PCR

Se necesita en grandes cantidades de secuencias específicas de ADN. Se consigue a través de una PCR.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica utilizada para replicar y amplificar secuencias de
ADN. El método utiliza secuencias cortas de ADN llamados cebadores para seleccionar la parte del genoma a
amplificar. La temperatura de la muestra se sube y se baja repetidamente para ayudar a la enzima de replicación
del ADN a duplicar la secuencia del ADN que está siendo copiada. Con esta técnica se pueden producir un billón
de copias de la secuencia en estudio.
PCR, o la reacción en cadena de la polimerasa, es una reacción química que los biólogos moleculares utilizan para
amplificar (crear copias) fragmentos de ADN. Esta reacción permite que unos pocos fragmentos de ADN se repliquen en
millones o miles de millones de copias. La amplificación del ADN nos permite estudiar la molécula del ADN en detalle en el
laboratorio.
Técnica de la biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis.
Con este procedimiento, resulta mucho más sencillo identificar, con una probabilidad muy alta, virus o bacterias causantes
de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado.
Conceptos de la PCR
Sensibilidad: cantidad mínima de ADN necesaria para que se produzca la amplificación, para obtener una banda. Se
relaciona con los falsos negativos, se da porque no se ha amplificado por no tener suficiente cantidad de ADN.
Especificidad: obtención de un solo producto amplificado. Si los oligos tienen más de un sitio al que se pueden unir
aparecerá más de un producto amplificado. Se relaciona con los falsos positivos, se da porque se ha amplificado una región
de ADN que no se buscaba amplificar.
Eficiencia: amplificación máxima que se puede obtener en un número determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete el ADN polimerasa durante la amplificación. Gran importancia en la
secuenciación. Una buena fidelidad permite evitar falsos positivos y negativos.
Aplicaciones: biología molecular, medicina forense,enfermería, pruebas para detectar virus o bacterias,
laboratorios y atención primaria sanitaria. Cualquier disciplina que necesite amplificar un fragmento concreto del
ADN
Procedimiento
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados
ciclos. Cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. Las temperaturas usadas y el tiempo
aplicado en cada ciclo dependen de una gran variedad de parámetros.
Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede
realizarse de diferentes modos,calentando la muestra entre 94−95 °C. La temperatura a la cual se decide realizar la
desnaturalización depende de la proporción que tenga la cadena, como del largo de la misma. Alineamiento o unión del
cebador.
El cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello, se necesita bajar la temperatura a 40−68
°C durante 20-40 segundos, permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN,
solo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido
de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la
molécula que va a ser amplificada.
Extensión o elongación de la cadena
La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los nucleótidos
complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los nucleótidos con el grupo 3'-hidroxilo del final de la
hebra de ADN creciente. La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. La temperatura de
máxima actividad está en 75−80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo depende tanto del ADN polimerasa usado como de la
longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar.
Elongación final
Se lleva a cabo a una temperatura de 70−74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que
cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.
Conservación
Este es un paso que se lleva a cabo a 4−15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo.La
PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15−100 μL, en pequeños tubos de 0,2−0,5 mL que se colocan
en el termociclador.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de electroforesis, que separan
los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga.

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Eficiencia: amplificación máxima que se puede obtener en un número determinado de ciclos.

Extensión o elongación de la cadena

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