CHROMATOGRAPHIE

-Aspects généraux-
 I. INTRODUCTION

La chromatographie est une méthode de

séparation qui permet de séparer les constituants
d’un mélange en phase homogène liquide ou
gazeux.

Elle sert en analyse pour identifier et quantifier des

composés au sein d’échantillons divers.

C’est une technique de séparation très puissante qui permet de

travailler sur des quantités allant jusqu’au µg

2
 II. Principe

Le principe de base repose sur les équilibres de

concentration qui apparaissent lorsqu’un composé
est mis en présence de deux phases non miscibles.
En chromatographie, l’une, dite stationnaire, est
emprisonnée dans une colonne ou fixée sur
un support et l’autre, dite mobile, se déplace au
contact de la première.

3
Principe

 Séparation de mélange complexe

 Basée sur des équilibres particuliers entre les composés et deux

phases :

 Phase stationnaire

 Phase mobile
 Différentes interactions peuvent entrer en jeu :

 Adsorption
 Partage
 Paires d’ions
 Échange d’ions
 Exclusion stérique
4
Principe
 Affinité forte du produit pour la phase stationnaire :

 Le produit progresse lentement dans la phase

stationnaire

 Le temps de rétention du produit est long

 Affinité forte du produit pour la phase mobile :

 Le produit progresse rapidement dans la phase

stationnaire

 Le temps de rétention du produit est plus court

 Le temps de rétention du composé permet son identification

5
 III. Définition
La chromatographie est une méthode physique de
séparation basée sur les différentes affinités d’un ou
plusieurs composés à l’égard de deux phases
(stationnaire et mobile).
L'échantillon est entraîné par la phase mobile au
travers de la phase stationnaire qui a tendance à
retenir plus ou moins les composés de l'échantillon à
l'aide de différentes interactions. L’échantillon est
adsorbé puis désorbé sur la phase stationnaire, ou est
plus ou moins soluble dans la phase mobile.

6
IV. Applications

Les applications de ce procédé sont donc

potentiellement très nombreuses, d’autant plus que
beaucoup de mélanges hétérogènes ou sous forme
solide peuvent être mis en solution par emploi d’un
solvant (celui-ci apparaissant comme un composé
supplémentaire).

7
Domaines d’applications
 Industrie chimique : production, contrôle…

 Industrie alimentaire : corps gras, vins et spiritueux, bière, arôme…

 Industrie cosmétique et parfums

 Industrie pharmaceutique

 Energie : raffinerie de pétrole, gaz naturel, biomasse…

 Contrôle pollution : eaux, sols, atmosphère

 Exploration spatiale

 Police scientifique

 Recherche scientifique

8
La statistique ci- dessus fait apparaitre que la
chromatographie, à elle seule , représente plus de la
moitié du chiffre d’affaires de l’instrumentation
d’analyse moléculaire
9
 V. Historique
Le terme chromatographie vient du grec « chroma =
couleur » et « graphein = écrire ». a été réalisée en
1906 par le botaniste russe Mikhaïl Tswett
chromatographie et consistait à séparer les pigments
d'une feuille d'épinard sur une colonne en CaCO3 .
Tswett constatait : "Tout comme les rayons lumineux
d'un spectre, les différentes composantes d'un mélange
de colorants se déploient sur la colonne de carbonate
de calcium selon une loi et peuvent être analyser
qualitativement et quantitativement.

10
Quelques dates importantes :

1906 : Découverte de phénomène chromatographique par M. TSWETT

Cette technique fut quasi-abandonnée jusqu'en 1930, où Edgar Lederer a

purifié par la méthode de Tswett la lutéine du jaune d’œuf

1938 : Première chromatographie sur couches minces (Ismailov et

Schraiber)
1952 : Première chromatographie gazeuse (MARTIN et JAMES)
1955 – 1960 : Age d’or de la chromatographie en phase gazeuse
1967 : Début de la chromatographie liquide haute performance (HUBER
et HUZSMAN)

En 1979, première séparation chirale par HPLC

De nos jours : Amélioration instrumentale (informatisation) et

innovation dans le domaine de la miniaturisation (nanotechnologie)

11
VI. Terminologie générale de la chromatographie.

Soluté: toute substance constituant d’un mélange, séparée par

chromatographie.
Phase mobile: le vecteur, liquide ou gazeux, qui déplace le soluté.
Phase stationnaire: le produit qui, par ses affinités avec les solutés, va
permettre leur séparation quand la phase mobile les déplace.
Support: Un substrat inerte qui porte la phase stationnaire.
Remplissage: l’ensemble des produits (adsorbant, support + phase
stationnaire, etc...) qui garnissent une colonne chromatographique.
Colonne chromatographique: tube de diamètre et longueur variable, en
verre, métal, ou autre substance, à l’intérieur duquel s’opèrent les
séparations chromatographiques.
Chromatogramme: trace sur un papier enregistreur des réponses
successives du détecteur, au cours de l’élution des solutés hors des
colonnes.
12
13
Les questions que vous aurez à vous poser ?

 Quel type d’échantillon ? Solide, liquide, gazeux

 Que veut on doser ? Composé majeur, mineur ou des traces

 Analyse partielle ou complète de l’échantillon ?

 Récupération de l’échantillon ?

 Précision de l’analyse ? Qualitatif ou quantitatif

 Durée de l’analyse ?

 Quel sera le coût de l’analyse ?

 Poids de l’analyse sur l’environnement ?

14
VII. Classification
On peut classer les différents types de chromatographies de plusieurs
façons différentes selon que l’on considère la nature des phases
utilisées ou les mécanismes de séparation des composés.

VII.1. Classification selon la nature des phases :

• la phase mobile est un fluide, donc soit un liquide, soit un gaz

,soit encore un fluide supercritique

• la phase stationnaire est soit un solide, soit un liquide (fixé sur

un support solide).

15
La combinaison de ces possibilités conduit à diverses
possibilités :

PHASE MOBILE PHASE STATIONNAIRE METHODE CHROMATOGRAPHIQUE

Gaz Solide C.G.S

Gaz Liquide C.G.L
Liquide Solide C.L.S
Liquide Liquide C.L.L

● la chromatographie supercritique (SFC) La SFC représente un

cas intermédiaire entre LC et GC, les fluides supercritiques
possédant des propriétés à la frontière entre celles des liquides
et celles des gaz.

16
VII.2- Classification selon le phénomène chromatographique :

Ce dernier dépend de la nature (et de la structure) de la phase stationnaire

utilisée. On distinguera donc :

• la chromatographie d'adsorption (LSC, GSC) (lorsque la phase

stationnaire est un solide); par extension on pourrait y rattacher la
chromatographie d'affinité, qui correspond à un cas où les propriétés
d'adsorption de la phase stationnaire sont spécifiques vis-à-vis d'un (ou
une famille de) composé(s).
• la chromatographie de partage (LLC, GLC), lorsque la phase
stationnaire est un liquide non miscible avec la phase mobile (mise en jeu
de coefficients de partage).
• la chromatographie d'échange d'ions (IEC), où la phase stationnaire
porte des groupes fonctionnels acides ou basiques, destinée à séparer des
composés ionisés.
• la chromatographie d'exclusion (SEC) où la phase stationnaire
(poreuse) se comporte comme un tamis et sépare les composés en
fonction de leur taille; on parle aussi de chromatographie de perméation de
gel (GPC).
17
VII.3. Classifications selon les procédés utilisés :

Selon le conditionnement de la phase stationnaire, on

distinguera :

• la chromatographie sur colonne

• la chromatographie sur papier

• la chromatographie sur couche mince.

18
 VII.4. Classifications selon les procédés utilisés :
Selon les modalités de migration de la phase mobile, on distinguera

• La chromatographie par développement (les constituants de

l'échantillon restent sur la phase stationnaire)
procédé dans lequel la phase mobile a plus d’affinité que le soluté
pour la phase stationnaire, donc le pousse devant elle. Procédé
essentiellement mis en œuvre actuellement en chromatographie
planaire à la fin de laquelle les solutés séparés ne sont en général
pas récupérés.

• La chromatographie d'élution (les substances sont entraînées

hors de la phase stationnaire).
Procédé s’effectue sur une colonne, dans la quell la phase mobile
parcourt en permanence la phase stationnaire afin que les solutés
introduits à une extrémité de celle-ci sortent à l’extrémité opposée.
Dans cette méthode, la phase mobile est inerte vis-à-vis de la phase
stationnaire.
19
VII.5. Classification selon les paramètres intervenant
dans la séparation :
Les paramètres physico-chimiques sur lesquels reposent les
principes de séparation sont :

● la polarité et/ou l'hydrophobicité : polarité de phase

normale ou inversée

● la charge électrique : échange d'ions

● la taille et la forme (en fait, le volume) : exclusion ou

perméation de gel

● l'existence de structures particulières qui

permettent d'établir des liaisons spécifiques :
chromatographie d'affinité

20
 interactions tripartites entre soluté, phase
stationnaire et phase mobile

21
VIII. Propriétés des phases stationnaires

• On distingue

– Le support: silice ou alumine

– La phase elle-même
• Adsorbant
• Solide à pores calibrés
• Liquide imprégnant les pores
• Molécules greffées
– Fonction organique

– Échangeur d’ions

22
 IX. Comparaison CG/CL

Les deux techniques de base de la chromatographie ne

sont pas compétitives mais tout à fait complémentaires.
Quelques avantages de la CL :
• Possibilité de chromatographier : Produits thermolabiles
et Produits de haute masse molaire.
• Dérivation des produits peut être automatisée
• Mode préparatif facile à mettre en œuvre
Quelques avantages de la C.G :
• Détecteurs spécifiques et sensibles
• Couplage avec spectrométrie
• Possibilité d’analyser les produits de très faibles
masses molaires.
23
X. Grandeurs chromatographiques

Le chromatogramme Un chromatogramme est un diagramme à deux dimensions

montrant l’évolution, en fonction du temps, d’un paramètre (absorbance,
fluorescence…) qui dépend de la concentration instantanée du soluté en sortie
de colonne.
Le temps (ou très rarement le volume d’élution) est porté en abscisse et
l’intensité du signal de détection en ordonnée. La ligne de base correspond au
tracé obtenu en l’absence de composé élué. La séparation est complète quand le
chromatogramme présente autant de pics chromatographiques revenant à la
ligne de base qu’il y a de composés dans le mélange à analyser
24
25
 Grandeurs physiques : Temps

tM (Temps mort) : temps écoulé pour un composé non retenu

traverse la colonne

tR (Temps de rétention) : temps écoulé entre l’instant de

l’injection et le max du pic du composé

t’R (Temps de rétention réduit) : temps de rétention affranchit

des phénomènes hors phase stationnaire
t’R = tR – tM
26
PICS D’ÉLUTION GAUSSIENS

27
un exemple de chromatogramme réel qui montre que
l’élution des composés peut conduire à des pics qui
ressemblent vraiment à des courbes gaussiennes

28
29
 Grandeurs de rétention :
volume de rétention VR (Volume d’élution): Le volume rétention (
d’élution) VR de chaque soluté représente le volume de phase mobile
nécessaire pour le faire migrer d’une extrémité à l’autre de la colonne.

VR = tR ·D

En CG, pour un soluté donné, le VR est constant si la température du four

est constante

Volume d’un pic, Vpic. Il correspond au volume de phase mobile

dans lequel le composé est dilué en sortie de colonne. Il vaut par
définition :
Vpic = v·D

30
Grandeurs de rétention :

volume mort VM (Volume de la phase mobile dans la colonne)

Le volume de la phase mobile dans la colonne (encore appelé volume
mort) VM correspond au volume interstitiel accessible. Il peut être
calculé d’après le chromatogramme, à condition d’introduire un soluté
non retenu par la phase stationnaire. On peut l’exprimer en fonction de
tM et du débit D :
VM = tM ·D

* en CG, le VM est déterminé avec du méthane

* en CL, le VM est déterminé à partir du pic du solvant

Volume de la phase stationnaire : Ce volume désigné par VS

n’apparaît pas sur le chromatogramme. Dans les cas simples on le
calcule en retranchant du volume total interne de la colonne vide le
volume de la phase mobile.

31
 Attention

VM différent du volume de la colonne car il faut prendre en compte

la porosité ε de la colonne

VCol = Volume de la colonne = π . L. (d/2)2

VM = Volume mort = π . (d/2)2 . ε

ε = 0,8 pour une bonne colonne

32
VM (Volume mort) : Volume de la phase mobile

tM : tps mort
VM = tM . D D : Débit

VS (Volume stationnaire) : Volume de la phase stationnaire

Vtot : Vol. total interne

VS = Vtot - VM
VR (Volume rétention) : Volume de la phase mobile qu’il faut faire passer
pour faire migrer le soluté
tR : tps rétention
VR = tR . D D : Débit

33
Grandeurs physiques : COEFFICIENT DE DISTRIBUTION (K)

C’est le paramètre physico-chimique de base en chromatographie qui

quantifie le rapport de concentration de chaque composé entre les deux
phases en présence.

Les valeurs de K sont très variables. Elles sont grandes (1 000, par
exemple) lorsque la phase mobile est un gaz, et petites (2, par ex.)
lorsque les deux phases sont à l’état condensé.
Chaque composé n’occupant qu’un espace limité de la colonne et de plus
avec une concentration variable, les valeurs vraies de CM et de CS ne sont
pas accessibles mais leur rapport est constant.

34
Facteur de rétention k (ou de capacité): Quand un composé de
masse totale mT est introduit dans la colonne, il se répartit en deux
quantités : mM dans la phase mobile et mS dans la phase stationnaire. Si
on ne change pas les conditions opératoires, ces deux quantités
demeurent constantes au cours de sa migration dans la colonne. Leur
rapport, appelé facteur de rétention, est indépendant de mT :

Ce paramètre rend compte de la faculté plus ou moins grande de la colonne à

retenir chaque composé (capacité). Dans la mise au point des séparations on
fait en sorte que k ne dépasse pas 10, afin de ne pas trop allonger le temps de
passage des composés.

- k varie avec les conditions opératoires (ΦMob, ΦStat , température)

- k est indépendant de débit (D)
- k est indépendant de la longueur de la colonne (L)
- Définit le comportement des colonnes
- k est le paramètre le plus important d’une colonne 35
Sachant que le temps de rétention d’un composé tR est tel que tR = tM + tS ,
la valeur de k est donc accessible à partir du chromatogramme (tS = tR)

Cette relation importante est également souvent rencontrée sous la forme :

VR = tR ·D

VM = tM ·D

VR = VM (1+k)
36
 Règle générale : Facteur de rétention k’

 k’ = 0 → tR = tM ou VR = VM

☻ Composé non retenu par la phase stationnaire

 k’ faible

☻ Composé peu retenu par la phase stationnaire

☻ tR rapide

 k’ très grand

☻ Composé très retenu par la phase stationnaire

☻ tR très grand

 k’ trop grand

☻ Composé trop retenu par la phase stationnaire

☻ Phénomène de diffusion, le pic s’élargit 37
 Règle générale : Facteur de rétention k’

 Ordre de grandeur de k’ : Compris entre 1 et 10

 Le meilleur compromis :

☻ Analyse courte
☻ Bonne séparation

2 < k’ < 6

38
1 heures
Facteur de sélectivité a (séparation) entre deux solutés :
Permet de préciser les positions relatives de deux pics adjacents 1 et 2
sur un chromatogramme (t’R2 > t’R1) a > 1

39
FACTEUR DE RÉSOLUTION ENTRE DEUX PICS : (entre deux
solutés) traduit la séparation relative de deux solutés sur le
chromatogramme (tR2 > tR1) : R > O

À partir de R = 1,5 on considère que les pics sont résolus, la vallée entre les
pics étant d’environ 2 %.
40
 Exemple appliqué à la CPG:
 Séparation de deux composés A et B sur une colonne de 2 m :

 Calculer la résolution de la colonne ?

o Données expérimentales :

 tRA = 400 sec ωA = 19,5 sec

 tRB = 420 sec ωB = 20,5 sec
 tM = 50 sec

R = 2.(420-400)/(19,5+20,5) = 1

Mauvaise séparation
41
Effet de la longueur de la colonne sur la résolution

42
Les chromatogrammes réels sont quelquefois loin de présenter des
pics d’aspect gaussien.
Il y a plusieurs raisons à cela. En particulier il se produit une
irrégularité de concentration dans la zone de dépôt de la substance
en tête de colonne. De plus, la vitesse de la phase mobile est nulle au
niveau de la paroi et maximum au centre de la colonne.
L’asymétrie observée d’un pic est traduite par deux paramètres
appelés facteur d’asymétrie (Fa) et facteur de traînée (Ft), mesurés à
10 % de sa hauteur.

43
Le chromatogramme réel

Cas idéal Surcharge Composé trop peu

de la phase stationnaire retenu

 Irrégularité de concentration dans la zone de dépôt

 Vitesse de la phase mobile non constante dans la colonne

44
a- isotherme linéaire

Situation idéale correspondant à

l’invariance de l’isotherme de
concentration ( facteur de traînée
est égale à 1).

45
b- isotherme convexe

situation dans laquelle la phase

stationnaire est saturée – de ce fait la
montée du pic est plus rapide que la
descente (facteur de traînée plus grand
que 1) ;

46
c- isotherme concave

situation inversée : le constituant est

trop retenu dans la phase
stationnaire, le temps de rétention
est allongé et la montée du pic est
plus lente que la descente, (facteur
de traînée inférieur que 1)

47
 Cas idéal Surcharge Composé trop
de la phase peu retenu
stationnaire

Pour chaque type de colonne, les fabricants indiquent quelle est leur capacité
limite exprimée en ng/composé, avant déformation du pic. Les situations a, b et
c sont illustrées avec des chromatogrammes réels en CLHP.
48
XI-THÉORIE DE LA CHROMATOGRAPHIE

Depuis un demi-siècle, différentes théories visant à

modéliser la chromatographie ont été et continuent à être
proposées.
Les plus connues sont les approches statistiques (théorie
stochastique), le modèle des plateaux, et l’approche par la
dynamique moléculaire.

49
XI- 1 : la théorie cinétique

 La théorie cinétique considère le pic chromatographique comme

représentatif de la distribution statistique des temps de rétention
des molécules d’une substance donnée sur la colonne.

 La théorie cinétique considère les phénomènes de diffusion et de

transfert de masse

50
 Phénomènes de diffusion :

Diffusion moléculaire longitudinale

Diffusion turbulente
Remplissage

51
 Transfert de masse

 t0, les molécules a et b d’une

même substance sont sur la
a b
même ligne

 ti, a va rester dans le pore du

grain de la phase stationnaire et b
dans la phase mobile

 tf, b ira plus vite que la

molécule a

52
2 heures
Les solutions pour minimiser des phénomènes de diffusion :

 Améliorer l’homogénéité de la phase:

 Absence d’hétérogénéités
 Absence de bulle
 Absence de vide

 Réduire le diamètre des particules dp

 Homogénéiser le débit de la phase mobile

 Diminuer la taille des grains et des pores

53
En résumé :

 Prendre des particules

 De petites tailles
 De faible porosité

 Réaliser des chromatographies

 Rapides
 Avec des phases stationnaires miniaturisées

 Travailler

 A faible température
 En réduisant les volumes morts

54
XI – 2 : la théorie des plateaux

 La théorie des plateaux est sans doute la meilleure théorie

permettant d’expliquer les phénomènes de séparation
chromatographique.

 Modélisation des équilibres Soluté/Phase stationnaire/Phase

mobile sous la forme de plateaux.

55
 Limitations :

 Absence de considération des phénomènes de

diffusion

 Impossibilité d’introduire tout l’échantillon dans

un volume infiniment petit

 Absence de considération cinétique (vitesse

d’échanges entre les deux phases)

56
57
Ces équilibres successifs sont à la base de la notion de
plateau théorique selon lequel la colonne de longueur L est
découpée en N petits disques fictifs de même hauteur H,
numérotés de 1 à n. Pour chacun d’eux, la concentration du
soluté dans la phase mobile est en équilibre avec la
concentration dans la phase stationnaire de ce soluté. À
chaque nouvel équilibre le soluté a progressé d’un petit
disque supplémentaire dans la colonne, appelé plateau
théorique

58
Simulation à l’aide d’un tableur de l’élution de deux composés A et B,
chromatographiés sur une colonne de 30 plateaux (KA= 0,6 ; KB=1,6 ;
MA=300 mg ; MB=300 mg) Composition du mélange en sortie de
colonne pour les 100 premiers équilibres.

59
Hauteur des plateaux théoriques

 Paramètre N : Nombre de plateaux théoriques

 Paramètre H : Hauteur des plateaux théoriques

 Paramètre L : longueur de La colonne

H = L/N

N.B
N : paramètre relatif, dépend du soluté et des conditions
opératoires

60
XII. EFFICACITÉ D’UNE COLONNE
XII.1 Efficacité théorique (nombre de plateaux théoriques)
À mesure que le soluté migre dans la colonne, il occupe une zone
allant s’élargissant. Cette dispersion linéaire sl, repérée par la variance
sl² croît avec la distance parcourue. Lorsque cette distance vaut L
(longueur de la colonne), on pose :

tR et s doivent
être mesurés H = L/N ou N=L/H
dans la même
unité (temps,
distances ou
volumes
écoulés, si le
débit est
constant)

61
XII.2. Efficacité réelle (nombre de plateaux théoriques
effectifs)
Afin de comparer les performances de colonnes de conceptions
différentes, vis-à-vis d’un même composé, (c’était notamment le cas en
CPG lorsqu’on voulait comparer les performances d’une colonne
capillaire et d’une colonne remplie) on remplace le temps total tR
qui figure dans les expressions de l’efficacité théorique par le temps de
rétention réduit tR’ qui ne tient pas compte du temps mort tM passé par le
composé dans la phase mobile. Les trois précédentes expressions
deviennent :

Nombre de plateaux N
- grandeur caractérisant le fonctionnement de la colonne
chromatographique
- Dépend des conditions de fonctionnement
- Détermination expérimentale

62
En chromatographie gazeuse, on utilisé une valeur corrigée appelée
hauteur de plateau effectif Heff faisant intervenir l’efficacité réelle à la
place de l’efficacité théorique.
Le calcul de Heff à partir de l’efficacité réelle utilise l’expression
Heff = L / Neff

Hauteur de plateau réduite. En chromatographie dont la phase mobile

est un liquide et pour les colonnes dont le remplissage est formé de
particules sphériques, on rencontre assez souvent la hauteur de
plateau réduite, h, qui tient compte du diamètre moyen dm des
particules.
h = H /dm h = L /N.dm

63
* Hauteur du plateau équivalent
– dépend de la taille des particules de phase stationnaire
– Dépend du remplissage de la colonne
– Dépend du débit (d) de phase mobile

64
XIII: OPTIMISATION D’UNE ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE

La chromatographie analytique est essentiellement utilisée en analyse

quantitative. Cette fin, il faut pouvoir déterminer les aires des pics des
espèces à doser, donc les séparer. Pour y parvenir on fait de plus en plus
souvent appel à des logiciels d’optimisation basés sur la connaissance du
processus chromatographique.

En chromatographie en phase gazeuse, les séparations peuvent être si

complexes qu’on ne peut déterminer par avance s’il est préférable de
optimisé le choix de :
* La colonne, de sa longueur, de son diamètre,
• La phase stationnaire,
• La composition de la phase mobile,
• Les paramètres de séparation (température et débit),

sont autant de facteurs qui interagissent les uns sur les autres

65
 La résolution et le temps d’élution sont les deux variables dépendantes les
plus importantes à considérer. Dans toute optimisation.

il ne faut toutefois pas oublier le temps nécessaire à la colonne

pour revenir aux conditions initiales avant d’effectuer l’analyse
suivante.

Si on ne s’intéresse qu’à certains des composés présents, on peut faire appel à

un détecteur sélectif qui ne verra, à la limite, qu’eux seuls. Dans d’autres cas, par
contre, on s’attache à séparer le plus grand nombre possible de composés du
mélange initial .

66
Suivant les types de chromatographie, l’optimisation est plus ou moins rapide.
En chromatographie en phase gazeuse elle est plus facile qu’en
chromatographie liquide où intervient la composition de la phase mobile.

Chromatogrammes d’une séparation. La phase mobile est

un mélange binaire eau / acétonitrile

67
Le chromatographiste est toujours prisonnier d’un triangle dont les
sommets correspondent à la résolution, à la vitesse et à la capacité,
trois paramètres qui s’opposent. Une chromatographie analytique
optimisée utilise à plein le potentiel du paramètre le plus efficace : la
sélectivité. Dans ce triangle elle se situe donc près du sommet
résolution.

68
XIV - ANALYSE QUANTITATIVE PAR CHROMATOGRAPHIE

Le développement considérable pris par la chromatographie en

analyse quantitative est dû essentiellement à sa fiabilité et à sa
précision. La relation entre la masse injectée de l’analyte dans la
colonne et l’aire du pic correspondant sur le chromatogramme
conduit à une méthode comparative, utilisée dans beaucoup de
protocoles normalisés de dosages.
Pour calculer la concentration massique d’un composé responsable
d’un pic sur le chromatogramme il faut réunir deux conditions

- Disposer d’un échantillon authentique du composé que l’on veut

doser, à usage de référence, pour déterminer la sensibilité du détecteur à
son égard,

- Logiciel ou autre pour connaître soit les hauteurs soit les aires des
différents pics d’élution d’intérêt.

69
Détecteur sensible au débit massique (F.I.D).
Le détecteur à ionisation de flamme donne une réponse
proportionnelle au débit massique.
dm
h= k
dt
masse de soluté de la tranche :
h
dm
dm
h=k
h dt t
l’integrale du pic

a b
70
En pratique b
+∞
A = ∫ hdt = ∫ hdt
-∞ a
b b
A = ∫ hdt = ∫ k(dm/dt)dt
a a

mT masse du composé injectée dans la colonne

A = k.mT k coefficient de réponse absolu du composé
A aire du pic d’élution du composé

L’aire du pic est directement proportionnelle à la masse de soluté

traversant le détecteur. Cette aire est indépendante du débit du gaz
vecteur.

La méthode manuelle de calcul de la surface d’un pic par

triangulation n’est plus employée. Il est utile cependant de savoir que
pour un pic gaussien, le produit de sa largeur à mi-hauteur par sa
hauteur, correspond à environ 94 % de la surface totale du pic.
71
Détecteur sensible à la concentration (T.C.D)
Le catharomètre donne une réponse proportionnelle à la
concentration.

1 dn
h = kc =
h dn moles dans Q dt
La tranche dt dn : nombre de moles de soluté
passant par le détecteur pendant dt
h
Q : débit volumique du gaz

1 dn
a dt b h = kc =
Q dt t
72
 a 1 dn nT
A = ∫ hdt = k ∫ hdt dt = k
b Q dt Q

nT
A=
Q
L’aire du pic est directement proportionnelle au nombre de
moles de soluté traversant le détecteur et inversement
proportionnelle au débit du gaz Vecteur.

Nécessité absolue de maintenir le débit constant

tout au long de l’analyse.

73
 MESURES DES AIRES DES PICS

On assimile la surface du pic

C gaussien à celle du triangle ABC
construit sur les tangentes aux
poins d’inflexion I et J.
hT AT = ½ l.hT
hm I 2π J

hm +∞
√c Apic = ∫ hdt avec
-∞
0 t

A B h = hM exp (-t2/2σ2)
I

Apic = hM σ.√2π = 2,507 hM.σ

74
 dh -hM
Première dérivée : = t exp (-t2/σ2)
dt σ2

d2h -hM
Deuxième dérivée : = t exp (-t2/σ2) [ 1 – t2/σ2]
d2t σ2

* I et J sont bien situés à t = -σ et t = +σ et h = hM / √c

* dérivée en J égale à hM / σ√c
* tangente en J : ligne passant par J (σ, hM / √c) de pente
- hM / √c = α
L’équation de cette tangente h = αt + hM / √c – α.σ intercepte l’axe
des t à l/2 = 2σ

l = 4σ intercepte l’axe des h à hT = 2hM / √c

75
 hM As √2πc
donc AT = 4 σ et = = 1,034
√c AT 4

Largeur à mi hauteur
Ab = bhM = 2 √2log2 . σhM

Apic = √2π.hM.σ
hM b Apic √2π
hM/2 D’où = = 1,064
Ab 2√2log2

Ab = 0.94 Apic
0 t
Pour un pic gaussien, le produit de sa largeur à mi-hauteur par
sa hauteur, correspond à environ 94 % de la surface totale du pic
76
Pour déterminer les aires des pics, on utilise les fonctions
spécialement prévues des logiciels de chromatographie, qui
assurent non seulement le pilotage du chromatographe, mais qui
analyser les données, quantifier et fournir le rapport d’analyse
correspondant à l’une des méthodes d’analyse quantitative
préprogrammées

Tous les logiciels permettent d’effectuer des corrections de ligne

de base, de prendre en compte les pics négatifs et de choisir une
méthode d’intégration pour les pics.

77
 XV. DETERMINATION DE LA COMPOSITION D’UN
MELANGE
On distingue trois méthodes principales :

* Normalisation interne : on compare les aires des pics d’élution au

cours d’une même injection.

* L’étalonnage externe ou "méthode des injections comparées ": on

compare sur deux chromatogrammes l’aire
du pic d’élution de la substance de référence à
celle du produit à doser.

* L’étalonnage interne : on compare les aires des pics de la substance

de référence et du produit à doser à la
surface du pic d’élution d’un produit témoin
appelé "étalon interne" ajouté lors du dosage
et de l’étalonnage.
78
MÉTHODE DE L’ÉTALONNAGE EXTERNE

Cette méthode permet de calculer la teneur (en termes de

concentration ou de pourcentage massique) d’un ou plusieurs

constituants apparaissant séparés sur le chromatogramme,

même en présence d’autres composés donnant des pics non

résolus. Facile de mise en œuvre, elle correspond à

l’application d’un principe commun à beaucoup de dosages.

79
Aéch Aréf

Chromatogramme de Chromatogramme
la solution échantillon d’étalonnage.

méch = Céch .V = K . Aéch mréf = Créf .V = K . Aréf

Aéch
Céch = Créf
Aréf

80
La précision des résultats dépend :
- Des pesées de la substance de référence et de l’échantillon ;
- Des dilutions;
- De la reproductibilité du volume d’injection ;
- Du maintient des conditions chromatographiques strictement
constantes pendant l’étalonnage et le dosage

81
 MÉTHODE DE L’ÉTALONNAGE INTERNE (ÉTALON INTERNE)

On rajoute au mélange une quantité connue d’un corps pur

(EI) : celui-ci doit :
♦ ne pas être présent dans le mélange de départ ;
♦ éluer en dehors de tout pic du mélange.

Cette deuxième méthode repose sur l’utilisation du coefficient de réponse relatif de

chaque composé à doser vis-à-vis d’un marqueur introduit comme référence.

Affranchir de l’imprécision concernant les volumes injectés, un handicap

de la précédente méthode.

La méthode nécessite, ici encore, deux chromatogrammes, l’un pour calculer les
coefficients de réponse relatifs et l’autre pour l’analyse de l’échantillon.

Les aires des pics des produits à quantifier sont donc comparées avec
celle d’un composé de référence, appelé étalon interne, introduit à une
concentration connue dans l’échantillon.

82
 Calcul des coefficients de réponse relatifs

Supposons que l’échantillon contienne deux composés à doser 1 et 2,

et que le composé E désigne un composé supplémentaire à usage
d’étalon interne

A’1 C’1
A1 C1
A’2 C’2
A2 C2 E E
1 A’E CE
AE CE
2 1
2
Solvant

Solvant

Chromatogramme Chromatogramme de la
d’étalonnage solution échantillon

83
Dans une première étape, on commence par préparer une solution
de concentration C1 en 1, C2 en 2 et CE en E. Appelons A1, A2 et AE
les aires des pics d’élution repérés sur le chromatogramme obtenu
à partir d’une prise d’essai de cette solution.
Si m1, m2 et mE sont les quantités réellement introduites dans la
colonne, on peut écrire les trois relations suivantes.

84
Ces rapports permettent de calculer les coefficients de réponse relatifs
de 1 et de 2 vis-à-vis de E choisi comme étalon, et désignés par K1/E et
K2/E :

Comme les masses mi réellement injectées sont proportionnelles aux

concentrations massiques correspondantes Ci, (mi = Ci ·V )., on en
déduit les deux expressions suivantes :

85
 Chromatographie de l’échantillon – Calcul des concentrations

La seconde étape de l’analyse consiste à chromatographier un volume

quelconque d’une solution faite avec l’échantillon à étudier et dans
laquelle a été ajoutée une quantité connue du composé E. Soient A’1,
A’2 et A’E, les aires du nouveau chromatogramme obtenu dans les
mêmes conditions opératoires. Si m’1, m’2 et m’E désignent les masses
de 1, 2 et E réellement introduites dans la colonne, on aura :

À partir des coefficients relatifs calculés dans la première expérience

ainsi que de la concentration de l’étalon interne dans l’échantillon, C’E,
connue, on accède à :

A’i
C’i= C’E . Ki/E
A’E
86
 La teneur du soluté i dans l’échantillon, exprimée en %

Cette méthode exige néanmoins un bon choix de l’étalon interne dont les
caractéristiques peuvent se résumer ainsi
➤ il doit être pur et ne pas se trouver initialement dans l’échantillon ;
➤ son pic d’élution doit être bien résolu par rapport à tous ceux qui
forment le chromatogramme de l’échantillon ;
➤ son temps de rétention doit être proche de celui (ou de ceux) du (ou des)
soluté(s) à doser ;
➤ sa concentration doit être proche ou supérieure à celle des autres
solutés pour être dans les conditions d’une réponse linéaire du détecteur ;
➤ il doit être inerte vis-à-vis des composés de l’échantillon.

87
MÉTHODE PAR NORMALISATION INTERNE

Cette méthode, également appelée « 100 % normalisée », est réservée

aux mélanges dont on a identifié tous les constituants par autant de
pics d’élution séparés sur le chromatogramme, afin de pouvoir faire le
bilan complet de l’échantillon concerné .

88
On prépare une solution d’étalonnage contenant les trois composés 1, 2, et
3 dont les concentrations massiques sont respectivement C1, C2, C3. Le
chromatogramme correspondant à l’injection d’un volume V , présente trois
pics d’aires A1, A2 et A3. Ces aires seront reliées aux masses injectées m1,
m2 et m3 par trois expressions.

Étant donné que mi = Ci ·V , on aboutit, pour K1/3 et K2/3, aux expressions

suivantes :

Ci Aj
Ki/j =
Cj Ai
la condition de normalisation étant que x1 + x2 + x3 = 100

89
 EXERCICE D'APPLICATION

Sur une colonne HPLC (phase stationnaire : C18), 15cm x

4,6mm, remplie de particules de 5mm, avec l’acétonitrile
(CH3CN) comme phase mobile et à une température de
30°C, on mesure un temps mort de 1,07 mn.

Dans ces conditions, on obtient la séparation ci-contre

entre les 2 amphétamines :
Amphétamine (A) : temps de rétention = 2,40 min, largeur
du pic à mi-hauteur d = 5 sec.
Methamphétamine (M) : temps de rétention = 2,85 min,
largeur du pic à mi-hauteur d = 6 sec.

1- Calculez le facteur de séparation a

2- Calculez le facteur de résolution R

3- Évaluez le nombre de plateau théorique de la colonne N

90
Solutions:
1- k'(A) = 1,243 et k'(M) = 1,664 d'où a = 1,338.

2- R = 1,118

3- N = 5390 plateaux théoriques d'après Purnell

91
 II-1 – COMMENT AMÉLIORER UNE SÉPARATION EN
CHROMATOGRAPHIE ?

Figure 1: Séparations entre 2 pics en chromatographie 92

Il y a deux possibilités pour améliorer la séparation
entre les 2 pics du chromatogramme (a) :
1- A largeur de pic constante, on peut augmenter la
différence de temps de rétention entre les 2 pics,
ceci est illustré dans chromatogramme (b)
2- A temps de rétention constant, on peut diminuer
la largeur des pics, le chromatogramme (c) illustre
ce phénomène.
En pratique, on peut jouer à la fois sur ces 2
paramètres pour améliorer une séparation.
En conclusion, deux paramètres s'avèrent donc
primordiaux en chromatographie, la rétention et la
forme du pic.

93