2.5.

La chromatographie d’affinité
Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est un support macromoléculaire
chimiquement inerte sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologique
pour un soluté de l’échantillon à analyser.
Trois types d’affinité sont utilisés :
 Affinité enzyme – substrat
 Affinité ligand – récepteur
 Affinité antigène – anticorps
 Très souvent la molécule fixée sera sur le substrat, le ligand ou l’anticorps. Ceci
permettra de purifier l’enzyme, le récepteur ou l’antigène, respectivement.

Etape de fixation
Le mélange de molécules contenant le composé à purifier est chargé sur la colonne d’affinité.
Seule la molécule présentant une affinité pour la colonne sera retenue par l’effecteur greffé
sur la phase stationnaire.
Etape de purification
En continuant à faire passer du tampon dans la colonne, toutes les molécules contaminantes
sont éliminées et éluées.

Etape d’élution
La molécule est finalement décrochée de la colonne et recueillie dans l’éluat.
Souvent l’un des deux partenaires de l’interaction au moins est une protéine (P), l’autre sera
qualifié de ligand (L) de cette protéine.

2.6. Chromatographie Liquide à Haute Performance

 C’est en fait une chromatographie sur colonne, mais à haute pression, ce qui permet
d’éviter toute perte de charge et de maintenir un débit constant. Hormis la
chromatographie de partage, tous les types de chromatographie vus dans ce chapitre
peuvent être adaptées à cette technique.
 Tous ces phénomènes sont directement liés à la surface de la phase stationnaire solide.

 Plus cette dernière est importante, plus il y a d’interactions avec le soluté et plus la
séparation sera bonne. Il est donc intéressant d’utiliser des particules de phase
stationnaire de la plus petite taille possible.
Organes
a) Un réservoir de solvant (éluant) qui contient la phase mobile en quantité suffisante.
Plusieurs flacons d'éluants (solvants de polarités et de concentrations différentes) sont
disponibles pour pouvoir réaliser des gradients à l'aide de la pompe doseuse.
b) La pompe : elle est munie d'un système de gradient permettant d'effectuer une
programmation de la nature du solvant. Elle permet de travailler :
- en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de
l'analyse.
- en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des
constituants du mélange d'éluants.
c) Vanne d'injection : C'est un injecteur à boucles d'échantillonnage. Il existe des
boucles de différents volumes 20, 50, 100, 500µL…... Le choix du volume de la
boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de la concentration supposée des
produits à analyser. Le système de la boucle d'injection permet d'avoir un volume
injecté constant, ce qui est important pour l'analyse quantitative.
d) La colonne : Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible
inerte aux produits chimiques, souvent en inox ou en verre, de diamètre compris entre
4 et 20 mm pour des longueurs généralement de 15 à 30 cm. Au-delà, les importantes
pertes de charges exigeraient des pressions de liquide beaucoup trop élevées.
La phase stationnaire
- La phase normale :
La phase normale est constituée de gel de silice. Ce produit est très polaire. Il faut donc
utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont
retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent en tête.
L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps du gel de
silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations.
- La phase inverse :
La phase inverse est majoritairement composée de silice greffé par des chaînes linéaires de 8
ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant
polaire.
Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier. Contrairement à une
phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la qualité
de la séparation est donc maintenue constante.
 Lors du passage du soluté, des interactions polaires s'effectuent entre celui-ci et la silice
tandis que l'éther de pétrole (apolaire) passe sans éluer la molécule du soluté.
La phase mobile
L'interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase stationnaire normale ou à
polarité inversée se répercute sur les temps de rétention des solutés.
La polarité de la phase stationnaire permet de distinguer deux situations de principe :
- si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la
chromatographie est dite en phase normale ;
- si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire (le
plus souvent des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la
chromatographie en phase inverse. En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit
sur les facteurs de rétention k des composés.

e) Détecteurs
 Spectroscopie dans l’UV et le Vis.
Mesure l’absorbance absolue d’un soluté une longueur d’onde variable entre 190 et 800 nm,
Les avantages du détecteur UV-Vis sont nombreux :
- Sensibilité : Détection de substances de concentrations trop faible.
 - Sélectivité : Il est possible de choisir une ou des longueurs d’ondes qui permettront de
voir apparaître le pic correspondant à certaines substances choisies.
- Peu sensible aux variations de débit et de température.
- Utilisation et entretien facile.
 Fluorimétrie
Mesure l’énergie de fluorescence d’un soluté excité par une radiation ultraviolette. Ce
procédé sert pour les composés fluorescents ou les dérivés fluorescents de certains
composés.
Avantages:
- Encore plus sensible que le détecteur UV-Vis.
- Très spécifique.
- Peu sensible aux variations de débit et de température.
Inconvénients :
- Les substances doivent être fluorescentes.
- Sensibilité à l’oxygène dissous dans la phase mobile.

2.7. Chromatographie en phase gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse (CPG) s'applique principalement aux composés

gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition.
Le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée d'une colonne, qui renferme une substance
active solide ou liquide (phase stationnaire), puis il est transporté à travers celle-ci à l'aide
d'un gaz porteur (ou gaz vecteur).
Les différentes molécules du mélange vont se séparer et sortir de la colonne les unes après
les autres après un certain temps qui est fonction de l'affinité de la phase stationnaire avec
ces molécules.
 Chromatographie gaz-liquide (partage) La phase stationnaire est un liquide non
volatil fixé par imbibition d’un support inerte. Le soluté se partage entre le gaz vecteur
et le liquide stationnaire.
 Chromatographie gaz-solide (adsorption) La phase stationnaire est un solide
adsorbant (gel de silice, alumine, etc.)
 Dans les deux cas, le gaz vecteur est le gaz qui véhicule les solutés ; la phase mobile
est constituée du gaz vecteur et des solutés gazeux.
 Schéma d’un appareil à chromatographie en phase gazeuse.
Échantillons
 Les limites de sensibilité sont, selon les appareils, de l’ordre du nanogramme et même
du picogramme.
 Le traitement de l’échantillon varie selon les substances analysées :
- Lorsque les solutés sont directement volatilisables, les substances sont solubilisées dans un
solvant et chromatographiées.
- Lorsque les solutés ne sont pas volatils à la température du chromatographe ou bien sont
décomposés à cette température, il faut les transformer en dérivés volatils stables : les acides
aminés sont ainsi estérifiées par le butanol, les acides gras estérifiés par le méthanol, …..

Injecteur
Il sert à l’introduction du mélange à analyser dans la colonne. Cette opération est faite :
- A l’aide d’une microseringue pour les liquides et les solutions.
- A l’aide d’une vanne à boucles pour les mélanges gazeux. La température idéale est
celle qui est 20° plus élevée que le point d’ébullition de la substance la moins volatile.

La température
On adopte généralement une température légèrement supérieure (20°C) au point de
vaporisation du constituant le moins volatil. D’un point de vue technique, la colonne est
maintenue dans un four à bain d’air thermostaté.
Les colonnes
Elles peuvent être métalliques, en plastique pour des séparations à basse température, en verre
et joints Téflon.
Il existe deux grands types de colonnes avec des variantes:
- Les colonnes remplies ou à garnissage (packed).
- Les colonnes capillaires (open tubular)

Détecteur et enregistreur
À la sortie de cette colonne, un détecteur très sensible est placé, par exemple :
- Un TCD : détecteur électrique, le passage des composants va faire varier la tension, cette
variation est due à la différence de conductibilité de chaque composant ;
- Un FID : détecteur à ionisation de flamme : une tension de l'ordre de la centaine de volts
est maintenue entre la buse de la flamme et une électrode entourant cette dernière. Lorsque
les molécules traversent la flamme, elles sont ionisées ce qui provoque entre les électrodes
un courant électrique qui est ensuite amplifié.
- Un ECD : détecteur à absorption électronique : des électrons sont émis, en général par une
source radioactive (rayonnement bêta), et traversent le gaz ; lorsqu'un électron rencontre une
molécule de gaz, il peut être capturé, ce qui fait varier l'intensité du courant d'électrons, cette
intensité étant mesurée en continu.
- Un MS : spectromètre de masse, utilisant principalement l'impact électronique ou
l'ionisation chimique.

2.8. Chromatographie supercritique

On peut considérer cette chromatographie comme intermédiaire entre la CPG et la LC. Dans
ce mode de chromatographie, la phase mobile est un fluide "supercritique". Cette
chromatographie peut s'effectuer aussi bien sur une colonne de HPLC en acier que sur une
colonne capillaire de GLC.

Lorsqu’un fluide est placé dans des conditions de température et de pression supérieures au
point critique, il entre dans un état dit supercritique. C’est un état qui n’existe pas dans la
nature.

Ces fluides ont des propriétés différentes: ils ont une viscosité proche de celle d’un gaz, une
densité proche de celle du liquide avec un pouvoir de diffusivité très élevé par rapport au
fluide liquide. Ce qui facilite leur pénétration dans des milieux poreux.

Exemple :
La technique du CO2 SUPERCRITIQUE permet de travailler à une température modérée (à
partir de 31°C), ce qui ne dénature pas les qualités organoleptiques et les principes actifs de
l'extrait obtenu, l’extrait reste dans un état proche du naturel. Elle permet d'autre part
d'obtenir des extraits exempts de tous résidus de solvant d'extraction. A la fin de l’extraction,
par abaissement de la pression (phase de détente), on provoque le passage du gaz carbonique
de l’état supercritique à l’état gazeux et le CO2 s’élimine tout seul de l’extrait sous pression
atmosphérique.

Quelques fluides supercritiques : Température et pression critique de quelques fluides

supercritiques.

Le CO2 supercritique est le solvant le plus utilisé, il présente de nombreuses propriétés qui
en font un solvant de choix :
- Pas de solvant résiduel à la fin du traitement (évacuation sous pression atmosphérique)
- Non toxique
- Chimiquement inerte, pas de problèmes d’oxydation du produit
- Inodore
- Non inflammable
- Basse température critique.

La SFC peut utiliser différents détecteurs, y compris le détecteur à ionisation de flamme, le

détecteur à photométrie de flamme, le détecteur à capture d'électrons et le spectromètre de
masse.

Application de la SFC
L'agro-alimentaire :
- Extraction/fractionnement de diverses matrices (animales ou végétales) : - extraits de
plantes, décaféination du café et du thé,…
- Extraction de fragrances et d'arômes
- Extraction de composants à partir de graines de citronnier - préparation de tabac sans
nicotine
- Extraction et /fractionnement de graisses animales (ex : oméga 3) et végétales,
préparation d’aliments pauvres en cholestérols.
- Extraction en continu de vitamines liposolubles.
- Préparation d’un produit anti-oxydant à partir de sésame.
La pharmacie : extraits de plantes médicinales, de stéroïdes, de pénicilline, élimination ou
remplacement de solvants.
La chimie : diverses réactions peuvent être menées en milieu supercritique : oxydations,
condensations, photochimie, polymérisation...
La biochimie : purification d'antibiotiques, d'acides organiques,..

L'utilisation de gaz spéciaux et d'équipements de grande qualité en réalisant des

chromatographies à fluide supercritique (CFS) permet d'obtenir des résultats plus précis.