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Practica de PCR. Biologia Molecular Aplicada
Practica de PCR. Biologia Molecular Aplicada
Practica de PCR. Biologia Molecular Aplicada
PRÁCTICA:
AUTOR:
ASIGNATURA:
NOMBRE DE LA PROFESORA:
GRUPO: 4 C
• Desnaturalización por calor (≥90 °C). Separa la doble hebra en dos sencillas
rompe enlaces de hidrógeno que unen las bases.
• Alineación (entre 40°C y 65°C). Unión de los primers u oligonucleótidos al DNA.
Permite la unión específica de los oligos a su hebra complementaria.
• Extensión (eleva la temperatura a 72°C). La enzima Taq DNA polimerasa se usa
para replicar las hebras de DNA.
1) PCRs para la amplificación de un solo sitio conocido del genoma (locus). Estos
PCRs requieren conocer la secuencia que se trabaja, en cuyo caso se utilizan
oligonucleótidos diseñados a partir de la secuencia de ese gen y se obtiene un solo
fragmento de un tamaño ya conocido
2) PCRs en los que no es necesario conocer la región que se está amplificando (se
amplifican regiones no conocidas, como zonas hipervariables del genoma), por lo
cual no se sabe el tamaño del fragmento (o fragmentos) que se esperan. Éstos se
utilizan para determinar polimorfismo genómico y son los más comunes para
fingerprint, ya que es sencillo obtener los datos (un gel de agarosa después del PCR
es suficiente), se observan varios loci simultáneamente y la información de las
zonas variables permite inferir los datos necesarios para análisis de genética de
poblaciones.
PRÁCTICA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y
ELECTROFORESIS
Objetivo:
Muestra:
1. Verificar que esté disponible sobre la mesa todo el material para preparar la
reacción de PCR.
2. 2. Preparar la siguiente reacción en un microtubo de 0.25 ml:
• 38.5μl Agua
• 5μl Buffer 10x
• 1μl DNTP´s 10 mM
• 2μl Oligo Mix (10uM c/u)
• 3μl DNA templado
• 0.5 μl Taq Polimerasa
3. Centrifuga para mezclar la reacción a 8,000 rpm durante 15 segundos.
4. 4. Coloca tu muestra en el termociclador con el siguiente programa de
amplificación:
• 2 min 95 ºC
• 40 ciclos de:
- 15 seg/95 ºC
- 15 seg/56 ºC
- 45 seg/72 ºC
• 5 min a 72ºC
• Mantener a 12ºC
5. Al finalizar la amplificación la reacción se guarda en el congelador.
Resultados de la electroforesis:
DIAGRAMA DE PROCESO DE LA PRACTICA
CUESTIONARIO
DNTPs: son nucleótidos que sirven para generar las nuevas cadenas de ADN.
Taq Polimerasa: la enzima Taq DNA polimerasa se usa para replicar las hebras de
DNA. La Taq polimerasa comienza el proceso de extensión en dirección 5’ a 3’
agregando los nucleótidos correspondientes, obteniéndose la hebra
complementaria de DNA.
g. ¿En qué pasos de la práctica consideras que debe tenerse más cuidado,
y por qué?
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: