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Table Des Matières
Table Des Matières
Table Des Matières
I.1. Généralités :
I.2.Historique :
I.2.Historique :
1906 - Le botaniste russe, M. TSWETT, publie son. livre: "Les chromophylles dans le monde
végétal et animal", où sa méthode de séparation de pigments est décrite en détail.
1931 - KHUN et LEDERER séparent à une échelle préparative les carotènes et des
xanthophylles. Le long sommeil de la méthode de Tswett est rompu ; elle se développe
rapidement, grâce aussi aux travaux de BROCKMANN, KARRER, WINTERSTEIN et
ZECHMEISTER.
I.4.Principe :
Le principe de la chromatographie est basé sur la migration différentielle des divers
solutés contenus dans l’échantillon analysé et obtenue par la partition des solutés entre les
phases fixe et mobile. Chaque molécule du mélange à séparer est soumise à une force de
rétention, affinité du soluté pour la phase fixe et une force de mobilité, entrainement du soluté
par la phase mobile (entrainement qui dépend essentiellement de la solubilité de la molécule
dans la phase mobile). La résultante de ces deux forces étant variable selon la molécule, chacune
d’elle migrera à une vitesse qui lui est propre
Les facteurs qui interviennent dans le partage des molécules à séparer entre les phases
fixe et mobile sont : la solubilité dans un solvant liquide, la taille, la forme, la présence de
groupements d’atomes formant des sites particuliers, la polarité, la charge électrique.
Coefficient de partage
Lorsqu’un soluté A est distribué entre deux liquides non miscibles (S et S’), il s’établit
un équilibre :
AsAs’
On définit le coefficient de partage comme étant le rapport des concentrations du soluté
A dans les deux phases S et S’ à l’équilibre et à température donnée :
q= [A]s’/[A]s
Un soluté très soluble dans la phase fixe aura un RF faible
Un soluté très soluble dans la phase mobile aura un RF élevé et proche de 1.
II.1.2.-Solvants
Un partage est caractérisé par ses deux solvants de développement, l’un fixe, l’autre
mobile. Les deux solvants sont caractérisés par leurs différences de polarité et leurs non-
miscibilités. Généralement, le solvant fixe est polaire (très souvent l’eau). Le solvant mobile,
non polaire, est constitué fréquemment d’un mélange de solvants plus au moins apolaires, selon
les nécessités de la séparation.
II.1.3.-Support
Pour servir de support à la phase stationnaire, il faut des matières poreuses neutres, peu ou pas
adsorbantes, finement divisées.
-Terre d’infusoires Ex. célité 535, hyflo superce.
-Gel de silice : qui peut être purifié par lavage à l’éther ou au chloroforme.
-Cellulose : un lavage préliminaire et soigné est utile.
-Caoutchouc en poudre : purifié par extraction à l’acétone.
-Terre d’infusoires imprégnée : Ex.hyflo supercel exposé à des vapeurs de diméthyl
dichlorosilane.
-Papier cellulosique type Whatman.
II.1.4.-Analyse des fractions
L’analyse des fractions est presque toujours qualitative et elle peut être quelque fois
quantitative.
Analyse qualitative
L’identification des composés du mélange peut se faire selon plusieurs procédés :
-par utilisation de témoins (standards): ce sont des composés supposés du mélange dont on
dépose des solutions pures sur le même chromatogramme. On compare la migration des témoins
à celle des spots de l’échantillon analysé.
-on caractérise la migration des solutés 1 et2 soit par leur RF soit par leur RT :
Distance parcourue par le solute
𝑅𝐹 =
Distance parcourue par le solvant
Dans le cas où l’on chromatographie des substances incolores, il est nécessaire de visualiser les
spots : plusieurs procédés peuvent être utilisés :
par fluorescence.
par une réaction chimique, on distingue :
- Des réactions spécifiques, employées pour une seule substance, la réaction de Millon pour la
tyrosine par exemple.
Remarque :
Dans le cas où le mélange contient des solutés de mobilités voisines, on peut augmenter
le pouvoir séparateur en réalisant une chromatographie bidimensionnelle : sur le même support,
on réalise une première chromatographie à l'aide d'un système de solvants, puis une deuxième
à l'aide d'un second système de solvants, dans une direction perpendiculaire à la première.
II.1.5.-Appareillage :
La chromatographie de partage liquide-liquide peut être réalisée :
Sur colonne : La colonne est remplie d’un support imprégné d’un solvant fixe.
L’ensemble constitue la phase stationnaire.
Sur papier : la feuille de papier, sur laquelle le dépôt a été fait, est introduite dans la
cuve contenant la phase fixe, le plus souvent aqueuse.
III.1.3.- Appareillage :
Dans tout appareil de chromatographie liquide haute performance on retrouvera toujours les
éléments de base suivants :
un ou plusieurs réservoirs de phase mobile contenant soit des solvants purs soit des
mélanges de solvants dans des concentrations connues.
un système d'injection comportant une boucle d'échantillonnage calibrée.
une colonne remplie, en acier inox, de quelques centimètres de long.
un détecteur permettant à la fois, de mettre en évidence la sortie des solutés de la colonne
et de donner un signal proportionnel à la quantité de chacun de ces solutés, dans un
mélange. L'utilisation d'un solvant pur ou d'un mélange de solvants de composition
constante dans le temps correspond à une étude en mode ISOCRATIQUE (le solvant
utilisé possède le même pouvoir éluant durant toute l’élution).
L'utilisation d'un mélange de solvants dont la composition est variable dans le temps correspond
à une étude en mode GRADIENT.
III.1.3.1.-Réservoir de phase mobile
Un réservoir de solvant (éluant) qui contient la phase mobile en quantité suffisante.
Plusieurs flacons d'éluant (solvants de polarités différentes) sont disponibles pour pouvoir
réaliser des gradients d'élution (mélange de plusieurs solvants à des concentrations variables),
à l'aide de la pompe doseuse.
III.1.3.2.-Système de pompage
La pompe est munie d'un système de gradient permettant d'effectuer une
programmation de la nature du solvant. Elle permet de travailler: - en mode isocratique, c'est-
à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de l'analyse
- en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des constituants du
mélange d'éluant. Les pompes actuelles ont un débit variable de quelques microlitres/mn à
plusieurs ml/min.
III.1.3.3.-Vanne d’injection
Le systéme d’injection permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui est important
pour l'analyse quantitative, il est constitué le plus souvent d’une vanne rhéodyne, la boucle
d’injection (capacité de 5 à 5000μl ) est remplie dans un premier temps, puis dans un
deuxième temps en tournant la vanne on procède à l’injection dans de bonnes conditions, il
convient :
de ne pas surcharger la colonne (si l’échantillon est trop important on aboutit à des pics
très larges et des phénomènes de traine, ce qui diminue le pouvoir de résolution de la
chromatographie)
d’injecter très rapidement.
Fig.2. Vanne d’injection à boucle
III.1.3.4.-Colonnes
Les colonnes de HPLC sont usuellement en acier inoxydable. La plupart des colonnes
ont une longueur de 10 à 30 cm et un diamètre intérieur de 4 à 10 μm. La colonne est souvent
précédé pour augmenter sa durée de vie, d'une précolonne dite colonne de garde, courte de
1cm, qui retient les composés indésirables. On change périodiquement cette précolonne, bien
qu'il soit par ailleurs conseillé de faire passer les échantillons avant analyse à travers un filtre
de porosité inférieure à 0,5μm.
III.1.3.5.-Détecteurs
Le détecteur a pour but de fournir un signal électrique reflétant en continu les
variations de composition de l'eluat en sortie de colonne ce qui permet de détecter le passage
des composés successifs, les plus utilisés en HPLC :
III.1.3.5.1.-Spectrophotomètre UV-Visible
La réponse de ce type de détecteur est fondée sur la loi de Beer-Lambert Do= ε C l
- les détecteurs à longueur d'onde fixe. La longueur d'onde de 254 nm a été fixée par
l'utilisation de la lampe à vapeur de mercure, qui a une raie d'émission maximale à 253,7 nm.
Ceci a permis la construction de détecteurs de grande sensibilité, extrêmement stables et très
utiles, car la plupart des composés organiques présentent une absorption dans l'U.V. au
voisinage de 254 nm. - Les détecteurs à longueur d'onde variable ; les détecteurs à longueur
d'onde variable sont utiles lorsque le maximum de sensibilité correspond à une longueur
d'onde autre que 254 nm. – Les détecteurs à barrette de diodes. L'utilisation du principe de la
diode photoélectrique en tant que récepteur dans un spectrophotomètre est réservée au
montage de type multicanal, sous forme de barrette de diodes. Une barrette de diodes de
quelques mm contient plusieurs centaines de diodes, chacune reçoit le rayonnement contenu
dans un petit domaine spectral. Chacun des circuits élémentaires est exploré par un système
pilote : par un micro-ordinateur. Ce système permet l'acquisition du spectre de l'échantillon
en temps réel, une représentation en 3 dimensions (temps, absorbance, longueur d'onde) et
une caractérisation des composés par leur spectre. Détecteur à barrette de diodes
III.1.3.5.2.-Détecteur à fluorescence
La fluorescence est le rayonnement émis par des composés comportant certains
groupements fonctionnels, lorsqu'ils sont excités par une radiation lumineuse. Le rendement
de la fluorescence est fonction des longueurs d'onde d'excitation et d'émission.
Certains composés présentent une fluorescence naturelle ; si tel n'est pas le cas, il est souvent
possible d'obtenir au niveau du détecteur des dérivés fortement fluorescents en faisant agir
avant la séparation chromatographique des réactifs appropriés sur les composés de
l'échantillon ne présentant aucune fluorescence.
III.1.3.5.3.-Détecteur réfractométrique
Le réfractomètre mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la sortie de
la colonne. Cette mesure, extrêmement précise, dépend néanmoins de la température du
liquide. On compare cet indice avec celui de la phase mobile pure : il y a donc une référence
d'où le terme de variation de l'indice. Ce détecteur exclut les variations de la composition de
la phase mobile ; il n'est donc possible de travailler qu'en mode isocratique avec ce détecteur.
Il existe d’autres types de Détecteurs par exemple :
- Détecteur conductimétrique (utilisable pour les substances chargées)
- Détecteur à mesure de radioactivité…
III.1.3.6.-Phase mobile
Il est recommandé de toujours employer des solvants traités spécifiquement pour la
CLHP; ils doivent être dégazés afin de ne pas introduire de bulles d’air dans la colonne de
dégazage. Le dégazage est effectué par ultra sons ou par barbotage d’un gaz inerte
chimiquement par exemple azote, argon, hélium..
Ainsi malgré la haute qualité des solvants, la filtration sur filtre spécial (0,4 μm) est
recommandée.
III.1.3.7.-Phase stationnaire
Les phases stationnaires en CLHP sont très variées:
HPLC d’adsorption : La phase stationnaire est constituée d’un solide polaire et adsorbant
: silice non greffée, silice greffée polaire….., la phase mobile est un éluant isocratique apolaire
ou un gradient de polarité.
HPLC phase inversée :
La phase stationnaire est un solide apolaire, c’est une silice greffée apolaire, par
exemple une silice greffée 18 carbones.
HPLC d’exclusion :
La phase stationnaire est un solide poreux, silice poreuse à groupements silanols
bloqués ou supports organiques, polymères réticulés. La phase mobile est un éluant
isocratique inerte.
HPLC ionique :
La phase stationnaire est une silice greffée chargée ou un support acrylique chargé. La
phase mobile est un gradient de pH ou de force ionique.
III.1.4.-Application :
Les domaines d’applications sont nombreux et vastes, l’HPLC est particulièrement
employée en cosmétologie ou en biochimie.
-elle permet l’analyse de substances thermiquement instables, puisque l’opération s’effectue
à T° ambiante.
- l’analyse de substances peu volatiles.
-l’analyse des substances ionisés (protéines, acides aminés…).
III.2.-Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
Les premières véritables expériences de CPG ont été réalisées par Martin et James en
1951 sur les acides gras de faible masse moléculaire. La séparation se faisant par partage et la
méthode a été décrite par Martin et ses collaborateurs comme de la chromatographie de
partage gaz-liquide. Cette technique d’analyse est à l’heure actuelle l’une des plus utiles et
des plus répandues dans les laboratoires de chimie analytique et biochimie, elle a été
perfectionnée et permet maintenant de séparer les constituants de mélange très complexes
contenant jusqu'à 200 composés analogues, pour des échantillons très réduits.
III.2.1.-Principe :
La chromatographie en phase gazeuse est une transposition de la chromatographie sur
colonne dans laquelle la phase mobile liquide a été remplacée par un gaz.
La CPG gaz-solide est une chromatographie d’adsorption, la phase stationnaire étant
un solide adsorbant, la migration différentielle est assurée par les différences d’adsorbalité.
La CPG gaz-liquide est une chromatographie de partage, la phase stationnaire étant un liquide
non volatil réparti sur un support inerte. Le gaz vecteur est le gaz qui véhicule les solutés. la
migration différentielle est obtenue par les différences de solubilité dans le liquide fixe. Le
soluté se partage entre le gaz vecteur et le liquide stationnaire.
III.2.2.-Appareillage
III.2.2.2.-injecteur :
Les échantillons liquides sont injectés à l’aide d’une micro-seringue graduée dans la
chambre de vaporisation, au travers d’un bouchon généralement constitué de téflon, la
température doit être suffisante a l’entrée de l’échantillon pour permettre une vaporisation
du liquide sans que l’échantillon se décompose ou que s’effectue une séparation partielle des
constituants, en règle générale en choisit la température d’ébullition du constituant le moins
volatil, pour plus d’efficacité, on prélèvera le plus faible volume d’échantillon (1 à 10μl) qui
soit compatible avec la sensibilité du détecteur.
Nature d’échantillon injecté :
Le traitement de l’échantillon varie selon les substances analysées :
-lorsque les solutés à analyser sont directement volatilisables, les substances sont extraites,
purifiées, solubilisées dans un solvant volatil pur et chromatographiés.
-lorsque les solutés ne sont pas volatils à la température du chromatographe ou bien sont
décomposés à cette température, il faut les transformer avant l’analyse en dérivés volatils
stables ; les acides aminés sont estérifiés par le méthanol, les oses réduits en alditols, puis
acétylés….
III.2.2.3.-La colonne :
La colonne est placée dans un four fermé à thermostat pour maintenir la température
constante à 0,5°C prés et pour que les conditions soient reproductibles. Cette température
peut être choisie dans une gamme allant de la température ambiante jusqu'à plus de 400°C
et pour une opération isotherme,
Les colonnes sont métalliques, en plastiques (pour des séparations à basse température), en
verre et joints téflon lorsque le métal des colonnes risque de provoquer une décomposition
catalytique de l’échantillon analysé. Diverses formes ont été utilisées : rectilignes, en spirales,
cette dernière est la plus employée car elle permet de limiter l’encombrement de l’appareil.
En CPG d’adsorption on utilise des colonnes de 1m de long et de 3mm de diamètre. En CPG
de partage on travaille avec des colonnes pouvant atteindre 5m. On peut distingué deux types
de colonnes :
Les colonnes remplies (classiques): constituées de tubes ayant jusqu’a 5m de long, de 2
à 4mm de diamètre intérieur, en verre, en métal (aluminium, acier inoxydables ou cuivre ou
en plastique résistant aux hautes températures (téflon).
Les colonnes capillaires: les premières colonnes capillaires en quartz étaient préparées
en revêtant la surface interne d’un tube de silice vitreuse, de 50m de longueur et de 0,22 mm
de diamètre intérieur.
Choix de la phase stationnaire :
En CPG gaz-solide, les adsorbants gel de silice, alumine,…peuvent subir différents
traitements, afin de modifier leur pouvoir adsorbant.
En CPG gaz-liquide, la phase stationnaire est un support inerte imprégné d’un liquide. Le
liquide est un hydrocarbure, un silicone, un ester, un polyol, caractérisé par sa température
d’utilisation et sa polarité.
III.2.2.4.-Détecteur:
Placé à la sortie de la colonne de séparation, leur fonction est de détecter et de
mesurer, après séparation la présence de petites quantités de constituants dans l’éluat de la
colonne.
Les résultats sont envoyés à un appareil qui trace une courbe appelée
chromatogramme.
Le choix du détecteur dépend de plusieurs facteurs tels que le niveau des concentrations à
mesurer et la nature des constituants séparés.
Détecteur à ionisation de flammes :
C’est un détecteur à une voie, très sensible, le gaz vecteur, en sortie de colonne est
mélangé à de l’hydrogène, puis brule entre deux électrodes ; il s’établie un courant entre les
électrodes du à l’ionisation de la flamme. Ce courant est constant lorsque le gaz vecteur est
pur et le scripteur de l’enregistreur trace une ligne de base. Si un soluté organique
accompagne le gaz vecteur, sa combustion modifie l’intensité du courant et cette variation est
enregistrée sous forme d’un pic.