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    Métodos Diagnóstico de Virología

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    Paulina Soto
    Este documento describe varios métodos moleculares como la PCR, RT-PCR, PCR anidada y hibridación. La PCR es una técnica que permite amplificar una secuencia de ADN específica y está compuesta de tres etapas: desnaturalización, hibridación de cebadores y elongación. La RT-PCR se usa para amplificar ARN a través de la síntesis de cDNA. La PCR anidada aumenta la especificidad usando dos rondas de PCR.

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    Este documento describe varios métodos moleculares como la PCR, RT-PCR, PCR anidada y hibridación. La PCR es una técnica que permite amplificar una secuencia de ADN específica y está compuesta de tres etapas: desnaturalización, hibridación de cebadores y elongación. La RT-PCR se usa para amplificar ARN a través de la síntesis de cDNA. La PCR anidada aumenta la especificidad usando dos rondas de PCR.

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    Métodos diagnóstico de virología

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    Este documento describe varios métodos moleculares como la PCR, RT-PCR, PCR anidada y hibridación. La PCR es una técnica que permite amplificar una secuencia de ADN específica y está compuesta de tres etapas: desnaturalización, hibridación de cebadores y elongación. La RT-PCR se usa para amplificar ARN a través de la síntesis de cDNA. La PCR anidada aumenta la especificidad usando dos rondas de PCR.

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    Este documento describe varios métodos moleculares como la PCR, RT-PCR, PCR anidada y hibridación. La PCR es una técnica que permite amplificar una secuencia de ADN específica y está compuesta de tres etapas: desnaturalización, hibridación de cebadores y elongación. La RT-PCR se usa para amplificar ARN a través de la síntesis de cDNA. La PCR anidada aumenta la especificidad usando dos rondas de PCR.

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    METODOS MOLECUALES

    CLONACION ACELULAR

    La PCR fue basada en los estudios de ADN o ARN, lo detecta

    Es la replicación de nuestro ADN a través del ciclo celular llevada por nuestro organismo

    La clonación es replicar una molécula, célula, afuera in vitro

    Detecta o analiza una molécula precursora de RNA, se copia

    Clon conjunto de elementos genéticamente idéntico entre sí,

    La PCR es una clonación acelular in vitro

    REACCIÓN DE LA CADENA POLIMERASA (PCR)

    Desarrollada en 1986 por Kary Banks Mullis

    Premio Nobel de Química De 1993

    Las mejoras hechas por Mullis permitieron convertir a la PCR en una técnica central  en bio
    química y biología molecular

     Objetivos de PCR

    Amplificación propiamente dicha para disponer de cantidad suficiente como para


    utilizarlos, con fines diversos

    Detección para poder detectarlo en muestras con pequeñas cantidades del DNA diana.

    Componentes de la PCR

     Enzimas
     Termociclador
     Componentes químicos

    Mezcla maestra de la PCR

    REACTIVOS:
     Muestra del paciente
     Buffer de PCR
     Nucleotidos 4 dNTP (citocina, adenine, guanina
     2 primers o cebadores: forward y reverse(3 a 5’)
     Tubo de polietileno especial
     Ion de magnesio
     Cloruro de sodio
     DNA Polimerasa termoestable

    Principio

    Tiene 3 etapas

    1) Desnaturalización, se hace in vitro mediante el calentamiento mediante el


    termociclador para la separación de dos hebras de ADN. Se consigue a una
    temperatura de 68 a 98 grados y se deja a una incubación breve
    2) Templado (hibridación), es especifica, s introduce los primers o cebadores,
    enfriamos rápidamente por debjeado de la temperatura de fusión, temperatura de
    hasta 67 grados y su tiempo de 10-20 min la hebra está abierta, se
    polidonucleoticos, se renaturaliza
    3) Elongación (replicación), amplificación a 72 – 756 grados de 1- 3 minutos, explica
    la parte de la secuencia amplificada es la polimerasa, hace que se copie y elongue

    Termociclador

    Maquina que calienta y enfria en un periodo corto de tiempo

    Pasos de la PCR

    Describa la curva de la PCR (grafico)

    1) Etapa previa: Se calienta la tapa del termociclador durante 9 minutos a 95 grados


    2) Desnaturalizacion a 60 seg a 95 grados
    3) Templado o hibridación a 55 grados por 50 seg
    4) Elongación a 180 seg a 72 grados
    5) Se apaga el aparato automáticamente

    Objetivo:
    Conseguir una enorme amplificación del número de moléculas que contienen la
    secuencia  diana o de interés.
    Características de la PCR

     Rendimiento: Productos de cada ciclo, acumulación de fragmentos (insertar


    formula)
     Duración: relacionada con las tres etapas, está dada por cada ciclo y numero de
    ciclos que debemos optimizar
     Especificidad: los da los primers o cebadores, especializa, da una banda única
     Capacidad de retención (sensibilidad): es alta, puede permitir detectar una sola
    molécula o fragmento de DNA o cualquier tipo de muestra clínica
     Fidelidad: La da la enzima polimerasa, copia lo que da el primer, capacidad de
    copiar secuencia sin cambio del material genético, depende de la enzima empleada

    La PCR tiene la capacidad de copiar el material genético sin mutaciones

    Detección de los resultados

    Se prepara un gel de agarosa para electroforesis

    Pesamos el gel de agarosa

    Lo colocamos en el matraz y lo llevamos al microondas a 65 grados, hasta que llegue a


    ebullición y que quede liquida transparente

    Lo sacamos y vertimos en la bandeja, dejamos reposar durante 30 minutos y este se va


    solidificar totalmente (gel duro)

    Le colocamos un marcador de peso molecular

    Se le coloca 10 microlitros de muestra y 2 microlitros de colorante para saber la corrida


    electroforética

    Lo colocamos en la bandeja con el gel polimerizado y se coloca el buffer corrido y se carga


    las muestras

    Se tapa y se conecta a la fuente de poder entre 70 – 100 v por 45 minutos a 1 hora.

    Resultados:

    Detección por tinción con un agente fluorescente y observación bajo luz ultravioleta
    ELECTROFORESIS EN GEL

    Técnica utilizada para separar fragmentos de ADN según su tamaño

    VARIANTES DE PCR

    NESTED PCR O PCR ANIDADA

    Diseñada para aumentar la especifidad, esta modificacion consta de dos grupos


    de cebadores dirigidos contra la misma Diana. Consta de 4 primers: dos internos
    y dos externos.
    El primero grupo de cebadores se desarrolla de manera usual, mientras que el
    Segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al
    primer grupo

    Especificidad

    Se hace dos rondas. La especificidad de la PCR anidada depende fundamentalmente de la


    temperatura empleada en la fase de hibridación y de la cantidad de iones divalente que
    se incorporan a la reacción (además de depender de la secuencia de cebadores o primers)

    RT – PCR

    -Se trata de una amplificación de RNA especialmente de mRNA a través de la síntesis


    previa de su cDNA, que después se amplifica por PCR

    -Es el método con mayor capacidad de detección de los disponibles para la medida de
    expresión génica in vitro

    -Puede utilizarse como métodos de detección molecular de genes para estudiar de


    genoma de virus de ARN como los retrovirus (por ejemplo el VIH) o el virus de la gripe
    (virus de la influenza)

    Principio:

    Se hace la retrotrascrpicion con el primer


    Le agregamos al tubo la transcriptasa diversa

    Obtenemos el hibrido de

    Se desnaturaliza y se hace los tres componentes de la etapa,

    PCR CON ADAPTADORES

    Puede amplificar una región de de DNA se secuencia desconocida

    PCR A LA INVERSA

    Se emplea para clonar regiones desconocidas de un DNA

    PCR EN TIEMPO REAL

    Permite observar la cinética de la reacción

    Mide la velocidad de amplificación de ADN

    Se cuantifica el número de ciclos que ha sido necesarios para alcanzar una cantidad
    prefijada de DNA productos

    La cuantificación depende de sondas de hibridación, estas sondas van marcadas por una
    sustancia fluorescente

     Sondas TaqMan

     Sondas molecular Beacons

     Sondas scorpion

    Detecta los productos de PCR en tiempo real, con equipos com

    El queencher la el

    METODOS DE HIBRIDACIÓN

     Hibridación en fase liquida


     Hibridación en soporte solido
     Hibridación in situ

    HIBRIDACION DE SOPORTE SOLIDO


    DOT BLOT Y SLOT-BLOT

    Gota a gota: Dot Blot

    Manchas alargadas: Slot blot

    Se aplica sobre un filtro de nylon o nitrocelulosa, cuyas propiedades de absorción fijan las
    moléculas de ARN y proteínas

    Pongo sondas para que hbride, se bloquea,

    Resultados de Dot Blot

    HIBRIDACION SOUTHERM

    Detecta dna

    Principio en una corrida en un gel de agarosa, se fragementa, amplificamos,

    HIBRIDACION NOTHERM

    Diferencias

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