MXPA01009074A

MXPA01009074A - Nuevo ligando zalfa11 de citocina.

Info

Publication number: MXPA01009074A
Application number: MXPA01009074A
Authority: MX
Inventors: Jane A Gross
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1999-03-09
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2002-03-27
Also published as: IL145288A; CN1378595A; HUP0200418A3; BR0008772A; BR0008772B1; ES2295019T3; PT1165791E; IL207424A; CN102406937A; KR20010103794A; RU2346951C2; EP1165791B1; EP2295577A3; WO2000053761A2; IL195713A; PL207350B1; CN1827639A; DK1165791T3; CN101575377A; CN1927883A

Abstract

La presente invencion se refiere a las moleculas polipeptidicas y polinucleotidicas del Ligando zalfall. El Ligando zalfall es una nueva citocina. Los polipeptidos pueden ser utilizados dentro de los metodos para estimular la proliferacion y/o el desarrollo de las celulas hematopoyeticas in vitro e in vivo. La presente invencion tambien incluye los metodos para producir la proteina, los usos para la misma y los anticuerpos para esta.

Description

NUEVO LIGANDO ZALFAll DE CITOCINA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La proliferación y diferenciación de células de organismos múltiples son controladas por hormonas y por factores de crecimiento polipeptídicos. Estas moléculas difundibles permiten que las células se comuniquen una con la otra y actúen al unisono para formar células, tejidos y órganos, y para reparar el tejido dañado. Los ejemplos de hormonas y factores de crecimiento incluyen las hormonas esteroides (por ejemplo estrógeno, testosterona), hormona paratiroidea, hormona estimulante del folículo, las interleucinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , eritropoyetina (EPO) y calcitonina. Las hormonas y factores de crecimiento influyen el metabolismo celular mediante el enlace a los receptores. Los receptores pueden ser proteínas membranales integrales que están ligadas a las vías de señalización dentro de la célula, tales como los sistemas de segundo mensajero. Otras clases de receptores son moléculas solubles, tales como los factores de transcripción.

REF: 132852 Las citocinas estimulan en general la proliferación o diferenciación de células de la línea hematopoyética o participan en los mecanismos de la respuesta inmune e inflamatoria del cuerpo. Los ejemplos de citocinas que afectan la hematopoyesis son la eritropoyetina (EPO) , que estimula el desarrollo de las células sanguíneas rojas,; trombopoyetina (TPO), que estimula el desarrollo de las células de la línea de megacariocitos; y el factor de estimulación de colonia de granulocitos (G-CSF) , que estimula el desarrollo de los neutrófilos. Estas citocinas son útiles en la restauración de los niveles normales de las células sanguíneas en pacientes que sufren de anemia, trombocitopenia, y neutropenia o que reciben quimioterapia para el cáncer. Las interleucinas son una familia de citocinas que son' mediadoras de las respuestas inmunológicas, incluyendo la inflamación. Las interleucinas son mediadoras de una variedad de patologías inflamatorias. Centrales a una respuesta inmune están las células T, las cuales producen muchas citocinas e inmunidad adaptativa a los antígenos. Las citocinas producidas por las células T han sido clasificadas como del tipo 1 y del tipo 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317, 1998) . Las citocinas del tipo 1 incluyen IL-2, IFN-?, LT-a, y están involucradas en las respuestas inflamatorias, inmunidad viral, inmunidad contra parásitos intracelulares y rechazo de aloinjerto. Las citocinas del tipo 2 incluyen IL-4. IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, y están involucradas en las respuestas humorales, inmunidad contra helmintos y respuesta alérgica. Las citocinas compartidas entre los tipos 1 y 2 incluyen IL-3, GM-CSF y TNF-a. Existe alguna evidencia para sugerir que las poblaciones de células T productoras de tipo 1 y tipo 2 migran preferentemente hacia los diferentes tipos de tejido inflamado . Las células T maduras pueden ser activadas, por ejemplo, por un antígeno u otro estímulo, para producir, por ejemplo, citocinas, moléculas bioquímicas de señalización, o receptores que influyen además el destino de la población de células T. Las células B pueden ser activadas por medio de receptores sobre su superficie celular, incluyendo el receptor de células B y otras moléculas accesorias para realizar funciones de células accesorias, tales como la producción de citocinas . Las células asesinas naturales (NK) tienen una célula progenitora común con las células T y las células B, y juegan un papel en la supervivencia inmune. Las células NK, las cuales comprenden hasta 15% de los linfocitos sanguíneos, no expresan receptores de antígeno, y por lo tanto no utilizan el reconocimiento de MHC como requerimiento para el enlace a una célula objetivo. Las células NK están involucradas en el reconocimiento y muerte de ciertas células tumorales y células viralmente infectadas. In vivo, se cree que las células NK requieren la activación, no obstante, in vi tro, las células NK han mostrado que matan algunos tipos de células tumorales sin activación. Las actividades demostradas in vivo de la familia de citocinas ilustran el potencial clínico enorme de, y la necesidad para, otras citocinas, agonistas de citocinas, y antagonistas de citocinas. La presente invención enfrenta estas necesidades mediante la provisión de una nueva citocina que estimula las células de la línea celular hematopoyética, así como las composiciones y métodos relacionados . La presente invención proporciona tales polipéptidos para estos y otros usos, que deben ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una ilustración de un alineamiento múltiple de la IL-2 humana, IL-15 humana, el Ligando zalfall (SEQ ID NO. 2), IL-4 humana, IL-4 de ratón, GM-CSF humano y GM-CSF de ratón.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de describir la invención con detalle, puede ser de auxilio para el entendimiento de la misma, definir los siguientes términos : El término "marcador de afinidad" es utilizado en la presente para denotar un segmento polipeptídico que puede ser acoplado a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o la detección del segundo polipéptido o proporcionar sitios para el acoplamiento del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, cualquier péptido o proteína para el cual esté disponible un anticuerpo u otro agente de enlace específico, puede ser utilizado como un marcador de afinidad. Los marcadores de afinidad incluyen un tramo de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J . 4 : 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), la glutation-S-transferasa (Smith y Johnson, Gene 67: 31, _1988)., el marcador de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 82: 7952-4, 1985), la sustancia P, el péptido FlagMR (Hopp et al., Biotechnology 6 : 1204-10, 1988), el péptido de enlace a la estreptavidina, u otro epítope antigénico o dominio de enlace. Ver, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2 : 95-107, 1991. Los ADNs que codifican para los marcadores de afinidad son disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . El término "variante alélica" se utiliza en la presente para denotar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede dar como resultado el polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar para polipéptidos que tienen secuencia alterada de aminoácidos. El término variante alélica es también utilizado en la presente para denotar una proteína codificada pro una variante alélica de un gen. Los términos "amino-terminal" y "carboxilo-terminal" son utilizados en la presente para denotar las posiciones dentro de los polipéptidos. Donde el contexto lo permita, estos términos son utilizados con referencia a una secuencia o porción particular de un polipéptido para denotar la proximidad o la posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia colocada carboxilo-terminal a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido, está localizada próxima al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo. El termino "par complemento/anti-complemento" denota las porciones no idénticas que forman un par estable, no covalentemente asociado, bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par complemento/anti-complemento. Otros pares complemento/anti-complemento ejemplares incluyen los pares receptor/ligando, anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítope) , los pares de polinucleótido en sentido/antisentido, y similares. Donde la disociación subsecuente del par complemento/anti-complemento es deseable, el par complemento/anti-complemento tiene una afinidad de enlace menor de 109 M"1. El término "complementos de una molécula polinucleotídica" denota una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de base complementaria y la orientación inversa en comparación a una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5 ' CCCGTGCAT 3 ' . El término "secuencia nucleotídica degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (en comparación a una molécula polinucleotídica de referencia que codifica para un polipéptido) . Los codones degenerados contienen tripletes diferentes de nucleótidos, pero codifican para el mismo residuo de aminoácidos (por ejemplo, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno para Asp) . El término "vector de expresión" es utilizado para denotar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica para un polinucleótido de interés, operablemente enlazado a los segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Tales segmentos adicionales incluyen las secuencias promotoras y terminadoras , y pueden también incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un aumentador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de expresión son en general derivados de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos. El término "aislado" cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido ha sido removido de su medio genético natural y está de este modo libre de otras secuencias de codificación extrañas o no deseadas, y está en una forma adecuada para el uso dentro de los sistemas de producción de proteínas, manipulados mediante ingeniería genética. Tales moléculas aisladas son aquellas que son separadas de su ambiente natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los cuales éstas están ordinariamente asociadas, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural tales como los promotores y los terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para una persona de experiencia ordinaria en la técnica (ver, por ejemplo Dynan y Tijan, Nature 316: 774-78, 1985) . Un polipéptido o proteína "aislado" es un polipéptido o proteína que se encuentra en una condición diferente de su ambiente nativo, tal como separado de la sangre y del tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, por ejemplo más de 95% puros, más preferentemente más de 99% puros. Cuando se utiliza en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glucosiladas o derivatizadas . El término "neoplásico" , cuado se hace referencia a las células, indica las células que sufren proliferación nueva y anormal, particularmente en un tejido en donde la proliferación está descontrolada y es progresiva, dando como resultado un neoplasma. Las células neoplásicas pueden ser ya sea malignas, por ejemplo invasoras o metastáticas, o benignas. El término "operablemente enlazado" , cuando se hace referencia a los segmentos de ADN, indica que los segmentos están acomodados de modo que éstos funcionan al unísono para sus fines pretendidos, por ejemplo la transcripción inicia en el promotor y procede a través del segmento de codificación hacia el terminador. El término "ortólogo" denota un polipéptido o proteína obtenida a partir de una especie que es la contraparte funcional de un polipéptido o proteína de una especie diferente. Las diferencias de secuencias entre ortólogos son el resultado de la especiación. "Parálogos" son proteínas distintas pero estructuralmente relacionadas, elaboradas por un organismo. Se cree que los parálogos surgen a través de la duplicación de los genes. Por ejemplo, la a-globina, ß-globina, y la mioglobina son parálogos uno del otro . Un "polinucleótido" es un polímero de una sola hebra o de hebra doble de las bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas desde el extremo 5' hacia el extremo 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y AD?, y pueden ser aislados de fuentes naturales, sintetizados in vi tro, o preparados a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos son expresados como pares de bases (abrevados "pb"), nucleótidos ("nt") o kilobases ("kb"). Donde el contexto lo permita, los últimos dos términos pueden describir polinucleótidos que son de una sola hebra o de doble hebra. Cuando el término es aplicado a las moléculas de doble hebra, éste es utilizado para denotar la longitud completa y se entenderá que es equivalente al término "pares de bases" . Será reconocido por aquellos expertos en la técnica que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en longitud, y que los extremos de las mismas pueden estar intercalados o escalonados como resultado de la escisión enzimática; de este modo, todos los nucleótidos dentro de una molécula polinucleotídica de doble hebra pueden no estar apareados . Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, ya sea producidos naturalmente o de manera sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos son comúnmente denominados como "péptidos" . El término "promotor" es utilizado en la presente por su significado reconocido en la técnica, para denotar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan el enlace de la ARN-polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras son comúnmente, pero no siempre, encontradas en las regiones 5' de no codificación de los genes. Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína puede también comprender componentes no peptídicos, tales como grupos carbohidrato. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden ser agregados a una proteína por la célula en la cual es producida la proteína, y variarán con el tipo de célula. Las proteínas son definidas en la presente en términos de sus estructuras de cadena principal de aminoácidos; los sustituyentes tales como los grupos carbohidrato son en general no especificados, pero pueden estar presentes no obstante. El término "receptor" denota una proteína asociada a una célula que se enlaza a una molécula bioactiva (por ejemplo un ligando) y es mediadora del efecto del ligando sobre la célula. Los receptores enlazados a la membrana están caracterizados por una estructura de péptidos múltiples que comprende un dominio extracelular de enlace al ligando y un dominio efector intracelular que está típicamente involucrado en la transducción de la señal. El enlace del ligando al receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor, que provoca una interacción entre el dominio efector y otra u otras moléculas en la célula. Esta interacción a su vez conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que están ligados a las interacciones receptor-ligando incluyen la transcripción del gen, la fosforilación, la desfosforilación, incrementos en la producción de AMP cíclico, movilización del calcio celular, movilización de los lípidos membranales, adhesión celular, hidrólisis de los lípidos de inositol e hidrólisis de los fosfollpidos . En general, los receptores pueden ser enlazados a la membrana, citosólicos o nucleares; monoméricos (por ejemplo, el receptor de la hormona estimuladora de la tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multimérico (por ejemplo, receptor de PDGF, receptor de la hormona del crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6) . El "término" secuencia de señal secretora" denota una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido (un "péptido secretor") que, como un componente de un polipéptido más grande, dirige el polipéptido más grande a través de una vía secretora de una célula en la cual éste es sintetizado. El polipéptido más grande es comúnmente escindido para remover el péptido secretor durante el tránsito a través de la vía secretora.

El término "variante de empalme" es utilizado en la presente para denotar formas alternativas del ARN transcrito a partir de un gen. La variación de empalme surge naturalmente a través del uso de sitios de empalme alternativos dentro de una molécula de ARN transcrita, o menos comúnmente entre las moléculas de ARN separadamente transcritas, y puede dar como resultado varios ARNms transcritos a partir del mismo gen. Las variantes de empalme pueden codificar para los polipéptidos que tienen una secuencia alterada de aminoácidos. El término variante de empalme es también utilizado en la presente para denotar una proteína codificada por una variante de empalme del ARN transcrito a partir de un gen. Los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros determinados mediante métodos analíticos imprecisos (por ejemplo electroforesis en gel) se entenderá que son valores aproximados . Cuando tal valor es expresado como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, el valor establecido de X se entenderá que es preciso a -+10%. Todas las referencias citadas en la presente son incorporadas por referencia en su totalidad. La presente invención está basada en parte en el descubrimiento de una novedosa secuencia de ADN que codifica para una proteína que tiene la estructura de una citocina de un cúmulo de cuatro hélices . A través de los procesos de clonación, los ensayos de proliferación y los estudios de enlace descritos con detalle en la presente, ha sido identificada una secuencia polinucleotídica que codifica para un novedoso polipéptido ligando, es decir un ligando con alta especificidad para el receptor previamente huérfano, zalfall. Este ligando polipeptídico, designado Ligando zalfall, fue aislado de una genoteca de ADNc generada a partir de células de sangre periférica humana, activadas (hPBCs) , las cuales fueron seleccionadas para CD3. CD3 es un marcador de la superficie celular único para las células de origen linfoide, particularmente células T. En los ejemplos siguientes, una línea celular que es dependiente de la vía ligada al receptor huérfano zalfall, para la supervivencia y el crecimiento en ausencia de otros factores de crecimiento, fue utilizada para seleccionar una fuente del ADNc que codifica para el ligando zalfall. La línea celular dependiente del factor de crecimiento, preferida, fue utilizada para la transfección y expresión del receptor zalfall y fue BaF3 (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734y 1985; Mathey- Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). No obstante, otras líneas celulares dependientes del factor de crecimiento, tales como FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64 : 786-790, 1984), y M07e (Kiss et al., Leukemia 7 : 235-240, 1993) son adecuadas para este propósito. La secuencia de aminoácidos para el receptor zalfall indicó que el receptor codificado perteneció a la subfamilia del receptor de citocina de la Clase I que incluye, pero no está limitado a, los receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF y G-CSF (para una revisión ver, Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" en Cytokine 5(2) : 95-106, .1993). El receptor zalfall es completamente descrito en la Solicitud de Patente del PCT No. US99/22149 de pertenencia común. El análisis de la distribución tisular del ARNm del receptor zalfall reveló la expresión en nodulo linfático, leucocitos de sangre periférica (PBLs), bazo, médula ósea, y timo. Además, el ARNm fue abundante en la línea celular Raj i (ATCC ?o. CCL-86) derivada de un linfoma de Burkitt. La distribución tisular del receptor sugiere que un objetivo para el ligando zalfall predicho es las células de la línea hematopoyética, en particular las células progenitoras linfoides y las células linfoides. Otras citocinas conocidas de un cúmulo de cuatro hélices que actúan sobre las células linfoides incluyen IL-2, IL-4, IL-7 e IL-15. Para una revisión de las citocinas de cúmulo de cuatro hélices, ver, ?icola et al., Advances in Protein Chemistry 52: 1-65, 1999 y Kelso, A., Immunol . Cell Biol. 76: 300-317, 1998. Los medios condicionados (CM) provenientes de células de sangre periférica humana estimulada con PMA/Ionomicina, seleccionada por CD3+, apoyaron el crecimiento de células BaF3 que expresaron el receptor zalfall y fueron de otro modo dependientes de IL-3. Los medios condicionados provenientes de las células que no fueron.- 1) estimuladas con PMA/lonomicina; o que no fueron: 2) seleccionadas con CD3 (con o sin estimulación con PMA/lonomicina) no soportaron el crecimiento de las células del receptor BaF3/zalfall . Los experimentos control demostraron que esta actividad proliferativa no fue atribuible a otros factores de crecimiento conocidos, y que la habilidad de tales medios condicionados para estimular la proliferación de las células que expresan el receptor de zalfall podría ser neutralizada por una forma soluble del receptor. La proliferación de las células BaF3 que expresan el receptor de zalfall, expuestas a CM proveniente de células de sangre periférica humana, estimuladas con PMA/lonomicina, seleccionadas con CD3+, fueron identificadas mediante inspección visual de los cultivos y/o mediante el ensayo de proliferación. Muchos ensayos de proliferación adecuados son conocidos en la técnica, e incluyen los ensayos para la reducción de un colorante tal como Azul alamar1* (AccuMed International, Inc. Westlake, Ohio), bromuro de 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2 , 5-difeniltetrazolio (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983); 3 - (4 , 5-dimetil-tiazol-2 -il) -5 , 3 -carboximetoxifenil-2H-tetrazolio; hidróxido de 2, 3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -5- [ (fenilamino) carbonil] -2H-tetrazolio; y cloruro de cianoditolil-tetrazolio (los cuales son comercialmente disponibles de Polysciences, Inc., Warrington, PA) ; ensayos de mitogénesis, tales como la medición de la incorporación de 3H-timidina; ensayos de exclusión de colorante utilizando, por ejemplo, negro de naftaleno o azul de tripan; captación del colorante utilizando diacetil-fluoresceína; y liberación de cromo. Ver, en general, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3a. ed., Wiley-Liss, 1994, la cual se incorpora por referencia en la presente. Una biblioteca genómica de ADNc fue preparada a partir de las células de sangre periférica humana, primarias, estimuladas con PMA y con Ionomicina, seleccionadas con CD3+. La genoteca de ADNc de las células de sangre periférica humana estimuladas con PMA y Ionomicina, seleccionadas con CD3+, fue dividida en combinados que contenían moléculas de ADNc múltiples y fue transfectada a una línea de células huésped, por ejemplo, las células de BHK 570 (ATCC No. de acceso 10314) . Las células huésped transfectadas fueron cultivadas en un medio que no contenía factores de crecimiento exógenos y el medio condicionado fue recolectado. Los medios condicionados fueron evaluados para la habilidad para estimular la proliferación de las células BaF3 transfectadas con el receptor zalfall. El medio condicionado que produce combinados de ADNc que estimuló las células BaF3/receptor zalfall fue identificado. Este ADNc plasmídico, combinado fue sometido a electroforesis en AD?c de E. coli y se aisló a partir de colonias simples y se transfectó individualmente en células BHK 570. Los clones positivos fueron identificados mediante un resultado positivo en el ensayo de proliferación BaF3/receptor zalfall, y la especificidad fue probada por neutralización de la proliferación utilizando el receptor zalfall soluble. Se aisló un clon positivo, y el análisis secuencial reveló que la secuencia polinucleotídica contenida dentro del AD? plasmídico era novedosa. La secuencia de señal secretora está comprendida de los residuos de aminoácidos 1 (Met) a 31 (Gly) , y el polipéptido maduro está comprendido de los residuos de aminoácidos 32 (Gln) a 162 (ser) (como se muestra en la SEQ ID ?O. 2) .

En general, se predice que las citocinas tienen una estructura de cuatro hélices alfa, con las hélices A, C y D que son las más importantes en las interacciones ligando-receptor, y están más altamente conservadas entre los miembros de la familia. Con referencia a la secuencia de aminoácidos del Ligando zalfall humano mostrada en la SEQ ID NO. 2, el alineamiento de las secuencias de aminoácidos del Ligando zalfall humano, IL-15 humana, IL-4 humana, y GM-CSF humano se predice que la hélice A del Ligando zalfall es definida por los residuos de aminoácidos 41-56; la hélice B por los residuos de aminoácidos 69-84; la hélice C por los residuos de aminoácidos 91-105; y la hélice D por los residuos de aminoácidos 135-148; como se muestra en la SEQ ID NO. 2. El análisis estructural sugiere que el rizo A/B es largo, el rizo B/C es corto y el rizo C/D es largo paralelo. Esta estructura de rizo da como resultado una organización helicoidal arriba-arriba-abajo-abajo. Los residuos de cisteína son absolutamente conservados entre el Ligando zalfall e IL-15, como se muestra en la Figura 1. Los residuos de cisteína que son conservados entre IL-15 y el Ligando zalfall corresponden a los residuos de aminoácidos 71, 78, 122 y 125 de la SEQ ID NO. 2. La conservación de algunos de los residuos de cisteína es también encontrada en IL-2, IL-4, GM-CSF y el Ligando zalfall .correspondiente a los residuos de aminoácidos 78 y 125 de la SEQ ID NO. 2, como se muestra en la Figura 1. La colocación consistente de cisteína es además la confirmación de la estructura del cúmulo de cuatro hélices. También altamente conservada en la familia que comprende IL-15, IL-2, IL-4, GM-CSF y el Ligando zalfall, está la secuencia Glu-Phe-Leu como se muestra en la SEQ ID NO. 2 en los residuos 136-138 como en la Figura 1. El análisis adicional del Ligando zalfall con base en los alineamientos múltiples (como se muestra en la Figura 1) predice que los residuos de aminoácidos 44, 47 y 135 (como se muestra en la SEQ ID NO. 2) juegan un papel importante en el enlace del ligando zalfall a su receptor cognado. Además, la secuencia predicha de aminoácidos del Ligando zalfall murino muestra 57% de identidad a la proteína humana predicha. Con base en la comparación entre las secuencias de los residuos bien conservados del Ligando zalfall humano y murino, se encontraron en las regiones predichas que codifican para las hélices A y D. Los polinucleótidos correspondientes que codifican para las regiones polipeptídicas del Ligando zalfall, los dominios, las porciones, los residuos y las secuencias descritas en la presente, son como se muestran en la SEQ ID NO. 1. El análisis mutacional detallado ha sido realizado para IL-4 e IL-2, las cuales están altamente relacionadas al ligando zalfall. El análisis de IL-2 murina (Zurawski et al., EMBO J. 12: 5113-5119, 1993) muestra residuos en las hélices A y C que son importantes para el enlace a IL-2Rß; los residuos críticos son Asp34, Asn99 y Asn_03. Los residuos múltiples dentro del rizo A/B de IL-2 y la hélice B, son importantes para el enlace de IL-2Ra, mientras que únicamente un residuo simple, Gln_41 en la hélice D, es vital para el enlace con IL-2Ra. Similarmente, las hélices A y c son sitios de interacción entre IL-4 e IL-4Ra (estructuralmente similar a IL-2Ra) y los residuos dentro de la hélice D son vitales para la interacción de IL-2Ra (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1657-1662, 1997; Kruse et al., EMBO J. 11: 3237-3244, 1992) . En particular, la mutación Tyr_24 a Asp en IL-4 humana crea un antagonista, el cual se enlaza con lL-4Ra pero no con IL-2Ra y por lo tanto no puede señalar (Kruse et al. ibid. 1992) . Mientras que la hélice A está relativamente bien conservada entre el ligando zalfall humano y murino, la hélice C es más divergente. Mientras que ambas especies tienen aminoácidos ácidos predominantes en esta región, las diferencias pueden explicar la especificidad de especie en la interacción entre el ligando zalfall y su receptor tipo "beta", zalfall. El rizo A/B y la hélice B del Ligando zalfall están bien conservados entre especies; aunque no ha sido todavía identificada la subunidad del receptor correspondiente a IL-2Ra , la conservación a través de esta región sugiere que es funcionalmente significativa. Las hélices D del Ligando zalfall humano y murino están también altamente conservadas. Los antagonistas del receptor zalfall pueden ser designados a través de mutaciones dentro de la hélice D del Ligando zalfall. Éstos pueden incluir el truncamiento de la proteína a partir del residuo Gln145 (SEQ ID NO. 2), o mutaciones de Gln?_5 o Ile_48 (de la SEQ ID NO. 2; correspondiente a Tyr24 en 11-4 humana) a los residuos tales como Ala o Asp. Cualquier mutación que perturbe la estructura helicoidal del Ligando zalfall puede abolir el enlace con su receptor y de este modo inhibir la señalización. Las citocinas con cúmulos de cuatro hélices son también agrupadas por la longitud de sus hélices componentes. Las citocinas de la forma de "hélice larga" consisten en general de entre 24-30 residuos en las hélices, e incluyen IL-6, el factor neutrotrófico ciliar (CNTF) , factor inhibitorio de la leucemia (LIF) y la hormona humana del crecimiento (hGH) . Las citocinas de la forma "hélice corta" consisten en general de entre 18-21 residuos en las hélices e incluyen IL-2, IL-4 y GM-CSF. Se cree que el Ligando zalfall es un nuevo miembro del grupo de citocinas de la forma de hélice corta. Los estudios utilizando CNTF e IL-6 demostraron que una hélice de CNTF puede ser intercambiada por la hélice equivalente en IL-6, confiriendo propiedades de enlace de CTNF a la quimera. De este modo, parece que los dominios funcionales de las citocinas de cuatro hélices son determinados con base en la homología estructural, independientemente de la identidad secuencial, y pueden mantener la integridad funcional en una quimera (Kallen et al., J. Biol. Chem. 274: 11859-11867, 1999) . Por lo tanto, los dominios helicoidales del Ligando zalfall serán útiles para la preparación de moléculas de fusión quiméricas, particularmente con otras citocinas de forma de hélice corta, para determinar y modular la especificidad de enlace al receptor. De interés particular son las proteínas de fusión manipuladas mediante ingeniería genética por la hélice A y/o la hélice D, y las proteínas de fusión que combinan los dominios helicoidal y de rizo provenientes de otras citocinas de forma corta tales como IL-2, IL-4, e IL-15 y GM-CSF. Los residuos de aminoácidos que comprenden las hélices A, B, C y D, y los rizos A/B, BC y C/D para el Ligando zalfall, IL-2, IL-4, IL-15 y GM-CSF, se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 La presente invención proporciona las moléculas polinucleotídicas, incluyendo las moléculas de ADN y ARN, que codifican para los polipéptidos del Ligando zalfall descritos en la presente. Aquellos expertos en la técnica reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación secuencial considerable entre estas moléculas polinucleotídicas. La SEQ ID ?O. 3 es una secuencia degenerada de AD? que abarca todos los AD?s que codifican para el polipéptido del Ligando zalfall de la SEQ ID NO. 2. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la secuencia degenerada de la SEQ ID NO. 3 también proporciona todas las secuencias de ARN que codifican para la SEQ ID NO. 2 mediante la sustitución de U por T. De este modo, los polinucleótidos que codifican para el polipéptido del Ligando zalfall que comprenden el nucleótido 1 ó 97 al nucleótido 486 de la SEQ ID NO. 3 y sus equivalentes de ARN, son contemplados por la presente invención. La Tabla 2 describe los códigos de una sola letra utilizados dentro de la SEQ ID NO. 3 para denotar las posiciones de los nucleótidos degenerados. Las "resoluciones" son los nucleótidos denotados por el código de una sola letra. "Complemento" indica el código para el o los nucleótidos complementarios. Por ejemplo, el código Y denota C o T, y su complemento R denota A o G, con A que es complementario a T, y G que es complementario a C.

Tabla 2 Nucleót:ido Resolución Complemento Resolución A A T T C C G G G G C C T T A A R A|G Y C|T Y C| R A G M A| K G T K G| M A| C S c| s C G W Al w Al T H A|C|T D A|G|T B C|G|T V A|C|G V A|C|G B C|G|T D A|G|T H A|C|T N AICIGIT N AlClGlT Los codones degenerados utilizados en la SEQ ID NO. 3, que abarcan todos los posibles codones para un aminoácido dado, se describen en la Tabla 3.

Tabla 3 Aminoácido Código de Una Codones Codón Sola Letra Degenerado Cys C TGC TGT TGY Ser S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN Thr T AC ACC ACG ACT ACN Pro P CCA CCC CCG CCT CCN Ala A GCA GCC GCG GCT GCN Gly G GGA GGC GGG GGT GGN Asn N AAC AAT AAY Asp D GAC GAT GAY Glu E GAA GAG GAR Gln Q CAA CAG CAR His H CAC CAT CAY Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN Lys K AAA AAG AAR Met M ATG ATG He I ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN Val V GTA GTC GTG GTT GTN Phe F TTC TTT TTY Tyr Y TAC TAT TAY Trp W TGG TGG Ter • TAA TAG TGA TRR Asn | Asp B RAY Glu|Gln Z SAR Cualquiera X NNN Una persona de experiencia ordinaria en la técnica apreciará que es introducida cierta ambigüedad en la determinación de un codón degenerado, representativo de todos los posibles codones que codifican para cada aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado para la serina (WSN) puede, en algunas circunstancias, codificar para la arginina (AGR) , y el codón degenerado para la arginina (MGN) puede, en algunas circunstancias, codificar para la serina (AGY) . Existe una relación similar entre los codones que codifican para la fenilalanina y la leucina. De este modo, algunos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada pueden codificar para secuencias de aminoácidos variantes, pero una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede identificar fácilmente tales secuencias variantes por referencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2. Las secuencias variantes pueden ser fácilmente probadas para la funcionalidad como se describe en la presente. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica apreciará que diferentes especies pueden mostrar "uso de codón preferencial". En general, ver, Grantham et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas et al. Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13 : 355-64, 1981; Grosjean y Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158 : 573-97, 1982. Como se utiliza en la presente, el término "uso de codón preferencial" o "codones preferenciales" es un término de la técnica referente a los codones de producción de proteínas que son más frecuentemente utilizados en células de una cierta especie, favoreciendo de este modo uno o unos pocos representantes de los posibles codones que codifican para cada aminoácido (Ver Tabla 3) . Por ejemplo, el aminoácido Treonina (Thr) puede ser codificado por ACÁ, ACC, ACG, o ACT, pero en células de mamífero, ACC es el codón más comúnmente utilizado; en otras especies, por ejemplo, en células de insecto, levadura, virus o bacterias, pueden ser preferenciales diferentes codones de Thr. Los codones preferenciales para una especie particular pueden ser introducidos dentro de los polinucleótidos de la presente invención mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codones preferenciales dentro del ADN recombinante puede, por ejemplo, aumentar la producción de la proteína al hacer a la traducción de la proteína más eficiente dentro de un tipo celular particular o una especie particular. Por lo tanto, la secuencia de codón degenerado descrita en la SEQ ID NO. 3 sirve como una plantilla para optimizar la expresión de los polinucleótidos en diversos tipos celulares y diversas especies comúnmente utilizadas en la técnica y descritas en la presente. Las secuencias que contienen los codones preferenciales pueden ser probadas y optimizadas para la expresión en diversas especies, y probadas para la funcionalidad como se describe en la presente .

Como se anotó previamente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y ARN. Los métodos para la preparación del ADN y el ARN son bien conocidos en la técnica. En general, el ARN es aislado de un tejido o célula que produce grandes cantidades del ARN del Ligando zalfall. Tales tejidos y células son identificados por manchado o transferencia de Northern (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5102, 1980), o mediante selección del medio condicionado proveniente de diversos tipos celulares para la actividad sobre células objetivo o tejidos objetivo. Una vez que es identificada la actividad o la célula o el tejido productor de ARN, el ARN total puede ser preparado utilizando extracción con isotiocianato de guanidinio, seguido por el aislamiento mediante centrifugación en gradiente de cloruro de cesio (Chirgwin et al., Biochemistry 18 : 52-94, 1979). El AR? Poly (A) + es preparado a partir del AR? total utilizando el método de Aviv y Leder (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 69 : 1408-12, 1972) . El ADN complementario (ADNc) es preparado a partir del ADN poli (A) + utilizando métodos conocidos. En una alternativa, el ADN genómico puede ser aislado. Los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos del Ligando zalfall son luego identificados y aislados por ejemplo mediante hibridación o PCR.

Un Ligando zalfall que codifica para el clon de longitud completa puede ser obtenido mediante procedimientos de clonación convencionales . Los clones de ADN complementario (ADNc) son preferidos, aunque para algunas aplicaciones (por ejemplo, la expresión en animales transgénicos) puede ser preferible para utilizar un clon genómico, o para modificar un clon de ADNc para incluir al menos un intrón genómico. Los métodos para la preparación del ADNc y los clones genómicos son bien conocidos y están dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica, e incluyen el uso de la secuencia descrita en a presente, o partes de la misma, para el sondeo o cebadura de una genoteca. Las genotecas de expresión pueden ser sondeadas con anticuerpos para los fragmentos del receptor zalfall, u otros socios de enlace específicos. Las secuencias polinucleotídicas del Ligando zalfall descritas en la presente pueden también ser utilizadas como sondas o cebadores para clonar las regiones de no codificación 5' de un gen del Ligando zalfall. En vista de la expresión específica del tejido observada para el Ligando zalfall, esta región génica se espera que proporcione expresión específica hematopoyética linfoide. Los elementos promotores provenientes de un gen del Ligando zalfall podrían de este modo ser utilizados para dirigir la expresión específica del tejido de los genes heterólogos, por ejemplo en animales transgénicos o pacientes tratados con terapia génica. La clonación de las secuencias 5' flanqueantes también facilita la producción de las proteínas del Ligando zalfall mediante "activación del gen" como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,641,670. En resumen, la expresión de un gen del Ligando zalfall endógeno en una célula es alterada por la introducción dentro del locus del Ligando zalfall, de una construcción de ADN que comprende al menos una secuencia de dirección al objetivo, una secuencia reguladora, un exón, y un sitio donador de empalme, no apareado. La secuencia de dirección al objetivo es una secuencia de no codificación 5', del Ligando zalfall, que permite la recombinación homologa de la construcción con el locus del Ligando zalfall endógeno, con lo cual las secuencias dentro de la construcción se llegan a enlazar operablemente con la secuencia de codificación del Ligando zalfall. De esta manera, un promotor del Ligando zalfall endógeno puede ser reemplazado o suplementado con otras secuencias reguladoras para proporcionar expresión mejorada, específica de tejido, o de otro modo regulada. La presente invención proporciona además los polipéptidos contraparte y los polinucleótidos provenientes de otras especies (ortólogos) . Estas especies incluyen, pero no están limitadas a mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otras especies de vertebrados e invertebrados. De interés particular son los polipéptidos del Ligando zalfall provenientes de otras especies de mamíferos, incluyendo murinos, porcinos, ovinos, bovinos, caninos, felinos, equinos, y otros polipéptidos de primate. Los ortólogos del Ligando zalfall humano pueden ser clonados utilizando información y las composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con las técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, un ADNc puede ser clonado utilizando el ARNm obtenido a partir de un tipo tisular o celular que exprese el Ligando zalfall como se describe en la presente. Las fuentes adecuadas del ARNm pueden ser identificadas mediante el sondeo de los manchados de Northern con las sondas diseñadas a partir de las secuencias descritas en la presente. Una biblioteca genómica o genoteca es luego preparada a partir del ARNm de un tejido positivo o línea celular positiva. El ADNc que codifica para el Ligando zalfall puede ser luego aislado mediante una variedad de métodos, tales como mediante sondeo con un ADNc humano, completo o parcial, o con uno o más grupos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. Un ADNc puede también ser clonado utilizando la reacción en cadena de polimerasa, o PCR (Mullís, Patente de los Estados Unidos No. 4,683,202), utilizando cebadores diseñados a partir de las secuencias del Ligando zalfall humano, representativo, descritas en la presente. Dentro de un método adicional, la genoteca de ADNc puede ser utilizada para transformar o transfectar células huésped, y la expresión del ADNc de interés puede ser detectada con un anticuerpo para el polipéptido del Ligando zalfall, estudios de enlace o ensayos de actividad. Pueden también ser aplicadas técnicas similares para el aislamiento de los clones genómicos . La secuencia polinucleotídica para el ortólogo de ratón del Ligando zalfall ha sido identificada y es mostrada en la SEQ ID NO. 55 y la secuencia correspondiente de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 56. Existe una identidad de 62% entre las secuencias de ratón y de humano sobre una región de 124 aminoácidos que corresponde a los residuos 30 a 153 en la SEQ ID NO. 2, y los residuos 23 a 146 de la SEQ ID NO. 56 del Ligando zalfall. La secuencia madura para el Ligando zalfall de ratón comienza putativamente en His_8 (como se muestra en la SEQ ID NO. 56) , que corresponde a His2s (como se muestra en la SEQ ID NO. 2) en la secuencia humana. Debido a que una forma truncada del polipéptido humano es activa, es probable que un polipéptido equivalente del Ligando zalfall de ratón (por ejemplo sin los residuos His_8 a Pro2 de la SEQ ID NO. 56) sea también activo. El análisis tisular reveló que la expresión del Ligando zalfall de ratón es encontrada en testículos, bazo y timo. Aquellos expertos en la técnica reconocen que la secuencia descrita en la SEQ ID NO. 1 representa un alelo simple del Ligando zalfall humano y que la variación alélica y el empalme alternativo se espera que ocurran también. Las variantes alélicas de esta secuencia pueden ser clonadas mediante el sondeo de ADNc o las bibliotecas genómicas provenientes de diferentes individuos de acuerdo a procedimientos estándares. Las variantes alélicas de la secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO. 1, incluyendo aquellas que contienen mutaciones silenciosas, y aquellas en las cuales las mutaciones dan como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención, como lo son las proteínas que son variantes alélicas de la SEQ ID NO. 2. Los ADNcs generados a partir de los ARNms alternativamente empalmados, los cuales conservan las propiedades del polipéptido del Ligando zalfall, son incluidos dentro del alcance de la presente invención, como lo son los polipéptidos codificados por tales AD?cs y AR?ms . Las variantes alélicas y las variantes de empalme de estas secuencias pueden ser clonadas mediante el sondeo del AD?c o de las bibliotecas genómicas a partir de diferentes individuos o tejidos de acuerdo a los procedimientos estándares conocidos en la técnica. El gen del Ligando zalfall ha sido trazado en mapa al marcador estructural de IL-2, SHGC-12342, colocando el Ligando zalfall aproximadamente a 180 kb del marcador de IL-2. El uso de los marcadores circunvecinos coloca al gen del Ligando zalfall en la región 4q27 sobre el mapa del cromosoma 4 de LDB, integrado (The Genetic Location Datábase, University of Sout hampton) . La presente invención también proporciona los reactivos que encontrarán uso en aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, el gen del Ligando zalfall, una sonda que comprende el ADN o ARN del Ligando zalfall o una subsecuencia del mismo, pueden ser utilizados para determinar si el gen del Ligando zalfall está presente sobre un cromosoma humano, tal como el cromosoma 4, o si ha ocurrido la mutación del gen. Con base en la anotación de un fragmento de ADN genómico humano que contiene una parte del ADN genómico del Ligando zalfall (Genbank No. de Acceso AC007458) , el Ligando zalfall está localizado en la región 4q27 del cromosoma 4. Las aberraciones cromosómicas detectables en el locus del gen del Ligando zalfall incluyen, pero no están limitadas a, aneuploidía, cambios en el número de copias del gen, pérdida de la heterogeneidad (LOH) , translocaciones, inserciones, supresiones, cambios en el sitio de restricción y reacomodos. Tales aberraciones pueden ser detectadas utilizando polinucleótidos de la presente invención mediante el empleo de técnicas genéticas moleculares, tales como el análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (RFLP) , análisis de repetición en tándem corta (STR) empleando técnicas de PCR, y otras técnicas de análisis de enlace genético conocidas en la materia (Sambrook et al., ibid; Ausubel et al., ibid. ; Marian, Chest 108. 255-65, 1995). El conocimiento preciso de la posición de un gen puede ser útil para un número de propósitos, incluyendo: 1) la determinación de si una secuencia es parte de un contiguo existente y la obtención de las secuencias genéticas vecinas adicionales, en diversas formas, tales como YACs, BACs o clones de ADNc; 2) la provisión de un gen candidato posible para una enfermedad heredable que permite el enlace a la misma región cromosómica; y 3) organismos modelo de referencia cruzada, tales como ratón, que pueden ayudar a determinar qué función puede tener un gen particular. Como se estableció previamente, los residuos del gen del Ligando zalfall humano cercanos al gen de IL-2, que está en una región del cromosoma 4q que se ha mostrado tiene enlace con la susceptibilidad a la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (incluyendo la enfermedad de Crohn (CD) y la colitis ulcerativa) en algunas familias (Hampe et al. Am. J. Hum. Genet. 64: 808-816, 1999; Cho et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 7502-7507, 1998) . Además, el gen del receptor zalfall traza el mapa a 16pll, otra región genómica que está asociada con la susceptibilidad a CD (Hugot et al., Nature 379: 821-823, 1996; Ohmen et al., Hum. Mol. Genet. 5: 1679-1683, 1996) . CD es una inflamación crónica del intestino con involucramiento sistémico frecuente; mientras que la etiología exacta es desconocida, la disfunción inmunorreguladora que involucra falla de la tolerancia a los antígenos ordinarios del intestino, es un componente mayor (para revisiones ver (Braegger et al., Annals Allergy 72: 135-141, 1994; Sartor, Am. J. Gastroenterol. 92: 5S US, 1997) ) . Varios estudios han encontrado actividad de NK anormal en pacientes con CD (ver, por ejemplo, (Egawa et al., J. Clin. Lab. Immunol . 20: 187-192, 1986; Aparicio-Pagés et al. J. Clin. Lab. Immunol. 29: 119-124, 1989; van Tol et al., Scand J. Gastroenterol . 27: 999-1005, 1992)), y la formación de células B de memoria defectuosa ha sido también documentada (Brogan et al., J. clin. Lab. Immunol . 24: 69-74, 1987).

Ya que el Ligando zalfall juega un papel en la regulación inmune, y ya que los genes para el receptor y el ligando caen dentro de las regiones de susceptibilidad de CD, el receptor y el ligando son genes candidatos para la predisposición genética a la enfermedad de Crohn. La determinación del involucramiento del receptor de zalfall y/o del Ligando zalfall en la patología de IBD puede ser llevada a cabo mediante diversos métodos . El secuenciamiento de los exones a partir del ADN genómico puede revelar mutaciones de codificación (incluyendo las mutaciones en mal sentido, no en sentido y de desplazamiento estructural) , como puede ser el secuenciamiento de los ADNcs. Una ventaja adicional del secuenciamiento a partir del ADN genómico es que las uniones de empalme están también contenidas dentro de los fragmentos secuenciados y pueden revelar anormalidades de empalme, que pueden no aparecer en las muestras de ADNc si, por ejemplo, los ARNs mal empalmados fueron rápidamente degradados. La estructura genómica del Ligando zalfall ha sido determinada. Otros métodos para el análisis del Ligando zalfall y el receptor en los pacientes con IBD incluyen: (1) la evaluación de la producción del ligando a partir de las células T activadas provenientes de pacientes versus controles normales (por ejemplo mediante bioensayo) ; (2) hibridación in si tu del receptor zalfall o el ARN del Ligando zalfall a las secciones del intestino inflamadas provenientes de pacientes con IBD, en comparación a secciones similares provenientes de controles normales; (3) inmunohistoquímica sobre las secciones provenientes de pacientes con IBD versus controles normales; y (4) evaluación de la capacidad de respuesta de las células B periféricas de los pacientes al Ligando zalfall, como se mide mediante los ensayos de mitogenésis. Un diagnóstico podría ayudar a los médicos a determinar el tipo de enfermedad y la terapia asociada, apropiada, y podría ayudar en la conciliación genética. Como tal, los anticuerpos del Ligando anti -zalfall de la invención, los polinucleótidos, y los polipéptidos pueden ser utilizados para la detección del polipéptido del Ligando zalfall, ARNm o los anticuerpos anti-Ligando zalfall, sirviendo de este modo como marcadores y ser directamente utilizados para la detección o las enfermedades genéticas o los cánceres, como se describe en la presente, utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. Además, las sondas polinucleótidicas del Ligando zalfall pueden ser utilizadas para detectar las anormalidades que involucran el cromosoma 4q27 como se describe en la presente. Estas anormalidades pueden estar asociadas con enfermedades humanas, o tumorigénesis, aborto espontáneo u otros desórdenes genéticos. De este modo, las sondas del polinucleótido del Ligando zalfall pueden ser utilizadas para detectar anormalidades o genotipos asociados con estos defectos.

Como se discutió anteriormente, los defectos en el gen del Ligando zalfall mismo pueden dar como resultado un estado de enfermedad humano, heredable. Las moléculas de la presente invención, tales como los polipéptidos, antagonistas, agonistas, polinucleótidos y anticuerpos de la presente invención podrían ayudar a la detección, diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades asociadas con un defecto genético en el Ligando zalfall. Además, las sondas polinucleotídicas del Ligando zalfall pueden ser utilizadas para detectar diferencias alélicas entre los individuos enfermos o no enfermos, en el locus cromosómico del Ligando zalfall. Como tales, las secuencias del Ligando zalfall pueden ser utilizadas como diagnósticos en el perfilamiento de forense de ADN. En general, los métodos de diagnóstico utilizados en el análisis de conexión genética, para detectar una anormalidad genética o una aberración en un paciente, son conocidos en la técnica. La mayoría de los métodos de diagnóstico comprenden los pasos de: (i) obtener una muestra genética proveniente de un paciente potencialmente enfermo, el portador del paciente enfermo o no enfermo potencial, de un alelo recesivo de la enfermedad; (ií) la producción de un primer producto de reacción mediante la incubación de la muestra genética con una sonda polinucleotídica del Ligando zalfall en donde el polinucleótido se hibridará a la secuencia polinucleotídica complementaria, tal como un análisis RFLP o mediante incubación de la muestra genética con cebadores en sentido y antisentido en una reacción de PCR bajo condiciones de reacción de PCR apropiadas; (iii) la visualización del primer producto de reacción mediante electroforesis en gel y/u otro método conocido tal como la visualización del primer producto de reacción con una sonda polinucleotídica del Ligando zalfall en donde el polinucleótido se hibridará a la secuencia polinucleotídica complementaria de la primera reacción; (iv) la comparación del primer producto de reacción visualizado a un segundo producto de reacción control de una muestra genética proveniente de un individuo control o normal . Una diferencia entre el primer producto de reacción y el producto de reacción control, es indicadora de una anormalidad genética en el paciente enfermo o potencialmente enfermo, o la presencia de un fenotipo de portador recesivo heterocigoto para un paciente no enfermo, o la presencia de un defecto genético en un tumor proveniente de un paciente enfermo, o la presencia de una anormalidad genética en un feto o en un embrión antes del implante. Por ejemplo, una diferencia en el patrón del fragmento de restricción, la longitud de los productos de PCR, la longitud de las secuencias repetitivas en el locus genético del Ligando zalfall, y similares, son indicadoras de una anormalidad genética, una aberración genética, o una diferencia alélica en comparación al control normal. Los controles pueden ser provenientes de miembros no afectados de la familia, o individuos no relacionados, dependiendo de la prueba y de la disponibilidad de las muestras. Las muestras genéticas para el uso dentro de la presente invención incluyen el ADN genómico, ARNm y ADNc aislado de cualquier tejido o de otra muestra biológica de un paciente, tales como, pero no limitadas a, sangre, saliva, semen, células embrionarias, fluido amniótico, y similares. La sonda polinucleotídica o el cebador pueden ser ARN o ADN, y comprenderá una porción de la SEQ ID NO. 1, el complemento de la SEQ ID NO . 1, o un equivalente de ARN del mismo. Tales métodos de mostrar el análisis de conexión genética a los fenotipos de la enfermedad humana, son bien conocidos en la técnica. Para referencia a los métodos basados en PCR en pruebas de diagnóstico ver, en general, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols : Current Methods and Applications (Humana Press, I?c . 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cáncer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek y Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998), y Meltzer (ed.), PCR en Bíoanalysis (Humana Press, Inc. 1998)) .

Las mutaciones asociadas con el locus del Ligando zalfall pueden ser detectadas utilizando las moléculas de ácido nucleico de la presente invención mediante el empleo de métodos estándares para el análisis de mutación directa, tales como el análisis de polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción, el análisis de repetición en tándem corto que emplea las técnicas de PCR, el análisis del sistema de mutación refractario de amplificación, la detección del polimorfismo de conformación de una sola hebra, los métodos de escisión con ARN-asa, la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, el análisis de mal acoplamiento ayudado por fluorescencia, y otras técnicas de análisis genético conocidas en la materia (ver, por ejemplo, Mathew (ed. ) , Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108: 255 (1995), Coleman y Tsongalis, Molecular Diagnostics (Humana Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren et al. (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998) , y Richards y Ward, "Molecular Diagnostic Testing" en Principies of Molecular Medicine, páginas 83-88 (Humana Press, Inc. 1998) . El análisis directo de un gen del Ligando zalfall para una mutación puede ser realizado utilizando un ADN genómico del sujeto. Los métodos para la amplificación del ADN genómico, obtenido por ejemplo a partir de linfocitos de sangre periférica, son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, en las páginas 7.1.6 a 7.1.7 (John Wiley _ Sons 1998) ) . Las posiciones de los intrones en el gen del Ligando zalfall fueron determinadas mediante identificación de los clones genómicos, seguida por el secuenciamiento de las uniones intrón/exón. El primer intrón se encuentra entre el residuo de aminoácidos 56 (Leu) y el residuo 57 (Val) en la SEQ ID NO. 2, y es de 115 pares de bases de longitud. El segundo intrón es el más grande por 4.4 kilobases, y se encuentra entre el residuo de aminoácidos 68 (Glu) y el residuo 69 (Thr) en la SEQ ID NO. 2. El tercer intrón es de 2.6 kilobases, y se encuentra entre el residuo de aminoácidos 120 (Leu) y el residuo 121 (Thr) en la SEQ ID NO. 2. El intrón final, de 89 pares de bases, se encuentra entre el residuo de aminoácidos 146 (Lys) y el residuo 147 (Met) en la SEQ ID NO. 2. El gen completo abarca aproximadamente 8 kb.

La estructura del gen del Ligando zalfall es similar a aquella del gen de IL-2 (Fuj ita et al. Proc . Natl. Acad. Sci. 80: 7437-7441, 1983), aunque el gen del Ligando zalfall contiene un intrón adicional (intrón 4) . El patrón de un primer intrón corto y un segundo y tercer intrones largos, es conservado entre los dos genes, aunque el gen de IL-2 es ligeramente más pequeño (aproximadamente 6 kb) . El gen de IL-15, por otra parte, consiste de 8 exones y abarca al menos 34 kb (Anderson et al. Genomics 25: 701-706, 1995) . De este modo, el gen del Ligando zalfall es más similar en estructura al gen de IL-2 que al gen de IL-15. Dentro de las modalidades de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican para el Ligando zalfall, aisladas, de la invención, pueden hibridarse bajo condiciones estrictas a las moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO. 1, a las moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia nucleotídica de los nucleótidos 47 a 532 de la SEQ ID NO. 1, o a las moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO. 1. En general, las condiciones estrictas son seleccionadas para ser de aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica definida y un pH definido. El Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica definida y Ph definido) a la cual 50% de la secuencia objetivo se híbrida a una sonda perfectamente acoplada. Un par de moléculas de ácido nucleico, tales como ADN-ADN, ARN-ARN y ADN-ARN, pueden hibridarse si las secuencias nucleotídicas tienen algún grado de complementariedad. Los híbridos pueden tolerar los pares de bases mal apareados o acoplados en la doble hélice, pero la estabilidad del híbrido es influenciada por el grado de mal acoplamiento. El Tm del híbrido mal acoplado disminuye por 1°C por cada 1-1.5% de mal apareamiento de par de bases. La variación de la exigencia de las condiciones de hibridación permite el control sobre el grado de mal acoplamiento que estará presente en el híbrido. El grado de exigencia se incrementa conforme se incrementa la temperatura de hibridación y la fuerza iónica del amortiguador de hibridación disminuye. Está muy por dentro de las habilidades de una persona de experiencia en la técnica el adaptar estas condiciones para el uso con un híbrido polinucleotídico particular. El Tm para una secuencia objetivo específica es la temperatura (bajo condiciones definidas) a la cual 50% de la secuencia objetivo se hibridará a una secuencia sonda perfectamente acoplada. Aquellas condiciones que influyen el Tm incluyen, el tamaño y el contenido de pares de bases de la sonda polinucleotídica, la fuerza iónica de la solución de hibridación, y la presencia de los agentes desestabilizadores en la solución de hibridación. Numerosas ecuaciones para calcular Tm son conocidas en la técnica, y son específicas para ADN, ARN y los híbridos de ADN-ARN y las secuencias sonda polinucleotídicas de longitud variante (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Segunda Edición (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1987); Berger y Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Cri t . Rev. Biochem. Mol . Biol . 26: 227 (1990)). La dotación lógica informática del análisis secuencial tal como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4 . 0 (Premier Biosoft International; Palo alto, CA) , así como los sitios sobre Internet, son herramientas disponibles para el análisis de una secuencia dada y el cálculo de Tm con base en los criterios definidos por el usuario. Tales programas pueden también analizar una secuencia dada bajo condiciones definidas e identificar las secuencias sonda adecuadas. Típicamente, la hibridación de las secuencias polinucleotídicas más largas, mayores de 50 pares de bases, se realiza a temperaturas de aproximadamente 20-25°C por debajo del Tm calculado. Para las sondas más pequeñas, de menos de 50 pares de bases, la hibridación es típicamente llevada a cabo al Tm o 5-10°C por debajo del Tm calculado. Esto permite la proporción máxima de hibridación para los híbridos de ADN-ADN y ADN-ARN. Después de la hibridación, las moléculas de ácido nucleico pueden ser lavadas para eliminar las moléculas de ácido nucleico no hibridadas, bajo condiciones estrictas, o bajo condiciones altamente exigentes. Las condiciones de lavado exigentes típicas incluyen el lavado en una solución de 0.5x-2x de SSC con 0.1% de dodeciisulfato de sodio (SDS) a 55-65°C. Es decir, las moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido del Ligando zalfall variante, se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado estrictas, en las cuales la exigencia de lavado es equivalente a 0.5x-2x de SSC con 0.1% de SDS a 55-65°C, incluyendo 0.5x SSC con 0.1% de SDS a 55°C, o 2x SSC con 0.1% de SDS a 65°C. Una persona de experiencia en la técnica puede divisar fácilmente las condiciones equivalentes, por ejemplo, al sustituir SSPE por SSC en la solución de lavado. Las condiciones de lavado altamente estrictas, típicas incluyen el lavado en una solución de 0.1x-0.2x de SSC con 0.1% de dodeciisulfato de sodio (SDS) a 50-65°C. En otras palabras, las moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido del Ligando zalfall variante, se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO. 1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado altamente estrictas, en las cuales la exigencia de lavado es equivalente a 0.1x-0.2x de SSC con 0.1% de SDS a 50-65°C, incluyen O.lx de SSC con 0.1% de SDS a 50°C, o 0.2x de SSC con 0.1% de SDS a 65 °C. La presente invención también proporciona los polipéptidos aislados del Ligando zalfall que tienen una identidad secuencial sustancialmente similar a los polipéptidos de la SEQ ID NO. 2, o sus ortólogos. El término "identidad secuencial sustancialmente similar" es utilizado en la presente para denotar los polipéptidos que comprenden al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o más de 95% de identidad secuencial a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO. 2, o sus ortólogos. La presente invención también incluye los polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más de 95% de identidad secuencial a la secuencia de residuos de aminoácidos 1 a 162 ó 33 a 162 de la SEQ ID NO. 2. La presente invención incluye además las moléculas de ácido nucleico que codifican para tales polipéptidos. Los métodos para determinar la identidad porcentual son descritos más adelante. La presente invención también contempla las moléculas variantes de ácido nucleico del Ligando zalfall que pueden ser identificadas utilizando dos criterios: una determinación de la similitud entre el polipéptido codificado con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2, y/o un ensayo de hibridación, como se describe anteriormente. Tales variantes del Ligando zalfall incluyen las moléculas de ácido nucleico: (1) que se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO. 1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado estrictas, en las cuales la exigencia de lavado es equivalente a 0.5x-2x de SSC con 0.1% de SDS a 55-65°C; o (2) que codifican para un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 80%, a menos 90%, al menos 95% o más de 95% de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2. Alternativamente, las variantes del Ligando zalfall pueden ser caracterizadas como moléculas de ácido nucleico: (1) que se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado altamente estrictas, en las cuales la exigencia de lavado es equivalente a 0.1x-0.2x de SSC con 0.1% de SDS a 50-65°C; y (2) que codifican para un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más de 95% de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2. El por ciento de identidad secuencial es determinado por métodos convencionales. Ver, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603 (1986), y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992) . En resumen, dos secuencias de aminoácidos están alineadas para optimizar las calificaciones de alineamiento utilizando una penalidad por apertura de espacio vacío de 10, una penalidad por extensión de espacio vacío de 1, y la matriz de calificación "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff {ibid. ) como se muestra en la Tabla 4 (los aminoácidos son indicados por los códigos estándares de una sola letra) .

Número total de acoplamientos idénticos x 100 [longitud de la secuencia más larga más el número de espacios libres introducidos en la secuencia más larga con el fin de alinear las dos secuencias] Tabla 4 A R N D C Q E G H K M W V A 4 R -1 5 N -2 O 6 D -2 -2 1 6 C O -3 -3 -3 9 Q -1 1 0 0 -3 5 E -1 0 0 2 4 2 5 G 0 -2 0 -1 3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 1 -3 0 O -2 8 I -1 -3 -3 -3 1 -3 -3 -4 -3 4 L -1 -2 -3 -4 1 -2 -3 -4 -3 2 4 K -1 2 0 -1 3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -1 -2 -3 1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 F -2 -3 -3 -3 2 -3 -3 -3 -1 0 O -3 0 6 P -1 -2 -2 -1 3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 0 1 0 O O -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 T 0 -1 0 -1 1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 w -3 -3 -4 -4 2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 V 0 -3 -3 -3 1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 O -3 -1 4 Aquellos expertos en la técnica aprecian que existen muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos . El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineamiento de proteínas, adecuado, para el examen del nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos descrita en la presente y la secuencia de aminoácidos de un Ligando zalfall, variante, putativo. El algoritmo FATSA es descrito por Pearson y Lipman, Proc . Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) , y por Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) . En resumen, FASTA caracteriza primeramente la similitud secuencial mediante la identificación de las regiones compartidas por la secuencia de búsqueda (por ejemplo, la SEQ ID NO. 2) y una secuencia de prueba que tiene ya sea la más alta densidad de identidades (si la variable ktup es 1) o los pares de identidades (si ktup=2) , sin considerar las sustituciones de aminoácidos conservadoras, inserciones, o supresiones. Las diez regiones con la más alta densidad de identidades son luego calificadas mediante comparación de la similitud de todos los aminoácidos apareados utilizando una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones son "recortados" para incluir únicamente aquellos residuos que contribuyen a la más alta calificación. Si existen varias regiones con calificaciones mayores que el valor de "corte" (calculado por una fórmula predeterminada con base en la longitud de la secuencia y el valor ktup) , entonces las regiones iniciales recortadas son examinadas para determinar si las regiones pueden ser unidas para formar un alineamiento aproximado con los espacios libres. Finalmente, las regiones de más alta calificación de las dos secuencias de aminoácidos son alineadas utilizando una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444 (1970) ; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787 (1974)), que permite inserciones y supresiones de aminoácidos. Los parámetros preferidos para el análisis FASTA son: ktup=l, penalidad por abertura de espacio libre=10, penalidad por extensión de espacio vacío=l, y matriz de sustitución=BLOSUM62. Estos parámetros pueden ser introducidos dentro de un programa FASTA mediante la modificación del archivo de la matriz de calificación ("SMATRIX"), como se explica en el Apéndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) . FASTA puede también ser utilizado para determinar la identidad secuencial de las moléculas de ácido nucleico, utilizando una proporción como se describe anteriormente. Para las comparaciones de la secuencia de nucleótidos, el valor ktup puede estar en el intervalo de entre uno a seis, 51 preferentemente de tres a seis, más preferentemente de tres, con otros parámetros ajustados por omisión. Los polipéptidos variantes del Ligando zalfall o los polipéptidos con identidad secuencial sustancialmente similar, son caracterizados como poseedores de una o más sustituciones, supresiones o adhesiones de aminoácidos. Estos cambios son preferentemente de una naturaleza menor, que son las sustituciones conservadoras de aminoácidos (ver Tabla 5) y otras sustituciones que no afectan de manera significativa el plegamiento o la actividad del polipéptido; pequeñas supresiones, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino- o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina amino-terminal, un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o un marcador de afinidad. La presente invención incluye de este modo los polipéptidos de aproximadamente 108 a 216 residuos de aminoácidos que comprenden una secuencia que es al menos 70%, preferentemente al menos 90%, y más preferentemente 95% o más idéntica a la región correspondiente de la SEQ ID NO. 2. Los polipéptidos que comprenden los marcadores de afinidad pueden comprender además un sitio de escisión proteolítica entre el polipéptido del Ligando zalfall y el marcador de afinidad. Tales sitios preferidos incluyen los sitios de escisión de trombina y los sitios de escisión del factor Xa.

Tabla 5 Sustituciones conservadoras de aminoácidos Básicos : argmma lisina histidina Ácidos ácido glutámico ácido aspártico Polares : glutamina asparagina Hidrofóbicos leucina isoleucina valina Aromáticos fenilalanina triptofano tirosina Pequeños glicina alanina serina treonina metionina La determinación de los residuos de aminoácidos que comprenden regiones o dominios que son críticos para mantener la integridad estructural, puede también ser llevada a cabo. Dentro de estas regiones se pueden determinar los residuos específicos que serán más o menos tolerantes del cambio y mantendrán la estructura terciaria completa de la molécula. Los métodos para analizar la estructura de la secuencia incluyen, pero no están limitados a alineamiento de las secuencias múltiples con alta identidad de aminoácidos o de nucleótidos, propensiones de estructura secundaria, patrones binarios, empaquetamiento complementario e interacciones polares enterradas (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5: 372-376, 1995 y Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6: 3-10, 1996) . En general, cuando se diseñan modificaciones para las moléculas o se identifican fragmentos específicos, la determinación de la estructura será acompañada por la evaluación de la actividad de las moléculas modificadas. Los cambios en la secuencia de aminoácidos son realizados en los polipéptidos del Ligando zalfall para minimizar la perturbación de la estructura de más alto orden, esencial para la actividad biológica. Por ejemplo, donde el polipéptido del Ligando zalfall comprende una o más hélices, los cambios en los residuos de aminoácidos serán realizados para no perturbar la geometría de la hélice, y otros componentes de la molécula donde los cambios en la conformación abaten alguna función crítica, por ejemplo, el enlace de la molécula a sus socios de enlace, por ejemplo, las hélices A y D, los residuos 44, 47 y 135 de la SEQ ID NO. 2. Los efectos de los cambios en la secuencia de aminoácidos pueden ser predichos, por ejemplo mediante modelación por computadora como se describe anteriormente, o determinados por el análisis de la estructura cristalina (ver, por ejemplo, Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2: 266-268, 1995) . Otras técnicas que son bien conocidas en la materia comparan el plegamiento de una proteína variante a una molécula estándar (por ejemplo, la proteína nativa) . Por ejemplo, se puede realizar la comparación del patrón de cisteína en una variante y las moléculas estándares. La espectrometría de masa y la modificación química utilizando reducción y alquilación, proporcionan métodos para determinar los residuos de cisteína que están asociados con los enlaces disulfuro o están libres de tales asociaciones (Bean et al., Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2: 1732-1748, 1993; y Patterson et al., Anal. Chem. 66: 3727-3732, 1994) . Se cree en general que si una molécula modificada no tiene el mismo patrón de cisteína que la molécula estándar, el plegamiento podría ser afectado. Otro método bien conocido y aceptado para la medición del plegamiento es el dicrosismo circular (CD) . La medición y comparación de los espectros de CD generados por una molécula modificada y la molécula estándar, es rutinaria (Johnson, Proteins 7 : 205-214, 1990) . La cristalografía es otro método bien conocido para analizar el plegamiento y la estructura. La resonancia magnética nuclear (RMN) , el trazado del mapa del péptido digestivo y el trazado del mapa del epítope son también métodos conocidos para analizar el plegamiento y las similitudes estructurales entre las proteínas y los polipéptidos (Schaanan et al., Science 257: 961-964, 1992) . El perfil de hidrofilicidad de Hopp/Woods de la secuencia proteica del Ligando zalfall como se muestra en la SEQ ID NO. 2, puede ser generado (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 38-24-3828, 1981; Hopp, J . Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 y Triquier et al., Protein Engineering 11: 153-169, 1998) . El perfil está basado en una ventana deslizante de seis residuos. Los residuos G, S y T enterrados y los residuos H, Y y W expuestos fueron ignorados. Por ejemplo, en el Ligando zalfall, las regiones hidrofílicas incluyen los residuos de aminoácidos 114-119 de la SEQ ID NO. 2, los residuos de aminoácidos 101-105 de la SEQ ID NO. 2, y los residuos de aminoácidos 126-131 de la SEQ ID NO. 2, los residuos de aminoácidos 113-118 de la SEQ ID NO. 2, y los residuos de aminoácidos 158-162 de la SEQ ID NO. 2. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la hidrofilicidad o la hidrofobicidad serán tomadas en cuenta cuando se diseñen modificaciones en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del Ligando zalfall, para no perturbar el perfil estructural biológico completo. De interés particular para el reemplazo son los residuos hidrofóbicos seleccionados del grupo que consiste de Val, Leu e He o el grupo que consiste de Met, Gly, Ser, Ala, Tyr y Trp. Por ejemplo, los residuos tolerantes de sustitución podrían incluir los residuos 100 y 103 como se muestran en la SEQ ID NO. 2. Los residuos de cisteína en las posiciones 71, 78, 122 y 125 de la SEQ ID NO. 2, serán relativamente intolerantes de sustitución. Las identidades de los aminoácidos esenciales pueden también ser impedidas a partir del análisis de la similitud secuencial entre IL-15, IL-2, IL-4 y GM-CSF con el Ligando zalfall. Utilizando métodos tales como el análisis "FASTA" descrito previamente, las regiones de alta similitud son identificadas dentro de una familia de proteínas y utilizadas para analizar la secuencia de aminoácidos para las regiones conservadas . Un procedimiento alternativo para identificar una variante del polinucleótido del Ligando zalfall con base en la estructura, es determinar si una molécula de ácido nucleico que codifica para un gen del Ligando zalfall, variante, potencial, puede hibridarse a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 1, como se discute anteriormente. Otros métodos para identificar los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención son procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081 (1989), Bass et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88: 4498 (1991) , Coombs y Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering" , en Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). En la última técnica, las mutaciones de alanina simple son introducidas en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadas para la actividad biológica o bioquímica como se describe más adelante para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al., J. Biol . Chem . 271: 4699 (1996). La presente invención también incluye los fragmentos funcionales de los polipéptidos del Ligando zalfall y las moléculas de ácido nucleico que codifican para tales fragmentos funcionales. El Ligando zalfall "funcional" o un fragmento del mismo como se define en la presente, está caracterizado por su actividad proliferativa o de diferenciación, por su habilidad para inducir o inhibir funciones celulares especializadas, o por su habilidad para enlazarse específicamente a un anticuerpo anti-Ligando zalfall o - un receptor de zalfall (ya sea soluble o inmovilizado) . Como se describió previamente en la presente, el Ligando zalfall está caracterizado por una estructura de un grupo de cuatro hélices que comprende la hélice A (residuos de aminoácidos 41-56) , hélice B (residuos de aminoácidos 69-84) , hélice C (residuos de aminoácidos 92-105) y hélice D (residuos de aminoácidos 135-148), como se muestra en la SEQ ID NO. 2. De este modo, la presente invención proporciona además las proteínas de fusión que abarcan: (a) las moléculas polipeptídicas que comprenden una o más de las hélices descritas anteriormente; y (b) los fragmentos funcionales que comprenden una o más de estas hélices . La otra porción polipeptídica de la proteína de fusión puede ser contribuida por otra citocina de un cúmulo de cuatro hélices, tales como IL-15, IL-2, IL-4 y GM-CSF, o por un péptido de señal secretora no nativo y/o uno no relacionado, que facilita la secreción de la proteína de fusión.

De este modo, la presente invención proporciona las proteínas de fusión que comprenden al menos cuatro polipéptidos, en donde el orden de los polipéptidos desde el extremo N hasta el extremo C son: un primer polipéptido que comprende los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: (a) los residuos de aminoácidos 36-46 de la hélice A de IL-2, de la SEQ ID NO. 111; (b) los residuos de aminoácidos 29-43 de la hélice A de IL-15, de la SEQ ID NO. 112; (c) los residuos de aminoácidos 45-68 de la hélice A de IL-4, de la SEQ ID NO. 113; (d) los residuos de aminoácidos 30-44 de la hélice A de GM-CSF de la SEQ ID NO. 114; y (e) los residuos de aminoácidos 41 a 56 de la SEQ ID NO. 2; un primer espaciador de 6-27 aminoácidos; y un segundo polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: (a) los residuos de aminoácidos 53-75 de la hélice B de IL-2, de la SEQ ID NO. 1111; (b) los residuos de aminoácidos 65-83 de la hélice B de IL-4 de la SEQ ID NO. 112; (c) los residuos de aminoácidos 84-101 de la hélice B de IL-15 de la SEQ ID NO. 113; (d) los residuos de aminoácidos 72-81 de la hélice B de GM-CSF, de la SEQ ID NO. 114; y (e) los residuos de aminoácidos 69-84 de la SEQ ID NO. 2; un segundo espaciador de 5-11 residuos de aminoácidos; un tercer polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) los residuos 87-99 de la hélice C de IL-2 de la SEQ ID NO. 111; (b) los residuos 95-118 de la hélice C de IL-4 de la SEQ ID NO. 112; (c) los residuos 107-119 de la hélice C de IL-15, de la SEQ ID NO. 113; (d) los residuos 91-102 de la hélice C de GM-CSF, de la SEQ ID NO. 114; y (e) los residuos de aminoácidos 92-105 de la SEQ ID NO. 2; un tercer espaciador de 3-29 residuos de aminoácidos; y un cuarto polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: (a) los residuos de aminoácidos 103-121 de la hélice D de IL-2, de la SEQ ID NO. 111; (b) los residuos de aminoácidos 134-157 de la hélice D de IL-15, de la SEQ ID NO. 112; (c) los residuos de aminoácidos 134-160 de la hélice D de IL-4, de la SEQ ID NO. 113; (d) los residuos de aminoácidos 120-131 de la hélice D de GM-CSF, de la SEQ ID NO. 114; y (e) los residuos de aminoácidos 135-148 de la SEQ ID NO. 2, en donde al menos uno de los cuatro polipéptidos es proveniente del Ligando zalfall. En otras modalidades en que los péptidos espaciadores serán seleccionados de los rizos A/B, B/C y C/D del Ligando zalfall, IL-2, IL-4, IL-15 o GM-CSF, son como se muestran en la Tabla 1. Los análisis de supresión rutinarios de las moléculas de ácido nucleico pueden ser realizados para obtener fragmentos funcionales de una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido del Ligando zalfall. Como una ilustración, las moléculas de ADN que tienen la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO. 1 o fragmentos de la misma, pueden ser digeridos con la nucleasa BaI31 para obtener una serie de supresiones anidadas . Estos fragmentos de ADN son luego insertados dentro de los vectores' de expresión en la estructura de lectura apropiada, y los polipéptidos expresados son aislados y probados para la actividad del Ligando zalfall, o para la habilidad de enlazarse a los anticuerpos anti- Ligando zalfall, o el receptor de zalfall. Una alternativa *a la digestión con exonucleasa es utilizar la mutagénesis dirigida al oligonucleótido para introducir supresiones o codones de detención para especificar la producción de un fragmento deseado del Ligando zalfall. Alternativamente, los fragmentos particulares de un gen del Ligando zalfall pueden ser sintetizados utilizando la reacción en cadena de polimerasa. Los métodos estándares para identificar los dominios funcionales son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, los estudios sobre el truncamiento en uno o en ambos extremos de los interferones han sido resumidos por Horisberger y Di Marco, Pharmac . Ther. 66 : 507 (1995) . Además, las técnicas estándares para el análisis funcional de las proteínas se describen por ejemplo por, Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993); Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon" , en Biolpgical Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor" , en Control of Animal Cell Proliferation 1, Boynton et al., (eds.), páginas 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270: 29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270: 25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995); y Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996). Las sustituciones de aminoácidos múltiples pueden ser realizadas y probadas utilizando métodos conocidos de mutagénesis y selección, tales como aquellas descritas por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241: 53 (1988) o Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86: 2152 (1989)). En resumen, estos autores describen los métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando el polipéptido funcional, y luego secuenciando los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden ser utilizados incluyen la representación visual del fago (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30: 10832 (1991), Ladner et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,223,409, Huse, Publicación Internacional No. WO 92/06204) , y la mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., Gene 46: 145 (1986), y Ner et al., DNA 7: 127, (1988)). Las variantes de las secuencias nucleotídicas y polipeptídicas del Ligando zalfall, descritas, pueden ser generadas a través de entremezclado o revoltura de ADN como se describe por Stemmer, Nature 370: 389 (1994) , Stemmer, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91: 10747 (1994) , y Publicación Internacional No. WO 97/20078. En resumen, las moléculas de ADN variantes son generadas por recombinación homologa in vi tro mediante fragmentación aleatoria de un ADN progenitor, seguido por el reensamblaje utilizando PCR, dando como resultado las mutaciones puntuales aleatoriamente introducidas. Esta técnica puede ser modificada mediante el uso de una familia de moléculas de ADN progenitor, tales como las variantes alélicas o las moléculas de ADN provenientes de diferentes especies, para introducir variabilidad adicional en el proceso. La selección para la actividad deseada, seguida por las iteraciones adicionales de mutagénesis y el ensayo, proporciona la "evolución" rápida de las secuencias, mediante selección de las mutaciones deseables mientras que se seleccionan simultáneamente contra los cambios dañinos . Los métodos de mutagénesis como se describen en la presente pueden ser combinados con los métodos de selección automatizados, de alto rendimiento, para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados, clonados en las células huésped. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican para los polipéptidos biológicamente activos, o los polipéptidos que se enlazan con los anticuerpos anti-Ligando zalfall o el receptor zalfall soluble, pueden ser recuperados a partir de la célula huésped y rápidamente secuenciados utilizando el equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y pueden ser aplicados a los polipéptidos de estructura desconocida. Además, las proteínas de la presente invención (o los fragmentos polipeptídicos de las mismas) pueden ser unidos a otras moléculas bioactivas, particularmente otras citocinas, para proporcionar moléculas multifuncionales. Por ejemplo, una o más hélices del Ligando zalfall pueden ser unidas a otras citocinas para aumentar sus propiedades biológicas o eficiencia de producción. La presente invención proporciona de este modo una serie de novedosas moléculas híbridas en las cuales un segmento que comprende una o más de las hélices del Ligando zalfall se fusiona a otro polipéptido. La fusión es preferentemente realizada mediante el empalme al nivel del ADN para permitir la expresión de las moléculas quiméricas en sistemas de producción recombinantes . Las moléculas resultantes son luego evaluadas para propiedades tales como la solubilidad mejorada, estabilidad mejorada, vida media de despejo prolongada, niveles mejorados de expresión y de secreción, y la farmacodinámica. Tales moléculas híbridas pueden además comprender residuos adicionales de aminoácidos (por ejemplo, un ligador polipeptídico) entre las proteínas o polipéptidos componentes. Los aminoácidos de origen no natural incluyen, sin limitación, la trans-3-metilprolina, 2 , 4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3 , 3-dimetilprolina, ter-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3 -azafenilalanina, 4-azafenilalanina, y 4-fluorofenilalanina. Son conocidos varios métodos en la técnica para incorporar los residuos de aminoácidos de origen no natural dentro de las proteínas. Por ejemplo, un sistema in vi tro puede ser empleado, en donde las mutaciones no en sentido son suprimidas utilizando los ARNts supresores, químicamente aminoacilados. Los métodos para la síntesis de aminoácidos y la aminoacilación del ARNt son conocidos en la técnica. La transcripción y la traducción de los plásmidos que contienen mutaciones no en sentido se llevan a cabo típicamente en un sistema libre de células que comprende un extracto de E. coli S30 y las enzimas comercialmente disponibles y otros reactivos. Las proteínas son purificadas mediante cromatografía. Ver, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722 (1991), Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301 (1991), Chung et al., Science 259: 806 (1993), y Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90: 10145 (1993) . En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en oocitos de Xenopus mediante microinyección del ARNm mutado y los ARNts supresores, químicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991 (1996)).

Dentro de un tercer método, las células de E. coli son cultivadas en ausencia de un aminoácido natural que va a ser reemplazado (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia del o de los aminoácidos de origen no natural, deseados (por ejemplo, 2 -azafenilalanina, 3 -azafenilalanina, 4-azafenilalanina, o 4-fluorofenilalaina) . El aminoácido de origen no natural es incorporado dentro de la proteína en lugar de su contraparte natural. Ver, Koide et al., Biochem. 33: 7470 (1994) . Los residuos de aminoácidos de origen natural pueden ser convertidos a especies de origen no natural mediante modificación química in vi tro . La modificación química puede ser combinada con la mutagénesis dirigida al sitio para expandir adicionalmente la gama de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2: 395 (1993) . Puede ser ventajoso estabilizar el Ligando zalfall para extender la vida media de la molécula, particularmente para extender la persistencia metabólica en un estado activo. Para lograr la vida media extendida, las moléculas del Ligando zalfall pueden ser químicamente modificadas utilizando los métodos descritos en la presente. La PEGilación es un método comúnmente empleado que se ha demostrado incrementa la vida meda en plasma, la solubilidad incrementada, y la antigenicidad e inmunogenicidad disminuidas (Nucci et al., Advanced Drug Delivery Reviews 6 : 133-155, 1991 y Lu et al., Int. J. Peptide Protein Res. 43: 127-138, 1994) . Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético, los aminoácidos de origen no natural, y los aminoácidos no naturales pueden ser sustituidos por los residuos de aminoácidos del Ligando zalfall. La presente invención también proporciona los fragmentos polipeptídicos o los péptidos que comprenden una porción que posee epítope de un polipéptido del Ligando zalfall descrito en la presente. Tales fragmentos o péptidos pueden comprender un "epítope inmunogénico" , el cual es una parte de una proteína que promueve una respuesta de anticuerpo cuando la proteína completa es utilizada como un inmunógeno. Los péptidos que poseen epítope inmunogénico pueden ser identificados utilizando métodos estándares (ver, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 81: 3998 (1983)). En contraste, los fragmentos polipeptídicos o los péptidos pueden comprender un "epítope antigénico" , el cual es una región de una molécula proteica a la cual puede enlazarse específicamente un anticuerpo. Ciertos epítopes consisten de un tramo lineal o contiguo de aminoácidos, y la antigenicidad de tal epítope no es perturbada por los agentes desnaturalizadores . Es conocido en la técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que pueden imitar a los epítopes de una proteína, pueden ser utilizados para estimular la producción de anticuerpos contra la proteína (ver, por ejemplo, Sutcliffe et al., Science 219: 660 (1983)). En consecuencia, los péptidos y los polipéptidos que poseen epítope antigénico de la presente invención son útiles para producir anticuerpos que se enlazan con los polipéptidos descritos en la presente. Los perfiles de hidrofilicidad de Hopp/woods pueden ser utilizados para determinar las regiones que tienen el más alto potencial antigénico (Hopp et al., 1981, ibid. y Hopp, 1986, ibid. ) . En el Ligando zalfall estas regiones incluyen: los residuos de aminoácidos 114-119, 101-105, 126-131, 113-118, y 158-162 de la SEQ ID NO. 2. Los polipéptidos y péptidos que poseen epítope antigénico contienen preferentemente al menos cuatro a diez aminoácidos, al menos diez a catorce aminoácidos, o aproximadamente catorce a aproximadamente treinta aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 56. Tales polipéptidos y péptidos que poseen epítope pueden ser producidos mediante la fragmentación de un polipéptido del Ligando zalfall, o mediante síntesis química de péptidos, como se describe en la presente. Además, los epítopes pueden ser seleccionados mediante representación visual del fago de las genotecas de péptidos aleatorios (ver, por ejemplo, Lañe y Stephen, Curr. Opin. Immunol . 5: 268 (1993); y Córtese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616 (1996) ) . Los métodos estándares para identificar los epítopes y producir anticuerpos a partir de péptidos pequeños que comprenden un epítope, son descritos por ejemplo por Mole, "Epitope Mapping", en Methods in Molecular Biology, vol. 10, Manson (ed.), páginas 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies" en Monoclonal antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter y Ladyman (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), y Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, páginas 9.3.1-9.3.5 y páginas 9.4.1.-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997) . No obstante de la secuencia nucleotídica particular de un polinucleótido variante del Ligando zalfall, el polinucleótido codifica para un polipéptido que está caracterizado por su actividad proliferativa o de diferenciación, su habilidad para inducir o inhibir funciones celulares especializadas, o por la habilidad para enlazarse específicamente a un anticuerpo anti-Ligando zalfall o el receptor zalfall. Más específicamente, los polinucleótidos del Ligando zalfall variante codificarán para los polipéptidos que muestran al menos 50% y preferentemente más de 70%, 80% ó 90% de la actividad del polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO. 2. Para cualquier polipéptido del Ligando zalfall, incluyendo las variantes y las proteínas de fusión, una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede generar fácilmente una secuencia polinucleotídica completamente degenerada, que codifica para esa variante, utilizando la información descrita en las Tablas 1 y 2 anteriores . La presente invención proporciona además una variedad de otras fusiones polipeptídicas (y las proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones polipeptídicas) . Por ejemplo, el polipéptido del Ligando zalfall puede ser preparado como una fusión a una proteína de dimerización como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,155,027 y 5,567,584. Las proteínas de dimerización preferidas a este respecto incluyen los dominios de la región constante de inmunoglobulina. Las fusiones de inmunoglobulina-polipéptido del Ligando zalfall pueden ser expresadas en células manipuladas mediante ingeniería genética (para producir una variedad de análogos del Ligando zalfall, multiméricos) . Los dominios auxiliares pueden ser fusionados a los polipéptidos del Ligando zalfall para dirigirlos a las células, tejidos, o macromoléculas específicas. Por ejemplo, un polipéptido o proteína del Ligando zalfall podría ser dirigido a un tipo celular predeterminado, mediante la fusión de un polipéptido del Ligando zalfall a un ligando, que se enlaza específicamente a un receptor sobre la superficie de esa célula objetivo. De esta manera, los polipéptidos y las proteínas pueden ser dirigidos para fines terapéuticos o de diagnóstico. El polipéptido del Ligando zalfall puede ser fusionado a dos o más porciones, tales como un marcador de afinidad para la purificación y un dominio de dirección al objetivo. Las fusiones polipeptídicas pueden también comprender uno o más sitios de escisión, particularmente entre los dominios. Ver, Tuan et al., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996.

Utilizando los métodos discutidos en la presente, una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede identificar y/o preparar una variedad de polipéptidos que tienen identidad secuencial sustancialmente similar a los residuos 1-162 ó 33-162 de la SEQ ID NO. 2, o los fragmentos funcionales y fusiones de los mismos, en donde tales polipéptidos o fragmentos o fusiones conservan las propiedades de la proteína tipo silvestre, tales como la habilidad para estimular la proliferación, la diferenciación, inducir la función celular especializada o enlazarse al receptor de zalfall o a los anticuerpos contra el Ligando zalfall. Los polipéptidos del Ligando zalfall de la presente invención, incluyendo los polipéptidos de longitud completa, los fragmentos funcionales, y los polipéptidos de fusión, pueden ser producidos en células huésped manipuladas mediante ingeniería genética, de acuerdo a las técnicas convencionales . Las células huésped adecuadas son aquellos tipos celulares que pueden ser transformados o transfectados con el ADN exógeno, y desarrolladas en cultivo, e incluyen bacterias, células de hongo, y células eucarióticas superiores, cultivadas. Las células eucarióticas, particularmente las células cultivadas de organismos multicelulares, son las preferidas. Las técnicas para la manipulación de las moléculas de ADN clonadas y la introducción del ADN exógeno, dentro de una variedad de células huésped, son descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987. En general, una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido del Ligando zalfall está operablemente enlazada a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, en general incluyendo un promotor de la transcripción y un terminador, dentro de un vector de expresión. El vector contendrá también comúnmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque aquellos expertos en la técnica reconocerán que dentro de ciertos sistemas los marcadores seleccionables pueden ser proporcionados sobre vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede ser proporcionada mediante la integración dentro del genoma de la célula huésped. La selección de los promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es un asunto de diseño rutinario dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. Muchos de tales elementos son descritos en la literatura y son disponibles a través de proveedores comerciales .

Para dirigir un polipéptido del Ligando zalfall a la vía secretora de una célula huésped, una secuencia de señal secretora (también conocida como una secuencia guía, la secuencia prepro o la secuencia pre) es proporcionada en el vector de expresión. La secuencia de señal secretora puede ser aquella del Ligando zalfall, o puede ser derivada de otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o sintetizada de novo . La secuencia de señal secretora está operablemente enlazada a la secuencia de ADN del Ligando zalfall, por ejemplo, las dos secuencias están unidas en la estructura de lectura correcta y colocadas para dirigir el polipéptido recién sintetizado hacia la vía secretora de la célula huésped. Las secuencias de señal secretora son comúnmente colocadas 5' a la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias de señal secretora pueden ser colocadas en otro sitio en la secuencia de ADN de interés (ver, por ejemplo, Welch et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,037,743; Holland et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,143,830). Alternativamente, la secuencia de señal secretora contenida en los polipéptidos de la presente invención es utilizada para dirigir otros polipéptidos hacia la vía secretora. La presente invención proporciona tales polipéptidos de fusión. Un polipéptido de fusión de señal puede ser elaborado en donde una secuencia de señal secretora derivada del residuo de aminoácido 1-31 de la SEQ ID NO. 2 va a ser operablemente enlazado a una secuencia de ADN que codifica para otro polipéptido, utilizando los métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. La secuencia de señal secretora contenida en los polipéptidos de fusión de la presente invención es preferentemente fusionada amino-terminalmente a un péptido de señal para dirigir el péptido adicional hacia la vía secretora. Tales construcciones tienen numerosas aplicaciones conocidas en la técnica. Por ejemplo, estas novedosas construcciones de fusión de la secuencia de señal secretora pueden dirigir la secreción de un componente activo de una proteína normalmente no secretada. Tales fusiones pueden ser utilizadas in vivo o in vi tro para dirigir los péptidos a través de la vía secretora. Las células de mamífero cultivadas son huéspedes adecuados dentro de la presente invención. Los métodos para introducir el ADN exógeno dentro de las células huésped de mamífero incluyen la transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1982; Graham y Van der Eb, Virology 52 : 456, 1973), electroporación (Neuman et al., EMBO J. 1 : 841-5, 1982), transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid.), y transfección mediada por liposoma (Hawley-Nelson et al., focus 15: 73, 1993; Cíccarone et al., Focus 15 : 80, 1993) , y vectores virales (Miller y Rosman, BioTechniques 7: 980-9s, 1989; Wang y Finer, Nature Med. 2: 714-6, 1996) . La producción de polipéptidos recombinantes en células de mamífero cultivadas se describen, por ejemplo, por Levinson et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,713,339; Hagen et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,784,950; Palmiter et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,579,821; y Ringold, Patente de los Estados Unidos No. 4,656,134. Las células de mamífero cultivadas adecuadas incluyen las células COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J . Gen . Virol. 36: 59-72, 1977) y las líneas celulares de ovario de hámster Chino (por ejemplo CHO-Kl; ATCC No. CCL 61) . Las líneas celulares adecuadas, adicionales, son conocidas en la técnica y disponibles de los depositarios públicos tales como la Colección Norteamericana de Cultivo de Especies (American Type Culture Collection) , Manassas, VA. En general, los promotores fuertes de la transcripción son los preferidos, tales como los promotores del SV-40 o del citomegalovirus. Ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,956,288. Otros promotores adecuados incluyen aquellos provenientes de los genes de la metalotioneína (Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,579,821 y 4,601,978) y el promotor tardío mayor del adenovirus . La selección de fármaco es en general utilizada para seleccionar las células de mamífero cultivadas dentro de las cuales ha sido insertado el ADN extraño. Tales células son comúnmente denominadas como "transfectantes" . Las células que han sido cultivadas en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su progenie, son referidas como "transfectantes estables" . Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica para la resistencia al antibiótico neomicina. La selección es llevada a cabo en presencia de un fármaco tipo neomicina, tal como G-418 o similar. Los sistemas de selección pueden también ser utilizados para incrementar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso denominado como "amplificación" . La amplificación es llevada a cabo mediante el cultivo de los transfectantes en presencia de un bajo nivel del agente selectivo y luego incrementando la cantidad del agente selectivo para seleccionar las células que producen los altos niveles de los productos de los genes introducidos . Un marcador seleccionable, amplificable, preferido es la di idrofolato-reductasa, que confiere resistencia al metotrexato. Otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a la higromicina, resistencia a fármacos múltiples, puromicina-acetiltransferasa) pueden también ser utilizados . Los marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, tales como la proteína fluorescente verde, o las proteínas de la superficie celular, tales como CD4, CD8, MHC de la Clase I, fosfatasa alcalina placentaria, pueden ser utilizadas para clasificar las células transfectadas de las células no transfectadas por medios tales como clasificación por FACS o la tecnología de separación por esferas magnéticas. Otras células eucarióticas superiores pueden también ser utilizadas como huéspedes, incluyendo células vegetales, células de insecto y células de ave. El uso de Agrobacterium rhizogenes como un vector para la expresión de los genes en células vegetales ha sido revisado por Sinkar et al., J. Biosci . (Bangalore) 11: 47-58, 1987. La transformación de las células de insecto y la producción de polipéptidos extraños en éstas se describe por Guarino et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,162,222 y publicación WIPO WO 94/06463. Las células de insecto pueden ser infectadas con baculovirus recombinante, comúnmente derivado del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (acNPV) . Ver, King, L.A. y Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Londres, Champman y Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Nueva York,, Oxford University Press, 1994; y Richardson, C.D., Ed. , Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. El Segundo método de elaboración del baculovirus recombinante utiliza un sistema basado en transposón, descrito por Luckow (Luckow, V.A. et al., J. Virol 67: 4566-79, 1993). Este sistema es vendido en el equipo Bac-to-Bac (Life Technologies, Rockville, MD) . Este sistema utiliza un vector de transferencia, pFastBaclMR (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica para el polipéptido del Ligando zalfall hacia un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande llamado un "bácmido" . El vector de transferencia pFastBacl™1 utiliza el promotor de polihedrina de acNPV para impulsar la expresión del gen de interés, en este caso el Ligando zalfall. No obstante, pFastBaclMR puede ser modificado a un grado considerable. El promotor de la polihedrina puede ser removido y sustituido con el promotor de la proteína básica de baculovirus (también conocido como promotor Peor, p6.9 o MP) el cual es expresado tempranamente en la infección por el baculovirus, y ha mostrado que es ventajoso para expresar proteínas secretadas. Ver, Hill-Perkins, M.S. y Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971-6., 1990; Bonning, B.C. et al., J. gen. Virol. 75: 1551-6, 1994; y Chazenbalk, G.D., y Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995. En tales construcciones de vector de transferencia, una versión corta o larga del promotor de proteína básica puede ser utilizada. Además, los vectores de transferencia pueden ser construidos, los cuales reemplazan las secuencias de señal secretoras del Ligando zalfall nativo, con las secuencias de señal secretora derivadas de las proteínas de insecto. Por ejemplo, una secuencia de señal secretora proveniente de la Ecdisteroide-glucosiltransferasa (EGT) , Melitina de abeja mielera (Invitrogen, Carisbad, CA) , o baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, CA) pueden ser utilizados en las construcciones para reemplazar la secuencia de señal secretora del Ligando zalfall nativo. Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión intraestructural con el ADN que codifica para un marcador de epítope en el extremo C o N del polipéptido del Ligando zalfall, expresado, por ejemplo, un marcador del epítope Glu-Glu (Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985) . Utilizando las técnicas conocidas en la materia, un vector de transferencia que contiene el Ligando zalfall es transformado en E. coli , y seleccionado para los bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido, indicador del baculovirus recombinante. El ADN bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante es aislado, utilizando técnicas comunes, y utilizado para transfectar células de Spodoptera frugiperda, por ejemplo células Sf9. El virus recombinante que expresa el Ligando zalfall es subsecuentemente producido . Las reservas virales recombinantes son elaboradas mediante métodos comúnmente utilizados en la técnica. El virus recombinante es utilizado para infectar células huésped, típicamente una línea celular derivada del gusano devastador del otoño, Spodoptera frugiperda . Ver, en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principies and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Otra línea celular adecuada es la línea celular High FiveOMR (Invitrogen) proveniente de Trichoplusia ni (Patente de los Estados Unidos No. 5,300,435) . Las células de hongos, incluyendo las células de levadura, pueden también ser utilizadas dentro de la presente invención. Las especies de levadura de interés particular a este respecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Pichia methanolica . Los métodos para transformar células de S . cerevisiae con el ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de las mismas, son descritos por ejemplo por Kawasaki, Patente de los Estados Unidos No. 4,599,311; Kawasaki et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,931,373; Brake, Patente de los Estados Unidos No. 4,870,008; Welch et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,037,743; y Murray et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,845,075. Las células transformadas son seleccionadas por fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente la resistencia a fármacos o la habilidad para desarrollarse en ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina) . Un sistema vector preferido para el uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema vector P0T1 descrito por Kawasaki et al. (Patente de los Estados Unidos No. 4,931,373), que permite que las células transformadas sean seleccionadas por desarrollo en medios que contienen glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para el uso en levadura incluyen aquellos de los genes de enzimas glucolíticas (ver, por ejemplo, Kawasaki, Patente de los Estados Unidos No. 4,599,311; Kingsman et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,615,974; y Bitter, Patente de los Estados Unidos No. 4,977,092) y genes de deshidrogenasa de alcohol. Ver también Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 y 4,661,454. Los sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida mal tosa son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65, 1986 y Cregg, Patente de los Estados Unidos No. 4,882,279. Las células de Aspergillus pueden ser utilizadas de acuerdo a los métodos de McKnight et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,935,349. Los métodos para la transformación de Acremonium chrysogenum son descritos por Sumino et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,162,228. Los métodos para la transformación de Neurospora son descritos por Lambowitz, Patente de los Estados Unidos No. 4,486,533. El uso de Pichia methanolica como huésped para la producción de proteínas recombinantes es descrito en las publicaciones del WIPO WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para el uso en la transformación de P. methanolica serán comúnmente preparadas como plásmidos circulares, de doble hebra, los cuales son preferentemente linearizados antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, se prefiere que el promotor y terminador en el plásmido sea aquel de un gen de P. methanolica, tal como el gen de la utilización de alcohol de P. methanolica {AUG1 o AUG2) . Otros promotores útiles incluyen aquellos de los genes de la dihidroxiacetona-sintasa (DHAS) formiato-deshidrogenasa (FMD) , y catalasa (CAT) . Para facilitar la integración del ADN dentro del cromosoma del huésped, se prefiere tener el segmento de expresión completo del plásmido flanqueado en ambos extremos por la secuencia de ADN del huésped. Un marcador seleccionable preferido para el uso en Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica, el cual codifica para la fosforribosil-5-aminoimidazol-carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), que permite que las células huésped ade2 se desarrollen en ausencia de adenina. Para el proceso industrial a gran escala, donde es deseable minimizar el uso de metanol, se prefiere utilizar células huésped en las cuales sean suprimidos los genes de la utilización del metanol (AUG1 y AUG2) . Para la producción de proteínas secretadas, las células huésped deficientes en los genes de la proteasa vacuolar { PEP4 y PRB1) son los preferidos. La electroporación es utilizada para facilitar la introducción de un plásmido que contiene el ADN que codifica para un polipéptido de interés dentro de células de P. methanolica . Se prefiere transformar las células de P. methanolica mediante electroporación utilizando un campo eléctrico pulsado de decaimiento exponencial, que tiene una fuerza de campo de 2.5 a 4.5 kV/cm, preferentemente de aproximadamente 3.75 kV/cm, y una constante de tiempo (O) de 1 a 40 milisegundos, más preferentemente aproximadamente 20 milisegundos. Las células huésped procarióticas, incluyendo las cepas de las bacterias Escherichia coli , Bacillus y otros géneros, son también células huésped útiles dentro de la presente invención. Las técnicas para transformar estos huéspedes y expresar secuencias de ADN extrañas, clonadas en éstas, son bien conocidas en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al., ibid. ) . Cuando se expresa un polipéptido del Ligando zalfall en bacterias tales como E. coli , el polipéptido puede ser retenido en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles, o puede ser dirigido hacia el espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células son lisadas, y los granulos son recuperados y desnaturalizados utilizando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado puede ser luego replegado y dimerizado mediante la dilución del desnaturalizante, tal como mediante diálisis contra una solución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido por la diálisis contra una solución salina amortiguada. En el último caso, el polipéptido puede ser recuperado del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional, mediante la desintegración de la célula (por ejemplo, mediante sonicación o choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, con lo cual se evita la necesidad para la desnaturalización y el replegamiento. Las células huésped transformadas o transfectadas son cultivadas de acuerdo a los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el desarrollo de las células huésped elegidas . Una variedad de medios adecuados, incluyendo medios definidos y medios complejos, son conocidos en la técnica y en general incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios pueden también contener componentes tales como factores de crecimiento o suero, como se requiera. El medio de crecimiento en general seleccionará las células que contienen el ADN exógenamente agregado, por ejemplo mediante selección de fármaco o deficiencia en un nutriente esencial, que es complementado por el marcador seleccionable llevado sobre el vector de expresión, o cotransfectado dentro de la célula huésped. Las células de P. methanolica son cultivadas en un medio que comprende fuentes adecuadas de carbono, nitrógeno y nutrientes en trazas a una temperatura de aproximadamente 25°C a 35°C. Los cultivos líquidos son proporcionados con suficiente aireación por medios convencionales, tales como agitación de matraces pequeños o purga de fermentadores. Un medio de cultivo preferido para P. methanolica es YEPD (2% de D-glucosa, 2% de Peptona BactoMR (Difco Laboratories, Detroit, MI) , 1% de extracto de levadura BactoMR (Difco Laboratories), 0.004% de adenina y 0.006% de L-leucina).

Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención a una pureza mayor o igual a 80%, más preferentemente a una pureza mayor o igual a 90%, aún más preferentemente a una pureza mayor o igual a 95%, y particularmente se prefiere un estado farmacéuticamente puro, que es mayor de 99.9% puro con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y los ácidos nucleicos, y libre de agentes infecciosos y pirógenos. Preferentemente, un péptido purificado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal . Los polipéptidos del Ligando zalfall recombinantes, expresados (o polipéptidos del Ligando zalfall quiméricos) pueden ser purificados utilizando métodos y medios de purificación convencionales y/o fraccionamiento. La precipitación con sulfato de amonio y extracción con ácido o caótropo puede ser utilizada para el fraccionamiento de las muestras. Los pasos de purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatita, exclusión de tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices de especialidad, y similares. Son preferidos los derivados de PEÍ, DEAE, QAE y Q. Los medios cromatográficos ejemplares incluyen aquellos medios derivatizados con grupos fenilo, butilo, u octilo, tales como Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia) , Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PPA) , Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen esferas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas de celulosa, esferas de agarosa, esferas de agarosa reticuladas, esferas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas, y similares, que son insolubles bajo las condiciones en las cuales éstas van a ser utilizadas. Estos soportes pueden ser modificados con grupos reactivos para permitir el acoplamiento de las proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o porciones carbohidrato. Los ejemplos de las químicas de acoplamiento incluyen la activación con bromuro de cianógeno, la activación con N-hidroxisuccinimida, la activación con epóxido, la activación con sulfhidrilo, la activación con hidrazida, y los derivados carboxilo y amino para las químicas de acoplamiento de carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son bien conocidos y ampliamente utilizados en la técnica, y son disponibles de los proveedores comerciales . Los métodos para el enlace de los polipéptidos receptores a los medios de soporte, son bien conocidos en la técnica. La selección de un método particular es un asunto de diseño rutinario y es determinante en parte por las propiedades del soporte elegido. Ver, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principies & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser aislados mediante explotación de sus propiedades físicas o bioquímicas. Por ejemplo, la cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC) puede ser utilizada para purificar las proteínas ricas en histidina, incluyendo aquellas que comprenden marcadores de polihistidina. En resumen, un gel es primeramente cargado con iones metálicos divalentes para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7, 1985) . Las proteínas ricas en histidina serán adsorbidas a esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo del ion metálico utilizado, y serán eluidas mediante elución competitiva, disminuyendo el pH, o utilizando agentes quelantes fuertes. Otros métodos de purificación incluyen la purificación de proteínas glucosiladas mediante cromatografía de afinidad de lectina y cromatografía de intercambio iónico (Methods in Enzymol . , Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp . 529-39) y el uso del receptor soluble de zalfall. Dentro de las modalidades adicionales de la invención, una fusión del polipéptido de interés y un marcador de afinidad (por ejemplo, la proteína de enlace a la maltosa, un dominio de inmunoglobulina) puede ser construida para facilitar la purificación. Además, utilizando los métodos descritos en la técnica, las fusiones polipeptídicas, o las proteínas del Ligando zalfall híbrido, son construidas utilizando regiones o dominios del Ligando zalfall de la invención, en combinación con aquellos de otras proteínas de la familia de citocinas humanas (por ejemplo interleucinas o GM-CSF) , o proteínas heterólogas (Sambrook et al., ibid. , Altschul et al., ibid. , Picard, Cur. Opin. Biology, 5: 511-5, 1994, y referencias en ésta) . Estos métodos permiten la determinación de la importancia biológica de los dominios o regiones más grandes en un polinucleótido de interés. Tales híbridos pueden alterar la cinética de reacción, el enlace, la construcción o expansión de la especificidad del sustrato, o alterar la localización tisular y celular de un polipéptido, y pueden ser aplicados a los polipéptidos de estructura desconocida. Las proteínas de fusión pueden ser preparadas mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica mediante la preparación de cada componente de la proteína de fusión y conjugándolos químicamente.

Alternativamente, un polinucleótido que codifica para ambos componentes de la proteína de fusión en la estructura de lectura apropiada, puede ser generado utilizando técnicas conocidas y expresado mediante los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, parte o toda la hélice que confiere una función biológica puede ser intercambiada entre el Ligando zalfall de la invención con las hélices funcionalmente equivalentes provenientes de otro miembro de la familia, tales como IL-15, IL-2, IL-4 o GM-CSF. Tales componentes incluyen, pero no están limitados a, la secuencia de señal secretora; las hélices A, B, C, D; los rizos A/B, B/C, C/D; de las citocinas de cúmulo de cuatro hélices. Podría esperarse que tales proteínas de fusión tengan un perfil funcional biológico que sea el mismo o similar a los polipéptidos de la presente invención u otras proteínas conocidas de la familia de citocinas de cúmulo de cuatro hélices, dependiendo de la fusión construida. Además, tales proteínas de fusión pueden mostrar otras propiedades como se describe en la presente. Las técnicas estándares de biología molecular y de clonación pueden ser utilizadas para intercambiar los dominios equivalentes entre el polipéptido del Ligando zalfall y aquellos polipéptidos a los cuales éstos se fusionan. En general, un segmento de ADN que codifica para un dominio de interés, por ejemplo, las hélices A a la D del Ligando zalfall, u otro dominio descrito en la presente, está operablemente enlazado intraestructuralmente al menos a otro segmento de ADN que codifica para un polipéptido adicional (por ejemplo un dominio o región proveniente de otra citocina, tal como IL-2, o similar), y se inserta dentro de un vector de expresión apropiado, como se describe en la presente. En general, las construcciones de ADN son realizadas tal que los diversos segmentos de ADN que codifican para las regiones correspondientes de un polipéptido son operablemente enlazadas dentro de la estructura para hacer una construcción simple que codifica para la proteína de fusión completa, o una porción funcional de la misma. Por ejemplo, una construcción de ADN podría codificar a partir del extremo N hacia el extremo C una proteína de fusión que comprende un polipéptido de señal seguido por una proteína de fusión de citocina de cúmulo de cuatro hélices, madura, que contiene la hélice A, seguida por la hélice B, seguida por la hélice C, seguida por la hélice D. Tales proteínas de fusión pueden ser expresadas, aisladas, y evaluadas para la actividad como se describe en la presente. Los polipéptidos del Ligando zalfall o fragmentos del mismo pueden también ser preparados a través de síntesis química. Los polipéptidos del Ligando zalfall pueden ser monómeros o multímeros; glucosilados o no glucosilados; pegilados o no pegilados; y pueden o no incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial . Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser preparados mediante síntesis de péptidos en fase sólida, por ejemplo como se describe por Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963. La actividad de las moléculas de la presente invención puede ser medida utilizando una variedad de ensayos que miden la proliferación de y/o el enlace a las células que expresan el receptor de zalfall. De interés particular son los cambios en las células dependientes del Ligando zalfall. Las líneas celulares adecuadas que van a ser manipuladas mediante ingeniería genética para ser dependientes del Ligando zalfall, incluyen la línea celular BaF3 dependiente de IL-3 (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984), y M07e (Kiss et al., Leukemia 7 : 235-240, 1993). Las líneas celulares dependientes del factor de crecimiento pueden ser establecidas de acuerdo a los métodos publicados (por ejemplo, Greenberger et al., Leukemia Res . 8 : 363-375, 1984; Dexter et al., en Baum et al. Eds., Experimental Hematology Today, 8 Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979; 145-156, 1980) . Las proteínas de la presente invención son útiles para estimular la proliferación, activación, diferenciación y/o inducción o inhibición de la función celular especializada de las células de la homeostasis involucrada de' la función hematopoyética e inmune. En particular, los polipéptidos del Ligando zalfall son útiles para estimular la proliferación, activación, diferenciación, inducción o inhibición de funciones celulares especializadas de las células de las líneas hematopoyéticas, incluyendo, pero no limitadas a, células T, células B, células NK, células dendríticas, monocitos, y macrófagos, así como células epiteliales. La proliferación y/o diferenciación de células hematopoyéticas puede ser medida in vi tro utilizando células cultivadas o in vivo mediante la administración de moléculas de la invención reclamada al modelo animal apropiado. Los ensayos que miden la proliferación celular o la diferenciación celular son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ensayos que miden la proliferación incluyen ensayos tales como la quimiosensibilidad al colorante rojo neutro (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8 : 347-354, 1990, incorporada por referencia en la presente) , incorporación de nucleótidos radiomarcados (Cook et al., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989, incorporada por referencia en la presente), incorporación de 5-bromo-2 ' -desoxiuridina (BrdU) en el ADN de las células en proliferación (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985, incorporada por referencia en la presente) , y el uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol . Methods 65: 55-63, 1983; Alley et al., Cáncer Res. 48: 589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5 : 69-84, 1995; y Scudiero et al., Cáncer Res. 48: 4827-4833, 1988; todas incorporadas por referencia en la presente) . Los ensayos que miden la diferenciación incluyen, por ejemplo, la medición de los marcadores de la superficie celular asociados con expresión específica de la etapa, de un tejido, la actividad enzimática, la actividad funcional o los cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; todas incorporadas por referencia en la presente) . Las moléculas de la presente invención pueden ser evaluadas in vivo utilizando sistemas de distribución viral. Los virus ejemplares para este propósito incluyen adenovirus, herpesvirus, retrovirus, virus de la vaccinia, y virus adenoasociados (AAV). El adenovirus, un virus de ADN de doble hebra, es actualmente el mejor vector de transferencia de genes estudiado, para la distribución del ácido nucleico heterólogo (para revisión, ver T.C. Becker et al., Meth. Cell Biol. 43: 161-89, 1994; y J.T. Douglas y D.T. Curiel, Science & Medicine 4 : 44-53, 1997) . Como un ligando, la actividad del polipéptido del Ligando zalfall puede ser medida mediante un microfisiómetro biosensor basado en silicio el cual mide la proporción de acidificación extracelular o la excreción de protones asociada con el enlace al receptor y las respuestas celulares fisiológicas, subsecuentes. Un dispositivo ejemplar es el Microfisiómetro CytosensorMR fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, California. Una variedad de respuestas celulares, tales como la proliferación celular, el transporte de iones, la producción de energía, la respuesta inflamatoria, la activación reguladora y receptora, y similares, pueden ser medidos mediante este método. Ver, por ejemplo, McConnell, H.M. et al., Science 257: 1906-1912; Pitchford, S. et al., Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212: 49-59, 1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998. Además, el Ligando zalfall puede ser utilizado para identificar células, tejidos, o líneas celulares que responden a una vía estimulada por el Ligando zalfall. El microfisiómetro, descrito anteriormente, puede ser utilizado para identificar rápidamente las células que responden al ligando, tales como las células que responden al Ligando zalfall de la presente invención. Las células pueden ser cultivadas en presencia o ausencia del polipéptido del Ligando zalfall. Aquellas células que promueven un cambio medible en la acidificación extracelular en presencia del Ligando zalfall responden al Ligando zalfall. Tales células o líneas celulares pueden ser utilizadas para identificar antagonistas y agonistas del polipéptido del Ligando zalfall como se describe anteriormente. En vista de la distribución tisular observada para los agonistas del receptor de zalfall (incluyendo el Ligando zalfall natural/sustrato/cofactor/etc . ) y/o los antagonistas, tienen enorme potencial en aplicaciones in vi tro e in vivo . Los compuestos identificados como agonistas del Ligando zalfall son útiles para la expansión, proliferación, activación, diferenciación, y/o inducción o inhibición de funciones celulares especializadas de las células involucradas en la homeostasis de la hematopoyesis y la función inmune. Por ejemplo, el Ligando zalfall y los compuestos agonistas son útiles como componentes de medios de cultivo de células, definidos, y pueden ser utilizados solos o en combinación con otras citocinas y hormonas para reemplazar el suero que es comúnmente utilizado en el cultivo celular. Los agonistas son de este modo útiles en promover específicamente el crecimiento y/o el desarrollo de las células T, células B, células NK, linfocitos citotóxicos, y otras células de las líneas linfoide y mieloide en cultivo.

Los antagonistas son también útiles como reactivos de investigación para la caracterización de los sitios de interacción ligando-receptor. Los antagonistas son útiles para inhibir la expansión, proliferación, activación, y/o diferenciación de las células involucradas en la regulación de la hematopoyesis. Los inhibidores de la actividad del Ligando zalfall (antagonistas del Ligando zalfall) incluyen los anticuerpos del Ligando anti-zalfall y los receptores del Ligando zalfall solubles, así como otros agentes peptídícos y no peptídicos (incluyendo ribozimas) . El Ligando zalfall puede también ser utilizado para identificar inhibidores (antagonistas) de su actividad. Los compuestos de prueba son agregados a los ensayos descritos en la presente para identificar compuestos que inhiben la actividad del Ligando zalfall. Además de aquellos ensayos descritos en la presente, las muestras pueden ser probadas para la inhibición de la actividad del Ligando zalfall dentro de una variedad de ensayos diseñados para medir el enlace al receptor, la estimulación/inhibición de las respuestas celulares dependientes del Ligando zalfall, o la proliferación de las células que expresan el receptor de zalfall. Un polipéptido del Ligando zalfall puede ser expresado como una fusión con una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, típicamente un fragmento Fc, que contiene dos dominios de región constante y carece de la región variable. Los métodos para preparar tales fusiones son descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,155,027 y 5,567,584. Tales fusiones son típicamente secretadas como moléculas multiméricas en donde las porciones Fc están unidas por puentes disulfuro una a la otra, y dos polipéptidos no Ig están acomodados en estrecha proximidad uno al otro. Las fusiones de este tipo pueden ser utilizadas por ejemplo, para la dimerización, incremento de la estabilidad y de la vida media in vivo, para purificar por afinidad el ligando, así como una herramienta de ensayo in vi tro o un antagonista. Para el uso en ensayos, las quimeras son enlazadas a un soporte por medio de la región Fc y utilizadas en un formato de ELISA. Un polipéptido que se enlaza al Ligando zalfall puede también ser utilizado para la purificación del ligando. El polipéptido es inmovilizado sobre un soporte sólido, tal como esferas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas, resinas basadas en sílice, poliestireno, poliacrilamida reticulada, o materiales similares que son estables bajo las condiciones de uso. Los métodos para enlazar los polipéptidos a soportes sólidos son conocidos en la técnica, e incluyen la química de la amina, la activación con bromuro de cianógeno, la activación con N-hidroxisuccinimida, la activación con epóxido, la activación con sulfhidrilo, y la activación con hidrazida. El medio resultante estará en general configurado en la forma de una columna, y los fluidos que contiene el ligando se hacen pasar a través de la columna una o más veces para permitir que el ligando se enlace al polipéptido receptor. El ligando es luego eluido utilizando cambios en la concentración salina, agentes caotrópicos (clorhidrato de guanidina) , o pH para perturbar el enlace ligando-receptor. Un sistema de ensayo que utiliza un receptor que se enlaza al ligando (o un anticuerpo, un miembro de un par complemento/anticomplemento) o un fragmento de enlace del mismo, y un instrumento biosensor comercialmente disponible (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) puede ser ventajosamente empleado. Tal receptor, anticuerpo, miembro de un par complementario/anti-complementario o un fragmento del mismo, es inmovilizado sobre la superficie de una lasca o microcircuito receptor. El uso de este instrumento es descrito por Karlsson, J. Immunol . Methods 145: 229-40, 1991 y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento es covalentemente acoplado, utilizando la química de la amina o del sulfhidrilo, a fibras de dextrano que están acopladas a la película de oro dentro de la celda de flujo. Una muestra de prueba se hace pasar a través de la celda. Si un ligando, epítope, o miembro opuesto del par complemento/anti-complemento está presente en la muestra, éste se enlazará al receptor inmovilizado, al anticuerpo o al miembro, respectivamente, provocando un cambio en el índice de refracción del medio, que es detectado como un cambio en la resonancia de plasmón superficial de la película de oro. Este sistema permite la determinación de las proporciones de encendido y apagado, a partir de las cuales puede ser calculada la afinidad de enlace, y la evaluación de estequiometría del enlace. Alternativamente, el enlace ligando/receptor puede ser analizado utilizando la tecnología SELDI(TM) (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA) . Los polipéptidos receptores que se enlazan al ligando, pueden también ser utilizados dentro de otros sistemas de ensayo conocidos en la técnica. Tales sistemas incluyen el análisis de Scatchard para la determinación de afinidad de enlace (ver Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) y ensayos calorimétricos (Cunningham et al., Science 253: 545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991) . Los polipéptidos del Ligando zalfall pueden también ser utilizados para preparar anticuerpos que se enlazan a los epítopes del Ligando zalfall, a los péptidos o polipéptidos. El polipéptido del Ligando zalfall o un fragmento del mismo sirve como un antígeno (inmunógeno) para inocular a un animal y promover una respuesta inmune . Una persona de experiencia en la técnica podría reconocer que los polipéptidos antigénicos, que poseen epítope, contienen una secuencia de al menos 6, preferentemente al menos 9, y más preferentemente al menos 15 hasta aproximadamente 30 residuos de aminoácidos contiguos de un polípéptido del Ligando zalfall (por ejemplo, SEQ ID NO. 2) . Los polipéptidos que comprenden una porción más grande de un polipéptido del Ligando zalfall, por ejemplo de 30 a 100 residuos hasta la longitud completa de la secuencia de aminoácidos, son también incluidos. Los antígenos o epítopes inmunogénicos pueden también incluir marcadores acoplados, adyuvantes y portadores, como se describe en la presente. Los antígenos adecuados incluyen el polipéptido del Ligando zalfall codificado por la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 32 hasta el aminoácido número 162, o un fragmento contiguo de 9 a 131 aminoácidos del mismo. Otros antígenos adecuados incluyen, la longitud completa y el Ligando zalfall maduro, las hélices A-D, y las hélices individuales o múltiples A, B, C, y D, de la estructura de cúmulo de cuatro hélices del Ligando zalfall como se describe en la presente. Los péptidos preferidos para utilizarse como antígenos son péptidos hidrofílicos tales como aquellos predichos por una persona de experiencia en la técnica a partir de una gráfica de hidrofobicidad, como se describe en la presente, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 114-119, 101-105, 126-131, 113-118, y 158-162 de la SEQ ID NO. 2. Los anticuerpos provenientes de una respuesta inmune generada por la inoculación de un animal con estos antígenos, pueden ser aislados y purificados como se describe en la presente. Los métodos para la preparación y aislamiento de anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, Cooligan et al., (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Hurrell, J.G.R., Ed. , Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Ratón, Florida, 1982. Como podría ser evidente para una persona de experiencia ordinaria en la técnica, los anticuerpos policlonales pueden ser generados a partir de la inoculación de una variedad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, gallinas, conejos, ratones, y ratas con un polipéptido del Ligando zalfall o un fragmento del mismo. La inmunogenicidad de un polipéptido del Ligando zalfall puede ser incrementada a través del uso de un adyuvante, tal como alumbre (hidróxido de aluminio) o adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización incluyen también polipéptidos de fusión, tales como las fusiones del Ligando zalfall o una porción del mismo con un polipéptido de inmunoglobulina o con una proteína de enlace a la maltosa. El inmunógeno polipeptídico puede ser una molécula de longitud completa o una porción de la misma. Si la porción polipeptídica es "similar a hapteno", tal porción puede ser ventajosamente unida o enlazada a un portador macromolecular (tal como la hemocianina de lapa keyhole (KLH) , albúmina sérica bovina (BSA) o toxoide tetánico) para la inmunización. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpos" incluye los anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales, y fragmentos de enlace al antígeno, tales como los fragmentos proteolí"ticos F(ab')2 y Fab. Los anticuerpos o fragmentos intactos manipulados mediante ingeniería genética, tales como los anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos de cadena simple y similares, así como los péptidos y polipéptidos sintéticos de enlace al antígeno, son también incluidos. Los anticuerpos no humanos pueden ser humanizados mediante injerto de CDRs no humanos sobre la estructura humana y las regiones constantes, o mediante la incorporación de los dominios variables no humanos, completos (opcionalmente "revistiéndolos" con una superficie similar a la humana mediante reemplazo de los residuos expuestos, en donde el resultado es un anticuerpo "disfrazado"). En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden conservar residuos no humanos dentro de los dominios estructurales de la región variable humana para aumentar las características de enlace adecuadas. A través de la humanización de anticuerpos, puede ser incrementada la vida media biológica, y el potencial para las reacciones inmunes adversas después de la administración a humanos, es reducido. Además, los anticuerpos humanos pueden ser producidos en animales no humanos transgénicos que han sido manipulados mediante ingeniería genética para contener genes de inmunoglobulina humana como se describe en la Publicación del WIPO WO 98/24893. Se prefiere que los genes de inmunoglobulina endógenos en estos animales sean inactivados o eliminados, tal como mediante recombinación homologa. Se considera que los anticuerpos se enlazan específicamente si: 1) éstos muestran un nivel de umbral de actividad de enlace, y 2) éstos no reaccionan de manera cruzada significativamente con las moléculas polipeptídicas relacionadas. Un nivel de umbral de enlace es determinado si los anticuerpos anti-Ligando zalfall en la presente, se enlazan a un polipéptido del Ligando zalfall, a un péptido o un epítope del mismo con una afinidad al menos 10 veces mayor que la afinidad de enlace al polipéptido control (ligando no zalfall) . Se prefiere que los anticuerpos muestren una actividad de enlace (Ka) de 106 M"1 o mayor, preferentemente 107 M"1 o mayor, más preferentemente 108 M"1 o mayor, y lo más preferentemente 199 M"1 o mayor. La afinidad de enlace de un anticuerpo puede ser fácilmente determinada por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard (Scatchard, G. , Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949). Si los anticuerpos anti-Ligando zalfall no de manera cruzada significativamente con las moléculas del polipéptido relacionado se muestran, por ejemplo, por el anticuerpo que detecta el polipéptido del Ligando zalfall, pero no los polipéptidos relacionados conocidos utilizando un análisis de manchado de Western estándar (Ausubel et al., ibid.). Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos son aquellos descritos en la técnica anterior, tales como los ortólogos conocidos, y los parálogos, y miembros conocidos similares de una familia de proteínas. La selección puede también ser realizada utilizando el Ligando zalfall no humano, y los polipéptidos mutantes del Ligando zalfall. Además, los anticuerpos pueden ser "seleccionados contra" polipéptidos relacionados conocidos, para aislar una población que se enlaza específicamente a los polipéptidos del Ligando zalfall. Por ejemplo, los anticuerpos producidos para el Ligando zalfall son adsorbidos a polipéptidos relacionados adheridos a una matriz insoluble; los anticuerpos específicos para el Ligando zalfall fluirán a través de la matriz bajo las condiciones amortiguadoras apropiadas . La selección permite el aislamiento de los anticuerpos policlonales y monoclonales que no reaccionan de manera cruzada a los polipéptidos conocidos, estrechamente relacionados (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan et al., (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, INc, 1995). La selección y aislamiento de los anticuerpos específicos es bien conocida en la técnica. Ver, Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., adv. In Immunol . 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd. , 1996; Benjamín et al., Ann. Rev. Immunol . 2: 67-101, 1984. El enlace específico de los anticuerpos anti-Ligando zalfall puede ser detectado mediante un número de métodos conocidos en la técnica, y descritos más adelante.

Una variedad de ensayos conocidos por aquellos conocidos en la técnica pueden ser conocidos para detectar los anticuerpos que se enlazan a los polipéptidos o proteínas del Ligando zalfall. Los ensayos ejemplares son descritos con detalle en Antibodies.: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: inmunoelectoforesis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) , manchado por punto o ensayo de manchado o transferencia de Western, ensayo de inhibición o competición, y ensayo de emparedado. Además, los anticuerpos pueden ser seleccionados por el enlace a la proteína o polipéptido del Ligando zalfall tipo silvestre versus mutante . Los anticuerpos para el Ligando zalfall pueden ser utilizados para marcar células que expresan el Ligando zalfall; para aislar el Ligando zalfall mediante purificación por afinidad; para ensayos de diagnóstico para determinar los niveles en circulación de los polipéptidos del Ligando zalfall; para detectar o cuantificar el Ligando zalfall soluble como un marcador de la patología o enfermedad subyacente; en métodos analíticos empleando FACS; para seleccionar genotecas de expresión; para generar anticuerpos anti-idiotipo; y como anticuerpos neutralizadores o como antagonistas para bloquear la actividad del Ligando zalfall in vi tro e in vivo . Los marcadores directos adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas, y similares; los marcadores o etiquetas indirectas pueden caracterizar el uso de biotina-avidina u otros pares complemento/anti-complemento como intermediarios. Los anticuerpos en la presente pueden también ser directa o indirectamente conjugados a fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos conjugados utilizados para aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico in vivo . Además, los anticuerpos para el Ligando zalfall o fragmentos del mismo, pueden ser utilizados in vi tro para detectar el Ligando zalfall desnaturalizado o fragmentos del mismo en ensayos, por ejemplo, Manchado de Western u otros ensayos conocidos en la técnica. Las moléculas detectables, adecuadas, pueden ser directa o indirectamente acopladas al polipéptido o al anticuerpo, e incluir radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las moléculas citotóxicas adecuadas pueden ser directa o indirectamente acopladas al polipéptido o anticuerpo, e incluir toxinas bacterianas o vegetales (por ejemplo, toxina de la difteria, saporina, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina y similares) , así como radionúclidos terapéuticos tales como yodo- 131, renio-188 o itrio- 90 (ya sea directamente acoplados al polipéptido o al anticuerpo, o indirectamente acoplados por medio de una porción quelante, por ejemplo) . Los polipéptidos y anticuerpos pueden también ser conjugados a fármacos citotóxicos, tales como adriamicina. Para el acoplamiento indirecto de una molécula detectable o citotóxica, la molécula detectable o citotóxica puede ser conjugada con un miembro de un par complemento/anti-complemento, donde el otro miembro se enlaza a la porción del polipéptido o del anticuerpo. Para estos propósitos, la biotina/estreptavidina es un par ejemplar de complemento/anti-complemento. Los polipéptidos de enlace pueden también actuar como "antagonistas" del Ligando zalfall para bloquear el enlace del Ligando zalfall y la transducción de la señal in vi tro e in vivo . Estos polipéptidos que se enlazan al Ligando anti-zalfall podrían ser útiles para inhibir la actividad del Ligando zalfall o el enlace en la proteína. Las proteínas de fusión polipéptido-toxina o las proteínas de fusión anticuerpo-toxina pueden ser utilizadas para la inhibición o ablación dirigida a las células o a los tejidos (por ejemplo, para tratar células o tejidos cancerosos) . Alternativamente, si el polipéptido tiene dominios funcionales múltiples (por ejemplo, un dominio de activación o un dominio de enlace al receptor, más un dominio de dirección al .objetivo) , una proteína de fusión que incluye únicamente el dominio de dirección al objetivo puede ser adecuado para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria a un tipo celular o tisular de interés. En casos donde el dominio de la proteína de fusión incluye únicamente una molécula complementaria, la molécula anti-complementaria puede ser conjugada a una molécula detectable o citotóxica. Tales proteínas de fusión de molécula complementaria al dominio representan de este modo un vehículo de dirección al objetivo, genérico, para la distribución específica de célula/tejido de conjugados de moléculas genéricas anticomplementarias-detectables/citotóxicas . Las proteínas de fusión Ligando zalfall-citocina o las proteínas de fusión anticuerpo-citocina pueden ser utilizadas para aumentar la muerte in vivo de los tejidos objetivo (por ejemplo, cánceres de sangre y de médula ósea) , si el polipéptido del Ligando zalfall o el anticuerpo anti-Ligando zalfall se dirige a la sangre o a la célula de la médula ósea, hiperproliferativa (ver, en general, Hornick et al., Blood 89: 4437-47, 1997). Las proteínas de fusión descritas hacen posible el dirigir una citocina a un sitio de acción deseado, con lo cual se proporciona una concentración local elevada de la citocina. Los polipéptidos del Ligando zalfall adecuados o los anticuerpos anti-Ligando zalfall se dirigen a una célula o tejido no deseable (por ejemplo un tumor o una leucemia), y realizan la lisis mejorada de la célula objetivo, mediada por la citocina fusionada, por parte de las células efectoras. Las citocinas adecuadas para este propósito incluyen interleucina 2 y el factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , por ejemplo. La diferenciación es un proceso dinámico y progresivo, que comienza con las células de la línea pluripotencial y que termina con las células terminalmente diferenciadas . Las células de la línea pluripotencial que pueden regenerarse sin compromiso para una línea, expresan un grupo de marcadores de diferenciación que se pierden cuando se realiza el compromiso hacia una línea celular. Las células progenitoras expresan un grupo de marcadores de diferenciación que pueden o no continuar siendo expresados conforme las células progresan hacia la vía de la línea celular, hacia la maduración. Los marcadores de diferenciación que son expresados exclusivamente por células maduras son usualmente propiedades funcionales tales como productos celulares, enzimas para producir productos celulares, y receptores. La etapa de la diferenciación de una población celular es verificada periódicamente mediante la identificación de marcadores presentes en la población celular. Existe evidencia que sugiere que los factores que estimulan los tipos celulares específicos hacia una vía, hacia la diferenciación o desdiferenciación terminal, afectan la población celular completa que se origina de un precursor común o célula totipotencial. De este modo, la presente invención incluye la estimulación o inhibición de la proliferación de células linfoides, células hematopoyéticas y células epiteliales. El Ligando zalfall fue aislado de tejido que se sabe tenía función inmunológica importante y que contenía células que juegan un papel en el sistema inmune. El Ligando zalfall es expresado en células de sangre periférica activadas, seleccionadas por CD3+, y se ha mostrado que la expresión del Ligando zalfall se incrementa después de la activación de las células T. Además, los resultados de los experimentos descritos en la sección de ejemplos en la presente, demuestran que los polipéptidos de la presente invención tienen un efecto sobre el crecimiento/expansión y/o estado diferenciado de las células NK o los progenitores de NK. La evidencia adicional demuestra que el Ligando zalfall afecta la proliferación y/o diferenciación de las células T y las células B in vivo . Los factores que estimulan la proliferación de los progenitores hematopoyéticos y activan las células maduras, son en general conocidos. Las células NK responden a IL-2 únicamente, pero la proliferación y la activación requieren en general factores de crecimiento adicionales. Por ejemplo, se ha mostrado que IL-7 y el Factor Steel (ligando del equipo c) fueron requeridos para la formación de colonias de progenitores de ?K. IL-15 + IL-2 en combinación con IL-7 y el Factor Steel fue más efectivo (Mrózek et al., Blood 87: 2632-2640, 1996). ?o obstante, las citocinas no identificadas pueden ser necesarias para la proliferación de subgrupos específicos de células ?K y/o progenitores de ?K (Robertson et al., Blood 76: 2451-2438, 1990) . Una composición que comprende el Ligando zalfall e IL-15 estimula los progenitores de ?K y las células ?K, con evidencia de que esta composición es más potente que los factores y combinaciones de factores, previamente descritos . Los ensayos que miden la diferenciación incluyen, por ejemplo, la medición de los marcadores celulares asociados con la expresión específica de etapa de un tejido, actividad enzimática, actividad funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; todas incorporadas por referencia en la presente) . Alternativamente, el polipéptido del Ligando zalfall mismo puede servir como un marcador adicional de la superficie celular o secretado, asociado con la expresión específica de la etapa, de un tejido. Como tal, la medición directa del polipéptido del Ligando zalfall, o su pérdida de expresión en un tejido conforme ésta se diferencia, puede servir como un marcador para la diferenciación de los te idos . Similarmente, la medición directa del polipéptido del Ligando zalfall, o su pérdida de expresión en un tejido puede ser determinada en un tej ido o en células conforme éstas sufren progresión tumoral. Los incrementos en la invasividad y en la motilidad de las células, o la ganancia o pérdida de expresión del Ligando zalfall en una condición precancerosa o cancerosa, en comparación al tejido normal, pueden servir como un diagnóstico para la transformación, invasión y metástasis en la progresión del tumor. Como tal, el conocimiento de una etapa de progresión de un tumor o la metástasis del mismo, ayudará al médico a elegir la terapia más adecuada, o la agresividad del tratamiento, para un paciente individual con cáncer, dado. Los métodos de la medición de la ganancia y pérdida de la expresión (ya sea del ARNm o de la proteína) son bien conocidos en la técnica, y descritos en la presente, y pueden ser aplicados a la expresión del Ligando zalfall. Por ejemplo, la aparición o desaparición de los polipéptidos que regulan la motilidad celular puede ser utilizada para ayudar al diagnóstico y prognosis del cáncer de próstata (Banyard, J. y Zetter, B.R., Cáncer and Metast. Rev. 17: 449-458, 1999). Como un efector de la motilidad celular, la ganancia o pérdida de expresión del Ligando zalfall puede servir como un diagnóstico para los cánceres linfoides, de células B, epiteliales, hematopoyéticos y otros. Además, la actividad y efecto del Ligando zalfall sobre la progresión tumoral y la metástasis puede ser medida in vivo . Varios modelos de ratón singeníeos han sido desarrollados para estudiar la influencia de los polipéptidos, los compuestos u otros tratamientos sobre la progresión del tumor. En estos modelos, las células tumorales pasadas en cultivo son implantadas en ratones de la misma cepa que el donador tumoral. Las células se desarrollarán en tumores que tienen características similares en los ratones recipientes, y la metástasis ocurrirá también en algunos de los modelos. Los modelos tumorales apropiados para los presentes estudios incluyen el carcinoma de pulmón de Lewis (ATCC No. CRL-1642) y el melanoma B16 (ATCC No. CRL-6323) , entre otros. Estos son ambos, líneas tumorales comúnmente utilizadas, singénicas para el ratón C57BL6/J, que son fácilmente cultivados y manipulados in vi tro. Los tumores resultantes de la implantación de cualquiera de estas líneas celulares son capaces de realizar la metástasis hacia el pulmón en ratones C57BL6/J. El modelo de carcinoma de pulmón de Lewis ha sido utilizado recientemente en ratones para identificar un inhibidor de la angiogénesis (O'Reilly MS, et al. Cell 79: 315-328, 1994). Los ratones C57BL6/J son tratados con un agente experimental ya sea a través de la inyección diaria de proteína recombinante, agonista o antagonista o una inyección de una sola vez del adenovirus recombinante. Tres días después de este tratamiento, 105 a 10c células son implantadas bajo la piel dorsal.

Alternativamente, las células mismas pueden ser infectadas con el adenovirus recombinante, tales como uno que expresa el Ligando zalfall, antes de la implantación, de modo que la proteína es sintetizada en el sitio del tumor o intracelularmente, en vez de sistémicamente. Los ratones normalmente desarrollan tumores visibles dentro de 5 días. Los tumores se dejan desarrollar por un periodo de hasta 3 semanas, tiempo durante el cual éstos pueden alcanzar un tamaño de 1500 a 1800 mm3 en el grupo tratado con control. El tamaño del tumor y el peso del cuerpo son cuidadosamente verificados periódicamente a todo lo largo del experimento. Al tiempo del sacrificio, el tumor es removido y pesado junto con los pulmones y el hígado. El peso del pulmón ha mostrado que correlaciona perfectamente con la carga tumoral metastática. Como una medida adicional, son contadas las metástasis de la superficie pulmonar. El tumor extirpado, los pulmones y el hígado son preparados para el examen histopatológico, para la inmunohistoquímica, y la hibridación in si tu, utilizando métodos conocidos en la técnica, y descritos en la presente. La influencia del polipéptido expresado en cuestión, por ejemplo, el Ligando zalfall, sobre la habilidad del tumor para reclutar la vasculatura y sufrir metástasis, puede de este modo ser evaluada. Además, aparte del uso del adenovirus, las células implantadas pueden ser transitoriamente transfectadas con el Ligando zalfall. El uso de transfectantes estables del Ligando zalfall así como el uso de promotores inducibles para activar la expresión del Ligando zalfall in vivo, son conocidos en la técnica, y pueden ser utilizados en este sistema para evaluar la inducción del metástasis del Ligando zalfall. Además, el Ligando zalfall purificado o el medio condicionado con el Ligando zalfall puede ser directamente inyectado dentro de este modelo de ratón, y por lo tanto ser utilizado en este sistema. Para referencia general ver, O'Reilly MS et al. Cell 79: 315-328, 1994; y Rusciano D. et al. Murine Models of Liver Metástasis. Invasión Metástasis 14: 349-361, 1995.

El Ligando zalfall será útil en el tratamiento de la tumorigénesis, y por lo tanto podría ser útil en el tratamiento del cáncer. El Ligando zalfall inhibe la proliferación estimulada por IL-4, de las células B normales estimuladas por anti-IgM y un efecto similar es observado en las líneas tumorales de células B sugiriendo que puede existir beneficio terapéutico en el tratamiento de los pacientes con el Ligando zalfall, con el fin de inducir las células tumorales de células B hacia un estado menos proliferativo. El ligando puede ser administrado en combinación con otros agentes ya en uso, incluyendo los agentes terapéuticos convencionales así como los moduladores inmunes tales como el interferón alfa. Los interferones alfa/beta han mostrado que son efectivos en el tratamiento de algunas leucemias y modelos de enfermedad animal, y los efectos inhibitorios del desarrollo, del interferón alfa y del Ligando zalfall son aditivos para al menos una línea celular derivada del tumor de células B. La presente invención proporciona un método para reducir la proliferación de las células B o T neoplásicas, que comprende el administrar a un mamífero con un neoplasma de células B o T, una cantidad de una composición del Ligando zalfall, suficiente para reducir la proliferación de las células B o T neoplásicas. En otras modalidades, la composición puede comprender al menos otra citocina seleccionada del grupo que consiste de IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando de Flt3 o el ' factor de células totipotenciales . En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para reducir la proliferación de células B o T neoplásicas que comprende el administrar a un mamífero con un neoplasma de células B o T, una cantidad de una composición del antagonista del Ligando zalfall suficiente para reducir la proliferación de las células B o T neoplásicas. En otras modalidades, la composición puede comprender al menos otra citocina seleccionada del grupo que consiste de IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando de Flt3 , o el factor de células totipotenciales. Además, el antagonista del Ligando zalfall puede ser una proteína de fusión ligando/toxina. Una toxina de fusión del Ligando zalfall-saporina puede ser empleada contra un grupo similar de leucemias y linfomas, extendiendo la gama de leucemias que pueden ser tratadas con el Ligando zalfall. La activación mediada por la toxina de fusión del receptor zalfall, proporciona dos medios independientes para inhibir el desarrollo de las células objetivo, el primero siendo idéntico a los efectos observados por el ligando solo, y el segundo debido a la distribución de la toxina a través de la internalización del receptor. El patrón de expresión restringido a la línea linfoide del receptor zalfall sugiere que el conjugado ligando-saporina puede ser tolerado por los pacientes . Cuando el tratamiento para las malignidades incluye el trasplante de médula ósea o células totipotenciales, alogénicas, el Ligando zalfall puede ser valioso en el mejoramiento del efecto injerto versus huésped. El Ligando zalfall estimula la generación de células NK líticas a partir de los progenitores de médula y estimula la proliferación de células T después de la activación de los receptores antigénicos. Por lo tanto, cuando los pacientes reciben trasplantes de médula alogénícos, el Ligando zalfall aumentará la generación de respuestas antitumorales, con o sin la infusión de linfocitos donadores. La distribución tisular de un receptor para una citocina dada ofrece una fuerte indicación de los sitios potenciales de la acción de esa citocina. El análisis de Northern del receptor de zalfall reveló los transcritos en bazo, timo, nodulos linfáticos, médula ósea, y leucocitos de sangre periférica en humano. Los tipos celulares específicos fueron identificados como los que expresan los receptores de zalfall, y fueron observadas señales fuertes en una reacción de linfocitos mixtos (MLR) y en el linfoma de Burkitt Raj i . Las dos líneas celulares monocíticas, THP-1 (Tsuchiya et al., Int. J. Cáncer 26: 171-176, 1980) y U937 (Sundstrom et al., Int. J. Cáncer 17: 565-577, 1976), fueron negativas . El receptor de zalfall es expresado a niveles relativamente altos en MLR, en la cual las células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) proveniente de dos individuos, se mezclan, dando como resultado activación mutua. La detección de altos niveles del transcrito en la MLR pero no en las poblaciones de células T o B en descanso, sugiere que la expresión del receptor de zalfall puede ser inducida en uno o más tipos celulares durante la activación. La activación de poblaciones aisladas de células T y B puede ser artificialmente lograda mediante la estimulación de las células con PMA y ionomicina. Cuando las células clasificadas fueron sujetas a estas condiciones de activación, los niveles del transcrito del receptor de zalfall se incrementaron en ambos tipos celulares, apoyando un papel para este receptor y el Ligando zalfall en las respuestas inmunes, especialmente en expresiones autocrinas y paracrinas de células T y B durante la activación. El Ligando zalfall puede también jugar un papel en la expresión de progenitores más primitivos involucrados en la linfopoyesis . Se encontró que el receptor de zalfall está presente a bajos niveles en las células T y B en reposo, y fue suprarregulado durante la activación en ambos tipos celulares. De manera interesante, las células B también subregulan el mensaje más rápidamente que las células T, sugiriendo que la amplitud de la señal y la sincronización de apagado de la señal son importantes para la regulación apropiada de las respuestas de las células B. Además, una gran proporción de las células propria de la lámina intestinal muestran señales de hibridación positiva con el receptor de zalfall. Este tejido consiste de una población mixta de células linfoides, incluyendo las células T CD4+ activadas y las células B activadas. La disfunción inmune, en particular la activación crónica de la respuesta mucosal inmune, juega un papel importante en la etiología de la enfermedad de Crohn; la respuesta anormal para y/o la producción de las citocinas proinflamatorias es también un factor sospechoso (Braegger et al., Annals Allergy 72: 135-141, 1994; Sartor RB Am. J. Gastroenterol. 92: 5S-lls, 1997. El Ligando zalfall en concierto con IL-15 expande las células NK de los progenitores de la médula ósea y aumenta la función efectora de las células NK. El Ligando zalfall también coestimula las células B maduras estimuladas con los anticuerpos anti-CD40, pero inhibe la proliferación de las células B a las señales a través de IgM. El Ligando zalfall aumenta la proliferación de las células T en concierto con una señal a través del receptor de células T, y la sobre-expresión en ratones transgénicos conduce a la linfopenia y a una expansión de los monocitos y los granulocitos. Estos efectos pleiotrópicos del Ligando zalfall sugieren que éste puede proporcionar utilidad terapéutica para una amplia gama de enfermedades que surgen de los defectos en el sistema inmune, incluyendo (pero no limitadas a) lupus eritematoso sistémico (SLE) , artritis reumatoide (RA) , esclerosis múltiple (MS) , miastenia gravis, y diabetes. Es importante notar que estas enfermedades son el resultado de una red compleja de disfunciones inmunes (SLE, por ejemplo, es la manifestación de los defectos en las células T y B) , y que las células inmunes son dependientes de la interacción una con la otra para promover una respuesta inmune potente. Por lo tanto, el Ligando zalfall (o un antagonista del Ligando) que puede ser utilizado para manipular más de un tipo de célula inmune es un candidato terapéutico atractivo para la intervención en etapas múltiples de enfermedad. Los polipéptidos y las proteínas de la presente invención pueden también ser utilizados ex vivo, tal como en el cultivo de médula autóloga. En resumen, la médula ósea es removida de un paciente antes de la quimioterapia o trasplante de órgano y tratada con el Ligando zalfall, opcionalmente en combinación con una o más citocinas. La médula tratada es luego devuelta al paciente después de la quimioterapia para acelerar la recuperación de la médula o después de un trasplante para suprimir la enfermedad injerto versus huésped. Además, las proteínas de la presente invención pueden también ser utilizadas para la expansión ex vivo de la médula o de células progenitoras de sangre periférica (PBPC) . Antes del tratamiento, la médula puede ser estimulada con el factor de células totipotenciales (SCF) para liberar las células progenitoras tempranas hacia la circulación periférica. Estos progenitores pueden ser recolectados y concentrados de la sangre periférica y luego tratados en cultivo con el Ligando zalfall, opcionalmente en combinación con una o más de otras citocinas, incluyendo pero no limitadas a SCF, IL-2, IL-4, IL-7 o IL-15, para diferenciar y proliferar en cultivos linfoides de alta densidad, los cuales pueden ser luego devueltos al paciente después de la quimioterapia o el trasplante. La presente invención proporciona un método para la expansión de las células hematopoyéticas y los progenitores de células hematopoyéticas que comprenden el cultivo de la médula ósea o las células de sangre periférica con una composición que comprende una cantidad del Ligando zalfall suficiente para producir un incremento en el número de células linfoides en las células de médula ósea o de sangre periférica en comparación a las células de médula ósea o de sangre periférica cultivadas en ausencia del Ligando zalfall. En otras modalidades, las células hematopoyéticas y las células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides. En otra modalidad más, las células linfoides son células NK o células T citotóxicas. Además, la composición puede también comprender al menos otra citocina seleccionada del grupo que consiste de IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando Flt3 y el factor de células totipotenciales. Alternativamente, el Ligando zalfall puede activar el sistema inmune, lo cual podría ser importante en el refuerzo de la inmunidad contra enfermedades infecciosas, tratamiento de pacientes inmunocomprometidos, tales como pacientes con VIH, o en el mejoramiento de vacunas. En particular, la estimulación del Ligando zalfall o la expansión de las células NK, o sus progenitores, podría proporcionar valor terapéutico en el tratamiento de la infección viral, y como un factor antineoplásico. Se piensa que las células NK juegan un papel principal en la eliminación de las células tumorales metástasicas y en pacientes con metástasis y tumores sólidos que tiene niveles disminuidos de actividad de células NK (Whiteside et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 230: 221-244, 1998) . Similarmente, la estimulación del Ligando zalfall de la respuesta inmune contra los agentes patógenos virales y no virales (incluyendo bacterias, protozoarios y hongos) podrían proporcionar valor terapéutico en el tratamiento de tales infecciones por la inhibición del crecimiento de tales agentes infecciosos. La determinación directa o indirectamente de los niveles de un patógeno o un antígeno, tal como una célula tumoral, presentes en el cuerpo puede ser lograda por un número de métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. La presente invención incluye un método para estimular una respuesta inmune en un mamífero expuesto a un antígeno o patógeno, que comprende los pasos de: 1) determinar directa o indirectamente el nivel de antígeno o patógeno presente en el mamífero; 2) administrar una composición que comprende el polipéptido del Ligando zalfall en un vehículo farmacéuticamente aceptable; 3) determinar directa o indirectamente el nivel de antígeno o de patógeno en dicho mamífero; 4) comparar el nivel del antígeno o del patógeno en el paso 1 al nivel del antígeno o patógeno en el paso 3 , en donde un cambio en el nivel es indicador de la estimulación de una respuesta inmune. En otra modalidad más la composición del Ligando zalfall es re-administrada. En otras modalidades, el antígeno es un tumor de células B; un virus; un parásito o una bacteria.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para estimular una respuesta inmune en un mamífero expuesto a un antígeno o patógeno, que comprende: 1) la determinación de un nivel de un anticuerpo específico de antígeno o de patógeno; 2) la administración de una composición que comprende el polipéptido del Ligando zalfall en un vehículo farmacéuticamente aceptable; 3) la determinación de un nivel de post-administración de anticuerpo específico de antígeno o de patógeno; 4) la comparación del nivel del anticuerpo en el paso (1) al nivel del anticuerpo en el paso (3) , en donde un incremento en el nivel de anticuerpo es indicador de la estimulación de una respuesta inmune. Los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos del Ligando zalfall son útiles dentro de las aplicaciones en terapia génica donde se desea incrementar o inhibir la actividad del Ligando zalfall. Si un mamífero tiene un gen del Ligando zalfall mutado o ausente, el gen del Ligando zalfall puede ser introducido dentro de las células de mamífero. En una modalidad, un gen que codifica para un polipéptido del Ligando zalfall es introducido in vivo en un vector viral. Tales vectores incluyen un virus de ADN atenuado o defectuoso, tal como, pero no limitado a, el virus del herpes simple (HSV), papilomavirus, virus de Epstein Barr (EBV) , adenovirus, virus adeno-asociado (AAV) , 1993. Alternativamente, el vector puede ser introducido mediante lipofección in vivo utilizando liposomas. Los lípidos catiónicos sintéticos pueden ser utilizados para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica para un marcador (Felgner et al., Proc. Natl . Acad. Sci. EUA 85: 8027-31, 1988) . El uso de la lipofección para introducir genes exógenos dentro de órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. La dirección al objetivo molecular de los liposomas para células específicas, representa un área de beneficio. Más particularmente, la dirección de la transfección a células particulares representa un área de beneficio. Por ejemplo, la dirección de la transfección a tipos celulares particulares podría ser particularmente ventajosa en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el sistema inmune, el páncreas, el hígado, el riñon, y el cerebro. Los lípidos pueden ser químicamente acoplados a otras moléculas para fines de dirección al objetivo. Los péptidos dirigidos (por ejemplo, hormonas o neurotransmisores) , proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no peptídicas pueden ser acoplados a liposomas químicamente . Es posible remover las células objetivo del cuerpo; introducir el vector como un plásmido de AD? desnudo; y luego re-implantar las células transformadas dentro del cuerpo. Los vectores de ADN desnudos para terapia génica pueden ser introducidos dentro de las células huésped deseadas mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato de calcio, el uso de una pistola de genes o el uso de un transportador vector de ADN. Ver, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963-7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621-4, 1988. La metodología antisentido puede ser utilizada para inhibir la transcripción del gen del Ligando zalfall, tal como para inhibir la proliferación celular in vivo. Los polinucleótidos que son complementarios a un segmento de un polinucleótido que codifica para el Ligando zalfall (por ejemplo, un polinucleótido como se describe en la SEQ ID NO. 1) están diseñados para enlazarse al ARNm que codifica para el Ligando zalfall y para inhibir la traducción de tal ARNm. Tales polinucleótidos antisentido son utilizados para inhibir la expresión de los genes que codifican para el polipéptido del Ligando zalfall en cultivo celular o en un sujeto. Los ratones manipulados mediante ingeniería genética para expresar el gen del Ligando zalfall, denominados como "ratones transgénicos", y ratones que muestran una ausencia completa de función del gen del Ligando zalfall, denominados como "ratones suprimidos en un gen", pueden también ser generados (Snouwaert et al., Science 257: 1083, 1992; Lowell et al., Nature 366: 740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science 244: 1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. et al. Annu Rev. Genet. 20: 465-499, 1986) . Por ejemplo, los ratones transgénicos que sobre-expresan el Ligando zalfall, ya sea ubicuamente o bajo un promotor específico de tejido o restringido a un tejido, pueden ser utilizados para investigar si la sobre-exprésion provoca un fenotipo. Por ejemplo, la sobre-expresión de un polipéptido del Ligando zalfall de tipo silvestre, el fragmento polipeptídico o un mutante del mismo pueden alterar los procesos celulares normales, dando como resultado un fenotipo que identifica un tejido en el cual la expresión del Ligando zalfall es funcionalmente relevante y puede indicar un objetivo terapéutico para el Ligando zalfall, sus agonistas o antagonistas. Por ejemplo, un ratón transgénico preferido para manipular mediante ingeniería genética es uno que sobre-expresa el Ligando zalfall (residuos de aminoácidos 32-162 de la SEQ ID NO. 2) . Además, tal sobre-expresión puede dar como resultado un fenotipo que muestra una similitud con enfermedades humanas. Similarmente, los ratones suprimidos en el gen del Ligando zalfall pueden ser utilizados para determinar si el Ligando zalfall es absolutamente requerido ín vivo . El fenotipo de los ratones suprimidos en un gen es predictivo de los efectos in vivo que pueden tener un antagonista del Ligando zalfall, tales como aquellos descritos en la presente. El ADNc del Ligando zalfall humano o de ratón puede ser utilizado para generar ratones suprimidos en algún gen. Estos ratones pueden ser empleados para estudiar el gen del Ligando zalfall y la proteína codificada por éste en un sistema in vivo, y pueden ser utilizados como modelos in vivo para las enfermedades humanas correspondientes. Además, la expresión de ratones transgénicos de los polinucleótidos antisentido del Ligando zalfall o las ribozimas dirigidas contra el Ligando zalfall, descrito en la presente, pueden ser utilizados análogamente a ratones transgénicos descritos anteriormente. Los estudios pueden ser llevados a cabo mediante la administración también de la proteína del Ligando zalfall purificada. Para el uso farmacéutico, las proteínas de la presente invención son formuladas para la administración parenteral, particularmente intravenosa o subcutánea, de acuerdo a métodos convencionales. Los conjugados del polipéptido o del anticuerpo bioactivos, descritos en la presente, pueden ser distribuidos intravenosamente, intraarterialmente o intraductalmente o pueden ser introducidos localmente en un sitio pretendido de acción.

La administración intravenosa será por inyección de bolo o por infusión en un periodo típico de una a varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína del Ligando zalfall en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa al 5% en agua o similares. Las formulaciones pueden además incluir uno o más excipientes, conservadores, solubilizadores, agentes amortiguadores, albúmina para prevenir la pérdida de la proteína sobre superficies del frasco, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19a ed., 1995. Las dosis terapéuticas estarán en general en el intervalo de 0.1 a 100 µg/kg de peso del paciente por día, preferentemente 0.5-20 µg/kg por día, con la dosis exacta determinada por el médico, de acuerdo a los estándares aceptados, tomando en cuenta la naturaleza y la severidad de la condición que va a ser tratada, los rasgos del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de experiencia .ordinaria en la técnica. Las proteínas pueden ser administradas por el tratamiento agudo, en una semana o menos, frecuentemente en un periodo de uno a tres días, o pueden ser utilizadas en el tratamiento crónico, en varios meses o años. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva del Ligando zalfall es una cantidad suficiente para producir un cambio clínicamente significativo en la función hematopoyética o inmune . La invención es además ilustrada por los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Construcción de la Quimera MPL-polipéptido zalfall: dominio extracelular MPL y TM fusionado al dominio de señalización intracelular de zalfall - Los dominios extracelular y transmembranal del receptor MPL murino fueron aislados de un plásmido que contenía el receptor MPL murino (plásmido PHZl/MPL) utilizando PCR con los cebadores ZC17,212 (SEQ ID NO. 5) y ZC19,914 (SEQ ID NO. 6). Las condiciones de reacción fueron como sigue: 95°C por 1 minuto; 35 ciclos a 95°C por 1 minuto, 45°C por 1 minuto, 12 ° C por 2 minutos; seguido por 72 °C a 10 minutos; luego un remojo a 10 °C. El producto de PCR fue corrido sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% (Boerhinger Mannheim, Indianápolis, IN) y aproximadamente 1.5 kb del fragmento del receptor MPL se aisló utilizando el equipo de extracción en gel QuiaquickMR (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los dominios intracelulares de zalfall humano fueron aislados a partir de un plásmido que contenía el ADNc del receptor de zalfall, utilizando PCR con los cebadores ZC19,913 (SEQ ID NO. 8) y ZC20,097 (SEQ ID NO. 9) . La secuencia polinucleotídica correspondiente a la secuencia que codifica para el receptor de zalfall, es mostrada en la SEQ ID NO. 7, y la secuencia correspondiente de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 115. Las condiciones de reacción fueron como se describen anteriormente . El producto de PCR fue corrido sobre agarosa al 1% de bajo punto de fusión (Boerhinger Mannheim) y el fragmento de zalfall de aproximadamente 900 pares de bases se aisló utilizando el equipo de extracción en gel Qiaquick siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada uno de los fragmentos aislados descritos anteriormente fueron mezclados a una proporción volumétrica 1:1 y utilizados en una reacción de PCR utilizando ZC17,212 (SEQ ID NO. 5) y ZC20,097 (SEQ ID NO. 9) para crear la quimera MPL-zalfall. Las condiciones de reacción fueron como sigue: 95°C por 1 minuto; 35 ciclos a 95°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto, 72°C por 2 minutos; seguido por 72 °C a 10 minutos; luego un remojo a 10°C. El producto de PCR completo fue corrido sobre un gel de agarosa al 1% de bajo punto de fusión (Boehringer Mannheim) y un fragmento quimera de MPL-zalfall de aproximadamente 2.4 kb fue aislado utilizando el equipo de extracción de gel de Qiaquick (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento quimera MPL-zalfall fue digerido con EcoRI (BRL) y Xbal (Boerhinger Mannheim) siguiendo las instrucciones del fabricante. La digestión completa fue corrida sobre un gel de agarosa al 1% de bajo punto de fusión (Boerhinger Mannheim) y la quimera MPL-zalfall escindida fue aislada utilizando el equipo de extracción en gel Qiaquick^ (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La quimera MPL-zalfall escindida, resultante fue insertada dentro de un vector de expresión como se describe más adelante. El vector de expresión recipiente pZP-5N fue digerido con EcoRI (BRL) y HindIII (BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante, y purificado en gel como se describe anteriormente. Este fragmento vector fue combinado con la quimera MPL-zalfall escindida con EcoRI y Xbal, aislada anteriormente y un fragmento ligador Xbal/HindIII en una reacción de ligadura. La ligadura fue corrida utilizando la Ligasa T4 (BRL) , a 15°C toda la noche. Una muestra de la ligadura fue sometida a electroporesis dentro de células de E. coli electrocompetentes DH10B ElectroMAXMR (25 µF, 200O, 2.3 V).

Los transformantes fueron colocados en placa sobre placas de LB+Ampicilina y las colonias simples fueron seleccionadas por PCR para verificar la quimera MPL-zalfall utilizando ZC17,212 (SEQ ID NO. 5) Y ZC20,097 (SEQ ID NO. 9) utilizando las condiciones de PCR como se describen anteriormente . La confirmación de la secuencia quimera MPL-zalfall fue realizada mediante análisis secuenciales utilizando los siguientes cebadores: ZC12,700 (SEQ ID NO. 10), ZC5,020 (SEQ ID NO. 11), ZC6,675 (SEQ ID NO. 12), ZC7,727 (SEQ ID NO. 13), ZC8,290 (SEQ ID NO. 14), ZC19,572 (SEQ ID NO. 15), ZC6,622 (SEQ ID NO. 16), ZC7,736 (SEQ ID NO. 17), y ZC9,273 (SEQ ID NO. 18). El inserto fue aproximadamente de 2.4 pb, y fue de longitud completa.

Ejemplo 2 Proliferación basada en la quimera MPL-zalfall, en el ensayo de BAF3 utilizando Azul Alamar A. Construcción de las células BaF3 que Expresan la quimera MPL-zalfall BaF3, una línea de células prelinfoides dependientes de la interleucina 3 (IL-3) derivadas de médula ósea murina (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986) , fue mantenida en medio completo (medio RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) suplementado con 10% de suero fetal de ternera inactivado con calor, 2 ng/ml de IL-3 murina (mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN) , L-glutaMax-lMR 2 mM (Gibco BRL) , piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL) , y antibióticos P N (GIBCO BRL) ) . Antes de la electroporación, el ADN del plásmido de pZP-5N/MPL-zalfall (Ejemplo 1) fue preparado y purificado utilizando un Equipo Qiagen Maxi prep. (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células BaF3 para la electroporación fueron lavadas una vez en medio RPMI y luego resuspendidas en medio RPMI a una densidad celular de 107 células/ml. Un ml de las células Baf3 resuspendidas se mezcló con 30 µg de ADN plasmídico pZP-TN/MPL-zalfall y transferido a cámaras de electroporación desechables, separadas (GIBCO BRL) . Después de un periodo de incubación de 15 minutos a temperatura ambiente a las células se les administraron dos choques en serie (800 lFad/300 V.; 1180 lFad/300 V.) distribuidos por un aparato de electroporación (CELL-PORATORMR; GIBCO BRL) . Después de un tiempo de recuperación de 5 minutos, las células sometidas a electroporesis fueron transferidas a 50 ml de medio completo y colocadas en una incubadora por 15-24 horas (37°C, 5% de C02) . Las células fueron luego centrifugadas y resuspendidas en 50 ml de medio completo que contenía la selección GeneticinMR (Gibco) (500 µg/ml de G418) en un matraz T-162 para aislar el combinado resistente a G418. Los combinados de las células BaF3 transfectadas, de aquí en adelante denominadas células BaF3/MPL-zalfall, fueron evaluados para la capacidad de señalización como se describe más adelante.

B. Prueba de la capacidad de señalización de las células BaF3/MPL-zalfall utilizando un Ensayo de Proliferación con Azul Alamar Las células BaF3/MPL-zalfall fueron centrifugadas y lavadas en el medio completo, descrito anteriormente, pero sin mIL-3 (de aquí en adelante denominado como el "medio libre de mIL-3"). Las células fueron centrifugadas y lavadas 3 veces para asegurar la eliminación de la mIL-3. Las células fueron luego contadas en un hemocitómetro. Las células fueron sembradas en placa en un formato de 96 pozos a 5000 células por pozo en un volumen de 100 µl por pozo utilizando el medio libre de mIL-3. La proliferación de las células BaF3/MPL-zalfall fue evaluada utilizando la trombopoyetina murina (mTPO) diluida con el medio libre de mIL-3 a concentraciones de 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125/ml, 62 ng/ml, 30 ng/ml, 15 ng/ml, 7.5 ng/ml, 3.75 ng/ml, 1.8 ng/ml, 0.9 ng/ml, 0.5 ng/ml y 0.25 ng/ml. 100 µl de la mTPO diluida se agregaron a las células BaF3/MPL-zalf ll . El volumen de ensayo total es de 200 µl. Los controles negativos fueron corridos en paralelo utilizando los medios libres de mIL-3 únicamente, sin la adición de mTPO. Las placas de ensayo fueron incubadas a 37°C, 5% de C02 por 3 días tiempo en el cual se agregó Azul Alamar (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pozo. El Azul Alamar da una lectura fluorométrica basada en la actividad metabólica de las células, y es de este modo una medición directa de la proliferación celular en comparación a un control negativo. Las placas fueron nuevamente incubadas a 37°C, 5% de C02 por 24 horas. Las placas fueron leídas sobre el lector de placas FmaxMR (Moleuclar Devices Sunnyvale, CA) utilizando el programa SoftMAXMR Pro, a longitudes de onda de 544 (Excitación) y 590 (Emisión) . Los resultados confirmaron la capacidad de señalización de la porción intracelular del receptor de zalfall, ya que la trombopoyetina indujo la proliferación aproximadamente 10 veces sobre el antecedente a concentraciones de mTPO de 62 ng/ml y mayores.

Ejemplo 3 Construcción del vector de expresión que expresa zalfall de longitud completa El receptor de zalfall completo fue aislado de un plásmido que contenía el ADNc del receptor de zalfall (SEQ ID NO. 7) utilizando PCR con los cebadores ZC19,905 (SEQ ID NO. 19) y ZC19,906 (SEQ ID NO. 20). Las condiciones de reacción fueron como sigue: 95°C por 1 minuto; 35 ciclos a 95°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto, 72°C por 2 minutos; seguido por 72 °C a 10 minutos; luego un remojo a 10°C. El producto de PCR fue corrido sobre un gel de agarosa al 1% de bajo punto de fusión (Boerhinger Mannheim) y el ADNc de zalfall de aproximadamente 1.5 kb fue aislado utilizando el equipo de extracción en gel QiaquickMR (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc de zalfall purificado fue digerido con BamHl (Boerhinger Mannheim) y EcoRI (BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante. La digestión completa fue corrida sobre un gel de agarosa al 1% de bajo punto de fusión (Boerhinger Mannheim) y el fragmento zalfall escindido fue purificado utilizando el equipo de extracción en gel QiaquickMR siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento zaflall escindido, resultante fue insertado dentro de un vector de expresión como se describe más adelante . El vector de expresión recipiente pZP-5N fue digerido con BamHl (Boerhinger Mannheim) y EcoRI (BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante, y purificado en gel como se describe anteriormente. Este fragmento vector fue combinado con el fragmento de zalfall escindido con BamHl y EcpRI, aislado anteriormente en una reacción de ligadura utilizando la Ligasa T4 (BRL) . La ligadura fue incubada a 15°C toda la noche. Una muestra de la ligadura fue sometida a electroporesis en células de E. coli electrocompetentes DH10B electroMAXMR (25 µF, 200O, 2.3 V). Los transformantes fueron sembrados en placa sobre placas de LB+Ampicilina y las colonias simples seleccionadas mediante PCR para verificar la secuencia zalfall utilizando ZC19,905 (SEQ ID NO. 19) y ZC19,906 (SEQ ID NO. 20) utilizando las condiciones de PCR como se describen anteriormente . La confirmación de la secuencia de zalfall fue realizada mediante análisis secuenciales utilizando los siguientes cebadores: ZC12,700 (SEQ ID NO. 10), ZC5,020 (SEQ ID NO. 11), ZC20,114 (SEQ ID NO. 21), ZC19,459 (SEQ ID NO. 22), ZC19,954 (SEQ ID NO. 23), y ZC20,116 (SEQ ID NO. 24). El inserto fue de aproximadamente 1.6 kb y fue de longitud completa.

Ejemplo 4 Proliferación basada en zalfall en el ensayo de BAF3 utilizando Azul Alamar A. Construcción de Células BaF3 que Expresan el receptor de alfall Las células BaF3 que expresan el receptor de zalfall de longitud completa fueron construidas como en el Ejemplo 2A anterior, utilizando 30 µg del vector de expresión de zalfall, descrito en el Ejemplo 3 anterior. Las células BaF3 que expresan el APNm del receptor de zalfall fueron designadas como BaF3/zalfall . Estas células fueron utilizadas para seleccionar el Ligando zalfall como se describe más adelante en los Ejemplos 5 y 6.

Ejemplo 5 Selección para el Ligando zalfall utilizando las células BaF3/zalfall usando un Ensayo de Proliferación con Azul Alamar A. Activación de Esplenocitos Primarios de Mono para probar la presencia del Ligando zalfall Esplenocitos de mono fueron estimulados in vi tro para producir medios condicionados para probar la presencia de la actividad del Ligando zalfall como se describe más adelante. Los bazos de mono fueron obtenidos de monos M. nesestrian hembras, de 8 años de edad. Los bazos fueron desintegrados para producir una suspensión de células simples. Las células mononucleares fueron aisladas mediante gradiente de densidad Ficoll-Paque® PLUS (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) . Las células mononucleares fueron sembradas a 2 x 106 células/ml en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS y activado con 5 ng/ml de forbol-12-miristato-13 -acetato (PMA) (Calbiochem, San Diego, CA) , y 0.5 mg/ml de IonomycinR (Calbiochem) por 48 horas. El sobrenadante de las células de bazo de mono, estimuladas, fue utilizado para evaluar la proliferación de las células BaF3/zalfall como se describe más adelante.

B. Selección para el Ligando zalfall utilizando células BaF3/zalfall utilizando un Ensayo de Proliferación con Azul Alamar Las células BaF3/zalfall fueron centrifugadas y lavadas en medio libre de mIL-3. Las células fueron centrifugadas y lavadas 3 veces para asegurar la eliminación de la mIL-3. Las células fueron luego contadas en un hemocitómetro . Las células fueron sembradas en placa en un formato de 96 pozos a 5000 células por pozo en un volumen de 100 µl por pozo utilizando medios libres de mlL-3. La proliferación de las células BaF3/zalfall fue evaluada, utilizando medios condicionados provenientes de bazo activado de mono (ver Ejemplo 5A) . El medio condicionado fue diluido con medio libre de mlL-3 a concentraciones de 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% y 0.375%. 100 µl del medio condicionado diluido fueron agregados a las células BaF3/zalfall . El volumen de ensayo total es de 200 µl . Las placas de ensayo fueron incubadas a 37°C, 5% de C02 por 3 días tiempo en el cual se agregó Azul Alamar (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pozo. Las placas fueron nuevamente incubadas a 37°C, 5% de C02 por 24 horas. Las placas fueron leídas sobre un lector de placas Fmax™ (Molecular devices) como se describe anteriormente (Ejemplo 2) . Los resultados confirmaron la respuesta proliferativa de las células BaF3/zalfall a un factor presente en los medios condicionados de bazo activado de mono. La respuesta, como se midió, fue aproximadamente 4 veces superior al antecedente a la concentración de 50%. Las células BaF3 no transfectadas no proliferaron en respuesta a este factor, mostrando que este factor es específico para el receptor de zalfall.

C. Fuente * Primaria Humana utilizada para aislar el Ligando zalfall Se tomaron extracciones de sangre de 100 ml de cada uno de seis donadores. La sangre fue extraída utilizando 10 tubos Vacutainer® de 10 ml que contenían heparina. La sangre fue combinada de seis donadores (600 ml) , diluida 1:1 en PBS, y separada utilizando Ficol-Paque® PLUS (Pharmacia Biotech.). El rendimiento de las células humanas primarias aisladas, después de la separación sobre el gradiente de ficoll, fue de 1.2 x 109 células. Las células fueron suspendidas en 9.6 ml de amortiguador MACS (PBS, 0.5% de EDTA, EDTA 2 mM) . 1.6 ml de suspensión celular fueron retirados y se agregaron 0.4 ml de microesferas CD3 (Miltenyi biotec, Auburn, CA) . La mezcla fue incubada por 15 minutos a 4°C. Estas células marcadas con esferas de CD3 fueron lavadas con 30 ml de amortiguador MACS y luego resuspendidas en 2 ml de amortiguador MACS . Una columna VS+ (Miltenyi) fue preparada de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La columna VS+ fue luego colocada sobre un campo magnético VarioMACSMR (Miltenyi) . La columna fue equilibrada con 5 ml de amortiguador MACS. Las células humanas primarias aisladas fueron luego aplicadas a la columna. Las células negativas a CD3 se dejaron pasar de lado a lado. La columna fue enjuagada con 9 ml de amortiguador MACS (3 x 3 ml) . La columna fue luego removida del imán y colocada sobre un tubo falcon de 15 ml. Las células positivas a CD3+ fueron eluidas mediante la adición de 5 ml de amortiguador MACS a la columna, y las células enlazadas fueron extraídas utilizando el émbolo proporcionado por el fabricante. La incubación de las células con las esferas magnéticas CD3 , lavados, y los pasos de la columna VS+ (incubación hasta la elusión) anteriores, fueron repetidos cinco veces más. Las fracciones CD3+ resultantes provenientes de seis separaciones de columna fueron combinadas . El rendimiento de las células humanas seleccionadas por CD3+ fue de 3 x 108 células totales. Una muestra de las células humanas seleccionadas por CD3+ combinadas, fue retirada para la tinción y clasificación sobre un clasificador de células por anticuerpo fluorescente (FACS) para evaluar su pureza. Las células seleccionadas CD3+ humanas fueron 91% células CD3+. Las células seleccionadas CD3+ humanas fueron activadas mediante la incubación en RPMI + 5% de FBS + 10 ng/ml de PMA y Ionomicina 0.5 µg/ml (Calbiochem) por 13 horas a 37°C. El sobrenadante proveniente de estas células humanas seleccionadas por CD3+, activadas, fue probado para la actividad del Ligando zalfall como se describe más adelante. Además, las células humanas seleccionadas por CD3+, activadas, fueron utilizadas para preparar una genoteca de ADNc, como se describe en el Ejemplo 6 más adelante .

D. Prueba del sobrenadante proveniente de células humanas seleccinadas por CD3+ activadas, para el Ligando zalfall utilizando las células BaF3/zalfall y un Ensayo de Proliferación con Azul Alamar Las células BaF3/zalfall fueron centrifugadas y lavadas en medio libre de mIL-3. Las células fueron centrifugadas y lavadas 3 veces para asegurar la eliminación de mIL-3. Las células fueron luego contadas en un hemocitómetro. Las células fueron sembradas en placa en un formato de 96 pozos a 5000 células por pozo en un volumen de 100 µl por pozo utilizando el medio libre de mlL-3. La proliferación de las células BaF3/zalfall fue evaluada utilizando medios condicionados a partir de células humanas seleccionadas por CD3+, activadas (ver Ejemplo 5C) diluidas con medio libre de mIL-3 a concentraciones de 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% y 0.375%. 100 µl del medio condicionado diluido fueron agregados a las células BaF3/zalfall . El volumen de ensayo total es de 200 µl . Las placas de ensayo fueron incubadas y evaluadas como se describe en el Ejemplo 5B . Los resultados confirmaron la respuesta proliferativa de las células BaF3/zalfall a un factor presente en el medio condicionado de células humanas seleccionadas por CD3+, activadas. La respuesta, como se mide, fue aproximadamente 10 veces mayor al antecedente a la concentración de 50%. Las células BaF3 no transfectadas no proliferaron en respuesta a este factor, mostrando que este factor es específico para el receptor de zalfall. Además, el receptor de zalfall soluble bloqueó esta actividad proliferativa en las células BaF3/zalfall (ver, Ejemplo 11) .

Ejemplo 6 Clonación del Ligando zalfall humano a partir de una Genoteca de células seleccionadas por CD3+, humanas La selección de una genoteca de ADNc de células seleccionadas con CD3+, activadas, humanas, primarias, reveló un ADNc aislado que es un nuevo miembro de la familia de citocinas de cúmulo de cuatro hélices. Este ADNc codificó para el Ligando zalfall. El ADNc fue identificado mediante selección para la actividad del Ligando zalfall utilizando el receptor de zalfall.

A. El vector para la construcción de la genoteca seleccionada por CD3+ El vector para la construcción de la genoteca seleccionada por CD3+ fue pZP7NX. El vector pZP7NX fue construida como sigue: La región de codificación para el marcador selectivo DHFR en el vector pZP7 fue removida mediante digestión de ADN con las enzimas de restricción Ncol y PstI (Boehringer Mannheim) . El ADN digerido fue corrido sobre un gel de agarosa al 1%, cortado y purificado en gel utilizando el Equipo de Extracción en Gel Qiagen (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Un fragmento de ADN que representa la región de codificación del marcador selectivo Zeocina fue amplificado mediante el método de PCR con los cebadores ZC13,946 (SEQ ID NO. 25) y ZC13,945 (SEQ ID NO. 26), y pZeoSV2 (+) como una plantilla. Existen sitios de restricción PstI y Bell adicionales en el cebador ZC13,946 (SEQ ID NO. 25), y sitios Ncol y Sful adicinales en el cebador ZC13,945 (SEQ ID NO. 26). El fragmento de PCR fue cortado con las enzimas de restricción PstI y Ncol y clonado dentro del vector pZP7 preparado mediante la escisión con las mismas dos enzimas y la purificación subsecuente en gel. Este vector fue llamado pZP7Z. Posteriormente la región de codificación de la Zeocina fue removida mediante digestión del ADN del pZP7Z vector con las enzimas de restricción Bell y Sful. El ADN digerido fue corrido sobre un gel de agarosa al 1%, cortado y purificado en gel, y luego ligado con un fragmento de ADN de la región de codificación de la Neomicina cortado a partir del vector pZem228 (depositado en la Colección Norteamericana de Cultivo de Especies (American Type Culture Collection), Manassas, VA; ATCC Depósito No. 69446 con las mismas enzimas de restricción (Bell y Sful) . Este nuevo vector fue llamado pZP7N, en el cual la región de codificación para el marcador selectivo de DHFR fue reemplazado por la región de codificación por un marcador selectivo de Neomicina provenientes del vector pZem228. Un fragmento rellenador que incluye un sitio Xhol fue agregado a pZP7N para crear un vector adecuado para la clonación direccional de alta eficiencia de ADNc; este nuevo vector fue llamado pZP7NX. Para preparar el vector para el ADNc, se digirieron 20 µg de pZP7NX con 20 unidades de EcoRI (Life Technologies Gaithersberg, MD) y 20 unidades de Xhol (Boehringer Mannheim Indianápolis, IN) por 5 horas a 37°C, luego a 68 °C por 15 minutos. La digestión fue luego corrida sobre un gel de agarosa al 0.8% de bajo punto de fusión, 1XTAE para separar el rellenador del vector. La banda del vector fue extirpada y digerida con "beta-Agarasa" (New England Biolabs, Beverly, MA) siguiendo las instruccines del fabricante. Después de la precipitación con etanol el vector digerido fue resuspendido en agua a 45 ng/ml en la preparación para la levadura de la genoteca de ADNc seleccionada por CD3+, descrita más adelante.

B. Preparación de la genoteca de ADNc de células seleccionadas por CD3+, activadas, humanas, primarias Aproximadamente 1.5 x 10 células seleccionadas por CD3+, humanas, primarias, estimuladas en ionomicina/PMA fueron aisladas mediante centrifugación después del cultivo a 37°C por 13 horas (Ejemplo 5C) . El ARN total, aislado del botón celular utilizando el equipo "RNeasy Midi" de Qiagen, Inc. (Valencia, CA) . El ARNm fue aislado de 225 microgramos del ARN total utilizando el "equipo de purificación de AR?m, MPG" de CPG Inc. (Lincoln Park, ?J) . 3.4 microgramos del AR?m se aislaron y se convirtieron al AD?c de doble hebra utilizando el siguiente procedimiento. El AD?c de la primera hebra proveniente de las células seleccionadas por CD3+ humanas, estimuladas, fue sintetizado como sigue. Nueve µl del ARNm de CD3+ poli (A) seleccionado por el Oligo d(T) a una concentración de 0.34 µg/µl y 1.0 µl del cebador de primera hebra ZC18,698 (SEQ ID NO. 27) a 1 µg/µl que contenía un sitio de restricción Xhol se mezclaron y se calentaron a 65 °C por 4 minutos y se enfriaron mediante enfriamiento sobre hielo. La síntesis del ADNc de la primera hebra fue iniciada por la adición de 9 µl del amortiguador de primer hebra (amortiguador 5x SUPERSCRIPT®; (Life Technologies) , 4 µl de ditiotreitol 10 mM y 2 µl de una solución de trifosfato de desoxinucleótido que contenía 10 mM de cada uno de dATP, dGTP, dTTP y 5-metil-dCTP (Pharmacia Biotech Inc.) a la mezcla de ARN-cebador. La mezcla de reacción fue incubada a 45°C por 4 minutos seguido por la adición de 8 µl de la transcriptasa inversa ARNasa H SuperscriptII® a 200 U/µl, (Life Technologies) . La reacción se incubó a 45°C por 45 minutos seguido por una incubación con elevación de 1°C cada 2 minutos a 50°C, donde la reacción fue mantenida por 10 minutos. Para desnaturalizar cualquier estructura secundaria y permitir la extensión adicional del ADNc, la reacción fue luego calentada a 70°C por 2 minutos y luego disminuida a 55°C por 4 minutos después de lo cual se agregaron 2 µl de la transcriptasa inversa SuperscriptII® y se incubó por 15 minutos adicionales seguido por una elevación hasta 70°C 1 minuto/l°C. Los nucleótidos no incorporados fueron removidos del ADNc mediante la precipitación dos veces en presencia de 2 µg del portador de glucógeno, acetato de amonio 2.0 M y 2.5 volúmenes de etanol, seguido por un lavado de 100 µl con etanol al 70%. El ADNc fue resuspendido en 98 µl de agua para el uso en la síntesis de la segunda hebra. La síntesis de la segunda hebra fue realizada sobre el ADNc de la primera hebra bajo condiciones que promovieron la cebadura de la primera hebra de la síntesis de la segunda hebra, dando como resultado la formación de la Horquilla de ADN. La reacción de la segunda hebra contenía 98 µl del ADNc de la primera hebra, 30 µl del amortiguador de la polimerasa I 5x (Tris-HCl 100 mM, pH 7.5, cloruro de potasio 500 mM, cloruro de magnesio 25 mM, sulfato de amonio 50 mM, 2 µl de ditiotreitol 100 mM, 6 µl de una solución que contenía 10 mM de cada uno de los trifosfatos de desoxinucleótido, 5 µl de b-NAD 5 mM, 1 µl de la ADN-ligasa de E. coli a 3 U/µl (New England Biolabs Inc.) y 4 µl de la ADN-polimerasa I de E. coli a 10 U/µl (New England Biolabs Inc.) . La reacción fue llevada a cabo a temperatura ambiente y se incubó a temperatura ambiente por 2 minutos, seguido por la adición de 4 µl de la ARNasa H a 3.8 µ/µl (Life Technologies) . La reacción fue incubada a 15°C por 2 horas, seguido por una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. 10 µl de Tris 1M pH 7.4 se agregaron a la reacción y se extrajeron dos veces con fenol/cloroformo y una vez con cloroformo, las fases orgánicas fueron luego nuevamente extraídas con 50 µl de TE (Tris 10 mM pH 7.4, EDTA 1 mM) , se combinaron con el otro precipitado acuoso y etanólico en presencia de acetato de sodio 0.3 M. El botón fue lavado con 100 µl de etanol al 70%, secado al aire y resuspendido en 40 µl de agua. El ADN de una sola hebra de la estructura de horquilla fue escindido utilizando la nucleasa de frijol mung. La mezcla de reacción contenía 40 µl del ADNc de segunda hebra, 5 µl de amortiguador de nucleasa de frijol mung lOx (Life Technologies) , 5 µl de nucleasa de frijol mung (Pharmacia Biotech Corp.) diluido a 1 U/µl en amortiguador de nucleasa de frijol mung IX. La reacción se incubó a 37°C por 45 minutos. La reacción se terminó mediante la adición de 10 11 de Tris: HCl 1M, pH 7.4 seguido por extracciones secuenciales con fenol/cloroformo y con cloroformo como se describe anteriormente. Después de las extracciones, el ADNc fue precipitado con etanol en presencia de acetato de sodio 0.3 M. El botón o concentrado fue lavado con 100 µl de etanol al 70%, secado al aire y resuspendido en 38 µl de agua. El ADNc resuspendido fue enromado en el extremo con ADN-polimerasa T4. El ADNc, el cual fue resuspendido en 38 µl de agua, fue mezclado con 12 µl de amortiguador de ADN-polimerasa T4 5x (Tris: HCl 250 mM, pH 8.0, cloruro de potasio 250 mM, cloruro de magnesio 25 mM) , 2 µl de ditiotreitol 0.1 M, 6 µl de una solución que contenía 10 mM de cada trifosfato de desoxinucleótido y 2 µl de la ADN-polimerasa T4 a 1 U/µl (Boehringer Mannheim Corp.). Después de una incubación de 45 minutos a 15°C, la reacción fue terminada por la adición de 30 Ul de TE, seguido por las extracciones secuenciales con fenol/cloroformo y cloroformo, y extraídas nuevamente con 20 µl de TE como se describe anteriormente. El ADN fue precipitado con etanol en presencia de 2 µl de portador Pellet PaintMR (Novagen) y acetato de sodio 0.3 M y se resuspendió en 11 µl de agua. Los adaptadores EcoRI fueron ligados sobre los extremos 5 ' del ADNc descrito anteriormente para hacer posible la clonación dentro de un vector de expresión. 11 µl del ADNc y 4 µl de 65 pmol/µl de adaptador hemifosforilado de EcoRI (Pharmacia Biotech Corp.) fueron mezclados con 5 µl de amortiguador de ligasa 5x (Life Technologies) , 2 µl de ATP 10 mM y 3 µl de ADN-ligasa T4 1 µl (Life Technologies) , 1 µl de amortiguador de ligadura 10X (Promega Corp.), 9 µl de agua. La dilución extra con amortiguador IX fue para prevenir que el Pellet Paint precipitara. La reacción se incubó 9 horas en un baño de agua a temperatura cada vez mayor desde 10°C a 22°C en 9 horas, seguido por 45 minutos a 25°C. La reacción se terminó mediante la incubación a 68°C por 15 minutos.

Para facilitar la clonación direccional del ADNc dentro de un vector de expresión, el ADNc fue digerido con Xhol, dando como resultado un ADNc que tenía un extremo cohesivo EcoRI 5' y un extremo cohesivo Xhol 3'. El sitio de restricción Xhol en el extremo 3' del ADNc había sido previamente introducido utilizando el cebador ZC18698 (SEQ ID No. 27) . La digestión por la enzima de restricción se llevó a cabo en una mezcla de reacción que contenía 35 µl de la mezcla de ligadura descrita anteriormente, 6 µl del amortiguador H lOx (Boehringer Mannheim Corp.), 1 µl de BSA a 2 mg/ml (Biolabs Corp.), 17 µl de agua y 1.0 µl de Xhol a 40 U/µl (Boehringer Mannheim) . La digestión se llevó a cabo a 37°C por 1 hora. La reacción se terminó mediante la incubación a 68 °C por 15 minutos, seguido por precipitación con etanol, lavado, secado como se describe anteriormente, y resuspensión en 30 µl de agua. El ADNc resuspendido fue calentado a 65°C por 5 minutos y enfriado sobre hielo, se agregaron 4 µl del colorante de carga en gel 5X (Research Genetics Corp.), el ADNc fue cargado sobre un gel TAE IX de agarosa de bajo punto de fusión al 0.8% (agarosa de bajo punto de fusión SEA PLAQUE GTG^; FMC Corp.) y sometido a electroforesis. Los adaptadores contaminantes y el ADNc por debajo de 0.6 Kb de longitud fueron extirpados del gel . Los electrodos fueron invertidos, la agarosa fundida fue agregada para rellenar los pozos, el amortiguador fue cambiado y el ADNc fue sometido a electroforesis hasta que se concentró cerca del origen de la banda. El área del gen que contenía el ADNc concentrado fue extirpada y colocada en un tubo para microcentrífuga, y la agarosa fue fundida mediante calentamiento a 65°C por 15 minutos. Después del equilibrio de la muestra a 45 °C, se agregaron 2 µl de la beta-agarasa I a 1 U/µl (Biolabs, Inc.), y la mezcla se incubó por 90 minutos a 45°C para digerir la agarosa. Después de la incubación, 1 décimo del volumen del acetato de sodio 3M fue agregado a la muestra, y la mezcla fue incubada sobre hielo por 15 minutos. La muestra fue centrifugada a 14,000 x g por 15 minutos a temperatura ambiente para remover la agarosa no digerida, el ADNc fue precipitado con etanol, lavado en etanol al 70%, secado al aire y resuspendido en 40 µl de agua. Para determinar la proporción óptima del ADNc al vector, varias ligaduras fueron ensambladas y sometidas a electroporesis. En resumen, 2 µl amortiguador de ligasa T4 5X (Life Technologies) , 1 µl de ATP 10 mM, 1 µl de pZP7NX digerido con EcoRI-Xhol, 1 11 de ADN-ligasa T4 diluida a 0.25 U/µl (Life Technologies) agua a 10 µl y 0.5, 1.2 ó 3 µl de ADNc, fueron mezclados en 4 ligaduras separadas, incubados a 22°C por 4 horas, a 68°C por 20 minutos, precipitados con acetato de sodio-etanol, lavados, secados y resuspendidos en 10 11. Un microlitro simple de cada ligadura fue sometido a electroporesis en 40 µl de bacterias electrocompetentes DHlOb ElectroMaxMR (Life Technologies) utilizando una cubeta de 0.1 cm (Biorad) y un controlador de pulso GenepulserMR (Biorad) ajustado a 2.5 KV, 251F, 200 ohmios. Estas células fueron inmediatamente resuspendidas en 1 ml de caldo SOC (Manniatis et al . supra) seguido por 500 11 de glicerol al 50%-SOC como un conservador. Estas "reservas de glicerol" fueron congeladas en varias alícuotas a -70°C. Una alícuota de cada uno fue descongelada y colocada en placa en serie sobre placas de agar LB suplementadas con ampicilina a 100 µg/ml . Los números de las colonias indicaron que la proporción óptima del ADNc CD3+ al vector pZP7NX fue de 1 µl a 45 ng; tal ligadura produjo 4.5 millones de clones primarios . Para fines de seleccionar esta genoteca utilizando un ensayo de proliferación basado en BaF3-zalfall (Ejemplo 5) reservas de glicerol descritas anteriormente fueron diluidas en cultivos líquidos de 100 ó 250 clones por combinado, en placas de microtitulación de pozo profundo, desarrolladas 24 horas a 37°C con agitación y el plásmido se aisló utilizando un equipo Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante. Tal ADN fue subsecuentemente transfectado dentro de las células BHK, el medio se acondicionó 72 horas, se cosechó y se colocó sobre células BaF3-zalfall 5K por 72 horas después de lo cual la proliferación fue evaluada utilizando un ensayo de fluorescencia de "Azul Alamar" (Ejemplo 5B y Ejemplo 2B) . Para fines de seleccionar la genoteca mediante clonación por trampa de secreción, una forma amplificada, compleja de la genoteca fue necesaria para transfectar las células COS-7. Aproximadamente 4.8 millones de clones fueron sembrados en placa sobre 110 placas con agar LB de 15 cm, suplementado con 100 µg/ml de ampicilina, 10 µg/ml de meticilina. Después de desarrollar las placas toda la noche a 37°C, las bacterias fueron cosechadas mediante raspado y centrifugadas. El ADN plasmídico fue extraído de las bacterias concentradas utilizando un Nucleobond-giga^ (Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este plásmido fue luego utilizado para transfectar las células COS-7 (ATCC No. CRL 1651) sobre portaobj etivo y seleccionado utilizando la técnica de trampa de secreción descrita más adelante (Ejemplo 12) .

Ejemplo 7 Clonación de Expresión del Ligando zalfall humano Las reservas en glicerol provenientes de la genoteca celular seleccionada por CD3+, humana, activada (Ejemplo 6) fueron agregadas al Caldo Super IIMR (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) + 0.1 mg/ml de ampicilina (amp) a una concentración de 250 células por 800 mícrolitros. Las células de E. coli se dejaron equilibrar por 24 horas a temperatura ambiente. Al tiempo de la inoculación, se sembraron en placa 400 microlitros sobre placas LB + amp para determinar el título efectivo de la inoculación. Después de 24 horas las placas fueron contadas y luego la concentración final del Super BrothIIMR + E. coli fue ajustada de modo que la concentración final fuera de 250 células por 1.2 ml . Tres veces 2 litros fueron inoculados para un total de 6 litros. Los medios fueron luego sembrados en placa sobre bloques de pozo profundo de 96 pozos (Qiagen) . La colocación en placa fue realizada sobre el surtidor Q-Fill2MR de 8 canales (Genetix, Christchurch, Dorset, UK) . Las células de E. coli fueron desarrolladas toda la noche a 37°C agitando a 250 rpm sobre un agitador ambiental New Brunswick Scientific Innova 4900 multi -tier. Las células de E. coli fueron centrifugadas de la solución a 3000 rpm, utilizando una centrífuga Beckman GS-6KR. Estos botones de E. coli fueron congelados a -20°C o utilizados frescos antes de la minipreparación del ADN plasmídico. Cada botón contiene aproximadamente 250 clones de ADNc provenientes de la genoteca de células seleccionadas por CD3+.

Estos combinados de 250 clones de ADNc fueron luego minipreparados utilizando el equipo QIAprepMR 96 Turbo Miniprep (Qiagen) . El ADN plasmídico fue eluido utilizando 125 µl de TE (Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM) . Este ADN plasmídico fue luego utilizado para transfectar las células BHK.

Transfección de BHK Las células de BHK fueron sembradas en placa en placas de cultivo de tejido de 96 pozos a una densidad de 12,000 células por pozo en un volumen de 100 µl por pozo. El medio de cultivo fue DMEM (Gibco/BRL) , 5% de suero fetal bovino inactivado por calor, L-glutamina 2 mM (Gibco/BRL) , IX de PSN (Gibco/BRL) , piruvato de sodio 1 mM (Gibco/BRL) . Al siguiente día, las células BHK fueron lavadas una vez con 100 µl de SFA. SFA es medio libre de suero el cual es DMEM/F12 (Gibco/BRL) , GutaMaxMR 2 mM (Gibco/BRL) , piruvato de sodio 1 mM, 10 µg/ml de transferrina, 5 µg/ml de insulina, 10 µg/ml de fetuina, 2 µg/ml de selenio, HEPES 25 mM (Gibco/BRL) , aminoácidos no esenciales 100 µM (Gibco/BRL) . Se realizó una mezcla de ADN/LipofectamineMR como sigue: se combinaron 2.2 µl de reactivo LipofectamineMR (Gibco/BRL) con 102.8 µl de SFA a temperatura ambiente; aproximadamente 5 µl del ADN plasmídico (20 ng/µl) se agregaron luego a LipofectamineMR/SFA para formar la mezcla de ADN/LipofectamineMR, que se incuba a temperatura ambiente por 30 minutos. El SFA fue removido de las células BHK y las células fueron incubadas con 50 µl de la mezcla ADN/LipofectamineMR por 5 horas a 37°C con 5% de C02. Cinco µl de la mezcla de ADN/LipofectamineMR se agregaron a cada uno de dos pozos de las células BHK, de modo que las transfecciones fueron realizadas por duplicado. Después de que las células BHK fueron incubadas con la mezcla de ADN/LipofectamineMR por 5 horas, la mezcla de ADN/LipofectamineMR fue retirada y se agregaron 100 µl de medio de cultivo. Las células fueron incubadas toda la noche, el medio fue retirado y reemplazado con 100 µl de medio de cultivo. Después del cultivo de las células por 72 horas, se eliminó el medio condicionado, se congeló a -80°C por un mínimo de 20 minutos, se descongeló y luego se evaluaron 50 µl en el ensayo de proliferación de zalfall/BaF3 , descrito en el Ejemplo 2B y Ejemplo 5, para identificar los combinados de 250 clones con actividad de ligando. Treinta y cinco placas de 96 pozos fueron seleccionadas en un ensayo simple. Esto representó aproximadamente 250 ADNcs/pozo o 840,000 ADNcs total. De estos, el medio condicionado proveniente de 54 pozos (representando 250 ADNcs por pozo) probó ser positivo en el ensayo de proliferación. El medio condicionado proveniente de estos combinados positivos fue probado nuevamente en un segundo ensayo (trampa de secreción) con y sin el receptor soluble (ver, Ejemplo 12) . El receptor soluble zalfallCEE (Ejemplo 10A) fue utilizado a una concentración final de aproximadamente 1 µg/ml. Para los 54 combinados positivos, esencialmente toda la actividad fue neutralizada mediante la adición del receptor zalfall soluble, indicando que estos combinados contenían un ADNc proveniente del Ligando zalfall. Cuatro de estos combinados positivos fueron elegidos para romper y aislar un ADNc simple que pudiera codificar para el Ligando zalfall. Estos fueron 45C5, 46G11, 40H12, y 60A1. Para cada uno de estos 4 combinados, se utilizó 1 µl de ADN para transformar las células ElectroMaxMR DH10B (Gibco/BRL) , mediante electroporación. Los transformantes fueron sembrados en placa sobre placas de LB + amp (100 µg/ml) + meticilina (10 µg/ml) para dar colonias simples. Para cada combinado sometido a electroporesis, 960 colonias individuales fueron transportados con la punta de un palillo a diez placas de 96 pozos que contenían 1.2 ml de SuperBrothIIMR por pozo. Estas placas fueron numeradas #1-10 para cada uno de los combinados de rompimiento (45C5, 46G11, 40H12 y 60A1) . Estos fueron cultivados toda la noche y el ADN plasmídico se minipreparó como se describe anteriormente. Para 46G11, 40H12 y 60A1, el ADN plasmídico proveniente de las placas de rompimiento fue transfectado dentro de células BHK como se describe anteriormente. Para 45 C5, se utilizó un protocolo "rastreo rápido" (fast track) para acelerar la identificación del ADNc del Ligando zalfall. Las células BHK fueron transfectadas con el ADN plasmídico a partir de las placas de rompimiento como se describe anteriormente, la mezcla de ADN/LipofectamineMR fue retirada después de una incubación de 5 horas, y se agregó medio de cultivo. Ya que las transfecciones fueron realizadas por duplicado, el medio de cultivo fue cosechado al siguiente día después de 24 horas de una de las placas BHK transfectadas, y cosechado al día siguiente después de 48 horas de la placa transfectada remanente. El medio condicionado de 24 horas fue evaluado como se describe anteriormente para la actividad del Ligando zalfall utilizando el ensayo de proliferación como se describe en la presente. El ADN plasmídico fue combinado a partir de las placas de rompimiento 45C5 #1-4 y evaluado para el enlace del receptor soluble de zalfall a su ligando mediante el protocolo de "trampa de secreción" (ver, Ejemplo 12, siguiente) . Ocho clones positivos fueron identificados a partir de un total de 384 secuencias. Los resultados del ensayo de proliferación confirmaron la actividad del Ligando zalfall y correlacionaron con los resultados del ensayo de trampa de secreción (ver Ejemplo 12) . Concurrentemente, el ADN plasmídico minipreparado a partir de las placas #1-4 del rompimiento del combinado 45C5 fue secuenciado para determinar la secuencia de ADN de cada uno de los 384 clones. Varios clones que fueron positivamente identificados en los ensayos de proliferación y trampa de secreción fueron también secuenciados utilizando los siguientes cebadores: ZC14,063 (SEQ ID No. 28), ZC7,764a (SEQ ID No. 38), ZC7,764b (SEQ ID No. 39), ZC22,034 (SEQ ID No. 40), y ZC22,035 (SEQ ID No. 41). La secuencia polinucleotídica del Ligando zalfall fue de longitud completa (SEQ ID No. 1) y su secuencia correspondiente de aminoácidos es mostrada (SEQ ID No. 2.

Ej emplo 8 Construcción de vectores de expresión en mamífero que expresan los receptores solubles de zalfall: zalfallCEE, zalfallCFLG, zalfallCHIS y zalfall-Fc4 Construcción del Vector de Expresión de Mamífero zalfall, que contiene zalfallCEE, zalfallCFLG y zalfallCHIS Se preparó un vector de expresión para la expresión del dominio extracelular soluble del polipéptido zalfall, pC4zalfallCEE, en donde la construcción es diseñada para expresar un polipéptido zalfall comprendido de la metionina inicial predicha, y truncada adyacente al dominio transmembranal predicho, y con una etiqueta Glu-Glu C-terminal (SEQ ID No . 29) . Un fragmento de ADN de zalfall generado por PCR, de 700 pares de bases fue creado utilizando ZC19,931 (SEQ ID No. 30) y ZC19,932 (SEQ ID No . 31) como cebadores de PCR para agregar los sitios de restricción Asp718 y BamHl. Un plásmido que contenía el ADNc del receptor zalfall (SEQ ID No. 7) fue utilizado como una plantilla. La amplificación por PCR del fragmento zalfall fue realizada como sigue: Veinticinco ciclos a 94°C por 0.5 minutos; cinco ciclos a 94 °C por 10 segundos, 50 °C por 30 segundos, 68 °C por 45 segundos, seguido por una retención a 4°C. La reacción fue purificada mediante extracción con cloroformo/fenol y precipitación con isopropanol, y digerida con Asp7l8 y BamHl (Gibco BRL) siguiendo el protocolo del fabricante. Una banda del tamaño predicho, 700 pb, fue visualizada mediante electroforesis en gel de agarosa 1%, extirpada y el ADN fue purificado utilizando un sistema de purificación QiaexIIMR (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

El ADN extirpado fue subclonado dentro del plásmido pC4EE el cual había sido cortado con BamHl y Asp718. El vector de expresión pC4zalfallCEE utiliza el péptido de señal zalfall nativo y acopla el marcador Glu-Glu (SEQ ID No. 29) al extremo C de la porción extracelular de la secuencia polinucleotídica que codifica para el polipéptido zalfall. El plásmido pC4EE, es un vector de expresión de mamífero que contiene un cásete de expresión que tiene el promotor de metalotioneina 1 de ratón, sitios de restricción múltiples para la inserción de las secuencias de codificación, un codón de detención y un terminador de la hormona humana del crecimiento. El plásmido tiene también un origen de replicación de E. coli , una unidad de expresión marcadora seleccionable de mamífero, que tiene un promotor SV40, el aumentador y el origen de replicación, un gen DHFR y el terminador SV40. Aproximadamente 30 ng del inserto de zalfall digerido por restricción y aproximadamente 12 ng del vector digerido fueron ligados toda la noche a 16°C. Un microlitro de cada reacción de ligadura fue independientemente sometido a electroporesis dentro de células DH10B competentes (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y sembradas en placa sobre placas LB que contenían 50 mg/ml de ampicilina, y se incubaron toda la noche. Las colonias fueron seleccionadas mediante análisis de restricción del ADN preparado a partir de 2 ml de cultivos líquidos de las colonias individuales. La secuencia de inserto de los clones positivos fue verificada mediante análisis secuencial. Se realizó una preparación de plásmido a gran escala utilizando un equipo QIAGEN® Maxi prep. (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se utilizó el mismo proceso para preparar los receptores solubles de zalfall con un marcador his C-terminal, compuesto de 6 residuos His en una hilera; y una bandera C-terminal (SEQ ID No. 37) como marcador, zalfallCFLAG. Para preparar estas construcciones, el vector anteriormente mencionado tiene ya sea el marcador HIS o FLAG® en lugar del marcador glu-glu (SEQ ID No. 29) .

B. Construcción del Vector de Expresión de zalfall-Fc4 del receptor de zalfall soluble Un plásmido de expresión que contiene todo o parte de un polinucleótido que codifica para zalfall fue construido por medio de recombinación homologa. El dominio extracelular del receptor de zalfall fue fusionado a la región Fc derivada de la IgG humana, llamado "Fc4" (SEQ ID No . 33) que contiene una mutación, de modo que ya no se enlaza al receptor Fc . Un fragmento del AD?c de zalfall fue aislado utilizando PCR que incluye la secuencia polinucleotídica proveniente del dominio extracelular del receptor de zalfall. Los dos cebadores utilizados en la producción del fragmento zalfall fueron: (1) los cebadores para PCR que incluyen cada uno desde el extremo 5 ' hasta el extremo 3'.- 40 pares de bases de la secuencia flanqueante del vector (5' del inserto) y 17 pares de bases correspondientes al extremo 5' del dominio extracelular de zalfall (SEQ ID No. 32) ; y (2) 40 pares de bases del extremo 5' de la secuencia polinucleotídica Fc4 (SEQ ID No. 33) y 17 pares de bases correspondientes al extremo 3' del dominio extracelular de zalfall (SEQ ID No. 34) . El fragmento de Fc4 para la fusión con el zalfall fue generado mediante PCR de una manera similar. Los dos cebadores utilizados en la producción del fragmento Fc4 fueron: (1) un cebador 5' que consiste de 40 pares de bases de la secuencia desde el extremo 3 ' del dominio extracelular de zalfall y 17 pares de bases del extremo 5' de Fc4 (SEQ ID No . 35); y (2) un cebador 3' que consiste de 40 pares de bases de la secuencia vector (3' del inserto) y 17 pares de bases del extremo 3-' de Fc4 (SEQ ID ?o. 36) . La amplificación por PCR de cada una de las reacciones descritas anteriormente se realizó como sigue: un ciclo a 94 °C por 2 minutos; veinticinco ciclos a 60 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto; un ciclo a 72 °C por 5 minutos; seguido por un periodo de retención a 4°C. 10 µl de los 100 µl de la reacción de PCR fueron corridos sobre un gel de agarosa LMP al 0.8% (Seaplaque GTG) con el amortiguador TVE 1 x para el análisis. Los 90 µl restantes de la reacción de PCR se precipitaron con la adición de 5 µl de cloruro de sodio 1 M y 250 µl de etanol absoluto. El vector de expresión utilizado fue derivado del plásmido pCZR199 derivado de pZP9 (ATCC Depósito No. 98668), y se cortó con Smal (BRL) . El vector de expresión fue derivado del plásmido pCZR199, y es un vector de expresión de mamífero que contiene un cásete de expresión que tiene el promotor temprano inmediato de CMV, un intrón de consenso proveniente de la región variable de locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, sitios de restricción múltiples para la inserción de secuencias de codificación, un codón de detención y un terminador de la hormona humana del crecimiento. El vector de expresión tiene también un origen de replicación de E. coli , una unidad de expresión del marcador seleccionable de mamífero que tiene un promotor SV40, el aumentador y el origen de replicación, un gen DHFR y el terminador SV40. El vector de expresión utilizado fue construido a partir de pCZR199 mediante el reemplazo del promotor de la metalotioneina con el promotor temprano inmediato de CMV.

Cien microlitros de las células de levadura competentes {S. cerevisiae) fueron combinadas con 10 µl que contenían aproximadamente 1 µg de cada uno de los insertos zalfall y Fc4, y 100 ng del vector de expresión digerido con Smal (BRL) y transferido a una cubeta de electroporación de 0.2 cm. Las mezclas de levadura/ADN fueron electropulsadas a 0.75 kv (5 kV/cm) , ohmios "infinito", 25 µF. A cada cubeta se agregaron 600 µl de sorbitol 1.2 M y la levadura se sembró en placa en dos alícuotas de 300 µl sobre dos placas URA-D y se incubaron a 30°C. Después de aproximadamente 48 horas, los transformantes de levadura Ura+ provenientes de una placa simple fueron resuspendidos en 1 ml de agua y centrifugados brevemente para convertir en botón las células de levadura. El botón o concentrado celular fueron resuspendidos en 1 ml de amortiguador de lisis (2% de Tritón X-100, 15 de SDS, cloruro de sodio 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM) . Quinientos microlitros de la mezcla de lisis se agregaron a un tubo Eppendorf que contenía 300 µl de esferas de vidrio lavadas con ácido y 200 µl de fenol-cloroformo, se agitaron en torbellino por intervalos de 1 minuto dos o tres veces, seguido por una centrifugación de 5 minutos en una centrífuga Eppendorf a velocidad máxima. Trescientos microlitros de la fase acuosa se transfirieron a un tubo fresco, y el ADN precipitó con 300 µl de etanol (EtOH) , seguido por centrifugación por 10 minutos a 4°C. El botón de ADN fue resuspendido en 100 µl de agua. La transformación de las células de E. coli electrocompetentes (DH10B, Gibco BRL) se realizó con 0.5-2 ml de preparación de ADN de levadura y 40 µl de células DH10B. Las células fueron electropulsadas a 2.0 kv, 25 mF y 400 ohmios. Después de la electroporación, se sembraron en placa 1 ml de SOC (2% de Triptona BactoMR (Difco, Detroit, MI), 0.5% de extracto de levadura (Difco), cloruro de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2.5 M, cloruro de magnesio 10 mM, sulfato de magnesio 10 mM, glucosa 20 mM) en alícuotas de 250 µl sobre cuatro placas de LB/AMP (caldo LB (Lennox) , 1.8% de Agar Bacto (Difco), 100 mg/L de ampicilina) . Los clones individuales que albergan la construcción de expresión correcta para zalfall-Fc4 fueron identificados mediante digestión por restricción para verificar la presencia del inserto zalfall-Fc4 y para confirmar que las diversas secuencias de ADN hayan sido unidas correctamente una a la otra. El inserto de los clones positivos fue sujeto al análisis secuencial. El ADN plasmídico a mayor escala es aislado utilizando el equipo Qiagen Maxi (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 9 Transfección y Expresión de los Polipéptidos del Receptor Soluble de Zalfall A. Expresión en Mamífero del receptor de zalfall soluble, zalfallCEE, zalfallCFLG, y zalfallCHIS Las células BHK 570 (ATCC No. CRL-10314) , pase 27, fueron sembradas en placa a 1.2 x 106 células/pozo (placa de 6 pozos) en 800 µl de medio DMEM libre de suero (SF) (DEMEM, Gibco/BRL High Glucose) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) . Las células fueron transfectadas con los plásmidos de expresión que contenían zalfallCEE, zalfallCFLG, o zalfallCHIS descritos anteriormente (ver, Ejemplo 8) , utilizando LipofectinMR (Gibco/BRL) , en DMEM libre de suero (SF) . Tres microgramos de zalfallCEE, zalfallCFLG, o zalfallCHIS fueron cada uno diluidos separadamente en tubos de 1.5 ml hasta un volumen final total de 100 µl de SF DMEM. En tubos separados, se mezclaron 15 µl de LipofectinMR (Gibco/BRL) con 100 µl de SF DMEM. La mezcla de LipofectinMR fue incubada a temperatura ambiente por 30-45 minutos luego se agregó la mezcla de ADN y se dejó incubar aproximadamente 10 a 15 minutos a temperatura ambiente.

La mezcla completa de ADN: Lipofectipffi fue agregada a las células sembradas en placa y distribuida uniformemente sobre ellas. Las células fueron incubadas a 37°C por aproximadamente cinco horas, luego transferidas a placas MAXI separadas de 150 mm en un volumen final de 30 ml de DMEM/5% de suero fetal bovino (FBS) (Hyclone, Logan, UT) . Las placas fueron incubadas a 37°C, 5% de C02, toda la noche y la mezcla de ADN: LipofectinMR fue reemplazada con medio de selección (5% de FBS/DMEM con metotrexato 1 µM (MTX)) al siguiente día. Aproximadamente 10-12 días después de la transfección, las placas fueron lavadas con 10 ml de SF DMEM. El medio de lavado fue aspirado y reemplazado con 7.25 ml de DMEM libre de suero. Mallas de Teflón estériles (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA) pre-humedecidos en SF DMEM fueron luego colocadas sobre las colonias celular clónales. Un filtro de nitrocelulosa estéril pre-humedecído en SF DMEM fue luego colocado sobre la malla. Se transfirieron marcas de orientación sobre la nitrocelulosa a la caja de cultivo. Las placas fueron luego incubadas por 5-6 horas en una incubadora a 37°C con 5% de C02. Después de la incubación, los filtros/mallas fueron removidos, y los medios aspirados y reemplazados con 5% de FBS/DMEM con MTX 1 µM. Los filtros fueron luego bloqueados en leche en polvo descremada al 10%/amortiguador de Western A (Western A: Tris 50 mM, pH 7.4, EDTA 5 mM, 0.05% de NP-40 , cloruro de sodio 150 mM y 0.25% de gelatina) por 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador rotatorio. Los filtros fueron luego incubados con uno de los conjugados de anticuerpo-HRP anti -Glu-Glu, anti-FAL® o anti-HIS, respectivamente, en 2.5% de leche en polvo descremada/amortiguador Western A por una hora a temperatura ambiente en un agitador rotatorio. Los filtros fueron luego lavados tres veces a temperatura ambiente con Western A por 5-10 minutos por lavado. Los filtros fueron revelados con el reactivo ultra ECL (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y visualizados sobre Lumi-Imager (Roche Corp.). Las colonias clónales de expresión positiva fueron mecánicamente colocadas en placas de 12 pozos en 1 ml de 5% de FCS/DMEM con MTX 5 µM, luego desarrolladas hasta la confluencia. Las muestras de los medios condicionados fueron luego probadas para los niveles de expresión vía SDS-PAGE y análisis de Western. Los tres clones de expresión más alta para cada construcción fueron recogidos; 2 de 3 fueron congelados como se describe anteriormente y uno fue expandido para la prueba de micloplasma y la siembra de fábrica a gran escala.

B. Expresión en Mamífero del Receptor soluble de zalfall, zalfall-Fc4 Las células BHK 570 (ATCC No. CRL-10314) fueron sembradas en placas en cajas de cultivo de tejido de 10 cm y se dejaron desarrollar hasta aproximadamente 50 a 70% de confluencia toda la noche a 37°C, 5% de C02, en medio DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) , 5% de suero fetal bovino (Hyclone, Logan, UT) , L-glutamina 1 mM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) , piruvato de sodio 1 mM (Gibco/BRL) ) . Las células fueron luego transfectadas con el plásmido que contenía zalfall-Fc4 (ver, Ejemplo 8) , utilizando LipofectamineMR (Gibco/BRL) , en la formulación del medio libre de suero (SF) (DMEM, 10 mg/ml de transferrina, 5 mg/ml de insulina, 2 mg/ml de fetuina, 1% de L-glutamina y 1% de piruvato de sodio) . El plásmido que contenía zalfall-Fc4 fue diluido en tubos de 15 ml hasta un volumen final total de 640 ml con medio SF. Se mezclaron 35 ml de LipofectamineMR (Gibco/BRL) con 605 ml de medio SF. La mezcla de LipofectamineMR fue agregada a la mezcla de ADN y se dejó incubar aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Cinco mililitros de medio SF fueron agregados a la mezcla de ADN: Lipofectamine MR Las células fueron enjuagadas una vez con 5 ml de medio SF, aspiradas, y se agregó la mezcla de ADN: LipofectamineMR. Las células fueron incubadas a 37°C por cinco horas, luego se agregaron a cada placa 6.4 ml del medio DMEM/10% de FBS, 1% de PSN, las placas fueron incubadas a 37°C toda la noche y la mezcla de ADN: Lipofectamine™* fue reemplazada con 5% de medio fresco FBS/DMEM al siguiente día. Al día 2 después de la transfección, las células fueron divididas en el medio de selección (medio DMEM/FBS descrito anteriormente con la adición de metotrexato 1 µM (Sigma Chemical Co., Saint Louis, MO) ) en placas de 150 mm a 1:10, 1:20 y 1:50. Los medios sobre las células fueron reemplazados con medios de selección frescos en el día 5 después de la transfección. Aproximadamente 10 días después de la transfección, dos cajas de cultivo de 150 mm de las colonias resistentes al metotrexato provenientes de cada transfección fueron tripsinizadas y las células se combinaron y se colocaron en un matraz T-162 y se transfirieron a un cultivo a gran escala.

Ejemplo 10 Purificación de receptores solubles de zalfall a partir de células BHK 570 A. Purificación del polipéptido zalfallCEE a partir de BHK 570 A no ser que se indique de otro modo, todas las operaciones fueron llevadas a cabo a 4°C. El siguiente procedimiento fue utilizado para purificar el polipéptido zalfall que contenía los marcadores Gluglu C-terminales (EE) . Treinta litros del medio condicionado de fábrica de células fue concentrado a 1.6 litros con un cartucho espiral Amicon S10Y3 sobre un ProFlux A30. Se agregó una solución inhibidora de proteasa a los 1.6 litros concentrados del medio condicionado de fábrica celular a partir de las células BHK 570 transfectadas (ver, Ejemplo 9) a concentraciones finales de 2.5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, Sigma Chemical Co. Saint Louis, MO) , leupeptina 0.003 mM (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) , pepstatina 0.001 mM (Boehringer-Mannheim) y Pefabloc 0.4 mM (Boehringer-Mannheim). Las muestras fueron removidas para el análisis y el volumen a granel fue congelado a -80°C hasta que se inició la purificación. Las concentraciones totales de proteína objetivo del medio condicionado de fábrica celular concentrado fue determinado vía SDS-PAGE y análisis de manchado de Western con el anticuerpo anti-EE, conjugado a HRP. Una columna de 100 ml de G-Sepharose anti-EE (preparado como se describe más adelante) se vació en una columna de Waters AP-5, de 5 cm x 10 cm. La columna fue empaquetada por flujo y equilibrada sobre un BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) pH 7.4. El medio condicionado de fábrica celular concentrado fue descongelado, se esterilizó por filtración en un filtro de 0.2 micrómetros, el pH se ajustó a 7.4, luego se cargó sobre la columna toda la noche con una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna (CVs) de solución salina amortiguada con fosfato (PBS, pH 7.4), luego se eluyó con tapón, con 200 ml de PBS (pH 6.0) que contenía 0.5 mg/ml de péptido EE (Anaspec, San José, California) a 5 ml/minuto. El péptido EE utilizado tiene la secuencia EYMPME (SEQ ID No . 29) . La columna fue lavada con 10 CVs con PBS, luego eluida con 5 CVs de glicina 0.2 M, pH 3.0. El pH de la columna eluída con glicina fue ajustado a 7.0 con 2 CVs de PBS 5X, luego equilibrada en PBS (pH 7.4) . Se recolectaron fracciones de cinco ml sobre la cromatografía de elusión completa y absorbancia a 280 y 215 nM fueron verificadas periódicamente; el paso de lado a lado y los lavados combinados fueron también guardados y analizados . Las fracciones pico de elución del polipéptido EE fueron analizadas para la proteína objetivo vía la tinción con plata de SDS-PAGE y manchado de Western con el anticuerpo anti-EE, conjugado a HRP. Las fracciones de elución polipeptídicas de interés fueron combinadas y concentradas a partir de 60 ml hasta 5.0 ml, utilizando un concentrador giratorio de membrana de corte de peso molecular de 10,000 Daltones (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para separar el zalfallCEE de otras proteínas de co-purificación, las fracciones combinadas de la elución concentrada del polipéptido fueron sujetas a una columna POROS HQ-50 (resina de intercambio aniónico fuerte de PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) a pH 8.0. Una columna de 1.0 x 6.0 cm fue vaciada y empaquetada por flujo sobre un BioCad Sprint . La columna fue cargada con un ion contrario y luego equilibrada en Tris 20 mM pH 8.0 (Tris- (Hidroximetil-aminometano) ) . La muestra fue diluida 1:13 (para reducir la fuerza iónica del PBS) luego cargada sobre la columna Poros HQ a 5 ml/minuto . La columna fue lavada con 10 CVs con Tris 20 mM pH 8.0 luego eluida con un gradiente de 40 CV de Tris 20 mM/cloruro de sodio 1 M (NaCl) a 10 ml/minuto. Se recolectaron fracciones de 1.5 ml sobre la cromatografía completa y se verificó periódicamente la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones pico de elución fueron analizadas por medio de tinción de Plata de SDS-PAGE. Las fracciones de interés fueron combinadas y concentradas a 1.5-2 ml utilizando un concentrador giratorio de membrana de corte de peso molecular de 10,000 Daltones (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para separar el polipéptido zalfallCEE del péptido EE libre y cualesquiera proteínas de co-purificación, contaminantes, las fracciones concentradas combinadas fueron sujetas a cromatografía sobre una columna Sephadex S200 1.5 x 90 cm (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada y cargada en PBS a una velocidad de flujo de 1.0 ml/minuto utilizando un BioCad Sprint. Se recolectaron fracciones de 1.5 ml a través de la cromatografía completa y se verificó periódicamente la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones pico fueron caracterizadas vía la tinción con Plata de SDS-PAGE, y únicamente se combinaron las fracciones más puras . Este material representó el polipéptido zalfallCEE purificado. Este material purificado fue finalmente sujeto a una columna ActiClean Etox de 4 ml (Sterogene) para eliminar cualesquiera endotoxinas remanentes. La muestra se hizo pasar sobre la columna de gravedad equilibrada con PBS cuatro veces, luego la columna fue lavada con un volumen simple de 3 ml de PBS, que se combinó la muestra "limpiada" . El material fue luego esterilizado por filtración en un filtro de 0.2 micrómetros y almancenado a -80°C hasta que se tomaron las alícuotas.

Sobre geles de SDS-PAGE teñidos con Azul de Coomassie y Plata, sometidos a manchado de Western, el polipéptido zalafallCEE fue una banda mayor de un peso molecular aparente de aproximadamente 50,000 Daltones. La movilidad de esta banda fue la misma sobre geles reductores y no reductores . La concentración de proteína del material purificado fue realizada mediante análisis de BCA (Pierce, Rockford, IL) y la proteína fue tomada como alícuota, y almacenada a -80 °C de acuerdo a nuestros procedimientos estándares. Sobre geles IEF (enfoque isoeléctrico) la proteína corre con un Pl menor de 4.5. La concentración del polipéptido zalfallCEE fue de 1.0 mg/ml. Para preparar la Sepharose anti-EE, un volumen de lecho de 100 ml de proteína G-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) se lavó 3 veces con 100 ml de PBS que contenía 0.02% de azida de sodio utilizando una unidad de filtro de 0.45 micrómetros Nalgene, de 500 ml . El gel fue lavado con 6 volúmenes de trietanolamina 200 mM, pH 8.2 (TEA, Sigma, Saint Louis, MO) , y un volumen igual de la solución del anticuerpo EE que contiene 900 mg del anticuerpo, fue agregado. Después de una incubación de toda la noche a 4°C, el anticuerpo no enlazado fue removido mediante lavado de la resina con 5 volúmenes de TEA 200 mM, como se describe anteriormente. La resina fue resuspendida en 2 volúmenes de TEA, transferida a un recipiente adecuado, y se agregó dimetilpimilimidato-2HCl (Pierce, Rockford, IL) disuelto en TEA, a una concentración final de 36 mg/ml de gel de proteína G-Sepharose. El gel se hizo oscilar a temperatura ambiente por 45 minutos y el líquido fue removido utilizando la unidad de filtro como se describió anteriormente. Los sitios no específicos sobre el gel fueron luego bloqueados mediante incubación por 10 minutos a temperatura ambiente con 5 volúmenes de etanolamina 20 mM en TEA 20 mM. El gel fue luego lavado con 5 volúmenes de PBS que contenía 0.02% de azida de sodio y se almacenó en esta solución.

Purificación del polipéptido zalfallCFLAG a partir BHK 570 A no ser que se indique de otro modo, todas las operaciones fueron llevadas a cabo a 4°C. Se utilizó el siguiente procedimiento para purificar el polipéptido zalfall que contenía los marcadores FLAG® (FLG) C-terminales (Sigma-Aldrich Co.). Treinta litros del medio condicionado de fábrica celular se concentró a 1.7 litros con un cartucho espiral Amicon S10Y3 sobre un ProFlux A30. Una solución de inhibidor de proteasa fue agregada a los 1.7 litros del medio condicionado de fábrica celular concentrado, proveniente de las células BHK 570 transfectadas (ver, Ejemplo 9) a concentraciones finales de ácido etilendiaminotetraacético 2.5 mM (EDTA, Sigma Chemical Co. Saint Louis, MO) , leupeptina 0.003 mM (B0.003 mM (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) , pepstatina 0.001 mM (Boehringer-Mannheim) y Pefabloc 0.4 mM (Boehringer-Mannheim) . Las muestras fueron retiradas para el análisis y el volumen a granel fue congelado a -80°C hasta que se inició la purificación. Las concentraciones de proteína objetivo total del medio condicionado de fábrica celular se determinó por medio de SDS-PAGE y análisis de manchado de Western con el anticuerpo anti-FLAG® conjugado a HRP (Kodak) . Una columna de 125 ml del gel de afinidad M2-agarosa anti-FLAG® (Sigma-Aldrich Co.) se vació en un Waters AP-5, en una columna de vidrio de 5 cm x 10 cm. La columna fue empaquetada por flujo y equilibrada sobre un BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) pH 7.4. El medio condicionado de la fábrica celular concentrada se descongeló, se esterilizó por filtración un filtro de 0.2 micrómetros, el pH se ajustó a 7.4, luego se cargó sobre la columna toda la noche con una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. La columna fue lavada con 10 volúmenes de columna (CVs) de solución salina amortiguada con fosfato (PBS, pH 7.4), luego se eluyó con 250 ml de PBS (pH 6.0) que contenía 0.5 mg/ml de péptido FLAG® (Sigma-Aldrich Co.) a 5 ml/minuto. El péptido FLAG® utilizado tiene la secuencia DYKDDDDK (SEQ ID No. 37) . La columna se lavó con 10 CVs con PBS, luego eluida con 5 CVs de glicina 0.2 M, pH 3.0. El pH de la columna eluida con glicina fue ajustado a 7.0 con 2 CVs de PBS 5X, luego equilibrada en PBS (pH 7.4) . Se recolectaron fracciones de cinco ml sobre la cromatografía de elución completa y se verificó periódicamente la absorbancia a 280 y 215 nM; el paso de lado a lado y los combinados de lavado fueron también guardados y analizados. Las fracciones pico de elución del polipéptido FLAG® fueron analizadas para la proteína objetivo por medio de tinción con Placa de SDS-PAGE y manchado de Western con el anticuerpo anti-FLAG conjugado a HRP. Las fracciones de elución del polipéptido, de interés, fueron combinadas y concentradas desde 80 ml hasta 12 ml utilizando un concentrador giratorio de membrana de corte de peso molecular de 10,000 Daltones (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para separar el zalfallCFLG de otras proteínas que co-purifican, las fracciones combinadas de elución del polipéptido fueron sujetas a una columna POROS HQ-50 (resina de intercambio aniónico fuerte de PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) a pH 8.0. Una columna de 1.0 x 6.0 cm se vació y se empaqueto por flujo sobre un BioCad Sprint . La columna fue cargada con el ion contrario y luego equilibrada en Tris 20 mM pH 8.0 (Tris- (hidroximetil-aminometano) ) . La muestra fue diluida 1:13 (para reducir la fuerza iónica de PBS) luego cargada sobre la columna Poros HQ-50 a 5 ml/minuto. La columna fue lavada con 10 volúmenes de columna (CVs) con Tris 20 mM pH 8.0 y luego eluida con un gradiente de 40 CV de Tris 20 mM/cloruro de sodio 1M (NaCl) a 10 ml/minuto. Las fracciones de 1.5 ml fueron recolectadas sobre la cromatografía completa y se verificó periódicamente la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones pico de elución fueron analizadas vía la tinción con Plata de SDS-PAGE. Las fracciones de interés fueron combinadas y concentradas a 1.5-2 ml utilizando un concentrador giratorio de membrana de corte de peso molecular de 10,000 Daltones (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para separar el polipéptido zalfallCFLG del péptido FLAG® libre y cualesquiera proteínas de co-purificación contaminantes, las fracciones concentradas combinadas fueron sujetas a cromatografía sobre una columna Sephacryl S200 de 1.5 x 90 cm (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada y cargada en PBS a una velocidad de flujo de 1.0 ml/minuto utilizando un BioCad Sprint. Se recolectaron fracciones de 1.5 ml a través de la cromatografía completa y se verificó periódicamente la absorbancia a 280 y 215 nM.

Las fracciones pico fueron caracterizadas vía la tinción con Plata de SDS-PAGE, y únicamente se combinaron las fracciones más puras . Este material representó el polipéptido zalfallCFLG purificado. Este material purificado fue finalmente sujeto a una columna ActiClean Etox de 4 ml (Sterogene) para remover cualesquiera endotoxinas remanentes . La muestra se hizo pasar sobre la columna de gravedad equilibrada con PBS, cuatro veces, luego la columna fue lavada con un volumen simple de 3ml de PBS, que se combinó con la muestra "limpiada" . El material fue luego esterilizado por filtración en un filtro de 0.2 micrómetros y almacenado a -80 °C hasta que se tomaron las alícuotas. Sobre los geles de SDS-PAGE sometidos a manchado de Western, y tinción con Azul de Coomassie y con Plata, el polipéptido zalfallCFLG fue una banda mayor de un peso molecular aparente de aproximadamente 50,000 Daltones. La movilidad de esta banda fue la misma sobre geles reductores y no reductores . La concentración de proteína del material purificado fue realizada mediante análisis de BCA (Pierce, Rockford, IL) y se tomó una alícuota de la proteína, y se almacenó a -80°C de acuerdo a nuestros procedimientos estándares. Sobre geles de IEF (enfoque isoeléctrico) la proteína corre con un Pl menor de 4.5. La concentración del polipéptido zalfallCFLG fue de 1.2 mg/ml.

C. Purificación del polipéptido zalfall-Fc4 a partir de células BHK 570 transfectadas A no ser que se indique de otro modo, todas las operaciones fueron llevadas a cabo a 4°C. Se utilizó el siguiente procedimiento para purificar el polipéptido zalfall que contenía la fusión C-terminal a IgG/Fc humana (zalfall-Fc4; Ejemplos 8 y 9) . 12,000 ml del medio condicionado proveniente de las células BHK 570 transfectadas con zalfall-Fc4 (Ejemplo 9) se filtraron a través de un filtro de esterilización de 0.2 µm y luego se suplementaron con una solución de inhibidores de proteasa, hasta concentraciones finales de leupeptina 0.001 mM (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) , pepstatina 0.001 mM (Boehringer-Mannheim) y Pefabloc 0.4 mM (Boehringer-Mannheim) . Una proteína G de sepharose (volumen de lecho de 6 ml, Pharmacia Biotech) fue empaquetada y lavada con 500 ml de PBS (Gibco/BRL) . El medio condicionado suplementado se hizo pasar sobre la columna con una velocidad de flujo de 10 ml/minuto, seguido por lavado con 1000 ml de PBS (BRL/Gibco) . Zalfall-Fc4 fue eluido de la columna con glicina 0.1 M pH 3.5 y se recolectaron fracciones de 2 ml directamente en 0.2 ml de Tris 2M pH 8.0, para ajustar el pH final a 7.0 en las fracciones. Las fracciones eluidas fueron caracterizadas por SDS-PAGE y manchado de Western con anticuerpos anti-Fc humano (Amersham) . El análisis de manchado de Western de los geles reductores de SDS-PAGE revela una proteína inmunorreactiva de aproximadamente 80,000 KDa en las fracciones 2-10. los geles de SDS-PAGE teñidos con Plata también revelaron un polipéptido zalfall : Fc de 80,000 KDa en las fracciones 2-10. Las fracciones 2-10 fueron combinadas . La concentración de la proteína de las fracciones combinadas fue realizada mediante análisis de BCA (Pierce, Rockford, IL) y se tomaron alícuotas del material, y se almacenaron a -80°C de acuerdo a nuestros procedimientos estándares . La concentración de las fracciones combinadas fue de 0.26 mg/ml.

Ejemplo 11 Ensayo que utiliza los receptores solubles (mutantes) zalfallCEE, zalfallCFLG y zalfall-Fc4 del receptor soluble de zalfall, en el ensayo de inhibición competitiva Las células BaF3/Zalfall fueron centrifugadas y lavadas en medio libre de mIL-3. Las células fueron lavadas y centrifugadas 3 veces para asegurar la eliminación de mIL-3. Las células fueron luego contadas en un hemocitómetro. Las células fueron sembradas en placa en el formato de 96 pozos a 5000 células por pozo en un volumen de 100 µl por pozo utilizando el medio libre de mIL-3. Ambos medios condicionados provenientes de la activación de células de bazo de mono y las células seleccionadas CD3+ humanas, descritas en el Ejemplo 5, fueron agregados en los experimentos separados a concentraciones de 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% y 0.375%, con o sin los receptores solubles de zalfall (las construcciones de CEE, C-flag, y Fc4 ; Ver, Ejemplo 9 y 10) a 10 µg/ml. El volumen de ensayo total fue de 200 µl. Las placas de ensayo fueron incubadas a 37°C con 5% de C02 por 3 días, tiempo en el cual se agregó Azul Alamar (Accumed) a 20 µl/pozo. Las placas fueron nuevamente incubadas a 37°C, 5% de C0 por 24 horas. Las placas fueron leídas sobre el lector de placas FmaxMR (Molecular Devices) como se describe en el Ejemplo 2. Los resultados demostraron la inhibición completa del desarrollo celular a partir de cada una de las diferentes construcciones del receptor soluble de zalfall a 10 µg/ml, confirmando que el factor en cada muestra fue específico para el receptor zalfall. Las curvas de titulación, diluyendo los receptores solubles, fueron también corridas utilizando el ensayo anteriormente establecido. Los receptores de zalfall solubles, zalfallCEE y zalfallCFLG, fueron capaces de inhibir completamente el crecimiento a concentraciones tan bajas como de 20 ng/ml. El receptor de zalfall soluble, zalfall-Fc4 mutante, fue únicamente efectivo a 1.5 µg/ml .

Ejemplo 12 Ensayo de trampa de secreción Se utilizó un ensayo de trampa de secreción para identificar el ADNc para el ligando zalfall. Los combinados de ADN positivos fueron obtenidos a partir del esfuerzo de clonación de expresión descrita en el Ejemplo 7. Los combinados de ADN de 250 clones fueron transfectados en células BHK en formato de 96 pozos, y el medio condicionado fue colocado en el ensayo de proliferación utilizando las células BaF3/zalfall descritos en los Ejemplos 4 y 5. Varios combinados de ADN dieron actividades positivas las cuales fueron repetidas y neutralizas con los receptores solubles de zalfall (ver Ejemplo 11) . Uno de los combinados de ADN positivos, 45C5, fue transfectado dentro de las células COS en el formato de 12 pozos, utilizando el método de Lipofectamine™ descrito más adelante. Un ensayo de trampa de secreción fue luego realizado utilizando los receptores solubles de zalfall (marcados con Glu-Glu C-terminales ya sea con o sin biotinilación; marcados con Flag C-terminal; o las fusiones del receptor soluble Fc4 zalfall) (Ejemplo 9) para probar el enlace directo entre el ligando potencial del receptor de zalfall en el combinado 45C5 y el receptor soluble de zalfall (ver más adelante) . El resultado fue positivo. De este modo, el ADN del combinado 45C5 fue sometido a electroporesis en E. coli , y las colonias simples fueron picadas en diez placas de 96 pozos. Las placas fueron agitadas a 37°C por 24 horas, y luego se realizaron minipreparaciones de ADN (Equipo QiaPepMR 96 Turbo Miniprep; Qiagen) en el formato de 96 pozos utilizando un Equipo TomTech Quadra 9600. El ADN plasmídico fue luego combinado en el formato de hileras y columnas, transfectado dentro de las células COS, y luego los combinados positivos fueron determinados mediante la trampa de secreción como se describe más adelante.

Transfección de Células COS La transfección de células COS fue realizada como sigue: Se mezclan 3 µl del ADN combinado y 5 µl de Lipofectamine™ en 92 µl de medio DMEM libre de suero (55 mg de piruvato de sodio, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2.5 mg de insulina, 1 µl de selenio y 5 mg de fetuina en 500 ml de DMEM) , se incuba a temperatura ambiente por 30 minutos y luego se agregan 400 µl de medio DMEM libre de suero. Se agregan 500 µl de esta mezcla sobre 1.5 x 105 células COS/pozo, sembradas en placa sobre la placa de cultivo de tejidos de 12 pozos y se incuban por 5 horas a 37°C. Se agregan 500 µl de medio FBS DMEM al 20% (100 ml de FBS, 55 mg de piruvato de sodio y 146 mg de L-glutamina en 500 ml de DMEM) y se incuban toda la noche.

Ensayo de Trampa de Secreción La trampa de secreción fue realizada como sigue: Los medios con células fueron enjuagados con PBS y luego fijadas por 15 minutos con 1.8% de Formaldehído en PBS. Las células fueron luego lavadas con TNT (Tris-HCL 0.1M, cloruro de sodio 0.15M, y 0.05% de Tween 20 en agua) , y se permearon con 0.1% de Triton-X en PBS por 15 minutos, y nuevamente se lavaron con TNT. Las células fueron bloqueadas por 1 hora con TNB (Tris-HCL 0.1M, cloruro de sodio 0.15M y 0.5% de Reactivo de Bloqueo (Equipo ?E? renaissance TSA-Direct) en agua) y se lavaron nuevamente con T? . Si se utiliza la proteína biotinilada, las células fueron bloqueadas para incubaciones de 15 minutos con Avidina y luego Biotina (Vector Labs) lavando entre cada uno con T?T. Dependiendo de que receptor soluble se utilizara, las células fueron incubadas con: (A) 1-3 µg/ml de la proteína de fusión zalfall -Fc4 del receptor soluble zalfall (Ejemplo 10) ; (B) 3 µg/ml del receptor soluble de zalfall marcado C-terminal con FLAG, zalfallCFLG (Ejemplo 10) ; (C) 3 µg/ml del receptor soluble de zalfall C-terminalmente marcado con Glu-Glu, zalfallCEE (Ejemplo 10) ; o (D) 3 µg/ml del receptor soluble de zalfall biotinilado, zalfallCEE en T?B . Las células fueron luego lavadas con T?T. Dependiendo de que receptor soluble se utilizará, las células fueron incubadas por otra horas con: (A) Ig-HRP anti-humana, de cabra, diluida 1:200 (específica de Fc) ; (B) M2-HRP diluida a 1:1000; (C) anticuerpo anti-HRP anti-GluGlu diluido 1:1000; o (D) estreptavidina HRP diluida 1:300 (Equipo ?E?) en T?B. Nuevamente, las células fueron lavadas con TNT. cloruro de sodio 0.15M, y 0.05% de Tween 20 en agua) , y se permearon con 0.1% de Triton-X en PBS por 15 minutos, y nuevamente se lavaron con TNT. Las células fueron bloqueadas por 1 hora con TNB (Tris-HCL 0.1M, cloruro de sodio 0.15M y 0.5% de Reactivo de Bloqueo (Equipo NEN renaissance TSA-Direct) en agua) y se lavaron nuevamente con TNT. Si se utiliza la proteína biotinilada, las células fueron bloqueadas para incubaciones de 15 minutos con Avidina y luego Biotina (Vector Labs) lavando entre cada uno con TNT. Dependiendo de que receptor soluble se utilizara, las células fueron incubadas con: (A) 1-3 µg/ml de la proteína de fusión zalfall-Fc4 del receptor soluble zalfall (Ejemplo 10) ; (B) 3 µg/ml del receptor soluble de zalfall marcado C-terminal con FLAG, zalfallCFLG (Ejemplo 10) ; (C) 3 µg/ml del receptor soluble de zalfall C-terminalmente marcado con Glu-Glu, zalfallCEE (Ejemplo 10); o (D) 3 µg/ml del receptor soluble de zalfall biotinilado, zalfallCEE en TNB. Las células fueron luego lavadas con TNT. Dependiendo de que receptor soluble se utilizará, las células fueron incubadas por otra horas con: (A) Ig-HRP anti-humana, de cabra, diluida 1:200 (específica de Fc) ; (B) M2-HRP diluida a 1:1000; (C) anticuerpo anti-HRP anti-GluGlu diluido 1:1000; o (D) estreptavidina HRP diluida 1:300 (Equipo NEN) en TNB. Nuevamente, las células fueron lavadas con TNT.

El enlace positivo fue detectado con el reactivo tiramina de fluoresceína, diluido 1:50 en amortiguador de dilución (equipo NEN) y se incubó por 4-6 minutos, y se lavó con TNT. Las células fueron preservadas con el Medio Vectashield Mounting (Vector Labs Burlingame, CA) diluido 1:5 en TNT. Las células fueron visualizadas utilizando un filtro FITC sobre el microscopio fluorescente.

Ejemplo 13 Asignamiento cromosómico y colocación del gen para el ligando de zalfall El gen para el ligando de zalfall fue trazado en mapa al cromosoma 4 utilizando la versión comercialmente disponible del "Panel de Trazado de Mapa Híbrido por Radiación Stanford G3" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL) . El "Panel Stanford G3 RH" contiene los ADNs provenientes de cada uno de los 83 clones híbridos de radiación del genoma humano completo, más dos ADNs control (el donador RM y el recipiente A3) . Un servidor WWW públicamente disponible (http://shgc-www.stanford.edu) permite la localización cromosómica de los marcadores. Para el trazado del mapa del gen de ligando zalfall con el "Panel Stanford G3 RH" , reacciones de 20 µl se establecieron en una placa de microtitulación de 96 pozos (Stratagene, La Jolla, CA) y se utilizaron en un ciclador térmico "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene) . Cada una de las 85 reacciones de PCR consistieron de 2 µl del amortiguador de reacción de PCR KlenTaq 10X (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) , 1.6 µl de mezcla de dNTPs (2.5 mM de cada uno, PERKIN-ELMER, Foster City, CA) , 1 µl de cebador en sentido, ZC 22,050 (SEQ ID No. 42), 1 µl de cebador antisentido, ZC 22,051 (SEQ ID No.43), 2 µl de "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0.4 µl de la mezcla de polimerasa KlenTaq Advantage 50X (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng de ADN proveniente de un clon híbrido individual o el control y ddH20 para un volumen total de 20 µl . Las reacciones fueron cubiertas con una cantidad igual de aceite mineral y selladas. Las condiciones del ciclador de PCR fueron como sigue: un ciclo inicial de desnaturalización por 5 minutos a 94°C, 35 ciclos de una desnaturalización de 45 segundos a 94°C, 45 segundos de recocido a 60 °C y 1 minuto y 15 segundos de extensión a 72°C, seguido por una extensión final de 1 ciclo de 7 minutos a 72°C. Las reacciones fueron separadas mediante electroforesis sobre un gel de agarosa al 2% (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Los resultados mostraron colección del gen de ligando zalfall al marcador estructural de IL2, SHGC-12342 con una calificación LOD mayor de 12 y a una distancia de 6 cR 1000 (aproximadamente 180 kb) del marcador. El uso de los marcadores vecinos coloca al gen del ligando zalfall en la región 4q27 sobre el mapa del cromosoma 4 LDB integrado (La Base de Datos Location Genetic, Universidad de Southlampton, WWW servidor: http : //cedar . genetics . soton. ac . uk/public_html/ ) .

Ejemplo 14 Identificación y clonación del ligando zalfall murino utilizando una secuencia EST para obtener el ligando zalfall murino de longitud completa A. Secuencia EST de ligando zalfall de ratón Mediante la búsqueda de la base de datos con la secuencia de ADNc de ligando de zalfall humano (SEQ ID No. 1) como una búsqueda, se identificó un EST de ratón (EST1483966) como una secuencia parcial potencial para el ligando zalfall de ratón. EST1483966 representa un fragmento genómico de ratón, en el cual una secuencia peptídica derivada de dos exones potenciales compartía alta identidad secuencial con un segmento peptídico del ligando de zalfall humano (aminoácido 13 (He) al aminoácido 80 (Gln) de la SEQ ID No . 2) .

B. Selección por PCR del panel de ADNc maratón de ratón Ocho muestras de ADNc maratón de ratón (Clontech) fueron seleccionadas mediante PCR que se describe más adelante. Las muestras de ADNc maratón de ratón, fueron preparadas a partir de tejidos de cerebro, páncreas, riñon, placenta, glándulas salivales, piel, testículos, útero, embrión y bazo. Estos fueron realizados domésticamente utilizando un equipo de amplificación de ADNc MarathonMR (Clontech) de acuerdo a las instrucciones de fabricante. Con base en la secuencia EST, dos cebadores de PCR, ZC22,056 (SEQ ID No . 44) y ZC22,057 (SEQ ID No. 45) fueron utilizados para identificar una fuente de ligando de zalfall de ratón, mediante PCR Las condiciones de reacción de PCR fueron como sigue: 94 °C por 2 minutos; 35 ciclos a 94°C por 30 segundos, 68 °C por 2 minutos; seguido por 68 °C por 4 minutos; luego un remojo a 10°C. Los productos de PCR fueron corridos sobre un gel de agarosa al 1%. Una banda fuerte de 50 pares de bases que representa un fragmento de ADNc amplificado fue visualizada. Esto indicó que el ADNc maratón, de bazo de ratón es la fuente para la clonación del ADNc del ligando zalfall de ratón. El ADNc maratón de bazo de ratón contenía un ADNc positivo el cual fue subsecuentemente identificado mediante análisis secuencial como un ADNc parcial para el ligando zalfall de ratón.

C. Una secuencia compuesta para el ADNc de longitud completa, de ratón, fue generado mediante 5'- y 3'- RACE Las secuencias flanqueantes 5' y 3' de la secuencia del ADNc parcial, del ligando zalfall de ratón fueron obtenidas mediante amplificación 5'- y 3'- RACE. Dos rondas de amplificación de PCR anidada fueron realizadas con oligocebadores específicos del gen, adicionales ZC22.205 (SEQ ID No. 46) y ZC22.206 (SEQ ID No. 47), ZC22.056 (SEQ ID No. 44) y ZC22,057 (SEQ ID No. 45), y dos cebadores oligo adaptadores ZC9,739 (SEQ ID No. 48) y ZC9,719 (SEQ ID No . 49). Las reacciones de PCR fueron corridas como sigue: 94°C por 2 minutos; 35 ciclos a 94 °C por 30 segundos, 68°C por 2 minutos; seguido por 68 °C por 4 minutos; luego un remojo a 10°C. Los productos de PCR fueron corridos sobre un gel de agarosa al 1%, y fueron identificados un producto 5'- RACE de aproximadamente 300 pares de bases y un producto 3 ' - RACE de aproximadamente 800 pares de bases. Estos fragmentos fueron aislados utilizando el equipo de extracción en gel QiaquickMR (Qiagen) . Los productos de PCR purificados fueron secuenciados utilizando los siguientes cebadores: ZC,719 (SEQ ID No. 49), ZC22,205 (SEQ ID No. 46) y ZC22,206 (SEQ ID No. 47) . Una secuencia del ligando zalfall de ratón, de longitud completa, compuesta, preeliminar, fue identificada mediante la combinación de los fragmentos 5'- y 3 '-RACE. El clon de ratón, de longitud completa, fue aislado como se describe e el ejemplo 15 siguiente.

Ejemplo 15 Aislamiento del clon de ADNc de zalfall de ratón a partir de una genoteca activada de bazos de ratón A. Fuente Primaria Murina Utilizada para Aislar el Ligando zalfall de ratón Bazos de ratón provenientes de ratones Balb/C, fueron recolectados y aplastados entre portaobjetos de extremo congelado para crear una suspensión celular. El rendimiento de las células de ratón primarias aisladas fue de 6.4xl?8 células antes de la selección descrita más adelante . Las células de bazo fueron suspendidas en 9.6 ml de amortiguador MACS (PBS, 0.5% de EDTA, EDTA 2mM) . 1.6 ml de la suspensión celular fueron retirados y se agregaron 0.4 ml de microesferas CD90 (Thy 1.2) (Miltenyi Biotec) . La mezcla fue incubada por 15 minutos a 4°C. Las células marcadas con las esferas CD90 fueron lavadas con 30 ml de amortiguador MACS, y luego resuspendidas en 2 ml de amortiguador MACS.

Se preparó una columna de VS+ (Miltenyi) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La columna VS+ fue luego colocada en un campo magnético VarioMACSMR (Miltenyi) . La columna fue equilibrada con 5 ml de amortiguador MACS. Las células de ratón primarias, aisladas fueron luego aplicadas a la columna. Las células negativas a CD3 se dejaron pasar al través. La columna fue enjuagada con 9 ml de amortiguador MACS (3 x 3 ml) . la columna fue luego retirada del, imán y colocada sobre un tubo falcon de 15 ml . Las células CD90+ fueron eluídas mediante la adición de 5 ml del amortiguador MACS a la columna, y las células enlazadas se empujaron hacia fuera utilizando el émbolo proporcionado por el fabricante. La incubación de las células con las esferas magnéticas CD90, los lavados y los pasos de columna VS+ (incubación hasta la elución) anteriormente mencionados, fueron repetidos una vez más. Las fracciones CD90+ resultantes provenientes de las dos separaciones en columna fueron combinadas . El rendimiento de las células de bazo de ratón seleccionadas por CD90+ fue de lxlO8 células totales. Una muestra de las células de ratón seleccionadas por CD90+ combinadas, fueron retiradas para la tinción y la clasificación sobre un clasificador de células por anticuerpo fluorescente (FACS) para evaluar su pureza. Un anticuerpo CD3e anti-ratón, de hámster, conjugado a PE (PharMingen) se utilizo para la tinción y la clasificación de las células seleccionadas por CD90+. Las células seleccionadas por CD90+, de ratón, fueron 93% células CD3+, sugiriendo que las células eran 93% células T. Las células seleccionadas por CD90+ murinas fueron activadas mediante la incubación de 3xl06 células/ml en RMPI + 5% de FBS + PMA, 10 ng/ml e Ionomicina 0.5 µg/ml (Calbiochem) por toda la noche a 37°C. El sobrenadante proveniente de estas células de ratón seleccionadas por CD90+, activadas fue probado para la actividad del ligando zalfall como se describe más adelante. Además, las células de ratón seleccionadas por CD90+, activadas, fueron utilizadas para preparar la genoteca de ADNc, como se describe en el Ejemplo 16 más adelante.

Ejemplo 16 Clonación del ligando zalfall de ratón a partir de una genoteca de células seleccionadas por CD90+, de ratón La clasificación de una genoteca de ADNc de células seleccionadas por CD90+ activadas, de ratón, primarias, reveló un ADNc aislado que es un novedoso miembro de la familia de citocinas de cúmulo de cuatro hélices. Este ADNc codificó para el ortólogo de ratón del ligando zalfall humano. El ADNc fue identificado mediante selección de hibridación.

A. El vector para la construcción de la genoteca seleccionada por CD90+ El vector, pZP7N fue utilizada para la construcción de la genoteca seleccionada por CD3+9 (Ver Ejemplo 6A) .

B. Preparación de la genoteca de ADNc de células seleccionadas por CD90+, activadas, de ratón, primarias Aproximadamente 1.5xl08 células de ratón primarias seleccionadas por CD90+, estimuladas en ionomicina/PMA (Ejemplo 15) fueron aisladas mediante centrifugación. El ARN total fue aislado del botón celular y se convirtió a ADNc de doble hebra como se describe en' el Ejemplo 6B . Este ADN fue subsecuentemente transfectado dentro de las células BHK, como se describe en el Ejemplo 6B, y la proliferación fue evaluada utilizando un ensayo de fluorescencia de "Azul Alamar" (Ejemplo 2B) . Para fines de clasificación de la genoteca por clonación de trampa de secreción, una forma amplificada, compleja de la genoteca, fue necesaria para transfectar las células COS-7. Se sembraron en placa 4.8 millones de clones sobre 110 de placas de agar LB de 15 cm, suplementado con 100 µg/ml de ampicilina, 10. µg/ml de meticilina. Después de desarrollar las placas toda la noche a 37°C, las bacterias fueron cosechadas mediante raspado y centrifugadas. El ADN plasmídico fue extraído de las bacterias concentradas utilizando un Nucleobond-gigaMR (Clonetech) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este plásmido fue luego utilizado para transfectar las células COS-7 sobre portaobjetos, y seleccionado utilizando la técnica de trampa de secreción descrita más adelante (Ejemplo 17) .

C. Selección de la genoteca de ADNc de ratón, activada Aproximadamente 5xl05 clones fueron sembrados en placa sobre Maxi placas 10 LB/Amp. Las colonias fueron levantadas, desnaturalizadas, neutralizadas y reticuladas utilizando el procedimiento estándar (Sambrook, J. et al. Supra.). Cincuenta nanogramos del fragmento de PCR 5 '-RACE de 300 pb (Ejemplo 14) fueron marcados con 32P utilizando el equipo de marcación de cebador aleatorio Prime- Itr RmT (Stratagene) . Los 10 filtros fueron hibridados con esta sonda marcada a 65°C toda la noche utilizando la solución de hibridación ExpressHybMR (Clontech) . Los filtros fueron luego lavados secuencialmente a 60°C por 1 hora tres veces con 0.2xSSC (cloruro de sodio 30 mM, citrato de sodio 3 mM, pH 7.0), 0.1% de SDS; y luego a 65°C por 1 hora. Los filtros fueron luego expuestos a -80 °C toda la noche, y la película de rayos X fue revelada. Los tapones de agar que contenían las colonias positivas fueron extraídos, y los clones sembrados en placas sobre placas LB/Amp de 10 cm. Las colonias fueron luego levantadas con un filtro e hibridadas nuevamente siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente. Un clon de ADN, llamado MHL/pZP7, fue aislado y secuenciado utilizando los siguientes cebadores: ZC14,063 {SEQ ID No. 50), ZC5,020 (SEQ ID No. 51), ZC22,421 (SEQ ID No. 52), ZC22,604 (SEQ ID No . 53), y ZC22,641 (SEQ ID No. 54) . La secuencia polinucleotídica de este clon es el ligando zalfall de ratón, de longitud completa (SEQ ID No. 55) y consistente con la secuencia compuesta obtenida a partir de los productos 5'- y 3'- RACE. La secuencia de aminoácido correspondiente para el ligando zalfall de ratón se muestra en la SEQ ID No. 56.

Ejemplo 17 El ligando zalfall de ratón se enlaza al receptor soluble zafall humano en el ensayo de trampa de secreción El ADN para el clon de ratón MHL/pZP7 fue transfectado dentro de células COS, y el enlace del receptor soluble zalfall humano, zalfall-Fc4 (Ejemplo 10C) a las células COS transfectadas fue probado mediante un ensayo de trampa de secreción (Ejemplo 12) . El ensayo confirmó que el ligando zalfall de ratón se enlaza al receptor soluble zalfall humano. La transfección de células COS fue realizada como en el Ejemplo 12 utilizando 0.7 µg de ADN MHL/pZP7 (Ejemplo 16) en 3 µl . La trampa de secreción fue realizada como en el ejemplo 12 utilizando 1 µg/ml de la proteína de fusión Fc4 del receptor soluble de zalfall (Ejemplo 10C) en TNB, e Ig-HRP de cabra anti-humana diluida a 1:200 (específica de Fc) en TNB para el anticuerpo detectable. El enlace positivo del receptor zalfall humano soluble a las células fijadas, preparadas, fue detectado con el reactivo de tiramina fluoresceína como en el Ejemplo 12. Las células fueron preservadas y visualizadas de acuerdo al Ejemplo 12. El resultado positivo indicó que el ligando zalfall de ratón se enlaza al receptor soluble de zalfall humano .

Ejemplo 18 Expresión del ligando zalfall en células de mamífero A. Construcción del vector de expresión MHL/pZP9 Un vector de expresión fue preparado para la expresión del ligando zalfall de ratón en células de mamífero. Un fragmento de ADN de ligando zalfall generado por PCR, de 500 pb fue creado utilizando ZC22,283 (SEQ ID No. 57) y ZC22,284 (SEQ ID No. 58) como cebadores de PCR para amplificar la región de codificación del Ligando zalfall de ratón y agregar los sitios de restricción Xhol y Xbal. El clon MHL/pZP7 del ligando zalfall de ratón (Ejemplo 16) fue utilizado como una plantilla. Las condiciones de reacción de PCR fueron como sigue: 94 °C por 2 minutos; 25 ciclos a 94 °C por 30 segundos, 68 °C por 2 minutos; seguido por 68 °C por 4 minutos, luego un remojo a 10°C. Una banda del tamaño predicho, de aproximadamente 500 pb, fue visualizada mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, extirpado y el ADN fue purificado utilizando un sistema de codificación QiaexIIMR (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN purificado fue digerido con Xhol y Xbal (Boehringer Mannheim) a 37°C por 2 horas. Luego el ADN fue aislado en gel y purificado siguiendo el procedimiento anterior.

El ADN extirpado fue subclonado dentro del plásmido pZP9 el cual fue cortado con Xhol y Xbal (Boehringer Mannheim) . El plásmido pZP9 es un vector de expresión de mamífero que contiene un cassette de expresión que tiene el promotor de la metalotionina-1 de ratón (MT-l) , sitios de restricción múltiples para la inserción de las secuencias de codificación, y un terminador de la hormona humana del crecimiento. El plásmido tiene también un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcador selectivo de mamífero que tiene un promotor SV40, el aumentador y el origen de replicación, un gen de DHFR y el terminador SV40. Aproximadamente 30 ng del fragmento del ligando zalfall de ratón, digerido por restricción, y aproximadamente 10 ng del vector pZP9 digerido fueron ligados a temperatura ambiente por 2 horas . Dos µg de la reacción de ligadura fueron transformados en células competentes INVaF' (Invitrogen) de acuerdo al protocolo del fabricante y sembradas en placas sobre placas LB que contenían 50 µg/ml de ampicilina, e incubadas a 37°C toda la noche. Las colonias fueron seleccionadas mediante análisis de restricción utilizando Xhol y Xbal (Boehinger Mannheim) del ADN preparado a partir de los cultivos líquidos de colonias individuales. La secuencia de inserto de los clones positivos fue verificada mediante análisis secuencial y fue la secuencia del ligando zalfall de ratón. Una preparación de plásmido a gran escala fue realizada utilizando un equipo Qiagen® Maxi prep (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El vector de expresión que contiene el ligando zalfall de ratón fue llamado MHL/pZP9.

B. Expresión en mamífero del ligando zalfall de ratón Las células BHK 570 (ATCC No. CRL-10314) fueron sembradas en placa en cajas de cultivo de tejidos de 10 cm y se dejaron desarrollar a aproximadamente 20% de confluencia toda la noche a 37°C, 5% de C02, en medio de DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL medio con Alto Contenido de Glucosa; Gibco BRL, Gaithersburg, MD) , 5% de suero fetal bovino (Hyclone, Logan, UT) , L-glutamina lmM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) , piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL) ) . Las células fueron luego transfectadas con el plásmido MHL/pZP9 (Ejemplo 18A) utilizando un equipo de transfección de fosfato de calcio estable, de mamífero (Stratagene) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Un día después de la transfección, las células fueron divididas 1:10 y 1:20 en los medios de selección (medio DMEM/FBS con la adición de metotrexato 1 µM (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) ) en placas de 150 mm. Los medios sobre las células fueron reemplazados con medios de selección frescos en el día 5 después de la transfección. Aproximadamente 10 días después de la transfección, las colonias resistentes al metotrexato fueron tripsinizadas y las células combinadas y sembradas en placa en matraces de cultivo a gran escala. Una vez que las células fueron desarrolladas hasta aproximadamente 90% de confluencia, éstas fueron enjuagadas con PBS tres veces, y cultivadas con el medio ESTEP2 libre de suero (DMEM (Gibco BRL), 0.11 g/1 de Piruvato de sodio, 3.7 g/1 de carbonato ácido de sodio, 2.5 mg/l de insulina, 5 mg/l de transferrina, pH 7.0) como medio condicionado. Los medios condicionados fueron recolectados tres días después, y colocados en un ensayo de proliferación de BaF3 utilizando Azul Alamar, descrito en el Ejemplo 19 siguiente.

Ejemplo 19 El ligando zalfall de ratón activa el receptor de zalfall humano en el ensayo de BaF3 utilizando Azul Alamar La proliferación de las células BaF3/zalfall (Ejemplo 4, y 5B) fue evaluada utilizando los medios condicionados libres de suero provenientes de las células BHK que expresan el ligando zalfall de ratón (Ejemplo 18) .

Las células BaF3 Zalfall fueron centrifugadas, lavadas y colocadas en placa en medios libres de mIL-3 como se describe en el Ejemplo 5B. La proliferación de las células BaF3/Zalfall fue evaluada utilizando los medios condicionados libres de suero a partir de las células BHK que expresan el ligando zalfall de ratón (Ejemplo 18) . El medio condicionado fue diluido con medio libre de m.IL-3 a concentraciones de : 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% y 0.375%. El ensayo de proliferación fue realizado como en el Ejemplo 5B. Los resultados confirmaron la respuesta proliferativa de las células BaF3/Zalfall al ligando zalfall de ratón. La respuesta, como se midió, fue de aproximadamente 5 veces mayor sobre el antecedente a la concentración de 50%.

Ejemplo 20 El ligando zalfall activa el receptor de zalfall humano en el ensayo de luciferasa A. construcción de la línea celular BaF3/KZ134/zalfall El plásmido KZ134 fue construido con los oligonucleótidos complementarios ZC12,749 (SEQ ID No. 59) y ZC12,748 (SEQ ID No. 60) que contienen los elementos de enlace al factor de transcripción STAT a partir de 4 genes. Un elemento inducible por c-fos Sis modificado (m67SIE, o hSIE) (Sadowski, H. Et al. Science 261:1739-1744, 1993), el p21 SIE1 proveniente del gen p21 WAF1 (Chin, Y. et al. Science 272:719-722, 1996), el elemento de respuesta de glándula mamaria del gen de la ß-caseína (Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol 11:3745-3755, 1991), y un elemento inducible por STAT del gen Fcg Rl (Seidel, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3041-3045, 1995). Estos oligonucleótidos contienen extremos compatibles con Asp718-Xhol y fueron ligados, utilizando los métodos estándares, dentro de un vector reportero de luciferasa de luciérnaga, recipiente, con un promotor c-fos (Poulsen, L.K. et al., J. Biol. Chem. 273 : 6229-6232, 1998) digerido con las mismas enzimas y que contienen un marcador seleccionable por neomicina. El plásmido KZ134 fue utilizado para transfectar establemente las células BaF3 , utilizando los métodos estándares de transfección y de selección, para elaborar la línea celular BaF3/KZ134. Una línea celular indicadora BaF3/KZ134 estable, que expresa el receptor zalfall de longitud completa, fue construido como en el Ejemplo 2A, utilizando aproximadamente 30 µg del vector de expresión de zalfall, descrito en el Ejemplo 3. Los clones fueron diluidos, sembrados en placa y seleccionados utilizando técnicas estándares. Los clones fueron seleccionados mediante el ensayo de luciferasa (ver Ejemplo 20B, siguiente) utilizando los medios condicionados por el ligando zalfall de ratón, como un inductor. Los clones con la más alta respuesta a la luciferasa (vía la luciferasa STAT) y el antecedente más bajo, fueron seleccionados. Se seleccionó una línea celular transfectada, estable. La línea celular fue llamada BaF3/KZ134/zalfall .

B. El ligando zalfall humano y de ratón activa el receptor zalfll humano en el ensayo de luciferasa de BaF3/KZ134/Zalfall Las células BaF3/KZ134/Zalfall fueron centrifugadas y lavadas en medio libre mIL-3. Las células fueron centrifugadas y lavadas tres veces para asegurar la eliminación de mIL-3. Las células fueron contadas en un hemocitómetro. Las células fueron colocadas en placa en un formato de 96 pozos a aproximadamente 30,000 células por pozo en un volumen de 100 µl por pozo, utilizando medios libres de mIL-3. Se utilizó el mismo procedimiento para las células BaF3/KZ134 no transfectadas, para el uso como un control en el ensayo subsecuente . La activación por STAT de las células BaF3/KZ134/Zalfall fue evaluada utilizando los medios condicionados a partir de (1) las células BHK570 transfectadas con el ligando zalfall humano (Ejemplo 7) o (2) las células BHK570 transfectadas con el ligando zalafall de ratón (Ejemplo 18) , o (4) medios libres de mlL-3 para medir la respuesta control únicamente con el medio. Los medios condicionados fueron diluidos con los medios RPMI libres de mIL-3 a concentraciones de 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% y 0.375%. 100 µl del medio condicionado fueron agregados a las células BaF3/KZ134/Zalfall. El ensayo utilizando el medio condicionado fue realizado en paralelo sobre células BaF3/KZ134 no transfectadas, como un control. El volumen total de ensayo fue de 200 µl . las placas de ensayo fueron incubadas a 37°C, 5% de C02 por 24 horas tiempo en el cual las células fueron concentradas mediante centrifugación a 2000 rpm por 10 minutos, y el medio fue aspirado y se agregaron 25 µl de amortiguador de lisis (Promega) . Después de 10 minutos a temperatura ambiente, las placas fueron medidas para la activación de la construcción del reportero STAT leyéndolas sobre un luminómetro (Labsystems Luminoskan, modelo RS) el cual agregó 40 µl del substrato de ensayo de luciferasa (Promega) a una integración de cinco segundos . Los resultados confirmaron la respuesta del reportero STAT de las células BaF3/KZ134/Zalafall al ligando zalfall humano. La repuesta, como se midió, fue aproximadamente 50 veces mayor al control con medio únicamente, a la concentración de 50%. La activación por STAT en respuesta al ligando zalfall humano estuvo ausente en las células control BaF3/KZ134 no transfectadas, mostrando que la respuesta es mediada a través del receptor de Zalfall. Los resultados también confirmaron la respuesta del reportero STAT de las células BaF3/KZ134/Zalfall al ligando zalfall de ratón. La respuesta, como se midió, fue aproximadamente 40 veces mayor sobre el control con medio únicamente, a la concentración de 50%. Además, la activación de STAT en respuesta al ligando zalfall de ratón fue evidente (aproximadamente 5 veces) sobre las células control BaF/KZ134 no transfectadas, sugiriendo que las células BaF3 murinas pueden tener el receptor de ratón endógeno .

Ejemplo 21 El ligando zalfall de ratón es activo en el ensayo de médula ósea de ratón A. Aislamiento de las células de médula, de baja densidad, no adherentes : Se obtuvo un aspirado de fémur de ratón fresco (médula) de ratones Balb/C o C57BL/6 machos, de 6 a 10 semanas de edad. La médula fue luego lavada con RPMI+10% de FBS (JRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan UT) y suspendida en RPMI+10% de FBS como una suspensión de células de médula, totales . La suspensión completa de células de médula fue luego sujeta a un gradiente de densidad (Nycoprep, 1.077, Animal: Gibco BRL) para enriquecer las células de baja densidad, principalmente mononucleares, como sigue: La suspensión de células de médula, completas (aproximadamente 8 ml) fue cuidadosamente colocada con pipeta sobre la parte superior de una solución en gradiente de aproximadamente 5 ml de Nycoprep en un tubo cónico de 15 ml y luego se centrifugó a 600 x g por 20 minutos. La capa interfacial que contenía las células mononucleares de baja densidad, fue luego retirada, lavada con RPMI+10% de FBS en exceso, y concentradas mediante centrifugación a 400 x g por 5-10 minutos. Este botón o concentrado fue resuspendido en RPMI+10% de FBS y sembrado en placa en un matraz T-75 a aproximadamente 106 células/ml, e incubadas a 37°C con 5% de C02 por aproximadamente 2 horas . Las células resultantes en suspensión fueron células de Médula de baja Densidad, No Adherentes (NA LD) .

B. Ensayo en 96 Pozos Las Células de Médula de Ratón NA LD fueron sembradas en placa a 25,000 a 45,000 células/pozo en placas de cultivo de tejido de 96 pozos en RPMI+10% de FBS + 1 ng/ml de Factor de Células totipotenciales de Ratón (mSCF) (R&D Systems, Minneapolis, MN) , más 5% de medio condicionado de uno de los siguientes: (1) células BHK 570 que expresan el ligando zalfall de ratón (Ejemplo 18) , (2) células BHK 570 que expresan el ligando zalfall humano (Ejemplo 7) , o (3) células BK 570 control, que contienen el vector y que no expresan el ligando. Estas células fueron luego sujetas a una variedad de tratamientos con citocina para probar la expansión o diferenciación de las células hematopoyéticas provenientes de la médula. Para la prueba, las células de médula de ratón NA LD, sembradas en placa, fueron sujetas a la Interleucina-15 humana (hIL-15) (R&D Systems) , o una de un panel de otras citocinas (R&D Systems) . La dilución en serie de hll-15, o las otras citocinas, fueron probadas, con la dilución en serie a un medio desde aproximadamente 50 ng/ml hasta aproximadamente 6025 ng/ml de concentración. Después de 8 a 12 días los ensayos de 96 pozos fueron calificados para la proliferación celular mediante el ensayo de Azul Alamar como se describe en el Ejemplo 5B.

C. Resultados del Ensayo de Médula de Ratón NA LD, de 96 pozos Los medios condicionados provenientes de las células BHK que expresan el ligando zalfall humano y de ratón actuaron en sinergia con hIL-15 para promover la expansión de una población de células hematopoyéticas en la médula de ratón NA LD. Esta expansión de células hematopoyéticas no fue mostrada con el medio condicionado con BHK, control, más IL-15. La población de células hematopoyéticas expandidas por el ligando zalfall de ratón con IL-15, y aquellas células hematopoyéticas expandidas por el ligando zalfall humano con hIL-15, fueron además propagadas en el cultivo celular. Estas células hematopoyéticas fueron teñidas, un anticuerpo de células NK anti-Pan, marcadas con Psicoeritrina (Pharmigen) y sujetas a análisis de citometría de flujo, que demostró que las células expandidas se tiñeron positivamente para este marcador de células asesinas naturales (NK) . Fue corrido el mismo ensayo de 96 pozos, utilizando células de médula humana, compradas de Poietic Technologies, Gaithersburg, MD . Nuevamente, en conjunto con IL-15, el ligando zalfall de ratón y de humano expandió una población de células hematopoyéticas que se tiñeron positivamente para el marcador de células NK utilizando el anticuerpo descrito anteriormente.

Ejemplo 22 Construcciones para la generación de ratones transgénicos del ligando zalfall humano A. Construcción para la expresión del ligando zalfall humano a partir del promotor MT-1 específico de hígado Los oligonucleótidos fueron diseñados para generar un fragmento de PCR que contenía una secuencia Kozak de consenso y la región de codificación del ligando zalfall humano. Aquellos oligonucleótidos fueron designados con un sitio Fsel en el extremo 5' y un sitio AscI en el extremo 3', para facilitar la clonación dentro de (a) pMT12-8, el presente vector transgénico estándar, o (b) pKF051, un vector transgénico específico de la línea linfoide (Ejemplo 22B) . Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo con 200 ng de la plantilla del ligando zalfall humano (Ejemplo 7) y los oligonucléotidos ZC22,143 (SEQ ID No. 61) y ZC22,144 (SEQ ID No . 62). Las condiciones de la reacción de PCR fueron como sigue: 95°C por 5 minutos, en donde la ADNc-polimerasa AdvantageMR (Clontech) fue agregada; 15 ciclos de 95°C por 60 segundos, 60°C por 60 segundos, 72°C por 90 segundos y 72 °C por 7 minutos. Los productos de PCR fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa y purificados utilizando un equipo de extracción en gel QiaQuick (Qiagen) El fragmento de ADN de 488 pb, aislado, fue digerido con Fsel y Asel (Boehringer Mannheim) , precipitado con etanol y ligado dentro de pMT12-8 previamente digerido con Fsel y Asel. El plásmido pMT12-8, diseñado para la expresión de un gen de interés en el hígado y otros tejidos en ratones transgénicos, contiene un cassette de expresión flanqueado por 10 kb del ADN de MT-15' y 7 kb del ADN del MT-13 ' . El cásete de expresión comprende el promotor MT-1, el intron de la insulina II de rata, un poliligador para la inserción del clon deseado, y la secuencia poli A de la hormona de crecimiento humano (hGH) . Aproximadamente un microlitro de cada reacción de ligadura fue sometido a electroporesis dentro de células competentes DH10B ElectroMax"11 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y sembradas en placas LB que contenían 100 µg/ml de ampicilina, e incubadas toda la noche. Las colonias fueron picadas y desarrolladas en medio LB que contenía 100 µg/ml de ampicilina. El ADN miniprep fue preparado a partir de los clones picados y seleccionado para el inserto del Ligando zalfall mediante digestión por EcoRI solo, Fsel y Asel combinados, y la electroporesis en gel de agarosa, subsecuente. Las maxipreps del Ligando zalfall pMT humano, correcto, fueron realizadas. Un fragmento Salí que contiene las secuencias flanqueantes 5' y 3', el promotor MT-1, el intron de la insulina II de rata, el ADNc del Ligando zalfall humano y la secuencia poli A de hGH se preparó para ser utilizado para la microinyección de oocitos murinos fertilizados. La microinyección y la producción de ratones transgénicos fueron producidos como se describe en Hoga, B. * et al. Manipulating the Mouse Embryo, 2° ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994.

B. Construcción de expresión para el Ligando zalfall humano a partir del promotor EµLCK específico de la línea linfoide.

Los oligonucleótidos fueron diseñados para generar un fragmento de PCR que contenía una secuencia Kozak de consenso y la región de codificación del Ligando zalfall humano. Estos oligonucleótidos fueron diseñados con un sitio Fsel en el extremo 5' y un sitio AscI en el extremo 3', para facilitar la clonación dentro de pKFOSl, un vector transgénico específico de la línea linfoide.

Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo con 200 ng de la plantilla del Ligando zalfall humano (Ejemplo 7) y los oligonucleótidos ZC22,143 (SEQ ID No. 61) y ZC22,144 (SEQ ID No. 62). Una reacción de PCR fue realizada utilizando la ADNc-polimerasa AdvantageMR (Clontech) bajo las siguientes condiciones: 95°C por 5 minutos; 15 ciclos de 95°C por 60 segundos, 60°C por 60 segundos, y 72 °C por 90 segundos; y 72 °C por 7 minutos. Los productos de PCR fueron purificados como se describe anteriormente. El fragmento de ADN de 488 pb, aislado, fue digerido con Fsel y Asel (Boehringer-Mannheim) , precipitados con etanol y dentro del pKF051 previamente digerido con Fsel y Asel. El vector transgénico pKF051 es derivado de pl026X (Iritani, B.M., et al., EMBO J. 16:7019-31, 1997) y contiene el promotor proximal Ick específico de células T, el aumentador de la cadena pesada µ de inmunoglobulina, específico de las células B/T, un poliligador para la inserción del clon deseado, y un gen hGH mutado que codifica para una proteína de hormona de crecimiento inactiva (proporcionando los intrones 3 ' y una señal de poliadenilación) . Aproximadamente un microlitro de cada reacción de ligadura fue sometido a electroporesis, sembrado en placa, los clones fueron picados y seleccionados para el inserto del Ligando zalfall humano mediante digestión por restricción, como se describe anteriormente. Un clon correcto del Ligando pKF051-zalfall fue verificado mediante secuenciamiento, y se realizó un maxiprep de este clon. Un fragmento Notl que contenía el promotor proximal lck y el aumentador de inmunoglobulina µ (EµLCK) , el ADNc del Ligando zalfall y el gen hGH mutado se preparó para ser utilizado para la microinyección dentro de oocitos murinos fertilizados .

Ejemplo 23 Distribución tisular del Ligando zalfall de ratón Los Manchados de Northern de Tejido Múltiple Murino (Ratón, Embrión Murino, Clontech; MB1010, MB1012 Origene) fueron sondeados para determinar la distribución tisular de la expresión del Ligando zalfall murino. Una sonda derivada de la PCR, de aproximadamente 484 pb fue amplificada utilizando el plásmido MHL/pZP7 (Ejemplo 16) como un plantilla y los oligonucleótidos ZC22283 (SEQ ID No. 57) y ZC22284 (SEQ ID No. 58) como cebadores. La amplificación por PCR fue llevada acabo como sigue: 1 ciclo a 94°C por 1 minutos; 35 ciclos a 94 °C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos, y 72 °C por 30 segundos; seguido por un ciclo a 72 °C por 10 minutos. Los productos de PCR fueron visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa y el producto de PCR de aproximadamente 484 pb fue purificado utilizando un equipo de Extracción en Gel (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La sonda fue radioactivamente marcada utilizando el equipo de marcación REDIPRIMEMR (Amersham) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La sonda fue purificada utilizando una columna de empuje NUCTRAPMR (Stratagene) . La solución EXPRESSHYBMR (Clontech) fue utilizada para la prehibridación y como una solución de hibridación para los manchados de Northern. La hibridación tuvo lugar toda la noche a 65°C utilizando 106 cpm/ml de la sonda marcada. Los manchados fueron luego lavados tres veces en 2X SSC y 0.1% de SDS a temperatura ambiente, seguido por 2 lavados en 0.1X SSC y 0.1% de SDS a 55°C. Fueron observados en testículos dos transcritos de aproximadamente 1.2 y 3.5 kb.

El transcrito superior únicamente fue observado en el timo. El Manchado por Puntos Maestro de ARN murino (Clontech) que contenía ARNs de varios tejidos que fueron normalizados para 8 genes domésticos fue también sondeado e hibridado como se describe anteriormente. La expresión fue observada en testículos.

Ejemplo 24 Purificación del Ligando zalfall humano y murino no marcado de BHK 570 A no ser que se establezca de otro modo, todas las operaciones fueron llevadas a cabo a 4°C. El siguiente procedimiento fue utilizado para purificar el Ligando zalfall murino y humano a partir de medios condicionados de células BHK 570, transfectadas con una construcción que expresa ya sea el Ligando zalfall humano (Ejemplo 25) o el Ligando zalfall de ratón (MHL/pZP9) (Ejemplo 18) . El medio condicionado fue concentrado mediante técnicas estándares. El medio condicionado concentrado (CM) fue esterilizado por filtración a través de 0.45 y 0.22 micrómetros. El medio fue luego eluido a baja fuerza iónica { < 12 mS) en HEPES 0.01 M (JRH Biosciences, Lenexa, KS) a pH 7.0. El CM diluido, de baja fuerza iónica, fue luego cargado sobre una columna de 10 x 66 mm (6 ml) Poros HS 50 (PerSeptive BioSystems) , Framingham, MA) toda la noche a 4 ml/min utilizando un BioCAD SPRINT (Perceptive BioSystems) . La columna fue lavada con 10 a 20 volúmenes de columna (CV) con HEPES 0.01 M pH 7.0. las proteínas enlazadas fueron luego eluidas gradualmente con cloruro de sodio 1 M (mallinckrodt, Paris, KY) en HEPES 0.01 M pH 7.0 a 5 ml/ minuto; fueron recolectadas fracciones de dos ml sobre la cromatografía completa y se verificó periódicamente la absorbancia de 280 y 215 nM. Las fracciones de absorbancia pico fueron analizadas mediante el bioensayo y mediante tinción con plata de SDS-PAGE (Geno Technology, St . Louis, MO) y Coomassie (Sigma, St . Louis, MO) . Las fracciones pico fueron combinadas, esterilizadas por filtración y diluidas a < 19 mS con solución salina amortiguada con fosfato (PBS, Gibco BRL) a pH 7.2. La muestra diluida fue luego cargada a 2 ml/minuto utilizando un BioCad SPRINT, ya sea sobre una columna Poros AL 0.8 ml que tenía el receptor soluble zalfallCFLAG (Ejemplo 10B) o el receptor soluble de fusión zalafall-Fc4 (Ejemplo 10C) inmovilizado sobre la resina (ver más adelante) . La columna fue luego lavada con al menos 20 CV de PBS a 10 ml/minuto. La columna fue luego rápidamente eluida con una inyección de 600 µl de glicina 0.1 M (Acido Aminoacético; Glicocola, Espectro, Gardena, CA) pH 2.5 a una velocidad de flujo de 10 ml/minuto con PBS sobre un BioCAD 7OOE. Las fracciones de 1 ml fueron recolectadas por 6 segundos cada vez e inmediatamente el pH se neutralizó con 55 µl de TRIS 2M (Tris (Hidroximetil) Aminometano, EM Science, Gibbstown, NJ) a pH 8.8 la absorbancia a 280 y 215 nM fue verificada periódicamente sobre la cromatografía completa .

Las fracciones pico fueron analizadas mediante el bioensayo y mediante tinción con plata SDS-PAGE (Geno Technology) y Coomassie (Sigma) . Fueron observadas dos bandas, de aproximadamente 24 kD y 18 kD sobre los geles de Plata y de Coomassie para el Ligando zalfall de ratón. Una banda simple, a aproximadamente 18 kD, fue observada sobre los geles de Plata y de Coomassie para el Ligando zalfall humano .

Inmovilización de los polipéptidos del receptor soluble de zalafall humano sobre medio POROS AL Las columnas de POROS AL que tenían el receptor soluble del zalfallCFLAG inmovilizado (Ejemplo 10B) o el receptor soluble de fusión zalfall-Fc4 (Ejemplo 10C) fueron preparadas. Se utilizaron aproximadamente 3 mg del receptor soluble zalafallCFLAG y aproximadamente 10 mg del receptor soluble de fusión zalfall-Fc4. Todas las operaciones fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente sobre un BioCAD 7OOE. Una columna de 4.5 X 50 mm con el medio POROS AL que fue empaquetado por flujo en cloruro de sodio 2 M de acuerdo a las especificaciones de los fabricantes. La columna fue luego equilibrada en sulfato de sodio 1.1 M/fosfato de sodio 50 mM, pH 7.2. El receptor fue concentrado a ' 4 mg/ml utilizando un concentrador giratorio Millipore 30 MWKO luego diluido 1:1 en sulfato de sodio 1.1 M/fosfato de sodio 50 mM, pH 7.2. La columna fue eluida con un flujo a 2 ml/minuto en sulfato de sodio 1.1 M/fosfato de sodio 50 mM pH 7.2 y se realizaron inyecciones de 100 µl del ligando diluido cada 9 CVs hasta un estado de reposo de la saturación, o hasta que se alcanzó la ruptura. Fue luego corrido un gradiente de 62 CV desde sulfato de sodio 1.1 M/fosfato de sodio 50 mM pH 7.2, hasta sulfato de sodio 550 mM/fosfato de sodio 50 mM pH 7.2/5 mg/ml de Cianoborohidruro de Sodio. La columna fue luego mantenida por aproximadamente 2 horas para completar la química de inmovilización. La columna fue luego equilibrada en TRIS 0.2 M pH 7.5/5 mg/ml de Cianoborohidruro de Sodio y se dejo reposar por aproximadamente 1 hora para tapar la columna. Finalmente, la columna fue equilibrada en PBS/0.02% de Azida de Sodio, y se almacenó a 4°C hasta que fue necesario. Antes del uso, la columna fue pre-eluida con glicina 0.1 M para asegurar que las proteínas no específicas fueran removidas, y que la columna no estuviera lixiviando el receptor soluble de zalfall, humano, inmovilizado.

Ejemplo 25 Expresión del Ligando zalfall humano en células de mamífero A. construcción del vector de expresión PZMPll/zalfallLig Un plásmido de expresión que contenía todo o parte de un polinucleótido que codifica para el Ligando zalfall humano, fue reconstruido por medio de recombinación homologa. Un fragmento de ADNc del Ligando zalfall humano (SEQ ID No. 63) fue aislado utilizando PCR. Dos cebadores fueron utilizados en la producción del fragmento del Ligando zalfall humano en una reacción de PCR: (1) cebador ZC22,052 (SEQ ID No . 64), que contenía 40 pb de la secuencia flanqueante del vector y 17 pb correspondientes al extremo amino del Ligando zalfall humano, y (2) el cebador ZC22,053 (SEQ ID No. 65), que contenía 40 pb del extremo 3 ' correspondiente a la secuencia vector flanqueante y 17 pb correspondientes al extremo carboxilo del Ligando zalfall humano. Las condiciones de reacción de PCR fueron como sigue: 1 ciclo a 94 °C por 2 minutos; 25 ciclos a 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, y 72°C por 30 segundos seguido por 1 ciclo a 72 °C por 5 minutos; remojo a 4°C. Se corrieron 10 µl de la reacción de PCR de 100 µl sobre un gel de agarosa de LMP al 0.8% (Seaplaque GTG) con 1 x de amortiguador TBE para el análisis, y se observó el fragmento esperado de aproximadamente 560 pb.

Los restantes 90 µl de la reacción de PCR fueron precipitados con la adición de 5 µl de cloruro de sodio 1 M y 250 µl de etanol absoluto, para ser utilizados para la recombinación sobre el vector recipiente pZMPll como se describe más adelante. El plásmido recipiente pZMPll fue previamente cortado con Smal . El plásmido pZMPll fue derivado del plásmido pCZR199 (descrito en la presente, por ejemplo, Ejemplo 8) . El plásmido pCZR199 es un vector de expresión de mamífero que contiene un cásete de expresión que tiene el promotor temprano inmediato de CMV, un intron de consenso proveniente de la región variable del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, los sitios de restricción múltiple es para la inserción de las secuencias de codificación, un codón de detención y un terminador de la hormona humana de crecimiento. El plásmido también tiene un origen E. coli de replicación, una unidad de expresión del marcador seleccionable de mamífero que tiene un promotor SV40, el aumentador y el origen de replicación, un gen de DHFR y el terminador de SV40. El vector pZMPll fue construido a partir de pCZR199 e incluye el reemplazo del promotor de la metalotioneina con el promotor temprano de CMV, y las secuencias Kozac en el extremo 5' de la estructura de lectura abierta.

Cien microlitros de las células de levaduras competentes {S. Cerevisiae) fueron combinados con 10 µl de una mezcla que contenía aproximadamente 1 µg del inserto del Ligando zalfall humano, y 100 ng del vector pZMPll digerido con Smal, y transferido sobre una cubeta de electroporación de 0.2 cm. Las mezclas de levadura/ADN fueron sometidas a electropulsos a 0.75 kV (5 kV/cm) , ohms infinitos, 25 µF. A cada cubeta se agregaron 600 µl de sorbitol 1.2 M y la levadura fue luego sembrada en placa en dos alícuotas de 300 µl sobre dos placas URA-D e incubadas a 30°C. Después de aproximadamente 48 horas, los transformantes de lavadura Ura+ provenientes de una placa simple fueron resuspendidos en 1 ml de agua y centrifugados brevemente para concentrar las células de levadura. El botón celular fue resuspendido en 1 ml de amortiguador de lisis (2% de Tritón X-100, 1% de SDS, cloruro de sodio 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0 EDTA 1 mM) . Quinientos microlitros de la mezcla de lisis fueron agregados a un tubo Eppendorf que contenía 300 µl de esferas de vidrio lavadas con ácido, y 200 µl de fenol-cloroformo, se agitaron en torbellino por intervalo de 1 minuto, dos o tres veces, seguido por una centrifugación de 5 minutos en una centrífuga Eppendorf a máxima velocidad. Trescientos microlitos de la fase acuosa fueron transferidos a un tubo fresco, y el ADN precipitado con 600 µl de etanol (etOH) , seguido por la centrifugación por 10 minutos a 4°C. El botón de ADN fue resuspendido en 100 µl de agua. La transformación de las células electrocompetentes de E. coli (DH120B, GibcoBRL) fue realizada con 0.5-2 ml de la preparación del ADN de levadura y 40 µl de las células de DH10B. Las células fueron sometidas a electropulso a 2.0 kV, 25 mF y 400 ohms. Después de la electroporación, se sembró en placa 1 ml de SOC (2% de Triptona BactoMR (Difco, Detroit, MI), 0.5% de extracto de levadura (Difco) , cloruro de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2.5 mM, cloruro de magnesio 10 mM, sulfato de magnesio 10 mM, glucosa 20 mM) en alícuotas de 250 µl sobre cuatro placas LB AMP (caldo LB (Lennox) , 1.8% de Agar BactoMR (Difco) , 100 mg/l de Ampicilina) . Los clones individuales que albergan la construcción de expresión correcta para el Ligando zalfall humano fueron identificadas mediante digestión por restricción para verificar la presencia del inserto y para confirmar que las diversas secuencias de ADN han sido unidas correctamente una a la otra. El inserto de los clones positivos fue sujeto a análisis secuencial. El ADN plasmídico a mayor escala fue aislado utilizando el equipo Qiagen Maxi (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

B. Expresión en mamífero del Ligando zalfall humano Las células BHK 570 (ATCC NO: CRL-10314) fueron sembradas en placa en cajas de cultivo de tejido de 10 cm y se dejaron desarrollar hasta aproximadamente 50 a 70% de confluencia toda la noche a 37°C, 5% de C02 en medio DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 5% de suero fetal bovino (Hyclone, Logan, UT) , L-glutamina 1 mM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) , piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL) . Las células fueron luego transfectadas con el plásmido PZMPll/zalfallLig (Ejemplo 25A) , utilizando LipofectamineMR (Gibco BRL) , en la formulación del medio libre de suero (SF) (DMEM, 10 mg/ml de transferrina, 5 mg/ml de insulina, 2 mg/ml de fetuina, 1% de L-glutamina y 1% de piruvato de sodio) . Zalfall-Fc4/pZMP6 (Ejemplo 8B) fue diluido en tubos de 15 ml hasta un volumen final total de 640 µl con el medio SF. Se mezclaron 35 µl de LipofectamineMR (Gibco BRL) con 605 µl de medio SF. La mezcla de LipofectamineMR fue agregada a la mezcla de ADN y se dejo incubar a aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Cinco mililitros de medio SF fueron agregados a la mezcla de ADN: LipofectamineMR. Las células fueron enjuagadas una vez con 5 ml del medio SF, aspiradas, y se agregó la mezcla de ADN: LipofectamineMR. Las células fueron incubadas a 37°C por 5 horas, luego se agregaron a cada placa 6.4 ml de DMEM/10% de FBS, 1% de medio PSN. Las placas fueron incubadas a 37°C toda la noche y la mezcla de ADN: Lipofectamine1^ fue reemplazada con 5% de medio FBS/DMEM fresco al siguiente día. En el día 5 después de la transfección, las células fueron divididas en el matraz T-162 en el medio de selección (DMEM/5% de FBS, 1% de L-GLU, 1% de NaPyr) . Aproximadamente 10 días después de la transfección, dos cajas de cultivo de 150 mm de colonias resistentes al metotrexato provenientes de cada transfección fueron tripsinizadas y las células fueron combinadas y sembradas en placa en un matraz T-162 y transferidas a un cultivo a gran escala. Los medios condicionados provenientes del cultivo a gran escala fueron utilizados para purificar el polipéptido del Ligando zalfall humano como se describe en el Ejemplo 24.

Ejemplo 26 Construcción para la generación de ratones transgénicos con el Ligando zalfall de ratón A. Construcción para la expresión del Ligando zalfall de ratón a partir del promotor EµLCK específico de la línea linfoide Los oligonucleótidos fueron diseñados para generar un fragmento de PCR que contenía una secuencia Kozak de consenso y la región de codificación del Ligando zalfall de ratón. Estos oligonucleótidos fueron diseñados con un sitio Fsel en el extremo 5' y un sitio AscI en el extremo 3', para facilitar la clonación dentro de: (a) pKF051, un vector transgénico específico de la línea linfoide, o (b) pTG12-8, nuestro vector transgénico estándar. Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo con 200 ng de la plantilla del Ligando zalfall de ratón (SEQ ID No. 55; Ejemplo 16) y los oligonucleótidos ZC23,115 (SEQ ID No. 66) y ZC23,116 (SEQ ID No. 67). Se realizó una reacción de PCR utilizando la ADNc-polimerasa AdvantageMR (Clontech) bajo las condiciones de PCR descritas en el Ejemplo 22B. El producto de PCR fue aislado como se describe en el Ejemplo 22B. Los fragmentos de ADN de 440 pb, aislado, fue digerido y ligado dentro de pK051 previamente digerido con Fsel y AscI, como se describe en el Ejemplo 22B. Aproximadamente un microlitro de cada reacción de ligadura fue sometido a electroporesis sembrado en placa, los clones fueron picados y seleccionados para el inserto del Ligando zalfall humano, mediante digestión por restricción como se describe en el Ejemplo 22. Un clon correcto del Ligando pKF051-zalfall fue verificado mediante secuenciamiento, y se realizo la maxiprep de este clon. Un fragmento Notl que contenía el promotor proximal lck, el aumentador µ de inmunoglobulina, el ADNc del Ligando zalfall y el gen hGH mutado se preparó para ser utilizado para la microinyección dentro de oocitos murinos fertilizados .

B. Construcción para la expresión del Ligando zalfall de ratón a partir del promotor MT-1 específico del hígado Este mismo inserto del Ligando zalfall de ratón proveniente del Ejemplo 26A, fue subclonado dentro del vector pTG12-8 como se describe en el Ejemplo 22A. Para esta construcción, se digirieron aproximadamente 10 mg del ADN maxiprep del Ligando pKF051-zalfall digerido con Fsel y AscI combinados, precipitado con etanol, y el fragmento del Ligando zalfall de ratón fue purificado como se describe en el Ejemplo 22. Este fragmento fue luego ligado dentro de pTG12-8 el cual había sido previamente digerido con Fsel y AscI, como se describe en el Ejemplo 22A. La electroporación, la selección de los clones y un maxiprep fueron realizados como se describe en el Ejemplo 22. Un fragmento Salí que contenía las secuencias flanqueantes 5' y 3', el promotor MT-1, el intron de insulina II de rata, el ADN de Ligando zalfall de ratón y la secuencia poli A de hGH fue preparado para ser utilizado para la microinyección dentro de oocitos murinos fertilizados.

Ejemplo 27 Anticuerpos policlonales del Ligando zalfall de ratón Los anticuerpos policlonales fueron preparados mediante la inmunización de 2 conejos blancos hembra New Zealand, con la proteína recombinante purificada muzalfallL/MBP-6H (Ejemplo 32) . Los conejos fueron cada uno administrados con una inyección intraperitoneal inicial de 200 mg de proteína purificada en el Adyuvante Completo de Freud, seguido por inyecciones intraperitoneales de refuerzo, de 100 mg de péptido en adyuvante incompleto de Freud cada tres semanas . Siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo (3 inyecciones totales) , los- animales fueron sangrados y el suero fue recolectado. Los animales fueron luego reforzados y sangrados cada tres semanas . El suero de conejo específico de muzalfallL/MBP- 6H fue preadsorbido de los anticuerpos anti-MBP utilizando la columna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) y se preparó utilizando 10 mg de la proteína de enlace a la maltosa, recombinante, purificada (MBP) por gramo de CNBr-SEPHAROSE. El MBP recombinante fue realizado y purificado sobre una columna de amilosa doméstica, utilizando los métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos policlonales específicos del Ligando muzalfall fueron purificados por afinidad a partir del suero de conejo utilizando una columna de proteínas CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que se preparó utilizando 10 mg de la proteína recombinante purificada de antígeno específico, muzalfalll/MBP-6H (Ejemplo 32) seguido por una diálisis 20X en PBS toda la noche. Los anticuerpos específicos del Ligando muzalfall fueron caracterizados por ELISA utilizando 1 µg/ml de las proteínas recombinantes purificadas en muzalfallL/MBP-6H (Ejemplo 32) o huzalfallL/MBP/6H (Ejemplo 32) como objetivos de anticuerpo. El límite inferior de la detección (LLD) del anticuerpo purificado por afinidad anti -muzalfallL/MBP-6H de conejo, es de 100 pg/ml sobre su antígeno recombinante purificado específico muzalfallL/MBP-6H y 500 pg/ml sobre el huzalfallL-MBP/6H recombinante, purificado.

Ejemplo 28 Construcción del vector de expresión de mamífero y expresión del Ligando zalfall humano, a gran escala, en células CHO DG44 Un vector de expresión de mamífero para el Ligando zalfall humano (SEQ ID No. 1) diseñado para agregar un sitio Salí en el extremo 5' y un sitio Pmel al extremo 3' del ADNc, fue construido por medio de la amplificación por PCR a partir de un plásmido que contenía el Ligando zalfall humano (Ejemplo 7) con los cebadores oligonucleotídicos, ZC22,054 (SEQ ID No. 70) y ZC22,0.55 (SEQ ID No. 71) . Las condiciones de la reacciones de PCR fueron como sigue: 94 °C por 4 minutos; 25 ciclos a 94 °C por 45 segundos, 50 °C por 45 segundos, y 72 °C por 3 minutos; y 72°C por 10 minutos. El producto de PCR fue aislado como se describe en la presente, y cortado con Salí en Pmel, luego ligado al plásmido pDC312 previamente cortado en los sitios de restricción apropiados en el poliligador, utilizando los métodos estándares descritos en la presente. El plásmido pDC312 se describe en Morris, A. et al., "Expression Augmenting Sequence Element (EASE) isolated from Chínese Hámster Ovary cells", en Animal Cell Technology, Carrondo, MJT et al (eds.) (1997) Kluwer Academic Publisers, The Netherlands, p. 529-534. El vector ligado fue transfectado dentro de las células CHO DG44 adaptadas en suspensión (en caja Novo Nordisk, Dinamarca) mediante lipofección utilizando el reactivo LipofectaminePlus11"2 (Gibco/BRL) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los transfectantes fueron seleccionados sobre el medio PFCHO (JRH, Lenexa, Kansas) libre de timidina, e hipoxantina, seguido por la selección con metotrexato 200 mM (Sigma, St. Louis, MO) . Las células resistentes al metotrexato fueron clonadas mediante dilución y evaluadas para la producción del Ligando zalfall mediante el ensayo de la actividad de BaF3 (Ejemplo 5B) . Un clon productivo fue aumentado de escala y desarrollado en un bioreactor de 7 a 20 litros (Applikon Bioreactors, Schiedman, Holanda) en el medio PFCHO para producir el material para la purificación (Ejemplo 29) .

Ejemplo 29 Purificación a gran escala del Ligando zalfall humano y murino, no marcado a partir de las líneas celulares de expresión en mamífero, BHk y CHO A. Ligando zalfall humano expresado en CHO A no ser que se indique de otro modo, todas las operaciones fueron llevadas a cabo a 4°C. Se utilizó el siguiente procedimiento para purificar el Ligando zalfall humano a partir de al menos 30 litros de medio condicionado de CHO (ver Ejemplo 28) . El medio condicionado concentrado o no concentrado (CM) fue esterilizado por filtración a través de filtros de 0.45 y 0.22 micrómetros. Los medios condicionados fueron luego amortiguados con MES 0.01 M (Fluka BioChemika, Suiza)) y el pH ajustado a 6.0, y luego cargado sobre una columna de 50 X 100 mm (196 ml) Poros 50 HS (intercambiador de cationes fuertes de BioSystems PerSeptive Framingham, MA) toda la noche a 4-10 ml/minuto utilizando un BioCAD SPRINT (Perceptive BioSystems) . La columna fue lavada con 10-20 volúmenes de columna (CV) con MES 0.01 M/cloruro de sodio 0.130 M (Mallinckrodt, París, KY) pH 6.0. Las proteínas enlazadas fueron luego eluidas con un gradiente de 0.130 M a 1 M de cloruro de cesio de 10 CV, en MES 0.01 M pH 6.0 a 30 ml/minuto; se recolectaron fracciones de 25 ml sobre la cromatografía completa y la absorbancia a 280 y 215 nM fueron verfificadas periódicamente. Las fracciones de absorbancia pico fueron analizadas mediante tinción con plata SDS-PAGE (Geno Technology, St . Louis, MO) , Coomassie (Sigma, St . Louis, MO) y manchado inmunológico de Western utilizando anticuerpos contra el Ligando zalfall humano (Ejemplo 33 y Ejemplo 34) . Las fracciones pico fueron combinadas y luego concentradas en un concentrador de células agitadas sobre una membrana YM10 (Millipore/Amicon, Bedford, MA) hasta un valor nominal (1-10 ml) . La muestra fue luego cargada sobre una columna de exclusión de tamaño de alta resolución Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) apropiada (52-600 ml) equilibrada en PBS (Gibco BRL) a velocidades de flujo de 1-2 ml/minuto; fracciones de 1-2 ml fueron recolectadas sobre la cromatografía completa y se verificó periódicamente la absorbancia de 280 y 215 nM. Las fracciones pico fueron analizadas mediante tinción con plata SDS-PAGE (Geno Technology, St . Louis, MO) , y Coomassie (Sigma, St. Louis, MO) . Las fracciones de interés fueron combinadas y concentradas con concentradores giratorios centrífugos MWKO Millipore de 5 kD hasta un volumen mínimo. El producto final fue luego analizado mediante tinción con Coomassie de SDS-PAGE (Sigma, St . Louis, MO) , manchado Inmunológico de Western, secuenciamiento N-terminal, análisis de aminoácidos, y BCA (Pierce Rockford, Illinois) para la pureza y concentración de la proteína.

B. Ligando zalfall murino expresado por BHK 570 A no ser que se indique de otro modo, todas las operaciones fueron llevadas a cabo a 4°C. Se utilizó el siguiente procedimiento para verificar el Ligando zalfall murino a partir de medios condicionados por BHK (Ejemplo 18) . Los medios condicionados concentrados o no concentrados (CM) fueron esterilizados por filtración a través de filtros de 0.45 y 0.22 micrómetros. Los medios fueron luego amortiguados con MES 0.01 M (Fluka BioChemika, Suiza)) y el pH se ajustó a 6.0. El CM fue analizado, cargado y eluido sobre una columna AS como se describe en el Ejemplo 29A. Las fracciones de interés fueron combinadas y luego concentradas en un concentrador de células con agitación, como en el Ejemplo 29A, hasta un volumen de 20-30 ml. El pH fue ajustado a 7.0 y luego la muestra fue cargada ya sea sobre una columna Poros AL de 0.8 ml que tenía aproximadamente 3 mg del receptor soluble marcado, zalfallCFLAG (Ejemplo 10B) o uno con aproximadamente 10 mg del receptor de fusión zalfall-Fc4 (Ejemplo 10C) inmovilizado sobre la resina (ver método más adelante) a 1 ml/minuto sobre BioCAD SPRINT. La columna fue luego lavada con al menos 20 CV de cloruro de sodio 0.3 M/PBS (Gibco BRL) /MES 0.01 M a 10 ml/minuto. La columna fue luego rápidamente eluida con una inyección de 600 µl de glicina 0.1 M (Acido aminoacético; Glycocol, Espectro, Gardena, CA) pH 2.5 a una velocidad de flujo de 10 ml/minuto con PBS sobre un BioCAD SPRINT. Las fracciones de 1 ml fueron recolectadas por 6 segundos cada vez e inmediatamente se les neutralizó el pH con 55 µl de TRIS 2 M pH 8.8 (Tris (Hidroximetil) Aminometano, EM Science, Gibbstown, NJ) . La absorbancia a 280 y 215 nM fueron verificadas sobre la cromatografía completa. Las fracciones pico fueron analizadas con tinción con plata SDS-PAGE (Geno Technology, St. Louis, MO) , Coomassie (Sigma, St. Louis, MO) y manchado Inmunológico dde Western como se describe anteriormente. Las fracciones pico fueron combinadas y luego concentradas en un concentrador de células con agitación con en el Ejemplo 29A hasta un volumen mínimo de (1-10 ml) . la muestra fue luego cargada, equilibrada y analizada con el Ejemplo 29A, sobre una columna de exclusión de tamaño de alta resolución Sephacryl S-200 (Pharmacia) apropiada. Las fracciones pico fueron analizadas por tinción con plata SDS-PAGE (Geno Technology, St . Louis, MO) , y Coomassie (Sigma, St . Louis, MO) . Las fracciones de interés fueron combinadas y concentradas, y analizadas como en el Ejemplo 29A.

C. Inmovilización de Proteína sobre medios POROS AL Todas las operaciones fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente sobre un BioCAD 700E. Una columna de flujo empaquetado de 4.5 X 50 mm con el medio POROS AL en cloruro de sodio 2 M de acuerdo a las especificaciones de los fabricantes. La columna fue luego equilibrada en sulfato de sodio 1.1 M y fosfato de sodio 50 mM, pH 7.2. El receptor fue concentrado a 4 mg/ml utilizando un concentrador giratorio centrífugo MWKO Millipore de 30 kD y luego diluido 1:1 en sulfato de sodio 1.1 M y fosfato de sodio 50 mM, pH 7.2. La columna fue sometida a un flujo de 2 ml/minuto en sulfato de sodio 1.1 M y fosfato de sodio 50 mM, pH 7.2 e inyecciones de 100 µl del ligando diluido fueron realizadas cada 9 CVs hasta que se alcanzó el estado de reposos de saturación o el rompimiento. Un gradiente de 62 CV fue luego corrido desde sulfato de sodio 1.1 M y fosfato de sodio 50 mM pH 7.2 hasta sulfato de sodio 550 mM y fosfato de sodio 50 mM, pH 7.2, con 5 mg/ml de cianoborohidruro de sodio. La columna fue mantenida por 2 horas para completar la química de movilización. La columna fue luego equilibrada en TRIS 0.2 M, pH 7.2 con 5 mg/ml de cianoborohidruro de sodio, y se dejo reposar por 1 hora. Finalmente, la columna se equilibró en PBS con Azida de Sodio al 0.02% y luego se almacenó a 4°C hasta que fuera necesario. Antes del uso, la columna fue pre-eluida con glicina 0.1 M para asegurar que las proteínas no específicas fueran removidas, y la columna no lixiviada en el receptor inmovilizado.

Ejemplo 30 Construcción del vector de expresión, expresión purificación del Ligando zalfall humano y murino, no marcado, proveniente de Baculovirus A. Construcción para la Expresión del Ligando zalfall humano en Baculovirus Un vector de expresión, pzalfallL, fue preparado para expresar los polipéptidos del Ligando zalfall Humano en células de insecto. Una secuencia que contiene el fragmento de 517 pb para el Ligando zalfall humano y los sitios de restricción BamHl y Xhol, codificados, sobre los extremos 5' y 3' respectivamente, fue generado mediante amplificación por PCR a partir de un plásmido que contenía el ADNc del Ligando zalfall humano (Ejemplo 7) utilizando los cebadores ZC23,444 (SEQ ID No . 74) y ZC23,445 (SEQ ID No. 75) . Las condiciones de reacción de PCR fueron como sigue: 1 ciclo de 94 °C por 4 minutos, seguido por 25 ciclos de 94°C por 45 segundos, 50°C por 45 segundos, y 72°C por 2 minutos; 1 ciclo a 72°C por 10 minutos; seguido por un remojo a 4°C. El fragmento fue visualizado mediante electroforesis en gel (1% SeaPlaque/l% de NuSieve) . La banda fue extirpada, diluida a 0.5% de agarosa con cloruro de magnesio 2 mM, fundida a 65 °C, digerida con BamHl y con Xhol (Boehringer Mannheim) , y ligada dentro de un vector de expresión baculoviral digerido con BamHI/XhoI, pZBV3L. El pZBV3L es una modificación del vector de expresión de pFastBactIMR (Life Technologies) donde el promotor de polihedrina ha sido removido y reemplazado con el promotor de la proteína Básica de Activación tardía. Aproximadamente 14 nanogramos del inserto del Ligando zalfall digerido por restricción y aproximadamente 40 nanogramos del vector correspondiente fueron ligados toda la noche a 16 °C. La mezcla de ligadura fue dividida 3 veces en TE (Tris HCl 10 mM, pH 7.5 y EDTA 1 mM) y aproximadamente 4 fmol de la mezcla de ligadura diluida se transformó dentro de las células competentes Library Efficiency, DH5a (Life Technologies) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, mediante choque por calor por 45 segundos en un baño de agua a 42 °C. El ADN transformado y las células fueron diluidas en 450 µl de medio SOC, (2% de Tryptona Bacto"1*, 0.5% de Extracto de Levadura Bacto, 10 ml de cloruro de sodio 1 M, cloruro de potasio 1.5 mM, cloruro de magnesio 10 mM, sulfato de magnesio 10 mM, y glucosa 20 mM) y sembradas en placa sobre placas LB que contenían 100 µg/ml de ampicilina. Los clones fueron analizados mediante digestiones de restricción y 1 µl del clon positivo fue transformado dentro de 20 µl de las células competentes DHlOBac Max Efficiency (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, mediante choque por calor como se describe anteriormente. Las células transformadas fueron luego diluidas en 980 µl de medio SOC (2% de Tryptona BactoMR, 0.5% de Extracto de Levadura BactoMR, 10 ml de cloruro de sodio 1 M, cloruro de potasio 1.5 mM, cloruro de magnesio 10 mM, sulfato de magnesio 10 mM, y glucosa 20 mM) se desarrollaron en un incubador con agitación a 37°C por 4 horas y se sembraron sobre placas de Agar Luria que contenía 50 µg/ml de kanamicina, 7 µg/ml de gentamicina (Life Technologies) , 10 µg/ml de tetraciclina, IPTG (Pharmacia Biotech) y Bluo-Gal (Life Technologies) . Las células sembradas en placa fueron incubadas por 48 horas a 37°C. Se utilizó una selección de color para identificar aquellas células que tenían el inserto del donador que codifica para el Ligando zalfall humano, que se había incorporado dentro del plásmido (referido como un "bácmido" ) . Aquellas colonias las cuales fueron de color blanco, fueron recogidas para el análisis. El ADN Bácmido de Ligando zalfall humano fue aislado a partir de las colonias positivas utilizando el sistema QiaVac Miniprepd (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Los clones fueron seleccionados para el inserto correcto mediante amplificación de ADN utilizando los cebadores para el elemento transponible en el bácmido vía PCR utilizando los cebadores ZC447 (SEQ ID No. 76) y ZC976 (SEQ ID No. 77) . Las condiciones de reacción de PCR fueron como sigue: 35 ciclos a 94°C por 45 segundos, 50°C por 45 segundos, y 72°C por 5 minutos; 1 ciclo a 72°C por 10 minutos; seguido por remojo a 4°C. El producto de PCR fue corrido sobre un gel de agarosa al 1% para verificar el tamaño del inserto. Aquellos clones que tenían el inserto correcto fueron utilizados para transfectar las células de Spodoptera frugiperda (Sf9) .

B. Expresión y generación de material para la purificación del Ligando zalfall humano a partir de baculovirus Las células Sf9 fueron sembradas a 5 x 106 por placa de 35 mm y se dejaron acoplar por 1 hora a 27°C. cinco microlitros del ADN del bácmido del Ligando zalfall humano (arriba) fueron diluidos con 100 µl de Sf-900 II SFM (Life Technologies) . Seis microlitros del reactivo CellFCETIN (Life Technologies) se diluyeron con 100 µl de Sf-900 II SFM. El ADN bácmido y las soluciones de lípidos fueron nuevamente mezclados e incubados 30-45 minutos a temperatura ambiente. Los medios de una placa de células fueron aspirados, las células se lavaro una vez con 2 ml de medio fresco Sf-9000 II SFM. Ochocientos microlitros de Sf-900 II SFM se agregaron a la mezcla del lípido-ADN. El medio de lavado fue aspirado y la mezcla de ADN-lípido se agregó a las células. Las células fueron incubadas a 27°C por 4-5 horas. La mezcla de ADN-lípido fue aspirada y se agregaron a cada placa 2 ml del medio Sf-900 II. Las placas fueron incubadas a 27°C, 90% de humedad, por 96 horas después de lo cual el virus fue cosechado. Para la amplificación primaria, las células de Sf9 fueron desarrolladas en 50 ml de Sf-900 II SFM en un matraz de 125 ml con agitación, hasta una densidad aproximada de 0.41-0.52 x 105 células/ml. Éstas fueron infectadas con 150 µl de la reserva viral de lo anterior, e incubadas a 27°C por 3 días, después de lo cual el virus fue cosechado de acuerdo a los métodos estándares conocidos en la técnica. Una muestra de 500 µl sometida para la actividad en un ensayo BaF3 (Ejemplo 5) mostró que ésta fue biológicamente activa. Para la amplificación secundaria, las células Sf9 fueron desarrolladas en 1 litro de Sf-900 II SFM en un matraz de 2800 ml con agitación, hasta una densidad aproximada de 0.5 x 105 células/ml. Este se infectó con 500 µl de la reserva viral primaria descrita anteriormente, y se incubó a 27°C por 4 días, después de lo cual el virus fue cosechado de acuerdo a los métodos estándares conocidos en la técnica. El virus fue titulado y desarrollado a gran escala para la purificación del ligando zalfall humano, producido por el baculovirus (huzalfallL-Bv) , como se describe en el Ejemplo 30C y el Ejemplo 30D, siguientes.

C. Purificación a gran escala del ligando zalfall humano/murino expresado por el baculovirus A no ser que se indique de otro modo, todas las operaciones fueron llevadas a cabo a 4°C. Se utilizó el siguiente procedimiento para purificar el ligando zalfall humano (huzalfallL-Bv) a partir de medio condicionado por BV (Ejemplo 30B) . El medio condicionado (CM) fue esterilizado por filtración a través de filtros de 0.45 y 0.22 micrómetros, luego amortiguado con MES 0.01' M (Fluka BioChemika, Suiza) y el pH ajustado a 6.0. El CM fue luego cargado sobre una columna POROS 50 HS y corrido, las fracciones recolectadas, analizadas como se describe en el Ejemplo 29A. Las fracciones pico anteriores fueron combinadas, concentradas, corridas sobre una columna de exclusión de tamaño de alta resolución, y analizadas como se describe en el Ejemplo 29A. Las fracciones de interés provenientes de la columna de exclusión de tamaño fueron combinadas y concentradas con concentradores centrífugos MWCO Millipore de 5 kD hasta un volumen mínimo. El producto final fue luego analizado mediante Coomassie de SDS-PAGE (Sigma, St. Louis, Missouri) , manchado inmunológico de Western, secuenciamiento N-terminal, análisis de aminoácidos y CB (Pierce, Rockford, Illinois) para la pureza y concentración de la proteína como se describe en el Ejemplo 29A. La proteína a granel fue almacenada a -80 °C.

D. Purificación a pequeña escala (<2 mg) del ligando zalfall humano/murino expresado por el baculovirus A no ser que se indique de otro modo, todas las operaciones fueron llevadas a cabo a 4°C. Se utilizó el siguiente procedimiento para purificar <2 mg del ligando zalfall humano o murino a partir de los medios condicionados con BV. El CM fue filtrado, amortiguado y el pH ajustado como en el ejemplo 30C. El CM fue luego cargado, eluido y la cromatografía con POROS 50 HS fue analizada como en el Ejemplo 30C. Las fracciones se combinaron y luego se concentraron por medio de diafiltración en un concentrador de celda agitada sobre una membrana YM10 (MWCO de 10 kD) (Millipore/Amicon, Bedford. MA) a un volumen nominal (20-30 ml) . El pH se ajustó a 7.0 y luego la muestra se cargó ya sea sobre una columna Poros AL 0.8 ml que tenía aproximadamente 3 mg del receptor soluble zalfallCFLAG (Ejemplo 10B) o una con aproximadamente 10 mg del receptor soluble de fusión zalfall-Fc4 (Ejemplo 10C) inmovilizado sobre la resina (ver el método del Ejemplo 29C) a 1 ml/minuto sobre BioCad SPRINT. La columna fue lavada con al menos 20 CV de NaCl 0.3 M/PBS (Gibco BRL) MES 0.01 M a 10 ml/minuto. La columna fue luego rápidamente eluida con una inyección de 600 µl de glicina 0.1 M (Ácido aminoacético; Glicocola, Spectrum Gardena, CA) pH 2.5 a una velocidad de flujo de 10 ml/min con PBS sobre un BioCAD SPRINT. Las fracciones de 1 ml fueron recolectadas por 6 segundos cada vez e inmediatamente el pH se neutralizó con 55 µl de TRIS 2 M (Tris (hidroximetil) aminometano, EM Science, Gibbstown, NJ) pH. 8.8 La absorbancia a 280 y 25 nm se verificaron periódicamente sobre la cromatografía completa. Las fracciones fueron analizadas como se describe anteriormente. Las fracciones pico fueron combinadas y luego concentradas por medio de diafiltración en un concentrador de celdas agitado, sobre una membrana YM10 (MWCO de 10 kD) (Millipore/Amicon, Bedford, MA) a 1-2 ml . La muestra fue luego cargada sobre una columna de exclusión de tamaño de alta resolución Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) apropiada, equilibrada en PBS (Gibco BRL) a una velocidad de flujo óptima; las fracciones se recolectaron sobre la cromatografía completa y se verificó periódicamente la absorbancia a 280 y 15 nm. Las fracciones fueron analizadas como se describe anteriormente. 1 ciclo de 94°C por 2 minutos, seguido por 35 ciclos de 94°C por 15 segundos, 50°C por 30 segundos, y 72°C por 2 minutos; 1 ciclo a 72 °C por 10 minutos; seguido por un remojo a 4°C. Una pequeña porción del producto de PCR fue visualizada mediante electroforesis en gel (1% de agarosa NuSieve) . El resto del fragmento fue purificado utilizando el equipo de purificación de PCR Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante y eluido con 30 µl de H20. El fragmento fue luego digerido con Bspel y Xbal (Boerhinger Mannheim) que son enzimas de restricción, a 37°C por aproximadamente 2 horas, luego corrido sobre un gel de agarosa como se describe anteriormente . La banda fue extirpada, purificada y eluida utilizando el equipo de extracción en gel Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento purificado fue ligado dentro del vector de expresión baculoviral digerido con Bspel/Xbal, pZBV37L. El vector pZBV37L es una modificación del vector de expresión de pFastBacIMR (Life Technologies) , donde el promotor de polihedrina ha sido removido y remplazado con el Promotor de Proteína Básica de activación tardía, seguido por la secuencia de señal secretora a partir de la UDP-Glucosiltransferasa de Ecdisteroide (EGT) . Aproximadamente 5 µl del inserto del ligando zalfall murino, digerido por restricción, y aproximadamente 100 ng del vector cortado correspondiente fueron ligados toda la noche a 16°C en aproximadamente 20 µl . Cinco µl de la mezcla de ligadura se sometieron a electroporesis en 50 µl de células bacterianan electrocompetentes Life Technologies DH12S utilizando una cubeta de 2 mm con ajustes de 2 kv, 25 µF y 400 ohmios. Las células sometidas a la electroporesis fueron rescatadas en 1 ml de medio SOC (2% de Triptona de Bacto1"1, 0.5% de Extracto de Levadura Bacto, 10 ml de cloruro de sodio 1M, cloruro de potasio 1.5 mM, cloruro de magnesio 10 mM, sulfato de magnesio 10 mM, y glucosa 20 mM (Gibco BRL) ) desarrolladas a 37°C por aproximadamente 1 hora y sembradas en placa sobre placas de LB que contenían 100 µg/ml de ampicilina. El ADN proveniente de los clones fue aislado y analizado mediante digestiones de restricción para identificar los clones positivos. Aproximadamente 5 ng de ADN provenientes de un clon positivo fueron transformados en 20 µl de células competentes DHlOBac Max Efficiency (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, mediante choque térmico por 45 segundos en un baño de agua a 42 °C. Las células transformadas fueron luego diluidas y desarrolladas como se describe en el Ejemplo 30A. Los bácmidos que contenían el inserto del ligando zalfall murino fueron identificados y aislados como se describe en el Ejemplo 30A. Los clones fueron seleccionados para el inserto correcto mediante amplificación del ADN utilizando los cebadores para el elemento transponible en el bácmido vía la PCR utilizando los cebadores ZC447 (SEQ ID NO: 76) y ZC976 (SEQ ID NO_77). Las condiciones de reacción de PCR fueron como sigue: 35 ciclos de 94 °C por 45 segundos, 50 °C por 45 segundos, y 72 °C por 5 mintuos; 1 ciclo a 72 °C por 10 minutos; seguido por un remojo a 4°C. El producto de PCR fue corrido sobre un gel de agarosa al 1% para verificar el tamaño del inserto. Aquellos que tenían el inserto correcto fueron utilizados para transfectar las células de Spodoptera frugiperda (Sf9) .

F. Expresión y generación de material para la purificación de zalfall de ratón a partir de baculovirus Se sembraron células de Sf9 a 1 millón de células por placa de 35 mm y se dejaron acoplar por 1 hora a 27°C. El ADN del bácmido del ligando zalfall murino fue transfectado como se describe en el Ejemplo 30B y el virus fue cosechado. Para la amplificación primaria, las células Sf9 fueron sembradas como se describe anteriormente y se agregaron 500 µl del sobrenadante 72 horas después de la transfección, y los cultivos se dejaron proceder por 96 horas después de lo cual el virus fue cosechado de acuerdo a los métodos estándares.

Para la amplificación secundaria, las células Sf9 fueron sembradas como se describe anteriormente y se agregaron 200 µl de la reserva viral Primaria. Los cultivos fueron incubados a 27°C por 72 horas, después de lo cual el virus fue cosechado de acuerdo a los métodos estándares . Para la amplificación terciaria, 10 µl de la reserva viral Amplificada Secundaria fueron colocadas sobre las SF9s a 500,000 células por pozo en 50 ml de medio SF900II en un matraz con agitación de 250 ml por 6 días, y el virus fue cosechado como se describe anteriormente. El virus fue titulado y desarrollado a gran escala para la purificación del ligando zalfall murino producido por el baculovirus ( (muzalfallL-Bv) , como se describe en el Ejemplo 30C y en el Ejemplo 30D. La presencia de la proteína de peso molecular predicho en el sobrenadante, fue determinada mediante análisis de Western utilizando un anticuerpo policlonal anti-huzalfallL/MBP-6H (Ejemplo 27) . El análisis del ensayo de proliferación basado en BaF3 (Ejemplo 5) también mostró que el ligando secretado fue activo.

Ejemplo 31 Expresión del ligando zalfall humano y de ratón en E. coli A. Construcción del vector de expresión de fusión ligando zalfall humano-MBP, ptap98/ligando zalfall Un plásmido de expresión que contenía un polinucleótido que codifica para parte del ligando zalfall humano fusionado N-terminalmente a la proteína de enlace a la maltosa (MBP) fue construido por medio de recombinación homologa. Un fragmento del ADNc del ligando zalfall humano (SEQ ID NO:l) fue aislado utilizando PCR. Se utilizaron dos cebadores en la producción del fragmento del ligando zalfall en una reacción de PCR: (1) cebador ZC22,128 (SEQ ID NO:78), que contiene 40 pb de la secuencia flanqueante al vector y 26 pb correspondientes al extremo amino del ligando zalfall, (2) el cebador ZC22,127 (SEQ ID NO:79), que contenía 40 pb del extremo 3' correspondientes a la secuencia vector flanqueante y 28 pb correspondientes al extremo carboxilo del ligando zalfall humano. Las condiciones de reacción de PCR fueron como sigue: 25 ciclos de 94°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos, y 72°C por 1 minuto; seguido por un remojo de 4°C, corrido por duplicado. Dos µl de la reacción de PCR de 100 µl fueron corridos sobre un gel de agarosa al 1.0% con un amortiguador 1 x TBE para el análisis, mostrando la banda esperada de aproximadamente 472 pb. Los 90 µl remanentes de la reacción de PCR fueron combinados con el segundo tubo de PCR precipitado con 400 µl de etanol absoluto para ser utilizados para la recombinación dentro del vector pTAP98 cortado con Smal para producir la construcción que codifica para al fusión MBP-ligando zalfall como se describe más adelante. El plásmido pTAP98 fue derivado de los plásmidos pRS316 y pMAL-c2. El plásmido pR316 es un vector lanzadera de Saccharomyces cerevisiae (Hieter P. Y Sikorski, R. , Genetics 122:19-27, 1989). pMAL-C2 (NEB) es un plásmido de expresión de E. coli . Este posee el promotor tac que impulsa a MalE (gen que codifica para MBP) seguido por un marcador His, un sitio de escisión de trombina, un sitio de clonación, y un terminador rrnB. El vector pTAP98 fue construido utilizando la recombinación homologa en levadura. 100 ng de pMAL-c2 cortado con EcoRI se recombinó con Iµg de pRS316 cortado con Pvul, 1 µg de ligador, y 1 µg de pRS316 cortado con Scal/EcoRI. El ligador consistió de los oligos ZC19,372 (SEQ ID NO:80) (100 pmol); ZC19,351 (SEQ ID NO:81) (1 pmol): ZC19,352 (SEQ ID NO:82) (1 pmol) ZC19,371 (SEQ ID NO: 83) (100 pmol) combinados en una reacción de PCR. Las condiciones fueron como sigue: 10 ciclos de 94°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos, y 72°C por 30 segundos; seguido por un remojo de 4°C. Los productos de PCR fueron concentrados por medio de precipitación con etanol al 100%. Cien microlitros de células de levadura competentes {S. cerevisiae) fueron combinadas con 10 µl de una mezcla que contenía aproximadamente 1 µg de producto de PCR del ligando zalfall, y 100 ng del vector pTAP98 digerido con Smal, transferidos a una cubeta de electroporación de 0.2 cm. La mezcla de levadura/ADN fue sometida a electropulsos a 0.75 kV (5 kV/cm) , ohmios infinitos 2.5 µ. A cada cubeta se agregaron 600 µl de sorbitol 1.2 M. La levadura fue luego sembrada en placa en dos alícuotas de 300 µl sobre dos placas URA D e incubada a 30°C. Después de aproximadamente 48 horas, los transformantes de levadura Ura+ provenientes de una placa simple fueron resuspendidos en 1 ml de agua y centrifugados brevemente para concentrar las células de levadura . El botón o concentrado celular se resuspendió en 1 ml de amortiguador de lisis (2% de Tritón X-100, 1% de SDS, cloruro de sodio 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM) . Quinientos microlitros de la mezcla de lisis fueron agregados a un tubo Eppendorf que contenía 300 µl de esferas de vidrio lavadas con ácido y 200 µl de fenol-cloroformo, se agitaron en torbellino por intervalos de 1 minuto dos o tres veces, seguido por una centrifugación de 5 minutos en una centrífuga Eppendorf a velocidad máxima. Trescientos microlitros de la fase acuosa se transfirieron a un tubo fresco, y el ADN precipitó con 600 µl de etanol (EtOH) , seguido por centrifugación por 10 minutos a 4°C. El botón de ADN fue resuspendido en 100 µl de H20. La transformación de las células de E. coli electrocompetentes (MC1061, Casadaban y colaboradores, J. Mol. Biol.. 138, 179-207) se realizó con 1 µl de preparación de ADN de levadura y 40 µl de células MC1061. Las células fueron electropulsadas a 2.0 kV, 25 µF y 400 ohmios. Después de la electroporación, se sembraron en placas 0.6 ml de SOC (2% de triptona BactoRM (Difco, Detroit, MI), 0.5% de extracto de levadura (Difco), cloruro de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2.5 mM, cloruro de magnesio 10 mM, sulfato de magnesio 10 mM, glucosa 20 mM) en una alícuota sobre placas LB AMP (caldo LB (Lennox) , 1.8% de agar BactoRM (Difco), 100 mg/l de ampicilina). Los clones individuales que albergan la construcción de expresión correcta para el ligando zalfall humano fueron identificados mediante expresión. Las células fueron desarrolladas en Superbroth II (Becton Dickinson) con 100 µg/ml de ampicilina, toda la noche. 50 µl del cultivo de toda la noche se utilizaron para inocular 2 ml de Superbroth II + 100 µl/ml de ampicilina, fresco.

Los cultivos fueron desarrollados a 37°C, agitando por 2 horas. 1 ml del cultivo fue inducido con IPTG 1 M. 2-4 horas más tarde 250 µl de cada cultivo fueron mezclados con 250 µl de esferas de vidrio lavadas con ácido, y 250 µl de amortiguador Thorner con 5% de ßME y colorante (urea 8 M, Tris 100 mM, pH 7.0, 10% de glicerol, EDTA 2 mM, 5% de SDS) . Las muestras fueron agitadas en torbellino por un minuto y calentadas a 65°C por 5-10 minutos. Se cargaron 20 µl por banda sobre un gel PAGE al 4-12% (NOVEX) . Los geles fueron corridos en el amortiguador 1XMES . Los clones positivos fueron designados pTAP126 y sujetos a análisis secuencial. La secuencia polinucleotídica de la fusión MBP-ligando zalfall humano dentro de pTAP126 se muestra en la SEQ ID NO: 84, y el polipéptido correspondiente en la SEQ ID NO: 85.

B. Expresión bacteriana del ligando zalfall humano Un microlitro del ADN de secuenciamiento fue utilizado para transformar la cepa W3110 (ATCC) . Las células fueron sometidas a electropulsos a 2.0 kV, 25 µF y 400 ohmios. Después de la electroporación, se sembraron en placas 0.6 ml de SOC (2% de triptona BactoRM (Difco, Detroit, MI), 0.5% de extracto de levadura (Difco), cloruro de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2.5 mM, cloruro de magnesio 10 mM, sulfato de magnesio 10 mM, glucosa 20 mM) en una alícuota sobre placas LB AMP (caldo LB (Lennox) , 1.8% de agar Bacto™ (Difco), 100 mg/l de ampicilina) . Los clones individuales fueron expresados . Las células fueron desarrolladas en Superbroth II (Becton Dickinson) con 100 µg/ml de ampicilina toda la noche. 50 µg del cultivo de toda la noche fueron utilizados para inocular 2 ml de la mezcla Superbroth II + 100 µg/ml de ampicilina, fresca. Los cultivos fueron desarrollados a 37°C, agitando por 2 horas. 1 ml del cultivo fue inducido con IPTG 1 mM. 2-4 horas más tarde se mezclaron 250 µl de cada cultivo con 250 µl de esferas de vidrio lavadas con ácido y 250 µl de amortiguador Thorner con 5% de ßME y colorante (urea 8 M, Tris 100 mM, pH 7.0, 10% de glicerol, EDTA 2 mM, 5% de SDS) . Las muestras fueron agitadas en torbellino por un minuto y calentadas 65 °C por 10 minutos. Se cargaron 20 µl por banda sobre un gel PAGE al 4-12% (NOVEX) . Los geles fueron corridos en el amortiguador 1XMES. Los clones positivos fueron utilizados para aumentar la purificación de la proteína de la proteína de fusión huzalfallL/MBP-6H (Ejemplo 32, más adelante).

C. Construcción del vector de expresión pTAP98/ligando zalfall de ratón de la fusión ligando zalfall de ratón-MBP Un plásmido de expresión que contenía un polinucleótido que codifica para parte del ligando zalfall de ratón fusionado N-terminalmente a la proteína de enlace a la maltosa (MBP) se construyó por medio de recombinación homologa, como se describe en el Ejemplo 31A. Un fragmento de ADNc del ligando zalfall de ratón (SEQ ID NO: 55) se aisló utilizando PCR. Se utilizaron dos cebadores en la producción del fragmento del ligando zalfall de ratón en una reacción de PCR: (1) cebador ZC22,849 (SEQ ID NO:86), que conteniene 40 pb de la secuencia flanqueante del vector y 24 pb correspondientes al extremo amino del ligando zalfall de ratón, y (2) el cebador ZC22,850 (SEQ ID NO:87), que contiene 40 pb del extremo 3' correspondiente a la secuencia vector flanqueante y 21 pb correspondientes al extremo carboxilo del ligando zalfall de ratón. Las condiciones de reacción de PCR fueron como se describe anteriormente. El fragmento de aproximadamente 450 pb fue clonado dentro de pTAP98 como se describe anteriormente. Los clones fueron transformados, identificados y desarrollados como se describe anteriormente. Los clones positivos fueron designados pTAP134 y sujetos a análisis secuencial. La secuencia polinucleotídica de la fusión MBP-ligando zalfall de ratón dentro de pTAB134 es mostrada en la SEQ ID NO: 88, y la secuencia polipeptídica correspondiente mostrada en la SEQ ID NO: 89. Los clones positivos fueron utilizados para desarrollar en E. coli como se describe anteriormente para la purificación de la proteína de fusión muzalfallL/MBP-6H (Ejemplo 32) .

Ejemplo 32 Purificación del ligando zalfall-MBP o el receptor de zalfall-MBP A no ser que se indique de otro modo, todas las operaciones fueron llevadas a cabo a 4°C. Se utilizó el siguiente procedimiento para purificar las fusiones del ligando zalfall-MBP para el ligando zalfall humano-MBP (huzalfallL/MBP-6H) o el ligando zalfall murino-MBP (muzalfallL/MBP-6H) proveniente de E. coli . Las fusiones del receptor zalfall de ratón o humano-MBP fueron llevadas a cabo utilizando el mismo método. La pasta de E. coli congelada, pre-centrifugada, fue descongelada y diluida en 2 litros de amortiguador B (Tris 0.02 M (EM Science); cloruro de sodio 0.2 M (Mallincordt) ; 2-mercapto-etanol 0.01 M (EM Science); pH 8.0; con 5 mg/l de pepstatina A (Boerhinger Mannheim) ; 5 mg/l de Aprotinina (Boerhinger Mannheim) ; y 1 mg/l de PMSF (Fluka) más 1-2 ml de un reactivo anti-espumante AF289 anti-espuma (Sigma) . La mezcla fue procesada en un desintegrador de células French Press pre-enfriado (Constant Systems LTD) con 1406-2109 kg/cm2 (20-30 kPSI) . El lisado fue luego centrifugado a 18,000 x g por 45 minutos a 4°C; el sobrenadante fue retenido. Una suspensión de 200 ml de resina Amylose (new England BioLabs) , pre-equilibrada en amortiguador A (Tris 0.02 M (EM Science); cloruro de sodio 0.2 M (Mallincrodt) ; 2-mercapto-etanol 0.01 M (EM-Science) ; pH 8.0), fue agregado al sobrenadante del lisado e incubado toda la noche en botellas giratorias de 2 1 para permitir la absorción máxima del lote, de la proteína de fusión MBP. La resina fue lavada en el formato de columna en lotes para volúmenes > 5 columnas con amortiguador A, luego eluida en lotes con el amortiguador C (amortiguador A, con maltosa 0.02 M (Sigma) ) . Las fracciones crudas fueron recolectadas y verificadas periódicamente por la absorbancia a 280 mm. La proteína eluida fue analizada mediante tinción de Comassie (Sigma) de SDS NuPAGE (NOVEX) . La muestra y la proteína a granel fueron almacenados a -80°C.

Ejemplo 33 Anticuerpos policlonales para el ligando zalfall humano Los anticuerpos policlonales para el ligando zalfall humano fueron preparados mediante la inmunización de 2 conejos blancos New Zeland hembras, con la proteína recombinante purificada huzalfallL/MPB-6H (Ejemplo 32) o la proteína recombinante de CHO purificada, huzalfallL-CHO (Ejemplo 29) . A los conejos se les administró una inyección intraperitoneal inicial de 200 mg de proteína purificada en Adyuvante Completo de Freund seguido por inyecciones ip de refuerzo de 100 mg de proteína purificada en Adyuvante Incompleta de Freund, cada tres semanas. Siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo (3 inyecciones totales) , los animales fueron sangrados y el suero fue recolectado. Los animales fueron luego reforzados y sangrados cada tres semanas . El suero de conejo producido para huzalfallL/MBP-6H fue pre-adsorbido de los anticuerpos anti-MBP utilizando una columna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que fue preparada utilizando 10 mg de MBP recombinante, purificada por gramo de CNBr-SEPHAROSE (Pharmacia) . MBP recombinante fue elaborada y purificada sobre una columna de amilosa domésticamente, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos policlonales específicos del ligando huzalfall fueron purificados por afinidad a partir de suero de conejo utilizando una columna de proteína CNBr-SEHPAROSE 4B (Pharmacia LKB) que se preparó utilizando 10 mg de la proteína recombinante purificada por antígeno específico, huzalfallL/MBP-6H o 10 mg de la proteína recombinante de CHO purificada, huzalfallL-CHO por gramo de CNBr-SEPHAROSE, seguido por diálisis 20X en PBS, toda la noche. Los anticuerpos específicos del ligando huzalfallL fueron caracterizados por ELISA utilizando 1 µg/ml de las proteínas recombinantes purificadas, huzalfallL/MBP-6H (Ejemplo 32) , el ligando zalfall humano (huzalfallL-CHO) (Ejemplo 29) , o muzalfallL-MBP/6H (Ejemplo 32) como objetivos de anticuerpo. El límite inferior de la detección (LLD) del anticuerpo purificado por afinidad, de conejo anti-huzalfallL/MBP-6H fue de 10 ng/ml sobre su antígeno recombinante purificado, específico, huzalfallL/MBP-6H, 500 pg/ml sobre huzalfallL-CHO recombinante, purificado, y 100 pg/ml sobre muzalfallL/MBP-6H recombinante purificado (Ejemplo 32) . El LLD del anticuerpo de conejo purificado por afinidad, anti -huzalfallL-CHO fue de 20 pg/ml sobre su antígeno recombinante específico, purificado, huzalfallL- CHO, 500 pg/ml sobre huzalfallL/MBP-6H recombinante, purificado, y 50 ng/ml sobre muzalfallL/MBP-6H recombinante, purificado.

Ejemplo 34 Anticuerpos Anti-peptídicos del ligando zalfall humano Los anticuerpps policlonales anti-peptídicos del ligando zalfall humano fueron preparados mediante la inmunización de 2 conejos blancos New Zealand hembra con el péptido de ligando zalfall humano, huzalfallL-1 (SEQ ID NO: 72) o huzalfallL-3 (SEQ ID NO: 73) . Los péptidos fueron sintetizados utilizando un sintetizador de péptidos Applied biosystems Modelo 431A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los péptidos fueron luego conjugados a la proteína portadora, hemocianina de lapa (KLH) con activación por maleimida. A los conejos se les administró una inyección intraperitoneal inicial de 200 mg de péptido en Adyuvante Completo de Freund, seguido por inyecciones peritoneales de refuerzo de 100 mg de péptido en Adyuvante Incompleto de Freund cada 3 semanas . Siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo (3 inyecciones totales) , los animales fueron sangrados y el suero fue recolectado. Los animales fueron luego reforzados y sangrados cada tres semanas.

Los sueros de conejo producidos para los péptidos del ligando zalfall humano fueron caracterizados por una verificación del título por ELISA utilizando un 1 µg/ml del péptido respectivo utilizado para elaborar el anticuerpo (SEQ ID NO: 72 O SEQ ID NO: 73) como un objetivo de anticuerpo. Los 2 sueros de conejo para el péptido huzalfallL-1 tuvieron un título para su péptido específico a una dilución de 1:5,000,000 (1:5E6). Los 2 sueros de conejo para el péptido huzalfallL-3 tuvieron el título para su péptido específico a una dilución de 1:5E6. Los anticuerpos policlonales específicos del péptido del ligando zalfall humano, fueron purificados por afinidad a partir de suero de conejo utilizando las columnas de proteína de CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que fueron preparadas utilizando 10 mg del péptido específico respectivo (SEQ ID NO: 72 o SEQ ID NO: 73) por gramo de CNBr-SEPHAROSE, seguido por diálisis 20X en PBS toda la noche. Los anticuerpos específicos del ligando huzalfall fueron caracterizados por una verificación del título por ELISA utilizando 1 µg/ml del antígeno peptídico purificado, apropiado o las proteínas de longitud completa, recombinantes purificadas como objetivos de anticuerpos. El límite inferior de detección (LLD) del anticuerpo purificado por afinidad anti-huzalfallL-1, de conejo es de 500 pg/ml sobre su antígeno peptídico específico (huzalfallL-1; SEQ ID NO.-72), 500 pg/ml sobre el huzalfallL/MBP-6H recombinante, purificado (Ejemplo 32) y 500 pg/ml sobre el huzalfallL/MBP-CHO recombinante, purificado (Ejemplo 29) . No se observó reactividad cruzada para el muzalfallL/MBP-6H recombinante, purificado (Ejemplo 32) . El LLD del anticuerpo purificado por afinidad anti-huzalfallL-3 de conejo es de 50 pg/ml sobre su antígeno peptídico específico (huzalfallL-1; SEQ ID NO:73); 50 pg/ml sobre el huzalfallL/MBP-6H recombinante, purificado, 50 pg/ml sobre el huzalfallL/MBP-CHO recombinante, purificado (Ejemplo 29) y 100 pg/ml sobre el huzalfallL-Bv recombinante, de baculovirus, purificado (Ejemplo 30) . La reactividad cruzada fue observada para el muzalfallL/MBP-6H recombinante, purificado (Ejemplo 32) con un LLD de 5 ng/ml .

Ejemplo 35 Anticuerpos monoclonales para el receptor de zalfall humano Los anticuerpos monoclonales para el receptor de zalfall fueron preparados mediante la inmunización de 5 ratones BalbC (Harían Sprague Dawley, Indianápolis, IN) con la proteína receptora soluble recombinante, purificada, zalfallCEE (huzalfallL-CEE-BHK) (Ejemplo 10A) . A los ratones se les administró una inyección intraperitoneal inicial de 20 mg de proteína purificada en Adyuvante Completo de Freund (Pierce, Rockford, IL) seguido por inyecciones IP de refuerzo de 10 mg de proteína purificada en Adyuvante Incompleto de Freund cada dos semanas. Siete a diez días después de la administración de la tercera inyección de refuerzo, los animales fueron sangrados y el suero fue recolectado. Las muestras de suero de ratón producidas para el huzalfallL-CEE-BHK fueron caracterizadas por una verificación del título por ELISA utilizando la proteína huzalfallL-Fc de CHO (Ejemplo 10C) como un objetivo de anticuerpo. Una muestra de suero de ratón tuvo un título para el objetivo del anticuerpo específico a una dilución de 1:1,000,000 (1:1E6). Cuatro muestras de suero de ratón tuvieron títulos para el objetivo de anticuerpo específico a una dilución de 1:100,000 (1:1E5). Fueron cosechados esplenocitos de 4 ratones con alto título y fusionados a células de mieloma murino SP2/0 utilizando PET 1500 (Boerhinger Mannheim, Reino Unido) en dos procedimientos de fusión separados utilizando una proporción de fusión de los esplenocitos a las células de mieloma de 4.1' (Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow y D. Lañe, Cold Spring Harbor Press) . Después de 10 días de desarrollo después de la fusión, los hibridomas productores de anticuerpo específico, fueron identificados mediante ELISA utilizando la proteína zalfall-Fc4 humana de BHK, recombinante, purificada (Ejemplo 10C) como un objetivo de anticuerpo y mediante FACS utilizando células Baf3 que expresan la secuencia huzalfall (Ejemplo 4 y Ejemplo 2) como un objetivo de anticuerpo. Los 4 hibridomas resultantes positivos por ambos métodos fueron clonados tres veces mediante dilución limitante. Los anticuerpos fueron designados: 249.8.2.1.2.2; 247.10.2.15.4.6; 249.19.2.2.3.5; y 249.15.2.4.2.7.

Ejemplo 36 Ratones transgénicos del ligando zalfall A. Generación ratones transgénicos que expresan el ligando zalfall de humano y de ratón Los ligandos de ADN provenientes de vectores transgénicos (Ejemplo 22 y Ejemplo 26) que contenían las secuencias flanqueantes 5' y 3' del promotor respectivo (promotor MT-1 específico del hígado (ligando zalfall de ratón (Ejemplo 26B) o el promotor LCK específico de la línea linfoide (ligando zalfall de humano y de ratón (Ejemplos 26A y 22B) , el intrón de la insulina II de rata, el ADNc del ligando zalfall y la secuencia poli A de la hormona del crecimiento, fueron preparados y utilizados para la microinyección dentro de oocitos murinos B6C3fl fertilizados (Taconic, Germantown, NY) utilizando un protocolo de microinyección estándar. Ver, Hogan, B. y colaboradores, Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994. Ocho ratones transgénicos que expresan el ligando zalfall humano a partir del promotor EµLCK específico de la línea linfoide, fueron identificados entre 44 cachorros. Cuatro de éstos fueron cachorros que murieron y 4 se desarrollaron hasta la edad adulta. Los niveles de expresión fueron claramente bajos en estos animales. Veinte ratones transgénicos que expresan el ligando zalfall de ratón a partir del promotor EµLCK específico de la línea linfoide, fueron identificados entre 77 cachorros. Los 20 se desarrollaron hasta la edad adulta. Los niveles de expresión fueron claramente bajos en estos animales. Tres ratones transgénicos que expresaron el ligando zalfall de ratón a partir de promotor MT-1 específico del hígado, fueron identificados entre 60 cachorros . Dos de estos cachorros murieron y 1 se desarrolló hasta la edad adulta. Los niveles de expresión fueron claramente bajos en estos animales. Los tejidos fueron preparados y examinados histológicamente como se describe más adelante.

B. Evaluación microscópica de los tejidos a partir de ratones transgénicos El bazo, el timo y los nodulos linfáticos mesentéricos fueron recolectados y preparados para el examen histológico a partir de animales transgénicos que expresan el ligando zalfall humano y de ratón (Ejemplo 36A) . Otros tejidos que fueron rutinariamente cosechados incluyeron los siguientes: hígado, corazón, pulmón, riñon, piel, glándula mamaria, páncreas, estómago, intestino delgado y grueso, cerebro, glándulas salivales, traquea, esófago, adrenales, pituitaria, tracto reproductivo, glándulas sexuales accesorias masculinas, músculo esquelético incluyendo nervio periférico, y fémur con médula ósea. Los tejidos fueron cosechados a partir de un cachorro neonato el cual murió inesperadamente, y varios ratones transgénicos adultos, como se describe más adelante. Las muestras fueron fijadas en formalina amortiguada al 10%, rutinariamente procesadas, incrustadas en parafina, seccionadas a 5 micrómetros, y teñidas con hematoxilina y eosina. Los portaobjetos fueron examinados y calificados para la severidad de los cambios tisulares (0=ninguno, l=leve, 2=moderado, 3=severo) por un patólogo veterinario certificado, ciego al tratamiento.

El cachorro y dos ratones adultos hembra que expresan el ligando zalfall humano, y 3 de los 6 ratones adultos macho que expresan el ligando zalfall de ratón mostraron infiltrados inflamatorios en muchos de los tejidos examinados. Los órganos afectados variaron algo de ratón a ratón. El filtrado inflamatorio fue compuesto principalmente de neutrófilos y macrófagos en números y proporciones variantes, y fue en general leve a moderado en el grado de severidad. Además, esos animales mostraron cambios en los órganos linfoides, incluyendo linfopenia moderada a severa en el bazo y el timo (transgénicos del ligando zalfall de humano y de ratón) ; y linfopenia severa (transgénicos del ligando zalfall humano) , o supuración leve a severa por la linfadenitis piogranulomatosa (transgénicos del ligando zalfall de ratón) en nodulos linfáticos. Además, fue evidente la hematopoyesis extramedular incrementada en los bazos. Estos cambios no fueron observados en ratones control de igual edad.

C. Análisis citométrico de flujo de tejidos provenientes de ratones transgénicos que sobre-expresan el ligando zalfall Animales transgénicos que sobre-expresan ya sea el ligando zalfall de humano o de ratón (Ejemplo 36A) fueron sacrificados para el análisis citométrico de flujo de sangre periférica, timo, nodulos linfáticos, médula ósea y bazo . Las suspensiones celulares fueron realizadas a partir del bazo, del timo y de los nodulos linfáticos mediante trituración de los órganos con fórceps en medio de cultivo enfriado con hielo (500 ml de medio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) ; 5 ml de L-glutamina lOOx (Gibco BRL. Grand Island, NY) , 5 ml de Piruvato de sodio lOOx (Gibco BRL) ; 5 ml de penicilina 100X, estreptomicina, neomicina (PSN) (Gibco BRL) y luego prensando suavemente las células a través de una coladera celular (Falcon, VWR Seatle, WA) , se recolectaron 200 ml de sangre periférica en tubos heparinizados y se diluyeron a 10 mis con HBSS que contenía 10U de heparina/ml . Los eritrocitos fueron removidos del bazo y de las preparaciones de sangre periférica mediante lisis hipotónica. Las suspensiones de células de médula ósea fueron realizadas mediante lavado a chorro de la médula proveniente de los fémures, con medio de cultivo enfriado con hielo. Las células fueron contadas y probadas para la viabilidad utilizando Azul de Tripan (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) . Las células fueron resuspendidas sobre medios de tinción enfriados con hielo (HBSS, 1% de suero fetal bovino, 0.1% de azida de sodio) a una concentración de diez millones por mililitro. El bloqueo del receptor Fc y el enlace no específico de los anticuerpos a las células fue logrado mediante la adición de sueros de cabra normales al 10% y el bloque Fc (Pharmigen, La Jolla, CA) a la suspensión celular. Las suspensiones celulares fueron mezcladas con volúmenes iguales de anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromo (PharMingen) , incubados sobre hielo por 60 minutos y luego lavados dos veces con amortiguador de lavado enfriado con hielo (PBS, 1% de suero fetal bovino, 0.1% de azida de sodio) antes de la resuspensión en 400 ml de amortiguador de lavado que contenía 1 mg/ml de 7-AAD (Molecular Probes, Eugene, OR) como un marcador de viabilidad en algunos ejemplos. Los datos del flujo fueron adquiridos sobre un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems, San José, CA) . La adquisición y los análisis fueron realizados utilizando el programa CellQuest (BD Immunocyutometry Systems) . Los animales transgénicos que expresaron el ligando zalfall ya sea humano o de ratón, a los más altos niveles, tuvieron poblaciones celulares dramáticamente alteradas en todos los órganos linfoides analizados . Los cambios observados incluyeron la pérdida completa de la celularidad tímica, ausencia completa de células B positivas a CD45R, y tamaño incrementado y celularidad incrementada de los bazos. El bazo y la médula ósea tuvieron números incrementados de células de tamaño mieloide, lo cual fue explicado por los incrementos en los monocitos y en los neutrófilos. El pan-marcador de células NK (DX5) fue incrementado en muchas poblaciones. Los fundadores de expresión moderada tuvieron cambios menos dramáticos pero todavía significativos, consistentes con el fenotipo observado en los expresadores altos . Los ratones con el más bajo nivel de expresión no tuvieron un incremento significativo en las células mieloides ni disminución en los números de células B. Estos no mostraron cambios significativos en las poblaciones de timocitos con disminuciones en las células doblemente positivas CD4+CD8+ e incrementos en las células positivas a CD4 y a CD8 simples .

Ejemplo 37 Estudio de dosis-respuesta de la proteína humana recombinante purificada, del ligando zalfall, en ratones normales A. Resumen Seis ratones hembra normales de seis semanas de edad C57B1/6 (Harían Sprague Dawley, Indianápolis, IN) . Fueron tratados mediante inyección peritoneal una vez al día por cuatro u ocho días con uno de los cuatro niveles de dosis del ligando zalfall humano, recombinante, purificado (Ejemplo 24) a 0.1, 0.5, 5 o 50 µg/ratón/día o con vehículo como un control . Los pesos corporales y las temperaturas corporales fueron verificados diariamente. Ya sea en el día cuatro o en el día nueve, cuatro de los ocho ratones provenientes de cada grupo de tratamiento con proteína y cinco de los diez ratones en el grupo control con vehículo fueron sacrificados. Se cosecharon y se analizaron la sangre, la médula ósea y los tejidos, las perturbaciones potenciales en los tejidos linfoides fueron examinadas, así como los parámetros fisiológicos y toxicológicos generales. No existió evidencia de toxicidad de la proteína del ligando zalfall humano a cualquiera de las dosis probadas . Los pesos corporales y las temperaturas permanecieron sin cambio. No existieron cambios aparentes en los parámetros de la química clínica. No obstante, existieron hallazgos consistentes relacionados a los porcentajes incrementados de las células de la línea mieloide en médula ósea, en bazo y en sangre periférica en ratones tratados con la más alta dosis del ligando zalfall en comparación al grupo control con vehículo. Existió un incremento estadísticamente significativo en las células de tamaño de la línea mieloide identificadas mediante análisis citométrico de flujo del homogeneizado de bazo en el grupo de alta dosis. Los bazos de los dos grupos de más alta dosis fueron estadísticamente significativamente más grandes que los otros grupos. En el examen histopatológico médico, no obstante, únicamente fue observado un incremento marginal en la hematopoyesis extramedularmente en el grupo de más alta dosis. Existió un incremento estadísticamente significativo en la proporción mieloide a eritroide de la médula ósea en el grupo con dosis más alta, en comparación a los otros grupos. Finalmente, existieron incrementos observados en la sangre periférica en las cuentas de células sanguíneas blancas totales y en el porcentaje de monocitos en el mismo grupo.

B. Preparación de la solución de dosificación El ligando zalfall humano, recombinante, purificado (Ejemplo 24) fue diluido en solución salina amortiguada con fosfato estéril (Gibco BRL, Grand Island, NY) a concentraciones para distribuir 50, 5, 0.5 ó 0.1 microgramos de proteína en 0.1 ml de vehículo PBS. La dosis para los primeros cuatro días fueron realizadas en el día 0 y congeladas en un congelador a -20°C antes del uso. Las dosis para los días cinco al ocho fueron realizadas en el día cinco y congeladas como se describe anteriormente. Las alícuotas del mismo PBS fueron similarmente congeladas para el grupo control tratado con vehículo. En el día de la administración las alícuotas apropiadas fueron descongeladas y 0.1 ml de la solución se inyectó intraperitonealmente en los ratones cada día por cuatro a ocho días .

C. Diseño del estudio Los ratones fueron de seis semanas de edad al comienzo del estudio. Cada grupo de tratamiento consistió de ocho ratones, excepto para el grupo control con vehículo que incluyó diez ratones. La mitad de los ratones de cada grupo de tratamiento fueron sacrificados después de cuatro días de tratamiento y la otra mitad después de ocho días . Antes del tratamiento de cada día, cada ratón fue pesado y su temperatura corporal registrada utilizando el Sistema de Libreta Programable Portátil (BMDS, Inc., Maywood, NJ) , mediante exploración del ratón para la identificación del número y la temperatura corporal a partir de los transpondedores implantados subcutáneamente (IPTT-100, BMDS, Maywood, NJ) . En el sacrificio, los tejidos cosechados para evaluar las poblaciones de células sanguíneas blancas mediante análisis citométrico de flujo incluyeron médula ósea, timo y bazo. El análisis FACS de los órganos linfoides y la médula ósea fue realizado con el FACSCalibur (Becton Dickinson, Mansfield, MA) . Los tejidos cosechados para el examen histológico para los signos de la toxicidad de la proteína incluyeron: bazo, timo, hígado, riñon, glándulas adrenales, corazón y pulmones. Todos los tejidos fijados para histología fueron obtenidos a 4°C toda la noche en Solución Salina Amortiguada Normal al 10% (NBF) (Surgipath, Richmond, IL) . Al día siguiente el NBF fue reemplazado con etanol al 70% y los tejidos devueltos a 4°C hasta el procesamiento para histología. Los tejidos fueron procesados y teñidos con hematoxilina y eosina domésticamente, luego enviados a un patólogo por contrato para el análisis histopatológico. La sangre fue recolectada para las cuentas de las células sanguíneas, completas (CBC) y los perfiles de la química del suero. Las CBS fueron analizadas domésticamente con el Analizador Hematológico Selvin 3500 (Abbott Diagnostics División, Abbott Park, IL) y las cuentas de células sanguíneas blancas diferenciales, manuales, fueron analizadas en Phoenix Central Laboratory, (Everett, WA) . El suero fue mantenido congelado a -20°C hasta el envío a Phoenix Central Laboratory para los paneles de química sérica completa. Para evaluar las proporciones mieloide: eritroide, la médula ósea proveniente de un fémur fue aplicada a portaobjetos CytoSpin (CYTOSPIN 3 CYTOCENTRIFUGE and CYTO SLIDES, Shandon, Pittsburg, PA) y enviadas a los Laboratorios Central de Phoenix para el análisis .

D. Resultados del estudio No existieron indicaciones clínicas aparentes de los defectos fisiológicos o de la toxicidad del ligando zalfall humano a las dosis de 50 µg/día o menores. Los pesos corporales y las temperaturas permanecieron normales por toda la duración de los tratamientos. Los parámetros de la química sérica estuvieron en intervalos normales . Las cuentas de plaquetas y células sanguíneas rojas o eritrocitos parecieron normales. En los ratones que recibieron 50 µg/día por 8 días, las cuentas diferenciales manuales de células sanguíneas blancas mostraron que el porcentaje de monocitos fue evaluado en la sangre periférica, y un incremento aparente en las cuentas totales de células sanguíneas blancas . En la médula ósea arrastrada por chorro desde un fémur, las proporciones mieloide a eritroide fueron incrementadas en el grupo de dosis de 50 µg, y a un grado menor el grupo de dosis de 5 µg desde el ajuste de dosis de 8 días. En una comparación de columna múltiple no paramétrica utilizando InStat (InStat MAC; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) , esta diferencia fue estadísticamente significativa (p = 0.0049). La diferencia entre el grupo de dosis más alta y el vehículo fue también significativa (p = 0.0286) . Las células sanguíneas blancas incrementadas en la sangre periférica y el incremento significativo en los precursores mieloídes en la médula pueden de este modo estar relacionados . La evaluación histológica de los siguientes tejidos no mostró evidencia aparente de cambios citológicos o estructurales, de eventos mitóticos o necrosis; timo, hígado, riñon, glándulas adrenales, duodeno, páncreas, yeyuno, caecum, colon, nodulos linfáticos mesentéricos, útero, ovario, glándulas salivales, corazón, tráquea, pulmón y cerebro. No existieron diferencias aparentes entre los grupos de tratamiento en los pesos del timo, riñon, hígado y cerebro. De todos los tejidos examinados, únicamente los pesos del bazo fueron significativamente afectados . Cada peso de bazo de ratón fue normalizado a su peso cerebral. En el grupo de tratamiento a 50 µg/día comparado al vehículo, los grupos de tratamiento de 0.1 µg y 0.5 µg, el promedio de los pesos del bazo fue casi 50% mayor después de cuatro días de tratamiento y casi 100% mayor después de ocho días que los pesos promedio del bazo de los otros tres grupos. En el grupo del cuarto día, el grupo de 5 µg/día también tendió a tener bazos más grandes que los grupos control y de baja dosis. La diferencia en los pesos del bazo/cerebro con los datos provenientes de los grupos de cuatro días y de ocho días combinados con el grupo de tratamiento, fue estadísticamente significativo (p = 0.0072) mediante la prueba de ANDEVA no paramétrica de Kruskall-Wallace, la prueba de comparación de columna múltiple utilizando el programa InStat (GraphPad Software) . Un incremento marginal en la hematopoyesis extramedularmente, especialmente en la pulpa roja, fue observada en bazos de ratones del grupo de más alta dosis, incluso en los ratones tratados por cuatro días. El análisis citométrico de flujo de los bazos mostró un incremento significativo en la proporción de las células de tamaño mieloide en el grupo de dosis más alta (p = 0.01, prueba t de Student) , representando los incrementos en los monocitos y en los neutrófilos. Este efecto puede estar relacionado al porcentaje incrementado de células mononucleares de sangre periférica, así como' al incremento aparente en los precursores mieloides en la médula ósea, descritos anteriormente. Además, los ratones transgénicos derivados de la inserción del gen zalfall humano tuvieron hematopoyesis extramedularmente incrementada en sus bazos en comparación a las carnadas no transgénicas.

Se observaron varios cambios en el grupo de dosis de 50 µg por día en comparación al grupo control que implicó el ligando zalfall en la producción o desarrollo de las células de la línea mieloide. Tomados conjuntamente, los cambios observados sugieren que zalfall puede ser útil como una proteína terapéutica en especialidades médicas tales como en desórdenes cancerosos e inmunológicos descritos en la presente.

Ejemplo 38 Examen preliminar y estudio de distribución tisular de la proteína recombinante, purificada del ligando zalfall humano A. Resumen Con el fin de elucidar la distribución tisular y los patrones de eliminación del ligando rhzalfall purificado, fue emprendido un estudio farmacocinético preliminar. Ratones macho de nueve semanas de edad C57BI/6 fueron administrados con la proteína de zalfall humano, recombinante, purificada marcada con 11:LIndio (11:LIn) (NEN, Boston, MA) por una de tres rutas . Se administró una inyección de bolo simple a cada ratón ya sea mediante la ruta intravenosa (IV) , intraperitoneal (IP) , o subcutánea (SC) . Los ratones inyectados ya sea mediante la ruta subcutánea o intraperitoneal fueron sacrificados en una o tres horas después de la inyección. Los ratones inyectados intraperitonealmente fueron sacrificados después ya sea de diez minutos o una hora después de la inyección. Se cosecharon sangre, plasma y tejidos selectos a diversos puntos de tiempo y se contaron con un contador gamma para estimar la vida media aproximada y la distribución tisular de la proteína marcada exógena . Los tej idos que fueron cosechados para el conteo, así como los intervalos de sacrificio fueron seleccionados con base en el reporte de la distribución de otras citocinas marcadas con radionúclidos . En el sacrificio, los tejidos cosechados para el conteo de la radioactividad incluyeron el timo, bazo, riñon, un lóbulo del hígado, un lóbulo del riñon, y vejiga urinaria. En el grupo de recibió la inyección intraperitonealmente, el intestino fue también contado para evaluar la incidencia de la inyección dentro del intestino, y en los ratones dosificados subcutáneamente, la piel con las estructuras adyacentes en el área de la inyección fue también contada. Las cpm para el pulmón e hígado completos fueron calculadas a partir de una sección que fue contada, y un porcentaje del peso total del órgano representado por la sección.

Después del final del estudio los tejidos recolectados, la sangre completa y el plasma fueron contados en el contador gamma COBRA II AUTO-GAMA (Packard Instrument Company, Meriden, CT) . Una alícuota de la solución de dosificación marcada, original, fue también contada al final del estudio con los tejidos. Esto permitió el cálculo de la radioactividad inyectada total, porcentual, para cada ratón y la corrección simultánea de todas las cuentas para el decaimiento radioactivo. Las aproximaciones del volumen sanguíneo remanente y los pesos de los órganos indicaron que la mayor parte de las cuentas administradas fueron explicadas, y por lo tanto el porcentaje de las cuentas por tejido fueron una representación razonable de la distribución de las cuentas después de la administración del ligando zalfall marcado, por cada ruta .

B. Marcación con Indio del ligando zalfall El ligando zalfall humano, recombinante, purificado (Ejemplo 29) fue conjugado con un exceso de 10 veces molar de DTPA (Pierce, Rockford, II.) mediante la incubación de 30 minutos a la temperatura ambiente en PBS. El DTPA sin reaccionar y los hidrolizados fueron removidos mediante el cambio del amortiguador sobre un Biomax-5k NMWL (Ultrafree-15, Millipore, Bedford, MA) . El pico de proteína de volumen vacío fue concentrado a 5 mg/ml y una alícuota fue tomada para la prueba en un bioensayo (estimulación con anti-CD40 de células B murinas (Ejemplo 44) ) . Después de la confirmación de que el conjugado de DTPA tenía todavía bioactividad completa, el conjugado fue unido a 0.5 mg/ml con acetato de sodio 1M, pH 6.0. Dos mCi de 1:L1Indio fueron tomadas en 0.5 ml de acetato de sodio 1M, pH. 6.0 y se mezclaron con el DTPA-ligando zalfall humano por 30 minutos a temperatura ambiente. El 11:LIndio no incorporado fue removido durante el intercambio del amortiguador a PBS sobre una columna PD-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ) . El material radio-marcado fue diluido con el ligando zalfall humano no marcado, para dar una actividad específica de 100 mCi/mg, se esterilizó por filtración y se almacenó a 4°C toda la noche. Cien por ciento de la proteína marcada fue retenida sobre una membrana Biomax-5k NMWL (Millipore) . El ligando zalfall humano marcado con ?:L1In fue administrado a ratones en los estudios de eliminación y estudios farmacocinéticos. Cincuenta µg de la proteína del ligando zalfall humano, marcada con 5 µCi del ligando zalfall humano marcado, en 0.1 ml de vehículo PBS, se administró a cada animal.

C. Resultados del estudio de distribución preliminar Después de una y tres horas siguientes a la administración por las tres rutas, la más alta concentración del ligando 1:L1In-zalfall humano, se encontró en el riñon y la segunda más alta fue en orina y en vejiga urinaria, como se puso en evidencia por estos tejidos que tenían el más alto cpm. Las cuentas promedio recuperadas de los riñones fueron de 3 a 8 veces mayores que las cuentas de hígado completas, dependiendo de la ruta de inyección y del punto de tiempo de sacrificio. Por ejemplo, la cpm de riñon promedio a 60 minutos después de la inyección IV, fue 4.5 veces mayor que las cuentas promedio calculadas para el hígado total a partir del mismo grupo. En el grupo que fue sacrificado diez minutos después de la administración intravenosa, el cpm más alto fue nuevamente en riñon, y la segunda acumulación más alta equivalente fue en hígado, vejiga urinaria y urina.

D. Estudio farmacocinético preliminar Se realizaron recolecciones de sangre y de plasma a los 10, 30 y 60 minutos después de la inyección por las tres rutas . Después de la inyección por la ruta intravenosa, un grupo separado de ratones tuvo muestras de sangre y plasma tomados a los dos, cinco y diez minutos. Otro grupo de ratones quienes recibieron sus inyecciones ya sea por la ruta IP o SC tuvieron sangre muestreada a las una, dos y tres horas. Para los grupos de tratamiento ver Tabla 6. El corchete de los tiempos de recolección cortos reportan la vida media de IL-2 después de la inyección intravenosa. La Tl/2 reportada estuvo en el intervalo de 2.5 a 5.1 minutos. Por referencia a la administración in vivo a IL-2, ver Donohue JH y Rosenberg SA J Immunol, 130: 2203, 1983. Los puntos de tiempo prolongados fueron elegidos para delinear la fase de eliminación anticipada.

Tabla 6 Se ha mostrado que IL-2 no marcada es eliminada del suero con una vida media de aproximadamente tres minutos en ratones después de la inyección IV. Por referencia ver Donahue, JH y Rosenburg supra . Después de de la inyección IP y SC de cantidades similares de IL-2, la duración de la persistencia de la actividad de IL-2 en suero fue prolongada de 2 unidades/ml por menos de 30 minutos después de la inyección IV a más de 2 unidades/ml por 2 horas después de la IP y 6 horas después de la inyección SC. La ruta principal de despejo de la IL-2 parece ser el riñon. El ligando zalfall ha mostrado que es estructuralmente similar a IL-2, como se discute en la presente. La evaluación preliminar de la eliminación del ligando zalfall parece ser consistente con el despejo aparente de IL-2 con los riñones, con base en la acumulación de cpm predominantemente en los ríñones, seguido por la vejiga urinaria y la orina en el presente estudio. Fueron realizadas estimaciones de los parámetros farmacocinéticos con base en el análisis no compartimental de los datos de cpm obtenidos del plasma, utilizando el programa de análisis PK, WinNonLin, Versión 1.1 (Scientific Consulting Inc., Cary, NC) . Las vidas medias plasmáticas del ligando zalfall fueron estimadas utilizando las constantes de la velocidad de eliminación terminal, predichas, para las administraciones intravenosa, subcutánea e intraperitoneal de una dosis de 50 µg. Los resultados farmacocinéticos fueron estimaciones debidas a los puntos de datos limitados en la región de eliminación terminal de los perfiles de la concentración plasmática versus tiempo. Además, el ajuste de la fase de eliminación preliminar para la dosificación SC e IP requirió el uso de datos de puntos de tiempo durante los cuales la absorción del ligando l?:LIn-zalfall humano está todavía ocurriendo aparentemente. No obstante, las estimaciones de las vidas medias después de la dosificación intravenosa, subcutánea, e intraperitoneal fueron de 13.6 minutos, 18.8 minutos y 34.3 minutos, respectivamente. Ya que un intervalo de dosificación no fue evaluado, no fue aparente si estaba ocurriendo la eliminación saturable o activa (cinética de Michaelis Menten) . Por lo tanto, estos cálculos de la vida media son estimaciones . Los estimados de la biodisponibilidad de la proteína marcada fueron realizados con base en el área bajo la curva (AUC) después de la dosificación subcutánea o intraperitoneal en comparación a aquella de dosificación intravenosa. La biodisponibilidad estimada después de la inyección subcutánea e intraperitoneal fue de 35.8% y 63.9% respectivamente. Debido a que únicamente una dosis de proteína fue estudiada, la biodisponibilidad no fue evaluada como una función de dosis. El despejo estimado y el volumen de distribución (con base en los datos provenientes de la inyección intravenosa) fueron de 0.48 ml/min, y 6.1 ml, respectivamente. Aunque los datos son preliminares, el destino del ligando zalfall administrado IV fue similar a aquel reportado para IL-2, otra citocina de cúmulo de 4 hélices (Donahue, JH y Roserburg, SA supra) . Como IL-2, el ligando zalfall administrado intravenosamente tuvo una vida media plasmática de únicamente algunos minutos, con el despejo principal en el riñon. Tres horas después de la inyección, la mayor parte del material marcado extraído del riñon fue todavía retenido en una membrana Biomax 5K NMLW (Millipore) . Ya que se ha reportado previamente que el indio permanece asociado con la proteína incluso durante la degradación lisosomal (Staud, F. y colaboradores, J. Pharm. Sciences 88: 577-585, 1999) el ligando zalfall se está acumulando y puede ser degradado en el riñon. El presente estudio también mostró, como fue observado con muchas otras proteínas, incluyendo IL-2 (Donahue, JH y Rosenburg, SA, supra) , que la administración IP y SC prolongó significativamente los niveles plasmáticos del ligando zalfall.

Ejemplo 39 Aislamiento y expansión de la fracción CD34+ de MNC de médula ósea humana fresca, utilizando el ligando zalfall para la evaluación de la actividad ?K A. Selección y aislamiento de las células CD34+ provenientes de médula ósea humana Células mononucleares de médula ósea humana, fresca (M?C) , fueron preparadas para enriquecer las células que tenían la actividad de células ?K. Las M?Cs humanas frescas fueron obtenidas de Poeitic Technologies (Gaithersburg, MD) . 10 ml de alfa MEM (JRH, Lenexa, KS) que contenía 10% de HIA PBS (Heyclone, Logan, UT) y 1% de PS? como antibiótico (Gibco, BRL, Grand Island, ?Y) se agregó a la suspensión celular y las células se hicieron pasar a través de un tamiz de 100 µm. Las células fueron luego contadas, concentradas, lavadas con 10 ml de PBS que contenía 2% de FBS, luego concentradas nuevamente y resuspendidas en 1 ml de PBS que contenía 2% de FBS. Las células que tenían un marcador superficial de células CD34 (células CD34+) fueron magnéticamente separadas utilizando un equipo Detachabead con Dynabeads M-450 CD34 (Dynal, Osio, Noruega), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las células CD34+ y las células CD34- fueron posteriormente analizadas .

B. Expansión de las células CD34+ utilizando el ligando zalfall Una fracción de células CD34+ fue sembrada en placa sobre 34 pozos en una placa de 24 pozos. 50,000 células positivamente seleccionadas suspendidas en 1 ml de Alfa MEM (JRH) que contenía 10% de HIA FBS (Hyclone) y 1% de PSN (Gibco/BRL) , más las diversas citocinas descritas más adelante fueron sembradas en placa en cada uno de los 4 pozos (1-4) . Se utilizaron diversos reactivos para probar la expansión inducida por el ligando zalfall de las MNC de médula ósea seleccionadas por CD34+. Los reactivos incluyeron flt3 humano (R & D, Minneapolis, MN) ; el ligando zalfall humano purificado (Ejemplo 30C y Ejemplo 30D) ; y IL-15 humana (R&D) . Los reactivos fueron combinados como sigue en el día 0: En el pozo #1, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano. En el pozo #2, se agregaron 2 ng/ml de flt3 y 15 ng/ml del ligando zalfall humano, purificado. En el pozo #3, se agregaron 2 ng/ml de flt3 y 20 ng/ml de IL15 humana. En el pozo #4, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano, 15 ng/ml del ligando zalfall humano, purificado y 20 ng/ml de IL15 humana. Después de la incubación por 18 días, las células de suspensión provenientes de cada pozo fueron concentradas, y luego resuspendidas en 0.5 ml de MEM alfa (JRH) que contenía 10% de HIA FBS (Hyclone) y 1% de PSN (Gibco/BRL) , y se contaron para evaluar la proliferación de la fracción celular CD34+. Se observó bajo nivel de proliferación en presencia de flt3 sólo (pozo control #1) , pero la presencia de IL-15 o zalfall además de flt3 no tuvo efecto significativo sobre la expansión (pozos #2 y #3) . No obstante, la expansión más allá del control de flt3 fue evidente en el paso #4 que contenía IL-15 y el ligando zalfall además de flt3. Este resultado sugirió que zalfall e IL-15 actúan en sinergia para expandir la población de células CD34+ humanas. Además, los resultados de este experimento apoyaron los resultados observados con el ligando zalfall de ratón en el ensayo BM de ratón (Ejemplo 21) . Todas las poblaciones celulares fueron luego probadas para la actividad NK y sujetas al análisis de citometría de flujo, como se muestra más adelante (Ejemplo 41) .

C. Expansión de la células CD34+ o CD34- utilizando el ligando zalfall con adición retardada de IL-15 Las fracciones positiva (CD34+) y negativa (CD34-) fueron sembradas en placas separadamente en seis pozos (1-6) de placas de 12 pozos. Cada uno de los seis pozos contenía 100,000 células positiva o negativamente seleccionadas en 2 ml de alfa MEM que contenía 10% de HIA FBS y PSN, descritos anteriormente. Los reactivos utilizados fueron como se describen anteriormente. En el pozo #1, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano en el día 0. En el pozo #2, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano en el día 0, y después de 5 días de incubación se agregaron 20 ng/ml de IL-15 humana. En el pozo #3, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano y 15 ng/ml del ligando zalfall humano en el día 0. En el pozo #4, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano y 15 ng del ligando zalfall humano en el día 0 y después de 5 días de incubación se agregaron 20 ng/ml de IL15 humana. En el pozo #5, se agregaron 2 ng/ml de fit 3 y 20 ng/ml de IL15 humana en el día 0. En el pozo #6, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano, 15 ng/ml del ligando zalfall humano, y 20 ng/ml de IL15 humana, en el día 0. Después de la incubación por un total de 15 días desde el inicio del experimento, las células de cada pozo fueron cosechadas y contadas.

En la población CD34+ se observó un bajo nivel de proliferación en presencia de flt3 sólo (pozo control #1) , pero la presencia de IL-15 o zalfall agregados en el día 0 además de flt3 no tuvieron efectos significativos sobre la expansión (pozos, #3 y #5) . La adición de IL-15 después de 5 días tuvo algún efecto proliferativo en comparación al control con flt3 (pozo # 2 en comparación al pozo #1) y un efecto proliferativo en presencia de zalfall (pozo #4 en comparación al pozo #3) . No obstante, la mayor expansión fue evidente en el pozo #6 que contenía IL-15 y el ligando zalfall además de flt3 en el día 0. En la población CD34-, no se observó proliferación en presencia de flt3 sólo (pozo control #1) , y de hecho fue evidente una disminución en la población celular. La presencia de zalfall agregada en el día 0 además de flt3 (pozo #3) fue similar al control con flt3. La presencia de IL-15 agregada en el día 5 incrementó el efecto de proliferación de células en presencia (pozo #4) o ausencia (pozo #2) del ligando zalfall. Nuevamente, la mayor expansión fue evidente en el pozo #6 el cual contenía IL-15 y el ligando zalfall además de flt3 en el día 0. Todas las poblaciones celulares fueron luego probadas para la actividad NK y sujetas a análisis FACS, como se muestra más adelante (Ejemplo 41) .

Ejemplo 40 Aislamiento y expansión de células frescas de ratón utilizando el ligando zalfall humano y de ratón para la evaluación de la actividad NK de marcadores de células NK A. Aislamiento y expansión de células de médula ósea de baja densidad, de ratón, frescas, utilizando el ligando zalfall de humano y de ratón.

Células de médula ósea de ratón, frescas, fueron aisladas mediante el pinzado de ambos extremos de los fémures de ratón, y haciendo fluir a chorro dos a tres mililitros del medio de crecimiento (ver más adelante) a través de la parte interna del hueso hacia un tubo de recolección. El medio de crecimiento fue 500 ml del medio RPMI 1640 (JRH Bioscinces, Lenex, KS) ; 5 ml de L-glutamina lOOx (Gibco BRL, Grand Island NY) ; 5 ml de Piruvato de sodio lOOx (Gibco BRL) ; 5 ml de 100X de penicilina, estreptomicina, neomicina (PSN) (Gibco BRL) ; y 50 ml de Suero Fetal Bovino inactivado por calor (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, UT) . Las células de la médula fueron luego desintegradas al tomar con pipeta el medio hacia arriba y hacia abajo varias veces. Las células fueron luego concentradas y lavadas una vez con el medio de crecimiento, y se hicieron pasar a través de un tamiz de 70 micrómetros. Las células mononucleares de baja densidad fueron luego aisladas al sujetar las células de la médula a un gradiente de densidad. Las células de la médula en cinco a ocho mililitros del medio de crecimiento fueron cuidadosamente colocadas con pipeta sobre la parte superior de cinco a ocho mililitros de NycoPrep 1.077 Animal (Nycomed, Oslo, Noruega) en un tubo para centrífuga. Este gradiente fue luego centrifugado a 600 X g por 20 minutos. Las células mononucleares de baja densidad fueron cosechadas a partir de la capa interfacial entre NycoPrep y el medio. Estas células fueron luego diluidas a aproximadamente 20 ml en medio de crecimiento, concentradas y lavadas . Las células fueron luego sembradas en placa a aproximadamente 0.5 - 1.5 x 106 células por mililitro en medio de crecimiento en un matraz de cultivo de tejidos, estándar y se incubó a 37°C, con 5% de C02 por dos horas . Las células de la médula, de baja densidad (NA LD) no adherentes, fueron luego cosechadas y sembradas en placa a 0.5 - 2.0 x 105 células por mililitro en medio de crecimiento más 2.5 nanogramos por mililitro de flt3 de ratón (R & D Systems, Minneapolis, MN) más 25 a 50 nanogramos por mililitro de interleucina 15 (IL-15) (R & D Systems) con o sin 50 a 150 nanogramos por mililitro de ligando zalfall humano; o con o sin 0.12 a 10 nanogramos por mililitro de ligando zalfall de ratón. No existió expansión significativa sin la adición del ligando zalfall humano o de ratón. Las células no adherentes fueron expandidas en los cultivos que contenían ligando zalfall de ratón tan bajo como de 0.12 ng/ml y en los cultivos que contenían el ligando zalfall humano tan bajo como de 22 ng/ml. En cultivos que contenían el ligando zalfall de humano y de ratón, la expansión de la célula no adherente se incrementó con el incremento de la dosis si el ligando zalfall, con la respuesta de saturación del ligando de ratón a aproximadamente 5-10 ng/ml y el ligando de ratón que no alcanza una respuesta de saturación incluso a la dosis más alta de 200 ng/ml. El ligando zalfall humano pareció ser aproximadamente 20 a 100 veces menos potente en las células de ratón que el ligando zalfall de ratón. Después de aproximadamente cinco a diez días las células de ratón expandidas por el ligando zalfall fueron cosechadas y analizadas mediante citometría de flujo (FACSCalibur; Becton Dickinson, Mansfield, MA) para determinar qué porcentaje de ellas eran positivas para los antígenos de las células NK donde 46% fueron positivas para el marcador DX5 de las células PanNK (Pharmingen) .

B. Aislamiento y expansión de las células de médula de ratón, agotadas, de línea, frescas Las células de la médula agotadas en línea, de médula de ratón, frescas (lin-) fueron aisladas de células de médula de ratón, frescas, primeramente mediante la incubación de las células con los siguientes anticuerpos: TER119, Gr-1, B220, MAC-1, CD3e e I-Ab (Pharmingen, San Diego, CA) . Las células lin+ fueron luego removidas con IgG de oveja anti-rata Dynabeads M-450 (Dynal, Lake Success, NY) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células de médula lin- negativamente seleccionadas fueron luego sembradas en placa como se describe anteriormente en el medio de crecimiento más 2.5 ng/ml de flt3 (R&D Systems) y 25 ng/ml de IL-15 (R&D Systems); o flt3, IL-15 y ligando zalfall de ratón, 2 a 5% del medio condicionado con el ligando zalfall de ratón BHK. Después de seis días de crecimiento, los cultivos fueron cosechados, contados y sometidos a un ensayo de actividad de células NK (Ejemplo 41) . Las células desarrolladas con el ligando zalfall de ratón fueron aproximadamente dos a tres veces más efectivas en la lisis de las células objetivo de células NK (células YAC-1) que las células desarrolladas sin ligando zalfall.

C. Aislamiento y expansión de timocitos CD4- CD8-(doblemente negativos o DN) Los timocitos frescos de ratón fueron aislados mediante desmenuzamiento y tamizado de los timos provenientes de ratones de tres a ocho semanas de edad. Las células CD4- CD8- (DN) fueron luego negativamente seleccionadas mediante la incubación de los timocitos con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 (PharMingen) , luego el retiro de las células CD4+ CD8+ con la IgG de oveja anti-rata Dynabeads M-450 (Dynal) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los timocitos de ratón DN fueron luego desarrollados en medio de crecimiento más 2.5 ng/ml de flt3 (R&D Systems) , 25 ng/ml de IL-15 (R&D Systems) y 10 ng/ml de IL-7 ' (R&D Systems) con o sin el ligando zalfall de ratón como se describe anteriormente. Seis días después las células fueron cosechadas, contadas, analizadas mediante citometría de flujo como se describe anteriormente, y también sometidas a un ensayo de actividad de células NK (Ejemplo 41) . El cultivo desarrollado con el ligando zalfall de ratón produjo aproximadamente 480,000 células mientras que el cultivo sin el ligando zalfall produjo únicamente aproximadamente 160,000 células. El cultivo desarrollado con el ligando zalfall de ratón se encontró que era aproximadamente 16.2% positivo para el antígeno Pan NK, DX5 de células NK (PharMingen) . El cultivo desarrollado sin el ligando zalfall fue 14.6% positivo para DX5. Las células desarrolladas con las células objetivo de células NK, lisadas con el ligando zalfall, YAC-1, aproximadamente dos veces mejor que las células desarrolladas sin el ligando zalfall. Las células expandidas no lisaron significativamente una línea de células objetivo, control, negativas, EL4. Estos resultados sugirieron que el ligando zalfall expande selectivamente las células NK líticas.

Ejemplo 41 Actividad de células expandidas con el ligando zalfall de ratón y de humano y células NK murinas maduras en ensayos de citotoxidad de células NK A. Ensayo de células NK Las citolisis objetivo mediada por células NK fue examinada mediante un ensayo estándar de liberación de 51Cr. Las células objetivo (células K562 (ATCC No. CLL-243) en ensayos humanos y células YAC-1 (ATCC No. TIB-160) en ensayos de ratón) carecen de la expresión de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) , haciéndolas susceptibles a la lisis mediada por células NK. Una línea celular objetivo control, negativa, en ensayos de ratón es el timoma EL4, de MHC+ (ATCC No. TIB-39) . Se desarrollaron las células K562, EL4 y YAC-1 en el medio RP10 (medio RPMI 1640 estándar (Gibco/BRL, Grand Island, NY) suplementado con 10% de FBS (Hyclone, Logan, UT) , así como glutamina 4 mM (Dibco/BRL) , 100 Ul/ml de penicilina+100 MCG/ml de estreptomicina (Gibco/BRL) , 50 µM de ß-mercaptoetanol (Gibco/BRL) y amortiguador HEPES 10 mm (Gibco/BRL) . En el día del ensayo, se cosecharon 1-2 x 106 células objetivos y se resuspendieron a 2.5-5 x 106 células/ml en el medio RP10. Se agregaron 50-100 µl de 51Cr de cromato de sodio a 5 mCi/ml (?E?, Boston, MA) directamente a las células y se les incubó por 1 hora a 37°C, luego se lavaron dos veces con 12 ml de PBS y se resuspendieron en 2 ml de medio RP10. Después de contar las células sobre un hemocitómetro, las células objetivo fueron diluidas a 0.5-1 x 105 células/ml y 100 µl (0.5-1 x 104 células) se mezclaron con las células efectoras como se describe más adelante. En ensayos humanos, las células efectoras fueron preparadas a partir de células BM CD34+ humanas, seleccionadas y expandidas (Ejemplo 39B) que fueron cosechadas, lavadas, contadas y mezcladas a diversas concentraciones con las células objetivo marcadas con 51Cr, en placas de fondo redondo de 96 pozos, e incubadas por 4 horas a 37°C. Después de la co-incubación de las células efectoras y las células objetivo marcadas, la mitad del sobrenadante de cada pozo fue recolectada y contada en un contador gamma por 1 minuto/muestra. El porcentaje de liberación específica de 51Cr fue calculado a partir de la fórmula 100 x (X-Y) / (Z-Y) , donde X es la liberación de 51Cr en presencia de las células efectoras, Y es la liberación espontánea en ausencia de las efectoras, y Z es la liberación total de 51Cr a partir de las células objetivo incubadas con 0.5% de Tritón X-100. Los datos fueron trazados gráficamente como el % de lisis específica versus la proporción efector a objetivo en cada pozo.

B. Actividad de las células expandidas con el ligando zalfall humano Las HPCs humanas CD34+ aisladas, cultivadas con flt3 +/- ligando zalfall y flt3 + IL-15 +/- ligando zalfall (Ejemplo 39) , fueron cosechadas en el día 15 para evaluar su capacidad de lisar las células K562 MHC" en un ensayo de liberación de ?XCr estándar como se describe anteriormente, y para analizar su fenotipo superficial mediante citometría de flujo. Como se esperaba a partir de los reportes previos (Mrozek, E. y colaboradores, Blood 87: 2632-2640, 1996; y Yu, H y colaboradores, Blood 92: 3647-3657, 1998), la adición simultánea de IL-15 y flt3L sí indujo el desarrollo de una población pequeña de células CD56". De manera interesante, aunque las células BM cultivadas simultáneamente con el ligando zalfall y flt3L no se expandieron significativamente, existió un incremento significativo en los números de células totales en los cultivos que contenían una combinación de flt3L, ligando zalfall e IL-15 (ver, Ejemplo 39) . Para una evaluación del fenotipo superficial de estos cultivos BM humanos, se tiñeron alícuotas pequeñas de las células para el análisis citométrico de flujo de 3 colores con los anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-CD3-FITC, anti-CD56-PE y anti-CD16-Cychorme (todos de PharMingen, San Diego, CA) y analizados sobre un FACSCalibur utilizando el programa CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . Este análisis citométrico de flujo confirmó que las células que se desarrollan a partir de estos cultivos fueron células NK diferenciadas, ya que éstas eran grandes y granulares, y expresaron CD56 y CD16, y fueron CD3" (Lanier, LL Annu. Rev. Immunol . 16: 359-393, 1998). Además, estas células mostraron función efectora significativamente mayor que aquellas células desarrolladas con IL-15 y flt3. Más específicamente, las células desarrolladas en las tres citocinas lisaron más de 40% de los objetivos K562 a una proporción de efector a objetivo (E:T) de 1.5, mientras que las células desarrolladas en IL-15+flt3L lisaron menos de 5% de los objetivos a un E:T de 2. Estos datos demuestran que, en combinación con IL-15, el ligando zalfall estimula la diferenciación de las células NK a partir de las células BM CD34Y C. Actividad de las células expandidas con el ligando zalfall de ratón Para probar los efectos del ligando zalfall sobre las células progenitoras hematopoyéticas, murinas, las células de médula ósea negativas a la línea, purificadas, (Lin-) provenientes de ratones C57B1/6 fueron expandidas en flt3 + IL-15 +/- ligando zalfall, como se describe en el Ejemplo 40B. En el día 6 del cultivo, las células ("efectoras") fueron cosechadas y contadas, luego resuspendidas en 0.4 ml de medio RP10 (Ejemplo 41A) . Dos alícuotas (0.15 ml cada una) de cada muestra expandida con o sin el ligando zalfall (Ejemplo 41A) fueron diluidas en serie 3 veces por duplicado en placas de 96 pozos de fondo redondo, para un total de 6 pozos de 100 µl cada uno. Los 100 µl restantes de las células fueron teñidos para los marcadores superficiales de las células NK con los anticuerpos monoclonales FITC-anti-2B4 y PE-anti-DX5 (PharMingen) y analizados mediante citometría de flujo. Cada grupo de células expuestas a flt3 + IL-15 con o sin la presencia del ligando zalfall tuvieron fracciones similares de las células 2B4+ DX5+ en el intervalo de 65-75% de positivas para ambos marcadores NK. Para el ensayo de la lisis de NK, las células objetivo (YAC-1 y EL4) fueron marcadas con 51Cr como se describe anteriormente. Después de contar las células objetivo sobre un hemocitómetro, las células objetivo fueron diluidas a 0.5 x 105 células/ml y 100 µl de YAC-1 o EL-4 (0.5-1 x 104 células) fueron mezcladas con 100 µl de células efectoras e incubadas por 4 horas a 37°C. La lisis específica fue determinada para cada pozo como se describe anteriormente . Se encontró que las células desarrolladas en presencia de flt3 + IL-15 + ligando zalfall mostraron actividad lítica mejorada (aproximadamente 2 veces) contra los objetivos YAC-1 (pero no mataron la línea celular control EL4 MHC+) . A una proporción efector a objetivo (E:T) de 5, las células NK generadas en presencia de las 3 citocinas (ligando zalfall + flt3 + IL-15) lisaron 12% de las células YAC-1, mientras que aquellas células NK expandidas con flt3 + IL-15 lisaron 6% de los objetivos YAC-1. Los experimentos subsecuentes confirmaron esta tendencia. En un segundo procedimiento para determinar la actividad biológica del ligando zalfall sobre células NK murinas, se aislaron timocitos de ratón CD4"CD8" inmaduros, ("doble negativo", DN) como se describe en el Ejemplo 40C y se les cultivó con IL-15 + flt3 + IL-7 ó IL-15 + flt3 + IL-2, con o sin el ligando zalfall. En el día 6 de cultivo, las células fueron cosechadas y evaluadas para la actividad lítica NK sobre las células YAC-1 y EL4 como se describe anteriormente. Se encontró que las células cultivadas en presencia del ligando zalfall tenían la mayor actividad lítica en este ensayo, con la actividad lítica aumentada sobre aquellas células cultivadas en presencia de otras citocinas. Específicamente, los timocitos DN desarrollados con IL-15 + flt3 + 11-7 mataron 18% de las células YAC-1 a E:T de 24, mientras que las células desarrolladas en presencia de IL-15 + flt3 + IL-2 más el ligando zalfall mataron 48% de los objetivos a la misma ET. Los timocitos DN desarrollados en IL-15 + flt3 + IL-2 mataron 15% de los objetivos YAC-1 a una E:T de 6, mientras que las células desarrolladas con estas 3 citocinas y el ligando zalfall mataron 35% de las células YAC-1 a una E:T de 9. La citometría de flujo fue realizada sobre las células cultivadas un día antes del ensayo de lisis de NK.

Como fue cierto para los cultivos de médula ósea, a pesar del efecto proliferativo del ligando zalfall (los números de células se incrementan aproximadamente 2 veces cuando se agrega el ligando zalfall) , no aumentó significativamente la fracción de células DX5+ (17-20% de las células totales en los cultivos con IL-7, y 35-46% del total en cultivos con IL-2) . Estos datos implican que el ligando zalfall, en combinación con IL-15 y flt3, aumenta la actividad lítica de las células NK generadas de médula ósea o de timo murinos.

D. Actividad del ligando zalfall de ratón sobre las células NK murina maduras Con el fin de probar los efectos del ligando zalfall de ratón sobre las células NK maduras, se aislaron bazos de cuatro ratones C57B1/6 de 5 semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) y se les aplastó con portaobjetos de vidrio de extremo congelado para crear una suspensión celular. Las células sanguíneas rojas o eritrocitos fueron removidos mediante lisis hipotónica como sigue: las células fueron concentradas y el sobrenadante fue removido mediante aspiración. Se desintegró el botón con agitación suave en torbellino, luego se agregaron 900 µl de agua estéril mientras que se agitaba, seguido rápidamente (menos de 5 segundos después) por 100 µl de 10X HBSS (Gibco/BRL) . Las células fueron luego resuspendidas en 10 ml de IX HBSS y los detritus fueron retirados al hacer pasar las células sobre una coladera celular revestida con malla de nailon (Falcon) . Estas células del bazo agotadas en RBC fueron luego concentradas y resuspendidas en amortiguador MACS (PBS + 1% de BSA + EDTA 2 mM) y contadas. Se tiñeron 300 x 106 de las células con las esferas magnéticas recubiertas con anti-DX5 (Miltenyi Biotec) y las células NK DX5+ positivamente seleccionadas sobre una columna de separación MACS VS+, de acuerdo a las instrucciones del fabricante, conduciendo a la recuperación de 8.4 x 106 células DX5+ y 251 x 106 células DX5" Cada uno de estos grupos de células fueron cultivados en placas de 24 pozos (0.67x 106 células/pozo, 2 pozos por condición de tratamiento) en el medio RP10 (Ejemplo 41A) sólo o con 1) 30 ng/ml del ligando zalfall de ratón, 2) 30 ng/ml de IL-2 de ratón, recombinante (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) , 3) 30 ng/ml de IL-15 de humana, recombinante (R&D) , 4) 30 ng/ml de cada uno del ligando zalfall de ratón y de hIL-15, o 5) 30 ng/ml de cada uno de mIL-2 y hIL-15. Las células fueron cosechadas después de 21 horas, lavadas, y resuspendidas en el medio RP10 y contadas . Las células fueron luego evaluadas para su habilidad de lisar las células objetivo YAC-1 o EL4 marcadas con 51Cr, como se describe en el Ejemplo 41A. En general, existió poca actividad NK a partir de los grupos DX5" (células no NK) , pero las células DX5" cultivadas con el ligando zalfall y con hIL-15 sí lisaron 25% de las células objetivo YAC-1 a una E:T de 82. Por comparación, las células DX5" cultivadas con hIL-15 sólo, lisaron 14% de los objetivos YAC-1 a una E:T de 110. Esto sugiere que el ligando zalfall e IL-15 están actuando conjuntamente sobre las células NK 1.1+ residuales, en esta preparación celular. Como para la preparación de células DX5+ el tratamiento con el ligando zalfall de ratón sólo, no incrementó significativamente su función efectora (su lisis de las células YAC-1 fue similar al grupo no tratado) . Como se esperaba, IL-2 e IL-15 mejoró significativamente NK. El más alto nivel de lisis, no obstante, fue detectado en el grupo tratado con el ligando zalfall y hIL-15 (65% de lisis de las células YAC-1 a una E:T de 3.3, versus 45% de lisis a una E:T de 4 para el grupo de tratamiento con hIL-15) . Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren que aunque el ligando zalfall sólo no puede incrementar la actividad de lisis de las células NK, éste sí aumenta la actividad de lisis de NK de las células NK maduras, cuando se administran con IL-15.

Ejemplo 42 Proliferación del ligando Zalfall de las células T humanas y de ratón en un ensayo de Proliferación de células T A. Proliferación del ligando Zalfall Murino de células T de ratón Las células T provenientes de ratones C57B1/6 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) fueron aisladas de linfocitos y esplenocitos combinados provenientes de nodulos linfáticos axilares, braquiales, inguinales, cervicales, y mesentéricos (LNs) . Los bazos fueron aplastados con portaobjetos de vidrio de extremo congelado para crear una suspensión celular. Los LNs fueron desintegrados con fórceps y se hicieron pasar a través de un colador celular para eliminar los desechos . Los esplenocitos y las células LN combinados fueron separados en subgrupos CD8+ y CD4+ utilizando dos columnas de separación magnética MACS sucesivas, de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) . Los timocitos completos fueron recolectados de los mismos ratones . Las células fueron cultivadas a 3xl05 células/pozo (timocitos) o 105 células/pozo (células T maduras) con concentraciones cada vez mayores del Ligando zalfall murino purificado (0-30 ng/ml) (Ejemplo 24 y Ejemplo 29) en placas de fondo plano de 96 pozos pre-recubiertas toda la noche a 4 C con concentraciones variantes del mAb 2C11 anti-CD3 (PharMingen) por 3 días a 37 C. El anticuerpo anti-CD3 sirvió para activar las células T murinas a través del receptor de células T. Cada pozo fue pulsado con 1 µCi de 3H-timidina en el día 2 y las placas se cosecharon y se contaron 16 horas después para evaluar la proliferación. Cuando se probó el Ligando zalfall en los ensayos de proliferación de células T, se encontró que éste coestimulaba los timocitos murinos activados por anti-CD3, conduciendo a un desarrollo acelerado de las células CD8+CD4" (la mayoría de los timocitos cultivados con el Ligando anti-CD3+zalfall fueron CD8+CD4" por el día 3 de cultivo, mientras que las células cultivadas con el anti-CD3 solo no se desviaron significativamente hacia este fenotipo hasta el día 5) . No se observaron niveles significativos de proliferación de timocitos para el Ligando zalfall en ausencia de anti-CD3. De manera interesante, cuando se evaluaron las células T murinas, periféricas, maduras, para su habilidad de responder al Ligando zalfall+anti-CD3 , se encontró que únicamente el subgrupo CD8+, pero no el subgrupo CD4 respondieron de una manera dependiente de la dosis al Ligando zalfall. Se observó también proliferación débil pero reproducible de las células CD8+ (pero no las células CD4") en respuesta al Ligando zalfall solo. De manera interesante, esto no fue observado para las células T humanas (ver ejemplo 42B siguiente) .

B. Proliferación del Ligando zalfall humano de células T humanas Las células T humanas CD4+ y CD8+ fueron aisladas de PBMC como se describe en el ejemplo 43 siguiente. Las células fueron cultivadas a aproximadamente 105 células/pozo con concentraciones cada vez mayores de Ligando zalfall humano, purificado (0-50 ng/ml) (Ejemplo 24) en placas de fondo plano de 96 pozos pre-recubiertas toda la noche a 4 C con diversas concentraciones del anticuerpo monoclonal UCHT1 anti-CD3 humano (PharMingen) por 3 días a 37 C. Cada pozo fue pulsado con 1 µCi de 3H-timidina en el día 2, y las placas fueron cosechadas y contadas 16 horas más tarde. De manera contraria a los presentes resultados con las células T de ratón, nuestros datos preliminares sugieren que el Ligando zalfall humano co-estimula las células T humanas CD4+, pero no las células CD8+, de una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 43 La PCR en tiempo real muestra la expresión del Ligando zalfall en células CD4+ humanas A. Las células T humanas purificadas como una fuente primaria, utilizadas para evaluar la expresión del Ligando zalfall humano Se recolectaron 150 ml de sangre completa de un donador humano saludable y se mezclaron 1:1 con PBS en tubos cónicos de 50 ml . Treinta ml de la sangre diluida fueron luego re-cubiertos con 15 ml de Ficoll Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) . Estos gradientes fueron centrifugados 30 minutos a 500 g y se dejaron detener sin frenado. Las células agotadas en RBC en la interfaz (PBMC) fueron recolectadas y lavadas 3 veces con PBS. El rendimiento de PBMC humano aislado fue de 200xl06 antes de la selección descrita más adelante. Las PBMCs fueron suspendidas en 1.5 ml de amortiguador MACS (PBS, 0.5% de EDTA, EDTA 2 mM) y 3xl06 células fueron separadas para el ARN control y para el análisis citométrico de flujo. En seguida se agregaron 0.25 ml de microesferas anti-CD8 humano (Miltenyi Biotec) y la mezcla se incubó por 15 minutos a 4 C. Estas células marcadas con las esferas CD8 fueron lavadas con 30 ml de amortiguador MACS, y luego resuspendidas en 2 ml de amortiguador MACS. Se preparó una columna VS+ (Miltenyi) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La columna VS+ fue luego colocada en un campo magnético VarioMACS (Miltenyi) . La columna fue equilibrada con 5 ml de amortiguador MACS. Las células de ratón primarias, aisladas fueron luego aplicadas a la columna. Las células negativas a CD8 se dejaron pasar al través. La columna fue enjuagada con 9 ml (3 x 3 ml) de amortiguador MACS. La columna fue luego retirada del imán y colocada sobre un tubo falcon de 15 ml . Las células CD8+ fueron eluidas mediante la adición de 5 ml de amortiguador MACS a la columna, y las células enlazadas se extrajeron por chorro utilizando el émbolo proporcionado por el fabricante. El rendimiento de las células T periféricas humanas seleccionadas, CD8+ fue de aproximadamente 51xl06 células totales. Las células CD8 negativas que fluyeron de lado a lado fueron recolectadas, contadas, teñidas con esferas recubiertas con anti-CD4 humano, luego incubadas y se hicieron pasar sobre una nueva columna VS+ a las mismas concentraciones que se describen anteriormente. El rendimiento de las células T periféricas humanas, seleccionadas CD4+ fue de 42xl06 células totales. Una muestra de cada una de las células T humanas seleccionadas CD8+ y CD4+ fue removida para la tinción y clasificación sobre un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) para evaluar su pureza. Un anticuerpo anti-CD4 humano, conjugado a PE, un anticuerpo FITC anti-CD8 humano, y un anticuerpo CyChrome anti-CD19 humano (todos de PharMingen) fueron utilizados para teñir las células seleccionadas por CD8+ y CD4+. Las células seleccionadas por CD8 en este primer experimento fueron 80% CD8+, y las células seleccionadas por CD4 fueron 85% CD4+. En dos experimentos subsecuentes (Ejemplo 43B) , las células purificadas CD8+ fueron 84% y 81% puras, y las células CD4+ fueron 85% y 97% puras, respectivamente. En un experimento, se tiñeron las células no enlazadas (que fluyen de lado a lado) con esferas recubiertas con anti-CD19 humano (Miltenyi) y se les corrió sobre una tercera columna de esferas magnéticas para aislar las células B CD19+ (éstas fueron 92% puras) . Las células seleccionadas CD8+, CD4+ y CD19+ humanas fueron activadas mediante incubación de 0.5xl06 células/ml en RPMI + 5% de ultrasuero humano (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) + PMA 10 ng/ml y Ionomicina 0.5 µg/ml (Calbiochem) por aproximadamente 4, 16, ó 24 horas a 37 C. Las células T (2.5xl06/pozo) fueron alternativamente estimuladas en placas de 24 pozos pre-recubiertas toda la noche con 0.5 µg/ml del anticuerpo monoclonal UCHT1 anti-CD3 , enlazado a la placa (PharMingen) con o sin el anticuerpo monoclonal anti-CD28 soluble (PharMingen) a 5 µg/ml. A cada punto de tiempo, las células fueron cosechadas, concentradas, lavadas una vez con PBS, y concentradas nuevamente . El sobrenadante fue removido y los botones fueron congelados en un baño de hielo seco/etanol, luego almacenados a -80 C para la preparación del ARN a una fecha posterior. La PCR en tiempo real fue realizada sobre estas células seleccionadas CD8+, CD4+ y CDl9+ humanas, como se describe en el Ejemplo 43B y 43C siguientes, para evaluar el Ligando zalfall humano y la expresión del receptor.

B. Cebadores y Sondas para la RT-PCR cuantitativa para la expresión del Ligando zalfall humano La RT-PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencia ABl PRISM 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) ha sido previamente descrita (Ver Heid, CA et al., Genome Research 6^:986-994, 1996; Gibson, UEM et al., Genome Research 6 : 995-1001, 1996; y Sundaresan, S et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). Este método incorpora el uso de una sonda específica del gen que contiene los colorantes reportero y apagador. Cuando la sonda está intacta, la emisión del colorante reportero es negada debido a la proximidad del colorante apagador. Durante la extensión de PCR utilizando los cebadores delantero e inverso específicos del gen, adicionales, la sonda es escindida por la actividad de la nucleasa 5' de la polimerasa Taq que libera el colorante reportero, dando como resultado un incremento en la emisión fluorescente. Los cebadores y sondas utilizados para los análisis de RT-PCR cuantitativos, en tiempo real, fueron diseñados utilizando el programa de diseño de cebador Primer Express™ (PE Applied Biosystems) . Los cebadores para el Ligando zalfall humano fueron diseñados abarcando una unión intrón-exón para eliminar la amplificación del ADN genómico. El cebador delantero, ZC22,281 (SEQ ID NO.90) y el cebador inverso ZC22,279 (SEQ ID NO.91) fueron utilizados ambos a la concentración de 300 nM para sintetizar un producto de 80 pares de bases. La sonda TaqMan del Ligando zalfall correspondiente, ZG32 (SEQ ID NO. 2) fue sintetizada por PE Applied Biosystems. La sonda fue marcada con un colorante fluorescente reportero (6-carboxi -fluorosceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) en el extremo 5' y un colorante fluorescente apagador (6-carboxi-tetrametil-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems) en el extremo 3 ' . Con el fin de probar la integridad o la calidad de todas las muestras de ARN, éstas fueron seleccionadas para el ARNr utilizando el grupo de cebadores y sondas ordenados de PE Applied Biosystems (cat No. 4304483) . El colorante fluorescente reportero para esta sonda es VIC (PE Applied Biosystems) . Los resultados del ARNr permitirán la normalización del Ligando zalfall. El ARN fue preparado a partir de los concentrados proporcionados en el Ejemplo 43A, utilizando el equipo R?easy Miniprep^ Kit (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El AR? control fue preparado a partir de aproximadamente 1 millón de células BHK que expresan el Ligando zalfall humano.

C. Cebadores y Sondas para la RT-PCR cuantitativa para la expresión del Receptor zalfall humano La PCR en tiempo real fue realizada para evaluar la expresión del receptor zalfall como en el Ejemplo 43B y el Ejemplo 43D, utilizando las células preparadas bajo las condiciones detalladas en 43A, y las sondas específicas para el receptor de zalfall. El cebador delantero, ZC22,277 (SEQ ID ?0.93) y el cebador inverso, ZC22,276 (SEQ ID ?0.94) fueron utilizados en una reacción de PCR (ver arriba) a una concentración de aproximadamente 300 nM para sintetizar un producto de 143 pares de bases. La sonda TaqMan® de zalfall correspondiente, designada ZG31 (SEQ ID ?O. 95) fue sintetizada y marcada por PE Applied Biosystems . El ARN proveniente de las células BaF3 que expresan al receptor zalfall humano fue utilizado para generar el control apropiado para las curvas estándares para la PCR en tiempo real descrita en el Ejemplo 43D siguiente.

D. RT-PCR cuantitativa en tiempo real Los niveles relativos del ARN del Ligando zalfall fueron determinados mediante el análisis de las muestras de AR? total, utilizando el método de RT-PCR de un solo paso (PE Applied Biosystems) . El AR? proveniente de las células BHK que expresan el Ligando zalfall humano fue utilizado para generar una curva estándar. La curva consistió de diluciones en serie en el intervalo de 2.5-2.5xl0"4 ng para la selección del ARNr y 25-0.0025 ng para la selección del Ligando zalfall, con cada punto analizado por triplicado. Las muestras de AR? total fueron también analizadas por triplicado para los niveles del transcrito del Ligando zalfall humano y para los niveles del AR?r como un control endógeno. Cada reacción de RT-PCR de un solo paso consistió de 25 ng del AR? total en amortiguador A (cloruro de potasio 50 mM, Tris-HCl 10 mM, y el colorante estándar interno, ROX (PE Applied Biosysytems) ) , los cebadores apropiados (50 nM para las muestras de AR?r, 300 nM para las muestras del Ligando zalfall) y la sonda (50 nM para ARNr, 100 nM para el Ligando zalfall) , cloruro de magnesio 5.5 mM, 300 µM de cada uno d-CTP, d-ATP, y d-GTP, y 600 µM de d-UTP, transcriptasa inversa (0.25 U/µl), ADN-polimerasa AmpliTaq (0.025 (U/µl) e inhibidor de ARNasa (0.4 U/µl) en un volumen total de 25 µl . Las condiciones de ciclo térmico consistieron de un paso RT inicial a 48 C por 30 minutos, un paso de activación con AmpliTaq Gold de 95 C por 10 minutos, seguido por 40 ciclos de amplificación por 15 segundos a 95 C y 1 minuto a 60 C. Los niveles relativos del ARN del Ligando zalfall fueron determinados por el Método de la Curva Estándar como se describe en el Boletín de Usuario No. 2 (PE Biosystems; Boletín de Usuario #2; Sistema de Detección de Secuencia ABl Prism 7700, Cuantificación Relativa de la Expresión del Gen, Diciembre 11, 1997) utilizando las mediciones del ARNr para normalizar los niveles del Ligando zalfall. Las muestras fueron comparadas con relación al calibrador dentro de cada experimento. El calibrador fue arbitrariamente elegido con base en la buena calidad del ARN y un nivel de expresión al cual podrían ser significativamente comparadas otras muestras. Los resultados de los experimentos que analizan la expresión del Ligando zalfall y el receptor zalfall en células estimuladas y no estimuladas (Ejemplo 43A) son como se describen en el Ejemplo 43E siguiente.

E. Expresión del receptor zalfall humano y del ligando en células CD4+, CD8+ y CD19+ El primer experimento utilizó RT-PCR, descrito anteriormente, para evaluar la expresión del receptor zalfall en muestras de CD4+ y CD8+ estimuladas con anti-CD3 y no estimuladas a los puntos de tiempo de 0 horas (células no estimuladas ("en reposo")), y a 4 horas, 15.5 horas y 24 horas, después de la estimulación. La muestra CD4+ en reposo fue arbitrariamente elegida como el calibrador y se le dio un valor de 1.00. Existió aproximadamente un incremento de 4 veces en la expresión de receptor en las células CD4+ no estimuladas de 4 horas a 24 horas de cultivo y un incremento de aproximadamente 8 veces sobre el mismo periodo de tiempo en las células CD4+ estimuladas con anti-CD3. Las células CD8+ mostraron un incremento de 7 veces en la expresión del receptor zalfall que fue máximo a las cuatro horas y disminuyó con el tiempo. Con la estimulación con anti-CD3, las células CD8+ tuvieron un incremento constante de 8 veces en la expresión del receptor. Este primer experimento también utilizó RT-PCR para evaluar la expresión del Ligando zalfall en las mismas muestras CD4+ y CD8+ no estimuladas y estimuladas con anti-CD3. La muestra CD8 estimulada con anti-CD3 a las 4 horas fue arbitrariamente elegida como el calibrador y se le dio un valor de 1.00. Los resultados mostraron que las células CD4+ y CD8+ no estimuladas no expresan el Ligando zalfall. Se observó una elevación significativa de la expresión en células CD4+ estimuladas con anti-CD3, a las 4 horas, con aproximadamente un incremento de 300 veces en la señal observada a las 15.5 horas. Las células CD8+ expresaron una pequeña cantidad del ligando después de la estimulación con anti-CD3, no obstante, esto es probablemente debido a la contaminación de la población CD8+ con un pequeño número de células CD4+. El segundo experimento utilizó RT-PCR para evaluar la expresión del receptor de zalfall en muestras de PMA estimulado con anti-CD3 + las muestras de CD4+ y CD8+ estimuladas con Ionomicina y no estimuladas, a puntos de tiempo de 0 horas, y a las 3.5 horas, 16 horas y 24 horas después de la activación. La muestra CD8+ en reposo fue arbitrariamente elegida como el calibrador y se le dio un valor de 1.00. Las células CD4+ y CD8+ en reposo no tuvieron cantidades significativas de expresión de receptor. La expresión fue de aproximadamente 3 veces mayor en las muestras de PMA + CD4+ estimulada con Ionomicina a las 3.5 horas, 16 horas y 24 horas después de la estimulación. La expresión en las células CD4+ activadas con anti-CD3 alcanzaron un máximo 10 veces por arriba de los niveles antecedentes a las 3.5 horas después de la estimulación, luego cayeron nuevamente a niveles 4 veces por arriba del antecedente a las 16 horas después de la estimulación. Las células CD8+ mostraron un incremento de 4 veces en la expresión a las 3.5 horas después de PMA + estimulación con Ionomicina, con la expresión que disminuyó a los puntos de tiempo subsecuentes. Como en el primer experimento, las células CD8+ estimuladas con anti-CD3 nuevamente mostraron un incremento de 8 veces por arriba de la inducción antecedente de la expresión del receptor. Estas muestras provenientes del segundo experimento fueron también utilizadas para evaluar la expresión del Ligando zalfall. La muestra de PMA + CD4+ estimulada con Ionomicina, de 24 horas, fue arbitrariamente elegida como el calibrador y se le dio un valor de 1.00. Los resultados mostraron que nuevamente ninguna de las células no estimuladas expresó el Ligando zalfall. Existió una inducción de aproximadamente 30 veces de la expresión del ligando en las células CD4+ estimuladas con anti-CD3 a las 3.5 horas, como se observa en el experimento previo (a las 4 horas) . No obstante, existió únicamente aproximadamente una inducción de 5 veces con PMA + estimulación con Ionomicina a las 3.5 horas, que disminuyó a los tiempos de punto subsecuentes. Nuevamente, las células CD8+ expresaron una cantidad muy pequeña del Ligando que fue probablemente atribuida a las células CD4+ contaminantes . El experimento final utilizó RT-PCR para evaluar la expresión del receptor de zalfall en muestras de CD4+ y CD8+ no estimuladas y estimuladas con anti-CD3 y con anti-CD3/anti-CD28 , a los puntos de tiempo de 0 horas, y a las 2 horas, 4 horas y 16 horas después de la estimulación. Las células CD19+ activadas con PMA + Ionomicina fueron también seleccionadas para la expresión del receptor a los mismos intervalos de tiempo. La muestra CD4+ restante fue arbitrariamente elegida como el calibrador y se le dio un valor de 1.00. Las células CD4+ estimuladas con anti-CD3, a las 2 horas, únicamente tuvieron una inducción 4 veces la del receptor, en comparación a la inducción 10 veces mayor observada a las 3.5 horas en el experimento previo. La combinación de anti-CD3 y anti-CD28 incrementó la expresión del receptor de zalfall a 8 veces por arriba del antecedente. Las células CD8+ estimuladas con anti-CD3/anti-CD28, a las 16 horas, tuvieron muy bajos niveles de expresión del receptor de zalfall, como se observa en las células CD8+ en los experimentos previos (arriba) . Las células CD19+ estimuladas con PMA + Ionomicina tuvieron la expresión de receptor de zalfall más significativa con un incremento de 19 veces a las dos horas, pero los niveles de expresión disminuyeron nuevamente a aquellos de las células restantes por 16 horas. Estas muestras provenientes del experimento final fueron también utilizadas para evaluar el ligando zalfall por RT-PCR. La muestra de CD8+ estimulada con anti-CD3/anti-CD28 de 16 horas, fue arbitrariamente elegida como el calibrador y se le dio un valor de 1.00. Los resultados mostraron que a las dos horas las células CD4+ tuvieron una inducción de aproximadamente 2 veces de la expresión del Ligando zalfall con una estimulación de anti-CD3 y una inducción 5 veces mayor con anti-CD3 + anti-CD28. Estas condiciones de estimulación indujeron la expresión del ligando con el tiempo, con las células CD4+ estimuladas a las 16 horas que mostraron niveles de expresión de ligandos 70 veces superiores al antecedente. Las células CD8+ y CD19+ no mostraron expresión de Ligando zalfall. Una cierta cantidad de variación fue esperada entre las extracciones de sangre (por ejemplo, muestras múltiples a diferentes tiempos del mismo paciente y entre pacientes múltiples) . Por lo tanto, las tendencias de los datos son analizadas dentro de cada estudio o a partir de una muestra de sangre simple y los tres experimentos anteriores fueron comparados para una conclusión completa. La tendencia a partir de los experimentos de PCR en tiempo real descritos anteriormente es que todos los tipos celulares probados, las células B CD19+ activadas con PMA + Ionomicina expresaron los más altos niveles del ARN del receptor de zalfall. Las células CD4+ y CD8+ pueden también ser estimuladas para expresar al receptor, pero a más bajos niveles que en las células B. El Ligando zalfall fue expresado casi exclusivamente en las células T CD4+ estimuladas (y no por las células CD8+ o las células B CD19+) . Aunque la estimulación con PMA + Ionomicina indujo una buena señal del Ligando zalfall en este ensayo, se obtuvo una señal significativamente más alta a partir de las células T CD4+ estimuladas con el anticuerpo monoclonal anti-CD3 o una combinación de los anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28, condiciones que imitan mejor un encuentro con antígeno in vivo .

Ejemplo 44 Proliferación dependiente del Ligando zalfall, de las células B estimuladas con anti-CD4 o anti-IgM _____ purificación de células B Humanas Un frasco que contenía 1 x 108 células mononucleares de sangre periférica humana, sometidas a aféresis, congeladas (PBMC) fueron rápidamente descongeladas en un baño de agua a 37 C y resuspendidas en 25 ml de medio de células B (Medio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) , 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 5% de L-glutamina, 5% Pen/Strep) (Gibco BRL)) en un tubo de 50 ml (Falcon VWR, Seattle, WA) . Las células fueron probadas para la viabilidad utilizando azul de Trypan (Gibco BRL) . Diez mililitros de Ficol/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) se colocaron en capa bajo la suspensión celular y se centrifugaron por 30 minutos a 1800 rpm y se dejaron detener con el freno apagado. La interfaz fue luego retirada y transferida a un tubo Falcon fresco de 50 ml, llevado hasta un volumen final de 40 ml con PBS y centrifugado con 10 minutos a 1200 rpm con el freno encendido. La viabilidad de las células aisladas fue nuevamente probada utilizando el Azul de Trypan. Alternativamente, la sangre humana recién extraída fue diluida a 1:1 con PBS (Gibco BRL) y colocada en capas sobre Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia) , centrifugada y lavada como se describe anteriormente. Las células aisladas de cualquiera de las fuentes fresca o congelada dieron resultados equivalentes . Las células B fueron purificadas a partir de las células sanguíneas periféricas flotadas en Ficoll de donadores humanos normales (ver arriba) con esferas magnéticas anti-CD19 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza de las preparaciones resultantes fue verificada de periódicamente mediante análisis citométrico de flujo con el anticuerpo FITC anti-CD22 (Pharmingen, San Diego, CA) . Las preparaciones de células B fueron típicamente >90% puras .

B. Purificación de Células B Murinas Se preparó una suspensión de esplenocitos murinos mediante el desmenuzamiento de bazos de ratón adulto C57B1/6 (Charles River Laboratories. Wilmington, MA) con agujas flexionadas en el medio de células B. Las RBCs fueron removidas mediante lisis hipotónica. Las células positivas a CD43 fueron removidas con esferas magnéticas CD43 (Miltenyi Biotec) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza de las preparaciones resultantes fue verificada periódicamente mediante análisis citométrico de flujo con el anticuerpo FITC anti-CD45R (Pharmingen) . Las preparaciones de células B fueron típicamente >90% puras.

C. Proliferación de células B estimuladas con anti-CD40 en presencia de ligando zalfall humano o murino Las células B provenientes de una fuente humana o de ratón fueron resuspendidas a una concentración final de 1 x 10d células/ml en medio de células B y sembradas en placa a 100 µl/pozo en una placa de fondo en U de 96 pozos (Falcon, VWR) que contenía diversas condiciones de estimulación para llevar el volumen final a 200 µl/pozo. Para la estimulación con anti-CD40, los cultivos humanos fueron suplementados con 1 µg/ml de anti-CD40 humano (Genzyme, Cambridge, MA) y los cultivos de ratón fueron suplementados con 1 µg/ml de anti-CD40 murino (Serotec, Reino Unido) . El Ligando zalfall humano o de ratón fue agregado a diluciones en el intervalo de 1 pg/ml a 100 ng/ml. La especificidad del efecto del Ligando zalfall fue confirmada por la inhibición del Ligando zalfall con 25 mg/ml de zalfallCEE humano, soluble (Ejemplo 10A) . Todos los tratamientos fueron realizados por triplicado. Las células fueron luego incubadas a 37 C en una incubadora humidificada por 120 horas (humanas) ó 72 horas (ratón) . Dieciséis horas antes de la cosecha, se agregó 1 µCi de 3H-timidina (Amersham, Piscataway, NJ) a todos los pozos para evaluar si las células B habían proliferado. Las células fueron cosechadas en una placa de filtro de 96 pozos (UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT) utilizando un cosechador de células (Packard) y recolectadas de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las placas fueron secadas a 55 C por 20-30 minutos y el fondo de los pozos se selló con un sellador de placa opaca. A cada pozo se agregaron 0.25 ml de fluido de cintilación (Microscint-O, Packard) y la placa fue leída utilizando un contador de cintilación de placa TopCount (Packard) . La incubación con el Ligando zalfall a concentraciones de 3 ng/ml o más, aumentó la proliferación inducida por anti-CD40 soluble de una manera dependiente de la dosis en células B murinas y humanas por tanto como 30 veces . Las células B murinas y humanas respondieron igualmente también a su Ligando zalfall respectivo. En ambas especies, la estimulación fue específica para el Ligando zalfall, ya que ésta fue revertida por la presencia del receptor zalfall soluble en el cultivo.

D. Proliferación de Células B estimuladas con anti-IgM, en presencia del Ligando zalfall humano o murino La células B provenientes de una fuente humana o de ratón como se describe anteriormente (Ejemplo 44A y Ejemplo 44B) fueron sembradas en placa como se describe anteriormente (Ejemplo 44C) . Para la estimulación de anti-IgM de las células humanas, las placas fueron prerrecubiertas toda la noche con 10 mg/ml de anticuerpos IgM anti-humanos F(ab'). (Southern Biotech Associates, Birmingham, Alabama) y lavadas con medio estéril justo antes del uso. Los cultivos fueron suplementados con 0-10 ng/ml de hu rIL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Para la estimulación con anti-IgM de células murinas, se agregó anti-IgM soluble (Biosource, Camarillo, CA) a los cultivos a 10 mg/ml. A cada una de las condiciones anti-IgM/IL-4 precedentes, se agregó el Ligando zalfall humano o murino a diluciones en el intervalo de 1 pg/ml-100 ng/ml como se describe anteriormente. La especificidad del efecto del Ligando zalfall fue confirmada mediante inhibición con el receptor zalfall humano, soluble, como se describe anteriormente (Ejemplo 44C) . Todos los tratamientos fueron realizados por triplicado. Las células fueron incubadas, marcadas con 3H-timidina, cosechadas, y analizadas como se describe en el Ejemplo 44C. La incubación con el Ligando zalfall a concentraciones de 0.3 ng/ml o más inhibió la proliferación inducida por anti-IgM insoluble (ratón) o anti-IgM e IL-4 (humana) de una manera dependiente de la dosis. Esta inhibición fue específica para el Ligando zalfall, ya que esto fue revertido por la presencia del receptor zalfall soluble en el cultivo.

Ejemplo 45 Expresión del receptor soluble de zalfall humano en E. coli A. Construcción del vector de expresión pCZR225 que expresa el polipéptido de fusión huzalfall/MBP-6H Un plásmido de expresión que contenía un polinucleótido que codifica para un receptor soluble en zalfall humano fusionado C-terminalmente a la proteína de enlace a la maltosa (MBP) fue construido por medio de recombinación homologa. Un fragmento del ADNc de zalfall humano (SEQ ID NO. 7) fue aislado utilizando PCR. La secuencia polinucleotídica para el polipéptido de fusión del receptor soluble de zalfall se muestra en la SEQ ID NO. 96. Fueron utilizados dos cebadores en la producción del fragmento de zalfall humano en una reacción de PCR: (1) Cebador ZC20,187 (SEQ ID NO. 98), que contiene 40 pb de la secuencia flanqueante del vector y 25 pb correspondientes al extremo amino de zalfall humano, y (2) el cebador ZC20,185 (SEQ ID NO. 99), que contiene 40 pb del extremo 3' correspondiente a la secuencia del vector flanqueante y 25 pb correspondientes al extremo carboxilo de zalfall humano. Las condiciones de reacción de PCR fueron como sigue: 25 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos, y 72 °C por 1 minuto; seguido por remojo a 4°C, corrido por duplicado. Dos µl de la reacción de PCR de 100 µl fueron corridos sobre un gel de agarosa al 1% con 1 x de amortiguador TBE para el análisis, y se observó el fragmento esperado de aproximadamente 660 pb. Los 90 µl restantes de la reacción de PCR fueron combinados con el segundo tubo de PCR precipitado con 400 µl de etanol absoluto. El ADN precipitado se utilizó para la recombinación dentro del vector recipiente pTAP98 cortado con Smal (Ejemplo 31) para producir la construcción que codifica la fusión MBP-zalfall. Los clones fueron transformados, identificados y desarrollados como se describe en el Ejemplo 31. Los clones positivos fueron designados pCZR225 y sujetos a análisis secuencial. La secuencia polinucleotídica para el polipéptido de fusión del receptor soluble MBP-zalfall es mostrada en la SEQ ID NO. 96, y la secuencia polipeptídica correspondiente se muestra en la SEQ ID NO. 97. Los clones positivos fueron utilizados para desarrollarse en E. coli como se describe en el Ejemplo 34 para la purificación de la proteína, de la proteína de fusión huzalfall/MPB-6H (Ejemplo 46, siguiente) .

Ejemplo 46 Purificación del receptor soluble huzalfall/MBP-6H a partir de la fermentación de E. coli A no ser que se indique de otro modo, todas las operaciones fueron llevadas a cabo a 4°C. Se utilizó el siguiente procedimiento para la purificación del polipéptido receptor soluble de hazalfall/MBP-6H. Las células de E. coli que contenían la construcción pCZR225 y que expresan el receptor soluble huzalfall/MBP-6H (Ejemplo 45) fueron desarrolladas en caldo SuperBroth II (12 g/1 de caseína, 24 g/1 de Extracto de Levadura, 11.4 g/1 de fosfato dipotásico, 1.7 g/1 de fosfato monopotásico; Becton Dickinson, Cockeysville, MD) , y congelado en 0.5% de glicerol. Veinte gramos de las células congeladas en SuperBroth II + Glicerol fueron utilizados para purificar la proteína. Las células congeladas fueron descongeladas y diluidas 1:10 en una solución inhibidora de proteasa (amortiguador de Extracción) antes de la lisis de las células y liberación de la proteína del receptor soluble hazalfall/MBP-6H. Las células diluidas contenían concentraciones finales de Tris 20 mM (JT Baker, Philipsburg, NJ) cloruro de sodio 100 mM (NaCl, Mallinkrodt, Paris, KY) , fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0.5 mM (PMSF, Sigma Chemical Co., St., Louis, MO) , 2 µl/ml de Leupeptina (Fluka, Suiza) , y 2 µg/ml de Aprotinina (Sigma) . Un sistema de rompimiento celular French Press (Constant Systems Ltd., Warwick, Reino Unido) con temperatura de -7 a -10°C y 2109 kg/cm2 (30 KPSI) se utilizó para lisar las células. Las células diluidas fueron verificadas para el rompimiento mediante las lecturas de A60o antes y después de la Prensa French. Las células lisadas fueron centrifugadas a 18,000G por 45 minutos para eliminar el detritus de las células rotas y el sobrenadante se utilizó para purificar la proteína. Las concentraciones totales de proteína objetivo del sobrenadante se determinaron por medio del Ensayo de Proteína BCA (Pierce, Rockford, IL) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Una columna de 25 ml de la resina de Afinidad de Metal Talón (Clontech, Palo Alto, CA) (preparada como se describe más adelante) se vació en una columna de vidrio Bio-Rad de 2.5 cm de diámetro x 10 cm de altura. La columna fue empaquetada y equilibrada por gravedad con 10 volúmenes de columna (CVs) del amortiguador de equilibrio Talón (Tris 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 8.0). El sobrenadante fue cargado por lotes a la resina de afinidad metálica Talón y se hizo oscilar toda la noche. La resina fue vaciada nuevamente de la columna y se lavó con 10 CV's del amortiguador de equilibrio Talón por gravedad, luego se eluyó por gravedad con 140 ml de amortiguador de elución (amortiguador de Equilibrio Talón + imidazol 200 mM-Fluka Chemical) . La columna Talón fue limpiada con 5 CVs de ácido 2- (N-morfolino) -etansulfónico 20 mM, pH 5.0 (MES, Sigma) , 5 CVs de agua destilada, luego se almacenó en 20% de etanol/0.1 de azida de sodio. Fracciones de catorce ml fueron recolectadas sobre la cromatografía de elución completa y las fracciones fueron leídas con la absorbancia a 280 y 320 nM y ensayo de proteínas BCA; el paso de lado a lado y los combinados de los lavados fueron también guardados y analizados. Las fracciones de elución de proteína de interés fueron combinadas y cargadas directamente a la resina de Amílosa (New England Biolabs, Beverly, MA) . Para obtener el polipéptido huzalfall/MBP-6H más puro, las fracciones combinadas de elución por afinidad Talón fueron sujetas a la resina de Amilosa (22 ml) a pH 7.4. Una columna Bio-Rad de 2.5 cm de diámetro x 10 cm de altura fue vaciada, empaquetada y equilibrada en 10 CVs del amortiguador de equilibrio de amilosa-Tris 20 mM (JT Baker) , cloruro de sodio 100 mM (Mallinkrodt) . PMSF 1 mM (Sigma) , beta-mercaptoetanol 10 mM (BME, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH), pH 7.4. La muestra fue cargada por gravedad a una velocidad de flujo de 0.5 ml/minuto. La columna fue lavada por 10 CVs con amortiguador de equilibrio de Amilosa, luego eluida con aproximadamente 2 CV del amortiguador de equilibrio de Amilosa + Maltosa 10 mM (Fluka Biochemical, Suiza) por gravedad. Fracciones de 5 ml fueron recolectadas sobre la cromatografía completa y se leyó la absorbancia a 280 y 320 nM. La columna de Amilosa fue regenerada con 1 CV de agua destilada, 5 CVs de SDS al 0.1% (p/v) (Sigma), 5 CVs de agua destilada, y luego 5 CVs de amortiguador de equilibrio de Amilosa. Las fracciones de interés fueron combinadas y dializadas en un Slide-A-Lyzer (Pierce) con 4 x litros de PBS pH 7.4 (Sigma) para remover los contaminantes de bajo peso molecular, intercambiar el amortiguador y desalar. Después de los cambios de PBS, el material cosechado representó el polipéptido huzalfall/MBP-6H purificado. El polipéptido huzalfall/MBP-6H fue analizado mediante tinción de Coomasie de SDS-PAGE y análisis de manchado de Western con el anticuerpo anti-conejo conjugado a HRP (Rockland, Gilbertsville, PA) . La concentración del polipéptido huzalfall/MBP-6H fue de 1.92 mg/ml como se determinó por el análisis de BCA. El polipéptido huzalfall/MBP-6H purificado fue preparado para la inyección en conejos y enviado a R & R Research and Development (Stanwood, WA) para la producción del anticuerpo. Los conejos fueron inyectados para producir el antisuero anti-huzalfall/MBP-6H (Ejemplo 47, siguiente) .

Ejemplo 47 Anticuerpos Policlonales contra el receptor de Zlfall Fueron preparados anticuerpos policlonales mediante la inmunización de dos conejos blancos New Zealand hembras, con el polipéptido huzalfall/MBP-6H purificado (Ejemplo 46) , o el receptor soluble de zalfallCEE recombinante, purificado (Ejemplo 10A) . Los anticuerpos policlonales correspondientes fueron designados anti-huzalfall/MBP-6H de conejo y anti-huzalfall-CEE-BHK de conejo, respectivamente. A los conejos se les administró una inyección intraperitoneal inicial de 200 mg de proteína purificada en Adyuvante Completo de Freund (Pierce, Rockford, IL) seguido por inyecciones intraperitoneales de refuerzo de 100 mg de proteína purificada en Adyuvante Incompleto de Freund cada tres semanas. Siete a diez días después de la administración de la tercera inyección de refuerzo, los animales fueron sangrados y el suero fue recolectado. Los conejos fueron luego reforzados y sangrados cada tres semanas . Los anticuerpos policlonales específicos de zalfall fueron purificados por afinidad a partir de suero de conejo utilizando una columna de proteínas CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que se preparó utilizando 10 mg del polipéptido huzalfall/MBP-6H purificado (Ejemplo 32) por gramo de CNBr-SEPHAROSE, seguido por diálisis 20x en PBS toda la noche. Los anticuerpos específicos de zalfall fueron caracterizados por una verificación del título por ELISA utilizando 1 mg/ml del antígeno proteico apropiado como un objetivo de anticuerpo. El límite inferior de la detección (LLD) del anticuerpo purificado por afinidad, de conejo anti-huzalfall/MBP-6H está a una dilución de 500 pg/ml. El LLD del anticuerpo purificado por afinidad de conejo, anti-huzalfall-CEE-BHK está a una dilución de 50 pg/ml .

Ejemplo 48 Distribución del receptor de Zalfall Para evaluar la distribución de zalfall sobre diversos tipos celulares, se generaron anticuerpos policlonales de conejo y monoclonales de ratón (mAbs) dirigidos contra el receptor humano (Ejemplo 35 y Ejemplo 47) y estos anticuerpos se conjugaron a la biotina para el uso en citometría de flujo. Se utilizaron inicialmente los anticuerpos policlonales, los cuales fueron de afinidad relativamente baja, para teñir un panel de líneas celulares: la línea de células pre-B murinas, dependientes de IL-3, las células BaF3 de tipo silvestre (Palacios and Steinmetz, ibid; Mathey-Prevot y colaboradores, ibid) ; células BaF3 transfectadas con zalfall humano (Ejemplo 4) ; líneas Raji de células de linfoma de Burkitt humanas (ATCC No. CCL-86) , Ramos (ATTC No. CRL-1596) , RPMI 8226 (ATCC No. CCL-155) , y Daudi (ATCC No. CCL-213); línea Jurkat de células de leucemia de células T humanas (ATCC No . TIB-152) ; líneas celulares Thp-1 de leucemia mielomonocítica humana (ATCC ?o . TIB-202) y UT937 (ATCC ?o. CRL-1593.2); células HLT60 promielomonocíticas humanas (ATCC ?o. CCL-240) ; línea celular A20 de linfoma de células B murinas (ATCC ?o. TIB-208) ; y línea celular EL4 de timoma murino (ATCC ?o. TIB-39) . Las células fueron cosechadas, lavadas una vez con FACS, con amortiguador lavado y con suero (WBS) . WBS consistió de solución salina balanceada de Hank (Gibco/BRL) + HEPS 10 mM (Gibco/BRL) + 1% de BSA (Sigma) + 10% de suero normal de cabra (Gemini Bioproducts, Woodland, CA) + 10% de suero de conejo normal (Sigma) . El amortiguador de lavado (WB) fue idéntico a WBS excepto que éste estuvo libre de suero. Después del lavado, las células fueron resuspendidas en 100 µl de WB que contenía 10 µg/ml de anticuerpos policlonales de conejo anti-zalfall (Ejemplo 47) . Las células fueron mantenidas sobre hielo con el anticuerpo por 20 minutos, luego lavadas con WB y resuspendidas en WB que contenía el anticuerpo de cabra anti-FITC de conejo (BioSource, International) , se incubaron otros 20 minutos sobre hielo, luego se lavaron y se resuspendieron en 400 µl de WB para el análisis sobre un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton, Dickinson) . Las muestras control fueron teñidas con el anticuerpo secundario de cabra anti-FITC de conejo, únicamente. La tinción positiva fue definida como un desplazamiento por arriba de la tinción con el secundario solo. Aunque los anticuerpos policlonales fueron de baja afinidad, se detectó con confianza la expresión de zalfall sobre el transfectante BaF3/zalfall, en los cuatro linfomas de Burkitt humanos (Raji, Ramos, Daudi, y RPMI 8226), y las células T de Jurkat. Las células HL-60 en reposo (no diferenciadas) no se enlazaron a los anticuerpos anti-zalfall, pero se detectó una señal positiva sobre las células HL-60 activadas por 24 horas con PMA (Calbiochem, La Jolla, CA) que induce la diferenciación de las células HL-60 en una célula similar a monocito. Se observó también una señal positiva sobre las células UT937 y Thp-1, aunque esta señal puede haber sido debida al enlace no específico. Los anticuerpos policlonales reaccionaron cruzadamente débilmente sobre la línea A20 de células B de ratón, pero no se observó tinción del timoma murino EL4.

Los cuatro anticuerpos monoclonales anti-zalfall (Ejemplo 35) fueron conjugados a biotina, y un subgrupo de las células descritas anteriormente se seleccionó para la expresión del receptor zalfall (BaF3, BaF3/zalfall, Raji, Jurkat, y HL-60 en reposo) . Las células fueron cosechadas, lavadas, luego resuspendidas en 100 µl de WB que contenía 15 µg/ml de cada uno de los cuatro anticuerpos monoclonales biotinilados . Las células fueron incubadas con el mAb por 20 minutos sobre hielo, luego lavadas con 1.5 ml de WB y concentradas en una centrífuga. El sobrenadante fue retirado mediante aspiración y los botones o concentrados fueron resuspendidos en 100 µl de estreptavidina conjugada a CyChrome (CyC-SA; PharMingen) , luego incubados sobre hielo por otros 20 minutos y lavados, y concentrados como se describe anteriormente. Los tubos control contenían células teñidas únicamente con CyC-SA. Los botones fueron resuspendidos en 400 µl de WB y la citometría de flujo se realizó como se describe anteriormente. La tinción positiva fue definida como una señal que excede el nivel antecedente de la tinción con CyC-SA solo. Utilizando el transfectante BaF3/zalfall como un control, fue capaz de clasificar los 4 mAbs en términos de sus respectivas intensidades de fluorescencia media (MFl) , las cuales pueden reflejar la afinidad del anticuerpo y/o el grado de biotinilación de los mAbs. Los mAbs fueron clasificados como sigue, del MFl más alto al más bajo: 249.28.2.1.2.2, 247.10.2.15.4.6, 249.19.2.2.3.5, y 249.15.2.4.2.7. Las células Raji fueron teñidas positivamente con los anticuerpos monoclonales con zalfall. Las células de Jurkats se tiñeron positivamente con los anticuerpos monoclonales de zalfall pero no tan fuertemente como las células, B (Raji) . De este modo, el receptor de zalfall fue expresado sobre estas líneas celulares B y T. Los patrones de tinción sobre las células HL60 no activadas fueron idénticos para todos los mAbs, y la señal fue muy débil. Se cree que esta señal no refleja la expresión efectiva de zalfall por las células HL-60, sino más bien puede ser debida al enlace no específico de los mAbs de ratón a las células humanas, probablemente vía los receptores de Fc.

Ejemplo 49 Efecto del Ligando zalfall humano sobre la fusión con saporina tóxica de las células B y el Ligando zalfall Los efectos del Ligando zalfall humano fueron probados sobre las líneas celulares B humanas siguientes: y las líneas celulares Raji del linfoma de Burkitt humano (ATCC No. CCL-86) , y Ramos (ATCC No. CRL-1596) ; la línea celular RPMI 1788 (ATCC No. CRL-156) de linfoma de células B de EBV humano; la línea celular IM-9 de mieloma/plasmacitoma humano (ATCC No. CRL159) ; y la línea de células B transformadas por EBV humanas, DAKIKI (ATCC-No. TIB-206) y las células HS Sultán (ATCC No. CRL-1484) . Después de aproximadamente 2-5 días de tratamiento con el Ligando zalfall, fueron encontrados cambios en la expresión del marcador superficial en las líneas celulares IM-9, Raji, Ramos, y RPMI1788, mostrando que estas células pueden responder al Ligando zalfall. Las líneas de células B humanas tratadas con el Ligando zalfall se desarrollaron mucho más lentamente que las células no tratadas cuando se resembraron en placa en cajas de cultivo de células. Estas células tuvieron también una expresión incrementada del ligando FAS, como se evaluó mediante citometría de flujo (Ejemplo 49D y Ejemplo 49E) , y sensibilidad moderadamente incrementada a un anticuerpo FAS activante (Ejemplo 49A) . Estos resultados indican que el Ligando zalfall podría controlar algunos tipos de neoplasmas de células B induciéndolas a diferenciarse a un estado menos proliferativo y/o más sensible al ligando FAS. Además, el receptor de zalfall es expresado sobre la superficie de varias de estas líneas celulares (Ver Ejemplo 48) . De este modo, el Ligando zalfall y el conjugado ligando zalfall humano-inmunotoxina saporina (Ejemplo 49B, siguiente) , u otra fusión de Ligando zalfall-toxina, podrían ser terapéuticamente utilizados en leucemias y linfomas de células B.

A. El efecto del Ligando zalfall humano sobre la línea de células B Células IM-9 fueron sembradas a aproximadamente 50,000 células por ml +/- 50 µg/ml del Ligando zalfall humano purificado (Ejemplo 29) . Después dé 3 días de desarrollo, las células fueron cosechadas, lavadas y contadas, y luego sembradas nuevamente en placa a aproximadamente 2500 células/ml en placas de 96 pozos dentro de pozos con 0, 0.033, 0.1 ó 0.33 µg/ml de anticuerpo anti -FAS /R&D Systems, Minneapolis) . Después de 2 días se realizó un ensayo de fluorescencia con azul Alamar (Ejemplo 2B) para evaluar la proliferación de las células . Las células IM-9 tratadas con el Ligando zalfall se desarrollaron únicamente a 27% de la densidad de las células no tratadas, en ausencia del anticuerpo anti-FAS. En presencia de 0.33 µg/ml de anticuerpo anti-FAS, las células tratadas con Ligando zalfall fueron inhibidas un 52% adicional mientras que las células no tratadas fueron inhibidas únicamente por 30%. La inhibición total del crecimiento celular con el Ligando zalfall y 0.33 µg/ml del anticuepo anti-FAS, fue de 86%. Cuando las células IM-9 fueron pretratadas por tres días con o sin el Ligando zalfall y luego resembradas en placa a 100 células por pozo y desarrolladas con o sin el anticuerpo anti-FAS por 6 días, el desarrollo de las células no tratadas evaluadas por el ensayo de Azul Alamar (Ejemplo 2B) fue inhibido únicamente con 25% por el anticuerpo anti-FAS mientras que el desarrollo de las células tratadas con el Ligando zalfall fue inhibido 95% con relación al crecimiento de las células no tratadas en cero por ciento de anticuerpo anti-FAS.

B. El efecto del Ligando zalfall humano- inmunotoxina saporina, sobre líneas de células B La construcción y purificación del conjugado de Ligando zalfall humano-inmunotoxina saporina (zalfallL-sap) se describe en el Ejemplo 50. zalfallL-sap humano fue mucho más potente que la saporina sola al inhibir el desarrollo celular. Cuando las células tratadas son sembradas nuevamente en placa después de un tratamiento de tres o cuatro días, las células tratadas con zalfallL-sap humano, se desarrollaron muy pobremente.

Las células IM-9, Ramos y K562 (ATCC No. CCL-243) fueron sembradas a aproximadamente 2500 células/pozo en placas de 96 pozos con cero a 250 ng/ml del conjugado zalfall humano-sap ó 0-250 ng/ml de saporina (Stirpe y colaboradores, Biotechnology 10:405-412, 1992) únicamente como un control . Las placas fueron incubadas 4 días y luego se realizó un ensayo de proliferación con Azul Alamar (Ejemplo 5B) . A la concentración máxima del conjugado zalfall humano-sap, el desarrollo de las células IM-9 y las células RAMOS fue inhibido por 79% y 65% respectivamente. Las células K562 que son bajas/negativas por flujo para la expresión del receptor de zalfall no fueron afectadas por zalfall, mostrando de este modo la especificidad del efecto del conjugado . Las células IM-9 fueron sembradas a 50,000 células/ml en placas de 6 pozos a cero y 50 ng/ml del conjugado zalfall-sap humano. Después de 3 días las células fueron cosechadas y contadas, y luego sembradas nuevamente en placa de 100 a 0.8 células por pozo en diluciones en serie a un medio, y 12 pozos por dilución celular sin el Ligando zalfall-inmunotoxina saporina. Después de 6 días, se calificó el número de pozos con el crecimiento a cada dilución celular, de acuerdo a los resultados de un ensayo de proliferación con azul Alamar (Ejemplo 2B) .

Cuando se evaluó el número de células mediante el ensayo de azul Alamar (Ejemplo 2B) , después de 6 días de crecimiento las células control sembradas a aproximadamente 12.5 y 6.25 células por pozo tuvieron crecimiento eguivalente a las células tratadas con zalfall-sap, sembradas a 100 y 50 células/pozo, respectivamente. De este modo, el desarrollo de las células IM-9 tratadas, supervivientes fue notablemente deteriorado incluso después del retiro y de la siembra en placa de zalfall-inmunotoxina sap. La distribución tisular limitada del receptor zalfall humano (Ejemplo 48) , y la especificidad de la acción de zalfall-sap a las líneas celulares que expresan el receptor, sugieren que este conjugado puede ser tolerado in vivo.

C. El efecto del Ligando zalfall humano- inmunotoxina saporina sobre la viabilidad de líneas de células B Células HS Sultán (ATCC No CRL-1484) fueron sembradas a aproximadamente 40,000 células por ml en placas de 12 pozos, y desarrolladas por cinco días ya sea sin citocinas agregadas ó 40 ng/ml del Ligando zalfall humano purificado (Ejemplo 29) ó 25 ng/ml del conjugado zalfallL humano-sap (Ejemplo 50 siguiente) o con 20 ng/ml de IFN-alfa (RDI) o el Ligando zalfall e IFN-alfa. El Ligando zalfall inhibió el desarrollo de las células Hs Sultán en un 63%. IFN-alfa inhibió el desarrollo por un 38%. El Ligando zalfall más IFN-alfa inhibió el desarrollo en un 78%, indicando que los efectos inhibitorios del desarrollo del Ligando zalfall humano e IFN-alfa pueden ser aditivos, zalfall humano-sap inhibió el desarrollo de las células HS Sultán en un 92%. Los resultados anteriores apoyan el posible uso del Ligando zalfall humano o de zalfallL humano-sap en el tratamiento de malignidades u otras enfermedades que expresan el receptor de zalfall, particularmente aquellas de origen de células B. La combinación del ligando de zalfall con IFN-alfa es específicamente sugerida por su efecto aditivo en la inhibición de las células HS Sultán. Algunos otros tipos de malignidades linfoides y enfermedades pueden también expresar el receptor de zalfall, como las células T activadas también expresan el ARNm del receptor (Ejemplo 48) , y algunas de estas enfermedades pueden también responder al Ligando zalfall de la terapia de fusión del Ligando zalfall-tóxico.

D. La expresión de FAS (CD95) sobre líneas de células B humanas es incrementada por la estimulación del Ligando zalfall humano Las líneas de células B humanas, HS Sultán (ATCC No. CRL-1484), IM-9 (ATCC No. CRL159) , RPMI 8226 (ATCC No. CCL-155) , RAMOS (ATCC No. CRL-1596) , DAKIKI (ATCC No. TIB-206), y RPMI 1788 (ATCC No. CRL-156) , fueron todas tratadas con o sin Ligando zalfall humano purificado, de 10 a 50 ng/ml (Ejemplo 29) por 2 a 8 días. Las células fueron luego teñidas con el anticuerpo anti-CD95 conjugado a PE (PharMingen, San Diego, CA) , de acuerdo al protocolo del fabricante, y analizadas sobre un FACScalibur (Becton Dickinson, San José, CA) . En todas las líneas celulares, la tinción de anti-CD95 (FAS o APO-1) fue incrementada, y en algunos casos más de dos veces, después del tratamiento con el Ligando zalfall humano.

E. La Expresión de FAS (CD95) sobre Células B Primarias de Bazo de ratón es incrementada por la estimulación del Ligando zalfall humano Se obtuvieron esplenocitos primarios de ratón mediante el desmenuzamiento de los bazos provenientes de ratones C57/BL6 de 8 a 12 semanas de edad. Los eritrocitos fueron lisados mediante tratamiento de la preparación por 5 segundos con agua y luego colocados a través de un tamiz de 70 micrómetros. Los esplenocitos remanentes fueron lavados y sembrados en placa en RPMI (JRH Bioscience) más 10% de HIA-FBS (Hyclone, Logan, UT) . La interleucina 2 (IL-2) R & D Systems) con o sin el Ligando zalfall humano, como se describe anteriormente. Éstas fueron luego incubadas a 37°C, en 5% de C02 por 5 días. Los esplenocitos fueron cosechados y teñidos con el anticuerpo anti-CD95, conjugado a PE (PharMingen) y el anticuerpo anti-CDl9, conjugado a FITC (PharMingen) de acuerdo al protocolo del fabricante. Las células fueron analizadas mediante citometría de flujo sobre un FACScalibur (Becton Dickinson) . Después de analizar las células B de ratón CD19+, se encontró que la tinción anti-CD95 se incrementó sobre las células B tratadas con IL-2 más el Ligando zalfall humano en comparación a aquellas en IL-2 solo. La tinción anti-CD95 fue de 37 unidades fluorescentes relativas (RFU) sobre las células B en IL-2 sola y 55 RFU sobre las células B cultivadas en IL-2 y el Ligando zalfall humano.

Ejemplo 50 Construcción y purificación de la fusión tóxica del Ligando zalfall Bajo un contrato de suministro, se enviaron 10 mg del Ligando zalfall (Eemplo 29) a Advanced Targeting Systems (ATS, San Diego, CA) para la conjugación a la toxina vegetal saporina (Stirpe et al., Biotechnology 10: 405-412, 1992). Zymogenetics recibió de ATS 1.3 mg de un conjugado proteico comprendido de 1.1 moléculas de saporina por molécula del Ligando zalfall humano, formulado a una concentración de 1.14 mg/ml en fosfato de sodio 20 nM, cloruro de sodio 300 nM, pH 7.2.

Ejemplo 51 Fusión tóxica del Ligando zalfall in vivo A. Prueba del conjugado zalfall-saporina en ratones El conjugado zalfall-saporina (Ejemplo 49) fue administrado a ratones C57BL6 (hembras, de 12 semanas de edad, adquiridos de Taconic) a dos diferentes dosis: 0.5 y 0.05 mg/kg. Las inyecciones fueron dadas intravenosamente en vehículo consistente de 0.1% de BSA (ICN, Costa Mesa, CA) . Se administraron tres inyecciones en un periodo de una semana (día O, 2, y 7) . Se tomaron muestras sanguíneas de los ratones en el día 0 (pre-inyección) y en los días 2 y 8 (después de la inyección) . Se recolectó la sangre en tubos heparinizados (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) , y las cuentas celulares fueron determinadas utilizando un analizador de hematología automatizado (Abbot Cell-Dyn modelo No. CD-3500CS, Abbot Park, IL) . Los animales fueron sacrificados y se les realizó la necropsia en el día 8 después de la recolección de la sangre. Se recolectaron el bazo, el timo, el hígado, los riñones y la médula ósea para la histopatología. El bazo y el timo fueron pesados, y se recolectó una muestra adicional de sangre en tubos separadores de suero. El suero fue enviado a los Laboratorios Centrales de Phoenix (Phoenix Central Labs.), Everett, WA, para la prueba en un panel de química estándar. Las muestras fueron también recolectadas para el análisis citométrico de flujo como se describe en la presente. Las cuentas de las células sanguíneas en circulación y las mediciones de la química del suero no difirieron significativamente entre los ratones tratados con el conjugado zalfall y los ratones tratados con una dosis equivalente de la toxina no conjugada (saporina) . El análisis histológico de los tejidos en los ratones tratados con zalfall-saporina no mostró cambios significativos con relación a los ratones tratados con una dosis equivalente de la toxina no conjugada. Estos resultados indicaron que el conjugado de saporina no fue tóxico in vivo .

B. Prueba de la fusión de saporina tóxica al Ligando zalfall sobre tumores derivados de células B in vivo Los efectos del Ligando zalfall humano y de la fusión de la saporina tóxica al Ligando zalfall humano (Ejemplo 50) sobre las células tumorales humanas son probados in vivo utilizando un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón descrito en la presente. Los modelos de xenoinjerto son inicialmente probados utilizando las líneas celulares seleccionadas con base en los experimentos in vi tro, tales como aquellos descritos en el Ejemplo 49. estas líneas celulares incluyen, pero no están limitadas a: líneas Raji de células de linfoma de Burkitt humano (ATCC No. CCL-86) , y Ramos (ATCC No. CRL-1596) ; la línea RPMI 1788 de células humanas (ATCC No. CRL-156) ; línea IM-9 de células de mieloma/plasmacitoma humano (ATCC No. CRL159) ; la línea celular humana DAKIKI (ATCC No. TIB-206) , y las células HS Sultán (ATCC No. CRL-1484) . Las células derivadas directamente de tumores humanos pueden también ser utilizadas en este tipo de modelo. De esta manera, la selección de las muestras de los pacientes para la sensibilidad al tratamiento con el Ligando zalfall o con una fusión de saporina tóxica al Ligando zalfall, puede ser utilizada para seleccionar las indicaciones óptimas para el uso de zalfall en la terapia anti-tumoral . Después de la selección del xenoinjerto apropiado en el modelo in vivo descrito anteriormente, la actividad inducida por el Ligando zalfall de las células asesinas naturales y/o los efectos del Ligando zalfall sobre los tumores derivados de las células B, son evaluados in vivo . El Ligando zalfall humano es probado para su habilidad de generar células efectoras citotóxicas (por ejemplo células NK) con actividad contra los tumores derivados de células B utilizando modelos de xenoinjerto de. tumor de ratón descritos en la presente. Además, los efectos directos del Ligando zalfall sobre los tumores, pueden también ser evaluados. Los modelos de xenoinjerto que van a ser llevados a cabo son seleccionados como se describe anteriormente. Un protocolo que utiliza las células humanas estimuladas con el Ligando zalfall es desarrollado y probado para la eficiencia en el agotamiento de las células tumorales y la promoción de la supervivencia en ratones inoculados con las líneas celulares o los tumores primarios .

Ejemplo 52 Identificación de los Clones del Cromosoma Artificial Pl que coniene el ADN genómico del Ligando zalfall humano El inserto de ADNc del Ligando zalfall humano fue amplificado mediante PCR utilizando los cebadores basados en el vector. El producto de PCR fue marcado con 32P e hibridado a filtros de alta densidad que representan una genoteca PAC (Cromosoma Artificial Pl) . Los filtros y las reservas de genoteca congeladas fueron obtenidos de Roswell Park Cáncer Institute, Buffalo, New York; el segmento de la genoteca fue RPCI6, con una profundidad de cobertura cuatro veces mayor. Los filtros fueron hibridados toda la noche a 65°C en ExpressHyb (Clontech) y fueron lavados de acuerdo a las sugerencias del fabricante. La descodificación de las señales positivas dio como resultado la identificación de cuatro clones PAC, designados 23H17, 34A9, 105G9, y 236H14. El análisis de PCR utilizando cebadores específicos para el extremo 5' (ZC22,452 (SEQ ID NO. 100) y ZC 22,451 (SEQ ID NO. 101)) y el extremo 3' (ZC 22,450 (SEQ ID NO. 102) y ZC 22,449 (SEQ ID NO. 103)) de la región de codificación mostró que los PACs 34A9 y G105G9 contenían ambos extremos, mientras que los PACs 23H17 y 236H14 contenían el extremo 5' únicamente. El PAC 23H17 fue digerido con EcoRI y Notl, y se identificó un fragmento de 9 kb que se híbrido con la sonda de ADNc del Ligando zalfall. Este fragmento fue aislado y subclonado, utilizando los métodos descritos en la presente, dentro de pBluescript II SK (+) (Stratagene) previamente digerido con EcoRI y Notl. El secuenciamiento reveló que este fragmento contenía aproximadamente 380 pares de bases de la región promotora, exones 1, 2 y 3, todos de los intrones 1 y 2 , y terminaron dentro del intrón 3. El extremo 3' del gen del Ligando zalfall humano fue obtenido mediante PCR utilizando ADN a partir del PAC 34A9 como plantilla, con los cebadores ZC23,771 (SEQ ID NO. 104) y ZC22,449 (SEQ ID NO. 103) . La ADN-polimerasa Taq fue utilizada, con el amortiguador proporcionado, con la adición de 4% de DMSO. Las condiciones de reacción fueron como sigue: 94°C, 5 minutos; seguido por 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 52 °C por 1 minuto, 72 °C por 3 minutos; luego 72 °C por 7 minutos. Esto generó un fragmento de 2.9 kb que contenía parte del exón 3 , los intrones 3 y 4 , todo el exón 4, y la porción de codificación del exón 5. La estructura genómica del gen del Ligando zalfall humano es como sigue de 5 ' a 3': la SEQ ID NO. 105, que contiene aproximadamente 240 pb del promotor, el exón 1 (número de nucleótido 240-45 de la SEQ ID NO. 105) , el intrón 1 (número de nucleótido 456-562 de la SEQ ID NO. 105), el exón 2 (número de nucleótido 563-598 de la SEQ ID NO. 105) , y parte del intrón 2 que contiene 748 pares de bases del extremo 5' (número de nucleótido 599-1347 de la SEQ ID NO. 105) ; un espacio vacío de aproximadamente 3 kb; la SEQ ID NO. 106, que contiene los 718 pares de bases 3' del intrón 2, el exón 3 (número de nucleótido 719-874 de la SEQ ID NO. 106), y parte del extremo 5' del intrón 3 (número de nucleótido 875-1656 de la SEQ ID NO. 106) ; un espacio libre de menos de aproximadamente 800 pb; SEQ ID NO. 107, que contiene 644 pb del intrón 3; un espacio vacío de menos de aproximadamente 800 pb; y la SEQ ID NO. 108, que contiene los 435 pb 3' del intrón 3, exón 4 (número de nucleótido 436-513 de la SEQ ID NO. 108) , el intrón 4 (número de nucleótido 514-603 de la SEQ ID NO. 108) , y parte del extremo 5' del exón 5 (número de nucleótido 604-645 de la SEQ ID NO. 108) .

Ejemplo 53 Estudio de enlace del Ligando zalfall marcado con 125I en líneas celulares 25 microgramos del Ligando zalfall humano, purificado (Ejemplo 29) se marcaron con 2 mCI de 125I. utilizando yodoesferas (Pierce, Rockford Illinois) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Esta proteína marcada fue utilizada para evaluar el enlace del Ligando zalfall a las células Raji humanas (ATCC No. CCL-86) , utilizando el enlace a las células BaF3 murinas de tipo silvestre, y las células BaF3 transfectadas con el receptor de zalfall (células BaF3/hzalfall) como controles. El Ligando zalfall que se enlaza a las células BaF3/hzalfall fue esperado (control positivo) , mientras que no se esperó ningún enlace a las células BaF3 de tipo silvestre (control negativo) , con base en los resultados del ensayo de proliferación (Ejemplo 5) . Aproximadamente 5X105 células Raj i/pozo, 1X106 BaF3/hzalfall y 1X106 células BaF3/?ozo, fueon cada una sembradas en placa, en placas de 96 pozos. Se agregaron 10 ng/ml del Ligando zalfall, humano marcado por duplicado a los pozos, con una serie de diluciones del competidor del Ligando zalfall humano, no marcado, agregado a partir de un exceso de 250 veces molar en diluciones 1:4 hasta un exceso molar de 0.061 veces. Cada punto fue corrido por duplicado. Después de que el Ligando zalfall humano, marcado, fue agregado a los pozos, éste se dejó incubar a 4°C por 2 horas para permitir el enlace del Ligando a las células. Las células fueron luego lavadas 3 veces en amortiguador de enlace (RPMI-1710 (JRH Bioscience) con 1% de BSA (Sigma) ) , y se contaron sobre el contador gamma COBRA II AUTO-GAMMA (Packard Instrument Company, Meriden, CT) .

El enlace del Ligando zalfall marcado a las células, fue evidente en las células Raji y BaF3/hzalfall . además, para las células Raji, un exceso promedio de 250 veces molar del Ligando zalfall no marcado disminuyó el enlace 3 veces en presencia de un competidor no marcado, no específico (Interferon Gamma de R&D Systems, Minneapolis, MN) , y 3.7 veces con relación al no competidor. La competencia fue observada de una manera dependiente de la dosis para el competidor no marcado específico, el Ligando zalfall humano. De este modo, el Ligando zalfall que se enlaza a las células Raji fue específico. Similarmente, para las células control positivo BaF3/zalfall, el exceso molar de 250 veces del Ligando zalfall no marcado disminuyó el enlace 2 veces con relación al competidor no específico y 3.06 veces con relación al no competidor. De este modo, el Ligando zalfall que se enlaza a las células BaF3/zalfall fue también específico. No se observó enlace competible con las células BaF3 de tipo silvestre. De este modo, el Ligando zalfall mostró que se enlaza específicamente a las células Raji, y a las células BaF3/hzalf ll, pero no a las células BaF3 control negativo.

Ejemplo 54 Expresión del Receptor de zalfall sobre Células Humanas de Sangre Periférica A. Preparación y Cultivo de Células Humanas de Sangre Periférica La sangre humana recién extraída fue diluida 1:1 con PBS (GIBCO BRL) y colocada en capas sobre Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) y centrifugada por 30 minutos a 1800 rpm y se dejaron detener con el freno apagado. La capa interfacial fue removida y transferida a un tubo Falcon fresco de 50 ml (Falcon, VWR, Seattle, WA) , llevado a un volumen final de 40 ml con PBS y centrifugado por 10 minutos a 1200 rpm con el freno encendido. La viabilidad de las células aisladas fue probada utilizando Azul de Trypan (GIBCO BRL) y las células fueron resuspendidas a una concentración final de 1 x 10s células/ml d? medio celular (Medio RPMI 1640, suero bovino fetal al 10% inactivado por calor, 5% de L-glutamina, 5% de Pen/Strep) (GIBCO BRL) . Las células fueron cultivadas en placas de 6 pozos (Falcon, VWR) por 0, 4 ó 24 horas con una variedad de diferentes estímulos descritos más adelante. La estimulación de anti-IgM. anti-CD40 y anti-CD3 fueron realizadas como en el Ejemplo 44 y en el Ejemplo 42. El miristato-acetato de forbol (PMA) y ionomicina (Sigma, Saint Louis, MO) (Ejemplo 5C) fueron agregados a los pozos apropiados a 10 ng/ml y 0.5 mg/ml respectivamente. Las células fueron incubadas a 37°C en una incubadora humidificada por varias veces.

B. Tinción y Análisis del Anticuerpo Las células fueron recolectadas de las placas, lavadas y resuspendidas en medio de tinción enfriado con hielo (HBSS, 1% de suero fetal bovino, 0.1% de azida de sodio) a un concentración de aproximadamente diez millones de células por ml . El bloqueo del receptor Fc y el enlace no específico de los anticuerpos a las células fue logrado mediante la adición de 10% de suero de cabra normal (Gemini Bioproducts, Woodland, CA) y 10% de suero humano normal (Ultraserum, Gemini) a la suspensión celular. Las alícuotas de las suspensiones celulares fueron mezcladas con un anticuerpo monoclonal marcado con FITC contra uno de los marcadores de línea CD3 , CD19 o CD14 (PharMingen, La Jolla, CA) y un anticuerpo monoclonal biotinilado contra el receptor de zalfall humano (hu-zalfall) (Ejemplo 35) . La especificidad de tinción fue determinada mediante competencia utilizando el receptor soluble zalfallCEE (Ejemplo 10A) a un exceso de masa de diez veces. Después de la incubación sobre hielo por 60 minutos, las células fueron lavadas dos veces con el medio de tinción enfriado con hielo y resuspendidas en 50 ml de medio de tinción que contenía estreptavidina-PE (Caltag, Burlingame, CA) . Después de una incubación de 30 minutos sobre hielo, las células fueron lavadas dos veces con amortiguador de lavado enfriado con hielo (PBS, 1% de suero fetal bovino, 0.1% de azida de sodio) y resuspendido en amortiguador de lavado que contenía 1 mg/ml de 7-AAD (Molecular Probes, Eugene, OR) como un marcador de viabilidad. Se adquirieron los datos de flujo sobre las células vivas utilizando un citómetro de flujo FACScalibur (BD Immunocytometry Systems, San José, CA) . La adquisición y el análisis fueron realizados utilizando el programa CellQuest (BD Immunocytometry Systems) . ) Los resultados de la tinción por el anticuerpo anti-zalfall mostraron que el receptor de zalfall humano es expresado sobre células de sangre periférica humana que expresan ya sea CD3 , CD19 o CD14. La tinción sobre las células CD3 y CD19 fue específica, como se puso en evidencia por la competencia absoluta con el receptor soluble de zalfall. La tinción sobre las células CD14 mostró alguna especificidad para el Ligando, como se puso en evidencia por la competencia parcial con el receptor soluble. La activación de las células T con anti-CD3 o las células B con anti-CD40 dio como resultado un nivel incrementado de zalfall en la superficie celular, a las 24 horas . No se observó ningún incremento en el nivel de expresión de zalfall a las 4 horas con algún estímulo sobre alguna de las poblaciones celulares. El tratamiento de las células con el Ligando zalfall dio como resultado una disminución en la tinción de zalfall sobre las células positivas a CD3 y positivas a CD19 pero no las células positivas a CD14 a las 4 y 24 horas.

Ejemplo 55 Evaluación Preliminar de la Estabilidad Acuosa del Ligando zalfall humano Se condujeron estudios preliminares para evaluar las características de estabilidad acuosa del Ligando zalfall humano en apoyo del bioprocesamiento, formulación y administración in vivo . Los objetivos fueron: 1) verificar la estabilidad y recuperación a partir de Alzet Minipumps y el almacenamiento y manejo generales; 2) determinar la naturaleza indicadora de la estabilidad de varios métodos analíticos incluyendo la HPLC de intercambio catiónico (CX-HPLC) , HPLC de fase inversa (RP-HPLC) , HPLC de exclusión de tamaño (SEC-HPLC) , y bioensayo (proliferación de BaF3/zalfallR (por ejemplo, Ejemplo 2 y Ejemplo 4) , y 3) determinar las vías de degradación limitadoras de la estabilidad y sus dependencias cinéticas. Alícuotas del Ligando zalfall purificado humano (Ejemplo 29) fueron preparadas mediante la dilución a 2 mg/ml en PBS (pH 7.4) y se almacenaron en criofráseos de polietileno de baja densidad (LDPE) (Nalgene, 1.8 ml) a -80°C (control) , 5°C, 30°C, y 37°C. Las muestras fueron evaluadas intermitentemente en 29 días mediante CX- , RP-, SEC-HPLC, y bioensayo. Las alícuotas fueron también almacenadas a -80°C y sujetas a ciclos de congelamiento-descongelamiento (f/t) (-80°C/temperatura ambiente; 5X f/t, 10X f/t) . La recuperación del Ligando zalfall humano fue determinada con relación al control a -80 °C (1 f/t) en todos los ensayos . La solución del Ligando zalfall humano, remanente a partir de las muestras control de -80°C fueron recongeladas (-80°C) después del análisis. Esta alícuota (2 f/t) fue utilizada para evaluar la estabilidad térmica y conformacional del Ligando zalfall humano como una función del pH utilizando dicroísmo circular (CD) . La solución de 2 mg/ml fue diluida a 100 µg/ml en amortiguadores de PBS en el intervalo de pH 3.3-8.8. Los espectros de CD de UV lejano fueron verificados periódicamente sobre el intervalo de temperatura de 5 a 90°C a intervalos de 5°C (n=3/pH) .

El espectropolarímetro CD utilizado fue un Jasco 715 (Jasco, Easton, MD) . El desplegamiento térmico fue verificado periódicamente mediante los cambios en la elipticidad a 222 nm como una función de la temperatura. Los estimados de Tm fueron estimados asumiendo un modelo de desplegamiento de dos estados. Los datos fueron ajustados (sigmoidales) utilizando Slide Write Plus para Windows versión 4.1 (Advanced Graphics Software; Encinitas, CA) . La recuperación y la estabilidad a partir de Alzet Minipumps (Modelo No. 1007D; ALZA Corporation, Mountain View, CA) fue evaluada mediante el llenado de las bombas con 100 µl de la solución del Ligando zalfall humano a 2 mg/ml, colocando las bombas en 1.8 ml de LDPE que contenía 1 ml de PBS (pH 7.4), y almacenándolas a 37°C. La liberación/recuperación del Ligando zalfall humano a partir de las minibombas fue evaluada por CX-, RP-, y SEC-HPLC en los días 2, 4 y 7. La actividad fue evaluada mediante el bioensayo en el día 7. El estudio fue diseñado para evaluar la liberación de 3 bombas por tiempo de toma de muestra. Los datos cromatográficos sugirieron que los métodos " CX- y SEC-HPLC fueron indicadores de la estabilidad, mientras que el método RP-HPLC no lo fue. Al menos 3 picos adicionales que indican los productos de degradación aparentes fueron observados mediante CX-HPLC.

El método SEC-HPLC resolvió un agregado del Ligando zalfall humano aparente, eluyendo antes del Ligando zalfall humano. No obstante, no fueron observados picos adicionales significativos eluyendo después del pico del Ligando zalfall humano. Esto sugiere que los productos de degradación observados por CX-HPLC más probablemente resultan de las modificaciones de los aminoácidos tales como la desamidación, en vez de los procesos de hidrólisis/proteólisis que conducen a las variantes acortadas. Un grado pequeño de frente/cola fue observado por RP-HPLC (con relación al control) en las muestras que habían mostrado haber sufrido degradación significativa por SEC- y CX-HPLC. ?o obstante, los productos de degradación aparentes no fueron resueltos por RP-HPLC. La degradación observada por CX-HPLC se incrementó como una función del tiempo-temperatura, y siguió cinética aparente de primer orden. El Ligando zalfall humano porcentual recuperado por CX-HPLC después de 29 días a 37°C, 30°C y 5C fue 39%, 63%, y 98%, respectivamente. La agregación fue también incrementada de una manera dependiente del tiempo y la temperatura. El por ciento de agregado encontrado en las preparaciones almacenadas por 29 días a 37°C, 30°C y 5°C fue de 7.4, 3.4 y por debajo de límites detectables (BDL) , respectivamente. ?o se observaron diferencias significativas por el bioensayo en ninguna muestra, sugiriendo que los productos de degradación tienen actividad eguivalente al Ligando zalfall humano, intacto. No se observó degradación por ningún ensayo en las muestras sujetas hasta 10 ciclos de f/t. La liberación del Ligando zalfall humano de las mínibombas Alzet fue consistente con la liberación volumétrica teórica, esperada. Esto sugiere que la adsorción superficial significativa podría no deteriorar la distribución del Ligando zalfall humano utilizando Alzet Minipump con concentración de relleno de 2 mg/ml. La degradación consistente con aquella previamente percibida, fue observada. El por ciento de pureza determinado por CX-HPLC del Ligando zalfall humano liberado después de 2, 4 y 7 días, fue 96%, 90% y 79%, respectivamente. Se debe reconocer que la degradación también ocurre después' de que el Ligando zalfall humano es liberado hacia o diluido con el medio de liberación. Por lo tanto, el por ciento de pureza dentro de la minibomba puede ser algo diferente de aquel determinado para estar en el medio de liberación. La bioactividad de cada muestra fue consistente con la cantidad esperada del Ligando zalfall humano, liberado de las minibombas . Los espectros de CD de UV lejano del Ligando zalfall humano, como se esperaba, fueron consistentes con las interleucinas, tales como IL-3 (J". Biochem. , 23: 352-360, 1991), IL-4 {Biochemistry, 30: 1259-1264, 1991), y los mutantes de IL-6 (Biochemistry, 35: 11503-11511, 1996). Cambios burdos en los espectros de CD de UV lejano como una función del pH, no fueron observados. Los resultados mostraron que el pH de la estabilidad térmica/conformacional máxima fue de aproximadamente pH 7.4. El análisis de las curvas de desplegamiento estuvo basado en un mecanismo de desplegamiento en dos estados para permitir la comparación de la estabilidad térmica/conformacional como una función del pH/composición. No obstante, pueden existir uno o más intermediarios durante el proceso de desplegamiento, ya que la cooperatividad fue relativamente baja, con base en la poca profundidad de la curva de desplegamiento. Aunque los estudios no fueron específicamente diseñados para determinar si el Ligando zalfall se repliega después del desplegamiento térmico a 90 °C, los datos preliminares sugieren que al menos ocurre el replegamiento parcial después de que la temperatura de la muestra es enfriada hasta 20°C. Estos estudios permiten que sea identificado un paradigma analítico para evaluar la pureza y verificar la estabilidad del Ligando zalfall humano. Por ejemplo, SEC-HPLC puede ser utilizada para caracterizar el grado y la proporción de agregación en la solución acuosa. De igual modo, CX-HPLC puede ser utilizada para caracterizar el grado y proporción de degradación del Ligando zalfall humano mediante mecanismos diferentes de la agregación. El bioensayo puede ser utilizado para verificar la estabilidad del Ligando zalfall humano y sus productos de degradación acuosa. Por ejemplo, las variantes del Ligando zalfall humano generadas en solución acuosa y resueltas por CX-HPLC pueden por sí mismas ser útiles como agentes terapéuticos, ya que éstos tienen bioactividad equivalente. También, el hecho de que el Ligando zalfall humano sea degradado por varios procesos diferentes (agregación, modificaciones de aminoácidos) sugiere una formulación preferida o única que minimiza la velocidad de cada proceso de degradación que pueda ser necesaria para la estabilidad a largo plazo de un producto en solución. La identificación de la naturaleza de los productos de degradación acuosos y la determinación de sus dependencias cinéticas (pH, concentración, excipientes) está en camino. La estabilidad del Ligando zalfall humano en suero/plasma es determinada para apoyar el diseño y la interpretación de los estudios in vivo . A partir de lo anterior, se apreciará que, aunque han sido descritas modalidades específicas de la invención en la presente, para fines de ilustración, pueden ser realizadas diversas modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones anexas .

LISTADO DE SECUENCIAS <110> ZymoGenetics. Inc. <120> NUEVO IJXSNDO ZALFA1 1 DE CITOCINA <130> 99-16PC <150> US 09/264.908 <151> 1999-03-09 <150> US 09/265.992 <151> 1999-03-11 <150> US 60/142.013 <151> 1999-07-01 <160> 115 <170> EastSEQ pea Wi ndo s Versi on 3.0 <210> 1 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (47)... (532) <400> 1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtactt atg aga tec 55 Met Arg Ser 1 agt ect ggc aac atg gag agg att gtc ate tgt ctg atg gtc ate ttc 103 Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg He Val He Cys Leu Met Val He Phe 5 10 15 ttg ggg acá ctg gtc cae aaa tea age tec caá ggt caá gat cgc cae 151 Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His 20 25 30 35 atg att aga atg cgt caá ctt ata gat att gtt gat cag ctg aaa aat 199 Met He Arg Met Arg Gln Leu He Asp He Val Asp Gln Leu Lys Asn 40 45 50 tat gtg aat gac ttg gtc ect gaa ttt ctg cca gct cca gaa gat gta 247 Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val 55 60 65 gag acá aac tgt gag tgg tea gct ttt tec tgt ttt cag aag gcc caá 295 Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln 70 75 80 cta aag tea gca aat acá gga aac aat gaa agg ata ate aat gta tea 343 Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg He He Asn Val Ser 85 90 95 att aaa aag ctg aag agg aaa cca ect tec acá aat gca ggg aga aga 391 He Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg 100 105 110 115 cag aaa cae aga cta acá tgc ect tea tgt gat tet tat gag aaa aaa 439 Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys 120 •* 125- 130 cca ecc aaa gaa ttc cta gaa aga ttc aaa tea ctt etc caá aag atg 487 Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met 135 140 145 att cat cag cat ctg tec tet aga acá cae gga agt gaa gat tec 532 He His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser 150 155 160 tgaggatcta acttgcagtt ggacactatg ttacataetc taatatagta gtgaaagtca 592 tttctttgta ttccaagtgg aggagcccta ttaaattata taaagaaata 642 <210> 2 <_11> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Gl u Arg He Val H e Cys Leu Met 1 5 10 15 Val He Phe Leu Gly Thr Leu Val Hi s Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln 20 25 30 Asp Arg His Met He Arg Met Arg Gln Leu He Asp He Val Asp Gln 35 40 45 Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln 65 70 75 80 Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg He He 85 90 95 Asn Val Ser He Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala 100 105 110 Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr 115 120 125 Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu 130 135 140 Gln Lys Met He His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu 145 150 155 160 Asp Ser <210> 3 <211> 486 <212> ADN <213> Secuencia Artificial _ . <220> <223> Secuencia polinucléotíjdica Degenerada para el ligando zalfal l hupiario <221> característica misoelanea <222> (1) . . . (486) <223> n - A.T.C or G <400> 3 atggnwsnw snccnggnaa yatggargn athgtnatht gyytnatggt nathttyytn 60 ggnacnytng tncayaarws nwsnwsncar ggncargay gncayatgat hmgnatgmgn 120 carytnathg ayathgtnga ycarytnaar aaytaygtna aygayytngt nccngartty 180 ytnccngcnc cngargaygt ngaracnaay tgygartggw sngenttyws ntgyttycar 240 aargcncary tnaarwsngc naayacnggn aayaaygarm gnathathaa ygtnwsnath 300 aaraaryna argnaarcc nccnwsnacn aaygcnggnm gnmgncaraa rcaymgnytn 360 acntgyccnw sntgygayws ntaygaraar aarccnccna argarttyyt ngarmgntty 420 aarwsnytny tncaraarat gatheayear cayytnwsnw snmgnacnca yggnwsngar 480 gaywsn 486 <210> 4 <211> 535 <212> AEN <213> Mus musculus <220> <221> Fuente <222> (0)...(0) <223> EST1483966 GenBank Acc #AA764063 <400> 4 taaacatgta tcatataagg atatgtcata ataaggatta atattatata attataaata 6 atttataata cttataatat cattgtttgg ttcactaata aatctatgga tacatggtca 12 aaatggaaat gaatattttg ccaattatta atccccaaag tcattgaaaa taageataac 18 cattetactg acttgttaga etetaaacta acataaaata cattttcaga aataaattca 24 acegatetta cctttacatc ttgtggagct gatagaagtt caggatccta agaaaattaa 30 ccaaagagta ttagttctga gttggtgata caagtcaaaa ggctcctttt gcattaatta 360 aaaaaatatt atttaaattg cattgtgaca aacatggcct taccaagtca ttttcataga 42 tttteagetg ttcaacaatg tcaataaggt gacgaagtct aatcaggagg cgatctggcc 48 cttgggggct tgatttatgg gccactgtcc ccaagaagat gactaccaga cagac 53 <210> 5 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Ar1__E__a__L <220> <223> Cebador Oliganucleotídico ZC17212 <400> 5 ggggaattcg aagccatgcc ctcttgggcc etc 33 <210> 6 <211> 30 <212> ÁDN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador Oligopucleotí ico ZC19914 <400> 6 caatggatgg gtctttagca gcagtaggcc 30 <210> 7 <211> 1614 <212> <213> Homo sapiens <400> 7 atgccgcgtg gctgggccgc ccccttgctc ctgctgctgc tccagggagg ctggggctgc 6 cccgacctcg tctgctacac cgattacctc cagacggtca tctgcatcct ggaaatgtgg 12 aacctccacc ccagcacgct cacccttacc tggcaagacc agtatgaaga gctgaaggac 18 gaggccacct cctgcagcct ccacaggtcg gcccacaatg ccacgcatgc cacctacacc 24 tgccacatgg atgtattcca cttcatggcc gacgacattt tcagtgtcaa catcacagac 30 cagtctggca actactccca ggagtgtggc agctttctcc tggctgagag catcaagccg 36 gctccccctt tcaacgtgac tgtgaccttc tcaggacagt ataatatctc ctggcgctca 42 gattacgaag accctgcctt ctacatgctg aagggcaagc ttcagtatga gctgcagtac 48 aggaaccggg gagacccctg ggctgtgagt ccgaggagaa agctgatctc agtggactca 54 agaagtgtct ccctcctccc cctggagttc cgcaaagact cgagctatga gctgcaggtg 60 cgggcagggc ccatgcctgg ctcctcctac caggggacct ggagtgaatg gagtgacccg 66 gtcatctttc agacccagtc agaggagtta aaggaaggct ggaaccctca cctgctgctt 72 ctcctcctgc ttgtcatagt cttcattcct gccttctgga gcctgaagac ccatccattg 78 tggaggctat ggaagaagat atgggccgtc cccagccctg agcggttctt catgcccctg 84 tacaagggct gcagcggaga cttcaagaaa tgggtgggtg cacccttcac tggctccagc 90 ctggagctgg gaccctggag cccagaggtg ccctccaccc tggaggtgta cagctgccac 96 ccaccacgga gcccggccaa gaggctgcag ctcacggagc tacaagaacc agcagagctg 102 gtggagtctg acggtgtgcc caagcccagc ttctggccga cagcccagaa ctcggggggc 108 tcagcttaca g'tgaggagag ggatcggcca tacggcctgg tgtccattga cacagtgact 114 gtgctagatg cagaggggcc atgcacctgg ccctgcagct gtgaggatga cggctaccca 1200 gccctggacc tggatgctgg cctggagccc agcccajggcc tagaggaccc actcttggat 1260 gcagggacca cagtcctgtc ctgtggctgt gtctcagctg gcagccctgg gctaggaggg 132 cccctgggaa gcctcctgga cagactaaag ccaccccttg cagatgggga ggactgggct 138 gggggactgc cctggggtgg ccggtcacct ggaggggtct cagagagtga ggcgggctca 1440 cccctggccg gcctggatat ggacacgttt gacagtggct ttgtgggctc tgactgcagc 1500 agccctgtgg agtgtgactt caccagcccc ggggacgaag gacccccccg gagctacctc 156 cgccagtggg tggtcattcc tccgccactt tcgagccctg gaccccaggc cagc 161 <210> 8 <_11> 30 <212> AEW <213> Secxiericia Artificial <220> <223> _tB_?- c_iga__i__±3__oo ZC19913 <400> 8 ggcctactgc tgctaaagac ccatccattg 3 <210> 9 <211> 33 <212> *EN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oJ_go__?_crleotí_tieD 3.220097 <400> 9 acatctagat tagctggcct ggggtccagg cgt <210> 10 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador ol?gopucleotídico 2C32700 <400> 10 ggaggtctat ataagcagag c <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador OligornicleotS iLso ZC5020 <400> 11 cactggagtg gcaacttcca g <210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Sectiencia Artificial <220> <223> Gebadorr oligonucleotí ico ZC6675 <400> 12 gtggatgccg aacccagtcc <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC7727 <400> 13 tgttcacagc tacctgggct c <210> 14 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC8290 <400> 14 ccaccgagac tgcttggatc accttg 2 <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC19572 <400> 15 gtcctgtggc tgtgtctcag 2 <210> 16 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC6622 <400> 16 ctgggctgga aactggcaca c 2 <210> 17 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídxco ZC7736 <400> 17 cactgtcaga aatggagc 1 <210> 18 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC9273 <400> 18 ggtccctccc cgggcaccga gaga 2 <210> 19 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC1 9905 <400> 19 acaggatccg tcagcatgcc gcgtggctgg gccgcc 36 <210> 20 <211> 33 <212> D <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC1 9906 <400> 20 acagaattct tagctggcct ggggtccagg cgt 33 <210> 21 <211> 22 <212> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC201 1 4 400> 21 cctgccttct acatgctgaa gg <210> 22 <211> 21 <212> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC1 9459 <400> 22 ctcctcctgc ttgtcatagt c 2 <210> 23 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC1 9954 <400> 23 actgggctgg gggactgc 1 <210> 24 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC201 1 6 <400> 24 agcacagtca ctgtgtcaat gg 2 <210> 25 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC1 3946 <400> 25 ccctgcagtg atcaacatgg ccaagttgac cagtgccgtt 4 <210> 26 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC13945 <400> 26 gcccatggac tagtttcgaa aggtegagtg tcagtcctgc teetc 4 <210> 27 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC1 8698 <400> 27 tttttttctc gagacttttt tttttttttt tttt 3 <210> 28 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC1 4063 <400> 28 caccagacat aatagctgac agact 25 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia de aminoácidos con Marcador Glu-Glu (CEE) <400> 29 Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 30 <211> 36 <2i2> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC1 9931 <400> 30 ggttggtacc gcaagatgcc gcgtggctgg gccgcc 3 <210> 31 <211> 29 <212> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC1 9932 <400> 31 __ . cggaggatcc gtgagggttc cagccttcc 2 <210> 32 <211> 66 <212> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador Oligonucleotídico que abarca la región flanqueante del vector y extremo 5 ' del dominio extracelular de zalfa11 <400> 32 tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc agggaattea tegataatge cgcgtggctg 6 ggccgc 6 <210> 33 <211> 699 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 33 gageccagat etteagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgecaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagea cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc catcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 5 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagage 6 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 6 tacaegeaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 6 <210> 34 <211> 62 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Primer Cebador Oligonucleotídico que abarca el extremo 3 ' del dominio extracelular zalf a1 1 y el exíTremo 5 ' de Fc4 <400> 34 gcacggtggg catgtgtgag ttttgtctga agatctgggc tcgtgagggt tccagccttc ct <210> 35 <211> 61 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Segundo Cebador Oligonucleotídico que abarca e extremo 3 ' del dominio extracelular zalfa11 y e extremo 5* de Fe4 <400> 35 agacccagtc agaggagtta aaggaaggct ggaaccctca cgagcccaga tetteagaca <210> 36 <211> 67 <212> AD <213> Secuencia Artificial 39.9 <220> <223> Cebador oligonucleotídico que abarca el ext 3' de Fc4 y la región flanqueante del vecto <400> 36 gtgggcctct ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tctagattat ttacccggag acaggga <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia de aminoácidos FLAG C-terminal <400> 37 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 38 <211> 26 <212> ADN <2l3> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC7764a <400> 38 tttttttttt tttttttttt ttttta <210> 39 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC7764b <400> 39 tttttttttt tttttttttt tttttc <210> 40 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22034 <400> 40 , ttcaaatcac ttctccaaa 19 <210> 41 <211> 20 <212> ADÑ <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22035 <400> 41 ttttggagaa gtgatttgaa 20 <210> 42 <211> 16 <212> ADN • ' - <213>Secuencia Artificial <220> <223>Cebador oligonucleotídico ZC22050 <400> 42 gaatgcgtca acttat 16 <210> 43 <211> 16 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223>Cebador oligonucleotídico ZC22051 <400> 43 ggaccaagtc attcac 16 <210> 44 <211> 25 ; <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotxdico ZC22056 <400> 44 gtctgtctgg tagtcatctt cttgg 25 <210> 45 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22057 <400> 45 cttgtggagc tgatagaagt tcagg 25 <210> 46 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencxa Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22205 <400> 46 agctgttcaa caatgtcaat aaggtg 26 <210> 47 <211> 24 <212> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22206 <400> 47 cctcctgatt agacttcgtc acct 24 <210> 48 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC9739 <400> 48 ccatcctaat acgactcact atagggc 2 <210> 49 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC971 9 <400> 49 actcactata gggctcgagc ggc 2 <210> 50 <211> 25 <212> ADH <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC1 4063 <400> 50 caccagacat aatagctgac agact 25 <210> 51 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC5020 <400> 51 cactggagtg gcaacttcca g 21 <210> 52 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22421 <400> 52 ctaaaatggc tccttcaaaa <210> 53 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> 223> Cebador oligonucleotídico ZC22604 400> 53 cacacaggcc ggccaccatg ggcttccagc ctccggccgc <210> 54 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22641 <400> 54 atgcgttggt tctgattgtg <210> 55 <211> 3072 <212> ADN <213> mus musculus <220> <221> CDS <222> (54) . . . (491) <400> 55 gagaaccaga ccaaggccct gtcatcagct cctggagact cagttetggt ggc atg 56 Met 1 gag agg acc ctt gtc tgt ctg gta gtc ate ttc ttg ggg acá gtg gcc 104 Glu Arg Thr Leu Val Cys Leu Val Val He Phe Leu Gly Thr Val Ala 5 10 15 cat aaa tea age ecc caá ggg cca gat cgc etc ctg att aga ctt cgt 15 His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu He Arg Leu Arg 20 25 30 cae ctt att gac att gtt gaa cag ctg aaa ate tat gaa aat gac ttg 20 His Leu He Asp He Val Glu Gln Leu Lys He Tyr Glu Asn Asp Leu 35 40 45 gat ect gaa ctt cta tea gct cca caá gat gta aag ggg cae tgt gag 248 Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro G n Asp Val Lys Gly His Cys Glu 50 55 60 65 cat gca gct ttt gcc tgt ttt cag aag gcc aaa etc aag cca tea aac 296 His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser Asn 70 75 80 ect gga aac aat aag acá ttc ate att gac etc gtg gcc cag etc agg 344 Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe He He Asp Leu Val Ala Gln Leu Arg 85 90 95 agg agg ctg ect gcc agg agg gga gga aag aaa cag aag cae ata gct 392 Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys lys Gln Lys His He Ala 100 105 110 aaa tgc ect tec tgt gat teg tat gag aaa agg acá ecc aaa gaa ttc 440 Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu Phe 115 120 125 cta gaa aga cta aaa tgg etc ctt caá aag atg att cat cag cat etc 488 Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met He His Gln His Leu 130 135 140 145 tec tagaacacat aggacccgaa gattcctgag gatcegagaa gattecegag 541 Ser gactgaggag acgccggaca etatagaege teaegaatge aggagtacat cttgcctctt 601 gggattgcaa gtggagaagt acgatacgtt atgataagaa caaetcagaa aagctatagg 661 ttaagatcct ttcgcccatt aactaagcag acattgtggt tccctgcaca gactccatgc 721 tgtcaacatg gaaaatctca actcaacaag agcccagctt cccgtgtcag ggatttctgg 781 tgcttctcaa gctgtggctt catcttattg cccaactgtg acattctttg attggaaggg 841 gaaaactaaa gcttttagca aaaatacagc tagggaattt gtcgatctgc gagagtaaga 901 ectettatga tcctaacgga atgatgtaag ctggaaataa taagcataag atgaaattga 961 aaattgaagt ctttattctt taagaaaaac tttgtacttg aaagcatgtc tgaagagttt 1021 actcattacc acaaacatct agcatattga taactaacat ctttatactc tacaagagag 1081 gctttccaga taggtacagt ttttcttctc tattaggtct atcaaaattt aacctattat 1141 gagggtcacc cctggctttc actgtttttc taaagaggca agggtgtagt aagaagcagg 1201 cttaagttgc cttcctccca atgtcaagtt cctttataag ctaatagttt aatcttgtga 1261 agatggcaat gaaagcctgt ggaagtgcaa acctcactat cttctggagc caagtagaat 1321 tttcaagttt gtagctctca cctcaagtgg ttatgggtgt cctgtgatga atctgctagc 1381 tccagcctca gtctcctctc ccacatcctt tcctttcttt cctctttgaa acttctaaga 1441 aaaagcaatc caaacaagtt cagcacttaa gacacattgc atgcacactt ttgataagtt 1501 aaatccaacc atctatttaa aatcaaaatc aggagatgag ccaagagacc agaggttctg 1561 ttccagtttt aaacagactt ttactgaaca tcccaatctt ttaaccacag aggctaaatt 1621 gagcaaatag ttttgccatt tgatataatt tccaacagta tgtttcaatg tcaagttaaa 1681 aagtctacaa agctattttc cctggagtgg tatcatcgct ttgagaattt cttatggtta 1741 aaatggatct gagatccaag catggcctgg gggatggttt tgatctaagg aaaaaggtgt 1801 ctgtacctca cagtgccttt aaaacaagca gagatcccgt gtaccgccct aagatagcac 1861 agactagtgt taactgattc ccagaaaagt gtcacaatca gaaccaacgc attctcttaa 1921 actttaaaaa tatgtattgc aaagaacttg tgtaactgta aatgtgtgac tgttgatgac 1981 attatacaca catagcccac gtaagtgtcc aatggtgcta gcattggttg ctgagtttgc 2041 tgctcgaaag ctgaagcaga gatgcagtcc ttcacaaagc aatgatggac agagagggga 2101 gtctccatgt tttattcttt tgttgtttct ggctgtgtaa ctgttgactt cttgacattg 2161 tgatttttat atttaagaca atgtatttat tttggtgtgt ttattgttct agccttttaa 2221 atcactgaca atttctaatc aagaagtaca aataattcaa tgcagcacag gctaagagct 2281 tgtatcgttt ggaaaagcca gtgaaggctt ctccactagc catgggaaag ctacgcttta 2341 gagtaaacta gacaaaattg cacagcagtc ttgaacctct ctgtgctcaa gactcagcca 2401 gtcctttgac attattgttc actgtgggtg ggaacacatt ggacctgaca cactgttgtg 2461 tgtccatgaa ggttgccact ggtgtaagct ttttttggtt ttcattctct tatctgtaga 2521 acaagaatgt ggggctttcc taagtctatt ctgtatttta ttctgaactt cgtatgtctg 2581 agttttaatg ttttgagtac tcttacagga acacctgacc acacttttga gttaaatttt 2641 atcccaagtg tgatatttag ttgttcaaaa agggaaggga tatacataca tacatacata 2701 catacataca tatatatata tatatataca tatatatata tatatatatg tatatatata 2761 tatatataga gagagagaga gagagagaga gagaaagaga gagaggttgt tgtaggtcat 2821 aggagttcag aggaaatcag ttatggccgt taatactgta gctgaaagtg ttttctttgt 2881 gaataaattc atagcattat tgatctatgt tattgctctg ttttatttac agtcacacct 2941 gagaatttag ttttaatatg aatgatgtac tttataactt aatgattatt tattatgtat 3001 ttggttttga atgtttgtgt tcatggcttc ttatttaaga cctgatcata ttaaatgcta 3061 cccagtccgg a 3072 <210> 56 <211> 146 <212> PRT <213> mus musculus <400> 56 Met Glu Arg Thr Leu Val Cys Leu Val Val He Phe Leu Gly Thr Val 1 5 10 15 Ala His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu He Arg Leu 20 25 30 Arg His Leu He Asp He Val Glu Gln Leu Lys He Tyr Glu Asn Asp 35 40 45 sí- Leu Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys 50 55 60 Glu His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser 65 70 75 80 Asn Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe He He Asp Leu Val Ala Gln Leu 85 90 95 Arg Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His He 100 105 110 Ala Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu 115 120 125 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met He His Gln His 130 135 140 Leu Ser 145 <210> 57 <211> 34 <212>ADN <213> Secuencia Artificial __ <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22283 <400> 57 cgctcgagac catggagagg acccttgtct gtct 3 <210> 58 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22284 <400> 58 gctctagaat cttctcggat cctcaggaat c 3 <210> 59 <211> 100 <212> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleoíido ZC12749 <400> 59 gtaccttccc gtaaatccct ccccttcccg gaattacaca cgcgtatttc ccagaaaagg aactgtagat ttctaggaat tcaatccttg gccacgcgtc <210> 60 <211> 100 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido ZC12748 <400> 60 tcgagacgcg tggccaagga ttgaattcct agaaatetac agttcctttt ctgggaaata cgcgtgtgta attccgggaa ggggagggat ttacgggaag ' <210> 61 <211> 32 <212> ADN , _ . <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleóti.do ZC221 43 <400> 61 cgtatcggcc ggccaccatg agatecagtc ct <210> 62 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC221 44 <400> 62 cgtacgggcg cgcctcagga atetteaett ce <210> 63 <211> 483 <212>ADN . <213> ho o sapiens 400> 63 tccagtcctg gcaacatgga gaggattgtc atctgtctga tggtcatctt cttggggaca 60 ctggtccaca aatcaagetc ccaaggtcaa gatcgccaca tgattagaat gcgtcaactt 120 atagatattg ttgatcagct gaaaaattat gtgaatgact tggtccctga atttctgcca 180 gctccagaag atgtagagac aaactgtgag tggtcagctt tttcctgttt tcagaaggcc 240 caactaaagt cagcaaatac.aggaaacaat gaaaggataa tcaatgtatc aattaaaaag 300 ctgaagagga aaccaccttc cacaaatgea gggagaagac agaaacacag actaacatgc 360 ccttcatgtg attcttatga gaaaaaacca cccaaagaat tcctagaaag attcaaatca 420 cttctccaaa agatgattea teageatetg tectetagaa cacacggaag tgaagattec 480 tga 483 <210> 64 <211> 57 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22052 <400> 64 tcatataggc cggccatatg cccgggcgcc accatggait .ccagtcctgg caacatg 57 <210> 65 <211> 57 <2i2> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotxdico ZC22053 <400> 65 gtacaacccc agagctgttt taaggcgcgc etetagatca ggaatettea cttccgt 57 <210> 66 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC231 1 5 <400> 66 gtatacggcc ggccaccatg gagaggaccc tt 32 <210> 67 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC231 1 6 <400> 67 cgtatcggcg cgccctagga gagatgctga tg <210> 68 <211> 35 <212> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC20892 <400> 68 gtatacgttt aaacgccacc atgccgcgtg gctgg <210> 69 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC20893 <400> 69 cgtatcggcg cgccttacaa tggatgggtc tt <210> 70 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22054 <400> 70 cccggggtcg acaccatgga ttccagtcct ggcaacatg <210> 71 <211> 32 <212> ADN - - .T- <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotxdico ZC22055 <400> 71 tgcagtttaa actcaggaat cttcacttcc gt <210> 72 <211> 40 <212> PRT <213> Secuencia Artificial _ <220> <223> Péptido Huzalf l l L-1 <400> 72 Gln Asp Arg His Met H e Arg Met Arg Gln Leu He Asp He Val Asp 1 5 10 15 Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Va+ Pro Glu Phe Leu Pro Ala 20 25 30 Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys 35 40 <210> 73 <211> 32 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Péptido HuzalfallL-3 <400> 73 Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu 1 5 10 15 Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met He His Gln His Leu Ser 20 25 30 <210> 74 <211> 29 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotxdico ZC23444 <400> 74 gcccgggcgg atccatggat tccagtcct <210> 75 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC23445 <400> 75 cgcgccctcg agtcaggaat cttcacttcc gt 3 <210> 76 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC447 <400> 76 taacaatttc acacagg 1 <210> 77 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC976 <400> 77 cgttgtaaaa cgacggcc 1 <210> 78 <211> 66 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC221 28 <400> 78 tcaccacgcg aattcggtac cgctggttcc gcgtggatcc caagatcgcc acatgattag 60 aatgcg 66 <210> 79 <211> 68 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC221 27 <400> 79 tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca tcaggaatct tcacttccgt 60 gtgttcta 68 <210> 80 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial - <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC19372 <400> 80 tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattegage 40 <210> 81 <211> 60 <212> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC1 9351 <400> 81 acgcgcagac taattegage tcccaccatc accatcacca cgcgaattcg gtaccgctgg 60 <210> 82 <211> 60 <212> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC19352 400> 82 actcactata gggcgaattg cccgggggat ccacgcggaa ccagcggtac cgaattcgcg 6 <210> 83 <211> 42 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC19371 <400> 83 acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tg 4 <210> 84 <211> 1560 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> CDS <222> (!) . . . ( 1560) <223 Polinucledtido de fusión MBP-Ligando zalf a1 1 humano <400> 84 atg aaa act gaa gaa ggt aaa ctg gta ate tgg att aac ggc gat aaa 48 Met Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val He Trp He Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 ggc tat aac ggt etc gct gaa gtc ggt aag aaa ttc gag aaa gat acc 96 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 gga att aaa gtc acc gtt gag cat ccg gat aaa ctg gaa gag aaa ttc 144 Gly He Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 cca cag gtt gcg gca act ggc gat ggc ect gac att ate ttc tgg gca 192 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp He He Phe Trp Ala 50 55 60 cae gac cgc ttt ggt ggc tac gct caá tet ggc ctg ttg gct gaa ate 240 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu He 65 70 75 80 -JJJX acc ccg gac aaa gcg ttc cag gac aag ctg tat ccg ttt acc tgg gat 288 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 gcc gta cgt tac aac ggc aag ctg att gct tac ccg ate gct gtt gaa 336 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu. He Ala- Tyr Pro He Ala Val Glu 100 105 110 gcg tta teg ctg att tat aac aaa gat ctg ctg ccg aac ccg cca aaa 384 Ala Leu Ser Leu He Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 acc tgg gaa gag ate ccg gcg ctg gat aaa gaa ctg aaa gcg aaa ggt 432 Thr Trp Glu Glu He Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 aag age gcg ctg atg ttc aac ctg caá gaa ccg tac ttc acc tgg ccg 480 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Ero..Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 ctg att gct gct gac ggg ggt tat gcg ttc aag tat gaa aac ggc aag 528 Leu He Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 tac gac att aaa gac gtg ggc gtg gat aac gct ggc gcg aaa gcg ggt 576 Tyr Asp He Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 ctg acc ttc ctg gtt gac ctg att aaa aac aaa cae atg aat gca gac 624 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu He Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 acc gat tac tec ate gca gaa gct gcc ttt aat aaa ggc gaa acá gcg 672 Thr Asp Tyr Ser He Ala G u Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 atg acc ate aac ggc ccg tgg gca tgg tec aac ate gac acc age aaa 720 Met Thr He Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn He Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 gtg aat tat ggt gta acg gta ctg ccg acc ttc aag ggt caá cca tec 768 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 aaa ccg ttc gtt ggc gtg ctg age gca ggt att aac gcc gcc agt ccg 816 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly He Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 aac aaa gag ctg gca aaa gag ttc etc gaa aac tat ctg ctg act gat 864 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280. 285 gaa ggt ctg gaa gcg gtt aat aaa gac aaa ccg ctg ggt gcc gta gcg 912 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 ctg aag tet tac gag gaa gag ttg gcg aaa gat cca cgt att gcc gcc 960 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg He Ala Ala 305 310 315 320 acc atg gaa aac gcc cag aaa ggt gaa ate atg ccg aac ate ccg cag 1008 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu He Met Pro Asn He Pro Gln 325 . 330 - - 335 atg tec gct ttc tgg tat gcc gtg cgt act gcg gtg ate aac gcc gcc 1056 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val He Asn Ala Ala 340 345 350 age ggt cgt cag act gtc gat gaa gcc ctg aaa gac gcg cag act aat 1104 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 teg age tec cae cat cae cat cae cae gcg aat teg gta ccg ctg gtt 1152 Ser Ser Ser His His His His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val 370 375 380 ccg cgt ggá tec caá gat cgc cae atg att aga atg cgt caá ctt ata 1200 Pro Arg Gly Ser Gln Asp Arg His Met He Arg Met Arg Gln Leu He 385 390 395 400 gat att gtt gat cag ctg aaa aat tat gtg aat gac ttg gtc ect gaa 1248 Asp He Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu 405 410 415 ttt ctg cca gct cca gaa gat gta gag acá aac tgt gag tgg tea gct 1296 Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala 420 425 430 ttt tec tgt ttt cag aag gcc caá cta aag tea gca aat acá gga aac 1344 Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn 435 440 445 aat gaa agg ata ate aat gta tea att aaa aag ctg aag agg aaa cca 1392 Asn Glu Arg He He Asn Val Ser He Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro 450 455 460 ect tec acá aat gca ggg aga aga cag aaa cae aga cta acá tgc ect 1440 Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro 465 470 475 480 tea tgt gat tet tat gag aaa aaa cca ecc aaa gaa ttc cta gaa aga 1488 Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg 485 490 495 ttc aaa tea ctt etc caá aag atg att cat cag cat ctg tec tet aga 1536 Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met He His Gln His Leu Ser Ser Arg 500 , 505 - • 510 acá cae gga agt gaa gat tec tga 1560 Thr His Gly Ser Glu Asp Ser * 515 <210> 85 <211> 519 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Polipéptido de fusión MBP-Ligando zalf a1 1 human <400> 85 Met Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val He Trp He Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Al a Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly He Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp He He Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu He 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu He Ala Tyr Pro He Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu He Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu He Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 ^ 155 160 Leu He Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 " 175 Tyr Asp He Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu He Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser He Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr He Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser .Asn He Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly He Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg He Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu He Met Pro Asn He Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val He Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Ser His His Hi s His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val 370 375 380 Pro Arg Gly Ser Gln Asp Arg His Met He Arg Met Arg Gln Leu He 385 390 395 400 Asp He Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu 405 410 415 Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala 420 425 430 Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn 435 440 445 Asn Glu Arg lie He Asn Val Ser He Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro 450 455 460 Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro 465 470 475 480 Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg 485 490 495 Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met He His Gln His Leu Ser Ser Arg 500 505 510 Thr His Gly Ser Glu Asp Ser 515 <210> 86 <211> 64 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22849 <400> 86 tcaccacgcg aattcggtac cgctggttcc gcgtggatcc ccagatcgcc tcctgattag 60 actt 64 <210> 87 <211> 64 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22850 <400> 87 tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca ctaggagaga tgctgatgaa 60 tcat 64 <210> 88 <211> 1533 <212> AD <213> Secuencia Artificial zalf a1 1 de aaa 48 Lys acc 96 Thr ttc 144 Phe cea cag gtt gcg gca act ggc gat ggc ect gac att ate ttc tgg gca 192 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp He He Phe Trp Ala 50 55 . - -60 cae gac cgc ttt ggt ggc tac gct caá tet ggc ctg ttg gct gaa ate 240 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu He 65 70 75 80 acc ccg gac aaa gcg ttc cag gac aag ctg tat ccg ttt acc tgg gat 288 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 gcc gta cgt tac aac ggc aag ctg att gct tac ccg ate gct gtt gaa 336 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu He Ala Tyr Pro He Ala Val Glu 100 105 110 gcg tta teg ctg att tat aac aaa gat ctg ctg ccg aac ccg cca aaa 384 Ala Leu Ser Leu He Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 acc tgg gaa gag ate ccg gcg ctg gat aaa gaa ctg aaa gcg aaa ggt 432 Thr Trp Glu Glu He Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 aag age gcg ctg atg ttc aac ctg caá gaa ccg tac ttc acc tgg ccg 48 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 ctg att gct gct gac ggg ggt tat gcg ttc aag tat gaa aac ggc aag 52 Leu He Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 tac gac att aaa gac gtg ggc gtg gat aac gct ggc gcg aaa gcg ggt 57 Tyr Asp He Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 ctg acc ttc ctg gtt gac ctg att aaa aac aaa cae atg aat gca gac 62 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu He Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 acc gat tac tec ate gca gaa gct gcc ttt aat aaa ggc gaa acá gcg 67 Thr Asp Tyr Ser He Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 atg acc ate aac ggc ccg tgg gca tgg tec aac ate gac acc age aaa 72 Met Thr He Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn He Asp Thr Ser Lys 225 230 , ^235 240 gtg aat tat ggt gta acg gta ctg ccg acc ttc aag ggt caá cca tec 76 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 aaa ccg ttc gtt ggc gtg ctg age gca ggt att aac gcc gcc agt ccg 81 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly He Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 aac aaa gag ctg gca aaa gag ttc etc gaa aac tat ctg ctg act gat 86 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 gaa ggt ctg gaa gcg gtt aat aaa gac aaa ccg ctg ggt gcc gta gcg 91 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 ctg aag tet tac gag gaa gag ttg gcg aaa gat cca cgt att gcc gcc 96 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg He Ala Ala 305 310 315 320 acc atg gaa aac gcc cag aaa ggt gaa ate atg ccg aac ate ccg cag 1008 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu He Met Pro Asn He Pro Gln 325 330 335 atg tec gct ttc tgg tat gcc gtg cgt act gcg gtg ate aac gcc gcc 1056 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val He Asn Ala Ala 340 345 350 age ggt cgt cag act gtc gat gaa gcc ctg aaa gac gcg cag act aat 1104 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 teg age tec cae cat cae cat cae cae gcg aat teg gta ccg ctg gtt 1152 Ser Ser Ser His His His His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val 370 375 380 ccg cgt gga tec cca gat cgc etc ctg att aga ctt cgt cae ctt att 1200 Pro Arg Gly Ser Pro Asp Arg Leu Leu He Arg Leu Arg His Leu He 385 390 395 400 gac att gtt gaa cag ctg aaa ate tat gaa aat gac ttg gat ect gaa 1248 Asp He Val Glu Gln Leu Lys He Tyr Glu Asn Asp Leu Asp Pro Glu 405 . 410 _ 415 ctt cta tea gct cca caá gat gta aag ggg cae tgt gag cat gca gct 1296 Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys Glu His Ala Ala 420 425 430 ttt gcc tgt ttt cag aag gcc aaa etc aag cca tea aac ect gga aac 1344 Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser Asn Pro Gly Asn 435 440 445 aat aag acá ttc ate att gac etc gtg gcc cag etc agg agg agg ctg 1392 Asn Lys Thr Phe He He Asp Leu Val Ala Gln Leu Arg Arg Arg Leu 450 455 460 ect gcc agg agg gga gga aag aaa cag aag cae ata gct aaa tgc ect 1440 Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His He Ala Lys Cys Pro 465 470 475 480 tec tgt gat teg tat gag aaa agg acá ecc aaa gaa ttc cta gaa aga 1488 Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg 485 490 495 cta aaa tgg etc ctt caá aag atg att cat cag cat etc tec tga 1533 Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met He His Gln His Leu Ser * 500 505 510 "f - <210> 89 <211> 510 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polipéptido de fusión MBP-Ligando zalfa11 de ratón <400> 89 Met Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val He Trp He Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly He Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp He He Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Sly Leu Leu Ala Glu He 65 70 75 80 T r Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu He Ala Tyr Pro He Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu He Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu He Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu He Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp He Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu He Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser He Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr He Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn He Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly He Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg He Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu He Met Pro Asn He Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val He Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Ser His His His His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val 370 375 380 Pro Arg Gly Ser Pro Asp Arg Leu Leu He Arg Leu Arg His Leu He 385 390 395 400 Asp He Val Glu Gln Leu Lys He Tyr Glu Asn Asp Leu Asp Pro Glu 405 410 415 Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys Glu His Ala Ala 420 425 430 Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser Asn Pro Gly Asn 435 440 445 Asn Lys Thr Phe He He Asp Leu Val Ala Gln Leu Arg Arg Arg Leu 450 455 460 Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His He Ala Lys Cys Pro 465 470 475 480 Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg 485 490 495 Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met He His Gln His Leu Ser 500 505 510 <210> 90 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22281 <400> 90 tgtgaatgac ttggtccctg aa 2 o ZC22279 2 zalfal l humano, ZG32 31 <223> Cebador oligonucleotídico ZC22277 <400> 93 ccaggagtgt ggcagctttc 20 <210> 94 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22276 <400> 94 gcttgccctt cagcatgtag a 21 <210> 95 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Sonda TaqMan zalf a1 1 Humano, ZG31 <400> 95 cggctccccc tttcaacgtg act 23 <210> 96 <211> 1821 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <221> CDS <222> (1) . . . (1821) <223> Secuencia polinucleotídica del receptor de MBP-zalf a1 1 <400> 96 atg aaa ate gaa gaa ggt aaa ctg gta ate tgg att aac ggc gat aaa 48 Met Lys He Glu Glu Gly Lys Leu Val He Trp He Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 ggc tat aac ggt etc gct gaa gtc ggt aag aaa ttc gag aaa gat acc 96 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 gga att aaa gtc acc gtt gag cat ccg gat aaa ctg gaa gag aaa ttc 144 Gly He Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 cca cag gtt gcg gca act ggc gat ggc ect gac att ate ttc tgg gca 192 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp He He Phe Trp Ala 50 55 60 cae gac cgc ttt ggt ggc tac gct caá tet ggc ctg ttg gct gaa ate 240 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu He 65 70 75 80 gat 288 Asp gaa 336 Glu gcg tta teg ctg att tat aac aaa gat ctg ctg ccg aac ccg cca aaa 384 Ala Leu Ser Leu He Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 acc tgg gaa gag ate ccg gcg ctg gat aaa gaa ctg aaa gcg aaa ggt 432 Thr Trp Glu Glu He Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 aag age gcg ctg atg ttc aac ctg caá gaa ccg tac ttc acc tgg ccg 480 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 ctg att gct gct gac ggg ggt tat gcg ttc aag tat gaa aac ggc aag 528 Leu He Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 , 170- 175 tac gac att aaa gac gtg ggc gtg gat aac gct ggc gcg aaa gcg ggt 576 Tyr Asp He Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 ctg acc ttc ctg gtt gac ctg att aaa aac aaa cae atg aat gca gac 624 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu He Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 acc gat tac tec ate gca gaa gct gcc ttt aat aaa ggc gaa acá gcg 672 Thr Asp Tyr Ser He Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 atg acc ate aac ggc ccg tgg gca tgg tec aac ate gac acc age aaa 720 Met Thr He Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn He Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 gtg aat tat ggt gta acg gta ctg ccg acc ttc aag ggt caá cca tec 768 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 agt ccg 816 Ser Pro act gat 864 Thr Asp gaa ggt ctg gaa gcg gtt aat aaa gac aaa ccg ctg ggt gcc gta gcg 912 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 ctg aag tet tac gag gaa gag ttg gcg aaa gat cca cgt att gcc gcc 960 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg He Ala Ala 305 310 315 320 acc atg gaa aac gcc cag aaa ggt gaa ate atg ccg aac ate ccg cag 1008 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu He Met Pro Asn He Pro Gln 325 330 335 atg tec gct ttc tgg tat gcc gtg cgt act gcg gtg ate aac gcc gcc 1056 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val He Asn Ala Ala 340 . 345 - . 350 age ggt cgt cag act gtc gat gaa gcc ctg aaa gac gcg cag act aat 1104 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 teg age tec cae cat cae cat cae cae gcg aat teg gta ccg ctg gtt 1152 Ser Ser Ser His His His His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val 370 375 380 ccg cgt gga tec tgc ecc gac etc gtc tgc tac acc gat tac etc cag 1200 Pro Arg Gly Ser Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln 385 390 395 400 acg gtc ate tgc ate ctg gaa atg tgg aac etc cae ecc age acg etc 1248 Thr Val He Cys He Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu 405 410 415 acc ctt acc tgg caá gac cag tat gaa gag ctg aag gac gag gcc acc 1296 Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr 420 425 430 tec tgc age etc cae agg teg gcc cae aat gcc acg cat gcc acc tac 1344 Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr 435 440 445 acc tgc cae atg gat gta ttc cae ttc atg gcc gac gac att ttc agt 1392 Thr Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp He Phe Ser 450 455 460 gtc aac ate acá gac cag tet ggc aac tac tec cag gag tgt ggc age 1440 Val Asn He Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser 465 470 475 480 ttt etc ctg gct gag age ate aag ccg gct ecc ect ttc aac gtg act 1488 Phe Leu Leu Ala Glu Ser He Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr 485 490 495 gtg acc ttc tea gga cag tat aat ate tec tgg cgc tea gat tac gaa 1536 Val Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn He Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu 500 505 510 gac ect gcc ttc tac atg ctg aag ggc aag ctt cag tat gag ctg cag 1584 Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln 515 520 - . 525 tac agg aac cgg gga gac ecc tgg gct gtg agt ccg agg aga aag ctg 1632 Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu 530 535 540 ate tea gtg gac tea aga agt gtc tec etc etc ecc ctg gag ttc cgc 1680 He Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg 545 550 555 560 aaa gac teg age tat gag ctg cag gtg cgg gca ggg ecc atg ect ggc 1728 Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly 565 570 575 tec tec tac cag ggg acc tgg agt gaa tgg agt gac ccg gtc ate ttt 1776 Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val He Phe 580 585 590 cag acc cag tea gag gag tta aag gaa ggc tgg aac ect cae tag 1821 Gln Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His * 595 600 605 <210> 97 <211> 606 <212> PRT <213> Secuencia Artificial 220> <; 223> Secuencia polipeptídica del receptor soluble de MBP-zalfa1 1 <400> 97 Met Lys He Glu Glu Gly Lys Leu Val He Trp He Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly He Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp He He Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu He 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu He Ala Tyr Pro He Ala Val Glu 100 . 105 110 Ala Leu Ser Leu lie Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu He Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu He Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp He Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu He Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser He Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr He Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn He Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly He Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg He Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu He Met Pro Asn He Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val He Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Ser His His His His His. His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val 370 375 380 Pro Arg Gly Ser Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln 385 390 395 400 Thr Val He Cys He Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu 405 410 415 Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr 420 425 430 Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr 435 440 445 Thr Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp He Phe Ser 450 455 460 Val Asn He Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser 465 470 475 480 Phe Leu Leu Ala Glu Ser He Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr 485 490 495 Val Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn He Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu 500 505 510 Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln 515 520 525 Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu 530 535 540 He Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg 545 550 555 560 Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly 565 570 575 Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val He Phe 580 585 590 Gln Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His 595 600 605 <210> 98 <211> 65 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC20187 -;*:-: <400> 98 tcaccacgcg aattcggtac cgctggttcc gcgtggatcc tgccccgacc tcgtctgcta 60 caccg 65 <210> 99 <211> 68 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC20185 <400> 99 tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca ctagtgaggg ttccagcctt 60 cctttaac 68 <210> 100 <211> 21 <212> ADN , _ . . <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22452 <400> 100 tcttcttggg gacactggtc c 21 <210> 101 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC22451 400> 101 aatcatgtgg cgatcttgac c 21 <210> 102 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial dor oligonucleotídico ZC22450 cagactaaca tgcccttcat g 21 <210> 103 <211> 23 <212> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotxdico ZC22449 <400> 103 ttcacttccg tgtgttctag agg 23 <210> 104 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotxdico ZC23771 <400> 104 accaccttcc acaaatgc 18 <210> 105 <211> 1347 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 105 gaattcaccc attctctctt tttcctgtca aagatgcaga tggggcacat ttcgttgact 60 ccatcaatcc ctgcccccac acattagcac atgeacaegt atacctagcc agtggaaaag 120 aaaaaagagt tactcacatt catccatttt acaaagattt ccaggctgca atgggagggc 180 tttacctctc cctgaaggat gaataaatag gtagettaac tgacaacctg ttetcagtca 240 agctgaagtg aaaacgagac caaggtctag ctctactgtt ggtacttatg agatecagtc 300 ctggcaacat ggagaggatt gtcatctgtc tgatggtcat cttcttgggg acactggtcc 360 acaaatcaag ctcccaaggt caagatcgcc acatgattag aatgcgtcaa cttatagata 420 ttgttgatca gctgaaaaat tatgtgaatg acttggtaag actatatttg tcacaacaaa 480 atetaaatca tacttttcaa ttaatataaa aggagggttt ggcttataaa aataactcag 540 aacaaatttt cttttgctct aggtccctga atttctgcca gctccagaag atgtagaggt 600 aagaccagtt gaatttattt ctgaaaatac attggacata agtttttaaa tecaataaga 660 aagacattag catgattata taggagtata ctgaatttta atgaacttag cggtctaata 720 attgatgaaa tatttattta tattttggtt aaattcattg atttaccaaa aaccaactaa 780 aaaatgctat attatattcc tcataaacta tgtttatctt caagaatetc taagagtact 840 cctaagtagt attgctgaga cagaataaca aaactagaaa cgaaatctat actctgatca 900 gtttctgaac aatgcacagc tagttactct ttaagagece ttgggcatga aagcttttga 960 gccttctttg ttatcctacc gaagaaacat agatacatac agtaggaagc agaattaacc 1020 ttttaataac aaaettaaaa aagaaagaaa gaaagaatta gattacaggg acagcatgga 1080 gaaatggtgg tgtggaaatc aaagctgtcc tttagaatat aatteacata taccttggcc 1140 tcagtgagtc ttgtctttgg ccttccgtga. ggtcttttga aagaaccatt ttcaacaatt 1200 catcccgtct ettaagecat ttaaatccat tagagtteca ggaagaagag gcctggcatg 1260 agttcagagt gctgtcccgc tgatcttttt ctcagtaact tetaegatet gatcttctgg 1320 tctggtaccc tgaggtataa atgcaat 1347 <210> 106 <211> 1656 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 106 cctcaactgc ttgattcagg cagaatecta accctaaact gagctgggag tatgaaaagg 60 gttttagaaa agtcatggtg tgatctatgg caagtatatt gattettaga tgtaaaatat 120 gctatcagag ggaggtaccc acttcctttc tccaaaggag gggctttaat tcattttctt 180 catctgttaa ctttacaaat atatgttgat cattaactgg caagacacta tgcctggcgc 240 tgtacagaat aaaatgctgc tcaagacatg tcatgataga tacattaaca gaaaccacaa 300 acaaatgaaa aatgttcttc atcagactat aacataattt acccaaagct gccactagtc 360 acagtgtaag ttttagagcc teataaetca gcaaatgtgt cctaaaccga actaactctc 420 ctttataaaa cacaaaggtc ttgtccacca cccagacatc aaaatggtcc tctgtgtagc 480 atcaggaata aagcattgtg aagaagtgag gctcctttct etettatetg cgaagcaggg 540 gattgtccct ttttcccatc ccaaagatta agtaggaggt gaaatcatac ctcactcatc 600 tgttgaaacg atgtaatgca cgacattgca gaagagatag aaatagagga ttgggaaagc 660 tatcttttac tttctgaata atgtttgtta acatatatac aaattgttta tctttcagac 720 aaactgtgag tggtcagctt tttcctgttt tcagaaggcc caactaaagt cagcaaatac 780 aggaaacaat gaaaggataa taaatgtatc aattaaaaag ctgaagagga aaccaccttc 840 cacaaatgea gggagaagac agaaacacag actagtaaga ttgtcatttg tcatctctct 900 tatttgtact tataaactat atatettgea ttacataaac atacacacac acctgtagcc 960 agggctgctg gtgtcttcct tacetatagt tatgeettat tatacatggt gctttttttt 1020 tttaagacag agtctcactc tgtcacccag gctggagtgc agtggcgtga tctctgctca 1080 ccgcaagatc cacctcccgg tttcacgcca ttctcctcct acctcagcct cctgagtacc 1140 tgggactaca ggtgcccgcc a_catgcccg gctaattttg tttttgtatt tttagtaaag 1200 acagggtttc accatgttag ccaggatggt ctcgatctcc tgaccccgtg atccgcccgc 1260 cttggcctcc caaagtgtgg ggattacagg catgagccac cgcacccggc ctatacgtgg 1320 tgcattttaa gaagtagggt cactctttta agcccacaga cttgaaagta ttcaaaaacc 1380 caattataat ttcctagtag tccttggcag ctggaatatg ttaatatagc ttetcaaggt 1440 gaggaagtca ttaggeagag aatccaactg tgattttgga gttaagaact atttcctctc 1500 atatggtcac agataaettg tattcttatt aacaggaget agatectage tttctaacaa 1560 gaaaagagcc tacaagaaga ctagggcaaa tcttaaactt tgcctcctct ctaaatcata 1620 ttactatctg tacatcagea gagtcagtat tgaatt 1656 <210> 107 <211> 644 <212> ADN <213> Hoo sapiens <400> 107 agctaaactt agaactctcc agttaagcat gtteatetta tagatgagga aaagtgagat 60 ctacaaagga gttaagtcac tagccccaag ttccataaat agtgtcagaa tgagaattag 120 aacgtatatc tactatettt tagtgaaatg ctctcactac aacatcacac tggcattgag 180 atgetaacta ccaagcaatg gcttggtgtt tggatctaaa tagggataaa gacaaagage 240 ataaactaag aaagcttttt aaaaatctaa gtgagcaatc catatatgaa aaactgttca 300 atctccctag taatcacata aatgcgagtt aaaacaagga aatcctgttt tttecaatta 360 aacattttaa acaataccct ataataataa gaatgeteca agtgaaaaga ggtaaaaccc 420 tttataatgt atatcaaage cttaaaattt ttatcccttt aatttagtaa ttctacttct 480 aggaatatat caaataagea aagatatata tgaaaaatta tttacagaga tgttctttgg 540 agtaatgtag acaaaaataa aaagttagat acagctgggt gtggtggctc atgcctgtat 600 tcccagcact ttgggaggcc gaggcaggcg gatcacctga gatc 644 <210> 108 <211> 645 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> característica miscelánea <222> (D...C645) <223> n = A.T.C o G <400> 108 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gttagatgea ccnttgggtc caaaaatagt aagagtgcat 60 cctatgtgga aacagaccaa ccactacatg tcatattttt gaagattatt taacacttag 120 gaaatcctgt gatatgttaa gtgtgaaaaa aaaaaagcaa atcaccaact ggtataaata 180 atgtaaatgc acaataataa ttaaaaatac ccaaaacaca gagagaatat acattaaaac 240 attgcagtgg gattectate tctgggaatg ggattacaag gactttttcc attgttactt 300 tccaaacagt tttatgtact tetegaatgt ttttcagtga acataattta tgtttttaat 360 gaaaaaaaat tttaagaaac attttattac gaaaaaaatt ttaaagaaga ctgttacttt 420 ttcattgatt tetagacatg cccttcatgt gattettatg agaaaaaacc acccaaagaa 480 ttcctagaaa gattcaaatc acttctccaa aaggtatcta ccttaagttt catttgattt 540 tctgctttat ctttacctat ccagatttgc ttcttagtta ctcacggtat actattteca 600 cagatgatte ateageatet gtectetaga acacacggaa gtgaa 645 <210> 109 <_11> 36 <212> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223>Cebador oligonucleotídico ZC25970 <400> 109 atgcattcta gactaggaga gatgctgatg aatcat 3 <210> 110 <211> 36 <212> A°N <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico ZC25969 <400> 110 atgcattccg gacataaatc aagcccccaa gggcca 3 <210> 111 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys He Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met He Leu Asn Gly He 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu He Ser Asn He Asn Val He 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr He Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser He He Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 112 <211> 153 <212> PRT <213> Ho ) sapiens <400> 112 Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala 1 5 . 10 15 Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp He Thr Leu Gln 20 25 30 Glu He He Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys 35 40 45 Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp He Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr 50 55 60 Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln 85 .* 90 - - 95 Phe His Arg His Lys Gln Leu He Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala 115 120 125 Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr He Met 130 135 140 Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150 <210> 113 <211> 162 <212> PRT <213> Hoe> sapiens <400> 113 Met Arg He Ser Lys Pro His Leu Arg Ser He Ser He Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly He His 20 25 30 Val Phe He Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val He Ser Asp Leu Lys Lys He Glu Asp Leu He 50 • 55 60 Gln Ser Met His He Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val He Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser He His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu He He Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn He 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His He Val Gln Met Phe He Asn 145 150 155 160 Thr Ser <210> 114 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens 400> 114 . Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser He 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 Val Asn Ala He Gln.Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val He Ser Glu Met Phe 50 55 60 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Ala Thr Gln He He Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Val He Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140 <210> 115 <211> 538 <212> PRT <213> Ho o sapiens <400> 115 Met Pro Arg Gly Trp Al a Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly 1 5 10 15 Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr 20 25 30 Val He Cys He Leu Gl u Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr 35 40 45 Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser 50 55 60 Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr 65 70 75 80 Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp He Phe Ser Val 85 90 95 Asn He Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe 100 105 110 Leu Leu Ala Glu Ser He Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val 115 120 125 Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn He Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp 130 135 140 Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr 145 150 . 155 160 Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu He 165 170 175 Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys 180 185 190 Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser 195 200 205 Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val He Phe Gln 210 215 220 Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu 225 230 235 240 Leu Leu Leu Leu Val He Val Phe He Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys 245 250 255 Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys He Trp Ala Val Pro Ser 260 265 270 Pro Gl u Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe 275 280 285 Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Gl u Leu Gly 290 295 300 Pro Trp Ser Pro Gl u Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys Hi s 305 310 315 320 Pro Pro Arg Ser Pro Al a Lys Arg Leu Gln Leu Thr Gl u Leu Gln Glu 325 330 335 Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp 340 345 350 Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp 355 360 365 Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser He Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala 370 375 380 Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro 385 390 395 400 Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp 405 410 415 Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser 420 425 430 Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg 435 440 445 Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro 450 455 460 Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser 465 470 475 480 Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly 485 490 495 Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp 500 505 510 Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Tcp Val Val He Pro Pro 515 520 525 . Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser 530 535 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a los residuos 41 (Gln) al 148 (lie) como se muestra en la SEQ ID ?O. 2, en donde el residuo en la posición 44 es Asp, el residuo en la posición 47 es Asp y el residuo en la posición 135 es Glu.

2. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los residuos de aminoácidos 71, 78, 122 y 125 son cisteína.

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de los residuos de aminoácidos es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO . 2, a partir de los residuos 41 (Gln) al 148 (lie) .

4. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de residuos de aminoácidos es 100% idéntica a la SEQ ID ?O. 2, a partir de los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) .

5. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido se enlaza al receptor de zalfall como se muestra en la SEQ ID NO . 115.

6. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de residuos de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID ?O. 2, a partir del residuo 32 (Gln) al residuo 162 (Ser) o como se muestra en la SEQ ID ?O. 56 (ratón) a partir del residuo 23 (Gln) al residuo 146 (Ser) .

7. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de residuos de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID ?O. 2 es el residuo 1 (Met) al residuo 162 (Ser) o como se muestra en la SEQ ID ?O. 56 (ratón) es el residuo 1 (Met) al residuo 146 (Ser) .

8. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende al menos 14 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID ?O. 2 o la SEQ ID ?O . 56.

9. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque los residuos de aminoácidos son seleccionados del grupo que consiste de: a) los residuos de aminoácidos 41-56 de la SEQ ID NO . 2; b) los residuos de aminoácidos 69-84 de la SEQ ID NO . 2; O los residuos de aminoácidos 92-105 de la SEQ ID ?O. 2; y d) los residuos de aminoácidos 135-148 de la SEQ ID NO. 2.

10. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende al menos cuatro polipéptidos, en donde el orden de los polipéptidos desde el extremo N hasta el extremo C es : un primer polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos del 41 al 56 de la SEQ ID NO. 2; un primer espaciador de 6 a 27 residuos de aminoácidos; un segundo polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: a) los residuos 53-75 de la hélice B de IL-2, de la SEQ ID NO. 111; b) los residuos 65-83 de la hélice B de IL-4, de la SEQ ID NO. 112; c) los residuos 84-101 de la hélice B de IL-5, de la SEQ ID NO. 113; d) los residuos 72-81 de la hélice B de GMCSF, de la SEQ ID NO. 114; y e) los residuos de aminoácidos 69-84 de la SEQ ID NO. 2; un segundo espaciador de 5-11 residuos de aminoácidos; un tercer polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: a) los residuos 87-99 de la hélice C de IL-2, de la SEQ ID NO. 111; b) los residuos 95-118 de la hélice C de IL-4, de la SEQ ID NO. 112; . c) los residuos 107-119 de la hélice C de IL-15, de la SEQ ID NO. 113; d) los residuos 91-102 de la hélice C de GMCSF, de la SEQ ID NO. 114; y e) los residuos de aminoácidos 92-105 de la SEQ ID NO. 2; un tercer espaciador de 3 a 29 residuos de aminoácidos; y un cuarto polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: a) los residuos 103-121 de la hélice D de IL-2, de la SEQ ID NO. 111; b) los residuos 134-157 de la hélice D de IL-15, de la SEQ ID NO. 112; c) los residuos 134-160 de la hélice D de IL-4, de la SEQ ID NO. 113; d) los residuos 120-131 de la hélice D de GMCSF, de la SEQ ID NO. 114; y e) los residuos de aminoácidos 135-148 de la SEQ ID NO. 2.

11. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende al menos cuatro polipéptidos, en donde el orden de los polipéptidos desde el extremo N hasta el extremo C es : un primer polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: a) los residuos 36-46 de la hélice A de IL-2, de la SEQ ID NO. 111; b) los residuos 29-43 de la hélice A de IL-4, de la SEQ ID NO. 112; c) los residuos 45-68 de la hélice A de IL-15 de la SEQ ID NO. 113; d) los residuos 30-44 de la hélice A de GMCSF, de la SEQ ID NO. 114; y e) los residuos de aminoácidos 41-56 de la SEQ ID NO. 2; un primer espaciador de 6 a 27 residuos de aminoácidos; un segundo polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: a) los residuos 53-75 de la hélice B de IL-2, de la SEQ ID NO. 111; b) los residuos 65-83 de la hélice B de IL-4, de la SEQ ID NO. 112; c) los residuos 84-101 de la hélice B de IL-15, de la SEQ ID NO. 113; d) los residuos 72-81 de la hélice B de GMCSF, de la SEQ ID NO . 114; y e) los residuos de aminoácidos 69-84 de la SEQ ID ?O. 2; un segundo espaciador de 5 a 11 residuos de aminoácidos; un tercer polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: a) los residuos 87-99 de la hélice C de IL-2, de la SEQ ID ?O. 111; b) los residuos 95-118 de la hélice C de IL-4, de la SEQ ID ?O. 112; c) los residuos 107-119 de la hélice C de IL-15, de la SEQ ID ?O. 113; d) los residuos 91-102 de la hélice C de GMCSF, de la SEQ ID NO. 114; y e) los residuos de aminoácidos 92-105 de la SEQ ID NO. 2; un tercer espaciador de 3 a 29 residuos de aminoácidos; y un cuarto polipéptido que comprende una secuencia de los residuos de aminoácidos 135-148 de la SEQ ID NO. 2.

12. Una proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el cuarto polipéptido comprende los residuos de aminoácidos 135-148 de la SEQ ID NO. 2.

13. Una molécula polinucleotídica aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.

14. La molécula polinucleotídica aislada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque los nucleótidos son como se muestra en la SEQ ID NO. 1 desde el nucleótido 167 hasta el nucleótido 490 o como se muestra en la SEQ ID NO. 3 desde el nucleótido 121 hasta el nucleótido 444.

15. Una molécula polinucleotídica aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para el polipéptido de conformidad con la reivindicación 8.

16. Una molécula polinucleotídica aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para el polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO . 2 desde el residuo 32 al residuo 162 o como se muestra en la SEQ ID ?O. 56 desde el residuo 23 hasta el residuo 146.

17. La molécula polinucleotídica aislada de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque los nucleótidos son como se muestra en la SEQ ID ?O. 1 desde el nucleótido 140 hasta el nucleótido 532 o como se muestra en la SEQ ID ?O. 3 desde el nucleótido 94 hasta el nucleótido 486.

18. Una molécula polinucleotídica aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de los nucleótidos que codifican para el polipéptido como se muestra en la SEQ ID ?O. 2 desde el residuo 1 hasta el residuo 162, o como se muestra en la SEQ ID ?O. 56 desde el residuo 1 hasta el residuo 146.

19. La molécula polinucleotídica aislada de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque los nucleótidos son como se muestran en la SEQ ID ?O. 1 desde el nucleótido 47 hasta el nucleótido 532 o como se muestra en la SEQ ID NO. 3 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 486.

20. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende los siguientes elementos operablemente enlazados: a) un promotor de la transcripción; b) un segmento de ADN que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: a) los residuos de aminoácidos 41-56 de la SEQ ID NO. 2; los residuos de aminoácidos 69-84 de la SEQ ID NO. 2; C) los residuos de aminoácidos 92-105 de la SEQ ID NO. 2; y d) los residuos de aminoácidos 135-148 de la SEQ ID NO. 2; y c) un terminador de la transcripción.

21. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende los siguientes elementos operablemente enlazados: a) un promotor de la transcripción; b) un segmento de ADN que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a los residuos 41 (Gln) al 148 (lie) como se muestra en la SEQ ID NO. 2, en donde el residuo en la posición 44 es Asp, el residuo en la posición 47 es Asp y el residuo en la posición 135 es Glu; y c) un terminador de la transcripción.

22. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende los siguientes elementos operablemente enlazados: a) un promotor de la transcripción; b) un segmento de ADN que codifica para un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 32 (Gln) al 162 (Ser) de la SEQ ID NO. 2; y c) un terminador de la transcripción.

23. Una célula cultivada, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20, 21 ó 22.

24. Un método para producir una proteína, caracterizado porque comprende: el cultivo de una célula de conformidad con la reivindicación 23 bajo condiciones en donde el segmento de ADN es expresado; y la recuperación de la proteína codificada por el segmento de AD?.

25. Un método para producir un anticuerpo para un polipéptido del Ligando zalfall, caracterizado el método porque comprende : la inoculación de un animal con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) un polipéptido que consiste de 9 a 131 aminoácidos, en donde el polipéptido es idéntico a una secuencia contigua de residuos de aminoácidos en la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 32 (Gln) hasta el aminoácido número 162 (Ser) ; b) un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1; c) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 41 (Gln) hasta el aminoácido 148 (lie) ; d) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 41 (Gln) hasta el aminoácido 56 (Val) ; e) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 69 (Thr) hasta el aminoácido 84 (Leu) ; f) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 92 (Asn) hasta el aminoácido 105 (Arg) ; g) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 135 (Glu) hasta el aminoácido 148 (lie) ; h) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 72; i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 73; j) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 32 (Gln) hasta el aminoácido número 162 (Ser) ; ) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 1 (Met) hasta el aminoácido número' 162 (Ser) ; 1) un polipéptido que cqmprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 114 hasta el aminoácido número 119; m) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 101 hasta el aminoácido número 105; n) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 126 hasta el aminoácido número 131; o) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 113 hasta el aminoácido número 118; p) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 desde el aminoácido número 158 hasta el aminoácido número 162; y en donde el polipéptido promueve una respuesta inmune en el animal para producir el anticuerpo; y el aislamiento del anticuerpo a partir del animal .

26. Un anticuerpo producido mediante el método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a un polipéptido del Ligando zalfall.

27. Un anticuerpo, caracterizado porque se enlaza específicamente a un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.

28. Un método para estimular una respuesta inmune en un mamífero expuesto a un antígeno o patógeno, caracterizado el método porque comprende los pasos de: 1) determinar directa o indirectamente el nivel de antígeno o patógeno presente en dicho mamífero; 2) administrar una composición que comprende el polipéptido del Ligando zalfall en un vehículo farmacéuticamente aceptable; 3) determinar directa o indirectamente el nivel de antígeno o patógeno en dicho mamífero; y 4) comparar el nivel del antígeno o del patógeno en el paso 1 al nivel de antígeno o patógeno en el paso 3, en donde un cambio en el nivel es indicador de la estimulación de una respuesta inmune.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende además: 5) la re-administración de una composición que comprende un polipéptido del Ligando zalfall en un vehículo farmacéuticamente aceptable; 6) la determinación directa o indirectamente del nivel de antígeno o patógeno en dicho mamífero; y 7) la comparación del nivel de antígeno o patógeno en el paso 1 al nivel de antígeno en el paso 6, en donde un cambio en el nivel es indicador de la estimulación de una respuesta inmune.

30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 ó 29, caracterizado porque el antígeno es un tumor de células B; un virus; un parásito o una bacteria.

31. Un método para la expansión de células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas, caracterizado porque comprende el cultivo de la médula ósea o las células de sangre periférica con una composición que comprende una cantidad del Ligando zalfall suficiente para producir un incremento en el número de células linfoides en la médula ósea o células de sangre periférica, en comparación a las células de médula ósea o de sangre periférica cultivadas en ausencia del Ligando zalfall.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque las células hematopoyéticas y las células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides.

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque las células linfoides son células NK o células T citotóxicas.

34. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la composición también comprende al menos una citocina seleccionada del grupo que consiste de IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando de Flt3 y factor de células totipotenciales .

35. Un método para reducir la proliferación de células B o T neoplásicas, caracterizado el método porque consiste en administrar a un mamífero con un neoplasma de células B o T, una cantidad de una composición del Ligando zalfall, suficiente para reducir la proliferación de las células B o T neoplásicas.

36. el método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la composición también comprende al menos otra citocina seleccionada del grupo que consiste de IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando de Flt3 o el factor de células totipotenciales .

37. Un método para reducir la proliferación de células B o T neoplásicas, caracterizado el método porque comprende el administrar a un mamífero con un neoplasma de células B o T, una cantidad de una composición del antagonista del Ligando zalfall, suficiente para reducir la proliferación de las células B o T neoplásicas.

38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la composición comprende al menos una citocina seleccionada del grupo que consiste de IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando de Flt3 o el factor de células totipotenciales.

39. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el antagonista del Ligando zalfall es la proteína de fusión ligando/toxina.

40. Un método para estimular una respuesta inmune en un mamífero expuesto a un antígeno o patógeno, caracterizado el método porque comprende: (1) la determinación de un nivel de un anticuerpo específico de antígeno o de patógeno; (2) la administración de una composición que comprende el polipéptido del Ligando zalfall en un vehículo farmacéuticamente aceptable; (3) la determinación de un nivel post-administración del anticuerpo específico del antígeno o del patógeno; (4) la comparación del nivel del anticuerpo en el paso (1) al nivel del anticuerpo en el paso (3) , en donde un incremento en el nivel de anticuerpo es indicador de la estimulación de una respuesta inmune.

41. Un método para detectar la presencia del ARN del Ligando zalfall en una muestra biológica, caracterizado porgue comprende los pasos de: a) el poner en contacto una sonda de ácido nucleico del Ligando zalfall bajo condiciones de hibridación ya sea con (i) las moléculas de AR? de prueba aisladas de la muestra biológica, o (ii) las moléculas de ácido nucleico sintetizadas a partir de las moléculas de AR? aisladas, en donde la sonda tiene una secuencia nucleotídica que comprende ya sea una porción de la secuencia nucleotídica de la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 18, o su complemento, y b) la detección de la formación de híbridos de la sonda de ácido nucleico y las moléculas de AR? de prueba o las moléculas de ácido nucleico sintetizadas, en donde la presencia de los híbridos indica la presencia del AR? del Ligando zalfall en la muestra biológica.

42. Un método para detectar la presencia del Ligando zalfall en una muestra biológica, caracterizado el método porque comprende los pasos de: a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, de conformidad con las reivindicaciones 26 ó 27, en donde la puesta en contacto es realizada bajo condiciones que permiten el enlace del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo a la muestra biológica, y b) la detección de cualquiera del anticuerpo enlazado o el fragmento de anticuerpo enlazado. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las moléculas polipeptídicas y polinucleotídicas del Ligando zalfall. El Ligando zalfall es una nueva citocina. Los polipéptidos pueden ser utilizados dentro de los métodos para estimular la proliferación y/o el desarrollo de las células hematopoyéticas in vi tro e in vivo . La presente invención también incluye los métodos para producir la proteína, los usos para la misma y los anticuerpos para ésta. 1/1 1516 3031 4546 6061 7576 90 hIL-2 APTSSSTKK TQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN PKLTRMLTFFY MPKKATE—LKHLQ hIL-15 -AGIH VFILGCFSAGLPTE AN VNVISDLKKI-EDLIQSMHIDAT--- LY TESDVHPSCKVTAMK zall-Lig sSSQGQDRHMIRM RQLIDIVDQLKNYVNDLVPEF ----LP APEDVETNCESAFS hIL-4 --- HKCD- ITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDI-- —-FA ASKNTTE---- ETF mIL-4 ---- HIHGCDK NHLREIIGILNEVTGEGTPCTEMDVPN LT ATKNTTE----SELV hGM-CSF SPSPSTQPWEHV NAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETV --E VISEMFD---LQEPT mGM-CSF -- --IIVTRPWKHV EAIKEALNLLDDMPVTL---NEEV — E VVSNEFS---FKLT 91 105106 120121 - 135136 150151 165 166 180 hIL-2 CLEEELKPLEEVLNL AQSKNFHLRPRDLIS NINVIVLGLGSE - TTFMCE- YADETATIVEFLNRW hIL-15 CFLLELQVISLESGD ASIHDTVENLIILAN NSLSSNGNVTESG CKECEE LEE -NIKEFLQSF zall-Lig CFQAQLKSANTGNN ERIINVSIKKLKRKP PSTNAGRRQKHRL --TCPSCDS YEKK-PPKEFLERF hIL-4 CRAATVLRQFYSHHE KDTRCLGATAQQFHR HKQLIRFLKRLDRNLWGLAGL---- --NSCPV KEANQSTLENFLERL mIL-4 CRAS VLRIFYLKHG K-TPCLKKNSSVLME LQRLFRAFRGLDS SISCTM NESKSTSL DFLESL hGM-CSF CLQTRLELYKQGLRG SLTKLKGPLTMMASH YKQHCPPTPE--- TSCA- -TQIITFESFKENL mGM-CSF CVQTRLKIFEQGLRG NFTKLKGALNMTASY YQTYCPPTPE TDCE- -TQVTTYADFIDSL hIL-2 ITFCQSIISTL 132 hIL-15 VHIVQMFINTS1 134 zall-Lig KSLLQMIHQHLSSR THGSEDS 136 hIL-4 TIMREKYSKCSS 129 mIL-4 KSIMQMOYS 120 hGM-CSF KDFLLVIPFDC--WE 119 mGM-CSF KTFLTDIPFEC--KK PSQK 118 FIGURA 1