifugación con los mismos tres toros, otro día. Los resultados se muestran en la fig. 91. Los resultados confirman que hay poca diferencia en la tasa de recuperación a 650 g comparada con 750 g.

EJEMPLO IV DE CENTRIFUGACION Se recogió semen de dos toros diferentes en dos días diferentes. El semen se transportó y se evaluó de la manera descrita anteriormente. 266 Sobre la base de la concentración de esperma del semen sin tratar, los espermatozoides se diluyeron con ácido cítrico-Tris (TCA, pH 7.3) más piruvato 10 m , hasta una concentración de 150x106 espermatozoides/ml. Los espermatozoides se tiñeron con Hoechst 33342 10 µ a 41° C durante 20 min. Después de la tinción, 267 µ? de la solución que contenía los espermatozoides teñidos se diluyeron hasta alcanzar una concentración de 1x106 espermatozoides/ml mediante la adición de las siguientes soluciones amortiguadoras simuladas: 2 mi de PBS con 0% (v/v) de yema de huevo; y 37.733 mi de PBS con 0.1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA). Los espermatozoides teñidos y las soluciones amortiguadoras simuladas se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos. Se tomaron cuatro alícuotas de 9 mi de la mezcla de espermatozoides teñidos obtenidos de cada toro y las soluciones amortiguadoras simuladas. Las cuatro alícuotas del primer toro se centrifugaron a combinaciones variables de velocidad y tiempo de la centrífuga en la siguiente secuencia: (1) 700 g durante 7 minutos para la primera alícuota; (2) 700 g durante 10 minutos para la segunda alícuota; (3) 650 g durante 10 minutos para la tercer alícuota; y (4) 650 g durante 7 minutos para la cuarta alícuota. Las cuatro alícuotas del segundo toro se centrifugaron a combinaciones variables de velocidad y tiempo de la centrífuga en la siguiente secuencia: (1) 700 g durante 10 minutos para la primera alícuota; 267 (2) 700 g durante 7 minutos para la segunda alícuota; (3) 650 g durante 10 minutos para la tercer alícuota; y (4) 650 g durante 7 minutos para la cuarta alícuota. Toda la centrifugación se llevó a cabo en tubos de centrífuga de 15 mi en una centrífuga de rotor basculante (Allegra 6R, Beckman Coulter Inc. Fullerton, CA) a 22°C. El intervalo de tiempo entre la recolección de semen en la granja y la centrifugación en el laboratorio fue de 4-5 horas. Inmediatamente después de la centrifugación, se extrajo el sobrenadante con pipetas de 10 mi, dejando ~250 µ? de sobrenadante con cada uno de los sedimentos. Los sedimentos se resuspendieron en 250 µ? de PBS Delbecco (pH 7.0). La motilidad del esperma y la motilidad progresiva se observaron mediante un analizador de motilidad Hamilton Thorn (Hamilton-Thorn Motility Analyzer) (dos portaobjetos por muestra; dos cámaras por portaobjetos) después de la tinción pero antes de la centrifugación y nuevamente después de la centrifugación. La concentración del esperma se determinó mediante la medición con un hemocitómetro de una alícuota de unos 100 µ? de la mezcla sin centrifugar de espermatozoides teñidos y soluciones amortiguadoras simuladas, que se había colocado en el congelador y una alícuota de 10 µ? del sedimento resuspendido mezclado con 90 µ? de fijador (0.1% de glutaraldehído en citrato de sodio al 3.4%). La tasa de recuperación se determinó de la misma forma que en el ejemplo I de centrifugación. Los resultados se muestran en las figs. 92 y 93. Los datos indican que >85% de los espermatozoides pueden 268 recuperarse después de la centrifugación a 650 g ó 700 g, durante 7 ó 10 minutos (Fig. 92). Sin embargo, la tasa de recuperación fue algo mejor (95%) a 700 g. La disminución en la motilidad después de la centrifugación (comparada con la motilidad antes de la centrifugación) en todos los tratamientos podría ser debida a la presencia de espermatozoides muertos/anómalos/frágiles que podrían no resistir la agresión de la fuerza centrífuga. La motilidad del esperma descendió en un 10-14% (Fig. 93) en todos los tratamientos. La disminución mayor en la motilidad del esperma (14%) a 650 g durante 7 minutos podría ser debida a la exposición más larga del esperma a la solución amortiguadora simulada cuando se llevó a cabo la centrifugación a 650 g después de 700 g. La centrifugación no mostró ningún efecto adverso sobre la motilidad progresiva de los espermatozoides, más bien hubo una mejoría de alrededor de 2-3%.

EJEMPLO V DE CENTRIFUGACION Se recogió el semen de un toro en dos días diferentes. El semen se evaluó, se diluyó y se tifló con Hoechst 33342 y fue diluido posteriormente con soluciones amortiguadoras simuladas según se describe en el ejemplo IV de centrifugación. Para cada una de las muestras de semen se obtuvieron cuatro alícuotas de 9 mi de la mezcla de espermatozoides teñidos y soluciones amortiguadoras simuladas. Las alícuotas de la primera muestra se centrifugaron a una de las siguientes combinaciones de velocidad y tiempo de 269 la centrífuga en la siguiente secuencia: (1) 750 g durante 10 minutos para la primera alícuota; (2) 750 g durante 7 minutos para la segunda alícuota; (3) 700 g durante 0 minutos para la tercer alícuota; y (4) 700 g durante 7 minutos para la cuarta alícuota. Para las alícuotas obtenidas de la segunda muestra, las combinaciones de velocidad y tiempo de la centrífuga fueron las mismas, pero la secuencia se modificó del siguiente modo: (1) 750 g durante 7 minutos para la primera alícuota; (2) 750 g durante 10 minutos para la segunda alícuota; (3) 700 g durante 7 minutos para la tercer alícuota; y (4) 700 g durante 10 minutos para la cuarta alícuota. La centrifugación se llevó a cabo en un tubo de centrífuga de 15 mi en una centrífuga de rotor basculante (Allegra 6R, Beckman Coulter Inc. Fullerton, CA) a 22°C. El intervalo entre la recolección de semen en la granja y la centrifugación en el laboratorio fue de 6.5 horas aproximadamente para la primera muestra y de 4 horas aproximadamente para la segunda muestra. El procedimiento posterior a la centrifugación, es decir, la extracción del sobrenadante, la resuspensión del sedimento, la determinación de la concentración del esperma y la estimación de la motilidad con el analizador de motilidad Hamilton-Thorn (Hamilton-Thorn Motility Analyzer), se llevó a cabo siguiendo el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo IV. Los resultados se muestran en las figs. 94 y 95. 270 Los resultados muestran que >85% de la población de esperma en una suspensión sumamente diluida puede recuperarse con 700 g ó 750 g en 7 minutos ó 10 minutos (Fig. 94). Un aumento de la fuerza g a 750 g no mejoró significativamente la tasa de recuperación. Como el caso en el ejemplo IV de centrifugación, en todos los tratamientos se observó disminución en la motilidad después de la centrifugación (en comparación con la motilidad antes de la centrifugación). En el experimento actual, la motilidad del esperma descendió aproximadamente 13-20% (Fig. 95), que es un porcentaje un poco mayor que el del ejemplo IV de centrifugación. La variación podría ser debida a la variación en la muestra de semen y al mayor intervalo de tiempo desde la recolección del semen hasta la centrifugación (6 horas) en una muestra. Como se explicó en el ejemplo IV, la disminución en la motilidad del esperma (aproximadamente 20%) con la centrifugación a baja velocidad (700 xg, durante 7 ó 10 min.) podría deberse a la mayor exposición del esperma a la solución amortiguadora simulada cuando fue centrifugado después de la centrifugación a 750 g. La disminución en la motilidad progresiva fue insignificante (1-5%).

B. Centrifugación de esperma inactivo [Insert] 271 C Centrifugación secundaria Para recuperar el esperma que de otro modo se podría perder en el sobrenadante, es posible centrifugar el sobrenadante después que éste ha sido separado del sedimento. Sin adherir a una teoría en particular, los solicitantes creen que la interfase sedimento/sobrenadante impide el movimiento de los espermatozoides dentro del sedimento. La extracción de la interfase mediante la separación del sedimento del sobrenadante permitirá que la centrifugación adicional del sobrenadante provoque la formación de un segundo sedimento con los espermatozoides que hubieran quedado en el sobrenadante. El segundo sedimento se puede resuspender y agregar al esperma resuspendido del primer sedimento.

D. Filtración La filtración es un método de concentración alternativo que se puede usar para evitar la pérdida de espermatozoides en el sobrenadante. Como se muestra en la fig. 96, según la materialización de uno de los ejemplos, un filtro 2415 se incorpora en un recipiente de recolección 2403. Se aconseja que el tamaño de los poros en el filtro esté en dentro del intervalo de 0.2 - 1 micrómetro aproximadamente. Es también aconsejable que el filtro no sea un filtro de profundidad (por ejemplo, un filtro que tenga pasajes tortuosos en los que puedan quedar atrapadas las colas de los espermatozoides). Más bien es aconsejable que el filtro sea lo más fino posible. Por ejemplo, es aconsejable que el filtro tenga un espesor de 50 µ?? a 500 µ??;ß5 más 272 aconsejable que el espesor sea de 75 µ?? a 250 µ??; y aún es más aconsejable que el espesor del filtro sea de 100 µ?t? a 150 µ??. Se aplica vacío de nivel bajo 2417 para extraer los líquidos a través del filtro cuando se recogen las gotitas 33. Es importante usar vacío de nivel bajo (menos de 20 pulgadas de mercurio (0.6906 kg/cm2, por ejemplo, 15 pulgadas de mercurio (0.5179 kg/cm2) para evitar infligir daño a los espermatozoides. En una materialización el vacío es lo bastante bajo como para que la velocidad de extracción del líquido sea de aproximadamente 1.0 ml/15 segundos. Según otra materialización de la invención actual, el vacío se aplica intermitentemente para permitir que los espermatozoides se recuperen. En otra materialización, el filtro 2415 está construido de un material que es compatible con los espermatozoides, si bien no tiene ninguna afinidad de unión a ellos. Al finalizar la separación, aproximadamente 80-90% de los líquidos se habrán extraído a través del filtro. Sin embargo, queda suficiente líquido (aproximadamente 10-20%) para que los espermatozoides se acumulen en una suspensión concentrada 2405, impidiendo de ese modo que los espermatozoides formen una torta de filtración. La suspensión concentrada se puede transferir a otro recipiente 2419, como se muestra en la fig. 97 por ejemplo. Se puede usar un mecanismo de jeringa 2409 con un filtro de la punta de la cánula 2411 para extraer una parte del líquido remanente de este recipiente 2419. Sin embargo, en el recipiente quedan líquidos suficientes para evitar que los espermatozoides formen una torta en el filtro 241 . Se aplican las mismas consideraciones al filtro de la punta de la 273 cánula 2411 que al filtro 2415 del recipiente de recolección. Por lo tanto, es aconsejable que el tamaño de poro del filtro de la cánula 241 varíe entre 0.2 y 1.0 micrómetros aproximadamente y que el filtro de la cánula sea relativamente fino para evitar que las colas de los espermatozoides queden atrapadas en los tortuosos pasajes del filtro. Por ejemplo, un filtro de punta de jeringa de fibra de polipropileno hueco DynaGard®, que se encuentra disponible comercialmente de los Laboratorios Spectrum, Inc. de Rancho Domínguez, CA, se puede usar para el filtro de la punta de la cánula. Como se muestra en la fig. 98, se vierte un líquido de resuspensión 2413 a través del filtro de la punta de la cánula para lavar las células que pueden estar adheridas a la superficie del filtro y devolverlas a la suspensión. El líquido de resuspensión puede contener una cantidad del líquido filtrado y/o un diluyente apropiado. Después de efectuar un retrolavado a través del filtro con una cantidad de líquido de resuspensión suficiente para extraer los espermatozoides del filtro, se puede agregar líquido de resuspensión adicional si se desea. La cantidad total de líquido de resuspensión se selecciona para llevar la concentración a un valor deseado (por ejemplo, aproximadamente 20 x 106 espermatozoides/ml). Por lo tanto, el proceso de filtración de esta materialización es un proceso en tres pasos que incluye el uso de un filtro en el recipiente de recolección, la filtración mediante un filtro de la cánula y la resuspensión para obtener la concentración deseada. En un proceso alternativo de filtración en dos pasos, se combinan el primero y el segundo paso del proceso en tres pasos descrito 274 anteriormente para que la extracción de todo el líquido sea a través de un filtro de la cánula. En este proceso los espermatozoides separados se dirigen a un recipiente de recolección que no tiene filtro. Los líquidos se extraen por medio de vacío de bajo nivel y/o vacío intermitente como se describió anteriormente, que se aplica a través del filtro de la punta de la cánula 2411. Cuando los espermatozoides están formando parte de una suspensión concentrada, se hace un retrolavado con un líquido de resuspensión, como por ejemplo un diluyente, a través del filtro de la cánula para obtener la concentración deseada de espermatozoides.

EJEMPLO I DE FILTRACION El ejemplo I de filtración muestra la tasa de recuperación y la motilidad de los espermatozoides después de la concentración mediante un proceso de filtración en tres pasos de la invención actual. Se recogieron muestras de semen de tres toros y se evaluaron según lo estipulado anteriormente en la sección de preparación de muestras. Una de las tres muestras de semen se descalificó por no satisfacer los criterios de calidad iniciales mínimos. Las dos muestras restantes se diluyeron con una cantidad de TCA (pH 7.3) adecuada para obtener una concentración de 150 x 106 espermatozoides/ml. Se agregaron 500 ul de PBS con 10% de yema de huevo y 9.5 mi de PBS con 0.1% de BSA a cada uno de dos tubos de ensayo de 15 mi. A cada tubo de ensayo se agregaron 67 ul de la muestra de semen 275 (aproximadamente 10 x 106 espermatozoides)y se incubaron durante veinte minutos a temperatura ambiente. Con referencia a la fig. 99, se usó una bomba de vacío 2427 para aplicar presión negativa para extraer una alícuota de cuatro mi del semen diluido 2423 a través de un filtro 2425. El filtrado 2429 se recogió en una jeringa 2421. Después de la filtración los espermatozoides que quedaron en el filtro se retrolavaron con 1 mi de solución amortiguadora TCA en un tubo de 15 mi. La motilidad del esperma se evaluó visualmente. Las muestras se mezclaron con un fijador (0.1% de glutaraldehído en citrato de sodio al 3.4%) antes y después de la filtración para inmovilizar los espermatozoides. La concentración del esperma se determinó usando un hemocitómetro. El número total de espermatozoides se calculó sobre la base del volumen multiplicado por la concentración de espermatozoides. La tasa de recuperación se calculó como el número total de espermatozoides en la porción a la que se efectuó el retrolavado dividida por el número total de espermatozoides en la alícuota antes de la filtración. El proceso se repitió con un filtro diferente. El experimento probó los dos filtros siguientes: (1) un filtro (jeringa) de disco de membrana de 1.0 pm PTFE (no FTPE) (que comercializa Pall Corporation, Life Science Group, Ann Arbor, MI, Cat N° PN4226T o VWR, Batavia, IL, Cat. N° 28143-928); y (2) filtro (jeringa) de disco de membrana de 0.8 SFCA (acetato de celulosa sin surfactante) (Corning, Inc., Corning, NY, Cat. N° 431221; VWR Batavia, IL, Cat. # 28200-028). Los resultados se muestran en la fig. 101. Se recuperaron más espermatozoides con filtros de acetato de celulosa en comparación con el filtro de PTFE, es decir 67 frente a 276 33% debido a las proteínas de baja afinidad de unión del acetato de celulosa. La motilidad visual de los espermatozoides recuperados fue del 63% (PTFE) al 68% (acetato de celulosa).

EJEMPLO II DE FILTRACION El ejemplo II de filtración muestra la tasa de recuperación y la motilidad de los espermatozoides después de la concentración mediante un proceso de filtración en dos pasos de la invención actual. Se recogieron muestras de semen de tres toros y se evaluaron según lo estipulado anteriormente en la sección anterior de preparación de muestras. Las tres muestras se diluyeron con una cantidad de TCA (pH 7.3) adecuada para obtener una concentración de 150 x 106 espermatozoides/ml. A cada uno de los 50 tubos de ensayo se agregó un mi y medio de PBS con 10% de yema de huevo y 28.3 mi de PBS con 0.1% de BSA. Se agregaron 200 pl de la muestra de semen (aproximadamente 30 x 106 espermatozoides) a cada tubo de ensayo y se incubaron durante treinta minutos a temperatura ambiente. Con referencia a la fig. 100, se utilizó una jeringa 2431 para aplicar presión negativa para extraer una alícuota de 6 mi del semen diluido 2433 de cada tubo de ensayo a través de un filtro 2435. El filtro se colocó en un soporte del filtro 2437 (un soporte de filtro Swinnex de Millipore Corporation, Billerica, MA Cat # SX0002500,). Después de la filtración, el soporte de filtración 2437 se desconectó de la jeringa y el tubo, conservando intacto el soporte del filtro. 277 Los espermatozoides en el filtro se recogieron invirtiendo la parte superior del ensamblaje del filtro y retrolavando con 1 mi de solución amortiguadora TCA empleando una jeringa de 3 mi que tenía un trozo pequeño de tubo en la punta de un tubo de ensayo de 15 mi. La motilidad del esperma se evaluó visualmente. Las muestras se mezclaron con un fijador (0.1% de glutaraldehído en citrato de sodio al 3.4%) antes y después de la filtración para inmovilizar los espermatozoides. La concentración de espermatozoides se determinó usando un hemocitómetro. El número total de espermatozoides y la tasa de recuperación se calcularon como se especifica en el ejemplo I de filtración. El proceso se repitió dos veces para probar filtros diferentes. El experimento probó los dos filtros siguientes: (1) un filtro de membrana de Teflón de 0.2 pm (comercialmente disponible de X-Partek, P.J Cobert Associates Inc. St. Louis Cat. N° 944106; y (2) un filtro de membrana de acetato de celulosa de 0.8 (Millipore Corporation, Billerica, MA Cat. N°AAWP 02500). Los resultados se muestran en la fig. 102. La tasa de recuperación de espermatozoides fue baja en ambos filtros (~25%). En el filtro de teflón fue baja como en el ejemplo I. Sin embargo, la baja tasa de recuperación y poca motilidad visual de los espermatozoides a los que se les efectuó el retrolavado en el filtro de acetato de celulosa podría deberse al material usado por diferentes proveedores y/o a la capacidad de los espermatozoides de unirse al soporte/ montaje del filtro. 278 F. Concentración de medio denso Otro método alternativo de concentrar los espermatozoides recogidos depende de la flotación de los espermatozoides en un medio de alta densidad. Según este método, se agrega un medio de alta densidad a los espermatozoides recogidos para elevar el peso específico de la suspensión por encima de aproximadamente 1.3. Por ejemplo, para aumentar el peso específico de la suspensión se puede usar una suspensión de sílice coloidal tal como está disponible comercialmente de las marcas registradas Percoll® e Isolate®. Los espermatozoides flotarán en la parte superior de la suspensión, donde pueden ser separados o recogidos de otro modo, debido al mayor peso específico de la suspensión. A las células que se han recogido de la superficie se les agrega un líquido de resuspensión para llevar la concentración final a aproximadamente 20 x 106 espermatozoides/ml. Parte del líquido de suspensión puede ser extraído por uno de los métodos de filtración descritos anteriormente antes del agregado del medio de alta densidad para reducir la cantidad de medio de alta densidad necesario para obtener el peso específico deseado. 279 Cric-dilución A. Crioprotección A. Crioprotección Una vez que el esperma fue separado y recogido en los recipientes de recolección, se puede usar para ¡nseminar hembras de mamíferos. Esto puede ocurrir casi de inmediato, requiriendo poco tratamiento adicional del esperma. Asimismo, el esperma también se puede enfriar o congelar para usar en una fecha posterior. En tales casos, puede ser beneficioso administrar un tratamiento adicional al esperma para reducir al mínimo la repercusión sobre la viabilidad o la motilidad posterior a la descongelación como resultado del enfriamiento y la congelación. En general, un criodiluyente consiste en un amortiguador o solución amortiguada, una fuente proteica y un crioprotector. Antes se dieron ejemplos de amortiguadores y soluciones amortiguadas que se pueden usar en el criodiluyente en lo que se refiere a la recolección y dilución de las muestras. Habitualmente estos amortiguadores tendrán una concentración de aproximadamente 0.001 M a aproximadamente 1.0M y su pH es entre aproximadamente 4.5 y aproximadamente 8.5; preferentemente de aproximadamente 7.0. Si está incluida, se puede agregar una fuente proteica para proporcionar sustento a las células y para amortiguar el contacto de las 280 células con el recipiente de recolección. La fuente proteica puede ser cualquier fuente proteica que no interfiera con la viabilidad de los espermatozoides y sea compatible con el amortiguador o solución amortiguada particular que se utilice. Algunos ejemplos de fuentes proteicas son la leche (incluso la homogeneizada por calor y la descremada), el extracto lácteo, la yema de huevo, el extracto de yema de huevo, la proteína de soja y el extracto de proteína de soja. Tales proteínas se pueden encontrar en una concentración entre aproximadamente 10% (v/v) y aproximadamente 30% (v/v), preferentemente entre aproximadamente 10 % (v/v) y aproximadamente 20 % (v/v) y mejor sí es de aproximadamente 20 % (v/v). Aunque la leche se puede usar en combinación con un amortiguador o solución amortiguada, en general se usa a falta de éstos, ya que la leche misma es una solución que se puede utilizar para los mismos fines que un amortiguador o solución amortiguada. En tales casos, el criodiluyente contendría entre aproximadamente 80 % (v/v) y aproximadamente 90 % (v/v) de leche. Preferentemente se incluye un crioprotector en el criodiluyente para reducir o evitar el choque frío y para conservar la fecundidad del esperma. En el medio se conocen numerosos crioprotectores. La selección de un crioprotector apropiado para usar con un diluyente determinado puede variar y depende de la especie de la que se obtuvo el esperma congelado. Algunos ejemplos de crioprotectores apropiados son, por ejemplo, el glicerol, el dimetil sulfóxido, el etilenglicol, el propilenglicol, la trehalosa, Triiadyl® y combinaciones de éstos. Si están incluidos, en general, estos crioprotectores 281 están presentes en el criodiluyente en una cantidad de entre aproximadamente 1 % (v/v) y aproximadamente 15 % (v/v), preferentemente en una cantidad entre aproximadamente 5 % (v/v) y aproximadamente 10 % (v/v), mejor si es entre aproximadamente 7 % (v/v), y lo mejor es que esté presente en una cantidad de aproximadamente 6 % (v/v). En una materialización particular, el criodiluyente está compuesto por agua, Triladyl®, yema de huevo y ácido pirúvico. En aún otra materialización, el criodiluyente está compuesto por Triladyl ®, 25 g de yema de huevo y ácido pirúvico 10 mM en 75 ml_ de agua. Opcionalmente, el criodiluyente también puede contener una variedad de aditivos que son beneficiosos para la viabilidad o motilidad del esperma y que evitan o reducen los efectos colaterales perjudiciales de la crioconservación. Entre dichos aditivos se encuentran, por ejemplo, una fuente de energía, un antibiótico o una preparación que regula las reacciones de oxidación/reducción dentro de la célula o del medio celular, cada uno de los cuales se trata antes con relación a la recolección y dilución de muestras. Dichos aditivos se pueden agregar al criodiluyente de acuerdo con eso. Es más, en el criodiluyente puede haber componentes adicionales beneficiosos para la viabilidad y la motilidad del esperma. Se incluyen en esta lista de materiales, por ejemplo ácidos grasos (Perez-Pe, Theriogenology (2001) 56: 425-434), proteínas del plasma seminal (Perez-Pe, Theriogenology (2001) 56: 425-434), reductasas, lauril sulfato de sodio y de trietanolamina, pentoxifilina, AMPc, y ATP. Dichos componentes se agregan 282 en una concentración o cantidad adecuada para obtener el efecto deseado proporcionado por el componente específico o la combinación de componentes.

B. Crioconservación de los espermatozoides separados En la mayoría de los casos, no es posible usar de inmediato los espermatozoides que fueron separados como se describió anteriormente para la inseminación artificial. En el caso específico de una aplicación de separación de espermatozoides para uso comercial, los espermatozoides separados se deben almacenar y/o transportar antes de que se puedan usar en inseminación artificial. Esto generalmente requiere la crioconservación de los espermatozoides. El esperma separado se puede cargar en cilindros alargados (conocido como "pajillas" en la industria de cría) y se lo somete a la crioconservación para protegerlo durante el transporte y el almacenamiento. Los espermatozoides sometidos a la crioconservación se pueden almacenar durante períodos largos en nitrógeno líquido. Para usar el esperma sometido a crioconservación, se puede sumergir la pajilla en un baño María caliente para descongelarlo. Luego la pajilla se carga en una pistola de inseminación artificial que se usa para inseminar a una hembra. Se deben tomar varias precauciones para proteger a los espermatozoides durante el proceso de crioconservación. De otro modo los espermatozoides resultarán tan dañados (como lo indica una tasa baja de motilidad posterior a la descongelación, del 5-10%) que no serán adecuados para usar en inseminación artificial. 283 Los métodos convencionales de crioconservación consisten en agregar secuencialmente una fuente proteica (por ejemplo, yema de huevo), enfriar el esperma a una temperatura de aproximadamente 4-5° C, agregar un crioprotector (por ejemplo, glicerol), mantener al esperma y al crioprotector a una temperatura constante en el intervalo de 4-5° C aproximadamente durante un período suficiente para permitir que los espermatozoides se equilibren con el crioprotector y después sobreenfriar el esperma, por ejemplo sumergiendo los espermatozoides en nitrógeno líquido a -196° C para el almacenamiento. Los técnicos de la profesión saben que la finalidad de la fuente proteica es proteger al esperma del daño cuando se lo enfría desde aproximadamente 14° C hasta aproximadamente 8o C, que es la temperatura a la que los espermatozoides son más susceptibles al choque frío. En contraposición, el crioprotector protege a los espermatozoides del daño a temperaturas inferiores a 0° C. Aún cuando las temperaturas que se emplean en la crioconservación son muy inferiores a la congelación y el término "congelación" a veces se emplea para describir la crioconservación, los técnicos de la profesión también saben que el esperma crioconservado no está realmente congelado. Para ser preciso, el esperma crioconservado está en un estado sobreenfriado. El período convencional durante el cual los espermatozoides y el crioprotector se mantienen a una temperatura constante puede durar desde 60 minutos hasta muchas horas. El tiempo total que lleva completar la crioconservación utilizando los métodos convencionales en general supera las cuatro horas Además, se cree que hasta 50% de los 284 espermatozoides mueren durante los procesos convencionales de crioconservación. Aunque según algunas materializaciones de la invención actual el esperma es crioconservado utilizando métodos convencionales, otras materializaciones de la invención actual emplean métodos mejorados de crioconservación que permiten reducir el tiempo que requiere el proceso y/o mejorar la sanidad del esperma crioconservado. La fig. 103 muestra un diagrama de flujo de trabajo que describe los pasos de una materialización ejemplar de un método mejorado de crioconservación de esperma según la invención actual. En el paso 2501 , la concentración de una solución que contiene espermatozoides separados se ajusta para quedar dentro del intervalo de 1 millón - 40 millones de espermatozoides/ml aproximadamente, dependiendo de la norma que use el consumidor final (por ejemplo, asociación de cría). Por ejemplo, la concentración de esperma puede ajustarse para quedar en el intervalo de 20 millones a 24 millones de espermatozoides/ml aproximadamente. El ajuste de la concentración de esperma puede incluir la adición de líquido de resuspensión, soluciones amortiguadoras y/o diluyentes al esperma concentrado, como se describe anteriormente. En el paso 2503, se agrega un crioprotector (por ejemplo, glicerol) antes de que el esperma se enfríe. Los espermatozoides comienzan a equilibrarse con el crioprotector en cuanto entran en contacto con éste. En el paso 2505 también se agrega una fuente proteica (por ejemplo, yema de huevo) a la solución que contiene los espermatozoides como se describió anteriormente. 285 La solución con los espermatozoides, la fuente proteica y el crioprotector se carga en pajillas convencionales de inseminación artificial de 0.5 ó 0.25 mi utilizando un equipo de carga convencional en el paso 2507. Los técnicos de la profesión conocen una cantidad de equipos y técnicas convencionales que se pueden usar para cargar semen en las palillas. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N° 5,249,610, otorgada a Cassou, et al. el 5 de octubre de 1993 e incorporada aquí como referencia, proporciona instrucciones sobre el relleno de las pajillas con semen bovino utilizando una boquilla inyectora desechable. Es más, Minitube de América, ubicada en Verona Wl comercializa el equipo para llenar las pajillas. Para cargar los espermatozoides separados en las pajillas se puede utilizar cualquiera de estos métodos de carga o equipos convencionales o similares. Después de la carga, los espermatozoides se enfrían hasta una temperatura de mantenimiento en el paso 2509. En general, la temperatura de mantenimiento se selecciona teniendo en cuenta lo siguiente: mantener a los espermatozoides a una temperatura demasiado alta (por ejemplo, 10° C) puede causar daño innecesario por choque frío; se cree que la equilibración de los espermatozoides con un crioprotector (por ejemplo, glicerol) es más activa a temperaturas de 4-5° C; y se cree que mantener a los espermatozoides a temperaturas demasiado bajas (por ejemplo, < 0o) los daña. De este modo, de acuerdo con una materialización, la temperatura de mantenimiento debe estar en el intervalo de 0-8° C. Es mejor si la temperatura de mantenimiento está en el intervalo de 2-6° C. Es aún mejor si 286 la temperatura de mantenimiento está en el intervalo de 4-5° C. En otra materialización, la velocidad de enfriamiento que se usa para este paso 2509 se selecciona para reducir al mínimo el daño a los espermatozoides. Por ejemplo, se puede controlar la velocidad de enfriamiento (es decir, prácticamente constante) para proporcionar un enfriamiento homogéneo y evitar que el esperma sufra el choque térmico. La velocidad de enfriamiento también debe enfriar al esperma lo suficientemente rápido para reducir su metabolismo antes de que la membrana sufra daño, pero lo suficientemente lento como para que no sufra choque térmico. Se puede controlar la velocidad de enfriamiento colocando las pajillas que contienen los espermatozoides en un congelador programable (por ejemplo, un congelador 1810CD IceCube que está disponible comercialmente de Minitube de América, ubicado en Verana, Wl) para enfriarlos. Según una materialización, el congelador programable enfría al esperma que está a la temperatura ambiente aproximadamente (habitualmente entre 22 y 24° C) a una velocidad de enfriamiento constante de 0.1 y 0.3° C/minuto. Es mejor si la velocidad de enfriamiento es de aproximadamente 0.15 y 0.25° C/min. Es mejor aún si la velocidad de enfriamiento es de aproximadamente 0.2° C/min. En otra materialización, se selecciona la velocidad de enfriamiento para enfriar el esperma de su temperatura inicial hasta la temperatura de mantenimiento en 90 minutos aproximadamente. En otra materialización más, se selecciona la velocidad de enfriamiento para enfriar el esperma desde su temperatura inicial hasta la temperatura de mantenimiento a una velocidad de enfriamiento 287 constante en aproximadamente 90 minutos. Las velocidades de enfriamiento mencionadas anteriormente se refieren en realidad a la velocidad de enfriamiento de la cámara del congelador programable, pero debido a las paredes finas y a la forma larga, delgada de la pajilla (es decir, aproximadamente 5.25 pulgadas (13.33cm) de largo , menos de 3 mm de diámetro y aproximadamente 0.15 mm de espesor de la pared) y a las propiedades conductoras de la pajilla, la diferencia de temperatura entre los espermatozoides y la cámara de enfriamiento no es significativa. Después que los espermatozoides se enfriaron hasta alcanzar la temperatura de mantenimiento, en el paso 2511 se mantienen a esa temperatura o a una temperatura próxima durante un período para permitir completar sustancialmente su equilibración con el crioprotector. Por ejemplo, el congelador programable descrito anteriormente se puede programar para mantener a los espermatozoides a una temperatura constante durante el período. Según otra materialización de la invención actual, los espermatozoides se mantienen a la temperatura de mantenimiento durante un período más corto en comparación con los métodos convencionales porque ya se equilibraron con el crioprotector durante el proceso de enfriamiento. Por ejemplo, el período puede variar entre 10 y 60 minutos. Es mejor si el período varía entre 20 y 40 minutos. Es mejor aún si el período es de aproximadamente 30 minutos. En otra materialización el período es inferior a 60 minutos. En otra materialización más, el período es inferior a 40 minutos. El período de mantenimiento relativamente corto ofrece varias ventajas en un 288 proceso comercial de separación de esperma. En primer lugar, reduce el tiempo requerido para procesar el esperma separado, que puede traducirse en el ahorro en los costos. Además, los espermatozoides todavía llevan a cabo procesos metabólicos a temperaturas en el intervalo de 0-8° C, de modo que reducir el tiempo en que los espermatozoides deban mantenerse a esta temperatura puede mejorar su sanidad, lo que aumenta su valor para los criadores de animales, que están interesados en los índices de acierto de la inseminación artificial. Después de mantener los espermatozoides a la temperatura de mantenimiento durante un período como se describió antes, en el paso 2513 se enfrían hasta una temperatura que se acerca a la zona de temperatura crítica de crioconservación. Los técnicos de la profesión saben que la zona de temperatura crítica es la zona en la que la formación de cristales de hielo y los cambios en la presión osmótica dañan a los espermatozoides. Esta temperatura puede variar dependiendo de la solución que se use en la crioconservación de los espermatozoides, pero la zona de temperatura crítica generalmente se encuentra en el intervalo comprendido entre -18 y -35° C. Algunas veces se informa que esta zona de temperatura crítica se encuentra en el intervalo comprendido entre -18 y -30° C aproximadamente. De este modo, según otra materialización de la invención actual, la velocidad de enfriamiento utilizada para enfriar los espermatozoides desde la temperatura de mantenimiento hasta una temperatura que se aproxime a -18° C (por ejemplo., -15° C) se selecciona para proteger la sanidad del esperma. Los 289 factores pertinentes a considerar incluyen el hecho de que los espermatozoides aún se están equilibrando con el crioprotector durante este período, el hecho de que aún llevan a cabo algunas funciones metabólicas y el hecho de que todavía son un poco sensibles al cambio rápido de temperatura. Nuevamente, es aconsejable que la velocidad de enfriamiento sea una velocidad controlada, como una velocidad que se puede programar en el congelador programable descrito anteriormente. Es mejor si la velocidad de enfriamiento que se utiliza para enfriar el esperma desde la temperatura de mantenimiento hasta una temperatura que se aproxima a -18° C aproximadamente es una velocidad de enfriamiento constante. De este modo, según otra materialización de la invención actual, los espermatozoides son enfriados de la temperatura de mantenimiento hasta aproximadamente -15° C a una velocidad de enfriamiento en el intervalo de 1.0 - 5.0° C/ min aproximadamente. Es mejor si la velocidad de enfriamiento se encuentra en el intervalo de 2.0 - 4.0° C/min aproximadamente. Es mejor aún si la velocidad de enfriamiento es de aproximadamente 3.0° C/min. El paso 2515 consiste en el enfriamiento rápido de los espermatozoides a través de la zona de temperatura crítica para limitar el tiempo que los espermatozoides permanecen allí. Por lo tanto, según una materialización de la invención actual, la velocidad de enfriamiento a través de la zona de temperatura crítica (por ejemplo, -18° C hasta aproximadamente -30° C) se selecciona para que sea mucho más rápida que la velocidad de enfriamiento utilizada para enfriar a los espermatozoides hasta la temperatura 290 de mantenimiento y la velocidad de enfriamiento utilizada para enfriar a los espermatozoides hasta la temperatura próxima a la zona de temperatura crítica. Por lo tanto, es aconsejable que la velocidad de enfriamiento más marcada se encuentre en el intervalo de aproximadamente 8-40° por minuto. Es mejor si la velocidad de enfriamiento más marcada se encuentra en el intervalo de aproximadamente 8-12° C por minuto. Es mejor aún si la velocidad de enfriamiento más marcada es de aproximadamente 10° C por minuto. El intervalo de temperatura en el que se usa la velocidad de enfriamiento más marcada puede ir más allá de la zona de temperatura crítica. De ese modo, en otra materialización de la invención actual, los espermatozoides se enfrían a una de las velocidades de enfriamiento más marcadas descritas antes, de aproximadamente -15° C a aproximadamente -40° C. En otra materialización, los espermatozoides se enfrían a una de las velocidades de enfriamiento más marcadas descritas antes, de aproximadamente -15° C a aproximadamente -80 °C. El paso que consiste en enfriar el esperma a través de la zona de temperatura crítica a una velocidad más marcada se puede realizar en el congelador programable descrito antes. Después que los espermatozoides se enfriaron por debajo de la zona de temperatura crítica (por ejemplo, hasta -80° C), en el paso 2517 las pajillas que contienen los espermatozoides separados se sumergen en nitrógeno líquido (-196° C) para proporcionar la máxima vida útil a los espermatozoides separados. El uso de nitrógeno líquido para almacenar 291 espermatozoides crioconservados está generalizado en la industria de cría de animales en el contexto de espermatozoides sin separar. Por lo tanto, los técnicos de la profesión estarán familiarizados con tecnologías que incluyen el transporte y almacenamiento de esperma en nitrógeno líquido, por lo que no es necesario tratarlo minuciosamente aquí. Es suficiente señalar que se dispone de recipientes convencionales para almacenar a largo plazo cantidades a granel de pajillas de inseminación artificial en nitrógeno líquido y que también se dispone de recipientes más pequeños y portátiles para almacenar las pajillas de inseminación artificial en nitrógeno líquido para el transporte a los clientes y/o el transporte a un establecimiento agropecuario que tenga una o más hembras para ¡nseminar con esperma crioconservado. Una ventaja de los métodos de crioconservación descritos aquí es que la crioconservación se puede llevar a cabo en menos tiempo que el que se requiere según los métodos convencionales. Quizás relacionado con esto, la disminución de la motilidad debida a la crioconservación de acuerdo con la invención actual es sólo aproximadamente del 5-1 %, como lo indica el ejemplo que se trata a continuación. Por lo tanto, la crioconservación según la invención actual, conserva sanos a los espermatozoides como lo indican las pruebas que demuestran que los espermatozoides crioconservados según la invención actual tienen una motilidad que supera el 50% (por ejemplo, aproximadamente 60%), después que se descongelan en un baño María a 37° C durante aproximadamente 50 segundos. Como se trató anteriormente, se puede analizar la motilidad de los espermatozoides por medio de un equipo 292 automático(por ejemplo, el analizador de esperma IVOS de Hamilton Thorn Research) o mediante el examen visual. Debe señalarse que los métodos de crioconservación descritos anteriormente se consideran para el uso en un proceso de separación de espermatozoides a escala comercial. Por lo tanto, según una materialización de la invención actual, los pasos de los métodos originales descritos aquí se realizan simultáneamente en un lote de espermatozoides separados para crioconservar rápidamente todo el lote de espermatozoides de una forma que los conserve sanos. Por ejemplo, utilizando el equipo de citometría de flujo multicanal que se describe a continuación, es posible obtener aproximadamente 840 x 106 cromosomas separados que tengan el cromosoma X en el sistema de recolección del equipo en aproximadamente 20 minutos. Es una cantidad de espermatozoides suficiente para llenar varias docenas de pajillas. Es más, un lote puede incluir los espermatozoides combinados de dos o más citómetros de separación diferentes. Después de estar concentrados como se describió anteriormente, los espermatozoides se puedan cargar en cualquier cantidad de pajillas y se pueden crioconservar como un lote. Por ejemplo, según una materialización de la invención, lleva aproximadamente 5 minutos agregar un diluyente(que incluye una fuente proteica y un crioprotector) a un lote de espermatozoides, y aproximadamente 15 minutos cargar los espermatozoides en las pajillas de inseminación artificial con un equipo de carga automático. Todas las pajillas del lote se enfrían simultáneamente en un congelador programable. Además, la capacidad de 293 algunos congeladores programables permite la crioconservación simultánea de miles de pajillas de inseminación artificial. Por ejemplo, el congelador IceCube 1810CD mencionado anteriormente tiene la capacidad de crioconservar simultáneamente más de 2.500 pajillas de 0.5 mi o más de 3800 pajillas de 0.25 mi. Por lo tanto, para iniciar el paso de enfriamiento se podría esperar a obtener lotes múltiples. Alternativamente, se podrían obtener lotes múltiples prácticamente al mismo tiempo al operar en paralelo equipos múltiples de citometría de flujo multicanal (ver a continuación) y enfriar simultáneamente lotes múltiples obtenidos de ahí juntos en un congelador programable. En una materialización de la invención actual, lleva un período de menos de 220 minutos enfriar los espermatozoides de la temperatura ambiente a un estado sobreenfriado y sumergirlos en nitrógeno líquido (-196° C). En otra materialización, el período de sobreenfriamiento es inferior a 190 minutos. En otra materialización, el período de sobreenfriamiento es inferior a 150 minutos. Los técnicos de la profesión reconocerán que se pueden hacer modificaciones importantes a los métodos de ejemplo previos sin apartarse del alcance de la invención actual. Por ejemplo, los espermatozoides se pueden crioconservar en un recipiente diferente a una pajilla de inseminación artificial. Asimismo, los pasos del método que incluyen el cambio o el mantenimiento de la temperatura se pueden llevar a cabo por cualquier medio apropiado, inclusive baños María, vapores de nitrógeno líquido y congeladores programables o no programables convencionales, por ejemplo. Además, se 294 puede usar una amplia variedad de sustancias o combinaciones de sustancias como fuente proteica y/o crioprotector sin apartarse del alcance de la invención actual. Entre estas sustancias se encuentran las sustancias y las concentraciones de las sustancias indicadas anteriormente en la parte en que se tratan las soluciones amortiguadoras, los diluyentes, los crioprotectores, los líquidos envolventes y los líquidos de recolección. Es más, el orden de algunos pasos en el método se puede variar sin apartarse del alcance de esta invención. Aunque la fig. 95 indica que el crioprotector se agrega después de ajustar la concentración del esperma separado, también contempla la posibilidad de agregar un crioprotector antes de ajustar la concentración sin apartarse del alcance de la invención actual. Por ejemplo, el crioprotector se puede suministrar en el líquido de recolección o en el líquido envolvente que se utiliza con un citómetro de flujo. Algunos de los beneficios de la invención actual también se pueden obtener enfriando parcialmente los espermatozoides y agregando después el crioprotector. Asimismo, el orden en el que se agrega la fuente proteica puede variar en tanto ésta sea eficaz para proteger a los espermatozoides del choque frío cuando pasan por el intervalo de temperatura de 14 a 8o C aproximadamente.

EJEMPLO I DE CRIOCONSERVACION El semen bovino se recogió, se transportó y se evaluó como se describió anteriormente. Se colocaron dos tubos de ensayo que contenían 5 295 mi de solución amortiguadora TCA (pH 7.3) cada uno en uno de dos baños María durante al menos cinco minutos. Uno de los baños María estaba a una temperatura de 35° C y el otro a 41° C. A cada tubo se agregaron espermatozoides a 24° C de modo que la concentración final en cada tubo fue de 150 x 106 espermatozoides/ml. Los dos tubos se dividieron en dos alícuotas que se mantuvieron en los respectivos baños María. Después de que el esperma se equilibró con la solución amortiguadora TCA durante cinco minutos, se agregó solución Hoeschst 33342 80 µ? a una de las alícuotas a 35° C y a una de las alícuotas a 41° C. Después de agregar solución Hoechst 33342, las cuatro alícuotas se incubaron durante 20 minutos en sus respectivos baños María. Después de la incubación, los tubos de ensayo se sacaron de los baños María y se dejaron a temperatura ambiente (aproximadamente 25° C) durante cinco minutos. Luego los contenidos de cada tubo de ensayo se diluyeron con un diluyente TCA que contenía 20% de yema de huevo y 6% de glicerol (v/v) (pH 7.0) hasta obtener una concentración final de 20 x 106 espermatozoides/ml. Los contenidos de cada tubo de ensayo se usaron después para llenar una pajilla de inseminación artificial de 0.5 mi. Se colocó cada una de las cuatro pajillas en un congelador programable (un congelador 1810CD IceCube de Minitube de América, Wl). En el congelador programable se programó la siguiente secuencia de enfriamiento: (1) 22° C a 4° C a -0.2 °C/min; (2) se mantuvo a 4o C durante 30 min; (3) 4° C a -15° C a -3.0 °C/min; y (4) -15° C a -80° C a -10.0 °C/min. Después de alcanzar -80° C, las pajillas se sumergieron en nitrógeno líquido (- 296 196° C) durante 45 minutos. Luego las pajillas se sumergieron en un baño María a 37° C durante 50 segundos para descongelarlas. La motilidad del esperma se examinó bajo un microscopio de contraste de fase tanto antes como después de la crioconservación. Los resultados se muestran en la fig. 104. La motilidad posterior a la descongelación estuvo en general en el orden del 60%. Esto representa una disminución en la motilidad de solamente 5-11% aproximadamente, en comparación con la motilidad anterior a la crioconservación. El análisis de varianza no reveló ningún efecto significativo ni de la solución Hoechst 33342 ni de la incubación a 41° C en la motilidad de esperma posterior a la descongelación.

Funcionamiento del sistema El funcionamiento general 813 del sistema de citometría de flujo 9 se describirá ahora con referencia a la fig. 82 y en el contexto específico de espermatozoides (por ejemplo, espermatozoides bovinos), pero se comprenderá que la descripción es solamente un ejemplo y que el sistema se puede usar para procesar otros tipos de partículas. La primera serie de pasos que llevan al circuito cerrado de repetición de seis segundos implica la calibración del sistema. Después de inicializar 769, se lleva a cabo una verificación del sistema 771 para confirmar, entre otras cosas, que el procesador 131 o los procesadores están en funcionamiento. Si se detecta un error después de la falla de tres controles del sistema 775, se solicita la interacción del usuario 773. Si la verificación del 297 sistema es positiva, el microprocesador dirige el sistema para enjuagar 777 el sistema de boquilla con un líquido apropiado y luego un material de control de calidad 779, como cuentas o núcleos bovinos, se hacen pasar a través del sistema para inicializar los parámetros de detección (ver 739 en la fig. 72) y confirmar que el sistema está operando dentro de un control de calidad aceptable. Esto implica la evaluación del material de control para probar la sensibilidad y la precisión del sistema para confirmar que el sistema puede discriminar adecuadamente una muestra. Si el control de calidad no se confirma después de tres intentos 775, se solicita la intervención del usuario 773. Si el material de control de calidad indica un nivel aceptable de control de calidad, una muestra 781 es aspirada y se verifica la calidad 783 de una porción o alícuota de la muestra que se debe separar. La calidad de la muestra se puede determinar mediante el cálculo de un factor de calidad (factor-Q) de la muestra. Por ejemplo, se puede detectar el tipo de células en una primera alícuota de la muestra. Durante esta detección, los parámetros de detección inicializados (741) se vuelven a controlar y se generan los parámetros de discriminación iniciales (745). Si el tipo de células detectadas en la alícuota indica que la muestra cumple o supera una norma preestablecida (por ejemplo, que la muestra se puede discriminar para producir determinada pureza o motilidad y, en particular, que hay suficientes espermatozoides X vivos disponible para el procesamiento), entonces el sistema continúa con la operación. Si la calidad de la muestra fracasa tres 298 veces 775, se solicita la interacción del usuario. La continuación de la operación implica la separación 785 del resto de la muestra empleando un circuito cerrado de repetición de seis segundos. Al comienzo del circuito, el microprocesador confirma que la separación de la muestra no está completa 789. Si la separación de la muestra está completa 789, el microprocesador procede a aspirar la muestra siguiente 781 si está disponible o a detener la operación de separación 793 si no hay otra muestra disponible. Si no se completó la separación de la muestra 789, el microprocesador verifica ¡nicialmente la discriminación X/Y 795 de la muestra para confirmar que está dentro de un intervalo óptimo. En otras palabras, se lleva a cabo el análisis de desplazamiento como se observó anteriormente (761 en la fig. 72). Si se debe realizar algún cambio, tales cambios se implementan y se controla nuevamente la discriminación 795. Si la discriminación todavía es inaceptable a esta altura, la separación se desactiva 793 y se solicita la interacción del usuario. De lo contrario, el sistema continúa para determinar si el sistema dispensador de líquido está abasteciendo de líquido y células a una velocidad dentro un intervalo óptimo 801. Esta determinación depende del tipo de estrategia de control que se emplee. Para la estrategia de control de alta recuperación, la tasa óptima se determinaría evaluando la pureza o mediante el valor de x/x+~X de la población recogida. Si la pureza determinada supera un nivel requerido de pureza, la velocidad de alimentación de células se incrementa al aumentar una señal de control de la velocidad provista por la 299 bomba de jeringa 803. Esto tiende a aumentar las células coincídentes y a disminuir la pureza porque se recogerían más células coincidentes, incluso células ~X con las células X. Si la pureza determinada es inferior a la pureza requerida, la velocidad de alimentación de las células se reduce disminuyendo la señal de control de la velocidad provista por la bomba de jeringa para reducir la frecuencia de las células coincidentes 803. Así, la velocidad de alimentación de las células es una función de la pureza determinada de la población recogida en comparación con un nivel de pureza deseado, es decir, una función de los espermatozoides ~X identificados recogidos. Para la estrategia de control de elevada pureza, la velocidad óptima se determinaría mediante el cálculo de las células X perdidas X, es decir, células X desechadas/células X desechadas + células X recogidas. Si la cantidad o el porcentaje de las células X perdidas es inferior a un nivel aceptable, la velocidad de alimentación de las células se incrementa al aumentar la señal de control de velocidad provista a la bomba de jeringa 803. Esto tendería a aumentar las células coincidentes y a aumentar la cantidad de células X desechadas debido a que más células, incluso células X, serían desechadas con las células Y. Si la cantidad o el porcentaje de células X perdidas es superior al nivel aceptable, la velocidad de alimentación de las células se reduce al disminuir la señal de control de velocidad provista a la bomba de jeringa 803 para disminuir las células coincidentes. Por lo tanto, la velocidad de alimentación de células es una función de las células X perdidas determinadas de la población desechada en comparación con la cantidad de 300 células X en la población recogida, es decir, una función de la cantidad de espermatozoides X no recogidos. Si esta velocidad modificada es aceptable 805, el sistema efectúa otra verificación del sistema 807. Si la verificación del sistema es aceptable 807, la separación continúa en el circuito de seis segundos. Si no, el sistema se reinicia 809. Si después de reiniciado el sistema no es aceptable o si la velocidad de alimentación modificada no es aceptable 811 , se desactiva la separación 793 y se solicita la intervención del usuario 773. Las corrientes de gotitas separadas se recogen mediante el sistema de recolección 2201. Las gotitas separadas en la población de células X pasan por la ventana de salida 2245 en el primer dispositivo interceptor 2247 para ser interceptadas por el segundo dispositivo interceptor 2249. Desde allí, las gotitas que contienen células X circulan hacia un recipiente de recolección 2207. Otras gotitas son interceptadas por el primer dispositivo interceptor 2247 y dirigidas hacia el canal de desechos 2805. Se entiende que las gotitas interceptadas por el primer dispositivo interceptor también se pueden recuperar, como se indicó anteriormente. Cuando una cantidad adecuada de espermatozoides que tienen el cromosoma X se recogió en el recipiente de recolección, se puede interrumpir la separación para permitir la concentración del esperma en el recipiente de recolección 2207. Se puede colocar un nuevo recipiente de recolección debajo del primer dispositivo interceptor 2247 o el líquido recogido se puede verter en otro recipiente y volver a colocar el recipiente de recolección. Luego se puede 301 reanudar la separación. Los espermatozoides en el líquido recogido se concentran, se cargan en las pajillas y se congelan como se describió anteriormente.

Control de la temperatura durante la operación Se puede utilizar el control de la temperatura a lo largo del proceso para mejorar los resultados del mismo. Como ya se discutió antes, se puede controlar la temperatura del esperma durante varios pasos del proceso (p. ej., durante la tinción y la crioconservación). En varias materializaciones de esta invención, se controlan las temperaturas de los espermatozoides a lo largo de los diversos pasos del método para mejorar los resultados. Por ejemplo, la fig. 105 es un diagrama de flujo de trabajo de una materialización de un método de control de la temperatura según la invención actual. La temperatura de las muestras de semen en el momento en que son recogidas se determinará en función de la temperatura corporal del animal del que son tomadas. Por ejemplo, en el paso 2601 se recogen muestras de semen bovino a aproximadamente 37° C. En el paso 2603 se usa un recipiente aislante para transportar las muestras de semen al laboratorio desde el sitio de recolección. El recipiente aislante demora el enfriamiento del esperma. Durante la evaluación de la muestra en el paso 2605, la temperatura se mantiene por debajo de la temperatura de recolección, pero 302 por encima de la temperatura de transición vitrea por debajo de la cual la membrana de los espermatozoides sufre daño. Por ejemplo, la temperatura se puede mantener entre aproximadamente 18 y 37° C. En otra materialización, la temperatura se puede mantener entre aproximadamente 24 y 37° C durante la evaluación de la muestra. En una materialización en particular, los espermatozoides se colocan en un ambiente que tiene una temperatura entre aproximadamente 22 y 25° C durante la evaluación de la muestra. Dependiendo de la temperatura del esperma en el momento en que llega al laboratorio, el efecto de colocarlo en un ambiente que tiene una temperatura en el intervalo entre 22 y 25° C puede ser: continuar enfriando lentamente el esperma, mantener la temperatura del esperma o aumentar ligeramente la temperatura del mismo. En una materialización, en el paso 2607 la temperatura puede aumentarse (p. ej. a 40° C o más) para la tinción, como se discutió en la sección de tinción. En otra materialización, la temperatura de los espermatozoides durante el paso de tinción puede estar en el intervalo entre 20 y 40° C, como se analizó antes. En el paso 2609, la mezcla de semen teñida se mantiene en un baño María hasta el momento en que la mezcla se introduce en un citómetro de flujo. La temperatura del baño María puede ser semejante a la utilizada en el paso de tinción. En una materialización la temperatura del baño María se encuentra en el intervalo entre 40 y 47° C. En otra materialización la temperatura del baño María se encuentra en el intervalo entre 20 y 37° C. Aún en otra materialización la temperatura del baño María se encuentra en el 303 intervalo entre 20 y 25° C. Después de mantener los espermatozoides teñidos en el baño María entre un minuto y dos horas, se los separa por citometría de flujo como se analizó antes en el paso 2611. En el paso 2613 se concentran los espermatozoides recogidos. La concentración se puede llevar a cabo en un ambiente que tenga una temperatura que no modificará mucho la temperatura de los espermatozoides. Por ejemplo, en una materialización, la concentración se puede llevar a cabo en un ambiente que tenga una temperatura en el intervalo entre aproximadamente 20 y 25° C. En el paso 2615 al esperma concentrado se le agregan un diluyente, una fuente proteica y un crioprotector. Luego, en el paso 2617 los espermatozoides se cargan en las pajillas de inseminación artificial. En una materialización, el paso de carga se realiza en un ambiente que tiene una temperatura que no cambiará mucho la temperatura de los espermatozoides. Finalmente, en el paso 2619 la temperatura del esperma se controla durante la crioconservación como se analizó antes. En otra materialización, los espermatozoides pueden teñirse a temperaturas aún menores sin apartarse del alcance de la invención actual. Por ejemplo, puede ser deseable separar a los espermatozoides en un citómetro de flujo a una temperatura relativamente baja (p. ej. aproximadamente entre 0o C y 8o C). Esto puede requerir la modificación del control total de temperatura. Antes que nada, cuando se enfrían los espermatozoides antes de su introducción en un citómetro de flujo, en general no se deben usar yema de huevo ni otras fuentes proteicas que protegen a los 304 espermatozoides del choque frío a temperaturas inferiores a la temperatura de transición vitrea, puesto que este tipo de sustancias proteicas tienden a estropear u obstruir la fluídica del citómetro de flujo. De este modo, es aconsejable enfriar los espermatozoides antes de llevar a cabo el paso de tinción a fin de aprovechar los protectores naturales contra el choque frío del semen puro, como por ejemplo el líquido seminal. Cualquier intento de teñir los espermatozoides antes de enfriarlos requerirá el agregado de soluciones amortiguadoras para proteger al esperma, que diluirán al semen puro y reducirán la protección natural contra el choque frío. Por consiguiente, una materialización de la invención actual para separar a los espermatozoides a una temperatura entre aproximadamente 0o C y 8o C incluye la colocación de dichos espermatozoides en un ambiente con una temperatura inferior a 8o C para enfriarlos hasta una temperatura entre aproximadamente 0o C y 8o C antes de la tinción. Se puede utilizar cualquier método para enfriar a los espermatozoides, pero es deseable utilizar un método que los proteja contra sus rápidas fluctuaciones de temperatura durante el proceso de enfriamiento. Por ejemplo, en una materialización, un recipiente que contiene los espermatozoides se coloca en un baño María a temperatura ambiente, el que a su vez se coloca en un ambiente con una temperatura por debajo de aproximadamente 8o C. En otra materialización, se controla la temperatura de los espermatozoides y se agrega hielo al baño María para enfriar aún más dichas células. El paso de tinción se puede llevar a cabo como se describió antes excepto en que la mezcla de tinción se 305 somete a una temperatura entre aproximadamente 0o C y 8o C. Debido a la menor temperatura, el período de incubación requerido para teñir las células es considerablemente mayor. Una vez que los espermatozoides se han enfriado hasta 8o C o por debajo, es preferible evitar calentarlos. Así, otra materialización de la invención actual consiste en operar el citómetro de flujo en un ambiente con una temperatura en el intervalo entre 0o C y 8o C. De manera similar, otra materialización de la invención actual consiste en recoger los espermatozoides separados en un recipiente de recolección que está rodeado por un entorno con una temperatura entre aproximadamente 0o C y 8o C. Aún otra materialización de la invención actual consiste en agregar diluyentes, crioprotectores, soluciones amortiguadoras, fuentes proteicas, antibióticos, antioxidantes u otros aditivos a una temperatura entre aproximadamente 0o C y 8o C. Con respecto al agregado del crioprotector, puede ser aconsejable agregar un poco más del que se agregaría después de separar a los espermatozoides, a una temperatura en el intervalo entre 0o C y 8o C. De este modo, en una materialización en particular, se agrega un crioprotector que contiene 7 % de glicerol (v/v) a los espermatozoides después de que han sido separados, a una temperatura entre aproximadamente 0o C y 8o C. Generalmente, se produce un sobreenfriamiento de los espermatozoides en el intervalo de temperatura entre 0o C y 8o C como se describe antes en la sección de crioconservación. Sin embargo, los espermatozoides deberán mantenerse a una temperatura entre 306 aproximadamente 0o C y 8o C por un período después del agregado del crioprotector antes del sobreenfriamiento, para dar tiempo a que dichos espermatozoides se equilibren con el crioprotector. Así, de acuerdo con una materialización, se deja que los espermatozoides se equilibren con el crioprotector durante un período de aproximadamente 30 minutos a 3 horas. En otra materialización, se deja que los espermatozoides se equilibren con el crioprotector durante un período de 1 a 2 horas. En otra materialización en particular, los espermatozoides se dejan equilibrar con el crioprotector durante un período de aproximadamente 90 minutos. Se pueden usar los métodos y equipos convencionales de control de temperatura (p. ej., baños de agua, estufas de incubación, refrigeradores y congeladores) para calentar o enfriar la muestra a fin de que alcance o mantenga las temperaturas especificadas en las materializaciones precedentes de la invención. Se entiende que colocar una muestra en un ambiente con una temperatura diferente a la de la muestra, hará que la temperatura de la muestra cambie con el tiempo. Puede incluso haber variaciones de temperatura dentro de la muestra. Como se ha mencionado, es deseable cambiar la temperatura de la muestra gradualmente para ayudar a mantener la sanidad del esperma. El cambio gradual de temperatura también sirve para reducir la variación de la temperatura dentro de la muestra. Como bien saben los técnicos de la profesión, la velocidad de cambio de la temperatura de la muestra estará influida por muchos factores, incluidos el volumen de la muestra, el tamaño y la forma del recipiente que la contiene y la 307 magnitud de la diferencia de temperatura entre la muestra y el ambiente. Sin embargo, los técnicos de la profesión podrán fácilmente elegir un método y un equipo adecuados para alcanzar el control de la temperatura deseado después de considerar todos los factores relacionados. Los técnicos de la profesión reconocerán que puede haber una variación sustancial en el control de la temperatura del ejemplo sin apartarse del alcance de la invención. En general, una vez que se han enfriado los espermatozoides es aconsejable evitar calentarlos. Además, las variaciones de la temperatura que se analizaron antes en relación con la obtención de la muestra, la tinción, la separación, la obtención en forma de gotita, la concentración y la crioconservación se pueden incorporar al control general de la temperatura sin apartarse del alcance de la invención actual. Por otra parte, el tiempo durante el que los espermatozoides permanecen a cualquier temperatura también puede afectar a la sanidad del esperma. De este modo, el procesamiento según la materialización en la que la temperatura se controla a lo largo de todo el proceso se debe completar dentro de un cronograma como se discute a continuación.

Cronograma para la operación En general, es deseable completar el proceso de separación del esperma en el menor tiempo posible para reducir el daño al mismo. Como se analizó antes, la invención actual puede comprender la tinción a una temperatura elevada para reducir el tiempo necesario para teñir los 308 espermatozoides. Por ejemplo, ciertas materializaciones del método mejorado de tinción descrito, reducen el tiempo requerido para teñir a 10 minutos aproximadamente. Asimismo, el nuevo citómetro descrito antes se puede usar para separar espermatozoides en menos tiempo que el requerido con un citómetro convencional. Por ejemplo, un citómetro de flujo que use la tecnología analizada antes puede recoger entre 2000 y 10000 espermatozoides con las características de ADN deseadas por segundo. Además, el proceso de crioconservacion se puede usar para reducir el tiempo necesario para completar la crioconservacion de los espermatozoides procesados en comparación con los métodos tradicionales de crioconservacion. Por consiguiente, una materialización de la invención actual implica el procesamiento del esperma de conformidad con un método general para aprovechar una o más innovaciones que ahorran tiempo, para reducir el tiempo requerido para completar todo el proceso. Por ejemplo, según una materialización de la invención actual, se recoge un lote de espermatozoides (p. ej. una eyaculación) de un mamífero macho (p. ej. un toro), se efectúa un control de calidad, se tiñe, se separa de acuerdo con las características especificas de ADN, se carga en uno o más recipientes (p. ej. pajillas) y se crioconserva durante un período de aproximadamente 12 horas a partir de su obtención. En otra materialización, el período es inferior a 8 horas aproximadamente. En otra materialización, el período es inferior a 6 horas aproximadamente. En otra materialización, el período es inferior a 3 horas aproximadamente. Aún en otra materialización, el período es inferior a 2 309 horas aproximadamente. En otra materialización, el período es inferior a 1 hora aproximadamente.

Equipo de separación multicanal y método Para separar más esperma en menos tiempo, es posible usar más de una unidad de citometría en paralelo para separar la misma muestra de esperma. Una manera de hacer esto es sencillamente dividir los espermatozoides teñidos en alícuotas múltiples y procesar cada alícuota en un citómetro diferente. Sin embargo, según se tratará a continuación, se pueden obtener ciertas ventajas al diseñar un equipo que consta de varias unidades de citometría en una única unidad de citometría multicanal integrada.

Sistema multicanal que comparte una plataforma integrada Las figs. 106-116 muestran una materialización de la invención que comprende un sistema de citometría multicanal, designado en general 1001 , en el que múltiples unidades de citometría de flujo monocanal, designadas 1003, están agrupadas formando un sistema integrado para dar el producto separado. En esta materialización en particular se ilustran cuatro de tales unidades, pero el número puede variar. Las unidades pueden integrarse de diversas maneras, por ejemplo compartiendo una plataforma integrada que comprende uno o más de los siguientes elementos (1) un suministro común de partículas 1005; (2) una fuente común de radiación electromagnética 1007; 310 (3) una cubierta común 1009; (4) una entrada común para la operación de control de las unidades 1011; (5) una salida común 1019 que permite la evaluación de la operación de una unidad en relación con otra unidad; (6) un sistema dispensador de líquido común 1021; (7) un sistema común de control de temperatura 1023; (7) una fuente común de energía 1025; (8) un sistema común de recuperación de desechos 1027; (9) un sistema común de placa deflectora 1029; y (9) un sistema común de limpieza 1031. En una materialización, el sistema incluye todos estos elementos, pero se entenderá que un sistema multicanal de esta invención puede incluir cualquier combinación de elementos. El uso de elementos comunes es beneficioso porque le permite al sistema ser operado de manera más eficiente y redituable, logra resultados más uniformes entre los canales al reducir el número de variables, facilita cualquier localización de problemas que pueda ser necesaria y es económico. El enfoque multicanal también hace al sistema de separación más susceptible de ampliar o reducir a escala. Cada una de las unidades de citometría 1003 tiene componentes similares a ciertos componentes del equipo de citometría de flujo 9 de la materialización anterior y, por conveniencia, las correspondientes partes se designan con los mismos números de referencia con el agregado de un número primo ('). En general, cada unidad comprende un sistema de boquilla 101', un soporte para montar el sistema de boquilla 331', un transductor 105',y un instrumento óptico de epiluminación 417' para centrar el haz de luz 25' en la corriente de líquido 21' que sale por el orificio de la boquilla 03", todo como 311 se describió previamente. Cada unidad consta además de un fotodetector 117' que se puede operar como en la primera materialización para detectar las emisiones de fluorescencia 3G de las partículas en la corriente 21' y convertir las emisiones 31' en señales eléctricas 701' que se procesan para clasificar las partículas por una característica específica de ADN. Cada unidad 1003 está también equipada para separar las gotitas 33' en diferentes grupos o poblaciones 123', 125' según la clasificación de las partículas contenidas en las gotitas 35'. Las poblaciones de gotitas separadas por las unidades son recogidas por el sistema de recolección 2201.

A. Cubierta común y disposición en módulos Las unidades de citometría de flujo están montadas en una disposición modular en una cubierta común 1009. En la materialización que se muestra en las fig. 106 y 109-1 3, la cubierta tiene una base 1069 y dos paredes laterales 1071 que se extienden hacia arriba desde la base. Las paredes laterales tienen un par de salientes 1073 para sostener un panel de la cubierta Inferior 1075 del frente de la cubierta 1077 y un par de salientes superiores 1081. Un panel de la cubierta inferior 1075 en el frente de la cubierta 1077 está montado entre las salientes inferiores 1073. Las salientes superiores 1081 sostienen un panel de la cubierta superior 1083 en la parte posterior de la cubierta 1085. Las partes delantera y trasera de la cubierta 1077, 1085 están prácticamente abiertas para permitir el acceso al equipo que está en su interior. Se comprenderá que la cubierta 1009 puede tener otras 312 configuraciones sin apartarse del alcance de la invención. Aún más, se entenderá que las diversas unidades pueden estar instaladas en cubiertas separadas. Las unidades de citometría de flujo 1003 están montadas una al lado de la otra como módulos en un marco apropiado 1087 en la cubierta 1009. Específicamente, los soportes de la boquilla 331' para colocar las boquillas 10 están unidos libremente a una barra en forma de cruz 1089 (Fig. 106) fijados a las paredes laterales 1071 de la cubierta y las bases 429' de los instrumentos de epiluminación 417' están sujetas libremente a una placa de montaje en ángulo 1093 que se extiende entre las paredes laterales 071 de la cubierta hacia la parte trasera de ésta 1085 (Fig. 109), esta disposición es tal que una unidad particular puede ser instalada o retirada como un módulo. Esta disposición en módulos facilita la instalación, el retiro para mantenimiento y/o reemplazo, y permite agregar fácilmente cualquier cantidad de unidades de citometría de flujo 1003 según sea necesario para aumentar la capacidad de producción del sistema.

B. Sistema de suministro y sistema dispensador de líquido comunes El sistema dispensador de líquido 1021 de esta materialización está equipado para proporcionar líquidos apropiados a cada una de las unidades de citometría 1003. Como se ilustra esquemáticamente en la fig. 108, generalmente el sistema consta de una bomba 1105 para transferir el 313 líquido de transporte 17' a presión desde un suministro común del líquido de transporte 1107, un sistema de gas a presión 1 15 para transferir el líquido a presión desde un suministro común 1117 del líquido envolvente 19' y un sistema de distribución 1121 para recibir los líquidos desde los respectivos suministros y dispensar los líquidos a presión a las diversas unidades de citometría 1003, según sea necesario. En la materialización específica de la fig. 116, el suministro del líquido de transporte comprende un recipiente 123 que contiene un volumen adecuado de dicho líquido (por ejemplo, 5 mi.). El recipiente se sostiene mediante un soporte 1125, que puede ser un bloque 1133 que tiene una cavidad 1135 clasificado por tamaño para recibir el recipiente 1123. El bloque también tiene una segunda cavidad 1137 para sostener un recipiente 1139 que contiene una solución amortiguadora adecuada para el acondicionamiento del sistema durante el uso, como se describirá más adelante. Es aconsejable (pero no imprescindible) que la bomba 1105 para dispensar el líquido de transporte del recipiente sea una bomba de jeringa 1141 como la que se describió antes. El émbolo de la bomba se puede desplazar por el recorrido de admisión para aspirar el volumen elegido de líquido de transporte 17' del recipiente 1139 y por el recorrido de descarga para dispensar el líquido de transporte a través de una línea de suministro 1147 al distribuidor 1177 y de allí a las diversas boquillas 101' del sistema. La bomba de jeringa también se puede operar para aspirar líquido del recipiente 1139 que contiene solución amortiguadora y bombear ésta a través del 314 sistema de una manera que se describirá. Una válvula de tres vías 1149 controla el flujo de líquido de transporte y de solución amortiguadora desde y hacia la bomba 1141. La bomba es accionada por un motor de velocidad variable controlada por el procesador 131'. A modo de ejemplo, la bomba puede ser accionada por un motor paso a paso que funciona a velocidades selectivamente variables para bombear el líquido de transporte al sistema distribuidor 1121 a las velocidades necesarias para obtener la producción deseada de las unidades 1003. Se pueden usar bombas de jeringa múltiples u otros tipos de dispositivos dispensadores de líquido en vez de una única bomba de jeringa. En una materialización el suministro 1117 del líquido envolvente comprende un recipiente 1155, es decir, un tanque conectado al distribuidor 1177 por medio de una línea de suministro 157. El sistema de gas a presión 1115 se puede operar para presurizar el tanque y comprende una fuente de gas presurizado 1161 (por ejemplo, aire o nitrógeno) que comunica con el tanque mediante una línea de gas 1163 que tiene incorporado un regulador 1 165 para controlar la presión provista al tanque y una válvula de dos vías 1 167 que, en una primera posición, establece comunicación entre el tanque y la fuente de gas, y en una segunda posición, se puede operar para ventilar el tanque. El regulador de la presión del gas 1165 es un regulador convencional ajustable para controlar la presión provista desde la fuente de aire. El sistema de gas a presión 1115 también incluye una línea de gas 1169 para presurizar un abastecimiento 1173 de la solución de limpieza (por ejemplo, agua 315 desionizada de un tanque) que puede usarse para enjuagar el sistema de circuitos de líquido de una manera que se describirá de aquí en más. El flujo a través de la línea de gas es controlado por una válvula de dos vías 1167 que se puede operar de la misma manera que la válvula 1167. En una materialización, el distribuidor 1 177 comprende un bloque laminado 1179 (Fig. 112) de un material en el que se forman conductos 1 181 para delimitar un circuito de flujo de líquido 1 185 como el que se muestra en forma de diagrama en la fig. 1 0. (Los conductos se pueden formar labrando ranuras en las caras de las láminas antes de ensamblarlas para formar el bloque.) El circuito de líquido incluye entradas 1189, 1191 conectadas a la bomba de jeringa 1141 y al suministro 1 7 del líquido envolvente y conjuntos de salidas 1 193, para proveer dichos líquidos a las unidades de citometría de flujo 1003, cada uno de tales conjuntos incluye una salida de líquido de transporte y una salida de líquido envolvente. El flujo a través de los diversos conductos de flujo 1181 es controlado por válvulas V1-V6 que, en una materialización, son válvulas accionadas por solenoide en alojamientos unidos al bloque del distribuidor 1179. Es preferible que el bloque sea de material prácticamente transparente (por ejemplo, plástico acrílico) para facilitar el monitoreo del sistema 1121 y la localización de problemas. En la materialización que se muestra, el distribuidor 1177 está sujeto a una pieza del marco 1203 y se extiende entre las paredes laterales 1071 de la cubierta 1009 adyacente al fondo de la cubierta debajo de los sistemas de boquilla 101'. Las entradas y las salidas 1193, del distribuidor 316 1177 puede tener conexiones 205 roscadas en el bloque, como la tuerca sin pestaña y accesorios de casquillos de Upchurch Scientific, una división de Scivex. Se entenderá que el diseño y la construcción del circuito de líquido 1185 en general y del distribuidor 1 177 en particular, pueden variar sin apartarse del alcance de la invención actual. Haciendo referencia a la fig. 116, el circuito de distribución de líquido 1185 para el líquido de transporte 17' incluye un depósito de muestra 1207 para mantener un suministro limitado del líquido de transporte(por ejemplo, 1.0 mi). Si el líquido de transporte contiene espermatozoides, por ejemplo, disponer de un depósito de este tipo cerca de las boquillas 01' es beneficioso para la viabilidad y la motilidad de los espermatozoides, ya que el almacenamiento de tales células, aun durante períodos cortos, en espacios pequeños puede perjudicar la motilidad. El flujo del líquido de transporte desde el depósito de muestra 1207 a las boquillas 101' es controlado por una serie de válvulas de dos vías V1A-V D, una para cada boquilla. Cada una de las válvulas V1A-V1 D tiene una primera posición que establece la comunicación de líquido entre la aguja 1217 del depósito de muestra y la aguja 157' de la boquilla respectiva para la dispensación del líquido de transporte 17' a la aguja sometida a la presión generada por la bomba de jeringa 1141 y una segunda posición que establece comunicación de líquido entre la aguja 1217 y un sistema de desechos, generalmente designado 1221 , que es común a todas las unidades de citometría de flujo 1003. En la materialización que se muestra, el sistema de desechos 1221 comprende un 317 tanque de desechos 1223 para mantener material de desecho, un mecanismo 1225 como una bomba de vacío para generar un vacío en el tanque de desechos, y líneas de desecho 1227 que conectan las válvulas V1A-V D y el tanque de desechos. Se provee una válvula V3 en la corriente arriba de la línea de desechos del tanque de desechos para la apertura y cierre de la línea de desechos, según sea necesario. Se provee un filtro hidrófobo apropiado 1233 en la línea que conecta el tanque de desechos 1223 y la bomba de vacío 1225. El circuito distribuidor de líquido 1 185 para el líquido envolvente 19' incluye una pluralidad de válvulas V2A-V2D. Cada válvula tiene una primera posición que establece comunicación de líquido con el suministro 17 del líquido envolvente del tanque para dispensar el líquido envolvente 19' a un cuerpo de flujo respectivo 133' a través de una línea de suministro de líquido envolvente 1241 , y una segunda posición que establece comunicación de líquido entre el cuerpo de flujo y el tanque de desechos mediante una línea de desechos 1247. La presión a la cual el líquido envolvente se dispensa a los cuerpos de flujo 133' dependerá de la presión del tanque de líquido envolvente (controlado por el regulador 1165) que puede variar de 1 a 100 psi (0.0703 a 7.03 kg/cm2), mejor si es de 10 a 50 psi (0.703 a 3.515 kg/cm2), mejor aún si es de 15 a 40 psi (1.0545 a 2.812 kg/cm2) y todavía mejor aún si es de aproximadamente 20 a 30 psi (1.406 a 2.109 kg/cm2). Aunque el uso de un suministro común para todas las unidades tiene diversas ventajas, se considera que al menos algunas de las unidades 318 de citometría de flujo podrían abastecerse con material de muestra de fuentes independientes.

C. Fuente de energía y controles de entrada y salida comunes Las unidades de citometría de flujo 003 también comparten una fuente común de energía 1025, sistemas comunes de suministro de energía, una entrada común (GUI) 715' para el control del funcionamiento de los canales por el microprocesador 131' y una salida común provista al microprocesador que permite evaluar el funcionamiento de un canal en relación con el de otro canal. Por ejemplo, la salida común incluye proporcionar las señales digitalizadas de cada sistema de epiluminación al microprocesador para indicar la intensidad de fluorescencia medida por cada canal, para indicar la velocidad a la cual cada canal está separando las partículas, para indicar las variaciones de tinción (que puede ser indicado por la diferencia de intensidad de los pulsos de fluorescencia de las células X e Y) y para indicar los límites de la decisión 763 usados por cada canal para discriminar entre partículas. Como otro ejemplo, la salida común incluye proporcionar las señales de salida de los sensores de división 389' al microprocesador para indicar el sitio de división de la gotita 107' de cada canal. 319 D. Control común de temperatura Opcionalmente, se provee un sistema de control de temperatura, en general designado 1257, para regular la temperatura de los contenidos de los recipientes 1 23 en el bloque de soporte 1133 y la temperatura del distribuidor 1177. Dicho control de temperatura reduce la variabilidad del sistema, proporcionando así mediciones más uniformes entre los canales y, para ciertos tipos de células (por ejemplo, espermatozoides), ayudando a mantener su viabilidad. En una materialización, el sistema de control de temperatura 1257 comprende un circuito de flujo de líquido 1259 que consta de conductos para líquido 1263 en el bloque de soporte 1133 y conductos para líquido 1269 en el bloque del distribuidor 1179 y una unidad de control 1265 para hacer circular un líquido térmico (por ejemplo, agua) por el circuito a una temperatura seleccionada. Es aconsejable que la temperatura sea tal que mantenga el líquido, especialmente el líquido de transporte, a una temperatura óptima para maximizar la viabilidad de las células y, si se trata de espermatozoides, la motilidad de los mismos. Se coloca una válvula de cierre V6 en el circuito para controlar el flujo por el circuito. La unidad de control de la temperatura se puede usar para mantener los espermatozoides a la temperatura deseada antes de separarlos como se trató anteriormente. Todas las válvulas del sistema dispensador de líquido 1021 son accionadas por medios convencionales, como solenoides, bajo el control de un operador o de una programación adecuada. Es deseable que las diversas 320 líneas de flujo de líquido que conectan los componentes del sistema fuera del bloque del distribuidor 1179 sean de tubería plástica prácticamente transparente para poder observar cualquier bloqueo. Por ejemplo, la tubería puede ser de 0.0625 pulg. (0.158cm) de diámetro externo de polímero de FEP (etilenpropileno fluorado). Es aconsejable que las líneas de flujo del sistema de control de temperatura 1257 sean algo más grandes (por ejemplo, 0.125 pulg. (0.317cm) de diámetro externo) para proporcionar mayor capacidad de flujo.

E. Haz de luz y sistema de división del haz de luz comunes Según se observó previamente, el sistema multicanal comparte una fuente común de radiación electromagnética o haz de luz 1007. A modo de ejemplo (y no de manera excluyente), la fuente puede ser un haz de luz láser de un láser con emisión multilínea en el ultravioleta principalmente a longitudes de onda de 351.1 nm y 363.8 nm. Alternativamente, puede ser deseable usar un láser de pulsos (por ejemplo, un láser de modo cerrado), en particular para sincronizar el muestreo digital con un láser de pulsos (como se trató en la sección láser de pulso) para aumentar la potencia efectiva suministrada a cada unidad de citometría, aumentando de ese modo el número de unidades de citometría que pueden operarse con un único láser. La potencia necesaria para generar el haz de luz láser variará según los requisitos de cada unidad de citometría de flujo y del número de unidades. Por ejemplo, si hay N unidades y cada unidad necesita un haz de 321 luz que tenga una potencia efectiva de W vatios, entonces será necesario generar un haz de luz que tenga una potencia de (W x N) + L, donde L equivale a la pérdida de potencia del sistema entre los elementos ópticos de éste. El uso de un único láser para abastecer a todas las unidades de citometría de flujo es económico en comparación con un sistema que usa múltiples láser. También es eficaz y proporciona mediciones más uniformes de un canal al siguiente, porque no hay ninguna variabilidad debida a diferentes características del haz de luz (por ejemplo, intensidad del haz de luz, polaridad de la luz, divergencia del haz) o ruido eléctrico resultante del uso de múltiples láser. Según una materialización de la invención actual, un sistema de división y orientación del haz se usa para dividir un único haz de luz láser en tres o más haces independientes. Como se muestra en la fig. 1 7, por ejemplo, un divisor del haz 50/50 1270 (es decir, un divisor del haz que se puede operar para dividir un único haz en dos haces independientes que tengan aproximadamente la misma intensidad) se puede usar para dividir un único haz 25' en dos haces 1270A, 1270B. Al usar un segundo divisor del haz 50/50 1271 para dividir uno de los dos haces 1270B en dos haces adicionales 271 A, 1271B, se puede generar un total de tres haces 1270A, 1271 A, 1271 B de un único haz 25'. Cada haz puede dirigirse al sistema óptico de un citómetro de flujo, por ejemplo un sistema óptico de epiluminación 415' como se muestra en la fig. 117. También se podrían usar más divisores del haz 50/50 para dividir el único haz de luz láser en cualquier cantidad de haces 322 separados independientes. Según se muestra esquemáticamente en la fig. 118, se puede agregar, por ejemplo, un tercer divisor del haz 1272 al sistema de división del haz de tres vías (Fig. 117) de modo que los tres divisores del haz 50/50 1270, 1271 , 1272 se puedan usar para dividir un único haz 25' en cuatro haces independientes 271 A, 1271 B, 1272A, 1272B. De esto se puede apreciar fácilmente que el haz único puede dividirse en cualquier cantidad de haces independientes. Se pueden utilizar otras disposiciones divisoras del haz para dividir el haz entrante de la fuente en múltiples haces de luz para las diversas unidades. Una materialización aconsejable de un sistema de división del haz se muestra en las figs. 106 y 109. Se proporciona un sistema de orientación del haz 1273 para guiar al haz común 1007 a los instrumentos ópticos 417' de las diversas unidades de citometría de flujo 1003. En la materialización ilustrada en las figs. 106 y 111 , el sistema de orientación 1273 incluye un conjunto de espejo inferior 1279 montado en una pared lateral 1071 de la cubierta 009, un conjunto de espejo superior 1281 montado en la pared lateral 1071 encima del conjunto del espejo inferior y una serie de filtros reflectores 1283, uno asociado a cada instrumento de óptica 417'. El conjunto del espejo inferior se puede operar para reflejar un haz 007 de una fuente apropiada ascendentemente hacia el conjunto del espejo superior, y el conjunto del espejo superior se puede operar para reflejar el haz a través de una abertura en la pared lateral 1071 hacia los filtros reflectores 431' de los diversos instrumentos 417'. 323 En una materialización, el conjunto del espejo inferior incluye una base 1285 sujeta a la pared lateral 1071 de la cubierta 1009, una plataforma 1289 que se desplaza verticalmente sobre la base mediante un mecanismo adecuado 1291, como un micrómetro, una placa basculante 1293 en la plataforma (por ejemplo, una montura óptica cinemática modelo P100-P de Newport) y un espejo 1295 sobre la placa, la posición del espejo se puede regular moviendo la plataforma y la placa del espejo a las posiciones apropiadas. El conjunto del espejo superior es similar al conjunto del espejo inferior, comprende una base 1297, una plataforma que se puede desplazar verticalmente 1299, una placa basculante en la plataforma 1301, y un espejo 1303 sobre la placa. Un par de placas del objetivo 1309 se fijan a la pared lateral de la cubierta 1009 entre los conjuntos del espejo superior e inferior. Las placas del objetivo 1309 alinearon verticalmente los orificios 1311 allí para facilitar el ajuste de los espejos superior e inferior de modo que un haz entrante 1007 sea reflejado con exactitud hacia los filtros reflectores 431' de los instrumentos 417', cuyos filtros están todos alineados con el haz entrante. Cada uno de los tres primeros filtros reflectores 1315, 1317, 319 funciona como un divisor del haz, es decir, funciona para reflejar un porcentaje específico del haz y para pasar el porcentaje restante. Por ejemplo, en el caso de los cuatro instrumentos de epiluminación, cada uno de los filtros reflectores 431' de los tres primeros instrumentos refleja un porcentaje de la luz láser 1007, para que cada una de las tres primeras unidades de la serie reciba 25% de la radiación electromagnética del haz 324 original 1007. Por ejemplo, los filtros reflectores de la primera, segunda y tercera unidades pueden reflejar un 25 %, un 33 % y un 50 % de la luz incidente, respectivamente. Es aconsejable que el último filtro reflector 1321 de la serie refleje toda la luz restante (aproximadamente 25% del haz original) al último instrumento de la serie. Como resultado, cada uno de los cuatro instrumentos debe recibir la misma intensidad de radiación (luz) para interrogar las células en las corrientes respectivas. Dependiendo de los dispositivos de división del haz usados en el sistema anterior 1273, puede ser aconsejable que el haz láser tenga una determinada polarización. La relación transmitancia a reflectancia de los filtros dieléctricos puede variar dependiendo de la polarización de la luz. Aún más, cuando se trata con luz linealmente polarizada, los filtros dieléctricos (que se fabrican para usar a un ángulo específico de incidencia) pueden ser demasiado sensibles a las variaciones en el ángulo de incidencia. La luz polarizada circular o elípticamente soluciona este problema hasta cierto punto porque el vector de polarización de la luz está en una diversidad de orientaciones diferentes con respecto a los ejes ópticos de un filtro dieléctrico cuando la luz interactúa con el filtro. Por lo tanto, la luz polarizada elípticamente o circularmente simula la luz polarizada aleatoriamente, que es más tolerante a las variaciones en el ángulo de incidencia en un filtro dieléctrico. En consecuencia, si el láser descrito anteriormente genera un haz de luz que tiene una polarización vertical, por ejemplo, puede ser ventajoso convertir la luz en luz polarizada circularmente antes de dividirla. Como 325 comprenderán los técnicos de la profesión, esto puede llevarse a cabo pasando el haz través de una placa de retardo de 1/4-onda (filtro) de material polarizante que tiene sus ejes ópticos rotados 45 grados en relación con el plano de polarización del láser. El haz transmitido por la lámina de onda tendrá polarización aproximadamente circular y puede ser más fácilmente dividida para proporcionar haces múltiples a los sistemas ópticos de las unidades de citometría de flujo respectivas. Es más, al hacer rotar la placa de retardo de ondas para alterar el ángulo entre la polarización del láser y los ejes ópticos del material usado para hacer la lámina de onda, se puede introducir excentricidad en la polarización aproximadamente circular del haz (es decir, la polarización se puede hacer más elíptica). Cambiando la excentricidad de la polarización elíptica del haz se puede cambiar la relación transmitancia a reflectancia de los filtros dieléctricos al hacer que el vector de polarización para un mayor porcentaje de luz tenga un ángulo particular con respecto al eje óptico del filtro dieléctrico. En consecuencia, si el equilibrio de luz entre las múltiples unidades de citometría está fuera del intervalo deseado, se puede hacer rotar la lámina de onda para aumentar o reducir la excentricidad de la luz elípticamente polarizada, alterando de ese modo las relaciones transmitancia a reflectancia de los diversos filtros hasta que se logre un mejor equilibrio. De igual manera, si la lámina de onda está transmitiendo luz polarizada elípticamente, se puede influir la relación transmitancia a reflectancia de uno de los filtros al rotar ese filtro. 326 Independientemente del método usado para dividir el único haz en múltiples haces independientes. Se puede lograr el equilibrio de la energía entregada a cada unidad de citometría bloqueando selectivamente un porcentaje de la luz para reducir a todas las unidades de citometría al mismo nivel de energía. Por ejemplo, se puede seleccionar el filtro de densidad neutral 447' de cada sistema de epiluminación 415' para bloquear más o menos luz de modo de equilibrar la energía de iluminación entregada por el divisor del haz y el sistema de orientación a cada unidad de citometría. Si un canal de una unidad multicanal recibe significativamente más iluminación del sistema de división y orientación del haz, se puede usar un filtro de densidad neutral 467' que transmita menos luz en el sistema de epiluminación 415' de ese canal para llevar la energía de iluminación de ese canal más en línea con los otros canales. Es aconsejable, aunque no esencial, que las variaciones en la energía de iluminación canal a canal sea inferior a 10 % aproximadamente. Es aún más aconsejable que las variaciones canal a canal sean inferiores al 5%, aproximadamente. También se apreciará que la exploración con láser de pulsos, como se describió anteriormente, puede ser aconsejable para la citometría de flujo multicanal. Por ejemplo, se puede reemplazar el láser con emisión multilínea en el UV por un láser de pulsos de modo cerrado que opere a aproximadamente 85 MHz para permitir a más canales de citometría de flujo ser accionados por un único láser. Por ejemplo, la máxima energía proporcionada en cada pulso de un láser de modo cerrado que emite pulsos 327 con un ancho (duración) de cerca de 12 pico segundos a una frecuencia de aproximadamente 85 MHz es aproximadamente 800 veces la energía promedio de salida del láser. Por lo tanto, un láser de modo cerrado (por ejemplo, un Vanguard 350 de Spectra-Physics) puede proporcionar suficiente energía de iluminación para operar unas pocas docenas de unidades de citometría (por ejemplo, 32 unidades de citometría) mientras opere sólo a 350 milivatios, aproximadamente. También se considera el uso de los sistemas de fibra óptica para proveer de luz a las unidades. En esta materialización, se usan las fibras para dirigir la luz del láser a las respectivas unidades, eliminando así la necesidad de contar con el sistema de orientación descrito anteriormente.

F. Placas deflectoras comunes En la materialización que se muestra en las fig. 106 y 108-116, el sistema de separación 119' de cada unidad de citometría de flujo 1003 es prácticamente idéntico al sistema de separación 19 descrito en la primera materialización, excepto en que las unidades comparten preferentemente dos placas deflectoras comunes 1331 que se extienden a través del ancho de la cubierta 1009 en el frente de la misma. Utilizar un conjunto común de placas deflectoras tiene sus ventajas, entre ellas una carga uniforme de un canal al siguiente, el uso de una fuente común de energía, un área de placa mayor que proporciona un campo eléctrico más estable y una deflexión de gotitas más uniforme y un ángulo de deflexión más constante para la recolección de 328 las muestras separadas. Las placas deflectoras 1331 están montadas en un marco 1333 sujeto a la cubierta 1009. Alternativamente, se podría proveer de placas independientes a cada unidad.

G. Sistema común de recolección En la materialización que se muestra en las fig. 107 y 116, un sistema común de recolección 2801 incluye dos dispositivos interceptores para cada unidad de citometría como se describió anteriormente conectados con el sistema de recolección 2201 para la unidad única. Sin embargo, se provee un marco común 2803 para sostener a los ocho dispositivos interceptores. Incluso, uno de los dos dispositivos interceptores para cada unidad de citometría dirige el líquido a un canal común de desechos 2805 en lugar de a un recipiente de recolección. El canal de desechos facilita el desecho de las gotitas separadas que contienen partículas de escaso valor (por ejemplo, espermatozoides que tienen el cromosoma Y para la cría de vacas lecheras). Si es aconsejable retener todas las gotitas separadas, se puede quitar el canal de desechos y colocar recipientes de recolección debajo de cada dispositivo interceptor. Los cuatro recipientes de recolección de la materialización que se muestra en la fig. 107 descansan en las aperturas de la superficie de una bandeja de recolección 2807. Se puede proporcionar un baño María común (no se muestra) bajo la superficie de la bandeja de recolección para controlar la temperatura del contenido de los recipientes de recolección. 329 H. Control multicanal Las diversas unidades de citometría de flujo son controladas por el microprocesador 131', (u otro sistema adecuado de procesamiento) que es deseable que tenga una entrada y una salida comunes como se trató anteriormente. Es aconsejable, que los parámetros operativos de cada unidad de citometría de flujo 1003 se puedan fijar independientemente de las otras unidades para que tales parámetros puedan variarse como entre unidades. Estos parámetros pueden incluir, por ejemplo, la frecuencia de formación de gotitas, las estrategias de control y separación utilizadas por una unidad particular, los criterios usados por cada unidad para clasificar y separar las partículas en el líquido suministrado a la unidad y otros parámetros. Por ejemplo, en ciertas situaciones puede ser deseable proveer a una o más unidades con líquido de transporte 17' a una primera velocidad de flujo y a otras unidades a una segunda (diferente) velocidad de flujo. De manera semejante, puede ser aconsejable usar una estrategia de separación de control (por ejemplo, una estrategia "de alta eficacia") para una o más unidades mientras que se usa una diferente estrategia (por ejemplo, una estrategia de "pérdida baja") para otras unidades. Mediante la variación controlada de estos parámetros entre las unidades, basada en los antecedentes y los datos recopilados en tiempo real, se puede administrar la producción de las unidades y los resultados del sistema optimizado. La capacidad de funcionar independientemente también permite operar a 330 unidades seleccionadas, en el caso de que no se necesiten o no estén disponibles todas las unidades.

I. Funcionamiento del sistema multicanal El funcionamiento del sistema multicanal de esta materialización es similar al descrito anteriormente, excepto en que las múltiples unidades de citometría de flujo se adaptan para realizar operaciones de citometría de flujo en paralelo (es decir, durante el mismo período o períodos superpuestos) para una mayor producción. Antes del comienzo de un proceso, el sistema dispensador de líquido 1021 se enjuaga, si fuera necesario, con solución de limpieza del tanque 1173 moviendo la válvula V5 a su posición de limpieza. El sistema se acondiciona a continuación con solución amortiguadora usando la bomba de jeringa 1141. Durante este procedimiento, las válvulas V1A-V1 D y V2A-V2D se mueven para establecer comunicación con el receptáculo de desechos 1223 que está al vacío. Como resultado, la solución de limpieza y/o la solución amortiguadora fluyen a través del sistema hacia los desechos. Este proceso limpia el sistema 1021, ceba la bomba de jeringa 1 41 y extrae las burbujas de aire del sistema. Con la válvula de tres vías 1149 adecuadamente colocada, la bomba de jeringa 1141 se desplaza por un recorrido de admisión para aspirar una cantidad de líquido de transporte 17' que contiene partículas, por ejemplo, espermatozoides, después de lo cual la válvula 1149 se mueve para 331 establecer comunicación con el distribuidor 1177 y la bomba de jeringa se desplaza por un recorrido de descarga para bombear un volumen de líquido de transporte al depósito 1207 para llenarlo. La temperatura del líquido de transporte 17' es controlada por el sistema de control de temperatura 1257 para mantener las células del líquido de transporte a la temperatura deseada. Con las válvulas V1A-V1D en la posición que establece comunicación con el depósito de muestra 1207, un nuevo accionamiento de la bomba de jeringa 1141 fuerza al líquido de transporte, a través de las líneas, a las agujas de los respectivos conjuntos de boquillas para que fluya a través de las boquillas 101', como se describió anteriormente. Al mismo tiempo, y con las válvulas V2A-V2D en la posición que establece comunicación con el tanque del líquido envolvente 1 55, el líquido envolvente 19' es forzado a través de las líneas de suministro a los cuerpos de flujo respectivos y a través de las boquillas, también como se describió anteriormente. Este proceso continúa durante un período adecuado y suficiente para bombear un volumen apropiado de líquido a través del sistema 1001. La duración de un proceso particular variará según la cantidad de líquido de transporte del recipiente de suministro, la velocidad a la cual el líquido de transporte se bombea a través del sistema, y el número de canales del sistema. Por ejemplo, un proceso puede continuar sólo durante un período limitado (por ejemplo, 15 minutos durante los cuales se dispensa un mi de líquido de transporte a cada boquilla) o puede continuar indefinidamente, con el suministro de líquido renovándose según sea necesario. 332 Cuando una aguja 157' se obstruye, la válvula apropiada V1 se mueve para establecer comunicación con el receptáculo de desechos 1223. El líquido envolvente 19' que se introduce en el cuerpo de flujo 133' fluirá luego forzado por el vacío 1225 nuevamente a través de la aguja 157' a los desechos, enjuagando y limpiando de este modo a la aguja. Si hay necesidad de cerrar el flujo a una boquilla en particular, sencillamente se cambian las válvulas V1 y V2 a sus posiciones de desecho. Aunque el sistema descrito aquí en lo que se refiere a las configuraciones tanto monocanal como multicanal se ha descrito con respecto a la separación de partículas, como la separación de células X e Y, se contempla que dichas partículas incluyan cualquier partícula que tenga características diferentes que pueden arbitrariamente indicarse como característica A y característica B. Aún más, se comprenderá que en algunas materializaciones, la función de separación se puede eliminar por completo, para que el equipo de citometría de flujo (monocanal o multicanal) opere sólo clasificando las partículas y no separándolas. Si bien el sistema multicanal se describe antes en el contexto de la operación de las unidades de citometría de flujo en paralelo, se comprenderá que las unidades también podrían operarse en serie. Por ejemplo, se contempla que las partículas de una corriente podrían ser separadas por una unidad en múltiples poblaciones, y que una o más de las poblaciones separadas podría luego pasar a través de una o más de las otras unidades en serie para llevar a cabo operaciones adicionales de separación 333 con el fin de separar partículas diferentes, usando la misma estrategia de separación o una diferente.

J. Materialización multicanal vertical Las figs. 119 y 120 muestran otro ejemplo de sistema de citometría de flujo multicanal. Este sistema que se designa en general 4001 consta de cuatro unidades de citometría de flujo 4009 agrupadas. El sistema de boquilla 101', el sistema óptico de epiluminación 450', las placas deflectoras 629', la estación de muestra 4051 , el mecanismo de prevención de contaminación 4031 y otros componentes de cada unidad 4009 están montados en una tabla de montaje vertical compartida=40 1. Con referencia a la fig. 120, un único láser 4013 y un sistema de división y orientación del haz 4015, que es sustancialmente similar al sistema de división y orientación del haz 1273 descrito anteriormente, proporciona iluminación para cada sistema de epiluminación 450'. El láser 4013 pasa a través de un orificio 4019 (Fig. 119) en una cubierta común 4021 que contiene el sistema de división y orientación del haz 4115. El sistema de división y orientación del haz 4115=y el sistema de epiluminación 450' están en un lado de la tabla 4011. El conjunto de la lente de enfoque 491' de cada sistema de epiluminación 450' se extiende a través de la tabla 4011 hasta el otro lado (similarmente a la configuración mostrada en el sistema monocanal mostrado (Figs. 26 y 27), en el que están montados los restantes=componentes de las unidades 4009. Las unidades 4009 están todas orientadas de modo que sus 334 sistemas de boquilla 101' dirijan las corrientes de líquido 21' corriente abajo. Cada unidad 4009 también tiene un sistema de recolección 4031 , que incluye un recipiente de recolección 4033 para recoger gotitas 33 que contienen una población deseada de partículas y un recipientes de desechos=4035 para recoger otras gotitas 33. Se puede usar un baño María (no se muestra) u otro control de temperatura para controlar la temperatura recipiente de recolección 4033.

Repercusión del procesamiento multicanal en el proceso general El proceso general descrito anteriormente se puede llevar a cabo con separación multicanal de esperma para disminuir el tiempo requerido para separar los espermatozoides. Con pocas excepciones, el método no cambia. Un cambio menor es que los espermatozoides separados se recogerán en múltiples recipientes de recolección. Si se desea, el contenido de los múltiples recipientes de recolección se puede combinar para su concentración. Alternativamente, el contenido de cada recipiente de recolección se puede concentrar por separado. Se apreciará que el tiempo necesario para separar un lote de espermatozoides (por ejemplo, una eyaculación) desde la recolección hasta que se completa el paso de crioconservación, se puede reducir significativamente usando múltiples unidades de citometría para procesar el lote. Por ejemplo, si cuatro unidades de citometría operan en paralelo para procesar el lote de espermatozoides, el tiempo necesario para completar la separación se reduce a aproximadamente 335 un cuarto del tiempo necesario para separar el lote usando una única unidad de citometría. Por lo tanto, al sustituir el paso de separación de los espermatozoides con una única unidad de citometría por el paso de separación de los espermatozoides con cuatro unidades de citometría que operan en paralelo, se puede reducir el ejemplo de cronograma para la realización completa del método desde la recolección hasta la finalización del paso de congelación. El tiempo se puede reducir aún más, aumentando la cantidad de citómetros que funcionan en paralelo para separar los espermatozoides de la muestra, sujeto a las limitaciones prácticas que implica el funcionamiento de un sistema en paralelo que tiene más de cuatro de dichas unidades. De este modo, según una materialización de la invención actual, el paso de separación en el proceso general descrito anteriormente se realiza separando los espermatozoides según una característica específica de ADN en un equipo de citometría de flujo multicanal. En aún otra materialización, un método de procesamiento de espermatozoides comprende el paso de separación de los espermatozoide según una característica específica de ADN en un equipo de citometría de flujo multicanal en el que cada canal recoge aproximadamente de 2000 a 10000 espermatozoides con la característica deseada de ADN por segundo.

Separación multicanal Ejemplo I Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro usando una vagina artificial y la muestra se transportó a una instalación de 336 tinción cercana en un envase de temperatura controlada a 37° C. Al llegar, se analizó la concentración del semen, la motilidad visual, la motilidad y la motilidad progresiva con el analizador Hamilton-Thorn Motility Analyzer (IVOS), según los procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Se prepararon seis tubos de 1 m!_ de suspensión de esperma de 150 X 06 espermatozoides/mL suspendiendo una alícuota de semen a 41° C en solución amortiguadora TCA N° 2 que contenía piruvato 0 mM llevando el pH general a 7.35. Luego se agregaron a las muestras de esperma distintas cantidades de solución acuosa de Hoechst 33342 10 mM para obtener las siguientes concentraciones finales de solución de colorante Hoechst 33342 :200, 300, 400, 500, 600 y 700 µ?. Cada una de las seis muestras se incubó a 41° C durante 30 minutos aproximadamente. Las muestras fueron analizadas por citometría de flujo y el % de CV de la población de células X fue estimado por un algoritmo de computadora iterativo para las muestras de Hoechst 33342, 200, 300 y 400 µ?. Se determinó que los % de CV para las soluciones de Hoechst 33342 300 y 200 µ? se encontraban en el intervalo aceptable próximo a 1.3 % de CV. En consecuencia, se determinó que se usaría una concentración de solución de Hoechst 33342 250 µ? para teñir un lote de espermatozoides para el procesamiento posterior. Se prepararon dos tubos que contenían 2 mL cada uno de suspensión de esperma de 150 X 106 espermatozoides/mL suspendiendo una alícuota de semen a 41° C en solución amortiguadora TCA N° 2 que contenía 337 piruvato 10 µ? (llevando nuevamente el pH general a 7.35). Luego se agregó solución acuosa de Hoechst 33342 10 µ? a cada una de las dos suspensiones de esperma para obtener una concentración final de solución de colorante Hoechst 33342 250 µ?. Las suspensiones de esperma se mantuvieron en un baño María a 41° C durante 30 min. Después de 30 minutos, las suspensiones de esperma se retiraron del baño María a 41° C y se agregaron 4 pL de solución de FD&C N°40 de 25 mg/mL a una de las suspensiones. La otra muestra se almacenó a temperatura ambiente para proporcionar muestras de comparación para los ensayos de evaluación. La suspensión de esperma teñida y enfriada se cargó sobre el puerto de muestra de un canal de un citómetro de flujo de separación de gotitas de cuatro canales. Como líquido envolvente se usó PBS de Delbecco. El citómetro se equipó con una boquilla orientadora como se describió anteriormente y que tiene un orificio de 60 micrómetros. Se instaló una placa deflectora semicircular perpendicular al eje longitudinal de la boquilla como se describió anteriormente. El transductor se operó a 54 kHz y el sitio de división de la gotita se controló manualmente. Un sistema óptico de epiluminación como se describió anteriormente se usó para dirigir aproximadamente 25% del haz de una onda láser continua para que cruzara la corriente de líquido en un ángulo perpendicular. Las lentes de enfoque y recolección tenían una apertura numérica de 0.65. El haz se enfocó a una mancha luminosa que tenía un ancho inferior a 3 pm para la exploración de rendija de los espermatozoides. Se utilizó el procesamiento de señales digitales para 338 extraer la diferencia en la pendiente crítica y el área del pulso para cada pulso de onda detectado. Los parámetros de clasificación para la clasificación de las células X, las células Y y las células indeterminadas en CSD bidimensional y el espacio característico del área del pulso se ingresaron manualmente en el sistema de procesamiento para clasificar a los espermatozoides según el contenido cromosómico. El esperma se separó según el contenido de cromosomas X e Y usando una estrategia de separación de aceptación de coincidencia para la recolección de células X, asignando un 50/50 de probabilidad de que cada espermatozoide sin clasificar fuera una célula X o una célula Y. Se ajustó manualmente la tasa de líquido de la muestra para mantener la pureza de la población de células X recogidas (según se indica por el GUI) en un 85 % o mejor y para mantener la tasa de recolección de células X por encima de una tasa mínima. Después de que se recogieron en un tubo aproximadamente quince millones de espermatozoides X que habían estado en remojo en el líquido envolvente durante al menos una hora y luego habían sido recubiertos con 0.5 mL de solución amortiguadora TCA N° 2 con 10 % de yema de huevo de pH 7.0, el tubo se retiró y se reemplazó con un tubo adicional que había sido preparado de manera similar. Inmediatamente después de quitar un tubo de recolección del citómetro de flujo, se preparó una muestra de comparación de suspensión de esperma teñido pero no separado. Las muestras separadas y de comparación se centrifugaron durante 7 min @ 750 g en un tubo de 15 mL. Se extrajeron 339 los sobrenadantes usando una pipeta de transferencia para obtener una concentración de aproximadamente 40 millones de espermatozoides/mL. Se agregó solución amortiguadora TCA N° 2 de pH 7.0 a las suspensiones de esperma para obtener una concentración final de aproximadamente 20 millones de espermatozoides/mL. Este proceso continuó hasta que el citómetro de flujo produjo cuatro tubos de recolección (A2-A5). Las muestras separadas y las muestras de comparación "no separadas" se evaluaron con el analizador IVOS. La muestra separada A3 y su muestra de comparación no separada se evaluaron con respecto al % de acrosomas intactos mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial. Todas las muestras separadas se contaron con hemocitómetro para determinar la tasa de producción de esperma separado por hora. El % de esperma que tenía cromosomas X se confirmó al volverlo a analizar con citómetro de flujo. Se proporcionan los resultados de la evaluación con el analizador IVOS de las muestras separadas y las muestras de comparación "no separadas" en las figs. 121 (motilidad) y 122 (motilidad progresiva). El número total de esperma separado en cada tubo de recolección se muestra en la fig. 123. La tasa de esperma separado por hora en cada período de recolección se muestra en la fig. 124. El porcentaje de esperma que contiene cromosomas X para cada muestra separada se indica en la fig. 125. Los resultados de la evaluación de la integridad de los acrosomas fueron 72% de acrosomas intactos para la muestra separada y 78% para la muestra de comparación no separada. Los resultados demuestran la capacidad técnica para producir 340 más de 5000 células X separadas por segundo con una pureza superior al 85 % por canal del sistema de citometría de flujo multicanal durante períodos prolongados. Los resultados también muestran la capacidad técnica para producir más de 7000 células X por segundo con pureza superior al 85% durante períodos prolongados en condiciones ideales. Aún más, los resultados indican que las muestras de espermatozoides separadas obtenidas mediante dicha separación por citometría de flujo a gran velocidad sólo sufrirán leves disminuciones en la motilidad, lo que indica que el esperma separado tendrá buena fecundidad.

Separación multicanal Ejemplo II Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro utilizando una vagina artificial. La eyaculación se dividió en dos alícuotas. La primera alícuota de 250 pL de semen se suspendió en 5 mL de Triladyl® a 37° C. La segunda alícuota, compuesta por el resto de la eyaculación, se suspendió en dos partes de amortiguador de carbonato (pH 6.1-6.2) a 37° C. Ambas alícuotas se transportaron a 37° C en un recipiente de temperatura controlada a una instalación de procesamiento. En la instalación de procesamiento, la primera alícuota se hizo flotar en -120 mL de agua a 37° C en un vaso de precipitados de 200 mL y se colocó en una habitación fría para enfriarla lentamente hasta 5° C. A la segunda alícuota se le analizó la concentración, la motilidad y la motilidad progresiva con el analizador Hamilton-Thorn Motility Analyzer (IVOS), según los procedimientos estándar y 341 bien conocidos (Farrell et al. Theríogenology, 49(4): 871-9 (Marzo de 998)). Se prepararon tres tubos de 1 ml_ de una suspensión de esperma de 150 X 106 espermatozoides/mL transfiriendo subalícuotas que contenían 150 millones de espermatozoides de la segunda alícuota a tubos vacíos, centrifugando a 500 g durante 5 min, retirando los sobrenadantes y resuspendiendo los sedimentos de esperma en 1 ml_ de amortiguador TCA N° 2 que contenía piruvato 10 mM, de pH 7.35 a 28° C. Se agregó solución de Hoechst 33342 10 mM en agua a cada uno de los tres tubos en diferentes cantidades para obtener concentraciones finales de colorante de 100, 150 y 200 µ? de Hoechst 33342. Cada uno de los tres tubos se mantuvo a 28° C durante aproximadamente 60 minutos. El esperma de cada uno de los tres tubos se analizó mediante citometría de flujo y se determinó el CV de la intensidad de fluorescencia total de la población X para las condiciones de tinción con 100, 150 y 200 µ? de Hoechst 33342 utilizando un algoritmo computacional interactivo. Los CV para 150 y 200 µ? de Hoechst 33342 estuvieron ambos dentro del intervalo aceptable próximo al 1.3 %. De este modo, se determinó usar las condiciones de tinción que incluían la concentración 50 µ? de Hoechst 33342 para la separación. Se preparó un tubo que contenía 5 mL de una suspensión de esperma de 150 X 06 espermatozoides/mL transfiriendo subalícuotas que contenían 750 millones de espermatozoides de la segunda alícuota, centrifugando a 500 g durante 5 min, retirando los sobrenadantes y resuspendiendo los sedimentos de esperma en amortiguador TCA N° 2 que 342 contenía piruvato 10 mM, de pH 7.35 a 28° C. Se agregó solución de 33342 10 mM en agua al tubo en una cantidad que dio una concentración final de colorante de 150 µ? de Hoechst 33342. El tubo se mantuvo en baño María a 28° C durante 60 min. Después de 60 minutos, el tubo se retiró del baño María a 28° C y se agregaron 10µ? de FD&C N° 40 de 25 mg/mL. La suspensión de esperma teñido y enfriado se cargó en el puerto de muestra de un canal de un citómetro de flujo multicanal de separación de gotitas. La suspensión de esperma se mantuvo a 28° C. Utilizando prácticamente las mismas regulaciones del instrumento que se establecieron en el Ejemplo I de Separación multicanal, se separaron los espermatozoides con cromosomas X e Y mediante un sistema de citómetro de flujo utilizando una estrategia de interrupción de coincidentes durante un período necesario para colocar una población enriquecida en células X de aproximadamente dieciocho millones de espermatozoides en un tubo de recolección que había sido preparado sumergiéndolo en líquido envolvente durante al menos una hora y luego agregando 0.5 mL de medio de crioconservación Triladyl® que contenía piruvato 10 mM de pH 6.6. Los espermatozoides se introdujeron en el sistema de citometría de flujo a una velocidad entre aproximadamente 25000 y 30000 células/segundo. Se recogió una población enriquecida de células X a una velocidad que varió entre 4500 células por segundo y 6000 células por segundo. Una vez que se separaron aproximadamente 18 millones de espermatozoides en un tubo de recolección, el tubo se retiró y fue reemplazado por otro tubo que había sido 343 preparado de manera similar. Inmediatamente después de retirar el tubo de recolección del citómetro de flujo, la suspensión de esperma separado se centrifugó a 700 g durante 7 minutos. Se extrajo el sobrenadante usando una pipeta de transferencia para obtener una concentración de aproximadamente 100 millones de espermatozoides/mL. Se agregó solución de crioconservación Triladyi® que contenía piruvato 10 mM (pH 6.6) a las suspensiones de esperma para obtener una concentración final de aproximadamente 50 millones de espermatozoides/mL. Este proceso continuó hasta que el citómetro de flujo produjo tres tubos de recolección (D1-D3). Aproximadamente 52 millones de espermatozoides fueron separados en 259 min obteniéndose una velocidad de recolección general de aproximadamente 12 millones de espermatozoides X por hora de separación. Los tubos de muestra separada y resuspendida se hicieron flotar en - 20 mL de agua a 28° C en un vaso de precipitados de 200 mL y se colocaron en una habitación fría a 5o C para enfriarlos lentamente. Después que las muestras separadas alcanzaron los 5o C, los tres tubos de esperma separado se combinaron en un tubo. La mezcla de muestras se analizó con el analizador IVOS para determinar el % de motílldad, el % de motilidad progresiva y la concentración. Se agregó más medio de crioconservación Triladyi® que contenía piruvato 10 mM (pH 6.6) a la muestra para obtener una concentración final de aproximadamente 50 millones de espermatozoides/mL. El % de espermatozoides que contenían cromosomas X en la mezcla de muestras fue de 87 % como se determinó mediante 344 repetición del análisis con citómetro de flujo. Un resumen de la evaluación del analizador IVOS en comparación con la muestra no separada de la misma eyacuiación se ilustra en la fig. 126. La mezcla de muestras separadas y la primera alícuota se cargaron en una pajilla estándar de 0.25 ce en una habitación fría a 5o C. Las pajillas cargadas se transfirieron a un congelador programable y se congelaron según el programa siguiente: 5 min a 5o C, enfriar desde 5o C hasta -12° C a 4o C/min, enfriar desde -12° C hasta -100° C a 40° C/min, enfriar desde -100° C hasta -140° C a 20° C/min, mantener a -140° C. Después que las pajillas alcanzaron los -140° C, se retiraron rápidamente del congelador y se sumergieron en nitrógeno líquido. A las pajillas descongeladas se les determinó con el analizador IVOS el % de motilidad y el % de motilidad progresiva después de la incubación a 37° C durante 30 y 120 minutos. Los resultados de un conjunto de dos pajillas separadas y no separadas se resumen en las figs. 127 y 128.

Separación multicanal Ejemplo III Se recogió semen de un toro maduro sexualmente utilizando una vagina artificial y la eyacuiación se dividió en dos alícuotas. Una primera alícuota de 250 ? de semen se suspendió en 5 mL de Triladyl® a 37° O Una segunda alícuota, compuesta por el resto de la eyacuiación, se suspendió en dos partes de amortiguador de carbonato (dos partes 0.097 moles/L de NaHCO3, 0.173 moles/L de KHCO3, 0.090 moles/L C6H8O7 H20 en agua) (pH 345 6.1-6.2) a 37° C. Ambas alícuotas se transportaron a 37° C en un recipiente de temperatura controlada a la instalación de procesamiento. En la instalación de procesamiento, la primera alícuota se hizo flotar en ~120 ml_ de agua a 37° C en un vaso de precipitados de 200 mL y se colocó en una habitación fría para enfriarla lentamente hasta 5o C. A la segunda alícuota se le analizó la concentración, la motilidad y la motilidad progresiva con el analizador Hamilton-Thorn Motility Analyzer (IVOS), según los procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Se prepararon dos tubos con la suspensión de esperma que contenía 150 X 106 espermatozoides/mL transfiriendo a cada uno de los dos tubos vacíos una fracción que contenía 900 millones de espermatozoides de la segunda alícuota, centrifugando cada tubo a 500 X g durante 5 minutos, retirando el sobrenadante de cada tubo y resuspendiendo cada uno de los sedimentos de esperma en 6 mi de amortiguador TCA N° 2 que contenía piruvato 10 mM de pH 7.35 a 28° C. A cada uno de los tubos se agregó solución Hoechst 33342 10 mM para obtener concentraciones finales del colorante de 200 µ? de Hoechst 33342 en un tubo y 400 µ? de Hoechst 33342 en el otro tubo. Cada uno de los tubos se mantuvo a 28° C durante aproximadamente 120 minutos. El esperma de cada uno de los tubos se analizó mediante citometría de flujo y se determinó el CV de la intensidad de fluorescencia total de la población X para las condiciones de tinción con 200 µ? y 400 µ? de Hoechst 33342 utilizando un algoritmo computacional 346 interactivo. Los CV para Hoeschst 33342 para 200 µ? y 400 µ estuvieron ambos dentro del intervalo aceptable próximo al 1.3 %. La suspensión de esperma teñido con una concentración de 200 µ de Hoechst 33342 fue elegida para la separación. Se agregaron 10µ? de FD&C N°40 de 25 mg a este tubo de suspensión de esperma teñido inmediatamente antes de la separación. La suspensión de esperma teñido se cargó en el puerto de muestra de un canal de un citómetro de flujo multicanal de separación de gotitas. La suspensión de esperma se mantuvo a 28° C. Utilizando prácticamente las mismas regulaciones del instrumento que se establecieron en el Ejemplo I de Separación multicanal, utilizando una estrategia de interrupción de coincidentes durante se separaron los espermatozoides con cromosomas X e Y mediante el sistema de citómetría de flujo durante un período necesario para colocar una población de células enriquecida en cromosomas X de aproximadamente dieciocho millones de espermatozoides en un tubo de recolección que había sido preparado sumergiéndolo en amortiguador envolvente durante al menos una hora y luego agregando 0.5 mL de medio de crioconservación Triladyl® de pH 6.6. Los espermatozoides se introdujeron en el sistema de citómetría de flujo a una velocidad entre aproximadamente 25000 y 30000 células/segundo. Se recogió una población enriquecida de células con el cromosoma X a una velocidad que varió entre 4500 células por segundo y 6000 células por segundo. Una vez que se separaron aproximadamente 18 millones de espermatozoides en un tubo de 347 recolección, el tubo se retiró y fue reemplazado por otro tubo que había sido preparado de manera similar. Inmediatamente después de retirar un tubo de recolección del citómetro de flujo, la suspensión de esperma separado se centrifugó durante 7 min a 700 X g. El sobrenadante se extrajo con una pipeta de transferencia para obtener una concentración de aproximadamente 100 millones de espermatozoides/mL. Se agregó medio de crioconservación Triladyl® (pH 6.6) a las suspensiones de esperma para obtener una concentración final de aproximadamente 50 millones de espermatozoides/mL. Este proceso continuó hasta que el citómetro de flujo produjo dos tubos de recolección (C1-C3). Aproximadamente 35 millones de espermatozoides fueron separados en 193 minutos obteniéndose una velocidad de recolección general de 11 millones de espermatozoides con el cromosoma X por hora de separación. Los tubos de muestra separada y resuspendida se hicieron flotar en ~120 mL de agua a 28° C en un vaso de precipitados de 200 mL y se colocaron en una habitación fría a 5o C para enfriarlos lentamente. Después que las muestras separadas alcanzaron los 5o C, los tres tubos de esperma separado se combinaron en un tubo. La mezcla de muestras se analizó con el analizador IVOS para determinar el % de motilidad, el % de motilidad progresiva y la concentración. Se agregó más medio de crioconservación Triladyl® (pH 6.6) a la muestra para obtener una concentración final de aproximadamente 50 millones de espermatozoides/mL. El % de espermatozoides que contenían cromosomas X en la mezcla de muestras fue de 88% como se determinó mediante repetición del análisis con 348 citómetro de flujo. Un resumen de la evaluación del analizador IVOS en comparación con la muestra no separada de la misma eyaculacion se ilustra en la fig. 129. La mezcla de muestras separada y no separada (es decir, la primera alícuota antes mencionada) se cargaron en pajillas estándar de 0.25 ce en una habitación fría a 5o C. Las pajillas cargadas se transfirieron a un congelador programable y se congelaron según el programa siguiente: 5 min a 5o C, enfriar desde 5o C hasta -12° C a 4o C/min, enfriar desde -12° C hasta -100° C a 40° C/min, enfriar desde -100° C hasta -140° C a 20° C/min, mantener a -140° C. Después que las pajillas alcanzaron los -140° C, se retiraron rápidamente del congelador y se sumergieron en nitrógeno líquido. A las pajillas descongeladas se les determinó con el analizador IVOS el % de motilidad y el % de motilidad progresiva después de la incubación a 37° C durante 30 y 120 minutos. Los resultados de un conjunto de pajillas separadas y no separadas se resumen en las figs. 130 y 131.

Separación multicanal Ejemplo IV Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro utilizando una vagina artificial y la eyaculacion se dividió en dos alícuotas. La primera alícuota de 250 pL de semen se suspendió en 5 mL de Triladyl® a 37° C. La segunda alícuota, compuesta por el resto de la eyaculacion, se suspendió en dos partes de amortiguador de carbonato a 37° C (dos partes 0.097 moles/L de NaHC03; 0.173 moles/L de KHC03; 0.090 moles/L 349 C6H807-H20 en agua)(pH 6.1-6.2) y se mantuvo bajo C02. Ambas alícuotas se transportaron a 37° C en un recipiente de temperatura controlada a la instalación de procesamiento. En la instalación de procesamiento, la primera alícuota se hizo flotar en ~120 ml_ de agua a 37° C en un vaso de precipitados de 200 mL y se colocó en la habitación fría para enfriarla lentamente hasta 5o C. A la segunda alícuota se le analizó la concentración, la motilidad y la motilidad progresiva con el analizador Hamilton-Thorn Motility Analyzer (IVOS), según los procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theríogenology, 49(4): 871-9 (Marzo de 1998)). Se preparó un tubo de 5 mL de suspensión de esperma de 50 X 106 espermatozoides/mL transfiriendo una fracción que contenía 750 millones de espermatozoides de la segunda alícuota (pH 6.1-6.2) a un tubo vacío y agregando amortiguador de carbonato a 28° C (pH 7.35) hasta un volumen final de 5 mi. A esta suspensión de esperma, se le agregó solución de Hoechst 33342 10 mM en agua para obtener una concentración final de colorante 150 µ? de Hoechst 33342. La suspensión se mantuvo a 41 ° C bajo C02 durante aproximadamente 40 minutos y luego se colocó a 28° C para su separación. Se agregaron 10 µ? de FD&C N° 40 de 25 mg/mL al tubo de la suspensión de esperma teñido justo antes de la separación. La suspensión de esperma teñido se cargó en el puerto de muestra de un canal de un citómetro de flujo multicanal de separación de gotitas. La suspensión de esperma se mantuvo a 28° C. Utilizando prácticamente las mismas regulaciones del instrumento que se establecieron 350 en el Ejemplo I de Separación multicanal, se separaron los espermatozoides con cromosomas X e Y mediante un sistema de citómetro de flujo utilizando una estrategia de interrupción de coincidentes durante un período necesario para colocar una población de células enriquecida en cromosomas X de aproximadamente dieciocho millones de espermatozoides en un tubo de recolección que había sido preparado sumergiéndolo en amortiguador envolvente durante al menos una hora y después agregándole 0.5 mL de medio de crioconservación Triladyl® (pH 6.6). Los espermatozoides se introdujeron en el sistema de citometría de flujo a una velocidad entre aproximadamente 25000 y 30000 células/segundo. Se recogió una población enriquecida de células con cromosomas X a una velocidad que varió entre 4500 células por segundo y 6000 células por segundo. Una vez que se separaron aproximadamente 18 millones de espermatozoides en un tubo de recolección, el tubo se retiró y fue reemplazado por otro tubo que había sido preparado de manera similar. Inmediatamente después de retirar el tubo de recolección del citómetro de flujo, la suspensión de esperma separado se centrifugó a 700 X g durante 7 minutos. Se extrajo el sobrenadante usando una pipeta de transferencia para obtener una concentración de aproximadamente 100 millones de espermatozoides/mL. Se agregó medio de crioconservación Triladyl® y piruvato (pH 6.6) a las suspensiones de esperma para obtener una concentración final de aproximadamente 50 millones de espermatozoides/mL. Este proceso continuó hasta que el citómetro de flujo produjo dos tubos de recolección (C2-C3). Los tubos de muestra separada y 351 resuspendida se hicieron flotar en ~120 mL de agua a 28° C en un vaso de precipitados de 200 mL y se colocaron en una habitación fría a 5o C para enfriarlos lentamente. Después que las muestras separadas alcanzaron los 5o C, los dos tubos de esperma separado se combinaron en un tubo. La mezcla de muestras se analizó con el analizador IVOS para determinar el % de motilidad, el % de motilidad progresiva y la concentración. Se agregó más medio de crioconservación Triladyl® y piruvato (pH 6.6) a la muestra para obtener una concentración final de aproximadamente 50 millones de espermatozoides por mL. Un resumen de la evaluación del analizador IVOS en comparación con la muestra no separada de la misma eyeculación se ilustra en la figura 132. La mezcla de muestras separadas y la muestra sin separar (es decir, la primera alícuota antes mencionada) se cargaron en pajillas estándar de 0.25 ce en la habitación fría a 5o C. Las pajillas cargadas se transfirieron a un congelador programable y se congelaron según el programa siguiente: 5 min a 5o C, enfriar desde 5o C hasta -12° C a 4o C/min, enfriar desde -12° C hasta -100° C a 40° C/min, enfriar desde -100° C hasta -140° C a 20° C/min, mantener a -140° C. Después que las pajillas alcanzaron los -140° C, se retiraron rápidamente del congelador y se sumergieron en nitrógeno líquido. A las pajillas descongeladas se les determinó con el analizador IVOS el % de motilidad y el % de motilidad progresiva inmediatamente después de descongelarlas y después de la incubación a 37° C durante 30 minutos. Los resultados de un conjunto de dos pajillas separadas y no 352 separadas se resumen en las figs. 133 y 134.

Sistema de Boquilla del Tubo Capilar La fig. 135 ilustra un sistema alternativo de boquilla, generalmente designado 1335, similar al que se describió anteriormente excepto en que un tubo capilar 1337(de cuarzo o sílice fundido, por ejemplo) está conectado a la boquilla 137 para que el líquido que está saliendo del orificio de la boquilla 03 se dirija hacia el interior y a través del tubo. El sistema óptico 109 del citómetro de flujo está acoplado ópticamente al lado del tubo de manera apropiada, como mediante una cámara 1341 llena con un medio que transmite luz como aceite o gel que tienen un índice de refracción conocido. El uso de un tubo capilar, en comparación con la salida en chorro de la corriente de líquido a través del espacio abierto, tiene el beneficio de reducir la estratificación lenticular de la corriente 21 debido a la energía acústica provista por el transductor 105 y permitir que la lente de enfoque 1343 se coloque de inmediato adyacente a la corriente de líquido para aumentar la resolución de las señales de emisión. Una vez que se haya interrogado y clasificado a las partículas, se las puede separar usando cualquier técnica convencional conocida por los técnicos de la profesión, como por ejemplo mediante el uso de un dispositivo de desviación del líquido que se muestra en la fig. 137 u otros dispositivos apropiados como los sistemas de fotoablación o ios sistemas de separación de gotitas. 353 Técnicas de separación diferentes de la técnica de separación de gotitas Separación por fotoablación Las mejoras de esta invención en la citometría de flujo son aplicables no sólo a la separación de células en gotitas como se describió anteriormente, sino también a otras técnicas de separación, como la separación por fotoablación (ablación con láser). La separación por fotoablación se trata en la patente de los Estados Unidos N° 4,395,397, que se incorpora aquí en su totalidad como referencia. La fig. 136 ilustra esquemáticamente una materialización de un sistema de fotoablación de citometría de flujo monocanal, generalmente designado con su número de referencia. Como se muestra en la fig. 136, el sistema de separación por fotoablación 1351 es similar al sistema de separación de gotitas de la fig. 2 y las partes correspondientes se designan con los números de referencia correspondientes con el agregado de número primo doble ("). En general, el sistema comprende los mismos componentes que el sistema de la fig. 2, excepto en que se eliminan los componentes de separación de gotitas (por ejemplo, el transductor 105, el dispositivo de carga 627, las placas deflectoras 629 y las fuentes de energía asociadas 635). En cambio estos componentes son reemplazados por un láser 1353 o un dispositivo similar que responde a las instrucciones recibidas del microprocesador 131" para extirpar las 354 partículas no deseadas de la corriente de líquido 21". Como resultado, la corriente recogida en un receptáculo de recolección 1355 contiene una población deseada de partículas. Por ejemplo, si las partículas a analizar son espermatozoides y el resultado buscado es recoger espermatozoides con una característica A (por ejemplo, un contenido del cromosoma deseado), entonces el microprocesador recibe señales del sistema de epiluminación 415" que identifica las células que no tienen la característico A y activa selectivamente el láser para extirpar dichas células o de otro modo las torna ineficaces. Se pueden emplear diferentes estrategias de separación de control en un sistema de fotoablación, incluso las estrategias de separación de "alta recuperación" y de "pureza elevada" tratadas antes en el contexto de un separador de gotitas. En un sistema de fotoablación, las partículas contenidas en la corriente de líquido están espaciadas a diversos intervalos a lo largo de la corriente y en general están una después de la otra en fila india. Las partículas tienen diferentes características, algunas tienen una característica A, por ejemplo y otras tienen una característica B. La secuencia de las partículas es aleatoria, así que vista como una procesión continua, las partículas se pueden dividir en diferentes series de partículas, una atrás de la otra, incluida una primera serie de partículas que consta sólo de una o más partículas que tienen la característica A, una segunda serie de partículas que consta sólo de una o más partículas que tienen la característica B y una tercera serie de partículas que consta de dos o más partículas muy juntas al 355 menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. El último (tercer) grupo corresponde en general a las partículas muy juntas en una gotita "coincidente" tratada anteriormente, al menos a los efectos de la estrategia de separación. Por lo tanto, dos o más partículas del tercer grupo pueden estar muy juntas en el sentido de que la separación entre las partículas es insuficiente para permitir una discriminación o clasificación exacta de las partículas, o porque tal separación es insuficiente para permitir a una partícula de la serie ser extirpada por el láser sin dañar a la(s) otra(s) partícula (s) de la misma serie. De todas maneras, las partículas muy juntas en cada (o al menos en alguna) tercera serie de partículas se pueden extirpar o no extirpar, según la estrategia de separación empleada. Debe señalarse que múltiples partículas en una primera serie o múltiples partículas en una segunda serie podrían estar "muy juntas", pero puesto que las partículas en cualquiera de dichas series tiene la misma característica (A o B), se las trata como a una serie de partícula única, al menos a efectos de la estrategia de separación. El sistema de fotoablación puede ser un sistema monocanal o un sistema multicanal, como se describió anteriormente. 356 Separación por desviación del líquido Se considera que los principios de esta invención pueden también aplicarse a los sistemas de citometría de flujo que usan técnicas de desviación del líquido, según se divulga, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos N° 6,432,246 (Adair), 4,756,427 (Gohde.et al.), y 3,791 ,517 (Friedman), que se incorporan aquí en su totalidad como referencia. La fig. 137 es una vista parcial de un sistema de ese tipo, generalmente designado 1357. Es prácticamente idéntico al sistema que se muestra en la fig. 2 excepto en que el sistema de boquilla 101" incluye un tubo capilar 1369 (por ejemplo, consulte fig. 135) y el sistema de separación comprende un dispositivo de desviación del líquido 1359 acoplado al tubo capilar 1369 más allá del sitio de interrogación 115'. La construcción y el funcionamiento del dispositivo de desviación del líquido pueden incorporar cualquier tecnología de desviación del líquido convencional como se divulgó en las patentes a las que se hizo referencia antes. En general, el dispositivo funciona para separar las partículas deseadas de las partículas no deseadas en respuesta a las instrucciones recibidas del procesador, al desviar intermitentemente las porciones de la corriente de líquido que contienen las partículas deseadas o no deseadas a lo largo de recorridos de flujo independientes 1361 y 365 para la recolección en recipientes o similares. La desviación se logra habitualmente accionando selectivamente un transductor 1367 en uno de los recorridos de flujo. Las diversas estrategias de separación descritas anteriormente 357 respecto a la separación de gotitas y la separación por fotoablación también se pueden emplear en un sistema de desviación del líquido. En el sistema de desviación del líquido, las partículas contenidas en la corriente de líquido también están espaciadas a diversos intervalos a lo largo de la corriente y en general una atrás de la otra en fila india. Las partículas tienen diferentes características, algunas tienen una característica A, por ejemplo y otras tienen una característica B y la secuencia de partículas es aleatoria. Por consiguiente, como se trató antes con respecto al sistema de fotoablación, la procesión de partículas se puede dividir en diferentes series de partículas, una atrás de la otra, incluida una primera serie de partículas que consta de una o más partículas que tienen la característica A, una segunda serie de partículas que consta de una o más partículas que tienen la característica B y una tercera serie de partículas que consta de dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. El último (tercer) grupo corresponde en general a las partículas muy juntas en una gotita "coincidente" tratada anteriormente, al menos a los efectos de la estrategia de separación. Por lo tanto, dos o más partículas del tercer grupo pueden estar muy juntas en el sentido de que la separación entre las partículas es insuficiente para permitir una discriminación o clasificación exacta de las partículas, o porque tal separación es insuficiente para permitir a una partícula de la serie ser desviada por el dispositivo de desviación del líquido y separada de otra partícula de la misma serie. De todas maneras, las partículas muy juntas en cada (o al menos en alguna) 358 tercera serie de partículas se pueden desviar a un sitio de recolección o a otro, según la estrategia de separación empleada. Según se explicó antes con respecto a la separación por fotoablación, múltiples partículas de una primera serie o múltiples partículas de una segunda serie podrían estar "muy juntas", pero puesto que las partículas de cualquiera de dichas series tienen la misma característica (A o B), son tratadas como una serie de partícula única a los efectos de la estrategia de separación. El sistema de desviación del líquido puede ser un sistema monocanal o multicana!, como se describió anteriormente.

Separación por interferencia de gotitas También se considera que la tecnología de esta invención se puede usar conjuntamente con una técnica de desviación fluídica por interferencia de gotitas. Por ejemplo, un sistema de separación por interferencia de gotitas de alta velocidad 1371 , que se muestra esquemáticamente en la fig. 138, se puede usar para separar las partículas al desviar los segmentos seleccionados de la corriente coaxial de líquido de transporte y líquido envolvente. En contraposición a algunas otras técnicas de separación, la técnica de separación por interferencia de gotitas no necesita que la corriente coaxial de líquido de transporte y de líquido envolvente forme gotitas. Por lo tanto, no hay ninguna necesidad de acoplar al sistema de boquilla 101'" usado para dispensar el líquido de transporte y el líquido envolvente un sistema 359 generador de gotitas. Únicamente a modo de ejemplo, pasar los líquidos de transporte y envolvente a través de un sistema de boquilla a 60 psi (4.218 kg/cm2) para crear una corriente de 50 micrómetros de diámetro es una disposición adecuada para la formación de una corriente coaxial laminar de líquido para la dispensación de partículas al sistema de separación por interferencia de gotitas. Las partículas de la corriente coaxial de líquido se analizan y clasifican mediante el sistema óptico 109'" y el procesador 131"' a medida que se mueven a través del sitio de interrogación 115'", según se ha descrito anteriormente para los otros sistemas de separación. La separación se produce más allá del sitio de interrogación, en un lugar donde la corriente coaxial de líquido cruza una corriente de interferencia de gotitas de alta velocidad 1373. La corriente de interferencia de gotitas 1373 es generada por un sistema de generación de gotitas 1375 similar al sistema de generación de gotitas usado para la separación de gotitas. Una corriente de líquido de alta velocidad 1379 pasa a través de un sistema de boquilla de gran velocidad 1377 que está acoplado a un transductor piezoeléctrico 1381 u otra fuente de energía acústica para hacer que la corriente de líquido de alta velocidad se rompa en gotitas 1383 más allá de la boquilla de alta velocidad. Por ejemplo, un líquido sin partículas a 1500 psi ( 05.45 kg/cm2) puede pasar a través de una boquilla de alta velocidad para formar un chorro de líquido de 70 micrómetros de diámetro de alta velocidad. La boquilla de alta velocidad puede hacerse oscilar a 400 kHz para formar gotitas de alta velocidad. Las 360 gotitas de alta velocidad 1383 pasan por un campo eléctrico generado por una o más placas de deflexión eléctrica 1387 de modo que el recorrido de las gotitas de alta velocidad pueda ser controlado al aplicar selectivamente una carga eléctrica a las gotitas, como se hizo para controlar el recorrido de las gotitas en el sistema de separación de gotitas. La corriente de interferencia de gotitas de alta velocidad se dirige de modo que algunas gotitas de alta velocidad crucen la corriente coaxial de líquido en un sitio 1399 más allá del sitio de interrogación. Por ejemplo, las gotitas sin cargar 1389 se pueden dirigir para que choquen con la corriente de líquido en tanto que las gotitas cargadas 1391 se desvían lejos de la corriente coaxial de líquido. Cuando una gotita de alta velocidad choca con la corriente coaxial de líquido, un segmento 1397 de la corriente de líquido y todas las partículas contenidas en ella son desviadas del camino que de otro modo habrían tomado. La aplicación de una carga o de ninguna carga a una gotita de alta velocidad se sincroniza para que la llegada de esa gotita a la intersección 1399 con la corriente coaxial de líquido coincida con la llegada de un segmento particular de la corriente coaxial de líquido. Por lo tanto, al cargar selectivamente las gotitas de alta velocidad dependiendo de la clasificación de las partículas contenidas en los segmentos de la corriente coaxial, se puede separar partículas al desviar todos los segmentos de la corriente coaxial de líquido que contienen una o más partículas seleccionadas y no desviando otros segmentos de la corriente coaxial o viceversa. Los capilares de recolección 1403 que tienen un vacío leve se pueden usar para recoger tanto el segmento 361 desviado 1397 como el no desviado de la corriente coaxial. Se puede fijar el sistema de separación por interferencia de gotitas para que las gotitas de alta velocidad se fusionen con segmentos desviados de la corriente coaxial o para que las gotitas de alta velocidad permanezcan separadas de los segmentos desviados de la corriente después de la colisión con los segmentos de la corriente coaxial. Dado que no hay partículas ni células en la corriente de interferencia de gotitas de alta velocidad 1373, es posible usar presiones muy altas y frecuencias de gotitas muy altas sin dañar a las partículas ni a las células que se van a separar. Esto permite la separación de segmentos de la corriente cada uno de los cuales tiene menos volumen (por ejemplo, cuatro veces menos volumen) que el volumen de una gotita en el sistema de separación de gotitas. Esto aumenta en gran medida la máxima producción del sistema a la vez que reduce el factor de dilución de las partículas separadas. Es más, debido a que se usa un líquido finamente filtrado sin células ni partículas para formar la corriente de interferencia de gotitas, es posible la formación más uniforme de gotitas porque la boquilla de formación de gotitas tiene menor probabilidad de obstruirse o sufrir acumulación proteica que el sistema de boquilla usado en el sistema de separación de gotitas. Otra ventaja es que la distancia entre el análisis de partículas en el sitio de interrogación y el sitio de separación 1399 se puede reducir (por ejemplo, a la cuarta parte), permitiendo predecir de manera más exacta el tiempo de llegada de una determinada partícula al sitio de separación. Además, el 362 sistema de interferencia de gotitas permite una mayor flexibilidad en el ajuste del tamaño o la presión de la boquilla para la corriente coaxial de líquido. Si se desea, el sistema de separación por interferencia de gotitas se puede combinar con el sistema de boquilla del tubo capilar. Un sistema multicanal de separación por interferencia de gotitas puede usar una bomba fluídica de alta presión para suministrar líquido de una fuente común de suministro a múltiples boquillas generadoras de una corriente de interferencia de gotitas. Cuando se introducen los elementos de la invención actual o las materializaciones de ésta, los artículos "a", "un", "una", "el", "la" y "dicho" o "dicha" tienen la intención de decir que hay uno o más de los elementos. Los términos "comprende", "consiste en", "consta de", "incluye" y "tiene" tienen la intención de ser inclusivos y quieren decir que puede haber otros elementos diferentes de los elementos enumerados. El término "o" tiene la intención de incluir "y/o" y quiere decir "uno u otro o ambos". Por lo tanto, una indicación de "ABC o DEF" significa (1) ABC, o (2) DEF, o (3) tanto ABC como DEF. El término "y/o" tiene la intención de querer decir lo mismo que "o" tal como se lo definió anteriormente. Por lo tanto, el término "y/o" tiene la intención de incluir "o" y quiere decir "uno u otro o ambos". Por ejemplo, una indicación de "ABC y/o DEF" significa (1) ABC, o (2) DEF, o (3) tanto ABC como DEF. En vista de lo anterior, se reconocerá que se cumplieron varios objetivos de la invención y se obtuvieron otros resultados beneficiosos. Como se pueden efectuar diversos cambios en las construcciones, los productos y métodos anteriores sin apartarse del alcance 363 de la invención, se tiene la intención de que todas las materias contenidas en la descripción anterior y que se muestran en los dibujos acompañantes se interpreten como ejemplos y no en un sentido excluyente.

Comentarios sobre las características originales Los técnicos de la profesión reconocerán que la invención descrita anteriormente comprende aspectos originales, entre los que se incluyen al menos los siguientes: A. Equipo de separación multicanal A1. Un sistema multicanal para separar partículas según una o más características de las mismas, que consta de: unidades de citometría de flujo múltiples, que se pueden operar individualmente para separar una población deseada de partículas en una mezcla de partículas, mediante la interrogación de una corriente de líquido que contiene dichas partículas, utilizando un haz de radiación electromagnética, dichas unidades comparten una plataforma integrada que consta de al menos uno de los elementos siguientes: (1) un suministro común de partículas; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de 364 las unidades; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene tales partículas a dichas unidades de citometría de flujo. A2. El sistema de A1 en el que dichas partículas son células. A3. El sistema de A1 en el que dichas partículas son espermatozoides. A4. El sistema de A1 en el que dicho sistema comprende al menos el elemento (2), y en el que una o más de las unidades múltiples de citometría de flujo mencionadas constan de una unidad de citometría de flujo de separación de gotitas de chorro en aire. A5. El sistema de A1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos los elementos (2) y (3). A6. El sistema de A1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos los elementos (4) y (5). A7. El sistema de A1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (2); dicha fuente común consta de un haz láser único. A8. El sistema de A7 que consta además de un sistema divisor del haz para dividir el haz láser único en múltiples haces y dirigir los múltiples haces al interior de los sistemas ópticos de las respectivas unidades de citometría de flujo. A9. El sistema de A8 en el que dicho haz láser único consiste en una cantidad de pulsos, cada uno de los cuales tiene una potencia máxima mayor que la potencia de salida promedio del láser. 365 A10. El sistema de A1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (3); dichas unidades de citometría de flujo constan de módulos intercambiables desmontables en la cubierta. A11. El sistema de A1 en el que cada unidad de citometría de flujo consta de un sistema óptico de epiluminación para interrogar una corriente de líquido respectiva. A12. El sistema de A1 además consta de un sistema de recolección para recoger dicha población deseada de partículas de cada unidad. A13. El sistema de A1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (5), y en el que dicha salida común consta de una indicación de la intensidad de fluorescencia medida por cada unidad. A14. El sistema de A1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (5) y en el que dicha salida común consta de una indicación de la velocidad a la que cada unidad separa las partículas. A15. El sistema de A1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (5) y en el que dicha salida común consta de una indicación de las variaciones de tinción de las partículas. A16. El sistema de A1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (5) y en el que dicha salida común consta de una indicación de un límite de decisión utilizado por cada unidad para la discriminación entre partículas. A17. El sistema de A1 en el que cada una de dichas unidades 366 de citometría de flujo consta de un sistema de separación de gotitas. A18. El sistema de A1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (5) y en el que dicha información consta de una indicación de un sitio de división de las gotitas de cada unidad. A19. El sistema de A1 en el que al menos una de dichas unidades de citometría de flujo consta de un sistema de fotoablación. A20. El sistema de A1 en el que al menos una de dichas unidades de citometría de flujo consta de un sistema de separación por desviación del líquido. A21. El sistema de A1 en el que dichas unidades de citometría de flujo se adaptan para operar en paralelo. A22. El sistema de A1 en el que la plataforma integrada comprende al menos un haz láser compartido que se puede operar para emitir una cantidad de pulsos de radiación electromagnética, en el que cada pulso tiene una potencia máxima que supera la potencia promedio del láser y en el que una o más de dichas unidades de citometría de flujo constan de: un canal de flujo para dirigir una corriente de líquido que contiene partículas de la muestra a través de un sitio de interrogación de partículas; un sistema de orientación del haz que se puede operar para dirigir una parte de la radiación electromagnética en un pulso hacia el sitio de interrogación; un circuito de sincronización que se puede operar para producir una señal de sincronización indicativa de la llegada de la radiación 367 electromagnética al sitio de interrogación; un detector adaptado para detectar radiación electromagnética del sitio de interrogación y que se puede operar para producir una señal analógica que varía con el tiempo indicativa de la intensidad de la radiación electromagnética detectada; un convertidor analógico-digital adaptado para recibir la señal analógica que varia con el tiempo como entrada y para analizar la señal analógica para producir una salida digitalizada; y un procesador electrónico que se puede operar para analizar la salida digitalizada del convertidor analógico-digital como una función de la señal de sincronización. A23. El sistema de A1 en el que las unidades múltiples de citometría de flujo comprenden tres o más unidades de citometría de flujo. A24. El sistema de A1 en el que las unidades múltiples de citometría de flujo comprenden al menos doce unidades de citometría de flujo. A25. El sistema de la reclamación A1 , en el que la plataforma integrada comprende al menos el elemento (5), y en el que el procesador común lleva cabo al menos uno de los siguientes: (1) recibir y procesar dicha información en tiempo real; y (2) recibir y procesar dicha información para permitir evaluar el funcionamiento de una unidad con respecto a otra unidad. A26. El sistema de A1 en el que dicha unidad de citometría de flujo consta de un sensor que se puede operar para generar una señal de salida variable en el tiempo indicativa de al menos una característica de las 368 partículas, en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (5) y dicha información recibida por el procesador común comprende las señales de salida de los respectivos sensores, y en el que el procesador se puede operar para recibir las señales de salida como una corriente prácticamente continua y para procesar prácticamente continuamente las señales de salida en tiempo real. A27. El sistema de A1 en el que dicha plataforma integrada comprende un procesador común que se puede operar para enviar señales de control a las unidades de citometría de flujo en tiempo real durante un proceso de separación, para ajustar su funcionamiento como una función de dicha información recibida por el procesador común, y en el que las unidades de citometría de flujo responden a las señales de control.

B. Método de separación multicanal B1. Un método multicanal de separación de partículas según una o más características de las partículas, que consiste en: proveer de varias unidades de citometría de flujo; operar dichas unidades de citometría de flujo para llevar a cabo una cantidad de operaciones de citometría de flujo, dichas operaciones comprenden la formación de corrientes de líquido separadas, que cada una contiene una mezcla de partículas y separar las poblaciones deseadas de partículas en dichas mezclas de partículas interrogando las corrientes mediante haces de radiación electromagnética; y 369 compartir al menos uno de los elementos siguientes mientras se llevan a cabo dichas operaciones: (1) un suministro común de partículas para dichas corrientes; (2) una fuente común de radiación electromagnética para dichos haces; (3)una entrada común de control de operaciones; (4) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento de una unidad en relación con otra unidad; (5) un sistema común para dispensar líquido a dichas corrientes; y (6) una cubierta común para dichas unidades de citometría de flujo. B2. El método de B1 en el que dichas partículas son células. B3. El método de B1 en el que dichas partículas son espermatozoides. B4. El método de B1 en el que al menos una de dichas unidades múltiples de citometría de flujo comprende una unidad de citometría de flujo de separación de gotitas de chorro en aire. B5. El método de B1 además comprende compartir al menos dicha fuente común de radiación electromagnética en forma de un haz de luz láser único; dicho método además consiste en dividir el haz de luz láser único en haces múltiples y dirigirlos al interior de los sistemas ópticos de las unidades de citometría de flujo respectivas. B6. El método de B5 que consiste además en reflejar un porcentaje del haz de luz del único haz hacia el sistema óptico de una de dichas unidades de citometría de flujo y pasar un porcentaje del haz de luz del haz único para transmitir al sistema óptico de otra de dichas unidades de 370 citometría de flujo. B7. El método de B6 que consiste además en usar un láser de estado sólido para formar dicho haz de luz láser único. B8. El método de B7 que consiste además en un láser de estado sólido de modo cerrado de manera que el único haz de luz láser consta de muchos pulsos, en el que cada pulso tiene una potencia máxima que es mayor que la potencia de salida promedio del láser. B9. El método de B1 que consiste además en compartir al menos el elemento (6) y dicho método consiste además en instalar de manera desmontable dichas unidades de citometría de flujo en la cubierta común. B10. El método de B1 que consiste además en compartir al menos dicha fuente común de radiación electromagnética en forma de un láser compartido; el método consiste además en los pasos de: emitir una pluralidad de pulsos de radiación electromagnética (EMR) de un láser, en el que la potencia máxima de cada pulso supera la potencia promedio del láser; dirigir cada pulso al interior de un sistema de división y orientación del haz para iluminar intermitentemente cada corriente de líquido y las partículas contenidas allí al dirigir una parte de la energía en los pulsos a lo largo del recorrido del haz desde el láser hasta cada sitio de interrogación detectar EMR de al menos un sitio de interrogación; generar una señal analógica que varía con el tiempo indicativa de la intensidad de la EMR detectada en dicho sitio de interrogación; generar una señal de sincronización indicativa de la llegada de un pulso a dicho sitio de interrogación; transformar la señal analógica que varía con el tiempo en una señal digital; y analizar la señal digital para determinar las características de las partículas en la corriente de líquido que fluye por el sitio de interrogación respectivo. B11. El método de B1 que consiste además en usar una primera estrategia de separación en una primera operación de dichas operaciones y una segunda estrategia de separación diferente a la primera estrategia de separación en una segunda operación de dichas operaciones. B12. El método de B1 que consiste además en recoger una población de las partículas deseadas separadas mediante cada unidad de citometría de flujo y combinar la población recogida de una unidad con la población recogida de una unidad diferente para producir una población combinada de partículas deseadas. B13. El método de B1 que consiste además en variar la velocidad a la que el líquido se dispensa a una o más unidades de citometría de flujo como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de una población separada primero; y (2) la cantidad de partículas deseadas en una segunda población. B14. El método de B1 que consiste además en llevar a cabo dichas operaciones de citometría de flujo en paralelo.

B15. El método de B1 en el que el paso compartido comprende compartir al menos el elemento (4); el método consiste además en usar el procesador común para llevar a cabo al menos alguna de los siguientes: (1) recibir y procesar dicha información en tiempo real; y (2) recibir y procesar dicha información para permitir evaluar el funcionamiento de una unidad con respecto a otra unidad. B16. El método de B1 en el que el paso compartido comprende compartir al menos el elemento (4); el método consiste además en usar un sensor para cada unidad de citometría de flujo respectiva para generar una señal variable en el tiempo indicativa de al menos una característica de las partículas y usar el procesador común para recibir las señales de salida respectivas como una corriente prácticamente continua y para procesar las señales de salida en tiempo real. B17. El método de B1 en el que el paso compartido comprende compartir al menos el elemento (4), el método consiste además en enviar una señal de control a una o más de las unidades de citometría de flujo en tiempo real durante un proceso de separación para ajusfar el funcionamiento de la unidad como una función de la información recibida por el procesador común. C. [Reserved] D. Analizador multicanal D1. Un sistema multicanal para clasificar partículas de acuerdo más características de las partículas, que consta de: una pluralidad de unidades de citometría de flujo cada una de las cuales se puede operar para clasificar partículas de una mezcla de partículas, interrogando a una corriente de líquido que contiene dichas partículas usando un haz de radiación electromagnética, dichas unidades comparten una plataforma integrada que comprende al menos uno de los siguientes elementos: (1) un suministro común de partículas; (2) una cubierta común; (3) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (4) un procesador común para recibir y procesar la información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento de una unidad en relación con otra unidad; y (5) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichas partículas a dichas unidades de citometría de flujo. D2. El sistema de D1 en el que dicha plataforma integrada comprende además una fuente común de radiación electromagnética. D3. El sistema de D1 en el que dichas partículas son células. D4. El sistema de D1 en el que dichas partículas son espermatozoides. D5. El sistema de D1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos los elementos (3) y (4). D6. El sistema de D1 en el que dicha plataforma integrada comprende además una fuente común de radiación electromagnética. D7. El sistema de D1 en el que dicha plataforma integrada comprende además una fuente común de radiación electromagnética, la que consta de un único haz de luz láser. D8. El sistema de D7 que comprende además un sistema divisor del único haz de luz láser en múltiples haces y que dirige los múltiples haces a los sistemas ópticos de las unidades de citometría de flujo respectivas. D9. El sistema de D1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (2), dichas unidades de citometría de flujo constan de módulos intercambiables desmontables instalados en la cubierta. D10. El sistema de D1 en el que cada unidad de citometría de flujo comprende un sistema óptico de epiluminación para interrogar a una corriente de líquido respectiva. D11. El sistema de D1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (4) y en el que dicho procesador se puede operar para producir una indicación de la intensidad de fluorescencia medida por cada unidad. D12. El sistema de D1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (4) y en el que dicho procesador se puede operar para producir una indicación de la velocidad a la que cada unidad está separando partículas. D13. El sistema de D1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (4) y en el que dicho procesador se puede operar para producir una indicación de las variaciones de tinción de las partículas. D14. El sistema de D1 en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (4) y en el que dicho procesador se puede operar para producir una indicación de un límite de decisión usado por cada unidad para discriminar entre partículas. D15. El sistema de D1 en el que dichas unidades de citometría de flujo se adaptan para funcionar en paralelo. D16. El sistema de D1 en el que dicha pluralidad de unidades de citometría de flujo se pueden operar para separar las partículas. D17. El sistema de D16 en el que la plataforma integrada comprende además una fuente común de radiación electromagnética y en el que dicha pluralidad de unidades de citometría de flujo consta de una unidad de citometría de flujo de separación de gotitas chorro en aire. D18. El sistema de D1 , en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (4), y en el que el procesador común se puede operar para llevar a cabo al menos uno de los siguientes: (1) recibir y procesar dicha información en tiempo real; y (2) recibir y procesar dicha información para permitir evaluar el funcionamiento de una unidad con respecto a otra unidad. D19. El sistema de la reclamación D1 en el que dicha unidad de citometría de flujo consta de un sensor que se puede operar para generar una señal de salida variable en el tiempo indicativa de al menos una característica de las partículas, en el que dicha plataforma integrada comprende al menos el elemento (4) y dicha información recibida por el procesador común comprende las señales de salida de los respectivos sensores, y en el que el procesador se puede operar para recibir las señales de salida como una corriente prácticamente continua y para procesar las señales de salida en tiempo real. D20. El sistema de D1 en el que dicha plataforma integrada comprende un procesador común que se puede operar para enviar señales de control a las unidades de citometría de flujo en tiempo real durante un proceso de separación, para ajustar su funcionamiento como una función de dicha información recibida por el procesador común, y en el que las unidades de citometría de flujo responden a las señales de control.

E. Método de análisis multicanal El Un método multicanal de clasificación de partículas según una o más características de las partículas, que consiste en: proveer de una pluralidad de unidades de citometría de flujo; operar dichas unidades de citometría de flujo para llevar a cabo una pluralidad de operaciones de citometría de flujo; dichas operaciones consisten en formar corrientes de líquido independientes, cada una de las cuales contiene una mezcla de partículas, y clasificar las partículas de dichas mezclas de partículas interrogando a las corrientes mediante haces de radiación electromagnética; y compartir al menos uno de los siguientes elementos para llevar a cabo dichas operaciones: (1) un suministro común de partículas para dichas corrientes; (2) una entrada común de control de operaciones; (3) un procesador común para recibir y procesar la información de las unidades para permitir la evaluación de la operación de una unidad en relación con otra unidad; (4) un sistema dispensador de líquido común para dispensar líquido a dichas corrientes; y (5) una cubierta común para dichas unidades de citometría de flujo. E2. El método de E1 que comprende además compartir una fuente común de radiación electromagnética para dichos haces. E3. El método de E2 en el que dicha pluralidad de unidades de citometría de flujo comprende una unidad de citometría de flujo de separación de gotitas de chorro en aire. E4. El método de E1 que consiste además en operar dicha pluralidad de citómetros de flujo para separar dicha mezcla de partículas sobre la base de su clasificación. E5. El método de E1 en el que dichas partículas son células. E6. El método de E1 en el que dichas partículas son espermatozoides. E7. El método de E1 que consiste además en compartir una fuente común de radiación electromagnética para dichos haces en forma de un único haz de luz láser, dividir el único haz de luz láser en múltiples haces y dirigir los múltiples haces al interior de los sistemas ópticos de las unidades de citometría de flujo respectivas. E8. El método de E7 en el que el paso compartido comprende al menos el elemento (5), el método consiste además en orientar dicho haz único de luz láser al interior de dicha cubierta común antes de dividir el haz.

E9. El método de E7 que consiste además en reflejar un porcentaje de luz del único haz de luz hacia el sistema óptico de una de dichas unidades de citometría de flujo y pasar un porcentaje de luz del único haz de luz para su transmisión al sistema óptico de otra de dichas unidades de citometría de flujo. E10. El método de E1 en el que el paso compartido comprende al menos el elemento (5), el método consiste además en instalar de manera desmontable dichas unidades de citometría de flujo en la cubierta común. E11. El método de E1 consiste en operar cada unidad de citometría de flujo para interrogar a una corriente de líquido respectiva usando un sistema óptico de epiluminación. E12. El método de E1 que consiste además en operar dichas unidades de citometría de flujo en paralelo. E13. El método de E1 en que dicha pluralidad de unidades de citometría de flujo comprenden doce o más unidades de citometría de flujo.

F. [Reservado] G. Método de división del haz de luz láser único para citometría multicanal G1. Un método de separación de partículas usando un sistema que comprende tres o más unidades de citometría de flujo, cada una de las cuales se puede operar para separar a una población deseada de partículas de una mezcla de partículas, interrogando a una corriente de líquido que contiene dichas partículas usando un haz de luz; dicho método en consiste en: generar un único haz de luz láser; dividir el único haz en tres o más haces de luz y dirigir los haces de luz al interior de los sistemas ópticos de las unidades de citometría de flujo; y operar las unidades de citometría de flujo para separar las partículas. G2. El método de G1 en el que cada unidad de citometría interroga a la corriente de líquido con un haz de luz de aproximadamente la misma intensidad. G3. El método de G1 en el que cada unidad necesita un haz de luz que tenga una potencia de W vatios y en el que dicho método consiste además en generar dicho haz de luz con una potencia de (W x N) + L, donde N equivale a la cantidad de unidades de citometría de flujo y L equivale a la pérdida de energía del sistema. G4. El método de G1 que consiste además en equilibrar la cantidad de haces de luz usados por las unidades de citometría para interrogar a las corrientes de líquido respectivas, usando uno o más filtros para atenuar la intensidad de al menos uno de dichos tres o más haces de luz. G5. El método de G4 que consiste además en ajustar la intensidad del haz de luz que entra en las unidades respectivas, para que cada unidad reciba la misma cantidad de luz del haz con una tolerancia del 10 %. G6. El método de G1 en el que al menos una de dichas unidades de citometría de flujo usa un proceso de separación de gotitas para separar dichas partículas. G7. El método de G1 en el que al menos una de dichas unidades de citometría de flujo usa un proceso de fotoablación para separar dichas partículas. G8. El método de G1 en el que al menos una de dichas unidades de citometría de flujo usa un proceso de separación por desviación del líquido para separar dichas partículas. G9. El método de G1 en el que dichas unidades de citometría de flujo están montadas en una cubierta común, el método consiste además en orientar dicho único haz de luz láser al interior de dicha cubierta común antes de dividirlo. G10. El método de G9 que consiste además en reflejar un porcentaje de la luz del único haz de luz hacia el sistema óptico de una de dichas unidades de citometría de flujo y pasar un porcentaje de la luz del único haz de luz para su transmisión al sistema óptico de otra de dichas unidades de citometría de flujo. G11. El método de G1 en el que el paso de división de un único haz consiste en dividir un único haz en cuatro haces independientes. G12. El método de G11 en el que el paso de división consiste en usar un divisor del haz 50/50 para dividir el único haz en dos haces, usar un segundo divisor del haz 50/50 para dividir uno de los dos haces en dos haces adicionales y usar un tercer divisor del haz 50/50 para dividir el otro de los dos haces en otros dos haces adicionales. H. Equipo para separación empleando una estrategia de separación H1. En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, la mejora comprende: un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema de separación para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente. H2. El sistema de H1 en el que las partículas son células y las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. H3. El sistema de H1 en el que las partículas son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. H4. El sistema de H3 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva(~X). H5. El sistema de H4 consiste además en mantener la pureza de dicha al menos una población en más de 85 % pero en menos de 95 %. H6. El sistema de H1 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando dicha pureza es mayor que una pureza deseada y disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando dicha pureza es menor que dicha pureza deseada. H7. El sistema de H1 en el que el control determina la pureza de dicha al menos una población sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una pureza deseada y en el que el control varía la velocidad de dispensación de líquido para que la pureza corresponda a la pureza deseada. H8. El sistema de H7 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población es mayor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A en al menos una población y en el que el control disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población es menor que dicha cantidad aceptable. H9. El sistema de H8 en el que el control determina la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una cantidad aceptable de partículas con la característica A en dicha al menos una población y en el que el control varía la velocidad de dispensación del líquido para obtener dicha cantidad aceptable en dicha al menos una población. H10. El sistema de H1 en el que dicha corriente se forma para contener partículas en general una después de la otra en una serie que comprende conjuntos secuenciales de partículas, incluidos primeros conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica A, segundos conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica B y terceros conjuntos de partículas que cada uno comprende dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. H11. El sistema de H10 en el que dicho sistema de separación se puede operar para usar una estrategia de separación en la que dichos primeros conjuntos de partículas son seleccionados para la recolección en dicha al menos una población y dichos segundos y terceros conjuntos de partículas no son seleccionados para la recolección en dicha al menos una población. H12. El sistema de H10 en el que dicho sistema de separación se puede operar para usar una estrategia de separación en la que dichos primeros y terceros conjuntos de partículas son seleccionados para la recolección en dicha al menos una población y dichos segundos conjuntos de partículas no son seleccionados para la recolección en dicha al menos una población. H13. El sistema de H1 en el que dicho sistema de separación comprende un sistema de separación de gotitas. H14. El sistema de H1 en el que dicho sistema de separación comprende un sistema de separación por fotoablación. H15. El sistema de H1 en el que dicho sistema de separación comprende un sistema de separación por desviación del líquido.

I. Método para la separación de partículas usando una estrategia de separación 11 Un método de uso de un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho método consiste en: dispensar un líquido que contiene dichas partículas; formar con el líquido una corriente y usar la citometría de flujo para clasificar las partículas de la corriente según dichas características; separar las partículas de la corriente de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar de ese modo al menos una población que contiene las partículas deseadas; y variar la estrategia de separación o variar la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. 12. El método de 11 en el que las partículas son células y las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. 13. El método de 11 en el que dichas partículas son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. 14. El método de 13 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva(~X). 15. El método de 13 que consiste además en mantener dicha pureza en más de 85 % pero en menos de 95 %. 16 El método de 11 que consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando dicha pureza es mayor que una pureza deseada y disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando dicha pureza es menor que dicha pureza deseada. 17. El método de 11 que consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población es mayor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A en al menos una población y en disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población es menor que dicha cantidad aceptable. 18. El método de R1 consiste además en formar la corriente para contener partículas en general una después de la otra en una serie que comprende conjuntos secuenciales de partículas, que incluye primeros conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica A, segundos conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica B y terceros conjuntos de partículas que cada uno comprende dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. 19. El método de 18 que consiste además en separar dichas partículas según una estrategia de separación en la que sólo se seleccionan los primeros conjuntos de partículas para la recolección en dicha al menos una población. 110. El método de 18 que consiste además en separar dichas partículas según una estrategia de separación en la que se seleccionan primeros y terceros conjuntos de partículas para la recolección en dicha al menos una población. 111. El método de 11 en el que dicha separación comprende usar un proceso de separación de gotitas. 112. El método de 11 en el que dicha separación comprende usar un proceso de separación por fotoablación. 113. El método de 11 en el que dicha separación comprende usar un proceso de separación por desviación del líquido.

J. Separador de gotitas que incluye una estrategia de separación J1. Un sistema para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de: un sistema dispensador de líquido para dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas; un equipo de citometría de flujo para recibir dicha corriente, formar gotitas que contienen dichas partículas, y separar dichas gotitas en diferentes poblaciones según una estrategia de separación, dichas gotitas incluyen primeras gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica A, segundas gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica B y terceras gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica A y uno o más partículas con la característica B; y un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema de separación para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de al menos una población de gotitas en lo que se refiere a las partículas con característica A o a las partículas con característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente. J2. El sistema de J1 en el que el control controla el sistema dispensador de líquido para mantener la velocidad de dispensación del líquido prácticamente constante y en el que el control varía la estrategia de separación. J3. El sistema de J2 en el que el control varía la estrategia de separación a fin de variar el porcentaje de terceras gotitas en una de las poblaciones de gotitas.

J4. El sistema del sistema de J1 en el que el control controla el sistema dispensador de líquido para variar la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de la pureza de dicha al menos una población de gotitas. J5. El sistema de J4 en el que dicha pureza es de por lo menos 85 % y no más de 95 %. J6. El sistema de J1 en el que el control controla el sistema dispensador de líquido para variar la velocidad a la que se dispensa el liquido como una función de la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A en dicha corriente. J7. El sistema de J6 en el que la velocidad a la que se dispensa el líquido se varía para que la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población de gotitas represente por lo menos aproximadamente un 60 % de la cantidad total de partículas con la característica A en dicha corriente. J8. El sistema de J1 en el que dichas partículas son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. J9. El sistema de J1 en el que la relación entre las partículas con la característica A y las partículas con la característica B en dicha mezcla es una relación conocida y en el que dicho control se puede operar para clasificar alguna de las partículas que tienen la característica A o la característica B y para variar la velocidad de dispensación del líquido como una función de la relación entre las partículas clasificadas y la relación conocida. J10. El sistema de J1 en el que el control determina la pureza de las partículas separadas sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una pureza deseada y en el que el control varía la velocidad de modo que la pureza de dicha al menos una población de gotitas corresponda en general a la pureza deseada.

K. Método de separación de gotitas que incluye una estrategia de separación K1. Un método para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consiste en: dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas; formar gotitas que contienen dichas partículas; separar dichas gotitas en diferentes poblaciones según una estrategia de separación, dichas gotitas incluyen primeras gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica A, segundas gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica B y terceras gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica A y una o más partículas con la característica B; y variar la estrategia de separación o variar la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de al menos una población de gotitas en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o partículas con la característica B en al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. K2. El método de K1 que consiste además en mantener la velocidad a la que se dispensa el líquido prácticamente constante, y variar la estrategia de separación. K3. El método de K2 que consiste además en variar la estrategia de separación a fin de variar el porcentaje de terceras gotitas en una de las poblaciones de gotitas. K4. El método de K1 que consiste además en variar la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de la pureza de al menos una de las poblaciones de gotitas. K5. El método de K4 que consiste además en mantener dicha pureza en el intervalo de 85 % a 95 %. K6. El método de K1 que consiste además en variar la velocidad a la que se dispensa el liquido como una función de la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A en dicha corriente. K7. El método de K6 en el que la velocidad a la que se dispensa el líquido se varia para que la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una de las poblaciones de gotitas represente por lo menos aproximadamente un 60 % de la cantidad total de partículas con la característica A en dicha corriente. K8. El método de K1 en el que dichas partículas son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. K9. El método de K1 que consiste además en aumentar la velocidad cuando la pureza de dicha al menos una población gotitas es mayor que la pureza deseada y disminuir la velocidad cuando la pureza de dicha al menos una población de gotitas es menor que la pureza deseada.

L. Separador de gotitas con velocidad de flujo variable que tiene circuito cerrado de retroalimentación L1. Un sistema para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de: un sistema dispensador de líquido de velocidad variable para dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas; un equipo de citometría de flujo para recibir dicha corriente, formar gotitas que contienen dichas partículas, y separar dichas gotitas en diferentes poblaciones según una estrategia de separación, dichas gotitas incluyen primeras gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica A, segundas gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica B y terceras gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica A y una o más partículas con la característica B; y un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la que se dispensa el líquido desde el sistema dispensador de líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de al menos una de las poblaciones de gotitas en lo que se refiere a las partículas con característica A o a las partículas con característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente. L2. El sistema de L1 en el que el control controla el sistema dispensador de líquido para variar la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de la pureza de al menos una de las poblaciones de gotitas. L3. El sistema de L2 en el que la pureza es de por lo menos 85 % y no más de 95 %. L4. El sistema de L1 en el que el control controla el sistema dispensador de líquido para variar la velocidad a la que se dispensa el liquido como una función de la cantidad o porcentaje de partículas con la característica A en al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A en dicha corriente. L5. El sistema de L4 en el que la velocidad a la que se dispensa el líquido se varía para que la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una de las poblaciones de gotitas represente por lo menos aproximadamente un 60 % de la cantidad total de partículas con la característica A en dicha corriente. L6. El sistema de L1 en el que las partículas son células y las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. L7. El sistema de L1 en el que dichas células son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. L8. El sistema de L7 en el que al menos algunas de las gotitas de dicha al menos una población de gotitas contiene al menos una célula X viva y al menos una célula Y en la misma gotita y en el que dicha pureza de dicha al menos una población de gotitas se mide por X/(X+Y). L9. El sistema de L8 en el que dicho control se puede operar para variar la velocidad de dispensación del líquido para mantener dicha pureza en más de 85 % pero en menos de 95 %. L10. El sistema de L7 en el que la característica B es indicativa de células que no son células X vivas.

L 1. El sistema de L7 en el que dicho control se puede operar para variar la velocidad de dispensación del líquido de modo que el porcentaje de células X vivas en dicha al menos una población de gotitas es al menos 60 % de la cantidad total de células X vivas en dichas primeras, segundas y terceras pluralidades de gotitas. L12. El sistema de L11 en el que la pureza de dicha al menos una población de gotitas se mantiene en menos de 95 %. L13. El sistema de L1 en el que la relación entre las partículas con la característica A y las partículas con la característica B en dicha mezcla es una relación conocida y en el que dicho control se puede operar para clasificar alguna de las partículas que tienen la característica A o la característica B y para variar la velocidad de dispensación del líquido como una función de la relación entre las partículas clasificadas y la relación conocida. L14. El sistema de L1 en el que las partículas que tienen la característica A son espermatozoides X vivos y las partículas que tienen la característica B son espermatozoides que no son espermatozoides X vivos, y en el que dicho control se puede operar para variar la velocidad de dispensación del líquido como una función de la relación entre el porcentaje de espermatozoides clasificados y el 50 %. L15. El sistema de L1 en el que el control aumenta la velocidad cuando la pureza de dicha al menos una población de gotitas es mayor que una pureza deseada y disminuye la velocidad cuando la pureza de dicha al menos una población de gotitas es menor que la pureza deseada. L16. El sistema de L1 en el que el control determina la pureza de dichas partículas separadas sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una pureza deseada y en el que el control varía la velocidad de modo que la pureza de dicha al menos una población de gotitas corresponda en general a la pureza deseada.

M. Método de separación de gotitas que usa velocidad de flujo variable y retroalimentación M1. Un sistema para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consiste en: dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas; formar gotitas que contienen dichas partículas; separar dichas gotitas en diferentes poblaciones según una estrategia de separación, dichas gotitas incluyen primeras gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica A, segundas gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica B y terceras gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica A y una o más partículas con la característica B; y variar la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de al menos una de las población de gotitas en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o partículas con la característica B en al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. M2. El método de M1 que consiste además en variar la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de la pureza de al menos una de las poblaciones de gotitas. 3. El método de M2 en el que dicha pureza es de por lo menos 85 % y no más de 95 % 4. El método de M1 que consiste además en variar la velocidad a la que se dispensa el liquido como una función de la cantidad de partículas con la característica A en al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A en dicha corriente. M5. El método de M4 que consiste además en variar la velocidad a la que se dispensa el líquido para que la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una de las poblaciones de gotitas represente por lo menos aproximadamente 60 % de la cantidad total de partículas con la característica A en dicha corriente. M6. El método de M1 en el que las partículas son células y las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. M7. El método de M1 en el que dichas células son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. 8. El método de M7 en el que al menos algunas de las gotitas de dicha al menos una población de gotitas contiene al menos una célula X viva y al menos una célula Y en la misma gotita y en el que dicha pureza de dicha al menos una población de gotitas se mide por X/(X+Y). M9. El método de M8 que consiste además en variar la velocidad de dispensación del líquido para mantener dicha pureza a más de 85% pero menos de 95%. M10. El método de M7 en el que la característica B es indicativa de células que no son células X vivas. M11. El método de M7 que consiste además en variar la velocidad de dispensación del líquido de modo que el porcentaje de células X vivas en dicha al menos una población de gotitas es al menos 60 % de la cantidad total de células X vivas en dichas primeras, segundas y terceras pluralidades de gotitas. M12. El método de M11 que consiste además en mantener la pureza de dicha al menos una población de gotitas en menos de 95 %. M13. El método de M1 en el que la relación entre las partículas con la característica A y las partículas con la característica B en dicha mezcla es una relación conocida y dicho método consiste además en variar la velocidad de dispensación del líquido como una función de la relación entre las partículas clasificadas y la relación conocida. M14. El método de M1 en el que las partículas que tienen la característica A son espermatozoides X vivos y las partículas que tienen la característica B no son espermatozoides X vivos, dicho método consiste además en variar la velocidad de dispensación del líquido como una función de la relación entre los espermatozoides clasificados y el 50 %. M15. El método de M1 que consiste además en aumentar la velocidad cuando la pureza de dicha al menos una población de gotitas es mayor que la pureza deseada y disminuir la velocidad cuando la pureza de dicha al menos una población de gotitas es menor que la pureza deseada.

N. Sistema de separación de esperma para una estrategia de separación de pureza elevada N1. Un sistema para separar espermatozoides X y espermatozoides Y, dicho sistema consta de: un sistema dispensador de líquido de velocidad variable para dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides X e Y; un equipo de citometría de flujo para (1) recibir dicha corriente y formar gotitas que contienen dichas partículas, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides Y y una tercera pluralidad de gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X y uno o más espermatozoides Y, (2) separar dichas primeras gotitas de dichas segundas y terceras gotitas, (3) recoger dichas primeras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides X y (4) identificar una cantidad de espermatozoides X en al menos una población; y un control que responda a las instrucciones recibidas del citómetro de flujo para variar la velocidad a la que se dispensa el líquido al citómetro de flujo como una función de la cantidad de espermatozoides X identificados en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de espermatozoides X en dichas primeras, segundas y terceras gotitas. N2. El sistema de N1 en el que dicho equipo de citometría de flujo se puede operar para identificar la cantidad de células X recogidas en dicha al menos una población y en el que el control varía la velocidad a la que se dispensa el líquido al citómetro de flujo para mantener la cantidad de células X recogidas en dicha al menos una población en una cantidad aceptable o por encima de una cantidad aceptable en relación con el número total de células X en dichas primeras, segundas y terceras gotitas. N3. El sistema de N2 en el que dicha cantidad aceptable es al menos 60 % de dicha cantidad total de células X. N4. El sistema de N3 en el que dichas células X son espermatozoides X vivos. N5. El sistema de N2 en el que el control se puede operar para aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de células X en dicha al menos una población está por encima de dicha cantidad aceptable y para disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de células X en dicha al menos una población está por debajo de dicha cantidad aceptable. 0. Método de separación de esperma que incluye una estrategia de separación de pureza elevada 01. Un método para separar espermatozoides X y espermatozoides Y, dicho sistema consiste en: dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides X e Y a una primera ubicación y hacer que dicha corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides Y y una tercera pluralidad de gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X y uno o más espermatozoides Y; separar dichas primeras gotitas de dichas segundas y terceras gotitas; recoger dichas primeras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides X; identificar una cantidad de espermatozoides X recogidos en dicha al menos una población; y variar la velocidad a la que se dispensa el líquido a dicha primera ubicación como una función de la cantidad de espermatozoides X identificados recogidos en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de células X en dichas primeras, segundas y terceras gotitas. 02. El método de 01 que consiste además en variar la velocidad a la que se dispensa el líquido a dicha primera ubicación para mantener la cantidad de células X recogidas en dicha al menos una población en una cantidad aceptable o por encima de una cantidad aceptable en relación con la cantidad total de células X en dichas primeras, segundas y tercera gotitas. 03. El método de 02 en el que dicha cantidad aceptable es al menos 60 % de dicha cantidad total de células X. 04. El método de 03 en el que dichas células X son células X vivas. 05. El método de 01 que consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad o el porcentaje de células X en dicha al menos una población está por encima de dicha cantidad aceptable y para disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad o porcentaje de células X en dicha al menos una población está por debajo de dicha cantidad aceptable.

P. Separador de esperma para una estrategia de separación de alta recuperación P1. El sistema para separar espermatozoides X y espermatozoides Y, dicho sistema consta de: un sistema dispensador de líquido de velocidad variable para dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides X e Y; un citómetro de flujo para (1) recibir dicha corriente y formar gotitas que contienen dichas partículas, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides Y y una tercera pluralidad de gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X y uno o más espermatozoides Y, (2) separar dichas primeras y terceras gotitas de dichas segundas gotitas, (3) recoger dichas primeras y terceras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides X y (4) identificar una cantidad de espermatozoides Y en al menos una población; y un control que responda a las instrucciones recibidas del citómetro de flujo para variar la velocidad a la que se dispensa el líquido al citómetro de flujo como una función de la cantidad de espermatozoides Y identificados en dicha al menos una población. P2. El sistema de P1 en el que dicho control varía la velocidad a la que se dispensa el líquido al sistema del citómetro de flujo para mantener la pureza de dicha al menos una población en una pureza deseada o por encima de una pureza deseada. P3. El sistema de P2 en el que dicho control se puede operar para aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza de dicha al menos una población es mayor que dicha pureza deseada y para disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza es menor que dicha pureza deseada. P4. El sistema de P2 en el que dicha pureza deseada no es mayor que 95 %. P5. El sistema de P2 en el que dichos espermatozoides X son células vivas.

Q. Método de separación de esperma que incluye una estrategia de separación de alta recuperación Q1. Un método para separar espermatozoides X y espermatozoides Y, dicho sistema consiste en: dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides X e Y a una primera ubicación y hacer que dicha corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides Y y una tercera pluralidad de gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X y uno o más espermatozoides Y; separar dichas primeras y terceras gotitas de dichas segundas gotitas; recoger dichas primeras y terceras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides X; identificar una cantidad de espermatozoides Y recogidos en dicha al menos una población; y variar la velocidad a la que se dispensa el líquido a dicha primera ubicación como una función de la cantidad de espermatozoides Y identificados recogidos en dicha al menos una población. Q2. El método de Q1 que consiste además en variar la velocidad a la que se dispensa el líquido para mantener la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las células X en una pureza deseada o por encima de una pureza deseada. Q3. El método de Q2 que consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza de dicha al menos una población es mayor que dicha pureza deseada y disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza es menor que dicha pureza deseada. Q4. El método de Q2 en el que dicha pureza deseada no es mayor que 95 %. Q5. El método de Q2 en el que dichos espermatozoides X son células vivas. Q6. Un método para separar espermatozoides X y espermatozoides Y utilizando citometría de flujo, dicho método consiste en: dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides X e Y a una primera ubicación y hacer que dicha corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides Y y una tercera pluralidad de gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X y uno o más espermatozoides Y; separar dichas primeras y terceras gotitas de dichas segundas gotitas; y recoger dichas primeras y terceras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides X. Q7. El método de Q6 en el que dichos espermatozoides X son células vivas y no células X muertas. Q8. Un método para separar espermatozoides X y espermatozoides Y utilizando citometría de flujo, dicho método consiste en: dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides X e Y y hacer que dicha corriente se rompa en gotitas; interrogar a la corriente de líquido antes de que se rompa en gotitas para identificar cuáles espermatozoides residirán en qué gotitas; separar gotitas que contienen espermatozoides X de gotitas no que contienen espermatozoides X; y recoger dichas gotitas que contienen espermatozoides X, incluidas gotitas que contienen al menos un espermatozoide X y al menos un espermatozoide Y. Q9. El método de Q8 en el que dichos espermatozoides X son células vivas y no células X muertas.

R. Separación por fotoablación que incluye una estrategia de separación R1. En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación que consta de un láser para extirpar partículas seleccionadas de la corriente de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, la mejora comprende: un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el láser para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha ai menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A no extraídas o de partículas con la característica B no extraídas en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente.

R2. El sistema de R1 en el que las partículas son células y las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. R3. El sistema de R1 en el que dichas células son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. R4. El sistema de R3 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva(~X). R5. El sistema de R1 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza de dicha al menos una población es mayor que una pureza deseada y disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza es menor que dicha pureza deseada. R6. El sistema de R1 en el que el control determina dicha pureza sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una pureza deseada, y en el que el control varía la velocidad de dispensación del líquido para obtener la pureza deseada. R7. El sistema de R1 en el que dicha corriente se forma en una corriente que contiene partículas en general una después de la otra en una serie que comprende conjuntos secuenciales de partículas, incluidos primeros conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica A, segundos conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica B y terceros conjuntos de partículas que cada uno comprende dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. R8. El sistema de R7 en el que dicho láser extirpa sólo los segundos conjuntos de partículas. R9. El sistema de R8 en el que dicho control mantiene la pureza de dicha al menos una población en más de 85 % pero en menos de 95 %. R10. El sistema de R7 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva (~X) y dicho láser se puede operar para extirpar los segundos conjuntos de partículas y los terceros conjuntos de partículas de la corriente. R11. El sistema de R10 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población es mayor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A no extirpadas en al menos una población, y en el que el control disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población es menor que dicha cantidad aceptable. R12. El sistema de R10 en el que el control determina la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una cantidad aceptable de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población, y en el que el control varía la velocidad de dispensación del líquido para obtener la cantidad aceptable de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población.

S. Método de separación por fotoablación que incluye una estrategia de separación S1. Un método de uso de un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho método consiste en: dispensar un líquido que contiene dichas partículas; formar con el líquido una corriente y usar la citometría de flujo para clasificar las partículas de la corriente según dichas características; separar las partículas de la corriente extirpando las partículas seleccionadas de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar de ese modo al menos una población que contiene las partículas deseadas; y variar la estrategia de separación o variar la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas o partículas con la característica B no extirpadas en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. S2. El método de S1 en el que las partículas son células y las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. 53. El método de S1 en el que dichas células son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. 54. El método de S1 que consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza de dicha al menos una población es mayor que una pureza deseada y disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza es menor que la pureza deseada. S5. El método de S1 que consiste además en formar con dicho líquido una corriente que contiene partículas en general una después de la otra en una serie que comprende conjuntos secuenciales de partículas, que incluye primeros conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica A, segundos conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica B y terceros conjuntos de partículas que cada uno comprende dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. 56. El método de S5 que consiste además en extirpar los segundos conjuntos de partículas y no los primeros ni los terceros conjuntos de partículas. 57. El método de S6 que consiste además en mantener la pureza de dicha al menos una población en más de 85 % pero en menos de 95 %. 58. El método de S5 que consiste además en extirpar los segundos y terceros conjuntos de partículas y no los primeros conjuntos de partículas. 59. El método de S8 que consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población es mayor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A no extirpadas en al menos una población y en disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población es menor que dicha cantidad aceptable.

T. Separador por fotoablación que tiene velocidad de flujo variable y retroalimentación T1. En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido de velocidad variable para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometria de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometria de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación que consta de un láser para extirpar partículas seleccionadas de la corriente de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, la mejora comprende: un control que responde a la información recibida del equipo de citometria de flujo para controlar el láser para que varíe la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A no extraídas o de partículas con la característica B no extraídas en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente. T2. El sistema de T1 en el que las partículas son células y las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. T3. El sistema de T2 en el que dichas células son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. T4. El sistema de T3 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva(~X) y dicho láser extirpa sólo los segundos conjuntos de partículas. T5. El sistema de T4 consiste además en mantener la pureza de dicha al menos una población en más de 85 % pero en menos de 95 %. T6. El sistema de T2 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva(~X) y en el que dicho láser extirpa los segundos y terceros conjuntos de partículas. 17. El sistema de T1 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza de al menos una población es mayor que la pureza deseada y disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza es menor que la pureza deseada. T8. El sistema de T1 en el que el control determina una pureza de al menos una población sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una pureza deseada, y en el que el control varía la velocidad de dispensación del líquido para obtener la pureza deseada. T9. El sistema de T8 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población es mayor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A en dicha al menos una población y en el que el control disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A en al menos una población es menor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A en al menos una población. T10. El sistema de T8 en el que el control determina la cantidad total de partículas con la característica A en dicha al menos una población sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una cantidad aceptable de partículas con la característica A en al menos una población, y en el que el control varía la velocidad de modo que la cantidad de partículas con la característica A en al menos una población es dicha cantidad o porcentaje aceptables. T11. El sistema de T1 en el que dicha corriente se forma en una corriente que contiene partículas en general una después de la otra en una serie que comprende conjuntos secuenciales de partículas, incluidos primeros conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica A, segundos conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica B y terceros conjuntos de partículas que cada uno comprende dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. T12. El sistema de T11 en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo (X), en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva (~X), en el que el láser extirpa los segundos conjuntos de partículas y terceros conjuntos de partículas y no el primer conjunto de partículas y en el que el control varía la velocidad a la que se dispensa el líquido al citómetro de flujo como una función de la cantidad de espermatozoides X vivos en al menos una población. T13. El sistema de T11 en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo (X), en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva (~X), en el que el láser extirpa los segundos conjuntos de partículas y no los primeros y terceros conjuntos de partículas y en el que el control varía la velocidad a la que se dispensa el líquido al sistema de citómetro de flujo como una función de la cantidad de espermatozoides ~X vivos en dicha al menos una población.

U. Método de separación por fotoablación que incluye una estrategia de separación de velocidad de flujo variable U1. Un método de uso de un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho método consiste en: dispensar un líquido que contiene dichas partículas; formar con el líquido una corriente y usar la citometría de flujo para clasificar las partículas de la corriente según dichas características; separar las partículas de la corriente extirpando las partículas seleccionadas de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar de ese modo al menos una población que contiene las partículas deseadas; y variar la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas o partículas con la característica B no extirpadas en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. U2. El método de U1 en el que las partículas son células y las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. U3. El sistema de U2 en el que dichas células son espermatozoides y la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. U4. El método de U3 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva(~X) y dicho láser extirpa sólo los segundos conjuntos de partículas. U5. El método de U4 que consiste además en mantener la pureza de dicha al menos una población en más de 85 % pero en menos de 95 %. U6. El método de U2 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva(~X) y en el que dicho láser extirpa los segundos y terceros conjuntos de partículas.

U7. El método de U1 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza de al menos una población es mayor que la pureza deseada y disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza es menor que la pureza deseada. U8. El sistema de U1 en el que el control determina una pureza de al menos una población sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una pureza deseada, y en el que el control varía la velocidad de dispensación del líquido para obtener la pureza deseada. U9. El sistema de U8 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población es mayor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A en dicha al menos una población y en el que el control disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A en al menos una población es menor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A en al menos una población. U10. El sistema de U8 en el que el control determina la cantidad total de partículas con la característica A en dicha al menos una población sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una cantidad aceptable de partículas con la característica A en al menos una población, y en el que el control varía la velocidad de modo que la cantidad de partículas con la característica A en al menos una población es dicha cantidad o porcentaje aceptables. U11. El sistema de U1 en el que dicha corriente se forma en una corriente que contiene partículas en general una después de la otra en una serie que comprende conjuntos secuenciales de partículas, incluidos primeros conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica A, segundos conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica B y terceros conjuntos de partículas que cada uno comprende dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. U12. El sistema de U11 en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo (X), en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva (~X), en el que el láser extirpa los segundos conjuntos de partículas y terceros conjuntos de partículas y no el primer conjunto de partículas y en el que el control varía la velocidad a la que se dispensa el líquido al citómetro de flujo como una función de la cantidad de espermatozoides X vivos en al menos una población. U13. El sistema de U11 en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo (X), en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva (~X), en el que el láser extirpa los segundos conjuntos de partículas y no los primeros y terceros conjuntos de partículas y en el que el control varía la velocidad a la que se dispensa el líquido al sistema del citómetro de flujo como una función de la cantidad de espermatozoides ~X vivos en dicha al menos una población.

V. Separador de partículas por desviación del líquido que incluye una estrategia de separación V1. En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación por desviación del líquido para separar partículas seleccionadas de la corriente de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, la mejora comprende: un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema de separación por desviación del líquido para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente. V2. El sistema de V1 en el que las partículas son células y las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. V3. El sistema de V1 en el que dichas células son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. V4. El sistema de V3 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva(~X). V5. El sistema de V1 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza de dicha al menos una población es mayor que una pureza deseada y disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza es menor que la pureza deseada. V6. El sistema de V1 en el que el control determina dicha pureza sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una pureza deseada, y en el que el control varía la velocidad de dispensación del líquido para obtener la pureza deseada. V7. El sistema de V1 en el que dicha corriente se forma en una corriente que contiene partículas en general una después de la otra en una serie que comprende conjuntos secuenciales de partículas, incluidos primeros conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica A, segundos conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica B y terceros conjuntos de partículas que cada uno comprende dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. V8. El sistema de V7 en el que dicho láser extirpa sólo los segundos conjuntos de partículas. V9. El sistema de V8 en el que dicho control mantiene la pureza de dicha al menos una población en más de 85 % pero en menos de 95 %. V10. El sistema de V7 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva (~X) y dicho láser se puede operar para extirpar los segundos conjuntos de partículas y los terceros conjuntos de partículas de la corriente. V11. El sistema de V10 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población es mayor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A no extirpadas en al menos una población, y en el que el control disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población es menor que dicha cantidad aceptable. V12. El sistema de V10 en el que el control determina la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una cantidad aceptable de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población, y en el que el control varía la velocidad de dispensación del líquido para obtener la cantidad aceptable de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población.

W. Método de separación por desviación del liquido que incluye una estrategia de separación W1. Un método de uso de un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho método consiste en: dispensar un líquido que contiene dichas partículas; formar con el líquido una corriente y usar la citometría de flujo para clasificar las partículas de la corriente según dichas características; separar las partículas de la corriente desviando las partículas de la corriente seleccionadas de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar de ese modo al menos una población que contiene las partículas deseadas; y variar la estrategia de separación o variar la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. W2. El método de W1 en el que las partículas son células y en el que las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. W3. El método de W1 en el que dichas células son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. W4. El método de W1 que consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza de dicha al menos una población es mayor que una pureza deseada y disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza es menor que la pureza deseada. W5. El método de W1 que consiste además en formar con dicho líquido una corriente que contiene partículas en general una después de la otra en una serie que comprende conjuntos secuenciales de partículas, que incluye primeros conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica A, segundos conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica B y terceros conjuntos de partículas que cada uno comprende dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. W6. El método de W5 que consiste además en extirpar los segundos conjuntos de partículas y no los primeros ni los terceros conjuntos de partículas. W7. El método de W6 que consiste además en mantener la pureza de dicha al menos una población en más de 85 % pero en menos de 95 %. W8. El método de W5 que consiste además en extirpar los segundos y terceros conjuntos de partículas y no los primeros conjuntos de partículas. W9. El método de W8 que consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población es mayor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A no extirpadas en al menos una población y en disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población es menor que dicha cantidad aceptable.

X. Separador por desviación del líquido que incluye una estrategia de separación de velocidad de flujo variable XI . En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación por desviación del líquido para separar partículas seleccionadas de la corriente de acuerdo con dicha clasificación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, la mejora comprende: un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente. X2. El sistema de X1 en el que las partículas son células y las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. X3. El sistema de X1 en el que dichas células son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. X4. El sistema de X3 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva(~X). X5. El sistema de X1 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza de dicha al menos una población es mayor que una pureza deseada y disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza es menor que la pureza deseada. X6. El sistema de X1 en el que el control determina dicha pureza sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una pureza deseada, y en el que el control varía la velocidad de dispensación del líquido para obtener la pureza deseada. X7. El sistema de X1 en el que dicha corriente forma una corriente que contiene partículas en general una después de la otra en una serie que comprende conjuntos secuenciales de partículas, incluidos primeros conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica A, segundos conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica B y terceros conjuntos de partículas que cada uno comprende dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. X8. El sistema de X7 en el que dicho láser extirpa sólo los segundos conjuntos de partículas. X9. El sistema de X8 en el que dicho control mantiene la pureza de dicha al menos una población en más de 85 % pero en menos de 95 %. X10. El sistema de X7 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva (~X) y dicho láser se puede operar para extirpar los segundos conjuntos de partículas y los terceros conjuntos de partículas de la corriente. X11. El sistema de X10 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población es mayor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A no extirpadas en al menos una población, y en el que el control disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población es menor que dicha cantidad aceptable. X12. El sistema de X10 en el que el control determina la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una cantidad aceptable de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población, y en el que el control varía la velocidad de dispensación del líquido para obtener la cantidad aceptable de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población.

Y. Método de separación por desviación del líquido que incluye velocidad de flujo variable y retroalimentación Y1. Un método de uso de un sistema de ciíometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho método consiste en: dispensar un líquido que contiene dichas partículas; formar con el líquido una corriente y usar la citometría de flujo para clasificar las partículas de la corriente según dichas características; separar las partículas de la corriente desviando las partículas de la corriente seleccionadas de acuerdo con dicha clasificación para proporcionar de ese modo al menos una población que contiene las partículas deseadas; y variar la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. Y2. El método de Y1 en el que las partículas son células y en el que las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. Y3. El método de Y1 en el que dichas células son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. Y4. El método de Y1 que consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza de dicha al menos una población es mayor que una pureza deseada y disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando la pureza es menor que la pureza deseada. Y5. El método de Y1 que consiste además en formar con dicho líquido una corriente que contiene partículas en general una después de la otra en una serie que comprende conjuntos secuenciales de partículas, que incluye primeros conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica A, segundos conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica B y terceros conjuntos de partículas que cada uno comprende dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. Y6. El método de Y5 que consiste además en extirpar los segundos conjuntos de partículas y no los primeros ni los terceros conjuntos de partículas.

Y7. El método de Y6 que consiste además en mantener la pureza de dicha al menos una población en más de 85 % pero en menos de 95 %. Y8. El método de Y5 que consiste además en extirpar los segundos y terceros conjuntos de partículas y no los primeros conjuntos de partículas. Y9. El método de Y8 que consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población es mayor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A no extirpadas en al menos una población y en disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A no extirpadas en dicha al menos una población es menor que dicha cantidad aceptable.

Z. [Reservado] AA. Convertidor AJO para las señales de salida PMT y análisis v clasificación DSP AA1 . En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, la mejora comprende: un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida analógica que varía con el tiempo de dicho equipo de citometría de flujo y proporciona una salida que incluye información digital, correspondiente a dicha salida analógica que varía con el tiempo, en el que dicha salida analógica que varía con el tiempo y su correspondiente información digital son indicativas de la característica A o la característica B; un procesador de señal digital que analiza y clasifica la información digital y proporciona una señal de separación a dicho sistema de separación como una función de la información digital analizada y clasificada. AAIA. El sistema de AA1 en el que la salida analógica que varía con el tiempo comprende una serie de pulsos de onda, cada uno de los cuales es representativo de la característica de una partícula, en el que el procesador de señal digital detecta porciones de la información digital correspondiente a los pulsos de onda y clasifica dichas porciones detectadas y en el que el procesador de señal digital proporciona dicha señal de separación como una función de dichas porciones detectadas y clasificadas. AAIB. El sistema de AA1 que consta además de un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema de separación para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente. AA2. El sistema de AA1B en el que las partículas son células y las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. AA3. El sistema de AA1B en el que las partículas son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. AA4. El sistema de AA3 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva(~X). AA5. El sistema de AA4 consiste además en mantener la pureza de dicha al menos una población en más de 85 % pero en menos de 95 %. AA6. El sistema de AA1 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando dicha pureza es mayor que una pureza deseada y disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando dicha pureza es menor que dicha pureza deseada.

AA7. El sistema de AA1 en el que el control determina la pureza de dicha al menos una población sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una pureza deseada y en el que el control varía la velocidad de dispensación del líquido para que la pureza corresponda a la pureza deseada. AA8. El sistema de AA7 en el que el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población es mayor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A en al menos una población y en el que el control disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población es menor que dicha cantidad aceptable. AA9. El sistema de AA8 en el que el control determina la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una cantidad aceptable de partículas con la característica A en dicha al menos una población y en el que el control varía la velocidad de dispensación del líquido para obtener dicha cantidad aceptable en dicha al menos una población. AA10. El sistema de AA1 en el que dicha corriente se forma para contener partículas en general una después de la otra en una serie que comprende conjuntos secuenciales de partículas, incluidos primeros conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica A, segundos conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica B y terceros conjuntos de partículas que cada uno comprende dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de las cuales tiene la característica B. AA11. El sistema de AA10 en el que dicho sistema de separación se puede operar para usar una estrategia de separación en la que dichos primeros conjuntos de partículas son seleccionados para la recolección en dicha al menos una población y dichos segundos y terceros conjuntos de partículas no son seleccionados para la recolección en dicha al menos una población. AA12. El sistema de AA10 en que dicho sistema de separación se puede operar para usar una estrategia de separación en la que dichos primeros y terceros conjuntos de partículas son seleccionados para la recolección en dicha al menos una población y dicho segundo conjunto de partículas no es seleccionado para la recolección en dicha al menos una población. AA13. El sistema de AA1 en el que dicho sistema de separación comprende un sistema de separación de gotitas. AA14. El sistema de AA1 en el que dicho sistema de separación comprende un sistema de separación por fotoablación.

AA15. El sistema de AA1 en el que dicho sistema comprende un sistema de separación por desviación del líquido. AA16. El sistema de AA1 en el que dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para detectar pulsos correspondientes a la información digital, instrucciones para extraer características de los pulsos detectados e instrucciones para discriminar los pulsos detectados como una función de sus características extraídas. AA17. El sistema de AA16 en el que dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para definir un límite de decisión que discrimina entre las características extraídas que representan las características A y las características extraídas que representan la característica B. AA18. El sistema de AA17 en el que dicho procesador de señal digital ajusta la ubicación relativa del límite de decisión en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica A y en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica B como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o las partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. AA19. El sistema de AA1 en el que dicho procesador de señal digital comprende un procesador de manejo de datos para ensamblar la información digital en una corriente continua. AA20. El sistema de AA1 en el que dicho procesador de señal digital comprende un procesador de detección de pulsos para detectar pulsos de onda representados por la información digital y en el que dicho procesador de señal digital clasifica la información digital como una función de los pulsos de onda detectados. AA21. El sistema de AA20 que consta además de un filtro para filtrar la salida analógica a una frecuencia igual o menor que la mitad de la velocidad continua de toma de muestras del convertidor, en el que el convertidor convierte la salida analógica filtrada en la información digital correspondiente y en el que dicho procesador de señal digital clasifica la información digital como una función de un límite de discriminación. AA22. El sistema de AA21 en el que la velocidad continua de toma de muestras es casi 105 MHz o más alto. AA23. El sistema de AA1 en el que dicho procesador de señal digital comprende un procesador de extracción y discriminación de características para definir un límite de decisión que discrimine entre las características extraídas que representan la características A y las características extraídas que representan la característica B y en el que el procesador de extracción y discriminación de características extrae características representadas por dicha información digital y clasifica las características como una función del límite de decisión. AA24. El sistema de AA1 en el que dicho procesador de señal digital comprende un procesador de separación que responde a la clasificación para proporcionar las señales de separación a dicho sistema de clasificación. AA25. El sistema de AA1 en el que el procesador enumera la cantidad de partículas clasificadas que tienen la característica A o que tienen la característica B. AA26. El sistema de AA1 en el que dicho procesador de señal digital clasifica la información digital como una función de reducción de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica A para que sea prácticamente igual o menor que una cantidad preseleccionada o como una función de reducción al mínimo de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica B para que sea prácticamente igual o menor que una cantidad preseleccionada. AA27. El sistema de AA26 en el que la cantidad preseleccionada es aproximadamente 1 ,5 % o menor. AA27a. El sistema de AA26 en el que la cantidad preseleccionada es aproximadamente 1 ,3% o menor. AA28. El sistema de AA1 en el que dicho procesador de señal digital clasifica la información digital de tal manera que una población de las partículas que tienen la característica A y una población de las partículas que tienen la característica B corresponden a un modelo de computadora de tres poblaciones que incluye una primera población modelo de partículas que tienen la característica A, una segunda población modelo de partículas que tienen la característica B y una tercera población modelo de partículas no alineadas, dicho modelo estima las estadísticas poblacionales de cada una de las primera, segunda y tercera poblaciones modelo. AA29. El sistema de AA28 en el que la tercera población modelo comprende dos poblaciones de partículas no alineadas y en el que el modelo estima las estadísticas poblacionales para las dos poblaciones. AA30. El sistema de AA1 en el que dicho procesador de señal digital comprende un procesador de detección de pulsos para detectar pulsos de onda representados por la información digital y en el que dicho procesador de señal digital clasifica la información digital como una función de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica A o como una función de un coeficiente de variación de una población de las partículas que tienen la característica B. AA30a. El sistema de AA30 que consta además de un filtro para filtrar la salida analógica a una frecuencia igual o menor que la mitad de la velocidad continua de toma de muestras del convertidor, en el que el convertidor convierte la salida analógica filtrada en la información digital correspondiente y en el que dicho procesador de señal digital clasifica la información digital como una función de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica A o como una función de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica B. AA30b. El sistema de AA1 en el que dicho procesador de señal digital consta de un procesador de extracción y discriminación de características para definir un límite de decisión que discrimine entre las características extraídas que representan las características A y las características extraídas que representan la característica B y en el que el procesador de extracción y discriminación de características extrae las características representadas por dicha información digital y clasifica las características como una función de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica o como una función de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica B. AA31. Un método de uso de un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho método consiste en: dispensar un líquido que contiene dichas partículas; formar una corriente con el líquido y usar citometría de flujo para detectar las partículas de la corriente según dichas características; separar las partículas de la corriente y de acuerdo con una estrategia de separación proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas; convertir una salida analógica de dicha citometría de flujo en la información digital correspondiente en que la salida analógica es indicativa de la característica A o la característica B; y analizar y clasificar la información digital y separar las partículas como una función de la información digital analizada y clasificada. AA31A. El método de AA31 que consiste además en variar la estrategia de separación o variar la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. AA32. El método de AA31 en el que las partículas son células y las características A y B están relacionadas con las características físicas de las células. AA33. El método de AA31 en el que dichas partículas son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. AA34. El método de AA33 en el que la característica B es indicativa de una cosa diferente de una célula X viva(~X). AA35. El método de AA33 que consiste además en mantener dicha pureza en más de 85 % pero en menos de 95 %. AA36. El método de AA31 que consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando dicha pureza es mayor que una pureza deseada y disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando dicha pureza es menor que dicha pureza deseada. AA37. El método de AA31 que consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población es mayor que una cantidad aceptable de partículas con la característica A en al menos una población y en disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población es menor que dicha cantidad aceptable. AA38. El método de AA31 que consiste además en formar la corriente para contener partículas en general una después de la otra en una serie que comprende conjuntos secuenciales de partículas, que incluye primeros conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica A, segundos conjuntos de partículas que cada uno comprende una o más partículas con la característica B y terceros conjuntos de partículas que cada uno comprende dos o más partículas muy juntas al menos una de las cuales tiene la característica A y al menos una de los cuales tiene la característica B. AA39. El método de AA38 que consiste además en separar dichas partículas según una estrategia de separación en la que sólo se seleccionan los primeros conjuntos de partículas para la recolección en dicha al menos una población. AA40. El método de AA38 que consiste además en separar dichas partículas según una estrategia de separación en la que se seleccionan primeros y terceros conjuntos de partículas para la recolección en dicha al menos una población. AA41. El método de AA31 en el que dicha separación comprende usar un proceso de separación de gotitas. AA42. El método de AA31 en el que dicha separación comprende usar un proceso de separación porfotoablación. AA43. El método de AA31 en el que dicha separación comprende usar un proceso de separación por desviación del líquido. AA44. El método de AA31 que consiste además en detectar pulsos de onda representados por la información digital, que extraen las características de los pulsos de onda de la Información digital, y discriminar los pulsos de onda detectados como una función de sus características extraídas. AA45. El método de AA44 que consiste además en definir un límite de decisión que discrimine entre las características extraídas que representan las características A y las características extraídas que representan la característica B. AA46. El método de AA45 que consiste además en ajustar la ubicación relativa del límite de decisión en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica A y en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica B como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o las partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. AA47. El método de AA31 en el que dicha conversión comprende tomar muestras sincrónicamente de la salida analógica. AA48. El método de AA31 en el que clasificar la información digital consiste en clasificar la información digital como una función de reducción al mínimo de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica A para que sea prácticamente igual o menor que una cantidad preseleccionada o como una función de reducción al mínimo de un coeficiente de variación de una población de las partículas que tienen la característica B para que sea prácticamente igual o menor que una cantidad preseleccionada. AA49. El sistema de AA48 en el que la cantidad preseleccionada es aproximadamente 1 ,5 % o menor. AA50. El método de AA31 en el que clasificar la información digital consiste en clasificar la información digital de tal manera que una población de las partículas que tienen la característica A y una población de partículas que tienen la característica B correspondan a un modelo de computadora de tres poblaciones que incluye una primera población modelo de partículas que tienen la característica A, una segunda población modelo de partículas que tienen la característica B y una tercera población modelo de partículas no alineadas, dicho modelo estima la estadística poblacional de cada una de las primera, segunda y tercera poblaciones modelo. AA51. El método de AA31 en el que clasificar la información digital consiste en clasificar la información digital como una función de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica A o como una función de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica B.

BB. Determinación de los parámetros iniciales de detección BB1. En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, la mejora comprende: un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida analógica que varía con el tiempo de dicho equipo de citometría de flujo y proporciona una salida que incluye información digital, correspondiente a dicha salida analógica que varía con el tiempo, en el que dicha salida analógica que varía con el tiempo y su correspondiente información digital son indicativas de la característica A o la característica B; un procesador de señal digital que determina las características de fondo de dicha salida analógica que varía con el tiempo de dicha información digital; detectar pulsos de onda representados por dicha información digital como una función de dichas características de fondo determinadas; y proporcionar una señal de separación a dicho sistema de separación como una función de los pulsos de onda detectados. BB2. El sistema de la reclamación BB1 en el que dicho procesador de señal digital emplea un procedimiento iterativo para determinar un umbral de detección de pulsos para definir las características de fondo, dicho procedimiento iterativo incluye: calcular los estimados de la estadística de fondo a partir de la información digital; usar los estimados calculados para aplicar una lógica de detección de pulsos a dicha información digital a fin de identificar los pulsos indicativos de la característica A o la característica B; volver a calcular los estimados sin usar la información digital correspondiente a los pulsos identificados; y repetir el procedimiento anterior hasta que los estimados de la estadística de fondo converjan o ocurra una cantidad máxima fija de iteraciones.

BB3. El sistema de BB1 en el que dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para detectar pulsos de onda representados por la información digital, instrucciones para extraer características de los pulsos detectados e instrucciones para discriminar los pulsos detectados como una función de sus características extraídas. BB4. El sistema de BB3 en el que dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para definir un límite de decisión que discrimine entre las características extraídas que representan las características A y las características extraídas que representan la característica B. BB5. El sistema de BB4 en el que dicho procesador de la señal digital ajusta la ubicación relativa del límite de la decisión en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica A y en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica B como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o las partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. BB6. El sistema de BB1 que consta además de un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema de separación para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente. BB7. El sistema de B1 en el que dicho procesador de la señal digital comprende un procesador de detección de pulsos para detectar pulsos de onda representados por la información digital y en el que dicho procesador de la señal digital clasifica la información digital como una función de los pulsos de onda detectados. BB8. El sistema de BB7 que consta además de un filtro para filtrar la salida analógica a una frecuencia igual o menor que la mitad de una velocidad de toma de muestras del convertidor, y en el que el convertidor convierte la salida analógica filtrada en la información digital correspondiente.

CC. Generar los parámetros iniciales de discriminación CC1. En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo con dicha clasificación y. según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, la mejora comprende: un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida analógica que varía con el tiempo de dicho equipo de citometría de flujo y proporciona una salida que incluye información digital, correspondiente a dicha salida analógica que varía con el tiempo, en el que dicha salida analógica que varía con el tiempo y su correspondiente información digital son indicativas de la característica A o la característica B; y un procesador de señal digital que genera parámetros iniciales de discriminación a partir de la información digital, discrimina la información digital como una función de los parámetros iniciales de discriminación, y proporciona una señal de separación a dicho sistema de separación como una función de la información digital discriminada. CC2. El sistema de la reclamación CC1 en el que el procesador de señal digital emplea al menos uno de los siguientes algoritmos para generar los parámetros de discriminación iniciales: k-medias, k-medias difusas y aglomeración jerárquica acumulativa. CC3. El sistema de CC1 en el que dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para detectar pulsos de onda representados por la información digital, instrucciones para extraer características de los pulsos de onda detectados e instrucciones para discriminar los pulsos de onda detectados como una función de sus características extraídas. CC4. El sistema de CC3 en el que dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para definir un límite de decisión que discrimina entre las características extraídas que representan las características A y las características extraídas que representan la característica B. CC5. El sistema de CC4 en el que dicho procesador de la señal digital ajusta la ubicación relativa del límite de la decisión en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica A y en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica B como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o las partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. CC6. El sistema de CC1 que consta además de un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema de separación para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B, y (2) la cantidad de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente.

DD. Tomar sincrónicamente muestras de los pulsos de onda para clasificar DD1. En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de: un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, y un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formarlo en una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características; un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida analógica que varía con el tiempo que comprende una serie de pulsos de onda de dicho equipo de citometría de flujo y proporciona una salida que incluye información digital, correspondiente a dichos pulsos de onda, en el que dichos pulsos de onda y su correspondiente información digital son indicativas de la característica A o la característica B; y un procesador de señal digital que analiza la información digital y que clasifica la partícula como una función de la información digital analizada correspondiente a ella. DD2. El sistema de la reclamación DD1 en el que dicho procesador digital emplea un umbral de detección para definir los pulsos de onda y en que dicho umbral de detección es una función de un estimado promedio de fondo y una desviación estándar de la información digital calculada dentro de una ventana móvil de muestras que terminan con la muestra actual. DD3. El sistema de la reclamación DD1 en el que el control digital emplea un análisis estadístico de detección de anomalías y en el que la información digital anómala desde el punto de vista estadístico de las características de fondo de la información digital se considera parte de un pulso digital. DD4. El sistema de DD1 en el que dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para detectar pulsos correspondientes a la información digital, instrucciones para extraer características de los pulsos detectados e instrucciones para discriminar los pulsos detectados como una función de sus características extraídas. DD5. El sistema de DD4 en el que dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para definir un límite de decisión que discrimine entre las características extraídas que representan las características A y las características extraídas que representan la característica B. DD6. El sistema de DD5 en el que dicho procesador de la señal digital ajusta la ubicación relativa del límite de la decisión en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica A y en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica B como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o las partículas con la característica B en al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. DD7. El sistema de DD1 que consta además de un filtro para filtrar la salida analógica a una frecuencia igual o menor que la mitad de una velocidad de toma de muestras del convertidor, y en el que el convertidor convierte la salida analógica filtrada en la información digital correspondiente. DD8. El sistema de DD1 que consta además de un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema de separación para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente.

DD9. El sistema de DD1 en el que el procesador enumera la cantidad de partículas clasificadas que tienen la característica A o que tienen la característica B. DD10. El sistema de DD1 que consta además de un dispositivo de iluminación de pulsos en sincronización con una toma de muestras sincrónica para iluminar las partículas para producir los pulsos de onda correspondientes. DD11. El sistema de DD10 en el que dicho procesador de señal digital comprende un procesador de detección de pulsos para detectar pulsos de onda representados por la información digital y en el que dicho procesador de señal digital clasifica la información digital como una función de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica A o como una función de un coeficiente de variación de una población de las partículas que tienen la característica B.

EE. Extracción de características EE1. En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, la mejora comprende: un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida analógica que varía con el tiempo de dicho equipo de citometría de flujo y proporciona una salida que incluye información digital, correspondiente a dicha salida analógica que varía con el tiempo, en el que dicha salida analógica que varía con el tiempo y su correspondiente información digital son indicativas de la característica A o la característica B; un procesador de señal digital que extrae características a partir de la información digital y proporciona una señal de separación a dicho sistema de separación como una función de las características extraídas. EE2. El equipo de la reclamación EE1 en el que la característica extraída corresponde a una o más de las características siguientes: el área del pulso, el pico del pulso, el área interna del pulso, el ancho del pulso, la correlación gaussiana del pulso, el pico retardado dei pulso o la pendiente del pulso. EE3. El equipo de la reclamación EE2 en el que la característica extraída comprende una aproximación de una derivada o pendiente del pulso en un punto del pulso en relación con una altura de pico promedio del pulso. EE4. El equipo de la reclamación EE3 en el que dicho punto a lo largo del pulso corresponde a un punto en el que hay una diferencia entre una primera derivada de un pulso producido por partículas que tienen la característica A y una primera derivada de un pulso producido por partículas que tienen la característica B. EE5. El equipo de la reclamación EE3 en el que la salida analógica que varía con el tiempo corresponde a un pulso de emisión de fluorescencia por parte de las partículas y en el que dicho punto a lo largo del pulso corresponde a un punto en el cual una diferencia entre una primera derivada de un pulso producido por las partículas que tienen la característica A y una primera derivada de un pulso producido por las partículas que tienen la característica B está en un máximo o próximo a él. EE6. El equipo de la reclamación EE3 en el que la salida analógica que varía con el tiempo corresponde a un pulso de emisión de fluorescencia de las partículas y en el que dicho punto a lo largo del pulso es una función de la altura de pico de los pulsos de emisión de fluorescencia. EE7. El equipo de EE1 en el que dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para detectar pulsos de forma de onda representados por la información digital, instrucciones para extraer características de los pulsos de onda detectados e instrucciones para discriminar los pulsos de onda detectados como una función de sus características extraídas. EE8. El equipo de EE7 en el que dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para definir un límite de decisión que discrimine entre las características extraídas que representan las características A y las características extraídas que representan la característica B.

EE9. El equipo de EE8 en el que dicho procesador de señal digital ajusta la ubicación relativa del límite de decisión en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica A y en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica B como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o las partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. EE10. El equipo de EE1 que consta además de un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema de separación para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A p de partículas con la característica B en dicha corriente. EE11. El equipo de EE1 en el que dicho procesador de señal digital comprende un procesador de detección de pulsos para detectar pulsos de onda representados por la información digital y para clasificar los pulsos de onda detectados. EE12. El equipo de EE11 que consta además de un filtro para filtrar la salida analógica a una frecuencia igual o menor que la mitad de una velocidad de toma de muestras del convertidor, y en el que el convertidor convierte la salida analógica filtrada en la información digital correspondiente.

FF. Discriminar pulsos de onda FF1. En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, la mejora comprende: un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida analógica que varía con el tiempo que comprende pulsos de onda de dicho equipo de citometría de flujo y proporciona una salida que incluye información digital, correspondiente a dichos pulsos de onda, en el que dichos pulsos de onda y su correspondiente información digital son indicativas de la característica A o la característica B; un procesador de señal digital que discrimina la información como indicativa de la característica A o como indicativa de la característica B y proporciona una señal de separación a dicho sistema de separación como una función de la información digital discriminada. FF2. El equipo de FF1 en el que dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para detectar pulsos de onda representados por la información digital, instrucciones para extraer características en los pulsos de onda detectados e instrucciones para discriminar los pulsos de onda detectados como una función de sus características extraídas. FF3. El equipo de FF2 en el que dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para definir un límite de decisión que discrimine entre las características extraídas que representan las características A y las características extraídas que representan la característica B. FF4. El equipo de FF3 en el que dicho procesador de la señal digital ajusta la ubicación relativa del límite de decisión en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica A y en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica B como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o las partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha corriente. FF5. El equipo de FF1 en el que dicho procesador de la señal digital comprende un procesador de detección de pulsos para detectar pulsos de onda correspondientes a la información digital y en el que dicho procesador de la señal digital clasifica la información digital como una función de los pulsos de onda detectados. FF6. El equipo de FF5 que consta además de un filtro para filtrar la salida analógica a una frecuencia igual o menor que la mitad de una velocidad de toma de muestras del convertidor, y en el que el convertidor convierte la salida analógica filtrada en la información digital correspondiente. FF7. El equipo de FF1 que consta además de un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema de separación para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente. FF8. El equipo de FF1 que consta además de un dispositivo de iluminación de pulsos en sincronización con una toma de muestras sincrónica para ¡luminar las partículas para producir los pulsos de onda correspondientes. FF9. El equipo de FF8 en el que dicho procesador de señal digital comprende un procesador de detección de pulsos para detectar pulsos de onda representados por la información digital y en el que dicho procesador de señal digital clasifica la información digital como una función de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica A o como una función de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica B.

GG. Sensor de división de arreglo de DEL GG1. Un equipo para usar con una corriente continua de líquido que se está dividiendo en gotitas en un sitio de división, que comprende: una fuente de luz colocada en un lado de la corriente para iluminarla; un arreglo de diodos lineal colocado en el otro lado de la corriente adaptado para estar orientado a lo largo de un eje prácticamente paralelo a la corriente, dicho arreglo de diodos adaptado para detectar luz de la fuente de iluminación que pasa a través de la corriente y dicho arreglo de diodos adaptado para proporcionar una señal de salida correspondientes a la luz detectada; un control para recibir la señal de salida y proporcionar una señal de ubicación correspondiente a una ubicación del sitio de división.

GG2. El equipo de GG1 que comprende además una pantalla para proveer de una presentación que indique la ubicación del sitio de división. GG3. El equipo de GG1 que consta además de un transductor que aplica una fuerza a la corriente para variar la ubicación del sitio de división, dicho transductor varía una amplitud de la fuerza como una función de una señal de entrada y en el que la señal de ubicación del detector se proporciona al transductor como la señal de entrada. GG4. El equipo de GG3 que comprende además una tabla de consulta para especificar las variaciones de la amplitud de la fuerza aplicada a la corriente como una función de la ubicación del sitio de división.

HH. Sensor de división de citometría de flujo HH1. En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, la mejora comprende: una fuente de luz colocada en la segunda ubicación en un lado de la corriente para iluminarla; un arreglo de diodos lineal colocado en la segunda ubicación en el otro lado de la corriente adaptado para estar orientado a lo largo de un eje prácticamente paralelo a la corriente, dicho arreglo de diodos adaptado para detectar luz de la fuente de iluminación que pasa a través de la corriente y dicho arreglo de diodos adaptado para proporcionar una señal de salida correspondientes a la luz detectada; y un control para recibir la señal de salida indicativa de una posición de la segunda ubicación, dicho control que varia el funcionamiento de dicho transductor como una función de la señal de producción. HH2. El equipo de HH1 que consta además de un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema de separación para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o de partículas con la característica B en dicha corriente. HH3. El equipo de HH1 que comprende además una pantalla para proveer de una presentación que indique la ubicación del sitio de división. HH4. El equipo de HH1 que consta además de un transductor que aplica una fuerza a la corriente para variar la ubicación del sitio de división, dicho transductor varía una amplitud de la fuerza como una función de una señal de entrada y en el que la señal de ubicación del detector se proporciona al transductor como la señal de entrada. HH5. El equipo de HH4 que comprende además una tabla de consulta para especificar las variaciones de la amplitud de la fuerza aplicada a la corriente como una función de la ubicación del sitio de división.

II. Separador de gotitas que tiene óptica de epiluminación III . El equipo para separar partículas contenidas en una corriente de líquido según una o más características de las partículas, dicho sistema consta de: un equipo de citometría de flujo para dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas a una primera ubicación y para provocar que la corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dicho equipo de citometría de flujo se puede operar usando citometría de flujo para clasificar las partículas según dichas características y para separar dichas gotitas según la clasificación de las partículas contenidas en las gotitas; dicho equipo de citometría de flujo que consta de un sistema óptico de epiluminación incluida una lente de enfoque, dicho sistema de óptica se puede operar para dirigir un haz de luz láser a través de dicha lente de enfoque en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza la corriente de líquido en dicha primera ubicación de modo que dichas células pasen a través del haz, provocando emisiones de radiación electromagnética desde las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás. 112. El equipo de 111 en el que dichas partículas son células. 113. El equipo de 111 en el que dichas partículas son espermatozoides. II4. El sistema de II3 en el que dicho haz es enfocado por dicho sistema óptico como mancha luminosa en la corriente de líquido en dicha primera ubicación, dicha mancha luminosa tiene una forma generalmente elíptica con una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, siendo dicho ancho menor que la longitud de la cabeza de un espermatozoide que pasa a través de la mancha luminosa. 115. El equipo de II3 en el que dicho sistema óptico incluye un único fotodetector en la parte trasera de dicha lente de enfoque para detectar dichas emisiones. 116. El equipo de !I1 en el que dicho equipo de citometría de flujo consta además de una boquilla que tiene una superficie interior configurada para ejercer una fuerza en las partículas que tiende a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que pasen a través de dicho haz. 117. El equipo de 114 en el que dicha boquilla se puede rotar alrededor de un eje longitudinal de la boquilla para ajustar dicha orientación deseada de la partícula en relación con el eje del haz. 118. El equipo de 111 en el que dicho equipo de citometría de flujo consta de una boquilla orientada para dirigir la corriente de líquido en una dirección ascendente, no vertical. 119. El equipo de 111 en el que dicha boquilla tiene una superficie exterior recubierta con una capa no reflectora ni emisora. 1110. El equipo de 111 en el que dicho sistema óptico incluye un único fotodetector en la parte trasera de dicha lente de enfoque para detectar dichas emisiones. 1111. El equipo de 111 en el que dicho equipo de citometría de flujo comprende una boquilla que tiene un orificio y un tubo capilar que se extiende desde el orificio a través del cual se dispensa dicha corriente de líquido hasta dicha primera ubicación. 1112. El equipo de II9 en el que dicha primera ubicación está dentro de dicho tubo capilar. 1113. El sistema de 111 en el que dicho equipo de citometría de flujo consta de una pluralidad de unidades de citometría de flujo que se pueden operar para analizar simultáneamente múltiples corrientes de líquido, cada unidad de citometría de flujo comprende dicho sistema óptico de epiluminación.

JJ. Método de separación de partículas usando óptica de epiluminación JJ1. Un método para separar partículas contenidas en una corriente de líquido según una o más características de las partículas, dicho sistema consiste en: dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas a una primera ubicación y provocar que la corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación; y usar un proceso de citometría de flujo para clasificar las partículas según dichas características y separar dichas gotitas según la clasificación de las partículas contenidas en ellas, dicho proceso de citometría de flujo consiste en dirigir un haz de luz láser a través de una lente de enfoque en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza la corriente de líquido en dicha primera ubicación de modo que dichas células pasen a través del haz, provocando emisiones de radiación electromagnética por parte de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás. JJ2. El método de JJ1 en el que dichas partículas son células. JJ3. El método de JJ1 en el que dichas partículas son espermatozoides. JJ4. El método de JJ3 en el que el paso de dispensación de una corriente de líquido consiste en dirigir dicha corriente a través de un orificio de la boquilla que tiene un diámetro de 50 a 70 micrómetros a una presión de 20-40 psi (1.406 a 2.812 kg/cm2) y a una velocidad de 30.000 a 50.000 espermatozoides por segundo. JJ5. El método de JJ3 que consiste además en enfocar dicho haz en dicha corriente de líquido como una mancha luminosa de forma generalmente elíptica con una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, siendo dicho ancho menor que la longitud de la cabeza de un espermatozoide que pasa a través de la mancha luminosa del haz. JJ6. El método de JJ5 en el que la cabeza de dicho espermatozoide incluye una región de ADN que tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente y en el que dicho ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicha región de ADN. JJ7. El método de JJ3 que consiste además en generar una pluralidad de corrientes de líquido independientes que cada una contiene espermatozoides y, para cada una de tales corrientes, llevar a cabo los pasos (a) (b). JJ8. El método de JJ7 que consiste además en usar un haz común de luz láser para iluminar dichas corrientes de líquido. JJ9. El método de JJ1 que consiste además en ejercer una fuerza sobre las partículas que tiende a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que pasen a través de dicho haz. JJ10. El método de JJ4 que consiste además en hacer fluir la corriente de líquido a través de una boquilla configurada para ejercer dicha fuerza y rotar la boquilla alrededor de un eje longitudinal de la boquilla para ajusfar dicha orientación deseada de la partícula en relación con el eje del haz. JJ11. El método de JJ1 en el que dicho proceso de citometría de flujo consiste además en usar un solo fotodetector para detectar la emisión de radiación electromagnética.

KK. Separador por fotoablación que tiene óptica de epiluminación KK1. El equipo para separar partículas contenidas en una corriente de líquido según una o más características de las partículas, dicho sistema consta de: un equipo de citometría de flujo para dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas a una primera ubicación, clasificar las partículas según dichas características, y separar dichas partículas según dicha clasificación en al menos una población que contiene partículas deseadas; y un láser para extirpar partículas en dicha corriente, dicho equipo de citometría de flujo que consta de un sistema óptico de epiluminación incluida una lente de enfoque, dicho sistema de óptica se puede operar para dirigir un haz de luz láser a través de dicha lente de enfoque en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza la corriente de líquido en dicha primera ubicación de modo que dichas células pasen a través del haz, provocando emisiones de radiación electromagnética desde las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás. KK2. El equipo de KK1 en el que dichas partículas son células. KK3. El equipo de KK2 en el que dichas partículas son espermatozoides. KK4. El equipo de KK1 en el que dicho equipo de citometría de flujo consta además de una boquilla que tiene una superficie interior configurada para ejercer una fuerza en las partículas que tiende a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que pasen a través de dicho haz. KK5. El equipo de KK4 en el que dicha boquilla se puede rotar alrededor de un eje longitudinal de la boquilla para ajustar dicha orientación deseada de la partícula en relación con el eje del haz. KK6. KK1 (copiar reclamaciones AA2 etc.) LL Método de separación de partículas usando óptica de epiluminación y fotoablación LL1. Un método para separar partículas contenidas en una corriente de líquido según una o más características de las partículas, dicho sistema consiste en: usar un proceso de citometría de flujo para clasificar las partículas de una corriente de líquido según dichas características y para clasificar dichas partículas según dicha clasificación de partículas; y extirpar partículas de dicha corriente de líquido, dicho proceso de citometría de flujo consiste en dirigir un haz de luz láser a través de una lente de enfoque en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza la corriente de líquido de modo que dichas células pasen a través del haz, dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás.

MM. Separador de esperma que tiene óptica de epiluminación MM1. Un sistema para separar espermatozoides según las características de ADN cromosómico, que consta de: un equipo de citometría de flujo para dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas a una primera ubicación y para hacer que la corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dicho equipo de citometría de flujo se puede operar usando citometría de flujo para clasificar las células de acuerdo con dichas características de ADN y para separar dichas gotitas según la clasificación de las células contenidas en las gotitas, dicho equipo de citometría de flujo que consta de un sistema óptico de epiluminación incluida una lente de enfoque, dicho sistema óptico se puede operar para dirigir un haz de luz láser a través de dicha lente de enfoque en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza la corriente de líquido en dicha primera ubicación de modo que dichas células pasen a través del haz, dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás. MM2. El sistema de MM1 en el que dicho sistema óptico consta además de un fotodetector en dicho eje del haz en la parte trasera de dicha lente de enfoque que se puede operar para detectar y convertir al menos alguna de dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de ADN. MM3. El sistema de MM1 en el que dichas gotitas se separan en primeras gotitas cada una de las cuales contiene al menos un espermatozoide X vivo y segundas gotitas cada una de las cuales contiene al menos una célula Y. MM4. El sistema de MM3 en el que al menos alguna de las primeras gotitas contiene una célula X viva y una célula Y viva. MM5. El sistema de MM1 en el que dicho equipo de citometría de flujo consta de una boquilla que tiene una superficie interior configurada para ejercer una fuerza en ¡as células que tiende a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que pasen a través de dicho haz. M6. El sistema de MM5 en el que dicha boquilla se puede rotar alrededor de un eje longitudinal de la boquilla para ajustar dicha orientación deseada de la célula en relación con el eje del haz. MM7. El sistema de MM1 en el que dicho eje del haz cruza la corriente de líquido en un ángulo de incidencia oblicuo con respecto a un eje longitudinal de la corriente en dicha primera ubicación. M8. El sistema de MM1 en el que dicho haz es enfocado por dicho sistema óptico como una mancha luminosa en la corriente de líquido en dicha primera ubicación, dicha mancha luminosa tiene una forma generalmente elíptica con una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, siendo dicho ancho menor que la longitud de la cabeza de un espermatozoide que pasa a través de la mancha luminosa del haz. MM9. El sistema de MM8 en el que la cabeza de dicho espermatozoide incluye una región de ADN que tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente y en el que dicho ancho del impacto de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicha región de ADN. MM10. El sistema de MM1 en el que dicho equipo de citometría de flujo consta de una pluralidad de unidades de citometría de flujo que se pueden operar para analizar simultáneamente múltiples corrientes de líquido, cada unidad de citometría de flujo comprende dicho sistema óptico de epiluminación.

MM11. El sistema de MM1 en el que dicho equipo de citometría de flujo consta de una boquilla orientada para dirigir la corriente de líquido en una dirección ascendente, no vertical. MM12. El sistema de MM1 en que dicho sistema óptico incluye un solo fotodetector para detectar dichas emisiones. MM13. El sistema de M 1 que consta además de un recolector para recoger al menos dichas primeras gotitas. MM14. El sistema de MM1 en el que dicho equipo de citometría de flujo comprende una boquilla que tiene un orificio y un tubo capilar que se extiende desde el orificio a través del cual se dispensa dicha corriente de líquido hasta dicha primera ubicación. MM15. El equipo de MM14 en el que dicha primera ubicación está dentro de dicho tubo capilar. MM16. El sistema de MM15 en el que dicho sistema óptico está ópticamente acoplado a dicho tubo capilar para transmitir el haz al interior de la corriente que fluye a través del tubo.

NN. Método de separación de esperma usando óptica de epiluminación NN1. Un método de separación de espermatozoides de animales según sus características de ADN cromosómico, que consta de los pasos siguientes: (a) dispensar una corriente de líquido que contiene dichas células a una primera ubicación y hacer que la corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación; (b) dirigir un haz de luz láser a través de una lente de enfoque en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza la corriente de líquido en dicha primera ubicación, de modo que dichas células pasen a través del haz provocando emisiones de radiación electromagnética por parte de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás; (c) detectar y transformar al menos algunas de dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de ADN; (d) procesar dichas señales eléctricas y clasificar las células según dichas características de ADN; y (e) separar dichas gotitas según la clasificación de las células contenidas en las gotitas. NN2. El método de NN1 en el que dichas gotitas se separan en primeras gotitas cada una de las cuales contiene al menos un espermatozoide X vivo y segundas gotitas cada una de las cuales contiene al menos una célula Y. NN3. El método de NN2 en el que al menos alguna de las primeras gotitas contiene una célula X viva y una célula Y viva. NN4. El método de NN1 en el que el paso (a) consiste en dirigir dicha corriente a través de un orificio de boquilla que tiene un diámetro de 50 a 70 micrómetros a una presión de 20-40 psi (1.406 a 2.812 kg/cm2) y a una velocidad de 30.000 a 50.000 espermatozoides por segundo. NN5. El método de NN1 que consiste además en ejercer una fuerza sobre las células que tiende a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que pasen a través de dicho haz. NN6. El método de NN5 en el que dichos espermatozoides tienen cabezas con caras anchas y bordes estrechos y en el que dicha orientación deseada es una donde el haz choca contra dichas caras anchas. NN7. El método de NN6 en el que dicho paso de dispensación de líquido consiste en dirigir dicha corriente a través de una boquilla y en el que el método consiste además en rotar la boquilla alrededor de un eje longitudinal de la boquilla para ajustar dicha orientación deseada de las célula en relación con el eje del haz. NN8. El método de NN1 que consiste además en enfocar dicho haz en dicha corriente de líquido como una mancha luminosa de forma generalmente elíptica con una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, siendo dicho ancho menor que la longitud de la cabeza de un espermatozoide que pasa a través de la mancha luminosa del haz. NN9. El método de NN8 en el que la cabeza de dicho espermatozoide incluye una región de ADN que tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente y en el que dicho ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicha región de ADN. NN10. El método del método de NN5 en el que el paso (d) consiste en desviar al menos dichas primeras gotitas. NN11. El método de NN1 que consiste además en dirigir al menos algunas de dichas emisiones a través de un sistema filtrante que incluye un filtro espacial que tiene una apertura con dimensiones de longitud y ancho, al menos una de dichas dimensiones es regulable para variar el tamaño de la apertura. NN12. El método de NN1 que consiste además en dirigir dicha corriente de líquido a lo largo de una trayectoria ascendente no vertical. NN13. El método de NN1 que consiste además en generar una pluralidad de corrientes de líquido independientes que cada una contiene espermatozoides y, para cada una de tales corrientes, llevar a cabo los pasos (a,) (b), (c) y (d). NN13A. El método de NN13 que consiste además en usar un haz común de luz láser para iluminar dichas corrientes de líquido. NN14. El método de NN13 en el que dichas corrientes de líquido contienen líquido de un suministro común de líquido. NN15. El método de NN1 en el que dicha corriente de líquido se dispensa a dicha primera ubicación a través de un tubo capilar. 00. Analizador de esperma que tiene óptica de epiluminación 001. Equipo para clasificar espermatozoides de animal por las características de ADN cromosómico, que consta de: un sistema de boquilla para dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides a una primera ubicación y para ejercer una fuerza sobre los espermatozoides que tienda a hacerlos virar en una orientación deseada antes de que la corriente alcance dicha primera ubicación; un sistema óptico de epiluminación para dirigir un haz de radiación electromagnética en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza dicha corriente de líquido en dicha primera ubicación en un ángulo de incidencia distinto de 0 grados, de modo que dichas células pasen a través del haz dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás; un fotodetector que se puede operar para detectar y transformar al menos algunas de dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de ADN; un procesador para procesar dichas señales eléctricas y clasificar las células según dichas características de ADN. 002. El equipo de OO1 en el que dicho sistema de boquilla forma parte de un sistema de separación de células de gotitas. 003. El equipo de OO1 en el que dicho sistema de boquilla forma parte de un sistema de separación de células por fotoablación. 004. El equipo de OO1 en el que dicho sistema de boquilla forma parte de un sistema de separación de células por desviación del líquido. 005. El equipo de 001 en el que dicho sistema óptico consta además de un fotodetector en dicho eje del haz en la parte trasera de dicha lente de enfoque que se puede operar para detectar y convertir al menos alguna de dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de ADN. 006. El equipo de 001 en el que dicho equipo de citometría de flujo consta además de una boquilla que tiene una superficie interior configurada para ejercer una fuerza en las células que tiende a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que pasen a través de dicho haz. 007. El equipo de 006 en el que dicha boquilla se puede rotar alrededor de un eje longitudinal de la boquilla para ajusfar dicha orientación deseada de la célula en relación con el eje del haz. 008. El equipo de 001 en el que dicho eje del haz cruza la corriente de líquido en un ángulo de incidencia oblicuo en relación con un eje longitudinal de la corriente en dicha primera ubicación. 009. El equipo de 001 en el que dicho haz es enfocado por dicho sistema óptico como una mancha luminosa en la corriente de líquido en dicha primera ubicación, dicha mancha luminosa tiene una forma generalmente elíptica con una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, siendo dicho ancho menor que la longitud de la cabeza de un espermatozoide que pasa a través de la mancha luminosa del haz. 0010. El equipo de 009 en el que la cabeza de dicho espermatozoide incluye una región de ADN que tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente y en el que dicho ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicha región de ADN. 0011. El equipo de 001 en el que dicho equipo de citometría de flujo consta de una pluralidad de unidades de citometría de flujo que se pueden operar en paralelo para analizar simultáneamente múltiples corrientes de líquido, cada unidad de citometría de flujo comprende dicho sistema óptico de epiluminación. 0012. El equipo de 001 en el que dicho sistema de boquilla consta de una boquilla orientada para dirigir la corriente de líquido en una dirección ascendente, no vertical. 00 3. El equipo de 001 en el que dicho sistema óptico incluye sólo un fotodetector para detectar dichas emisiones. 0014. El equipo de 001 en el que dicho equipo de citometría de flujo comprende una boquilla que tiene un orificio y un tubo capilar que se extiende desde el orificio a través del cual se dispensa dicha corriente de líquido hasta dicha primera ubicación. 0015. El equipo de 0014 en el que dicha primera ubicación está dentro de dicho tubo capilar. 0016. El equipo de 0015 en el que dicho sistema óptico está ópticamente acoplado a dicho tubo capilar para transmitir el haz al interior de la corriente que fluye a través del tubo.

PP. Método de análisis de esperma usando óptica de epiluminación PP1. Un método de clasificación de espermatozoides de animales según sus características de ADN cromosómico, que consta de los pasos siguientes: (a) dispensar una corriente de líquido que contenga espermatozoides a una primera ubicación y ejercer una fuerza sobre los espermatozoides que tienda a hacerlos virar en una orientación deseada antes de que la corriente alcance dicha primera ubicación; (b) dirigir un haz de radiación electromagnética en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza dicha corriente de líquido en dicha primera ubicación en un ángulo de incidencia distinto de 0 grados de modo que dichas células pasen a través del haz, dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás; (c) detectar y transformar al menos algunas de dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de ADN; y (d) procesar dichas señales eléctricas y clasificar las células según dichas características de ADN. PP2. El método de PP1 que consiste además en separar dichas células según dichas características de ADN. PP3. El método de PP1 que consiste además en usar un proceso de separación por fotoablación para separar dichas células. PP4. El método de PP1 que consiste además en usar un proceso de separación por desviación del líquido para separar dichas células. PP5. El método de PP1 que consiste además en usar un proceso de separación de gotitas para separar dichas células. PP6. El método de PP1 en el que el paso (a) consiste en dirigir dicha corriente a través de un orificio de la boquilla que tiene un diámetro de 50 a 70 micrómetros a una presión de 20-40 psi (1.406 a 2.812 kg/cm2) y a una velocidad de 30.000 a 50.000 espermatozoides por segundo. PP7. El método de PP1 que consiste además en ejercer una fuerza sobre los espermatozoides que tienda a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que pasen a través de dicho haz. PP8. El método de PP7 en el que dichos espermatozoides tienen cabezas con caras anchas y bordes estrechos y en el que dicha orientación deseada es una donde el haz choca contra dichas caras anchas. PP9. El método de PP8 en el que dicho paso de dispensación de líquido consiste en dirigir dicha corriente a través de una boquilla y en el que el método consiste además en rotar la boquilla alrededor de un eje longitudinal de la boquilla para ajustar dicha orientación deseada de las célula en relación con el eje del haz. PP10. El método de PP1 que consiste además en enfocar dicho haz en dicha corriente de líquido como una mancha luminosa de forma generalmente elíptica con una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, siendo dicho ancho menor que la longitud de la cabeza de un espermatozoide que pasa a través de la mancha luminosa del haz. PP11. El método de PP10 en el que la cabeza de dicho espermatozoide incluye una región de ADN que tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente y en el que dicho ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicha región de ADN. PP12. El método de PP1 que consiste además en dirigir al menos algunas de dichas emisiones a través de un sistema filtrante que incluye un filtro espacial que tiene una apertura con dimensiones de longitud y ancho, al menos una de dichas dimensiones es regulable para variar el tamaño de la apertura. PP13. El método de PP1 que consiste además en dirigir dicha corriente de líquido a lo largo de una trayectoria ascendente no vertical. PP14. El método de PP1 que consiste además en generar una pluralidad de corrientes de líquido independientes que cada una contenga espermatozoides y, para cada una de tales corrientes, llevar a cabo los pasos (a,) (b), (c) y (d). PP15. El método de PP14 que consiste además en usar un haz común de luz láser para iluminar dichas corrientes de líquido. PP16. El método de PP14 en el que dichas corrientes de líquido contienen líquido de un suministro común de líquido. PP17. El método de PP1 en el que dicha corriente de líquido se dispensa a dicha primera ubicación a través de un tubo capilar.

QQ. Analizador de partículas que tiene óptica de epiluminación y ángulo de incidencia oblicuo QQ1. El equipo para analizar las partículas contenidas en una corriente de líquido, consta de: un sistema óptico de epiluminación para dirigir un haz de radiación electromagnética en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza dicha corriente de líquido en un ángulo de incidencia oblicuo en relación con un eje longitudinal de la corriente de líquido; dicho sistema de epiluminación que incluye una lente de enfoque en dicha trayectoria del eje del haz para enfocar dicho haz de radiación electromagnética en la corriente de líquido como una mancha, dichas partículas se adaptan para pasar a través de dicha mancha lo que da lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las partículas dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás; y un fotodetector en la parte trasera de la lente de enfoque para detectar y convertir al menos alguna de dichas emisiones en señales eléctricas a ser procesadas para obtener información con respecto a dichas partículas. QQ2. El equipo de QQ1 en el que dicho ángulo de incidencia se encuentra en el intervalo de 5 a 45 grados. QQ3. El equipo de QQ1 en el que dicho ángulo de incidencia se encuentra en el intervalo de 15 a 30 grados. QQ4. El equipo de QQ1 en el que dichas partículas son células y en el que dicha información está relacionada con las características de ADN de las células. QQ5. El equipo de QQ1 en el que dichas partículas son espermatozoides y en el que dicha información está relacionada con las características de ADN cromosómico X/Y de las células. QQ6. El equipo de QQ5 que consta además de un sistema de boquilla para dirigir dicha corriente de líquido y para ejercer una fuerza sobre los espermatozoides que tienda a hacerlos virar en una orientación deseada antes de que la corriente pase a través de dicho haz. QQ7. El equipo de QQ1 en el que dicho sistema de boquilla consta de una boquilla y en el que dicho haz choca contra dicha corriente de líquido en una ubicación a menos de 1 ,0 mm de la boquilla. QQ8. El equipo de QQ1 que consta además de un sistema de separación de células de gotitas para separar dichas partículas según dicha información. QQ9. El equipo de QQ1 que consta además de un sistema de separación de células por fotoablación para separar dichas partículas según dicha información. QQ10. El equipo de QQ1 que consta además de un sistema de separación de células por desviación del líquido para separar dichas partículas según dicha información.

RR. Método de análisis de partículas usando óptica de epiluminación con inclinación RR1. Un método para analizar las partículas contenidas en una corriente de líquido, que consiste en: dirigir un haz de radiación electromagnética en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza dicha corriente de líquido en un ángulo de incidencia oblicuo con respecto a un eje longitudinal de la corriente de líquido; enfocar dicho haz de radiación electromagnética en la corriente de líquido como una mancha luminosa, adaptando dichas partículas para pasar a través de dicha mancha luminosa dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las partículas dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás; detectar y transformar al menos algunas de dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de las partículas; y procesar dichas señales eléctricas para obtener información con respecto a dichas características. RR2. RR1 (agregar las reclamaciones similares a QQ2-etc.) SS. Analizador de células que tiene óptica de epiluminación v enfoque de mancha luminosa elíptica SS1. Equipo para analizar las características de ADN de las células en una corriente de líquido, cada célula comprende una región de ADN que tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente, dicho equipo consta de: un sistema óptico de epiluminación para dirigir un haz de radiación electromagnética en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz para que el haz cruce dicha corriente de líquido; dicho sistema óptico incluye una lente de enfoque en dicho eje del haz para enfocar el haz en la corriente de líquido como una mancha luminosa generalmente elíptica que tiene una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, el ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicha región de ADN, dichas células se adaptan para pasar a través de dicha mancha luminosa dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás, incluidas las emisiones de dichas regiones de ADN indicativas de dichas características de ADN; un fotodetector en la parte trasera de la lente de enfoque para detectar y convertir al menos alguna de dichas emisiones de dichas regiones de ADN en señales eléctricas indicativas de dichas características de ADN; y un sistema para procesar dichas señales eléctricas, identificar dichas características de ADN y clasificar las células según dichas características de ADN. SS2. El equipo de SS1 en el que dicho ancho de la mancha luminosa es menor que aproximadamente 3,0 µ?t?. 553. El equipo de SS2 en el que dicha longitud de la mancha luminosa es mayor que aproximadamente 80 µ??. 554. El equipo de SS1 en el que dichas células son espermatozoides y dichas características de ADN son indicativas del sexo de los espermatozoides. 555. El equipo de SS1 que consta además de un sistema de boquilla para ejercer una fuerza sobre las células que tienda a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que la corriente pase a través de dicho haz. 556. El equipo de SS1 que consta además de un sistema de separación de células de gotitas para separar dichas partículas según dichas características de ADN. 557. El equipo de SS1 que consta además de un sistema de separación de células por fotoablación para separar dichas partículas según dichas características de ADN. 558. El equipo de SS1 que consta además de un sistema de separación de células por desviación del líquido para separar dichas partículas según dichas características de ADN. SS9. El equipo para analizar las características de ADN cromosomicas de los espermatozoides de animal en una corriente de líquido que tiene una dirección de flujo, los espermatozoides tienen habitualmente una cabeza con un núcleo que comprende una región localizada del cromosoma que contiene al menos un cromosoma, dicho núcleo tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente, dicho equipo comprende: un sistema óptico para enfocar un haz de radiación electromagnética en la corriente de líquido como una mancha luminosa generalmente elíptica que tiene una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente, el ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicho núcleo, dichos espermatozoides se adaptan para pasar a través de dicha mancha luminosa dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de los espermatozoides, incluidas las emisiones por parte de dichas regiones del cromosoma indicativas de las características cromosomicas de las regiones; un fotodetector para detectar y transformar al menos algunas de dichas emisiones por parte de las regiones del cromosoma en señales eléctricas indicativas de dichas características cromosomicas; y un procesador para procesar dichas señales eléctricas, identificar dichas características cromosomicas y clasificar los espermatozoides según dichas características cromosómicas. SS10. El equipo de la reclamación SS9 en el que dichas características cromosómicas son indicativas del sexo de los espermatozoides. SS11. El equipo de la reclamación SS10 en el que dichos espermatozoides son espermatozoides bovinos. 5512. El equipo de la reclamación SS10 en el que dicha región del cromosoma se localiza dentro de un área del núcleo que se extiende en no más de aproximadamente un 20 % de la longitud del núcleo sobre cualquiera de los lados de un centro longitudinal del núcleo. 5513. El equipo de la reclamación SS10 en el que dicha región del cromosoma se localiza dentro de un área del núcleo que se extiende en no más de aproximadamente un 10 %-15 % de la longitud del núcleo sobre cualquiera de los lados de un centro longitudinal del núcleo. SS14. El equipo de la reclamación SS9 que consta además de un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida que varía con el tiempo de dicho fotodetector y proporciona una salida que incluye información digital correspondiente a dicha salida analógica que varía con el tiempo, en el que dicha salida analógica que varía con el tiempo y la información digital correspondiente son indicativas de dichas características cromosómicas; y en el que dicho procesador comprende un procesador de señal digital que analiza y clasifica la información digital. SS15. El equipo de la reclamación SS1 en el que dicho ancho de la mancha luminosa es menor que 3,0 µ??, aproximadamente. 5516. El equipo de la reclamación SS 15 en el que dicha longitud de la mancha luminosa es aproximadamente de 80 pm. 5517. El equipo de la reclamación SS9 que consta además de un sistema de boquilla para ejercer una fuerza sobre los espermatozoides que tienda a hacerlos virar en una orientación deseada antes de que la corriente pase a través de dicho haz. 5518. El equipo de la reclamación SS1 que consta además de un sistema de separación de células de gotitas para separar dichos espermatozoides según dichas características de ADN cromosómico. 5519. El equipo de la reclamación SS9 que consta además de un sistema de separación de espermatozoides por fotoablación para separar dichos espermatozoides según dichas características de ADN cromosómico. 5520. El equipo de la reclamación SS9 que consta además de un sistema de separación de espermatozoides por desviación del líquido para separar dichos espermatozoides según dichas características de ADN cromosómico.

TT. Método para analizar células que utiliza óptica de epiluminación y enfoque de mancha luminosa elíptica TT1. Un método para analizar las características de ADN de las células de una corriente de líquido, cada célula comprende una región de ADN que tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente, dicho método consiste en: dirigir un haz de radiación electromagnética en una dirección hacia adelante lo largo de un eje del haz para que el haz cruce dicha corriente de líquido; enfocar dicho haz de radiación electromagnética en la corriente de líquido como una mancha luminosa generalmente elíptica que tiene una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, el ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicha región de ADN, dichas células se adaptan para pasar a través de dicha mancha luminosa dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás; detectar y transformar dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de ADN; y procesar dichas señales eléctricas, que incluye diferenciar entre las señales eléctricas de las emisiones de la región de ADN de una cabeza de espermatozoide y las señales eléctricas de las emisiones de otras regiones del espermatozoide; y clasificar las células según dichas características de ADN. TT2. El método de TT1 en el que dichas células son espermatozoides.

TT3. El método de TT1 que consiste además en ejercer una fuerza sobre las células que tienda a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que la corriente pase a través de dicho haz. TT4. El método de TT1 que consiste además en separar en gotitas dichas células según dichas características de ADN. TT5. El método de ??? que consiste además en separar por fotoablación dichas partículas según dichas características de ADN. TT6. El método de TT1 que consiste además en separar por desviación del líquido dichas partículas según dichas características de ADN. TT7. Un método para analizar las características de ADN cromosómico de los espermatozoides de animal de una corriente de líquido que tiene una dirección de flujo, cada espermatozoide tiene una cabeza con un núcleo que comprende una región localizada del cromosoma que contiene al menos un cromosoma, dicho núcleo tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente, dicho método consiste en: enfocar un haz de radiación electromagnética en la corriente de líquido como una mancha luminosa generalmente elíptica que tiene una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente, el ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicho núcleo, dichos espermatozoides se adaptan para pasar a través de dicha mancha luminosa dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de los espermatozoides, incluidas las emisiones por parte de dichas regiones del cromosoma indicativas de las características cromosómicas de las regiones; detectar y transformar al menos algunas de dichas emisiones por parte de las regiones del cromosoma en señales eléctricas indicativas de dichas características cromosómicas; procesar dichas señales eléctricas, que incluye identificar dichas características cromosómicas; y clasificar los espermatozoides según dichas características cromosómicas. TT8. El método de la reclamación TT7 en el que dichas características cromosómicas son indicativas del sexo de los espermatozoides. TT9. El método de la reclamación TT8 en el que dichos espermatozoides son espermatozoides bovinos. TT10. El método de la reclamación TT8 en el que dicha región del cromosoma se localiza dentro de un área del núcleo que se extiende en no más de aproximadamente un 20 % de la longitud del núcleo sobre cualquiera de los lados de un centro longitudinal del núcleo. TT11. El método de la reclamación TT10 en el que dicha región del cromosoma se localiza dentro de un área del núcleo que se extiende en no más de aproximadamente un 10 %-15 % de la longitud del núcleo sobre cualquiera de los lados de un centro longitudinal del núcleo.

TT12. El método de la reclamación TT7 en el que dichas señales eléctricas comprenden una salida analógica que varía con el tiempo y que consiste además en tomar muestras sincrónicamente de la salida analógica que varía con el tiempo y proporcionar una salida que incluye la información digital correspondiente a dicha salida analógica que varía con el tiempo en el que dicha salida analógica que varía con el tiempo y la información digital correspondiente son indicativas de dichas características cromosómicas; en el que dicho procesamiento consiste en analizar la información digital; y en el que dicha clasificación consiste en clasificar la información digital analizada. TT 3. El método de la reclamación TT7 en el que dicho ancho de la mancha luminosa es menor que 3,0 pm, aproximadamente. TT14. El método de la reclamación TT 3 en el que dicha longitud de la mancha luminosa es mayor que 180 pm, aproximadamente. TT15. El método de la reclamación TT7 que consiste además en ejercer una fuerza sobre los espermatozoides que tienda a hacerlos virar en una orientación deseada antes de que la corriente pase a través de dicho haz. TT16. El método de la reclamación TT7 que consiste además en separar en gotitas dichos espermatozoides según dichas características de ADN. ???7. El método de la reclamación TT7 que consiste además en separar por fotoablación dichos espermatozoides según dichas características de ADN.

TT18. El método de la reclamación TT7 que consiste además en separar por desviación del líquido dichos espermatozoides según dichas características de ADN.

UU. Separador de espermatozoides que tiene sólo un fotodetector UU1. El equipo para clasificar y separar los espermatozoides según las características de ADN cromosómico de las células, dicho equipo comprende: un sistema de boquilla para dispensar una corriente de líquido que contiene dichas células a una primera ubicación y para hacer que la corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dicho sistema de boquilla comprende una boquilla que tiene una superficie interior configurada para ejercer una fuerza sobre las células que tienda a hacerlas virar en una orientación deseada antes de qué alcancen dicha primera ubicación; un sistema óptico para dirigir un haz de radiación electromagnética de modo que cruce la corriente de líquido en dicha primera ubicación para que las células de la corriente pasen a través de dicho haz dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las células; un solo fotodetector para detectar y convertir al menos algunas de dichas emisiones en señales eléctricas; y un sistema para clasificar las células según dichas características de ADN y para separar dichas gotitas según la clasificación de las células contenidas en las gotitas. UU2. El equipo de UU1 en el que dicho sistema óptico es un sistema de epiluminación.

W. Boquilla orientadora W1. Una boquilla para usar en el equipo de citometría de flujo para separar espermatozoides de animal de una corriente de líquido por el contenido de cromosoma, dicha boquilla comprende: un cuerpo de boquilla que tiene una superficie interior y un orificio mediante el cual dicha corriente de líquido se adapta al flujo; dicha superficie interior de la boquilla que comprende primera, segunda y tercera regiones axialmente estrechadas para acelerar progresivamente la velocidad de dicha corriente de líquido en una dirección corriente abajo hacia dicho orificio de la boquilla, al menos dos de dichas regiones tienen formas transversales generalmente elípticas orientadas en diferentes direcciones para aplicar fuerzas de torsión a dicha corriente de líquido tendientes a hacer virar los espermatozoides en una orientación deseada. W2. La boquilla de W1 en la que dicha forma transversal generalmente elíptica de una de dichas al menos dos regiones está orientada a 90 grados aproximadamente en relación con la forma transversal generalmente elíptica de la otra de dichas al menos dos regiones.

W3. La boquilla de W2 en la que dichas formas transversales generalmente elípticas de la primera y segunda regiones están orientadas en prácticamente la misma dirección para definir una primera zona de torsión y en la que la forma transversal generalmente elíptica de la tercera región, que constituye una segunda zona de torsión, está orientada a 90 grados aproximadamente en relación con las formas transversales generalmente elípticas de las primera y segunda regiones. W4. La boquilla de W3 en la que la primera zona de torsión tiene una longitud axial de 3,0-4,5 mm y la segunda zona de torsión tiene una longitud axial de 3,5-5,0 mm. W5. La boquilla de W1 en la que la tercera región se estrecha en un ángulo de 42-48 grados. W6. La boquilla de W1 en la que todas dichas regiones tienen formas transversales generalmente elípticas. W7. La boquilla de W1 en la que dicho cuerpo de la boquilla tiene una superficie exterior con una capa no reflectora. W8. La boquilla de W1 que consta además de un soporte para montar dicha boquilla en una posición que apunta hacia arriba para dirigir dicha corriente de líquido a lo largo de una trayectoria ascendente. W9. La boquilla de W8 en la que dicho cuerpo de la boquilla se puede rotar en dicho soporte sobre un eje longitudinal del cuerpo.

WW. Método de orientación de espermatozoides WW1. Un método para orientar espermatozoides de animal en el equipo de citometría de flujo, dicho método consiste en: introducir un líquido que contiene espermatozoides en una corriente de líquido; dirigir la corriente de líquido que contiene dichos espermatozoides sometiéndolos a una presión en el intervalo de 20 a 40 psi (1.406 a 2.812 kg/cm2) a través de una boquilla que tiene una o más regiones estrechadas para acelerar la velocidad de dicha corriente de líquido en una dirección corriente abajo hacia un orificio de la boquilla que tiene un diámetro en el intervalo de 50-70 micrones, una o más de dichas regiones estrechadas que tienen una forma transversal generalmente elíptica para aplicar una fuerza de torsión a dicha corriente de líquido que tiende a hacer virar las células en una orientación deseada a medida que pasan a través de dicho orificio a una velocidad en el intervalo de 30.000 a 50.000 espermatozoides por segundo. WW2. El método de VWV1 en el que dicha boquilla tiene tres o más regiones estrechadas para acelerar progresivamente la corriente de líquido hacia el orificio de la boquilla. WW3. El método de VWV2 en el que dicha boquilla tiene dos zonas de torsión definidas por las superficies interiores de la boquilla en dichas tres o más regiones estrechadas. WW4. El método de WW3 en el que dicha boquilla tiene un eje de flujo a través de dicho orificio y en el que al menos algunas de dichas superficies interiores de la boquilla tienen forma generalmente elíptica que se rotan una en relación con otra alrededor de dicho eje. WW5. El método de WW1 que consiste además en dirigir dicha corriente a lo largo de una trayectoria ascendente no vertical. WW6. El método de WW1 que consiste además en rotar el cuerpo de la boquilla sobre un eje longitudinal central del cuerpo mientras dirige dicha corriente.

XX. Separador de partículas que tiene boquilla que apunta hacia arriba XXI . El equipo para separar partículas usando citometría de flujo, que comprende: un sistema de boquilla para dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas a través de un orificio de boquilla a lo largo de una trayectoria ascendente no vertical; un sistema óptico para dirigir un haz de radiación electromagnética de modo que cruce dicha corriente de líquido en dicha primera ubicación dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las partículas; un fotodetector que se puede operar para detectar y transformar al menos algunas de dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de las partículas; un procesador para procesar dichas señales eléctricas y clasificar las partículas según dichas características; y un sistema de separación para separar dichas partículas según la clasificación de las partículas. XX2. El equipo de XX1 en el que dicho sistema de separación comprende un sistema de separación de gotitas. XX3. El equipo de XX1 en el que dicho sistema de separación comprende un sistema de separación por fotoablación. XX4. El equipo de XX1 en el que dicho sistema de separación comprende un sistema de separación por desviación del líquido. XX5. El equipo de XX1 en el que dicho sistema de boquilla comprende una boquilla que tiene una capa no reflectora. XX6. El equipo de XX1 en el que dicha trayectoria ascendente en el orificio de la boquilla está en un ángulo en el intervalo de 5-85 grados con respecto a la horizontal. XX7. El equipo de XX1 en el que dicha trayectoria ascendente en el orificio de la boquilla está en un ángulo en el intervalo de 15-75 grados con respecto a la horizontal. XX8. El equipo de XX1 en el que dicha trayectoria ascendente en el orificio de la boquilla está en un ángulo en el intervalo de 30-65 grados con respecto a la horizontal. XX9. El equipo de XX1 en el que dicha trayectoria ascendente en el orificio de la boquilla está en un ángulo en el intervalo de 45-60 grados con respecto a la horizontal. YY. Método de separación de partículas que usa una boquilla que apunta hacia arriba YY1. El método para separar partículas usando citometría de flujo, que comprende: un sistema de boquilla para dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas a través de un orificio de la boquilla a lo largo de una trayectoria ascendente no vertical hacia una primera ubicación; dirigir un haz de radiación electromagnética de modo que cruce dicha corriente de líquido en dicha primera ubicación dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las partículas; detectar y transformar al menos algunas de dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de las partículas; procesar dichas señales eléctricas y clasificar las partículas según dichas características; y separar dichas partículas según la clasificación de las partículas. YY2. El método de ??1 en el que dicho paso de separación consiste en separar usando un proceso de separación de gotitas. YY3. El método de YY1 en el que dicho paso de separación consiste en separar usando un proceso de separación por fotoablación. YY4. El método de YY1 en el que dicho paso de separación consiste en separar usando un proceso de separación por desviación del líquido.

ZZ. Parámetros del proceso ZZ1. Un método de separación de una población deseada partiendo de una mezcla de células usando citometría de flujo, donde dicha población tiene una característica de iluminación detectable, y dicho método comprende: dirigir una corriente del líquido que contiene dichas células a través de un orificio de la boquilla que tiene un diámetro de desde cerca de 50 a 70 pm a una presión en rango de cerca de 20 a 40 psi (1.406 a 2.812 kg/cm2) y a una velocidad de cerca de 30.000 a 50.000 células por segundo; hacer que la corriente de líquido se divida en gotitas a una frecuencia de cerca de 20 a 100 kHz; y separar las gotitas usando citometría de flujo para separar a dicha población deseada de células de dicha mezcla de células. ZZ2. El método de ZZ1 en el que dichas células son espermatozoides. ZZ3. El método de ZZ2 en que dicha población deseada de células contiene células X vivas.

AAA. Método comercial AAA1. Un método comercial que comprende el manejo de semen que contiene células; dicho método consiste en: obtener un suministro de semen; usar un equipo programable para llevar a cabo una pluralidad de operaciones integradas de citometría e flujo; dichas operaciones consisten en: (a) recibir dicho suministro de semen; (b) formar corrientes múltiples que contienen dichas células; y (c) separar dichas células en una primera población de células que tiene la característica A y una segunda población de células que tiene la característica B; y distribuir la primera o segunda población para uso comercial. AAA2. El método de AAA1 en el que dichas células son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. AAA3. El método de AAA2 en el que el semen es semen bovino y en el que la primera población se vende para usar en la inseminación artificial de vacas. AAA4. El método de AAA3 en el que dicho equipo programable se puede operar para realizar dichas operaciones en paralelo.

BBB. Método comercial BBB1. Un método comercial que comprende el manejo de una muestra de semen que contiene células; dicho método consiste en: obtener un suministro de semen; usar un equipo programable para llevar a cabo una pluralidad de operaciones integradas de citometría e flujo; dichas operaciones consisten en: (a) recibir dicho suministro de semen; y (b) separar dichas células a partir de una porción inicial de dicho suministro en poblaciones diferentes, incluida una primera población que contiene células que tienen la característica A y una segunda población que contiene células que tienen la característica B; y separar dichas células de la porción restante de dicho suministro en grupos diferentes, incluido un primer grupo que contiene células que tienen la característica A y un segundo grupo que contiene células que tienen la característica B, sólo si las células separadas inicialmente de la porción inicial cumplen o superan una norma preestablecida. BBB2. El método de BBB1 que consiste además en distribuir la primera o la segunda población para uso comercial. BBB3. El método de BBB1 en el que la norma preestablecida es una tasa de recuperación mínima de células que tienen la característica A o la característica B o una pureza mínima en al menos una de las poblaciones. BBB4. El método de BBB1 que consiste además en llevar a cabo dicha pluralidad de operaciones integradas de citometría de flujo en paralelo.

CCC. Método comercial CCC1. Un método comercial que comprende el manejo de una muestra de semen que contiene células; dicho método consiste en: obtener un suministro de semen; usar un equipo para llevar a cabo una pluralidad de operaciones integradas de citometría de flujo, dichas operaciones consisten en: (a) recibir dicho suministro de semen; y (b) separar dichas células de una primera porción de dicho suministro en poblaciones diferentes, incluida una primera población que contiene células que tienen la característica A y una segunda población de células que tienen la característica B, y separar dichas células de una segunda porción de dicho suministro en poblaciones diferentes, incluida una primera población que contiene células que tienen la característica A y una segunda población que contiene células que tienen la característica B; y mezclar una de las poblaciones de la primera porción con una de las poblaciones de la segunda porción para obtener una población combinada. CCC2. El método de CCC1 en el que la primera población de la primera porción tiene una pureza inaceptable, en el que la primera población de la segunda porción tiene una pureza aceptable y en el que la población combinada tiene una pureza aceptable.

DDD. Separación por interferencia de gotitas c/epilum ¡nación DDD1. Un sistema de interferencia de gotitas para separar espermatozoides según las características del ADN cromosómico, que consta de: un equipo de citometría de flujo para dispensar una corriente de líquido que contiene dichas células a una primera ubicación y para hacer que segmentos seleccionados de la corriente, de la corriente de líquido sean golpeados por una gotita de una corriente de líquido de interferencia de gotitas en una segunda ubicación, separando de ese modo los segmentos seleccionados y las células contenidas allí de la corriente de líquido, pudiéndose operar dicho equipo de citometría de flujo para clasificar las células según dichas características de ADN y separar los segmentos de la corriente de acuerdo con la clasificación de células contenidas en los segmentos de la corriente, dicho equipo de citometría de flujo consta de un sistema óptico de epiluminación incluida una lente de enfoque, dicho sistema óptico se puede operar para dirigir un haz de luz láser a través de dicha lente de enfoque en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza la corriente de líquido en dicha primera ubicación de modo que dichas células pasen a través del haz, provocando emisiones de radiación electromagnética a partir de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás. DDD2. El sistema de DDD1 en el que dicho sistema óptico consta además de un fotodetector en dicho eje del haz en la parte trasera de dicha lente de enfoque que se puede operar para detectar y convertir al menos alguna de dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de ADN. DDD3. El sistema de DDD1 en el que las células son espermatozoides y las características del ADN comprenden el contenido de cromosomas sexuales de los espermatozoides. DDD4. El sistema de DDD3 en el que dicho haz es enfocado por dicho sistema óptico como una mancha luminosa en la corriente de líquido en dicha primera ubicación, dicha mancha luminosa tiene una forma generalmente elíptica con una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, siendo dicho ancho menor que la longitud de la cabeza de un espermatozoide que pasa a través de la mancha luminosa del haz. DDD5. El sistema de DDD4 en el que la cabeza de dicho espermatozoide incluye una región de ADN que tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente y en el que dicho ancho de la macha luminosa del haz es menor que la longitud de dicha región de ADN. DDD6. El sistema de DDD1 en el que dicho equipo de citometría de flujo consta de una boquilla que tiene una superficie interior configurada para ejercer una fuerza en las células que tiende a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que pasen a través de dicho haz. DDD7. El sistema de DDD6 en el que dicha boquilla se puede rotar alrededor de un eje longitudinal de la boquilla para ajusfar dicha orientación deseada de la célula en relación con el eje del haz. DDD8. El sistema de DDD1 en el que dicho equipo de citometría de flujo consta de una pluralidad de unidades de citometría de flujo que se pueden operar para analizar simultáneamente múltiples corrientes de líquido, cada unidad de citometría de flujo comprende dicho sistema óptico de epiluminación.

DDD9. El sistema de DDD1 en que dicho sistema óptico incluye un solo fotodetector para detectar dichas emisiones. DDD10. El sistema de DDD1 en el que dicho equipo de citometría de flujo comprende una boquilla que tiene un orificio y un tubo capilar que se extiende desde el orificio a través del cual se dispensa dicha corriente de líquido hasta dicha primera ubicación. DDD11. El equipo de DDD10 en el que dicha primera ubicación está dentro de dicho tubo capilar. DDD 2. El sistema de DDD11 en el que dicho sistema óptico está ópticamente acoplado a dicho tubo capilar para transmitir el haz al interior de la corriente que fluye a través del tubo.

A'. Crioconservación a. Estándar (agregar crioprotector y después enfriar) A1'. Un método de crioconservación de espermatozoides que consiste en los pasos de: agregar un crioprotector a una cantidad de espermatozoides; enfriar dicha cantidad de espermatozoides y dicho crioprotector hasta una temperatura de mantenimiento en un intervalo de aproximadamente 0-8° C; mantener a dichos espermatozoides y dicho crioprotector prácticamente a dicha temperatura de mantenimiento durante un período de menos de 60 minutos; y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides hasta una temperatura de -40° C. A21. El método de la reclamación A1' en el que dicha temperatura de mantenimiento se encuentra en el intervalo de aproximadamente 2-6° C. A3'. El método de la reclamación A1' en el que dicha temperatura de mantenimiento se encuentra en el intervalo de aproximadamente 4-5° C. A4'. El método de la reclamación A1' en el que el paso de agregar un crioprotector consiste en agregar glicerol. A5'. El método de la reclamación A1' en el que el paso de agregar un crioprotector consiste en agregar aproximadamente 6% de glicerol (v/v). A6'. El método de la reclamación A1' en el que dicho período de mantenimiento es inferior a aproximadamente 40 minutos. A7'. El método de la reclamación A1' en el que dicho período de mantenimiento es de aproximadamente 30 minutos. A8'. El método de la reclamación A1' en el que el paso de enfriamiento consiste en enfriar dicha cantidad de esperma a una velocidad de enfriamiento prácticamente constante. A9'. El método de la reclamación A8' en el que la velocidad de enfriamiento es seleccionada para que dicha cantidad de espermatozoides se enfríe desde una temperatura superior a la temperatura de transición vitrea por debajo de la cual los espermatozoides pueden sufrir daño por el choque frío, hasta la temperatura de mantenimiento en aproximadamente 90 minutos. ?10? El método de la reclamación A8' en el que la velocidad de enfriamiento prácticamente constante se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0,1-0,3 0 C por minuto. A11'. El método de la reclamación A8' en el que la velocidad de enfriamiento prácticamente constante se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0,15-0,25 ° C por minuto. A12'. El método de la reclamación A1 en el que dicho período de mantenimiento es inferior a aproximadamente 40 minutos de duración. A13'. El método de la reclamación A1' en el que el paso de enfriamiento se realiza mediante el uso de un congelador programable para enfriar los espermatozoides a una velocidad programada. A14'. El método de la reclamación A13' en el que dicho período de mantenimiento es inferior a aproximadamente 40 minutos de duración. A151. El método de la reclamación A14' en el que la velocidad de enfriamiento programada comprende una velocidad de enfriamiento constante de aproximadamente 0,2° C por minuto. A16'. El método de la reclamación A1' en el que el paso de sobreenfriamiento de dicha cantidad de esperma consiste en enfriar los espermatozoides a una primera velocidad de enfriamiento hasta una temperatura que se aproxima a una zona de temperatura crítica a la que la formación de cristales de hielo y los cambios en la presión osmótica dañan los espermatozoides y enfriar el esperma a una segunda velocidad de enfriamiento más rápida que dicha primera velocidad de enfriamiento hasta una temperatura que es inferior a aproximadamente -30° C. A17'. El método de la reclamación A16' en el que dicha primera velocidad de enfriamiento se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1-5o C por minuto. A18'. El método de la reclamación A16' en el que dicha primera velocidad de enfriamiento se encuentra en el intervalo de aproximadamente 2-4° C por minuto. A19'. El método de la reclamación A16' en el que dicha primera velocidad de enfriamiento es de aproximadamente 3o C por minuto. ?20 El método de la reclamación A16' en el que dicha segunda velocidad de enfriamiento se encuentra en el intervalo de aproximadamente 8-12° C por minuto. A21'. El método de la reclamación A16' en el que dicha segunda velocidad de enfriamiento es de aproximadamente 10° C por minuto. A22'. El método de la reclamación A16' en el que los espermatozoides se enfrían hasta una temperatura de aproximadamente -15° C a dicha primera velocidad de enfriamiento. A23'. El método de la reclamación A22' en el que los espermatozoides se enfrían desde aproximadamente -15° C hasta una temperatura de aproximadamente -80° C a dicha segunda velocidad de enfriamiento. A24'. El método de la reclamación A16' en el que los espermatozoides se enfrían hasta una temperatura de aproximadamente -18° C a dicha primera velocidad de enfriamiento. A25'. El método de la reclamación A24' en el que los espermatozoides se enfrían desde aproximadamente -18° C hasta una temperatura de aproximadamente -80° C a dicha segunda velocidad de enfriamiento. A26'. El método de la reclamación A16' en el que los espermatozoides se enfrían a dicha primera velocidad y dicha segunda velocidad en un congelador programable. A27'. El método de la reclamación ?G en el que el paso de agregar un crioprotector a una cantidad de espermatozoides consiste en agregar un crioprotector a un líquido envolvente y usar dicho líquido envolvente en un citómetro de flujo que analiza espermatozoides. A28'. El método de la reclamación A27' que consta además del paso del uso de dicho citómetro de flujo para separar dichos espermatozoides en una población de espermatozoides que tienen una característica deseada para obtener dicha cantidad de espermatozoides. A29'. El método de la reclamación A1' en el que los pasos de enfriar dicha cantidad de esperma, mantener dichos espermatozoides a la temperatura de mantenimiento y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides se completan en menos de 220 minutos. A30'. El método de la reclamación A1' en el que los pasos de enfriamiento de dicha cantidad de esperma, mantener dichos espermatozoides a la temperatura de mantenimiento y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides se completan en menos de aproximadamente 190 minutos. A3 . El método de la reclamación A1' en el que los pasos de enfriamiento de dicha cantidad de esperma, mantener dichos espermatozoides a la temperatura de mantenimiento y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides se completan en menos de aproximadamente 150 minutos. A321. El método de la reclamación A1' que consta además del paso de cargar dicha cantidad de espermatozoides en una pajilla de inseminación artificial después de agregar el crioprotector a dicha cantidad de espermatozoides. A33'. El método de la reclamación A1' en el que dicha cantidad de espermatozoides constituye una primera cantidad de espermatozoides, el método que consta además de los pasos de obtener una población separada de espermatozoides que contiene más de 500 x 106 espermatozoides, de un citómetro de flujo, para de ese modo obtener una diversidad de cantidades de espermatozoides, incluida dicha primera cantidad de espermatozoides, cargar cada una de dicha diversas cantidades de espermatozoides en una pajilla de inseminación artificial y llevar a cabo los pasos de enfriar, mantener y sobreenfriar cada una de dichas diversas cantidades de espermatozoides en un proceso discontinuo para obtener un lote de pajillas para inseminación artificial que contienen espermatozoides crioconservados. A34'. El método de la reclamación A33' en el que dicha población separada de espermatozoides comprende más de 800 x 106 espermatozoides. A35'. El método de la reclamación A33' en el que los pasos del método se completan en menos de aproximadamente 240 minutos. A36'. El método de la reclamación A33' en el que los pasos del método se completan en menos de aproximadamente 210 minutos. A37'. El método de la reclamación A33' en el que los pasos del método se completan en menos de aproximadamente 170 minutos. A38'. El método de la reclamación A1' que consta además del paso de teñir dicha cantidad de espermatozoides con un colorante fluorescente selectivo de ADN antes del paso de enfriamiento. A39'. El método de la reclamación A38' en el que dicho colorante selectivo de ADN es Hoechst 33342. A40'. El método de la reclamación A39' en el que dicho paso de teñir dicha cantidad de esperma consta del paso de incubar dicha cantidad de espermatozoides durante un período en una solución que consiste es Hoechst 33342 a una temperatura que supera los 40° C. b. Después de la separación a baja temperatura A41'. Un método de crioconservación de espermatozoides que consiste en los pasos de: enfriar una cantidad de espermatozoides hasta una temperatura de mantenimiento en el intervalo de aproximadamente 0 - 8o C; agregar un crioprotector a dicha cantidad de espermatozoides; y mantener a dichos espermatozoides y dicho crioprotector prácticamente a dicha temperatura de mantenimiento durante un período de menos de 60 minutos. A42'. El método de la reclamación A41' en el que dicho período se encuentra en el intervalo de aproximadamente 30 minutos a menos de 60 minutos. A43'. El método de la reclamación A41' en el que el paso de agregar un crioprotector consiste en agregar glicerol. A44'. El método de la reclamación A41' en el que el paso de agregar un crioprotector consiste en agregar aproximadamente 7% de glicerol (v/v).

B'. Boquilla con deflector B1'. Una boquilla para usar en el equipo de citometría de flujo para analizar partículas en una corriente de líquido, dicha corriente de líquido consta de una corriente envolvente alrededor del núcleo de la corriente que contiene dichas partículas; dicha boquilla consta de: una boquilla que tiene una superficie interior que define una trayectoria de flujo para dicha corriente de líquido y un orificio para la salida de la corriente de líquido de la boquilla; y un deflector en la boquilla colocado en dicha trayectoria de flujo hacia arriba de dicho orificio para desviar la corriente de líquido según avanza por dicha trayectoria de flujo, el defiector y la superficie interior de la boquilla se configuran para orientar las partículas en la orientación deseada a medida que salen del orificio. B21. La boquilla de la reclamación B1' en la que dicho defiector se configura para desviar dicho núcleo de la corriente separado de un eje longitudinal central de la boquilla y hacia dicha superficie interior de la boquilla. B3'. La boquilla de la reclamación B1' en la que dicha boquilla tiene una primera área transversal de flujo hacia arriba de dicho defiector y una segunda área transversal de flujo diferente de dicha primera área transversal de flujo en el defiector. B4'. La boquilla de la reclamación B3' en la que dicha segunda área transversal de flujo es más pequeña que dicha primera área transversal de flujo. B5'. La boquilla de la reclamación B3' en la que dichas primera y segunda áreas transversales de flujo tienen diferentes formas. B6'. La boquilla de la reclamación B5' en la que dicha segunda área transversal de flujo es en general semicilíndrica. B7'. La boquilla de la reclamación B1' en la que a dicha superficie interior de la boquilla se le da una forma para que defina al menos dos regiones con inclinación axial corriente abajo de dicho defiector para acelerar progresivamente la velocidad de la corriente de líquido en dirección descendente hacia el orificio de la boquilla. ?8'. La boquilla de la reclamación B7' en la que dicho deflector se configura para desviar dicho núcleo de la corriente hacia una porción de dicha superficie interior de la boquilla definiendo por lo menos una de al menos dos de las regiones mencionadas con inclinación axial. B9'. La boquilla de la reclamación B8' en la que dichas al menos dos regiones axialmente estrechadas tienen formas transversales generalmente elípticas orientadas en diferentes direcciones para aplicar fuerzas de torsión a dicha corriente de líquido tendientes a hacer virar las partículas en dicha orientación deseada. B10'. La boquilla de la reclamación B9' en la que dicha forma transversal en general elíptica de una de dichas al menos dos regiones está orientada a aproximadamente 90 grados en relación con la forma transversal en general elíptica de la otra de dichas al menos dos regiones. B1 T. La boquilla de la reclamación B1' en la que la boquilla tiene una superficie exterior con una capa no reflectora. B12'. La boquilla de la reclamación BV que además consta de un soporte para montar dicha boquilla en una posición que apunta hacia arriba para dirigir dicha corriente de líquido a lo largo de una trayectoria ascendente. B131. La boquilla de la reclamación B13' en que la boquilla se puede rotar en dicho soporte alrededor de un eje longitudinal de la boquilla. B14'. La boquilla de la reclamación B1' en la que dicho deflector consta de una pieza del deflector para desviar dicha corriente de líquido y un soporte para sujetar dicha pieza del deflector en una posición fija en dicha boquilla. ?15'. La boquilla de la reclamación B14' en la que dicha pieza del deflector consta de una placa defiectora. B16'. La boquilla de la reclamación B15' en la que dicha placa defiectora tiene un primer tramo que se extiende en general transversalmente en relación con dicha corriente de líquido y un segundo tramo que se extiende en general en la dirección de dicha corriente de líquido. B17'. La boquilla de la reclamación B15' en la que dicho soporte consta de una cubierta en general cilindrica que sostiene dicha placa defiectora y está colocada en dicha boquilla. B18'. La boquilla de la reclamación B16' en la que dicha superficie interior de la boquilla tiene una región de sección transversal generalmente elíptica corriente abajo de dicho deflector y donde los mencionados primer y segundo tramos de la pieza del deflector cruzan a lo largo de una línea que es sustancialmente paralela con un eje principal de dicha sección transversal generalmente elíptica. B19'. La boquilla de la reclamación B16' en la que dicha superficie interior de la boquilla tiene una región de sección transversal generalmente elíptica corriente abajo de dicho deflector y donde dichos tramos de la pieza del deflector cruzan a lo largo de una línea que es prácticamente perpendicular con un eje principal de dicha sección transversal generalmente elíptica. B20'. La boquilla de la reclamación B15' en la que la placa deflectora es generalmente perpendicular a un eje longitudinal de la boquilla. B21'. La boquilla de la reclamación B20' en la que la placa deflectora tiene una forma semicircular. B22'. La boquilla de la reclamación B20' en la que la placa deflectora tiene una forma semieliptica. B23'. La boquilla de la reclamación B20' en la que a la superficie interior de la boquilla se le da una forma que define una saliente y el soporte comprende una junta tórica capaz de presionar la placa deflectora contra la saliente para mantener la placa deflectora en una posición deseada. B24'. El método de la reclamación B20' en el que el soporte del deflector sostiene la placa deflectora en una posición en la cual la placa deflectora cruza el eje longitudinal de la boquilla. B251. La boquilla de la reclamación B1' en que dichas partículas son espermatozoides.

C. Boquilla con deflector (método') C1'. Un método para orientar partículas en un equipo de citometría de flujo, dicho método consiste en: hacer circular una corriente de líquido que tiene un núcleo de la corriente de líquido de la muestra que contiene dichas partículas y una corriente envolvente de líquido envolvente que rodea el núcleo de la corriente para que fluya a través de una boquilla que tiene una superficie interior que en general se estrecha desde la porción corriente arriba de la boquilla hasta un 5 1 orificio en el extremo corriente abajo de la boquilla; y desviar la corriente del núcleo a medida que circula por la boquilla para someter a las partículas en el núcleo de la corriente a fuerzas hidrodinámicas que tienden a provocar que las partículas tomen una orientación deseada. C2'. [C2'j El método de la reclamación C1' en el que la boquilla tiene un eje longitudinal y el paso de desviación del núcleo de la corriente consiste en desviar el núcleo de la corriente separado del eje longitudinal hacia dicha superficie interior. C3'. El método de la reclamación C1' en el que la boquilla tiene un eje longitudinal y el paso de desviación del recorrido del núcleo de la corriente comprende desviar el núcleo de la corriente de un recorrido que coincide en general con el eje longitudinal a un recorrido desviado, donde al menos una porción del camino desviado queda separado del eje longitudinal de la boquilla. C4'. El método de la reclamación CV en el que la boquilla tiene un eje longitudinal, donde el método también comprende introducir el núcleo de la corriente en la corriente envolvente en una ubicación que está descentrada con respecto al eje longitudinal. C5'. El método de la reclamación C en el que el paso de desviación comprende el uso de un deflector para desviar el núcleo de la corriente. C6'. El método de la reclamación C1' en el que el paso de desviación comprende el uso de una placa deflectora para desviar el núcleo de la corriente y el uso de un soporte para el deflector para mantener en posición la placa deflectora en la boquilla. C7'. El método de la reclamación C6' en el que la placa deflectora cruza el eje longitudinal de la boquilla. C8'. El método de la reclamación C11 en el que la boquilla tiene una superficie interior a la que se le da una forma para que defina al menos una zona de torsión para someter las partículas a fuerzas orientadoras hidrodinámicas. C9'. El método de la reclamación C8' en que al menos una zona de torsión comprende una región estrechada de la boquilla que tiene una sección transversal en general elíptica. C10'. El método de la reclamación C8' en que a dicha superficie interior se le da una forma para que defina las múltiples zonas de torsión. C11\ El método de la reclamación C10' en que cada una de dichas zonas de torsión múltiples comprende una región estrechada de la boquilla que tiene una sección transversal generalmente elíptica. C12'. El método de la reclamación C1 T en el que la sección transversal generalmente elíptica para una primera zona de torsión de las zonas de torsión múltiples está orientada en una dirección diferente que la sección transversal generalmente elíptica para una segunda zona de torsión de las múltiples zonas de torsión. C13'. El método de la reclamación CV en el que el paso de desviación del núcleo de la corriente comprende el uso de un deflector para desviar el núcleo de la corriente, el método además comprende el paso de provocar que la corriente de líquido fluya a través de una primera área de flujo transversal y luego por una segunda área de flujo transversal corriente abajo de la primera área de flujo transversal, donde la primera y la segunda área de flujo transversal tienen formas diferentes. C14'. El método de la reclamación C15' en el que la segunda área de flujo transversal es más pequeña que la primera área de flujo transversal.

D'. Boquilla con aguja de invección asimétrica (equipo) D1'. Una sistema de boquilla para usar en un citómetro de flujo para analizar partículas en una corriente de líquido, dicha corriente de líquido consta de una corriente envolvente alrededor del núcleo de la corriente que contiene dichas partículas; dicho sistema de boquilla consta de: una boquilla que tiene un eje longitudinal, una superficie interior que define un recorrido de flujo para dicha corriente de líquido y un orificio en el extremo corriente abajo de la boquilla para la salida de la corriente de líquido de la boquilla, dicha superficie interior tiene una forma para definir al menos una zona de torsión que comprende una región axialmente estrechada con una sección transversal generalmente elíptica, para orientar dichas partículas en una orientación deseada a medida que la corriente de líquido fluye por la zona de torsión hacia el orificio; y un conducto de una fuente de partículas a la boquilla, donde dicho conducto se coloca para introducir dicho núcleo de corriente en la boquilla en una ubicación descentrada con respecto al eje longitudinal de la boquilla. D2'. El sistema de boquilla de la reclamación D1' en el que dicha ubicación es corriente arriba desde al menos una de las zonas de torsión mencionadas. D31. El sistema de boquilla de la reclamación D1' en el que al menos una zona de torsión de las mencionadas constituye una primera zona de torsión, y dicha boquilla comprende una segunda zona de torsión. D4'. El sistema de boquilla de la reclamación D3' en el que dicha ubicación es corriente arriba con respecto a la primera zona de torsión y al menos una porción de la segunda zona de torsión. D5'. El sistema de boquilla de la reclamación D3' en el que la segunda zona de torsión comprende una región axialmente estrechada de la boquilla que tiene una sección transversal generalmente elíptica. D6'. El sistema de boquilla de la reclamación D5' en el que el eje principal de la sección transversal generalmente elíptica de la primera zona de torsión está orientado en una dirección diferente a la del el eje principal de la sección transversal generalmente elíptica de la segunda zona de torsión. D7'. El sistema de boquilla de la reclamación D6' en el que la sección transversal generalmente elíptica de la primera zona de torsión está orientada a un ángulo de cerca de 90 grados con respecto a la sección transversal generalmente elíptica de la segunda zona de torsión. D8'. El sistema de boquilla de la reclamación D7' en el que dicha ubicación es corriente arriba con respecto a la primera zona de torsión y al menos una porción de la segunda zona de torsión.

E'. Introducción asimétrica de muestras (método) E1'. Un método de orientación de partículas en un citómetro de flujo que comprende: hacer que un líquido envolvente fluya a través de una boquilla que tiene un eje longitudinal y al menos una zona de torsión que comprende una región axialmente estrechada de la boquilla que tiene una sección transversal generalmente elíptica; e introducir una corriente de líquido central que contiene partículas en la corriente de líquido envolvente en una ubicación descentrada con respecto a dicho eje longitudinal para el flujo de la corriente de líquido envolvente y la corriente de líquido central a través de al menos una zona de torsión. E2'. El método de la reclamación E1 en que el paso de provocar la corriente de líquido a través de al menos una zona de torsión consiste en hacer que núcleo de la corriente fluya a lo largo de un recorrido de flujo, donde una porción de dicho recorrido de flujo corre descentrada con respecto al eje longitudinal de la boquilla, y someter dichas partículas a las fuerzas de orientación hidrodinámicas generadas por dicha zona de torsión mientras dichas partículas avanzan a lo largo de dicha porción descentrada del recorrido del flujo. E3'. El método de la reclamación E1 en el que al menos una de las zonas de torsión mencionadas constituye una primera zona de torsión, el método además comprende el paso de causar que la corriente de líquido envolvente y la corriente de líquido central fluyan a través de una segunda zona de torsión para orientar las partículas en una orientación deseada. E4'. El método de la reclamación E3 en el que dicha segunda zona de torsión comprende una región estrechada en la boquilla que tiene un área transversal generalmente elíptica. E5'. El método de la reclamación E4 en el que el eje principal del área de la sección transversal generalmente elíptica de la primera zona de torsión está orientado en una dirección diferente a la del eje principal del área de sección transversal generalmente elíptica de la segunda zona de torsión. E6'. El método de la reclamación E4 en el que el eje principal del área de la sección transversal generalmente elíptica de la primera zona de torsión es perpendicular al eje principal del área de sección transversal generalmente elíptica de la segunda zona de torsión.

F'. Concentración de esperma separado mediante centrifugación secundaria F1'. Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: recoger espermatozoides de un animal macho; separar los espermatozoides en una de múltiples poblaciones de espermatozoides sobre la base de una o más características de ADN específicas; obtener una cantidad de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN de una de dichas poblaciones múltiples de espermatozoides, estando contenida dicha cantidad de espermatozoides en un volumen de líquido de recolección; someter dicho volumen de líquido de recolección a un primer proceso de centrifugación para formar un primer sedimento de espermatozoides y un sobrenadante superpuesto al primer sedimento; separar el primer sedimento del sobrenadante; someter al sobrenadante a otra centrifugación para formar un segundo sedimento de espermatozoides que quedaron en el sobrenadante después de la primera centrifugación; y agregar un volumen de líquido de resuspensión al primer y segundo sedimento para obtener una suspensión de espermatozoides que tienen la característica deseada de ADN; la cantidad de dicho volumen de líquido de resuspensión se selecciona para obtener la concentración deseada de espermatozoides en la suspensión. F2'. El método de la reclamación F1' en el que el primer proceso de centrifugación consiste en centrifugar a una velocidad suficiente para generar una fuerza g en el intervalo de 550-800 g. F3'. El método de la reclamación F2' en el que el primer proceso de centrifugación consiste en centrifugar dicho volumen de líquido de recolección a dicha velocidad durante un período en el intervalo de 7-10 minutos. F4'. El método de la reclamación FV en el que una o más de las características especificadas del ADN consisten en la presencia en los espermatozoides, de un cromosoma sexual X o Y. F5'. El método de la reclamación F1' que consiste además en obtener diversas cantidades de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN y distribuir dichas cantidades diversas de espermatozoides a los criadores de animales mediante un sistema de distribución comercial.

G'. Filtración con presión baja G1'. Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: recoger espermatozoides de un animal macho; separar los espermatozoides para obtener una cantidad de espermatozoides que tienen una característica deseada; dicha cantidad de espermatozoides está contenida en un primer volumen de líquido que contiene una primera concentración de espermatozoides; y someter los espermatozoides a un paso de concentración en el cual la concentración de dichos espermatozoides se aumenta hasta una segunda concentración mayor que dicha primera concentración, en el que dicho paso de concentración consiste en hacer circular al menos una porción del primer volumen de líquido por un primer filtro a una presión diferencial a través del primer filtro de menos de aproximadamente 20 pulgadas de mercurio (0.9063 kg/cm2), dicho filtro tiene poros lo suficientemente pequeños para impedir el pasaje de dichos espermatozoides y retener un segundo volumen de líquido sin filtrar que contiene dichos espermatozoides. G2'. El método de la reclamación G1' en el que la presión diferencial a través del filtro durante dicha circulación es prácticamente constante. G3'. El método de la reclamación G1' que consta además del paso de reducir intermitentemente la presión diferencial a través del filtro durante un período y luego restaurar sustancialmente la presión diferencial. G41. El método de la reclamación G3' en el que el paso de reducir la presión diferencial consiste en el paso de reducir la presión diferencial a aproximadamente cero. G5'. El método de la reclamación G1' en el que los poros del filtro tienen un tamaño en el intervalo de aproximadamente 0,2-1 ,0 micrómetros.

G6'. El método de la reclamación GT en el que aproximadamente 80%-90% de dicho primer volumen de líquido circula a través de dicho primer filtro. G7'. El método de la reclamación G1' en el que dicho segundo volumen de líquido sin filtrar es suficiente para evitar la aglutinación de los espermatozoides en dicho primer filtro. G8'. El método de la reclamación G1' que consiste además en hacer circular al menos una porción de dicho segundo volumen de líquido sin filtrar través de un segundo filtro que tiene poros lo suficientemente pequeños para impedir el pasaje de dichos espermatozoides, retener un tercer volumen de líquido sin filtrar que contiene dichos espermatozoides y enjuagar dicho segundo filtro con un líquido de resuspensión para extraer los espermatozoides del segundo filtro, para agregar a dicho tercer volumen de modo de obtener dicha segunda concentración. G9'. El método de la reclamación G8' en el que aproximadamente 80% del segundo volumen de líquido sin filtrar circula a través de dicho segundo filtro. G10'. El método de la reclamación G8' en el que dicho tercer volumen de líquido sin filtrar es suficiente para evitar la aglutinación de los espermatozoides en dicho segundo filtro. G11'. El método de la reclamación G8' en el que dicho segundo filtro es un filtro fino que tiene un espesor en el intervalo de aproximadamente 50-500 micrómetros.

G12'. El método de la reclamación G8' en el que dicho segundo filtro es un filtro fino que tiene un espesor en el intervalo de aproximadamente 75-250 micrómetros. G13'. El método de la reclamación G8' en el que dicho segundo filtro es un filtro fino que tiene un espesor en el intervalo de aproximadamente 100-150 micrómetros. G14'. El método de la reclamación G1' en el que dicho primer filtro es un filtro fino que tiene un espesor en el intervalo de aproximadamente 50-500 micrómetros. G15'. El método de la reclamación G1' en el que dicho primer filtro es un filtro fino que tiene un espesor en el intervalo de aproximadamente 75-250 micrómetros. G16'. El método de la reclamación G1' en el que dicho primer filtro es un filtro fino que tiene un espesor en el intervalo de aproximadamente 100-150 micrómetros.

H'. Control de temperatura general (tinción a alta temperatura) H1'. Un método para procesar espermatozoides que consiste en los pasos de: recolectar una muestra de semen que contiene espermatozoides de un animal macho; transportar la muestra de semen a una planta de tratamiento; llevar a cabo un examen inicial de control de calidad del semen; teñir los espermatozoides en dicha muestra de semen con un colorante fluorescente selectivo de ADN, que se une selectivamente al ADN en los espermatozoides al exponer dichos espermatozoides a un colorante fluorescente selectivo de ADN, para formar una mezcla de tinción y someter la mezcla de tinción a una temperatura de al menos aproximadamente 40° C; usar un citómetro de flujo para separar los espermatozoides sobre la base de una característica específica de ADN; obtener una cantidad de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN suspendidos en un volumen de líquido; ajustar la concentración de los espermatozoides en dicha suspensión mediante un proceso de concentración para lograr la concentración deseada; y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides. H2'. El método de la reclamación H1' que consiste además en mantener la temperatura de los espermatozoides desde el momento en que se recogen hasta el comienzo del paso de tinción, a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 20-37° C y aislar los espermatozoides de las fluctuaciones de temperatura durante ese período. H3'. El método de la reclamación H2' en el que el paso de aislar los espermatozoides consiste en mantener la muestra de semen en un recipiente aislado durante el transporte a la planta de tratamiento. H4'. El método de la reclamación H1' que consta además del paso de colocar los espermatozoides teñidos en un ambiente con una temperatura en el intervalo de aproximadamente 18-25° C antes de introducirlos en dicho citómetro de flujo para enfriar los espermatozoides desde la temperatura que alcanzaron durante el paso de tinción antes de comenzar el paso de separación. H5'. El método de la reclamación HT en el que el paso de sobreenfriamiento consiste en enfriar los espermatozoides desde una temperatura que supera los 20° C hasta una temperatura en el intervalo de aproximadamente 0-8° C y agregar una fuente proteica y un crioprotector a dichos espermatozoides antes de que la temperatura de los espermatozoides se haya enfriado por debajo de 20° C. H6'. El método de la reclamación H5' que consiste además en el uso de un congelador programable para: (a) enfriar los espermatozoides a una temperatura de mantenimiento en el intervalo de aproximadamente 0-8° C; (b) mantener el esperma a dicha temperatura de mantenimiento durante un período de menos de aproximadamente 60 minutos para permitir que los espermatozoides prácticamente se equilibren con el crioprotector; (c) enfriar el esperma a una primera velocidad de enfriamiento hasta una temperatura que se aproxima a una zona de temperatura crítica en la que la formación de cristales de hielo y los cambios en la presión osmótica dañan los espermatozoides; y (d) enfriar los espermatozoides a través de dicha zona de temperatura crítica a una segunda velocidad de enfriamiento más rápida que dicha primera velocidad de enfriamiento. ?7'. El método de la reclamación H6' que consiste además en enfriar los espermatozoides desde dicha temperatura de mantenimiento a aproximadamente -15° C a dicha primera velocidad de enfriamiento. H8!. El método de la reclamación H7' que consiste además en enfriar los espermatozoides desde aproximadamente -18o C a por lo menos -30° C aproximadamente, a dicha segunda velocidad de enfriamiento. H9'. El método de la reclamación H6' que consiste además en enfriar los espermatozoides desde dicha temperatura de mantenimiento a aproximadamente -18° C a dicha primera velocidad de enfriamiento. ?10? El método de la reclamación H6' que consiste además en usar el congelador programable para enfriar los espermatozoides a dicha temperatura de mantenimiento a una velocidad de enfriamiento en el intervalo de aproximadamente 0,1-0,3° C por minuto. H11'. El método de la reclamación H10' que consiste además en usar el congelador programable para enfriar los espermatozoides desde dicha temperatura de mantenimiento hasta una temperatura de aproximadamente -15° C a dicha primera velocidad de aproximadamente 1-5° C por minuto. H12'. El método de la reclamación H6' que consiste además en usar el congelador programable para enfriar los espermatozoides desde una temperatura de aproximadamente -18° C hasta al menos aproximadamente -30° C a dicha segunda velocidad de enfriamiento de aproximadamente 8-12° C por minuto. H13'. El método de la reclamación H12' que consiste además en usar el congelador programable para enfriar los espermatozoides desde dicha temperatura de mantenimiento hasta una temperatura de aproximadamente - 15° C a dicha primera velocidad de enfriamiento de aproximadamente 1-5° C por minuto. H14'. El método de la reclamación H6' en el que los espermatozoides se mantienen a dicha temperatura de mantenimiento durante un período de aproximadamente 30 minutos. H 5'. El método de cualquiera de las reclamaciones H1'-H14' en el que la mezcla de tinción consta además de un antioxidante. H16'. El método de ia reclamación H15' en el que el antioxidante se selecciona del grupo que consiste en glutatión, piruvato y una combinación de éstos. H 7'. El método de cualquiera de las reclamaciones ?1' o H5'-H16' que consiste además en colocar los espermatozoides teñidos en un ambiente que tiene una temperatura de al menos aproximadamente 37° C hasta que se introducen en un citómetro de flujo. H18'. El método de cualquiera de las reclamaciones H1' o H5'-H16' que consiste además en colocar los espermatozoides teñidos en un ambiente que tiene una temperatura de al menos aproximadamente 40° C hasta que se introducen en un citómetro de flujo. H19'. El método de la reclamación H1' en el que el paso de obtención de una cantidad de espermatozoides consiste en obtener una población de espermatozoides vivos que tienen dicha característica deseada de ADN a una velocidad de al menos 5.000 espermatozoides por segundo. H20'. El método de la reclamación H19' en el que la pureza de dicha población es de al menos 85%.

J'. Control general de temperatura (sin tinción a alta temperatura) J1'. Un método para procesar espermatozoides que consiste en los pasos de: recolectar una muestra de semen que contiene espermatozoides de un animal macho; transportar la muestra de semen a una planta de tratamiento; realizar un examen inicial de control de calidad en la muestra de semen; teñir los espermatozoides en dicha muestra de semen con colorante fluorescente selectivo de ADN; separar los espermatozoides con un citómetro de flujo para obtener una o más poblaciones de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN; obtener una cantidad de espermatozoides que tienen la característica deseada de ADN suspendidos en un líquido; ajustar la concentración de dicha cantidad de espermatozoides para lograr una concentración deseada de espermatozoides que tienen ia característica deseada de ADN en una suspensión líquida; agregar un cric-protector a una cantidad de espermatozoides con la característica deseada en tanto dicha cantidad de espermatozoides tenga una temperatura superior a la temperatura de transición vitrea por debajo de la cual los espermatozoides están sujetos al daño por choque frío; enfriar dicha cantidad de espermatozoides y dicho crioprotector desde dicha temperatura de transición vitrea hasta una temperatura de mantenimiento en el intervalo de aproximadamente 0-8° C; mantener dicha cantidad de espermatozoides y el crioprotector en un intervalo de temperatura de aproximadamente 0 - 8o C durante un período inferior a 60 minutos; y sobreenfriar dicha cantidad de esperma hasta una temperatura inferior a -40° C. J2'. El método de la reclamación JT en el que dicho crioprotector se agrega aunque dicha cantidad de espermatozoides tenga una temperatura superior a aproximadamente 20° C. J3'. El método de la reclamación J1 ' en el que los espermatozoides teñidos se colocan en un ambiente a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20-25° C hasta que son separados en un citómetro de flujo. J4'. El método de la reclamación J1' que consiste además en usar un congelador programable para enfriar dicha cantidad de esperma a una primera velocidad de enfriamiento, desde dicha temperatura de mantenimiento hasta una temperatura que se aproxima a la zona de temperatura crítica, en la que la formación de cristales de hielo y los cambios en la presión osmótica dañan los espermatozoides y luego enfriar dicha cantidad de espermatozoides a través de dicha zona de temperatura crítica, a una segunda velocidad de enfriamiento que es más rápida que dicha primera velocidad de enfriamiento. J5'. El método de la reclamación J1' en el que ei paso de mantener dicha cantidad de espermatozoides consiste en mantener dicha cantidad de espermatozoides a dicha temperatura de mantenimiento durante un período inferior a aproximadamente 40 minutos. J6'. El método de la reclamación J1' en el que el paso de mantener dicha cantidad de espermatozoides consiste en mantener dicha cantidad de espermatozoides a dicha temperatura de mantenimiento durante un período de aproximadamente 30 minutos. J7'. El método de cualquiera de las reclamaciones J1 -J6' en el que el paso de tinción consta además del agregado de un antioxidante a los espermatozoides. J8'. El método de la reclamación J7' en el que el antioxidante se selecciona del grupo que consiste en glutatión, piruvato y una combinación de éstos. J9'. El método de la reclamación J1' en el que el paso de obtención de una cantidad de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN consiste en obtener una población de espermatozoides vivos que tienen dicha característica deseada de ADN a una velocidad de al menos 5.000 espermatozoides por segundo.

J10'. El método de la reclamación J9' en el que la pureza de dicha población de espermatozoides es de al menos 85%.

K'. Control general de temperatura (tinción en frío) K1'. Un método para procesar espermatozoides que consiste en los pasos de: recolectar una muestra de semen que contiene espermatozoides de un animal macho; transportar la muestra de semen a una planta de tratamiento; realizar un examen inicial de control de calidad en la muestra de semen; enfriar los espermatozoides hasta una temperatura en el intervalo de aproximadamente 0-8° C antes de llevar a cabo cualquier dilución sustancial de los espermatozoides; formar una mezcla que consta de una solución que contiene los espermatozoides y un colorante selectivo de ADN y someter la mezcla hasta una temperatura en el intervalo de 0-8° C para teñir los espermatozoides; separar los espermatozoides con un citómetro de flujo para obtener una o más poblaciones de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN; obtener una cantidad de espermatozoides que tienen la característica deseada de ADN, suspendida en un líquido; ajustar la concentración de dicha cantidad de espermatozoides para lograr una concentración deseada de espermatozoides que tienen la característica deseada de ADN en una suspensión líquida; agregar un crioprotector a dicha cantidad de espermatozoides; mantener dicha cantidad de espermatozoides y dicho crioprotector a una temperatura de mantenimiento en el intervalo de aproximadamente 0 - 8o C durante un período en el intervalo de aproximadamente 30 minutos a 3 horas; y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides hasta una temperatura inferior a 40° C. K2'. El método de la reclamación K1' que consta además del paso de evitar calentar sustancialmente las células en cualquier momento durante el proceso. K3'. El método de la reclamación K en el que el paso de enfriamiento de los espermatozoides hasta una temperatura en el intervalo de 0 - 8o consiste en colocar un recipiente que contiene los espermatozoides en un baño que está prácticamente a la misma temperatura que los espermatozoides preenfriados y colocar el baño en un ambiente a una temperatura inferior a aproximadamente 8o C. K4'. El método de la reclamación K3' en el que el paso de enfriamiento consiste además en controlar la temperatura de los espermatozoides a medida que se enfrían y agregar hielo al baño después de que los espermatozoides se enfriaron a una temperatura inferior a aproximadamente 10° C. ?5'. El método de la reclamación K1' en el que dicho período de mantenimiento se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1 - 2 horas. K6'. El método de la reclamación K1' en el que dicho período de mantenimiento se encuentra en el intervalo de aproximadamente 90 minutos. K7'. El método de la reclamación K1' en el que dicho período de mantenimiento se encuentra en el intervalo de aproximadamente 30 minutos a menos de 60 minutos. K8'. El método de la reclamación K1' en el que el paso de sobreenfriamiento de dicha cantidad de espermatozoides consiste en usar un congelador programable para enfriar dicha cantidad de espermatozoides a una primera velocidad de enfriamiento, desde dicha temperatura de mantenimiento hasta una temperatura que se aproxima a una zona de temperatura crítica en la que la formación de cristales de hielo y los cambios en la presión osmótica dañan los espermatozoides y luego enfriar dicha cantidad de espermatozoides a través de dicha zona de temperatura crítica a una segunda velocidad de enfriamiento, que es más rápida que dicha primera velocidad de enfriamiento. K9'. El método de la reclamación K1' en el que el paso de agregar un crioprotector consiste en agregar glicerol. K10'. El método de la reclamación K1' en el que el paso de agregar un crioprotector consiste en agregar 7% de glicerol (v/v).

K11". El método de la reclamación K1' en el que el paso de obtención de una cantidad de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN consiste en obtener una población de espermatozoides vivos que tienen dicha característica deseada de ADN a una velocidad de al menos 5.000 espermatozoides por segundo. K12'. El método de la reclamación K11' en el que la pureza de dicha población de espermatozoides es de al menos 85%.

L'. Sistema de recolección (Equipo) L1'. Un sistema de recolección para recoger una corriente de gotitas separadas por un citómetro de flujo de separación de gotitas que produce una corriente de gotitas que circulan por una trayectoria que incluye un componente horizontal, el sistema que consta de un dispositivo interceptor para interceptar las gotitas en dicha corriente a medida que circulan por dicha trayectoria y un recipiente de recolección dispuesto para recoger dichas gotitas interceptadas. L2'. El sistema de recolección de la reclamación Ll' en el que el dispositivo interceptor consta de una superficie de impacto dispuesta a través de dicha trayectoria contra la que dichas gotitas se adaptan para ¡mpactar. L3\ El sistema de recolección de la reclamación L2' en el que la superficie de impacto se dispone a través de dicha trayectoria en una ubicación en la que dichas gotitas tienen un componente de velocidad ascendente.

L4'. El sistema de recolección de la reclamación L2' en el que al menos algunas de las gotitas contienen partículas y la superficie de impacto está recubierta con una sustancia que reduce el daño a dichas partículas ante el impacto con la superficie de impacto. L5'. El sistema de recolección de la reclamación L4' en el que dicha sustancia consta de una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en yema de huevo, albúmina sérica bovina y solución salina amortiguada con fosfato. L6'. El sistema de recolección de la reclamación L4' en el que dichas partículas son espermatozoides. L7'. El sistema de recolección de la reclamación L2' en el que dicho dispositivo interceptor se configura para orientar dichas gotitas interceptadas hacia el recipiente de recolección. L8'. El sistema de recolección de la reclamación L7' en el que el dispositivo interceptor consta de una guía debajo de dicha superficie de impacto para orientar dichas gotitas hacia abajo hasta dicho recipiente de recolección. L9'. El sistema de recolección de la reclamación L7' en el que el dispositivo interceptor consta de un recinto hueco que define dicha superficie de impacto y tiene una ventana de entrada para la entrada de las gotitas que circulan por dicha trayectoria dentro de dicho recinto para impactar contra dicha superficie de impacto. L10'. El sistema de recolección de la reclamación L1' en el que dicha corriente de gotitas constituye una primera corriente de gotitas, dicho dispositivo interceptor constituye un primer dispositivo interceptor, dicho recipiente de recolección constituye un primer recipiente de recolección y dicho citómetro además produce una segunda corriente de gotitas que circulan por una segunda trayectoria que es diferente de dicha primera trayectoria, dicho sistema de recolección consta además de un segundo dispositivo interceptor para interceptar las gotitas que circulan por dicha segunda trayectoria y por un segundo recipiente de recolección para recoger las gotitas interceptadas por el segundo dispositivo interceptor. L1 Y. El sistema de recolección de la reclamación L10' en el que dicho primer dispositivo interceptor tiene una ventana a través de la cual se adapta para pasar dicha segunda corriente y en el que dicho segundo dispositivo interceptor se coloca detrás de dicho primer dispositivo interceptor para interceptar las gotitas en la segunda corriente que pasan a través de dicha ventana. L12'. El sistema de recolección de la reclamación L10' en el que dicho dispositivo interceptor se configura para orientar dichas gotitas interceptadas en la segunda corriente hacia el segundo recipiente de recolección. L13'. El sistema de recolección de la reclamación L1 ' en el que dichas gotitas contienen partículas, el sistema de recolección consta además de una sustancia que recubre las superficies de impacto de los dispositivos interceptores para reducir el daño a dichas partículas ante el impacto L14'. El sistema de recolección de la reclamación L13' en el que dichas partículas son espermatozoides vivos. L151. El sistema de recolección de la reclamación L13' en el que dicha sustancia consiste en una sustancia seleccionada del grupo que consta de: yema de huevo, albúmina sérica bovina y solución salina amortiguada con fosfato. L16'. El sistema de recolección de la reclamación L1' en combinación con un citómetro de flujo colocado para dirigir una corriente de gotitas al interior del dispositivo interceptor.

M'. Sistema de recolección (Método) M11. Un método de recolección de gotitas separadas por un citómetro de flujo de separación de gotitas que produce una corriente de gotitas que circulan por una trayectoria que incluye un componente horizontal; dicho método comprende los pasos de: interceptar dichas gotitas según avanzan por dicha trayectoria; y recoger dichas gotitas interceptadas en un primer recipiente de recolección. M2'. El método de la reclamación M1' en el que dicho paso de recolección consiste en orientar dichas gotitas interceptadas en dicho primer recipiente de recolección. M3'. El método de la reclamación M2' en el que dicho paso de intercepción consiste colocar una superficie de impacto a través de dicha trayectoria en una ubicación en la que dichas gotitas tienen un componente de velocidad ascendente. M4'. El método de la reclamación M3' que consiste además en ajustar la posición de dicha superficie de impacto para que se adapte a diferentes trayectorias de gotitas. M5'. El método de la reclamación MV en el que dicho citómetro de flujo produce primeras y segundas corrientes de gotitas que circulan por sus respectivas primeras y segundas trayectorias, cada trayectoria tiene un componente horizontal; dicho método que además consiste en interceptar dichas gotitas en dicha segunda corriente a medida que avanzan por dicha segunda trayectoria y recoger dichas gotitas interceptadas de la segunda corriente en un segundo recipiente de recolección. M61. El método de la reclamación M5' en el que dichas primera y segunda trayectoria se extienden prácticamente en un plano. M7'. El método de la reclamación M5' en el que las gotitas en dicha primera corriente son interceptadas al colocar una primera superficie de impacto a través de dicha primera trayectoria en una ubicación en la que dichas gotitas tienen un componente de velocidad ascendente y en que las gotitas en dicha segunda corriente son interceptadas al colocar una segunda superficie de impacto a través de dicha segunda trayectoria en una ubicación en la que dichas gotitas tienen un componente de velocidad ascendente. 8'. El método de la reclamación M7' en el que dicha segunda superficie de impacto se coloca con una elevación diferente a la de dicha primera superficie de impacto. M9'. El método de la reclamación MV en el que dichas gotitas contienen partículas y el paso de interceptar dichas gotitas consiste en usar un dispositivo interceptor para interceptar dichas gotitas; el método consiste además en contactar dicho dispositivo interceptor con una preparación para reducir el daño a dichas partículas. M10'. El método de la reclamación M9' en el que dichas partículas son espermatozoides vivos. M11'. El método de la reclamación M10' en el que dicha preparación comprende una sustancia seleccionada del grupo que consiste de: yema de huevo, albúmina sérica bovina y solución salina amortiguada con fosfato. M12'. El método de la reclamación M10' en el que el paso de contactar dicho dispositivo interceptor con una preparación consiste en remojar dicho dispositivo interceptor en dicha preparación durante un período que es suficiente para que la preparación sea absorbida por y/o se adhiera al dispositivo interceptor. 13'. El método de la reclamación M 2' en el que dicho período se encuentra en el intervalo de aproximadamente 30-90 minutos. M141. El método de la reclamación M13' en el que dicho período se encuentra en el intervalo de aproximadamente 30-60 minutos. 15'. El método de la reclamación 14' en el que dicho período es de aproximadamente 60 minutos. M16'. El método de cualquiera de las reclamaciones M10'-M15' en el que el paso de recolección de dichas gotitas consiste en recoger dichas gotitas en un recipiente de recolección; el método consta además del paso de contactar el recipiente de recolección con una preparación para reducir el daño a dichas partículas. M17*. El método de la reclamación M16' consiste además en el paso de contactar el recipiente de recolección con una preparación para reducir el daño a las partículas que consiste en contactar el vaso de recolección con la misma preparación usada para contactar el dispositivo interceptor. M18'. El método de la reclamación M16' en el que el paso de contactar el recipiente de recolección con una preparación para reducir el daño a dichas partículas consiste en remojar dicho recipiente de recolección en dicha preparación durante un período que es suficiente para que la preparación sea absorbida por y/o se adhiera al recipiente de recolección. M19'. El método de la reclamación M18' en el que dicho período se encuentra en el intervalo de aproximadamente 30-90 minutos. M20'. El método de la reclamación M18' en el que dicho período es de aproximadamente 60 minutos.

N'. Combinaciones sinérgicas a. FCM multicanal (con estrategia de separación) Nal'. Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: separar los espermatozoides en poblaciones diferentes de espermatozoides sobre la base de una o más características de ADN especificadas usando un proceso de citometría de flujo que consiste en dispensar un líquido de la muestra que contiene los espermatozoides a una pluralidad de unidades de citometría de flujo, cada una de las cuales se puede operar para separar los espermatozoides sobre la base de dicha una o más características de ADN, y operar dichas unidades mientras se comparte una plataforma integrada que consta de al menos uno de los siguientes elementos: (1) un suministro común de espermatozoides; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichos espermatozoides a dichas unidades de citometría de flujo; y variar la velocidad a la que el líquido de la muestra se dispensa a una o más de las unidades de citometría de flujo como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de una primera población separada de espermatozoides que tiene una característica de ADN deseada; y (2) la cantidad de espermatozoides que tienen dicha característica de ADN deseada en una segunda población separada.

Na2'. El método de la reclamación Nal' que consiste además en operar dichas unidades de citometría de flujo en paralelo. Na3'. El método de la reclamación Nal' en el que dicha una o más características especificadas del ADN consisten en la presencia en los espermatozoides, de un cromosoma sexual X o Y. b. FCM multicanal con procesamiento digital NbT. Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: separar los espermatozoides en poblaciones diferentes de espermatozoides sobre la base de una o más características de ADN especificadas usando un proceso de citometría de flujo que consiste en dispensar un líquido de la muestra que contiene los espermatozoides a una pluralidad de unidades de citometría de flujo, cada una de las cuales se puede operar para separar los espermatozoides sobre la base de dicha una o más características de ADN, y operar dichas unidades mientras se comparte una plataforma integrada que consta de al menos uno de los siguientes elementos: (1) un suministro común de espermatozoides; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichos espermatozoides a dichas unidades de citometría de flujo; y usar un convertidor analógico-digital o más para tomar muestras sincrónicamente de una salida que varía con el tiempo de cada unidad de citometría de flujo y proporcionar una salida que incluye información digital, correspondiente a dicha salida analógica que varía con el tiempo, en el que dicha salida analógica que varía con el tiempo y su correspondiente información digital son indicativas de dicha característica de ADN especificada. Nb2\ El método de la reclamación Nb en el que dicha una o más características especificadas del ADN consisten en la presencia en los espermatozoides, de un cromosoma sexual X o Y. c. FCM multicanal (C/ tinción a alta temperatura) Nc1'. Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: formar una mezcla de tinción que contiene los espermatozoides y un colorante fluorescente selectivo de ADN y someter la mezcla de tinción a una temperatura de al menos aproximadamente 40° C; y separar los espermatozoides en poblaciones diferentes de espermatozoides sobre la base de una o más características de ADN especificadas usando un proceso de citometría de flujo que consiste en dispensar un líquido de la muestra que contiene los espermatozoides a una pluralidad de unidades de citometría de flujo, cada una de las cuales se puede operar para separar los espermatozoides sobre la base de dicha una o más características de ADN, y operar dichas unidades mientras se comparte una plataforma integrada que consta de al menos uno de los siguientes elementos: (1) un suministro común de espermatozoides; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichos espermatozoides a dichas unidades de citometría de flujo. Nc2'. El método de la reclamación Nc1' en el que el colorante es un colorante excitable por la luz ultravioleta o un colorante excitable por la luz visible. Nc3'. El método de la reclamación Nc2' en el que el colorante es seleccionado del grupo que consiste en bisbenzimida, SYBR-14 y un conjugado, un análogo, o un derivado de éstos. Nc4'. El método de cualquiera de las reclamaciones Nc1'-Nc3' en el que la mezcla de tinción se somete a la temperatura durante un período suficiente para permitir que el colorante se una al ADN de tal manera que los espermatozoides X e Y se puedan separar de manera diferencial sobre la base de la fluorescencia. Nc5'. El método de la reclamación Nc4' en el que el período se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1-160 minutos. Nc6'. El método de cualquiera de las reclamaciones Nc1'-Nc5' en el que la mezcla de tinción consta además de un antioxidante.

Nc7'. El método de la reclamación NcV en el que dicha una o más características consisten en la presencia en los espermatozoides, de un cromosoma sexual X o Y. d. Multicanal (con crioconservación rápida) Nd1'. Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: separar los espermatozoides en poblaciones diferentes de espermatozoides sobre la base de una o más características de ADN especificadas usando un proceso de citometría de flujo que consiste en dispensar un líquido de la muestra que contiene los espermatozoides a una pluralidad de unidades de citometría de flujo, cada una de las cuales se puede operar para separar los espermatozoides sobre la base de dicha una o más características de ADN, y operar dichas unidades mientras se comparte una plataforma integrada que consta de a! menos uno de los siguientes elementos: (1) un suministro común de espermatozoides; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichos espermatozoides a dichas unidades de citometría de flujo; obtener una cantidad de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN de una o más de las poblaciones separadas de espermatozoides; agregar un crioprotector a dicha cantidad de espermatozoides; enfriar dicha cantidad de espermatozoides y el crioprotector hasta una temperatura de mantenimiento de aproximadamente 0-8° C; mantener a dichos espermatozoides y dicho crioprotector prácticamente a dicha temperatura de mantenimiento durante un período de menos de 60 minutos; y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides hasta una temperatura de -40° C. Nd2'. El método de la reclamación Nd1' en el que el paso de agregar un crioprotector consiste en agregar glicerol. Nd3'. El método de la reclamación Nd1' en el que dicha una o más características especificadas del ADN consisten en la presencia en los espermatozoides, de un cromosoma sexual X o Y. Nd4'. El método de la reclamación Nd1' en el que el paso que consiste en enfriar dicha cantidad de espermatozoides a dicha temperatura de mantenimiento comprende el uso de una velocidad de enfriamiento que es seleccionada para que dicha cantidad de espermatozoides se enfríe desde una temperatura superior a la temperatura de transición vitrea, por debajo de la cual los espermatozoides están sujetos al daño por choque frío, hasta dicha temperatura de mantenimiento, en aproximadamente 90 minutos. Nd5'. El método de la reclamación Nd4' en el que la velocidad de enfriamiento es una velocidad de enfriamiento prácticamente constante en el intervalo de aproximadamente 0,1-0,3° C por minuto. Nd6'. El método de la reclamación Nd1' en el que el paso de sobreenfriamiento de dicha cantidad de esperma consiste en enfriar los espermatozoides a una primera velocidad de enfriamiento hasta una temperatura que se aproxima a una zona de temperatura crítica a la que la formación de cristales de hielo y los cambios en la presión osmótica dañan los espermatozoides y enfriar el esperma a una segunda velocidad de enfriamiento más rápida que dicha primera velocidad de enfriamiento hasta una temperatura que es inferior a aproximadamente -30° C. Nd7'. El método de Nd1' que consiste además en: formar una mezcla de tinción que contiene los espermatozoides y un colorante fluorescente selectivo de ADN y someter la mezcla de tinción a una temperatura de al menos aproximadamente 40° C. e. Estrategia de separación (con tinción a alta temperatura) Ne1'. Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: formar una mezcla de tinción que contiene los espermatozoides y un colorante fluorescente selectivo de ADN y someter la mezcla de tinción a una temperatura de al menos aproximadamente 40° C; dispensar una corriente de líquido de dicha mezcla de tinción que contiene los espermatozoides a una primera ubicación y provocar que dicha corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides con un cromosoma sexual deseado, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides con un cromosoma sexual no deseado y terceras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides con el cromosoma sexual deseado y uno o más espermatozoides con el cromosoma sexual no deseado; separar dichas primeras gotitas de dichas segundas y terceras gotitas; recoger dichas primeras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides que tienen un cromosoma sexual deseado; identificar una cantidad de espermatozoides que tienen el cromosoma sexual deseado en dicha al menos una población; y variar la velocidad a la que se dispensa el líquido a dicha primera ubicación como una función de la cantidad de espermatozoides identificados como que tienen el cromosoma sexual deseado en dicha al menos una población, en relación con la cantidad total de espermatozoides que tienen el cromosoma sexual deseado en dichas primeras, segunda y terceras gotitas. Ne2'. Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: formar una mezcla de tinción que contiene los espermatozoides y un colorante fluorescente selectivo de ADN y someter la mezcla de tinción a una temperatura de al menos aproximadamente 40° C; dispensar una corriente de líquido de dicha mezcla de tinción que contiene los espermatozoides a una primera ubicación y provocar que dicha corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides con un cromosoma sexual deseado, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides con un cromosoma sexual no deseado y terceras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides con el cromosoma sexual deseado y uno o más espermatozoides con el cromosoma sexual no deseado; separar dichas primeras gotitas y terceras gotitas de dichas segundas gotitas; recoger dichas primeras y terceras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides que tienen un cromosoma sexual deseado; identificar una cantidad de espermatozoides que tienen el cromosoma sexual no deseado en dicha al menos una población; y variar la velocidad a la que se dispensa el líquido a dicha primera ubicación como una función de la cantidad de espermatozoides identificados como que tienen el cromosoma sexual no deseado en dicha al menos una población. f. Tinción a alta temperatura (c/ crioconservación rápida) NfV. Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: formar una mezcla de tinción que contiene los espermatozoides y un colorante fluorescente selectivo de ADN y someter la mezcla de tinción a una temperatura de al menos aproximadamente 40° C; separar dichos espermatozoides en dicha mezcla de tinción sobre la base de una característica específica de ADN; obtener una cantidad de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN; agregar un crioprotector a dicha cantidad de espermatozoides; enfriar dicha cantidad de espermatozoides y el crioprotector hasta una temperatura de mantenimiento de aproximadamente 0-8° C; mantener dichos espermatozoides y dicho crioprotector prácticamente a la temperatura de mantenimiento durante un período de menos de 60 minutos; y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides hasta una temperatura de -40° C. Nf2\ El método de la reclamación NF1 ' en el que el paso de agregar un crioprotector consiste en agregar glicerol. Nf3'. El método de la reclamación N T en el que dicha característica especificada del ADN consiste en la presencia en los espermatozoides, de un cromosoma sexual X o Y. Nf4'. El método de la reclamación Nf1 en el que el paso que consiste en sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides comprende el uso de una velocidad de enfriamiento que se selecciona para que dicha cantidad de espermatozoides se enfríe a aproximadamente 0-8° C en aproximadamente 90 minutos.

Nf5'. El método de la reclamación Nd4' en el que la velocidad de enfriamiento es una velocidad de enfriamiento prácticamente constante en el intervalo de aproximadamente 0,1-0,3° C por minuto. Nf6'. El método de la reclamación Nf1 en el que el paso de sobreenfriamiento de dicha cantidad de esperma consiste en enfriar los espermatozoides a una primera velocidad de enfriamiento hasta una temperatura que se aproxima a una zona de temperatura crítica a la que la formación de cristales de hielo y los cambios en la presión osmótica dañan los espermatozoides y enfriar el esperma a una segunda velocidad de enfriamiento más rápida que dicha primera velocidad de enfriamiento hasta una temperatura que es inferior a aproximadamente -30° C. g. Combinaciones múltiples Ng1'. (tinción a alta temperatura/separación multicanal/crioconservación rápida) Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: formar una mezcla de tinción que contiene los espermatozoides y un colorante fluorescente selectivo de ADN y someter la mezcla de tinción a una temperatura de al menos aproximadamente 40° C; separar los espermatozoides en dicha mezcla de tinción en poblaciones diferentes de espermatozoides sobre la base de una o más características de ADN especificadas usando un proceso de citometría de flujo que consiste en dispensar un líquido de la muestra a una pluralidad de unidades de citometría de flujo, cada una de las cuales se puede operar para separar los espermatozoides sobre la base de dicha una o más características de ADN, y operar dichas unidades mientras se comparte una plataforma integrada que consta de al menos uno de los siguientes elementos: (1) un suministro común de espermatozoides; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichos espermatozoides a dichas unidades de citometría de flujo; obtener una cantidad de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN; agregar un crioprotector a dicha cantidad de espermatozoides; enfriar dicha cantidad de espermatozoides y el crioprotector hasta una temperatura de mantenimiento de aproximadamente 0-8° C; mantener dichos espermatozoides y dicho crioprotector prácticamente a la temperatura de mantenimiento durante un período de menos de 60 minutos; y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides hasta una temperatura de -40° C. Ng2'. (Tinción a alta temperatura/separación multicanal/estrategia de separación de pureza elevada) Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: formar una mezcla de tinción que contiene los espermatozoides y un colorante fluorescente selectivo de ADN y someter la mezcla de tinción a una temperatura de al menos aproximadamente 40° C; dispensar una corriente de líquido de dicha mezcla de tinción que contiene los espermatozoides a cada una de una pluralidad de unidades de citometría de flujo y usar las unidades de citometría de flujo para romper cada corriente de líquido en gotitas, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides con un cromosoma sexual deseado, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides con un cromosoma sexual no deseado y terceras gotitas que cada contiene uno o más espermatozoides con el cromosoma sexual deseado y uno o más espermatozoides que tienen el cromosoma sexual no deseado; separar dichas primeras gotitas de dichas segundas y terceras gotitas usando un proceso de citometría de flujo de separación de gotitas que consiste en operar dicha pluralidad de unidades de citometría de flujo mientras se comparte una plataforma Integrada que consta al menos de uno de los siguientes elementos: (1) un suministro común de espermatozoides; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichos espermatozoides a dichas unidades de citometría de flujo; recoger dichas primeras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides que tienen un cromosoma sexual deseado; identificar una cantidad de espermatozoides que tienen el cromosoma sexual deseado en dicha al menos una población; y variar la velocidad a la que se dispensa el líquido a una o más de las unidades de citometría de flujo como una función de la cantidad de espermatozoides identificados como que tienen el cromosoma sexual deseado en dicha al menos una población, en relación con la cantidad total de espermatozoides que tienen el cromosoma sexual deseado en dichas primeras, segundas y terceras gotitas. Ng3'. (Tinción a alta temperatura/separación multicanal/estrategia de separación de alta recuperación) Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: formar una mezcla de tinción que contiene los espermatozoides y un colorante fluorescente selectivo de ADN y someter la mezcla de tinción a una temperatura de al menos aproximadamente 40° C; dispensar una corriente de líquido de dicha mezcla de tinción que contiene los espermatozoides a cada una de una pluralidad de unidades de citometría de flujo y usar las unidades de citometría de flujo para romper cada corriente de líquido en gotitas, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides con un cromosoma sexual deseado, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides con un cromosoma sexual no deseado y terceras gotitas que cada contiene uno o más espermatozoides con un cromosoma sexual deseado y uno o más espermatozoides que tienen un cromosoma sexual no deseado; separar dichas primeras gotitas y terceras gotitas de dichas segundas gotitas usando un proceso de citometría de flujo de separación de gotitas que consiste en operar dicha pluralidad de unidades de citometría de flujo mientras se comparte una plataforma integrada que consta al menos de uno de los siguientes elementos: (1) un suministro común de espermatozoides; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichos espermatozoides a dichas unidades de citometría de flujo; recoger dichas primeras y terceras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides que tienen un cromosoma sexual deseado; identificar una cantidad de espermatozoides que tienen el cromosoma sexual no deseado en dicha al menos una población; y variar la velocidad a la que se dispensa el líquido a una o más de las unidades de citometría de flujo como una función de la cantidad de espermatozoides identificados como que tienen el cromosoma sexual no deseado en dicha al menos una población. Ng4'. (Tinción a alta temperatura/separación multicanal/estrategia de separación/crioconservación rápida) Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: formar una mezcla de tinción que contiene los espermatozoides y un colorante fluorescente selectivo de ADN y someter la mezcla de tinción a una temperatura de al menos aproximadamente 40° C; dispensar una corriente de líquido de dicha mezcla de tinción que contiene espermatozoides a cada una de una pluralidad de unidades de citometría de flujo, usando las unidades de citometría de flujo para romper cada corriente de líquido en gotitas, y separar dichas gotitas según una o más características específicas de ADN de los espermatozoides contenidos en las gotitas, para obtener una o más poblaciones de espermatozoides que tiene una característica de ADN deseada mediante un proceso de citometría dé flujo de separación de gotitas que consiste en operar dicha pluralidad de unidades de citometría de flujo mientras se comparte una plataforma integrada que consta de al menos uno de los siguientes elementos: (1) un suministro común de espermatozoides; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichos espermatozoides a dichas unidades de citometría de flujo; variar la velocidad a la que el líquido se dispensa a una o más de las unidades de citometría de flujo como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha una o más poblaciones de espermatozoides que tienen una característica de ADN deseada; y (2) la cantidad de espermatozoides que tienen la característica de ADN deseada en dicha una o más poblaciones de espermatozoides en relación con la cantidad total de espermatozoides que tienen la característica de ADN deseada en dichas gotitas; agregar un crioprotector para proteger una cantidad de espermatozoides obtenidos de dicha una o más poblaciones de espermatozoides; enfriar dicha cantidad de espermatozoides y dicho crioprotector hasta una temperatura de mantenimiento de aproximadamente 0-8° C; mantener a dichos espermatozoides y dicho crioprotector prácticamente a dicha temperatura de mantenimiento durante un período de menos de 60 minutos; y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides hasta una temperatura de -40° C.

O'. Cronograma general 01'. Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: recoger espermatozoides de un animal macho; teñir los espermatozoides con un colorante fluorescente selectivo de ADN; iluminar los espermatozoides con radiación electromagnética para hacer que el colorante fluorescente selectivo de ADN emita luz fluorescente; detectar la luz fluorescente emitida por los espermatozoides; analizar la luz fluorescente emitida por los espermatozoides para determinar una o más características de ADN específicas de los espermatozoides; separar los espermatozoides en poblaciones múltiples de espermatozoides sobre la base de dichas una o más características de ADN específicas; obtener una cantidad de espermatozoides que tienen una característica de ADN deseada de una de dichas poblaciones múltiples de espermatozoides; y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides; en el que el paso de sobreenfriamiento se completa en menos de aproximadamente 12 horas después de recoger los espermatozoides. 02'. El método de la reclamación 01' en el que el paso que consiste en sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides se completa en menos de aproximadamente 8 horas después de recoger los espermatozoides. 03'. El método de la reclamación 01' en el que el paso que consiste en sobreenfriar dichos espermatozoides se completa en menos de aproximadamente 6 horas después de recoger los espermatozoides. 04'. El método de la reclamación 01' en el que el paso que consiste en sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides se completa en menos de aproximadamente 3 horas después de recoger los espermatozoides. 05'. El método de la reclamación 01' en el que el paso que consiste en sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides se completa en menos de aproximadamente 2 horas después de recoger los espermatozoides. 06'. El método de la reclamación 01' en el que el paso que consiste en sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides se completa en menos de aproximadamente 1 hora después de recoger los espermatozoides. 07'. El método de la reclamación 01' en el que los espermatozoides son espermatozoides vivos. 08'. El método de la reclamación 07' en el que dichas una o más características especificas del ADN consisten en la presencia en los espermatozoides de un cromosoma sexual X o Y. 09'. El método de la reclamación 01' que consta además de los pasos de descongelar dicha cantidad de espermatozoides después del paso de sobreenfriamiento y luego fecundar un óvulo con un espermatozoide de dicha cantidad de espermatozoides mediante inseminación artificial. 010'. El método de la reclamación 01' que consiste además en producir una diversidad de cantidades de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN y distribuir dicha diversidad de cantidades de espermatozoides a los criadores de animales mediante un sistema de distribución comercial.

P'. Velocidades de separación P1'. Un método para separar espermatozoides vivos según el contenido cromosómico que consiste en: (a) agregar un colorante fluorescente selectivo de ADN a un suministro de espermatozoides vivos; (b) hacer circular un líquido de la muestra que contiene dichos espermatozoides y un líquido envolvente a través de una boquilla orientadora que tiende a hacer girar a los espermatozoide en una orientación deseada; dicho líquido de la muestra y líquido envolvente salen de la boquilla como una corriente de líquido que consta de un núcleo de la corriente formado por el líquido de la muestra y los espermatozoides y un líquido envolvente que rodea el núcleo de la corriente; (c) aplicar energía acústica a la boquilla para provocar que la corriente de líquido se rompa en una corriente de gotitas en un sitio de división de gotitas corriente abajo de la boquilla; (d) dirigir un haz de radiación electromagnética para cruzar la corriente de líquido en un sitio de interrogación corriente arriba del sitio de división de gotitas para excitar el colorante fluorescente en los espermatozoides, provocando de ese modo emisiones fluorescentes por parte de los espermatozoides; (e) detectar las emisiones fluorescentes con un fotodetector que produce una señal analógica que varía con el tiempo indicativa de la intensidad de las emisiones fluorescentes detectadas; (f) procesar electrónicamente dicha señal analógica que varía con el tiempo para determinar el contenido cromosómico de una pluralidad de espermatozoides; (g) aplicar selectivamente una carga electrostática a la corriente de líquido para aplicar selectivamente o no aplicar una carga eléctrica a las gotitas según el contenido cromosómico de los espermatozoides contenidos en las gotitas; (h) usar un campo eléctrico para desviar las gotitas según su carga, separando de ese modo los espermatozoides contenidos en las gotitas que tienen la misma carga de los espermatozoides contenidos en las gotitas que tienen una carga diferente; y (i) recoger al menos una población de espermatozoides vivos a una velocidad de al menos 5.000 espermatozoides por segundo. ?2'. P1 ' en el que por lo menos una población recogida en el paso de recolección tiene una pureza de al menos 85%. ?3'. P1 ' en el que dicho paso de recolección consiste en recoger al menos una población de espermatozoides vivos a una velocidad de al menos 6.000 espermatozoides por segundo. P4'. PV en el que dicho paso de recolección consiste en recoger al menos una población de espermatozoides vivos a una velocidad de al menos 7.000 espermatozoides por segundo. P5'. PV que consiste además en operar dos o más unidades de citometría de flujo en paralelo de modo que cada una lleve a cabo los pasos (b) hasta (i) mientras comparten una plataforma integrada; dicha plataforma integrada consta de uno o más de los siguientes: (1 ) un suministro común de partículas; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene tales partículas a dichas unidades de citometría de flujo. ?6'. P5' en el que el paso de operar dichas dos o más unidades de citometría de flujo mientras comparten una plataforma integrada consiste en operar un láser de estado sólido de modo cerrado para producir un único haz que consta de una pluralidad de pulsos electromagnéticos donde la potencia máxima, de cada pulso es mayor que la potencia de salida promedio del láser, divide el haz único en dos o más haces y dirige cada uno de dichos dos o más haces a una de las unidades de citometría de flujo.

R'. CSD y exploración de rendija a. Espermatozoides RV. Un método para analizar las características de ADN cromosómico de los espermatozoides de animales en una corriente de líquido que tiene una dirección de flujo, cada espermatozoide tiene una cabeza con un núcleo que comprende una región cromosómica localizada que contiene al menos un cromosoma, dicho núcleo tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente; dicho método consiste en: enfocar un haz de radiación electromagnética en la corriente de líquido como una mancha luminosa generalmente elíptica que tiene una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente, el ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicho núcleo, dichos espermatozoides se adaptan para pasar a través de dicha mancha luminosa dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de los espermatozoides, incluidas las emisiones por parte de dichas regiones del cromosoma indicativas de las características del ADN cromosomico de las regiones; detectar y convertir al menos algunas de dichas emisiones de las regiones del cromosoma en señales eléctricas analógicas que varían con el tiempo indicativas de dichas características de ADN cromosomico; muestrear digitalmente la señal analógica que varía con el tiempo y proporcionar una salida que incluye información digital correspondiente a dicha señal analógica que varia con el tiempo; analizar la información digital para extraer la información indicativa de una característica derivada de las señales analógicas que varían con el tiempo; y clasificar al menos algunos de los espermatozoides por la presencia de una característica particular de ADN cromosómico basándose al menos en parte en dicha información extraída. R2'. El método de la reclamación R1' en el que dichas características del ADN cromosómico son indicativas del sexo de los espermatozoides. R3'. El método de la reclamación R2' en el que dichos espermatozoides son espermatozoides bovinos. R4'. El método de la reclamación R3' en el que dicha región cromosómica se localiza dentro de un área del núcleo que se extiende en no más de aproximadamente un 20% de la longitud del núcleo sobre cualquiera de los lados de un centro longitudinal del núcleo.

R5'. El equipo de la reclamación R3' en el que dicha región cromosómica se localiza dentro de un área del núcleo que se extiende en no más de aproximadamente un 10%-15% de la longitud del núcleo sobre cualquiera de los lados de un centro longitudinal del núcleo. R6'. El método de la reclamación R1' en el que el paso de muestreo digital comprende el muestreo en sincronía de la salida analógica que varía con el tiempo. R71. El método la reclamación R1' en el que dicho ancho de la mancha luminosa es menor que 3,0 µ??, aproximadamente. R8'. El método de la reclamación R7' en el que dicha longitud de la mancha luminosa es mayor que 100 µ??, aproximadamente. R9'. El método de la reclamación R1' que consiste además en ejercer una fuerza sobre los espermatozoides en la corriente que tiende a hacerlos virar en una orientación deseada antes de que la corriente pase a través de dicho haz. R10'. El método de la reclamación R1' que consiste además en separar en gotitas dichos espermatozoides según dichas características de ADN. R1 '. El método de la reclamación R1' que consiste además en separar por fotoablación dichos espermatozoides según dichas características del ADN cromosómico. R12'. El método de la reclamación R1' que consiste además en separar por desviación del líquido dichos espermatozoides según dichas características del ADN cromosómico. R13'. El método de la reclamación R1' en el que dicha característica derivada comprende la pendiente de la señal analógica que varía con el tiempo en un punto de la señal en relación con un valor de umbral. b. Partículas genéricas R14'. Un método para analizar partículas en una corriente de líquido que tiene una dirección de flujo; dicho método consiste en: enfocar un haz de radiación electromagnética en la corriente de líquido como una mancha luminosa generalmente elíptica que tiene una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente, el ancho de la mancha luminosa del haz es menor que el tamaño de dichas partículas, dichas partículas se adaptan para pasar a través de dicha mancha luminosa dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las partículas; detectar y convertir al menos algunas de dichas emisiones en señales eléctricas analógicas que varían con el tiempo indicativas de características de las partículas; muestrear digitalmente la señal analógica que varía con el tiempo y proporcionar una salida que incluye información digital correspondiente a dicha señal analógica que varía con el tiempo; analizar la información digital para extraer la información indicativa de una característica derivada de las señales analógicas que varían con el tiempo; y clasificar al menos algunas de las partículas según posean una característica particular basándose al menos en parte en dicha información extraída. R15'. El método de la reclamación R14' en el que el paso de muestreo digital comprende el muestro en sincronía de la salida analógica que varía con el tiempo. R16'. El método de la reclamación R14' que consiste además en separar en gotitas dichas partículas según dicha clasificación. R17'. El método de la reclamación R14' que consiste además en separar por fotoablación dichos espermatozoides según dichas características del ADN cromosómico. R18'. El método de la reclamación R14' que consiste además en separar por desviación del líquido dichos espermatozoides según dichas características del ADN cromosómico. R 9'. El método de la reclamación R14' en el que la característica derivada comprende la pendiente de la señal analógica que varía con el tiempo en un punto de la señal en relación con un valor de umbral.

S'. Equipo de FC de láser de pulsos S1'. Un aparato de citometría de flujo que consiste en: un canal de flujo para dirigir una corriente de líquido que contiene partículas de la muestra a través de un sitio de interrogación de partículas; un haz láser operable para emitir una pluralidad de pulsos de radiación electromagnética (EMR); cada pulso tiene una potencia máxima que supera la potencia promedio del láser, dichos pulsos se dirigen a lo largo de un recorrido del haz desde el láser hasta el sitio de interrogación de las partículas; un circuito de sincronización que se puede operar para producir una señal de sincronización indicativa de la llegada de los pulsos al sitio de interrogación; un detector adaptado para detectar EMR del sitio de interrogación y que se puede operar para producir una señal analógica que varía con el tiempo indicativa de la intensidad de la EMR detectada; un convertidor analógico-digital adaptado para recibir la señal analógica que varía con el tiempo como entrada y para analizar la señal analógica para producir una salida digitalizada; y un procesador electrónico que se puede operar para analizar la salida digitalizada del convertidor analógico-digital como una función de la señal de sincronización. S2'. El equipo de S1' en el que el haz láser se puede operar para emitir pulsos de EMR que tienen un ancho de aproximadamente 1-100 picosegundos a una frecuencia de pulsos de aproximadamente 50-150 MHz a una potencia de aproximadamente 100-500 milivatios. S3'. El equipo de S2' en el que el láser se puede operar para emitir pulsos de EMR que tienen un ancho de aproximadamente 5-20 picosegundos a una frecuencia de aproximadamente 70-100 MHz. S4'. El equipo de S1' en el que el circuito de sincronización consta de un sensor adaptado para percibir la luz correspondiente a los pulsos de EMR incluida la luz dispersada generada por la interacción de cada pulso con la corriente de líquido o incluida la luz del pulso de EMR. S5'. El equipo de S1' en que el circuito de sincronización consta de un oscilador que se puede operar para hacer que el láser emita un pulso. S6'. El equipo de S1' en el que el detector se adapta para detectar emisiones fluorescentes estimuladas mediante la energía de excitación de los pulsos. S7'. El equipo de S1' en el que el láser comprende un láser de estado sólido de modo cerrado. S8'. El equipo de S1' en el que el láser comprende un láser de conmutación de Q. S9'. El equipo S1' en el que el láser comprende un láser de vaciado de cavidad. S10'. El equipo de ST en el que el detector es un tubo fotomultiplicador.

S1 T. El equipo de S9' en el que el tubo fotomultiplicador tiene un tiempo de respuesta de menos de aproximadamente 2000 picosegundos. S12'. El equipo de S1' en el que el procesador electrónico se puede operar para procesar la salida digitalizada como un pulso de ondas. S13'. El equipo de S12' en el que el procesador electrónico se puede operar para extraer al menos una de las siguientes características de la salida digitalizada: diferencia crítica de pendiente; tiempo de elevación del pulso; punto máximo el pulso; área del pulso.

T. Método de láser de pulsos T . Un método para analizar partículas contenidas en una corriente de líquido según fluyen por un sitio de interrogación; dicho método consta de los pasos de: emitir una pluralidad de pulsos de radiación electromagnética (EMR) de un láser, en el que la potencia máxima de cada pulso supera la potencia promedio del láser; iluminar intermitentemente la corriente de líquido y las partículas allí contenidas dirigiendo dichos pulsos a lo largo del recorrido del haz hasta el sitio de interrogación de las partículas; detectar EMR del sitio de interrogación; generar una señal analógica que varía con el tiempo indicativa de la intensidad de la EMR detectada; generar una señal de sincronización indicativa de la llegada de un pulso al sitio de interrogación; transformar la señal analógica que varía en el tiempo en una señal digital; y analizar la señal digital para determinar características de las partículas en la corriente de líquido. 12' . El método de TV en el que el paso de convertir la señal analógica que varía en el tiempo en una señal digital comprende muestrear la señal analógica a la vez que se sincroniza para coincidir con la iluminación de la corriente de líquido por un pulso. T3'. El método de TV en el que el paso de iluminar la corriente de líquido da como resultado la excitación de un fluoroforo asociado con dichas partículas y el paso de convertir la señal analógica que varía con el tiempo en una señal digital comprende el muestreo de la señal analógica en un momento predeterminado después de la iluminación del sitio de interrogación y en la caída temporal del pulso de fluorescencia. T4'. El método de TV en el que cada pulso contiene energía suficiente para saturar dicho fluoroforo. T5'. El método de TV en el que el paso de detectar luz del sitio de interrogación consiste en usar un tubo fotomultiplicador para detectar emisiones fluorescentes de un fluoroforo asociado a dichas partículas. T6'. El método de TV en que el paso de emisión de pulsos de radiación electromagnética comprende el paso de emitir entre aproximadamente 50-150 millones pulsos por segundo, en el que cada pulso tiene un ancho entre aproximadamente de 1-100 picosegundos. T7'. El método de T1' en el que el paso de generar una señal de sincronización consiste en percibir la luz dispersada que resulta de la interacción de un pulso con la corriente de líquido. T8'. El método de 7T en el que el paso de generar una señal de sincronización consiste en generar una señal del oscilador y el paso de emitir una pluralidad de pulsos de EMR de un láser consiste en usar la señal del oscilador para hacer que el haz láser emita un pulso. T9'. El método de T1' en el que el paso de analizar la señal digital consiste en analizar la señal digital como un pulso de ondas. T10'. El método de T9' en el que el paso de analizar la señal digital consiste además en extraer al menos una de las siguientes características de la señal: diferencia crítica de pendiente; tiempo de elevación del pulso; punto máximo el pulso; área del pulso. T11'. El método de TT en el que dichas partículas son espermatozoides.

U' íReservedl V Optimización del CV V1'. Un proceso para evaluar una serie de condiciones para teñir una población de células para separación, la población comprende un primer tipo y un segundo tipo de células; el proceso consiste en: (a) teñir una fracción de la población de células con un colorante fluorescente de acuerdo con una serie de condiciones de tinción; (b) exponer las células teñidas a la radiación electromagnética a medida que las células se hacen pasar a través de un sitio de interrogación de un citómetro de flujo a una velocidad, R; (c) determinar una característica de emisión de fluorescencia de las células expuestas; (d) usar la característica de fluorescencia determinada para clasificar a las células expuestas en dos o más subpoblaciones de células, siendo una de las subpoblaciones una subpoblación enriquecida del primer tipo de células; (e) determinar un coeficiente de variación para la característica de emisión de fluorescencia de las células de la subpoblación enriquecida para proporcionar una indicación de la eficiencia de separación para las condiciones de tinción; y (f) determinar si se debe modificar alguna de las condiciones de tinción según las cuales las células se van a teñir o la velocidad, R, a la que las células teñidas se van a hacer pasar por el sitio de interrogación del citómetro de flujo para mejorar la eficiencia de separación. V2'. El proceso de la reclamación V11, en el que dicha fracción consta de una primera fracción y dicha serie de condiciones de tinción consta de una primera serie de condiciones de tinción, el proceso además consiste en teñir una segunda fracción de dicha población de células de acuerdo con una segunda serie de condiciones de tinción diferentes de la primera serie y realizar los pasos de (b) a (e) con dicha segunda fracción de la población de células. V3'. El proceso de la reclamación V2' en el que la segunda fracción se tiñe después de determinar el coeficiente de variación de la primera fracción. V4'. El proceso de la reclamación V2' en el que la segunda serie de condiciones de tinción difiere de la primera serie de condiciones de tinción en al menos uno de las siguientes: (1) la concentración del colorante fluorescente; (2) la duración de un período de tinción usado para teñir las células; y (3) una temperatura de las células durante un período de tinción usado para teñir las células. V5'. El proceso de la reclamación V2', que además consiste en teñir una tercera fracción de dicha población de células de acuerdo con una tercera serie de condiciones de tinción diferentes de la primera y segunda series y realizar los pasos de (b) a (e) con la tercera fracción de la población de células. V6'. El proceso de la reclamación V5', que además consiste en teñir una cuarta fracción de dicha población de células de acuerdo con una cuarta serie de condiciones de tinción diferentes de la primera, segunda y tercera series y realizar los pasos de (b) a (e) con la cuarta fracción de la población de células. V7'. El proceso de la reclamación V6', que además consiste en teñir una quinta fracción de dicha población de células de acuerdo con una quinta serie de condiciones de tinción diferentes de la primera, segunda, tercera y cuarta series y realizar los pasos de (b) a (e) con la quinta fracción de la población de células. V8'. El proceso de la reclamación V2', que además consiste en variar selectivamente las condiciones de la primera serie de condiciones de tinción sobre la base de dicha determinación para obtener la segunda serie de condiciones de tinción. V9.' El proceso de la reclamación V2', en el que una condición de tinción modificada según se determinó en el paso (f) en la segunda fracción se aplica a la tinción del resto de la población de células. V10'. El proceso de la reclamación V1', en el que múltiples fracciones de células se tiñen en el paso (a), cada fracción se tiñe según una serie única de condiciones de tinción, en el que los pasos de (b) a (e) se llevan a cabo para cada fracción, y en el que el paso (f) consiste en usar los coeficientes de variación respectivos para determinar la serie de condiciones de tinción a usar para teñir otras células en dicha población. V '. El proceso de la reclamación V1', en el que las células son espermatozoides. V12'. El proceso de la reclamación V111, en el que el primer tipo de células consiste en espermatozoides que tienen el cromosoma X. V13'. El proceso de la reclamación V11 en el que el paso (a) consiste en teñir las células con Hoechst 33342.

V14'. El proceso de la reclamación VT en el que dicha característica de emisión de fluorescencia consiste en una característica de un pulso de ondas de fluorescencia correspondiente al desplazamiento de una célula a través del sitio de interrogación, y en el que dicha característica es indicativa de al menos una de las siguientes: (1) intensidad de fluorescencia total; y (2) intensidad de fluorescencia pico. V15'. El proceso de la reclamación V1' además consiste en determinar antes del paso (f) si el coeficiente de variación del paso (e) es igual a o menor que un coeficiente de variación predeterminado y repetir los pasos de (a) a (e) usando una serie diferente de condiciones de tinción para teñir una fracción diferente de las células cada vez hasta que el coeficiente de variación determinado en el paso (e) sea igual a o menor que el coeficiente de variación predeterminado, y en el que el paso (f) consiste en determinar si usar las condiciones de tinción para teñir otras células si el coeficiente de variación del paso (e) para las respectivas condiciones de tinción es igual a o menor que el coeficiente de variación predeterminado. V16' Un proceso para evaluar una serie de condiciones para teñir una población de células para la separación; la población consta de un primer tipo y un segundo tipo de células; el proceso consiste en: (a) teñir una fracción de la población de células con un colorante fluorescente de acuerdo con una serie de condiciones de tinción; (b) exponer las células teñidas a radiación electromagnética a medida que las células teñidas pasan a través de un sitio de interrogación de un citómetro de flujo a una velocidad, R; (c) determinar una característica de emisión de fluorescencia de las células expuestas; (d) usar la característica de emisión de fluorescencia determinada para clasificar a las células expuestas en dos o más subpoblaciones de células, siendo una de las subpoblaciones una subpoblación enriquecida del primer tipo de células; (e) determinar un coeficiente de variación para la característica de emisión de fluorescencia de las células de la subpoblación enriquecida para proporcionar una indicación de la eficacia de separación para las condiciones de tinción; (f) determinar si es necesario modificar alguna de las condiciones de tinción según cuál fracción de células se va a teñir o la velocidad, R, a la que se hacen pasar las células teñidas por el sitio de interrogación del citómetro de flujo para mejorar la eficiencia de separación; y (g) aplicar la condición de tinción modificada al resto de la población de células. V171. El proceso de la reclamación V161 que consiste además en separar el resto de la población de células en un citómetro de flujo para obtener una población de la muestra del primer tipo de células enriquecida. V18'. El proceso de la reclamación V16', en el que dicha fracción consta de una primera fracción y dicha serie de condiciones de tinción consta de una primera serie de condiciones de tinción, el proceso consiste además en teñir una segunda fracción de dicha población de células de acuerdo con una segunda serie de condiciones de tinción diferentes de la primera serie y realizar los pasos de (b) a (e) con dicha segunda fracción de la población de células. V19'. El proceso de la reclamación V18' en el que la segunda fracción se tiñe después de determinar el coeficiente de variación de la primera fracción. V20'. El proceso de la reclamación V18' en el que la segunda serie de condiciones de tinción difiere de la primera serie de condiciones de tinción en al menos uno de las siguientes: (1) la concentración del colorante fluorescente; (2) la duración de un período de tinción usado para teñir las células; y (3) la temperatura de las células durante un período de tinción usado para teñir las células. V21'. El proceso de la reclamación V18', que además consiste en teñir una tercer fracción de dicha población de células de acuerdo con una tercera serie de condiciones de tinción diferentes de la primera y segunda series y realizar los pasos de (b) a (f) con la tercera fracción de la población de células. V22'. El proceso de la reclamación V21', que además consiste en teñir una cuarta fracción de dicha población de células de acuerdo con una cuarta serie de condiciones de tinción diferentes de la primera, segunda y tercera series y realizar los pasos de (b) a (f) con la cuarta fracción de la población de células.

V23'. El proceso de la reclamación V22', que consiste además en teñir una quinta fracción de dicha población de células de acuerdo con una quinta serie de condiciones de tinción diferentes de la primera, segunda, tercera y cuarta series y realizar los pasos de (b) a (f) con la quinta fracción de la población de células. V24'. El proceso de la reclamación V18\ que además comprende, antes del paso (g), seleccionar una serie de condiciones de tinción para usar en el paso (g) que dan como resultado un nivel de coeficiente de variación para la característica de emisión de fluorescencia que es igual a o menor que un coeficiente de variación predeterminado. V25'. El proceso de la reclamación V24', en el que el coeficiente de variación predeterminado es de aproximadamente 1 ,3% o menor. V26'. El proceso de la reclamación V16', que además consiste en determinar, antes del paso (f), si el coeficiente de variación del paso (e) es igual a o menor que un coeficiente de variación predeterminado y repetir los pasos de (a) a (e) usando una serie diferente de condiciones de tinción para teñir una fracción diferente de las células cada vez hasta que el coeficiente de variación determinado en el paso (e) sea igual a o menor que el coeficiente de variación predeterminado, y en el que el paso (f) consiste en determinar si usar las condiciones de tinción para teñir otras células si el coeficiente de variación del paso (e) para las condiciones de tinción respectivas es igual a o menor que el coeficiente de variación predeterminado. V27'. El proceso de la reclamación V16', en el que las células son espermatozoides. V28'. El proceso de la reclamación V27', en el que el primer tipo de células consiste en espermatozoides que tienen el cromosoma X. V29'. El proceso de la reclamación V16', en el que el paso (a) consiste en teñir las células con Hoechst 33342. V30'. El proceso de la reclamación V16', en el que dicha característica de emisión de fluorescencia comprende una característica de un pulso de ondas de fluorescencia correspondiente al desplazamiento de una célula a través del sitio de interrogación, y en el que dicha característica es indicativa de al menos una de las siguientes: (1) intensidad de fluorescencia total; y (2) intensidad de fluorescencia pico.

X'. Método de calibración automatizado XV. Un método para verificar continuamente la calibración de separación adecuada en un citómetro de flujo de separación de gotitas que aplica selectivamente o no aplica una de un conjunto de una o más cargas eléctricas a una pluralidad de gotitas a medida que se forman a partir de una corriente de liquido continua en un sitio de división de gotitas y separa electrostáticamente las gotitas en dos o más corrientes de gotitas separadas, dependiendo la selección de la carga eléctrica para cada gotita del contenido esperado de la gotita sobre la base de una regulación de demora de gotas que representa un estimado del tiempo que transcurre entre el momento en que una partícula contenida en la corriente de líquido continua es detectada en un sitio de interrogación del citómetro de flujo y la llegada de dicha partícula al sitio de división de gotitas; el método consiste en: (a) iluminar gotitas de una de dichas corrientes de gotitas separadas dirigiendo un haz de iluminación a lo largo de un eje del haz en una dirección hacia adelante a través de un sistema de lente para provocar la emisión de luz fluorescente por parte de cualquier partícula contenida en las gotitas; (b) usar dicho sistema de lente para recoger una parte de dicha luz fluorescente y dirigirla en una dirección hacia atrás a lo largo del eje del haz; (c) detectar al menos parte de la luz fluorescente recogida y generar una señal de salida representativa de la luz detectada; y (d) analizar la señal de salida y, sobre la base del análisis, ajusfar automáticamente al menos una de las siguientes: (1) la regulación de demora de gotas; y (2) la amplitud de una carga en dicho conjunto de cargas. X2'. El método de X1' en el que el paso de ajuste comprende ajusfar la regulación de demora de gotas como una función de la diferencia entre las emisiones de fluorescencia detectadas y las emisiones de fluorescencia que hubieran producido las gotitas que tuvieran el contenido esperado. El método de X1' en el que el paso de ajuste comprende ajustar la amplitud de una carga en dicho conjunto de cargas como una función de la variación en una intensidad de pico promedio de emisiones de fluorescencia detectadas para gotitas que contienen partículas fluorescentes. X4'. El método de XV en el que el paso de iluminación consiste en usar un cable de fibra óptica para guiar luz de la fuente de luz hasta una posición adyacente a dichas corrientes de gotitas separadas. X5'. El método de XV en el que el campo eléctrico es generado por un par de placas def lectoras eléctricamente cargadas, y en el que el paso de iluminación consiste en ¡luminar las gotitas a medida que se desplazan entre las placas deflectoras. X6. El método de X5' en el que al menos una de las placas deflectoras está sostenida por un soporte aislado eléctricamente, y en el que el paso de iluminación consiste en iluminar las gotitas a través de un orificio del soporte a medida que las gotitas se desplazan a través del campo eléctrico. X7'. El método de XV consiste además en usar le fuente de luz para iluminar las partículas en el sitio de interrogación. X8'. El método de X1 ' además consiste en realizar los pasos de (a) a (c) para cada una de las restantes de dichas dos o más corrientes de gotitas, y en el que el paso (d) consiste además en analizar cada una de las respectivas señales de salida y ajustar al menos una de las siguientes: (1) la regulación de demora de gotas como una función de la diferencia entre las emisiones de fluorescencia detectadas y las emisiones de fluorescencia que habrían producido las gotitas que tuvieran el contenido esperado; y (2) la amplitud de una carga en dicho conjunto de cargas como una función de las variaciones en la intensidad de pico promedio de emisiones de fluorescencia detectadas para gotitas que contienen partículas fluorescentes en al menos una de dichas corrientes de gotitas. X9'. El método de X8' en el que el campo eléctrico es generado por un par de placas deflectoras eléctricamente cargadas, y en el que el paso de iluminación consiste en ¡luminar las gotitas a medida que se desplazan entre las placas deflectoras. ?10? El método de X9' en el que al menos una de las placas deflectoras está sostenida por un soporte aislado eléctricamente, y en el que el paso de iluminación consiste en iluminar las gotitas a través de orificios del soporte a medida que las gotitas se desplazan a través del campo eléctrico.

Y'. Método de de calibración de la corriente de prueba Y1'. Un método para verificar continuamente la calibración de separación adecuada en un citómetro de flujo de separación de gotitas, que aplica selectivamente o no aplica una de un conjunto de una o más cargas eléctricas a una pluralidad de gotitas a medida que se forman a partir de una corriente de liquido continua en un sitio de división de gotitas y separa electrostáticamente las gotitas en dos o más corrientes de gotitas separadas, dependiendo la selección de la carga eléctrica para cada gotita del contenido esperado de la gotita sobre la base de una regulación de demora de gotas, que representa un estimado del tiempo que transcurre entre el momento en que una partícula contenida en la corriente de líquido continua es detectada en un sitio de interrogación del citómetro de flujo y la llegada de dicha partícula al sitio de división de gotitas; el método consiste en: seleccionar gotitas que se estime que tengan prácticamente probabilidad cero de contener una partícula; aplicar una carga de dicho conjunto de cargas a las gotitas seleccionadas para formar una corriente de prueba de las gotitas seleccionadas; iluminar las gotitas en la corriente de prueba; y detectar cualquier luz emitida o dispersada por cualquier partícula de las gotitas seleccionadas. Y2'. El método de Y1' además consiste en ajustar la regulación de demora de gotas si la luz detectada en el paso de detección supera un nivel de umbral. Y3'. El método de Y2' en el que el paso de ajuste se realiza automáticamente. Y4'. El método de Y1' en el que la carga aplicada en el paso de carga es una carga neutra. Y51. El método de Y1' en el que los pasos de iluminación y detección se realizan utilizando un sensor de epiluminación.

?'. Sistema de corrección de separación ZV. Un sistema de corrección de! sistema de separación para un citómetro de flujo de separación de gotitas que comprende: un elemento cargador para aplicar selectivamente una carga eléctrica de un conjunto de cargas eléctricas a cada gotita en una corriente de gotitas a medida que las gotitas se forman a partir de una corriente de líquido continua en un sitio de división de gotitas; un par de placas deflectoras cargadas eléctricamente más adelante abajo del elemento cargador colocadas de modo que las gotitas pasan a través de las placas deflectoras para separar las gotitas según su carga; y un sistema de eliminación de desechos que comprende al menos alguno de los elementos siguientes: (1) un sistema de aire que se puede activar selectivamente para eliminar desechos del elemento cargador; y (2) un sistema de aire que se puede activar selectivamente para eliminar desechos de las placas deflectoras. Z2'. El sistema de ZV en el que dicho sistema de eliminación de desechos comprende el elemento (1) y el elemento (2). Z3'. El sistema de Z1' en el que el sistema de eliminación de desechos se adapta para ser activado automáticamente por un procesador cuando el procesador determina que los desechos provenientes de las gotitas dispersas están interfiriendo con la separación de gotitas. Z4'. El sistema de Z1' en el que el sistema de eliminación de desechos comprende el elemento (1), y en el que dicho sistema de aire que se puede activar selectivamente del elemento (1) consta de un pasaje de vacío que tiene una apertura adyacente a dicho elemento cargador para eliminar mediante vacío los desechos del elemento cargador. Z5'. El sistema de ZV en el que el sistema de eliminación de desechos comprende el elemento (2), y en el que dicho sistema de aire que se puede activar selectivamente del elemento (2) consta de pasajes de vacío que tienen aperturas a través de las cuales se dispensa gas comprimido para eliminar por soplado los desechos de las placas deflectoras. Z6.' Un método para operar un sistema de citómtero de flujo de separación de gotitas, el método consiste en: usar un elemento cargador para aplicar selectivamente una carga eléctrica de un conjunto de cargas eléctricas a cada gotita en una corriente de gotitas a medida que las gotitas se forman a partir de una corriente de líquido continua en un sitio de división de gotitas; hacer pasar las gotitas entre un par de placas deflectoras eléctricamente cargadas corriente abajo del elemento cargador para separar las gotitas según su carga; usar un procesador para determinar si los desechos están interfiriendo con la separación de gotitas; y eliminar dichos desechos mediante un sistema de eliminación de desechos bajo el control del procesador si el procesador determina que los desechos están interfiriendo con la separación de gotitas, dicho sistema de eliminación de gotitas comprende al menos uno de los elementos siguientes: (1) un sistema de aire que se puede activar selectivamente para eliminar desechos del elemento cargador; y (2) un sistema de aire que se puede activar selectivamente para eliminar desechos de las placas deflectoras.

Reserva de los derechos Los solicitantes se reservan expresamente todos los derechos en lo que se refiere a presentar reclamaciones modificadas y solicitudes complementarias y/o fraccionarias en cualquier país designado para llevar adelante reclamaciones dirigidas a cualquier aspecto original identificado anteriormente y cualquier otra temática descrita en las especificaciones o indicada en los diagramas.

Claims

596 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un sistema multicanal para clasificar partículas de acuerdo con una o más características de las partículas, dicho sistema consta de: una pluralidad de unidades de citometría de flujo cada una de las cuales se puede operar para clasificar partículas en una mezcla de partículas, interrogando una corriente de líquido que contiene dichas partículas usando un haz de radiación electromagnética; dichas unidades comparten una plataforma integrada que consta de al menos uno de los elementos siguientes: (1) un suministro común de partículas; (2) una cubierta común; (3) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (4) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (5) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichas partículas a dichas unidades de citometría de flujo. 2. - El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha plataforma integrada comprende además una fuente común de radiación electromagnética. 3. - El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dichas partículas son espermatozoides. 4. - El sistema de conformidad con la reivindicación 1, 597 caracterizado además porque dichas unidades de citometría de flujo se adaptan para funcionar en paralelo. 5. - El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha pluralidad de unidades de citometría de flujo se pueden operar para separar las partículas. 6. - El sistema de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la plataforma integrada comprende además una fuente común de radiación electromagnética y en el que dicha pluralidad de unidades de citometría de flujo consta de una unidad de citometría de flujo de separación de gotitas de chorro en aire. 7. - Un método multicanal de clasificación de partículas según una o más características de las partículas, que consiste en: proveer de una pluralidad de unidades de citometría de flujo; operar dichas unidades de citometría de flujo para conducir una pluralidad de operaciones de citometría de flujo; dichas operaciones consisten en formar corrientes de líquido independientes, cada una de las cuales contiene una mezcla de partículas, y clasificar las partículas de dichas mezclas de partículas interrogando las corrientes mediante haces de radiación electromagnética; y compartir al menos uno de los elementos siguientes para llevar a cabo dichas operaciones: (1) un suministro común de partículas para dichas corrientes; (2) una entrada común de control de operaciones; (3) un procesador común para recibir y procesar la información de las unidades para permitir la evaluación de la operación de una unidad en relación con otra unidad; (4) un sistema 598 dispensador de líquido común para dispensar líquido a dichas corrientes; y (5) una cubierta común para dichas unidades de citometría de flujo. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende además una fuente común de radiación electromagnética para dichos haces. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicha pluralidad de unidades de citometría de flujo comprende una unidad de citometría de flujo de separación de gotitas de chorro en aire. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque consiste además en operar dicha pluralidad de citómetros de flujo para separar dicha mezcla de partículas sobre la base de su clasificación. 11- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dichas partículas son espermatozoides. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque consiste también en operar dichas unidades de citometría de flujo en paralelo. 13. - Un método de separación de partículas usando un sistema que comprende tres o más unidades de citometría de flujo, cada una de las cuales se puede operar para separar una población deseada de partículas de una mezcla de partículas, interrogando a una corriente de líquido que contiene dichas partículas usando un haz de luz; dicho método consiste en: generar un 599 único haz de luz láser; dividir el único haz en tres o más haces de luz y dirigir los haces de luz al interior de los sistemas ópticos de las unidades de citometría de flujo; y operar las unidades de citometría de flujo para separar las partículas. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque consiste además en equilibrar la cantidad de haces de luz usados por las unidades de citometría para interrogar a las corrientes de líquido respectivas, usando uno o más filtros para atenuar la intensidad de al menos uno de dichos tres o más haces de luz. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dichas unidades de citometría de flujo están montadas en una cubierta común, el método consiste además en orientar dicho único haz de luz láser al interior de dicha cubierta común antes de dividirlo. 16.- En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas; la 600 mejora consiste en: un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema de separación para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha corriente. 17. - El sistema de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque las partículas son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. 18. - El sistema de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el control aumenta la velocidad de dispensación del líquido cuando dicha pureza es mayor que una pureza deseada y disminuye la velocidad de dispensación del líquido cuando dicha pureza es menor que dicha pureza deseada. 19. - Un método de uso de un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B; dicho método consiste en: dispensar un líquido que contiene dichas partículas; formar con el líquido una corriente y usar la citometría de flujo para clasificar las partículas 601 de la corriente según dichas características; separar las partículas de la corriente de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar de ese modo al menos una población que contenga las partículas deseadas; y variar la estrategia de separación o variar la velocidad a la cual se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha corriente. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dichas partículas son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque consiste además en aumentar la velocidad de dispensación del líquido cuando dicha pureza es mayor que una pureza deseada y disminuir la velocidad de dispensación del líquido cuando dicha pureza es menor que dicha pureza deseada. 22. - Un sistema para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B; dicho sistema consta de: un sistema dispensador de líquido para dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas; un equipo de citometría de flujo para recibir dicha corriente, formar gotitas que 602 contengan dichas partículas, y separar dichas gotitas en diferentes poblaciones según una estrategia de separación, dichas gotitas incluyen primeras gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica A, segundas gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica B y terceras gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica A y una o más partículas con la característica B; y un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el equipo de citometría de flujo para que varíe la estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de al menos una población de gotitas en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en al menos una población de gotitas en relación con la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha corriente. 23. - El sistema de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el control controla el sistema dispensador de líquido para mantener la velocidad de dispensación del líquido prácticamente constante y en donde el control varía la estrategia de separación. 24. - El sistema de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el control varía la estrategia de separación a fin de variar el porcentaje de terceras gotitas en una de las poblaciones de 603 gotitas. 25. - El sistema de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el control controla el sistema dispensador de líquido para variar la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de la pureza de dicha al menos una población de gotitas. 26. - El sistema de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el control controla el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la que se dispensa el liquido como una función de la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A en dicha corriente. 27. - El sistema de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dichas partículas son espermatozoides y en donde la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. 28.- El sistema de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la relación entre las partículas con la característica A y las partículas con la característica B en dicha mezcla es una relación conocida y en donde dicho control se puede operar para clasificar alguna de las partículas que tienen la característica A o la característica B y para variar la velocidad de dispensación del líquido como una función de la relación entre las partículas clasificadas y la relación conocida. 29.- El sistema de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el control determina la pureza de las partículas 604 separadas sobre la base de las señales de salida del equipo de citometría de flujo, dicho sistema comprende además una entrada de operador al control para indicar una pureza deseada y en donde el control varía la velocidad de modo que la pureza de dicha al menos una población de gotitas corresponda en general a la pureza deseada. 30. - Un sistema para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B; dicho sistema consiste en: dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas; formar gotitas que contienen dichas partículas; separar dichas gotitas en diferentes poblaciones según una estrategia de separación, dichas gotitas incluyen primeras gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica A, segundas gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica B y terceras gotitas que cada una contiene una o más partículas con la característica A y una o más partículas con la característica B; y variar la estrategia de separación o variar la velocidad a la cual se dispensa líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de al menos una población de gotitas en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en al menos una población de gotitas en relación con la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha corriente. 31. - El método de conformidad con la reivindicación 30, 605 caracterizado además porque consiste también en mantener la velocidad a la que se dispensa el líquido prácticamente constante, y variar la estrategia de separación. 32. - El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque consiste también en variar la estrategia de separación a fin de variar el porcentaje de terceras gotitas en una de las poblaciones de gotitas. 33. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque consiste también en variar la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de la pureza de al menos una de las poblaciones de gotitas. 34. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque consiste también en variar la velocidad a la que se dispensa el liquido como una función de la cantidad de partículas con la característica A en dicha al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A en dicha corriente. 35 - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dichas partículas son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. 36.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque consiste también en aumentar la velocidad cuando la pureza de dicha al menos una población gotitas es mayor que la pureza deseada y disminuir la velocidad cuando la pureza de dicha al menos 606 una población de gotitas es menor que la pureza deseada. 37. - Un sistema para separar espermatozoides X y espermatozoides Y; dicho sistema consta de: un sistema dispensador de líquido de velocidad variable para dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides X e Y; un equipo de citometría de flujo para (1) recibir dicha corriente y formar gotitas que contengan dichas partículas, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides Y y una tercera pluralidad de gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X y uno o más espermatozoides Y, (2) separar dichas primeras gotitas de dichas segundas y terceras gotitas, (3) recoger dichas primeras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides X y (4) identificar una cantidad de espermatozoides X en al menos una población; y un control que responda a las instrucciones recibidas del citómetro de flujo para variar la velocidad a la que se dispensa el líquido al citómetro de flujo como una función de la cantidad de espermatozoides X identificados en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de espermatozoides X en dichas primeras, segundas y terceras gotitas. 38. - El sistema de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dicho equipo de citometría de flujo se puede operar para identificar la cantidad de células X recogidas en dicha al menos una población y en el que el control varía la velocidad a la que se dispensa el líquido al citómetro de flujo para mantener la cantidad de células X recogidas 607 en dicha a! menos una población en una cantidad aceptable o por encima de una cantidad aceptable en relación con el número total de células X en dichas primeras, segundas y terceras gotitas. 39. - Un método para separar espermatozoides X e Y, dicho método consiste en: dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides X e Y a una primera ubicación y hacer que dicha corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides Y y una tercera pluralidad de gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X y uno o más espermatozoides Y; separar dichas primeras gotitas de dichas segundas y terceras gotitas; recoger dichas primeras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides X; identificar una cantidad de espermatozoides X recogidos en dicha al menos una población; y variar la velocidad a la que se dispensa el líquido a dicha primera ubicación como una función de la cantidad de espermatozoides X identificados recogidos en dicha al menos una población en relación con la cantidad total de células X en dichas primeras, segundas y terceras gotitas. 40. - El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque consiste también en variar la velocidad a la que se dispensa el líquido a dicha primera ubicación para mantener la cantidad de células X recogidas en dicha al menos una población en una cantidad aceptable o por encima de una cantidad aceptable en relación con la cantidad 608 total de células X en dichas primeras, segundas y tercera gotitas. 41. - Un sistema para separar espermatozoides X y espermatozoides Y; dicho sistema consta de: un sistema dispensador de líquido de velocidad variable para dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides X e Y; un citómetro de flujo para (1) recibir dicha corriente y formar gotitas que contengan dichas partículas, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides Y y una tercera pluralidad de gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X y uno o más espermatozoides Y, (2) separar dichas primeras y terceras gotitas de dichas segundas gotitas, (3) recoger dichas primeras y terceras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides X y (4) identificar una cantidad de espermatozoides Y en al menos una población; y un control que responda a las instrucciones recibidas del citómetro de flujo para variar la velocidad a la que se dispensa el líquido al citómetro de flujo como una función de la cantidad de espermatozoides Y identificados en dicha al menos una población. 42. - El sistema de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado además porque dicho control varía la velocidad a la que se dispensa el líquido al sistema del citómetro de flujo para mantener la pureza de dicha al menos una población a una pureza deseada o por encima de una pureza deseada. 43. - Un método para separar espermatozoides X y 609 espermatozoides Y, dicho método consiste en: dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides X e Y a una primera ubicación y hacer que dicha corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides Y y una tercera pluralidad de gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X y uno o más espermatozoides Y; separar dichas primeras y terceras gotitas de dichas segundas gotitas; recoger dichas primeras y terceras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides X; identificar una cantidad de espermatozoides Y recogidos en dicha al menos una población; y variar la velocidad a la que se dispensa el líquido a dicha primera ubicación como una función de la cantidad de espermatozoides Y identificados recogidos en dicha al menos una población. 44. - El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque consiste también en variar la velocidad a la que se dispensa el líquido para mantener la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las células X a una pureza deseada o por encima de una pureza deseada. 45. - Un método para separar espermatozoides X y espermatozoides Y utilizando citometría de flujo; dicho método consiste en: dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides X e Y a una primera ubicación y hacer que dicha corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dichas gotitas comprenden primeras gotitas que cada una 610 contiene uno o más espermatozoides X, segundas gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides Y y una tercera pluralidad de gotitas que cada una contiene uno o más espermatozoides X y uno o más espermatozoides Y; separar dichas primeras y terceras gotitas de dichas segundas gotitas; y recoger dichas primeras y terceras gotitas para proporcionar al menos una población de espermatozoides X. 46.- En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo a dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contenga las partículas deseadas; la mejora comprende: un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida analógica que varía con el tiempo de dicho equipo de citometría de flujo y proporciona una salida que incluye información digital correspondiente a dicha salida analógica que varía con el tiempo, en el que dicha salida analógica que varía con el tiempo y su correspondiente información digital son indicativas de la característica A o la característica B; un procesador de señal digital que analiza y clasifica la información digital y proporciona una señal de separación a dicho sistema de separación como una 611 función de la información digital analizada y clasificada. 47.- El sistema de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque la salida analógica que varía con el tiempo comprende una serie de pulsos de ondas, cada uno de los cuales es representativo de la característica de una partícula, en el que el procesador de señal digital detecta porciones de la información digital correspondiente a los pulsos de ondas y clasifica dichas porciones detectadas y en el que el procesador de señal digital proporciona dicha señal de separación como una función de dichas porciones detectadas y clasificadas. 48.- El sistema de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque comprende también un control que responde a la información recibida del equipo de citometría de flujo para controlar el sistema de separación para que varíe su estrategia de separación o para controlar el sistema dispensador de líquido para que varíe la velocidad a la que se dispensa el líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha corriente. 49.- El sistema de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque las partículas son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. 612 50. - El sistema de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para detectar pulsos correspondientes a la información digital, instrucciones para extraer características en los pulsos detectados e instrucciones para discriminar los pulsos detectados como una función de sus características extraídas. 51. - El sistema de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para definir un límite de decisión que discrimina entre las características extraídas que representan las características A y las características extraídas que representan la característica B. 52. - El sistema de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado además porque dicho procesador de señal digital ajusta la ubicación relativa del límite de decisión en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica A y en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica B como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha corriente. 53. - El sistema de conformidad con la reivindicación 46, 613 caracterizado además porque dicho procesador de señal digital comprende un procesador de manejo de datos para ensamblar la información digital en una corriente continua. 54. - El sistema de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque dicho procesador de señal digital clasifica la información digital de tal manera que una población de las partículas que tienen la característica A y una población de las partículas que tienen la característica B corresponden a un modelo de computadora de tres poblaciones que incluye una primera población modelo de partículas que tienen la característica A, una segunda población modelo de partículas que tienen la característica B y una tercera población modelo de partículas no alineadas, dicho modelo estima las estadísticas poblacionales de cada una de las primera, segunda y tercera poblaciones modelo. 55. - Un método de uso de un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B; dicho método consiste en: dispensar un líquido que contiene dichas partículas; formar una corriente con el líquido y usar citometría de flujo para detectar las partículas de la corriente según dichas características; separar las partículas de la corriente y de acuerdo con una estrategia de separación proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas; convertir una salida analógica de dicha citometría de flujo en la información digital correspondiente en que la salida analógica es indicativa de la característica A 614 o la característica B; y analizar y clasificar la información digital y separar las partículas como una función de la información digital analizada y clasificada. 56. - El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque consiste también en variar la estrategia de separación o variar la velocidad a la cual se dispensa líquido como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha corriente. 57. - El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque dichas partículas son espermatozoides y en el que la característica A es indicativa de un espermatozoide X vivo. 58.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque consiste también en detectar pulsos de ondas representados por la información digital, extraer las características de los pulsos de ondas de la información digital, y discriminar los pulsos de ondas detectados como una función de sus características extraídas. 59.- El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque consiste también en definir un límite de decisión que discrimine entre las características extraídas que representan las características A y las características extraídas que representan la 615 característica B. 60.- El sistema de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque consiste también en ajusfar la ubicación relativa del límite de decisión en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica A y en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica B como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha corriente. 61- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque clasificar la información digital consiste en clasificar la información digital de tal manera que una población de las partículas que tienen la característica A y una población de las partículas que tienen la característica B correspondan a un modelo de computadora de tres poblaciones que incluye una primera población modelo de partículas que tienen la característica A, una segunda población modelo de partículas que tienen la característica B y una tercera población modelo de partículas no alineadas, dicho modelo estima la estadística poblacional de cada una de las primera, segunda y tercera poblaciones modelos. 62.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque clasificar la información digital consiste en 616 clasificar la información digital como una función de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica A o como una función de un coeficiente de variación de una población de partículas que tienen la característica B. 63.- En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo a dicha clasificación y según una estrategia de separación para proporcionar al menos una población que contenga las partículas deseadas, la mejora comprende: un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida analógica que varía con el tiempo de dicho equipo de citometría de flujo y proporciona una salida que incluye información digital correspondiente a dicha salida analógica que varía con el tiempo, en el que dicha salida analógica que varía con el tiempo y su correspondiente información digital son indicativas de la característica A o la característica B; un procesador de señal digital que determina las características de fondo de dicha salida analógica que varía con el tiempo de dicha información digital; detectar pulsos de ondas representados por dicha información digital como una función de dichas características de fondo determinadas; y proporcionar 617 una señal de separación a dicho sistema de separación como una función de los pulsos de ondas detectados. 64. - El sistema de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado además porque dicho procesador de señal digital emplea un procedimiento iterativo para determinar un umbral de detección de pulsos para definir las características de fondo; dicho procedimiento iterativo incluye: calcular los estimados de la estadística de fondo a partir de la información digital; usar los estimados calculados para aplicar una lógica de detección de pulsos a dicha información digital a fin de identificar los pulsos indicativos de la característica A o la característica B; volver a calcular los estimados sin usar la información digital correspondiente a los pulsos identificados; y repetir el procedimiento anterior hasta que los estimados de la estadística de fondo converjan u ocurra una cantidad máxima fija de iteraciones. 65. - El sistema de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque consta también de un filtro para filtrar la salida analógica a una frecuencia igual o menor que la mitad de una velocidad de toma de muestras del convertidor, y en el que el convertidor convierte la salida analógica filtrada en la información digital correspondiente. 66. - En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar 618 con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo a dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contenga las partículas deseadas; la mejora comprende: un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida analógica que varía con el tiempo de dicho equipo de citometría de flujo y proporciona una salida que incluye información digital, correspondiente a dicha salida analógica que varía con el tiempo, en el que dicha salida analógica que varía con el tiempo y su correspondiente información digital son indicativas de la característica A o la característica B; y un procesador de señal digital que genera parámetros de discriminación iniciales a partir de la información digital, discriminar la información digital como una función de los parámetros de discriminación iniciales, y proporcionar una señal de separación a dicho sistema de separación como una función de la información digital discriminada. 67. - El sistema de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado además porque el procesador de señal digital emplea a al menos uno de los siguientes algoritmos para generar los parámetros de discriminación iniciales: K-medias, k-medias difusas y aglomeración jerárquica acumulativa. 68. - En un sistema de citometría para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B; dicho sistema que consta de: un sistema 619 dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, y un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características; un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida analógica que varía con el tiempo que comprende una serie de pulsos de ondas de dicho equipo de citometría de flujo y proporciona una salida que incluye información digital correspondiente a dichos pulsos de ondas en el que dichos pulsos de ondas y su correspondiente información digital son indicativos de la característica A o la característica B; y un procesador de señal digital que analiza la información digital y clasifica la partícula como una función de la información digital analizada correspondiente. 69. - El sistema de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado además porque dicho procesador digital emplea un umbral de detección para definir los pulsos de onda y en que dicho umbral de detección es una función de un estimado promedio de fondo y una desviación estándar de la información digital calculada dentro de una ventana móvil de muestras que terminan con la muestra actual. 70. - El sistema de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado además porque el control digital emplea un análisis estadístico de detección de anomalías y en el que la información digital anómala desde el punto de vista estadístico de las características de fondo de la información digital se considera parte de un pulso digital. 620 71.- El sistema de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado además porque consta también de un dispositivo de iluminación de pulsos en sincronización con una toma de muestras sincrónica para iluminar las partículas para producir los pulsos de onda correspondientes. 72.- En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo a dicha clasificación y según una estrategia de separación para proporcionar al menos una población que contenga las partículas deseadas, la mejora comprende: un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida analógica que varía con el tiempo de dicho equipo de citometría de flujo y proporciona una salida que incluye información digital, correspondiente a dicha salida analógica que varía con el tiempo, en el que dicha salida analógica que varía con el tiempo y su correspondiente información digital son indicativas de la característica A o la característica B; un procesador de señal digital que extrae características a partir de la información digital y proporciona una señal de separación a dicho sistema de separación como una función de las características extraídas. 73.- El equipo de conformidad con la reivindicación 72, 621 caracterizado además porque la característica extraída corresponde a una o más de las características siguientes: el área del pulso, el pico del pulso, el área interna del pulso, el ancho del pulso, la correlación gaussiana del pulso, el pico retardado del pulso o la pendiente del pulso. 74 - El equipo de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado además porque la característica extraída comprende una aproximación de una derivada o pendiente del pulso en un punto del pulso en relación con una altura de pico promedio del pulso. 75.- El equipo de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque dicho punto a lo largo del pulso corresponde a un punto en el que hay una diferencia entre una primera derivada de un pulso producido por partículas que tienen la característica A y una primera derivada de un pulso producido por partículas que tienen la característica B. 76 - El equipo de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque la salida analógica que varía con el tiempo corresponde a un pulso de emisión de fluorescencia por parte de las partículas y en el que dicho punto a lo largo del pulso corresponde a un punto en el cual una diferencia entre una primera derivada de un pulso producido por las partículas que tienen la característica A y una primera derivada de un pulso producido por las partículas que tienen la característica B está en un máximo o próximo a él. 77.- El equipo de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque la salida analógica que varía con el tiempo 622 corresponde a un pulso de emisión de fluorescencia de las partículas y en el que dicho punto a lo largo del pulso es una función de la altura de pico de los pulsos de emisión de fluorescencia. 78. - En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas de acuerdo a dicha clasificación y según una estrategia de separación para proporcionar al menos una población que contenga las partículas deseadas, la mejora comprende: un convertidor analógico-digital que toma muestras sincrónicamente de una salida analógica que varía con el tiempo que comprende pulsos de onda de dicho equipo de citometría de flujo y proporciona una salida que incluye información digital, correspondiente a dichos pulsos de onda, en el que dichos pulsos de onda y su correspondiente información digital son indicativos de la característica A o la característica B; un procesador de señal digital que discrimina la información como indicativa de la característica A o como indicativa de la característica B y proporciona una señal de separación a dicho sistema de separación como una función de la información digital discriminada. 79. - El equipo de conformidad con la reivindicación 78, 623 caracterizado además porque dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para detectar pulsos de ondas representados por la información digital, instrucciones para extraer características en los pulsos de onda detectados e instrucciones para discriminar los pulsos de onda detectados como una función de sus características extraídas. 80. - El equipo de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado además porque dicho procesador de señal digital incluye instrucciones para definir un límite de decisión que discrimine entre las características extraídas que representan las características A y las características extraídas que representan las características B. 81. - El equipo de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado además porque dicho procesador de señal digital ajusta la ubicación relativa del límite de decisión en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica A y en lo que se refiere a las características extraídas que representan la característica B como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de dicha al menos una población en lo que se refiere a las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y (2) la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha al menos una población en relación con la cantidad de partículas con la característica A o la característica B en dicha corriente. 82. - Un equipo para separar las partículas contenidas en una corriente de líquido según una o más características de las partículas; dicho 624 sistema consiste en: un equipo de citometría de flujo para dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas a una primera ubicación y para provocar que la corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dicho equipo de citometría de flujo se puede operar usando citometría de flujo para clasificar las partículas según dichas características y para separar dichas gotitas según la clasificación de las partículas contenidas en las gotitas; dicho equipo de citometría de flujo que consta de un sistema óptico de epiluminación incluida una lente de enfoque, dicho sistema óptico se puede operar para dirigir un haz de luz láser a través de dicha lente de enfoque en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza la corriente de líquido en dicha primera ubicación de modo que dichas células pasen a través del haz, provocando emisiones de radiación electromagnética desde las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás. 83.- El equipo de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado además porque dichas partículas son espermatozoides. 84.- El sistema de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque dicho haz es enfocado por dicho sistema óptico como mancha luminosa en la corriente de líquido en dicha primera ubicación, dicha mancha luminosa tiene una forma generalmente elíptica con una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la 625 dirección de flujo de la corriente de líquido, siendo dicho ancho menor que la longitud de la cabeza de un espermatozoide que pasa a través de la mancha luminosa. 85. - El equipo de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado además porque dicho sistema óptico incluye un único fotodetector en la parte trasera de dicha lente de enfoque para detectar dichas emisiones. 86. - El sistema de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado además porque la cabeza de dicho espermatozoide incluye una región de ADN que tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente y en el que dicho ancho del impacto de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicha región de ADN. 87. - El equipo de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado además porque dicho equipo de citometría de flujo consta además de una boquilla que tiene una superficie interior configurada para ejercer una fuerza en las partículas que tiende a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que pasen a través de dicho haz. 88. - El sistema de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado además porque dicho equipo de citometría de flujo consta de una pluralidad de unidades de citometría de flujo que se pueden operar para analizar simultáneamente múltiples corrientes de líquido; cada unidad de citometría de flujo comprende dicho sistema óptico de epiluminación. 89. - Un método para separar partículas contenidas en una 626 corriente de líquido según una o más características de las partículas, dicho método consiste en: (a) dispensar una corriente de líquido que contiene dichas partículas a una primera ubicación y provocar que la corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación; y (b) usar un proceso de citometría de flujo para clasificar las partículas según dichas características y separar dichas gotitas según la clasificación de las partículas contenidas en ellas, dicho proceso de citometría de flujo consiste en dirigir un haz láser a través de una lente de enfoque hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza la corriente de líquido en dicha primera ubicación de modo que dichas células pasen a través del haz, dando como resultado emisiones de radiación electromagnética de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz hacia en dirección posterior. 90.- El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado además porque dichas partículas son espermatozoides. 91.- El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado además porque el paso de dispensación de una corriente de líquido consiste en dirigir dicha corriente a través de un orificio de la boquilla que tiene un diámetro de 50 a 70 micrómetros a una presión de 20-40 psi (1.406 a 2.812 kg/cm2) y a una velocidad de 30.000 a 50.000 espermatozoides por segundo. 92.- El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado además porque consiste también en enfocar dicho haz en dicha corriente de líquido como una mancha luminosa de forma generalmente 627 elíptica con una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, siendo dicho ancho menor que la longitud de la cabeza de un espermatozoide que pasa a través de la mancha luminosa del haz. 93. - El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado además porque la cabeza de dicho espermatozoide incluye una región de ADN que tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente y en el que dicho ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicha región de ADN. 94. - El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado además porque consiste también en generar una pluralidad de corrientes de líquido independientes que cada una contiene espermatozoides y, para cada una de tales corrientes, llevar a cabo los pasos (a,) (b). 95. - El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado además porque consiste también en usar un haz común de luz láser para iluminar dichas corrientes de líquido. 96. - El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado además porque consiste también en ejercer una fuerza sobre las partículas que tiende a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que pasen a través de dicho haz. 97. - El método de conformidad con la reivindicación 89, 628 caracterizado además porque dicho proceso de citometría de flujo consiste además en usar un solo fotodetector para detectar la emisión de radiación electromagnética. 98.- Un equipo para clasificar espermatozoides de animales por las características del ADN cromosómico, que consta de: un sistema de boquilla para dispensar una corriente de líquido que contiene espermatozoides a una primera ubicación y para ejercer una fuerza sobre los espermatozoides que tienda a hacerlos virar en una orientación deseada antes de que la corriente alcance dicha primera ubicación; un sistema óptico de epiluminación para dirigir un haz de radiación electromagnética en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza dicha corriente de líquido en dicha primera ubicación en un ángulo de incidencia distinto de 0 grados, de modo que dichas células pasen a través del haz dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás; un fotodetector que se puede operar para detectar y transformar al menos algunas de dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de ADN; un procesador para procesar dichas señales eléctricas y clasificar las células según dichas características de ADN. 99.- El equipo de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado además porque dicho equipo de citometría de flujo consta además de una boquilla que tiene una superficie interior configurada para ejercer una fuerza en las células que tiende a hacerlas virar en una 629 orientación deseada antes de que pasen a través de dicho haz. 100. - El equipo de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado además porque dicho haz es enfocado por dicho sistema óptico como una mancha luminosa en la corriente de líquido en dicha primera ubicación, dicha mancha luminosa tiene una forma generalmente elíptica con una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, siendo dicho ancho menor que la longitud de la cabeza de un espermatozoide que pasa a través de la mancha luminosa del haz. 101. - El equipo de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado además porque dicho equipo de citometría de flujo consta de una pluralidad de unidades de citometría de flujo que se pueden operar en paralelo para analizar simultáneamente múltiples corrientes de líquido, cada unidad de citometría de flujo comprende dicho sistema óptico de epiluminación. 102. - El equipo de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado además porque dicho sistema óptico incluye sólo un fotodetector para detectar dichas emisiones. 103. - Un método de clasificación de espermatozoides de animales según sus características de ADN cromosómico, que consta de los pasos siguientes: (a) dispensar una corriente de líquido que contenga 630 espermatozoides a una primera ubicación y ejercer una fuerza sobre los espermatozoides que tienda a hacerlos virar en una orientación deseada antes de que la corriente alcance dicha primera ubicación; (b) dirigir un haz de radiación electromagnética en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz que cruza dicha corriente de líquido en dicha primera ubicación en un ángulo de incidencia distinto de 0 grados de modo que dichas células pasen a través del haz, dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás; (c) detectar y transformar al menos algunas de dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de ADN; y (d) procesar dichas señales eléctricas y clasificar las células según dichas características de ADN. 104. - El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado además porque el paso (a) consiste en dirigir dicha corriente a través de un orificio de la boquilla que tiene un diámetro de 50 a 70 micrómetros a una presión de 20-40 psi (1.406 a 2.812 kg/cm2) y a una velocidad de 30.000 a 50.000 espermatozoides por segundo. 105. - El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado además porque consiste también en ejercer una fuerza sobre los espermatozoides que tienda a hacerlos virar en una orientación deseada antes de que pasen a través de dicho haz. 106. - El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado además porque consiste también en enfocar dicho haz en dicha 631 corriente de líquido como una mancha luminosa de forma generalmente elíptica con una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, siendo dicho ancho menor que la longitud de la cabeza de un espermatozoide que pasa a través de la mancha luminosa del haz. 107. - El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado además porque consiste también en generar una pluralidad de corrientes de líquido independientes que cada una contenga espermatozoides y, para cada una de tales corrientes, llevar a cabo los pasos (a,) (b), (c) y (d). 108. - Un equipo para analizar las características de ADN de las células en una corriente de líquido, cada célula comprende una región de ADN que tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente, dicho equipo consta de: un sistema óptico de epiluminación para dirigir un haz de radiación electromagnética en una dirección hacia adelante a lo largo de un eje del haz para que el haz cruce dicha corriente de líquido; dicho sistema óptico incluye una lente de enfoque en dicho eje del haz para enfocar el haz en la corriente de líquido como una mancha luminosa generalmente elíptica que tiene una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, el ancho de la mancha luminosa 632 del haz es menor que la longitud de dicha región de ADN, dichas células se adaptan para pasar a través de dicha mancha luminosa dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás, incluidas las emisiones de dichas regiones de ADN indicativas de dichas características de ADN; un fotodetector en la parte trasera de la lente de enfoque para detectar y convertir al menos alguna de dichas emisiones de dichas regiones de ADN en señales eléctricas indicativas de dichas características de ADN; y un sistema para procesar dichas señales eléctricas, identificar dichas características de ADN y clasificar las células según dichas características de ADN. 109. - El equipo de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado además porque dicho ancho de la mancha luminosa es menor que aproximadamente 3,0 µ??. 1 10. - Un método para analizar las características del ADN cromosómico de espermatozoides de animales en una corriente de líquido que tiene una dirección de flujo, los espermatozoides tienen habitualmente una cabeza con un núcleo que comprende una región cromosómica localizada que contiene al menos un cromosoma, dicho núcleo tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente; dicho equipo consiste en: un sistema óptico para enfocar un haz de radiación electromagnética en la corriente de líquido como una mancha luminosa generalmente elíptica que tiene una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende 633 en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente, el ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicho núcleo, dichos espermatozoides se adaptan para pasar a través de dicha mancha luminosa dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de los espermatozoides, incluidas las emisiones por parte de dichas regiones del cromosoma indicativas de las características cromosómicas de las regiones; un fotodetector para detectar y transformar al menos algunas de dichas emisiones por parte de las regiones del cromosoma en señales eléctricas indicativas de dichas características cromosómicas; y un procesador para procesar dichas señales eléctricas, identificar dichas características cromosómicas y clasificar los espermatozoides según dichas características cromosómicas. 11. - El equipo de conformidad con la reivindicación 110, caracterizado además porque dichas características cromosómicas son indicativas del sexo de los espermatozoides. 112. - El equipo de conformidad con la reivindicación 111 , caracterizado además porque dicha región del cromosoma se localiza dentro de un área del núcleo que se extiende en no más de aproximadamente un 20% de la longitud del núcleo sobre cualquiera de los lados de un centro longitudinal del núcleo. 1 13. - Un método para analizar las características de ADN de las células de una corriente de líquido, cada célula comprende una región de ADN que tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente; dicho método 634 consiste en: dirigir un haz de radiación electromagnética en una dirección hacia adelante lo largo de un eje del haz para que el haz cruce dicha corriente de líquido; enfocar dicho haz de radiación electromagnética en la corriente de líquido como una mancha luminosa generalmente elíptica que tiene una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente de líquido y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente de líquido, el ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicha región de ADN, dichas células se adaptan para pasar a través de dicha mancha luminosa dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las células dirigidas a lo largo de dicho eje del haz en una dirección hacia atrás; detectar y transformar dichas emisiones en señales eléctricas indicativas de dichas características de ADN; y procesar dichas señales eléctricas, que incluye diferenciar entre las señales eléctricas de las emisiones de la región de ADN de una cabeza de espermatozoide y las señales eléctricas de las emisiones de otras regiones del espermatozoide; y clasificar las células según dichas características de ADN. 114. - El método de conformidad con la reivindicación 113, caracterizado además porque dichas células son espermatozoides. 115. - El método de conformidad con la reivindicación 113, caracterizado además porque consiste también en separar en gotitas dichas células según dichas características de ADN. 635 116. - Un método para analizar las características de ADN cromosómico de los espermatozoides de animales de una corriente de líquido que tiene una dirección de flujo, cada espermatozoide tiene una cabeza con un núcleo que comprende una región cromosómica localizada que contiene al menos un cromosoma, dicho núcleo tiene una longitud en la dirección de flujo de la corriente; dicho método consiste en: enfocar un haz de radiación electromagnética en la corriente de líquido como una mancha luminosa generalmente elíptica que tiene una longitud a lo largo de un eje mayor que se extiende en general perpendicularmente a la dirección de flujo de la corriente y un ancho a lo largo de un eje menor que se extiende en general paralelamente a la dirección de flujo de la corriente, el ancho de la mancha luminosa del haz es menor que la longitud de dicho núcleo, dichos espermatozoides se adaptan para pasar a través de dicha mancha luminosa dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de los espermatozoides, incluidas las emisiones por parte de dichas regiones del cromosoma indicativas de las características cromosómicas de las regiones; detectar y transformar al menos algunas de dichas emisiones por parte de las regiones del cromosoma en señales eléctricas indicativas de dichas características cromosómicas; procesar dichas señales eléctricas, que incluye identificar dichas características cromosómicas; y clasificar los espermatozoides según dichas características cromosómicas. 117. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dichas características cromosómicas son 636 indicativas del sexo de los espermatozoides. 118. - Un equipo para clasificar y separar los espermatozoides según las características de ADN cromosomico de las células, dicho equipo comprende: un sistema de boquilla para dispensar una corriente de líquido que contiene dichas células a una primera ubicación y para hacer que la corriente se rompa en gotitas en una segunda ubicación, dicho sistema de boquilla comprende una boquilla que tiene una superficie interior configurada para ejercer una fuerza sobre las células que tienda a hacerlas virar en una orientación deseada antes de que alcancen dicha primera ubicación; un sistema óptico para dirigir un haz de radiación electromagnética de modo que cruce la corriente de líquido en dicha primera ubicación para que las células de la corriente pasen a través de dicho haz dando lugar a emisiones de radiación electromagnética por parte de las células; un solo fotodetector para detectar y convertir al menos algunas de dichas emisiones en señales eléctricas; y un sistema para clasificar las células según dichas características de ADN y para separar dichas gotitas según la clasificación de las células contenidas en las gotitas. 1 19. - El equipo de conformidad con la reivindicación 118, caracterizado además porque dicho sistema óptico es un sistema de epiluminación. 120. - Una boquilla para usar en el equipo de citometría de flujo para separar espermatozoides de animales en una corriente de líquido, por el contenido cromosómico; dicha boquilla comprende: un cuerpo de boquilla que 637 tiene una superficie interior y un orificio mediante el cual dicha corriente de líquido se adapta al flujo; dicha superficie interior de la boquilla que comprende primera, segunda y tercera regiones axialmente estrechadas para acelerar progresivamente la velocidad de dicha corriente de líquido en una dirección corriente abajo hacia dicho orificio de la boquilla, al menos dos de dichas regiones tienen formas transversales generalmente elípticas orientadas en diferentes direcciones para aplicar fuerzas de torsión a dicha corriente de líquido tendientes a hacer virar los espermatozoides en una orientación deseada. 121.- La boquilla de conformidad con la reivindicación 120, caracterizada además porque dicha forma transversal generalmente elíptica de una de dichas al menos dos regiones está orientada a 90 grados aproximadamente en relación con la forma transversal generalmente elíptica de la otra de dichas al menos dos regiones. 122.- La boquilla de conformidad con la reivindicación 121 , caracterizada además porque dichas formas transversales generalmente elípticas de la primera y segunda regiones están orientadas en prácticamente la misma dirección para definir una primera zona de torsión y en la que la forma transversal generalmente elíptica de la tercera región, que constituye una segunda zona de torsión, está orientada a 90 grados aproximadamente en relación con las formas transversales generalmente elípticas de las primera y segunda regiones. 123.- La boquilla de conformidad con la reivindicación 120, 638 caracterizada además porque consta también de un soporte para montar dicha boquilla en una posición que apunta hacia arriba para dirigir dicha corriente de líquido a lo largo de una trayectoria ascendente. 124. - La boquilla de conformidad con la reivindicación 123, caracterizada además porque dicho cuerpo de la boquilla se puede rotar en dicho soporte sobre un eje longitudinal del cuerpo. 125. - Un método para orientar espermatozoides de animales en el equipo de citometría de flujo; dicho método consiste en: introducir un líquido que contiene espermatozoides en una corriente de líquido; dirigir la corriente de líquido que contiene dichos espermatozoides sometiéndolos a una presión en el intervalo de 20 a 40 psi (1.406 a 2.812 kg/cm2) a través de una boquilla que tiene una o más regiones estrechadas para acelerar la velocidad de dicha corriente de líquido en una dirección corriente abajo hacia un orificio de la boquilla que tiene un diámetro en el intervalo de 50-70 micrones, una o más de dichas regiones estrechadas que tienen una forma transversal generalmente elíptica para aplicar una fuerza de torsión a dicha corriente de líquido que tiende a hacer virar las células en una orientación deseada a medida que pasan a través de dicho orificio a una velocidad en el intervalo de 30.000 a 50.000 espermatozoides por segundo. 126.- El método de conformidad con la reivindicación 125 en el que dicha boquilla tiene tres o más regiones estrechadas para acelerar progresivamente la corriente de líquido hacia el orificio de la boquilla. 127.- El método de conformidad con la reivindicación 126, 639 caracterizado además porque dicha boquilla tiene dos zonas de torsión definidas por las superficies interiores de la boquilla en dichas tres o más regiones estrechadas. 128 - Una boquilla para usar en el equipo de citometría de flujo para analizar partículas en una corriente de líquido, dicha corriente de líquido comprende una corriente envolvente alrededor del núcleo de la corriente que contiene dichas partículas; dicha boquilla consta de: una boquilla que tiene una superficie interior que define una trayectoria de flujo para dicha corriente de líquido y un orificio para la salida de la corriente de líquido de la boquilla; y un deflector en la boquilla colocado en dicha trayectoria de flujo hacia arriba de dicho orificio para desviar la corriente de líquido según avanza por dicha trayectoria de flujo, el deflector y la superficie interior de la boquilla se configuran para orientar las partículas en la orientación deseada a medida que salen del orificio. 129.- La boquilla de conformidad con la reivindicación 128, caracterizada además porque dicho deflector se configura para desviar dicho núcleo de la corriente separado de un eje longitudinal central de la boquilla y hacia dicha superficie interior de la misma. 130.- La boquilla de conformidad con la reivindicación 128, caracterizada además porque la dicha superficie interior de la boquilla se le da una forma para que defina al menos dos regiones con inclinación axial corriente abajo de dicho deflector para acelerar progresivamente la velocidad de la corriente de líquido en una dirección descendente hacia el orificio de la 640 boquilla. 131. - La boquilla de conformidad con la reivindicación 130 caracterizada además porque dicho deflector se configura para desviar dicho núcleo de la corriente hacia una porción de dicha superficie interior de la boquilla definiendo por lo menos una de al menos dos de las regiones mencionadas con inclinación axial. 132. - La boquilla de conformidad con la reivindicación 131 , caracterizada además porque las mencionadas al menos dos regiones con inclinación axial tienen formas transversales en general elípticas orientadas en diferentes direcciones para aplicar fuerzas de torsión a dicha corriente de líquido que tienden a virar las partículas en dicha orientación deseada. 133. - Un método para orientar partículas en un equipo de citometría de flujo; dicho método consiste en: hacer circular una corriente de líquido que tiene un núcleo de la corriente de líquido de la muestra que contiene dichas partículas y una corriente envolvente de líquido envolvente que rodea el núcleo de la corriente para que fluya a través de una boquilla que tiene una superficie interior que en general se estrecha desde la porción corriente arriba de la boquilla hasta un orificio en el extremo corriente abajo de la boquilla; y desviar la corriente del núcleo a medida que circula por la boquilla para someter a las partículas en el núcleo de la corriente a fuerzas hidrodinámicas que tienden a provocar que las partículas tomen una orientación deseada. 134. - El método de conformidad con la reivindicación 133, 641 caracterizado además porque la boquilla tiene un eje longitudinal y el paso de desviación del núcleo de la corriente consiste en desviar el núcleo de la corriente separado del eje longitudinal hacia dicha superficie interior. 135. - El método de conformidad con la reivindicación 133, caracterizado además porque el paso de desviación consiste en usar un deflector para desviar el núcleo de la corriente. 136. - Ei método de conformidad con la reivindicación 133, caracterizado además porque la boquilla tiene una superficie interior a la que se le da una forma para que defina al menos una zona de torsión para someter a las partículas a fuerzas orientadoras hidrodinámicas. 137. - Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: recoger espermatozoides de un animal macho; separar los espermatozoides en una de múltiples poblaciones de espermatozoides sobre la base de una o más características de ADN específicas; obtener una cantidad de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN de una de dichas poblaciones múltiples de espermatozoides, estando contenida dicha cantidad de espermatozoides en un volumen de líquido de recolección; someter dicho volumen de líquido de recolección a un primer proceso de centrifugación para formar un primer sedimento de espermatozoides y un sobrenadante superpuesto al primer sedimento; separar el primer sedimento del sobrenadante; someter al sobrenadante a otra centrifugación para formar un segundo sedimento de espermatozoides que quedaron en el sobrenadante después de la primera 642 centrifugación; y agregar un volumen de líquido de resuspensión al primer y segundo sedimento para obtener una suspensión de espermatozoides con la característica deseada de ADN; la cantidad de dicho volumen de líquido de resuspensión se selecciona para obtener la concentración deseada de espermatozoides en la suspensión. 138.- El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado además porque una o más de las características especificadas del ADN consisten en la presencia en los espermatozoides, de un cromosoma sexual X o Y. 139.- Un método para procesar espermatozoides- de animales que consiste en los pasos de: separar los espermatozoides en poblaciones diferentes de espermatozoides sobre la base de una o más características de ADN especificadas usando un proceso de citometría de flujo que consiste en dispensar un líquido de la muestra que contiene los espermatozoides a una pluralidad de unidades de citometría de flujo, cada una de las cuales se puede operar para separar los espermatozoides sobre la base de dicha una o más características de ADN, y operar dichas unidades mientras se comparte una plataforma integrada que consta de al menos uno de los siguientes elementos: (1) un suministro común de espermatozoides; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichos 643 espermatozoides a dichas unidades de citometría de flujo; y variar la velocidad a la que el líquido de la muestra se dispensa a una o más de las unidades de citometría de flujo como una función de al menos uno de los siguientes: (1) la pureza de una primera población separada de espermatozoides que tiene una característica de ADN deseada; y (2) la cantidad de espermatozoides que tienen dicha característica de ADN deseada en una segunda población separada. 140.- Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: separar los espermatozoides en poblaciones diferentes de espermatozoides sobre la base de una o más características de ADN especificadas usando un proceso de citometría de flujo que consiste en dispensar un líquido de la muestra que contiene los espermatozoides a una pluralidad de unidades de citometría de flujo, cada una de las cuales se puede operar para separar los espermatozoides sobre la base de dicha una o más características de ADN, y operar dichas unidades mientras se comparte una plataforma integrada que consta de al menos uno de los siguientes elementos: (1) un suministro común de espermatozoides; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichos espermatozoides a dichas unidades de citometría de flujo; y usar un 644 convertidor analógico-digital o más que para tomar muestras sincrónicamente de una salida que varía con el tiempo de cada unidad de citometría de flujo y proporcionar una salida que incluye información digital, correspondiente a dicha salida analógica que varía con el tiempo, en el que dicha salida analógica que varía con el tiempo y su correspondiente información digital son indicativas de dicha característica de ADN especificada. 141 - Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: separar los espermatozoides en poblaciones diferentes de espermatozoides sobre la base de una o más características de ADN especificadas usando un proceso de citometría de flujo que consiste en dispensar un líquido de la muestra que contiene los espermatozoides a una pluralidad de unidades de citometría de flujo, cada una de las cuales se puede operar para separar los espermatozoides sobre la base de dicha una o más características de ADN, y operar dichas unidades mientras se comparte una plataforma integrada que consta de al menos uno de los siguientes elementos: (1) un suministro común de espermatozoides; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene dichos espermatozoides a dichas unidades de citometría de flujo; obtener una cantidad de espermatozoides que tienen una característica deseada de ADN 645 de una o más de las poblaciones separadas de espermatozoides; agregar un crioprotector a dicha cantidad de espermatozoides; enfriar dicha cantidad de espermatozoides y el crioprotector hasta una temperatura de mantenimiento de aproximadamente 0-8° C; mantener a dichos espermatozoides y dicho crioprotector prácticamente a dicha temperatura de mantenimiento durante un período de menos de 60 minutos; y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides hasta una temperatura de -40° C. 142. - El método de conformidad con la reivindicación 141 , caracterizado además porque consiste también en: formar una mezcla de tinción que contiene los espermatozoides y un colorante fluorescente selectivo de ADN y someter la mezcla de tinción a una temperatura de al menos aproximadamente 40° C. 143. - El método de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado además porque la mezcla de tinción consta además de un antioxidante. 144. - Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: recoger espermatozoides de un animal macho; teñir los espermatozoides con un colorante fluorescente selectivo de ADN; iluminar los espermatozoides con radiación electromagnética para provocar que el colorante fluorescente selectivo de ADN emita luz fluorescente; detectar la luz fluorescente emitida por los espermatozoides; analizar la luz fluorescente emitida por los espermatozoides para determinar una o más características de ADN específicas de los espermatozoides; separar los 646 espermatozoides en poblaciones múltiples de espermatozoides sobre la base de dichas una o más características de ADN específicas; obtener una cantidad de espermatozoides que tienen una característica de ADN deseada de una de dichas múltiples poblaciones de espermatozoides; y sobreenfriar dicha cantidad de espermatozoides; en el que el paso de sobreenfriamiento se completa en menos de aproximadamente 12 horas después de recoger los espermatozoides. 145.- Un método para separar espermatozoides vivos según el contenido cromosómico que consiste en: (a) agregar un colorante fluorescente selectivo de ADN a un suministro de espermatozoides vivos; (b) hacer circular un líquido de la muestra que contiene dichos espermatozoides y un líquido envolvente a través de una boquilla orientadora que tiende a hacer girar los espermatozoides en una orientación deseada; dicho líquido de la muestra y líquido envolvente salen de la boquilla como una corriente de líquido que consta de un núcleo de la corriente formado por el líquido de la muestra y los espermatozoides y un líquido envolvente que rodea el núcleo de la corriente; (c) aplicar energía acústica a la boquilla para provocar que la corriente de líquido se rompa en una corriente de gotitas en un sitio de división de gotitas corriente abajo de la boquilla; (d) dirigir un haz de radiación electromagnética para cruzar la corriente de líquido en un sitio de interrogación corriente arriba del sitio de división de gotitas para excitar el colorante fluorescente en los espermatozoides, provocando de ese modo emisiones fluorescentes por parte de los espermatozoides; (e) detectar las emisiones fluorescentes con un 647 fotodetector que produce una señal analógica que varía con el tiempo indicativa de la intensidad de las emisiones fluorescentes detectadas; (f) procesar electrónicamente dicha señal analógica que varía con el tiempo para determinar el contenido cromosómico de una pluralidad de espermatozoides; (g) aplicar selectivamente una carga electrostática a la corriente de líquido para aplicar selectivamente o no aplicar una carga eléctrica a las gotitas según el contenido cromosómico de los espermatozoides contenidos en las gotitas; (h) usar un campo eléctrico para desviar las gotitas según su carga, separando de ese modo los espermatozoides contenidos en las gotitas que tienen la misma carga de los espermatozoides contenidos en las gotitas que tienen una carga diferente; y (i) recoger al menos una población de espermatozoides vivos a una velocidad de al menos 5.000 espermatozoides por segundo. 146. - El método de conformidad con la reivindicación 145, caracterizado además porque dicho paso de recolección consiste en recoger al menos una población de espermatozoides vivos a una velocidad de al menos 7.000 espermatozoides por segundo. 147. - El método de conformidad con la reivindicación 145, caracterizado además porque consiste también en operar dos o más unidades de citometría de flujo en paralelo de modo que cada una lleve a cabo los pasos de (b) hasta (i) mientras comparten una plataforma integrada, dicha plataforma integrada consta de uno o más de los siguientes: (1) un suministro común de partículas; (2) una fuente común de radiación electromagnética; (3) 648 una cubierta común; (4) una entrada común para controlar el funcionamiento de las unidades; (5) un procesador común para recibir y procesar información de las unidades para permitir la evaluación del funcionamiento una unidad con respecto a otra unidad; y (6) un sistema dispensador de líquido común para dispensar el líquido que contiene tales partículas a dichas unidades de citometría de flujo. 148.- Un proceso para evaluar una serie de condiciones para teñir una población de células para separación, la población comprende un primer tipo y un segundo tipo de células; el proceso consiste en: (a) teñir una fracción de la población de células con un colorante fluorescente de acuerdo con una serie de condiciones de tinción; (b) exponer las células teñidas a la radiación electromagnética a medida que las células se hacen pasar a través de un sitio de interrogación de un citómetro de flujo a una velocidad, R; (c ) determinar una característica de emisión de fluorescencia de las células expuestas; (d) usar la característica de fluorescencia determinada para clasificar a las células expuestas en dos o más subpoblaciones de células, siendo una de las subpoblaciones una subpoblacion enriquecida del primer tipo de células; (e) determinar un coeficiente de variación para la característica de emisión de fluorescencia de las células de la subpoblacion enriquecida para proporcionar una indicación de la eficiencia de separación para las condiciones de tinción; y (f) determinar si se debe modificar alguna de las condiciones de tinción según las cuales las células se van a teñir o la velocidad, R, a la que las células teñidas se van a hacer pasar por el sitio de 649 interrogación del citómetro de flujo para mejorar la eficiencia de separación. 149. - Un método para procesar espermatozoides de animales que consiste en los pasos de: recoger espermatozoides de un animal macho; separar los espermatozoides para obtener una cantidad de espermatozoides que tienen una característica deseada; dicha cantidad de espermatozoides está contenida en un primer volumen de líquido que contiene una primera concentración de espermatozoides; y someter los espermatozoides a un paso de concentración en el cual la concentración de dichos espermatozoides se aumenta hasta una segunda concentración mayor que dicha primera concentración, en el que dicho paso de concentración consiste en hacer circular al menos una porción del primer volumen de líquido por un primer filtro a una presión diferencial a través del primer filtro de menos de aproximadamente 20 pulgadas de mercurio (0.9063 kg/cm2), dicho filtro tiene poros lo suficientemente pequeños para impedir el pasaje de dichos espermatozoides y retener un segundo volumen de líquido sin filtrar que contiene dichos espermatozoides. 150. - En un sistema de citometría de flujo para separar una mezcla de partículas incluidas partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, dicho sistema consta de un sistema dispensador de líquido para dispensar un líquido que contiene dichas partículas, un equipo de citometría de flujo para recibir dicho líquido, formar con él una corriente y usando citometría de flujo clasificar las partículas según dichas características y un sistema de separación para separar las partículas 650 de acuerdo con dicha clasificación y según una estrategia de separación, para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, la mejora comprende: una fuente de luz colocada en la segunda ubicación en un lado de la corriente para iluminarla; un arreglo de diodos lineal colocado en la segunda ubicación en el otro lado de la corriente adaptado para estar orientado a lo largo de un eje prácticamente paralelo a la corriente, dicho arreglo de diodos adaptado para detectar luz de la fuente de iluminación que pasa a través de la corriente y dicho arreglo de diodos adaptado para proporcionar una señal de salida correspondientes a la luz detectada; y un control para recibir la señal de salida indicativa de una posición de la segunda ubicación, dicho control que varia el funcionamiento de dicho transductor como una función de la señal de producción 651 RESUMEN DE LA INVENCION Aparatos y métodos para analizar partículas, incluyendo aparatos y métodos para un procedimiento de clasificación de esperma que incluye: recolectar esperma de un animal 30; seleccionar condiciones de coloración 47A; teñir el esperma con colorante fluorescente selectivo de ADN 48; clasificar las células de esperma de conformidad con el contenido de cromosomas sexuales 55; y crioconservar una población de esperma clasificado 61 hasta utilizarse para inseminación artificial; una modalidad incluye el aparato 1001 y métodos para utilizar una pluralidad de unidades de citometría de flujo 9 compartiendo una plataforma integrada para clasificar células de esperma; en una modalidad, la clasificación citométrica de flujo incluye utilizar el siguiente aparato y métodos: una boquilla de orientación que tiene un deflector 101 ; un sistema óptico de epi-iluminación 109; un análisis de división de regiones de ADN localizadas dentro de los núcleos celulares 225; procesamiento de señal digital, que incluye muestreo sincronizado de señales de salida análogas 701 , forma de onda de impulso 497 presenta la extracción de una aproximación de un derivado de primer orden de una onda de forma de impulso 497 en un punto del impulso, cualquiera de varias estrategias de clasificación; y un sistema de calibración de clasificación automatizado 4201 ; en una modalidad, el procesamiento de señal digital incluye señales de salida análogas de muestreo 701 en tiempos relativos a la emisión de impulsos desde un láser de iluminación; otras modalidades son substancialmente 652 diferentes de las anteriores, incluyendo modalidades dirigidas a pasos individuales o sistemas que pueden utilizarse para cualquiera de las varias aplicaciones que implican el análisis de partícula. MONSANTO/cgt* P05/1413F