CN103529036A - 一种鉴别杂交黄颡鱼幼鱼性别的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杂交黄颡鱼[黄颡鱼(♀)╳瓦氏黄颡鱼(♂)]幼鱼性别鉴定的方法，运用活体性腺压片-醋酸洋红染色-乙醇结晶紫染色的方法，鉴定个体体长规格为3厘米以上杂交黄颡鱼，后经过性腺组织石蜡切片验证了此方法的准确性。此方法同样适用于普通黄颡鱼以及“全雄一号”黄颡鱼幼鱼的性别鉴定。该发明方法完成1尾幼鱼的性别鉴定仅需3分钟，2人配合2小时可以检测100尾幼鱼。本发明具有高效、经济、快速、准确、稳定的特点，在黄颡鱼及其杂交黄颡鱼雄性种苗培育中具有重要的应用价值，可以应用于黄颡鱼商品夏花苗性别的快速鉴定。

Description

一种鉴别杂交黄颡鱼幼鱼性别的方法

技术领域

本发明属于水产生物技术领域中的鱼类性别鉴定技术，更具体的说，本发明涉及一种快速准确鉴别杂交黄颡鱼[黄颡鱼(♀)╳瓦氏黄颡鱼(♂)]幼鱼性别的方法，此方法同样适用于普通黄颡鱼以及“全雄一号”黄颡鱼幼鱼的性别鉴定。本发明在在黄颡鱼及其杂交黄颡鱼雄性种苗培育中具有重要的应用价值，可以应用于黄颡鱼商品幼苗性别的快速鉴定。

背景技术

目前，黄颡鱼养殖品种主要有两种，即杂交黄颡鱼[黄颡鱼(♀)╳瓦氏黄颡鱼(♂)]、“全雄1号”黄颡鱼。

黄颡鱼[Pelteobagrus fulvidraco（Richardson）]和瓦氏黄颡鱼[Pelteobagrusvachelli（Richardson）]均隶属于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黄颡鱼属(Pelteobagrus)鱼类，是黄颡鱼属已知的5个种类中经济价值较高的两个种类。近几年来，随着黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼人工繁殖和养殖技术的突破，这两种鱼的大规模人工养殖正在全国各地兴起，特别是黄颡鱼的人工养殖更为广泛。然而，这两种鱼在生物学和生态学特性上存在着较大差异：黄颡鱼主要分布于湖泊，耐低氧能力比瓦氏黄颡鱼高，适于池塘养殖.但其个体较小，生长速度较慢，在高密度的池塘养殖中，当年苗种较难长到上市规格（50g以上）；瓦氏黄颡鱼主要分布于江河的流水水体，是黄颡鱼属中个体最大的一种，2龄鱼体重可达150-600g，最大个体体重达1850g，其生长速度快，当年茁种可以长到上市规格，但其缺点是耐低氧能力较黄颡鱼差，在池塘养殖中，水温超过32℃时死亡率大大上升。尽管目前黄颡鱼人工养殖已是许多地区渔业生产发展的新的经济增长点，但广大渔民仍迫切希望有黄颡鱼新品种的出现。杂交优势的利用已成为提高鱼产量和改进鱼品质的重要途径，通过黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼杂交所获得的杂交子代，具有体色诱人(黄褐色)、生长快速、抗逆性强（如比瓦氏黄颡鱼耐低氧和耐高温）、当年苗种可养成上市规格等优势，非常具有发展潜力。

在相同养殖条件下，第一年雄性黄颡鱼比同胞雌鱼的生长速度快30%左右，在养殖的第二年，其雄鱼生长至150-200g，而雌鱼却只有50-70g，雌雄鱼生长差异接近3倍。因此，如果能够在育种中人工控制黄颡鱼的性别，培育出全雄黄颡鱼，将大大提高产量，降低养鱼成本，提高经济效益。中国科学院水生生物研究所利用性逆转与雌核发育得到可用于生产的YY超雄黄颡鱼，与普通黄颡鱼雌鱼(XX)进行人工繁殖,得到了全雄黄颡鱼(XY)。

鱼类的早期性别鉴定及其控制一直是渔业研究领域关注的重大问题，性别鉴定伴随着对性别决定分子机理研究的深化，研究方法由传统方法向分子生物学方法过渡。目前，在绝大多数鱼类中鉴定不出异型性染色体，所以许多学者从细胞水平上直接观察性染色体，但此方法往往存在人为的主观因素容易导致错误，现在主要通过染色体显带、性连锁遗传性状和诱导雌核或雄核发育等来区别性染色体；一些濒危物种如鲟科（Acipenseridae）鱼类直接解剖观察性腺不可取，常用的方法是微创手术法、内窥镜法、超声鉴定法、血液生化及激素指标判别法和基因鉴定法等。这些鉴定方法步骤繁琐，而且需要操作者具备较深的分子生物学技术及一些特有的仪器才能获得结果。

目前，杂交黄颡鱼[黄颡鱼(♀)╳瓦氏黄颡鱼(♂)]、普通黄颡鱼、“全雄一号”黄颡鱼的性别鉴定方法多从形态学方面进行鉴定，然而形态学方法在幼鱼期不能有效鉴定，只能在成鱼期才能进行，但是黄颡鱼雌雄鱼生长差异所造成的饲料耗费对于育苗部门及养殖户十分重要，迫切需要在苗种幼鱼期就将性别鉴定出来。随着现代分子生物学的迅速发展，已用SRAP、AFLP等分子标记对黄颡鱼幼鱼性别进行鉴定，但是鉴定方法步骤繁琐，而且需要操作者具备专业的分子生物学技术及PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪等仪器才能获得理想的结果。

综上所述，目前需要一种经济、快捷、准确的黄颡鱼及其杂交种雌雄鉴别方法应用于生产实践，本发明仅需要在幼鱼长至3厘米以上，随机从幼鱼群体中取样便很容易区别幼鱼性别，而且该方法完成1尾幼鱼的性别鉴定仅需3分钟，2人配合2小时即可检测100尾幼鱼，且准确率达到100%，大大节省人力和物力，可以在黄颡鱼性别鉴定领域得到推广和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速准确鉴别杂交黄颡鱼[黄颡鱼(♀)╳瓦氏黄颡鱼(♂)]幼鱼性别的方法，并适用于普通黄颡鱼以及“全雄一号”黄颡鱼幼鱼的性别鉴定，适用于生产实践，以克服现有利用现代分子生物学技术鉴定黄颡鱼幼鱼性别的技术所用仪器需求太高、检测花费高、方法步骤繁琐等缺陷，本发明的鉴定方法更高效、经济、快速、准确、稳定，适用于生产实践。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案是：

一种鉴别杂交黄颡鱼[黄颡鱼(♀)╳瓦氏黄颡鱼(♂)]幼鱼性别的方法，该方法包括步骤：

1）染色液冰醋酸洋红溶液配制步骤：称取0.5g洋红染色剂，加入100mL45%的冰醋酸，加热溶解2-4分钟；待冷却后，过滤取滤液，避光常温保存；

2）染色液乙醇结晶紫溶液配制步骤：称取结晶紫染色剂1.0g，草酸铵0.4g，然后再加入20mL95%的乙醇，搅拌溶解，最后加入80mL双蒸水混合均匀，过滤后取其滤液，避光常温保存；

3）性腺组织固定步骤：用5%醋酸溶液0.2-0.4mL固定性腺组织，性腺组织迅速被固定,质地变硬,颜色变为乳白色；

4）性腺组织取样步骤：固定后30-60秒内取出乳白色的性腺组织，放在预先滴有1滴洋红醋酸溶液的载玻片上,再加入1滴结晶紫乙醇溶液让其染色2-4分钟,最后盖上盖玻片并将性腺组织轻轻压平,放在4×10的生物显微镜下观察；

5）压片观察：根据幼鱼性腺形状、细胞排列方式、细胞个体大小等方面的差异鉴别幼鱼的性别；性腺形状呈栉状分支；细胞体积小，细胞紧密堆积在一起，细胞与细胞间隔很难分辨的为雄鱼；性腺形状呈带状细丝；细胞体积相对较大，形状呈圆形或卵圆形，细胞排列规则，轮廓清晰的为雌鱼。

本发明还公开了利用上述方法测定杂交黄颡鱼雄性率的方法，是在幼鱼群体中进行随机抽样，样品数量为100尾以上，被抽样的幼鱼个体体长规格为3厘米以上；对抽样的个体按照上述方法鉴别性别；根据鉴别结果得出幼鱼群体的雄性率。

为了验证本发明方法的准确性，将相同个体的的另一条性腺组织取出采用传统的Bouin氏固定液按照常规方法固定幼鱼性腺，然后进行常规石蜡切片，后运用苏木精-伊红染色法染色后观察，与本发明压片观察得到的性别结果比较。通过比较，同一尾幼鱼取出的两条性腺组织分别使用染色压片技术与石蜡切片技术所得到的性别鉴定结果一致，表明本发明染色压片技术应用杂交黄颡鱼[黄颡鱼(♀)╳瓦氏黄颡鱼(♂)]、普通黄颡鱼、“全雄一号”黄颡鱼的幼鱼性别鉴定准确率达到100%。

本发明的方法，在杂交黄颡鱼[黄颡鱼(♀)╳瓦氏黄颡鱼(♂)]、普通黄颡鱼、“全雄一号”黄颡鱼幼鱼长至3厘米以上即可高效、经济、快速、准确、稳定的鉴定幼鱼的性别，由于雌雄鱼生长差异接近3倍，使育苗生产部门及养殖户能够快速稳定的测定黄颡鱼雄性率，以增加商品鱼的效益。

附图说明

图1为杂交黄颡鱼[黄颡鱼(♀)╳瓦氏黄颡鱼(♂)]精巢压片，示精原细胞（╳40）。

图2为杂交黄颡鱼[黄颡鱼(♀)╳瓦氏黄颡鱼(♂)]卵巢压片，示卵原细胞（╳40）。

具体实施方式

本发明具体实例如下：

1、鉴定前期准备

1）药品：5%醋酸溶液、乙酸（冰醋酸）、洋红染色剂（苯酚红）、结晶紫染色剂、草酸铵、95%乙醇、双蒸水

2）器材：生物显微镜、1mL注射器、眼科剪、虹膜小镊子、载玻片、盖玻片、滴管

3）染色液配制：按说明书中介绍的方法配制冰醋酸洋红溶液、乙醇结晶紫溶液

2、性别鉴定：

江苏省南京师范大学生命科学院水生经济动物种质资源与遗传育种研究室于2013年6月份在禄口黄颡鱼实验基地人工繁育出杂交黄颡鱼[黄颡鱼(♀)╳瓦氏黄颡鱼(♂)]10万尾、普通黄颡鱼2万尾、“全雄一号”黄颡鱼5万尾。杂交黄颡鱼在开口后30天后，90%鱼苗长至3厘米以上；普通黄颡鱼和“全雄一号”黄颡鱼在开口后35天后，90%鱼苗长至3厘米以上，3种幼鱼各随机取100尾。

用注射器将5%醋酸溶液注入幼鱼的腹腔,采用胸鳍注射或直接从腹腔注入，注射量为0.2-0.4mL，幼鱼个体偏大注射量将增大，使鱼苗的性腺组织迅速被固定,质地变硬,颜色变为乳白色。对性腺组织固定时,要掌握好5%醋酸溶液的注射量和性腺固定的时间。若固定时间超过1分钟,则会导致幼鱼体腔内组织的颜色变浅,难以将性腺组织分辨出来,增加性腺组织取样的难度。在进行性腺组织取样时,要用虹膜小镊子一次性地将性腺组织取出,且不要粘连过多的其它组织,否则鱼苗的性腺组织将很难再度分辨取出。

注射完毕后，30秒内用手术剪从肛门往头部方向剪开，剪至头骨处，然后用剪刀以垂直于开口方向，将鱼的体侧剪开，像开门一样用镊子拨开体侧的肌肉，轻轻拨开内脏团,将两条紧贴背部腹膜的已变白性腺组织剪断取出或直接拉扯性腺一侧将性腺一次性取出，放在预先滴有1滴(0.05mL)洋红醋酸溶液的载玻片上,再加入1滴(0.05mL)结晶紫乙醇溶液让其染色2-4分钟,最后盖上盖玻片并将性腺组织轻轻压平,放在4*10的生物显微镜下观察。要避免染色时间过长(宜不超过5分钟),否则会导致性腺组织着色过深而增加观察难度,影响性别鉴别的准确性。洋红染色剂的溶液浓度为0.5g/mL。结晶紫染色剂的溶液浓度为1g/mL。

根据幼鱼性腺形状、细胞排列方式、细胞个体大小等方面的差异鉴别幼鱼的性别。通过生物显微镜下观察：雄鱼精巢组织着色较卵巢组织深，形状呈栉状分支(形似树枝状)；精原细胞体积小，细胞紧密堆积在一起，细胞与细胞间隔很难分辨（如图1所示）。雌鱼卵巢组织着色较浅，形状呈带状细丝；卵原细胞体积相对较大，形状呈圆形或卵圆形，卵原细胞排列规则，轮廓清晰（如图2所示）。

采用石蜡切片技术验证此发明的准确性：每尾黄颡鱼幼鱼体壁两侧分别有一条性腺组织，将另一条性腺组织取出，用波恩氏固定液按照常规方法固定幼鱼性腺，因取幼鱼性腺时运用5%醋酸固定，为了保证固定液的成分及浓度，固定过程中更换固定液2次。然后进行常规石蜡切片，后运用苏木精-伊红染色法染色后观察，与压片观察得到的幼鱼性别结果比较（见表1）。

表1染色压片技术与石蜡切片技术鉴定幼鱼性别结果比较

通过比较，同尾幼鱼取出的两条性腺组织分别使用染色压片技术与石蜡切片技术所得到的性别鉴定结果一致。该专利技术应用杂交黄颡鱼[黄颡鱼(♀)╳瓦氏黄颡鱼(♂)]、普通黄颡鱼、“全雄一号”黄颡鱼的性别鉴定准确率达到100%。

Claims (2)

1.一种鉴别杂交黄颡鱼幼鱼性别的方法，它包括以下步骤：

1）染色液冰醋酸洋红溶液配制步骤：称取0.5g洋红染色剂，加入100mL45%的冰醋酸，加热溶解2-4分钟；待冷却后，过滤取滤液，避光常温保存；2）染色液乙醇结晶紫溶液配制步骤：称取结晶紫染色剂1.0g，草酸铵0.4g，然后再加入20mL95%的乙醇，搅拌溶解，最后加入80mL双蒸水混合均匀，过滤后取其滤液，避光常温保存；

2）性腺组织固定步骤：用5%醋酸溶液0.2-0.4mL固定性腺组织，性腺组织迅速被固定,质地变硬,颜色变为乳白色；4）性腺组织取样步骤：固定后30-60秒内取出乳白色的性腺组织，放在预先滴有1滴洋红醋酸溶液的载玻片上,再加入1滴结晶紫乙醇溶液让其染色2-4分钟,最后盖上盖玻片并将性腺组织轻轻压平,放在4×10的生物显微镜下观察；

3）压片观察：根据幼鱼性腺形状、细胞排列方式、细胞个体大小等方面的差异鉴别幼鱼的性别；性腺形状呈栉状分支；细胞体积小，细胞紧密堆积在一起，细胞与细胞间隔很难分辨的为雄鱼；性腺形状呈带状细丝；细胞体积相对较大，形状呈圆形或卵圆形，细胞排列规则，轮廓清晰的为雌鱼。

2.一种利用权利要求1所述方法测定杂交黄颡鱼雄性率的方法，其特征在于，在幼鱼群体中进行随机抽样，样品数量为100尾以上，被抽样的幼鱼个体体长规格为3厘米以上；对抽样的个体按照权利要求1的方法鉴别性别；根据鉴别结果得出幼鱼群体的雄性率。

Images