PL207350B1 - Izolowany polipeptyd, cząsteczka izolowanego polinukleotydu, komórka, sposób wykrywania obecności RNA liganda zalpha11, sposób wykrywania obecności polipeptydu, przeciwciało, zastosowanie kompozycji zawierającej polipeptyd, zastosowanie polipeptydu do rozprzestrzeniania komórek krwiotwórczych, zastosowanie polipeptydu do wytwarzania leku i polipeptyd do zastosowania w medycynie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Tło wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowany polipeptyd, cząsteczka izolowanego polinukleotydu, komórka, sposób wykrywania obecności RNA liganda zalpha11, sposób wykrywania obecności polipeptydu, przeciwciało, zastosowanie kompozycji zawierającej polipeptyd, zastosowanie polipeptydu do rozprzestrzeniania komórek krwiotwórczych, zastosowanie polipeptydu do wytwarzania leku i polipeptyd do zastosowania w medycynie.

Rozmnażanie i różnicowanie komórek organizmów wielokomórkowych jest kontrolowane przez hormony i polipeptydowe czynniki wzrostu. Te rozprzestrzeniające się cząsteczki pozwalają komórkom komunikować się nawzajem i działać w zgodzie kształtując komórki, tkanki i organy oraz naprawiając uszkodzone tkanki. Przykłady hormonów i czynników wzrostu obejmują hormony steroidowe (np. estrogen, testosteron), hormon przytarczyc, hormon folikulotropowy, interleukiny, płytkowy czynnik wzrostu (PDGF), czynnik wzrostu naskórka (EGF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), erytropoetyna (EPO) i kalcytonina.

Hormony i czynniki wzrostu wpływają na metabolizm komórkowy przez wiązanie z receptorami. Receptory mogą być integralnymi białkami błonowymi, które są związane ze ścieżkami sygnałowymi wewnątrz komórki, takimi jak wtórne układy informacyjne. Inne klasy receptorów są cząsteczkami rozpuszczalnymi, takimi jak czynniki transkrypcyjne.

Cytokiny zasadniczo stymulują proliferację lub różnicowanie komórek pochodzenia rodu krwiotwórczego lub biorą udział w mechanizmach odpornościowych i zapalnych organizmu. Przykłady cytokin wpływających na hematopoezę obejmują erytropoetynę (EPO), która pobudza rozwój krwinek czerwonych, trombopoetynę (TPO), która pobudza rozwój komórek rodu megakariocytów i czynnik stymulujący tworzenie kolonii i granulocytów (G-CSF), który pobudza rozwój granulocytów obojętnochłonnych. Te cytokiny są użyteczne przy przywracaniu prawidłowego poziomu komórek krwi u pacjentów cierpiących z powodu anemii, małopłytkowości i neutropenii albo otrzymujących chemioterapię nowotworów.

Interleukiny są rodziną cytokin, które pośredniczą w odpowiedziach odpornościowych, w tym w zapaleniu. Interleukiny pośredniczą w różnych patologicznych stanach zapalnych. Ośrodkiem odpowiedzi odpornościowej jest komórka T, która wytwarza wiele cytokin i adaptacyjną odporność wobec antygenów. Cytokiny wytworzone przez komórkę T sklasyfikowano jako typ 1 i typ 2 (Kelso, A.

Immun. Cell. Biol. 76: 300-317, 1998). Typ 1 cytokin obejmuje IL-2, IFN-γ, LT-α; wiążą się one z odpowiedzią zapalną, odpornością na wirusy, odpornością na pasożyty wewnątrzkomórkowe i odrzucanie przeszczepu allogenicznego. Typ 2 cytokin obejmuje IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 oraz IL-13; wiążą się z odpowiedzią humoralną, odpornością na pasożyty jelitowe oraz odpowiedzią alergiczną. Cytokiny należące zarówno do typu 1 jak i 2 obejmują IL-3, GM-CSF oraz TNF-α. Istnieją pewne dowody sugerujące, że typ 1 i typ 2 wytwarzający populację komórek T migruje przede wszystkim do różnych rodzajów komórek wykazujących stan zapalny.

Dojrzałe komórki T mogą być aktywowane, np. przez antygen lub inny bodziec, wytwarzając np. cytokiny, biochemiczne cząsteczki sygnałowe lub receptory, które dodatkowo wpływają na przeznaczenie populacji komórek T.

Komórki B mogą być aktywowane przez receptory na powierzchni komórki, w tym receptor komórki B oraz inne cząsteczki pomocnicze, wykonując działania cząsteczek pomocniczych, takie jak wytwarzanie cytokin.

Naturalni zabójcy (NK) mają wspólnego przodka z komórkami T i komórkami B, i odgrywają rolę w nadzorowaniu odporności. Komórki NK, które stanowią do 15% limfocytów krwi, nie wykazują ekspresji receptorów antygenowych, a zatem nie wykorzystują rozpoznania MHC jako wymagania przy wiązaniu z komórką docelową. Komórki NK są związane z rozpoznawaniem i zabijaniem pewnych komórek nowotworowych oraz komórek zakażonych wirusem. Jak się sądzi komórki NK in vivo wymagają aktywacji, jednak in vitro komórki NK jak się okazało zabijają pewne rodzaje komórek nowotworowych bez aktywacji.

Demonstrowana in vivo aktywność rodziny cytokin ilustruje ogromny pote ncjał kliniczny oraz zapotrzebowanie na potrzebę inne cytokiny, agonistów cytokin i antagonistów cytokin. Niniejszy wynalazek dotyczy tych potrzeb, ujawniając nowe cytokiny, które stymulują komórki pochodzenia krwiotwórczego, jak również odnośne kompozycje i sposoby.

PL 207 350 B1

Niniejszy wynalazek ujawnia takie polipeptydy dla tych i inny zastosowań, które powinny być oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie na podstawnie informacji zawartych w niniejszym dokumencie.

Krótki opis rysunków

Figura 1 jest ilustracją wielokrotnego uszeregowania ludzkiej IL-2, ludzkiej IL-15, liganda zalpha11 (SEQ ID Nr: 2), ludzkiej IL-4, mysiej IL-4, ludzkiego GM-CSF i mysiego GM-CSF.

Szczegółowy opis wynalazku

Zanim przedstawione zostaną szczegóły wynalazku, w zrozumieniu go może być pomocne zdefiniowanie następujących określeń.

Określenie „znacznik powinowactwa” stosuje się w niniejszym dokumencie do opisania segmentu polipeptydu, który może być dołączony do drugiego polipeptydu, umożliwiając oczyszczanie lub wykrywanie drugiego polipeptydu lub zapewniając miejsca do przyłączenia drugiego polipeptydu do substratu.

W zasadzie, jako znacznik powinowactwa można stosować każdy peptyd lub białko, dla którego dostępne jest przeciwciało lub inny specyficzny czynnik wiążący. Znaczniki powinowactwa obejmują znacznik polihistydynowy, białko A (Nilsson i inni, EMBO J. 4: 1075,1985; Nilsson i inni, Methods Enzymol. 198:3. 1991), transferazę S-glutationową (Smith i Johnson, Gene 67: 31, 1988), znacznik powinowactwa Glu-Glu (Grussenmeyer i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985), substancję P, peptyd Flag™ (Hopp i inni, Biotechnology 6: 1204-10, 1988), peptyd wiążący streptawidynę lub inny epitop antygenowy albo domenę wiążącą. Zobacz ogólnie. Ford i inni. Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. DNA kodujące znaczniki powinowactwa są dostępne w sprzedaży (np. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Określenie „wariant alleliczny stosuje się w niniejszym dokumencie do opisania każdej z dwóch lub więcej alternatywnych form genu zajmującego ten sam locus na chromosomie. Warianty alleliczne powstają naturalnie poprzez mutację i w populacjach mogą powodować polimorfizm fenotypowy. Mutacje genowe mogą być ciche (brak zmian w kodowanym polipeptydzie) lub mogą kodować polipeptydy o zmienionej sekwencji aminokwasowej. Określenie wariant alleliczny stosuje się w niniejszym dokumencie także do opisania białka kodowanego przez wariant alleliczny genu.

Określenia „aminoterminalny” i „karboksyterminalny” stosuje się w niniejszym dokumencie do opisania pozycji w polipeptydach. Jeśli kontekst na to pozwala, określenia te stosuje się w odniesieniu do poszczególnych sekwencji lub części polipeptydu do opisania bliskości lub względnej pozycji. Przykładowo, karboksyterminalne umiejscowienie pewnej sekwencji odnosi się do umiejscowienia sekwencji w polipeptydzie proksymalnie w stosunku do końca karboksylowego odnośnej sekwencji, lecz nie koniecznie znajduje się ona na końcu karboksylowym pełnego polipeptydu.

Określenie „para komplementarna/antykomplementarna” opisuje cząstki nieidentyczne, które w odpowiednich warunkach tworzą nie powiązane, kowalencyjnie stabilne pary. Przykładowo, biotyna i awidyna (lub streptawidyna) są prototypowymi członkami pary komplementarnej/antykomplementarnej. Innymi przykładami par jw. są pary receptor/ligand, pary przeciwciało/antygen (albo hapten lub epitop), pary polinukleotyd sensowny/antysensowny i inne. Jeśli pożądana jest późniejsza dysocjacja 9 -1 pary jw, para jw. korzystnie posiada powinowactwo wiązania wynoszące < 10⁹ M^-1.

Określenie „cząsteczka komplementarna wobec cząsteczki polinukleotydowej” oznacza cząsteczkę polinukleotydową mającą komplementarną sekwencję zasad i orientację odwrotną w porównaniu z sekwencją odnośną. Przykładowo, sekwencja 5' ATGCACGGG 3' jest komplementarna w stosunku do 5' CCCGTGCAT 3'.

Określenie „zdegenerowana sekwencja nukleotydowa” opisuje sekwencję nukleotydów, która obejmuje jeden lub więcej zdegenerowanych kodonów (w porównaniu z cząsteczką polinukleotydową odniesienia, która koduje polipeptyd). Zdegenerowane kodony zawierają różne triplety nukleotydów, ale kodują te same reszty aminokwasowe (czyli każdy triplet GAU i GAC koduje Asp).

Określenie „wektor ekspresyjny” stosuje się do opisania cząsteczki DNA, liniowej lub kolistej, która obejmuje segment kodujący dany polipeptyd, połączony operacyjnie z dodatkowymi segmentami, które zapewniają jej transkrypcję. Takie dodatkowe segmenty obejmują promotor i sekwencje terminatora i mogą też obejmować jeden lub więcej początków replikacji, jeden lub więcej znaczników selekcji, wzmacniaczy, sygnałów poliadenylacji itd. Wektory ekspresyjne ogólnie otrzymuje się z plazmidu lub wirusowego DNA lub mogą one zawierać elementy obu.

Określenie „izolowany”, stosowane w stosunku do polinukleotydu, oznacza, że polinukleotyd jest oddalony od swego naturalnego środowiska genetycznego, a więc jest pozbawiony innych obcych

PL 207 350 B1 lub niepotrzebnych sekwencji kodujących i jest w postaci odpowiedniej do stosowania w systemach wytwarzania białka metodami inżynierii genetycznej. Takie izolowane cząsteczki są oddzielone od swego naturalnego otoczenia i obejmują cDNA i klony genomowe. Izolowane cząsteczki DNA według niniejszego wynalazku są pozbawione innych genów, z którymi są zwykle związane, ale mogą obejmować naturalnie występujące regiony 5' i 3' nie ulegające translacji, takie jak promotory i terminatory. Identyfikowanie związanych regionów będzie oczywiste dla specjalisty (zobacz np. Dynan i Tijan, Nature 316: 774-78, 1985).

„Izolowany” polipeptyd lub białko oznacza polipeptyd lub białko znajdujące się stanie innym niż jego rodzime środowisko, np. poza krwią i tkanką zwierzęcą. W zalecanej postaci izolowany polipeptyd jest zasadniczo pozbawiony innych polipeptydów, szczególnie innych polipeptydów pochodzenia zwierzęcego. Zaleca się uzyskiwania polipeptydów w postaci wysoko oczyszczonej, czyli ponad 95% czystości, korzystniej ponad 99% czystości.

Przy stosowaniu w tym kontekście, określenie „izolowany” nie wyklucza obecności tego samego polipeptydu w alternatywnej postaci fizycznej, takiej jak dimer lub, alternatywnie, postaci glikozylowanej lub derywatyzowanej.

Określenie „neoplastyczny” w odniesieniu do komórek wskazuje komórki przechodzące nową i nieprawidłową proliferację, szczególnie w tkance, w której proliferacja jest niekontrolowana i postępująca, powodując powstanie nowotworu. Komórki nowotworowe mogą być albo złośliwe, czyli inwazyjne i przerzutowe, albo łagodne.

Określenie „połączony operacyjnie”, w odniesieniu do segmentów DNA, wskazuje, że segmenty są uszeregowane tak, że działają w zgodzie ze swymi zamierzonymi celami, np. transkrypcja ma początek w promotorze i przebiega poprzez segment kodujący do terminatora.

Określenie „ontolog” oznacza polipeptyd lub białko otrzymane od jednego gatunku, które jest funkcjonalnym duplikatem polipeptydu lub białka od innych gatunków. Różnice sekwencji między ortologami są wynikiem specjacji.

„Paralogi” są różnymi, lecz strukturalnie pokrewnymi białkami wytworzonymi przez organizm.

Uważa się, że paralogi powstają poprzez duplikację genową. Przykładowo, α-globina, β-globina i mioglobina są paralogami między sobą.

„Polinukleotyd” oznacza polimer o pojedynczym lub podwójnym łańcuchu zasad deoksyrybonukleotydowych lub rybonukleotydowych czytanych od końca 5' do 3'. Polinukleotydy obejmują RNA i DNA, mogą być izolowane z naturalnych źródeł, syntetyzowane in vitro lub wytwarzane z połączenia cząsteczek naturalnych i syntetycznych. Rozmiary polinukleotydów wyraża się jako pary zasad (w skrócie „bp”), nukleotydy („nt”) lub kilozasady („kb”). Jeśli pozwala na to kontekst, ostatnie dwa określenia mogą opisywać polinukleotydy, które mają pojedynczy łańcuch lub podwójny łańcuch. Kiedy określenie stosuje się do cząsteczek o podwójnym łańcuchu, stosuje się je do opisania ogólnej długości i jest rozumiane jako równoważne określeniu „pary zasad”.

Specjalista wie, że te dwie nici cząsteczek polinukleotydu o podwójnym łańcuchu mogą różnić się nieznacznie długością i że ich końce mogą być przesunięte w wyniku rozszczepienia enzymatycznego; tak więc, nie wszystkie nukleotydy w cząsteczce polinukleotydowej o podwójnej nici muszą być sparowane.

„Polipeptyd” oznacza polimer reszt aminokwasowych połączonych wiązaniami peptydowymi, wytworzony naturalnie lub syntetycznie. Polipeptydy o mniej niż około 10 resztach aminokwasowych określa się na ogół jako „peptydy”.

Określenie „promotor” stosuje się w niniejszym dokumencie zgodnie z jego znanym w technice znaczeniem, do opisywania części genu zawierającej sekwencje DNA, które zapewniają wiązanie polimerazy RNA i początek transkrypcji. Sekwencje promotorowe zwykle, lecz nie zawsze, znajdują się w regionach nie kodujących 5' genów.

„Białko” oznacza makrocząsteczkę obejmującą jeden lub więcej łańcuchów polipeptydowych. Białko może także obejmować składniki nie peptydowe, takie jak grupy węglowodanowe. Węglowodany i inne nie peptydowe podstawniki mogą być dodawane do białka przez komórkę, w której białko jest wytwarzane; zmienia się to wraz z typem komórki. Białka są definiowane w niniejszym dokumencie pod względem ich szkieletu aminokwasowego; podstawniki, takie jak grupy węglowodanowe, ogólnie nie są wyszczególniane, niemniej jednak mogą być obecne.

Określenie „receptor” stosuje się w niniejszym dokumencie do opisania białka związanego z komórką lub podjednostki polipeptydowej takiego białka, które wiąże się z bioaktywną cząsteczką („ligandem”) i pośredniczy we wpływie liganda na komórkę. Wiązanie liganda z receptorem powoduje

PL 207 350 B1 zmianę konformacyjną w receptorze (i w niektórych przypadkach multimeryzację receptora, czyli asocjację identycznych lub różnych podjednostek receptora), co powoduje oddziaływanie między domeną efektorową a inną cząsteczką (cząsteczkami) w komórce. Te interakcje z kolei prowadzą do zmian w metabolizmie komórki. Zdarzenia metaboliczne, związane z oddziaływaniem ligand receptor, obejmują transkrypcję genu, fosforylację, defosforylację, zwiększanie wytwarzania cyklicznego AMP, mobilizację wapnia komórkowego, mobilizację lipidów błonowych, adnezję komórki, hydrolizę lipidów inozytolowych i hydrolizę fosfolipidów.

Ogólnie, receptory mogą być związane z błoną, cytozolowe lub jądrowe; monomeryczne (np. receptor hormonu tyreotropowego, receptor beta adrenergiczny) lub multimeryczne (np. receptor PDGF, receptor hormonu wzrostu, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor erytropoetynowy i receptor IL-6).

Określenie „sekwencja sygnału wydzielania” opisuje sekwencję DNA, która koduje polipeptyd („peptyd wydzielniczy”), który jako składnik większego polipeptydu, kieruje większy polipeptyd poprzez ścieżkę wydzielniczą komórki, w której jest on syntetyzowany. Zwykle większy peptyd jest rozszczepiany, aby usunąć peptyd wydzielniczy podczas przejścia przez ścieżkę wydzielniczą.

Określenie „wariant splicingowy” stosuje się w niniejszym dokumencie do opisania alternatywnej formy RNA ulegającej transkrypcji z genu. Wariant splicingowy powstaje naturalnie poprzez użycie alternatywnych miejsc splicingowych w cząsteczce RNA ulegającej transkrypcji lub rzadziej między oddzielnie przepisywanymi cząsteczkami RNA ulegającymi oddzielnej transkrypcji i może powodować utworzenie kilku mRNA w wyniku transkrypcji tego samego genu. Warianty splicingowe mogą kodować polipeptydy o zmienionej sekwencji aminokwasowej. Określenie wariant splicingowy stosuje się w niniejszym dokumencie także do opisania białka kodowanego przez wariant splicingowy mRNA w wyniku transkrypcji genu.

Ciężary cząsteczkowe i długości polimerów określanych przez nieprecyzyjne metody analityczne (np. elektroforezę żelową) są rozumiane jako wartości przybliżone. Jeśli taka wartość jest wyrażana jako „około” X lub „w przybliżeniu” X, wyrażana wartość X jest rozumiana jako dokładna do ± 10%.

Niniejszy wynalazek opiera się częściowo na odkryciu nowej sekwencji DNA, która koduje białko, mające strukturę cytokiny z wiązką czterech helis. Poprzez procesy klonowania, testy proliferacji i badania wiązania opisane szczegółowo w niniejszym dokumencie, zidentyfikowano sekwencję polinukleotydową kodującą nowy polipeptyd liganda, który jest ligandem o wysokiej specyficzności wobec wcześniej osieroconego receptora zalpha11. Ten ligand polipeptydowy, oznaczony jako ligand zalpha11, izolowano z biblioteki cDNA utworzonej z aktywowanych ludzkich komórek krwi obwodowej (hPBC), które wybierano pod względem CD3. CD3 jest markerem na powierzchni komórki, który występuje powierzchniowo-komórkowym wyłącznie na komórkach pochodzenia limfoidowego, szczególnie komórkach T.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest izolowany polipeptyd zawierający sekwencję reszt aminokwasowych, która jest

a) co najmniej w 90% identyczna z resztami 41 (Gln) do 148 (Ile), jak ukazano w SEQ ID Nr: 2, przy czym reszta w pozycji 44 oznacza Asp, reszta w pozycji 47 oznacza Asp i reszta w pozycji 135 oznacza Glu, a reszty aminokwasowe 71, 78, 122 i 125 oznaczają cysteinę; lub

b) jest co najmniej w 90% identyczna z resztami 32 (Gln) do 162 (Ser) jak ukazano w SEQ ID Nr: 2, przy czym polipeptyd wiąże receptor zalfa11 jak ukazano w SEQ ID nr: 115.

W korzystnym rozwiązaniu izolowanego polipeptydu według wynalazku w odniesieniu do powyżej opisanego punktu la, sekwencja reszt aminokwasowych jest co najmniej w 95% identyczna z SEQ ID Nr: 2, od reszty 41 (Gln) do 148 (Ile).

Bardziej korzystnie, sekwencja reszt aminokwasowych jest w 100% identyczna z SEQ ID Nr: 2, od reszty 41 (Gln) do 148 (Ile).

W innym również korzystnym rozwiązaniu polipeptydu według wynalazku, w odniesieniu do 1b, sekwencja reszt aminokwasowych jest co najmniej w 95% identyczna z resztami 32 (Gln) do 162 (Ser) jak ukazano w sekwencji SEQ ID Nr: 2.

Bardziej korzystnie sekwencja reszt aminokwasowych jest taka jak pokazano w SEQ ID Nr: 2, od reszty 1 (Met) do reszty 162 (Ser).

Najkorzystniej sekwencja reszt aminokwasowych jest jak pokazano w SEQ ID Nr: 2 od reszty 32 (Gln) do reszty 162 (Ser).

PL 207 350 B1

Przedmiotem wynalazku jest również izolowany polipeptyd zawierający sekwencję reszt aminokwasowych jaką pokazano w SEQ ID Nr: 56 od reszty 23 (Gln) do reszty 146 (Ser), przy czym polipeptyd ten wiąże receptor zalfa11 jak pokazano w SEQ ID Nr: 115.

W korzystnym rozwiązaniu izolowanego polipeptydu według wynalazku, sekwencja reszt aminokwasowych, pokazana w SEQ ID Nr: 56 oznacza resztę 1 (Met) do reszty 146 (Ser).

Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka izolowanego polinukleotydu zawierająca sekwencję nukleotydów, która koduje polipeptyd zdefiniowany powyżej.

Korzystnym rozwiązaniem jest cząsteczka izolowanego polinukleotydy, w której nukleotydy są takie jak ukazano w SEQ ID Nr: 1, od nukleotydu 167 do nukleotydu 490 lub jak ukazano w SEQ ID Nr: 3, od nukleotydu 121 do nukleotydu 444.

Jeszcze bardziej korzystnie cząsteczka izolowanego polinukleotdu posiada nukleotydy takie jak pokazano w SEQ ID Nr: 1, od nukleotydu 140 do nukleotydu 532 lub jak pokazano w SEQ ID Nr: 3, od nukleotydu 94 do nukleotydu 486.

Bardziej korzystnie, cząsteczka izolowanego polinukleotydu posiada nukleotydy takie jak pokazano w SEQ ID Nr: 1, od nukleotydu 47 do nukleotydu 532 lub jak pokazano w SEQ ID Nr: 3, od nukleotydu 1 do nukleotydu 486.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wykrywania obecności RNA liganda zalpha11 w próbce biologicznej, polegający na tym, że obejmuje następujące etapy:

(a) zetknięcie sondy kwasu nukleinowego liganda zalpha11 w warunkach hybrydyzujących z albo (i) testowymi cząsteczkami RNA izolowanymi z próbki biologicznej, albo (ii) cząsteczkami kwasu nukleinowego syntetyzowanymi z izolowanych cząsteczek RNA, przy czym sonda posiada cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd jak zdefiniowano w zastrz. 6 lub 8 lub jej uzupełnienie; oraz (b) wykrywanie tworzenia hybryd sondy kwasu nukleinowego i albo testowych cząsteczek RNA albo syntetyzowanych cząsteczek kwasu nukleinowego, przy czym obecność hybryd wskazuje na obecność RNA liganda zalpha11 w próbce biologicznej i przy czym ligand zalfa11 jest polipeptydem jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało, które specyficznie wiąże się z ligandem polipeptydowym zalfha11, gdzie polipeptyd ten jest wybrany z:

a) polipeptydu stanowiącego sekwencję aminokwasową SEQ ID Nr: 2 od aminokwasu o numerze 41 (Gln) do aminokwasu o numerze 148 (Ile);

b) polipeptydu stanowiącego sekwencję aminokwasową SEQ ID Nr: 2 od aminokwasu o numerze 32 (Gln) do aminokwasu o numerze 162 (Ser);

c) polipeptydu stanowiącego sekwencję aminokwasową SEQ ID Nr: 2 od aminokwasu o numerze 1 (Met) do aminokwasu o numerze 162 (Ser).

Wynalazek dotyczy także sposobu wykrywania obecności polipeptydu, który zdefiniowano powyżej, w próbce biologicznej polegający na tym, że obejmuje następujące etapy:

(a) zetknięcia próbki biologicznej z przeciwciałem, lub fragmentem przeciwciała zdefiniowanym powyżej, przy czym zetknięcie przeprowadza się w warunkach, które pozwalają na wiązanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała z próbką biologiczną oraz (b) wykrywania jakiegokolwiek związanego przeciwciała lub związanego fragmentu przeciwciała.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji zawierającej polipeptyd jak zdefiniowano powyżej do wytwarzania leku do leczenia chorób wynikających z uszkodzeń układu immunologicznego.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji zawierającej polipeptyd jak zdefiniowano powyżej do wytwarzania leku do stymulowania odpowiedzi immunologicznej u ssaka poddanego działaniu antygenu lub patogenu, przy czym w zastosowaniu tego leku poziom antygenu lub patogenu obecnego u wspomnianego ssaka jest porównywane przed i po podaniu tego leku, przy czym zmiana w poziomie jest wskaźnikiem stymulowania odpowiedzi immunologicznej.

W korzystnym wykonaniu, zastosowania antygenem jest nowotwór komórki B, wirus, pasożyt lub bakteria.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu zdefiniowanego powyżej do rozprzestrzeniania komórek krwiotwórczych i prekursorów komórek krwiotwórczych in vitro, które to zastosowanie obejmuje hodowanie komórek szpiku kostnego lub krwi obwodowej z kompozycją, zawierającą ilość polipeptydu wystarczającą, aby wytworzyć wzrost liczby komórek limfoidalnych w szpiPL 207 350 B1 ku kostnym lub komórek krwi obwodowej, w porównaniu z komórkami szpiku kostnego lub krwi obwodowej hodowanymi przy braku polipeptydu zdefiniowanego powyżej.

W korzystnym wykonaniu tego zastosowania, komórkami krwiotwórczymi i prekursorami komórek krwiotwórczych są limfocyty. Bardziej korzystnie są to limfocyty, które są komórkami NK lub cytotoksycznymi komórkami T. Również w innym korzystnym rozwiązaniu zastosowania według wynalazku, kompozycja zawiera także co najmniej jedną inną cytokinę wybraną z grupy obejmującej IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligand Flt3 i czynnik komórki macierzystej.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu jak zdefiniowano powyżej do wytwarzania leku do leczenia nowotworu komórki B lub T, przez zmniejszania proliferacji nowotworowych komórek B lub T. Korzystnie lek zawiera także co najmniej jedną inną cytokinę wybraną z grupy obejmującej IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligand Flt3 lub czynnik komórki macierzystej.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kompozycji zawierającej polipeptyd jak zdefiniowano powyżej do wytwarzania leku do stymulowania odpowiedzi immunologicznej u ssaka narażonego na działanie antygenu lub patogenu, przy czym w zastosowaniu tego leku poziom specyficznego przeciwciała wobec tego antygenu lub patogenu obecnego u wspomnianego ssaka jest porównywane przed i po podaniu tego leku, przy czym zmiana w poziomie przeciwciała jest wskaźnikiem stymulowania odpowiedzi immunologicznej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu jak zdefiniowano powyżej do wytwarzania leku do leczenia raka. W zastosowaniu tym korzystnie wspomniany polipeptyd ma 95% identyczność do sekwencji reszt aminokwasowych zawierających sekwencję ukazaną jako SEQ ID Nr: 2 od reszty 32 do 162; a bardziej korzystnie wspomniany polipeptyd zawiera sekwencję reszt aminokwasowych zawierających sekwencję ukazaną jako SEQ ID Nr: 2 od reszty 32 do 162.

Korzystnie według zastosowania według wynalazku lek jest do leczenia proliferacji nowotworowych komórek B lub T, ewentualnie do leczenia białaczki, przy czym wspomniany polipeptyd jest w postaci fuzji białka i saporyny; lub ewentualnie do leczenia chłoniaka, przy czym wspomniany polipeptyd jest w postaci fuzji białka i saporyny.

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd jak zdefiniowano powyżej do zastosowania w medycynie.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor ekspresji zawierający następujące elementy połączone operacyjnie:

(a) promotor transkrypcji;

(b) segment DNA, kodujący polipeptyd jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 8; oraz (c) terminator transkrypcji.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka hodowana zawierająca wektor ekspresji, jak zdefiniowano powyżej.

Kolejno, przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania białka, polegający na tym, że obejmuje hodowanie komórki według wynalazku jak zdefiniowano powyżej w warunkach w których segment DNA jest poddany ekspresji; i odzyskiwanie białka kodowanego przez ten segment DNA.

W przedstawionych poniżej przykładach, do skriningu pod względem źródła cDNA kodującego ligand zalpha11 stosowano linię komórkową zależną od szlaku związanego z sierocym receptorem zalpha11, pod względem przeżycia i wzrostu przy braku innych czynników wzrostu. Zalecaną linią komórkową zależną od czynnika wzrostu, którą stosowano do transfekcji i ekspresji receptora zalpha11 była BaF3 (Palacios i Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot i inni. Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). Jednak inne linie komórkowe zależne od czynnika wzrostu, takie jak FDC-Pl (Hapel i inni, Blood 64: 786-790, 1984) oraz M07e (Kiss i inni. Leukemia 7: 235-240, 1993) są odpowiednie do tego celu.

Sekwencja aminokwasową dla receptora zalpha11 wskazywała, że kodowany receptor należał do klasy I podrodziny receptora cytokinowego, która obejmuje, lecz bez ograniczenia, receptory dla IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF i G-CSF (praca przeglądowa zobacz Cosman, „The Hematopoietin Receptor Superfamily” w Cytokine 5 (2): 95-106, 1993). Receptor zalpha11 został w pełni opisany we wspólnym zgłoszeniu patentowym PCT nr US99/22149. Analiza rozmieszczenia mRNA receptora zalpha11 w tkankach wykazała ekspresję w węźle chłonnym, leukocytach krwi obwodowej (PBL), śledzionie, szpiku kostnym i grasicy. Ponadto mRNA był powszechny w linii komórkowej Raji (ATCC No. CCL-86) otrzymanej z chłoniaka Burkitta.

Rozmieszczenie receptora w tkankach sugeruje, że celem dla przewidywanego liganda zalpha11 jest ród komórek krwiotwórczych, w szczególności progemtorowych komórek limfoidowych i komórek limfoidowych. Inne znane cytokiny z wiązką czterech helis, które oddziałują na komórki

PL 207 350 B1 limfoidowe, obejmują IL-2, IL-4, IL-7 i IL-15. Przegląd cytokiny z wiązką czterech helis, patrz Nicola i inni, Advances in Protein Chemistry 52: 1-65, 1999 oraz Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76: 300-317, 1998.

Kondycjonowane pożywki (CM) od stymulowanych PMA jonomycyną wybranych pod względem CD3 ludzkich komórek krwi obwodowej podtrzymywały wzrost komórek BaF3, które wykazywały ekspresję receptora zalpha11, a z drugiej strony były zależne od IL-3. Kondycjonowane pożywki z komórek, które nie były: 1) stymulowane PMA/jonomycyną; lub nie były: 2) wybrane pod względem CD3 (ze stymulacją PMA/jonomycyną lub bez) nie podtrzymywały wzrostu komórek BaF3/receptora zalpha11. Doświadczenia kontrolne pokazały, że tej aktywności proliferacyjnej nie można było przypisać innym znanym czynnikom wzrostu oraz że zdolność takich kondycjonowanych pożywek do stymulacji proliferacji komórek z ekspresją receptora zalpha11 nie mogła być zneutralizowana przez rozpuszczalną postać receptora.

Proliferację komórek z ekspresją receptora zalpha11 BaF3 poddanych ekspozycji na CM od wybranych CD3 pod względem stymulowanych PMA/jonomycyną ludzkich komórek krwi obwodowej identyfikowano przez wzrokowy przegląd hodowli i/lub przez test proliferacji. W technice znanych jest wiele odpowiednich testów proliferacji, które obejmują testy redukcji barwnika, takiego jak alamarBlue™ (AccuMed International, Inc. Westlake, Ohio), bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolium (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983); 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-5-3-karboksymetoksyfenylo-2H-tetrazolium; wodorotlenek 2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-5-[(fenyloamino)karbonylo]-2H-tetrazolium i chlorek cyjanoditolilotetrazolium (dostępne w sprzedaży w Polysciences, Inc., Warrington, PA); testy mitogenezy, takie jak pomiar wprowadzenia 3H-tymidyny; testy wykluczania barwnika przy użyciu np. czerni naftalenowej lub błękitu trypanowego; wychwytu barwnika przy użyciu diacetylofluoresceiny oraz uwalniania chromu. Patrz ogólnie, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, wydanie 3, Wiley-Liss, 1994, które załącza się w niniejszym dokumencie przez odniesienie.

Bibliotekę cDNA wytworzono z wybranych pod względem CD3, stymulowanych PMA i jonomycyną pierwotnych ludzkich komórek krwi obwodowej. Bibliotekę cDNA wybranych pod względem z CD3, stymulowanych PMA i jonomycyną ludzkich komórek krwi obwodowej} dzielono na zbiory zawierające różne cząsteczki cDNA i transfekowano do linii komórek gospodarza, np. komórek BHK 570 (ATCC numer dostępowy 10314).

Transfekowane komórki gospodarza hodowano w pożywce, która nie zawierała egzogenicznych czynników wzrostu i wyodrębniono kondycjonowaną pożywkę. Kondycjonowane pożywki testowano pod względem zdolności do stymulacji proliferacji komórek BaF3 transfekowanych receptorem zalpha11. Identyfikowano zbiory cDNA wytwarzające kondycjonowane pożywki, które stymulowały komórki BaF3/receptor zalpha11. Połączony plazmidowy cDNA podawano metodą elektroporacji E. coli. cDNA izolowano z pojedynczych kolonii i transfekowano indywidualnie do komórek BHK 570. Klony pozytywne identyfikowano przez dodatni wynik w teście proliferacji BaF3/receptor zalpha11, a specyficzność testowano przez neutralizację proliferacji przy użyciu rozpuszczalnego receptora zalpha11.

Izolowano klony pozytywne, a analiza sekwencji ujawniała, że sekwencja polinukleotydowa zawarta w plazmidowym DNA była nowa. Sekwencja sygnałowa wydzielania składa się z reszt aminokwasowych 1 (Met) do 31 (Gly), a dojrzały peptyd składa się z reszt aminokwasowych 32 (Gln) do 162 (Ser) (jak pokazano w SEQ ID Nr: 2).

Ogólnie przewiduje się, że cytokiny mające strukturę poczwórnej helisy alfa, przy czym helisy A, C i D są najistotniejsze w interakcjach ligand-receptor i są silnie konserwatywne wśród członków rodziny. W odniesieniu do ludzkiej sekwencji aminokwasowej liganda zalpha11 pokazanej w SEQ ID Nr: 2, dopasowania sekwencji aminokwasowych ludzkiego liganda zalpha11, ludzkiej IL-15, ludzkiej IL-4 i ludzkiej GM-CSF przewiduje się, że helisę A liganda zalpha11 tworzą reszty aminokwasowe 41-56; helisę B tworzą reszty aminokwasowe 69-84; helisę C tworzą reszty aminokwasowe 92-105 i helisę D tworzą reszty aminokwasowe 135-148, jak pokazano w SEQ ID Nr: 2. Analiza strukturalna sugeruje, że pętla A/B jest długa, pętla B/C jest krótka, a pętla C/D jest równolegle długa. Ta struktura pętli powoduje organizację helikalną góra-góra-dół-dół.

Reszty cysteinowe są całkowicie konserwatywne między ligandem zalpha11 i IL-15, jak pokazano w fig. 1. Reszty cysteinowe, które są konserwatywne między IL-15 i ligandem zalpha11 odpowiadają resztom aminokwasowym 71, 78, 122 i 125 SEQ ID Nr: 2.

PL 207 350 B1

Konserwatywność niektórych reszt cysteinowych ma miejsce także w IL-2, IL-4, GM-CSF i ligandzie zalpha11 odpowiadającym resztom aminokwasowym 78 i 125 SEQ ID Nr: 2, jak pokazano na fig. 1. Zgodne umiejscowienie cysteiny jest dodatkowym potwierdzeniem struktury wiązki czterech helis. Silnie konserwatywna w rodzinie obejmującej IL-15, IL-2, IL-4, GM-CSF i ligand zalpha11 jest także sekwencja Glu-Phe-Leu co pokazano w SEQ ID Nr: 2 przy resztach 136-138, jak w fig. 1.

Dodatkowa analiza liganda zalpha11 na podstawie wielokrotnych dopasowań (jak pokazano na fig. 1) pozwala przewidywać, że reszty aminokwasowe 44, 47 i 135 (jak pokazano w SEQ ID Nr: 2) odgrywają istotną rolę przy wiązaniu liganda zalpha11 z jego pokrewnym receptorem. Ponadto przewidywana sekwencja aminokwasową mysiego liganda zalpha11 wykazuje 57% identyczności z przewidywanym białkiem ludzkim. Na podstawie porównania sekwencji ludzkiego i mysiego liganda zalpha11 silnie konserwatywne reszty znajdowano w regionach które jak przewidywano kodują helisy alfa A i D.

Odpowiednie polinukleotydy kodujące polipeptyd, regiony, domeny, motywy, reszty i sekwencje liganda zalpha11 opisywane w niniejszym dokumencie są takie, jak pokazano w SEQ ID Nr: 1.

Przeprowadzono szczegółową analizę mutacji dla IL-4 i IL-2, z których obie były wysoce spokrewnione z ligandem zalpha11. Analiza mysiej IL-2 (Żurawski i inni, EMBO J. 12: 5113-5119, 1993) wskazuje, że reszty w helisach A i C są istotne dla wiązania z IL-2Re; najważniejszymi resztami są ^Asp34 ^Asn90 ^{i Asn}103^.

Szereg reszty w mysiej pętli A/B IL-2 i helisie B jest istotny dla wiązania z IL-2Rα, podczas gdy tylko jedna reszta, Gln141 w helisie D, jest istotna dla wiązania z IL-2Rα.

Podobnie helisy A i C są miejscami interakcji między IL-4 i IL-4Rα (strukturalnie podobnymi do IL-2Rα), a reszty w helisie D są istotne dla interakcji IL-2Rα (Wang i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1657-1662, 1997; Kruse i inni, EMBO J. 11: 3237-3244, 11992). W szczególności mutacja Tyrl24 do Asp w ludzkiej IL-4 tworzy antagonistę, który wiąże się z IL-4Rα, lecz nie z IL-2Rα, a zatem nie może przekazywać sygnału (Kruse i inni, tamże, 1992).

Choć helisa A jest stosunkowo dobrze konserwatywna między ludzkim i mysim ligandem zalpha11, helisa C bardziej się różni. Choć oba rodzaje mają głównie aminokwasy kwasowe w tym regionie, różnice mogą determinować specyficzność rodzajową w interakcjach między ligandem zalpha11 a jego typem „beta” receptora, zalpha11.

Pętla A/B oraz helisa B liganda zalpha11 są silnie konserwatywne między gatunkami; chociaż nie zidentyfikowano dotąd podjednostki receptora odpowiadającej IL-2Rα, konserwacja w tym regionie sugeruje, że jest on funkcjonalnie znaczący. Helisy D ludzkiego i mysiego liganda zalpha11 są także silnie konserwatywne.

Antagonistów receptora zalpha11 można zaprojektować przez mutacje wewnątrz helisy D liganda zalpha11. Mogą one obejmować skrócenie białka od reszty Gln145, (SEQ ID Nr: 2) lub mutacje Gln145; lub Ile148 (z SEQ ID Nr: 2; odpowiadające Tyr124 w ludzkiej IL-4) na reszty takie jak Ala lub Asp. Każda mutacja, która zakłóca strukturę helikalną liganda zalpha11 może znieść wiązanie z jego receptorem, a więc hamować sygnał. Cytokiny z wiązką 4 helis grupuje się także ze względu na długość ich helis składowych. Postać cytokiny „o długich helisach” zasadniczo zawiera helisy o długości między 24-30 reszt i obejmuje IL-6, rzęskowy czynnik neutrotropowy (CNTF), czynnik hamujący białaczkę (LIF) i ludzki hormon wzrostu (hGH). Postać cytokiny „o krótkich helisach” zasadniczo zawiera helisy o długości 18-21 reszt i obejmuje IL-2, IL-4 oraz GM-CSF.

Uważa się, że ligand zalpha11 jest nowym członkiem grupy postaci cytokin o krótkiej helisie. Badania przy użyciu CNTF i IL-6 pokazują, że helisę CNTF można wymienić na równoważną helisę w IL-6, nadającą właściwości wiązania CTNF z chimerą.

Tak więc, okazuje się, że domeny funkcjonalne cytokin czterohelikalnych wynikają z homologii strukturalnej, bez względu na identyczność sekwencji i mogą one zachowywać integralność funkcjonalną w chimerze (Kallen i inni, J. Biol. Chem. 274: 11859-11867, 1999).

Zatem, helikalne domeny liganda zalpha11 będą użyteczne przy wytwarzaniu chimerycznych cząsteczek fuzyjnych, szczególnie z innymi postaciami cytokin o krótkich helisach, w celu określenia i modulowania specyficzności wiązania receptora.

Szczególnym zainteresowaniem cieszą się białka fuzyjne konstruowane z użyciem helisy A i/lub helisy D oraz białka fuzyjne, które łączą domeny helikalną i pętli od innej krótkiej postaci cytokiny, takiej jak IL-2, IL-4, IL-15 i GM-CSF.

Reszty aminokwasowe zawierające helisy A, B, C, i D oraz pętle A/B, B/C i C/D dla liganda zalpha11, IL-2, IL-4, IL-15 i GM-CSF przedstawiono w tablicy 1.

PL 207 350 B1

T a b l i c a 1

	Helisa A	Pętla A/B	Helisa B	Pętla B/C	Helisa C	Pętla C/D	Helisa D
Reszty liganda zalphall	41-56	57-68	69-84	85-91	92-105	106-134	135-148	SEQ ID Nr 2
Reszty IL-2	36-46	47-52	53-75	76-86	87-99	100-102	103-121	SEQ ID Nr 111
Reszty IL-4	29-43	44-64	65-83	84-94	95-118	119-133	134-151	SEQ ID Nr 112
Reszty IL-15	45-68	69-83	84-101	102-106	107-119	120-133	134-160	SEQ ID Nr 113
Reszty GM-CSF	30-44	45-71	72-81	82-90	91-102	103-119	120-131	SEQ ID Nr 114

Niniejszy wynalazek zastrzega cząsteczki polinukleotydowe, włączając cząsteczki DNA i RNA, które kodują ligand zalpha11 ujawniony w niniejszym dokumencie.

Specjaliści będą wiedzieć, że wobec zdegenerowania kodu genetycznego możliwa jest znaczna zmienność sekwencji pośród tych cząsteczek polinukleotydowych.

SEQ ID nr: 3 jest zdegenerowana sekwencją DNA, która obejmuje wszystkie DNA, kodujące polipeptyd zalpha11 z SEQ ID nr: 2.

Specjaliści będą wiedzieć, że zdegenerowana sekwencja z SEQ ID nr: 3 obejmuje także wszystkie sekwencje RNA polinukleotydy kodujące ligand zalpha11, obejmujące nukleotyd 1 lub 97 do nukleotydu 486 z SEQ ID nr: 4 i odpowiadające im RNA, są objęte niniejszym wynalazkiem.

Tablica 2 pokazuje jednoliterowy kod stosowany w SEQ ID nr: 3 tablica 3 do opisania pozycji zdegenerowanych nukleotydów.

„Rozróżnienia” oznaczają nukleotydy wskazywane przez litery kodu.

„Uzupełnienie” wskazuje kod dla nukleotydu (nukleotydów) komplementarnego.

Przykładowo, kod Y opisuje albo C albo T, a jego sekwencję komplementarną R opisuje A lub G, przy czym A jest komplementarne w stosunku do T i G jest komplementarne w stosunku do C.

T a b l i c a 2

Nukleotyd	Rozróżnienie	Uzupełnienie	Rozróżnienie
A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	A/G	Y	C/T
Y	C/T	R	A/G
M	A/C	K	G/T
K	G/T	M	A/C
S	C/G	S	C/G
W	A/T	W	A/T
H	A/C/T	D	A/G/T
B	C/G/T	V	A/C/G
V	A/C/G	B	C/G/T
D	A/G/T	H	A/C/T
D	A/G/T	H	A/C/T
N	A/C/G/T	N	A/C/G/T

Zdegenerowane kodony stosowane w SEQ ID nr: 3, obejmujące wszystkie możliwe kodony dla danego aminokwasu, przedstawiono w tablicy 3.

PL 207 350 B1

T a b l i c a 3

Aminokwas	Kod jednoliterowy	Kodony	Kodony zdegenerowane
Cys	C	TGT TGT	TGY
Ser	S	AGC ACT TCA TCC TCG TCT	WSN
Aminokwas	Kod jednoliterowy	Kodony	Kodony zdegenerowane
Thr	T	ACAACCACGACT	ACN
Pro	P	CCA CCC CCC CCT	CCN
Ala	A	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
Asn	N	AACAAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY
Glu	E	GAAGAG	GAR
Gln	Q	CAACAG	CAR
His	H	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	AAAAAG	AAR
Met	M	ATG	ATG
Ile	I	ATAATCATT	ATH
Leu	L	CTA CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTCTTT	TTY
Tyr	Y	TAC TAT	TAY
Trp	W	TGG	TGG
Ter	•	TAA TAG TGA	TRR
Asn/Asp	B		RAY
Glu/Gln	Z		SAR
Każdy	X		NNN

Specjalista będzie wiedział, że przy wprowadzaniu kodonu zdegenerowanego wprowadza się pewną dwuznaczność, reprezentatywną dla wszystkich możliwych kodonów, kodujących każdy aminokwas. Przykładowo, zdegenerowany kodon dla seryny (WSN) może w pewnych okolicznościach, kodować argininę (AGR), a zdegenerowany kodon dla argininy (MGN), może w pewnych okolicznościach, kodować serynę (AGY).

Podobne związki istnieją między kodonami kodującymi fenyloalaninę i leucynę. Tak więc niektóre polinukleotydy objęte zdegenerowana sekwencją mogą kodować odmienne sekwencje aminokwasowe, lecz specjalista może łatwo zidentyfikować takie odmienne sekwencje przez odniesienie do sekwencji aminokwasowej z SEQ ID nr: 2. Sekwencje odmienne można łatwo badać pod względem funkcjonalności, jak opisano w niniejszym dokumencie.

Specjalista będzie ponadto wiedział, że różne gatunki mogą wykazywać „preferencyjne wykorzystanie kodonu”. Ogólnie zobacz Grantham i inni, Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas i inni Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson i inni, Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean i Fiers, Gene 18; 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982.

Stosowane w niniejszym dokumencie określenie „preferencyjne wykorzystanie kodonu” lub „kodony preferencyjne” jest określeniem technicznym odnoszącym się do kodonów translacyjnych białka, które są najczęściej wykorzystywane w komórkach pewnych gatunków, faworyzując w ten sposób

PL 207 350 B1 jednego lub kilku przedstawicieli wszystkich możliwych kodonów kodujących każdy aminokwas (zobacz tablica 3). Przykładowo, aminokwas treonina (Thr) może być kodowany przez AGA, ACC, ACG lub ACT, lecz w komórkach ssaków najczęściej wykorzystywanym kodonem jest ACC; u innych gatunków, np. w komórkach owadów, drożdży, wirusów lub bakterii, różne kodony Thr mogą być preferowane. Preferowane kodony dla poszczególnych gatunków można wprowadzić do polinukleotydów według niniejszego wynalazku różnymi metodami znanymi w tej dziedzinie. Wprowadzenie sekwencji preferowanego kodonu do rekombinowanego DNA może np. zwiększyć wytwarzanie białka przez poprawienie skuteczności translacji białka w danym typie komórki lub gatunku. Zatem sekwencja zdegenerowanego kodonu ujawniona w SEQ ID nr: 3 służy jako matryca do optymalizacji ekspresji polinukleotydów w różnych typach komórek i gatunkach zwykle stosowanych w tej dziedzinie i ujawnionych w niniejszym dokumencie. Sekwencje zawierające preferencyjne kodony można badać i optymalizować pod względem ekspresji u różnych gatunków, oraz badać pod względem funkcjonalności, jak ujawniono w niniejszym dokumencie.

Jak zauważono wcześniej, izolowane polinukleotydy według niniejszego wynalazku obejmują DNA i RNA. Metody wytwarzania DNA i RNA są dobrze znane w tej dziedzinie. Ogólnie, RNA izoluje się z tkanki lub komórki, która wytwarza znaczne ilości RNA liganda zalpha11. Takie tkanki i komórki identyfikuje się metodą northern blotting (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980) lub przez skrining kondycjonowanej pożywki od różnych rodzajów komórek pod względem aktywności wobec docelowych komórek lub tkanek.

Po zidentyfikowaniu aktywności lub komórek albo tkanek wytwarzających RNA, całkowity RNA można wyodrębnić stosując ekstrakcję izotiocyjanianem guanidyny, a następnie izolację przez wirowanie w gradiencie CsCl (Chirgwin i inni, Biochemistry 18: 52-94, 1979). RNA poly (A)⁺ wytwarza się z całkowitego RNA stosując sposób według Aviv i Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-12, 1972). Komplementarny DNA (cDNA) wytwarza się z RNA poły(A)⁺ stosując znane metody. Alternatywnie, można izolować genomowy DNA. Następnie polinukleotydy kodujące polipeptydy liganda zalpha11 identyfikuje się i izoluje np. przez hybrydyzację lub PGR.

Klon pełnej długości kodujący ligand zalpha11 można otrzymać za pomocą konwencjonalnych metod klonowania. Zalecane są klony komplementarnego DNA (cDNA), choć dla niektórych zastosowań (np. ekspresja u zwierząt transgenicznych) korzystne może być stosowanie klonu genomowego lub modyfikacja klonu cDNA, aby zawierała co najmniej jeden intron genomowy. Metody wytwarzania cDNA i klonów genomowych są dobrze znane i mieszczą się w zakresie umiejętności specjalisty i obejmują stosowanie sekwencji ujawnionej w niniejszym dokumencie, lub jej części, do sondowania lub primingu biblioteki. Biblioteki ekspresyjne można sondować z użyciem przeciwciał wobec fragmentów receptora zalpha11 lub innych specyficznych partnerów wiązania.

Ujawnione w niniejszym dokumencie sekwencje polinukleotydowe liganda zalpha11 można także stosować jako sondy lub startery do klonowania regionów nie kodujących 5' genu liganda zalpha11. Pod względem ekspresji specyficznej dla tkanki obserwowanej dla liganda zalpha11, ten region genu, jak się oczekuje, zapewnia ekspresję specyficzną dla krwiotworzenia i limfoidu. Zatem elementy promotora z genu liganda zalpha11 można by stosować do kierowania ekspresji genów heterologicznych specyficznej wobec tkanki, np. u zwierząt transgenicznych lub pacjentów poddawanych terapii genowej. Klonowanie sekwencji oskrzydlających 5' także ułatwia wytwarzanie białek liganda zalpha11 przez „aktywację genu”, jak ujawniono w opisie patentowym US nr 5 641 670. W skrócie, ekspresję endogenicznego genu liganda zalpha11 w komórce zmienia się przez wprowadzenie do locus liganda zalpha11 konstrukcji DNA obejmującej co najmniej sekwencję celującą, sekwencję regulatorową, egzon oraz nie sparowane miejsce donorowo dla splicingu.

Sekwencją celującą jest sekwencja nie kodująca 5' liganda zalpha11, która pozwala na rekombinację homologiczną konstrukcji z endogenicznym locus liganda zalpha11, przez co sekwencję wewnątrz konstrukcji stają się operacyjnie związane z endogeniczną sekwencją kodującą liganda zalpha11. W ten sposób endogeniczny promotor liganda zalpha11 można zastąpić lub uzupełnić innymi sekwencjami regulatorowymi, aby zapewnić polepszoną, specyficzną dla tkanki lub w inny sposób regulowaną ekspresję.

Niniejszy wynalazek dodatkowo ujawnia odpowiadające polipeptydy i polinukleotydy od innych gatunków (ortologi). Gatunki te obejmują, lecz nie ograniczają się do ssaków, ptaków, płazów, gadów, ryb, owadów i innych gatunków kręgowców i bezkręgowców. Szczególnie interesujące są polipeptydy liganda zalpha11 od innych gatunków ssaków, włączając polipeptydy mysie, świńskie, owcze, bydlęce, psie, kocie, końskie, i innych naczelnych. Ortologi ludzkiego liganda zalpha11 można klonować

PL 207 350 B1 stosując informacje i kompozycje podane w niniejszym wynalazku w połączeniu z konwencjonalnymi technikami klonowania. Przykładowo, cDNA można klonować stosując mRNA otrzymany z rodzajów tkanek lub komórek, które wykazują ekspresję liganda zalpha11, jak ujawniono w niniejszym dokumencie. Odpowiednie źródła mRNA można identyfikować przez sondowanie odcisków northern sondami zaprojektowanymi z sekwencji, jakie ujawniono w niniejszym dokumencie. Następnie wytwarza się bibliotekę z mRNA dodatniej tkanki lub linii komórkowej.

Następnie można izolować cDNA kodujący zalpha11 różnymi metodami, takimi jak sondowanie z użyciem pełnego lub częściowego ludzkiego cDNA lub z użyciem jednego lub więcej zbiorów zdegenerowanych sond na bazie ujawnionych sekwencji. cDNA można także klonować stosując reakcję łańcuchową polimerazy, czyli PCR (Mullis, opis patentowy US nr 4 683 202), wykorzystując startery zaprojektowane z reprezentatywnej ludzkiej sekwencji liganda zalpha11, ujawnionej w niniejszym dokumencie.

W innej metodzie można stosować bibliotekę cDNA do transformowania lub transfekcji komórek gospodarza, zaś ekspresję badanego cDNA można wykrywać z użyciem przeciwciał wobec polipeptydu liganda zalpha11, badań wiązania lub testów aktywności. Podobne techniki można także stosować do izolacji klonów genomowych.

Sekwencję polinukleotydową dla mysiego ortologa liganda zalpha11 zidentyfikowano i została ona przedstawiona w SEQ ID Nr: 55, zaś odpowiednia sekwencja aminokwasową pokazana jest w SEQ ID Nr: 56. Istnieje 62% identyczności między sekwencją mysią i ludzką w regionie zawierającym 124 aminokwasów, który odpowiada resztom 30 do 153 w SEQ ID Nr: 2 i resztom 23 do 146 w SEQ ID Nr: 56 liganda zalpha11.

Dojrzała sekwencja mysiego liganda zalpha11 przypuszczalnie rozpoczyna się przy His18 (jak pokazano w SEQ ID Nr: 56), co odpowiada His25 (jak pokazano w SEQ ID Nr: 2) w sekwencji ludzkiej.

Ponieważ skrócona postać ludzkiego polipeptydu jest aktywna, jest prawdopodobne, że równoważny polipeptyd mysiego liganda zalpha11 (czyli bez reszt His18 do Pro22 SEQ ID Nr: 56) jest także aktywny. Analiza tkankowa ujawniła, że ekspresja mysiego liganda zalpha11 występuje w jądrze, śledzionie i grasicy.

Specjalista będzie wiedział, że sekwencja ujawniona w SEQ ID nr: 1 przedstawia pojedynczy allel ludzkiego liganda zalpha11 oraz jak się oczekuje, wystąpi wariant alleliczny oraz alternatywny splicing. Warianty alleliczne sekwencji DNA można klonować przez sondowanie cDNA lub bibliotek genomowych od różnych osobników zgodnie ze standardowymi procedurami. Warianty alleliczne sekwencji DNA pokazanej w SEQ ID nr: 1, łącznie z tymi, które zawierają ciche mutacje i tymi, w których mutacje powodują zmiany sekwencji aminokwasowej, wchodzą w zakres niniejszego wynalazku, a także białka, które są wariantami allelicznymi SEQ ID nr: 2. cDNA wytworzone z alternatywnie składanych mRNA, które zachowują właściwości polipeptydu liganda zalpha11 wchodzą w zakres niniejszego wynalazku, jak również polipeptydy kodowane przez ich cDNA i mRNA. Warianty alleliczne i warianty splicingowe tych sekwencji można klonować przez sondowanie cDNA lub bibliotek genomowych od różnych osobników lub tkanek zgodnie ze standardowymi procedurami znanymi w tej dziedzinie.

Gen liganda zalpha11 zmapowano do markera SHGC-12342 zrębu IL-2, pozycjonując ligand zalpha11 około 180 kb od markera IL-2. Stosowanie otaczających markerów pozycjonuje gen liganda zalpha11 w regionie 4q27 na zintegrowanej mapie LDB chromosomu 4 (The Genetic Location Database, University of Southhampton). Niniejszy wynalazek obejmuje także odczynniki, które znajdują zastosowanie w diagnostyce. Przykładowo, gen liganda zalpha11, sondę obejmująca DNA lub RNA liganda zalpha11 albo ich podsekwencję, można użyć do określania, czy gen liganda zalpha11 jest obecny na ludzkim chromosomie, takim jak chromosom 4, albo czy wystąpiła mutacja genowa. Na podstawie odczytania o fragmentu ludzkiego genomowego DNA zawierającego część genomowego DNA liganda zalpha11 (Genbank nr dostępu. AC007458) stwierdzono, że ligand zalpha11 jest położony w regionie 4q27 chromosomu 4.

Wykrywalne aberacje chromosomowe przy locus genu liganda zalpha11 obejmują, lecz bez ograniczenia, aneuploidię, zmiany liczby kopii genotypów, utratę heterogeniczności (LOH), translokacje, insercje, delecje, zmiany i przeszeregowania miejsc restrykcyjnych.

Takie aberacje można wykrywać przy użyciu polinukleotydów według niniejszego wynalazku, wykorzystując techniki genetyki molekularnej, takie jak analiza długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), analiza krótkiego powtórzenia tandemowego (STR) wykorzystująca techniki PCR oraz inne

PL 207 350 B1 techniki analizy powiązań genetycznych znanych w technice (Sambrook i inni, jak wyżej; Ausubel i inni, jak wyżej; Marian, Chest 108:255-65, 1995).

Dokładna wiedza o pozycji genu może być użyteczna dla wielu celów, w tym: 1) określanie, czy sekwencja jest częścią istniejącego sąsiedztwa i otrzymywanie dodatkowych otaczających sekwencji genetycznych w różnych postaciach, takich jak YAC, BAC lub klony cDNA; 2) określenie możliwego genu kandydującego dla chorób dziedzicznych, który wykazuje powiązanie z tym samym regionem chromosomowym; oraz 3) określenie odnośnego organizmu modelowego, takiego jak mysz, który może pomóc przy określaniu jaką funkcje może pełnić dany gen.

Jak stwierdzono wcześniej, ludzki gen liganda zalpha11 leży obok genu IL-2, który znajduje się w regionie wewnętrznym chromosomu 4q, który jak się okazuje, posiada powiązanie z podatnością na zapalenie jelit (IBD) (w tym chorobę Crohna (CD) i owrzodzenie wrzodziejące zapalenie jelita grubego) w pewnych rodzinach (Hampe i inni 7\m. J. Hum. Genet. 64: 808-816, 1999; Cho i inni Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 7502-7507, 1998). Poza tym gen receptora zalpha11 mapuje się do 16pll, innego regionu genomowego, który jest związany z podatnością na CD (Hugot i inni. Nature 379: 821-823. 1996: Ohmen i inni, Hum. Mol. Genet. 5: 1679-1683, 1996). CD jest przewlekłym zapaleniem jelit z częstymi powiązaniami układowymi; choć dokładna etiologia jest nieznana, dysfunkcja immunoregulatorowa obejmująca niemożność tolerancji zwykłych antygenów jelitowych, jest głównym elementem (przegląd patrz Braegger i inni, Annals Allergy 72: 135-141, 1994; Sartor. Am. J. Gastroenterol. 92: 5S-11S, 1997)). W kilku badaniach odkryto nieprawidłową aktywność NK u pacjentów z CD (patrz np. (Egawa i inni, J. Glin. Lab. Immunol. 20: 187-192, 1986; Aparicio-Pages i inni J. Glin. Lab. Immunol. 29: 119-124, 1989; van Tol i inni, Scand. J. Gastroenterol. 27: 999-1005, 1992)) oraz udokumentowano tworzenie nieprawidłowych komórek B pamięci (Brogan i inni, J. Glin. Lab. Immunol. 24: 69-74, 1987). Ponieważ ligand zalpha11 odgrywa rolę w regulacji odporności i ponieważ geny zarówno dla receptora jak i liganda leżą w regionach podatności na CD, zarówno receptor jak i ligand są genami kandydującymi dla genetycznej predyspozycji do choroby Crohna.

Powiązanie receptora zalpha11 i/lub liganda zalpha11 z patologią IBD można określić kilkoma metodami. Sekwencjonowanie egzonów z genomowego DNA może ujawnić mutacje kodowania (w tym mutacje zmiany sensowne, nonsensu, przesunięcia ramki odczytu), jak również sekwencjonowanie cDNA. Dodatkową zaletą sekwencjonowania z genomowego DNA jest to, że połączenia splicingu są także zawarte wewnątrz sekwencjonowanych fragmentów i mogą ujawnić nieprawidłowości splicingu, które mogą nie ujawnić się w próbkach cDNA, jeśli np. błędnie złożone RNA uległy szybkiej degradacji. Określono strukturę genomową liganda zalpha11. Inne metody analizy liganda zalpha11 i receptora u pacjentów z IBD obejmują:

(1) ocenę wytwarzania liganda z aktywowanych komórek T od pacjentów przeciwko kontroli prawidłowej (czyli przez biotest);

(2) hybrydyzację in situ RNA receptora zalpha11 lub liganda zalpha11 z wycinkami jelita z zapaleniem od pacjentów z IBD, w porównaniu z podobnymi wycinkami od kontroli prawidłowej;

(3) immunohistochemię na wycinkach od pacjentów z IBD przeciwko kontroli prawidłowej; oraz (4) ocenę odpowiedzi obwodowych komórek B pacjentów wobec liganda zalpha11, mierzonej w teście mitogenezy.

Diagnoza mogłaby pomóc lekarzowi w określaniu rodzaju choroby i odpowiedniej związanej terapii, lub pomagać w poradnictwie genetycznym. Jako takie, przeciwciała antyligand zalpha11 według wynalazku, polinukleotydy i polipeptydy można stosować do wykrywania polipeptydu liganda zalpha11, mRNA lub przeciwciał antyligand zalpha11, służąc więc jako markery i stosować bezpośrednio do wykrywania chorób genetycznych lub nowotworów, jakie opisano w niniejszym dokumencie, stosując metody znane w technice i opisane w niniejszym dokumencie. Dodatkowo sondy polinukleotydowe liganda zalpha11 można stosować do wykrywania nieprawidłowości obejmujących chromosom 4q27 jaki opisano w niniejszym dokumencie. Te nieprawidłowości mogą towarzyszyć chorobom człowieka, lub powstawaniu nowotworów, poronieniom samoistnym lub innym chorobom genetycznym. Dlatego sondy polinukleotydowe liganda zalpha11 można stosować do wykrywania nieprawidłowości lub genotypów związanych z tymi defektami.

Jak omówiono powyżej, defekty w samym genie liganda zalpha11 mogą powodować dziedziczny stan chorobowy człowieka. Cząsteczki według niniejszego wynalazku, takie jak polipeptydy, antagoniści, agoniści, polinukleotydy i przeciwciała według niniejszego wynalazku, mogą pomagać w wykrywaniu, diagnozie, zapobieganiu i leczeniu chorób związanych z defektem genetycznym liganda zalpha11. Poza tym sondy polinukleotydowe liganda zalpha11 można stosować do wykrywania różnic

PL 207 350 B1 allelicznych między osobnikami chorymi i nie chorymi w locus chromosomowym liganda zalpha11. Jako takie, sekwencje liganda zalpha11 można stosować jako środki diagnostyczne przy profilowaniu DNA w kryminalistyce.

Ogólnie, metody diagnostyczne stosowane w analizie powiązań genetycznych, do wykrywania nieprawidłowości lub aberracji u pacjenta są znane w technice. Większość metod diagnostycznych obejmuje etapy:

(i) otrzymywania próbki genetycznej od potencjalnie chorego pacjenta, chorego pacjenta lub potencjalnie nie chorego nośnika recesywnego allelu chorobowego;

(ii) wytwarzania pierwszego produktu reakcji przez inkubację próbki genetycznej z sondą polinukleotydową liganda zalpha11, w której polinukleotyd będzie hybrydyzować z komplementarną sekwencją polinukleotydową, np. w analizie RFLP lub przez inkubację próbki genetycznej z starterami sensownymi lub antysensownymi w reakcji PCR w odpowiednich warunkach dla reakcji PCR;

(iii) uwidocznienia pierwszego produktu reakcji przez elektroforezę żelową i/lub inne znane metody, takie jak uwidacznianie pierwszego produktu reakcji z użyciem sondy polinukleotydowej liganda zalpha11, w której polinukleotydy hybrydyzują z komplementarną sekwencją polinukleotydową z pierwszej reakcji i (iv) porównania uwidocznionego pierwszego produktu z drugim kontrolnym produktem reakcji próbki genetycznej od prawidłowego lub kontrolnego osobnika.

Różnica między pierwszym produktem reakcji, a kontrolnym produktem reakcji jest wskaźnikiem nieprawidłowości genetycznej u chorego lub potencjalnie chorego pacjenta albo obecności heterozygotycznego recesywnego fenotypu nośnika u pacjenta nie chorego, albo obecności defektu genetycznego w nowotworze u chorego pacjenta, albo obecności nieprawidłowości genetycznej u płodu lub zarodka przed wszczepieniem.

Przykładowo, różnica we wzorze fragmentu restrykcyjnego, długość produktów PCR, długość sekwencji powtarzających przy locus genu liganda zalpha11 i temu podobne, są wskaźnikiem nieprawidłowości genetycznej, aberacji genetycznej lub różnicy allelicznej w porównaniu z kontrolą prawidłową. Kontrole mogą pochodzić od zdrowych członków rodziny lub osób nie spokrewnionych, w zależności od testu i dostępności próbek. Próbki genetyczne do stosowania w niniejszym wynalazku obejmują genomowy DNA, mRNA i cDNA izolowany z dowolnej tkanki lub innej próbki biologicznej od pacjenta, np., lecz bez ograniczenia, krwi, śliny, nasienia, komórek zarodkowych, płynu owodniowego i temu podobnych.

Sondą polinukleotydową lub starterem może być RNA lub DNA i obejmuje ona część SEQ ID Nr: 1, sekwencję komplementarną do SEQ ID Nr: 1 lub ich odpowiedni RNA. Takie metody analizy powiązań genetycznych z ludzkim fenotypem chorobowym są dobrze znane w technice. Odniesienie do metod wykorzystujących PCR w diagnostyce, patrz ogólnie, Mathew (red.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (red.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (red.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek i Walaszek (red.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (red.). Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 11998) i Meltzer (red.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)).

Mutacje związane z locus liganda zalpha11 można wykrywać przy użyciu cząsteczek kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku z wykorzystaniem standardowych metod bezpośredniej analizy mutacji, takich jak analiza polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego, analiza powtórzenia krótkiego tandemu wykorzystująca techniki PCR, amplifikacji allelospecyficznej, wykrywanie polimorfizmu konformacji pojedynczego łańcucha, metody rozszczepiania za pomocą RNaz, elektroforezę w denaturującym gradiencie żelu, analizę niedopasowania za pomocą fluoresceiny oraz inne metody analizy genetycznej znane w technice (patrz np. Mathew (red.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108: 255 (1995), Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics (Human Press, Inc. 1996), Elles (red.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (red.). Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren i inni (red.), Genome Analysis, tom 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998) Dracopoli i inni (red.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998), oraz Richards i Ward, „Molecular Diagnostic Testing”, w Principles of Molecular Medicine, strony 83-88 (Humana Press, Inc. 1998).

Bezpośrednią analizę genu liganda zalpha11 pod względem mutacji można przeprowadzić przy użyciu genomowego DNA pacjenta. Metody powielania genomowego DNA, otrzymanego np. z limfo16

PL 207 350 B1 cytów krwi obwodowej, są dobrze znane specjalistom (patrz np. Dracopoli i inni (red.), Current Protocols in Human Genetics, na stronach 7.1.6 do 7.1.7 (John Wiley & Sons 1998)).

Pozycje intronów w genie liganda zalpha11 określano przez identyfikację klonów genomowych, a następnie przez sekwencjonowanie połączeń intron/egzon. Pierwszy leży między resztą aminokwasową 56 (Leu) a resztą 57 (Val) w Seq. ID. Nr 2 i ma długość 115 par zasad. Drugi intron jest największy (4,4 kilozasad) i leży między resztą aminokwasową 68 (Glu) a resztą 69 (Thr) w Seq. ID. Nr 2. Trzeci intron ma 2,6 kilozasad i leży między resztą aminokwasową 120 (Leu) i resztą 121 (Thr) w Seq. ID. Nr 2. Ostatni intron (89 par zasad) leży między resztą aminokwasową 146 (Lys) i resztą 147 (Met) w Seq. ID. Nr 2. Pełny gen zajmuje około 8 kb.

Struktura genu liganda zalpha11 jest podobna do struktury genu IL-2 (Fujita i inni Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 7437-7441, 1983), choć gen liganda zalpha11 zawiera jeden dodatkowy intron (intron 4). Wzór krótkiego pierwszego intronu i długiego drugiego i trzeciego intronu jest konserwatywny między dwoma genami, choć cały gen IL-2 jest nieco mniejszy (około 6 kb). Gen IL-15, z drugiej strony, składa się z 8 egzonów i zajmuje co najmniej 34 kb (Anderson i inni Genomics 25: 701-706, 1995). Tak więc gen liganda zalpha11 ma bardziej podobną strukturę do genu IL-2 niż do genu IL-15.

W postaciach realizacji wynalazku izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego ligand zalpha11 będą hybrydyzować w swoistych warunkach z cząsteczkami kwasu nukleinowego mającymi sekwencję nukleotydową z SEQ ID nr: 1, z cząsteczkami kwasu nukleinowego mającymi sekwencje nukleotydową o nukleotydach 47 do 532 z SEQ ID nr: 1 lub z cząsteczkami kwasu nukleinowego mającymi sekwencje nukleotydową komplementarną do SEQ ID nr: 1.

Ogólnie, swoiste warunki wybiera się jako około 5°C niższe niż temperatura topnienia (Tm,) dla konkretnej sekwencji w określonej mocy jonowej oraz pH. Tm oznacza temperaturę (przy określonej mocy jonowej i pH), przy której 50% sekwencji docelowej hybrydyzuje z doskonale dopasowaną sondą.

Para cząsteczek kwasu nukleinowego, taka jak DNA-DNA, RNA-RNA i DNA-RNA, może hybrydyzować, jeśli sekwencje nukleotydowe mają pewien stopień komplementarności. Hybrydy mnoga tolerować niedopasowane pary zasad w podwójnej helisie, lecz na stabilność hybrydy ma wpływ stopień niedopasowania. niedopasowanej hybrydy zwiększa się o 1°C na każde 1-1,5% niedopasowania par zasad.

Zmiany swoistości warunków hybrydyzacji pozwalają na kontrolę poprzez stopień niedopasowania, jaki będzie występować w hybrydzie. Stopień swoistości zwiększa się wraz ze wzrostem temperatury hybrydyzacji i spadkiem siły jonowej buforu hybrydyzacji.

Specjalista potrafi dostosować te warunki do użytku dla danej hybrydy polinukleotydowej. Tm dla specyficznej sekwencji docelowej oznacza temperaturę, (w określonych warunkach) przy której 50% sekwencji docelowej hybrydyzuje z doskonale dopasowaną sekwencją sondy.

Do warunków, które wpływają na Tm należą wielkość i zawartość par zasad w sondzie polinukleotydowej, siła jonowa roztworu do hybrydyzacji, i obecność czynników destabilizujących w roztworze hybrydyzacji.

W technice znane są liczne równania do obliczania Tm i są specyficzne dla DNA, RNA i hybryd DNA-RNA oraz sekwencji sond polinukleotydowych zmiennej długości (zobacz np. Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel i inni, (red.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger i Kimmel (red.). Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc. 1987); oraz Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227 (1990)).

Programy do analizy sekwencji, takie jak OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) i Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), jak również strony internetowe, są dostępnymi narzędziami do analizowania danej sekwencji i obliczania Tm w oparciu o kryteria określone przez użytkownika.

Takie programy mogą także analizować daną sekwencję w określonych warunkach i identyfikować odpowiednie sekwencje sond.

Zazwyczaj hybrydyzację dłuższych sekwencji polinukleotydowych (np. > 50 par zasad) przeprowadza się w temperaturach wynoszących około 20-25°C poniżej obliczonego Tm.

Dla mniejszych sond (np. < 50 par zasad) hybrydyzację zwykle przeprowadza się w Tm lub

5-10°C poniżej obliczonej Tm. Pozwala to na maksymalną szybkość hybrydyzacji dla hybryd DNA-DNA i DNA-RNA.

PL 207 350 B1

Po hybrydyzacji cząsteczki kwasu nukleinowego można przemyć w celu usunięcia nie zhybrydyzowanych cząsteczek kwasu nukleinowego w swoistych warunkach, lub bardzo swoistych warunkach. Typowe swoiste warunki mycia obejmują przemywanie w roztworze 0,5 x-2 x SSC z 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w temperaturze 55-65°C.

Oznacza to, że cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące wariant polipeptydu liganda zalpha11 hybrydyzują z cząsteczką kwasu nukleinowego mającą sekwencję nukleotydową z SEQ ID Nr: 1 (lub do niej komplementarną) w swoistych warunkach przemywania, w których swoistość przemywania jest równoważna 0,5x-2x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 55-65°C, w tym 0,5x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 55°C lub 2x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 65°C.

Specjalista może z łatwością określić równoważne warunki, np. zastąpienie SSPE w miejsce SSC w roztworze do przemywania.

Typowe bardzo swoiste warunki przemywania obejmują przemywanie w roztworze 0,1x-0,2x SSC z 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w temperaturze 50-65°C. Innymi słowy cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące wariant polipeptydu liganda zalpha11 hybrydyzują z cząsteczką kwasu nukleinowego mającą sekwencję nukleotydową SEQ ID Nr: 1 (lub do niej komplementarną) w bardzo swoistych warunkach przemywania, w których swoistość przywania jest równoważna 0,1x-0,2x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 50-65°C, w tym 0,1 x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 50°C lub 0,2 x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 65°C.

Niniejszy wynalazek ujawnia także izolowane polipeptydy liganda zalpha11, które mają zasadniczo podobną identyczność sekwencji do polipeptydów z SEQ ID nr: 2 lub ich ortologów.

Określenie „zasadniczo podobna identyczność sekwencji” stosuje się w niniejszym dokumencie do określania polipeptydów mających co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95% lub ponad 95% identyczności sekwencji z sekwencjami pokazanymi w SEQ ID nr: 2 lub ich ortologami.

Niniejszy wynalazek obejmuje także polipeptydy, które obejmują sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95% lub ponad 95% identyczności sekwencji z sekwencjami reszt aminokwasowych 1 do 162 lub 33 do 162 w z SEQ ID nr: 2.

Niniejszy wynalazek obejmuje dodatkowo cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują takie polipeptydy. Metody określania identyczności procentowej opisano poniżej.

Niniejszy wynalazek dotyczy także cząsteczek kwasu nukleinowego wariantu liganda zalpha11 które można identyfikować stosując dwa kryteria: określanie podobieństwa między kodowanym polipeptydem z sekwencją aminokwasową z SEQ ID Nr: 2 i/lub test hybrydyzacji, jaki opisano powyżej.

Takie warianty liganda zalpha11 obejmują cząsteczki kwasu nukleinowego:

(1) które hybrydyzują z cząsteczką kwasu nukleinowego mającą sekwencję nukleotydową SEQ ID Nr: 1 (lub do niej komplementarną) w swoistych warunkach przemywania, w których swoistość przemywania jest równoważna 0,5 x - 2 x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 55-65°C lub (2) które kodują polipeptyd mający co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95% lub ponad 95% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową z SEQ ID Nr: 2.

Alternatywnie, warianty liganda zalpha11 można scharakteryzować jako cząsteczki kwasu nukleinowego:

(1) które hybrydyzują z cząsteczką kwasu nukleinowego, mającą sekwencję nukleotydową SEQ ID Nr: 1 (lub do niej komplementarną) w bardzo swoistych warunkach przemywanie, w których swoistość przemywania jest równoważna 0,1x-0,2x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 50-65°C; i (2) które kodują polipeptyd mający co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95% lub ponad 95% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową z SEQ ID Nr: 2.

Identyczność procentową sekwencji określa się metodami konwencjonalnymi. Patrz np. Altschul i inni, Bull. Math. Bio. 48: 603 (1986) oraz Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992). W skrócie, dwie sekwencje aminokwasowe dopasowuje się w celu optymalizacji wyników dopasowania, stosując karę za wprowadzanie nowych przerw wynoszącą 10, karę za wydłużanie przerw istniejących wynoszącą 1 oraz macierz wynikową „BLOSUM 62” Henikoff i Henikoff (jak wyżej), co pokazano w tablicy 4 (aminokwasy oznacza się standardowym kodem jednoliterowym).

Całkowita liczba identycznych dopasowań x 100

[długość dłuższej sekwencji plus liczba przerw wprowadzonych do dłuższej sekwencji w celu dopasowania dwóch sekwencji]

PL 207 350 B1

Tablica 4

	A	R	N	D	C	Q	E	G	H
A	4
R	-1	5
N	-2	0	6
D	-2	-2	1	6
C	0	-3	-3	-3	9
Q	-1	1	0	0	-3	5
E	-1	0	0	2	-4	2	5
G	0	-2	0	-1	-3	-2	-2	6
H	-2	0	1	-1	-3	0	0	-2	8
I	-1	-3	-3	-3	-1	-3	-3	-4	-3
L	-1	-2	-3	-4	-1	-2	-3	-4	-3
K	-1	2	0	-1	-3	1	1	-2	-1
M	-1	-1	-2	-3	-1	0	-2	-3	-2
F	-2	-3	-3	-3	-2	-3	-3	-3	-1
P	-1	-2	-2	-1	-3	-1	-1	-2	-2
S	1	-1	1	0	-1	0	0	0	-1
T	0	-1	0	-1	-1	-1	-1	-2	-2
W	-3	-3	-4	-4	-2	-2	-3	-2	-2
Y	-2	-2	-2	-3	-2	-1	-2	-3	2
V	0	-3	-3	-3	-1	-2	-2	-3	-3

LKMFPSTWYV

-2 5

-1 5

0-306

-3 -1 -2 -4 7

0	-1	-2	-1	4
-1	-1	-2	-1	1	5
-3	-1	1	-4	-3	-2	11
-2	-1	3	-3	-2	-2	2	7
-2	1	-1	-2	-2	0	-3	-1 4

Specjalista będzie widział, że istnieje wiele dostępnych ustalonych algorytmów dopasowania dwóch sekwencji aminokwasowych. Algorytm poszukiwania podobieństwa „FASTA” Pearsona i Lipmana jest odpowiednią metodą dopasowania białka do badania poziomu identyczności sekwencji aminokwasowej ujawnionej w niniejszym dokumencie oraz sekwencji aminokwasowej przypuszczalnej odmiany liganda zalpha11. Algorytm FASTA opisano w Pearson i Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) i w Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990).

W skrócie, FASTA najpierw charakteryzuje podobieństwo sekwencji przez identyfikację regionów wspólnych dla poszukiwanej sekwencji (np. SEQ ID nr: 2) i sekwencji testowej, która albo posiada najwyższą gęstość identyczności (jeśli zmienna ktup wynosi 1) lub par identyczności (jeśli ktup = 2), nie biorąc pod uwagę konserwatywnych substytucji aminokwasowych, insercji lub delecji. Dziesięć regionów o najwyższej gęstości identyczności ponownie testuje się przez porównanie podobieństwa wszystkich sparowanych aminokwasów stosując macierz podstawienia aminokwasów, zaś końce regionów skraca się, aby obejmowały tylko reszty, które przyczyniają się do uzyskania najwyższego wyniku. Jeśli istnieje kilka regionów o wynikach większych niż wartość odcięcia (obliczona wstępnie określonym wzorem na podstawie długości sekwencji oraz wartości ktup), wtedy skracane regiony początkowe bada się, aby określić, czy regiony można połączyć, tworząc przybliżone dopasowanie z przerwami. Na koniec, regiony o najwyższych wynikach obu sekwencji aminokwasowych szereguje się stosując modyfikację algorytmu Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444 (1970); Sellers. SIAM J. Appl. Math. 26: 787 (1974)), która pozwala na insercje i delecje aminokwasowe. Zalecanymi parametrami dla analizy FASTA są: ktup = 1, kara za wprowadzenie przerwy = 10, kara za wydłużenie przerwy istniejącej = 1, macierz podstawienia = BLOSUM62. Te parametry

PL 207 350 B1 można wprowadzić do programu FASTA modyfikując plik macierzy wyników („SMATRIX”), co wyjaśniono w załączniku 2 do Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990).

FASTA można także stosować do określania identyczności sekwencji cząsteczek kwasu nukleinowego przy użyciu stosunku, jaki ujawniono powyżej. Przy porównywaniu sekwencji nukleotydowej wartość ktup może wynosić między jeden a sześć, korzystnie od trzech do sześciu, najkorzystniej trzy, przy czym inne parametry ustawiono jako domyślne.

Warianty polipeptydów liganda zalpha11 lub polipeptydy o zasadniczo podobnej identyczności sekwencji, charakteryzuje się jako mające jedną lub więcej substytucji aminokwasowych, delecji lub addycji. Zmiany te są korzystnie mniejszego znaczenia, czyli są to konserwatywne substytucje aminokwasowe (zobacz tablica 5) i inne substytucje, które nie wpływają znacząco na fałdowanie lub aktywność polipeptydu; małe delecje, zwykle wynoszące jeden do około 30 aminokwasów i małe przedłużenia amino- lub karboksyterminalne, takie jak aminoterminalna reszta metioninowa, mały peptyd łączący mający do około 20-25 reszt lub znacznik powinowactwa. Niniejszy wynalazek obejmuje więc polipeptydy mające od około 108 do 216 reszt aminokwasowych które zawierają sekwencję, będącą o conajmniej 70%, korzystnie co najmniej 90% i korzystniej 95% lub większej identyczności z odpowiadającym regionem z SEQ ID nr: 2. Polipeptydy obejmujące znaczniki powinowactwa mogą dodatkowo obejmować miejsce rozszczepienia proteolitycznego między polipeptydem liganda zalpha11 i znacznikiem powinowactwa. Zalecane miejsca obejmują trombinowe miejsca rozszczepienia oraz miejsca rozszczepienia dla czynnika Xa.

T a b l i c a 5

Konserwatywne substytucje aminokwasowe

Zasadowe:	arginina lizyna histydyna
Kwasowe:	kwas glutaminowy kwas asparaginowy
Polarne:	glutamina asparagina
Hydrofobowe:	leucyna izoleucyna walina
Aromatyczne:	fenyloalanina tryptofan tyrozyna
Małe:	glicyna alanina seryna treonina metionina

Można określić reszty aminokwasowe, które znajdują się w regionach lub domenach o największym ząnczeniu dla utrzymania całości struktury. W tych regionach można określić specyficzne reszty mające mniejszą lub większą tolerancję wobec zmian, które utrzymują całość struktury trzeciorzędowej cząsteczki. Metody analizy struktury sekwencji obejmują, między innymi dopasowanie wielu sekwencji o wysokiej identyczności aminokwasowej lub nukleotydowej, tendencji struktury drugorzędowej, wzorców podwójnych, komplementarnego upakowania oraz ukrytych interakcji polarnych (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5: 372-376, 1995 i Cordes i inni, Current Opin. Struct. Biol. 6: 3-10, 1996). Ogólnie, przy planowaniu modyfikacji w stosunku do cząsteczek lub identyfikacji specyficznych fragmentów, określaniu struktury będzie towarzyszyć ocena aktywności modyfikowanych cząsteczek.

Zmiany sekwencji aminokwasowej wykonuje się w polipeptydach liganda zalpha11 tak, aby zminimalizować zakłócenie struktury wyższego rzędu zasadniczej dla aktywności biologicznej. Przykładowo, jeśli polipeptyd liganda zalpha11 obejmuje jeden lub więcej helis, zmiany w resztach aminokwasowych będą wykonywane tak, aby nie przerwać geometrii helisy i innych składników cząsteczki, przy czym zmiany konformacji osłabiają pewne istotne funkcje, np. wiązanie cząsteczki z jej partnerami wiązania, np. helisy A i D, reszty 44, 47 i 135 SEQ ID Nr: 2. Wpływ zmian sekwencji aminokwaso20

PL 207 350 B1 wej można przewidzieć np. przez modelowanie komputerowe, jak ujawniono powyżej lub określić przez analizę struktury krystalicznej (zobacz np. Lapthorn i inni, Nat. Struct. Biol. 2: 266-268, 1995). Inne metody, dobrze znane w technice porównują składanie wariantu białka w stosunku do standardowej cząsteczki (np. białka natywnego). Przykładowo, można wykonać porównanie wzoru cysteinowego w wariancie i cząsteczce standardowej.

Spektrometria masowa i modyfikacja chemiczna z użyciem redukcji i alkilowania to metody określania reszt cysteinowych, związanych z wiązaniami disiarczkowymi lub nie uczestniczą w takich interakcjach (Bean i inni, Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2: 1732-1748, 1993 oraz Patterson i inni, Anal. Chem. 66: 3727-3732, 1994). Uważa się ogólnie, że jeśli modyfikowana cząsteczka nie posiada takiego samego wzoru wiązań disiarczkowych jak cząsteczka standardowa, fałdowanie będzie zakłócone. Inną dobrze znaną i akceptowaną metodą pomiaru fałdowania jest dichroizm kołowy (CD). Pomiar i porównanie widm CD wytworzonych przez zmodyfikowaną cząsteczkę i cząsteczkę standardową jest rutynowy (Johnson, Proteins 7: 205-214, 1990). Krystalografia jest inną dobrze znaną metodą analizowania fałdowania i struktury. Jądrowy rezonans magnetyczny (NMR), mapowanie enzymatyczne i mapowanie epitopowe są także znanymi metodami analizowania podobieństw fałdowania i struktury między białkami i polipeptydami (Schaanan i inni. Science 257: 961-964,1992).

Można utworzyć profil hydrofilowości Hoppa i Wioodsa sekwencji białka liganda zalpha11, jaką pokazano w SEQ ID nr: 2 (Hopp i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 oraz Triquier i inni. Protein Engineering 11: 153-169, 1998). Profil opiera się na przesuwającej się ramce o szerokości sześciu reszt. Ukryte reszty G, S i T oraz eksponowane reszty H, Y i W ignorowano. Przykładowo, w ligandzie zalpha11, regiony hydrofilowe obejmują reszty aminokwasowe 114-119 z SEQ ID nr: 2, reszty aminokwasowe 101-105 z SEQ ID nr: 2, reszty aminokwasowe 126-131 z SEQ ID nr: 2, reszty aminokwasowe 113-118 z SEQ ID nr: 2 oraz reszty aminokwasowe 158-162 z SEQ ID nr: 2.

Specjalista będzie widział, że hydrofilowość lub hydrofobowość będą brane pod uwagę przy planowaniu modyfikacji w sekwencji aminokwasowej polipeptydu liganda zalpha11, tak, aby nie zniszczyć całej struktury i właściwości biologicznych. Szczególnie istotne dla zamian są reszty hydrofobowe wybrane z grupy zawierającej Val, Leu i Ile lub grupy zawierającej Met, Gly, Ser, Ala, Tyr i Trp. Przykładowo, reszty tolerancyjne wobec substytucji mogłyby obejmować reszty 102 i 103 jak pokazano w SEQ ID nr: 2. Jednak, reszty cysteinowe mogłyby być relatywnie nietolerancyjne wobec substytucji. Reszty cysternowe w pozycjach 71, 78, 122 i 125 SEQ ID Nr: 2 będą względnie nietolerancyjne wobec substytucji.

Identyczność aminokwasów podstawowych można także wywnioskować z analizy podobieństwa sekwencji między IL-15, IL-2, IL-4 i OM-CSF a ligandem zalpha11. Stosując metody, takie jak analiza „FASTA” opisana wcześniej, w rodzinie białek identyfikuje się regiony o wysokim podobieństwie i wykorzystuje do analizy sekwencji aminokwasowej regionów konserwatywnych. Alternatywnym podejściem do identyfikacji wariantu polinukleotydu liganda zalpha11 na podstawie struktury, jest określenie, czy cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca potencjalny wariant polinukleotydu liganda zalpha11 może hybrydyzować z cząsteczką kwasu nukleinowego mającą sekwencję nukleotydów z SEQ ID Nr: 1, jaką omówiono powyżej.

Inne metody identyfikacji podstawowych aminokwasów w polipeptydach według niniejszego wynalazku są procedurami znanymi w tej dziedzinie, takimi jak mutageneza ukierunkowana lub mutageneza skanowania za pomocą alaniny (Cunningham i Wells, Science 244: 1081 (1989), Bass i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498 (1991), Coombs i Corey, „Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering,” w Protein: Analysis and Design. Angeletti (red.), strony 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). W ostatniej metodzie, wprowadza się pojedyncze mutacje alaninowe przy każdej reszcie w cząsteczce, i otrzymane zmutowane cząsteczki testuje się pod względem aktywności biologicznej jak ujawniono poniżej, w celu identyfikacji reszt aminokwasowych, najistotniejszych dla aktywności cząsteczki. Zobacz także, Hilton i inni, J. Biol. Chem. 277: 4699 (1996).

Niniejszy wynalazek obejmuje także funkcjonalne fragmenty polipeptydów liganda zalpha11 oraz cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące takie funkcjonalne fragmenty. „Funkcjonalny” ligand zalpha11 lub jego fragment określony w niniejszym dokumencie, charakteryzuje się aktywnością proliferacji i różnicowania, zdolnością do indukowania lub hamowania wyspecjalizowanych funkcji komórkowych bądź zdolnością do swoistego wiązania z przeciwciałem antyligand zalpha11 lub receptorem zalpha11 (rozpuszczalnym lub unieruchomionym). Jak wcześniej opisano w niniejszym dokumencie,

PL 207 350 B1 ligand zalpha11 charakteryzuje struktura wiązki czterohelikalnej, obejmująca helisę A (reszty aminokwasowe 41-56), helisę B (reszty aminokwasowe 69-84), helisę V (reszty aminokwasowe 92-105) i helisę D (reszty aminokwasowe 135-148), co pokazano w SEQ ID Nr: 2.

Tak więc, niniejszy wynalazek dodatkowo dotyczy białek fuzyjnych obejmujących: (a) cząsteczki polipeptydu obejmujące jedną lub więcej helis opisanych w niniejszym dokumencie; oraz (b) fragmenty funkcjonalne obejmujące jedną lub więcej tych helis. Pozostała część polipeptydu białka fuzyjnego może pochodzić od innej cytokiny o wiązce czterohelikalnej, np. IL-15, IL-2, IL-4 oraz GM-CSF lub od nie natywnego i/lub nie spokrewnionego peptydu sygnałowego wydzielania, który ułatwia wydzielanie białka fuzyjnego.

Tak więc, niniejszy wynalazek dotyczy białek fuzyjnych obejmujące co najmniej cztery polipeptydy, przy czym kolejność polipeptydów od końca N do końca C jest następująca: pierwszy polipeptyd obejmuje aminokwasy wybrane z grupy zawierającej:

(a) reszty aminokwasowe 36-46 z SEQ ID Nr: 111 helisy A IL-2;

(b) reszty aminokwasowe 29-43 z SEQ ID Nr: 112 helisy A IL-15;

(c) reszty aminokwasowe 45-68 z SEQ ID Nr: 113 helisy A IL-4;

(d) reszty aminokwasowe 30-44 z SEQ ID Nr: 114 helisy A GMCSF; oraz (e) reszty aminokwasowe 41 do 56 z SEQ ID Nr: 2; pierwszą sekwencję rozdzielającą o długości 6-27 aminokwasów; i drugi polipeptyd, który obejmuje reszty aminokwasowe wybrane z grupy zawierającej:

(a) reszty aminokwasowe 53-75 z SEQ ID Nr: 111 helisy B IL-2;

(b) reszty aminokwasowe 65-83 z SEQ ID Nr: 112 helisy B IL-4;

(c) reszty aminokwasowe 84-101 helisy B IL-15 z SEQ ID Nr: 113;

(d) reszty aminokwasowe 72-81 z SEQ ID Nr: 114 helisy B GMCSF; oraz (e) reszty aminokwasowe 69-84 z SEQ ID Nr: 2; druga sekwencją rozdzielającą o długości 5-11 reszt aminokwasowych; trzeci polipeptyd który obejmuj sekwencję reszt aminokwasowych wybranych z grupy zawierającej:

(a) reszty 87-99 z SEQ ID Nr: 111 helisy C IL-2;

(b) reszty 95-118 z SEQ ID Nr: 112 helisy C IL-4;

(c) reszty 107-119 z SEQ ID Nr: 113 helisy C IL-15;

(d) reszty 91-102 z SEQ ID Nr: 114 helisy C GMCSF; oraz (e) reszty aminokwasowe 92-105 z SEQ ID Nr: 2; trzecią sekwencją rozdzielającą o długości 3-29 reszt aminokwasowych i czwarty polipeptyd, który obejmuje reszty aminokwasowe wybrane z grupy zawierającej:

(a) reszty aminokwasowe 103-121 z SEQ ID Nr: 111 helisy D IL-2;

(b) reszty aminokwasowe 134-157 z SEQ ID Nr: 112 helisy D IL-15;

(c) reszty aminokwasowe 134-160 z SEQ ID. Nr: 113 helisy D IL-4;

(d) reszty aminokwasowe 120-131 z SEQ ID Nr: 114 helisy D GMCSF oraz (e) reszty aminokwasowe 135-148 z SEQ ID Nr: 2, przy czym co najmniej jeden z czterech polipeptydów pochodzi z liganda zalpha11.

W innych postaciach realizacji peptydy rozdzielające wybiera się spośród pętli A/B, B/C i C/D liganda zalpha11, IL-2, IL-4, IL-15 lub GM-CSF, co pokazano w tablicy 1.

Rutynowe analizy delecji cząsteczek kwasu nukleinowego można przeprowadzić w celu otrzymania funkcjonalnych fragmentów cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd liganda zalpha11. Na przykład cząsteczki DNA mające sekwencję nukleotydową z SEQ ID Nr: 1 lub jej fragmenty, można trawić nukleazą Ba131 otrzymując szeregi zagnieżdżonych delecji. Te fragmenty DNA wprowadza się następnie do wektorów ekspresyjnych w prawidłowej ramce odczytu i po ekspresji polipeptydy izoluje się i testuje pod względem aktywności liganda zalpha11, lub pod względem zdolności wiązania z przeciwciałami antyligand zalpha11 lub receptorem zalpha11. Jedną z alternatyw w stosunku do trawienia endonukleazą jest wykorzystanie mutagenezy skierowanej na oligonukleotyd, wprowadzającej delecje lub kodony stop aby określić wytwarzanie żądanego fragmentu liganda zalpha11. Alternatywnie, poszczególne fragmenty polinukleotydu liganda zalpha11 można syntetyzować stosując reakcję łańcuchową polimerazy.

Standardowe metody identyfikacji domen funcjonalnych są dobrze znane specjalistom. Przykładowo badania przycinania na każdym lub obu końcach interferonów omówiono w Horisberger i Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995). Ponadto standardowe techniki analizy funkcjonalnej białek opisano np. w Treuter i inni, Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993); Content i inni, „Expression and pre22

PL 207 350 B1 liminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon”, w Biological Interferon Systems. Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems. Cantell (red.), strony 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, „The EGF Receptor”, w Control of Animal Cell Proliferation 1, Boynton i inni (red.) strony 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau i inni, J. Biol. Chem. 270: 29270 (1995); Fukunaga i inni, J. Biol. Chem. 220:25291 (1995); Yamaguchi i inni, Biochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995); oraz Meisel i inni. Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996).

Wielokrotne substytucje aminokwasowe można wprowadzić i testować stosując znane metody mutagenezy i skriningu, takie jak te ujawnione w Reidhaar-Olson i Sauer (Science 241: 53-57, 1988)) lub Bowie i Sauer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989)). W skrócie, autorzy ci ujawniają metody równoczesnej randomizacji dwóch lub więcej pozycji w polipeptydzie, wybierając funkcjonalny polipeptyd, a następnie sekwencjonując mutagenizowane polipeptydy w celu określenia spektrum możliwych substytucji w każdej pozycji. Inne metody, które można stosować, obejmują ekspresję fagową (np. Lowman i inni, Biochem. 30: 10832-10837 (1991), Ladner i inni, opis patentowy US nr 5 223 409, Huse, publikacja międzynarodowa WG 92/062045) i mutageneza ukierunkowana (Derbyshire i inni, Gene 46: 145, (1986), Ner i inni, DNA 7: 127 (1988)).

Warianty ujawnionej sekwencji nukleotydowej i polipeptydu liganda zalpha11 można utworzyć poprzez tasowanie DNA jak ujawniono w Stemmer, Nature 370: 389, (1994), Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747 (1994) oraz publikacja międzynarodowa WG 97/20078. W skrócie, warianty DNA tworzy się przez homologiczną rekombinację in vitro przez losową fragmentację pierwotnego DNA, po czym ponowne złożenie z użyciem PCR, co daje losowo wprowadzone mutacje punktowe. Technikę tę, można modyfikować stosując rodzinę cząsteczek pierwotnego DNA, takich jak warianty alleliczne lub cząsteczki DNA od różnych gatunków, aby wprowadzić dodatkową zmienność do procesu. Selekcja lub skrining pod względem żądanej aktywności, po czym dodatkowe powtarzanie mutagenezy i test, zapewnia szybką „ewolucję” sekwencji przez selekcję pod względem pożądanych mutacji, przy równoczesnej selekcji przeciwko szkodliwym zmianom.

Metody mutagenezy, jakie ujawniono w niniejszym dokumencie, można łączyć z wysoko wydajnymi, zautomatyzowanymi metodami skriningu, aby wykryć aktywność klonowanych, mutagenizowanych polipeptydów w komórkach gospodarza. Mutagenizowane cząsteczki DNA, które kodują aktywne polipeptydy lub polipeptydy wiążące się z przeciwciałami antyligand zalpha11 lub rozpuszczalnym receptorem zalpha11, można odzyskać z komórek gospodarza i szybko sekwencjonować stosując nowoczesne urządzenia. Metody te pozwalają na szybkie określenie istotności poszczególnych reszt aminokwasowych w badanym polipeptydzie; można je stosować dla polipeptydów o nieznanej strukturze.

Oprócz tego białka według niniejszego wynalazku (lub ich fragmenty polipeptydowe) można łączyć z innymi cząsteczkami bioaktywnymi, szczególnie innymi cytokinami, aby otrzymać cząsteczki wielofunkcyjne. Przykładowo jedną lub więcej helis z liganda zalpha11 można połączyć z innymi cytokinami, aby poprawić ich właściwości biologiczne lub wydajność syntezy.

Niniejszy wynalazek ujawnia więc szereg nowych, hybrydowych cząsteczek, w których segment obejmujący jedną lub więcej helis liganda zalpha11 jest połączony z innym polipeptydem. Fuzję korzystnie wykonuje się przez splicing na poziomie DNA, aby umożliwić ekspresję cząsteczek chimerycznych w rekombinowanych układach produkcyjnych. Następnie otrzymane cząsteczki testuje się pod względem takich właściwości jak zwiększona rozpuszczalność, zwiększona stabilność, wydłużony czas półtrwania, zwiększona ekspresja i wydzielanie, oraz farmakodynamika. Takie cząsteczki hybrydowe mogą dodatkowo obejmować inne reszty aminokwasowe (np. łącznik polipeptydowy) między składowymi białkami lub polipeptydami.

Do występujących naturalnie aminokwasów należą, bez ograniczenia, trans-3-metyloprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hydroksyprolina, trans-4-hydroksyprolina, N-metyloglicyna, allotreonina, metylotreonina, hydroksyetylocysteina, hydroksyetylohomocysteina, nitroglutamina, homoglutamina, kwas pipekolinowy, kwas tiazolidynokarboksylowy, dehydroprolina, 3- i 4-metyloprolina, 3,3-dimetyloprolina, tertleucyną, norwalina, 2-azafenyloalanina, 3-azafenyloalanina, 4-azafenyloalanina i 4-fluorofenyloalanina. W tej dziedzinie znanych jest kilka metod wprowadzania do białek nie występujących naturalnie reszt aminokwasowych. Przykładowo, można wykorzystać system in vitro, w którym hamowane są nonsensowne mutacje z użyciem chemicznie aminoacylowanych supresorowych tRNA. Metody syntezy aminokwasów i aminoacylowania tRNA są znane w technice. Transkrypcję i translację plazmidów zawierających mutacje nonsensowne przeprowadza się w układzie pozbawionym komórek, obejmującym ekstrakt E. coli S30 i dostępne na rynku enzymy i inne odczynniki. Białka oczyszcza się przez chromatografię. Zobacz np. Robertson i inni, J. Am. Chem. Soc. 113: 2722 (1991), Ellman i inni,

PL 207 350 B1

Methods Enzymol. 202: 301 (1991), Chung i inni. Science 259: 806 (1993) oraz Chung i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145 (1993).

W drugiej metodzie, translację przeprowadza się w oocytach Xenopus przez mikroiniekcję zmutowanego mRNA i chemicznie aminoacylowanego supresorowego tRNA (Turcatti i inni, J. Biol. Chem. 211: 19991 (1996). W trzeciej metodzie komórki E. coli hoduje się przy braku naturalnego aminokwasu, który chce się zamienić (np. fenyloalaniny) i w obecności żądanego nie występującego naturalnie aminokwasu(aminokwasów) (np. 2-azafenyloalaniny, 3-azafenyloalaniny, 4-azafenyloalaniny lub 4-fluorofenyloalaniny). Nie występujący naturalnie aminokwas wprowadza się do białka w miejsce jego naturalnego odpowiednika (zobacz, Koide i inni, Blochem. 33: 7470-61994). Naturalnie występujące reszty aminokwasowe można zamienić na nie występujący naturalnie rodzaj, przez modyfikację chemiczną in vitro. Modyfikację chemiczną in vitro można połączyć z mutagenezą, ukierunkowaną aby dodatkowo poszerzyć zakres substytucji (Wynn i Richards, Protein Sci. 2: 395-403 (1993). Korzystna może być stabilizacja liganda zalpha11, aby przedłużyć okres półtrwania cząsteczki, szczególnie w celu wydłużenia trwałości metabolicznej w stanie aktywnym. Aby uzyskać wydłużony okres półtrwania, cząsteczki liganda zalpha11 można modyfikować chemicznie przy użyciu metod opisanych w niniejszym dokumencie. Traktowanie PEG jest jedną z metod powszechnie stosowanych, które, jak wykazano, wydłużają okres półtrwania w osoczu, zwiększają rozpuszczalność i zmniejszają antygeniczność i immunogeniczność (Nuccl i inni, Advanced Drug Delivery Reviews 6: 133-155, 1991 i Lu i inni, Int. J. Peptide Protein Res. 43: 127-138, 1994).

Ograniczona liczba nie konserwatywnych aminokwasów, aminokwasów które nie są kodowane przez kod genetyczny, nie występujących naturalnie aminokwasów oraz aminokwasów nienaturalnych można podstawić w miejsce reszt aminokwasowych liganda zalpha11.

Niniejszy wynalazek dotyczy także fragmentów polipeptydowych lub peptydów obejmujących część niosącą epitop polipeptydu liganda zalpha11 opisanego w niniejszym dokumencie. Takie fragmenty lub peptydy mogą obejmować „epitop immunogeniczny”, który jest częścią białka wzmagającego odpowiedź przeciwciała, gdy jako immunogen stosuje się całe białko. Immunogeniczne peptydy niosące epitop można identyfikować przy użyciu standradowych metod (patrz np. Geysen i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998 (1983)).

W przeciwieństwie do tego, fragmenty polipeptydowe lub peptydy mogą obejmować „epitop antygeniczny”, którym jest region cząsteczki białka, z którym przeciwciało może się specyficznie wiązać. Pewne epitopy zawierają liniowy lub przyległy obszar aminokwasów i antygeniczność takiego epitopu nie jest zakłócona przez środki denaturujące. Wiadomo w technice, że można stosować relatywnie krótkie peptydy syntetyczne, które naśladują epitopy białkowe, aby stymulować wytwarzanie przeciwciał przeciw białku (patrz np. Sutcliffe i inni. Science 219: 660 (1983)). W związku z tym, antygeniczne peptydy niosące epitop oraz polipeptydy według niniejszego wynalazku są użyteczne do indukcji przeciwciała, które wiążą się z polipeptydami opisanymi w niniejszym dokumencie. Profile hydrofobowości Hoppa i Woodsa można stosować do określenia regionów, które mają największą siłę antygenową (Hopp i inni, 1981, jak wyżej oraz Hopp, 1986, jak wyżej). W ligandzie zalpha11 regiony te obejmują: reszty aminokwasowe 114-119, 101-105, 126-131, 113-118 oraz 158-162 z SEQ ID Nr: 2.

Antygeniczne peptydy niosące epitopy oraz polipeptydy mogą obejmować co najmniej cztery do dziesięciu aminokwasów, co najmniej dziesięć do czternastu aminokwasów lub około czternastu do około trzydziestu aminokwasów z SEQ ID Nr: 2 lub SEQ ID Nr: 56. Takie peptydy niosące epitopy oraz polipeptydy można wytworzyć przez fragmentację polipeptydu liganda zalpha11 lub przez chemiczną syntezę peptydu, jak opisano w niniejszym dokumencie. Ponadto epitopy można wybrać przez ekspresję fagową losowych bibliotek peptydowych (patrz np. Lane i Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5: 268 (1993) oraz Cortese i inni, Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616 (1996)). Standardowe metody identyfikacji epitopów i wytwarzania przeciwcia z małych peptydów, które zawierają epitop, opisano np. w Mole, „Epitope Mapping” w Methods in Molecular Biology, tom 10, Manson (red.), strony 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992); Price, „Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies”, w Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter i Ladyman (red.), strony 60-84 (Cambridge University Press 1995) oraz Coligan i inni (red.), Current Protocols in Immunology, strony 9.3.1-9.3.5 i strony 9.4.1- 9.4.11 (John Wiley & Sons 1997).

Bez względu na konkretną sekwencję nukleotydową wariantu polinukleotydu liganda zalpha11, polinukleotyd koduje polipeptyd, który charakteryzuje się swą aktywnością proliferacji i różnicowania, zdolnością do indukcji lub hamowania wyspecjalizowanych funkcji komórkowych bądź przez zdolność do specyficznego wiązania z przeciwciałem antyligand zalpha11 lub receptorem zalpha11. Dokładniej,

PL 207 350 B1 wariantywne polinukleotydy liganda zalpha11 kodują polipeptydy, które wykazują co najmniej 50%, a korzystniej ponad 70%, 80% lub 90% aktywności polipeptydu przedstawionego w SEQ ID Nr: 2.

Dla każdego polipeptydu liganda zalpha11, w tym wariantów i białek fuzyjnych, specjalista łatwo wytworzy w pełni zdegenerowana sekwencję polinukleotydową kodującą ten wariant, przy użyciu informacji przedstawionych w tablicach 1 i 2 powyżej.

Niniejszy wynalazek dodatkowo dotyczy różnych innych polipeptydów fuzyjnych (i pokrewnych białek multimerycznych obejmujących jedną lub więcej fuzji polipeptydowych). Przykładowo , polipeptyd liganda zalpha11 można wytworzyć w postaci fuzji z dimeryzującym białkiem, jak ujawniono w opisach patentowych US nr 5 155 027 i nr 5 567 584. Zalecane białka dimeryzujące obejmują z tego względu domeny regionu stałego immunoglobuliny. Fuzje polipeptydowe immunoglobulinaligand zalpha11 mogą ulegać ekspresji w komórkach uzyskanych metodami inżynierii genetycznej (w celu produkcji różnych multimerycznych analogów liganda zalpha11). Domeny pomocnicze można połączyć z polipeptydami liganda zalpha11, aby skierować je do konkretnych komórek, tkanek lub makrocząsteczek. Przykładowo, polipeptyd liganda zalpha11 lub białko można by skierować na wcześniej określony rodzaj komórki, przez połączenie polipeptydu liganda zalpha11 z ligandem, który specyficznie wiąże się z receptorem na powierzchni tej komórki docelowej. W ten sposób polipeptydy i białka mogą być ukierunkowane do celów terapeutycznych lub diagnostycznych. Polipeptyd liganda zalpha11 można połączyć z dwoma lub więcej cząsteczkami, takimi jak znacznik powinowactwa do oczyszczania oraz domena kierunkująca. Fuzje polipeptydowe mogą także obejmować jedno lub więcej miejsc rozszczepiania, szczególnie między domenami. Patrz Tuan i inni, Connective Tissue Research 34: 1-9 (1996).

Stosując metody omówione w niniejszym dokumencie, specjalista może zidentyfikować i/lub wytworzyć różne polipeptydy, które mają zasadniczo podobną identyczność sekwencji z resztami 1-162 lub 33-162 z SEQ ID nr: 2 lub ich fragmenty funkcjonalne oraz fuzje, przy czym takie polipeptydy lub fragmenty zachowują właściwości białka typu dzikiego, np. zdolność do stymulacji proliferacji, różnicowania, indukcji wyspecjalizowanych funkcji komórkowych lub wiązania receptora zalpha11 lub przeciwciał liganda zalpha11.

Polipeptydy liganda zalpha11 według niniejszego wynalazku, w tym pełnej długości polipeptydy, funkcjonalne fragmenty oraz polipeptydy fuzyjne, można wytworzyć w komórkach gospodarza zmienionych metodami inżynierii genetycznej zgodnie z konwencjonalnymi technikami. Odpowiednie komórki gospodarza to te rodzaje komórek, które można transformować lub transfekować egzogenicznym DNA i hodować w kulturze; obejmują one komórki bakteryjne, komórki grzybów i hodowane komórki wyższych eukariontów. Zalecane są komórki eukariotyczne, szczególnie hodowane komórki organizmów wielokomórkowych. Techniki manipulacji klonowanymi cząsteczkami DNA i wprowadzania egzogenicznego DNA do różnych komórek gospodarza opisano w Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 wydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, oraz Ausubel i inni, red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.

Ogólnie, sekwencja DNA kodująca polipeptyd liganda zalpha11 jest połączona operacyjnie z innymi elementami genetycznymi wymaganymi do jej ekspresji, obejmującymi generalnie promotor transkrypcji i terminator, w wektorze ekspresyjnym. Wektor zawiera zwykle także jeden lub więcej markerów selekcyjnych oraz jeden lub więcej początków replikacji, choć specjaliści będą wiedzieć, że w pewnych układach markery selekcyjne mogą być dostarczone na oddzielnych wektorach, zaś replikację egzogenicznego DNA można uzyskać przez integrację z genomem komórki gospodarza. Wybór promotorów, terminatorów, markerów selekcyjnych, wektorów i innych elementów wchodzi w skład rutynowego planowania na poziomie przeciętnego specjalisty w tej dziedzinie. Wiele z takich elementów opisano w literaturze i są dostępne w sprzedaży.

Aby skierować polipeptyd liganda zalpha11 na szlak wydzielniczy komórki gospodarza, sekwencję sygnałową wydzielania (znaną także jako sekwencja liderowa, sekwencja prepro lub sekwencja pre) dostarcza się w wektorze ekspresji. Sekwencja sygnału wydzielania może być sekwencją z liganda zalpha11, lub może pochodzić z innego wydzielonego białka (np. t-PA) lub zostać zsyntetyzowana od nowa. Sekwencja sygnału wydzielania jest połączona operacyjnie z sekwencją DNA liganda zalpha11, czyli dwie sekwencje są połączone w prawidłowej ramce odczytu i umieszczone tak, aby kierować nowo syntetyzowany polipeptyd na szlak wydzielania komórki gospodarza. Sekwencje sygnału wydzielania są zwykle umieszczone od strony końca 5' w stosunku do sekwencji DNA kodującego badany polipeptyd, chociaż pewne sekwencje sygnałowe wydzielania mogą być umieszczone

PL 207 350 B1 w innym miejscu w sekwencji badanego DNA (zobacz, np. Welch i inni, opis patentowy US nr 5 037 743; Holland i inni, opis patentowy US nr 5 143 830).

Alternatywnie, sekwencję sygnału wydzielania zawartą w polipeptydach według niniejszego wynalazku stosuje się do kierowania innych polipeptydów na szlak wydzielania. Niniejszy wynalazek obejmuje takie peptydy fuzyjne. Można otrzymać sygnałowy polipeptyd fuzyjny, w którym uzyskana sekwencja sygnałowa wydzielania otrzymana z reszt aminokwasowych 1-31 z SEQ ID Nr: 2 jest łączona operacyjnie z sekwencją DNA kodującą inny polipeptyd, z użyciem metod znanych w tej dziedzinie i ujawnionych w niniejszym dokumencie. Sekwencję sygnału wydzielania zawartą w polipeptydach fuzyjnych według niniejszego wynalazku korzystnie łączy się aminoterminalnie z dodatkowym peptydem, aby kierować dodatkowy peptyd na szlak wydzielania. Takie konstrukcje mają liczne zastosowania znane w technice. Przykładowo, te nowe konstrukcje fuzyjne sekwencji sygnału wydzielania mogą kierować wydzielanie aktywnego składnika normalnie nie wydzielanego białka. Takie fuzje mogą być stosowane in vivo lub in vitro do kierowania peptydów poprzez szlak wydzielania.

Hodowane komórki ssaków są odpowiednimi gospodarzami w niniejszym wynalazku. Metody wprowadzania DNA do ssaczych komórek gospodarza obejmują transfekcję za pośrednictwem fosforanu wapnia (Wigier i inni. Cell 14: 725, 1978; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 2: 603, 1981: Graham i Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), elektroporację (Neumann i inni, EMBO J. 1: 841-845, 1982), transfekcję za pośrednictwem DEAE-dekstranu (Ausubel i inni, jak wyżej) oraz transfekcję za pośrednictwem liposomów (Hawley-Nelson i inni, Focus 15: 73, 1993; Ciccarone i inni, Focus 15: 80, 1993 oraz wektory wirusowe (Miller i Kosman, BioTechniques 7: 980-90, 1989; Wang i Finer, Nature Med. 2: 714-716, 1996). Wytwarzanie rekombinowanych polipeptydów w hodowanych komórkach ssaków opisano np. w Levinson i inni, opis patentowy US nr 4 713 339; Hagen i inni, opis patentowy US nr 4 784 950; Palmiter i inni, opis patentowy US nr 4 579 821; oraz Ringold, opis patentowy US nr 4 656 134. Odpowiednie hodowane komórki ssaków obejmują linie komórkowe COS-1 (ATCC nr CRL 1650), COS-7 (ATCC nr CRL 1651), BHK (ATCC nr CRL 1632), BHK 570 (ATCC nr CRL 10314), 293 (ATCC nr CRL1573; Graham i inni, J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) oraz linie komórkowe z jajników chomika chińskiego (np. CHO-K1; ATCC nr CCL 61). Inne odpowiednie linie komórkowe są znane w tej dziedzinie i dostępne w publicznych depozytach, takich jak American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Ogólnie, zaleca się silne promotory transkrypcji, takie jak promotory od SV40 lub cytomegalowirusa. Zobacz np. opis patentowy US nr 4 956 288. Inne odpowiednie promotory obejmują promotory genów metalotioneiny (opis patentowy US nr 4 579 821 i 4 601 978) oraz główny promotor późny adenowirusa.

Selekcję lekową stosuje się zazwyczaj do selekcji hodowanych komórek ssaków, do których wprowadzono obcy DNA. Takie komórki zwykle określa się jako „transfektanty”. Komórki, które hodowano w obecności czynnika selekcji i są zdolne do przekazania badanego genu potomstwu określa się jako „stabilne transfektanty”. Zalecanym markerem selekcyjnym jest gen kodujący odporność wobec antybiotyku neomycyny. Selekcję przeprowadza się w obecności leku typu neomycyny, takiego jak G-418 lub podobny. Układy selekcyjne można także stosować do zwiększania poziomu ekspresji badanego genu, zaś proces określa się jako „powielanie”. Powielanie przeprowadza się przez hodowlę transfektantów w obecności małej ilości czynnika selekcyjnego, a następnie zwiększenie ilości czynnika selekcyjnego, aby wybrać komórki, które wytwarzają dużą ilość produktów wprowadzonych genów. Zalecanym możliwym do powielenia markerem selekcyjnym jest reduktaza dihydrofolianowa, która nadaje odporność wobec metotreksatu. Można także stosować inne geny odporności na lek (np. odporność na higromycynę, odporność wielolekową, acetylotransferazę puromycynową). Alternatywne markery, które wprowadzają zmieniony fenotyp, takie jak zielone białko fluorescencyjne lub białka powierzchniowo komórkowe, takie jak CD4, CD8, MHC klasy I, łożyskowa fosfataza alkaliczna, można stosować do oddzielania transfekowanych komórek od komórek nie transfekowanych za pomocą sortowania FACS lub technologii rozdzielania z użyciem kulek magnetycznych.

Jako gospodarzy można także stosować inne wyższe komórki eukariotyczne, w tym komórki roślinne, komórki owadzie i komórki ptasie. Stosowanie Agrobacterium rhizogenes jako wektora do ekspresji genów w komórkach roślinnych omówiono w Sinkar i inni, J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987. Transformację komórek owadzich i wytwarzanie w nich obcych polipeptydów ujawnia się w Guarino i inni, opis patentowy US nr 5 162 222 oraz publikacja WIPO WG 94/06463. Komórki owadzie można infekować rekombinowanym bakulowirusem, zwykle otrzymywanym z wirusa poliedrozy jądrowej Autographa californica (AcNPV). Zobacz King, L. A. i Posee, R. D., The Baculowirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D. R. i inni, Baculowirus Expression

PL 207 350 B1

Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; oraz Richardson, C. D., red., Baculowirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology. Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Druga metoda wykonywania rekombinowanego bakulowirusa zalpha11 wykorzystuje system na bazie transpozonu opisany przez Lucków (Luckow, V. A. i inni, J. Virol 62: 4566-79, 1993).

Ten system, wykorzystujący wektory transferowe, jest sprzedawany w zestawie Bac-to-Bac (Life Technologies, Rockville, MD). Ten system wykorzystuje wektor transferowy pFastBac1™ (Life Technologies) zawierający transpozon Tn7 do przesuwania DNA kodującego polipeptyd zalpha11 do genomu bakulowirusa utrzymywanego w E. coli, w postaci dużego plazmidu zwanego „bacmid. Wektor transferowy pFastBac1™ wykorzystuje promotor polihedryny AcNPV, aby kierować ekspresją badanego genu w odpowiednim stopniu. Promotor poliedryny można usunąć i zastąpić promotorem białka zasadowego bakulowirusa (znanym także jako Pcor, p6.9 lub promotor MP), który ulega ekspresji wcześniej w infekcji bakulowirusem i okazał się korzystny przy ekspresji wydzielonych białek. Zobacz Hill-Perkins, M. S. i Possee, R. D., J .Gen. Virol. 11: 971-6, 1990; Bonning, B. C. i inni, J. Gen. Virol. 75: 1551-6, 1994; oraz, Chazenbalk, G. D. i Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995.

W takich konstrukcjach wektora trasferowego można stosować krótką lub długą wersję promotora białka zasadowego. Ponadto można skonstruować wektory transferowe, które zastępują natywne sekwencje sygnałowe wydzielania liganda zalpha11 sekwencjami sygnałowymi wydzielania pochodzącymi od białek owadzich. Przykładowo sekwencję sygnałową wydzielania z glukozylotransferazy ekdysteroidowej (EGT), pszczoły Melittin (Invitrogen, Carlsbad, CA) lub gp67 bakulowirusa (PharMingen, San Diego, CA) można stosować w konstrukcjach do zastępowania natywnej sekwencji sygnałowej wydzielania liganda zalpha11. Oprócz tego wektory transferowe mogą obejmować fuzję w ramce z DNA kodującym znacznik epitopowy przy końcu C lub N ulegającego ekspresji polipeptydu liganda zalpha11, np. znacznik epitopowy Glu-Glu (Grussenmeyer, T. i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. 52: 7952-4, 1985).

Stosując technikę znaną w tej dziedzinie wektor transferowy zawierający ligand zalpha11 transformuje się do E. coli i bada przesiewowe pod względem bacmidów, które zawierają przerwany gen lac2 wskaźnikowy dla rekombinowanego bakulowirusa. Bacmidowy DNA zawierający rekombinowany genom bakulowirusa izoluje się, stosując zwykłe techniki, i używa do transfekcji komórek Spodoptera frugiperda, np. komórek Sf9. Następnie wytwarzany się rekombinowany wirus, który wykazuje ekspresję zalpha11. Sporządza się rekombinowane wirusowe hodowle macierzyste metodami powszechnie stosowanymi w tej dziedzinie.

Rekombinowany wirus stosuje się do zakażania komórek gospodarza, zwykle linii komórkowej otrzymanej od ćmy, Spodoptera frugiperda. Zobacz ogólnie Glick i Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. ASM Press, Washington, D.C., 1994. Inną odpowiednią linią komórkową jest linia komórkowa High FiveO™ (Invitrogen) otrzymana z Trichoplusia ni (opis patentowy US nr 5 300 435).

Komórki grzybów, w tym komórki drożdży, można także stosować w niniejszym wynalazku. Szczególnie interesujące pod tym względem rodzaje drożdży to Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris i Pichia methanolica.

Metody transformowania komórek S. cerevisiae egzogenicznym DNA i wytwarzanie z nich rekombinowanych polipeptydów opisuje np. Kawasaki, opis patentowy US nr 4 599 311; Kawasaki i inni, opis patentowy US nr 4 931 373; Brake, opis patentowy US nr 4 870 008; Welch i inni, opis patentowy US nr 5 037 743; oraz Murray i inni, opis patentowy US nr 4 845 075. Transformowane komórki poddaje się selekcji fenotypowej określonej przez odpowiedni marker selekcyjny, zwykle odporność na lek lub zdolność do wzrostu przy braku określonych składników odżywczych (np. leucyny). Zalecanym systemem wektorowym do stosowania w Saccharomyces cerevisiae jest system wektorowy POTl ujawniony przez Kawasaki i in. (opis patentowy US nr 4 931 373), który pozwala na selekcję transformowanych komórek przez wzrost w pożywkach zawierających glukozę.

Odpowiednie promotory i terminatory do stosowania w drożdżach obejmują promotory i terminatory z genów enzymów glikolitycznych (zobacz np. Kawasaki, opis patentowy US nr 4 599 311; Kingsman i inni, opis patentowy US nr 4 615 974; i Bitter, opis patentowy US nr 4 977 092) oraz genów dehydrogenazy alkoholowej. Zobacz także w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych nr 4 990 446; 5 063 154; 5 139 936 i 4 661 454. Systemy transformacji dla innych drożdży, w tym Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii i Candida maltosa są znane w tej dziedzinie. Zobacz np. Gleeson i inni, J. Gen. Microbiol. 132: 34 5 9-34 65, 1986 i Cregg, opis

PL 207 350 B1 patentowy US nr 4 882 279. Można wykorzystać komórki Aspergillus zgodnie z metodami z McKnight i inni, opis patentowy US nr 4 935 349. Metody transformowania Acremonium chrysogenum ujawniono w Sumino i inni, opis patentowy US nr 5 162 228. Metody transformowania Neurospora ujawniono w Lambowitz, opis patentowy US nr 4 486 533.

Stosowanie Pichia methanolica jako gospodarza do wytwarzania rekombinowanych białek ujawniono w publikacjach WIPO WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 i WO 98/02565. Cząsteczki DNA do stosowania przy transformowaniu P. methanolica są zwykle wytwarzane w postaci dwuniciowych, kolistych plazmidów, które korzystnie linearyzuje się przed transformacją. Przy wytwarzaniu polipeptydu w P. methanolica zaleca się, aby promotor i terminator w plazmidzie pochodził z genu P. methanolica, takiego jak gen wykorzystania alkoholu P. methanolica (AUG1 lub AUG2). Inne użyteczne promotory obejmują promotory z genów syntazy dihydroksyacetonowej (DHAS), dehydrogenazy mrówczanowej (FMD) i katalazy (CAT).

Aby ułatwić integrację DNA z chromosomem gospodarza, zaleca się, aby posiadał cały segment ekspresji plazmidu oskrzydlonego na obu końcach przez sekwencje DNA gospodarza. Zalecanym markerem selekcyjnym do stosowania w Pichia methanolica jest gen ADE2 P. methanolica, który koduje karboksylazę fosforybozylo-5-aminoimidazolową (AIRC; EC 4.1.1.21), która pozwala komórkom gospodarza ade2 na wzrost przy braku adeniny.

W procesach przemysłowych na wielką skalę, w których pożądana jest minimalizacja użycia metanolu, zaleca się stosowanie komórek gospodarza, w których oba geny wykorzystania metanolu (AUG1 i AUG2) zostały usunięte. W celu wytworzenia wydzielonych białek, zaleca się komórki gospodarza bez genów proteaz wakuolowych (PEP4 i PRB1).

Elektroporację stosuje się w celu umożliwienia wprowadzenia plazmidu zawierającego DNA kodujący badany polipeptyd do komórek P. methanolica. Zaleca się transformowanie komórek P. methanolica przez elektroporację, stosując opadające wykładniczo, zmienne pole elektryczne o sile pola wynoszącej od 2,5 do 4,5 kV/cm, korzystnie około 3,75 kV/cm oraz stałej czasowej (Q) wynoszącej od 1 do 40 milisekund, najkorzystniej około 20 milisekund.

Prokariotyczne komórki gospodarza, w tym szczepy bakterii Escherichia coli, Bacillus i inne rodzaje są także użytecznymi komórkami gospodarza w niniejszym wynalazku. Techniki transformowania tych gospodarzy i ekspresji obcych sekwencji DNA w nich klonowanych są dobrze znane w tej dziedzinie (zobacz np. Sambrook i inni, jak wyżej). Przy ekspresji polipeptydu liganda zalpha11 w bakteriach, takich jak E. coli, polipeptyd może być utrzymywany w cytoplazmie, zwykle w postaci nierozpuszczalnych granulek, lub może być skierowany do przestrzeni około plazmatycznej przez bakteryjną sekwencję wydzielniczą.

W pierwszym przypadku komórki ulegają lizie, a granulki odzyskuje się i denaturuje, stosując np. izotiocyjanian guanidyny lub mocznik. Denaturowany polipeptyd można ponownie fałdować i dimeryzować przez rozcieńczenie substancji denaturowanej, np. przez dializę wobec roztworu mocznika i połączenie zredukowanego i utlenionego glutationu, a następnie dializę wobec buforowanego roztworu soli. W ostatnim przypadku polipeptyd można odzyskać z przestrzeni około plazmatycznej, w postaci rozpuszczalnej i funkcjonalnej, przez zniszczenie komórki (np. przez sonikację lub wstrząs osmotyczny) uwalniając zawartość przestrzeni okołoplazmatycznej i odzyskując białko, omijając przez to potrzebę denaturacji i fałdowania.

Transformowane i transfekowane komórki gospodarza hoduje się zgodnie z konwencjonalnymi procedurami w pożywce do hodowli zawierającej składniki odżywcze i inne składniki potrzebne do wzrostu wybranych komórek gospodarza. Różne odpowiednie pożywki, w tym pożywki określone i pożywki złożone, są znane w tej dziedzinie i zasadniczo zawierają źródło węgla, źródło azotu, podstawowe aminokwasy, witaminy i składniki mineralne. Pożywki mogą także zawierać takie składniki jak czynniki wzrostu lub surowicę, zależnie od potrzeb. Pożywka hodowlana selekcjonuje zazwyczaj pod względem komórek zawierających endogennie dodany DNA, np. przez selekcję lekową lub niedobór podstawowych składników odżywczych, które są uzupełniane przez marker selekcyjnym niesiony przez wektor ekspresji lub współtransfekowany do komórki gospodarza.

Komórki P. methanolica hoduje się w pożywce zawierającej odpowiednie źródła węgla, azotu i pierwiastków śladowych, w temperaturze około 25°C do 35°C. W hodowlach płynnych zapewnia się wystarczające napowietrzanie konwencjonalnymi sposobami, takimi jak wytrząsanie małych kolb lub zraszanie fermentorów. Zalecaną pożywka hodowlaną dla P. methanolica jest YEPD (2% D-glukoza, 2% Bacto™ Peptone (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% ekstrakt drożdżowy Bacto™ (Difco Laboratories), 0,004% adenina i 0,006% L-leucyna).

PL 207 350 B1

Zaleca się oczyszczanie polipeptydów według niniejszego wynalazku do > 80% czystości, korzystniej do > 90% czystości, jeszcze korzystniej > 95% czystości, a szczególnie zaleca się stan czystości farmaceutycznej, czyli ponad 99,9% czystości pod względem zanieczyszczeń makrocząsteczkowych, szczególnie innych białek i kwasów nukleinowych oraz pozbawienie czynników zakaźnych i pirogennych. Korzystnie, oczyszczony polipeptyd jest zasadniczo pozbawiony innych polipeptydów, szczególnie innych polipeptydów pochodzenia zwierzęcego.

Poddane ekspresji rekombinowane polipeptydy liganda zalpha11 (lub chimeryczne albo fuzyjne polipeptydy liganda zalphall) można oczyszczać stosując frakcjonowanie i/lub konwencjonalne metody i pożywki do oczyszczania. Do frakcjonowania próbek można stosować strącanie siarczanem amonu oraz ekstrakcję kwasową lub czynnikiem dezintegrującym. Przykładowe etapy oczyszczania mogą obejmować hydroksyapatyt, chromatografię wykluczenia wg wyników FPLC i wysoko sprawną chromatografię cieczową w układzie faz odwróconych.

Odpowiednie środowiska chromatograficzne obejmują derywatyzowane dekstrany, agarozę, celulozę, poliakrylamid, specjalne krzemionki i inne. Zaleca się pochodne PET, DEAE, QAE i Q. Przykładowe środowiska chromatograficzne obejmują te środowiska, które derywatyzowane z użyciem grup fenylowych, butylowych, lub oktylowych, takich jak Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) i inne; lub żywice poliakrylowe, takie jak Amberchrom CG 71 (Toso Haas) i inne. Odpowiednie podłoża stałe obejmują kulki szklane, żywice na bazie krzemionki, żywice celulozowe, kulki agarozowe, usieciowane kulki agarozowe, kulki polistyrenowe, usieciowane żywice poliakrylamidowe i inne, które są nierozpuszczalne w warunkach, w których mają być stosowane. Podłoża te mogą być modyfikowane grupami reaktywnymi, które pozwalają na przyłączanie białek przez grupy aminowe, grupy karboksylowe, grupy sulfhydrylowe, grupy hydroksylowe i/lub cząstki węglowodanowe. Przykłady odczynników sprzęgających obejmują aktywację bromkiem cyjanogenu, aktywację N-hydroksysukcynoimidem, aktywację epoksydową, aktywację sulfhydrylową, aktywację hydrazydkową oraz pochodne karboksylowe i aminowe dla karbodiimidowych odczynników sprzęgających. Te i inne stałe środowiska są dobrze znane i szeroko stosowane w tej dziedzinie oraz są dostępne w sprzedaży. Metody wiązania polipeptydów receptora ze stałymi podłożami są dobrze znane w tej dziedzinie. Wybór odpowiedniej metody jest kwestią rutynowego planowania i określa się ją częściowo na podstawie właściwości chemicznych wybranego podłoża. Zobacz np. Affinity Chromatography: Principles & Methods. Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku można izolować wykorzystując ich właściwości biochemiczne, strukturalne i biologiczne. Przykładowo, chromatografię adsorpcyjną z unieruchomionym jonem metalu (IMAC) można stosować do oczyszczania białek bogatych w histydynę, w tym zamierających znaczniki polihistydynowe. W skrócie, żel ładuje się najpierw dwuwartościowymi jonami metali tworząc chelat (Sulkowski, Trencls in Biochem. 3: 1-7, 1985). Białka bogate w histydynę będą adsorbowane na tej matrycy z różnym powinowactwem, w zależności od użytego jonu metalu i będą wymywane przez elucję kompetytywną, z obniżaniem pH, lub przez użycie silnych czynników chelatujących. Inne metody oczyszczania obejmują oczyszczanie białek glikozylowanych przez chromatografię powinowactwa lecytyny oraz chromatografię jonowymienną (Methods in Enzymol, tom 182, „Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, (red.), Acad. Press, San Diego, 1990, strony 529-39). W innych postaciach realizacji wynalazku, można skonstruować fuzję badanego polipeptydu i znacznika powinowactwa (np. białka wiązania z maltozą, domeny immunoglobuliny), aby ułatwić oczyszczanie.

Ponadto, stosując metody opisane w technice, konstruuje się fuzje polipeptydowe lub hybrydowe białka liganda zalpha11, stosując regiony lub domeny niniejszego liganda zalpha11 w połączeniu z regionami lub domenami z innych ludzkich białek rodziny cytokin (np. interleukiny lub GM-CSF) lub białek heterologicznych (Sambrook i inni, jak wyżej, Altschul i inni, jak wyżej, Picard, Cur. Opin. Biology. 5: 511-5, 1994 i odniesienia w tych dokumentach). Metody te pozwalają określić istotność biologiczną większych domen lub regionów w badanym polipeptydzie. Takie hybrydy mogą zmieniać kinetykę reakcji, wiązanie, ograniczać lub poszerzać swoistość substratowa lub zmieniać lokalizację tkankową lub komórkową polipeptydu i można je stosować z polipeptydami o nieznanej strukturze.

Białka fuzyjne można wytworzyć metodami znanymi specjalistom przez wytworzenie każdego składnika białka fuzyjnego i ich chemiczne sprzężenie. Alternatywnie, można wytworzyć polinukleotyd kodujący oba składniki białka fuzyjnego w prawidłowej ramce odczytu, stosując znane techniki i wywoływać ekspresję sposobami opisanymi w niniejszym dokumencie. Przykładowo część lub całość helisy nadającej funkcję biologiczną można zamieniać między ligandem zalpha11 według niniejszego wynaPL 207 350 B1 lazku z funkcjonalnie równoważnymi helisami od innego członka rodziny cytokin, takiego jak IL-15, IL-2, IL-4 lub GM-CSF. Takie składniki obejmują, lecz nie ograniczają się do sekwencji sygnału wydzielania, helis A, B, C, D; pętli A/B, B/C, C/D; cytokin o wiązce czterech helis. Takie białka fuzyjne posiadają, jak się oczekuje, biologiczny profil funkcjonalny, który jest taki sam lub podobny, jak dla polipeptydów według niniejszego wynalazku lub innych znanych białek rodziny cytokin o wiązce czterech helis, w zależności od skonstruowanej fuzji. Ponadto, takie białka fuzyjne mogą wykazywać inne właściwości, jak ujawniono w niniejszym dokumencie.

Standardowe techniki klonowania i biologii molekularnej można stosować do zamiany równoważnych domen między polipeptydami liganda zalpha11 a polipeptydami, z którymi są połączone. Ogólnie, segment DNA, który koduje badaną domenę, np. helisy A do D liganda zalpha11 lub inną domenę opisaną w niniejszym dokumencie, łączy się operacyjnie w ramce z co najmniej jednym innym segmentem DNA kodującym dodatkowy polipeptyd (np. domenę lub region od innej cytokiny, takiej jak IL-2 lub inne) i wprowadza do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, jakie opisano w niniejszym. Ogólnie konstrukcje DNA wykonuje się tak, że kilka segmentów DNA, które kodują odpowiadające regiony polipeptydu łączy się operacyjnie w ramce wytwarzając pojedynczą konstrukcję, która koduje całe białko fuzyjne lub jego część funkcjonalną. Przykładowo , konstrukcje DNA będą kodować od końca N do końca C białko fuzyjne obejmujące polipeptyd sygnałowy, następuje domenę wiążącą cytokinę, następnie domenę transbłonową, następnie dojrzałe białko fuzyjne cytokiny o wiązce czterech helis, zawierające helisę. A, potem helisę B, potem helisę C, potem helisę D. Takie białka fuzyjne można poddawać ekspresji, izolować i testować pod względem aktywności, jak opisano w niniejszym dokumencie.

Polipeptydy liganda zalpha11 lub jego fragmenty można także wytworzyć przez syntezę chemiczną, przy czym polipeptydy liganda zalpha11 mogą być monomerami lub multimerami; glikozylowane lub nie glikozylowane; traktowane PEG lub nietraktowane; i mogą obejmować lub mogą nie obejmować początkową resztę aminokwasu metroniny. Przykładowo polipeptydy można wytworzyć przez syntezę peptydu w fazie stałej, np. jak opisano u Merrifield, J. Am. Ghem. Soc. 85: 2149, 1963.

Aktywność cząsteczek według niniejszego wynalazku można mierzyć stosując różne testy mierzące proliferację i/lub wiązanie z komórkami wykazującymi ekspresję receptora zalpha11. Szczególnie interesujące zmiany w komórkach zależnych od liganda zalpha11. Odpowiednie konstruowane linie komórkowe, które są zależne od liganda zalpha11, obejmują linię komórkową BaF3 zależną od IL-3 (Palacios i Steinmetz, Cell. 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot i inni. Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), FDC-P1 (Hapel i inni, Blood 64: 786-790, 1984) i M07e (Kiss i inni. Leukemia 7: 235-240, 1993). Linie komórkowe zależne od czynnika wzrostu można uzyskać zgodnie z publikowanymi metodami (np. Greenberger i inni. Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter i inni, w Baum i inni red. Experimental Hematology Today, 8 Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979, 145-156, 1980).

Białka według niniejszego wynalazku są użyteczne do stymulacji proliferacji, aktywacji, różnicowania i/lub idukcji lub inhibicji wyspecjalizowanych funkcji komórkowych w komórkach związanych z homeostazą krwiotworzenia oraz funkcją odpornościową. W szczególności, polipeptydy liganda zalpha11 są użyteczne do stymulowania, proliferacji, aktywacji, różnicowania i/lub indukcji lub inhibicji wyspecjalizowanych funkcji komórkowych w komórkach rodu krwiotwórczego, w tym, lecz bez ograniczania, komórkach T, komórkach B, komórkach NK, komórkach dendrytycznych, monocytach oraz makrofagach, jak również komórkach nabłonkowych. Proliferację i/lub różnicowanie komórek krwiotwórczych można mierzyć in vitro przy użyciu komórek hodowanych lub in vivo przez podawanie cząsteczek według niniejszego wynalazku odpowiedniemu modelowi zwierzęcemu. Testy mierzące proliferację komórkową lub różnicowanie są dobrze znane.

Przykładowo, testy mierzące proliferację obejmują takie testy, jak czułość chemiczna na obojętny barwnik czerwony (Cavanaugh i inni, Investigational New Drugs 8: 347-354, 1990, załączony do niniejszego dokumentu przez odniesienie), wprowadzanie znakowanych promieniotwórczo nukleotydów (Cook i inni, Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989, załączony do niniejszego dokumentu przez odniesienie), wprowadzanie 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU) do DNA namnażających się komórek (Porstmann i inni, J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985, załączony do niniejszego dokumentu przez odniesienie) i stosowanie soli tetrazoliowych (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alley i inni, Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Marshall i inni, Growth Reg. 5: 69-84, 1995; i Scudiero i inni, Cancer Res. 48: 4827-4833, 1988; wszystkie załączone do niniejszego dokumentu przez odniesienie). Testy mierzące różnicowanie obejmują np. pomiar markerów na powierzchni komórek związanych z ekspresją specyficzną dla etapu w tkance, aktywność enzymatyczną, aktywność funkcjonalną

PL 207 350 B1 lub zmiany morfologiczne (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes. Adv. Anim. Cell. Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; wszystkie załączone do niniejszego dokumentu przez odniesienie).

Cząsteczki według niniejszego wynalazku można testować in vivo stosując wirusowe systemy dostarczania. Przykładowe wirusy do tego celu obejmują adenowirus, herpeswirus, retrowirusy, wirus krowianki i wirus związany z adenowirusem (AAV). Adenowirus, będący wirusem o podwójnej nici DNA, jest obecnie najlepiej przebadanym wektorem przenoszenia genu do dostarczania heterologicznego kwasu nukleinowego (przegląd, zobacz T.C. Becker i inni, Meth. Cell. Biol. 43: 161-89, 1994; i J. T. Douglas oraz D. T. Curiel, Science & Medicine 4: 44-53, 1997).

Aktywność polipeptydu liganda zalpha11 jako liganda można mierzyć mikrofizjometrem z czujnikiem na bazie krzemu, który mierzy tempo zakwaszania zewnątrzkomórkowego lub wydzielania protonów towarzyszące wiązaniu receptora i późniejszym fizjologicznym odpowiedziom komórkowym. Przykładowym urządzeniem jest Cytosensor™ Microphysiometer produkowany przez Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Tą metodą można mierzyć różne odpowiedzi komórkowe, takie jak proliferacja komórkowa, transport jonów, wytwarzanie energii, odpowiedź zapalna, aktywacja regulatorowa i receptorowa, i inne. Zobacz np. McConnell, H. M. i inni, Science 257: 1906-1912, 1992; Pitchford, S. i inni, Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997; Arimilli, S. i inni, J. Immunol. Meth. 212: 49-59, 1998; Van Liefde, I. i inni., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998.

Ponadto, ligand zalpha11 można stosować do identyfikacji komórek, tkanek lub linii komórkowych, które odpowiadają na szlak stymulowany ligandem zalpha11. Mikrofizjometr opisany powyżej można stosować do szybkiej identyfikacji komórek odpowiadających na ligand, np. komórek odpowiadających na ligand zalpha11 według niniejszego wynalazku. Komórki można hodować w obecności lub przy braku polipeptydu liganda zalpha11. Komórki, które wywołują mierzalną zmianę zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w obecności liganda zalpha11, odpowiadają na ligand zalpha11. Takie komórki lub linie komórkowe można stosować do identyfikacji antagonistów i agonistów polipeptydu liganda zalpha11, jak opisano powyżej.

Pod względem rozmieszczenia tkankowego obserwowanego dla agonistów receptora zalpha11 (w tym naturalnego liganda zalpha11/substratu/kofaktora/ itd.) i/lub antagonistów, mają ogromny potencjał w zastosowaniach, zarówno in vitro, jak i in vivo. Związki identyfikowane jako agoniści liganda zalpha11 są użyteczne do rozprzestrzeniania, proliferacji, aktywacji, różnicowania i/lub indukcji lub inhibicji wyspecjalizowanych funkcji komórkowych w komórkach związanych z homeostazą krwiotworzenia i funkcji odpornościowych. Przykładowo, ligand zalpha11 i związki agonistyczne są użyteczne jako składniki określonych pożywek do hodowli komórek i można je stosować pojedynczo lub w połączeniu z innymi cytokinami i hormonami w celu zastąpienia surowicy, którą stosuje się powszechnie w hodowli komórek. Agoniści są więc użyteczni w specyficznym pobudzaniu wzrostu i/lub rozwoju komórek T, komórek B, komórek NK, limfocytów cytotoksycznych i innych komórek limfoidalnych i mieloidalnych w hodowli.

Antagoniści są także użyteczni jako odczynniki badawcze do charakteryzowania miejsc interakcji ligand-receptor. Antagoniści są użyteczni do hamowania ekspansji, proliferacji, aktywacji i/lub różnicowania komórek związanych z regulacją krwiotworzenia. Inhibitory aktywności liganda zalpha11 (antagoniści liganda zalpha11) obejmują przeciwciała antyligand zalpha11 i rozpuszczalne receptory liganda zalpha11, jak również inne czynniki peptydowe i nie peptydowe (w tym rybozymy).

Ligand zalpha11 można także stosować do identyfikacji inhibitorów (antagonistów) jego aktywności. Związki testowe dodaje się do testów ujawnionych w niniejszym dokumencie do identyfikacji związków, które hamują aktywność liganda zalpha11. Oprócz testów ujawnionych w niniejszym dokumencie, próbki można testować pod względem inhibicji aktywności liganda zalpha11 z użyciem różnych testów przeznaczonych do pomiaru wiązania receptora, stymulacji/inhibicji odpowiedzi komórkowych zależnych od liganda zalpha11 lub proliferacji komórek wykazujących ekspresję receptora zalpha11.

Polipeptyd liganda zalpha11 można poddawać ekspresji w postaci fuzji ze stałym regionem łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, zwykle fragmentem Fe, który zawiera dwie domeny regionu stałego i nie posiada regionu zmiennego. Metody wytwarzania takich fuzji opisano w opisach patentowych US nr 5 155 027 i 5 567 584. Takie fuzje są zwykle wydzielane w postaci cząsteczek multimerycznych, przy czym części F są połączone między sobą wiązaniami disiarczkowymi i dwa polipeptydy niebędące Ig są położone bardzo blisko siebie. Fuzje tego typu można stosować np. do dimeryzacji, zwiększania stabilności i okresu półtrwania in vivo, do oczyszczania liganda przez powinowactwo, jako naPL 207 350 B1 rzędzie w testach in vitro lub antagonistę. Do stosowania w testach chimery wiąże się z podłożem poprzez region Fc i używa w teście ELISA.

Polipeptyd wiązania liganda zalpha11 można także stosować do oczyszczania liganda. Polipeptyd unieruchamia się na stałym podłożu, takim jak kulki agarozy, usieciowana agaroza, szkło, żywice celulozowe, żywice na bazie krzemionki, polistyren, usieciowany poliakrylamid lub inne materiały stabilne w warunkach stosowania. Metody wiązania polipeptydów ze stałymi podłożami są znane w tej dziedzinie i obejmują chemię amin, aktywację bromkiem cyjanogenu, aktywację N-hydroksysukcynoimidem, aktywację epoksydową, aktywację sulfhydrylową i aktywację hydrazydkową. Uzyskane środowisko ma zasadniczo postać kolumny, a płyny zawierające ligand przepuszcza się przez kolumnę jeden lub więcej razy, aby pozwolić na związanie liganda z polipeptydem receptora. Następnie ligand wymywa się stosując zmiany stężenia soli, czynniki dezintegrujące (chlorowodorek guanidyny) lub pH, aby rozerwać wiązanie ligand-receptor.

Korzystnie można wykorzystywać system testowy, który obejmuje receptor wiążący ligand (lub przeciwciało, jeden element pary komplementarnej/antykomplementarnej) lub jego fragment wiązania oraz dostępne na rynku urządzenie biosensorowe (np. BIAcore™, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Taki receptor, przeciwciało, element pary komplementarnej/antykomplementarnej lub fragment unieruchamia się na powierzchni chipa receptora. Wykorzystanie tego urządzenia opisano w Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-240, 1991 oraz Cunningham i Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63. 1993. Receptor, przeciwciało, element lub fragment przyłącza się kowalentnie, stosując chemię amin lub wodosiarczków, do włókien dekstranowych, które są przyłączone do folii złota wewnątrz naczynia przepływowego.

Próbkę testową przepuszcza się przez naczynia. Jeśli ligand, epitop, lub przeciwny członek pary komplementarnej/antykomplementarnej jest obecny w próbce, będzie się wiązać odpowiednio z unieruchomionym receptorem, przeciwciałem lub elementem, powodując zmianę współczynnika załamania środowiska, co wykrywa się jako zmianę w powierzchniowym rezonansie plazmonowym folii złota. Ten system pozwala na określenie współczynników włączenia i wyłączenia, z których można obliczyć powinowactwo i oszacować stechiometrię wiązania. Alternatywnie wiązanie można liganda z receptorem analizować przy użyciu technologii SELDI(TM) (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA).

Polipeptydy receptora wiążącego ligand można także stosować w innych testach znanych w technice. Takie systemy obejmują analizę Scatcharda do określania powinowactwa wiązania (patrz Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) oraz testy kalorymetryczne (Cunningham i inni. Science 253: 545-48, 1991; Cunningham i inni. Science 245: 821-25, 1991).

Polipeptydy liganda zalpha11 można także stosować do wytwarzania przeciwciał, które wiążą się z epitopami liganda zalpha11, peptydami lub polipeptydami. Polipeptyd liganda zalpha11 lub jego fragment służy jako antygen (immunogen) do szczepienia zwierzęcia i wzbudzania odpowiedzi immunologicznej. Specjalista będzie wiedział, że antygeniczne polipeptydy niosące epitop zawierają sekwencję mającą co najmniej 6, korzystnie co najmniej 9 i korzystniej co najmniej 15 do około 30 sąsiadujących reszt aminokwasowych polipeptydu liganda zalpha11 (np. SEQ ID Nr: 2). Należą do nich polipeptydy zawierające większą część polipeptydu liganda zalpha11, czyli od 30 do 100 reszty do całej długości sekwencji aminokwasowej. Antygeny lub epitopy immunogeniczne mogą także obejmować dołączone znaczniki, adjuwanty i nośniki, jakie opisano w niniejszym dokumencie. Odpowiednie antygeny obejmują polipeptyd liganda zalpha11 kodowany przez SEQ ID Nr: 2 od aminokwasu numer 32 do aminokwasu numer 162 lub jego ciągły fragment od 9 do 131. Inne odpowiednie antygeny obejmują pełnej długości, dojrzały ligand zalpha11, helisy A-D i pojedyncze lub wielokrotne helisy A, B, C, i D struktury wiązki czterohelikalnej liganda zalpha11, jakie opisano w niniejszym dokumencie. Zalecane peptydy do stosowania jako antygeny są peptydami hydrofilowymi, takimi jak przewidziane przez specjalistę na podstawie wykresu hydrofobowości, jaki opisano w niniejszym dokumencie, np. reszty aminokwasowe 114-119, 101-105, 126-131, 113-118 i 158-162 z SEQ ID Nr: 2.

Przeciwciała wytworzone z tej odpowiedzi odpornościowej przez szczepienie zwierzęcia tymi antygenami można izolować i oczyszczać jak opisano w niniejszym dokumencie. Metody wytwarzania i izolowania przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych są dobrze znane w technice. Zobacz np. Current Protocols in Immunology, Cooligan i inni (red.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, drugie wydanie. Cold Spring Harbor, NY, 1989; oraz Hurrell, J. G. R., red., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications. CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982.

PL 207 350 B1

Dla specjalisty będzie oczywiste, że przeciwciała ciepłokrwiste można wytworzyć szczepiąc różne ciepłokrwiste zwierzęta, takie jak konie, krowy, kozy, owce, psy, kurczęta, króliki, myszy i szczury polipeptydem liganda zalpha11 lub jego fragmentem. Immunogeniczność polipeptydu liganda zalpha11 można zwiększyć poprzez stosowanie adjuwanta, takiego jak ałun (wodorotlenek glinu) albo kompletny lub niekompletny adjuwant Freunda. Polipeptydy użyteczne do immunizacji obejmują także polipeptydy fuzyjne, takie jak fuzje liganda zalpha11 lub jego części z polipeptydem immunoglobuliny lub z białkiem wiążącym maltozę. Immunogen polipeptydowy może być cząsteczką pełnej długości lub jej częścią. Jeśli część polipeptydu jest „podobna do haptenu”, taką część można korzystnie łączyć lub wiązać z nośnikiem makrocząsteczkowym (takim jak hemocyjanina z Megatlura crenalata (KLH), albumina surowicy bydlęcej (BSA) lub toksoid tężcowy) w celu immunizacji.

W niniejszym dokumencie przyjmuje się że, określenie „przeciwciała” obejmuje przeciwciała poliklonalne, przeciwciała poliklonalne oczyszczone przez powinowactwo, przeciwciała monoklonalne oraz fragmenty wiążące antygen, takie jak F(ab')2 i fragmenty proteolityczne Fab. Obejmują one także genetycznie przebudowane nieuszkodzone przeciwciała całe lub fragmenty zmienione metodami inżynierii genetycznej, takie jak przeciwciała chimeryczne, fragmenty Fv, przeciwciała o pojedynczym łańcuchu i inne, jak również syntetyczne peptydy wiążące antygen oraz polipeptydy.

Przeciwciała inne niż ludzkie mogą być humanizowane przez szczepienie innych niż ludzkie CDR na ludzkie regiony zrębowe i stałe lub przez wprowadzenie całej innej niż ludzka domeny zmiennej (ewentualnie „opłaszczenie” ich powierzchnią podobną do ludzkiej przez zastąpienie reszt wystających, przy czym powstaje „obłożone” przeciwciało). W pewnych przypadkach humanizowane przeciwciała mogą zawierać inne niż ludzkie reszty w ludzkich domenach zrębowych regionu zmiennego wzmacniając cechy prawidłowego wiązania. Dzięki humanizowaniu przeciwciała okres półtrwania biologicznego może zostać zwiększony, a prawdopodobieństwo szkodliwych odpowiedzi odpornościowych podczas podawania ludziom, zostaje zmniejszone. Ponadto ludzie przeciwciała można wytworzyć u transgenicznych zwierząt nie będących ludźmi, które zmieniono, tak aby zawierały ludzkie geny immunoglobuliny jak ujawniono w publikacji WIPO WO 98/24893. Zaleca się, aby endogeniczne geny immunoglobuliny u tych zwierząt były inaktywowane lub wyeliminowane, np. przez rekombinację homologiczną.

Uważa się, że przeciwciała wiążą swoiście jeśli:

1) wykazują próg aktywności wiązania i

2) nie reagują krzyżowo w sposób istotny z pokrewnymi cząsteczkami polipeptydów.

Poziom progowy wiązania jest określony, jeśli przeciwciała liganda zalpha11 według niniejszego wynalazku wiążą się z polipeptydem, peptydem lub epitopem liganda zalpha11, z powinowactwem co najmniej 10-krotnie większym niż powinowactwo wiązania z polipeptydem kontrolnym (niezalpha11). Zaleca się, aby przeciwciała wykazywały powinowactwo wiązania (Ka) wynoszące 10⁶ M^-1 lub więcej, korzystnie 10⁷ M^-1 więcej, korzystniej 10⁸ M^-1 lub więcej, a najkorzystniej 10⁹ M^-1 lub więcej. Powinowactwo wiązania przeciwciała może łatwo typowy przeciętny specjalista, np. przez analizę Scatcharda (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672,194 9).

To, czy przeciwciała antyligand zalpha11 nie reagują krzyżowo w sposób istotny z pokrewnymi cząsteczkami polipeptydowymi, stwierdza się np. za pomocą przeciwciała wykrywającego polipeptyd liganda zalpha11, ale nie znane polipeptydy pokrewne, przy użyciu standardowej analizy western blot (Ausubel i inni, jak wyżej). Przykładami znanych polipeptydów pokrewnych są ortologi, i paralogi oraz podobni znani przedstawiciele rodziny białek. Można także przeprowadzić skrining przy użyciu innego niż ludzki liganda zalpha11 i zmutowanych polipeptydów liganda zalpha11. Ponadto przeciwciała mogą być „przesiewane wobec” znanych polipeptydów pokrewnych w celu wyizolowania populacji, która swoiście wiąże się z polipeptydami liganda zalpha11. Przykładowo, przeciwciała wzbudzone wobec liganda zalpha11 są adsorbowane do pokrewnych polipeptydów przylegających do nierozpuszczalnej matrycy; przeciwciała swoiste wobec liganda zalpha11 będą przepływać przez matrycę w odpowiednich warunkach buforowych.

Skrining pozwala na izolację przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych nie reagujących krzyżowo z blisko spokrewnionymi polipeptydami (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow i Lane (red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan i inni (red.). National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). Skrining i izolacja przeciwcił swoistych są dobrze znane w technice. Zobacz Fundamental Immunology, Paul (red.), Raven Press, 1993; Getzoff i inni, Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Coding, J. W. (wydawcy), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin i inni. Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101,1984.

PL 207 350 B1

Swoiste wiązanie przeciwciała antyligand zalpha11 można wykrywać licznymi metodami z techniki oraz opisanymi poniżej.

Do wykrywania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z białkami lub peptydami liganda zalpha11, można wykorzystać różne testy znane specjalistom. Przykładowe testy opisano szczegółowo w Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow i Lane (red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Reprezentatywne przykłady takich testów obejmują: immunoelektroforezę jednoczesną, test radioimmunologiczny, strącanie radioimmunologiczne, test immunoabsorpcyjny wiązania enzymu (ELISA), test dot blot lub Western blot, test hamowania lub współzawodnictwa, test sandwiczowy. Oprócz tego przeciwciała można przesiewać pod względem wiązania z typem dzikim przeciwko zmutowanemu białku lub polipeptydowi liganda zalpha11.

Przeciwciała wobec liganda zalpha11 można stosować do znakowania komórki wykazującej ekspresję zalpha11, do izolacji liganda zalpha11 przez oczyszczanie przez powinowactwo, do testów diagnostycznych określających poziom krążącego polipeptydu liganda zalpha11, wykrywania lub oceny ilościowej rozpuszczalnego liganda zalpha11 jako markera ukrytej patologii lub choroby, w metodach analitycznych, wykorzystujących FACS; do skriningu bibliotek ekspresyjnych; do tworzenia przeciwciał antyidiotypowych, oraz jako neutralizujące przeciwciała lub jako antagoniści do blokowania aktywności liganda zalpha11 in vitro oraz in vivo. Odpowiednie bezpośrednie znaczniki lub etykiety obejmują radionuklidy, enzymy, substraty, kofaktory, inhibitory, markery fluorescencyjne, markery chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne i inne; pośrednie znaczniki lub etykiety mogą obejmować stosowanie biotyny-awidyny lub innej pary uzupełnienie/antyuzupełnienie jako związków pośrednich. Przeciwciała według niniejszego dokumentu można także bezpośrednio lub pośrednio sprzęgać z lekami, toksynami, radionuklidami i innymi i te koniugaty stosować do diagnostyki in vivo lub zastosowań terapeutycznych. Ponadto przeciwciała wobec liganda zalpha11 lub ich fragmenty mogą być stosowane in vitro do wykrywania zdenaturowanego liganda zalpha11 lub jego fragmentów w testach, np. western blot lub innych testach znanych w tej dziedzinie.

Odpowiednie wykrywalne cząsteczki można bezpośrednio lub pośrednio łączyć z polipeptydem lub przeciwciałem obejmują one radionuklidy, enzymy, substraty, kofaktory, inhibitory, markery fluorescencyjne, markery chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne i inne. Odpowiednie cząsteczki cytotoksyczne mogą być bezpośrednio lub pośrednio połączone z polipeptydem lub przeciwciałem; obejmują one toksyny bakteryjne lub roślinne (np, toksynę błonicy, saporynę, egzotoksynę Pseudomonas, rycynę, abrynę i inne), jak również radionuklidy terapeutyczne, takie jak jod-131, ren-188 lub itr-90 (bezpośrednio połączone z polipeptydem lub przeciwciałem albo pośrednio połączone za pomocą np. cząstki chałatującej). Polipeptydy lub przeciwciała można także sprzęgać z lekami cytotoksycznymi, takimi jak adriamycyna. W celu bezpośredniego przyłączenia cząsteczki wykrywalnej lub cytotoksycznej, cząsteczkę wykrywalną lub cytotoksyczną można sprzęgać z elementem pary uzupełnienie/antyuzupełnienie, przy czym drugi ełement wiąże się z polipeptydem lub częścią przeciwciała. Do tych celów przykładem pary uzupełnienie/antyuzupełnienie jest biotyna/streptawidyna.

Polipeptydy wiążące działają także jako „antagoniści” liganda zalpha11, blokując wiązanie liganda zalpha11 i przewodzenie sygnału in vitro oraz in vivo. Te polipeptydy przeciwko wiązaniu liganda zalpha11 byłyby użyteczne przy hamowaniu aktywności liganda zalpha11 lub wiązania z białkiem.

Białka fuzyjne peptyd-toksyna lub białka fuzyjne przeciwciało-toksyna można stosować do hamowania komórki docelowej lub tkanki lub oderwania (przykładowo do leczenia komórki lub tkanki). Alternatywnie, jeśli peptyd posiada wiele domen funcjonalnych (czyli domenę aktywacji lub domenę wiązania liganda oraz domenę kierującą), białko fuzyjne obejmujące tylko domenę kierującą może być odpowiednie do kierowania cząsteczki wykrywalnej, cząsteczki cytotoksycznej lub cząsteczki komplementarnej do badanego rodzaju komórki lub tkanki. W przypadkach, w których białko fuzyjne zawierające tylko pojedynczą domenę obejmuje cząsteczkę komplementarną, cząsteczkę antykomplementarną można sprzęgać z cząsteczką wykrywalną lub cytotoksyczną. Takie białka fuzyjne domena-cząsteczka komplementarna reprezentują więc ogólny nośnik kierujący do dostarczania specyficznych wobec komórek/tkanek ogólnych koniugatów cząsteczkowych antykomplementarny-wykrywalny/cototoksyczny.

Białka fuzyjne ligand zalpha11-cytokina lub białka fuzyjne przeciwciało-cytokina można stosować do wzmacniania in vivo zabijania tkanek docelowych (np. nowotworów krwi oraz szpiku kostnego), jeśli peptyd liganda zalpha11 lub przeciwciało antyligand zalpha11 celuje w komórkę krwi lub szpiku kostnego o nadmiernej proliferacji (zobacz ogólnie, Hornick i inni, Blood 89: 4437-47, 1997). Opisane białka fuzyjne umożliwiają ukierunkowanie cytokiny do pożądanego miejsca działania, za34

PL 207 350 B1 pewniając przez to miejscowo podniesione stężenie cytokiny. Odpowiednie polipeptydy liganda zalpha11 lub przeciwciała antyligand zalpha11 celują w niepożądaną komórkę lub tkankę (czyli nowotwór lub białaczkę), zaś połączona cytokina pośredniczy we wzmocnionej lizie komórki docelowej przez komórki efektorowe. Odpowiednie cytokiny do tego celu obejmują np. interleukinę 2 i czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF).

Różnicowanie jest procesem progresywnym i dynamicznym, rozpoczynającym się od pluripotencjalnych komórek macierzystych i kończącym się ostatecznie zróżnicowanymi komórkami. Pluripotencjalne komórki macierzyste, które mogą regenerować się bez związania z rodem, wykazują ekspresję zbioru markerów zróżnicowania, które zostają utracone, gdy zachodzi związanie z rodem. Komórki potomne wykazują ekspresję zbioru markerów zróżnicowania, które mogą (lub nie) kontynuować ekspresję w miarę, jak komórki przechodzą szlak rodu komórkowego w kierunku dojrzewania. Markery różnicowania, które ulegają ekspresji wyłącznie przez komórki dojrzałe, oznaczają zwykle właściwości funkcjonalne, takie jak produkty komórkowe, enzymy do wytwarzania produktów komórkowych i receptory. Etap różnicowania populacji komórkowej jest monitorowany przez identyfikację markerów występujących w populacji komórek.

Istnieje dowód sugerujący, że czynniki stymulujące szlak specyficznego rodzaju komórek w kierunku końcowego różnicowania lub nie zróżnicowania wpływają na całą populacje komórkową poczynając od wspólnego prekursora lub komórki macierzystej. Tak więc, niniejszy wynalazek obejmuje stymulowanie lub hamowanie proliferacji komórek limfoidalnych, komórek krwiotwórczych i komórek nabłonkowych.

Ligand zalpha11 izolowano z tkanki, o której wiadomo, że pełni ważną funkcję immunologiczną i która zawiera komórki odgrywające rolę w układzie odpornościowym. Ligand zalpha11 podlega ekspresji w wybieranych pod względem CD3, aktywowanych komórkach krwi obwodowej; wykazano, że ekspresja liganda zalpha11 zwiększa się po aktywacji komórki T. Ponadto wyniki doświadczeń opisanych w niniejszym dokumencie w części przykłady pokazują, że polipeptydy według niniejszego wynalazku mają wpływ na wzrost/ekspansję i/lub stan zróżnicowania komórek NK lub przodków NK. Inny dowód pokazuje, że ligand zalpha11 wpływa na proliferację i/lub różnicowanie komórek T i komórek B in vivo. Czynniki, które zarówno stymulują proliferację przodków krwiotwórczych, jak i aktywują dojrzałe komórki, są ogólnie znane. Komórki NK odpowiadają na samą IL-2, lecz proliferacja i aktywacja wymaga zasadniczo dodatkowych czynników wzrostu. Przykładowo, wykazano, że IL-7 i Steel Factor (ligand c-kit) były wymagane do tworzenia kolonii przodków NK. IL-15 + IL-2 w połączeniu z IL-7 i Steel Factor były bardziej skuteczne (Mrózek i inni, Blood 87: 2632-2640, 1996). Jednak, niezidentyfikowane cytokiny mogą być konieczne do proliferacji specyficznych podzbiorów komórek NK i/lub przodków NK (Robertson i inni, Blood 76: 2451-2438, 1990). Kompozycja zawierająca ligand zalpha11 i IL-15 stymuluje przodków NK i komórki NK, dowodząc, że kompozycja ta jest silniejsza niż wcześniej opisywane czynniki i kombinacje czynników.

Testy mierzące różnicowanie obejmują np. pomiar markerów komórkowych związanych z ekspresją specyficzną dla etapu w tkance, aktywność enzymatyczną, aktywność funkcjonalną lub zmiany morfologiczne (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell. Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; wszystkie załączone do niniejszego dokumentu przez odniesienie). Alternatywnie polipeptyd liganda zalpha11 sam może służyć jako dodatkowy marker na powierzchni komórki lub wydzielony, związany z ekspresją specyficzną dla etapu w tkance. W związku z tym, bezpośredni pomiar polipeptydu liganda zalpha11 lub utraty jego ekspresji w tkance w miarę jej różnicowania może służyć jako marker różnicowania tkanek.

Podobnie, bezpośredni pomiar polipeptydu liganda zalpha11 lub jego utraty ekspresji w tkance można określić w tkance lub w komórkach w miarę jak zachodzi wzrost nowotworu. Wzrost inwazyjności i ruchomości komórek lub wzrost lub utrata ekspresji liganda zalpha11 w stanie przednowotworowym lub nowotworowym w porównaniu z tkanką prawidłową, może służyć jako diagnostyka transformacji, inwazji i przerzutu w progresji nowotworu. W związku z tym znajomość etpu progresji i przerzutów nowotworu będzie pomocna lekarzowi w wyborze najlepszej terapii lub agresywności leczenia, dla danego konkretnego pacjenta z nowotworem. Metody pomiaru wzrostu i utraty ekspresji (mRNA lub białka) są dobrze znane w technice i opisane w niniejszym dokumencie i można je stosować do ekspresji liganda zalpha11. Przykładowo, pojawienie lub zniknięcie polipeptydów, które regulują ruchliwość komórek, można stosować pomocniczo przy diagnozie i rokowaniach raka prostaty (Banyard, J. i Zetter, B. R., Cancer and Metast. Rev. 17: 449-458, 1999). Jako efektor ruchliwości komórkowej,

PL 207 350 B1 wzrost lub utrata ekspresji liganda zalpha11 może służyć jako rozpoznanie nowotworu limfoidalnego, komórek B, nabłonkowych, krwiotwórczych i innych nowotworów.

Ponadto, aktywność i wpływ liganda zalpha11 na progresję i przerzuty nowotworu można mierzyć in vivo. Do badania wpływu polipeptydów, związków lub innych metod leczenia progresji nowotworu, otrzymano kilka synergicznych modeli mysich. W tych modelach komórki nowotworu pasażowano w hodowli i wszczepiano myszom tego samego szczepu co dawca nowotworu. Komórki rozwijają się w nowotwory mające podobne cechy u myszy biorców, zaś w niektórych modelach wystąpią także przerzuty. Odpowiednie modele nowotworu do tych badań obejmują między innymi raka płuca Lewisa (ATCC Nr CRL-1642) i czerniaka B 16 (ATCC Nr CRL-6323). Obie są powszechnie używanymi linami nowotworowymi, jednorodnymi w stosunku do myszy C57BL6/J, które łatwo się hoduje i manipuluje in vitro. Nowotwory otrzymane z wszczepienia obu tych linii komórkowych są zdolne do przerzutów do płuca u myszy C57BL6/J. Model raka płuca Lewisa ostatnio stosowano u myszy do identyfikacji inhibitora angiogenezy (O'Reilly M. S. i inni, Cell. 79: 315-328,1994). Myszy C57BL6/J traktuje się czynnikiem doświadczalnym albo przez codzienne wstrzykiwanie rekombinowanego białka, agonisty lub antagonisty, albo jednorazową iniekcję rekombinowanego wirusa. Trzy dni po tym zabiegu 10⁵ do 10⁶ komórek wszczepia się pod skórę grzbietu.

Alternatywnie, same komórki można zakazić rekombinowanym adenowirusem, np. wykazującym ekspresję liganda zalpha11, przed wszczepieniem, tak że białko jest syntetyzowane w nowotworze lub raczej wewnątrz komórki niż układowo. U myszy zwykle rozwijają widoczne nowotwory powstają zwykle w ciągu 5 dni. Nowotwory pozostawia się do wzrostu przez okres do 3 tygodni, podczas których mogą osiągnąć wielkość 1500-1800 mm w grupie traktowanej kontrolnej. Wielkość guza i ciężar ciała są dokładnie monitorowane podczas doświadczenia. W momencie uśmiercenia, guz usuwa się i waży razem z płucem i wątrobą. Jak się okazało, ciężar płuca dobrze koreluje z występowaniem przerzutów. Jako dodatkowy wskaźnik, zlicza się przerzuty na powierzchni płuca. Wycięty guz, płuca i wątrobę preparuje się do badania histopatologicznego, immunohistochemii i hybrydyzacji in situ, stosując metody znane w technice i opisane w niniejszym dokumencie. Można więc ocenić wpływ ekspresji badanego polipeptydu, np. liganda zalpha11, na zdolność nowotworu do wytwarzania unaczynienia i tworzenia przerzutów. Oprócz tego, obok stosowania adenowirusa, wszczepione komórki można krótkotrwale transfekować ligandem zalpha11. Użycie stabilnych transfektantów liganda zalpha11, jak również użycie indukowalnych promotorów aktywujących ekspresją liganda zalpha11 in vivo, są znane w technice i można je stosować w tym systemie do oceny indukcji przerzutów liganda zalpha11. Ponadto oczyszczony ligand zalpha11 lub kondycjonowane pożywki liganda zalpha11 można bezpośrednio wstrzykiwać do tego modelu mysiego i skutkiem tego stosować w tym systemie. Informacje ogólne, patrz O'Reilly M. S, i inni. Cell. 79: 315-328, 1994; i Rusciano D. i inni, Murine Models of Liver Metastasis, Invasion Metastasis 14: 349-361, 1995.

Ligand zalpha11 będzie użyteczny w leczeniu powstawania nowotworu, a zatem byłby użyteczny w leczeniu nowotworu. Ligand zalpha11 hamuje proliferację stymulowaną IL-4 prawidłowych komórek B stymulowanych anty-IgM i podobny efekt obserwuje się w liniach nowotworowych komórek B co wskazuje, że może istnieć korzyść terapeutyczna przy leczeniu pacjentów ligandem zalpha11 w celu indukcji komórek nowotworu komórki B w stan mniej proliferacyjny. Ligand można by podawać w połączeniu z innymi czynnikami już stosowanymi, w tym zarówno konwencjonalnymi środkami chemioterapeutycznymi, jak również modulatorami odporności, takimi jak interferon alfa. Interferony alfa/beta okazały się skuteczne w leczeniu niektórych białaczek i modeli zwierzęcych chorób, przy czym wpływ hamujący wzrost interferonu alfa i liganda zalpha11 sumuje się dla co najmniej jednej linii komórkowej nowotworu pochodzącego od linii komórkowej komórek B.

Niniejszy wynalazek zastrzega sposób zmniejszania proliferacji nowotworu komórek B lub T, obejmujący podawanie ssakowi z nowotworem komórek B lub T ilości kompozycji liganda zalpha11 wystarczającej do zmniejszenia proliferacji nowotworowych komórek B lub T. W innych postaciach realizacji kompozycja może zawierać co najmniej jedną inną cytokinę wybraną z grupy obejmującej IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligand Flt3 lub czynnik komórki macierzystej.

W innym aspekcie niniejszy wynalazek zastrzega sposób zmniejszania proliferacji nowotworowych komórek B lub T obejmujący podawanie ssakowi z nowotworem komórek B lub T ilości kompozycji antagonisty liganda zalpha11 wystarczającej do zmniejszenia proliferacji nowotworowych komórek B lub T. W innych postaciach realizacji kompozycja może obejmować co najmniej jedną inną cytokinę wybraną z grupy obejmującej IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligand Flt3 lub czynnik komórki macierzystej. Ponadto antagonista liganda zalpha11 może być białkiem fuzyjnym ligand/toksyna.

PL 207 350 B1

Toksynę fuzyjną ligand zalpha11-saporyna można wykorzystać przeciwko podobnemu zbiorowi białaczek i chłoniaków, zwiększając zakres białaczek, które można leczyć ligandem zalpha11. Toksyna fuzyjna, która pośredniczy w aktywacji receptora zalpha11, zapewnia dwa niezależne sposoby hamowania wzrostu komórki docelowej, przy czym pierwszy jest identyczny z wpływem obserwowanym dla samego liganda, a drugi powoduje dostarczenie toksyny przez wejście, do wnętrza receptora. Ograniczony do komórek limfoidalnych wzór ekspresji receptora zalpha11 sugeruje, że koniugat ligand-saporyna może być tolerowany przez pacjentów.

Jeśli leczenie nowotworów złośliwych obejmuje allogeniczny przeszczep szpiku kostnego lub komórek macierzystych, ligand zalpha11 może być wartościowy przy zwiększaniu wpływu przeszczepu na nowotwór. Ligand zalpha11 stymuluje wytwarzanie litycznych komórek NK z przedków szpiku i stymuluje proliferację komórek T, a następnie aktywację receptorów antygenowych. Zatem, gdy pacjenci otrzymują allogeniczne przeszczepy szpiku, ligand zalpha11 będzie zwiększał powstawanie odpowiedzi antynowotworowych, przy wlewie limfocytów dawcy lub bez.

Rozmieszczenie tkankowe receptora dla danej cytokiny zapewnia silne wskazanie potencjalnych miejsc działania tej cytokiny. Analiza nothern receptora zalpha11 ujawniła transkrypty w ludzkiej śledzionie, grasicy, węźle chłonnym, szpiku kostnym i leukocytach krwi obwodowej. Specyficzne rodzaje komórek identyfikowano jako wykazujące ekspresję receptorów zalpha11 i widoczne były silne sygnały w mieszanej reakcji limfocytowej (MLR) i w chłoniaku Burkitta Raji. Dwie monocytarne linie komórkowe, THP-1 (Tsuchiya i inni, Int J. Cancer 26: 171-176, 1980) i U937 (Sundstrom i inni, Int. J. Cancer 17: 565-577, 1976), były negatywne.

Receptor zalpha11 ulega ekspresji na stosunkowo wysokim poziomie w MLR, w której komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMNC) od dwóch osobników miesza się, powodując obustronną aktywację. Wykrycie wysokich poziomów transkryptu w MLR, lecz nie w pozostałych populacjach komórek T lub B, sugeruje, że ekspresja receptora zalpha11 może być indukowana w jednym lub więcej rodzajach komórek podczas aktywacji. Aktywację populacji komórek T i B można uzyskać sztucznie przez stymulowanie komórek PMA i jonomycyną. Gdy posortowane komórki poddawano tym warunkom aktywacji, poziom transkryptu receptora zalpha11 zwiększał się w obu rodzajach komórek, potwierdzają rolę dla tego receptora i liganda zalpha11 w odpowiedzi immunologicznej, zwłaszcza ekspansji autokrynowej i parakrynowej komórek T i B podczas aktywacji. Ligand zalpha11 może także odgrywać rolę w ekspansji bardziej prymitywnych przodków związanych z tworzeniem limfocytów.

Odkryto, że receptor zalpha11 występuje w małych ilościach w pozostałych komórkach T i B i wzrastały one podczas aktywacji w obu rodzajach komórek. Co interesujące, komórki B także obniżają sygnał szybciej niż komórki T, co wskazuje, że amplituda sygnału i czas trwania wygaszania sygnału są istotne dla prawidłowej regulacji odpowiedzi komórki B.

Oprócz tego znaczny odsetek jelitowych komórek blaszki właściwej wykazuje pozytywne sygnały hybrydyzacji z receptorem zalpha11. Tkanka ta składa się z mieszanej populacji komórek limfoidowych, w tym aktywowanych komórkek T CD4+ i aktywowanych komórkek B. Dysfunkcja odporności, w danej przewlekłej aktywacji odpowiedzi odpornościowej błony śluzowej, odgrywa istotną rolę w etiologii choroby Crohna; nieprawidłowa odpowiedź i/lub wytwarzanie cytokin zapalnych jest także czynnikiem wywołującym podejrzenia (Braegger i inni, Annals Allergy 72: 135-141, 1994; Sartor R. B. Am. J. Gastroenterol. 92: 5S-11S, 1997. Ligand zalpha11 razem z IL-15 rozprzestrzenia komórki NK od przodków szpiku kostnego i wzmacnia funkcję efektorową komórek NK. Ligand zalpha11 także współstymuluje dojrzałe komórki B stymulowane przeciwciałami anty-CD40, lecz hamuje proliferację komórek B w odpowiedzi na sygnały IgM.

Ligand zalpha11 wzmacnia proliferację komórek T razem z sygnałem przez receptor komórki T, a nadekspresja u myszy transgenicznych prowadzi do niedoboru limfocytów i ekspansję monocytów i granulocytów. Te efekty piej otropowe liganda zalpha11 sugerują, że może on być użyteczny leczniczo dla szerokiego zakresu chorób powstających w wyniku defektów układu odpornościowego, w tym (lecz bez ograniczenia) tocznia układowego rumieniowatego (SLE), reumatoidalnego zapalenia stawów (RA), stawrdnienia rozsianego (MS), osłabienia mięśniowego i cukrzycy. Warto zauważyć, że te choroby są wynikiem złożonej sieci dysfunkcji odporności (np. SLE jest objawem defektów zarówno komórek T, jak i B) i że komórki odpornościowe zależą od interakcji z innymi, aby wzbudzić silną odpowiedź odpornościową. Zatem ligand zalpha11 (lub antagonista liganda), który można stosować do manipulowania więcej niż jednym rodzajem komórek odpornościowych, jest istotnym kandydatem terapeutycznym do ingerencji w wiele etapów choroby.

PL 207 350 B1

Polipeptydy i białka według niniejszego wynalazku można także stosować ex vivo, np. w autologicznej hodowli szpiku. W skrócie, szpik kostny pobiera się od pacjenta przed chemoterapią lub przeszczepem narządu i traktuje ligandem zalpha11, ewentualnie w połączeniu z jedną lub więcej innych cytokin. Następnie traktowany szpik zwraca się pacjentowi po chemioterapii, aby przyspieszyć regenerację szpiku lub po przeszczepie, aby zahamować chorobę przeszczep kontra gospodarz. Oprócz tego białka według niniejszego wynalazku można także stosować do ekspansji ex vivo szpiku lub komórek progenitorowych krwi obwodowej (PBPC).

Przed traktowaniem szpik można stymulować czynnikiem komórki macierzystej (SCF), aby uwolnić wczesne komórki progenitorowe do krążenia obwodowego. Te komórki można zbierać i zatężać z krwi obwodowej, a następnie traktować w hodowli ligandem zalpha11, ewentualnie w połączeniu z jedną lub więcej innych cytokin, w tym, lecz bez ograniczenia, SCF, IL-2, IL-4, IL-7 lub IL-15, w celu różnicowania i proliferacji do zagęszczonych hodowli limfoidowych, które następnie można zwrócić pacjentowi po chemioterapii lub przeszczepie.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu rozwoju komórek krwiotwórczych i krwiotwórczych komórek progenitorowych, obejmujący hodowlę szpiku kostnego lub komórek krwi obwodowej z kompozycją zawierającą ilość liganda zalpha11 wystarczającą do wytworzenia większej liczby komórek limfoidalnych w szpiku kostnym lub komórkach krwi obwodowej, w porównaniu ze szpikiem kostnym lub komórkami krwi obwodowej hodowanymi przy braku liganda zalpha11. W innych postaciach realizacji komórki krwiotwórcze i krwiotwórcze komórki progenitorowe oznaczają komórki limfoidalne. W innej postaci realizacji komórki limfoidalne oznaczają komórki NK lub cytotoksyczne komórki T. Ponadto kompozycja może także zawierać co najmniej jedną inną cytokinę wybraną z grupy obejmującej IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligand Flt3 i czynnik komórki macierzystej.

Alternatywnie, ligand zalpha11 może aktywować układ odpornościowy, co byłoby istotne w zwiększaniu odporności na choroby zakaźne, leczeniu pacjentów z obniżoną odpornością, takich jak pacjenci HIV+ lub przy ulepszaniu szczepionek. W szczególności stymulacja ligandem zalpha11 lub rozwój komórek NK, lub ich przodków, miałaby wartość terapeutyczną przy leczeniu infekcji wirusowych oraz jako czynnik przeciwnowotworowy. Komórki NK, jak się uważa, odgrywają główną rolę w eliminacji komórek przerzutowych nowotworu, zaś pacjenci zarówno z przerzutami jak i guzami litymi odznaczają się podwyższonym poziomem aktywności komórek NK (Whiteside i inni, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 230: 221-244, 1998). Podobnie stymulacja ligandem zalpha11 odpowiedzi odpornościowej przeciwko wirusowym i nie wirusowym czynnikom patogennym (w tym bakteriom, pierwotniakom, i grzybom) stanowiłaby wartość terapeutyczną przy leczeniu takich infekcji przez hamowanie wzrostu takich czynników infekcyjnych. Poziom patogenu lub antygenu, takiego jak komórka nowotworu, obecnego w organizmie, można określić bezpośrednio lub pośrednio uzyskać licznymi metodami znanymi w technice i opisanymi w niniejszym dokumencie.

Niniejszy wynalazek obejmuje sposób stymulowania odpowiedzi odpornościowej u ssaka poddanego ekspozycji na antygen lub patogen, obejmujący etapy:

(1) bezpośredniego lub pośredniego określania poziomu antygenu lub patogenu obecnego u wymienionego ssaka;

(2) podawanie kompozycji obejmującej polipeptyd liganda zalpha11 w dopuszczalnym nośniku farmaceutycznym;

(3) określania bezpośrednio lub pośrednio poziomu antygenu lub patogenu u wymienionego ssaka; i (4) porównania poziomu antygenu lub patogenu w etapie 1 z poziomem antygenu lub patogenu w etapie 3, przy czym zmiana poziomu jest wskaźnikiem stymulowania odpowiedzi odpornościowej.

W innej postaci realizacji kompozycję liganda zalpha11 podaje się ponownie. W innych postaciach realizacji antygenem jest nowotwór komórki B, wirus, pasożyt lub bakteria.

W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy sposobu stymulowania odpowiedzi odpornościowej u ssaka poddanego ekspozycji wobec antygenu lub patogenu obejmujący:

(1) określanie poziomu przeciwciała swoistego wobec antygenu lub patogenu;

(2) podawanie kompozycji obejmującej polipeptyd liganda zalpha11 w dopuszczalnym nośniku farmaceutycznym;

(3) określanie poziomu przeciwciała specyficznego wobec antygenu lub patogenu po podaniu;

(4) porównanie poziomu przeciwciała w etapie (1) z poziomem przeciwciała w etapie (3), przy czym wzrost poziomu przeciwciała jest wskaźnikiem stymulowania odpowiedzi odpornościowej.

PL 207 350 B1

Polinukleotydy kodujące polipeptydy liganda zalpha11 są użyteczne w terapii genowej, gdzie pożądane jest zwiększanie lub hamowanie aktywności liganda zalpha11. Jeśli ssak posiada zmutowany lub gen liganda zalpha11 lub go nie posiada, gen liganda zalpha11 można wprowadzić do komórki ssaka. W jednej postaci realizacji gen kodujący polipeptyd liganda zalpha11 wprowadza się in vivo w wektorze wirusowym. Takie wektory obejmują wirusy atenuowane lub z defektywnym DNA, takie jak, bez ograniczenia, wirus opryszczki (HSV), wirus brodawczaka, wirus Epsteina Barra (EBV), adenowirus, wirus związany z adenowirusem (AAV) i inne. Zaleca się wirusy defektywne, które całkowicie lub prawie całkowicie nie posiadają genów wirusowych. Wirus defektywny nie jest zakaźny po wprowadzeniu do komórki.

Stosowanie defektywnych wektorów wirusowych pozwala na podawanie do komórki w specyficznym, zlokalizowanym obszarze, bez obawy, że wirus zakazi inne komórki. Przykłady poszczególnych wektorów obejmują, lecz nie ograniczają się do defektywnego wektora wirusa opryszczki 1 (HSV1) (Kaplitt i inni, Molec. Cell. Neurosci. 2: 320-30,1991), atenuowanego defektywnego wektora adenowirusowego, takiego jak wektor opisany w Stratford-Perricaudet i inni, J. Clin. Invest. 90: 626-30, 1992 oraz defektywnego wektora wirusa związanego z adenowirusem (Samulski i inni, J. Virol. 61: 3096-101.1987; Samulski i inni, J. Virol. 63: 3822-8,1989).

W innej postaci realizacji, gen liganda zalpha11 można wprowadzić w wektorze retrowirusowym, np. jak opisano w Anderson i inni, opis patentowy US nr 5 399 346; Mann i inni Cell. 33: 153, 1983; Temin i inni, opis patentowy US nr 4 650 764; Temin i inni, opis patentowy US nr 4 980 289; Markowitz i inni, J. Virol. 62: 1120, 1988; Temin i inni, opis patentowy US nr 5 124 263; międzynarodowa publikacja patentowa nr WO 95/07358, opublikowana 16 marca 1995 przez Dougherty i inni; oraz Kuo i inni, Blood 82: 845, 1993. Alternatywnie, wektor można wprowadzić przez lipofekcję in vivo stosując liposomy. Syntetyczne lipidy kationowe można stosować do wytworzenia liposomów w celu transfekcji in vivo genu kodującego marker (Felgner i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7, 1987; Mackey i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988). Stosowanie lipofekcji do wprowadzania egzogenicznych genów do specyficznych narządów in vivo ma pewne korzyści praktyczne. Molekularne kierowanie liposomów do specyficznych komórek stanowi jeden obszar korzyści. Dokładniej, kierowanie transfekcji do poszczególnych komórek stanowi jeden obszar korzyści. Przykładowo, kierowanie transfekcji do poszczególnych rodzajów komórek byłoby szczególnie korzystne w tkance o komorach jednorodnych, takich jak trzustka, wątroba, nerka i mózg. Lipidy mogą być chemicznie sprzężone z innymi cząsteczkami w celu kierowania. Ukierunkowanie białka (np. hormony lub neurotransmitery), białka, takie jak przeciwciała, lub cząsteczki nie peptydowe można sprzęgać z liposomami chemicznie.

Możliwe jest usunięcie komórek docelowych z organizmu, wprowadzenie wektora w postaci nagiego DNA plazmidu; a następnie ponowne wszczepienie transformowanych komórek do organizmu. Nagie wektory DNA w terapii genowej można wprowadzić do żądanych komórek gospodarza metodami znanymi w tej dziedzinie, np. przez transfekcję, elektroporację, mikroiniekcję, transdukcję, fuzję komórkową, DEAE dekstran, wytrącanie fosforanem wapnia, stosowanie działka genowego lub stosowanie przenośnika wektorowego DNA. Zobacz np. Wu i inni, J. Biol. Chem. 267: 963-7, 1992: Wu i inni, J. Biol. Chem. 263: 14621-4,1988.

Metodę antysensowną można stosować do hamowania transkrypcji genu liganda zalpha11, np. do hamowania proliferacji komórkowej in vivo. Polinukleotydy, które są komplementarne z segmentem polinukleotydu kodującego ligand zalpha11 (np. polinukleotydu z SEQ ID Nr: 1), przeznaczone są do wiązania z mRNA kodującym ligand zalpha11 i do hamowania translacji takiego mRNA. Takie antysensowne polinukleotydy stosuje się do hamowania ekspresji genów kodujących polipeptyd liganda zalpha11 w hodowli komórkowej lub u pacjenta.

Można także wytworzyć myszy zmienione w celu ekspresji genu liganda zalpha11, określone jako „myszy transgeniczne” oraz myszy, które wykazują całkowity brak działania genu liganda zalpha11, przytaczane jako „myszy znokautowane” (Snouwaert i inni. Science 252: 1083, 1992; Lowell i inni. Nature 366: 740-42, 1993; Capecchi, M. R., Science 244: 1288-1292, 1989; Palmiter, R. D. i inni Annu. Rev. Genet. 20: 465-499, 1986). Przykładowo, myszy transgeniczne, które wykazują nadekspresję liganda zalpha11, albo wszędzie albo pod działaniem promotora specyficznego dla tkanki lub ograniczonego przez tkankę, można stosować do stwierdzenia, czy nadekspresja wywołuje fenotyp. Przykładowo, nadekspresja dzikiego typu polipeptydu liganda zalpha11, fragmentu polipeptydu lub jego mutanta może zmieniać normalne procesy komórkowe, dając fenotyp, który identyfikuje tkankę, w której ekspresja liganda zalpha11 jest funkcjonalnie istotna i może wskazywać cel terapeutyczny dla

PL 207 350 B1 liganda zalpha11, jego agonistów lub antagonistów. Przykładowo, zalecaną myszą transgeniczną do uzyskania jest mysz, która wykazuje nadekspresję liganda zalpha11 (reszty aminokwasowe 32-162 SEQ z ID Nr: 2). Ponadto, taka nadekspresja może wywoływać fenotyp wykazujący podobieństwo do chorób człowieka. Podobnie myszy znokautowane pod względem liganda zalpha11 można stosować do określania, gdzie ligand zalpha11 jest absolutnie wymagany in vivo. Fenotyp myszy znokautowanych może sugerować efekty in vivo tego antagonisty liganda zalpha11, takie jak opisane w niniejszym dokumencie. Ludzki lub mysi cDNA liganda zalpha11 można stosować do wytworzenia myszy znokautowanych. Myszy te można wykorzystać do badania genu liganda zalpha11 i białka kodowanego przezeń in vivo i można je stosować jako modele in vivo dla odpowiednich chorób człowieka. Ponadto ekspresję u myszy transgenicznych antysensownych polinukleotydów liganda zalpha11 lub rybozymów skierowanych przeciwko zalpha11, opisanych w niniejszym dokumencie, można stosować analogicznie dla myszy transgenicznych opisanych powyżej. Można również przeprowadzić badania przez podawanie oczyszczonego białka liganda zalpha11.

W zastosowaniach farmaceutycznych, białka według niniejszego wynalazku opracowuje się do dostarczania pozajelitowego, szczególnie dożylnego lub podskórnego, zgodnie z konwencjonalnymi metodami. Bioaktywne polipeptydy lub koniugaty przeciwciał opisane w niniejszym dokumencie można dostarczać dożylnie, dotętniczo lub doprzewodowo albo można wprowadzać miejscowo w zamierzonym miejscu działania. Podawanie dożylne następuje przez iniekcję w bolusie lub infuzję przez typowy okres jednej do kilku godzin. Ogólnie preparaty farmaceutyczne obejmują białko liganda zalpha11 w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, takim jak roztwór soli, buforowany roztwór soli, 5% dekstroza w wodzie lub temu podobne. Preparaty mogą dodatkowo obejmować jedną lub więcej substancji pomocniczych, konserwantów, środków ułatwiających rozpuszczanie, środków buforujących, albuminę do zapobiegania utracie białka na powierzchniach fiolek itd. Metody opracowywania receptur są dobrze znane w tej dziedzinie i zostały opisane np. w Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, red. Mack Publishing Co., Easton, PA, wydanie 19, 1995.

Dawki lecznicze zazwyczaj wynoszą od 0,1 do 100 μg/kg ciężaru ciała pacjenta dziennie, korzystnie 0,5-20 mg/kg dziennie, przy czym dokładną dawkę określa lekarz zgodnie z przyjętymi zasadami, biorąc pod uwagę charakter i ciężkość leczonego stanu, cechy pacjenta itd. Określenie dawki leży w możliwościach specjalisty. Białka mogą być podawane do leczenia ostrego, przez jeden tydzień lub mniej, często przez okres jednego do trzech dni lub mogą być stosowane w leczeniu przewlekłym, przez kilka miesięcy lub lat. Ogólnie terapeutycznie skuteczną ilością liganda zalpha11 jest ilość wystarczająca do wytworzenia klinicznie istotnej zmiany funkcji krwiotwórczej lub odpornościowej.

Wynalazek został dodatkowo zilustrowany przez następujące nie ograniczające przykłady.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Konstruowanie chimery polipeptydu MPL-zalpha11: zewnątrzkomórkowy MPL i domena TM połączone z wewnątrzkomórkową domeną sygnałową zalpha11

Zewnątrzkomórkowe i transbłonowe domeny mysiego receptora MPL izolowano z plazmidu zawierającego mysi receptor MPL (plazmid PHZl/MPL) stosując PCR z użyciem starterów ZC17,212 (SEQ ID nr: 5) i ZC19,914 (SEQ ID nr: 6). Warunki reakcji były następujące: 95°C przez 1 minutę; 35 cykli w temperaturze 95°C przez 1 minutę, 45°C przez 1 minutę, 72°C przez 2 minuty; po czym 72°C przez 10 minut; następnie nasycanie w temperaturze 10°C. Produkt PCR rozdzielano na 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (Boerhinger Mannheim, Indianapolis, 1N) i izolowano fragment receptora MPL o długości około 1,5 kb stosując zestaw do ekstrakcji w żelu Qiaquick™ (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta.

Wewnątrzkomórkowe domeny ludzkiego zalpha11 izolowano z plazmidu zawierającego cDNA receptora zalpha11 stosując PCR z użyciem starterów ZC 19,913 (SEQ ID nr: 8) i ZC20,097 (SEQ ID nr: 9). Sekwencję polinukleotydową odpowiadającą sekwencji kodującej receptora zalpha11 pokazano w SEQ ID nr:7, zaś odpowiadającą sekwencję aminokwasową pokazano w SEQ ID Nr: 115. Warunki reakcji były takie jak powyżej. Produkt PCR rozdzielano na 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (Boerhinger Mannheim) i izolowano fragment zalpha11 o długości około 900 bp stosując zestaw do ekstrakcji w żelu Qiaquick zgodnie z instrukcjami producenta.

Każdy z izolowanych fragmentów opisanych powyżej mieszano w stosunku objętościowym 1:1 i stosowano w reakcji PCR z użyciem ZC17,212 (SEQ ID nr: 5) i ZC20,097 (SEQ ID nr: 9), aby utworzyć chimerę MPL-zalpha11. Warunki reakcji były następujące: 95°C przez 1 minutę; 35 cykli w temperaturze 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę, 72°C przez 2 minuty; po czym 72°C przez

PL 207 350 B1 minut; następnie nasycanie w 10°C. Cały produkt PCR rozdzielano na 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (Boehringer Mannheim) i izolowano fragment chimery MPL-zalpha11 o długości około 2,4 kb stosując zestaw do ekstrakcji w żelu Qiaquick (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Fragment chimery MPL-zalpha11 trawiono EcoRI (BRL) i Xbal (Boerhinger Mannheim) zgodnie z instrukcjami producenta. Cały produkt trawienia rozdzielano na 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (Boehringer Mannheim) i rozszczepioną chimerę MPL-zalpha11 izolowano stosując zestaw do ekstrakcji w żelu Qiaquick™ (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Otrzymaną rozszczepioną chimerę MPL-zalpha11 wprowadzano do wektora ekspresji jaki opisano poniżej.

Biorczy wektor ekspresyjny pZP-5N trawiono EcoRI (BRL) i Hindlll (BRL) zgodnie z instrukcjami producenta i oczyszczano w żelu, jak opisano powyżej. Ten fragment wektora łączono z rozszczepioną EcoRI i Xbal chimerą MPL-zalpha11 izolowaną powyżej oraz fragmentem łącznika XbaI/HindIII w reakcji ligacji. Ligację prowadzono stosując ligazę T4 (BRL), w temperaturze 15°C przez noc. Próbkę ligacji poddawano elektroporacji w elektrokompetentnych komórkach E. coli DH10B ElectroMAX^TM (25 pfF, 200 Ω, 2,3 V). Transformanty wysiewano na płytki LB + Ampicillin i pojedyncze kolonie przesiewano za pomocą PCR sprawdzając pod względem chimery MPL-zalpha11, z użyciem ZC17,212 (SEQ ID nr: 5) i ZC20, 097 (SEQ ID nr: 9) stosując warunki PCR, jakie opisano powyżej.

Potwierdzenie sekwencji chimery MPL-zalpha11 wykonywano przez analizy sekwencji stosując następujące startery: ZC12,700 (SEQ ID Nr: 10), ZC5,020 (SEQ ID Nr: 11), ZC6,675 (SEQ ID Nr: 12), ZC7,727 (SEQ ID Nr: 13), ZC8,290 (SEQ ID Nr: 14), ZC19,572 (SEQ ID Nr: 15), ZC6,622 (SEQ ID Nr: 16), ZC7,736, (SEQ ID Nr: 17) i ZC9,273 (SEQ ID Nr: 18). Insert miał długość około 2,4 bp i był pełnej długości.

P r z y k ł a d 2

Proliferacja w oparciu o chimerę MPL-zalpha11 w teście BAF3 z użyciem Alamar Blue

A. Konstruowanie komórek BaF3 wykazujących ekspresję chimery MPL-zalpha11

BaF3, linię komórkową prelimfoidową zależną od interleukiny-3 (IL-3) otrzymaną z mysiego szpiku kostnego (Palacios i Steinmetz, Cell. 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot i inni. Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986) utrzymywano w kompletnych pożywkach (pożywka RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) uzupełnionych 10% inaktywowaną wysoką temperaturą płodową surowicą cielęcą, 2 ng/ml mysiej IL-3 (mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN), 2 mM L-glutaMax-1™ (Gibco BRL), 1 mM pirogronianu sodu (Gibco BRL), oraz antybiotykami PSN (GIBCO BRL)). Przed elektroporacją preparowano i oczyszczano DNA pZP-5N/MPL-zalpha11 (przykład 1) stosując zestaw Qiagen Maxi Prep (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki BaF3 do elektroporacji przemywano raz w pożywkach RPMI, a następnie ponownie zawieszano w pożywkach RPMI przy gęstości komórek wynoszącej 10 komórek/ml. Jeden ml ponownie zawieszonych komórek BaF3 mieszano z 30 pg plazmidowego DNA pZP-5N/MPL-zalpha11 i przenoszono do oddzielnych jednorazowych komór elektroporacji (GIBCO BRL). Po 15-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej komórki poddawano dwóm seryjnym wstrząsom (800 1 Fad/300 V; 1180 1 Fad/300 V) za pomocą urządzenia do elektroporacji (CELL-PORATOR™; GIBCO BRL). Po 5-minutowym okresie odpoczynku, elektroporowane komórki przenoszono do 50 ml kompletnych pożywek i umieszczano w inkubatorze na 15-24 godziny (37°C, 5% CO2). Komórki następnie odwirowywano i ponownie zawieszano w 50 ml kompletnych pożywek zapewniających selekcję Geneticin™ (Gibco) (500 pg/ml G418) w kolbie T-162, aby izolować komórki oporne wobec G418. Preparaty transfekowanych komórek BaF3, w niniejszym dokumencie zwane dalej komórkami BaF3/MPL-zalpha11, testowano pod względem zdolności sygnałowej, jak opisano poniżej.

B. Testowanie zdolności sygnałowej komórek BaF3/MPL-zalpha11 z użyciem testu proliferacji Alamar Blue

Komórki BaF3/MPL-zalpha11 odwirowywano i przemywano w kompletnych pożywkach, opisanych powyżej, lecz bez mIL-3 (w niniejszym dokumencie później określanych jako „pożywki pozbawione mIL-3”). Komórki odwirowywano i przemywano 3 razy, aby zapewnić usunięcie mIL-3. Komórki następnie zliczano w liczniku krwinek. Komórki wysiewano w formacie 96-studzienkowym w ilości 5000 komórek na studzienkę w objętości wynoszącej 100 μl na studzienkę, stosując pożywki pozbawione mIL-3.

Proliferację komórek BaF3/MPL-zalpha11 szacowano stosując mysią trombopoetynę (mTPO) rozcieńczoną pożywką pozbawioną mIL-3 do stężenia 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62 ng/ml, 30 ng/ml, 15 ng/ml, 7,5 ng/ml, 3,75 ng/ml, 1,8 ng/ml, 0,9 ng/ml, 0,5 ng/ml i 0,25 ng/ml. 100 μl rozcieńczonej mTPO dodawano do komórek BaF3/MPL-zalpha11. Całkowita objętość testowa wynosi 200 pi.

PL 207 350 B1

Kontrole ujemne analizowano równolegle stosując tylko pożywki pozbawione mIL-3, bez dodawania mTPO. Płytki testowe inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 3 dni, w czasie których dodawano Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) po 20 μl/studzienkę. Alamar Blue umożliwia odczyt fluorometryczny w oparciu o liczbę żywych komórek, a więc bezpośredni pomiar proliferacji ko mórkowej w porównaniu z kontrolą ujemną. Płytki inkubowano ponownie w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 24 godziny. Płytki odczytywano na czytniku płytek Fmax™ (Molecular Devices Sunnyvale, CA) stosując program SoftMax™ Pro, przy długości fali 544 (wzbudzenie) i 590 (emisja).

Wyniki potwierdziły zdolność sygnałową wewnątrzkomórkowej części receptora zalpha11, ponieważ trombopoetyna indukowała proliferację w przybliżeniu 10-krotnie ponad tło przy stężeniach mTPO 62 ng/ml i więcej.

P r z y k ł a d 3

Konstruowanie wektora ekspresji wykazującego ekspresję pełnej długości zalpha11

Cały receptor zalpha11 izolowano z plazmidu zawierającego cDNA receptora zalpha11 (SEQ ID Nr: 7) stosując PCR z użyciem starterów ZC19,905 (SEQ ID nr: 19) i ZC 19,906 (SEQ ID nr: 20). Warunki reakcji były następujące: 95°C przez 1 minutę; 35 cykli w temperaturze 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę, 72°C przez 2 minuty; po czym 72°C przez 10 minut; następnie nasycanie 10°C. Produkt PCR rozdzielano na 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (Boerhinger Mannheim) i izolowano cDNA zalpha11 o długości około 1,5 kb stosując zestaw do ekstrakcji w żelu Qiaquick™ (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta.

Oczyszczony cDNA zalpha11 trawiono BamHI (Boerhinger Mannheim) i EcoRI (BRL) zgodnie z instrukcjami producenta. Cały proces trawienia uruchamiano na 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (Boerhinger Mannheim) i oczyszczano rozszczepiony fragment zalpha11 stosując zestaw do ekstrakcji w żelu Qiaquick zgodnie z instrukcjami producenta. Otrzymaną rozszczepioną chimerę zalpha11 wprowadzano do wektora ekspresji, jak opisano poniżej.

Biorczy wektor ekspresji pZP-5N trawiono BamHI (Boerhinger Mannheim) i EcoRI (BRL) zgodnie z instrukcjami producenta i oczyszczano w żelu, jak opisano powyżej. Ten fragment wektora łączono z fragmentem zalpha11 rozszczepionym BamHI i EcoRI izolowanym powyżej, w reakcji ligacji z użyciem ligazy T4 (BRL). Ligację inkubowano w temperaturze 15°C przez noc. Próbkę ligacji poddawano elektroporacji do elektrokompetentnych komórek E. coli DHIOB electroMAK™ (25 μF, 2000, 2,3 V). Transformanty wysiewano na płytki LB + Ampicillin i pojedyncze kolonie przesiewano za pomocą PCR sprawdzając pod względem sekwencji zalpha11 z użyciem ZC19,905 (SEQ ID nr: 19)

ZC19,906 (SEQ ID nr: 20), stosując warunki PCR, jakie opisano powyżej.

Potwierdzenie sekwencji MPL-zalpha11 wykonywano przez analizy sekwencji stosując następujące startery: ZC12,700 (SEQ ID Nr: 10), ZC5,020 (SEQ ID Nr: 11), ZC20,114 (SEQ ID Nr: 21), ZC19,459 (SEQ ID Nr: 22), ZC19,954 (SEQ ID Nr: 23) i ZC20,116 (SEQ ID Nr: 24). Insert miał długość około 1,6 kb i był pełnej długości.

P r z y k ł a d 4

Proliferacja w oparciu o zalpha11 w teście BAF3 przy użyciu Alamar Blue

A. Konstruowanie komórek BaF3 wykazujących ekspresję receptora zalpha11

Konstruowano komórki BaF3 wykazujące ekspresję pełnej długości receptora zalpha11, jak w przykładzie 2A powyżej, stosując 30 μg wektora ekspresji zalpha11, opisanego w przykładzie 3 powyżej. Komórki BaF3 wykazujące ekspresję mRNA receptora zalpha11 oznaczano jako BaF3/zalpha11. Te komórki stosowano do skriningu pod względem liganda zalpha11, jak opisano poniżej w przykładach 5 i 6.

P r z y k ł a d 5

Skrining pod względem liganda zalpha11 przy użyciu komórek BaF3/Zalpha11 za pomocą testu proliferacji Alamar Blue

A. Aktywacja pierwotnych małpich komórek śledziony do testu na obecność liganda zalpha11

Małpie komórki śledziony stymulowano in vitro w celu wytworzenia kondycjonowanych pożywek do testowania na obecność aktywność liganda zalpha11, jak opisano poniżej. Małpie śledziony otrzymywano od 8-letnich samic małp M. nesestrian. Śledziony rozdrobniono w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczych komórek. Komórki jednojądrzaste izolowano z użyciem gradientu gęstości Ficoll_®

-Paque^® PLUS (Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja). Komórki jednojądrzaste wysiewano w ilości x 10⁶ komórek/ml w pożywkach RPMI-1640 uzupełnionych 10% FBS i aktywowanych 5 ng/ml 12-mirystynianu-13-octanu forbolu (PMA) (Calbiochem, San Diego, CA) i 0,5 mg/ml lonomycin™ (Cal42

PL 207 350 B1 biochem) przez 48 godziny. Supernatant od stymulowanych małpich komórek śledziony stosowano do testu proliferacji komórek BaF3/zalpha11, jaki opisano poniżej.

B. Skrining pod względem liganda zalpha11 przy użyciu komórek BaF3/Zalpha11 za pomocą testu proliferacji Alamar Blue

Komórki BaF3/Zalpha11 odwirowywano i przemywano w pożywkach pozbawionych mIL-3. Komórki odwirowywano i przemywano 3 razy, aby zapewnić usunięcie mIL-3. Komórki następnie zliczano w liczniku krwinek. Komórki wysiewano w 96-studzienkowym formacie w ilości 5000 komórek na studzienkę w objętości wynoszącej 100 μΐ na studzienkę stosując pożywki pozbawione mIL-3.

Proliferację komórek BaF3/Zalpha11 szacowano stosując kondycjonowane pożywki od aktywowanych małpich komórek śledziony (zobacz przykład 5A) Kondycjonowane pożywki rozcieńczano pożywką pozbawioną mIL-3 do stężenia 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% i 0,375%. 100 μg rozcieńczonych kondycjonowanych pożywek dodawano do komórek BaF3/Zalpha11. Całkowita objętość testowa wynosi 200 pi. Płytki testowe inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO przez 3 dni, w czasie których dodawano Aiamar Biue (Accumed, Chicago, IL) w ilości 20 pi/studzienkę. Płytki inkubowano ponownie w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 24 godziny. Płytki odczytywano na czytniku płytek Fmax™ (Moiecuiar devices), jak opisano powyżej (przykład 2).

Wyniki potwierdziły odpowiedź proiiferacyjną komórek BaF3/Zalpha11 wobec czynnika obecnego w kondycjonowanych pożywkach aktywowanej śiedziony małpiej. Zmierzona odpowiedź była w przybiiżeniu 4-krotnie ponad tło przy 50% stężeniu. Nie transfekowane komórki BaF3 nie proliferowały w odpowiedzi na ten czynnik, co świadczy o tym, że czynnik ten jest specyficzny dia receptora Zalpha11.

C. Pierwotne źródło iudzkie użyte do izolowania liganda zalpha11

Pobrano 100 mi próbek krwi od każdego z sześciu dawców. Krew pobierano stosując 10 x 10 ml rurki probówki vacutainer z heparyną. Krew ziewano od sześciu dawców (600 mi), rozcieńczano 1:1 _® w PBS i rozdzieiano stosując Ficoii-Paque^® PLUS (Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja). Liczba izoiowanych pierwotnych komórek iudzkich po rozdzieieniu gradientem fikoiu wynosiła 1,2 x 10 komórek.

Komórki zawieszano ponownie w 9,6 mi buforu MACS (PBS, 0,5% EDTA, 2 mM EDTA). 1,6 ml zawiesiny komórkowej pobierano i dodawano 0,4 mi mikrokuiek CD3 (Miitenyi Biotec, Auburn, CA). Mieszaninę inkubowano przez 15 minut w temperaturze 4°C. Komórki znakowane kuikami CD3 przemywano 30 mi buforu MACS, a następnie ponownie zawieszano w 2 mi buforu MACS.

Przygotowano koiumnę VS+ (Miitenyi) zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie koiumnę VS+ umieszczano w polu magnetycznym VarioMACS™ (Miitenyi). Koiumnę równoważono 5 mi buforu MACS. Izoiowane pierwotne iudzkie komórki nakładano następnie na koiumnę. Komórki CD3 ujemne pozostawiono do przejścia. Koiumnę przemywano 9 mi (3 x 3 mi) buforu MACS. Koiumnę następnie usuwano z poia magnetycznego i umieszczano w 15 mi rurce faicon, komórki CD3+ wymywano przez dodanie do koiumny 5 mi buforu MACS, a związane komórki wypłukano stosując tłoczek dostarczony przez producenta. Inkubację komórek z magnetycznymi kuikami CD3, przemywanie oraz etapy użytkowania koiumny VS+ (inkubacja do eiucji) jak powyżej, powtarzano jeszcze pięć razy. Otrzymane frakcje CD3+ z sześciu rozdziałów koiumnowych ziewano. Wydajność seiekcjonowanych pod wzgiędem CD3+ iudzkich komórek T wynosiła 3 x 10 wszystkich komórek.

Próbkę zianych seiekcjonowanych pod wzgiędem CD3+ iudzkich komórek T pobrano do barwienia i sortowania na urządzeniu do sortowania komórek z przeciwciałem fiuorescencyjnym (FACS), aby oszacować ich czystość. Seiekcjonowane pod wzgiędem CD3+ iudzkie komórki T stanowiły 91% komórek CD3+.

Seiekcjonowane pod wzgiędem CD3+ iudzkie komórki T aktywowano przez inkubację w RPMI + 5% FBS + PMA 10 ng/ml i jonomycynie 0,5 pg/ml (Calbiochem) przez 13 godzin w temperaturze 37°C. Supernatant od tych aktywowanych seiekcjonowanych pod wzgiędem CD3+ iudzkich komórek T testowano pod wzgiędem aktywności iiganda zalpha11, jak opisano poniżej. Ponadto aktywowane seiekcjonowane pod wzgiędem CD3+ komórki iudzkie stosowano do wytworzenia biiiotek cDNA, jak opisano w przykładzie 6 poniżej.

D. Testowanie supernatantu od aktywowanych seiekcjonowanych pod wzgiędem CD3+ iudzkich komórek T na iigand zalpha11 przy użyciu komórek BaF3/Zalpha11 oraz testu proliferacji Alamar Blue

Komórki BaF3/Zalpha11 odwirowywano i przemywano w pożywkach pozbawionych mIL-3. Komórki odwirowywano i przemywano 3 razy, aby zapewnić usunięcie mIL-3. Komórki wysiewano, zliPL 207 350 B1 czano w liczniku krwinek. Komórki powlekano w 96-studzienkowym formacie w ilości 5000 komórek na studzienkę w objętości wynoszącej 100 μΐ na studzienkę stosując pożywki pozbawione mIL-3.

Proliferację komórek BaF3/Zalpha11 szacowano stosując kondycjonowane pożywki od aktywowanych, selekcjonowanych pod względem CD3+ ludzkich komórek T (zobacz przykład 5C), rozcieńczone pożywką pozbawioną mlL-3 do stężenia 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% i 0,375%. 100 μl rozcieńczonych kondycjonowanych pożywek dodawano do komórek BaF3/Zalpha11. Całkowita objętość testowa wynosi 200 pi. Płytki testowe inkubowano i testowano, jak opisano w przykładzie 5B.

Wyniki potwierdziły odpowiedź proiiferacyjną komórek BaF3/Zalpha11 wobec czynnika obecnego w aktywowanych kondycjonowanych pożywkach seiekcjonowanych pod wzgiędem CD3+ iudzkich komórek T. Zmierzona odpowiedź, była w przybiiżeniu 10-krotnie wyższa od tła przy 50% stężeniu. Komórki BaF3 typu dzikiego nie proiiferowały w odpowiedzi na ten czynnik, co świadczy o tym, że czynnik ten jest specyficzny dla receptora Zalpha11. Ponadto rozpuszczalny receptor zalpha11 blokował tę aktywność proiiferacyjną w komórkach BaF3/Zalpha11 (patrz przykład 11).

P r z y k ł a d 6

Klonowanie ludzkiego liganda zalpha11 z iudzkiej bibiioteki komórek seiekcjonowanych pod wzgiędem CD3+

Skrining bibiioteki cDNA pierwotnych iudzkich aktywowanych komórek seiekcjonowanych pod wzgiędem CD3+ pozwoiiła uzyskać izoiowany cDNA, który jest nowym elementem rodziny cytokin o wiązce czterech heiis. Ten cDNA kodował iigand zalpha11. cDNA identyfikowano przez skrining pod wzgiędem aktywności iiganda zalpha11 przy użyciu receptora zalpha11.

A. Wektor do konstrukcji biblioteki selekcjonowanej przez CD3+

Wektorem do konstrukcji biblioteki seiekcjonowanej przez CD3+ był pZP7NX. Wektor pZP7NX konstruowano następująco: region kodujący dia markera seiekcji DHFR w wektorze pZP7 usuwano przez trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi Ncol i Pstl (Boehringer Mannheim). Trawiony DNA anaiizowano na 1% żeiu agarozowym, odcinano i oczyszczano w żeiu przy użyciu Qiagen Gei Extraction Kit (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Fragment DNA reprezentujący region kodujący marker seiekcyjny Zeocin powieiano metodą PCR stosując startery ZC13,946 (SEQ ID Nr: 25) i ZC13,945 (SEQ ID Nr: 26) oraz pZeoSV2(+) jako matrycę. Istnieją dodatkowe miejsca restrykcyjne Pstl i Bell w starterze ZC13,946 (SEQ ID Nr: 25) oraz dodatkowe miejsca Ncol i Sful w starterze ZC13,945 (SEQ ID Nr: 26). Fragment PCR cięto enzymami restrykcyjnymi Psti i Ncoi i kionowano do wektora pZP7 wytworzonego przez rozszczepienie takimi samymi dwoma enzymami i następnie oczyszczanie w żeiu. Wektor ten nazwano pZP7Z. Następnie region kodujący zeocynę usuwano przez trawienie DNA wektora pZP7Z enzymami restrykcyjnymi Bclll i Sful. Trawiony DNA analizowano na 1% żeiu agarozowym, odcinano i oczyszczano w żeiu, a następnie poddawano iigacji z fragmentem DNA regionu kodującego neomycynę odciętego od wektora pZem228 (złożonego w American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA; ATCC Deposit No 69446) takimi samymi enzymami restrykcyjnymi (Bell i Sful).

W tym nowym wektorze, nazwano pZP7N, region kodujący dia markera seiekcyjnego DHFR zastąpiono regionem kodującym dia markera seiekcyjnego neomycyny z wektora pZem228. Fragment uszczeiniający obejmujący miejsce dia Xho1 dodawano do pZP7N, aby utworzyć wektor odpowiedni do bezpośredniego kionowania cDNA o wysokiej wydajności; ten nowy wektor na zwano pZP7NX. Aby wytworzyć wektor dla cDNA, 20 pg pZP7NX trawiono 20 jednostkami EcoRI (Life Technologies Gaithersberg, MD) i 20 jednostkami XhoI (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN) przez 5 godzin w temperaturze 37°C, a następnie w temperaturze 68°C przez 15 minut. Produkt trawienia analizowano następnie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia w celu oddzielenia uszcze lniacza od wektora. Prążek wektora odcinano i trawiono „beta-agarazą” (New England Biolabs, Beverly, MA) zgodnie z zaleceniami producenta. Po wytrąceniu etanolem trawiony wektor ponownie zawieszano w wodzie do stężenia 45 ng/ml jako przygotowanie do ligacji biblioteki cDNA selekcjonowanej względem CD3+ opisanej poniżej.

B. Wytwarzanie biblioteki cDNA pierwotnych ludzkich aktywowanych komórek selekcjonowanych pod względem CD3+

Około 1,5 x 10⁸ pierwotnych ludzkich selekcjonowanych względem CD3+ komórek stymulowanych w jonomycynie/PMA izolowano przez wirowanie po hodowli w temperaturze 37°C przez 13 godzin (przykład 5C). Całkowity RNA izolowano z osadu komórek przy użyciu zestawu „RNeasy Midi”

PL 207 350 B1 firmy Qiagen, Inc. (Valencia, CA), mRNA izolowano z 225 mikrogramów całkowitego RNA przy użyciu „zestawu do oczyszczania MPG mRNA” firmy CPG Inc. (Lincoln Park, NJ). 3,4 mikrogramów mRNA izolowano i przekształcono w dwuniciowy cDNA przy użyciu następującej procedury.

Pierwszą nić cDNA od stymulowanych ludzkich komórek selekcjonowanych względem CD3+ syntetyzowano następująco. Dziewięć μΐ selekcjonowanego względem z Oligo d(T) RNA poli (A) CD3+ o stężeniu 0,34 1 μg/μl i 1,0 μΐ startera (stężenia 1 μg/μl) pierwszej nici ZC 18, 698 (SEQ ID No: 27) zawierającego miejsce restrykcyjne XhoI mieszano i ogrzewano w temperaturze 65°C przez minuty i chłodzono na lodzie. Syntezę pierwszej nici cDNA inicjowano przez dodanie 9 μΐ buforu _® pierwszej nici (5 x bufor SUPERSCRIPT ; (Life Technologies), 4 μl 100 mM ditiotreitolu i 2 μl roztworu trifosforanu deoksynukleotydu, zawierającego 10 mM każdego z dATP, dGTP, dTTP i 5-metylo-dCTP (Pharmacia Biotech Inc.) do mieszaniny RNA-starter. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperatu_® rze 45°C przez 4 minuty po czym dodawano 8 μl z SuperscriptII , (200 u/μθ odwrotnej transkryptazy RNazy H (Life technologies). Reakcję inkubowano w temperaturze 45°C przez 45 minut, po czym temperaturę inkubacji podnoszono o 1°C co 2 minuty do temperatury 50°C, w której reakcję utrzymywano przez 10 minut. Aby zdenaturować całą strukturę drugorzędową i pozwolić na dodatkowe wydłużenie cDNA, reakcję ogrzewano następnie do temperatury 70°C przez 2 minuty, następnie obniżo_® no do temperatury 55°C przez 4 minuty, po których dodawano 2 μl SuperscriptII RT i inkubowano dodatkowe 15 minut, po czym podnoszono temperaturę do 70°C z szybkością 1 minuty/10°C. Niewprowadzone nukleotydy usuwano z cDNA przez dwukrotne strącanie w obecności 2 μg nośnika glikogenowego, 2,0 M octanu amonu i 2,5 objętości etanolu, po czym przemywano 100 μl 70% etanolu. cDNA ponownie zawieszano w 98 μl wody do stosowania w syntezie drugiej nici.

Syntezę drugiej nici prowadzono na pierwszej nici cDNA w warunkach, które pobudzały przyg otowanie pierwszej nici do syntezy drugiej nici, powodując utworzenie DNA w postaci szpilki do włosów. Reakcja drugiej nici zawierała 98 μl pierwszej nici cDNA, 30 μl 5 x buforu polimerazy I (100 mM Tris: HCl, pH 7,5, 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 50 mM (NH₄)₂SO₄), 2 μl 100 mM ditiotreitolu, 6 μl roztworu zawierającego 10 mM każdego trifosforanu deoksynukleotydu, 5 μl 5 mM b-NAD, 1 μl 3 jednostek^l ligazy DNA E. coli (New England Biolabs Inc.) i 4 μl 10 jednostek^l E. coli polimerazy I DNA (New England Biolabs Inc.). Reakcję ustawiono w temperaturze pokojowej i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, po czym dodawano 4 μl 3,8 U^l RNazy H (Life Technologies). Reakcję inkubowano w temperaturze 15°C przez dwie godziny, a następnie 15 minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Do reakcji dodawano 10 μl IM TRIS pH7,4 i ekstrahowano dwukrotnie mieszaniną fenol/chloroform i raz chloroformem, następnie fazy organiczne ponownie ekstrahowano 50 μl TE (10 mM TRIS pH 7,4, 1 mM EDTA), zlewano z innymi roztworami wodnymi i wytrącano etanolem w obecności 0,3 M octanu sodu. Osad przemywano 100 μl 70% etanolu, suszono na powietrzu i ponownie zawieszano w 40 μl wody.

Jednoniciowy DNA o strukturze szpilki do włosów rozszczepiano przy użyciu nukleazy fasoli mung. Mieszanina reakcyjna zawierała 40 μl drugiej nici cDNA, 5 μl 10 x buforu nukleazy fasoli mung (Life technologies), 5 μl nukleazy fasoli mung (Pharmacia Biotech Corp.) rozcieńczonej do 1 jednostki^l w 1 x buforze nukleazy fasoli mung. Reakcję inkubowano w temperaturze 37°C przez 45 minut. Reakcję kończono przez dodanie 10 μl 1 M Tris: HCl, pH 7,4, po czym przeprowadzono kolejne ekstrakcje mieszaniną fenol/chloroform i chloroformem, jak opisano powyżej. Po ekstrakcjach cDNA wytrącano etanolem w obecności 0,3 M octanu sodu. Osad przemywano 100 μl 70% etanolu, suszono na powietrzu i ponownie zawieszano w 38 μl wody.

W ponownie zawieszonym cDNA wykonano lepkie końce z użyciem polimerazy DNA T4. cDNA, który ponownie zawieszano w 38 μl wody, mieszano z 12 μl 5 x buforu polimerazy DNA T4 (250 mM Tris:HCl, pH 8, 0, 250 mM KCl, 25 mM MgCl₂), 2 μl 0,1 M ditiotreitolu, 6 μl roztworu zawierającego 10 mM każdego trifosforanu deoksynukleotydu i 2 μl polimerazy DNA T4 OU/μΟ (Boehringer Mannheim Corp.). Po inkubacji przez 45 minut w temperaturze 15°C, reakcję kończono przez dodanie 30 μl TE, po czym przeprowadzono kolejne ekstrakcje mieszaniną fenol/chloroform i chloroformem i ekstrahowano ponownie 20 μl TE, jak opisano powyżej. DNA wytrącano etanolem w obecności 2 μl nośnika Pellet Paint™ (Novagen) i 0,3 M octanu sodu i ponownie zawieszano w 11 μl wody.

Adaptery Eco RI poddawano ligacji na końcach 5' cDNA opisanego powyżej, aby umożliwić klonowanie do wektora ekspresyjnego. 11 μl cDNA i 4 μl Eco RI hemifosforylowanego adaptera (65 pmol/μθ (Pharmacia Biotech Corp) mieszano z 5 μl 5 x buforu ligazy (Life Technologies), 2 μl 10 mM ATP i 3 μl 1 U^l ligazy DNA T4 (Life Technologies), 1 μl 10 x buforu ligacji (Promega Corp), 9 μl wody. Dodatkowe rozcieńczenie 1 x buforem wykonywano w celu zabezpieczenia osadu przed wytrąceniem. RePL 207 350 B1 akcję inkubowano 9 godzin w łaźni wodnej z podnoszeniem temperatury od 10°C do 22°C przez godzin, a następnie 45 minut w temperaturze 25°C. Reakcję kończono przez inkubację w temperaturze 68°C przez 15 minut.

Aby ułatwić bezpośrednie klonowanie cDNA do wektora ekspresyjnego, cDNA trawiono XhoI, powodując wytworzenie cDNA mającego lepki koniec 5' z Eco RI i lepki koniec 3' z XhoI. Miejsce restrykcyjne XhoI na końcu 3' cDNA wprowadzono wcześniej przy użyciu startera ZC 18698 (SEQ ID Nr: 27). Trawienie enzymem restrykcyjnym przeprowadzano w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 35 μl mieszaniny ligacyjnej opisanej powyżej, 6 μl 10 x buforu H (Boehringer Mannheim Corp.), 1 μl 2 mg/ml BSA (Biolabs Corp.), 17 μl wody i 1,0 μl 40 U^l XhoI (Boehringer Mannheim). Trawienie przeprowadzano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Reakcję kończono przez inkubację w temperaturze 68°C przez 15 minut, a następnie wytrącanie etanolem, przemywanie, suszenie, jak opisano powyżej i ponowne zawieszanie w 30 μl wody.

Ponownie zawieszony cDNA ogrzewano do temperatury 65°C przez 5 minut i chłodzono na lodzie, dodawano 4 μl 5 x barwnika do ładowania na żelu (Research Genetics Corp.), cDNA ładowano na 0,8% żel agarozowy o niskiej temperaturze topnienia IX TAE (agaroza o niskiej temperaturze topnienia SEA PLAQUE GTG™; FMC Corp.) i poddawano elektroforezie. Zanieczyszczające adaptery i cDNA poniżej 0,6 kb długości odcinano od żelu.

Elektrody odwracano, dodawano stopioną agarozę, aby wypełnić studzienki, wymieniano bufor i cDNA poddawano elektroforezie do zatężenia przy początku ścieżki. Obszar żelu zawierającego zatężony cDNA odcinano i umieszczano w probówce mikrowirówkowej, i agarozę topiono przez ogrzewanie do temperatury 65°C przez 15 minut. Po zrównoważeniu próbki do temperatury 45°C, dodawano 2 μl 1 U^l Beta-agarazy I (Biolabs, Inc.) i mieszaninę inkubowano przez 90 minut w temperaturze 45°C, aby rozłożyć agarozę.

Po inkubacji do próbki dodawano jedną dziesiątą objętości 3M octanu sodu i mieszaninę inkubowano na lodzie przez 15 minut. Próbkę wirowano przy 14000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć niestrawioną agarozę. cDNA wytrącano etanolem, przemywano w 70% etanolu, suszono powietrzem i ponownie zawieszano w 40 μl wody.

Aby określić optymalny stosunek cDNA do wektora, ustawiono kilka ligacji i poddawano je elektroporacji. W skrócie, 2 μl 5 x buforu ligazy T4 (Life Technologies), 1 μl 10 mM ATP, 1 μl pZP7NX trawiono EcoRl-XhoI, 1 (μθ ligazy DNA T4 rozcieńczonej do 0,25 U^l (Life Technologies) wodą do μl i 0,5, 1,2 lub 3 μl cDNA mieszano w 4 oddzielnych ligacjach, inkubowano w temperaturze 22°C przez 4 godziny, w temperaturze 68°C przez 20 minut, wytrącano roztworem octanu sodu w etanolu, przemywano, suszono i ponownie zawieszano w 10 (μ^. Jeden mikrolitr z każdej ligacji poddawano elektroporacji do 40 μl elektrokompetentnych bakterii DH10b ElectroMax™ (Life Technologies) przy użyciu 0,1 cm kuwetki (Biorad) i kontrolera impulsowego™ Genepulser, (Biorad) ustawionego na 2,5 KV, 251 F, 200 omów. Komórki natychmiast ponownie zawieszano w 1 ml bulionu SOC (Manniatis, i inni jak wyżej), po czym w 500 (μθ mieszaniny 50% glicerol-SOC jako konserwanta. Te „glicerolowe roztwory macierzyste” zamrażano w kilku równych częściach w temperaturze -70°C. Równą ilość każdego topiono i wysiewano seryjnie na płytkach LB-agar uzupełnionych ampicyliną w ilości 100 μg/ml. Liczby kolonii wskazywały, że optymalny stosunek CD3+ cDNA do wektora pZP7NX wynosił 1 μl do 45 ng; taka ligacja dawała 4,5 miliona pierwotnych klonów.

W celu skriningu tej biblioteki przy użyciu testu proliferacji w oparciu o BaF3-zalpha11 (przykład 5) glicerolowe roztwory macierzyste (patrz wyżej) rozcieńczano do płynnych hodowli o 100 lub 250 klonach na próbką w płytkach do mikromiareczkowania o głębokich studzienkach, hodowano 24 godziny w temperaturze 37°C z wytrząsaniem i plazmid izolowano przy użyciu zestawu Qiagen zgodnie z instrukcjami producenta.

Taki DNA transfekowano następnie do komórek BHK, pożywki kondycjonowano 72 godziny, zbierano i umieszczano na komórkach 5K BaF3-zalpha11 przez 72 godziny, po czym szacowano proliferację przy użyciu testu fluorescencyjnego „Alamar blue” (przykład 5B i przykład 2B).

W celu skriningu biblioteki przez klonowanie pułapki wydzielania, potrzebowano kompleksowej, powielonej postaci biblioteki do transfekcji komórek COS-7. Około 4,8 milionów klonów wysiewano na 110 15 cm płytkach LB-agar uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny i 10 μg/ml metycyliny. Po hodowaniu płytek przez noc w temperaturze 37°C bakterie zbierano przez zdrapanie i odwirowano. Plazmidowy DNA ekstrahowano z odwirowanych bakterii przy użyciu Nucleobond-giga™ (Clonetech) zgodnie z instrukcjami producenta. Ten plazmid używano następnie do transfekcji komórek

PL 207 350 B1

COS-7 (ATCC Nr CRL 1651) na płytkach i przesiewano przy użyciu techniki pułapki wydzielania opisanej poniżej (przykład 12).

P r z y k ł a d 7

Klonowanie ekspresyjne ludzkiego liganda zalpha11

Glicerolowe roztwory macierzyste z biblioteki aktywowanych ludzkich komórek selekcjonowanych pod względem CD3+ (przykład 6) dodawano do Super Broth II™ (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) + 0,1 mg/ml ampicyliny (amp) w stężeniu 250 komórek na 800 mikrolitrów. E. coli pozostawiano do zrównoważenia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. W momencie inokulacji, 400 mikrolitrów wysiewano na płytki LB + amp, aby określić aktualne miano inokulacji. Po 24 godzinach płytki zliczano, a następnie końcowe stężenie SuperBrothll™ + E. coli regulowano tak, że stężenie końcowe wynosiło 250 komórek na 1,2 ml. Trzy razy po 2 litry szczepiono w celu otrzymania w sumie 6 litrów. Następnie pożywki wysiewano w 96-studzienkowych blokach o głębokich studzienkach (Qiagen). Wysiewanie wykonywano na 8-kanałowym dozowniku Q-FH12™ (Genetix, Christchurch, Dorset, UK).

E. coli hodowano przez noc w temperaturze 37°C wytrząsając przy 250 obrotach/minutę, na wytrząsarce wielopoziomowej z kontrolną warunków New Brunswick Scientific Innova 4900. E. coli odwirowywano z roztworu przy 3000 obr/min, przy użyciu wirówki Beckman GS-6KR. Osady E. coli zamrażano w temperaturze -20°C lub stosowano świeże przed minipreparowaniem plazmidowego DNA. Każdy osad zawiera około 250 klonów cDNA z biblioteki ludzkich komórek selekcjonowanych pod względem CD3+. Próbki 250 klonów cDNA następnie poddawano minipreparowaniu przy użyciu zestawu QIAprep™ 96 Turbo Miniprep (Qiagen). Plazmidowy DNA wymywano przy użyciu 125 pl TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA). Ten plazmidowy DNA używano następnie do transfekcji komórek BHK.

Trasfekcja BHK

Komórki BHK wysiewano w 96-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowej przy gęstości wynoszącej 12000 komórek na studzienkę w objętości 100 pl na studzienkę. Pożywką hodowlaną była DMEM (GibcoBRL), 5% inaktywowaną wysoką temperaturą płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutamina (GibcoBRL), 1 x PSN (GibcoBRL), 1 mM pirogronian sodu (GibcoBRL).

Następnego dnia komórki BHK przemywano raz 100 pl SFA. SFA jest pożywką pozbawioną surowicy złożoną z DMEM/F12 (Gibco/BRL), 2 mM GlutaMax™(Gibco/BRL), 1 mM pirogronianu sodu, 10 pg/ml transferyny, 5 pg/ml insuliny, 10 pg/ml fetuiny, 2 pg/ml selenu, 25 mM HEPES (Gibco/BRL), 100 pM aminokwasów niepodstawowych (Gibco/BRL). Mieszaninę DNA/Lipofectamine™ przygotowuje się następująco: 2,2 pl odczynnika Lipofectamine™ (Gibco/BRL) łączy się z 102,8 pl SFA w temperaturze pokojowej; następnie około 5 pl plazmidowego DNA (200 ng/pl) dodaje się do Lipofectamine™/SFA tworząc mieszaninę DNA/Lipofectamine™, którą inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 30 minut. SFA usuwano z komórek BHK i komórki inkubowano z 50 pl mieszaniny DNA/ /Lipofectamine™ przez 5 godzin, w temperaturze 37°C z 5% CO2. Pięćdziesiąt pl mieszaniny DNA/ /Lipofectamine™ dodawano do każdej z dwóch studzienek komórek BHK tak, że transfekcję wykonywano podwójnie.

Po inkubacji komórek BHK z mieszaniną DNA/Lipofectamine™ przez 5 godzin mieszaninę DNA/Lipofectamine™ pobierano i dodawano 100 pl pożywki hodowlanej. Komórki inkubowano przez noc, pożywki oddzielano i ponownie umieszczano ze 100 pl pożywki hodowlanej. Po hodowaniu komórek przez 72 godziny, kondycjonowane pożywki pobierano, zamrażano w temperaturze -80°C przez minimum 20 minut, rozmrażano, a następnie 50 pl testowano w teście proliferacji zalpha11/BaF3, opisanym w przykładach 2B i przykładzie 5, w celu identyfikacji próbek 250 klonów z aktywnością liganda.

Trzydzieści pięć 96-studzienkowych płytek badano w pojedynczym teście. Odpowiadało to około 250 cDNA/studzienkę lub 840000 całkowitego cDNA. Z tego, kondycjonowane pożywki z 54 studzienek (odpowiadających 250 cDNA na studzienkę) określono jako pozytywne w teście proliferacji. Kondycjonowane pożywki z tym pozytywnych próbek testowano ponownie w drugim teście (pułapki wydzielania) z rozpuszczalnym receptorem i bez (patrz przykład 12). Rozpuszczalny receptor zalpha11 CEE (przykład 10A) stosowano przy stężeniu końcowym wynoszącym około 1 pg/ml. Dla wszystkich 54 pozytywnych próbek, zasadniczo całą aktywność zobojętniono przez dodanie rozpuszczalnego receptora zalpha11, co potwierdziło, że te próbki zawierały cDNA z liganda zalpha11. Cztery z tych pozytywnych próbek wybrano do rozdzielenia przerywania i izolowania pojedynczego cDNA, który będzie kodować ligand zalpha11. Były to 45C5, 46G11, 40H12 i 60A1.

PL 207 350 B1

Dla każdej z tych 4 próbek, 1 μΙ DNA stosowano do transformowania komórek DH10B ElectroMax™ (Gibco/BRL) przez elektroporację. Transformanty wysiewano na płytkach LB + amp (100 μg/ml) + metycylina (10 μg/ml) uzyskując pojedyncze kolonie.

Dla każdej elektroporowanej próbki, 960 poszczególnych kolonii przenoszono za pomocą pręcika do dziesięciu 96-studzienkowych płytek, zawierających 1,2 ml SuperBrothll™ na studzienkę. Płytki te ponumerowano #1-10 dla każdego z rozdzielonych próbek (45C5, 46G11, 40H12 i 60A1). Hodowano je przez noc i plazmidowy DNA poddawano minipreparowaniu jak powyżej. Dla 46G11, 40H12 i 60A1, plazmidowy DNA z rozdzielonych płytek transfekowano do komórek BHK jak powyżej.

Dla 45 C5, wykorzystywano protokół przyspieszony w celu przyspieszenia identyfikacji cDNA liganda zalpha11. Komórki BHK transfekowano plazmidowym DNA z rozdzielonych płytek jak powyżej, mieszaninę DNA/Lipofectamine™ usuwano po 5 godzinach inkubacji i dodawano pożywkę hodowlaną. Ponieważ transfekcję wykonywano w dwóch powtórzeniach, następnego dnia zbierano pożywkę hodowlaną po 24 godzinach, od jednej z transfekowanych płytek BHK i następnego dnia po 48 godzinach zbierano z pozostałej transfekowanej płytki. 24-godzinne kondycjonowane pożywki testowano jak powyżej pod względem aktywności liganda zalpha11 przy użyciu testu proliferacji, jak opisano w niniejszym dokumencie.

Plazmidowy DNA zlewano z 45C5 rozdzielanych płytek # 1-4 i testowano pod względem wiązania rozpuszczalnego receptora zalpha11 z jego ligandem z użyciem protokołu „pułapki wydzielania” (patrz przykład 12 poniżej). Zidentyfikowano osiem pozytywnych klonów spośród 384 sekwencji ogółem. Wyniki testu proliferacji potwierdzały aktywność liganda zalpha11 i korelowały z wynikami testu pułapki wydzielania (patrz przykład 12). Jednocześnie, plazmidowy DNA poddawany minipreparowaniu z płytek # 1-4 rozdzielonych płytek 45C5 sekwencjonowano, aby określić sekwencję DNA z każdego 384 klonów.

Kilka klonów, które zostały pozytywnie zidentyfikowane w testach proliferacji i pułapki wydzielania sekwencjonowano także przy użyciu następujących starterów: ZC14,063 (SEQ ID Nr: 28),

ZC7,764a (SEQ ID Nr: 38), ZC7,764b (SEQ ID Nr: 39), ZC22,034 (SEQ ID Nr: 40) i ZC22,035 (SEQ

ID Nr: 41). Sekwencja polinukleotydową liganda zalpha11 była pełnej długości (SEQ ID Nr: 1); przekazano odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową (SEQ ID Nr: 2).

P r z y k ł a d 8

Konstruowanie ssaczych wektorów ekspresyjnych, które wykazują ekspresję rozpuszczalnych receptorów zalphall: zalpha11CEE, zalpha11CFLG, zalpha11CHIS i zalpha11-Fc4

A. Konstruowanie ssaczego wektora ekspresyjnego zalpha11 zawierającego zalpha11CEE, zalpha11CFLG i zalpha11CHIS

Wytwarzano wektor ekspresji w celu ekspresji rozpuszczalnej, zewnątrzkomórkowej domeny polipeptydu zalpha11, pC4zalpha11CEE, w którym konstrukcja przeznaczona do ekspresji polipeptydu zalpha11 obejmowała przewidywaną początkową metioninę, skróconą przy przewidywanej domenie transbłonowej oraz C-terminalny znacznik Glu-Glu (SEQ ID nr: 29).

Wytwarzano fragment DNA zalpha11 o długości 700 bp utworzony przez PCR stosując ZC19,931 (SEQ ID nr: 30) i ZC19, 932 (SEQ ID nr: 31) jako startery PCR, aby dodać miejsca restrykcji Asp718 i BamHI. Plazmid zawierający cDNA receptora zalpha11 (SEQ ID nr: 7) stosowano jako matrycę. Przeprowadzano powielanie PCR fragmentu zalpha11 w następujący sposób: dwadzieścia pięć cykli w temperaturze 94°C przez 0,5 minuty; pięć cykli w temperaturze 94°C przez 10 sekund, 50°C przez 30 sekund, 68°C przez 45 sekund, następnie utrzymywanie w temperaturze 4°C. Reakcję oczyszczano przez ekstrakcję w mieszaninie chloroform/fenol i wytrącanie izopropanolem, i trawiono Asp718 i BamHI (Gibco BRL) zgodnie z instrukcjami producenta. Uwidoczniono prążek o przewidywanej wielkości (700 bp) przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym, odcinano i oczyszczano DNA stosując system oczyszczania QiaexII™ (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta.

Odcięty DNA subklonowano do plazmidu pC4EE, który pocięto BamHI i Asp718. Wektor ekspresyjny pC4zalpha11CEE wykorzystuje natywny peptyd sygnałowy zalpha11 i przyłącza znacznik Glu-Glu (SEQ ID nr: 29) do końca C sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd zalpha11. Plazmid pC4EE jest ssaczym wektorem ekspresji zawierającym kasetę ekspresyjną, mającą mysi promotor metalotioneiny-1, wielokrotne miejsca restrykcyjny do wprowadzania sekwencji kodujących, kodon stop oraz terminator ludzkiego hormonu wzrostu. Plazmid posiada także początek replikacji E. coli, jednostkę ekspresji markera selekcji ssaka mającą promotor SV40, wzmacniacz i początek replikacji, gen DHFR oraz terminator SV40.

PL 207 350 B1

Około 30 ng trawionego restrykcyjnie insertu zalpha11 i około 12 ng strawionego wektora poddawano ligacji przez noc w temperaturze 16°C. Jeden mikrolitr każdej reakcji ligacji poddano niezależnej elektroporacji do kompetentnych komórek DHlOB (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) zgodnie z instrukcjami producenta, wysiewano na płytkach LB zawierających 50 mg/ml ampicyliny i inkubowano przez noc. Kolonie badano przesiewowe przez analizę restrykcji DNA wytworzonego z 2 ml płynnych hodowli poszczególnych kolonii. Sekwencję insertu klonów dodatnich weryfikowano przez anali_® zę sekwencji. Wytwarzano plazmid na dużą skalę stosując zestaw QIAGEN^® Maxi prep (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta.

Ten sam sposób stosowano do wytworzenia rozpuszczalnych receptorów zalpha11 z C-terminalnym znacznikiem his, zawierających 6 kolejnych reszt His; oraz C-terminalny znacznik flagi (SEQ

ID nr: 37), zalpha11CFLAG. Aby zbudować te konstrukcje, wyżej wymieniony wektor wektor posiada _® albo znacznik HIS, albo FLAG^® zamiast znacznika glu-glu (SEQ ID nr: 29).

B. Ssacza konstrukcja ekspresji rozpuszczalnego receptora zalpha11, zalpha11-Fc4

Konstruowano plazmid ekspresyjny zawierający całość lub część polinukleotydu kodującego zalpha11 przez rekombinację homologiczną. Zewnątrzkomórkową domenę receptora zalpha11 połączono z regionem Fc pochodzącym od ludzkiej IgG, zwanym „Fc4” (SEQ ID Nr: 33), który zawiera mutację, tak, że nie wiąże już receptora Fc. Przy użyciu PCR izolowano fragment cDNA zalpha11, który obejmuje sekwencje polinukleotydową z domeny zewnątrzkomórkowej receptora zalpha11. Dwoma starterami użytymi przy wytwarzaniu fragmentu zalpha11 były: (1) każdy starter PCR obejmuje od końca 5' do 3': 40 bp wektorowej sekwencji oskrzydlającej (5' insertu) i 17 bp odpowiadające końcowi 5' zewnątrzkomórkowej domeny zalpha11 (SEQ ID nr: 32); oraz (2) 40 bp końca 5' sekwencji polinukleotydowej Fc4 (SEQ ID nr: 32) i 17 bp odpowiadające końcowi 3' zewnątrzkomórkowej domeny zalpha11 (SEQ ID nr: 34). W podobny sposób wytwarzano fragment Fc-4 do fuzji z zalpha11 przez PCR. Dwoma fragmentami użytymi do wytwarzania fragmentu Fc4 były: (1) starter 5' zawierający 40 bp sekwencji od końca 3' zewnątrzkomórkowej domeny zalpha11 i 17 bp końca 5' Fc4 (SEQ ID nr: 35); oraz (2) starter 3' zawierający 40 bp sekwencji wektorowej (3' insertu) i 17 bp końca 3' Fc4 (SEQ ID nr: 36).

Powielanie PCR każdej reakcji opisanej powyżej przeprowadzano w następujący sposób: jeden cykl w temperaturze 94°C przez 2 minuty; dwadzieścia pięć cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 60°C przez 30 sekund, 72°C przez 1 minutę; jeden cykl w temperaturze 72°C przez 5 minut; następnie utrzymywanie w 4°C. Dziesięć μl ze 100 μl reakcji PCR analizowano na 0,8% żelu agarozowym LMP (Seaplaque GTG) z 1 x buforem TBE do analizy. Pozostałe 90 μl reakcji PCR wytrąca się dodając 5 μl 1 M NaCl i 250 μl absolutnego etanolu. Użyty wektor ekspresyjny pochodził od plazmidu pCZR199 (Depozyt ATCC nr 98668) i był pocięty Smal (BRL). Wektor ekspresyjny pochodził od plazmidu pCZR199; jest on ssaczym wektorem ekspresyjnym zawierającym kasetę ekspresyjną, mającą bezpośrednio wczesny promotor CMV, intron konsensusowy z locus łańcucha ciężkiego regionu zmiennego mysiej immunoglobuliny, wielokrotne miejsca restrykcji do wprowadzania sekwencji kodujących, kodon stop i terminator ludzkiego hormonu wzrostu. Wektor ekspresyjny posiada także początek replikacji E. coli, jednostkę ekspresji markera selekcyjngo ssaka mającą promotor SV40, wzmacniacz i początek replikacji, gen DHFR oraz terminator SV40. Użyty wektor ekspresyjny konstruowano z pCZR199 przez zamianę promotora metalotioneiny na bezpośrednio wczesny promotor CMV.

Sto mikrolitrów kompetentnych komórek drożdży (S. cerevisiae) łączono z 10 μl zawierającymi w przybliżeniu 1 μg każdego z insertów zalpha11 i Fc4 oraz 100 ng wektora ekspresji trawionego Smal (BRL) i przenoszono do 0,2 cm kuwety do elektroporacji. Mieszaniny drożdży/DNA poddano działania impulsów elektrycznych: 0,75 kV (5 kV/cm), nieskończona oporność (Q), 25 μF. Do każdej kuwetki dodaje się 600 μl 1,2 M sorbitolu i drożdże wysiewa w dwóch 300 μl równych ilościach na dwóch płytkach URA-D i inkubuje w temperaturze 3 0°C.

Po około 48 godzinach transformanty drożdżowe Ura+ z pojedynczej płytki ponownie zawieszano w 1 ml H2O i wirowano krótko, aby zbić w grudkę komórki drożdży. Osad komórek ponownie zawieszano w 1 ml buforu do lizy (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). Pięćset mikrolitrów mieszaniny do lizy dodawano do probówek Eppendorfa zawierającej 300 μl kulek szklanych przemytych kwasem i 200 μl mieszaniny fenol-chloroform, wirowano przez 1 minutę dwa lub trzy razy, po czym wirowano 5 minut w wirówce Eppendorfa przy maksymalnej prędkości. Trzysta mikrolitrów fazy wodnej przenoszono do nowej probówki i DNA wytrącono 600 μl etanolu (EtOH), po czym wirowano przez 10 minut w temperaturze 4°C. Osad DNA ponownie zawieszano w 100 μl H₂O.

PL 207 350 B1

Transformację elektrokompetentnych komórek E. coli (DH10B, GibcoBRL) wykonuje się z użyciem 0,5-2 mi preparatu drożdżowego DNA i 40 pi komórek DH10B. Komórki poddano działaniu impulsów elektrycznych: o 2,0 kV, 25 mF i 400 omów. Po elektroporacji, 1 ml SOC (2% Bacto™ Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% ekstrakt drożdżowy (Difco), 10 mM NaCi, 2,5 mM KCi, 10 mM MgCi2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukozę) Wysiewano iiości w 250 pi na czterech płytkach LB AMP (pożywka LB (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/L ampicyliny).

Poszczegóine kiony posiadające prawidłowe konstrukcje ekspresji dia zaipha11-Fc4 identyfikowano przez trawienie restrykcyjne w ceiu zweryfikowania obecności insertu zaipha11-Fc4 i potwierdzenia, że różne sekwencje DNA zostały prawidłowo połączone jedna z drugą. Insert o dodatnich kionach poddawano anaiizie sekwencji. Na dużą skaię piazmidowy DNA izoiuje się stosując zestaw Qiagen Maxi (Qiagen), zgodnie z instrukcjami producenta.

P r z y k ł a d 9

Transfekcja i ekspresja poiipeptydów rozpuszczalnego receptora zalpha11

A. Ekspresja u ssaka rozpuszczalnego receptora zalpha11 zalpha11CEE, zalpha11CFLG i zalpha11CHIS

Komórki BHK 570 (ATCC nr CRL-10314), pasaż 27, wysiewano w iiości 1,2 x 10⁶ komórek/studzienkę (6-studzienkowej płytki) w 800 pi pożywek pozbawionych surowicy (SF) DMEM (DMEM, Gibco/BRL High Giucose) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Komórki transfekowane piazmidami ekspresyjnymi zawierającymi zaipha11CEE, zalpha11CFLG lub zalpha11CHIS opisanymi powyżej (zobacz przykład 8), stosując Lipofectin™ (Gibco BRL), w pozbawionej surowicy (SF) DMEM. Trzy mikrogramy każdego z zaipha11CEE, zalpha11CFLG lub zalpha11CHIS oddzielnie rozcieńczano do probówek 1,5 mi, do całkowitej objętości końcowej wynoszącej 100 pl SF DMEM. W oddzielnych probówkach 15 pi Lipofectin™ (Gibco BRL) mieszano ze 100 pi SF DMEM. Mieszaninę Lipofectin™ inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30-45 minut, następnie dodawano mieszaninę DNA i pozostawiano do inkubacji na około 10-15 minut w temperaturze pokojowej.

Całą mieszaninę DNA:Lipofectin™ dodawano do wysianych komórek i iosowo rozmieszczano na nich. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez około pięć godzin, następnie przenoszono do oddzieinych 150 mm płytek MAXI w końcowej objętości wynoszącej 30 mi DMEM/5% płodowej surowicy bydięcej (FBS) (Hycione, Logan, UT). Płytki inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez noc i mieszaninę DNA:Lipofectin™ zastępowano pożywkami selekcyjnymi (5% FBS/DMEM z 1 pM metotreksatu (MTX) następnego dnia.

Około 10-12 dni po transfekcji płytki przemywano 10 mi SF DMEM. Pożywki z przemywania pobrano i zastąpiono 7,25 mi pozbawioną surowicy DMEM. Jałowe sita tefionowe (Spectrum Medical Industries, Los Angeies, CA), wstępnie nasycone w SF DMEM, umieszczano następnie nad koioniami komórek z kionami. Jałowy fiitr nitroceiuiozowy, wstępnie nasycony w SF DMEM, umieszczano następnie nad sitem. Znaczki orientacyjne na nitroceiuiozie przenoszono do płytek z hodowią. Płytki inkubowano następnie przez 5-6 godzin w inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO2.

Po inkubacji fiitry/sita zdejmowano i pożywki pobierano i zastępowano 5% FBS/DMEM z 1 pM

MTX. Fiitry utrwaiano następnie w 10% odtłuszczonym mleku w proszku/buforze Western A (Western

A: 50mM Tris pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,05% NP-40, 150 mM NaCi oraz 0,25% żeiatyna) przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce rotacyjnej. Fiitry inkubowano następnie z koniugatami od_® powiednio przeciwciało-HRP anty-Glu-Glu, anty-FLAG^® lub anty-HIS, w 2,5% odtłuszczonym mieku w proszku/buforze Western A przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce rotacyjnej. Następnie fiitry przemywano trzy razy w temperaturze pokojowej z Western A przez 5-10 minut na przemywanie. Fiitry wywoływano przy użyciu odczynnika uitra ECL (Amersham Corp., Ariington Heights, IL) zgodnie z instrukcjami producenta i uwidaczniano na Lumi-Imager (Roche Corp.)

Wykazujące dodatnią ekspresję koionie z kionami zebrano mechanicznie do 12-studzienkowych płytek w jednym mi 5% FCS/DMEM z 5 pM MTX, następnie hodowano do ziania. Próbki kondycjonowanych pożywek testowano następnie pod wzgiędem poziomu ekspresji za pomocą SDS-PAGE i anaiizę western. Zbierano trzy kiony wykazujące najwyższą ekspresję dia każdej konstrukcji; dwa z trzech zamrażano na wszeiki wypadek zaś jeden powieiono do testowania mykopiazmą i posiewu na skaię przemysłową.

B. Ekspresja u ssaka rozpuszczalnego receptora zalpha11, zalpha11-Fc4

Komórki BHK 570 (ATCC nr: CRL-10314) wysiewano w 10 cm płytkach do hodowii tkankowej i pozostawiono do wzrostu do około 50 do 70% ziania przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO2 w pożywkach DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Giucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5%

PL 207 350 B1 płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-glutaminy (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM pirogronianu sodu (Gibco BRL)). Następnie komórki transfekowano plazmidem zawierającym zalpha11-Fc4 (zobacz przykład 8), stosując Lipofectamine™ (Gibco BRL), w preparacie pożywki pozbawionej surowicy (SF) (DMEM, 10 mg/ml transferyny, 5 mg/ml insuliny, 2 mg/ml fetuiny, 1% L-glutaminy i 1% pirogronianu sodu). Plazmid zawierający zalpha11-Fc4 rozcieńczano do próbek 15 ml do końcowej objętości całkowitej wynoszącej 640 ml z pożywkami SF. 35 ml Lipofectamine™ (Gibco BRL) mieszano z 605 ml pożywki SF. Mieszaninę Lipofectamine™ dodawano do mieszaniny DNA i pozostawiano do inkubacji na około 30 minut w temperaturze pokojowej. Pięć mililitrów pożywek SF dodawano do mieszaniny DNA:Lipofectamine™. Komórki przemywano raz 5 ml pożywek SF, pobierano i dodawano mieszaninę DNA:Lipofectamine™. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez pięć godzin, następnie do każdej płytki dodawano 6,4 ml pożywek DMEM/10% FBS, 1% PSN. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez noc i mieszaninę DNA:Lipofectamine™ zastępowano świeżymi 5% pożywkami FBS/DMEM następnego dnia. W dniu 2 po transfekcji komórki dzielono do pożywek selekcyjnych (DMEM/FBS pożywek z powyższego, dodając 1 mM metotreksat (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)) na płytkach 150 mm przy 1:10, 1:20 i 1:50. Pożywki z komórkami zastępowano świeżymi pożywkami selekcyjnymi w dniu 5 po transfekcji. Około 10 dni po transfekcji dwie płytki hodowlane 150 mm z koloniami opornymi wobec metotreksatu z każdej transfekcji poddawano działaniu trypsyny i komórki zlewano oraz wysiewano w kolbie T-162 i przenoszono do hodowli na dużą skalę.

P r z y k ł a d 10

Oczyszczanie rozpuszczalnych receptorów zalpha11 z komórek BHK 570

A. Oczyszczanie polipeptydu zalpha11CEE z BHK 570

Jeśli nie podano inaczej, wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze 4°C. Następujące procedury stosowano do oczyszczenia polipeptydu zalpha11 zawierającego C-terminalne znaczniki GluGlu (EE). Trzydzieści litrów fabrycznie kondycjonowanych pożywek komórkowych zatężono do 1,6 litra przy użyciu wkładu spiralnego Amicon S10Y3 na ProFlux A30. Roztwór inhibitora proteazy dodawano do zatężonego 1,6 litra fabrycznie kondycjonowanych pożywek komórkowych z transfekowanych komórek BHK 570 (zobacz przykład 9), do końcowego stężenia wynoszącego 2,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0,003 mM leupeptyny (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 mM pepsystatyny (Boehringer-Mannheim) i 0,4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim). Pobrano próbki do analizy i całą objętość zamrażano w temperaturze -80°C do rozpoczęcia oczyszczania. Całkowite stężenie docelowego białka w zatężonych fabrycznie kondycjonowanych pożywkach komórkowych określono przez analizę SDS-PAGE i western blot z przeciwciałem anty-EE sprzężonym z HRP.

100 ml kolumny anty-EE G-Sepharose (wytworzonej jak opisano poniżej) wylano do szklanej kolumny Waters AP-5, 5 cm x 10 cm. Kolumnę upakowano i równoważono na BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) przy użyciu roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS) pH 7,4. Zatężone komórkowe pożywki kondycjonowane fabrycznie rozmrożono, filtrowano jałowo przez filtr 0,2 mikrona, pH doprowadzono do 7,4, następnie ładowano na kolumnę na noc przy natężeniu przepływu 1 ml/minutę. Kolumnę przemywano 10 objętościami kolumny (CV) roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS, pH 7,4), następnie wymywano tłokowe 200 ml PBS (pH 6,0) zawierającego 0,5 mg/ml peptydu EE (Anaspec, San Jose, CA) przy 5 ml/minutę. Stosowany peptyd EE posiada sekwencję EYMPME (SEQ ID nr: 29). Kolumnę przemywano 10 CV przy użyciu PBS, następnie wymywano 5 CV 0,2M glicyny, pH 3,0. pH glicyny do wymywania kolumny dporowadzano do 7,0 za pomocą 2 CV 5X PBS, następnie równoważono w PBS (pH 7,4). Frakcje po pięć ml zbierano poprzez całą chromatografię elucyjną i monitorowano absorbancję przy 280 i 215 nM; przesącze i przemyte połączone frakcje także zachowywano i analizowano. Frakcje pikowe wymywania polipeptydu EE analizowano pod względem białka docelowego przez barwienie srebrem SDS-PAGE i metodą western blot z przeciwciałem anty-EE sprzężonym z HRP. Badane frakcje wymywania polipeptydu zlewano i zatężano z 60 ml do 5,0 ml stosując obrotowe urządzenie do zatężania z błoną o wartości odcięcia ciężaru cząsteczkowego 10000 daltonów (Millipore, Bedford, MA) zgodnie z instrukcjami producenta.

Aby oddzielić zalpha11CEE od innych białek oczyszczanych równocześnie, zatężane zlane frakcje wymywania polipeptydu podawano na POROS HQ-50 (silna żywica jono wymienna firmy PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) przy pH 8,0. Kolumnę 1,0 x 6,0 cm wylewano i upakowano na BioCad Sprint. Kolumnę ładowano przeciw jonami, a następnie równoważono w 20 mM TRIS pH 8,0 (tris(hydroksymetyloaminometan)). Próbkę rozcieńczano 1:13 (aby zmniejszyć moc jonową PBS), a następnie podawano na kolumnę Poros HQ w ilości 5 ml/minutę. Kolumnę przemywano 10 CV

PL 207 350 B1 mM Tris pH 8,0, następnie wymywano 40 CV gradientu 20 mM Tris/1M chlorku sodu (NaCl) przy przepływie 10 mi/minutę. Frakcje 1,5 mi zbierano w czasie całej chromatografii i monitorowano absorbancję przy 280 i 215 nM. Pikowe frakcje wymywania anaiizowano przez barwienie srebrem SDS-PAGE. Badane frakcje ziewano i zatężano do 1,5-2 mi stosując obrotowe urządzenie do zatężania z błoną o wartości odcięcia ciężaru cząsteczkowego 10000 daitonów (Miiiipore, Bedford, MA) zgodnie z instrukcjami producenta.

Aby oddzieiić poiipeptyd zaipha11CEE od woinego peptydu EE i wszeikich oczyszczanych równocześnie białek, ziewane zatężane frakcje poddawano chromatografii na koiumnie 1,5 x 90 cm Sephadex S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) równoważonej i ładowanej w PBS przy natężeniu przepływu wynoszącym 1,0 mi/min, stosując BioCad Sprint. Frakcje po 1,5 ml zbierano przez całą chromatografię i monitorowano absorbancję przy 280 i 215 nM. Frakcje pikowe charakteryzowano przez barwienie SDS-PAGE Silver i tyiko najczystsze frakcje ziewano. Ten materiał stanowił oczyszczony poiipeptyd zalpha11CEE.

Ten oczyszczony materiał podawano na koniec na 4 ml kolumny ActiClean Etox (Sterogen), aby usunąć wszeikie pozostałe endotoksyny. Próbkę przepuszczano przez koiumną grawitacyjną, równoważoną PBS cztery razy, następnie koiumnę przemywano jedną objętością 3 mi PBS, który ziewano z „oczyszczoną” próbką. Materiał następnie jałowo fiitrowano przez fiitr 0,2 mikrona i przechowywano w temperaturze -80°C do podzieienia na równe części.

Na poddanych analizie western blot żeiach SDS-PAGE barwionych błękitem Coomassie i srebrem, polipeptyd zalpha11CEE stanowił główny prążek o pozornym ciężarze cząsteczkowym wynoszącym 50000 daitonów. Mobiiność tego prążka była taka sama w żeiach redukujących i nieredukujących.

Zatężenie białka oczyszczanego materiału przeprowadzano przez anaiizę BCA (Pierce, Rockford, IL), białko podzieiono na równe części i przechowywano w temperaturze -80°C zgodnie ze standardowymi procedurami. Na żeiach iEF (ogniskowanie izoeiektryczne) białko wykazuje PI poniżej 4,5. Stężenie poiipeptydu zaipha11CEE wynosiło 1,0 mg/mi.

Aby wytworzyć anty-EE Sepharose, złoże o objętości 100 mi białka G-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) przemywano 3 razy 100 ml PBS zawierającego 0,02% azydek sodu, stosując 500 mi fiitr Naigen 0,45 mikronów. Żei przemywano 6,0 objętościami 200 mM trietanoioaminy, pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO) i dodawano równą objętość roztworu przeciwciała EE, zawierającego 900 mg przeciwciała. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 4°C niezwiązane przeciwciało usuwano przez przemycie żywicy 5 objętościami 200 mM TEA, jak opisano powyżej. Żywicę ponowne zawieszano w 2 objętościach TEA, przenoszono do odpowiedniego pojemnika i dodawano dimetyiopimiioimidan-2HCl (Pierce, Rockford, IL) rozpuszczony w TEA, do końcowego stężenia wynoszącego 36 mg/mi w żeiu białko G-Sepharose. Żei wytrzęsano deiikatnie w temperaturze pokojowej przez 45 minut i płyn usuwano stosując fiitr, jaki opisano powyżej. Niespecyficzne miejsca na żeiu utrwaiono następnie przez inkubację przez 10 minut w temperaturze pokojowej z 5 objętościami 20 mM etanoioaminy w 200 mM TEA. Żei następnie przemywano 5 objętościami PBS zawierającego 0,02% azydek sodu i przechowywano w tym roztworze w temperaturze.

B. Oczyszczanie polipeptydu zalpha11CFLAG z BHK 570

Jeśii nie podano inaczej, wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze 4°C. Następujące procedury stosowano do oczyszczenia polipeptydu zalpha11 zawierającego C-terminalne znaczniki _®

FLAG^® (FLG) (Sigma-Aidrich Co.). Trzydzieści iitrów komórkowych pożywek kondycjonowanych fabrycznie zatężono do 1,7 iitra stosując obrotowy wkład Amicon S10Y3 na ProFiux A30. Dodawano roztwór inhibitora proteazy do 1,7 iitra zatężanych komórkowych pożywek kondycjonowanych fabrycznie z transfekowano komórek BHK 570 (zobacz przykład 9) do końcowych stężeń wynoszących 2,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0,003 mM leupeptyny (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, 1N), 0,001 mM pepstatyny (Boehringer-Mannheim) i 0,4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim). Pobierano próbki do anaiizy, a całą objętość zamrażano w temperaturze -80°C do rozpoczęcia oczyszczania.

Całkowite stężenia białka doceiowego w komórkowych pożywkach kondycjonowanych fabrycz_® nie okreśiano przez SDS-PAGE i anaiizę western blot z przeciwciałem anty-FLAG^® (Kodak) sprzężo_® nym z HRP. 125 mi koiumnę żeiową z żeiem powinowactwa anty-FLAG^® M2-Agarose (Sigma-Aldrich

Co.) wylewano do szklanej kolumny Waters AP-5, 5 cm x 10 cm. Koiumnę upakowano i równoważono na BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) z użyciem roztworu soii buforowanego fosforanem (PBS) pH 7,4. Zatężone komórkowe pożywki kondycjonowane fabrycznie rozmrażano,

PL 207 350 B1 jałowo filtrowano przez filtr 0,2 mikrona, pH regulowano do 7,4, następnie ładowano na kolumnę przez noc przy natężeniu przepływu 1 ml/minutę.

Kolumnę przemywano 10 objętościami kolumny (CV) roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS, pH 7,4), następnie wymywano tłoczkowe 250 ml PBS (pH 6,0) zawierającym 0,5 mg/ml peptydu FLAG^® (Sigma-Aldrich Co.) przy przepływie 5 ml/minutę. Stosowany peptyd FLAG^® posiada sekwencję DYKDDDDK (SEQ ID nr: 37).

Kolumnę przemywano 10 CV PBS, następnie wymywano 5 CV 0,2M glicyny, pH 3,0. pH glicyny wymywanej z kolumny doprowadzano do 7,0 przy użyciu 2 CV 5X PBS, następnie równoważono w PBS (pH 7,4). Frakcje po pięć ml zbierano poprzez całą chromatografię elucyjną i monitorowano absorbancję przy 280 i 215 nM; połączony przesącz roztwór po przemywaniu także zachowywano _® i analizowano. Frakcje pikowe wymywania polipeptydu FLAG^® analizowano pod względem białka docelowego przez barwienie srebrem na SDS-PAGE i analizę western biot z przeciwciałem anty-FLAG sprzężonym z HRP. Badane frakcje wymywania polipeptydu zlewano i zatężano z 80 ml do 12 ml stosując obrotowe urządzenie do zatężania z błoną o wartości odcięcia ciężaru cząsteczkowego 10000 daltonów (Millipore, Bedford, MA) zgodnie z instrukcjami producenta.

Aby oddzielić zalpha11CFLG od innych białek oczyszczanych równocześnie, zatężane zlane frakcje wymywania polipeptydu podawano na POROS HQ-50 (silna żywica jonowymienna firmy PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) przy pH 8,0. Kolumnę o 1,0 x 6,0 cm wylewano i upakowano na BioCad Sprint. Kolumnę ładowano jonami przeciwnymi, następnie równoważono w 20 mM TRIS pH 8,0 (tris(hydroksymetyloaminometan)).

Próbkę rozcieńczano 1:13 (aby zmniejszyć moc jonową PBS), następnie ładowano na kolumnę Poros HQ-50 przy przepływie 5 ml/minutę. Kolumnę przemywano 10 objętościami kolumny (CV) 20 mM Tris pH 8,0, następnie wymywano 40 CV gradientu 20 mM Tris/1 M chlorku sodu (NaCl) przy przepływie 10 ml/minutę. Frakcje po 1,5 ml zbierano w czasie całej chromatografii i monitorowano absorbancję przy 280 i 215 nM.

Pikowe frakcje wymywania analizowano przez barwienie srebrem na SDS-PAGE. Badane frakcje zlewano i zatężano do 1,5-2 ml stosując obrotowe urządzenie do zatężania z błoną o wartości odcięcia ciężaru cząsteczkowego 10000 daltonów (Millipore, Bedford, MA) zgodnie z instrukcjami producenta.

_®

Aby oddzielić polipeptyd zalpha11CFLG od wolnego peptydu FLAG^® i wszelkich zanieczyszczających białek oczyszczanych równocześnie, zlewane zatężane frakcje poddawano chromatografii na kolumnie 1,5 x 90 cm Sephacryl S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) równoważonej i ładowanej w PBS przy natężeniu przepływu 1,0 ml/min, stosując BioCad Sprint. Frakcje po 1,5 ml zbierano przez całą chromatografię i monitorowano absorbancję przy 280 i 215 nM. Frakcje pikowe charakteryzowano przez barwienie srebrem na SDS-PAGE i tylko najczystsze frakcje zlewano. Ten materiał stanowił oczyszczony polipeptyd zalpha11CFLG.

Ten oczyszczony materiał podawano na koniec na 4 ml kolumnę ActiClean Etox (Sterogen), aby usunąć wswzelkie pozostałe endotoksyny. Próbkę przepuszczano przez kolumnę grawitacyjną równoważoną PBS cztery razy, następnie kolumnę przemywano jedną 3 ml objętością PBS, którą zlewano z „oczyszczonej” próbki. Materiał następnie filtrowano jałowo przez filtr 0,2 mikrona i przechowywano w temperaturze -80°C do podzielenia na równe części.

Na poddanych analizie western blot żelach barwionych błękitem Coomassie i srebrem SDS-PAGE, polipeptyd zalphallCFLG stanowił główny prążek o pozornym ciężarze cząsteczkowym wynoszącym 50000 daltonów. Mobilność tego prążka była taka sama w żelach redukujących i nieredukujących.

Zatężanie białka w oczyszczanym materiale przeprowadzano przez analizę BCA (Pierce, Rockford, IL), białko podzielono na równe części i przechowywano w temperaturze -80°C zgodnie ze standardowymi procedurami. Na żelach lEF (ogniskowanie izoelektryczne) białko wykazuje PI poniżej 4,5. Stężenie polipeptydu zalphallCFLG wynosiło 1,2 mg/mL.

C. Oczyszczanie polipeptydu zalpha11-Fc4 z transfekowanych komórek BHK 570

Jeśli nie podano inaczej, wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze 4°C. Następujące procedury stosowano do oczyszczenia polipeptydu zalpha11 zawierającego C-terminalną fuzję z ludzkim IgG/Fc (zalpha11-Fc4; przykłady 8 i 9). 12000 ml kondycjonowanych pożywek z komórek BHK 570 transfekowanych zalpha11-Fc4 (przykład 9) filtrowano przez 0,2 mm filtr wyjaławiający i następnie uzupełniono roztworem inhibitorów proteazy, do końcowych stężeń wynoszących 0,001 mM leupeptyny (Boerhinger-Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 mM pepstatyny (Boerhinger-Mannheim) i 0,4 mM

PL 207 350 B1

Pefabloc (Boerhinger-Mannheim). Białko G-Sepharose (złoże o objętości 6 ml, Pharmacia Biotech) upakowano i przemywano 500 ml PBS (Gibco/BRL).

Uzupełnione kondycjonowane pożywki przepuszczano przez kolumnę przy natężaniu przepływu 10 ml/minutę, po czym przemywano 1000 ml PBS (BRL/Gibco). Zalpha11-Fc4 wymywano z kolumny 0,1 M glicyna o pH 3,5 i 2 ml frakcje zbierano bezpośrednio do 2 ml 2M Tris pH 8,0, aby dostosować końcowe pH we frakcjach do 7,0.

Wymywane frakcje charakteryzowano za pomocą SDS-PAGE i analizę western blot z przeciwciałami przeciwko ludzkiemu Fc (Amersham). Analiza western blot redukujących żeli SDS-PAGE ujawnia immunoreaktywne białko o masie 80000 kDa we frakcjach 2-10. SDS-PAGE w żelach barwionych srebrem także ujawniła polipeptyd o masie 80000 kDa zalpha11:Fc we frakcjach 2-10. Frakcje 2-10 połączono.

Zatężenie białka połączonych frakcji przeprowadzano przez analizę BCA (Pierce, Rockford, IL), materiał podzielono na równe części przechowywano w temperaturze -80°C zgodnie ze standardowymi procedurami. Stężenie połączonych frakcji wynosiło 0,26 mg/ml.

P r z y k ł a d 11

Test przy użyciu rozpuszczalnego receptora zalpha11 (zmutowanych) rozpuszczalnych receptorów zalpha11CEE, zalpha11CFLG i zalpha11-Fc4 w kompetytywnym teście inhibicji

Komórki BaF3/Zalpha11 odwirowywano i przemywano w pożywkach pozbawionych mIL-3. Komórki odwirowywano i przemywano 3 razy, aby zapewnić usunięcie mIL-3. Komórki następnie zliczano w liczniku krwinek. Komórki wysiewano w formacie 96-studzienkowym w ilości 5000 komórek na studzienkę w objętości wynoszącej 100 μl na studzienkę, stosując pożywki pozbawione mIL-3.

Zarówno pożywki z aktywacji małpich komórek śledziony, jak i komórek selekcjonowanych pod względem CD3+, opisanych w przykładzie 5, dodawano w oddzielnych doświadczeniach przy stężeniach 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% i 0,375%, przy obecności lub bez rozpuszczalnych receptorów zalpha11 (konstrukcje CEE, C-flag i Fc4; zobacz przykład 9 i 10) w ilości 10 μg/ml. Całkowita objętość testowa wynosiła 200 pl.

Płytki testowe inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 3 dni, w czasie których dodawano 20 pl/studzienkę Alamar Blue (Accumed). Płytki inkubowano ponownie w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 24 godziny. Płytki odczytywano na czytniku płytek Fmax™ (Molecular Devices), jak opisano w przykładzie 2. Wyniki wskazywały na całkowitą inhibicję wzrostu komórek z każdej z różnych konstrukcji rozpuszczalnego receptora zalpha11 przy 10 pg/ml, potwierdzając, że czynnik w każdej próbce był specyficzny dla receptora zalpha11.

Otrzymano także krzywe miareczkowania, rozcieńczając rozpuszczalne receptory, przy użyciu powyższego testu. Zarówno rozpuszczalne receptory zalpha11, zalpha11CEE, jak i zalpha11CFLG były zdolne do pełnej inhibicji wzrostu przy małej ilości 20 ng/ml. Zmutowany rozpuszczalny receptor zalpha11 zalpha11-Fc4 był tak skuteczny jedynie przy 1,5 pg/ml.

P r z y k ł a d 12

Test pułapki wydzielania

Test pułapki wydzielania stosowano do identyfikacji cDNA dla liganda zalpha11. Pozytywne połączone DNA otrzymywano z klonowania ekspresyjengo opisanego przykładzie 7.

Połączenie DNA 250 klonów transfekowane do komórek BHK w formacie 96-studzienkowym i kondycjonowaną pożywkę umieszczano w teście proliferacji przy użyciu komórek BaF3/zalpha11 opisanym w przykładzie 4 i przykładzie 5. Kilka połączonych próbek DNA wykazywało pozytywną aktywność, które powtarzano i zobojętniano z użyciem rozpuszczalnych receptorów zalpha11 (patrz przykład 11).

Jedno z pozytywnych zlań DNA, 45C5, transfekowane do komórek COS w formacie 12-studzienkowym, przy użyciu metody Lipofectamine™ opisanej poniżej. Następnie przeprowadzano test pułapki wydzielania przy użyciu rozpuszczalnych receptorów zalpha11 (ze znacznikiem C-terminalnym Glu-Glu z biotynylowaniem lub bez; ze znacznkiem C-terminalnym Flag; lub fuzje Fc4 z rozpuszczalnym receptorem zalpha11) (przykład 9), w celu przetestowania bezpośredniego wiązania między potencjalnym ligandem receptora zalpha11 z próbek 45C5 i rozpuszczalnym receptorem zalpha11 (patrz poniżej). Wynik był pozytywny. W zwiąku z tym, DNA z próbki 45C5 poddawano elektroporacji do E. coli i pojedyncze kolonie zbierano do dziesięciu 96-studzienkowych płytek. Płytki wytrząsano w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie przeprowadzono mini preparowanie DNA (Qia-Prep™ 96 Turbo Miniprep Kit; Qiagen) w 96-studzienkowym formacie, przy użyciu TomTech Quadra 9600. Plazmidowy DNA następnie łączono rzędami i kolumnami, transfekowano do komórek COS, a następnie pozytywne zlania określano przez pułapki wydzielania, jak opisano poniżej.

PL 207 350 B1

Transfekcje komórek COS

Transfekcję komórek COS prowadzono następująco: mieszaninę 3 μl zlanego DNA i 5 μl Lipofectamine™ w 92 μl pożywek DMEM pozbawionych surowicy (55 mg pirogronianu sodu, 146 mg L-glutaminy, 5 mg transferyny, 2,5 mg insuliny, 1 μg selenu i 5 mg fetuiny w 500 ml DMEM) inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie dodaje 400 μl pożywki DMEM pozbawionej ₅ surowicy. Te 500 μl mieszaniny dodaje się do 1,5 x 10 COS komórek/studzienkę wysianych na 12-studzienkowej płytce do hodowli tkankowej i inkubuje przez 5 godzin w temperaturze 37°C. Dodaje się 500 μl 20% pożywki FBS DMEM (100 ml FBS, 55 mg pirogronianu sodu i 146 mg L-glutaminy w 500 ml DMEM) i inkubuje przez noc.

Test pułapki wydzielania

Pułapkę wydzielania prowadzono następująco: pożywki wypłukiwano z komórek za pomocą PBS, a następnie utrwalano przez 15 minut z użyciem 1,8% formaldehydu w PBS. Komórki następnie przemywano TNT (0,1M Tris-HCl, 0,15M NaCl i 0,05% Tween-20 w H2O) traktowano 0,1% Triton-X w PBS przez 15 minut i ponownie przemywano TNT. Komórki utrwalano przez 1 godzinę TNB (0,1 M Tris-HCl, 0,15M NaCl i 0,5% odczynnia utrwalającego (NEN Renaissance TSA-Direct Kit) w H2O) i przemywano ponownie TNT.

Jeśli stosowano biotynylowane białko, komórki utrwalano przez 15-minutowe inkubacje stosując awidynę a, następnie biotynę (Vector Labs) pomiędzy przemywaniem TNT. W zależności od tego, który rozpuszczalny receptor stosowano, komórki inkubowano przez 1 godzinę z: (A) 1-3 μg/ml białka fuzyjnego rozpuszczalnego receptora zalpha11, zalpha11-Fc4 (przykład 10); (B) 3 μg/ml rozpuszczalnego receptora zalpha11 znakowanego C-terminalnie FLAG, zalpha11CFLG (przykład 10); (C) 3 μg/ml rozpuszczalnego receptora zalpha11 znakowanego C-terminalnie GluGlu, zalpha11CEE (przykład 10); lub (D) 3 μg/ml biotynylowanego rozpuszczalnego receptora zalpha11, zalpha11CEE w TNB.

Następnie komórki przemywano TNT. W zależności od tego, który rozpuszczalny receptor stosowano, komórki inkubowano przez dodatkową godzinę z: (A) rozcieńczonym 1:200 kozim antyludzkim Ig-HRP (specyficznym dla Fc); (B) rozcieńczonym 1:1000 M2-HRP; (C) rozcieńczonym 1:1000 anty-GluGlu przeciwciałem-HRP; lub (D) rozcieńczonym 1:300 streptawidyno-HRP (zestaw NEN) w TNB. Ponownie komórki przemywano TNT.

Pozytywne wiązanie wykrywano z użyciem tyramidu fluoresceiny rozcieńczonego 1:50 w buforze do rozcieńczania (zestaw NEN), inkubowano przez 4-6 minuty i przemywano TNT. Komórki zakonserwowano z użyciem Vectashield Mounting Media (Vector Labs Burlingame, CA) rozcieńczonego 1:5 w TNT. Komórki uwidaczniano przy użyciu filtra FITC pod mikroskopem fluorescencyjnym.

P r z y k ł a d 13

Doposowanie w chromosomie i umiejscowienie genu dla liganda zalpha11

Gen dla liganda zalpha11 mapowano do chromosomu 4 przy użyciu dostępnej na rynku wersji „Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel” (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). „Stanford G3 RH Panel” zawiera DNA od każdego z 83 napromieniowanych klonów hybrydowych całego ludzkiego genomu oraz dwa kontrolne DNA (donor RM i biorca A3). Publicznie dostępny serwer WWW (http://shgc-www.stanford.edu) pozwala na lokalizację markerów na chromosomie.

W celu mapowania genu liganda zalpha11 z użyciem „Stanford G3 RH Panel”, 20 μl reakcje ustawiano w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania (Stratagen, La Jolla, CA) i stosowano w termocyklerze „RoboCycler Gradient 96” (Stratagen). Każda z 85 reakcji PCR obejmowała 2 μl buforu reakcji PCR 10 x KlenTaq (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1,6 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM każdy, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 μl sensownego startera, ZC 22,050 (SEQ ID Nr: 42), 1 μl antysensownego startera, ZC 22, 051 (SEQ ID Nr: 43), 2 μl „RediLoad” (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0,4 μl 50X Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng DNA od poszczególnych klonów hybrydowych lub kontrolnych i ddH2O do całkowitej objętości wynoszącej 20 pl. Reakcje pokrywano równą ilością oleju mineralnego i zamykano. Warunki w cyklerze PCR były następujące: początkowy 1 cykl 5 minut denaturacji w temperaturze 94°C, 35 cykli 45 sekund denaturacji w temperaturze 94°C, 45 sekund hybrydyzacji w temperaturze 60°C i 1 minuta i 15 sekund elongacji w temperaturze 72°C, po czym końcowy 1 cykl elongacji 7 minut w temperaturze 72°C. Reakcje rozdzielano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

Wyniki wykazywały połączenie genu liganda zalpha11 z markerem zrębowym IL2 SHGC-12342 z wynikiem LCD wynoszącym > 12 i w odległości 6 cR_10000 (około 180 kb) od markera. Stosowanie

PL 207 350 B1 otaczających markerów pozycjonuje gen liganda zalpha11 w regionie 4q27 na zintegrowanej mapie LDB chromosomu 4 (The Genetic Location Database, University of Southhampton, serwer WWW: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/publichtml/).

P r z y k ł a d 14

Identyfikacja i klonowanie mysiego liganda zalpha11 przy użyciu sekwencji EST w celu otrzymania pełnej długości mysiego liganda zalpha11

A. Sekwencja EST mysiego liganda zalpha11

Przeszukując bazę danych z ludzką sekwencją liganda zalpha11 cDNA (SEQ ID Nr: 1) jako zapytaniem, zidentyfikowano mysią EST (EST1483966) jako potencjalna częściową sekwencję dla mysiego liganda zalpha11. EST1483966 stanowi fragment genomu myszy, w którym sekwencja peptydowa pochodząca od dwóch potencjalnych egzonów dzieliła wysoką identyczność sekwencji z segmentem peptydu ludzkiego liganda zalpha11 (aminokwas 13 (Ile) do aminokwasu 80 (Gln) z SEQ ID Nr: 2).

B. Analiza przesiewowa PCR mysiego zbioru marathon cDNA

Jedenaście mysich próbek Marathon cDNA (Clontech) przesiewano za pomocą PCR, jak opisano poniżej. Mysie próbki marathon cDNA wytwarzano z tkanek mózgu, trzustki, nerki, łożyska, ślinianki, skóry, jądra, macicy, zarodka i śledziony. Przygotowano je we własnym labaratorium przy użyciu Marathon™ cDNA Amplification Kit (Clontech) zgodnie z instrukcjami producenta. Na podstawie sekwencji EST stosowano dwa startery PCR, ZC22,056 (SEQ ID Nr: 44) i ZC22,057 (SEQ ID Nr: 45) do identyfikacji źródła mysiego liganda zalpha11 w PCR. Warunki reakcji PCR były następujące: 94°C przez 2 minuty; 35 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, w temperaturze 68°C przez 2 minuty; po czym w temperaturze 68°C przez 4 minuty; następnie nasycenie w temperaturze 10°C. Produkty PCR analizwano na 1% żelu agarozowym. Stwierdzono silny prążek o długości 150 bp reprezentujący powielony fragment cDNA. Wskazywał on, że marathon cDNA mysiej śledziony jest źródłem dla klonowania cDNA mysiego liganda zalpha11. Marathon cDNA mysiej śledziony zawierał pozytywny cDNA, który następnie identyfikowano przez analizę sekwencji jako częściowy cDNA dla mysiego liganda zalpha11.

C. Składową sekwencję pełnej długości dla mysiego cDNA utworzono przez 5'- i 3'-RACE

Sekwencje oskrzydlające 5' i 3' częściowej sekwencji cDNA mysiego liganda zalpha11 otrzymywano przez powielanie 5' i 3' RACE. Przeprowadzano dwie serie zagnieżdżonego powielania PCR z dodatkowymi specyficznymi wobec genu oligostarterami ZC22,205 (SEQ ID Nr: 46) i ZC22,206 (SEQ ID Nr: 47), ZC22,056 (SEQ ID Nr: 44) i ZC22,057 (SEQ ID Nr: 45) i dwoma adapterowymi oligostarterami ZC9,739 (SEQ ID Nr: 48) i ZC9,719 (SEQ ID Nr: 49). Reakcje PCR prowadzono następująco: 94°C przez 2 minuty; 35 cykli w temperaturze 94°C, przez 30 sekund w temperaturze 68°C przez 2 minuty; po czym w temperaturze 68 °C przez 4 minuty; następnie nasycenie w temperaturze 10°C. Produkty PCR analizowano na 1% żelu agarozowym i identyfikowano produkt 5' RACE o długości około 300 bp i produkt 3' RACE o długości około 800 bp. Fragmenty te izolowano przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelowej Qiaquick™ (Qiagen).

Oczyszczone produkty PCR sekwencjonowano przy użyciu następujących starterów: ZC9,719 (SEQ ID Nr: 49), ZC22,205 (SEQ ID Nr: 46) i ZC22,206 (SEQ ID Nr: 47). Wstępną składową sekwencję pełnej długości mysiego liganda zalpha11 identyfikowano przez łączenie fragmentów 5' i 3' RACE. Pełnej długości mysi klon izolowano, jak opisano w przykładzie 15 poniżej.

P r z y k ł a d 15

Izolacja mysiego klonu cDNA zalpha11 z aktywowanej biblioteki mysiej śledziony

A. Pierwotne źródło mysie stosowane do izolacji mysiego liganda zalpha11

Mysie śledziony od myszy Balb/C zbierano i rozcierano między matowymi szkiełkami, aby utworzyć zawiesinę komórkową. Wydajność pierwotnych komórek mysich wynosiła 6,4 x 10⁸ komórek przed selekcją opisaną poniżej.

Komórki śledziony zawieszano w 9,6 ml buforu MACS (PBS, 0,5% EDTA, 2mM EDTA). 1,6 ml zawiesiny komórkowej pobierano i dodawano 0,4 ml CD90 (Thy 1,2) mikrokulek (Miltenyi Biotec). Mieszaninę inkubowano przez 15 minut w temperaturze 4°C. Komórki znakowane z użyciem kulek CD90 przemywano 30 ml buforu MACS, a następnie ponownie zawieszano w 2 ml buforu MACS.

Sporządzano kolumnę VS+ (Miltenyi) zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie kolumnę

VS+ umieszczano w polu magnetycznym YarioMACS™ (Miltenyi). Kolumnę równoważono 5 ml buforu

MACS. Następnie na kolumnę nakładano izolowane pierwotne komórki mysie. Komórki CD3-ujemne pozostawiono do przejścia przez kolumnę. Kolumnę przepłukiwano 9 ml (3 x 3 ml) buforu MACS. Ko56

PL 207 350 B1 lumnę następnie usuwano z pola magnetycznego i umieszczano w 15 ml probówce falcon, komórki CD90+ wymywano przez dodanie do kolumny 5 ml buforu MACS, a związane komórki wypłukiwano stosując tłoczek dostarczony prze producenta. Inkubację komórek z magnetycznymi kulkami CD90, przymywanie, etapy stosowania kolumny VS+ (inkubacja do elucji), jak powyżej, powtarzano jeszcze pięć razy. Otrzymane frakcje CD90+ z 2 rozdziałów kolumnowych zlewano. Wydajność selekcjonowanych pod względem CD90+ ludzkich komórek T wynosiła 1 x 10⁸ wszystkich komórek.

Próbkę połączonych selekcjonowanych pod względem CD90+ ludzkich komórek T usuwano do barwienia i sortowania na urządzeniu do sortowania komórek z przeciwciałem fluorescencyjnym (FACS), aby oszacować ich czystość. Do barwienia i sortowania komórek selekcjonowanych pod względem CD90+ stosowano chomicze przeciwciało antymysie CD3ε (PharMinge). Mysie komórki selekcjonowane pod względem CD90+ stanowiły 93% komórek CD3+, co wskazuje, że te komórki stanowiły 93% komórek T. Selekcjonowane pod względem CD90+ komórki mysie aktywowano przez inkubację 3 x 10⁶ komórek/ml w RPMI + 5% FBS + PMA 10 ng/ml i jonomycyny 0,5 μg/ml (Calbiochem) przez noc w temperaturze 37°C. Supernatant od tych aktywowanych selekcjonowanych pod względem CD90+ mysich komórek testowano pod względem aktywności liganda zalpha11, jak opisano poniżej. Ponadto aktywowane selekcjonowane pod względem CD90+ komórki mysie stosowano do wytworzenia bilioteki cDNA, jak opisano w przykładzie 16 poniżej.

P r z y k ł a d 16

Klonowanie mysiego liganda zalpha11 z mysiej biblioteki selekcjonowanych komórek CD90+

Skrining biblioteki cDNA pierwotnych mysich aktywowanych komórek selekcjonowanych pod względem CD90+ ujawnił izolowany cDNA, który jest nowym elementem rodziny cytokin o wiązce czterecnhelis. Ten cDNA kodował mysi ortolog ludzkiego liganda zalpha11. cDNA identyfikowano przez skrining hybrydyzacji.

A. Wektor do konstruowania biblioteki selekcjonowanych CD90+

Wektor pZP7N stosowano do konstrukcji biblioteki selekcjonowanej pod względem CD3+ (patrz przykład 6A).

B. Wytwarzanie biblioteki cDNA pierwotnych aktywowanych selekcjonowanych komórek CD90+

Około 1,5 x 10⁸ pierwotnych mysich selekcjonowanych komórek CD90+ stymulowanych w jonomycynie/PMA (przykład 15) izolowano przez wirowanie. Całkowity RNA izolowano z osadu komórek i przekształcono w dwuniciowy cDNA, o jak opisano w przkładzie 6B. Ten DNA transfekowane potem do komórek BHK, jak opisano w przykładzie 6B i proliferację szacowano przy użyciu testu fluorescencyjnego „Alamar blue” (przykład 2B). Do skriningu biblioteki przez klonowanie pułapki wydzielania potrzebna była złożona, powielona postać biblioteki do transfekcji komórek COS-7. 4,8 milionów klonów wysiano na 110 15 cm płytkach LB-agar uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny, 10 μg/ml metycyliny. Po hodowaniu płytek przez noc w temperaturze 37°C bakterie zbierano przez zdrapanie i odwirowano. Plazmidowy DNA ekstrahowano z odwirowanych bakterii przy użyciu Nucleobond-giga™ (Clonetech) zgodnie z instrukcjami producenta. Ten plazmid używano następnie do transfekcji komórek COS-7 na płytkach i przesiewano przy użyciu techniki pułapki wydzielania opisanej poniżej (przykład 17).

C. Skrining biblioteki aktywowanego mysiego cDNA ₅

Około 5 x 10⁵ klonów wysiewano na płytkach 10 LB/Amp Maxi. Kolonie podnoszono, denaturowano, zobojętniano i sieciowano przy użyciu standardowej procedury (Sambrook, J. i inni, jak wyżej.).

Pięćdziesiąt nanogramów fragmentu 5' RACE PCR o długości 300 bp' (przykład 14) znakowano ³²p przy użyciu zestawu do znakowania z losowym starterem Prime-Itr RmT (Stratagen). 10 filtrów hybrydyzowano z użyciem tej znakowanej sondy w temperaturze 65°C przez noc przy użyciu roztworu do hybrydacji ExpressHyb™ (Clontech). Filtry następnie przemywano kolejno w temperaturze 60°C przez 1 godzinę trzy razy stosując 0,2 x SSC (30 mM NaCl, 3 mM cytrynian sodu, pH 7,0), 0,1% SDS; a następnie w temperaturze 65°C przez 1 godzinę. Filtry naświetlano w temperaturze -80°C przez noc i wywoływano błonę rentgenowską. Czopy agarowe zawierające kolonie pozytywne wyciągano i klony wysiewano na 10 cm płytkach LB/Amp. Kolonie następnie podnoszono na filtrze i hybrydyzowano ponownie zgodnie z taką samą procedurą, jak opisana powyżej.

Jeden klon DNA, nazwany MllL/pZP7, izolowano i sekwencjonowano przy użyciu następujących starterów: ZC14,063 (SEQ ID Nr: 50), ZC5,020 (SEQ ID Nr: 51), ZC22,421 (SEQ ID Nr: 52), ZC22,604 (SEQ ID Nr: 53) i ZC22,641 (SEQ ID Nr: 54). Sekwencja polinukleotydowa tego klonu jest pełnej długości mysim ligandem zalpha11 (SEQ ID Nr: 55) i jest zgodna ze złożoną sekwencją pochodzącą od

PL 207 350 B1 produktów 5' i 3' RACE. Odpowiadającą sekwencję aminokwasową dia mysiego iiganda zalpha11 pokazano w SEQ ID Nr: 56.

P r z y k ł a d 17

Mysi ligand zalpha11 wiąże się z iudzkim rozpuszczainym receptorem zalpha11 w teście pułapki wydzielania

DNA mysiego kionu MiiL/pZP7 transfekowane do komórek COS, zaś wiązanie iudzkiego rozpuszczalnego receptora zalpha11, zalpha11-Fc4 (przykład 10C) z transfekowanymi komórkami COS testowano za pomocą testu pułapki wydzieiania (przykład 12). Test potwierdzał, że mysi iigand zalpha11 wiąże się z iudzkim rozpuszczainym receptorem zalpha11. Transfekcję komórek COS prowadzono jak dia przykładu 12 przy użyciu 0,7 pg DNA MiiL/pZP7 (przykład 16) w 3 pl.

Pułapkę wydzieiania prowadzono jak dia przykładu 12 przy użyciu 1 pg/mi białka fuzyjnego rozpuszczalnego receptora Fc4 zalpha11 (przykład 10C) w TNB i rozcieńczonego 1:200 koziego antyludzkiego Ig-HRP (specyficznego dia Fc) w TNB dia wykrywainego przeciwciała. Pozytywne wiązanie rozpuszczalnego ludzkiego receptora zalpha11 z wypreparowanymi utrwaionymi komórkami, wykrywano z użyciem tyramidu fiuoresceiny, jak w przykładzie 12. Komórki zakonserwowano i uwidaczniano zgodnie z przykładem 12. Pozytywny wynik wskazywał, że mysi iigand zalpha11 wiąże się z iudzkim rozpuszczalnym receptorem zalpha11.

P r z y k ł a d 18

Ekspresja mysiego liganda zalpha11 w komórkach ssaka

A. Konstrukcja wektora ekspresyjnego MllL/pZP9

Wytworzono wektor ekspresyjny w celu ekspresji mysiego liganda zalpha11 w komórkach ssaka. Fragment DNA liganda zalpha11 o długości 500 bp wytworzony za pomocą PCR utworzono przy użyciu ZC22,283 (SEQ ID Nr: 57) i ZC22,284 (SEQ ID Nr: 58) jako starterów PCR w ceiu powieienia regionu kodującego mysi iigand zalpha11 i dodawano miejsca restrykcyjne XhoI i Xbal. Mysi klon liganda zalpha11 MiiL/pZP7 (przykład 16) stosowano jako matrycę. Warunki reakcji PCR były następujące: 94°C przez 2 minuty; 25 cykii w temperaturze 94°C przez 30 sekund, w temperaturze 68°C przez 2 minuty; po czym w temperaturze 68°C przez 4 minuty; następnie nasycenie w temperaturze 10°C. Prążek o przewidywanej wieikości, około 500 bp, uwidaczniano przez eiektroforezę na 1% żeiu agarozowym, wycinano i DNA oczyszczano przy użyciu systemu do oczyszczania QiaexII™ (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczone DNA trawiono XhoI i Xbal (Boehringer Mannheim) w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Następnie DNA izoiowano w żeiu i oczyszczano zgodnie z powyższą procedurą.

Odcięty DNA subkionowano do piazmidu pZP9, który cięto XhoI i Xbai (Boehringer Mannheim). Piazmid pZP9 jest ssaczym wektorem ekspresyjnym, zawierającym kasetę ekspresyjną zawierającą mysi promotor metalotioneiny-1, wielokrotne miejsca restrykcyjne do wprowadzania sekwencji kodujących, kodon stop oraz terminator iudzkiego hormonu wzrostu. Piazmid posiada także początek repiikacji E. coli, jednostkę ekspresji markera seiekcyjnego ssaka, mającą promotor SV40, wzmacniacz i początek repiikacji, gen DHFR oraz terminator SV40.

Około 30 ng trawionego restrykcyjnie insertu liganda zalpha11 i około 10 ng strawionego wektora poddawano ligacji przez 2 godziny. 2 pg reakcji iigacji transformowano do kompetentnych komórek INVaF' (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta, wysiewano na płytkach LB zawierających 50 mg/mi ampicyiiny i inkubowano w temperaturze 37°C przez noc. Koionie badano przesiewano za pomocą anaiizy restrykcyjnej przy użyciu XhoI i Xbai (boehringer Mannheim) DNA wytworzonego z płynnych hodowii poszczegóinych koionii. Sekwencję insertu kionów dodatnich zweryfikowano przez anaiizę sekwencji jako sekwencję iiganda zalpha11. Wytwarzano piazmid na dużą skaię stosując zestaw QIAGEN(D Maxi prep (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Wektor ekspresyjny, który zawierał mysi iigand zalpha11, nazwano MllL/pZP9.

B. Ekspresja mysiego liganda zalpha11 u ssaka

Komórki BHK 570 (ATCC nr: CRL-10314) wysiewano na 10 cm płytkach do hodowii tkankowej i pozostawiono do wzrostu do około 50 do 20% ziania przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO2 w pożywkach DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% płodowej surowicy bydięcej (Hycione, Logan, UT), 1 mM L-glutaminy (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM pirogronianu sodu (Gibco BRL)). Następnie komórki transfekowane piazmidem zawierającym zalpha11-Fc4 (zobacz przykład 18A), stosując zestaw do stabiinej transfekcji CaPO (Stratagene) zgodnie z instrukcjami producenta.

PL 207 350 B1

Jeden dzień po transfekcji komórki dzielono w stosunku 1:10 i 1:20 do pożywek selekcyjnych (DMEM/FBS pożywek z dodatkiem 1 mM metotreksatu (Sigma Chemical Ce., St. Louis, Mo.)) na 150 mm płytkach. Pożywki na komórkach zastępowano świeżymi pożywkami selekcyjnymi w dniu 5 po transfekcji. Około 10 dni po transfekcji kolonie oporne wobec metotreksatu poddawano działaniu trypsyny i komórki zlewano oraz wysiewano w kolbach do hodowli na dużą skalę. Po wyhodowaniu komórek do około 90% zlania, przepłukiwano je trzykrotnie PBS i hodowano w kondycjonowanej pożywce ESTEP2 pozbawionej surowicy (DMEM (Gibco BRL), 0,11 g/l pirogromianu sodu, 3,7 g/l NaHCO3, 2,5 mg/l insuliny, 5 mg/l transferyny, pH 7,0). Kondycjonowane pożywki zbierano trzy dni później i stosowano do testu proliferacji BaF3 przy użyciu Alamar Blue, opisanego w przykładzie 19 poniżej.

P r z y k ł a d 19

Mysi ligand zalpha11 aktywuje ludzki receptor zalpha11 w teście BaF3 przy użyciu Alamar Blue

Proliferację komórek BaF3/zalpha11 (przykład 4 i 5B) szacowano przy użyciu kondycjonowanych pożywek pozbawionych surowicy z komórek BHK wykazujących ekspresję mysiego liganda zalpha11 (przykład 18),

Komórki BaF3/zalpha11 odwirowywano, przemywano i wysiewano w pożywkach pozbawionych mIL-3, jak opisano w przykładzie 5B.

Proliferację komórek BaF3/zalpha11 szacowano przy użyciu kondycjonowanych pożywek pozbawionych surowicy z komórek BHK wykazujących ekspresję mysiego liganda zalpha11 (przykład 18). Kondycjonowane pożywki rozcieńczano pożywką pozbawioną mIL-3 do stężeń: 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% i 0,375%. Test proliferacji prowadzono jak dla przykładu 5B.

Wyniki potwierdzały odpowiedź proliferacyjną komórek BaF3/zalpha11 wobec mysiego liganda zalpha11. Zmierzona odpowiedź była około 5-razy ponad tło przy 50% stężeniu.

P r z y k ł a d 20

Ligand zalpha11 aktywuje ludzki receptor zalpha11 w teście lucyferazy

A. Konstrukcja linii komórkowej BaF3/KZ134/zalpha11

Konstruowano plazmid KZ134 z użyciem komplementarnych oligonukleotydów ZC12,749 (SEQ ID Nr: 59) i ZC12,748 (SEQ ID Nr: 60), które zawierały elementy wiążące czynnik transkrypcji STAT z 4 genów. Modyfikowany indukowalny element Sis c-fos (m67SIE, czyli hSIE) (Sadowski, H. i inni. Science 261: 1739-1744. 1993), p21 SIEI z genu p21 WAFl (Chin, Y. i inni. Science 272: 719-722, 1996), element odpowiedzi gruczołu sutkowego genu P-kazeiny (Schmitt-Ney, M. i inni. Mol. Cell. Biol. 11: 3745-3755, 1991) i indukowalny element STAT genu Fcg RI, (Scidel, H, i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3041-3045, 1995). Te oligonukleotydy zawierają zgodne końce Asp718-XhoI i poddawano je ligacji, przy użyciu standardowych metod, do biorczego wektora reporterowego lucyferazy świetlika z promotorem c-fos (Poulsen, L. K. i inni, J. Biol. Chem. 273: 6229-6232, 1998) trawionego takimi samymi enzymami i zawierającego neomycynowy marker selekcyjnym. Plazmid KZ134 stosowano do stabilnej transfekcji komórek BaF3, przy użyciu standardowych metod transfekcji i selekcji, do otrzymania linii komórkowych BaF3/KZ134.

Stabilną wskaźnikową linię komórkową BaF3/KZ134, wykazującą ekspresję pełnej długości receptora zalpha11, konstruowano jak w przykładzie 2A, przy użyciu około 30 pg wektora ekspresyjnego zalpha11, opisanego w przykładzie 3. Klony rozcieńczano, wysiewano i selekcjonowano przy użyciu standardowych metod. Klony przesiewano w teście lucyferazy (patrz przykład 20B poniżej) przy użyciu kondycjonowanych pożywek ludzkiego liganda zalpha11 jako induktora. Selekcjonowano klony z najwyższą odpowiedzią lucyferazy (przez lucyferazę STAT) i najniższym tłem. Wyselekcjonowano stabilną linie transfektantów. Linię komórkową nazwano BaF3/KZ134/zalpha11.

B. Ludzki i mysi ligand zalpha11 aktywuje ludzki receptor zalpha11 w teście lucyferazy BaF3/KZ134/zalpha11

Komórki BaF3/KZl34/Zalpha11 odwirowywano i przemywano w pożywce pozbawionej mIL-3. Komórki wirowano i przemywano 3 razy, aby zapewnić usunięcie mIL-3. Komórki następnie zliczano w liczniku krwinek. Komórki wysiewano w formacie 96-studzienkowym w ilości 30000 komórek na studzienkę w objętości wynoszącej 100 pl na studzienkę, stosując pożywki pozbawione mIL-3. Taką samą procedurę stosowano dla nietransfekowanych komórek BaF3/KZ134 w celu użycia jako kontroli w kolejnym teście.

Aktywację STAT komórek BaF3/KZ1 34/zalpha1 1 szacowano przy użyciu kondycjonowanej pożywki od (1) komórek BHK570 transfekowanych ludzkim ligandem zalpha11 (przykład 7) lub (2) komórek BHK570 transfekowanych mysim ligandem zalpha11 (przykład 18) lub (4) pożywkami pozbawioPL 207 350 B1 nymi mIL-3, aby zmierzyć odpowiedź kontroii zawierających tyiko pożywkę. Kondycjonowane pożywki rozcieńczano pożywką RPMI pozbawioną mIL-3 przy stężeniu 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% i 0,375%. 100 pi rozcieńczonych kondycjonowanych pożywek dodawano do komórek BaF3/KZ134/zalpha11. Test przy użyciu kondycjonowanej pożywki wykonywano równoiegie na nietransfekowanych komórkach BaF3/KZ134 jako kontroię. Całkowita objętość testu wynosiła 200 pl. Płytki testowe inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 24 godziny, w czasie których komórki odwirowywano przy 2000 obr/min przez 10 minut i pożywki aspirowano i dodawano 25 pi buforu do lizy (Promega). Po 10 minutach w temperaturze pokojowej, dokonywano pomiaru płytek pod wzgiędem aktywacji konstrukcji reporterowej STAT, przez odczyty na luminometrze (Labsystems Luminoskan, model RS) z wykorzystaniem 40 pi substratu do testu iucyferazy (Promega) po pięciu sekundach integracji.

Wyniki potwierdzały odpowiedź reportera STAT komórek BaF3/KZ1 34/Zalpha1 1 wobec ludzkiego liganda zalpha11. Zamierzona odpowiedź, jak zmierzono, była około 50-krotnie ponad kontroię zawierającą tyiko pożywkę przy stężeniu 50%. Aktywacja STAT w odpowiedzi na ludzki ligand zalpha11 nie występowała w nietransfekowanych komórkach kontroinych BaF3/KZ134, co wskazuje, że odpowiedź występuje za pośrednictwem receptora zalpha11.

Wyniki także potwierdzały odpowiedź reporterową STAT komórek BaF3/KZ134/zalpha11 wobec mysiego liganda zalpha11. Zmierzona, była około 40 krotnie ponad kontroię zawierającą tyiko pożywkę przy stężeniu 50%. Ponadto aktywacja STAT w odpowiedzi na mysi iigand zalpha11 była znacząca (około 5-krotna) w nietransfekowanych kontroinych komórkach BaF/KZ134, co wskazuje, że mysie komórki BaF3 mogą posiadać endogeniczny mysi receptor.

P r z y k ł a d 21

Mysi ligand zalpha11 jest aktywny w teście mysiego szpiku kostnego

A. Izoiacja nie przyiegających komórek szpiku o niskiej gęstości

Świeży preparat z kości udowej myszy (szpik) otrzymywano od 6-10-tygodniowych samców myszy Baib/C iub C57BL/6. Szpik następnie przemywano RPMi + 10% FBS (JRH, Lenexa KS; Hyklon, Logan UT) i zawieszano w RPMl + 10% FDS w postaci zawiesiny komórkowej całego szpiku. Następnie, zawiesinę komórek całego szpiku poddawano działaniu gradientu gęstości (Nycoprep, 1.077, Animal; Gibco BRL), aby nastąpiło wzbogacenie w komórki o niskiej gęstości, w większości jednojądrzaste, następująco: zawiesinę komórkową całego szpiku (około 8 mi) ostrożnie pipetowano na wierzch około 5 mi roztworu gradientu Nycoprep w 15 mi próbce stożkowej, a następnie wirowano przy 600 x g przez 20 minut. Warstwę międzyfazową, zawierającą komórki jednojądrzaste o niskiej gęstości, następnie usuwano, przemywano nadmiarem RPMl + 10% FBS i odwirowywano przy 400 x g przez 5-10 minut. Osad ponownie zawieszano w RPMI + 10% FBS wysiewano w kolbie T-75 w iiości około 106 komórek/mi i inkubowano w temperaturze 37°C 5% CO2 przez około 2 godziny. Otrzymane komórki w zawiesinie były nie przyiegającymi komórkami szpiku o niskiej gęstości (NA LD).

B. Test 96 studzienek

Komórki NA LD mysiego szpiku wysiewano w iiości 25000 do 45000 komórek/studzienkę w płytkach o 96 studzienkach do hodowii tkankowej w RPMI +10% FBS + 1 ng/mL mysiego czynnika komórek macierzystych (mSCF) (R & D Systems, Minneapolis, MN) wraz z 5% kodycjonowanej pożywki od jednego z następujących: (1) komórek BHK 570 wykazujących ekspresję mysiego iiganda zalpha11 (przykład 18), (2) komórek BHK 570 wykazuj ących ekspresję iudzkiego iiganda zalpha11 (przykład 7) iub (3) kontroinych komórek BHK 570 zawierających wektor i niewykazujących ekspresji żadnego z iigandów. Te komórki następnie traktowano różnymi cytokinami, aby przetestować rozprzestrzenianie iub różnicowanie komórek krwiotwórczych ze szpiku. W tym ceiu wysiane komórki mysiego szpiku NA LD poddawano działaniu iudzkiej interieukinie-15 (hIL-15) (R & D Systems) lub jednej ze zbioru innych cytokin (R&D Systems). Testowano seryjne rozcieńczenia hIL-15 lub innych cytokin, z 2-krotnym seryjnym rozcieńczeniem od stężenia około 50 ng/mi do około 6025 ng/mi. Po 8 do 12 dniach 96--studzienkowe testy oceniano pod wzgiędem proiiferacji komórek za pomocą testu Aiamar biue, jak opisano w przykładzie 5B.

C. Wyniki testu 96-studzienkowego mysiego szpiku NA LD.

Kondycjonowane pożywki z komórek BHK wykazujących ekspresję zarówno mysiego, jak i ludzkiego liganda zalpha11 działały synergistycznie z hIL-15 i pobudzały ekspansję popuiacji komórek krwiotwórczych w mysim szpiku NA LD. Ta ekspansja komórek krwiotwórczych nie była widoczna w przypadku kontroinych kondycjonowanych pożywek BHK z IL-15. Popuiację komórek krwiotwór60

PL 207 350 B1 czych rozszerzona przez mysi ligand zalpha11 z hIL-15 i krwiotwórcze komórki rozprzestrzenione przez ludzki ligand zalpha11 z hTL-15 namnażano dodatkowo w hodowli komórkowej. Te komórki krwiotwórcze barwiono przeciwciałem przeciwko wszystkim komórkom NK znakowanym fikoerytryną (Pharmingen) i poddawano analizie metodą cytometrii przepływowej, która pokazała, że rozprzestrzenione komórki barwiły się pozytywnie pod względem markera komórki naturalnego zabójcy (NK).

Taki sam 96-studzienkowy test wykonywano przy użyciu świeżych ludzkich komórek szpiku zakupionych od Poietic Technologies, Gaithersburg, MD. Ponownie, w połączeniu z IL-15, mysi i ludzki ligand zalpha11 rozprzestrzeniał populację komórek krwiotwórczych, które barwiły się dodatnio dla markera komórki NK przy użyciu przeciwciała opisanego powyżej.

P r z y k ł a d 22

Konstrukcje do wytwarzania myszy transgenicznych z ludzkim ligandem zalpha11

A. Konstrukcja do ekspresji ludzkiego liganda zalpha11 z promotora specyficznego dla wątroby MT-1

Zaplanowano oligonukleotydy, aby utworzyć fragment PGR zawierający konsensusową sekwencje Kozaka i region kodujący ludzki ligand zalpha11. Te oligonukleotydy zaplanowano z miejscem Fsel na końcu 5' i miejscem AscI na końcu 3', aby ułatwić klonowanie do (a) pMT12-8, czyli standardowego transgenicznego wektora lub (b) pKF051, specyficznego dla limfoidu wektora transgenicznego (przykład 22B).

Reakcje PCR przeprowadzano z 200 ng matrycy ludzkiego liganda zalpha11 (przykład 7) oraz oligonukleotydami ZC22,143 (SEQ ID Nr: 61) i ZC22,144 (SEQ ID Nr: 62). Warunki reakcji PCR były następujące: 95°C przez 5 minut, w których dodawano polimerazę cDNA Advantage™ (Clontech); 15 cykli o temperaturze 95°C przez 60 sekund, 60°C przez 60 sekund i 72°C przez 90 sekund; oraz 72°C przez 7 minut. Produkty PCR rozdzielano przez elektroforezę na żelu agarozowym i oczyszczano przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelowej QiaQuick™ (Qiagen).

Izolowany fragment DNA o długości 488 bp trawiono Fsel i AscI (Boerhinger-Mannheim), wytrącano etanolem i poddawano ligacji do pMT12-8, wcześniej trawionego Fsel i AscI. Plazmid pMT12-8, przeznaczony do ekspresji badanego genu w wątrobie i innych tkankach myszy transgenicznej, zawiera kasetę ekspresyjną oskrzydloną przez 10 kb MT-1 5' DNA i 7 kb MT-1 3' DNA. Kaseta ekspresyjna zawiera promotor MT-1, intron insuliny II szczura, polilinker do insercji żądanego klonu i sekwencje poli A ludzkiego hormonu wzrostu (hGH).

Około jeden mikrolitr każdej reakcji ligacji poddawano elektroporacji do kompetentnych komórek DHlOB ElectroMax™ (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) zgodnie ze wskazówkami producenta, wysiewano na płytkach LB zawierających 100 pg/ml ampicyliny i inkubowano przez noc. Kolonie zbierano i hodowano w pożywkach LB zawierających 100 pg/ml ampicyliny. Z zebranych klonów minipreparowano DNA i przesiewano pod względem insertu ludzkiego liganda zalpha11 przez trawienie restrykcyjne samym EcoRI lub połączonymi Fsel i AscI i następnie elektroforezę w żelu agarozowym. Przeprowadzano maksipreparowanie prawidłowego pMT-ludzkiego liganda zalpha11. Wytworzono fragment Sali zawierający sekwencje oskrzydlające 5' 13', promotor MT-1, intron szczurzej insuliny II, cDNA ludzkiego liganda zalpha11 i sekwencję poli A hGH w celu użycia do mikroiniekcji do zapłodnionych oocytów mysich. Mikroiniekcję i wytwarzanie transgenicznych myszy wykonywano jak opisano w Hogan, B. i inni, Manipulating the Mouse Embryo, wydanie 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994.

B. Konstrukcja do ekspresji ludzkiego liganda zalpha11 z promotora specyficznego dla limfoidu Ep LCK

Zaplanowano oligonukleotydy, aby utworzyć fragment PCR zawierający konsensusową sekwencje Kozaka i region kodujący ludzki ligand zalpha11. Te oligonukleotydy zaplanowano z miejscem Fsel na końcu 5' i i miejscem AscI na końcu 3', aby ułatwić klonowanie do pKFO51, specyficznego dla limfoidu wektora transgenicznego.

Reakcje PCR przeprowadzano z użyciem 200 ng matrycy ludzkiego liganda zalpha11 (przykład 7) oraz oligonukleotydami ZC22,143 (SEQ ID Nr: 61) i ZC22,144 (SEQ ID Nr: 62). Reakcję PCR prowadzono przy użyciu polimerazy cDNA Advantage™ (Clontech) w następujących warunkach: 95°C przez 5 minut; 15 cykli o temperaturze 95°C przez 60 sekund, 60°C przez 60 sekund i 72°C przez 90 sekund; oraz 72°C przez 7 minut. Produkty PCR oczyszczano, jak opisano powyżej. Izolowany fragment DNA o długości 488 bp trawiono Fsel i AscI (Boerhinger-Mannheim), wytrącano etanolem i poddawano ligacji do pKF051 wcześniej trawionego Fsel i AscI. Wektor transgeniczny pKF051 pochodzi od pl026X (Iritani, B. M., i inni, EMBO J. 16: 7019-31, 1997) i zawiera najbliższy promotor lek specyficzny

PL 207 350 B1 dla komórek T, wzmacniacz łańcucha ciężkiego μl immunoglobuliny specyficznej dla komórek B/T, polilinker do insercji żądanego klonu i zmutowany gen hGH, który koduje nieaktywne białko hormonu wzrostu (dostarczając introny 3' i sygnał poliadenylacji).

Około jednego mikrołitra każdej reakcji ligacji poddawano ełektroporacji, wysiewano, zbierano klony i przesiewano pod względem insertu ludzkiego liganda zalpha11 przez trawienie restrykcyjne, jak opisano powyżej. Prawidłowy klon pKF051-ligand zalpha11 weryfikowano przez sekwencjonowanie i przeprowadzono maksipreparowanie tego klonu. Wytworzono fragment Notl, zawierający najbliższy promotor lek i wzmacniacz immunoglobuliny μ ^LCK), cDNA liganda zalpha11 i zmutowany gen hGH w celu użycia do mikroiniekcji do zapłodnionych oocytów myszy.

P r z y k ł a d 23

Rozmieszczenie w tkance mysiego liganda zalpha11

Mysie odciski northern biot z wielu tkanek (Mouse, Mouse Embryo, Clontech; MB 1010, MB 1012 Origen) sondowano aby określić rozmieszczenie w tkance ekspresji mysiego liganda zalpha11. Sondę pochodzącą z PCR o długości około 484 bp powielano przy użyciu plazmidu MllL/pZP7 (przykład 16) jako matrycy i oligonukleotydu ZC22283 (SEQ ID Nr: 57) i ZC22284 (SEQ ID Nr: 58) jako starterów. Powielanie PCR przeprowadzano następująco: 1 cykl w temperaturze 94°C przez 10 minut; 35 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund 50°C przez 30 sekund, i 72°C przez 30 sekund; po czym 1 cykl w temperaturze 72°C przez 10 minut. Produkty PCR uwidaczniano przez elektroforezę na żelu agarozowym i produkt PCR o długości około 484 bp oczyszczano przy użyciu Gel Extraction Kit (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Sondę znakowano radioaktywnie przy użyciu zestawu do znakowania REDIPRIME™ (Amersham) zgodnie z instrukcjami producenta. Sondę oczyszczano przy użyciu kolumny tłoczkowej NUCTRAP™ (Stratagen). Roztwór EXPRESSHYB™ (Clontech) stosowano do wstępnej hybrydyzacji i jako roztwór hybrydyzujący do metody northern blot. Hybrydyzacja miała miejsce przez noc w temperaturze 65°C przy użyciu 10⁶ cpm/ml znakowanej sondy. Odciski następnie przemywano trzy razy w 2 x SSC i 0,1% SDS w temperaturze pokojowej, po czym dwukrotnie przemywano w 0,1 x SSC i 0,1% SDS w temperaturze 55°C. Dwa transkrypty o długości około 1,2 i 3,5 kb były widoczne w jądrach. Jedynie górny transkrypt był widoczny w grasicy.

Master Dot Blot (Clontech) mysiego RNA, który zawierał RNA z różnych tkanek, które były normalizowane do 8 genów cytohomeostatycznych sondowano także i hybrydyzowano, jak opisano powyżej. Ekspresja była widoczna w jądrach.

P r z y k ł a d 24

Oczyszczanie nieznakowanego ludzkiego i mysiego liganda zalpha11 od BHK 570

Jeśli nie podano inaczej, wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze 4°C. Następującą procedurę stosowano do oczyszczania ludzkiego i mysiego liganda zalpha11 z kondycjonowanych pożywek od komórek BHK 570 transfekowanych konstrukcją wykazującą ekspresję ludzkiego liganda zalpha11 (przykład 25) albo mysiego liganda zalpha11 (MllL/pZP9) (przykład 18). Kondycjonowane pożywki zatężano standardowymi metodami. Zatężone kondycjonowane pożywki (CM) filtrowano jałowo przez filtry 0,45 i 0,22 mikrona. Następnie pożywki rozcieńczano do niskiej siły jonowej (< 2 mS) w 0,01 M HEPES (JRH Biosciences, Lenexa, K.S) przy pH 7,0. Rozcieńczone CM o niskiej sile jonowej nakładano następnie na kolumnę 10 x 66 mm (6 ml) Poros HS 50 (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA), przez noc przy przepływie 4 ml/minutę przy użyciu BioCAD SPRINT (Perceptive BioSystems). Kolumnę przemywano 10-20 objętościami kolumny (CV) z użyciem 0,01 M HEPES pH 7,0. Związane białka następnie wymywano etapowo z użyciem 1M NaCl (Mallinckrodt, Paris, KY) w 0,01 M HEPES pH 7,0 przy przepływie 5 ml/minutę; 2 ml frakcje zbierano przez całą chromatografię i monitorowano absorbancję przy 280 i 215 nM. Frakcje pikowe absorbancji analizowano przez biotest i przez barwienie srebra SDS-PAGE (Geno Technology, St. Louis, MO) i barwienie Coomassie (Sigma, St. Louis, MO). Frakcje pikowe zlewano, filtrowano jałowo i rozcieńczano do < 19 mS z użyciem roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS, Gibco BRL) przy pH 7,2.

Rozcieńczoną próbkę następnie nakładano z prędkością 2 ml/minutę przy użyciu BioCad SPRINT na kolumnę 0,8 ml Poros AL, która zawierała rozpuszczalny receptor zalpha11CFLAG (przykład 10B) lub fuzję rozpuszczalnego receptora zalpha11-Fc4 (przykład 10C) unieruchomione na żywicy (patrz poniżej). Następnie kolumnę przemywano co najmniej 20 CV PBS z prędkością 10 ml/minutę. Następnie kolumnę szybko wymywano przez iniekcję 600 μl 0,1 M glicyny (kwas aminooctowy; Glycocol, Spectrum, Gardena, CA) pH 2,5 przy prędkości przepływu 10 ml/minutę z PBS na BioCAD 700E. 1 ml frakcje zbierano przez 6 sekund każda i natychmiast pH zobojętniano 55 μl 2M TRIS

PL 207 350 B1 (tris(hydroksymethyl)aminometan, EM Science, Gibbstown, NJ) pH 8,8. Absorbancję przy 280 i 215 nM monitorowano przez całą chromatografię.

Frakcje pikowe analizowano przez biotest oraz przez barwienie srebrem SDS-PAGE (Geno Technology) i barwienie Coomassie (Sigma). Dwa prążki, o masie około 24 kD i 18 kD, widoczne były na obu żelach barwionych srebrem i Coomassie dla mysiego liganda zalpha11. Pojedynczy prążek, o masie około 18 kD, widoczny był na obu żelach barwionych srebrem i Coomassie dla ludzkiego liganda zalpha11.

Unieruchamianie polipeptydów ludzkiego rozpuszczalnego receptora zalpha11 na pożywce POROS AL

Wytwarzano kolumny Poros AL mające unieruchomiony rozpuszczalny receptor zalpha11CFLAG (przykład 10B) lub fuzję rozpuszczalnego receptora zalpha11-Fc4 (przykład 10C). Stosowano około 3 mg rozpuszczalnego receptora zalpha11CFLAG i około 10 mg fuzji rozpuszczalnego receptora zalpha11-Fc4. Wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze pokojowej na BioCAD 700E. Kolumnę 4,5 x 50 mm z pożywką POROS AL upakowywano 2M NaCl zgodnie z opisem producenta. Następnie kolumnę równoważono w 1,1 M Na2SO4/50 mM fosforanu sodu o pH 7,2. Receptor zatężano do 4 mg/ml przy użyciu obrotowego urządzenia do zatężania Millipore 30 MWKO, następnie rozcieńczano 1:1 w 1,1 M Na2SO4/50 mM fosforanu sodu o pH 7,2. Przepływ przez kolumnę wynosił 2 ml/minutę w 1,1 M Na₂SO₄/50 mM NaPhosphate pH 7,2 i wykonywano iniekcje 100 pl rozcieńczoonego liganda co 9 CV do osiągnięcia stałego stanu nasycenia lub przebicia kolumny. Następnie przepuszczano 62 CV gradient od 1,1 M Na2SO4/50 mM fosforanu sodu pH 7,2, do 550 mM Na2SO4/50 mM fosforanu sodu pH 7,2/5 mg/ml cyjanoborowodorku sodu. Następnie kolumnę utrzymywano przez około 2 godziny, aby zakończyć chemię unieruchamiania. Następnie kolumnę równoważono w 0,2 M TRIS pH 7,2/5 mg/ml cyjanoborowodorku sodu i pozostawiono na około 1 godzinę, aby nasąpiło zamknięcie. Na koniec kolumnę równoważono w PBS/0,02% azydku sodu i przechowywano w temperaturze 4°C do wykorzystania. Przed użyciem kolumnę wstępnie wymywano 0,1 M glicyną aby zapewnić usuniętcie niespecyficznych białek i aby kolumna nie wymywała unieruchomionego ludzkiego rozpuszczalnego receptora zalpha11.

P r z y k ł a d 25

Ekspresja ludzkiego liganda zalpha11 w komórkach ssaka

A. Konstrukcja wektora ekspresyjnego PZMP11/zalpha11Lig

Plazmid ekspresyjny zawierający całość lub część polinukleotydu kodującego ludzki ligand zalpha11 konstruowano przez rekombinację homologiczną. Fragment cDNA ludzkiego liganda zalpha11 (SEQ ID Nr: 63) izolowano przy użyciu PCR. Dwa startery stosowane przy wytwarzaniu fragmentu ludzkiego liganda zalpha11 w reakcji PCR: (1) starter ZC22,052 (SEQ ID Nr: 64), zawierający sekwencje oskrzydlającą wektor o długości 40 bp i 17 bp odpowiadających końcowi aminowemu ludzkiego liganda zalpha11 i (2) starter ZC22,053 (SEQ ID Nr: 65), zawierający 40 bp z końca 3' odpowiadających sekwencji oskrzydlającej wektor i 17 bp odpowiadających końcowi karboksylowemu ludzkiego liganda zalpha11. Warunki reakcji PCR były następujące: 1 cykl w temperaturze 94°C przez 2 minuty; 25 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund 60°C przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund; po czym 1 cykl w temperaturze 72°C przez 5 minut; nasycenie w temperaturze 4C°. Dziesięć pl z 100 pl reakcji PCR analizowano na żelu agarozowym 0,8% LMP (Seaplaque GTG) z 1 x buforem do analizy TBE; widoczny był oczekiwany fragment o długości około 560 bp. Pozostałe 90 pl reakcji PCR wytrącano przez dodanie 5 pl 1 M NaCl i 250 pl absolutnego etanolu do stosowania przy rekombinacji na wektorze biorczym pZMP11, jak opisano poniżej. Plazmid biorczy pZMP11 wcześniej pocięto Smal.

Plazmid pZMP11 otrzymano z plazmidu pCZR199 (opisanego w niniejszym dokumencie, np. przykład 8). Plazmid pCZR199 jest ssaczym wektorem ekspresyjnym zawierającym kasetę ekspresyjną mającą bezpośrednio wczesny promotor CMV, region konsensusowy z regionu zmiennego locusa łańcucha ciężkiego mysiej immunoglobuliny, wielokrotne miejsca restrykcyjne do wprowadzania sekwencji kodujących, kodon stop i terminator ludzkiego hormonu wzrostu. Plazmid także posiada początek replikacji E. coli, jednostkę ekspresyjną ssaczego markera selekcyjnego, mającą promotor SV40, wzmacniacz i początek replikacji, gen DHFR i terminator SV40. Wektor pZMP11 konstruowano z pCZR199; obejmuje on zastąpienie promotora metalotioneiny bezpośrednio wczesnym promotorem CMV i sekwencje Kozaka na końcu 5' otwartej ramki odczytu.

Sto mikrolitrów kompetentnych komórek drożdży (S. cerevisiae) łączono z 10 pl mieszaniny zawierającej w przybliżeniu 1 pg z ludzkich insertów liganda zalpha11 i 100 ng wektora pZMP11 trawionego Smal (BRL) i przenoszono do 0,2 cm kuwety do elektroporacji. Mieszaniny drożdży/DNA poddaPL 207 350 B1 wano działaniu impulsów elektrycznych: 0,75 kV (5 kV/cm), nieskończona oporność, 25 pF. Do każdej kuwetki dodano 600 pl 1,2 M sorbitolu i następnie drożdże wysiewano w dwóch równych ilościach 300 pl na dwóch płytkach URA-D i inkubowano w temperaturze 30°C.

Po około 48 godzinach transformanty drożdżowe Ura+ z pojedynczej płytki ponownie zawieszano w 1 ml H2O i wirowano krótko, aby zbić w grudkę komórki drożdży. Osad komórek ponownie zawieszano w 1 ml buforu do lizy (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). Pięćset mikrolitrów mieszaniny do lizy odmierzono do próbki Eppendorfa, zawierającej 300 pl kulek szklanych przemytych kwasem i 200 pl mieszaniny fenol-chloroform, wirowano przez 1 minutę dwa lub trzy razy, po czym wirowano 5 minut w wirówce Eppendorfa przy maksymalnej prędkości. Trzysta mikrolitrów fazy wodnej przenoszono do świeżej probówki, i DNA wytrącono 600 pl etanolu (EtOH), po czym wirowano przez 10 minut w temperaturze 4°C. Osad DNA ponownie zawieszano w 100 pl H2O.

Transformację elektrokompetentnych komórek E. coli (DHlOB, GibcoBRL) wykonywano z użyciem 0,5-2 ml drożdżowego DNA prep i 40 pl komórek DHlOB. Komórki poddano działaniu impulsów elektrycznych o 2,0 kV, 25 mF i 400 omów. Po elektroporacji 1 ml SOC (2% Bacto™ Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% ekstrakt drożdżowy (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukozę) wysiewano w ilości 250 pl na czterech płytkach LB AMP (bulion LB (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/L ampicyliny).

Poszczególne klony posiadające prawidłowe konstrukcje ekspresji dla ludzkiego liganda zalpha11 identyfikowano przez trawienie restrykcyjne w celu zweryfikowania obecności insertu i potwierdzenia, że różne sekwencje DNA zostały prawidłowo połączone jedna z drugą. Insert z dodatnich klonów poddawano analizie sekwencji. Na dużą, skalę plazmidowy DNA izolowano stosując zestaw Qiagen Maxi (Qiagen), zgodnie z instrukcjami producenta.

B. Ekspresja u ssaka ludzkiego liganda zalpha11

Komórki BHK 570 (ATCC nr: CRL-10314) wysiewano w 10 cm płytkach do hodowli tkankowej i pozostawiono do wzrostu do około 50 do 70% zlania przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO2, w pożywkach DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-glutaminy (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM pirogronianu sodu (Gibco BRL)). Następnie komórki transfekowane plazmidem PZMP11/zalpha11Lig (przykład 25A), stosując Lipofectamine™ (Gibco BRL), w preparacie pożywki pozbawionej surowicy (SF) (DMEM, 10 mg/ml transferyny, 5 mg/ml insuliny, 2 mg/ml fetuiny, 1% L-glutaminy i 1% pirogronianu sodu). Zalpha11-Fc4/pZMP6 (przykład 8B) rozcieńczano do probówek 15 ml do końcowej objętości całkowitej, wynoszącej 640 ml z pożywkami SF. 35 pl Lipofectamine™ (Gibco BRL) mieszano z 605 pl pożywki SF. Mieszaninę Lipofectamine™ dodawano do mieszaniny DNA i pozostawiono do inkubacji na około 30 minut w temperaturze pokojowej. Pięć mililitrów pożywek SF dodawano do mieszaniny DNA:Lipofectamine™. Komórki przemywano raz 5 ml pożywek SF, aspirowano i dodawano mieszaninę DNA:Lipofectamine™. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez pięć godzin, następnie do każdej płytki dodawano 6,4 ml pożywek DMEM/10% FBS, 1% PSN. Płytki inkubowano w temperaturze 37 °C przez noc i mieszaninę DNA:Lipofectamine™ zastępowano świeżymi 5% pożywkami FBS/DMEM następnego dnia. W dniu 5 po transfekcji komórki dzielono do kolb T-162 z pożywką selekcyjną (DMEM/FBS 5% FBS, 1% L-GLU, 1% NaPyr). Około 10 dni po transfekcji dwie 150 mm płytki hodowlane z koloniami opornymi wobec metotreksatu z każdej transfekcji poddawano działaniu trypsyny i komórki zlewano oraz wysiewano w kolbie T-162 i przenoszono do hodowli na dużą skalę. Kondycjonowane pożywki z hodowli na dużą skalę stosowano do oczyszczania polipeptydu liganda zalpha11, jak opisano w przykładzie 24.

P r z y k ł a d 26

Konstrukcja do wytwarzania myszy transgenicznej z mysim ligandem zalpha11

A. Konstrukcja do ekspresji mysiego liganda zalpha11 ze specyficznego dla limfoidu promotora

EpLCK

Zaplanowano oligonukleotydy, aby utworzyć fragment PCR zawierający konsensusową sekwencje Kozaka i region kodujący mysi ligand zalpha11. Te oligonukleotydy zaplanowano z miejscem Fsel na końcu 5' i miejscem AscI na końcu 3', aby ułatwić klonowanie do: (a) pKF051, specyficznego dla limfoidu wektora transgenicznego lub (b) pTG12-8, standardowego w miniejszym dokumencie wektora transgenicznego.

Reakcje PCR przeprowadzano z 200 ng matrycy mysiego liganda zalpha11 (SEQ ID Nr: 55; przykład 16) i oligonukleotydami ZC23,115 (SEQ ID Nr: 66) i ZC23,116 (SEQ ID Nr: 67). Reakcję PCR

PL 207 350 B1 prowadzono przy użyciu polimerazy cDNA Advantage™ (Clontech) w warunkach PCR opisanych w przykładzie 22B. Produkt PCR izolowano, jak opisano w przykładzie 22B. Izolowany fragment DNA o długości 440 bp trawiono i poddawano ligacji do pKF051 wcześniej trawionego FscI i AscI, jak opisano w przykładzie 22B.

Około jednego mikrolitra każdej reakcji ligacji poddawano elektroporacji, wysiewano, zbierano klony i przesiewano pod względem insertu ludzkiego liganda zalpha11 przez trawienie restrykcyjne, jak opisano w przykładzie 22. Prawidłowy klon pKF051 liganda zalpha11 weryfikowano przez sekwencjonowanie i prowadzono maksipreparowanie tego klonu. Wytworzono fragment Notl, zawierający najbliższy promotor lek, wzmacniacz immunoglobuliny μ, cDNA liganda zalpha11 i zmutowany gen hGH w celu użycia przy mikroinekcji do zapłodnionych oocytów myszy.

B. Konstrukcja do ekspresji mysiego liganda zalpha11 ze specyficznego dla wątroby promotora MT-1

Ten sam insert mysiego liganda zalpha11 z przykładu 26A subklonowano do wektora pTG12-8, jak opisano w przykładzie 22A. Dla tej konstrukcji, około 10 mg DNA maksipreparowanego pKF051-liganda zalpha11 trawiono łącznie Fsel i AscI, wytrącano etanolem i fragment mysiego liganda zalpha11 oczyszczano, jak opisano w przykładzie 22, Ten fragment następnie poddawano ligacji do pTG12-8, który wcześniej trawiono Fsel i AscI, jak opisano w przykładzie 22A. Elektroporację, skrining klonów i maksipreparowania prowadzono, jak opisano w przykładzie 22. Wytworzono fragment SalI zawierający sekwencje oskrzydlające 5' i 3', promotor MT-1, intron insuliny II szczura, cDNA mysiego liganda zalpha11 i sekwencje poli A hGH w celu użycia do mikroiniekcji do zapłodnionych oocytów myszy.

P r z y k ł a d 27

Mysie przeciwciała poliklonalne zalpha11-ligand

Przeciwciała poliklonalne wytwarzano przez immunizację 2 samic białych królików New Zealand oczyszczanym rekombinowanym białkiem muzalpha11L/MBP-6H (przykład 32). Królikom podawano początkową iniekcję dootrzewnową (ip) 200 mg oczyszczonego białka w kompletnym adirwancie Freunda, po czym przypominającą iniekcję ip 100 mg peptydu w niekompletnym adiuwancie Freunda, co trzy tygodnie. Siedem do dziesięciu dni po podaniu drugiej iniekcji przypominającej (ogółem 3 iniekcje), zwierzęta skrwawiano i zbierano surowicę. Następnie zwierzętom podawano dawki przypominające i pobierano krew co trzy tygodnie.

Surowice króliczą specyficzną wobec muzalpha11L/MBP-6H wstępnie adsorbowano z przeciwciał anty-MBP przy użyciu kolumny CNBr-SEPHAROSE-białko 4B (Pharmacia LKB), którą sporządzano przy użyciu 10 mg oczyszczonego rekombinowanego białka wiążącego maltozę (MBP) na gram CNBr-SEPHAROSE. Otrzymywano rekombinowany MBP i oczyszczano na kolumnie amylozowej we własnym laboratorum, przy użyciu metod dobrze znanych w technice. Przeciwciała poliklonalne specyficzne dla liganda muzalpha11 oczyszczano przez powinowactwo z surowicy króliczej przy użyciu kolumny CNBr-SEPHAROSE-białko 4B (Pharmacia LKB), które wytworzono przy użyciu 10 mg specyficznego wobec antygenu oczyszczonego rekombinowanego białka muzalpha11L/MBP-6H (przykład 32), po czym przez 20 x dializę w PBS przez noc. Przeciwciała specyficzne dla liganda muzalpha11 charakteryzowano w teście ELISA przy użyciu 1 μg/ml oczyszczonego rekombinowanego białka muzalpha11L/MBP-6H (przykład 32) lub huzalpha11L-MBP/6H (przykład 32) jako celów dla przeciwciał. Dolna granica wykrywania (LLD) oczyszczonego przez powinowactwo króliczego przeciwciała antymuzalphal1L/MBP-6H wynosi 100 pg/ml na jego specyficznie oczyszczonym rekombinowanym antygenie muzalpha11L/MBP-6H i 500 pg/ml na oczyszczonym rekombinowanym huzalpha11L-MBP/6H.

P r z y k ł a d 28

Konstrukcja ssaczego wektora ekspresyjnego i ekspresja na dużą skalę ludzkiego liganda zalpha11 w komórkach CHO DG44

Konstruowano ssaczy wektor ekspresyjny dla ludzkiego liganda zalpha11 (SEQ ID Nr: 1) zaplanowanego, aby dodać miejsce SalI na końcu 5' i miejsce Pmel na końcu 3' cDNA, przez powielanie przez PCR z plazmidu zawierającego ludzki ligand zalpha11 (przykład 7), z użyciem starterów oligonukleotydowych, ZC22,054 (SEQ ID Nr: 70) i ZC22,055 (SEQ ID Nr: 71). Warunki reakcji PCR były następujące: 94°C przez 4 minuty; 25 cykli w temperaturze 94°C przez 45 sekund, 50°C przez 45 sekund i 72°C przez 3 minuty; oraz 72°C przez 10 minut. Produkt PCR izolowano, jak opisano w niniejszym dokumencie, i pocięto Sali i Pmel, następnie poddawano ligacji do plazmidu pDC312 wcześniej pociętego w odpowiednich miejscach restrykcyjnych w polilinkerze, przy użyciu standardowych metod opisanych w niniejszym dokumencie. Plazmid pDC312 opisano w Morris, A. i inni, „Expression

PL 207 350 B1

Augmenting Seguence Element (EASE) isolated from Chinese Hamster Ovary Cells”, w Animal Cell Technology, Carrondo, MJT i inni (red.) (1997) Kluwer Academic Publisers, Holandia, strony 529-534.

Wektor, który poddawano iigacji, transfekowane de dostosowanych do zawiesiny komórek CHO DG44 (we własnym iaboratorum Neve Nerdisk, Dania) przez iipofekcję przy użyciu odczynnika LipofectaminePius™ (Gibco/BRL) zgodnie z instrukcjami producenta. Transfektanty seiekcjonowano na pożywce PFCHO (JRH, Lenexa, Kansas) pozbawionej tymidyny, i hipoksantyny, po czym seiekcjonowano na 200 nM metotreksacie (Sigma, St. Louis. MO). Komórki oporne na metotreksat kionowano przez rozcieńczanie i testowano pod wzgiędem wytwarzania iiganda zalpha11 za pomocą testu aktywności BaF3 (przykład 5B).

Kion produktywny zwiększano pod wzgiędem skali i hodowano w 7-20- litrowym bioreaktorze (Appiikon Bioreactors, Schiedam, Hoiandia) w pożywce PFCHO, w ceiu wytworzenia materiału do oczyszczania (przykład 29).

P r z y k ł a d 29

Oczyszczanie na dużą skaię nieznakowanego iudzkiego i mysiego iiganda zalpha11 z ssaczych iinii komórkowych ekspresji BHK i CHO

A. Ludzki ligand zalpha11 o ekspresji w CHO

Jeśii nie podano inaczej, wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze 4°C. Następującą procedurę stosowano do oczyszczania iudzkiego iiganda zalpha11, z co najmniej 30 iitrów kondycjonowanych pożywek CHO (patrz przykład 28). Zatężone iub niezatężone kondycjonowane pożywki (CM) fiitrowano z wyjaławianiem przez fiitry 0,45 i 0,22 mikrona. Kondycjonowane pożywki następnie buforowano 0,01 M MES (Fluka Biochemika, Szwajcaria)) i pH doprowadzono do 6,0, a następnie ładowano na 50 x 100 mm koiumnę (196 mi) Poros 50 HS (silny wymieniacz kationowy firmy PerSeptive BioSystems, Framingham, MA), przez noc przy przepływie 4-10 mi/minutę, przy użyciu BioCAD SPRINT (Perceptive BioSystems). Koiumnę przemywano 10-20 objętościami koiumny (CV) stosując 0,01 M MES/0,130 M NaCi (Maiiinckrodt, Paris, KY) o pH 6,0. Związane białka następnie wymywano gradientem 10 CV 0,130 M do 1 M NaCi w 0,01 M MES o pH 6,0 przy przepływie 30 mi/minutę; frakcje 25 mi zbierano przez całą chromatografię i monitorowano absorbancję przy 280 i 215 nM. Frakcje pikowe absorbancji anaiizowano za pomocą barwienia srebrem SDS-PAGE (Geno Technology, St. Louis, MO), barwienie Coomassie (Sigma, St. Louis, MO) i odciski immunologiczne western, przy użyciu przeciwciała przeciwko iudzkiemu iigandowi zalpha11 (przykład 33 i przykład 34).

Frakcje pikowe ziewano, następnie zatężano w urządzeniu mieszającym do zatężania komórek na błonie YM10 (Millipore/Amicon, Bedford, MA) do nominainej objętości (1-10 mi). Próbkę następnie podawano na odpowiednią koiumnę do chromotografii wykiuczania o wysokiej rozdzieiczości Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsaia, Szwecja) równoważoną w PBS (Gibco BRL) z natężeniem przepływu 1-2 ml/ml; 1-2 mi frakcje zbierano przez całą chromatografię i monitorowano absorbancję przy 280 i 215 nM. Frakcje pikowe anaiizowano przez za pomocą barwienia srebrem SDS-PAGE (Geno Technology, St. Louis, MO) i barwienie Coomassie (Sigma, St. Louis, MO).

Frakcje badane ziewano i zatężano z użyciem obrotowego urządzenia do zatężania Miiiipore o MWKO 5KD do minimainej objętości. Ostateczny produkt następnie anaiizowano przez barwienie Coomassie SDS PAGE (Sigma, St. Louis, MO), odciski immunologiczne western, sekwencjonowanie N-terminaine, anaiizę aminokwasów, i BCA (Pierce, Rockford, Iiiinois) aby okreśiić czystość i stężenie białka.

B. Ekspresja w BHK 570 mysiego liganda zalpha11

Jeśii nie podano inaczej, wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze 4°C. Następującą procedurę stosowano do oczyszczania iudzkiego iiganda zalpha11 z kondycjonowanych pożywek BHK (przykład 18). Zatężone iub niezatężone kondycjonowane pożywki (CM) fiitrowano z wyjaławianiem przez fiitry 0,45 i 0,22 mikrona. Pożywki następnie buforowano 0,01 M MES (Fluka Biochemika, Szwajcaria) i pH doprowadzano do 6,0. CM anaiizowano, podawano na koiumnę i wymywano na koiumnie AS, jak opisano w przykładzie 29A.

Frakcje badane ziewano, następnie zatężano w urządzeniu mieszającym do zatężania, jak w przykładzie 29A, do objętości wynoszącej 20-30 mi. pH dporowadzono do 7,0, następnie próbkę poddawano na 0,8 mi koiumnę Poros AL, która miała około 3 mg znakowanego rozpuszczainego receptora zaiphaiiCFLAG (przykład iOB) iub około 10 mg receptora fuzyjnego zalpha11-Fc4 (przykład 10C) unieruchomionego na żywicy (patrz metoda poniżej) przy przepływie 1 mi/minutę na BioCAD SPRINT. Następnie koiumnę przemywano co najmniej 20 CV 0,3 M NaCi/PBS (Gibco BRL)/0,01M MES przy przepływie 10 mi/minutę. Następnie koiumnę szybko wymywano 600 pi iniekcją 0,1M glicy66

PL 207 350 B1 ny (kwas aminooctowy; glikokol. Spectrum, Gardena, CA) pH 2,5 z natężeniem przepływu 10 ml/minutę z PBS na BioCAD SPRINT. Frakcje 1 ml zbierano przez 6 sekund każdą i natychmiast pH zobojętniano 55 pl 2M TRIS pH 8,8 (tris(hydroksymetylo)aminometan, EM Science, Gibbstown, NJ). Absorbancję monitorowano przy 280 i 215 nM przez całą chromatografię. Frakcje pikowe analizowano za pomocą barwienia srebrem SDS-PAGE (Geno Technology, St. Louis, MO), barwienie Coomasine (Sigma, St. Louis, MO) i metodą western biot, jak powyżej.

Frakcje pikowe zlewano, następnie zatężano w obrotowym urządzeniu do zatężania komórek, jak w przykładzie 29A do minimalnej objętości (1-10 ml). Próbkę następnie podawano, równoważono i analizowano jak w przykładzie 29A, na odpowiedniej kolumnie do chromotografii wykluczania o wysokiej rozdzielczości Sephacryl S-200 (Pharmacia). Frakcje pikowe analizowano za pomocą barwienia srebrem SDS-PAGE (Geno Technology, St. Louis, MO), i barwienie Coomassie (Sigma, St. Louis, MO). Frakcje badane zlewano i zatężano i analizowano jak w przykładzie 29A.

C. Unieruchamianie białka na pożywkach POROS AL

Wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze pokojowej na urządzeniu BioCAD 700E. Kolumnę 4,5 x 50 mm upakowywano pożywką POROS AL w 2M NaCl zgodnie z opisem producenta. Następnie kolumnę równoważono w 1,1 M Na2SO4 i 50 mM fosforanem sodu o pH 7,2. Receptor zatężano do 4 mg/ml przy użyciu obrotowego urządzenia do zatężania Millipore o MWKO 30 kD, następnie rozcieńczano 1:1 w 1,1 M Na2SO4 i 50 mM fosforanem sodu o pH 7,2. Przepływ przez kolumnę wynosił 2 ml/minutę w 1,1 M Na2SO4 i 50 mM fosforanem sodu o pH 7,2 i wykonywano 100 pl iniekcje rozcieńczonym ligandem co 9 CV do osiągnięcia stałego stanu nasycenia lub przebicia. Następnie podawano 62 CV gradientu od 1,1 M Na2SO4 i 50 mM fosforanem sodu o pH 7,2 do 550 mM Na2SO4 i 50 mM fosforanem sodu o pH 7,2 z 5 mg/ml cyjanoborowodorku sodu. Następnie kolumnę utrzymywano przez około 2 godziny, aby zakończyć chemię unieruchamiania. Następnie kolumnę równoważono w 0,2 M TRIS pH 7,2 z 5 mg/ml cyjanoborowodorku sodu i pozostawiono przez około 1 godzinę. Na koniec kolumnę równoważono w PBS z 0,02% azydkiem sodu i przechowywano w temperaturze 4°C do wykorzystania. Przed użyciem kolumnę wstępnie wymywano 0,1 M glicyną, aby zapewnić usunięcie niespecyficznych białek i nie dopuścić do ługowania unieruchomionego receptora.

P r z y k ł a d 30

Konstrukcja wektora ekspresyjnego, ekspresja i oczyszczanie nieznakowanego ludzkiego i mysiego liganda zalpha11 z bakulowirusa

A. Konstrukcja do ekspresji ludzkiego liganda zalpha11 w bakulowirusie

Wytwarzano wektor ekspresyjny, pzalpha11L, do ekspresji polipeptydów ludzkiego liganda zalpha11 w komórkach owadów. Utworzono fragment o długości 517 bp zawierający sekwencję dla ludzkiego liganda zalpha11 i kodowanych miejsc restrykcyjnych BamHI i XhoI odpowiednio na końcach 5' 13', przez powielanie PCR, z plazmidu zawierającego cDNA ludzkiego liganda zalpha11 (przykład 7) przy użyciu starterów ZC23,444 (SEQ ID NO: 74) i ZC23,445 (SEQ ID Nr: 75). Warunki reakcji PCR były następujące: 1 cykl w temperaturze 94°C przez 4 minuty, po czym 25 cykli w temperaturze 94°C przez 45 sekund, 50°C przez 45 sekund i 72°C przez 2 minuty; 1 cykl w temperaturze 72°C przez 10 minut; po czym nasycenie w temperaturze 4°C. Fragment uwidaczniano przez elektroforezę żelową (1% SeaPlaque/1% NuSieve). Prążek odcinano, rozcieńczano do 0,5% agarozy z użyciem 2 mM MgCl2, roztapiano w temperaturze 65°C, trawiono BamHI i XhoI (Boerhinger Mannheim) i poddawano ligacji do wektora ekspresyjnego bakulowirusa trawionego BamHI/XhoI, pZBV3L. Wektor pZBV3L jest modyfikacją wektora ekspresyjnego pFastBad™ (Life Technologies), w którym usunięto promotor poliedryny i zastąpiono późno aktywującym promotorem białka zasadowego. Około 14 nanogramów restrykcyjnie trawionego insertu liganda zalpha11 i około 40 ng odpowiadającego wektora poddawano ligacji przez noc w temperaturze 16°C.

Mieszaninę ligacyjną rozcieńczano 3-krotnie w TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5 i 1 mM EDTA) i około 4 fmoli rozcieńczonej mieszaniny ligacyjnej transformowano do kompetentnych komórek DH5a Efficiency Library (Life Technologies) zgodnie z instrukcjami producenta, przez szok cieplny przez 45 sekund w łaźni wodnej o temperaturze 42°C. Transformowany DNA i komórki rozcieńczano w 450 pl pożywki SOC (2% Bacto™ Tryptone, 0,5% ekstrakt drożdżowy, Bacto Yeast Extract, 10 ml 1M NaCl, 1,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 i 20 mM glukozy) i wysiewano na płytkach LB zawierających 100 pg/ml ampicyliny. Klony analizowano przez trawienie restrykcyjne i 1 pl klonu pozytywnego transformowano do 20 pl kompetentnych komórek DHlOBac Max Efficiency (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) zgodnie instrukcjami producenta, przez szok cieplny, jak opisano powyżej. Transformowane komórki następnie rozcieńczano w 980 pl pożywki SOC (2% Bacto™ Tryptone, 0,5% ekstrakt drożPL 207 350 B1 dżowy Bacto™ Yeast Extract, 10 mi 1M NaCl, 1,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 i 20 mM giukozy), hodowano inkubatorze z wytrząsaniem, w temperaturze 37°C przez cztery godziny i wysiewano na płytkach Luria Agar, zawierających 50 pg/ml kanamycyny, 7 pg/ml gentamycyny (Life Technologies), 10 pg/ml tetracykliny, IPTG (Pharmacia Biotech) i Bluo-Gal (Life Technologies).

Hodowane komórki inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37°C. Seiekcję barwy stosowano do identyfikacji tych komórek, które posiadały insert donorowy kodujący iudzki iigand zalpha11, który został wprowadzony do piazmidu (okreśiany jako „bakmid”).

Koionie, barwy białej, zbierano do anaiizy. DNA bakmidu iudzkiego iiganda zalpha11 izolowano z koionii pozytywnych przy użyciu systemu QiaVac MiniprepS (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Kiony przesiewano pod wzgiędem prawidłowego insertu przez powieianie DNA przy użyciu starterów w stosunku do ruchomego eiementu w bakmidzie, przez PCR przy użyciu starterów ZC447 (SEQ ID Nr: 76) i ZC976 (SEQ ID Nr: 77). Warunki reakcji PCR były następujące: 35 cykii w temperaturze 94°C przez 45 sekund 50°C przez 45 sekund i 72°C przez 5 minut; 1 cyki w temperaturze 72°C przez 10 minut; po czym nasycenie w temperaturze 4°C. Produkt PCR anaiizowano na 1% żeiu agarozowym, aby sprawdzić wieikość insertu. Kiony, które miały prawidłowy insert, stosowano do transfekcji komórek Spodoptera frugiperda (Sf9).

B. Ekspresja i wytwarzanie materiału do oczyszczania iudzkiego iiganda zalpha11 z bakulowirusa

Komórki Sf9 wysiewano w iiości 5 x 10⁶ komórek na 35 mm płytkę i pozostawiono do związania przez 1 godzinę w temperaturze 27°C. Pięć mikroiitrów bakmidowego DNA iudzkiego iiganda zalpha11 (powyżej) rozcieńczano 100 pi Sf-900 II SFM (Life Technologies). 6 pl Ce11FECTIN Reagent (Life Technoiogies) rozcieńczano 100 pl Sf-900 II SFM.

Bakmidowy DNA i roztwory lipidowe delikatnie mieszano i inkubowano 30-45 minut w temperaturze pokojowej. Pożywki z jednej płytki z komórkami aspirowano i komórki przemywano jednokrotnie 2 mi świeżej pożywki Sf-900 II SFM. Osiemset mikroiitrów Sf-900 II SFM dodawano do mieszaniny lipidy-DNA. Przemyte pożywki aspirowano i mieszaninę DNA-iipidy dodawano do komórek. Komórki inkubowano w temperaturze 27°C przez 4-5 godzin. Mieszaninę DNA-iipidy aspirowano i do każdej płytki dodawano 2 mi pożywki Sf-900 II. Płytki inkubowano w temperaturze 27°C, 90% wiigotności, przez 96 godzin, po czym wirusa zbierano.

W ceiu powieienia pierwotnego komórki Sf9 hodowano w 50 mi Sf-900 II SFM w 125 ml kolbie do wytrząsania do gęstości wynoszącej około 0,41-0,52 x 10 komórek/mi. Zakażano je następnie 150 pl roztworu macierzystego wirusa (patrz wyżej) i inkubowano w temperaturze 27°C przez 3 dni, po których wirus zbierano zgodnie ze standardowymi metodami znanymi w technice. Próbka, 500 pi, której aktywność badano w teście BaF3 (przykład 5) wykazywała, że jest biologicznie aktywna.

W ceiu powieienia wtórnego komórki Sf9 hodowano w 1 iitrze Sf-900 II SFM w 2800 ml kolbie ₅ do wytrząsania do gęstości wynoszącej około 0,5 x 10⁵ komórek/mi. Zakażano je 500 pi powyższego pierwotnego roztworu macierzystego wirusa i inkubowano w temperaturze 27°C przez 4 dni, po czym wirus zbierano zgodnie ze standardowymi metodami znanymi w technice.

Okreśiano miano wirusa i hodowano na dużą skaię w ceiu oczyszczania wytworzonego przez bakulowirus ludzkiego liganda zalpha11 (huzalpha11IL-Bv), jak opisano w przykładzie 30C i przykładzie 30D poniżej.

C. Oczyszczanie na dużą skaię iudzkiego/mysiego iiganda zalpha11 o ekspresji w bakulowirusie

Jeśii nie podano inaczej, wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze 4°C. Następującą procedurę stosowano do oczyszczania iudzkiego iiganda zalpha11 (huzalpha11IL-Bv) z kondycjonowanych pożywek BV (przykład BOB). Kondycjonowane pożywki (CM) fiitrowano z wyjaławianiem przez fiitry 0,45 i 0,22 mikrona, następnie buforowano z użyciem 0,01 M MES (Fiuka Biochemika, Szwajcaria)) i pH doprowadzano do 6,0. Następnie CM podawano na koiumnę POROS 50 HS i prowadzono rozdział, frakcje zbierano i anaiizowano, jak opisano w przykładzie 29A.

Powyższe frakcje pikowe ziewano, zatężano rozdzieiono na koiumnie do chromotografii wykluczania o wysokiej rozdzieiczości i anaiizowano, jak opisano w przykładzie 29A.

Badane frakcje z kolumny chromatografii wykiuczania ziewano i zatężano do minimainej objętości, stosując obrotowe urządzenie do zatężania o MWCO 5 kD Miiiipore. Końcowy produkt następnie analizowano przez SDS-PAGE Coomassie (Sigma, St. Louis, MO), metodą western biot, sekwencjonowanie N-terminaine, anaiizę aminokwasów i GB (Pierce, Rockford, Iiiinois) aby okreśiić stężenie białka, jak opisano w przykładzie 29A. Masę białkową przechowywano w temperaturze -80°C.

PL 207 350 B1

D. Oczyszczanie na małą skalę (< 2 mg) ludzkiego/mysiego liganda zalpha11 o ekspresji w bakulowirusie

Jeśli nie podano inaczej, wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze 4°C. Następującą procedurę stosowano do oczyszczania < 2 mg ludzkiego lub mysiego liganda zalpha11 z kondycjonowanych pożywek BV.

CM filtrowano, buforowano i pH regulowano jak w przykładzie 30C. CM następnie ładowano, podawano i chromatografię POROS 50 HS analizowano jak w przykładzie 30C. Frakcje zlewano następnie i zatężano przez diafiltrację w obrotowym urządzeniu do zatężania na błonie YM10 (MWCO 10 kD) (Millipore/Amicon, Bedford, MA) do nominalnej objętości (20-30 ml). pH doprowadzono do 7,0, następnie próbkę podawano na jedną kolumn z 0,8 ml Poros AL, która zawierała około 3 mg rozpuszczalnego receptora zalpha11CFLAG (przykład 10B) lub około 10 mg fuzji rozpuszczalnego receptora zalpha11-Fc4 (przykład 10C), unieruchomionych na żywicy (patrz metoda w przykładzie 29C) w ilości 1 ml/minutę na BioCad SPRINT. Następnie kolumnę przemywano co najmniej 20 CV 0,3 M NaCl/PBS(Gibco BRL) /0,01 M MES przy przepływie 10 ml/minutę. Następnie kolumnę szybko wymywano 600 pl wstrzykiem 0,1 M glicyny (kwas aminooctowy; glikokol. Spectrum, Gardena, CA) o pH 2,5 z natężeniem przepływu 10 ml/minutę z użyciem PBS na BioCAD SPRINT. Frakcje 1 ml zbierano przez 6 sekund każda i natychmiast pH zobojętniano 55 pl 2M TRIS (tris(hydroksymetylo)aminometan, EM Science, Gibbstown, NJ) pH 8,8. Absorbancję przy 280 i 215 nM monitorowano przez całą chromatografię. Frakcje analizowano, jak powyżej.

Frakcje pikowe zlewano, następnie zatężano przez diafiltrację w obrotowym urządzeniu do zatężania komórek na błonie YM10 (MWCO 10 kD) (Millipore/Amicon, Bedford, MA) do 1-2 ml. Próbkę następnie podawano na odpowiednią kolumnę Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) do chromatografii wykluczania o wysokiej rozdzielczości, zrównoważoną w PBS (Gibco BRL), przy optymalnym natężeniu przepływu; frakcje zbierano przez całą chromatografię i absorbancję monitorowano przy 280 i 215 nM. Frakcje analizowano, jak powyżej.

Badane frakcje zlewano i zatężano do nominalnej objętości, stosując obrotowe urządzenie do zatężania o MWCO 5 KD (Millipore). Produkt końcowy następnie analizowano przez SDS-PAGE Coomassie (Sigma, St. Louis, MO), metodę western blot, sekwencjonowanie N-terminalne, analizę aminokwasów i BCA (Pierce. Rockford, Illinois), aby określić czystość i stężenie białka. Masę białkową przechowywano, jak opisano powyżej.

E. Konstrukcja do ekspresji mysiego liganda zalpha11 w bakulowirusie: pzalpha11lig.M

Wytworzono wektor ekspresyjny, pzalpha11LM, do ekspresji mysich polipeptydów liganda zalpha11 w komórkach owada. Utworzono fragment o długości 413 bp zawierający sekwencję dla mysiego liganda zalpha11 i kodowane miejsca restrykcyjne BspEl i Xbal odpowiednio na końcach 5' 13', przez powielanie PCR z plazmidu zawierającego cDNA mysiego liganda zalpha11 (przykład 16), przy użyciu starterów ZC25,970 (SEQ ID Nr: 109) i ZC25,969 (SEQ ID Nr: 110), wykorzystując Expand High Fidelity PCR System (Boerhinger Mannheim) zgodnie z instrukcjami producenta. Warunki PCR były następujące: 1 cykl w temperaturze 94°C przez 2 minuty, po czym 35 cykli w temperaturze 94°C przez 15 sekund, 50°C przez 30 sekund i 72°C przez 2 minuty; 1 cykl w temperaturze 72°C przez 10 minut; po czym nasycenie w temperaturze 4°C. Niewielką część produktu PCR uwidaczniano przez elektroforezę żelową (1% NuSieve agarose). Pozostałą ilość fragmentu oczyszczano przy użyciu zestawu do oczyszczania PCR Qiagen zgodnie z instrukcjami producenta i wymywano do 30 pl H2O. Fragment następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi Bspel i Xbal (Boerhinger Mannheim) w temperaturze 37°C przez około 2 godziny, następnie analizowano na żelu agarozowym, jak opisano powyżej. Prążek odcinano, oczyszczano i wymywano przy użyciu zestawu do esktrakcji żelowej Qiagen zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczony fragment poddawano ligacji do wektora ekspresyjnego bakulowirusa trawionego Bspel/Xbal, pZBV37L. Wektor pZBV37L jest modyfikacją wektora ekspresyjnego pFastBad™ (Life Technologies), w którym usunięto promotor poliedryny i zastąpiono nim promotor białka zasadowego z późną aktywacją, po którym następuje sekwencja sygnału wydzielania UDP-glukozylotransfarazy ekdysteroidowej (EGT). Około 5 pl restrykcyjnie trawionego insertu mysiego liganda zalpha11 i około 100 ng odpowiadającego pociętego wektora poddawano ligacji przez noc w temperaturze 16°C w około 20 pl. 5 pl mieszaniny ligacyjnej poddawano elektroporacji do 50 pl elektrokompetentnych komórek bakterii DH12S Life Technologies wykorzystując 2 mm kuwetki i ustawienia 2 kV, 25 pf i 400 omów. Elektroporowane komórki umieszczano w 1 ml pożywki SOC (2% Bacto™ Tryptone, 0,5% ekstraktu drożdżowego Bacto Yeast Extract, 10 ml 1M NaCl, 1,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 i 20 mM glukozy (Gibco BRL)), hodowano w temperaturze 37°C przez około

PL 207 350 B1 godzinę i wysiewano na płytkach LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny. DNA z klonów izolowano i analizowano przez trawienie restrykcyjne, w celu identyfikacji pozytywnych klonów. Około 5 ng DNA z pozytywnego klonu transformowano do 20 μl kompetentnych komórek DH10Bac Max Efficiency (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) zgodnie instrukcjami producenta, przez szok cieplny przez 45 sekund w łaźni wodnej o temperaturze 42°C. Transformowane komórki następnie rozcieńczano i hodowano, jak opisano w przykładzie 30A. Bakmidy zawierające insert mysiego liganda zalpha11 identyfikowano i izolowano, jak opisano w przykładzie 30A. Klony przesiewano pod względem prawidłowego insertu przez powielanie DNA przy użyciu startmerów do ruchomego elementu w bakmidzie, przez PCR przy użyciu startmerów ZC447 (SEQ ID Nr: 76) i ZC976 (SEQ ID Nr: 77). Warunki reakcji PCR były następujące: 35 cykli w temperaturze 94°C przez 45 sekund, 50°C przez 45 sekund i 72°C przez minut; 1 cykl w temperaturze 72°C przez 10 minut; po czym nasycenie w temperaturze 4°C. Produkt PCR analizowano na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić wielkość insertu. Te, które miały prawidłowy insert, stosowano do transfekcji komórek Spodoptera frugiperda (Sf9).

F. Ekspresja i tworzenie materiału do oczyszczania mysiego zalpha11 z bakulowirusa

Komórki Sf9 wysiewano w ilości 1 miliona komórek na 35 mm płytkę i pozostawiano do związania przez 1 godzinę w temperaturze 27°C. Bakmidowy DNA mysiego liganda zalpha11 transfekowano, jak opisano w przykładzie 30B i zbierano wirusa.

W celu powielania pierwotnego, komórki Sf9 wysiewano jak powyżej i dodawano 500 μl supernatantu 72 godziny po transfekcji i hodowle pozostawiano do wzrostu przez 96 godzin, po czym wirus zbierano zgodnie ze standardowymi metodami.

W celu powielania wtórnego komórki Sf9 wysiewano jak powyżej i dodawano 200 μl pierwotnego roztworu macierzystego wirusa. Hodowle inkubowano w temperaturze 27°C przez 72 godziny, po czym wirus zbierano zgodnie ze standardowymi metodami.

W celu trzeciego powielania, 10 μl wtórnie powielonego roztworu wirusa umieszczano na SF9 w ilości 500000 komórek na studzienkę w 50 ml pożywki SF900II w 250 ml kolbie do wytrząsania na dni i wirus zbierano jak powyżej. Określano mianowano wirusa i hodowano na dużą skalę w celu oczyszczenia wytworzonego przez bakulowirus mysiego liganda zalpha11 (muzalpha1 IL-Bv), jak opisano w przykładzie 30C i przykładzie 30D.

Obecność białka o przewidywanym ciężarze cząsteczkowym w supernatancie określano przez analizę western przy użyciu przeciwciała poliklonalnego anty-muzalpha 11L/MBP-6H (przykład 27). Analiza testu proliferacji w oparciu o BaF3 (przykład 5) także wykazywała, że wydzielone białko było aktywne.

P r z y k ł a d 31

Ekspresja ludzkiego i mysiego liganda zalpha11 w E. coli

A. Konstrukcja wektora ekspresyjnego fuzji ludzki ligand zalpha11-MBP PTAP98/ligand zalpha11

Plazmid ekspresyjny zawierający polinukleotyd kodujący część ludzkiego liganda zalpha11 połączonego N-terminalnie z białkiem wiążącym maltozę (MBP) konstruowano przez rekombinację homologiczną. Fragment cDNA ludzkiego liganda zalpha11 (SEQ ID Nr: 1) izolowano przy użyciu PCR. Dwa startery stosowano przy wytwarzaniu fragmentu ludzkiego zalpha11 ligand w reakcji PCR: (1) starter ZC22,128 (SEQ ID Nr: 78), zawierający 40 bp sekwencji oskrzydlającej wektor i 26 bp odpowiadających końcowi aminowemu ludzkiego liganda zalpha11 i (2) starter ZC22,127 (SEQ ID Nr: 79) zawierający 40 bp końca 3' odpowiadających sekwencji oskrzydlającej wektor i 28 bp odpowiadających końcowi karboksylowemu ludzkiego liganda zalpha11. Warunki reakcji PCR były następujące: 25 cykli w temperaturze 94°C przez 3 0 sekund, 50°C przez 3 0 sekund i 72°C przez 1 minutę; po czym nasycenie w temperaturze 4°C, w dwóch powtórzeniach.

Dwa μl ze 100 μl reakcji PCR analizowano na 1,0% żelu agarozowym z buforem do analizy 1 x TBE, stwierdzając oczekiwany prążek o długości około 472 bp. Pozostałe 90 μl reakcji PCR łączono z drugą probówką PCR i wytrącano 400 μl absolutnego etanolu w celu użycia w rekombinacji do pociętego Smal wektora biorczego pTAP98, aby wytworzyć konstrukcję kodującą fuzję MBP-ligand zalpha11, jak opisano poniżej.

Plazmid pTAP98 otrzymywano z plazmidów pRS316 i pMAL-c2. Plazmid pRS316 jest wektorem przenoszenia Saccharomyces cerevisiae (Hieter P. i Sikorski, R., Genetics 122: 19-27, 1989). pMAL-C2 (NEB) jest plazmidem ekspresyjnym E. coli. Niesie on promotor tac kierujący MalE (gen kodujący MBP), następnie znacznik His, miejsce cięcia dla trombiny, miejsce klonowania, oraz terminator rrnB. Wektor pTAP98 konstruowano stosując homologiczną rekombinację drożdży. 100 ng pociętego EcoRI pMAL-c2 rekombinowane z 1 μg pRS316 pociętym Pvul, 1 μg linkera oraz 1 μg pRS316 pociętego

PL 207 350 B1

Scal/EcoRl. Łącznik zawierał oligonukleotydy ZC19,372 (SEQ ID nr: 80) (100 pmol); ZC19,351 (SEQ ID nr: 81) (1 pmol); ZC19,352 (SEQ ID nr: 82) (1 pmol) i ZC19,371 (SEQ ID nr: 83) (100 pmol) łączone w reakcji PCR. Warunki reakcji PCR były następujące: 10 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 50°C przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund; po czym nasycanie w temperaturze 4°C. Produkty PCR zatężano przez wytrącanie 100% etanolem.

Sto mikrolitrów kompetentnych komórek drożdży (S. cerevisiae) łączono z 10 pl mieszaniny zawierającej w przybliżeniu 1 pg produktu PCR ludzkiego liganda zalpha11 i 100 ng wektora pTAP98 trawionego Smal i przenoszono do 0,2 cm kuwetki de elektroporacji. Mieszaninę drożdże/DNA poddano działaniu impulsów elektrycznych: 0,75 kV (5 kV/cm), nieskończona oporoność, 25 pF. Do każdej kuwetki dodawano 600 pl 1,2 M sorbitolu. Następnie drożdże wysiewano w dwóch 300 pl ilościach na dwie płytki -URA D i inkubowano w temperaturze 30°C.

Po około 48 godzinach transformanty drożdżowe Ura+ z pojedynczej płytki ponownie zawieszano w 1 ml H2O i wirowano krótko, aby uzyskać osad komórek drożdży. Osad komórek ponownie zawieszano w 1 ml buforu do lizy (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). Pięćset mikrolitrów mieszaniny do lizy dodawano do probówki Eppendorfa zawierającej 300 pl szklanych kulek przemywanych kwasem i 200 pl mieszaniny fenol-chloroform, wirowano przez 1 minutę dwa lub trzy razy, po czym wirowano 5 minut w wirówce Eppendorfa przy maksymalnej prędkości. Trzysta mikrolitrów fazy wodnej przenoszono do świeżej probówki i DNA wytrącano 600 pl etanolu (EtOH), po czym wirowano przez 10 minut w temperaturze 4°C. Osad DNA ponownie zawieszano w 100 pl H2O.

Transformację elektrokompetentnych komórek E. coli (MC1061, Casadaban i inni J. Mol. Biol. 138: 179-207) wykonywano z 1 pl preparatu drożdżowego DNA i 40 pl komórek MC1061. Komórki poddawano elektropulsom działaniu impulsów elektrycznych: 2,0 kV, 25 pF i 400 omów. Po elektroporacji 0,6 ml SOC (2% Bacto™ Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% ekstrakt drożdżowy (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukozy) wysiewano w jednej równej ilości na płytkach LB AMP (pożywka LB (Lennox), 1,8% Bacto™ Agar (Difco), 100 mg/L ampicyliny).

Poszczególne klony zawierające prawidłową konstrukcję ekspresyjną dla ludzkiego liganda zalpha11 identyfikowano przez ekspresję. Komórki hodowano w Superbroth II (Becton Dickinson) ze 100|lg/ml ampicyliny przez noc. 50 pl całonocnej hodowli stosowano do zaszczepienia 2 ml świeżego Superbroth II + 100 pg/ml ampicyliny. Hodowle prowadzano w temperaturze 37°C, wytrząsając przez 2 godziny. 1 ml hodowli indukowano 1 mM IPTG. 2-4 godziny potem 250 pl każdej hodowli mieszano z 250 pl szklanych kulek przemywanych kwasem i 250 pl buforu Thornera z 5% βΜΕ oraz barwnikiem (8M mocznik, 100 mM Tris pH 7,0, 10% glicerol, 2 mM EDTA, 5% SDS).

Próbki wirowano przez jedną minutę i ogrzewano do temperatury 65°C przez 5-10 minut. 20 pl na tor ładowano na 4%-12% żelu PAGE (NOVEX). Rozdział na żelu prowadzono w buforze 1XMES. Klony dodatnie oznaczono pTAP126 i poddawano analizie sekwencji. Sekwencję polinukleotydową fuzji MBP-ludzki ligand zalpha11 w pTAP126 pokazano w SEQ ID Nr: 84, zaś odpowiadający polipeptyd w SEQ ID Nr: 85.

B. Ekspresja w bakteriach ludzkiego liganda zalpha11

Jeden mikrolitr sekwencjonowanego DNA stosowano do transformacji szczepu W3110 (ATCC). Komórki poddawano działaniu impulsów elektrycznych: 2,0 kV, 25 pF i 400 omów. Po elektroporacji 0,6 ml SOC (2% Bacto™ Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% ekstrakt drożdżowy (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4, 20 mM glukozy) wysiewano w równej ilości na płytkach LB AMP (LB bulionu (LennoK), 1,8% Bacto™ Agar (Difco), 100 mg/L ampicyliny).

Poszczególne klony poddawano ekspresji. Komórki hodowano w Superbroth II (Becton Dickinson) ze 100 pg/ml ampicyliny przez noc. 50 pl całonocnej hodowli stosowano do zaszczepienia 2 ml świeżego Superbroth II + 100 pg/ml ampicyliny. Hodowle prowadzono w temperaturze 37°C, wytrząsając przez 2 godziny. 1 ml hodowli indukowano 1 mM IPTG. 2-4 godziny potem 250 pl każdej hodowli mieszano z 250 pl szklanych kulek przemywanych kwasem i 250 pl buforu Thornera z 5% βΜΕ oraz barwnikiem (8M mocznik, 100 mM Tris pH 7,0, 10% glicerol, 2 mM EDTA, 5% SDS).

Próbki wirowano przez jedną minutę i ogrzewano do temperatury 65°C przez 10 minut. 20 pl na tor ładowano na 4%-12% żelu PAGE (NOVEX). Rozdział na żelu prowadzono w buforze 1XMES.

Pozytywne klony stosowano do hodowli w celu oczyszczania białka fuzyjnego huzalpha11 L/MBP-6H (przykład 32 poniżej).

PL 207 350 B1

C. Konstrukcja wektora ekspresyjengo fuzji mysiego liganda zalpha11-MBP, pTAP98/mysi ligand zalpha11

Plazmid ekspresyjny zawierający polinukleotyd kodujący część mysiego liganda zalpha11 połączonego N-terminalnie z białkiem wiążącym maltozę (MBP) wytwarzano przez rekombinację homologiczną, jak opisano w przykładzie 31A. Fragment cDNA mysiego liganda zalpha11 (SEQ ID Nr: 55) izolowano przy użyciu PCR. Stosowano dwa startery przy wytwarzaniu fragmentu mysiego liganda zalpha11, w reakcji PCR: (1) starter ZC22,849 (SEQ ID Nr: 86), zawierający 40 bp sekwencji oskrzydlającej wektor i 24 bp odpowiadających końcowi aminowemu mysiego liganda zalpha11 i (2) starter ZC22,850 (SEQ ID Nr: 87), zawierający 40 bp końca 3' odpowiadających sekwencji oskrzydlającej wektor i 21 bp odpowiadających końcowi karboksylowemu mysiego liganda zalpha11. Warunki reakcji PCR były takie, jak powyżej. Fragment o długości około 450 bp klonowano do pTAP98, jak opisano powyżej. Klony transformowano, identyfikowano i hodowano, jak opisano powyżej. Klony pozytywne oznaczono pTAP134 i poddawano analizie sekwencji. Sekwencję polinukleotydową fuzji MBP-mysi ligand zalpha11 w pTAP134 pokazano w SEQ ID Nr: 88, zaś odpowiadającą sekwencję polipeptydową pokazano w SEQ ID Nr:89. Pozytywne klony stosowano do hodowli w E. coli, jak opisano powyżej, w celu oczyszczania białka białka fuzyjnego muzalpha11L/MBP-6H (przykład 32).

P r z y k ł a d 32

Oczyszczanie liganda zalpha11-MBP lub receptora zalpha11-MBP

Jeśli nie podano inaczej, wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze 4°C. Następującą procedurę stosowano do oczyszczania fuzji ligand zalpha11-MBP dla ludzkiego liganda zalpha11-MBP (huzalpha11L/MBP-6H) lub mysiego liganda zalpha11-MBP (muzalpha11L/MBP-6H) z E. coli. Fuzje ludzkiego lub mysiego receptora zalpha11-MBP przeprowadzano przy użyciu takiej samej metody. Wstępnie odwirowaną zamrożoną pastę E. coli roztapiano i rozcieńczano do 2 litrów buforem B (0,02 M TRIS (EM Science); 0,2 M NaCl (Mallincrodt); 0,01 M 2-merkapto-etanolem (EM Science); pH 8,0; z 5 mg/l pepstatyny A (Boerhinger Mannheim); 5 mg/l aprotyniny (Boerhinger Mannheim) i 1 mg/l PMSF (Fluka)) oraz 1-2 ml środka przeciwpieniącego AF289 (Sigma). Mieszaninę obrabiano we wstępnie ochłodzonym urządzeniu do rozrywania komórek French Press (Constant Systems LTD) przy 20-30 kPSI.

Lizat następnie wirowano przy 18000 x g przez 45 minut w temperaturze 4°C zachowując supernatant. 200 ml zawiesiny żywicy amytoza (New England BioLabs), wstępnie zrównoważoną w buforze A (0,02 M TRIS (EM Science); 0,2 M NaCl (Mallincrodt); 0,01 M 2-merkapto-etanolu (EM Science); pH 8,0), dodawano do supernatantu lizatu i inkubowano przez noc w 21 obracających się butelkach aby uzyskać maksymalną absorpcję białka fuzyjnego MBP przez masę. Żywicę przemywano na kolumnie w sposób okresowy, > 5 objętościami kolumny z użyciem buforu A, następnie porcję wymywano z użyciem buforu C (buforu A z 0,02 M maltozą (Sigma)). Surowe frakcje zbierano i monitorowano mierząc absorbancję przy 280 nm. Wymyte białko analizowano za pomocą SDS NuPAGE (NOVEX) przy użyciu barwienia Coomassie (Sigma). Próbkę i masę białkową przechowywano w temperaturze -80°C.

P r z y k ł a d 33

Przeciwciała poliklonalne wobec ludzkiego liganda zalpha11

Przeciwciała poliklonalne wytwarzano przez immunizację 2 samic białych królików New Zealand oczyszczanym rekombinowanym białkiem huzalpha11L/MBP-6H (przykład 32). Każdy królik otrzymywał początkową iniekcję dootrzewnową (ip) 200 mg oczyszczonego białka w kompletnym adirwancie Freunda, po czym przypominającą injekcję ip 100 mg peptydu w niekompletnym adiuwancie Freunda, co trzy tygodnie. Siedem do dziesięciu dni po podaniu drugiej iniekcji przypominającej (ogółem 3 iniekcje), zwierzęta skrwawiano i zbierano surowicę. Następnie zwierzętom podawano dawki przypominające i pobierano krew co trzy tygodnie.

Surowice króliczą specyficzną wzbudzoną wobec huzalpha11L/MBP-eH wstępnie adsorbowano z przeciwciał anty-MBP przy użyciu kolumny CNBr-SEPHAROSE białko 4B (Pharmacia LKB), którą sporządzano przy użyciu 10 mg oczyszczonego rekombinowanego białka wiążącego maltozę (MBP) na gram CNBr-SEPHAROSE. Otrzymywano rekombinowany MBP i oczyszczano na kolumnie amylozowej we własnym laboratorium, przy użyciu metod dobrze znanych w technice. Przeciwciała poliklonalne specyficzne dla liganda huzalpha11 oczyszczano przez powinowactwo z surowicy króliczej, przy użyciu kolumny CNBr-SEPHAROSE białko 4B (Pharmacia LKB), którą wytworzono przy użyciu 10 mg specyficznego wobec antygenu oczyszczonego rekombinowanego białka muzalpha11L/MBP-6H (przykład 32), po czym przez dializę 20X w PBS przez noc. Przeciwciała specyficzne dla liganda hu72

PL 207 350 B1 zalpha11 charakteryzowano w teście ELISA przy użyciu 1 pg/ml oczyszczonego rekombinowanego białka huzalpha11L/MBP-6H (przykład 32), ludzkiego liganda zalpha11 (huzalpha11L-CHO) (przykład 29) lub muzalpha11L-MBP/6H (przykład 32) jako celów dla przeciwciał.

Dolna granica wykrywania (LLD) oczyszczonego przez powinowactwo króliczego przeciwciała antymuzalpha11L/MBP-6H wynosiła 10 ng/ml na jego specyficznie oczyszczonym rekombinowanym antygenie huzalphallL/MBP-6H 500 pg/ml na oczyszczonym rekombinowanym huzalpha11L-CHO i 100 pg/ml na oczyszczonym rekombinowanym muzalpha11L/MBP-6H (przykład 32). LLD króliczego przeciwciała antyhuzalpha11L-CHO oczyszczonego przez powinowactwo wynosiła 20 pg/ml na jego specyficznym oczyszczonym rekombinowanym antygenie huzalpha11L-CHO, 500 pg/ml na oczyszczonym huzalpha11L/MBP-6H i 50 ng/ml na oczyszczonym rekombinowanym muzalpha11L/MBP-6H.

LLD króliczego przeciwciała antyhuzalpha11L-CHO oczyszczonego przez powinowactwo wynosiła 20 pg/ml na jego specyficznym oczyszczonym rekombinowanym antygenie huzalpha11L-CHO, 500 pg/ml na oczyszczonym rekombinowanym huzalpha11L/MBP-6H i 50 ng/ml na oczyszczonym rekombinowanym muzalpha11L/MBP-6H.

P r z y k ł a d 34

Przeciwciała antypeptydowe wobec ludzkiego liganda zalpha11

Wytwarzano przeciwciała poliklonalne antypeptydowe wobec ludzkiego liganda zalpha11 przez immunizację 2 samic białych królików New Zealand peptydem ludzkiego liganda zalpha11, huzalphallL-1 (SEQ ID Nr: 72) lub huzalpha11L-3 (SEQ ID Nr: 73). Peptydy syntetyzowano przy użyciu syntetyzatora peptydów Applied Biosystems Model 431 A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Peptydy następnie sprzęgano z białkiem nośnikowym - hemocyjaniną z Megathura crenolata w (KLH) z aktywacją maleimidową. Królikom podawano początkową iniekcję dootrzewnową (ip) 200 mg peptydu w kompletnym adirwancie Freunda, po czym przypominające injekcję ip 100 mg peptydu w niekompletnym adirwancie Freunda co trzy tygodnie. Siedem do dziesięciu dni po podaniu drugiej iniekcji przypominającej (ogółem 3 iniekcje), zwierzęta skrwawiano i zbierano surowicę. Następnie zwierzętom podawano dawki przypominające i pobierano krew co trzy tygodnie.

Surowice krółicze wzbudzone wobec peptydów łudzkiego liganda zalpha11 charakteryzowano przez sprawdzanie miana za pomocą testu ELISA przy użyciu 1 pg/ml odpowiedniego peptydu użytego do wytworzenia przeciwciała (SEQ ID Nr: 72 lub SEQ ID Nr: 73), jako celu dla przeciwciała. Surowice od 2 królików wobec peptydu huzalphallL-1 miały miano wobec ich specyficznego peptydu przy rozcieńczeniu 1:5 000 000 (1:5E6). Surowice od 2 królików wobec peptydu huzalpha11L-3 miały miano wobec ich specyficznego peptydu przy rozcieńczeniu 1:5E6.

Przeciwciała poliklonalne specyficzne wobec peptydu ludzkiego liganda zalpha11 oczyszczano przez powinowactwo z surowicy króliczej przy użyciu kolumny CNBR-SEPHAROSE baiłko 4B (Pharmacia LKB), którą wytworzono przy użyciu 10 mg odpowiedniego specyficznego peptydu (SEQ ID Nr: 72 lub SEQ ID Nr: 73) na gram CNBr-SEPHAROSE, po czym przez 20 x dializę w PBS przez noc. Przeciwciała specyficzne wobec liganda Huzalpha11 charakteryzowano przez sprawdzanie miana za pomocą testu ELISA przy użyciu 1 pg/ml odpowiedniego oczyszczonego antygenu peptydowego lub oczyszczonego rekombinowanego białka pełnej długości jako celu dla przeciwciała.

Dolna granica wykrywania (LLD) króliczego przeciwciała antyhuzalpha11L-1 oczyszczonego przez powinowactwo wynosi 500 pg/ml na jego specyficznym antygenie peptydowym (huzalpha11L-1; SEQ ID Nr: 72), 500 pg/ml na oczyszczonym rekombinowanym huzalpha11L/MBP-6H (przykład 32) i 500 pg/ml na oczyszczonym CHO rekombinowanym huzalpha11L-CHO (przykład 29). Nie stwierdzone reaktywności krzyżowej wobec oczyszczonego rekombinowanego muzalpha11L/MBP-6H (przykład 32). LLD króliczego przeciwciała antyhuzalpha11L-3 oczyszczonego przez powinowactwo wynosi 50 pg/ml na jego specyficznym antygenie peptydowym (huzalpha11L-1; SEQ ID Nr: 73), 50 pg/ml na oczyszczonym rekombinowanym huzalpha11L/MBP-6H, 500 pg/ml na oczyszczonym CHO rekombinowanym huzalpha11L-CHO (przykład 29) i 100 pg/ml na oczyszczonym bakulowirusowym rekombinowanym huzalpha11L-Bv (przykład 30). Reaktywność krzyżowa była widoczna w oczyszczonym rekombinowanym muzalpha11L/MBP-6H (przykład 32), przy LLD wynoszącym 5 ng/ml.

P r z y k ł a d 35

Przeciwciała monoklonalne wobec ludzkiego receptora zalpha11

Wytwarzano przeciwciała monoklonalne wobec receptora zalpha11 przez immunizację 5 samców myszy BalbC (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) oczyszczonym rekombinowanym rozpuszczalnym białkiem receptora zalpha11CEE (huzalpha11-CEE-BHK) (przykład 10A). Każdej myszy podawano początkową iniekcję dootrzewnową (IP) 20 mg oczyszczonego białka w kompletnym adirPL 207 350 B1 wancie Freunda (Pierce, Rockford, IL), po czym przypominające injekcję IP 10 mg oczyszczonego białka w niekompietnym adiuwancie Freunda co dwa tygodnie. Siedem do dziesięciu dni po podaniu trzeciej dawki przypominającej, zwierzętom pobierano krew i zbierano surowicę.

Próbki mysiej surowicy wzbudzonej wobec huzalpha11-CEE-BHK charakteryzowano przez sprawdzanie miana za pomocą testu ELISA, przy użyciu oczyszczonego rekombinowanego CHO białka huzaipha11-Fc (przykład 10C) jako ceiu dia przeciwciała. Jedna mysia próbka surowicy miała miano wobec specyficznego ceiu przeciwciała przy rozcieńczeniu 1:1 000 000 (1:1E6). Cztery mysie próbki surowicy miały miano wobec specyficznego ceiu przeciwciała przy rozcieńczeniu 1:100000 (1:1 E5).

Komórki śiedziony pobierano od 4 myszy o wysokim mianie i połączono z mysimi komórkami szpiczaka SP2/0 przy użyciu PEG 1500 (Boerhinger Mannheim, Wieika Brytania), w dwóch oddzielnych procedurach fuzji, stosując stosunek fuzji 4:1 komórek śiedziony do komórek szpiczaka (Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow i D. Lane, Cold Spring Harbor Press). Po 10 dniach wzrostu po fuzji, specyficzne hybrydomy wytwarzające przeciwciała identyfikowano w teście ELISA, przy użyciu oczyszczonego rekombinowanego BHK białka iudzkiego zaipha11-Fc4 (przykład 10C), jako celu dla przeciwciała i przez FACS przy użyciu komórek Baf3, wykazujących ekspresję sekwencji huzalpha11 (przykład 4 i przykład 2), jako ceiu dia przeciwciała. Otrzymane 4 hybrydomy pozytywne w obu metodach kionowano trzy razy przez ograniczone rozcieńczanie. Przeciwciała oznaczano: 249.28.2.1.2.2; 247.10.2.15.4.6; 249.19.2.2.3.5 i 249.15.2.4.2.7.

P r z y k ł a d 36

Mysz transgeniczną z iigandem zaipha11

A. Wytwarzanie transgenicznych myszy wykazujących ekspresję iudzkiego i mysiego iiganda zalpha11

Wytwarzano fragmenty DNA z wektorów transgenicznych (przykład 22 i przykład 26) zawierających sekwencje oskrzydiające 5' i 3' odpowiedniego promotora (promotor MT-1 specyficzny dia wątroby (mysi ligand zalpha11 (przykład 26B) iub specyficzny dia iimfoidu promotor LCK (mysi i ludzki liganda zalpha11 (przykłady 26A i 22B), intron szczurzej insuiiny II, cDNA iiganda zalpha11 i sekwencje poii A iudzkiego hormonu wzrostu i stosowano do mikroiniekcji do zapłodnionych oocytów myszy B6C3fi (Taconic, Germantown, NY), przy użyciu standardowego protokołu iniekcji. Patrz Hogan, B. i inni, Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994.

Osiem transgenicznych myszy wykazujących ekspresję iudzkiego iiganda zalpha11 z promotorem specyficznym dla limfoidu EpLCK z identyfikowano wśród 44 młodych. Cztery z nich były padły, zaś 4 rosły do osiągnięcia dorosłości. Poziomy ekspresji były dość niskie u tych zwierząt. Dwadzieścia transgenicznych myszy wykazujących ekspresję mysiego iiganda zalpha11 ze specyficznym dla limfoidu promotorem EpLCK, z identyfikowano wśród 77 młodych. Wszystkie 20 hodowano do dorosłości. Poziomy ekspresji były dość niskie u tych zwierząt. Trzy transgeniczne myszy, wykazujące ekspresję mysiego liganda zalpha11 ze specyficznym dia wątroby promotorem MT-1, identyfikowano wśród 60 młodych. Dwa z tych młodych padł, zaś 1 hodowano do dorosłości. Poziomy ekspresji były dość niskie u tych zwierząt. Wytwarzano tkanki i badano histoiogicznie, jak opisano poniżej.

B. Ocena mikroskopowa tkanek od myszy transgenicznych

Śiedzionę, grasicę i krezkowe węzły chłonne pobierano i przygotowywano do badania histoiogicznego, od transgenicznych zwierząt wykazujących ekspresję iudzkiego i mysiego iiganda zalpha11 (przykład 36A). Inne tkanki, które rutynowo pobierano, były następujące: wątroba, serce, płuco, nerka, skóra, gruczoł sutkowy, trzustka, żołądek, jeiito cienkie i grube, mózg, śiinianka, tchawica, przełyk, nadnercze, przysadka, drogi rodne, gruczoły płciowe samców, mięsień szkieietowy łącznie z nerwem obwodowym i kość udowa ze szpikiem kostnym. Tkanki pobrano od noworodka, który padł nieoczekiwanie i kiiku dorosłych transgenicznych myszy, jak opisano poniżej. Próbki utrwaiano w 10% buforowanej formalinie, rutynowo opracowywano, osadzano w parafinie, wykonywano przekroje po 5 mikronów i barwiono hematoksyiiną i eozyną. Płytki badano i oceniano pod wzgiędem ciężkości zmian w tkance (0 = brak, 1 = łagodne, 2 = średnie, 3 = ciężkie) przez uprawnionego patoioga weterynaryjnego, pracującego w warunkach zaśiepionych / w warunkach śiepej próby.

młode i 2 dorosłe samice myszy wykazujące ekspresję iudzkiego iiganda zalpha11 oraz 3 z 6 dorosłych samców myszy wykazujących ekspresję mysiego iiganda zalpha11, wykazywały nacieki zapaine w wieiu badanych tkankach. Chore narządy różniły się nieco między myszami. Naciek zapalny składał się głównie z neutrofiii i makrofagów w różnych iiościach i proporcjach i miał zasadniczo

PL 207 350 B1 stopień ciężkości łagodny do średniego. Ponadto, zwierzęta wykazywały zmiany w narządach limfoidowych, w tym limfopenię średnią do ciężkiej w śledzionie i grasicy (u zwierząt transgenicznych pod względem ludzkiego i mysiego liganda zalpha11); i ciężką limfopenię (u zwierząt transgenicznych pod względem ludzkiego liganda zalpha11) lub łagodne do ciężkiego ropne do ropnoziarninowego zapalenie gruczołów limfatycznych (u zwierząt transgenicznych pod względem mysiego liganda zalpha11) w węzłach chłonnych. Oprócz tego w śledzionach wyraźne było zwiększone krwiotworzenie pozaszpikowe. Tych zmian nie obserwowano u myszy kontrolnych w odpowiednim wieku.

C. Analiza metodą cytometrii przepływowej tkanek od transgenicznych myszy z nadekpresją liganda zalpha11

Zwierzęta transgeniczne z nadekspresja ludzkiego lub mysiego liganda zalpha11 (przykład 36A) uśmiercano do analizy metodą cytometrii przepływowej krwi obwodowej, grasicy, węzła chłonnego, szpiku kostnego i śledziony.

Uzyskiwano zawiesiny komórkowe ze śledziony, grasicy i węzłów chłonnych, przez rozdrobnienie narządu szczypcami w pożywce hodowlanej z lodem (500 ml RPMI 1640 Medium (JRH Biosciences, Lenexa, K. S); 5 ml 100 x L-glutaminy (Gibco BRL, Grand Island, NY); 5 ml 100 x pirogronianu sodu (Gibco BRL); 5 ml 100 x penicyliny, streptomycyny, neomycyny (PSN) (Gibco BRL), a następnie delikatne przepuszczenie komórki filtr do sitka komórek (Falcon, VWR Seattle, WA). Krew obwodową (200 ml) zbierano w probówkach z heparyną i rozcieńczano do 10 ml stosując HBSS zawierający 10 jednostek heparyny/ml. Erytrocyty usuwano ze preparatów śledziony i krwi obwodowej przez lizę hipotoniczną. Zawiesiny komórkowe szpiku kostnego uzyskiwano przez wypłukanie szpiku z kości udowych za pomocą lodowatej pożywki hodowlanej. Komórki zliczano i testowano pod względem żywotności przy użyciu błękitu trypanowego (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Komórki zawieszano ponownie w barwiących pożywkach z lodem (HBSS, 1% płodowa surowica bydlęca, 0,1% azydek sodu) o stężeniu wynoszącym dziesięć milionów na mililtr. Blokowanie receptora Fc i niespecyficzne wiązanie przeciwciała z komórkami uzyskiwano przez dodanie do zawiesiny komórkowej 10% prawidłowej koziej surowicy i Fc Block (Pharmingen, La Jolla, CA).

Zawiesiny komórkowe mieszano z równymi objętościami znakowanego fluorochromem przeciwciała monoklonalnego (PharMingen), inkubowano na lodzie przez 60 minut, a następnie przemywano dwukrotnie lodowatym buforem do przemywania (PBS, 1% płodowa surowica bydlęca, 0,1% azydek sodu), a następnie ponownie zawieszano w 400 ml buforu do przemywania zawierającego 1 mg/ml 7-AAD (Molecular Probes, Eugen, OR) jako markera żywotności w niektórych próbkach. Dane przepływu uzyskiwano na cytometrze przepływowym FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Zarówno zbiór, jak i analizę, przeprowadzano przy użyciu oprogramowania CellQuest (BD Immunocytometry Systems).

Zwierzęta transgeniczne, które wykazywały ekspresję ludzkiego lub mysiego liganda zalpha11 na największym poziomie, miały dramatycznie powiększoną populację komórek w analizowanych narządach limfatycznych. Wydoczne zmiany obejmowały całkowitą utratę komórek grasicy, całkowity brak komórek B pozytywnych pod względem CD45R i powiększenie rozmiaru i ilości komórek śledziony. Zarówno śledziona, jak i szpik kostny, wykazywały zwiększoną liczbę powiększonych komórek szpiku, wskutek przez wzrostu zarówno monocytów, jak i neutrofili. Ilość markera komórek NK (DX5) była zwiększona w wielu populacjach. Myszy o średniej ekspresji miały mniej dramatyczne, lecz nadal istotne zmiany zgodne z fenotypem widocznym u myszy o dużej ekspresji. Myszy o najniższym poziomie ekspresji nie miały ani istotnego wzrostu komórek szpikowych, ani zmniejszonej liczby komórek B. Nie wykazywały istotnych zmian w populacji tymocytów ze zmniejszeniem podwójnie pozytywnych komórek CD4 + CD8 + i zwiększeniem pojedynczo pozytywnych komórek CD4 i CD8.

P r z y k ł a d 37

Oczyszczone rekombinowane ludzkie białko liganda zalpha11

Badanie zależności od dawki u myszy normalnych

A. Omówienie

Prawidłowe sześciotygodniowe samce myszy C57B1/6 (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN), traktowano przez iniekcję dootrzewnową raz dziennie albo przez cztery albo osiem dni jedną lub czterema dawkami oczyszczonego rekombinowanego ludzkiego liganda zalpha11 (przykład 24) w ilości 0,1, 0,5, 5 lub 50 pg/mysz/dzień lub nośnikiem jako kontrolą. Ciężar ciała i temperaturę ciała monitorowano codziennie. Dnia czwartego lub dnia dziewiątego, cztery z ośmiu myszy z każdej grupy traktowanej białkiem i pięć z dziesięciu myszy z grupy kontrolnej traktowanej nośnikiem uśmiercano.

PL 207 350 B1

Zbierano krew, szpik kostny oraz tkanki i analizowano. Badano potencjalne zakłócenia w tkankach limfoidalnych, jak również ogólnie parametry fizjologiczne i toksykologiczne.

Nie było dowodów na toksyczność białka ludzkiego liganda zalpha11 przy żadnej testowanej dawce. Ciężar i temperatura ciała pozostawały niezmienione. Nie było widocznych zmian w klinicznych parametrach chemicznych. Stwierdzono jednak spójne skutki odnoszące się do zwiększenia procentu komórek linii mieloidowej w szpiku kostnym, śledzionie i krwi obwodowej u myszy traktowanych najwyższymi dawkami liganda zalpha11 w porównaniu z kontrolami traktowanymi nośnikiem. Stwierdzono statystycznie istotny wzrost wielkości komórek linii mieloidowej określony metodą cytometrii przepływowej homogenatu śledziony, w grupie o najwyższej dawce. Śledziony z dwóch grup o najwyższych dawkach były statystycznie istotnie większe niż w innych grupach. Jednak podczas badania histopatologicznego widoczny był tylko minimalny wzrost krwiotworzenia pozaszpikowego w grupie z najwyższą dawką. Występował statystycznie istotny wzrost stosunku mieloidu do erytroidu w szpiku kostnym w grupie o najwyższej dawce, w porównaniu z innymi grupami.

Stwierdzono wreszcie, wzrosty widoczne dla krwi obwodowej, jeśli chodzi o całkowitą liczbę białych krwinek i procent monocytów w tej samej grupie.

B. Otrzywywanie roztworu do dawkowania

Oczyszczony rekombinowany ludzki ligand zalpha11 (przykład 24) rozcieńczano do jałowego roztworu soli buforowanego fosforanem (GibcoBRL, Grand Island, NY) w takich stężeniach, aby dostarczyć 50, 5, 0,5 lub 0,1 mikrogramów białka w 0,1 ml nośnika PBS. Dawki dla pierwszych czterech dni przygotowywano w dniu 0 i zamrażano w zamrażarce w temperaturze -20°C przed użyciem. Dawki dla dni od piątego do ósmego przygotowywano w dniu piątym i zamrażano jak powyżej. Równe części tego samego PBS zamrażano podobnie dla grupy kontrolnej traktowanej nośnikiem. W dniu podawania odpowiednie ilości roztapiano i 0,1 ml roztworu wstrzykiwano dootrzewnowe myszom każdego dnia, przez cztery lub osiem dni.

C. Plan badań

Myszy miały sześć tygodni na początku badania. Każda grupa traktowania obejmowała osiem myszy, z wyjątkiem grupy kontrolnej traktowanej nośnikiem, która obejmowała dziesięć myszy. Jedną połowę myszy w każdej grupie traktowania uśmiercano po czterech dniach traktowania, a drugą połowę po ośmiu dniach.

Przed traktowaniem każdego dnia każdą mysz ważono i zapisywano jej temperaturę ciała, przy użyciu Portable Programmable Notebook System (BMDS, Inc, Maywood, NJ), skanując numer identyfikacyjny i temperaturę ciała myszy na podstawie wskazań urządzeń przekaźnikowych wszczepionych podskórnie (IPTT-100, BMDS, Maywood, NJ).

Przy uśmiercaniu pobierano tkanki w celu oszacowania populacji krwinek białych mrtodę cytometrii przepływowej, która obejmowała szpik kostny, grasicę i śledzionę. Analizę FACS narządów limfoidowych i szpiku kostnego przeprowadzano z użyciem FACSCalibur, (Becton Dickinson, Mansfield, MA). Tkanki pobierane do badania histologicznego pod względem oznak toksyczności białka obejmowały: śledzionę, grasicę, wątrobę, nerkę, nadnercze, serce i płuco. Wszystkie tkanki utrwalone do histologii utrzymywano w temperaturze 4°C przez noc w 10% buforowanym roztworze soli fizjologicznej (NBF) (Surgipath, Richmond, IL). Następnego dnia NBF zastępowano 70% etanolem i tkanki ponownie utrzymywano w temperaturze 4°C do czasu opracowywania histologicznego.

Tkanki opracowywano i barwiono w pracowni hemotoksyliną i eozyną, a następnie wysyłano do współpracującego patologa, do analizy histopatologicznej. Krew zbierano do analizy pełnej morfologii krwi (CBC) i profili parametrów chemicznych surowicy. CBC analizowano we własnym laboratorium z użyciem analizatora hematologicznego Cell Dyn 3500 (Abbott Diagnostics Division, Abbott Park, IL) zaś ręczne zliczenia różnicujących białych krwinek analizowano w Phoenix Central Laboratory (Everett, WA). Surowice utrzymywano zamrożone w temperaturze -20°C do przekazania w Phoenix Central Laboratory do pełnego określenia paramatrów chemicznych i surowicy. Aby oszacować stosunki mieloid:erytroid, szpik kostny z kości udowej nałożono na szkiełka CytoSpin (CYTOSPIN 3 CYTOCENTRIFUGE i CYTO SLIDES, Shandon, Pittsburgh,PA) i wysłano do Phoenix Central Laboratories do analizy.

D. Wyniki badań

Nie było widocznych klinicznych wskaźników wpływu fizjologicznego lub toksyczności ludzkiego liganda zalpha11 w dawkach wynoszących 50 μg/dzień lub niższych. Ciężar ciała i temperatura pozostawały prawidłowe w czasie trwania traktowania. Parametry chemiczne surowicy mieściły się w nor76

PL 207 350 B1 mainych zakresach. Ziiczenia krwinek czerwonych i płytek wygiądały prawidłowo. U myszy otrzymujących 50 pg/dziennie przez 8 dni ręczne ziiczenia krwinek białych wykazywały, że procent monocytów wzrósł w krwi obwodowej oraz widoczny był wzrost całkowitej iiczby białych krwinek. W szpiku kostnym wypłukiwanym z kości udowej stosunek mieioidu do erytroidu był zwiększony w grupie o dawce 50 pg i w mniejszym stopniu w grupie z dawką 5 pq ze zbioru dawek ośmiodniowych. W nieparamterycznym porównaniu wieiokoiumnowym przy użyciu InStat (InStat MAC; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), różnica ta była statystycznie istotna (p = 0,0049). Różnica między grupą o najwyższej dawce i z nośnikiem była także istotna (p = 0,0286). Zwiększona iiczba białych krwinek w krwi obwodowej i istotny wzrost prekursorów mieioidu w szpiku, może być w związku z tym także powiązany.

Ocena histoiogiczna następujących tkanek wykazywała brak zmian cytoiogicznych iub strukturainych, procesów mitotycznych iub martwicy: grasica, wątroba, nerka, nadnercze, dwunastnica, trzustka, jelito czcze, kątnica, okrężnica, krezkowe węzły chłonne, macica, jajnik, śiinianka, serce, tchawica, płuco i mózg. Nie było widocznych różnic między grupami traktowanymi pod wzgiędem ciężaru grasicy, nerki, wątroby iub mózgu. We wszystkich badanych tkankach jedynie ciężar śiedziony był znacznie zmieniony.

Ciężar każdej śiedziony mysiej normaiizowano do ciężaru jej mózgu. W grupie traktowanej dawką 50 pg/dziennie w porównaniu z nośnikiem oraz grupami traktowanymi 0,1 pg i 0,5 pg, średnia ciężaru śiedziony była biisko 50% większa po czterech dniach traktowania i prawie 100% większa po ośmiu dniach niż średni ciężar śiedziony pozostałych trzech grup. W zbiorze czterodniowym grupa, której podawano 5 pg/dziennie, także miała tendencję do zwiększania śiedziony w stosunku do grupy kontroinej i o niskiej dawce. Różnica w ciężarze śiedziony/mózgu na podstawie danych z czterodniowego i ośmiodniowego zbioru w zaieżności od grupy traktowanej, była statystycznie istotna (p = 0,0072) w nieparametrycznym teście porównania z wieiokrotnymi koiumnami Kruskaii-Wallace ANOVA, przy użyciu programu InStat (GraphPad Software).

Marginalny wzrost krwiotworzenia pozaszpikowego, zwłaszcza w miazdze czerwonej, był widoczny w śiedzionach myszy z grupy o najwyższej dawce, nawet u myszy traktowanych cztery dni. Anaiiza metodę cytometii przepływowej śiedziony wykazywała istotny wzrost proporcji wieikości komórek mieloidu w grupie o najwyższej dawce (p = 0,01, test t - Studenta) świadczący o wzroście iiczby zarówno monocytów, jak i neutrofiii. Wpływ ten może być związany ze zwiększeniem procentu komórek jednojądrzastych we krwi obwodowej, jak również widocznym zwiększeniem prekursorów mieioidu w szpiku kostnym, opisanych powyżej. Ponadto myszy transgeniczne z insercją iudzkiego genu zalpha11, wykazywały zwiększone krwiotworzenie pozaszpikowe w śiedzionach, w porównaniu z młodymi osobnikami nietransgenicznymi.

Kilka zmian obserwowano w grupie dawki 50 pq na dzień, w porównaniu z grupą kontroiną, które świadczą o związku iiganda zalpha11 z wytwarzaniem iub rozwojem komórek iinii mieioidowej. Obserwowane zmiany sugerują łącznie, że zalpha11 może być użyteczny jako białko terapeutyczne w takich dziedzinach medycyny jak rak i schorzenia immunologiczne opisane w niniejszym dokumencie.

P r z y k ł a d 38

Wstępna eiiminacja i badanie dystrybucji tkankowej oczyszczonego rekombinowanego białka ludzkiego liganda zalpha11

A. Omówienie

W celu okreśiania schematów dystrybucji tkankowej i eiiminacji oczyszczonego iiganda rhzalpha11 przeprowadzono wstępne badanie farmakokinetyczne. Dziewięciotygodniowym samicom myszy C57B1/6 podawano oczyszczone rekombinowane iudzkie białko iiganda zalpha11 znakowane indem (In) (NEN, Boston, MA) jedną z trzech dróg. Pojedynczą iniekcję w boiusie podawano każdej myszy dożyinie (IV), dootrzewnowe (IP) aibo poskórnie (SC). Myszy, którym białko wstrzyknięto aibo poskórnie iub dootrzewnowe, uśmiercano po dziesięciu minutach albo jednej godzinie po iniekcji. Krew, osocze i wybrane tkanki pobierano w różnym czasie i ziiczano w iiczniku promieniowania gamma, aby oszacować przybiiżony okres półtrwania i dystrybucję tkankową egzogenicznego znakowanego białka. Tkanki, które pobierano do ziiczania, jak również przedziały uśmiercania, dobierano na podstawie doniesień o dystrybucji innych cytokin znakowanych radionuklidami.

Przy uśmiercaniu tkanki pobierane do ziiczania radioaktywności obejmowały grasicę, śiedzionę, nerkę, płat wątroby, płat płuca i pęcherz moczowy. W grupie otrzymującej iniekcję dootrzewnową ziiczano także jeiito, aby oszacować występowanie iniekcji do jeiita, zaś u myszy z iniekcją podskórną, ziiczano skórę wraz z strukturami głębszymi w obszarze iniekcji, cpm dia całej wątroby i płuca obiiczano z wycinków, którą ziiczano i procentu ciężaru całego narządu reprezentowanego przez wycinek.

PL 207 350 B1

Po zakończeniu badania pobrane tkanki, krew pełna i osocze, zliczano na liczniku promieniowania gamma COBRA II AUTO-GAMMA (Packard Instrument Company, Meriden, CT). Pewną ilość oryginalnie znakowanego roztworu do dawkowania zliczano także na końcu badania wraz z tkankami. Pozwoliło to obliczyć procent całkowitej wstrzykniętej radioaktywności dla każdej myszy i równoczesną korekcję wszystkich zliczeń względem spadku radioaktywności. Szacunki pozostałej objętości krwi i ciężaru narządów wskazywały, że większość zliczeń była rozsądną reprezentacją dystrybucji zliczeń po podaniu znakowanego liganda zalpha11 każdą z dróg.

B. Znakowanie indem^(-111) liganda zalpha11

Oczyszczony rekombinowany ludzki ligand zalpha11 (przykład 29) sprzęgano z 10-krotnym molowym nadmiarem DTPA (Peirce, Rockford, IL) przez inkubację przez 30 minut w temperaturze pokojowej w PBS. Nieprzereagowany DTPA i hydrolizaty usuwano przez wymianę buforu na Biomax-5k NMWL (Ultrafree-15, Millipore, Bedford, MA). Pik białka objętości pustej zatężano do 5 mg/ml i jednakową objętość wykorzystano do testowania w bioteście (stymulacja anty-CD40 mysich komórek B (przykład 44)).

Po potwierdzeniu, że koniugat DTPA nadal miał pełną aktywność biologiczną, koniugat roz(-111) cieńczano do 0,5 mg/ml za pomocą 1M octanu sodu o pH 6,0. Dwa MCi indu^(-111) dodawano do 0,5 ml 1M octanu sodu o pH 6,0 i mieszano z DTPA-ludzkim ligandem zalpha11 przez 30 minut, w temperaturze pokojowej.

Niewchłonięty ind^(-111) usuwano podczas wymiany buforu na PBS na kolumnie PD-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Radioznakowany materiał rozcieńczano z nie znakowanym ludzkim ligandem zalpha11 uzyskując aktywność właściwą 100 mCi/mg, filtrowano z wyjaławianiem i przechowywano w temperaturze 4°C przez noc. Sto procent znakowanego białka utrzymywano na błonie Biomax-5k NMWL (Millipore).

Znakowany indem^(-111) ludzki ligand zalpha11 podawano myszom w badaniach eliminacji i farmakokinetyki. Pięćdziesiąt pq ludzkiego białka liganda zalpha11 znakowanego 5 plCi znakowanego ludzkiego liganda zalpha11 w 0,1 ml nośnika PBS podawano każdemu zwierzęciu.

C. Wyniki wstępnego badania dystrybucji

Po jednej i trzech godzinach po podaniu wszystkimi trzema drogami najwyższe stężenie ludzkiego liganda zalpha11 znakowanego ¹¹¹In stwierdzono w nerce, zaś drugie w kolejności stwierdzono w moczu i pęcherzu moczowym, czego dowodziły najwyższe cpm tych tkanek. Średnie zliczenie z nerek było 3 do 8 razy wyższe niż całe zliczenie wątroby, w zależności od drogi iniekcji i punktu czasowego uśmiercenia. Przykładowo średnie cpm nerki w 50 minut po iniekcji IV było 4,5 razy większe niż średnie zliczenie obliczone dla całej wątroby z tej samej grupy. W grupie, którą uśmiercono dziesięć minut po podaniu dożylnym, najwyższe cpm było także w nerce, zaś drugie w kolejności nagromadzenie było równoważne w wątrobie, pęcherzu moczowym i moczu.

D. Wstępne badanie farmakokinetyczne

Pobierano krew i osocze 10, 30 i 60 minut po iniekcji wszystkimi trzema drogami. Po iniekcji IV, u oddzielnego zbiory myszy pobrano próbki krwi i osocza po dwóch, pięciu i dziesięciu minutach. U innego zbioru myszy, które otrzymywały iniekcje IP lub SC, krew pobrano po jednej, dwóch i trzech godzinach. Grupy traktowania, patrz tablica 6. Krótkie czasy pobierania precyzyjnie określają opisywany okres półtrwania IL-2 po iniekcji dożylnej. Określony T1/2 był rzędu 2,5 do 5,1 minut. Informacje o podawaniu in vivo IL-2, patrz Donohue J. H. i Rosenberg S. A., J. Immunol., 130: 2203, 1983. Długie czasy wyrano w celu dostosowania do przewidywanej fazy eliminacji.

T a b l i c a 6

Droga iniekcji	Czas krwawienia (minuty)	Czas uśmiercenia
Grupa dożylna 1	2, 5, 10	10 minut
Grupa dożylna 2	10, 30, 60	60 minut
Grupa dootrzewnowa 1	10, 30, 60	60 minut
Grupa dootrzewnowa 2	60, 120, 180	180 minut
Grupa podskórna 1	10, 30, 60	60 minut
Grupa podskórna 2	60, 120, 180	180 minut

PL 207 350 B1

Jak się okazało, nie znakowana IL-2 jest eliminowana z surowicy przy okresie półtrwania wynoszącym około trzy minuty u myszy po iniekcji IV. Literatura - patrz Donahue, J. H. i Rosenburg, jak wyżej. Po iniekcji IP i SC podobnej iiości IL-2, utrzymywanie się aktywności IL-2 w surowicy wydłużyłoby się z 2 jednostek/mi przez poniżej 30 minut po iniekcji IV, do ponad 2 jednostek/mi przez 2 godziny po IP i 6 godzin po iniekcji SC. Główną drogą kiirensu IL-2 jest, jak się okazuje, nerka. Jak się okazało iigand zalpha11 jest strukturalnie podobny do IL-2, co omówiono w niniejszym dokumencie. Wstępna ocena eiiminacji iiganda zalpha11 jest, jak się okazuje, zgodna z kiirensem pozornym IL-2 przez nerki, na podstawie akumuiacji cpm przede wszystkim w nerkach, następnie w pęcherzu moczowym i moczu, w niniejszym badaniu.

Wykonywano szacunki parametrów farmako-kinetycznych na podstawie bezprzedziałowej anaiizy danych cpm otrzymanych z osocza, przy użyciu programu do anaiizy PK WinNonLin, Version 1.1. (Scientific Consuiting Inc., Gary. NC). Okresy półtrwania w osoczu iiganda zalpha11 szacowano przy użyciu przewidywanych stałych szybkości eiiminacji końcowej dia podawania dożyinego, podskórnego i dootrzewnowego dawki 50 pg. Wyniki farmakokinetyczne były szacunkami wskutek ograniczonej iiczby danych w regionie końcowej eiiminacji stężenia w osoczu w profilach czasowych. Ponadto dopasowanie fazy eiiminacji końcowej dia dawkowania SC i IP wymagało wykorzystywania danych

111 z punktów czasowych, w czasie których absorpcja ¹¹¹In-ludzkiego liganda zalpha11 była widocznie wciąż obecna. Jednakże oszacowanie okresów półtrwania po podaniu dożyinym, podskórnym i dootrzewnowym wynosiło odpowiednio 13,6 minuty, 18,8 minuty i 34,2 minuty. Ponieważ zakres dawkowania nie był oceniany, nie wiadomo było, czy zachodziła eiiminacja nasycaina czy aktywna (kinetyka Michaelisa-Menten). Zatem te obiiczenia okresu półtrwania były szacunkowe.

Wykonywano szacunki dostępności bioiogicznej znakowanego białka, na podstawie obszaru pod krzywą (AUC), po podaniu podskórnym iub dootrzewnowym, w porównaniu z podaniem dożylnym. Szacowana dostępność bioiogicznapo iniekcji podskórnej i dootrzewnowej wynosiła odpowiednio 35,8% i 63,9%. Ponieważ badano tyiko jedną dawkę białka, dostępność bioiogiczna nie była oceniana jako funkcja dawki. Szacowany kiirens i objętość dystrybucji (na podstawie danych z iniekcji dożyinej), wynosiła odpowiednio 0,48 mi/minutę i 6,1 mi.

Mimo, że dane są wstępne, zachowanie iiganda zalpha11 podawanego IV było podobne do opisywanego dla IL-2, innej cytokiny o wiązce czterecheiis (Donahue, J. H. i Rosenburg, S. A., jak wyżej). Podobnie jak IL-2, ligand zalpha11 podawany IV miał okres półtrwania w osoczu wynoszący tyiko minuty, z głównym kiirensem w nerce. Trzy godziny po iniekcji większość znakowanego materiału ekstrahowana z nerki była nadai zatrzymywana w błonie Biomax 5K NMLW (Miiiipore). Ponieważ wcześniej donoszono, że ind pozostaje związany z białkiem nawet podczas rozkładu iizosomowego (Staud, F. i inni, J. Pharm. Sciences 88: 577-585, 1999) ligand zalpha11 akumuiuje się i może być rozkładany w nerce. Badanie to wykazało także, co obserwowano dia wieiu innych białek, w tym IL-2 (Donahue, J. H. i Rosenburg, S. A., jak wyżej), że podawanie IP i SC znacznie przedłużało iiość iiganda zalpha11 w osoczu.

P r z y k ł a d 39

Izoiacja i ekspansja frakcji CD34+ MNC świeżego iudzkiego szpiku kostnego przy użyciu iiganda zalpha11 w ceiu oszacowania aktywności NK

A. Seiekcja i izoiacja komórek CD34+ z iudzkiego szpiku kostnego

Komórki jednojądrzaste ze świeżego iudzkiego szpiku kostnego (MNC) otrzymano w ceiu wzbogacenia pod wzgiędem komórek mających aktywność komórki NK. Świeże iudzkie MNC otrzymywano z Poeitic Technologies (Gaithersburg, MD). 10 ml alfa MEM (JRII, Lenexa, K.S) zawierających 10% HIA FBS (Hyklon, Logan, UT) i antybiotyk 1% PSN (Gibco, BRL, Grand Island, NY) dodawano do zawiesiny komórkowej i komórki przepuszczano przez sito o wieikości 100 pm. Komórki następnie ziiczano, odwirowywano, przemywano 10 mi PBS zawierającym 2% FBS, następnie odwirowywano ponownie i ponownie zawieszano w 1 mi PBS zawierającym 2% FBS. Komórki mające marker CD34 na powierzchni (komórki CD34+) oddzieiano magnetycznie przy użyciu zestawu Detachabcad z Dynabeads M-450 CD34 ((Dynai, Osio, Norwegia), zgodnie z instrukcjami producenta. Zarówno frakcje komórek CD34+, jak i komórek CD34-dodatkowo anaiizowano poniżej.

B. Ekspansja komórek CD34+ przy użyciu iiganda zalpha11

Frakcję komórek CD34+ wysiewano do czterech studzienek w 24-studzienkowej płytce. 50000 pozytywnie seiekcjonowanych komórek zawieszano w 1 mi Aipha MEM (JRH) zawierającym 10% HIA

FBS (Hykion) i 1% PSN (Gibco/BRL), wraz z różnymi cytokinami opisanymi poniżej i wysiewano w każdej z 4 studzienek (1-4). Różne odczynniki stosowano do testowania pod wzgiędem ekspansji

PL 207 350 B1 indukowanej ligandem zalpha11 selekcjonowanych CD34+ MNC szpiku kostnego: odczynniki obejmowały ludzki flt3 (R & D, Minneapolis, MN); oczyszczony ludzki ligand zalpha11 (przykład 30C i przykład 30D); ludzki IL-15 (R & D). Odczynniki łączono następująco w dniu 0: w studzience # 1 dodawano 2 ng/ml ludzkiego flt3, w studzience # 2 dodawano 2 ng/ml ludzkiego flt3 i 15 ng/ml oczyszczonego ludzkiego liganda zalpha11. W studzience # 3 dodawano 2 ng/ml ludzkiego flt3 i 20 ng/ml ludzkiego IL15. W studzience # 4 dodawano 2 ng/ml ludzkiego flt3, 15 ng/ml oczyszczonego ludzkiego liganda zalpha11 i 20 ng/ml ludzkiego IL15. Po inkubacji przez 18 dni zawiesinę komórek z każdej studzienki odwirowywano, a następnie ponownie zawieszano w 0,5 ml alpha MEM (JRH) zawierającym 10% HIA FBS (Hyklon) i 1% PSN (Gibco/BRL) i zliczano w celu oszacowania proliferacji frakcji komórek CD34+. Niski poziom proliferacji był widoczny w obecności samego flt3 (studzienka kontrolna # 1), lecz obecność IL-15 lub zalpha11 oprócz flt3 nie miała znaczącego wpływu na ekspansję (studzienki # 2 i # 3). Jednak ekspansja poza kontrolę flt3 była ewidentna w studzience # 4, która zawierała IL-15 i ligand zalpha11 oprócz flt3. Wynik ten sugerował, że zalpha11 i IL-15 działają w synergii w celu ekspansji populacji ludzkich komórek CD34+. Ponadto wyniki tego doświadczenia potw ierdzały wyniki obserwowane dla mysiego liganda zalpha11 w teście mysiego BM (przykład 21).

Całą populacje komórkową testowano następnie pod względem aktywności NK i poddawano analizie metodą cytometrii przepływowej, jak pokazano poniżej (przykład 41).

C. Ekspansja komórek CD34+ lub CD34- przy użyciu liganda zalpha11 z opóźnionym dodawaniem IL-15

Zarówno frakcje pozytywne, jak i negatywne CD34 (CD34-) wysiewano oddzielnie do sześciu studzienek 12-studzienkowej płytki (1-6). Każda z sześciu studzienek zawierała 100000 pozytywnie lub negatywnie selekcjonowanych komórek w 2 ml alpha MEM zawierającym 10% HIA FBS i PSN, opisanym powyżej. Stosowane odczynniki były takie, jak opisano powyżej. W studzience # 1 dodawano 2 ng/ml ludzkiego flt3 w dniu 0. W studzience # 2 dodawano 2 ng/ml ludzkiego flt3 w dniu 0 i po 5 dniach inkubacji dodawano 20 ng/ml ludzkiej IL15. W studzience # 3 dodawano 2 ng/ml ludzkiego flt3 i 15 ng/ml ludzkiego liganda zalpha11 w dniu 0. W studzience # 4 dodawano 2 ng/ml ludzkiego flt3 i 15 ng/ml ludzkiego liganda zalpha11 w dniu 0 i po 5 dniach inkubacji dodawano 20 ng/ml ludzkiej IL15. W studzience # 5 dodawano 2 ng/ml ludzkiego flt3 i 20 ng/ml ludzkiego IL15 w dniu 0. W studzience # 6 dodawano 2 ng/ml ludzkiego flt3, 15 ng/ml ludzkiego liganda zalpha11 i 20 ng/ml ludzkiej IL15 w dniu 0. Po inkubacji przez całe 15 dni od początku doświadczenia komórki z każdej studzienki zbierano i zliczano.

W populacji CD34+ widoczny był niski poziom proliferacji w obecności samego flt3 (studzienka kontrolna # 1), lecz obecność lL-15 lub zalpha11 dodawanych w dniu 0 oprócz flt3 nie miała istotnego wpływu na ekspansję (studzienki # 3 i #5). Dodanie IL-15 po 5 dniach miało pewien wpływ proliferacyjny w porównaniu z kontrolą flt3 (studzienka # 2 w porównaniu ze studzienką # 1) i wpływ proliferacyjny w obecności zalpha11 (studzienka # 4 w porównaniu ze studzienką # 3). Jednak największa ekspansja była widoczna w studzience #6, która zawierała IL-15 i ligand zalpha11 oprócz flt3 w dniu 0.

W populacji CD34- nie było widać proliferacji w obecności samego flt3 (studzienka kontrolna # 1) i wyraźne było rzeczywiste zmniejszenie populacji komórek. Obecność zalpha11 dodawanego w dniu 0 oprócz flt3 (studzienka # 3) była podobna do kontroli flt3. Obecność IL-15 dodawanej w dniu 5 zwiększała efekt proliferacyjny komórek w obecności (studzienka # 4) lub braku (studzienka # 2) liganda zalpha11. Ponownie największa ekspansja była widoczna w studzience # 6, która zawierała IL-15 i ligand zalpha11 oprócz flt3 w dniu 0.

Całą populację komórek następnie testowano pod względem aktywności NK i poddawano analizie FACS, co pokazano poniżej (przykład 41).

P r z y k ł a d 40

Izolacja i ekspansja świeżych mysich komórek przy użyciu ludzkiego i mysiego liganda zalpha11 w celu oszacowania aktywności NK i markerów komórkowych NK

A. Izolacja i ekspansja świeżych mysich komórek szpiku kostnego o niskiej gęstości, przy użyciu ludzkiego i mysiego liganda zalpha11

Świeże mysie komórki szpiku izolowano przez obcięcie obu końców kości udowej myszy i wypłukanie dwoma do trzech mililitrów pożywki wzrostowej (patrz poniżej) przez wnętrze kości do probówki zbiorczej. Pożywką wzrostową było 500 ml RPMI 1640 Medium (JRH Biosciences, Lenexa, KS); 5 ml 100 x L-glutaminy (Gibco BRL. Grand Island, NY); 5 ml 100 x pirogronianu sodu (Gibco BRL); 5 ml 100 x penicyliny, streptomycyny, neomycyny (PSN) (Gibco BRL) i 50 ml inaktywowanej wysoką temperaturą bydlęcej surowicy płodej (FBS) (Hyklon Laboratories, Logan, UT). Wywołano następnie

PL 207 350 B1 rozpad komórek szpikowych przez kilkakrotne pipetowanie pożywek w górę i w dół. Następnie komórki odwirowywano, przemywano raz pożywką wzrostową i przepuszczano przez 70-mikronowe sito. Komórki jednojądrzaste o niskiej gęstości izolowano następnie przez poddanie komórek szpikowych działaniu gradientu gęstości. Komórki szpiku w pięciu do ośmiu mililitrach pożywki wzrostowej pipetowano ostrożnie na wierzch pięciu do ośmiu milimetrów NycoPrep 1,077 Animal (Nycomed, Oslo, Norwegia) w probówce wirówkowej. Następnie gradient ten wirowano przy 600 x g przez 20 minut. Komórki jednojądrzaste o niskiej gęstości zbierano z warstwy międzyfazowej między NycoPrep i pożywką. Komórki te rozcieńczono następnie do około 20 miliłitrów w pożywce wzrostowej, odwirowano i przemywano. Następnie komórki wysiewano w ilości około 0,5-1,5 x 10⁶ komórek na mililitr w pożywce wzrostowej, w standardowej kolbie do hodowli tkankowej i inkubowano w temperaturze 37°C 5%, CO2 przez dwie godziny.

Nieprzylegające komórki szpikowe o niskiej gęstości (NA LD) zbierano potem i wysiewano w ilości 0,5-1,5 x 10⁶ komórek na mililitr wraz z 2,5 nanogramami na mililitr mysiego flt3 (R and D Systems, Minneapolis, MN) oraz 25 do 50 nanogramami na mililitr ludzkiej interleukiny 15 (IL-15) (R and D Systems) z 50 do 150 nanogramami na mililitr ludzkiego liganda zalpha11 lub bez; albo z 0,12 do 10 nanogramami na mililitr mysiego liganda zalpha11 lub bez.

Nie było istotnej ekspansji bez dodania ludzkiego lub mysiego liganda zalpha11. Nieprzylegające komórki rozprzestrzeniały się w hodowlach zawierających mysi ligand zalpha11 w ilości zaledwie 0,12 ng/ml i w hodowlach zawierających ludzki ligand zalpha11 w ilości zaledwie 22 ng/ml. W hodowlach, zawierających zarówno ludzki jak i mysi ligand zalpha11, ekspansja nie przylegających komórek zwiększała się wraz ze zwiększaniem dawki liganda zalpha11, przy odpowiedzi nasycającej mysiego liganda w ilości około 5-10 ng/ml i ludzkiego, nie osiągającego odpowiedzi nasycającej nawet przy najwyższej dawce wynoszącej 200 ng/ml. Ludzki ligand zalpha11 okazał się około 20- do 100-krotnie słabszy w przypadku komórek mysich niż mysi ligand zalpha11. Po około pięciu do dziesięciu dniach rozprzestrzenione mysie komórki liganda zalphal zbierano i analizowano metodą cytometrii przepływowej (FACSCalibur; Becton Dickinson, Mansfield, MA), aby określić, jaki procent z nich był pozytywny pod względem antygenów komórek NK, przy czym 46% było pozytywnych dla markera komórkowego PahNK DX5 (Pharmingen).

B. Izolacja i ekspansja świeżych mysich komórek szpiku o zmniejszonej linii

Świeże mysie komórki szpiku o zmniejszonej linii (lin^-) izolowano ze świeżych mysich komórek szpiku, najpierw przez inkubację komórek z następującymi przeciwciałami: TER119, Gr-1, B220, MAC-1, CD3e i I-Ab (Pharmingen, San Diego. CA). Komórki lin⁺ następnie usuwano z użyciem owczej antyszczurzej IgG Dynabeads M-450 (Dynal, Lake Success, NY) zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie negatywnie selekcjonowane komórki szpiku lin^- wysiewano jak powyżej w pożywce wzrostowej wraz z 2,5 ng/mL flt3 (R & D Systems) i 25 ng/mL IL-15 (R & D Systems); albo fll3, IL-15 i mysim ligandem zalpha11, 2 do 5% kondycjonowanej pożywki BHK mysiego liganda zalpha11. Po sześciu dniach wzrostu, hodowle zbierano, zliczano i poddawano testowi aktywności komórek NK (przykład 41). Komórki hodowane z mysim ligand zalpha11 były około dwa do trzy razy skuteczniejsze pod względem lizy komórek docelowych dla komórek NK (komórki YAC-1) w stosunku do komórek hodowanych bez liganda zalpha11.

C. Izolacja i ekspansja tym ocytów CD4- CD8-(podwójnie negatywnych, czyli DN)

Świeże mysie tymocyty izolowano przez posiekanie i przesianie grasic od trzy- do ośmiotygodniowych myszy. Następnie komórki CD4- CD8- (DN) poddano negatywnej selekcji przez inkubację tymocytów z przeciwciałami anty-CD4 i anty-CD8 (PharMingen), następnie usunięcie komórek CD4+ CD8+ z użyciem owczej anty-szczurzej IgG Dynabeads M-450 (Dynal) zgodnie z instrukcjami producenta.

Mysie tymocyty DN hodowano następnie w pożywce wzrostowej wraz z 2,5 ng/mL flt3 (R & D Systems), 25 ng/mL IL-15 (R & D Systems) i 10 ng/mL IL-7 (R & D Systems) z mysim ligandem zalpha11 lub bez, jak powyżej. Sześć dni później komórki zbierano, zliczano, analizowano metodą cytometrii przepływowej jak opisano powyżej i także poddawano testowi aktywności komórek NK (przykład 41).

Hodowle prowadzone z mysim ligandem zalpha11 dawały około 480000 komórek, podczas gdy hodowla bez liganda zalpha11 dawała tylko około 160000 komórek. Hodowle prowadzone z mysim ligandem zalpha11 były, jak się okazało, w około 16,2% pozytywne pod względem antygenu komórki NK Pan NK, DX5 (PharMingen). Hodowle prowadzone bez liganda zalpha11 były w 14,6% pozytywne pod względem DX5. Komórki hodowane z ligandem zalpha11 rozkładały komórki docelowe dla komórek NK, YAC-1, około dwa razy lepiej niż komórki hodowane bez liganda zalpha11. Rozprzestrzenione

PL 207 350 B1 komórki nie rozkładaływ większym stopniu przez lizę negatywnej kontrolnej docelowej linii komórkowej, EL4. Te wyniki sugerowały, że ligand zalpha11 selektywnie rozprzestrzenia lityczne komórki NK.

P r z y k ł a d 41

Aktywność rozprzestrzenionych komórek ludzkiego i mysiego liganda zalpha11 oraz dojrzałych komórek NK w teście cytotoksyczności komórek NK

A. Test komórek NK

Docelową cytolizę za pośrednictwem komórek NK badano przez standardowy test uwalniania ⁵¹Cr. Komórki docelowe (komórki K562 (ATCC Nr CCL-243) w ludzkich testach i komórki YAC-1 (ATCC Nr TIB-160) w mysich testach) nie wykazywały ekspresji cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC), czyniąc je wrażliwymi na lizę za pośrednictwem komórek NK.

Negatywną kontrolną docelową linią komórkową w testach mysich jest grasiczak MHC+ EL4 (ATCC Nr TIB-39). Hodowano komórki K562, EL4, i YAC-1 w pożywce RPIO (standardowy RPMI 1640 (Gibco/BRL, Grand Island, NY) uzupełnionej 10% FBS (Hyklon, Logan, UT), jak również 4 mM glutaminy (Gibco/BRL), 100 jednostek międzynarodowych/ml penicyliny + 100 MCG/ml streptomycyny (Gibco/BRL), 50 pM p-merkaptoetanolu (Gibco/BRL) i 10 mM buforu HEPES (Gibco/BRL). W dniu testu 1-2 x 10⁶ docelowych zbierano i ponownie zawieszano w ilości 2,5-5 x 10⁶ komórek/ml w pożywce

RPIO. Dodawano 50-100 pl 5 mCi/ml ⁵¹Cr-chromianu sodu (NEN, Boston, MA) bezpośrednio do komórek i inkubowano je przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, następnie przemywano je dwukrotnie 12 ml PBS i ponownie zawieszano w 2 ml w pożywce RPIO. Po zliczeniu komórek na liczniku krwinek ko54 mórki docelowe rozcieńczono do 0,5-1 x 10⁵ komórek/ml i 100 pl (0,5-1 x 10⁴ komórek) mieszano z komórkami efektorowymi, jak opisano poniżej.

W ludzkich testach komórki efektorowe wytwarzano z selekcjonowanych i rozprzestrzenionych ludzkich komórek CD34+ BM (przykład 39B), które zbierano, przemywano, zliczano, mieszano przy różnych stężeniach ze znakowanymi ⁵¹Cr komórkami docelowymi w 96-studzienkowych płytkach z płaskim dnem i inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Po wspólnej inkubacji komórek efektorowych i znakowanych komórek docelowych, połowę supernatantu z każdej studzienki zbierano i zliczano w liczniku promieniowania gamma (1 min/próbkę). Procent specyficznego uwalniania ⁵¹Cr obliczano ze wzoru 100 x (X-Y) / (Z-Y), gdzie X oznacza uwalnianie ⁵¹Cr w obecności komórek efektorowych, Y oznacza spontaniczne uwalnianie przy braku efektorów, Z oznacza całkowite uwalnianie ⁵¹Cr z komórek docelowych inkubowanych z użyciem 0,5% Triton X-100. Dane nanoszono na wykres jako % specyficznej lizy wobec stosunku efektora do celu w każdej studzience.

B. Aktywność rozprzestrzenionych komórek ludzkiego liganda zalpha11

Izolowane CD34+ ludzkie HPC hodowane z flt3 +/- ligand zalpha11 i flt3 +IL-15 +/- ligand zalpha11 (przykład 39) zbierano w dniu 15, aby oszacować ich zdolność do lizy komórek K562 MHC51 w standardowym teście uwalniania ⁵¹Cr, jaki opisano powyżej i w celu analizy ich fenotypu powierzchniowego metodą cytometrii przepływowej. Jak oczekiwano na podstawie wcześniejszych doniesień (Mrozek, E. i inni, Blood 87: 2632-2640, 1996; i Yu, H i inni, Blood 92: 3647-3657, 1998), równoczesne dodawanie IL-15 i flt3L nie wpływało na wzrost małej populacji komórek CD56. Co interesujące, choć komórki BM hodowane równocześnie z ligandem zalpha11 i flt3L nie rozprzestrzeniały się znacząco, występowało znaczne zwiększenie całkowitej liczby komórek w hodowlach zawierających połączenie flt3L, liganda zalpha11 i IL-15 (patrz przykład 39).

W celu oszacowania fenotypu powierzchniowego z tych ludzkich hodowli BM, barwiono małe objętości komórek do 3-kolorowej analizy metodą cytometrii przepływowej z mAb anty-CD3-FITC, anty-CD56-PE i anty-CD 16-CyChrome (wszystkie od PharMingen, San Diego, CA) i analizowano je na FACSCalibur przy użyciu oprogramowania CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Ta analiza metodą cytometrii przepływowej potwierdzała, że komórki wyrastające z tych hodowli były zróżnicowanymi komórkami NK, ponieważ były duże, ziarninowe i wykazywały ekspresję zarówno CD56, jak i CD 16, i były CD3- (Lanier, L. L., Annu. Rev. Immunol. 16: 359-393, 1998).

Ponadto te komórki wykazywały nacznie wyższą funkcję efektorową niż te komórki takie hodowane z IL-15 i flt3. Dokładniej, komórki hodowane we wszystkich trzech cytokinach rozkładały ponad 40% docelowych K562 przy stosunku efektora do celu (E:T) wynoszącym 1,5, podczas gdy komórki hodowane w IL-15 + flt3L rozkładały mniej niż 5% celów przy E:T wynoszącym 2.

Te dane pokazują, że w połączeniu z IL-15 ligand zalpha11 stymuluje różnicowanie komórek NK z komórek CD34+ BM.

PL 207 350 B1

C. Aktywność rozprzestrzenionych komórek mysiego liganda zalpha11

Aby przetestować wpływ liganda zalpha11 na mysie krwiotwórcze komórki progenitorowe, oczyszczone komórki szpiku kostnego negatywne pod względem linii (Lin-) od myszy C57B1/6 rozprzestrzeniano w fIt3 + IL-15 +/- ligand zalpha11, jak opisano w przykładzie 40B. W dniu 6 hodowli komórki („efektorowe”) zbierano i zliczano, następnie ponownie zawieszano w 0,4 ml pożywki RPIO (przykład 41A).

Dwie objętości (0,15 ml każda) każdej próbki rozprzestrzenianej z ligandem zalpha11 lub bez (przykład 41A) rozcieńczano seryjnie 3-krotnie w dwóch przestrzeniach w 96-studzienkowych płaskodennych płytkach, w 6 studzienkach ogółem po 100 pl każda. Pozostałe 100 pl komórek barwiono pod względem markerów NK na powierzchni komórek z użyciem mAb FITC-anty-2B4 i PE-anty-DX5 (PharMingen) i analizowano metodą cytometrii przepływowej.

Każda grupa komórek poddana ekspozycji wobec flt3 + IL-15 z obecnością liganda zalpha11 lub bez miała podobne frakcje komórek 2B4 + DX5+, w zakresie od 65-75% pozytywnych dla obu markerów NK.

W celu zbadania lizy NK komórki docelowe (YAC-1 i EL4) znakowano ⁵¹Cr, jak opisano powyżej. Po zliczeniu docelowych komórek na liczniku krwinek komórki docelowe rozcieńczano do 0,5-1 x

10⁵ komórek/ml oraz 100 pl YAC-1 lub EL4 (0,5-1 x 10⁴ komórek), zmieszano z 100 pl komórek efektorowych i inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Specyficzną lizę określano dla każdej studzienki, jak opisano powyżej.

Stwierdzono, że komórki hodowane w obecności flt3 + IL-15 + ligand zalpha11 wykazywały wzmożoną aktywność lityczną (około 2-krotnie) przeciwko docelowym YAC-1 (lecz nie zabijały kontrolnej linii komórkowej MHC EL4). Przy stosunku efektora do celu (E:T) wynoszącym 5, komórki NK utworzone w obecności wszystkich 3 cytokin (ligand zalpha11 + fIt3 + IL-15) rozkładały 12% komórek YAC-1, podczas gdy takie komórki NK rozprzestrzenione za pomocą flt3 + IL-15 rozkładały 6% celów YAC-1. Następne doświadczenia potwierdzały ten trend.

W drugiej próbie określenia biologicznej aktywnośści liganda zalpha11 wobec mysich komórkek NK, izolowano niedojrzałe CD4^-CD8^- („podwójnie negatywne”, DN) mysie tymocyty, jak opisano w przykładzie 40C i hodowano je z IL-15 + flt3 + IL-7 lub IL-15 + flt3 + IL-2, z ligandem zalpha11 lub bez. W dniu 6 hodowli komórki zbierano i testowano pod względem aktywności litycznej NK na komórkach YAC-1 i EL4, jak opisano powyżej.

Odkryto, że komórki hodowane w obecności liganda zalpha11 miały największą aktywność lityczną w tym teście, przy wzmożonej aktywności litycznej większej od komórek hodowanych w obecności innych cytokin. Dokładniej, tymocyty DN hodowane z IL-15 + flt3 + lL-7 zabijały 18% komórek YAC-1 przy E:T wynoszącym 24, podczas gdy komórki hodowane w obecności IL-15 + flt3 + IL-7 z ligandem zalpha11 zabijały 48% celów przy takim samym E:T. Tymocyty DN hodowane w IL-15 + + flt3 + IL-2 zabijały 15% celów YAC-1 przy E:T wynoszącym 6, podczas gdy komórki hodowane z tymi trzema cytokinami i ligandem zalpha11 zabijały 35% komórek YAC-1 przy E:T wynoszącym 9.

Na hodowanych komórkach prowadzono cytometrię przepływową jeden dzień przed testem lizy NK. Podobnie jak w przypadku hodowli szpiku kostnego, mimo proliferacyjnego wpływu liganda zalpha11 (liczba komórek zwiększa się około 2-krotnie gdy jest dodawany ligand zalphall), nie zwiększał on istotnie frakcji komórek DX5 (17-20% wszystkich komórek w hodowli z IL-7, i 35-46% wszystkich w hodowli z IL-2).

Dane te wskazują, że ligand zalpha11 w połączeniu z IL-15 i flt3 wzmacnia aktywność lityczną komórek NK wytworzonych z mysiego szpiku kostnego lub grasicy.

D. Aktywność mysiego liganda zalpha11 wobec dojrzałych mysiych komórek NK

W celu przetestowania wpływu mysiego liganda zalpha11 na dojrzałe komórek NK izolowano śledziony od czterech 5-tygodniowych myszy C57B1/6 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) i rozdrabniano je zmatowionymi szkiełkami przykrywkowymi, aby utworzyć zawiesinę komórkową. Czerwone krwinki usuwano przez lizę hipotoniczną w następujący sposób: komórki wirowano i supernatant usuwano przez aspirację. Rozrywano osad przez delikatne mieszanie, następnie dodawano 900 pl jałowej wody z wytrząsaniem, następnie szybko (mniej niż 5 sekund później) 100 pl 10X HBSS (Gibco/BRL).

Komórki następnie ponownie zawieszano w 10 ml 1 x HBSS i cząstki stałe usuwano przez przepuszczenie komórek przez sito komórek z sitkiem nylonowym (Falcon). Śledziony pozbawione komórek RBC następnie odwirowywano, ponownie zawieszano w buforze MACS (PBS + 1% BSA + + 2 mM EDTA) i zliczano. Barwiono 300 x 10⁶ komórek z użyciem powlekanych anty-DX5 kulek maPL 207 350 B1 gnetycznych (Miltenyi Biotec) i pozytywnie selekcjonowano komórki DX5+ NK na kolumnie separacyjnej MACS VS+, zgodnie z instrukcjami producentów, w wyniku czego odzyskano 8,4 x 10⁶ DX5+ komórek i 251 x 10 DX5+ komórek.

Każdą z tych grup komórek hodowano w 24-studzienkowych płytkach (0,67 x 10⁶ komórek/studzienkę, 2 studzienki na jeden zestaw warunków) i w samej pożywce RPIO (przykład 41 A) lub z 1) 30 ng/ml mysiego liganda zalpha11, 2) 30 ng/ml rekombinowanej mysiej IL-2 (R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN), 3) 30 ng/ml rekombinowanej ludzkiej IL-15 (R & D), 4) 30 ng/ml mysiego liganda zalpha11 i hIL-15 lub 5) 30 ng/ml każdej z mIL-2 i hIL-15. Komórki zbierano po 21 godzinach, przemywano i ponownie zawieszano w pożywce RPIO i zliczano. Komórki następnie testowano pod względem zdolności do lizy znakowanych ⁵¹Cr komórek docelowych YAC-1 lub EL4, jak opisano w przykładzie 41 A.

Ogólnie obserwowano małą aktywność komórek NK z grup DX5- (brak komórek NK), lecz komórki DX5- hodowane z ligandem zalpha11 i hIL-15 rozkładały 25% YAC-1 komórek docelowych przy E:T wynoszącym 82. Dla porównania, komórki DX5- hodowane z samą hIL-15 rozkładały 14% celów YAC-1 przy E:T 110. To sugeruje, że ligand zalpha11 i IL-15 działają razem na pozostałych komórkach NK1.1+ NK w tym preparacie komórkowym.

Podobnie jak w przypadku preparatu komórkowego DX5+, traktowanie samym mysim ligandem zalpha11 nie zwiększało istotnie jego funkcji efektorowej (liza komórek YAC-1 była podobna jak w grupie nie traktowanej).

Jak oczekiwano, zarówno IL-2, jak i IL-15 znacznie poprawiały aktywność NK. Jednak najwyższy poziom liz, wykrywano w grupie traktowanej ligandem zalpha11 i hIL-15 (65% lizy komórek YAC-1 przy E:T 3,3, w stosunku do 45% lizy przy E:T 4 dla grupy traktowanej hIL-15). Wyniki sugerują łącznie, że chociaż sam ligand zalpha11 może nie zwiększać aktywności litycznej komórek NK, zwiększa aktywność lityczną NK dojrzałych komórek NK, przy podawaniu z IL-15.

P r z y k ł a d 42

Proliferacja ludzkich i mysich komórek T w obecności liganda zalpha11 w teście proliferacji komórek T

A. Proliferacja mysich komórek T w obecności mysiego liganda zalpha11

Izolowano komórki T od myszy C57B1/6 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) od połączonych splenocytów i limfocytów, z pachowych, ramiennych, pachwinowych, szyjnych i krezkowych węzłów chłonnych (LN). Śledziony rozdrabniano matowymi szkiełkami przykrywkowymi, aby utworzyć zawiesinę komórkową. LN siekano szczypcami i przepuszczano przez sito do komórek, aby usunąć cząstki stałe. Połączone splenocyty i komórki LN rozdzielano do podzbiorów CD8+ i CD4+ przy użyciu dwóch kolejnych magnetycznych kolumn separacyjnych MACS, zgodnie z instrukcjami producentów (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Od tych samych myszy pobierano wszystkie tymocyty.

₃

Komórki hodowano w ilości 3 x 10³ komórek/studzienkę (tymocyty) lub 10 komórek/studzienkę (dojrzałe komórki T) przy wzrastających stężeniach oczyszczonego mysiego liganda zalpha11 (0-30 ng/ml) (przykład 24 i przykład 29) w 96-studzienkowych płaskodennych płytkach wstępnie powlekanych przez noc w temperaturze 4°C z różnymi stężeniami mAb anty-CD3 2C11 (PharMingen) przez 3 dni w temperaturze 37°C. Przeciwciała anty-CD3 służyły do aktywowania mysich komórek T ₃ za pomocą receptora komórki T. Każdą studzienkę poddawano impulsom 1 μφ H-tymidyny w dniu 2, zaś płytki zbierano i zliczano 16 godzin później w celu oszacowania proliferacji.

Podczas testowania liganda zalpha11 w testach proliferacji komórek T, stwierdzono, że kostymuluje on aktywowane przez anty-CD3 mysie tymocyty, prowadząc do przyspieszonego wzrostu komórek CD8+CD4- (większość tymocytów hodowanych z anty-CD3 + ligand zalpha11 było CD8 + CD4do dnia 3 hodowli, podczas gdy komórki hodowane z samym anty-CD3 nie przyczyniały się istotnie do tego fenotypu do dnia 5). Nie obserwowano istotnego poziomu proliferacji tymocytów wobec liganda zalpha11 przy braku anty-CD3.

Co interesujące, gdy testowano dojrzałe obwodowe mysie komórki T pod względem zdolności do odpowiedzi na ligand zalpha11 + anty-CD3, odkryto, że tylko podzbiór CD8-, a nie CD4+, odpowiadał w sposób zależny od dawki na ligand zalpha11. Obserwowano także słabą, lecz powtarzalną proliferację komórek CD (lecz nie CD4-) w odpowiedzi na sam ligand zalpha11. Co interesujące, nie obserwowano tego dla ludzkich komórek T (patrz przykład 42B poniżej).

B. Proliferacja w obecności ludzkiego liganda zalpha11 ludzkich komórek T

Ludzkie komórki T CD4+ i CD8+ izolowano z PBMC, jak opisano w przykładzie 43 (poniżej).

₅

Komórki hodowano w ilości około 10⁵ komórek/studzienkę przy wzrastających stężeniach oczyszczo84

PL 207 350 B1 nego ludzkiego liganda zalpha11 (0-50 ng/ml) (przykład 24), w 96-studzienkowych płaskodennych płytkach wstępnie powlekanych przez noc w temperaturze 4°C zróżnymi stężeniami mAb antyludzkiego CDS UCHTl (PharMingen) przez 3 dni w temperaturze 37°C. Każdą studzienkę poddawano impulsom lplCi H-tymidyny w dniu 2; i płytki zbierano i zliczano 16 godzin później. W przeciwieństwie do wyników z mysimi komórkami T, wstępne dane sugerują, że ludzki ligand zalpha11 kostymuluje ludzkie komórki T CD4+, lecz nie CD8+, w sposób zależny od dawki.

P r z y k ł a d 43

PCR w czasie rzeczywistym wykazuje ekspresję liganda zalpha11 w ludzkich komórkach CD4+

A. Oczyszczone ludzkie komórki T jako pierwotne źródło stosowane w celu oszacowania ekspresji ludzkiego liganda zalpha11

Krew pełną (150 ml) zbierano od zdrowego ludzkiego dawcy i mieszano w stosunku 1:1 z PBS w 50 ml probówkach stożkowych. Po trzydzieści ml rozcieńczonej krwi wprowadzono następnie 15 ml Ficoll Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja). Te gradienty wirowano 30 minut przy 500 g i z zatrzymaniem bez hamowania. Komórki pozbawione RBC z przestrzeni międzyfazowej (PBMC) zbierano i przemywano 3 razy PBS. Wydajność ludzkich PBMC wynosiła 200 x 10⁶ przed selekcją opisaną poniżej.

PBMC zawieszano w 1,5 ml buforu MACS (PBS, 0,5% EDTA, 2 mM EDTA) i 3 x 10⁶ komórek odłożono jako kontrolę RNA i do analizy metodą cytometrii przepływowej. Następnie dodawano 0,25 ml mikrokulek antyludzkiego CDS (Miltenyi Biotec) i mieszaninę inkubowano przez 15 minut w temperaturze 4°C. Komórki znakowane kulkami CDS przemywano 30 ml buforu MACS, a następnie zawieszano w 2 ml buforu MACS.

Przygotowano kolumnę VS+ (Miltenyi) zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie kolumnę VS+ umieszczano w polu magnetycznym VarioMACS (Miltenyi). Kolumnę równoważono 5 ml buforu MACS. Izolowane pierwotne mysie komórki nakładano następnie na kolumnę. Komórki CDS-ujemne pozostawiono do przejścia. Kolumnę przepłukiwano 9 ml (3 x 3 ml) buforu MACS. Kolumnę następnie usuwano z pola magnetycznego i umieszczano w 15 ml probówce falcon, komórki CD8+ wymywano przez dodanie do kolumny 5 ml buforu MACS, a związane komórki wypłukiwano stosując tłoczek dostarczony przez producenta.

Wydajność selekcjonowanych CDS ludzkich obwodowych komórek T wynosiła około 51 x 10⁶ wszystkich komórek. Komórki negatywne pod względem CDS, które przeszły przez kolumnę, zbierano, zliczano, barwiono kulkami powlekanymi antyludzkim CD4, następnie inkubowano i przepuszczano przez nową kolumnę VS+ przy takich samych stężeniach, jak opisano powyżej.

Wydajność selekcjonowanych pod względem CD4+ obwodowych ludzkich komórek T wynosiła 42 x 10⁶ wszystkich komórek.

Próbkę połączonych selekcjonowanych pod względem CD8+ i CD4+ ludzkich komórek T pobierano do barwienia i sortowania na aktywowanym fluoorescencyjnie urządzeniu do sortowania komórek (FACS, aby oszacować ich czystość. Przeciwciała przeciwko ludzkim CD4 sprzężone z PE, przeciwciała przeciw ludzkiemu CD8-FITC i przeciwciała przeciw ludzkiemu CD19-CyChrome (wszystkie firmy PharMingen) stosowano do barwienia selekcjonowanych komórek CD8+ i CD4+.

Komórki selekcjonowane względem CDS w tym pierwszym doświadczeniu były w 80% CD8+, zaś komórki selekcjonowane względem CDA były w 85% CD4+. W 2 kolejnych doświadczeniach (przykład 43B), oczyszczone komórki CD8+ były w 84% i 81% czyste, zaś komórki CD4+ były odpowiednio w 85% i 97% czyste.

W jednym doświadczeniu barwiono nie wiążące (po przepływie) komórki kulkami powlekanymi anty-ludzkim CD19 (Miltenyi) i przepuszczano je przez trzecią kolumnę z kulkami magnetycznymi w celu izoalcji komórek B CD19+ (były one w 92% czyste).

Ludzkie selekcjonowane komórki CD8+, CD4+ i CD19+ aktywowano przez inkubację 0,5 x 10⁶ komórek/ml w RPMI + 5% ludzkie ultra surowicy (Gemini Bioproducts, Calahasas, CA) + PMA 10 ng/ml i jonomycynę 0,5 pg/ml (Calbiochem) przez około 4, 16 lub 24 godzin w temperaturze 37°C. Komórki T (2,5 x 10⁶/studzienkę) były zamiennie stymulowane w 24-studzienkowych płytkach wstępnie powlekanych przez noc 0,5 pg/ml związanego z płytką mAb anty-CD3 UCHTl (PharMingen) z rozpuszczalnym mAb anty-CD28 lub bez (PharMingen) w ilości 5 pg/ml. W każdym punkcie czasowym, komórki zbierano, odwirowywano, przemywano raz PBS i odwirowywano ponownie. Supernatant usuwano i osady szybko zamrażano w łaźni zawierającej mieszaninę suchy lód/etanol, następnie przechowywano w temperaturze -80°C do przygotowania RNA w późniejszym czasie.

PL 207 350 B1

PCR w czasie rzeczywistym prowadzono na tych iudzkich seiekcjonowanych komórkach CD8+, CD4+ i CD19+, jak opisano w przykładzie 43B i 43C poniżej, w celu oszacowania ludzkiego liganda zalpha11 i ekspresji receptora.

B. Startery i sondy do iiościowej RT-PCR w celu ekspresji ludzkiego liganda zalpha11

Iiościową RT-PCR w czasie rzeczywistyrr|przy użyciu ABI PRISM 7700 Seguence Detection

System (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) opisano wcześniej (patrz, Heid, CA i inni, Genome Research 6: 986-994, 1996; Gibson, U. E. M. i inni, Genome Research 6: 995-1001, 1996; i Sundaresan, S. i inni, Endocrinology 139:4756-4764, 1998). Metoda ta zakłada użycie sondy specyficznej dia genu, zawierającej zarówno barwnik reporterowy jak i wygaszający. Gdy sonda jest niezmieniona, emisja barwnika reporterowego nie zachodzi z powodu biiskości barwnika wygaszającego. Podczas wydłużania PCR przy użyciu dodatkowych starterów specyficznych wobec genu, zgodnych i przeciwnych, sonda uiega rozszczepieniu przez aktywność 5' nukieazy poiimerazy Taq, która uwalnia barwnik reporterowy powodując wzrost emisji fiuorescencji.

Startery i sondy stosowane do anaiizy iiościowej RT-PCR w czasie rzeczywistym zaplanowano przy użyciu oprogramowania do pianowania starterów Primer ExpressTM (PE Appiied Biosystems). Startery dla ludzkiego liganda zalpha11 zapianowano tak, że obejmują połączenie intron-egzon, aby wyeiiminować powieianie genomowego DNA. Zgodny starter, ZC22,281 (SEQ ID Nr: 90) i odwrotny starter. ZC22,279 (SEQ ID Nr: 91) stosowano przy stężeniu 300 nM do syntezy produktu o długości 80 bp. Odpowiadającą sondę TagMan iiganda zalpha11, ZG32 (SEQ ID Nr: 92, syntetyzowano w PE Applied Biosystems. Sondę znakowano repoterowym barwnikiem fiuorescencyjnym (6-carboksyfiuoresceina) (FAM) (PE Appiied Biosystems) na końcu 5' i wygaszającym barwnikiem fiuorescencyjnym (6-karboksytetrametylorodamina) (TAMRA) (PE Appiied Biosystems) na końcu 3'. W celu przetestowania integrainości iub jakości wszystkich próbek RNA, przesiewano je wzgiędem rRNA przy użyciu startera i zbioru sond zamówionych w PE Appiied Biosystems (numer kataiogowy 4304483). Reporterowym barwnikiem fluorescencyjnym dla tej sondy jest VIC (PE Applied Biosystems). Wyniki rRNA pozwoią na normaiizację wyników iiganda zalpha11.

Wytworzono RNA z osadu otrzymanego w przykładzie 43A, przy użyciu zestawu RNeasy Miniprep™ (Qiagen, Valencia, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Kontrolny RNA wytworzono z około 10 miiionów komórek BHK wykazujących ekspresję iudzkiego iiganda zalpha11.

C. Startery i sondy do iiościowej RT-PCR w celu ekspresji ludzkiego receptora zalpha11

Prowadzono PCR w czasie rzeczywistym, w celu oszacowania ekspresji receptora zalpha11, jak w przykładzie 43B i przykładzie 43D, przy użyciu komórek wytworzonych w warunkach podanych w 43A oraz sond specyficznych dla receptora zalpha11. Starter zgodny, ZC22,277 (SEQ ID Nr: 93) i starter odwrotny, ZC22,276 (SEQ ID Nr: 94), stosowano w reakcji PCR (powyżej) przy stężeniu około

300 nM, aby zsyntetyzować produkt o długości 143 bp. Syntetyzowano odpowiadającą sondę zal_® pha11 TagMan^®, oznaczoną ZG31 (SEQ ID Nr: 95), i znakowaną za pomocą PE Appiied Biosystems. RNA z komórek BaF3 wykazujących ekspresję iudzkiego receptora zalpha11 stosowano, aby utworzyć odpowiednią kontroię dia krzywych wzorcowych PCR w czasie rzeczywistymopisanych w przykładzie 43D poniżej.

D. Iiościowa RT-PCR w czasie rzeczywistym

Wzgiędne poziomy RNA iiganda zalpha11 okreśiano anaiizując próbki całkowitego RNA przy użyciu jednoetapowej metody RT-PCR (PE Appiied Biosystems). RNA z komórek BHK wykazujących ekspresję iudzkiego iiganda zalpha11 stosowano do wytworzenia używanej stosowanej krzywej wzorcowej. Krzywa obejmowała seryjne rozcieńczenia w zakresie od 2,5-2,5 x 10^-4 ng dla przesiewu rRNA i 25-0,0025 ng dla przesiewu liganda zalpha11 z każdym punktem krzywej wzorcowej anaiizowanym w trzech powtórzeniach.

Próbki całego RNA anaiizowano także w trzech powtórzeniach pod wzgiędem poziomu transkryptu ludzkiego liganda zalpha11 i pod wzgiędem poziomu rRNA jako endogenicznej kontroii. Każda reakcja jednoetapowej RT-PCR zawierała: około 25 ng całkowitego RNA w buforze A (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCi i wewnętrzny barwnik standardowy, ROX (PE Applied Biosystems); odpowiednie startery (około 50 nM starterów dia próbek rRNA; oraz około 300 nM starterów dia próbki iiganda zaipha11) i sondę (50 nM dia rRNA, 100 nM dia iiganda zaipha11), 5,5 mM MgCl2; 300 pM każdego z d-CTP, d-ATP i d-GTP oraz 600 pM d-UTP; odwrotną transkryptazę (0,25 jednostek/pl); poiimerazę DNA AmpliTaq™ (0,025 jednostki/pl) (PE Applied Biosystems); oraz inhibitor RNaz (0,4 jednostki/pi). Warunki cyklu cieplnego PCR obejmowały początkowy etap RT o cykiu w temperaturze 48°C przez 30 minut,

PL 207 350 B1 etap aktywacji AmpliTaq Gold w temperaturze 95°C przez 10 minut, po czym 40 cykli powielania przez 15 sekund w temperaturze 95°C i 1 minutę w temperaturze 60°C. Względne poziomy RNA liganda zalpha11 określano stosując metodę krzywej wzorcowej, którąopisano w Biuletynie użytkownika nr 2: (PE Biosystems; User Bulletin # 2: ABI Prism 7700 Seguence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, 11 grudnia 1997) stosując pomiary rRNA do normalizacji poziomu liganda zalpha11. Próbki porównywano w stosunku do kalibratora.

Kalibrator wybierano arbitralnie na podstawie dobrej jakości RNA i poziomu ekspresji, z którym inne próbki można było odpowiednio porównać. Wyniki doświadczeń analizujących ekspresję liganda zalpha11 i receptora zalpha w komórkach stymulowanych i nie stymulowanych (przykład 43A) są takie, jak opisano w przykładzie 43E poniżej.

E. Ekspresja receptora ludzkiego zalpha11 i liganda w komórkach CD4+, CD8+ i CD19+

W pierwszym doświadczeniu wykorzystywano metodą RT-PCR, opisaną powyżej, w celu oszacowania ekspresji receptora zalpha11 w próbkach niestymulowanych i stymulowanych anty-CD3 CD4+ i CD8+, w punktach czasowych godzin (nie stymulowane „odpoczywające”) komórki) oraz 4 godziny, 15,5 godzin i 24 godziny, po stymulacji. Pozostałą próbkę CD4+ wybierano arbitralnie jako kalibrator i nadano jej wartość 1,00. Występowało około 4-krotne zwiększenie ekspresji receptora w nie stymulowanych komórkach CD4+ z 4 godzin do 24 godzin hodowli i około 8-krotne zwiększenie przez taki sam okres w stymulowanych anty-CD3 komórkach CD4+. Komórki CD8+ wykazywały 7-krotne zwiększenie ekspresji receptora zalpha11, którego maksimum miało miejsce w 4 godzinie i zmniejszało się w czasie. Przy stymulacji anty-CD3 komórki CD8+ wykazywały stały 8-krotny wzrost ekspresji receptora.

W pierwszym doświadczeniu także wykorzystywano RT-PCR do oszacowania ekspresji liganda zalpha11 w tych samych stymulowanych anty-CD3 i nie stymulowanych próbkach CD4+ i CD8+. 4-godzinne stymulowane anty-CD3 próbki CD8+ wybierano arbitralnie jako kalibrator i nadawano wartość 1,00. Wyniki pokazały, że niestymulowane komórki CD4+ i CD8+ nie wykazywały ekspresji liganda zalpha11. Obserwowano znaczny wzrost ekspresji w komórkach CD4+ stymulowanych anty-CD3 w godzinie 4, z około 300-krotnym wzrostem sygnału obserwowanym w godzinie 15,5. Komórki CD8+ wykazywały ekspresję małej ilości liganda podczas stymulacji anty-CD3, jednak jest to prowadopodobnie spowodowane zanieczyszczeniem populacji CD8+ małą liczbą komórek CD4+.

W drugim doświadczeniu wykorzystywano RT-PCR do oszacowania ekspresji receptora zalpha11 w stymulowanych CD3, stymulowanych PMA + jonomycyną i nie stymulowanych próbkach CD4+ i CD8+, w punktach czasowych wynoszących 0 godzin, oraz 3,5 godziny, 16 godzin i 24 godziny po aktywacji. Pozostałą próbkę CD8+ wybierano arbitralnie jako kalibrator i nadawano wartość 1,00. Pozostałe komórki CD4+ i CD8+ nie wykazywały znaczącej ilości ekspresji receptora. Ekspresja była około 3-krotnie większa w próbkach CD4+ stymulowanych PMA + jonomycyną, w 3,5 godziny, 16 godzin i 24 godziny po stymulacji. Ekspresja komórek CD4+ aktywowanych anty-CD3 wykazywała maksimum na poziomie 10-krotnie wyższym od tła, w 3,5 godziny po stymulacji, następnie opadała do poziomu 4-krotnego powyżej tła w 16 godzinie po stymulacji. Komórki CD8+ wykazywały 4-krotny wzrost ekspresji w 3,5 godziny po stymulacji PMA+jonomycyną, przy ekspresji zmniejszającej się w kolejnych punktach czasowych. Jak w pierwszym doświadczeniu, komórki CD8+ stymulowane antyCD3 także wykazywały 8-krotnie większą od tła indukcję ekspresji receptora.

Te próbki z drugiego doświadczenia także wykorzystywano do oszacowania ekspresji liganda zalpha11. 24-godzinną próbkę stymulowaną PMA + jonomycyną wybierano arbitralnie jako kalibrator i nadawano wartość 1,00. Wyniki ponownie wykazywały brak ekspresji liganda zalpha11 w nie stymulowanych komórkach. Występowała około 30-krotna indukcja ekspresji liganda w komórkach CD4+ stymulowanych anty-CD3 w 3,5 godzinie, podobnie jak w poprzednim doświadczeniu (w 4 godzinie). Jednakże wystąpiła jedynie około 5-krotna indukcja dla stymulacji PMA i jonomycyną w 3,5 godzinie, która opadała w kolejnych punktach czasowych. Ponownie, komórki CD8+ wykazywały ekspresję bardzo małej ilości liganda, co było prawdopodobnie spowodowane zanieczyszczeniem komórkami CD4+.

W ostatnim doświadczeniu wykorzystywano RT-PCR do oszacowania ekspresji receptora zalpha11 w stymulowanych anty-CD3 i anty-CD3/anty-CD28 oraz niestymulowanych próbkach CD4+ i CD8+, w punktach czasowych 0 godzin oraz 2 godziny, 4 godziny i 16 godzin po stymulacji. Komórki CD19+ aktywowane PMA+jonomycyną także przesiewano pod względem ekspresji receptora, w tych samych przedziałach czasowych. Pozostałą próbkę CD4+ wybierano arbitralnie jako kalibrator i nadawano wartość 1,00. 2 godzinne komórki CD4+ stymulowane anty-CD3 wykazywały jedynie

PL 207 350 B1

4-krotną indukcję receptora, w porównaniu z 10-krotną indukcją widoczną w 3,5 godzinie w poprzednim doświadczeniu. Połączenie anty-CD3 i anty-CD28 zwiększało ekspresję receptora zalpha11 do 8-krotnej powyżej tła. 16-godzinne komórki CD8+ stymulowane anty-CD3/anty-CD28 miały bardzo niski poziom ekspresji receptora zalpha11, podobnie jak dla komórek CD8+ w poprzednich doświadczeniach (powyżej). Komórki CD19+ stymulowane PMA+jonomycyną miały najbardziej znaczącą ekspresję receptora zalpha11 (19-krotny wzrost w 2 godzinie), lecz poziom ekspresji opadał do stwierdzanego w pozostałych komórkach w 16 godzinie.

Te próbki z ostatniego doświadczenia wykorzystywano także do oszacowania liganda zalpha11 przez RT-PCR. 16-godzinną próbkę CD8+ stymulowaną anty-CD3/anty-CD28 wybierano arbitralnie jako kalibrator i nadawano wartość 1,00. Wyniki pokazały, że w 2 godzinie komórki CD4+ wykazywały około 2-krotną indukcję ekspresji liganda zalpha11, przy stymulacji anty-CD3 i 5-krotną indukcję przy stymulacji anty-CD3 oraz anty-CD28. Te warunki stymulacji indukowały ekspresję liganda w czasie, przy czym stymulowane przez 16 godzin komórki CD4+ wykazywały poziom ekspresji liganda 70-krotnie powyżej tła. Komórki CD8+ i CD19+ wykazywały brak ekspresji liganda zalpha11.

Spodziewano się pewnej zmienności między próbkami krwi (czyli wieloma próbkami pobieranymi w różnym czasie od tego samego pacjenta oraz między wieloma pacjentami). Analizowano zatem tendencje danych w każdym badaniu lub z pojedynczej próbki krwi zaś trzy powyższe doświadczenia porównywano pod względem wniosków ogólnych. Trend z doświadczeń PCR w czasie rzeczywistym opisanych powyżej jest taki, że ze wszystkich testowanych rodzajów komórek, komórki B CD19+ aktywowane PMA + jonomycyną wykazywały ekspresję najwyższego poziomu RNA receptora zalpha11. Komórki CD4+ i CD8+ można także stymulować do ekspresji receptora, lecz na niższym poziomie niż w komórkach B.

Ligand zalpha11 ulegał ekspresji prawie wyłącznie w stymulowanych komórkach T CD4+ (a nie w komórkach T CD8+ lub komórkach B CD19+). Chociaż stymulacja PMA+jonomycyną indukowała dobry sygnał liganda zalpha11 w tym teście, otrzymywano znacznie wyższy sygnał z komórek T CD4+ stymulowanych mAb anty-CD3 lub połączeniem mAb anty-CD3 i anty-CD28, warunkach, które lepiej naśladują napotykanie antygenu in vivo.

P r z y k ł a d 44

Proliferacja zależna od liganda zalpha11 komórek B stymulowanych anty-CD40 lub anty-IgM

A. Oczyszczanie ludzkich komórek B

Fiolkę zawierającą 1 x 10⁸ zamrożonych, poddanych aferezie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) szybko roztapiano w temperaturze 37°C na łaźni wodnej i ponownie zawieszano w 25 ml pożywki dla komórek B (RPMI Medium 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 10% inaktywowanej wysoką temperaturą płodowej surowicy bydlęcej, 5% L-glutaminy, 5% Pen/Strep) (Gibco BRL)) w probówce 50 ml (Falcon VWR, Seattle, WA). Komórki testowano pod względem zdolności do przeżycia, przy użyciu błękitu trypanu (Gibco BRL).

Dziesięć mililitrów Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) wprowadzono pod zawiesinę komórkową, i wirowano przez 30 minut przy 1800 obr/min i pozostawiano do zatrzymania bez hamowania. Powierzchnię międzyfazową usuwano następnie i przenoszono do świeżej 50 ml probówki Falcon, sprowadzając do końcowej objętości wynoszącej 40 ml za pomocą PBS i wirowano przez 10 minut przy 1200 obr/min z hamowaniem.

Żywotność izolowanych komórek ponownie testowano przy użyciu błękitu trypanu. Ewentualnie, świeżą próbkę ludzkiej krwi rozcieńczano 1:1 PBS (Gibco BRL) i wprowadzano na Ficoll/Hypague Plus (Pharmacia), wirowano i przemywano, jak powyżej. Komórki izolowane ze świeżego lub zamroźonego źródła dawały równoważne wyniki.

Komórki B oczyszczano z przemywanych Ficoll komórek krwi obwodowej zdrowych ludzkich dawców (powyżej) za pomocą kulek magnetycznych anty-CD19 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Czystość otrzymanych preparatów monitorowano metodą cytometrii przepływowej z użyciem Ab anty-CD22 FITC (Pharmingen, San Diego, CA). Preparaty komórek B były zwykle > 90% czyste.

B. Oczyszczanie mysich komórek B

Zawiesinę mysich splenocytów wytwarzano przez rozdrobnienie śledzion myszy C57B1/6 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) za pomocą zagiętych igieł w pożywce dla komórek B.

RBC usuwano przez lizę hipotoniczną. Komórki CD43 pozytywne usuwano za pomocą kulek magnetycznych CD43 (Miltenyi Biotec) zgodnie z instrukcjami producenta. Czystość otrzymanych preparatów

PL 207 350 B1 monitorowano metodą cytometrii przepływowej z Ab anty-CD45R FITC (Pharmingen). Preparaty komórek B były zwykie w > 90% czyste.

C. Proliferacja stymulowanych anty-CD40 komórek B w obecności iudzkiego iub mysiego iiganda zalpha11

Komórki B ze źródła iudzkiego iub mysiego ponownie zawieszano przy stężeniu końcowym wynoszącym 1 x 10⁶ komórek/mi w pożywce dia komórek B i wysiewano w iiości 100 pi/studzienkę w 95-studzienkowej płytce z okrągłym dnem (Faicon, VWR), zawierającej różne warunki stymuiacji, aby sprowadzić końcową objętość do 200 pi/studzienkę. W ceiu stymuiacji anty-CD40 ludzkie hodowle uzupełniano pg/ml anty-ludzkiego CD40 (Genzyme, Cambridge, MA), zaś mysie hodowie uzupełniano pg/ml antymysiego CD40 (Serotec, UK). Ludzki lub mysi ligand zalpha11 dodawano w rozcieńczeniach rzędu 1 pg/mi-100 ng/ml.

Specyficzność wpływu iiganda zalpha11 potwierdzano przez inhibicję iiganda zalpha11 za pomocą 25mg/mi rozpuszczainego iudzkiego zaipha11CEE (przykład 10A). Wszystkie procedury przeprowadzano w trzech powtórzeniach. Komórki następnie inkubowano w temperaturze 37°C w nawilżonym inkubatorze przez 120 godzin (iudzkie) iub 72 godziny (mysie).

₃

Szesnaście godzin przed zbiorem do wszystkich studzienek dodawano 1 piCi ³H-tymidyny (Amersham, Piscataway, NJ) w ceiu oszacowania, czy komórki B proiiferowały. Komórki zbierano do 96 studzienkowej płytki fiitracyjnej (UniFiiter GF/C, Packard, Meriden, CT) przy użyciu urządzenia do zbierania komórek (Packard) i zbierano zgodnie z instrukcjami producenta. Płytki suszono w temperaturze 55 °C przez 20-30 minut i spód studzienek uszczeiniano nieprzezroczystym uszczeiniaczem do płytek. Do każdej studzienki dodawano 0,25 mi płynu scyntyiacyjnego (Microscint-0, Packard) i płytkę odczytywano przy użyciu iicznika scyntyiacyjnego do płytek TopCount (Packard).

Inkubacja z ligandem zalpha11 przy stężeniach 3 ng/mi iub więcej zwiększała proiiferację indukowaną przez rozpuszczaine anty-CD40 w sposób zaieżny od dawki zarówno w mysich, jak i w iudzkich komórkach B, aż 30-krotnie. Mysie i iudzkie komórki B odpowiadały tak samo, także wobec ich odpowiedniego liganda zalpha11. U obu rodzajów stymuiacja była specyficzna wobec iiganda zalpha11, ponieważ była ona odwracana przez obecność rozpuszczainego receptora zalpha11 w hodowli.

D. Proliferacja stymulowanych anty-IgM komórek B w obecności iudzkiego iub mysiego iiganda zalpha11

Komórki B pochodzenia iudzkiego iub mysiego, jak opisano powyżej (przykład 44A i przykład 44B, wysiewano, jak opisano powyżej (przykład 44C). W celu stymulacji anty-IgM iudzkich komórek płytki wstępnie powiekano przez noc za pomocą 10 mg/ml F(ab')2, antyludzkiego IgM (Southern Biotech Associates, Birmingham, Aiabama) i przemywano jałową pożywką tuż przed użyciem. Hodowie uzupełniano 0-10 ng/ml hu rIL-4 (R & D Systems, Minneapolis, MN). W celu stymulacji anty-IgM mysich komórek do hodowii dodawano rozpuszczaine anty-IgM (Biosource, Camariiio, CA) w iiości 10 mg/mi. Do każdego z wcześniejszych warunków anty-IgM/IL-4 dodawano ludzki lub mysi ligand zalpha11 pw rozcieńczeniach rzędu 1 pg/mi-100 ng/mi, jak opisano powyżej. Specyficzność wpływu liganda zalpha11 potwierdzano przez inhibicję za pomocą rozpuszczainego iudzkiego receptora zalpha11, jak opisano powyżej (przykład 44C). Wszystkie procedury przeprowadzano w trzech powtórzeniach. Komórki inkubowano, znakowano H-tymidyną, zbierano i anaiizowano, jak opisano w przykładzie 44C.

Inkubacja z ligandem zalpha11 w stężeniach 0,3 ng/mi iub więcej hamowała proiiferację indukowaną przez nierozpuszczalne anty-IgM (mysie) lub anty-IgM i IL-4 (iudzkie) w sposób zaieżny od dawki. Inhibicja ta była specyficzna wobec iiganda zalpha11, ponieważ była ona odwracana przez obecność rozpuszczainego receptora zalpha11 w hodowli.

P r z y k ł a d 45

Ekspresja ludzkiego rozpuszczalnego receptora zalpha11 w E. coli

A. Konstrukcja wektora ekspresyjnego pCZR225, który wykazuje ekspresję poiipeptydu fuzyjnego huzalpha11/MBP-6H

Piazmid ekspresyjny zawierający poiinukieotyd kodujący iudzki rozpuszczainy receptor zalpha11 połączony C-terminainie z białkiem wiążącym maitozę (MBP) konstruowano przez rekombinację homoiogiczną. Fragment iudzkiego zalpha11 cDNA (SEQ ID Nr: 7) izoiowano przy użyciu PCR. Sekwencję poiinukieotydową poiipeptydu fuzyjnego rozpuszczainego receptora MBP-zalpha11 pokazano w SEQ ID Nr: 96. Dwa startery stosowano przy wytwarzaniu fragmentu ludzkiego zalpha11 w reakcji PCR: (1) starter ZC20,187 (SEQ ID Nr: 98), zawierający 40 bp sekwencji oskrzydiającej wekPL 207 350 B1 tor i 25 bp odpowiadających końcowi aminowemu ludzkiego zalpha11 i (2) starter ZC20,185 (SEQ ID Nr: 99), zawierający 40 bp końca 3' odpowiadających sekwencji oskrzydlającej wektor i 25 bp odpowiadających końcowi karboksylowemu ludzkiego zalpha11. Warunki reakcji PCR były następujące: 25 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 50°C przez 30 sekund i 72°C przez 1 minutę; po czym nasycenie w temperaturze 4°C, w dwóch powtórzeniach. Dwa pl ze 100 pl reakcji PCR analizowano na 1,0% żelu agarozowym z buforem 1 x TBE do analizy; widoczny był oczekiwany fragment o długości około 660 bp. Pozostałe 90 pl reakcji PCR łączono z drugą probówką do PCR wytrącaną 400 pl absolutnego etanolu. Wytrącony DNA stosowano do rekombinacji do ciętego Smal wektora biorczego pTAP98 (przykład 31), aby wytworzyć konstrukcję kodującą fuzję MBP-zalpha11. Klony transformowano, identyfikowano i hodowano jak opisano w przykładzie 31. Pozytywne klony, oznaczone pCZR225 i poddawano analizie sekwencji. Sekwencję polinukleotydową polipeptydu fuzyjnego rozpuszczalnego receptora MBP-zalpha11 pokazano w SEQ ID Nr: 96, zaś odpowiadającą sekwencję polipeptydową pokazano w SEQ ID Nr: 97. Pozytywne klony stosowano do hodowli w E. coli, jak opisano w przykładzie 31, w celu oczyszczania białka fuzyjnego huzalpha11/MBP-6H (przykład 46, poniżej).

P r z y k ł a d 46

Oczyszczanie rozpuszczalnego receptora huzalpha11/MBP-6H z fermentacji E. coli

Jeśli nie podano inaczej, wszystkie operacje przeprowadzano w temperaturze 4°C. Następujące procedury stosowano do oczyszczenia polipeptydu rozpuszczalnego receptora huzalpha11/MBP-6H. Komórki E. coli zawierające konstrukcję pCZR225 i wykazujące ekspresję rozpuszczalnego receptora huzalpha11/MBP-6H (przykład 45) hodowano w SuperBroth II (12 g/l kazeiny, 24 g/l ekstraktu drożdżowego, 11,4 g/l fosforanu dipotasowego, 1,7 g/l fosforanu monopotasowego; Becton Dickenson, Cockeysville, MD) i zamrażano w 0,5% glicerolu. Dwadzieścia gramów zamrożonych komórek w mieszaninie SuperBroth II + glicerol stosowano do oczyszczenia białka. Zamrożone komórki rozmrażano i rozcieńczano 1:10 w roztworze inhibitora proteazy (bufor ekstrakcyjny, a następnie prowadzono lizę komórek i uwalnianie białka rozpuszczalnego receptora huzalpha11/MBP-6H. Rozcieńczone komórki zawierały końcowe stężenia wynoszące 20 mM Tris (J. T. Baker, Philipsburg, NJ) 100 mM chlorku sodu (NaCl, Mallinkrodt, Paris, KY), 0,5 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 2 pg/ml leupeptyny (Fluka, Szwajcaria) i 2 pg/ml aprotyniny (Sigma). Prasę francuską - system do rozbijania komórek (Constant Systems Ltd., Warwick, UK) w temperaturze wynoszącej - 7 - do -10°C i 30K PSI stosowano do lizy komórek. Rozcieńczone komórki sprawdzono pod względem dezintegracji przez odczyty Aeoo przed i po zastosowaniu prasy. Poddane lizie komórki wirowano przy 18000G przez 45 minut, aby usunąć osad rozbitych komórek, zaś supernatant stosowano do oczyszczania białka. Całkowite stężenia białka docelowego z supernatantu określano w tekście białka BCA (Pierce, Rockford, IL), zgodnie z instrukcjami producenta.

ml kolumnę z żywicą Talon Metal Affinity (Clontech, Palo Alto, CA) (wytworzoną, jak opisano poniżej) wylewano do szklanej kolumny Bio-Rad, 2,5 cm śr. x 10 cm wys. Kolumnę upakowano i równoważono grawitacyjnie 10 objętościami kolumny (CV) buforu Talon Equilibration (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0). Supernatant ładowany okresowo na żywicę powinowactwa z metalem Talon kołysano przez noc. Żywicę wylewano z powrotem na kolumnę i przemywano 10 CV buforu Talon Equilibration grawitacyjnie, następnie grawitacyjnie wymywano 140 ml buforu do elucji (bufor Talon Equilibration + 200 mM imidazolu - Fluka Chemical). Kolumnę Talon oczyszczano 5 CV 20 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego o pH 5,0 (MES, Sigma), 5 CV destylowanej H2O, następnie przechowywano w 20% etanolu/0,1% azydku sodu. Frakcje po czternaście ml zbierano poprzez całą chromatografię elucyjną i odczytywano absorbancję frakcji przy 280 i 320 nM oraz analizowano za pomocą testu białka BCA; połączone frakcje przejścia i przemycia także zachowywano i analizowano. Badane frakcje wymywania białka zlewano i ładowano bezpośrednio na żywicę amylozową (New England Biolabs, Beverly, MA).

Aby otrzymać czystszy polipeptyd huzalpha11/MBP-6H, połączone frakcje elucji z kolumny powinowactwa Talon podawano na żywicę amylozową (22ml) o pH 7,4. Kolumnę 25 cm śr. x 10 cm wys. Bio-Rad wylewano, pakowano i równoważono w 10 CV amylozowego buforu do równoważenia - 20 mM Tris (J.T. Baker), 100 mM NaCl (Mallinkrodt), 1 mM PMSF (Sigma), 10 mM β-merkaptoetanolu (BME, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) o pH 7,4. Próbkę ładowano grawitacyjnie, przy natężeniu przepływu 0,5 ml/minutę. Kolumnę przemywano 10 CV amylozowego buforu do równoważenia, następnie wymywano około 2 CV amylozowego buforu do równoważenia + 10 mM maltozą (Fluka Biochemical, Szwajcaria) grawitacyjnie. Frakcje po 5 ml zbierano w czasie całej chromatografii i odczytywano absorbancję przy 280 i 320 nM. Kolumnę amylozową regenerowano 1 CV destylowanej H2O,

PL 207 350 B1

CV 0,1% (w/v) SDS (Sigma), 5 CV destylowanej H2O, a następnie 5 CV amylozowego buforu do równoważenia.

Badane frakcje zlewano i dializowano w urządzeniu Slide-A-Lyzer (Pierce) przy użyciu 4 x 41 PBS o pH 7,4 (Sigma), aby usunąć zanieczyszczenia o niskim ciężarze cząsteczkowym, wymieniano bufor i odsalano. Po wymianach PBS, zebrany materiał stanowił oczyszczany polipeptyd huzalpha11/MBP-6H. Oczyszczony polipeptyd huzalpha11/MBP-6H analizowano przez SDS-PAGE z barwieniem Coomassie oraz analizę western blot z antykróliczym przeciwciałem sprzężonym z HRP (Rockland, Gilbertsville, PA). Stężenie polipeptydu huzalpha11/MBP-6H wynosiło 1,92 mg/ml, określone w analizie BCA.

Oczyszczony polipeptyd huzalpha11/MBP-6H wytwarzano w celu wstrzyknięcia królikom i wysłano do R & R Research and Development (Stanwood, WA) w celu wytworzenia przeciwciała. Króliki poddano iniekcji w celu wytworzenia surowicy antyhuzalpha11/MiBP-6H (przykład 47, poniżej).

P r z y k ł a d 47

Przeciwciała poliklonalne przeciwko receptorowi zalpha11

Przeciwciała poliklonalne wytwarzano przez immunizację dwóch samic białych królików New Zealand z użyciem oczyszczanego polipeptydu huzalpha11/MBP-6H (przykład 46) lub oczyszczonego rekombinowanego rozpuszczalnego receptora zalpha11CEE (przykład 10A). Odpowiadające przeciwciała poliklonalne oznaczano odpowiednio jako królicze antyhuzalpha11/MBP-6H i królicze antyhuzalpha11-CEE-BHK. Każdemu królikowi podawano początkowo dootrzewnową (IP) iniekcję 200 mg oczyszczonego białka w kompletnym adiuwancie Freunda (Pierce, Rockford, IL), po czym przypominające iniekcje IP 100 mg oczyszczonego białka w niekompletnym adiuwancie Freunda, co trzy tygodnie. Siedem do dziesięciu dni po podaniu trzeciej dawki przypominającej zwierzęta skrwawiano i zbierano surowicę. Królikom podawano następnie dawkę przypominającą i pobierano krew co trzy tygodnie. Przeciwciała poliklonalne swoiste wobec zalpha11 oczyszczano przez powinowactwo z surowicy króliczej stosując kolumnę CNBr-SEPHAROSE białko 4B (Pharmacia LKB), którą wytwarzano stosując 10 mg oczyszczonego polipeptydu huzalpha11/MBP-eH (przykład 32) na gram CNBr-SEPHAROSE, po czym następowała dializa 20 x w PBS przez noc. Przeciwciała swoiste wobec Zalpha11 charakteryzowano przez sprawdzanie miana w teście ELISA stosując 1 mg/ml odpowiedniego antygenu białkowego jako cel przeciwciała. Dolna granica detekcji (LLD) króliczego przeciwciała antyhuzalpha11/MBP-6H oczyszczonego przez powinowactwo stanowi rozcieńczenie wynoszące 500 pg/ml. LLD króliczego przeciwciała anty-huzalpha11/MBP-6H oczyszczonego przez powinowactwo stanowi rozcieńczenie wynoszące 50 pg/ml.

P r z y k ł a d 48

Dystrybucja receptora zalpha11

Aby oszacować dystrybucję receptora zalpha11 w różnych rodzajach komórek, wytworzono zarówno królicze poliklonalne, jak i mysie przeciwciała monoklonalne (mAb) skierowane przeciwko ludzkiemu receptorowi (przykład 35 i przykład 47) i sprzęgano te przeciwciała z biotyną do wykorzystania w cytometrii przepływowej. Początkowo stosowano przeciwciała poliklonalne, które wykazywały stosunkowo niskie powinowactwo, do wybarwiania panelu linii komórkowych: linii zależnej od IL-3 mysich komórek pre-B dzikiego typu komórek BaF3 (Palacios i Steinmetz, jak wyżej; Mathey-Prevot i inni, jak wyżej); komórek BaF3 transfekowanych ludzkim zalpha11 (przykład 4); linie komórkowe Raji ludzkiego chłoniaka Burkitta (ATCC Nr CCL-86), Ramos (ATCC Nr 20 CRL-1596), RPMI 8226 (ATCC Nr CCL-155), i Daudi (ATCC Nr CCL-213); linię komórkową Jurkat białaczki ludzkich komórek T (ATCC Nr TIB-152); linie komórkowe ludzkiej białaczki monocytów szpikowych Thp-1 (ATCC Nr TIB-202) i UT937 (ATCC Nr CRL-1593.2); ludzkie komórki promielomonocytowe HLT60 (ATCC Nr CCL-240); mysią linię komórkową chłoniaka A20 komórek B (ATCC No TIB-208); i mysią linię komórkową grasiczaka EL4 (ATCC Nr TIB-39). Komórki zbierano, przemywano raz buforem do przemywania FACS z surowicą (WBS). WBS obejmowała zrównoważony roztwór soli Hanka (Gibco/BRL) + 10 mM HEPES (Gibco/BRL) + 1% BSA (Sigma) + 10% prawidłowa surowica kozia (Gemini Bioprodukts, Woodland, CA) + 10% prawidłowa surowica królicza (Sigma). Bufor do przemywania (WB) był identyczny jak WBS był jednak pozbawiony surowicy. Po przemywaniu, komórki ponownie zawieszano w 100 μl WB zawierających 10 μg/ml króliczych przeciwciał poliklonalnych anty-zalpha11 (przykład 47). Komórki utrzymywano na lodzie z Ab przez 20 minut, następnie przemywano WB i ponownie zawieszano w WB zawierającym kozie antykrólicze-FITC (BioSource, International), inkubowano ponownie przez 20 min na lodzie, następnie przemywano i ponownie zawieszano w 400 μl WB do analizy na cytometrze przepływowym FACSCalibur (Becton Dickinson). Próbki kontrolne barwiono tylko wtórnym kozim

PL 207 350 B1 przeciwciałem anty-króliczym-FITC. Pozytywne barwienie identyfikowano jako przesunięcie powyżej barwienia samym wtórnym. Chociaż przeciwciała poliklonalne miały niskie powinowactwo, z dużą pewnością wykrywano ekspresję zalpha11 na transfektancie BaF3/zalpha11, na wszystkich czterech ludzkich chłoniakach Burkitta (Raji, Ramos, Daudi i RPMI 8226 i na komórkach T Jurkat. Pozostałe (niezróżnicowane) komórki HL-60 nie wiązały przeciwciał antyzalpha11, lecz wykrywano pozytywny sygnał na komórkach HL-60 aktywowanych przez 24 godziny za pomocą PMA (Calbiochem, La Jolla, CA), który indukował różnicowanie komórek HL-60 do komórek podobnych do monocytów. Stwierdzono także pozytywny sygnał w przypadku komórek UT937 i Thp-1, choć ten sygnał może być spowodowany wiązaniem nieswoistym. Przeciwciała poliklonalne słabo reagowały krzyżowo w mysiej linii komórkowej B A20, lecz nie stwierdzono wybarwienia mysiego grasiczaka EL4.

Cztery przeciwciała monoklonalne antyzalpha11 (przykład 35) sprzęgano z biotyną, zaś podzbiór komórek opisany powyżej przesiewano pod względem ekspresji receptora zalpha11 (BaF3, BaF3/zalpha11, Raji, Jurkat i pozostałe HL-60). Komórki zbierano, przemywano, następnie ponownie zawieszano w 100 μl WB zawierającego 15 μg/ml jedno z 4 biotynylowanych mAb. Komórki inkubowano z mAb przez 20 minut na lodzie, następnie przemywano 1,5 ml WB i wirowano w wirówce. Supernatant usuwano przez aspirację i osad ponownie zawieszano w 100 μl streptawidyny sprzęganej z CyChrome (CyC-SA; PharMingen), następnie inkubowano na lodzie kolejne 20 minut, przemywano i wirowano jak poprzednio. Probówki kontrolne zawierały komórki barwione tylko CyC-SA. Osad ponownie zawieszano w 400 μl WB i przeprowadzano cytometrię przepływową, jak powyżej. Pozytywne barwienie oznaczało sygnał przekraczający poziom tła samego barwienia CyC-SA. Stosując transfektanta BaF3/zalpha11 jako kontrolę, udało się uszeregować 4 mAb w kategoriach ich odpowiedniej średniej intensywności fluorescencji (MFI), która może odzwierciedlać powinowactwo przeciwciała i/lub zakres biotynylacji mAb. mAbs uszeregowano następująco, od najwyższego do najniższego MFI: 249.28.2.1.2.2, 247.10.2.15.4.6, 249.19.2.2.3.5 i 249.15.2.4.2.7.

Komórki Raji barwiły się pozytywnie przeciwciałami monoklonalnymi zalpha11. Komórki Jurkats barwiły się pozytywnie przeciwciałami monoklonalnymi zalpha11, lecz nie tak silnie, jak komórki B (Raji). Tak więc, receptor zalpha11 ulegał ekspresji na tych liniach komórkowych B i T. Schematy barwienia na nie aktywowanych komórkach HL60 były identyczne dla wszystkich mAb, przy czym sygnał był bardzo słaby. Uważa się, że ten sygnał nie odzwierciedla właściwej ekspresji zalpha11 przez komórki hl-60, lecz raczej może być spowodowany nieswoistym wiązaniem mysich mAb z komórkami ludzkimi, prawdopodobnie przez receptory Fc.

P r z y k ł a d 49

Wpływ ludzkiego liganda zalpha11 na komórki B i fuzję ligand zalpha11-toksyczna saporyna

Wpływ ludzkiego liganda zalpha11 testowano na następujących ludzkich liniach komórek B: ludzkie linie komórkowe Raji chłoniaka Burkitta (ATCC Nr CCL-86) i Ramos (ATCC Nr CRL-1596); ludzka linia komórkowa chłoniaka komórek B EBV RPMI 1788 (ATCC Nr CRL-156) ludzka linia komórkowa czerniaka/szpiczaka IM-9 (ATCC Nr CRL15 9); i ludzka linia komórek B transformowanych EBV DAKlKJ (ATCC Nr TIB-206) oraz komórek HS Sultan (ATCC Nr CRL-1484). Po około 2-5 dni traktowania ligandem zalpha11 zmiany w ekspresji markera powierzchniowego stwierdzano w liniach komórkowych IM-9, Raji, Ramos i RPMI 1788, wykazując, że te komórki mogą odpowiadać na ligand zalpha11. Ludzkie linie komórkowe B traktowane ligandem zalpha11 rosły znacznie wolniej niż komórki nie traktowane, przy ponownym wysiewaniu w płytkach do hodowli tkanek. Te komórki także wykazywały zwiększoną ekspresję liganda FAS, co oszacowano metodą cytometrii przepływowej (przykład 49D i przykład 49E) i przez umiarkowany wzrost czułości wobec aktywującego przeciwciała FAS (przykład 49A). Te wyniki wskazują, że ligand zalpha11 mógł kontrolować niektóre rodzaje nowotworów komórek B przez ich indukcję do różnicowania, do stanu mniej proliferacyjnego i/lub bardziej wrażliwego na ligand FAS. Ponadto receptor zalpha11 ulega ekspresji na powierzchni kilku z tych linii komórkowych (patrz przykład 48). Tak więc ligand zalpha11 i koniugat ludzkiego liganda zalpha11immunotoksyna saporyna (przykład 49B, poniżej) lub inna fuzja ligand zalpha11-toksyna mogłyby być stosowane w terapii białaczek i chłoniaków komórek B.

A. Wpływ ludzkiego liganda zalpha11 na linie komórek B

Komórki IM-9 wysiewano w ilości około 50000 komórek na ml +/- 50 μg/ml oczyszczonego ludzkiego liganda zalpha11 (przykład 29). Po 3 dniach wzrostu komórki zbierano, przemywano i zliczano, a następnie ponownie wysiewano w ilości około 2500 komórek/ml w płytkach o 96 studzienkach do studzienek z 0,0,033, 0,1 lub 0,33 μg/ml przeciwciał anty-FAS (R & D Systems, Minneapolis).

Po 2 dniach prowadzono test fluorescencyjny Alamar blue (przykład 2B) w celu oszacowania prolife92

PL 207 350 B1 racji komórek. Komórki IM-9 traktowane ligandem zalpha11 rosły tylko do 27% gęstości komórek nie traktowanych przy braku przeciwciał anty-FAS. W obecności 0,33 μg/ml przeciwciał anty-FAS, komórki traktowane ligandem zalpha11 były hamowane o dodatkowe 52%, podczas gdy komórki nie traktowane były hamowane tylko o 30%. Całkowita inhibicja wzrostu komórek traktowanych zarówno ligandem zalphall, jak i 0,33 μg/ml przeciwciała anty-FAS wynosiła 86%. Gdy komórki IM-9 wstępnie traktowano przez trzy dni ligandem zalpha11 lub nie traktowano, a następnie ponownie wysiewano w ilości 100 komórek na studzienkę i hodowano z przeciwciałami anty-FAS lub bez przez 6 dni, wzrost nie traktowanych komórek, oceniany przez test Alamar Blue (przykład 2B), był hamowany tylko o 25% przez przeciwciała anty-FAS, podczas gdy wzrost komórek traktowanych ligandem zalpha11 był hamowany o 95% w stosunku do wzrostu komórek nie traktowanych przy braku przeciwciał anty-FAS.

B. Wpływ łódzkiego liganda zalpha11-immunotoksyna saporyna na linie komórkowe B Konstrukcję i oczyszczanie ludzkiego koniugatu ligand-immunotoksyna zalpha11 saporyna (zalpha1 L-sap) opisano w przykładzie 50. Ludzki zalpha1 IL-sap okazał się znacznie silniejszy niż sama saporyna pod względem hamowania wzrostu komórek. Gdy komórki traktowane ponownie wysiewano po trzech lub czterech dniach traktowania, komórki traktowane ludzkim zalpha1 IL-sap rosły bardzo słabo. Komórki IM-9, Ramos i K562 (ATCC Nr CCL-243) wysiewano w ilości około 2500 komórek/studzienkę w płytkach o 96 studzienkach z zero do 250 ng/ml ludzkiego koniugatu zalphal IL-sap lub tylko 0-250 ng/ml saporyny (Stirpe i inni, Biotechnology 10: 405-412, 1992) jako kontrolą. Płytki inkubowano 4 dni, następnie prowadzono test proliferacji Alamar Blue (przykład 5B). Przy maksymalnym stężeniu koniugatu ludzkiego zalpha11-sap, wzrost komórek IM-9 i komórek RAMOS był hamowany odpowiednio o 79% i 65%. Komórki K562, które mały niski/negatywny przepływ pod względem ekspresji receptora zalpha11, nie ulegały wpływowi zalpha11-sap, wykazując w ten sposób specyficzność wpływu koniugatu. Komórki IM-9 wysiewano w ilości 50000 komórek/ml do 6-studzienkowych płytek w ilości zero i 50 ng/ml koniugatu ludzkiego zalpha1 IL-sap. Po 3 dniach komórki zbierano i zliczano, następnie ponownie wysiewano od 100 do 0,8 komórek na studzienkę w 2-krotnych seryjnych rozcieńczeniach i 12 studzienek na rozcieńczenie komórek bez ludzkiego liganda zalpha11immuno-toksyna saporyna. Po 6 dniach oceniano liczbę studzienek ze wzrostem przy każdym rozcieńczeniu komórek zgodnie z wynikami testu proliferacji Alamar blue (przykład 2B). Gdy liczbę komórek oszacowano przez test Alamar blue (przykład 28), po 6 dniach wzrostu komórki kontrolne posiewane w ilości około 12,5 i 6,25 komórek na studzienkę, wykazywały równoważny wzrost z komórkami traktowanymi zalpha11-sap posianymi w ilości odpowiednio 100 i 50 komórek/studzienkę. Tak więc, wzrost przeżywających traktowanych komórek IM-9 był znacznie zakłócony nawet po usunięciu, przez ponowne powleczenie, the zalpha11-immunotoksyna sap. Ograniczona dystrybucja ludzkiego receptora zalpha11 (przykład 48) i specyficzność działania zalpha11-sap wobec linii komórkowych wykazujących ekspresję receptora sugerują, że ten koniugat może być tolerowany in vivo.

C. Wpływ ludzkiego liganda zalpha11-immunotoksyna saporyna na żywotność linii komórek B Komórki HS Sultan (ATCC Nr CRL-1484 ) wysiewano w ilości około 40000 komórek na ml do

12-studzienkowych płytek i hodowano przez pięć dni przy braku dodawanych cytokin albo z 40 ng/ml oczyszczonego ludzkiego liganda zalpha11 (przykład 29) lub 25 ng/ml koniugatu ludzkiego zalpha1 IL-sap (przykład 50 poniżej) lub z 20 ng/ml IFN-alfa (RDI) albo liganda zalpha11 i IFN-alfa. Ligand zalpha11 hamował wzrost komórek Hs Sultan o 63%. IFN-alfa hamował wzrost o 38%. Ligand zalpha11 plus IFN-alfa hamował wzrost 78%, wskazując, że wpływ hamujący na wzrost ludzkiego liganda zalpha11 i IFN-alfa może być addytywny. Ludzki zalpha1 IL-sap hamował wzrost komórek HS Sultan o 92%. Powyższe wyniki potwierdzają możliwość stosowania liganda zalpha11 lub ludzkiego zalpha11L-sap w leczeniu nowotworów złośliwych lub innych chorób, które wykazują ekspresję receptora zalpha11, szczególnie pochodzących od komórek B. Połączenie liganda zalpha11 z IFN-alfa jest szczególnie zalecane ze względu na ich wpływ addycyjny hamowania komórek HS Sultan. Niektóre inne rodzaje nowotworów złośliwych i chorób limfoidu mogą także wykazywać ekspresję receptora zalpha11, ponieważ aktywowane komórki T także wykazują ekspresję mRNA receptora (przykład 48), zaś niektóre z tych chorób mogą także odpowiadać na ligand zalpha11 w terapii ligandem zalpha11 - fuzją toksyczną.

D. Ekspresja FAS (CD95) w ludzkich liniach komórek B zwiększa się przez stymulację ludzkim ligandem zalpha11

Wszystkie ludzkie linie komórek B HS Sultan (ATCC Nr CRL-1484), IM-9 (ATCC Nr CRL159), RPMI 8226 (ATCC Nr CCL-I55), RAMOS (ATCC Nr CRL-1596), DAKIKI (ATCC Nr TIB-206) i RPMI

PL 207 350 B1

1788 (ATCC Nr CRL-156), traktowano 10 do 50 ng/ml oczyszczonego ludzkiego liganda zalpha11 (przykład 29) iub bez, przez 2 do 8 dni. Komórki następnie barwiono przeciwciałami anty-CD95 sprzężonymi z PE (PharMingen, San Diego, CA), zgodnie z protokołem producenta i anaiizowano na FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). We wszystkich liniach komórkowych, przy traktowaniu ludzkim ligandem zalpha11, barwienie anty-CD95 (FAS lub APO-1) było zwiększone, w pewnych przypadkach ponad dwukrotnie.

E. Ekspresja FAS (CD95) na pierwotnych mysich komórkach B śiedziony zwiększa się przez stymulację iudzkim iigandem zalpha11

Pierwotne mysie spienocyty otrzymywano przez posiekanie śiedzion od 8 do 12-tygodniowych myszy C57/BL6. Erytrocyty poddano iizie przez traktowanie preparatu przez 5 sekund wodą, następnie umieszczenie na sicie o średnicy oczka 70 mikronów. Pozostałe spienocyty przemywano i wysiewano w RPMI (JRH Bioscience) plus 10% HIA-FBS (Hyklon, Logan, UT), interleukina 2 (IL-2) (R i D Systems) z ludzkim ligandem zalpha11 iub bez, jak opisano powyżej. Następnie inkubowano je w temperaturze 37°C, w 5% CO2 przez 5 dni. Spienocyty zbierano i barwiono przeciwciałami antyCD95 sprzężonymi z PE (PharMingen) i przeciwciałami anty-CD 19 sprzężonymi z FITC (PharMingen) zgodnie z protokołem producenta. Komórki anaiizowano metodą cytometrii przepływowej na FACScalibur (Becton Dickinson). Podczas bramkowania na mysich komórkach B CD19+ odkryto, że barwienie anty-CD95 było zwiększone w komórkach B traktowanych IL-2 plus ludzki ligand zalpha11, w porównaniu z barwieniem samą IL-2. Barwienie anty-CD95 wynosiło 37 wzgiędnych jednostek fluorescencji (RFU) w komórkach B w samej IL-2 i 55 RFU w komórkach B hodowanych w IL-2 i ludzkim ligandzie zalpha11.

P r z y k ł a d 50

Konstrukcja i oczyszczanie toksycznej fuzji liganda zalpha11

Zgodnie z umową o dostawy, 10 mg iudzkiego liganda zalpha11 (przykład 29) wysłano do Advanced Targeting Systems (ATS, San Diego, CA) w ceiu sprzężenia z toksyną rośiinną saporyna (Stirpe i inni, Biotechnology 10: 405-412, 1992). Firma Zymogenetics otrzymała od ATS 1,3 mg koniugatu białka zawierającego 1,1 cząsteczki saporyny na cząsteczkę iudzkiego iiganda zalpha11, w preparacie o stężeniu wynoszącym 1,14 mg/mi w 20 nM fosforanu sodu, 300 nM chiorku sodu o pH 7,2.

P r z y k ł a d 51

Toksyczna fuzja liganda zalpha11 in vivo

A. Testowanie koniugatu zalpha11-saporyna u myszy

Koniugat zalpha11-saporyna (przykład 49) podawano myszom C57BL6 (samice, 12-tygodniowe, zakupione w firmie Taconic) w dwóch różnych rodzajach dawkowania: 0,5 i 0,05 mg/kg. Podawano iniekcje dożyine w nośniku zawierającym 0,1% BSA (ICN, Costa Mesa, CA). Podawano trzy iniekcje przez okres jednego tygodnia (dzień 0, 2 1 7). Próbki krwi pobierano od myszy w dniu 0 (przed iniekcją) i dniu 2 1 8 (po iniekcji). Krew zbierano do probówek z heparyną (Bectin Dickenson, Frankiin Lakes, NJ) i okreśiano iiczbę komórek przy użyciu automatycznego anaiizatora hematoiogicznego (Abbot Cell-Dyn model nr CD-3500CS, Abbot Park, IL). Zwierzęta usypiano i poddawano sekcji w dniu 8 po zebraniu krwi. Śiedzionę, grasicę, wątrobę, nerkę i szpik kostny pobierano do badania histopatologicznego. Śiedzionę i grasicę ważono i pobierano dodatkowe próbki krwi w probówkach z separatorem surowicy. Surowice wysyłano do Pheonix Centrai Labs, Everett, WA, do testowania w standardowym paneiu chemicznym. Próbki pobierano także do anaiizy metodą cytometrii przepływowej, jak opisano w niniejszym dokumencie. Ziiczenia komórek krwi krążącej i pomiary parametrów chemicznych surowicy nie różniły się istotnie między myszami traktowanymi koniugatem zalpha11 i myszami traktowanymi równoważną dawką niesprzężonej toksyny (saporyny). Anaiiza histologiczna tkanek u myszy traktowanych zalphall-saporyna wykazywała brak istotnych zmian w stosunku do myszy traktowanych równoważną dawką niesprzężonej toksyny. Te wyniki wskazywały, że koniugat saporyny był nie toksyczny in vivo.

B. Testowanie wpływu fuzji toksycznej iigand zalpha11-saporyna na nowotwory pochodzące od komórek B in vivo

Wpływ iudzkiego iiganda zalpha11 i toksycznej fuzji saporyny i ludzkiego liganda zalpha11 (przykład 50) na komórki iudzkiego nowotworu testuje się in vivo przy użyciu mysiego modeiu obcego przeszczepu nowotworu opisanego w niniejszym dokumencie. Modeie obcego przeszczepu testuje się początkowo przy użyciu iinii komórkowych seiekcjonowanych na podstawie doświadczeń in vitro, podobnie jak opisani w przykładzie 49. Te iinie komórkowe obejmują, iecz bez ograniczenia: iudzkie iinie

PL 207 350 B1 komórkowe Raji chłoniaka Burkitta (ATCC Nr CCL-86) i Ramos (ATCC Nr CRL-1596); ludzką linię komórkową RPMI 1788 (ATCC Nr CRL-156); ludzką linię komórkową czerniaka/szpiczaka IM-9 (ATCC Nr CRL159); ludzką linię komórkową DAKIKI (ATCC Nr TIB-206) i komórki HS Sultan (ATCC Nr CRL-1484). W tym typie modelu można także stosować komórki pochodzące bezpośrednio od ludzkich nowotworów. W ten sposób, można stosować skrining próbek pacjenta pod względem wrażliwości na traktowanie ligandem zalpha11 lub toksyczną fuzją saporynową liganda zalpha11, w celu wyboru optymalnych wskazań do stosowania zalpha11 w terapii antynowotworowej.

Po wybraniu odpowiedniego modelu obcego przeszczepu in vivo, opisanego powyżej, aktywność naturalnych zabójców indukowanych przez ligand zalpha11 i/lub wpływ liganda zalpha11 na nowotwory pochodzące od komórek B ocenia się in vivo. Ludzki ligand zalpha11 testuje się pod względem jego zdolności do tworzenia cytotoksycznych komórek efektorowych (np. komórek NK) o aktywności przeciwko nowotworom pochodzącym od komórek B, przy użyciu modeli mysiego obcego przeszczepu nowotworowego, opisanego w niniejszym dokumencie. Ponadto można oszacować bezpośredni wpływ ludzkiego liganda zalpha11 na nowotwory. Stosowane modele obcego przeszczepu wybiera się jak opisano powyżej. Wykorzystuje się protokół stosujący ludzkie komórki stymulowane ligandem zalpha11 i testuje pod względem skuteczności w usuwaniu komórek nowotworowych i zwiększaniu przeżycia u myszy szczepionych liniami komórkowymi lub pierwotnymi nowotworami.

P r z y k ł a d 52

Identyfikacja klonów sztucznego chromosomu P1 zawierających genomowy DNA ludzkiego liganda zalpha11 cDNA insertu ludzkiego liganda zalpha11 powielano metodą PCR przy użyciu starterów na ba32 zie wektora. Produkt PCR znakowano ³²P i hybrydyzowano z filtrami o wysokiej gęstości reprezentującymi bibliotekę PAC (PI Artificial Chromosome). Filtry i zamrożone roztwory macierzyste bibliotek otrzymywano z Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, New York; segmentem biblioteki był RPCI6, o czterokrotnej głębokości pokrycia. Filtry hybrydyzowano przez noc w temperaturze 65°C w ExpressHyb (Clontech) i przemywano zgodnie z zaleceniami producenta.

Dekodowanie pozytywnych sygnałów dawało identyfikację czterech klonów PAC, oznaczonych 23H17, 34A9, 105G9 i 236H14. Analiza PCR przy użyciu starterów specyficznych dla końca 5' (ZC22,452 (SEQ ID Nr: 100) i ZC 22,451 (SEQ ID Nr: 101)) oraz końca 3' (ZC 22, 450 (SEQ ID Nr: 102) i ZC 22,449 (SEQ ID Nr: 103)) regionu kodującego wykazywała, że PAC 34A9 i 105G9 zawierały oba końce, podczas gdy PAC 23H17 i 236H14 zawierały tylko koniec 5'. PAC 23H17 trawiono Eco RI i Not I i identyfikowano fragment o długości 9 kb, który hybrydyzowano z cDNA sondy liganda zalpha11.

Ten fragment izolowano i subklonowano, przy użyciu metod opisanych w niniejszym dokumencie, do pBluescript II SK (+) (Stratagen), wcześniej trawionego Eco RI i Not I. Sekwencjonowanie ujawniło, że ten fragment zawierał około 380 par zasad regionu promotorowego, egzony 1, 2 i 3, wszystkie introny 1 i 2 i kończył się w intronie 3. Koniec 3' genu ludzkiego liganda zalphall otrzymano metodą PCR przy użyciu DNA z PAC 34A9 jako matrycy, stosując startery ZC23,771 (SEQ ID Nr: 104) i ZC22,449 (SEQ ID Nr: 103).

Stosowano polimerazę DNA Tag, z dostarczanym buforem, przez dodanie 4% DMSO. Warunki reakcji były następujące: 94°C, 5 minut; po czym 35 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 52°C przez 1 minutę, 72°C przez 3 minuty; następnie 72°C przez 7 minut. Uzyskano w ten sposób fragment o długości 2,9 kb, który zawierał część egzonu 3, wszystkie introny 3 i 4, całość egzonu 4 i część kodującą egzonu 5.

Struktura genomowa genu ludzkiego liganda zalpha11 jest następująca od 5' do 3': SEQ ID Nr: 105, zawierająca około 240 bp promotora, egzon 1 (nukleotydy numer 240-455 z SEQ ID Nr: 105), intron 1 (nukleotydy numer 456-562 z SEQ ID Nr: 105), egzon 2 (nukleotyd numer 563-598 z SEQ ID Nr: 105) i część intronu 2 zawierająca 748 par zasad 5' (nukleotyd numer 599- 1 347 z SEQ ID Nr: 105); przerwa o długości około 3 kb; SEQ ID Nr: 106, zawierająca 718 bp 3' intronu 2, egzon 3 (nukleotydy numer 719-874 z SEQ ID Nr: 106) i część końca 5' intronu 3 (nukleotydy numer 875-1656 z SEQ ID Nr: 106); przerwa o długości poniżej około 800 bp; SEQ ID Nr: 107, zawierająca 644 bp intronu 3; przerwa o długości mniej niż około 800 bp i SEQ ID Nr: 108, zawierająca 435 bp 3' intronu 3, egzon 4 (nukleotydy numer 436-513 z SEQ ID Nr: 108), intron 4 (nukleotyd numery 514-603 z SEQ ID Nr: 108) i część końca 5' egzonu 5 (nukleotydy numer 604-645 z SEQ ID Nr: 108).

PL 207 350 B1

P r z y k ł a d 53

125

Badanie wiązania znakowanego ¹²⁵I ludzkiego liganda zalpha11 w iiniach komórkowych mikrogramów oczyszczonego ludzkiego liganda zalpha11 (przykład 29) znakowano 2 mCI

125 ¹²⁵I przy użyciu kuiek jodowych (Pierce, Rockford Iiiinois), zgodnie z instrukcjami producenta. To znakowane białko stosowano do oszacowania wiązania iudzkiego iiganda zalpha11 z ludzkimi komórkami Raji (ATCC Nr CCL-86), stosując wiązanie z dzikiego typu mysimi komórkami BaF3 i komórkami BaF3 transfekowanymi receptorem zalpha11 (komórki BaF3/hzalpha11) jako kontroiami. Spodziewano się wiązania iiganda zalpha11 z komórkami BaF3/hzalpha11 (kontroia pozytywna), zaś nie spodziewano się wiązania z komórkami BaF3 typu dzikiego (kontroia negatywna), w oparciu o wyniki testu proiiferacji (przykład 5).

Około 5 x 10⁵ komórek Raji/studzienkę, 21 x 10⁵ BaF3/hzalpha11 i 1 x 10⁶ komórek BaF3/studzienkę wysiewano w 96-studzienkowych płytkach. Dodawano dziesięć ng/mi znakowanego iudzkiego liganda zalpha11 do studzienek w dwóch powtórzeniach z seriami rozcieńczeń współzawodniczącego nieznakowanego iudzkiego iiganda zalpha11, z 250-krotnym nadmiarem molowym w rozcieńczeniach 1:4 do 0,061-krotnego nadmiaru molowego.

Każdy zestaw warunków miał dwa powtórzenia. Po dodaniu do studzienek znakowanego iudzkiego liganda zalpha11 pozostawiano go do inkubacji w temperaturze 4°C przez 2 godziny, pozwaiając na związanie iiganda z komórkami. Komórki następnie przemywano 3X w buforze wiązania (RPMI1710 (JRH Bioscience) z 1% BSA (Sigma)) i zliczano na liczniku gamma COBRA II AUTO-GAMMA (Packard Instrument Company, Meriden, CT).

Wiązanie znakowanego iiganda zalpha11 z komórkami było wyraźne w komórkach Raji i BaF3/hzalpha11. Oprócz tego w przypadku komórek Raji, średnio 250-krotny nadmiar molowy nieznakowanego liganda zalpha11 zmniejszał wiązanie 3-krotnie w obecności niespecyficznego nieznakowanego związku współzawodniczącego (Interferon Gamma firmy R&D Systems, Minneapolis, MN) i 3,7-krotnie w stosunku do braku związku współzawodniczącego. Współzawodniczenie było zaieżne od dawki dia specyficznego nieznakowanego związku współzawodniczącego - ludzkiego liganda zalpha11. Tak więc, wiązanie iiganda zalpha11 z komórkami Raji było specyficzne. Podobnie, w przypadku pozytywnej kontroii komórek BaF3/zalpha11, 250-krotny nadmiar molowy nieznakowanego liganda zalpha11 zmniejszał wiązanie 2-krotnie w stosunku do nie specyficznego związku współzawodniczącego i 3,06-krotnie w stosunku do braku związku współzawodniczącego. Tak więc, wiązanie liganda zalpha11 z komórkami BaF3/zalpha11 także było specyficzne. Nie obserwowano wiązania współzawodniczącego z komórkami BaF3 typu dzikiego. Tak więc, jak się okazało, iigand zalpha11 wiąże się specyficznie z komórkami Raji i z komórkami Baf3/hzalpha11, iecz nie z kontroią negatywną (komórki Baf3).

P r z y k ł a d 54

Ekspresja receptora zalpha11 na iudzkich komórkach krwi

A. Wytwarzanie i hodowla iudzkich komórek krwi obwodowej

Świeżo pobraną iudzką krew rozcieńczano w stosunku 1:1 za pomocą PBS (GIBCO BRL), wysiewano na Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ,) wirowano przez 30 minut przy 1800 obr/min i pozostawiano do zatrzymania bez hamowania. Warstwę międzyfazową usuwano i przenoszono do świeżej 50 mi probówki Faicon (Faicon, VWR, Seattie, WA), sprowadzając objętość końcową do 40 mi za pomocą PBS i wirowano przez 10 minut przy 1200 obr/min z hamowaniem. Żywotność izoiowanych komórek testowano przy użyciu błękitu trypanu (GIBCO BRL) i komórki ponownie zawieszano przy stężeniu końcowym wynoszącym 1 x 10⁶ komórek/mi w pożywce komórkowej (RPMI Medium 1640, 10% inaktywowanej wysoką temperaturą płodowej surowicy bydięcej, 5% L-glutaminy, 5% Pen/Strep) (GIBCO BRL).

Komórki hodowano w 6-studzienkowych płytkach (Falcon, VWR) przez 0, 4 iub 24 godzin z różnymi bodźcami, opisanymi poniżej. Stymuiację anty-IgM, anty-CD40 i anty-CD3 wykonywano jak w przykładzie 44 i przykładzie 42. Do odpowiednich studzienek dodawano mirystynianu octanu forbolu (PMA) i jonomycynę (Sigma, St. Louis, MO) (przykład 5C) w iiości odpowiednio 10 ng/mi i 0,5 mg/mi. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C w nawiiżonym inkubatorze przez różny czas.

B. Barwienie przeciwciał i anaiiza

Komórki zbierano z płytki, przemywano i ponownie zawieszano w iodowatej pożywce do barwienia (HBSS, 1% płodowej surowicy bydłęcej, 0,1% azydku sodu) w stężeniu wynoszącym około dziesięć miiionów komórek na miiiiitr. Biokowanie receptora Fc i niespecyficzne wiązanie przeciwciał

PL 207 350 B1 do komórek uzyskiwano przez dodanie do zawiesiny komórkowej 10% prawidłowej surowicy koziej (Gemini Bioproducts, Woodland, CA) i 10% prawidłowej surowicy ludzkiej (Ultraserum, Gemini). Równe objętości zawiesiny komórkowej mieszano ze znakowanymi FITC przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko jednemu z markerów linii CDS, CD 19 lub CD 14 (PharMingen, La Jolla, CA) i biotynylowanymi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko ludzkiemu receptorowi zalpha11 (huzalpha11) (przykład 35).

Specyficzność barwienia określano przez współzawodnictwo, przy użyciu rozpuszczalnego receptora zalpha11 CEE (przykład 10A) przy dziesięciokrotnym nadmiarze masowym. Po inkubacji na lodzie przez 60 minut komórki przemywano dwukrotnie lodowatą pożywką do barwienia i ponownie zawieszano w 50 ml pożywki do barwienia, zawierającej streptawidynę-PE (Caltag, Burlingame, CA). Po 30-minutowej inkubacji na lodzie komórki przemywano dwukrotnie lodowatym buforem do przemywania (PBS, 1% płodowej surowicy bydlęcej, 0,1% azydku sodu) i ponownie zawieszano w buforze do przemywania zawierającym 1 mg/ml 7-AAD (Molecular Probes, Eugen, OR) jako markera żywotności. Dane przepływu uzyskiwano na żywych komórkach, przy użyciu cytometru przepływowego FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Zarówno rejestrację, jak i analizę przeprowadzano przy użyciu oprogramowania CellQuest (BD Immunocytometry Systems). Wyniki barwienia przez przeciwciała antyzalpha11 wykazywały, że ludzki receptor zalpha11 ulega ekspresji na ludzkich komórkach krwi obwodowej, wykazujących ekspresję CD3, CD 19 CD 14. Barwienie na komórkach CDS i CD 19 było specyficzne, co udowodniono przez współzawodnictwo bezwzględne z rozpuszczalnym receptorem zalpha11. Barwienie na komórkach CD14 wykazywało pewną specyficzność wobec liganda, co udowodniono przez częściowe współzawodnictwo z rozpuszczalnym receptorem. Aktywacja komórek T z anty-CDS lub komórek B z anty-CD40 powodowała wzrost poziomu powierzchniowego zalpha11 po 24 godzinach. Brak wzrostu poziomu ekspresji zalpha11 był widoczny po 4 godzinach, dla każdego bodźca na każdej populacji komórek. Traktowanie komórek ligandem zalpha11 powodowało zmniejszenie barwienia zalpha11 na komórkach pozytywnych CDS i pozytywnych CD 19 lecz nie pozytywnych komórkach CD 14, zarówno po 4, jak i 24 godzinach.

P r z y k ł a d 55

Wstępna ocena stabilności ludzkiego liganda zalpha11 w wodzie

Prowadzono wstępne badania w celu oceny stabilności ludzkiego liganda zalpha11 w wodzie, w celu uzyskania informacji o zachowaniu w warunkach biologicznych, opracowywaniu preparatów i podawaniu in vivo. Celem były: 1) weryfikacja stabilności i odzysku z minipomp Alzet i ogólne przechowywanie oraz obróbka, 2) określenie charakteru wskazującego na stabilność kilku metod analitycznych, w tym z kationowymiennej HPLC (CX-HPLC), HPLC (RP-HPLC) w układzie faz odwróconych, HPLC wykluczenia (SEC-HPLC) i testy biologiczne (proliferacja BaF3/zalphallR (np. przykład 2 i przykład 4) i 3) określenie szlaków rozkładu ograniczających stabilność i ich zależności kinetycznych.

Równe objętości oczyszczonego ludzkiego liganda zalpha11 (przykład 29) otrzymano przez rozcieńczenie do 2 mg/ml w PBS (pH 7,4) i przechowywano w fiolkach do zamrażania (Nalgen, 1,8 ml) z polietylenu o niskiej gęstości (LDPE) w temperaturze -80°C (kontrola), 5°C, 30°C i 37°C. Próbki testowano co pewnien czas przez 29 dni metodami CX-, RP-, SEC-HPLC i w teście biologicznym. Równe ilości przechowywano także w temperaturze -80°C i poddawano cyklom zamrażania-rozmrażania (f/t) (-80°C/temperatura pokojowa; 5 x f/t, 10 x f/t). Odzysk ludzkiego liganda zalpha11 określano w stosunku do kontroli w temperaturze -80°C (1 f/t) we wszystkich testach.

Pozostały roztwór ludzkiego liganda zalpha11 z próbek kontrolnych w temperaturze -80°C ponownie zamrażano (-80°C) po analizie. Tę objętość (2 f/t) stosowano do oceny stabilności cieplnej konformacyjnej ludzkiego liganda zalpha11 w funkcji pH, metodą dichroizmu kołowego (CD). Roztwór mg/ml rozcieńczano do 100 μg/ml w buforach PBS w zakresie pH 3,3-8,8. Widma dalekiego UV CD rejestrowano w zakresie temperatury 5-90°C co 5°C (n = 3/pH). Stosowanym spektropolarymetrem CD był Jasco 715 (Jasco, Easton, MD). Rozwijanie termiczne monitorowano za pomocą zmian eliptyczności przy 222 nm jako funkcję temperatury. Szacowanie tm oceniano zakładając model rozwijania z dwoma stanami. Dane dopasowywano sigmoidalnie przy użyciu SlideWrite Plus for Windows v4.1 (Advanced Graphics Software; Encinitas, CA). Odzysk i stabilność z minipomp Alzet (Model Nr 1007D; ALZA Corporation, Mountain View, CA) szacowano przez napełnienie pomp 100 μl 2 mg/ml roztworu ludzkiego liganda zalpha11, umieszczając pompy w 1,8 ml LDPE zawierającym 1 ml PBS (pH 7,4) i przechowując je w temperaturze 37°C. Uwalnianie/odzysk ludzkiego liganda zalpha11 z minipomp szacowano metodami CX-, RP- i SEC-HPLC w dniu 2, 4 i 7. Aktywność szacowano w teście biologicznym w dniu 7. Badanie zaplanowano do oceny uwalniania z 3 pomp na jeden czas próbkowania.

PL 207 350 B1

Dane chromatograficzne sugerowały, że metody CX-1 SEC-HPLC wskazywały na stabilność, podczas gdy metoda RP-HPLC- nie. Co najmniej 3 dodatkowe piki wskazujące na widoczne produkty rozkładu obserwowano w CX-HPLC. Metoda SEC-HPLC rozdzielała widoczny agregat ludzkiego liganda zalpha11, wymywany przed ludzkim ligandem zalpha11. Nie obserwowano jednak znaczących dodatkowych pików wymywanych po piku ludzkiego liganda zalpha11. To sugeruje, że produkty rozkładu obserwowane w CX-HPLC najprawdopodobniej wynikały raczej z modyfikacji aminokwasowych, takich jak deamidowanie, niż procesów hydrolizy/proteolizy prowadzących do skróconych wariantów. Mały stopień rozmycia frontu/ogonowania obserwowano w RP-HPLC (w stosunku do kontroli) w próbkach, które, jak się okazało uległy znaczącemu rozkładowi w SEC- i CX-HPLC. Jednak widoczne produkty rozkładu nie były rozdzielane przez RP-HPLC.

Rozkład obserwowany w CX-HPLC zwiększał się w funkcji czasu i temperatury i był następstwem kinetyki pierwszego rzędu. Procent ludzkiego liganda zalpha11 odzyskanego przez CX-HPLC po 29 dniach w temperaturze 37°C, 30°C i 5°C wynosił odpowiednio 39%, 63% i 98%. Agregacja także zwiększała się w sposób zależny od czasu itemperatury. Procent agregatów stwierdzony w preparatach przechowywanych przez 2 9 dni w temperaturze 37°C, 30°C i 5°C wynosił odpowiednio 7,4, 3,4 i poniżej granicy wykrywalności (BDL).

Nie obserwowano istotnych różnic w teście biologiczynm żadnej próbki, co wskazuje, że produkty rozkładu mają równoważną aktywność do nieuszkodzonego ludzkiego liganda zalpha11. Nie obserwowano rozkładu w żadnym teście w próbkach poddawanych do 10 cykli f/t. Uwalnianie ludzkiego liganda zalpha11 z minipomp Alzet było zgodne z teoretycznym oczekiwanym uwalnianiem objętościowym. To sugeruje, że istotna adsorpcja powierzchniowa nie będzie zakłócać dostarczania ludzkiego liganda zalpha11 przy użyciu minipomp Alzet ze stężeniem napełniania 2 mg/ml.

Obserwowano rozkład zgodny z wcześniej stwierdzonym. Procent czystości CX-HPLC ludzkiego liganda zalpha11 uwalnianego po 2, 4 1 7 dniach, określony metodą CX-HPLC, wynosił odpowiednio 96%, 90% i 79%.

Należy także zauważyć, że rozkład występuje również po uwolnieniu ludzkiego liganda zalpha11 lub rozcieńczeniu pożywką do uwlaniania. Zatem procent czystości w minipompie może być nieco inny niż określony w pożywce do uwalniania. Aktywność biologiczna każdej próbki była zgodna z oczekiwaną ilością ludzkiego liganda zalpha11 uwalnianego z minipomp. Widma CD dalekiego UV ludzkiego liganda zalpha11, jak oczekiwano, były zgodne z interleukinami, takimi jak IL-3 (J. Biochem., 23: 352-360, 1991), IL-4 (Biochemistry, 30: 1259-1264, 1991) i mutantami IL-6 (Biochemistry, 35: 11503-111511, 1996). Całkowite zmiany w widmach CD dalekiego UV w funkcji pH nie były obserwowane. Wyniki wykazywały, że pH maksymalnej stabilności cieplnej/konformacyjnej wynosiło = pH 7,4.

Analiza krzywych rozwijania była w oparciu o dwustanowy machanizm rozwijania, co pozwoliło na porównanie stabilności cieplnej/konformacyjnej jako funkcji pH/składu. Jednak jeden lub więcej związków pośrednich może istnieć podczas procesu rozwijania, ponieważ kooperatywność była względnie niska, na podstawie płytkości krzywej rozwijania. Chociaż badania nie były konkretnie planowane, aby określić, czy ludzki ligand zalpha11 zwija się po rozwijaniu cieplnym do temperatury 90°C, wstępne dane sugerują, że zachodzi co najmniej częściowe zwijanie po schłodzeniu próbki do tempeartury 20°C. Te badania pozwalają na określenie analitycznego paradygmatu do oceny czystości i weryfikacji stabilności ludzkiego liganda zalpha11. Przykładowo, SEC-HPLC można stosować do określania obszaru i szybości agregacji w roztworze wodnym. Podobnie, CX-HPLC można stosować do określania obszaru i tempa rozkładu ludzkiego liganda zalpha11 przez mechanizmy inne niż agregacja. Do weryfikacji aktywności ludzkiego liganda zalpha11 i jego produktów rozkładu w wodzie, można stosować test biologiczny. Przykładowo, warianty ludzkiego liganda zalpha11 wytworzone w roztworze wodnym i rozdzielone w CX-HPLC mogą same być użyteczne jako środki terapeutyczne ponieważ, mają równoważną aktywność biologiczną. Także fakt, że ludzki ligand zalpha11 rozwija się w różnych procesach (agregacja, modyfikacje aminokwasowe) sugeruje zalecany lub niepowtarzalny preparat, który minimalizuje szybkość każdego procesu rozkładu i może być konieczny do uzyskania długotrwałej stabilności produktu w roztworze. Identyfikacja charakteru produktów rozkładu w wodzie i określenie ich zależności kinetycznych (pH, stężenie, substancje pomocnice) trwa. Określa się stabilność ludzkiego liganda zalpha11 w surowicy/osoczu w celu zaplanowania i interpretacji badań in vivo. Z powyższego, należy rozumieć, że mimo opisania w niniejszym dokumencie konkretnych postaci realizacji wynalazku w celach zilustrowania, można wykonywać różne modyfikacje bez odchodzenia od ducha i zakresu wynalazku. W związku z tym wynalazek nie jest ograniczony, chyba, że w załączonych zastrzeżeniach.

PL 207 350 B1

14P13622PL00

Lista sekwencji <110> ZymoGenetics. Inc.

<120> Nowe Ugandy ZALPHA11 <130> 99-16PC <150> US 09/264,908 <151> 1999-03-09 <150> US 09/265.992 <151> 1999-03-11 <150> US 60/142,013 <151> 1999-07-01 <160> 115 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (47). . . (532) <400> 1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtactt atg aga tcc 55

Met Arg Ser

agt

cct

ggc

aac

atg

gag

agg

att

gtc

atc

tgt

ctg

atg

gtc

atc

ttc

Ser

Pro

Gly

Asn

Met

Glu

Arg

Ile

Val

Ile

Cys

Leu

Met

Val

Ile

Phe

5

10

15

ttg

ggg

aca

ctg

gtc

cac

aaa

tca

agc

tcc

caa

ggt

caa

gat

cgc

cac

PL 207 350 B1

199

Leu

Gly

Thr

Leu

Val

His

Lys

Ser

Ser

Ser

Gin

Gly

Gin

Asp

Arg

His

20

25

30

35

atg

att

aga

atg

cgt

caa

ctt

ata

gat

att

gtt

gat

cag

ctg

aaa

aat

Met

Ile

Arg

Met

Arg

Gin

Leu

Ile

Asp

Ile

Val

Asp

Gin

Leu

Lys

Asn

40

45

50

tat

gtg

aat

gac

ttg

gtc

cct

gaa

ttt

ctg

cca

get

cca

gaa

gat

gta

Tyr

Val

Asn

Asp

Leu

Val

Pro

Glu

Phe

Leu

Pro

Ala

Pro

Glu

Asp

Val

55

60

65

gag

aca

aac

tgt

gag

tgg

tea

get

ttt

tec

tgt

ttt

cag

aag

gee

caa

Glu

Thr

Asn

Cys

Glu

Trp

Ser

Ala

Phe

Ser

Cys

Phe

Gin

Lys

Ala

Gin

70

75

80

eta

a ag

tea

gca

aat

aca

gga

aac

aat

gaa

agg

ata

atc

aat

gta

tea

Leu

Lys

Ser

Ala

Asn

Thr

Gly

Asn

Asn

Glu

Arg

Ile

Ile

Asn

Val

Ser

85

90

95

att

aaa

aag

ctg

aag

agg

aaa

cca

cct

tcc

aca

aat

gca

ggg

aga

aga

Ile

Lys

Lys

Leu

Lys

Arg

Lys

Pro

Pro

Ser

Thr

Asn

Ala

Gly

Arg

Arg

100

105

110

115

cag

aaa

cac

aga

eta

aca

tgc

cct

tea

tgt

gat

tet

tat

gag

aaa

aaa

Gin

Lys

His

Arg

Leu

Thr

Cys

Pro

Ser

Cys

Asp

Ser

Tyr

Glu

Lys

Lys

120

125

130

cca

CCC

aaa

gaa

ttc

eta

gaa

aga

ttc

aaa

tea

ctt

etc

caa

aag

atg

Pro

Pro

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Arg

Phe

Lys

Ser

Leu

Leu

Gin

Lys

Met

135

140

145

att

cat

cag

cat

ctg

tcc

tet

aga

aca

cac

gga

agt

gaa

gat

tcc

Ile

His

Gin

His

Leu

Ser

Ser

Arg

Thr

His

Gly

Ser

Glu

Asp

Ser

150

155

160

247

295

343

391

439

487

532 tgaggatcta acttgcagtt ggacactatg ttacatactc taatatagta gtgaaagtca tttctttgta ttccaagtgg aggagcccta ttaaattata taaagaaata <210> 2

592

642

100

PL 207 350 B1 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Arg Ser Ser Pro	Gly	Asn Met Glu	Arg	Ile	Val	Ile	Cys	Leu	Met
1 5			10					15
Val Ile Phe Leu Gly	Thr	Leu Val His	Lys	Ser	Ser	Ser	Gin	Gly	Gin
20		25					30
Asp Arg His Met Ile	Arg	Met Arg Gin	Leu	Ile	Asp	Ile	Val	Asp	Gin
35		40				45
Leu Lys Asn Tyr Val	Asn	Asp Leu Val	Pro	Glu	Phe	Leu	Pro	Ala	Pro
50		55			60
Glu Asp Val Glu Thr	Asn	Cys Glu Trp	Ser	Ala	Phe	Ser	Cys	Phe	Gin
65	70			75					80
Lys Ala Gin Leu Lys	Ser	Ala Asn Thr	Gly	Asn	Asn	Glu	Arg	Ile	Ile
85			90					95
Asn Val Ser Ile Lys	Lys	Leu Lys Arg	Lys	Pro	Pro	Ser	Thr	Asn	Ala
100		105					110
Gly Arg Arg Gin Lys	His	Arg Leu Thr	Cys	Pro	Ser	Cys	Asp	Ser	Tyr
115		120				125
Glu Lys Lys Pro Pro	Lys	Glu Phe Leu	Glu	Arg	Phe	Lys	Ser	Leu	Leu
130		135			140
Gin Lys Met Ile His	Gin	His Leu Ser	Ser	Arg	Thr	His	Gly	Ser	Glu
145	150			155					160
Asp Ser
<210> 3
<211> 486
<212> DNA
<213> Sekwencja	sztuczna

PL 207 350 B1

101 <220>

<223> Zdegenerowana sekwencja polinukleotydowa ludzkiego liganda zalphall <221> misc_feature <222> (1). . .(486) <223> n = A, T,C lub G <400> 3

atgmgnwsnw	snccnggnaa	yatggarmgn	athgtnatht	gyytnatggt	nathttyytn	60
ggnacnytng	tncayaarws	nwsnwsncar	ggncargaym	gncayatgat	hmgnatgmgn	120
carytnathg	ayathgtnga	ycarytnaar	aaytaygtna	aygayytngt	nccngartty	180
ytnccngcnc	cngargaygt	ngaracnaay	tgygartggw	sngcnttyws	ntgyttycar	240
aargcncary	tnaarwsngc	naayacnggn	aayaaygarm	gnathathaa	ygtnwsnath	300
aaraarytna	armgnaarcc	nccnwsnacn	aaygcnggnm	gnmgncaraa	rcaymgnytn	360
acntgyccnw	sntgygayws	ntaygaraar	aarccnccna	argarttyyt	ngarmgntty	420
aarwsnytny	tncaraarat	gathcaycar	cayytnwsnw	snmgnacnca	yggnwsngar	480

gaywsn 486 <210> 4 <211> 535 <212> DNA

<213>	Mus musculus
<220>
<221>	Źródło
<222>	(0) . . . (0)
<223>	EST1483966;	GenBank	Acc #AA764063
<400>	4
taaacatgta tcatataagg	atatgtcata	ataaggatta	atattatata	attataaata	60
atttataata cttataatat	cattgtttgg	ttcactaata	aatctatgga	tacatggtca	120
aaatggaaat gaatattttg	ccaattatta	atccccaaag	tcattgaaaa	taagcataac	180
cattctactg acttgttaga	ctctaaacta	acataaaata	cattttcaga	aataaattca	240

102

PL 207 350 B1

accgatctta	cctttacatc ttgtggagct gatagaagtt caggatccta agaaaattaa	300
ccaaagagta	ttagttctga gttggtgata caagtcaaaa ggctcctttt gcattaatta	360
aaaaaatatt	atttaaattg cattgtgaca aacatggcct taccaagtca ttttcataga	420
ttttcagctg	ttcaacaatg tcaataaggt gacgaagtct aatcaggagg cgatctggcc	480
cttgggggct	tgatttatgg gccactgtcc ccaagaagat gactaccaga cagac	535

<210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC17212 <400> 5 ggggaattcg aagccatgcc ctcttgggcc ctc 33 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC19914 <400> 6 caatggatgg gtctttagca gcagtaggcc 30 <210> 7 <211> 1614 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7

atgccgcgtg	gctgggccgc ccccttgctc ctgctgctgc tecagggagg ctggggctgc	60
cccgacctcg	tctgctacac cgattacctc cagacggtca tctgcatcct ggaaatgtgg	120
aacctccacc	ccagcacgct cacccttacc tggcaagacc agtatgaaga gctgaaggac	180

PL 207 350 B1

103

gaggccacct	cctgcagcct	ccacaggtcg	gcccacaatg	ccacgcatgc	cacctacacc	240
tgccacatgg	atgtattcca	cttcatggcc	gacgacattt	tcagtgtcaa	catcacagac	300
cagtctggca	actactccca	ggagtgtggc	agctttctcc	tggctgagag	catcaagccg	360
gctccccctt	tcaacgtgac	tgtgaccttc	tcaggacagt	ataatatctc	ctggcgctca	420
gattacgaag	accctgcctt	ctacatgctg	aagggcaagc	ttcagtatga	gctgcagtac	400
aggaaccggg	gagacccctg	ggctgtgagt	ccgaggagaa	agctgatctc	agtggactca	540
agaagtgtct	ccctcctccc	cctggagttc	cgcaaagact	cgagctatga	gctgcaggtg	600
cgggcagggc	ccatgcctgg	ctcctcctac	caggggacct	ggagtgaatg	gagtgacccg	660
gtcatctttc	agacccagtc	agaggagtta	aaggaaggct	ggaaccctca	cctgctgctt	720
ctcctcctgc	ttgtcatagt	cttcattcct	gccttctgga	gcctgaagac	ccatccattg	780
tggaggctat	ggaagaagat	atgggccgtc	cccagccctg	agcggttctt	catgcccctg	840
tacaagggct	gcagcggaga	cttcaagaaa	tgggtgggtg	cacccttcac	tggctccagc	900
ctggagctgg	gaccctggag	cccagaggtg	ccctccaccc	tggaggtgta	cagctgccac	960
ccaccacgga	gcccggccaa	gaggctgcag	ctcacggagc	tacaagaacc	agcagagctg	1020
gtggagtctg	acggtgtgcc	caagcccagc	ttctggccga	cagcccagaa	ctcggggggc	1080
tcagcttaca	gtgaggagag	ggatcggcca	tacggcctgg	tgtccattga	cacagtgact	1140
gtgctagatg	cagaggggcc	atgcacctgg	ccctgcagct	gtgaggatga	cggctaccca	1200
gccctggacc	tggatgctgg	cctggagccc	agcccaggcc	tagaggaccc	actcttggat	1260
gcagggacca	cagtcctgtc	ctgtggctgt	gtctcagctg	gcagccctgg	gctaggaggg	1320
cccctgggaa	gcctcctgga	cagactaaag	ccaccccttg	cagatgggga	ggactgggct	1380
gggggactgc	cctggggtgg	ccggtcacct	ggaggggtct	cagagagtga	ggcgggctca	1440
cccctggccg	gcctggatat	ggacacgttt	gacagtggct	ttgtgggctc	tgactgcagc	1500
agccctgtgg	agtgtgactt	caccagcccc	ggggacgaag	gacccccccg	gagctacctc	1560
cgccagtggg	tggtcattcc	tccgccactt	tcgagccctg	gaccccaggc	cagc	1614

<210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

104

PL 207 350 B1 <223> Starter oligonukleotydowy ZC19913 <400> 8 ggcctactgc tgctaaagac ccatccattg <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC20097 <400> 9 acatctagat tagctggcct ggggtccagg cgt <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC12700 <400> 10 ggaggtctat ataagcagag c <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC5020 <400> 11 cactggagtg gcaacttcca g <210> 12 <211> 20

PL 207 350 B1

105 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC6675 <400> 12 gtggatgccg aacccagtcc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC7727 <400> 13 tgttcacagc tacctgggct c 21 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC8290 <400> 14 ccaccgagac tgcttggatc accttg 26 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC19572 <400> 15

106

PL 207 350 B1 gtcctgtggc tgtgtctcag 20 <210> 16

<211>	21
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter oligonukleotydowy ZC6622
<400>	16

ctgggctgga aactggcaca c 21 <210> 17

<211>	18
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter oligonukleotydowy ZC7736
<400>	17

cactgtcaga aatggagc 18 <210> 18

<211>	24
<212>	□NA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220
<223>	Starter oligonukleotydowy ZC9273
<400>	18

ggtccctccc cgggcaccga gaga 24 <210> 19

<211>	36
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

PL 207 350 B1

107 <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC19905 <400> 19 acaggatccg tcagcatgcc gcgtggctgg gccgcc 36 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC19906 <400> 20 acagaattct tagctggcct ggggtccagg cgt 33 <210> 21 <2U> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC20114 <400> 21 cctgccttct acatgctgaa gg 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC19459 <400> 22 ctcctcctgc ttgtcatagt c 21 <210> 23

108

PL 207 350 B1 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC19954 <400> 23 actgggctgg gggactgc <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC20116 <400> 24 agcacagtca ctgtgtcaat gg <210 25 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Starter oligonukleotydowy ZC13946 <400 25 ccctgcagtg atcaacatgg ccaagttgac cagtgccgtt <210 26 <211> 45 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Starter oligonukleotydowy ZC13945

PL 207 350 B1

109 <400> 26 gcccatggac tagtttcgaa aggtcgagtg tcagtcctgc tcctc 45 <210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC18698 <400> 27 tttttttctc gagacttttt tttttttttt tttt 40 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC14063 <400> 28 caccagacat aatagctgac agact 25 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> sekwencja aminokwasowa znacznika Glu-Glu (CEE) <400> 29

Glu Tyr Met Pro Met Glu

5 <210> 30 <211> 36

110

PL 207 350 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC19931 <400> 30 ggttggtacc gcaagatgcc gcgtggctgg gccgcc 36 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC19932 <400> 31 cggaggatcc gtgagggttc cagccttcc 29 <210> 32 <211> 66 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy obejmujący wektor oskrzydlający region oraz koniec 5' domeny zewnątrzkomórkowej zalphall <400> 32 tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc agggaattca tcgataatgc cgcgtggctg 60 ggccgc 66 <210> 33 <211> 699 <212> DNA <213> Homo sapiens

PL 207 350 B1

111 <400> 33

gagcccagat	cttcagacaa	aactcacaca	tgcccaccgt	gcccagcacc	tgaagccgag	60
ggggcaccgt	cagtcttcct	cttcccccca	aaacccaagg	acaccctcat	gatctcccgg	120
acccctgagg	tcacatgcgt	ggtggtggac	gtgagccacg	aagaccctga	ggtcaagttc	190
aactggtacg	tggacggcgt	ggaggtgcat	aatgccaaga	caaagccgcg	ggaggagcag	240
tacaacagca	cgtaccgtgt	ggtcagcgtc	ctcaccgtcc	tgcaccagga	ctggctgaat	300
ggcaaggagt	acaagtgcaa	ggtctccaac	aaagccctcc	catcctccat	cgagaaaacc	360
atctccaaag	ccaaagggca	gccccgagaa	ccacaggtgt	acaccctgcc	cccatcccgg	420
gatgagctga	ccaagaacca	ggtcagcctg	acctgcctgg	tcaaaggctt	ctatcccagc	480
gacatcgccg	tggagtggga	gagcaatggg	cagccggaga	acaactacaa	gaccacgcct	540
cccgtgctgg	actccgacgg	ctccttcttc	ctctacagca	agctcaccgt	ggacaagagc	600
aggtggcagc	aggggaacgt	cttctcatgc	tccgtgatgc	atgaggctct	gcacaaccac	660
tacacgcaga	agagcctctc	cctgtctccg	ggtaaataa			699

<210> 34 <211> 62 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Pierwszy starter oligonukleotydowy przekraczający koniec 3' domeny zewnątrzkomórkowej zalphall oraz koniec 5' Fc4 <400> 34 gcacggtggg catgtgtgag ttttgtctga agatctgggc tcgtgagggt tccagccttc 60

ct
<210>	35
<211>	61
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>

112

PL 207 350 B1 <223> Drugi starter oligonukleotydowy obejmujący koniec 3' domeny zewnątrzkomórkowej zalphall oraz koniec 5’ Fc4 <400> 35 agacccagtc agaggagtta aaggaaggct ggaaccctca cgagcccaga tcttcagaca 60 a 61 <210> 36 <211> 67 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy obejmujący koniec 3' Fc4 oraz wektor oskrzydlający region <400> 36 gtgggcctct ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tctagattat ttacccggag 60 acaggga 67 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> C-terminalna sekwencja aminokwasowa FLAG <400> 37

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1	5
<210>	38 .
<211>	26
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>

PL 207 350 B1

113 <223> Starter oligonukleotydowy ZC7764a <400> 38 .

tttttttttt tttttttttt ttttta <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC7764b <400> 39 tttttttttt tttttttttt tttttc <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22034 <400> 40 ttcaaatcac ttctccaaa <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22035 <40Q> 41 ttttggagaa gtgatttgaa <210> 42 <211> 16

114

PL 207 350 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22050 <400> 42 gaatgcgtca acttat 16 <210> 43 <211> 16 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22051 <400> 43 ggaccaagtc attcac 16 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22056 <400> 44 gtctgtctgg tagtcatctt cttgg 25 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22057 <400> 45

PL 207 350 B1

115 cttgtggagc tgatagaagt tcagg 25 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22205 <400> 46 agctgttcaa caatgtcaat aaggtg 26 <210> 47 <211> 24 .

<212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22206 <400> 47 cctcctgatt agacttcgtc acct 24 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC9739 <400> 48 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 49 <2U> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

116

PL 207 350 B1 <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC9719 <400> 49 actcactata gggctcgagc ggc <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22 0>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC14063 <400> 50 caccagacat aatagctgac agact <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC5020 <400> 51 cactggagtg gcaacttcca g <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22421 <400> 52 ctaaaatggc tccttcaaaa <210> 53

PL 207 350 B1

117 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22604 <400> 53 cacacaggcc ggccaccatg ggcttccagc ctccggccgc 40 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22641 <400> 54 atgcgttggt tctgattgtg 20 <210> 55 <211> 3072 <212> DNA <213> mus musculus <220>

<221> CDS <222> (54). ..(491) <400> 55 gagaaccaga ccaaggccct gtcatcagct cctggagact cagttctggt ggc atg 56

Met gag agg acc ctt gtc 'tgt ctg gta gtc atc ttc ttg ggg aca gtg gcc 104

Glu Arg Thr Leu Val Cys Leu Val Val Ile Phe Leu Gly Thr Val Ala

10 15

118

PL 207 350 B1

cat

aaa

tea

age

ccc

ca a

ggg

cca

gat

ege

etc

ctg

att

aga

ctt

cgt

152

His

Lys

Ser

Ser

Pro

Gln

Gly

Pro

Asp

Arg

Leu

Leu

Ile

Arg

Leu

Arg

20

25

30

cac

ctt

att

gac

att

gtt

gaa

cag

ctg

aaa

atc

tat

gaa

aat

gac

ttg

200

His

Leu

Ile

Asp

Ile

Val

Glu

Gln

Leu

Lys

Ile

Tyr

Glu

Asn

Asp

Leu

35

40

45

gat

cct

gaa

ctt

eta

tea

get

cca

caa

gat

gta

aag

ggg

cac

tgt

gag

248

Asp

Pro

Glu

Leu

Leu

Ser

Ala

Pro

Gln

Asp

Val

Lys

Gly

His

Cys

Glu

50

55

60

65

cat

gca

get

ttt

gee

tgt

ttt

cag

aag

gee

aaa

etc

aag

cca

tea

aac

296

His

Ala

Ala

Phe

Ala

Cys

Phe

Gln

Lys

Ala

Lys

Leu

Lys

Pro

Ser

Asn

70

75

80

cct

gga

aac

aat

aag

aca

ttc

atc

att

gac

etc

gtg

gee

cag

etc

agg

344

Pro

Gly

Asn

Asn

Lys

Thr

Phe

Ile

Ile

Asp

Leu

Val

Ala

Gln

Leu

Arg

85

90

95

agg

agg

ctg

cct

gee

agg

agg

gga

gga

aag

aaa

cag

aag

cac

ata

get

392

Arg

Arg

Leu

Pro

Ala

Arg

Arg

Gly

Gly

Lys

Lys

Gln

Lys

His

Ile

Ala

100

105

110

aaa

tgc

cct

tcc

tgt

gat

teg

tat

gag

aaa

agg

aca

ccc

aaa

gaa

ttc

440

Lys

Cys

Pro

Ser

Cys

Asp

Ser

Tyr

Glu

Lys

Arg

Thr

Pro

Lys

Glu

Phe

115

120

125

eta

gaa

aga

eta

aaa

tgg

etc

ctt

caa

aag

atg

att

cat

cag

cat

etc

438

Leu

Glu

Arg

Leu

Lys

Trp

Leu

Leu

Gln

Lys

Met

Ile

His

Gln

His

Leu

130

135

140

145

tcc tagaacacat aggacccgaa gattcctgag gatccgagaa gattcccgag

Ser gactgaggag acgecggaca ctatagacgc tcacgaatgc aggagtacat cttgcctctt gggattgcaa gtggagaagt acgatacgtt atgataagaa caactcagaa aagctatagg ttaagatcct ttcgcccatt aactaagcag acattgtggt tccctgcaca gactccatgc

541

601

661

721

PL 207 350 B1

119

tgtcaacatg	gaaaatctca	actcaacaag	agcccagctt	cccgtgtcag	ggatttctgg	781
tgcttctcaa	gctgtggctt	catcttattg	cccaactgtg	acattctttg	attggaaggg	841
gaaaactaaa	gcttttagca	aaaatacagc	tagggaattt	gtcgatctgc	gagagtaaga	901
cctcttatga	tcctaacgga	atgatgtaag	ctggaaataa	taagcataag	atgaaattga	961
aaattgaagt	ctttattctt	taagaaaaac	tttgtacttg	aaagcatgtc	tgaagagttt	1021
actcattacc	acaaacatct	agcatattga	taactaacat	ctttatactc	tacaagagag	1081
gctttccaga	taggtacagt	tttt.Ctt.CLC	tattaggtct	atcaaaattt	aacctattat	1141
gagggtcacc	cctggctttc	actgtttttc	taaagaggca	agggtgtagt	aagaagcagg	1201
cttaagttgc	cttcctccca	atgtcaagtt	cctttataag	ctaatagttt	aatcttgtga	1261
agatggcaat	gaaagcctgt	ggaagtgcaa	acctcactat	cttctggagc	caagtagaat	1321
tttcaagttt	gtagctctca	cctcaagtgg	ttatgggtgt	cctgtgatga	atctgctagc	1381
tccagcctca	gtctcctctc	ccacatcctt	tcctttcttt	cctctttgaa	acttctaaga	1441
aaaagcaatc	caaacaagtt	cagcacttaa	gacacattgc	atgcacactt	ttgataagtt	1501
aaatccaacc	atctatttaa	aatcaaaatc	aggagatgag	ccaagagacc	agaggttctg	1561
ttccagtttt	aaacagactt	ttactgaaca	tcccaatctt	ttaaccacag	aggctaaatt	1621
gagcaaatag	ttttgccatt	tgatataatt	tccaacagta	tgtttcaatg	tcaagttaaa	1681
aagtctacaa	agctattttc	cctggagtgg	tatcatcgct	ttgagaattt	cttatggtta	1741
aaatggatct	gagatccaag	catggcctgg	gggatggttt	tgatctaagg	aaaaaggtgt	1801
ctgtacctca	cagtgccttt	aaaacaagca	gagatcccgt	gtaccgccct	aagatagcac	1861
agactagtgt	taactgattc	ccagaaaagt	gtcacaatca	gaaccaacgc	attctcttaa	1921
actttaaaaa	tatgtattgc	aaagaacttg	tgtaactgta	aatgtgtgac	tgttgatgac	1981
attatacaca	catagcccac	gtaagtgtcc	aatggtgcta	gcattggttg	ctgagtttgc	2041
tgctcgaaag	ctgaagcaga	gatgcagtcc	ttcacaaagc	aatgatggac	agagagggga	2101
gtctccatgt	tttattcttt	tgttgtttct	ggctgtgtaa	ctgttgactt	cttgacattg	2161
tgatttttat	atttaagaca	atgtatttat	tttggtgtgt	ttattgttct	agccttttaa	2221
atcactgaca	atttctaatc	aagaagtaca	aataattcaa	tgcagcacag	gctaagagct	2281
tgtatcgttt	ggaaaagcca	gtgaaggctt	ctccactagc	catgggaaag	ctacgcttta	2341
gagtaaacta	gacaaaattg	cacagcagtc	ttgaacctct	ctgtgctcaa	gactcagcca	2401
gtcctttgac	attattgttc	actgtgggtg	ggaacacatt	ggacctgaca	cactgttgtg	2461

120

PL 207 350 B1

tgtccatgaa	ggttgccact	ggtgtaagct	ttttttggtt	ttcattctct	tatctgtaga	2321
acaagaatgt	ggggctttcc	taagtctatt	ctgtatttta	ttctgaactt	cgtatgtctg	2581
agttttaatg	ttttgagtac	tcttacagga	acacctgacc	acacttttga	gttaaatttt	2641
atcccaagtg	tgatatttag	ttgttcaaaa	agggaaggga	tatacataca	tacatacata	2701
catacataca	tatatatata	tatatataca	tatatatata	tatatatatg	tatatatata	2761
tatatataga	gagagagaga	gagagagaga	gagaaagaga	gagaggttgt	tgtaggtcat	2821
aggagttcag	aggaaatcag	ttatggccgt	taatactgta	gctgaaagtg	ttttctttgt	2881
gaacaaattc	atagcattat	tgatctatgt	tattgctctg	ttttatttac	agtcacacct	2941
gagaatttag	ttttaatatg	aatgatgtac	tttataactt	aatgattatt	tattatgtat	3001
ttggttttga	atgtttgtgt	tcatggcttc	ttatttaaga	cctgatcata	ttaaatgcta	3061
cccagtccgg	a					3072

<210> 56 <211> 146 <212> PRT <213> mus musculus <400> 56

Met

Glu

Arg

Thr

Leu

Val

Cys

Leu

Val

Val

Ile

Phe

Leu

Gly

Thr

Val

1

15

10

15

Ala

His

Lys

Ser

Ser

Pro

Gln

Gly

Pro

Asp

Arg

Leu

Leu

Ile

Arg

Leu

20

25

30

Arg

His

Leu

Ile

Asp

Ile

Val

Glu

Gln

Leu

Lys

Ile

Tyr

Glu

Asn

Asp

35

40

45

Leu

Asp

Pro

Glu

Leu

Leu

Ser

Ala

Pro

Gln

Asp

Val

Lys

Gly

His

Cys

50

55

60

Glu

His

Ala

Ala

Phe

Ala

Cys

Phe

Gln

Lys

Ala

Lys

Leu

Lys

Pro

Ser

65

70

75

80

Asn.

Pro

Gly

Asn

Asn

Lys

Thr

Phe

Ile

Ile

Asp

Leu

Val

Ala

Gln

Leu

85

90

95

Arg

Arg

Arg

Leu

Pro

Ala

Arg

Arg

Gly

Gly

Lys

Lys

Gln

Lys

His

Ile

PL 207 350 B1

121

100 105 110

Ala

Lys

Cys

Pro

Ser

Cys

Asp

Ser

Tyr

Glu

Lys

Arg

Thr

Pro

Lys

Glu

115

120

125

Phe

Leu

Glu

Arg

Leu

Lys

Trp

Leu

Leu

Gin

Lys

Met

Ile

His

Gin

His

130 135 140

Leu Ser

145 <210> 57 <211> 34 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22283 <400> 57 cgctcgagac catggagagg acccttgtct gtct <210> 58 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22284 <400> 58 gctctagaat cttctcggat cctcaggaat c <210> 59 *211> 100 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd ZC12749

122

PL 207 350 B1 <400> 59 gtaccttccc gtaaatccct ccccttcccg gaattacaca cgcgtatttc ccagaaaagg 60 aactgtagat ttctaggaat tcaatccttg gccacgcgtc 100 <210> 60 <211> 100 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd ZC12748 <400> 60 tcgagacgcg tggccaagga ttgaattcct agaaatctac agttcctttt ctgggaaata 60 cgcgtgtgta attccgggaa ggggagggat ttacgggaag 100 <210> 61 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22143 <400> 61 cgtatcggcc ggccaccatg agatccagtc ct 32 <210> 62 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22144 <400> 62 cgtacgggcg cgcctcagga atcttcactt cc 32 <210> 63

PL 207 350 B1

123 <211> 493 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 63

tccagtcctg	gcaacatgga	gaggattgtc	atctgtctga	tggtcatctt	cttggggaca	60
ctggtccaca	aatcaagctc	ccaaggtcaa	gatcgccaca	tgattagaat	gcgtcaactt	120
atagatattg	ttgatcagct	gaaaaattat	gtgaatgact	tggtccctga	atttctgcca	180
gctccagaag	atgtagagac	aaactgtgag	tggtcagctt	tttcctgttt	tcagaaggcc	240
caactaaagt	cagcaaatac	aggaaacaat	gaaaggataa	tcaatgtatc	aattaaaaag	300
ctgaagagga	aaccaccttc	cacaaatgca	gggagaagac	agaaacacag	actaacatgc	360
ccttcatgtg	attcttatga	gaaaaaacca	cccaaagaat	tcctagaaag	attcaaatca	420
cttctccaaa	agatgattca	tcagcatctg	tcctctagaa	cacacggaag	tgaagattcc	480

tga 483 <210> 64 <211> 57 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22052 <400> 64 tcatataggc cggccatatg cccgggcgcc accatggatt ccagtcctgg caacatg 57 <210> 65 <211> 57 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22053 <400> 65 gtacaacccc agagctgttt taaggcgcgc ctctagatca ggaatcttca cttccgt 57

124

PL 207 350 B1 <210> 66 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC23115 <400> 66 gtatacggcc ggccaccatg gagaggaccc tt 32 <210> 67 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC23116 <40Q> 67 cgtatcggcg cgccctagga gagatgctga tg 32 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC20892 <400> 68 gtatacgttt aaacgccacc atgccgcgtg gctgg 35 <210> 69 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

PL 207 350 B1

125 <223> Starter oligonukleotydowy ZC20893 <400> 69 cgtatcggcg cgccttacaa tggatgggtc tt 32 <210> 70 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22054 <400> 70 cccggggtcg acaccatgga ttccagtcct ggcaacatg 39 <210> 71 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22055 <400> 71 tgcagtttaa actcaggaat cttcacttcc gt 32 <210> 72 <211> 40 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd huzalphallL-1 <400> 72

Gin Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gin Leu Ile Asp lie Val Asp

10 15

Gin Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala

126

PL 207 350 B1

25 30

Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys

40 <210> 73 <211> 32 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd huzalphallL-3 <400> 73

Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu

10 15

Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gin Lys Met Ile His Gin His Leu Ser

	20 25
<210>	74
<211>	29
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter oligonukleotydowy ZC23444

<400> 74 gcccgggcgg atccatggat tccagtcct 29

<210>	75
<211>	32
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter oligonukleotydowy ZC23445
<400>	75

PL 207 350 B1

127 cgcgccctcg agtcaggaat cttcacttcc gt 32 <210> 76 <211> 17 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC447 <400> 76 taacaatttc acacagg 17 <210> 77 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC97 6 <400> 77 cgttgtaaaa cgacggcc 18 <210> 78 <211> 66 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22128 <400> 78 tcaccacgcg aattcggtac cgctggttcc gcgtggatcc caagatcgcc acatgattag 60 aatgcg 66 <210> 79 <211> 68 <212> DNA

128

PL 207 350 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22127 <400> 79 tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca tcaggaatct tcacttccgt 60 gtgttcta 68 <210> 80 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC19372 <400> 80 tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc 40 <210> 81 <211> 60 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC19351 <400> 81 acgcgcagac taattcgagc tcccaccatc accatcacca cgcgaattcg gtaccgctgg 60 <210> 82 <211> 60 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC19352 <400> 82

PL 207 350 B1

129 actcactata gggcgaattg cccgggggat ccacgcggaa ccagcggtac cgaattcgcg 60 <210> 83 <211> 42 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC19371 <400> 83 acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tg 42 <210> 84 <211> 1560 <212> DMA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<221> CDS <222> (I)... (1560) <223> Polinukleotyd fuzyjny MBP-ludzki ligand zalphall <400> 84

atg

aaa

act

gaa

gaa

ggt

aaa

ctg

gta

atc

tgg

att

aac

ggc

gat

aaa

Met

Lys

Thr

Glu

Glu

Gly

Lys

Leu

Val

Ile

Trp

Ile

Asn

Gly

Asp

Lys

1

5

10

15

ggc

tat

aac

ggt

ctc

gct

gaa

gtc

ggt

aag

aaa

ttc

gag

aaa

gat

acc

Gly

Tyr

Asn

Gly

Leu

Ala

Glu

Val

Gly

Lys

tys

Phe

Glu

Lys

Asp

Thr

20

25

30

gga

att

aaa

gtc

ace

gtt

gag

cat

ccg

gat

aaa

ctg

gaa

gag

aaa

ttc

Gly

Ile

Lys

Val

Thr

Val

Glu

His

Pro

Asp

Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

Phe

35

40

45

cca

cag

gtt

gcg

gca

act

ggc

gat

ggc

cct

gac

att

atc

ttc

tgg

gca

Pro

Gin

Val

Ala

Ala

Thr

Gly

Asp

Gly

Pro

Asp

Ile

Ile

Phe

Trp

Ala

130

PL 207 350 B1

55 60

cac

gac

cgc

ttt

ggt

ggc

tac

get

caa

tet

ggc

ctg

ttg

get

gaa

atc

240

His

Asp

Arg

Phe

Gly

Gly

Tyr

Ala

Gin

Ser

Gly

Leu

Leu

Ala

Glu

Ile

65

70

75

80

acc

ccg

gac

aaa

gcg

ttc

cag

gac

aag

ctg

tat

ccg

ttt

acc

tgg

gat

288

Thr

Pro

Asp

Lys

Ala

Phe

Gin

Asp

Lys

Leu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Trp

Asp

85

90

95

gcc

gta

cgt

tac

aac

ggc

aag

ctg

att

get

tac

ccg

atc

get

gtt

gaa

336

Ala

Val

Arg

Tyr

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Ala

Tyr

Pro

Ile

Ala

Val

Glu

100

105

110

gcg

tta

tcg

ctg

att

tat

aac

aaa

gat

ctg

ctg

ccg

aac

ccg

cca

aaa

384

Ala

Leu

Ser

Leu

Ile

Tyr

Asn

Lys

Asp

Leu

Leu

Pro

Asn

Pro

Pro

Lys

115

120

125

ace

tgg

gaa

gag

atc

ccg

gcg

ctg

gat

aaa

gaa

ctg

aaa

gcg

aaa

ggt

432

Thr

Trp

Glu

Glu

Ile

Pro

Ala

Leu

Asp

Lys

Glu

Leu

Lys

Ala

Lys

Gly

130

135

140

aag

agc

gcg

ctg

atg

ttc

aac

ctg

caa

gaa

ccg

tac

ttc

acc

tgg

ccg

4B0

Lys

Ser

Ala

Leu

Met

Phe

Asn

Leu

Gin

Glu

Pro

Tyr

Phe

Thr

Trp

Pro

145

150

155

160

ctg

att

get

get

gac

ggg

ggt

tat

gcg

ttc

aag

tat

gaa

aac

ggc

aag

528

Leu

Ile

Ala

Ala

Asp

Gly

Gly

Tyr

Ala

Phe

Lys

Tyr

Glu

Asn

Gly

Lys

165

170

175

tac

gac

att

aaa

gac

gtg

ggc

gtg

gat

aac

get

ggc

gcg

aaa

gcg

ggt

576

Tyr

Asp

Ile

Lys

Asp

Val

Gly

Val

Asp

Asn

Ala

Gly

Ala

Lys

Ala

Gly

180

185

190

ctg

acc

ttc

ctg

gtt

gac

ctg

att

aaa

aac

aaa

cac

atg

aat

gca

gac

624

Leu

Thr

Phe

Leu

Val

Asp

Leu

Ile

Lys

Asn

Lys

His

Met

Asn

Ala

Asp

195

200

205

ace

gat

tac

tcc

atc

gca

gaa

get

gee

ttt

aat

aaa

ggc

gaa

aca

gcg

672

PL 207 350 B1

131

Thr Asp Tyr Ser 210	Ile	Ala	Glu 215	Ala	Ala
atg	acc	atc	aac	ggc	ccg	tgg	gca	tgg
Met	Thr	Ile	Asn	Gly	Pro	Trp	Ala	Trp
225					230
gtg	aat	tat	ggt	gta	acg	gta	ctg	ccg
Val	Asn	Tyr	Gly	Val	Thr	Val	Leu	Pro
				245
aaa	ccg	ttc	gtt	ggc	gtg	ctg	agc	gca
Lys	Pro	Phe	Val	Gly	Val	Leu	Ser	Ala
			260					265
aac	aaa	gag	ctg	gca	aaa	gag	ttc	ctc
Asn	Lys	Glu	Leu	Ala	Lys	Glu	Phe	Leu
		275					280
gaa	ggt	ctg	gaa	gcg	gtt	aat	aaa	gac
Glu	Gly	Leu	Glu	Ala	Val	Asn	Lys	Asp
	290					295
ctg	aag	tct	tac	gag	gaa	gag	ttg	gcg
Leu	Lys	Ser	Tyr	Glu	Glu	Glu	Leu	Ala
305					310
ace	atg	gaa	aac	gcc	cag	aaa	ggt	gaa
Thr	Met	Glu	Asn	Ala	Gln	Lys	Gly	Glu
				325
atg	tcc	gct	ttc	tgg	tat	gcc	gtg	cgt
Met	Ser	Ala	Phe	Trp	Tyr	Ala	Val	Arg
			340					345
age	ggt	cgt	cag	act	gtc	gat	gaa	gcc
Ser	Gly	Arg	Gln	Thr	Val	Asp	Glu	Ala
		355					360

Phe	Asn	Lys 220	Gly	Glu	Thr Ala
tcc	aac	atc	gac	acc	agc	aaa	720
Ser	Asn	Ile	Asp	Thr	Ser	Lys
	235					240
acc	ttc	aag	ggt	caa	cca	tcc	768
Thr	Phe	Lys	Gly	Gln	Pro	Ser
250					255
ggt	att	aac	gcc	gcc	agt	ccg	816
Gly	Ile	Asn	Ala	Ala	Ser	Pro
				270
gaa	aac	tat	ctg	ctg	act	gat	864
Glu	Asn	Tyr	Leu	Leu	Thr	Asp
			285
aaa	ccg	ctg	ggt	gcc	gta	gcg	912
Lys	Pro	Leu	Gly	Ala	Val	Ala
		300
aaa	gat	cca	cgt	att	gcc	gcc	960
Lys	Asp	Pro	Arg	Ile	Ala	Ala
	315					320
ate	atg	ccg.	aac	atc	ccg	cag	1008
Ile	Met	Pro	Asn	Ile	Pro	Gln
330					335
act	gcg	gtg	atc	aac	gcc	gcc	1056
Thr	Ala	Val	Ile	Asn	Ala	Ala
				350
ctg	aaa	gac	gcg	cag	act	aat	1104
Leu	Lys	Asp	Ala	Gln	Thr	Asn

365

132

PL 207 350 B1

teg

age

tcc

cac

cat

cac

cat

cac

cac

gcg

aat

teg

gta

ccg

ctg

gtt

1152

Ser

Ser

Ser

His

His

His

His

His

His

Ala

Asn

Ser

Val

Pro

Leu

Val

370

375

380

ccg

cgt

gga

tcc

caa

gat

ege

cac

atg

att

aga

atg

cgt

caa

ctt

ata

1200

Pro

Arg

Gly

Ser

Gln

Asp

Arg

His

Met

Ile

Arg

Met

Arg

Gln

Leu

Ile

385

390

395

400

gat

att

gtt

gat

cag

ctg

aaa

aat

tat

gtg

aat

gac

ttg

gtc

cct

gaa

1248

Asp

Ile

Val

Asp

Gln

Leu

Lys

Asn

Tyr

Val

Asn

Asp

Leu

Val

Pro

Glu

405

410

415

ttt

ctg

cca

get

cca

gaa

gat

gta

gag

aca

aac

tgt

gag

tgg

tea

get

1295

Phe

Leu

Pro

Ala

Pro

Glu

Asp

Val

Glu

Thr

Asn

Cys

Glu

Trp

Ser

Ala

420

425

430

ttt

tcc

tgt

ttt

cag

aag

gee

caa

eta

aag

tea

gca

aat

aca

gga

aac

1344

Phe

Ser

Cys

Phe

Gln

Lys

Ala

Gln

Leu

Lys

Ser

Ala

Asn

Thr

Gly

Asn

435

440

445

aat

gaa

agg

ata

atc

aat

gta

tea

att

aaa

aag

ctg

aag

agg

aaa

cca

1392

Asn

Glu

Arg

Ile

Ile

Asn

Val

Ser

Ile

Lys

Lys

Leu

Lys

Arg

Lys

Pro

450

455

460

cct

tcc

aca

aat

gca

ggg

aga

aga

cag

aaa

cac

aga

eta

aca

tgc

cct

1440

Pro

Ser

Thr

Asn

Ala

Gly

Arg

Arg

Gln

Lys

His

Arg

Leu

Thr

Cys

Pro

465

470

475

480

tea

tgt

gat

tet

tat

gag

aaa

aaa

cca

ccc

aaa

gaa

ttc

eta

gaa

aga

1488

Ser

Cys

Asp

Ser

Tyr

Glu

Lys

Lys

Pro

Pro

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Arg

485

490

495

ttc

aaa

tea

ctt

ctc

caa

aag

atg

att

cat

cag

cat

ctg

tcc

tet

aga

1536

Phe

Lys

Ser

Leu

Leu

Gln

Lys

Met

Ile

His

Gln

His

Leu

Ser

Ser

Arg

500

505

510

aca

cac

gga

agt

gaa

gat

tcc

tga

1560

Thr

His

Gly

Ser

Glu

Asp

Ser

★

PL 207 350 B1

133

515 <210> 85 <211> 519 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Polipeptyd fuzyjny MBP-ludzki ligand zalphall <400> 85

Met

Lys

Thr

Glu

Glu

Gly

Lys

Leu

Val

Ile

Trp

Ile

Asn

Gly

Asp

Lys

1

5

10

15

Gly

Tyr

Asn

Gly

Leu

Ala

Glu

Val

Gly

Lys

Lys

Phe

Glu

Lys

Asp

Thr

20

25

30

Gly

Ile

Lys

Val

Thr

Val

Glu

His

Pro

Asp

Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

Phe

35

40

45

Pro

Gin

Val

Ala

Ala

Thr

Gly

Asp

Gly

Pro

Asp

Ile

Ile

Phe

Trp

Ala

50

55

60

His

Asp

Arg

Phe

Gly

Gly

Tyr

Ala

Gin

Ser

Gly

Leu

Leu

Ala

Glu

ile

65

70

75

80

Thr

Pro

Asp

Lys

Ala

Phe

Gin

Asp

Lys

Leu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Trp

Asp

85

90

95

Ala

Val

Arg

Tyr

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Ala

Tyr

Pro

Ile

Ala

Val

Glu

100

105

110

Ala

Leu

Ser

Leu

Ile

Tyr

Asn

Lys

Asp

Leu

Leu

Pro

Asn

Pro

Pro

Lys

115

120

125

Thr

Trp

Glu

Glu

Ile

Pro

Ala

Leu

Asp

Lys

Glu

Leu

Lys

Ala

Lys

Gly

130

135

140

Lys

Ser

Ala

Leu

Met

Phe

ASn

Leu

Gin

Glu

Pro

Tyr

Phe

Thr

Trp

Pro

145

150

155

160

Leu

Ile

Ala

Ala

Asp

Gly

Gly

Tyr

Ala

Phe

Lys

Tyr

Glu

Asn

Gly

Lys

134

PL 207 350 B1

165 ΠΟ 175

Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

130 185 190

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

195 200 205

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

210 215 220

Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gin Pro Ser

245 250 255

Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

260 265 270

Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

275 280 285

Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

290 295 300

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala

305 310 315 320

Thr Met Glu Asn Ala Gin Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gin

325 330 335

Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

340 345 350

Ser Gly Arg Gin Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gin Thr Asn

355 360 365

Ser Ser Ser His His His His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val

370 375 380

Pro Arg Gly Ser Gin Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gin Leu Ile

385 390 395 400

PL 207 350 B1

135

Asp	Ile Val Asp	Gin Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val	Pro 415	Glu
405	410
ehe	Leu Pro Ala	Pro Glu Asp	Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp	Ser	Ala
	420		425 430
Phe	Ser Cys Phe	Gin Lys Ala	Gin Leu Lys Ser Ala Asn Thr	Gly	Asn
	435		440 445
Asn	Glu Arg Ile	Ile Asn Val	Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg	Lys	Pro
	450	455	460
Pro	Ser Thr Asn	Ala Gly Arg	Arg Gin Lys His Arg Leu Thr	Cys	Pro
465		470	475		480
Ser	Cys Asp Ser	Tyr Glu Lys	Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu	Glu	Arg
		485	490	495
Phe	Lys Ser Leu	Leu Gin Lys	Met Ile His Gin His Leu Ser	Ser	Arg
	500		505 510
His	Gly Ser Glu	Asp Ser
	515
<210> 86
<211> 64
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Starter oligonukleotydowy ZC22849

<400> 86 tcaccacgcg aattcggtac cgctggttcc gcgtggatcc ccagatcgcc tcctgattag 60 actt 64 <210> 87 <211> 64 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

136

PL 207 350 B1 <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22850 <400> 87 tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca ctaggagaga tgctgatgaa 60 tcat 64 <210> 88 <211> 1533 .

<212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Polinukleotyd fuzyjny MBP-mysi Ugand zalphall <221> CDS <222> (1)...(1533) <400> 88

atg

aaa

act

gaa

gaa

ggt

aaa

ctg

gta

atc

tgg

att

aac

ggc

gat

aaa

Met

Lys

Thr

Glu

Glu

Gly

Lys

Leu

Val

Ile

Trp

Ile

Asn

Gly

Asp

Lys

1

5

10

15

ggc

tat

aac

ggt

ctc

gct

gaa

gtc

ggt

aag

aaa

ttc

gag

aaa

gat

acc

Gly

Tyr

Asn

Gly

Leu

Ala

Glu

Val

Gly

Lys

Lys

Phe

Glu

Lys

Asp

Thr

20

25

30

gga

att

aaa

gtc

acc

gtt

gag

cat

ccg

gat

aaa

ctg

gaa

gag

aaa

ttc

Gly

Ile

Lys

Val

Thr

Val

Glu

His

Pro

Asp

Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

Phe

35

40

45

cca

cag

gtt

gcg

gca

act

ggc

gat

ggc

cct

gac

att

atc

ttc

tgg

gca

Pro

Gin

Val

Ala

Ala

Thr

Gly

Asp

Gly

Pro

Asp

Ile

Ile

Phe

Trp

Ala

50

55

60

cac

gac

cgc

ttt

ggt

ggc

tac

gct

caa

tct

ggc

ctg

ttg

gct

gaa

atc

His

Asp

Arg

Phe

Gly

Gly

Tyr

Ala

Gin

Ser

Gly

Leu

Leu

Ala

Glu

Ile

65

70

75

80

PL 207 350 B1

137

acc

ccg

gac

aaa

gcg

ttc

cag

gac

aag

ctg

tat

ccg

ttt

ace

tgg

gat

238

Thr

Pro

Asp

Lys

Ala

Phe

Gin

Asp

Lys

Leu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Trp

Asp

85

90

95

gcc

gta

cgt

tac

aac

ggc

aag

ctg

att

gct

tac

ccg

atc

gct

gtt

gaa

336

Ala

Val

Arg

Tyr

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Ala

Tyr

Pro

Ile

Ala

Val

Glu

100

105

110

gcg

tta

tcg

ctg

att

tat

aac

aaa

gat

ctg

ctg

ccg

aac

ccg

cca

aaa

384

Ala

Leu

Ser

Leu

Ile

Tyr

Asn

Lys

Asp

Leu

Leu

Pro

Asn

Pro

Pro

Lys

115

120

125

acc

tgg

gaa

gag

atc

ccg

gcg

ctg

gat

aaa

gaa

ctg

aaa

gcg

aaa

ggt

432

Thr

Trp

Glu

Glu

Ile

Pro

Ala

Leu

Asp

Lys

Glu

Leu

Lys

Ala

Lys

Gly

130

135

140

aag

agc

gcg

ctg

atg

ttc

aac

ctg

caa

gaa

ccg

tac

ttc

acc

tgg

ccg

480

Lys

Ser

Ala

Leu

Met

Phe

Asn

Leu

Gin

Glu

Pro

Tyr

Phe

Thr

Trp

Pro

145

150

155

160

ctg

att

gct

gct

gac

ggg

ggt

tat

gcg

ttc

aag

tat

gaa

aac

ggc

aag

528

Leu

Ile

Ala

Ala

Asp

Gly

Gly

Tyr

Ala

Phe

Lys

Tyr

Glu

Asn

Gly

Lys

165

no

175

tac

gac

att

aaa

gac

gtg

ggc

gtg

gat

aac

gct

ggc

gcg

aaa

gcg

ggt

576

Tyr

Asp

Ile

Lys

Asp

Val

Gly

Val

Asp

Asn

Ala

Gly

Ala

Lys

Ala

Gly

190

185

190

ctg

acc

ttc

ctg

gtt

gac

ctg

att

aaa

aac

aaa

cac

atg

aat

gca

gac

624

Leu

Thr

Phe

Leu

Val

Asp

Leu

Ile

Lys

Asn

Lys

His

Met

Asn

Ala

Asp

195

200

205

acc

gat

tac

tcc

atc

gca

gaa

gct

gcc

ttt

aat

aaa

ggc

gaa

aca

gcg

672

Thr

Asp

Tyr

Ser

Ile

Ala

Glu

Ala

Ala

Phe

Asn

Lys

Gly

Glu

Thr

Ala

210

215

220

atg

acc

atc

aac

ggc

ccg

tgg

gca

tgg

tcc

aac

atc

gac

acc

agc

aaa

720

Met

Thr

Ile

Asn

Gly

Pro

Trp

Ala

Trp

Ser

Asn

Ile

Asp

Thr

Ser

Lys

138

PL 207 350 B1

225

230

235

240

gtg

aat

tat

ggt

gta

acg

gta

ctg

ccg

acc

ttc

aag

ggt

caa

cca

tcc

768

Val

Asn

Tyr

Gly

Val

Thr

Val

Leu

Pro

Thr

Phe

Lys

Gly

Gin

Pro

Ser

245

250

255

aaa

ccg

ttc

gtt

ggc

gtg

ctg

agc

gca

ggt

att

aac

gcc

gcc

agt

ccg

816

Lys

Pro

Phe

Val

Gly

Val

Leu

Ser

Ala

Gly

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Pro

260

265

270

aac

aaa

gag

ctg

gca

aaa

gag

ttc

ctc

gaa

aac

tat

ctg

ctg

act

gat

864

Asn

Lys

Glu

Leu

Ala

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Asn

Tyr

Leu

Leu

Thr

Asp

275

280

285

gaa

ggt

ctg

gaa

gcg

gtt

aat

aaa

gac

aaa

ccg

ctg

ggt

gcc

gta

gcg

912

Glu

Gly

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Lys

Asp

Lys

Pro

Leu

Gly

Ala

Val

Ala

290

295

300

ctg

aag

tct

tac

gag

gaa

gag

ttg

gcg

aaa

gat

cca

cgt

att

gcc

gcc

960

Leu

Lys

Ser

Tyr

Glu

Glu

Glu

Leu

Ala

Lys

Asp

Pro

Arg

Ile

Ala

Ala

305

310

315

320

acc

atg

gaa

aac

gcc

cag

aaa

ggt

gaa

atc

atg

ccg

aac

atc

ccg

cag

1003

Thr

Met

Glu

Asn

Ala

Gin

Lys

Gly

Glu

Ile

Met

Pro

Asn

Ile

Pro

Gin

325

330

335

atg

tcc

gct

ttc

tgg

tat

gcc

gtg

cgt

act

gcg

gtg

atc

aac

gcc

gcc

1056

Met

Ser

Ala

Phe

Trp

Tyr

Ala

Val

Arg

Thr

Ala

Val

Ile

Asn

Ala

Ala

340

345

350

agc

ggt

cgt

cag

act

gtc

gat

gaa

gcc

ctg

aaa

gac

gcg

cag

act

aat

1104

Ser

Gly

Arg

Gin

Thr

Val

Asp

Glu

Ala

Leu

Lys

Asp

Ala

Gin

Thr

Asn

355

360

365

teg

agc

tcc

cac

cat

cac

cat

cac

cac

gcg

aat

tcg

gta

ccg

ctg

gtt

1152

Ser

Ser

Ser

His

His

His

His

His

His

Ala

Asn

Ser

Val

Pro

Leu

Val

370

375

380

ccg

cgt

gga

tcc

cca

gat

cgc

ctc

ctg

att

aga

ctt

cgt

cac

ctt

att

1200

PL 207 350 B1

139

Pro

Arg

Gly

Ser

Pro

Asp Arg

Leu

Leu

Ile

Arg

Leu

Arg

His

Leu

Ile

385

390

395

400

gac

att

gtt

gaa

cag

ctg

aaa

atc

tat

gaa

aat

gac

ttg

gat

cct

gaa

1248

Asp

Ile

Val

Glu

Gin

Leu

Lys

Ile

Tyr

Glu

Asn

Asp

Leu

Asp

Pro

Glu

405

410

415

ctt

eta

tea

gct

cca

caa

gat

gta

aag

ggg

cac

tgt

gag

cat

gca

get

1296

Leu

Leu

Ser

Ala

Pro

Gin

Asp

Val

Lys

Gly

His

Cys

Glu

His

Ala

Ala

420

425

430

ttt

gee

tgt

ttt

cag

aag

gee

aaa

ctc

aag

cca

tea

aac

cct

gga

aac

1344

Phe

Ala

Cys

Phe

Gin

Lys

Ala

Lys

Leu

Lys

Pro

Ser

Asn

Pro

Gly

Asn

435

440

445

set

aag

aca

ttc

ate

att

gac

ctc

gtg

gee

cag

ctc

agg

agg

agg

ctg

1392

Asn

Lys

Thr

Phe

Ile

Ile

Asp

Leu

Val·

Ala

Gir.

Leu

Arg

Arg

Arg

Leu

450

455

460

cct

gee

agg

agg

gga

gga

aag

aaa

cag

aag

cac

ata

gct

aaa

tgc

cct

144C

Pro

Ala

Arg

Arg

Gly

Gly

Lys

Lys

Gin

Lys

His

Ile

Ala

Lys

Cys

Pro

465

470

475

480

tcc

tgt

gat

teg

tat

gag

aaa

agg

aca

ccc

aaa

gaa

ttc

eta

gaa

aga

1488

Ser

Cys

Asp

Ser

Tyr

Glu

Lys

Arg

Thr

Pro

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Arg

485

4 90

495

eta

aaa

tgg

ctc

ctt

caa

aag

atg

att

cat

cag

cat

ctc

tcc

tga

1533

Leu

Lys

Trp

Leu

Leu

Gin

Lys

Met

Ile

His

Gin

His

Leu

Ser

★

500

S05

510

<210> 89 <211> 510 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Polipeptyd fuzyjny MBP-mysi ligand zalphall

140

PL 207 350 B1 <400> 89

Met Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys

10 15

Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr

25 30

Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe

40 45

Pro Gin Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala

55 60

His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gin Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile

70 75 80

Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gin Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

90 95

Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu

100 105 110

Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys

115 120 125

Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gin Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro

145 150 155 160

Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

180 185 190

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

195 200 205

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

210 215 220

PL 207 350 B1

141

Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala

225 230

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu

245

Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser

260

Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe

275 280

Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys

290 295

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu

305 310

Thr Met Glu Asn Ala Gin Lys Gly

325

Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val

340

Ser Gly Arg Gin Thr Val Asp Glu

355 360

Ser Ser Ser His His His His His

370 375

Pro Arg Gly Ser Pro Asp Arg Leu

385 390

Asp Ile Val Glu Gin Leu Lys Ile

405

Leu Leu Ser Ala Pro Gin Asp Val

420

Phe Ala Cys Phe Gin Lys Ala Lys

435 440

Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu

Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

235 240

Pro Thr Phe Lys Gly Gin Pro Ser

250 255

Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

265 270

Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

285

Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

300

Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala

315 320

Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gin

330 335

Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

345 350

Ala Leu Lys Asp Ala Gin Thr Asn

365

His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val

380

Leu Ile Arg Leu Arg His Leu Ile

395 400

Tyr Glu Asn Asp Leu Asp Pro Glu

410 415

Lys Gly His Cys Glu His Ala Ala

425 430

Leu Lys Pro Ser Asn Pro Gly Asn

445

Val Ala Gin Leu Arg Arg Arg Leu

142

PL 207 350 B1

450

455

460

Pro

Ala

Arg

Arg

Gly

Gly

Lys

Lys

Gln

Lys

His

Ile

Ala

Lys

Cys

Pro

465

470

475

480

Ser

Cys

Asp

Ser

Tyr

Glu

Lys

Arg

Thr

Pro

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Arg

485

490

495

Leu

Lys

Trp

Leu

Leu

Gln

Lys

Met

Ile

His

Gln

His

Leu

Ser

500

505

510

<210> 90 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22281 <400> 90 tgtgaatgac ttggtccctg aa <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22279 <400> 91 aacaggaaaa agctgaccac tea 23 <210> 92 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Sonda TagMan ludzkiego liganda zalphall, ZG32

PL 207 350 B1

143 <400> 92 tctgccagct ccagaagatg tagagacaaa c 31 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22277 <400> 93 ccaggagtgt ggcagctttc 20 <210> 94 <2U> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC22276 <400> 94 gcttgccctt cagcatgtag a 21 <210> 95 <211> 23 ' <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Sonda TaqMan ludzkiego zalphall, ZG31 <400> 95 cggctccccc tttcaacgtg act 23 <210> 96 <211> 1821 <212> DNA

144

PL 207 350 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<221> CDS <222> (1) . . . (1821) <223> Sekwencja polinukleotydowa rozpuszczalnego receptora MBP-zalphall <400> 96

atg

aaa

atc

gaa

gaa

ggt

aaa

ctg

gta

atc

tgg

att

aac

ggc

gat

aaa

48

Met

Lys

Ile

Glu

Glu

Gly

Lys

Leu

Val

Ile

Trp

Ile

Asn

Gly

Asp

Lys

1

5

10

15

ggc

tat

aac

ggt

ctc

gct

gaa

gtc

ggt

aag

aaa

ttc

gag

aaa

gat

acc

96

Gly

Tyr

Asn

Gly

Leu

Ala

Glu

Val

Gly

Lys

Lys

Phe

Glu

Lys

Asp

Thr

20

25

30

gga

att

aaa

gtc

acc

gtt

gag

cat

ccg

gat

aaa

ctg

gaa

gag

aaa

ttc

144

Gly

Ile

Lys

Val

Thr

Val

Glu

His

Pro

Asp

Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

Phe

35

40

45

cca

cag

gtt

gcg

gca

act

ggc

gat

ggc

cct

gac

att

atc

ttc

tgg

gca

192

Pro

Gin

val

Ala

Ala

Thr

Gly

Asp

Gly

Pro

Asp

Ile

Ile

Phe

Trp

Ala

50

55

60

cac

gac

cgc

ttt

ggt

ggc

tac

gct

caa

tct

ggc

ctg

ttg

gct

gaa

atc

240

His

Asp

Arg

Phe

Gly

Gly

Tyr

Ala

Gin

Ser

Gly

Leu

Leu

Ala

Glu

Ile

65

70

75

80

acc

ccg

gac

aaa

gcg

ttc

cag

gac

aag

ctg

tat

ccg

ttt

acc

tgg

gat

238

Thr

Pro

Asp

Lys

Ala

Phe

Gin

Asp

Lys

Leu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Trp

Asp

85

90

95

gcc

gta

cgt

tac

aac

ggc

aag

ctg

att

gcttac ccg i

atc i

gct gtt i

gaa

336

Ala

Val

Arg

Tyr

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Ala

Tyr

Pro

Ile

Ala

Val

Glu

100

105

110

gcg

tta

tcg

ctg

att

tat

aac

aaa

gat

ctg

ctg

ccg

aac

ccg

cca

aaa

384

PL 207 350 B1

145

Ala

Leu

Ser Leu 115

Ile

Tyr

Asn

Lys 120

Asp

Leu

Leu

Pro

Asn 125

Pro

Pro

Lys

acc

tgg

gaa

gag

atc

ccg

gcg

ctg

gat

aaa

gaa

ctg

aaa

gcg

aaa

ggt

432

Thr

Trp

Glu

Glu

Ile

Pro

Ala

Leu

Asp

Lys

Glu

Leu

Lys

Ala

Lys

Gly

130

135

140

aag

agc

gcg

ctg

atg

ttc

aac

ctg

caa

gaa

ccg

tac

ttc

acc

tgg

ccg

480

Lys

Ser

Ala

Leu

Met

Phe

Asn

Leu

Gin

Glu

Pro

Tyr

Phe

Thr

Trp

Pro

145

150

155

160

ctg

att

gct

gct

gac

ggg

ggt

tat

gcg

ttc

aag

tat

gaa

aac

ggc

aag

528

Leu

Ile

Ala

Ala

Asp

Gly

Gly

Tyr

Ala

Phe

Lys

Tyr

Glu

Asn

Gly

Lys

165

170

175

tac

gac

att

aaa

gac

gtg

ggc

gtg

gat

aac

gct

ggc

gcg

aaa

gcg

ggt

576

Tyr

Asp

Ile

Lys

Asp

Val

Gly

Val

Asp

Asn

Ala

Gly

Ala

Lys

Ala

Gly

180

185

190

ctg

acc

ttc

ctg

gtt

gac

ctg

att

aaa

aac

aaa

cac

atg

aat

gca

gac

624

Leu

Thr

Phe

Leu

Val

Asp

Leu

Ile

Lys

Asn

Lys

His

Met

Asn

Ala

Asp

195

200

205

acc

gat

tac

tcc

atc

gca

gaa

gct

gcc

ttt

aat

aaa

ggc

gaa

aca

gcg

672

Thr

Asp

Tyr

Ser

Ile

Ala

Glu

Ala

Ala

Phe

Asn

Lys

Gly

Glu

Thr

Ala

210

215

220

atg

acc

atc

aac

ggc

ccg

tgg

gca

tgg

tcc

aac

atc

gac

acc

agc

aaa

720

Met

Thr

Ile

Asn

Gly

Pro

Trp

Ala

Trp

Ser

Asn

Ile

Asp

Thr

Ser

Lys

225

230

235

240

gtg

aat

tat

ggt

gta

acg

gta

ctg

ccg

acc

ttc

aag

ggt

caa

cca

tcc

768

Val

Asn

Tyr

Gly

Val

Thr

Val

Leu

Pro

Thr

Phe

Lys

Gly

Gin

Pro

Ser

245

250

255

aaa

ccg

ttc

gtt

ggc

gtg

ctg

agc

gca

ggt

att

aac

gcc

gcc

agt

ccg

816

Lys

Pro

Phe

Val

Gly

Val

Leu

Ser

Ala

Gly

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Pro

260

265

270

146

PL 207 350 B1

aac

aaa

gag

ctg

gca

aaa

gag

ttc

ctc

gaa

aac

tat

ctg

ctg

act

gat

8 64

Asn

Lys

Glu

Leu

Ala

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Asn

Tyr

Leu

Leu

Thr

Asp

275

280

285

gaa

ggt

ctg

gaa

gcg

gtt

aat

aaa

gac

aaa

ccg

ctg

ggt

gcc

gta

gcg

912

Glu

Gly

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Lys

Asp

Lys

Pro

Leu

Gly

Ala

Val

Ala

290

295

300

ctg

aag

tct

tac

gag

gaa

gag

ttg

gcg

aaa

gat

cca

cgt

att

gcc

gcc

960

Leu

Lys

Ser

Tyr

Glu

Glu

Glu

Leu

Ala

Lys

Asp

Pro

Arg

Ile

Ala

Ala

305

310

315

320

acc

atg

gaa

aac

gcc

cag

aaa

ggt

gaa

atc

atg

ccg

aac

atc

ccg

cag

1008

Thr

Met

Glu

A3n

Ala

Gln

Lys

Gly

Glu

Ile

Met

Pro

Asn

Ile

Pro

Gln

325

330

335

atg

tcc

gct

ttc

tgg

tat

gcc

gtg

cgt

act

gcg

gtg

atc

aac

gcc

gcc

1056

Met

Ser

Ala

Phe

Trp

Tyr

Ala

Val

Arg

Thr

Ala

Val

Ile

Asn

Ala

Ala

340

345

350

agc

ggt

cgt

cag

act

gtc

gat

gaa

gcc

ctg

aaa

gac

gcg

cag

act

aat

1104

Ser

Gly

Arg

Gln

Thr

val

Asp

Glu

Ala

Leu

Lys

Asp

Ala

Gln

Thr

Asn

355

360

365

tcg

agc

tcc

cac

cat

cac

cat

cac

cac

gcg

aat

tcg

gta

ccg

ctg

gtt

1152

Ser

Ser

Ser

His

His

His

His

His

His

Ala

Asn

Ser

Val

Pro

Leu

Val

370

375

380

ccg

cgt

gga

tcc

tgc

ccc

gac

ctc

gtc

tgc

tac

acc

gat

tac

ctc

cag

1200

Pro

Arg

Gly

Ser

Cys

Pro

Asp

Leu

Val

Cys

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gln

385

390

395

400

acg

gtc

atc

tgc

atc

ctg

gaa

atg

tgg

aac

ctc

cac

ccc

agc

acg

ctc

1248

Thr

Val

Ile

Cys

Ile

Leu

Glu

Met

Trp

Asn

Leu

His

Pro

Ser

Thr

Leu

405

410

415

acc

ctt

acc

tgg

caa

gac

cag

tat

gaa

gag

ctg

aag

gac

gag

gcc

acc

1296

Thr

Leu

Thr

Trp

Gln

Asp

Gln

Tyr

Glu

Glu

Leu

Lys

Asp

Glu

Ala

Thr

PL 207 350 B1

147

420

425

430

tcc

tgc

agc

ctc

cac

agg

tcg

gcc

cac

aat

gcc

acg

cat

gcc

acc

tac

1344

Ser

Cys

Ser

Leu

His

Arg

Ser

Ala

His

Asn

Ala

Thr

His

Ala

Thr

Tyr

435

440

445

acc

tgc

cac

atg

gat

gta

ttc

cac

ttc

atg

gcc

gac

gac

att

ttc

agt

1392

Thr

Cys

His

Met

Asp

Val

Phe

His

Phe

Met

Ala

Asp

Asp

Ile

Phe

Ser

4S0

455

460

gtc

aac

atc

aca

gac

cag

tet

ggc

aac

tac

tcc

cag

gag

tgt

ggc

agc

1440

Val

Asn

Ile

Thr

Asp

Gin

Ser

Gly

Asn

Tyr

Ser

Gin

Glu

Cys

Gly

Ser

465

470

475

480

ttt

ctc

ctg

get

gag

agc

atc

aag

ccg

get

ccc

cct

ttc

aac

gtg

act

1488

Phe

Leu

Leu

Ala

Glu

Ser

Ile

Lys

Pro

Ala

Pro

Pro

Phe

Asn

Val

Thr

485

490

495

gtg

acc

ttc

tea

gga

cag

tat

aat

atc

tcc

tgg

cgc

tea

gat

tac

gaa

1536

Val

Thr

Phe

Ser

Gly

Gin

Tyr

Asn

Ile

Ser

Trp

Arg

Ser

Asp

Tyr

Glu

500

505

510

gac

cct

gcc

ttc

tac

atg

ctg

aag

ggt

aag

ctt

cag

tat

gag

ctg

cag

1584

Asp

Pro

Ala

Phe

Tyr

Met

Leu

Lys

Gly

Lys

Leu

Gin

Tyr

Glu

Leu

Gin

515

520

525

tac

agg

aac

cgg

gga

gac

ccc

tgg

get

gtg

agt

ccg

agg

aga

aag

ctg

1632

Tyr

Arg

Asn

Arg

Gly

Asp

Pro

Trp

Ala

Val

Ser

Pro

Arg

Arg

Lys

Leu

530

535

540

atc

tea

gtg

gac

tea

aga

agt

gtc

tcc

ctc

ctc

ccc

ctg

gag

ttc

cgc

1680

Ile

Ser

Val

Asp

Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Leu

Leu

Pro

Leu

Glu

Phe

Arg

545

550

555

560

aaa

gac

tcg

agc

tat

gag

ctg

cag

gtg

cgg

gca

ggg

ccc

atg

cct

ggc

1728

Lys

Asp

Ser

Ser

Tyr

Glu

Leu

Gin

Val

Arg

Ala

Gly

Pro

Met

Pro

Gly

565

570

575

tcc

tcc

tac

cag

ggg

acc

tgg

agt

gaa

tgg

agt

gac

ccg

gtc

atc

ttt

1776

148

PL 207 350 B1

Ser

Ser

Tyr

Gin Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp

Pro

Val 590

Ile Phe

580

585

cag

acc

cag

tca

gag

gag

tta

aag

gaa

ggc

tgg

aac

cct

cac

tag

1321

Gin

Thr

Gin

Ser

Glu

Glu

Leu

Lys

Glu

Gly

Trp

Asn

Pro

His

·*

595 600 605 <210> 97 <211> 606 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Sekwencja polipeptydowa rozpuszczalngo receptora MBP zalphall <400> 97

Met

Lys

Ile

Glu

Glu

Gly

Lys

Leu

Val

Ile

Trp

Ile

Asn

Gly

Asp

Lys

1

5

10

15

Gly

Tyr

Asn

Gly

Leu

Ala

Glu

Val

Gly

Lys

Lys

Phe

Glu

Lys

Asp

Thr

20

25

30

Gly

Ile

Lys

Val

Thr

Val

Glu

His

Pro

Asp

Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

Phe

35

40

45

Pro

Gin

Val

Ala

Ala

Thr

Gly

Asp

Gly

Pro

Asp

Ile

Ile

Phe

Trp

Ala

50

55

60

His

Asp

Arg

Phe

Gly

Gly

Tyr

Ala

Gin

Ser

Gly

Leu

Leu

Ala

Glu

Ile

65

70

75

80

Thr

Pro

Asp

Lys

Ala

Phe

Gin

Asp

Lys

Leu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Trp

Asp

85

90

95

Ala

Val

Arg

Tyr

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Ala

Tyr

Pro

Ile

Ala

Val

Glu

100

105

110

Ala

Leu

Ser

Leu

Ile

Tyr

Asn

Lys

Asp

Leu

Leu

Pro

Asn

Pro

Pro

Lys

115

120

125

PL 207 350 B1

149

Thr Trp Glu Glu Ile Pro

130

Lys Ser Ala Leu Met Phe

145 150

Leu Ile Ala Ala Asp Gly

165

Tyr Asp Ile Lys Asp Val

180

Leu Thr Phe Leu Val Asp

195

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala

210

Met Thr Ile Asn Gly Pro

225 230

Val Asn Tyr Gly Val Thr

245

Lys Pro Phe Val Gly Val

260

Asn Lys Glu Leu Ala Lys

275

Glu Gly Leu Glu Ala Val

290

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu

305 310

Thr Met Glu Asn Ala Gln

325

Met Ser Ala Phe Trp Tyr

340

Ser Gly Arg Gln Thr Val

Ala Leu Asp Lys Glu

135

Asn Leu Gln Glu Pro

155

Gly Tyr Ala Phe Lys

170

Gly Val Asp Asn Ala

185

Leu Ile Lys Asn Lys

200

Glu Ala Ala Phe Asn

215

Trp Ala Trp Ser Asn

235

Val Leu Pro Thr Phe

250

Leu Ser Ala Gly Ile

265

Glu Phe Leu Glu Asn

280

Asn Lys Asp Lys Pro

295

Glu Leu Ala Lys Asp

315

Lys Gly Glu Ile Met

330

Ala Val Arg Thr Ala

345

Asp Glu Ala Leu Lys

Leu Lys Ala Lys Gly

140

Tyr Phe Thr Trp Pro

160

Tyr Glu Asn Gly Lys

175

Gly Ala Lys Ala Gly

190

His Met Asn Ala Asp

205

Lys Gly Glu Thr Ala

220

Ile Asp Thr Ser Lys

240

Lys Gly Gln Pro Ser

255

Asn Ala Ala Ser Pro

270

Tyr Leu Leu Thr Asp

285

Leu Gly Ala Val Ala

300

Pro Arg Ile Ala Ala . 320

Pro Asn Ile Pro Gln

335

Val Ile Asn Ala Ala

350

Asp Ala Gln Thr Asn

150

PL 207 350 B1

355 360 365

Ser Ser Ser His His His His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val

370 375 380

Pro Arg Gly Ser Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gin

385 390 395 400

Thr Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu

405 410 415

Thr Leu Thr Trp Gin Asp Gin Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr

420 425 430

Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr

435 440 445

Thr Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser

450 455 460

Val Asn Ile Thr Asp Gin Ser Gly Asn Tyr Ser Gin Glu Cys Gly Ser

465 470 475 480

Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr

485 490 495

Val Thr Phe Ser Gly Gin Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu

500 505 510

Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gin Tyr Glu Leu Gin

515 520 525

Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu

530 535 540

Ile Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg

545 550 555 560

Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gin Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly

565 570 575

Ser Ser Tyr Gin Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe

580 585 590

PL 207 350 B1

151

Gin Thr Gin Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His

	595 600 605
<210>	98
<211>	65

<212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC20187 <400> 98 tcaccacgcg aattcggtac cgctggttcc gcgtggatcc tgccccgacc tcgtctgcta 60 caccg ’ 65

<210>	99
<211>	68
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter oligonukleotydowy ZC20135
<400>	99

tctgtatcag gctgaaaarc ttatctcatc cgccaaaaca ctagtgaggg ttccagcctt 60 cctttaac 68

<210>	100
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter oligonukleotydowy ZC22452
<400>	100

tcttcttggg gacactggtc c 21 <210> 101

152

PL 207 350 B1

<211>	21
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter oligonukleotydowy ZC22451
<400>	101

aatcatgtgg cgatcttgac c 21 <210> 102

<211>	21
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter oligonukleotydowy ZC22450
<400>	102

cagactaaca tgcccttcat g 21 <210> 103

<211>	23
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter oligonukleotydowy ZC22449
<400>	103

ttcacttccg tgtgttctag agg 23 <210> 104

<211>	18
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Starter oligonukleotydowy ZC23771

PL 207 350 B1

153 <400> 104 accaccttcc acaaatgc 18 <210> 105 <211> 1347 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105

gaattcaccc	attctctctt	tttcctgtca	aagatgcaga	tggggcacat	ttcgttgact	60
ccatcaatcc	ctgcccccac	acattagcac	atgcacacgt	atacctagcc	agtggaaaag	120
aaaaaagagt	tactcacatt	catccatttt	acaaagattt	ccaggctgca	atgggagggc	180
tttacctctc	cctgaaggat	gaataaatag	gtagcttaac	tgacaacctg	ttctcagtca	240
agctgaagtg	aaaacgagac	caaggtctag	ctctactgtt	ggtacttatg	agatccagtc	300
ctggcaacat	ggagaggatt	gtcatctgtc	tgatggtcat	cttcttgggg	acactggtcc	360
acaaatcaag	ctcccaaggt	caagatcgcc	acatgattag	aatgcgtcaa	cttatagata	420
ttgttgatca	gctgaaaaat	tatgtgaatg	acttggtaag	actatatttg	tcacaacaaa	480
atctaaatca	tacttttcaa	ttaatataaa	aggagggttt	ggcttataaa	aataactcag	540
aacaaatttt	cttttgctct	aggtccctga	atttctgcca	gctccagaag	atgtagaggt	600
aagaccagtt	gaatttattt	ctgaaaatac	attggacata	agtttttaaa	tccaataaga	660
aagacattag	catgattata	taggagtata	ctgaatttta	atgaacttag	cggtctaata	720
attgatgaaa	tatttattta	tattttggtt	aaattcattg	atttaccaaa	aaccaactaa	780
aaaatgctat	attatattcc	tcataaacta	tgtttatctt	caagaatctc	taagagtact	840
cctaagtagt	attgctgaga	cagaataaca	aaactagaaa	cgaaatctat	actctgatca	900
gtttctgaac	aatgcacagc	tagttactct	ttaagagccc	ttgggcatga	aagcttttga	960
gccttctttg	ttatcctacc	gaagaaacat	agatacatac	agtaggaagc	agaattaacc	1020
ttttaataac	aaacttaaaa	aagaaagaaa	gaaagaatta	gattacaggg	acagcatgga	1080
gaaatggtgg	tgtggaaatc	aaagctgtcc	tttagaatat	aattcacata	taccttggcc	1140
tcagtgagtc	ttgtctttgg	ccttccgtga	ggtcttttga	aagaaccatt	ttcaacaatt	1200
catcccgtct	cttaagccat	ttaaatccat	tagagttcca	ggaagaagag	gcctggcatg	1260
agttcagagt	gctgtcccgc	tgatcttttt	ctcagtaact	tctacgatct	gatcttctgg	1320

154

PL 207 350 B1 tctggtaccc tgaggtataa atgcaat 1347 <210> 106 <211> 1656 <212> DNA <213> Homo sapiens <40Q> 106

cctcaactgc	ttgattcagg	cagaatccta	accctaaact	gagctgggag	tatgaaaagg	60
gttttagaaa	agtcatggtg	tgatctatgg	caagtatatt	gattcttaga	tgtaaaatat	120
gctatcagag	ggaggtaccc	acttcctttc	tccaaaggag	gggctttaat	tcattttctt	180
catctgttaa	ctttacaaat	atatgttgat	cattaactgg	caagacacta	tgcctggcgc	240
tgtacagaat	aaaatgctgc	tcaagacatg	tcatgataga	tacattaaca	gaaaccacaa	300
acaaatgaaa	aatgttcttc	atcagactat	aacataattt	acccaaagct	gccactagtc	360
acagtgtaag	ttttagagcc	tcataactca	gcaaatgtgt	cctaaaccga	actaactctc	420
ctttataaaa	cacaaaggtc	ttgtccacca	cccagacacc	aaaatggtcc	tctgtgtagc	480
atcaggaata	aagcattgtg	aagaagtgag	gctcctttct	ctcttatctg	cgaagcaggg	540
gattgtccct	ttttcccatc	ccaaagatta	agtaggaggt	gaaatcatac	ctcactcatc	600
tgttgaaacg	atgtaatgca	cgacattgca	gaagagatag	aaatagagga	ttgggaaagc	660
tatcttttac	tttctgaata	atgtttgtta	acatatatac	aaattgttta	tctttcagac	720
aaactgtgag	tggtcagctt	tttcctgttt	tcagaaggcc	caactaaagt	cagcaaatac	780
aggaaacaat	gaaaggataa	taaatgtatc	aattaaaaag	ctgaagagga	aaccaccttc	340
cacaaatgca	gggagaagac	agaaacacag	actagtaaga	ttgtcatttg	tcatctctct	900
tatttgtact	tataaactat	atatcttgca	ttacataaac	atacacacac	acctgtagcc	960
agggctgctg	gtgtcttcct	tacctatagt	tatgccttat	tatacatggt	gctttttttt	1020
tttaagacag	agtctcactc	tgtcacccag	gctggagtgc	agtggcgtga	tctctgctca	1080
ccgcaagatc	cacctcccgg	tttcacgcca	ttctcctcct	acctcagcct	cctgagtacc	1140
tgggactaca	ggtgcccgcc	accatgcccg	gctaattttg	tttttgtatt	tttagtaaag	1200
acagggtttc	accatgttag	ccaggatggt	ctcgatctcc	tgaccccgtg	atccgcccgc	1260
cttggcctcc	caaagtgtgg	ggattacagg	catgagccac	cgcacccggc	ctatacgtgg	1320
tgcattttaa	gaagtagggt	cactctttta	agcccacaga	cttgaaagta	ttcaaaaacc	1380

PL 207 350 B1

155

caattataat	ttcctagtag	tccttggcag	ctggaatatg	ttaatatagc	ttctcaaggt	1440
gaggaagtca	ttaggcagag	aatccaactg	tgattttgga	gttaagaact	atttcctctc	1500
atatggtcac	agataacttg	tattcttatt	aacaggagct	agatcctagc	tttctaacaa	1560
gaaaagagcc	tacaagaaga	ctagggcaaa	tcttaaactt	tgcctcctct	ctaaatcata	1620
ttactatctg	tacatcagca	gagtcagtat	tgaatt			1656

<210> 107 <211> 644 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 107
agctaaactt	agaactctcc	agttaagcat	gttcatctta	tagatgagga	aaagtgagat	60
ctacaaagga	gttaagtcac	tagccccaag	ttccataaat	agtgtcagaa	tgagaattag	120
aacgtatatc	tactatcttt	tagtgaaatg	ctctcactac	aacatcacac	tggcattgag	180
atgctaacta	ccaagcaatg	gcttggtgtt	tggatctaaa	tagggataaa	gacaaagagc	240
ataaactaag	aaagcttttt	aaaaatctaa	gtgagcaatc	catatatgaa	aaactgttca	300
atctccctag	taatcacata	aatgcgagtt	aaaacaagga	aatcctgttt	tttccaatta	360
aacattttaa	acaataccct	ataataataa	gaatgctcca	agtgaaaaga	ggtaaaaccc	420
tttataatgt	atatcaaagc	cttaaaattt	ttatcccttt	aatttagtaa	ttctacttct	480
aggaatatat	caaataagca	aagatatata	tgaaaaatta	tttacagaga	tgttctttgg	540
agtaatgtag	acaaaaataa	aaagttagat	acagctgggt	gtggtggctc	atgcctgtat	600
tcccagcact	ttgggaggcc	gaggcaggcg	gatcacctga	gatc		644

<210> 108 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> misc_feature <222> (1)...(645) <223> η = A,T,C lub G

156

PL 207 350 B1 <400> 108

aaaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	gttagatgca	ccnttgggtc	caaaaatagt	aagagtgcat	60
cctatgtgga	aacagaccaa	ccactacatg	tcatattttt	gaagattatt	taacacttag	120
gaaatcctgt	gatatgttaa	gtgtgaaaaa	aaaaaagcaa	atcaccaact	ggtataaata	180
atgtaaatgc	acaataataa	ttaaaaatac	ccaaaacaca	gagagaatat	acattaaaac	240
attgcagtgg	gattcctatc	tctgggaatg	ggattacaag	gactttttcc	attgttactt	300
tccaaacaga	tttatgtact	tctcgaatgt	ttttcagtga	acataattta	tgtttttaat	360
gaaaaaaaat	tttaagaaac	attttattac	gaaaaaaatt	ttaaagaaga	ctgttacttt	420
ttcattgatt	tctagacatg	cccttcatgt	gattcttatg	agaaaaaacc	acccaaagaa	480
ttcctagaaa	gattcaaatc	acttctccaa	aaggtatcta	ccttaagttt	catttgattt	540
tctgctttat	ctttacctat	ccagatttgc	ttcttagtta	ctcacggtat	actatttcca	600
cagatgattc	atcagcatct	gtcctctaga	acacacggaa	gtgaa		645

<210> 109 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC25970 <400> 109 atgcattcta gactaggaga gatgctgatg aatcat 36 <210> 110 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC25969 <400> 110 atgcattccg gacataaatc aagcccccaa gggcca 36 <210> 111

PL 207 350 B1

157

<21

1>

153

<21

2> 1

PRT

<21

3> 1

Homo

sa'

piens

<40

0>

111

Met

Tyr

Arg

Met

Gin

Leu

Leu

Ser

Cys

Ile

Ala

Leu

Ser

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Val

Thr

Asn

Ser

Ala

Pro

Thr

Ser

Ser

Ser

Thr

Lys

Lys

Thr

Gin

Leu

20

25

30

Gin

Leu

Glu

His

Leu

Leu

Leu

Asp

Leu

Gin

Met

Ile

Leu

Asn

Gly

Ile

35

40

45

Asn

Asn

Tyr

Lys

Asn

Pro

Lys

Leu

Thr

Arg

Met

Leu

Thr

Phe

Lys

Phe

50

55

60

Tyr

Met

Pro

Lys

Lys

Ala

Thr

Glu

Leu

Lys

His

Leu

Gin

Cys

Leu

Glu

65

70

75

80

Glu

Glu

Leu

Lys

Pro

Leu

Glu

Glu

Val

Leu

Asn

Leu

Ala

Gin

Ser

Lys

85

90

95

Asn

Phe

His

Leu

Arg

Pro

Arg

Asp

Leu

Ile

Ser

Asn

Ile

Asn

Val

Ile

100

105

110

Vał

Leu

Glu

Leu

Lys

Gly

Ser

Glu

Thr

Thr

Phe

Met

Cys

Glu

Tyr

Ala

115

120

125

Asp

Glu

Thr

Ala

Thr

lie

Val

Glu

Phe

Leu

Asn

Arg

Trp

Ile

Thr

Phe

130 135 140

Cys Gin	Ser	Ile Ile Ser
145		150
<210>	112
<211>	153
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	112

Thr Leu Thr

158

PL 207 350 B1

Met

Gly

Leu

Thr

Ser

Gir.

Leu

Leu

Pro

Pro

Leu

Phe

Phe

Leu

Leu

Ala

1

5

10

15

Cys

Ala

Gly

Asn

Phe

Val

His

Gly

His

Lys

Cys

Asp

Ile

Thr

Leu

Gln

20

25

30

Glu

Ile

Ile

Lys

Thr

Leu

Asn

Ser

Leu

Thr

Glu

Gln

Lys

Thr

Leu

Cys

35

40

45

Thr

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Asp

Ile

Phe

Ala

Ala

Ser

Lys

Asn

Thr

Thr

50

55

60

Glu

Lys

Glu

Thr

Phe

Cys

Arg

Ala

Ala

Thr

Val

Leu

Arg

Gln

Phe

Tyr

65

70

75

80

Ser

His

His

Glu

Lys

Asp

Thr

Arg

Cys

Leu

Gly

Ala

Thr

Ala

Gln

Gln

85

90

95

Phe

His

Arg

His

Lys

Gln

Leu

Ile

Arg

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu

Asp

Arg

100

105

110

Asn

Leu

Trp

Gly

Leu

Ala

Gly

Leu

Asn

Ser

Cys

Pro

Val

Lys

Glu

Ala

115

120

125

Asn

Gln

Ser

Thr

Leu

Glu

Asn

Phe

Leu

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

Ile

Met

130

135

140

Arg

Glu

Lys

Tyr

Ser

Lys

Cys

Ser

Ser

145

150

<210>

113

<211>

162

<212>

PRT

<213>

Homo sapiens

<400>

113

Met

Arg

ile

Ser

Lys

Pro

His

Leu

Arg

Ser

Ile

Ser

Ile

Gln

Cys

Tyr

1

5

10

15

Leu

Cys

Leu

Leu

Leu

Asn

Ser

His

Phe

Leu

Thr

Glu

Ala

Gly

Ile

His

25 30

PL 207 350 B1

159

Val

Phe

Ile 35

Leu Gly

Cys

Phe

Ser Ala Gly Leu Pro Lys

Thr

Glu

Ala

40

45

Asn

Trp

Val

Asn

Val

Ile

Ser

Asp

Leu

Lys

Lys

Ile

Glu

Asp

Leu

Ile

50

55

60

Gin

Ser

Met

His

Ile

Asp

Ala

Thr

Leu

Tyr

Thr

Glu

Ser

Asp

Val

His

65

70

75

80

Pro

Ser

Cys

Lys

Val

Thr

Ala

Met

Lys

Cys

Phe

Leu

Leu

Glu

Leu

Gin

85

90

95

Val

Ile

Ser

Leu

Glu

Ser

Gly

Asp

Ala

Ser

Ile

His

Asp

Thr

Val

Glu

100

105

110

Asn

Leu

Ile

Ile

Leu

Ala

Asn

Asn

Ser

Leu

Ser

Ser

Asn

Gly

Asn

Val

115

120

125

Thr

Glu

Ser

Gly

Cys

Lys

Glu

Cys

Glu

Glu

Leu

Glu

Glu

Lys

Asn

Ile

130

135

140

Lys

Glu

Phe

Leu

Gin

Ser

Phe

Val

His

Ile

Val

Gin

Met

Phe

Ile

Asn

145

150

155

160

Thr

Ser

<210>

114

<211>

144

<212>

PRT

<213>

Homo sapiens

<400>

114

Met

Trp

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Leu

Leu

Gly

Thr

Val

Ala

Cys

Ser

Ile

1

5

10

15

Ser

Ala

Pro

Ala

Arg

Ser

Pro

Ser

Pro

Ser

Thr

Gin

Pro

Trp

Glu

His

20

25

30

Val

Asn

Ala

Ile

Gin

Glu

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Asn

Leu

Ser

Arg

Asp

35

40

45

Thr

Ala

Ala

Glu

Met

Asn

Glu

Thr

Val

Glu

Val

Ile

Ser

Glu

Met

Phe

160

PL 207 350 B1

55 60

Asp

Leu

Gin

Glu

Pro

Thr

Cys

Leu

Gin

Thr

Arg

Leu

Glu

Leu

Tyr

Lys

65

70

75

80

Gin

Gly

Leu

Arg

Gly

Ser

Leu

Thr

Lys

Leu

Lys

Gly

Pro

Leu

Thr

Met

85

90

95

Met

Ala

Ser

His

Tyr

Lys

Gin

His

Cys

Pro

Pro

Thr

Pro

Glu

Thr

Ser

100

105

110

Cys

Ala

Thr

Gin

Ile

Ile

Thr

Phe

Glu

Ser

Phe

Lys

Glu

Asn

Leu

Lys

115

120

125

Asp

Phe

Leu

Leu

Val

Ile

Pro

Phe

Asp

Cys

Trp

Glu

Pro

Val

Gin

Glu

130

135

140

<21

0>

115

<21

1>

538

<21

2>

PRT

<21

3>

Homo sa

piei

ns

<40

0>

115

Met

Pro

Arg

Gly

Trp

Ala

Ala

Pro

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Gin

Gly

1

5

10

15

Gly

Trp

Gly

Cys

Pro

Asp

Leu

Val

Cys

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Thr

20

25

30

Val

Ile

Cys

Ile

Leu

Glu

Met

Trp

Asn

Leu

His

Pro

Ser

Thr

Leu

Thr

35

40

45

Leu

Thr

Trp

Gin

Asp

Gin

Tyr

Glu

Glu

Leu

Lys

Asp

Glu

Ala

Thr

Ser

50

55

60

Cys

Ser

Leu

His

Arg

Ser

Ala

His

Asn

Ala

Thr

His

Ala

Thr

Tyr

Thr

65

70

75

80

Cys

His

Met

Asp

Val

Phe

His

Phe

Met

Ala

Asp

Asp

Ile

Phe

Ser

Val

85

90

95

Asn

Ile

Thr

Asp

Gin

Ser

Gly

Asn

Tyr

Ser

Gin

Glu

Cys

Gly

Ser

Phe

PL 207 350 B1

161

100 105 110

Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Ero Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val

115 120 125

Thr Phe Ser Gly Gin Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp

130 135 140

Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gin Tyr Glu Leu Gin Tyr

145 150 155 160

Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile

165 170 175

Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys

180 185 190

Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gin Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser

195 200 205

Ser Tyr Gin Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gin

210 . 215 220

Thr Gin Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu

225 230 235 240

Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys

245 250 255

Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser

260 265 270

Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe

275 280 285

Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly

290 295 300

Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His

305 310 315 320

Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gin Leu Thr Glu Leu Gin Glu

325 330 335

162

PL 207 350 B1

Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp

340 345 350

Pro Thr Ala Gin Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp

355 360 365

Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala

370 375 380

Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro

385 390 395 400

Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp

405 410 415

Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser

420 425 430

Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg

435 440 445

Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro

450 455 460

Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser

465 470 475 480

Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly

485 490 495

Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp

500 505 510

Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gin Trp Val Val Ile Pro Pro

515 520 525

Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gin Ala Ser

530 535

PL 207 350 B1

Claims (35)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Izolowany polipeptyd zawierający sekwencję reszt aminokwasowych, która jest

   a) co najmniej w 90% identyczna z resztami 41 (Gln) do 148 (Ile), jak ukazano w SEQ ID Nr: 2, przy czym reszta w pozycji 44 oznacza Asp, reszta w pozycji 47 oznacza Asp i reszta w pozycji 135 oznacza Glu, a reszty aminokwasowe 71, 78, 122 i 125 oznaczają cysteinę; lub

   b) jest co najmniej w 90% identyczna z resztami 32 (Gln) do 162 (Ser) jak ukazano w SEQ ID Nr: 2, przy czym polipeptyd wiąże receptor zalfa11, jak ukazano w SEQ ID nr: 115.
2. 2. Izolowany polipeptyd według zastrz. la, w którym sekwencja reszt aminokwasowych jest co najmniej w 95% identyczna z SEQ ID Nr: 2, od reszty 41 (Gln) do 148 (Ile).
3. 3. Izolowany polipeptyd według zastrz. 3, w którym sekwencja reszt aminokwasowych jest w 100% identyczna z SEQ ID Nr: 2, od reszty 41 (Gln) do 148 (Ile).
4. 4. Izolowany polipeptyd według zastrz. Ib, w którym sekwencja reszt aminokwasowych jest co najmniej w 95% identyczna z resztami 32 (Gln) do 162 (Ser) jak ukazano w sekwencji SEQ ID Nr: 2.
5. 5. Izolowany polipeptyd według zastrz. 4, w którym sekwencja reszt aminokwasowych jest jak ukazano w SEQ ID Nr: 2, od reszty 1 (Met) do reszty 162 (Ser).
6. 6. Izolowany polipeptyd według zastrz. 5, w którym sekwencja reszt aminokwasowych jest jak ukazano w SEQ ID Nr: 2 od reszty 32 (Gln) do reszty 162 (Ser).
7. 7. Izolowany polipeptyd zawierający sekwencję reszt aminokwasowych jaką ukazano w SEQ ID Nr: 56 od reszty 23 (Gln) do reszty 146 (Ser), przy czym polipeptyd ten wiąże receptor zalfa11, jak ukazano w SEQ ID Nr: 115.
8. 8. Izolowany polipeptyd według zastrz. 7, w którym sekwencja reszt aminokwasowych, jak ukazano w SEQ ID Nr: 56 oznacza resztę 1 (Met) do reszty 146 (Ser).
9. 9. Cząsteczka izolowanego polinukleotydu zawierająca sekwencję nukleotydów, która koduje polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 1-8.
10. 10. Cząsteczka izolowanego polinukleotydu według zastrz. 9, w której nukleotydy są takie jak ukazano w SEQ ID Nr: 1, od nukleotydu 167 do nukleotydu 490 lub jak ukazano w SEQ ID Nr: 3, od nukleotydu 121 do nukleotydu 444.
11. 11. Cząsteczka izolowanego polinukleotydu według zastrz. 10, w której nukleotydy są takie jak ukazano w SEQ ID Nr: 1, od nukleotydu 140 do nukleotydu 532 lub jak ukazano w SEQ ID Nr: 3, od nukleotydu 94 do nukleotydu 486.
12. 12. Cząsteczka izolowanego polinukleotydu według zastrz. 10, w której nukleotydy są takie jak ukazano w SEQ ID Nr: 1, od nukleotydu 47 do nukleotydu 532 lub jak ukazano w SEQ ID Nr: 3, od nukleotydu 1 do nukleotydu 4 86.
13. 13. Sposób wykrywania obecności RNA liganda zalpha11 w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (a) zetknięcie sondy kwasu nukleinowego liganda zalpha11 w warunkach hybrydyzujących z albo (i) testowymi cząsteczkami NA izolowanymi z próbki biologicznej, albo (ii) cząsteczkami kwasu nukleinowego syntetyzowanymi z izolowanych cząsteczek NA, przy czym sonda posiada cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd, jak zdefiniowano w zastrz. 6 lub 8 lub jej uzupełnienie; oraz (b) wykrywanie tworzenia hybryd sondy kwasu nukleinowego i albo testowych cząsteczek RNA, albo syntetyzowanych cząsteczek kwasu nukleinowego, przy czym obecność hybryd wskazuje na obecność RNA liganda zalpha11 w próbce biologicznej i przy czym ligand zalfa11 jest polipeptydem, jak zdefiniowano w którymkolwiek zastrz 1-8.
14. 14. Przeciwciało, które specyficznie wiąże się z ligandem polipeptydowym zalfha11, gdzie polipeptyd ten jest wybrany z:

    a) polipeptydu stanowiącego sekwencję aminokwasową SEQ ID Nr: 2 od aminokwasu o numerze 41 (Gln) do aminokwasu o numerze 148 (Ile);

    b) polipeptydu stanowiącego sekwencję aminokwasową SEQ ID Nr: 2 od aminokwasu o numerze 32 (Gln) do aminokwasu o numerze 162 (Ser);

    c) polipeptydu stanowiącego sekwencję aminokwasową SEQ ID Nr: 2 od aminokwasu o numerze 1 (Met) do aminokwasu o numerze 162 (Ser).

    164

    PL 207 350 B1
15. 15. Sposób wykrywania obecności polipeptydu jak zdefiniowano w zastrz. 1-8 w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (a) zetknięcia próbki biologicznej z przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała zdefiniowanym w zastrz. 14, przy czym zetknięcie przeprowadza się w warunkach, które pozwalają na wiązanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała z próbką biologiczną; oraz (b) wykrywania jakiegokolwiek związanego przeciwciała lub związanego fragmentu przeciwciała.
16. 16. Zastosowanie kompozycji zawierającej polipeptyd jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 8 do wytwarzania leku do leczenia chorób wynikających z uszkodzeń układu immunologicznego.
17. 17. Zastosowanie kompozycji zawierającej polipeptyd jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 8 do wytwarzania leku do stymulowania odpowiedzi immunologicznej u ssaka poddanego działaniu antygenu lub patogenu, przy czym w zastosowaniu tego leku poziom antygenu lub patogenu obecnego u wspomnianego ssaka jest porównywany przed i po podaniu tego leku, przy czym zmiana w poziomie jest wskaźnikiem stymulowania odpowiedzi immunologicznej.
18. 18. Zastosowanie według zastrz. 17, gdzie antygenem jest nowotwór komórki B, wirus, pasożyt lub bakteria.
19. 19. Zastosowanie polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 1-8 do rozprzestrzeniania komórek krwiotwórczych i prekursorów komórek krwiotwórczych in vitro, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórek szpiku kostnego lub krwi obwodowej z kompozycją zawierającą ilość polipeptydu wystarczającą, aby wytworzyć wzrost liczby komórek limfoidalnych w szpiku kostnym lub komórek krwi obwodowej, w porównaniu z komórkami szpiku kostnego lub krwi obwodowej hodowanymi przy braku polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 1-8.
20. 20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że komórkami krwiotwórczymi i prekursorami komórek krwiotwórczych są limfocyty.
21. 21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że limfocyty są komórkami NK lub cytotoksycznymi komórkami T.
22. 22. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że kompozycja zawiera także co najmniej jedną inną cytokinę wybraną z grupy obejmującej IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligand Flt3 i czynnik komórki macierzystej.
23. 23. Zastosowanie polipeptydu jak zdefiniowano w zastrz. 1-8 do wytwarzania leku do leczenia nowotworu komórki B lub T, przez zmniejszanie proliferacji nowotworowych komórek B Lub T.
24. 24. Zastosowanie polipeptydu według zastrz. 23, w którym lek zawiera także co najmniej jedną inną cytokinę wybraną z grupy obejmującej IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligand Flt3 lub czynnik komórki macierzystej.
25. 25. Zastosowanie kompozycji zawierającej polipeptyd jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 8 do wytwarzania leku do stymulowania odpowiedzi immunologicznej u ssaka narażonego na iziałanie antygenu lub patogenu, przy czym w zastosowaniu tego leku poziom specyficznego przeciwciała wobec tego antygenu lub patogenu obecnego u wspomnianego ssaka jest porównywani przed i po podaniu tego leku, przy czym zmiana w poziomie przeciwciała jest wskaźnikiem stymulowania odpowiedzi immunologicznej.
26. 26. Zastosowanie polipeptydu jak zdefiniowano w zastrz. 1-8 do wytwarzania leku do leczenia raka.
27. 27. Zastosowanie według zastrz. 26, w którym wspomniany polipeptyd ma 95% identyczność do sekwencji reszt aminokwasowych zawierających sekwencję ukazaną jako SEQ ID Nr: 2 od reszty 32 do 162.
28. 28. Zastosowanie według zastrz. 26-27, w którym wspomniany polipeptyd zawiera sekwencję reszt aminokwasowych zawierających sekwencję ukazaną jako SEQ ID Nr: 2 od reszty 32 do 162.
29. 29. Zastosowanie według zastrz. 27-28 do leczenia proliferacji nowotworowych komórek B lub T.
30. 30. Zastosowanie według zastrz. 26-27 do leczenia białaczki, przy czym wspomniany polipeptyd jest w postaci fuzji białka i saporyny.
31. 31. Zastosowanie według zastrz. 26-27 do leczenia chłoniaka, przy czym wspomniany polipeptyd jest w postaci fuzji białka i saporyny.
32. 32. Polipeptyd jak zdefiniowano w zastrz. 1-8 do zastosowania w medycynie.
33. 33. Wektor ekspresji zawierający następujące elementy połączone operacyjnie:

    (a) promotor transkrypcji;

    (b) segment DNA, kodujący polipeptydm jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 8; oraz (c) terminator transkrypcji.

    PL 207 350 B1

    165
34. 34. Komórka hodowana zawierająca wektor ekspresji, jak defniowano w zastrz. 33.
35. 35. Sposób wytwarzania białka, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki jak zdefiniowano w zastrz. 34, w warunkach, w których segment DNA jest poddany ekspresji; i odzyskiwanie białka kodowanego przez ten segment DNA.