Practica 5 Molecular

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
I. INTRODUCCIÓN
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue desarrollada por Kary Mullis en los
años ochenta.
Debemos esta técnica a Kary Mullis, quien, como él mismo relata en su autobiografía,
tuvo la genial idea cuando conducía de regreso a casa con un amigo en abril de 1983,
época en que buscaba una modificación del procedimiento de secuenciación de
Sanger-Coulson («didesoxi» o enzimático). Mullis dio a conocer la PCR en una reunión
científica en 1984, y en 1993 recibió el Premio Nobel de Química por este
descubrimiento.
Al igual que la técnica de secuencias del acido desoxirribonucleicos (DNA), la PCR ha

revolucionado la genética molecular, haciendo posible el estudio y análisis de una
amplia gama de genes que incluso pueden obtenerse a partir de un genoma complejo,
como es el de los mamíferos donde pueden existir alrededor de cien mil genes.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular
que permite la rápida replicación del ADN. Con la PCR, cantidades mínimas de
material genético pueden ser amplificadas millones de veces en pocas horas
permitiendo la detección rápida y fiable de los marcadores genéticos de enfermedades
infecciosas, cáncer y desórdenes genéticos.
Una vez realizada la PCR debemos confirmar la amplificación. El método más habitual
es la electroforesis en la que comprobamos si el tamaño del producto es adecuado.
Esto no es suficiente si queremos por primera vez establecer una PCR como prueba
clínica. Hay que confirmar la especificidad del producto mediante enzimas de
restricción (al menos 2), PCR “nested”, secuenciación o hibridación.
II. OBJETIVOS
 Comprender la importancia del protocolo de la PCR.

 Realizar la amplificación de un fragmento de ADN del virus TBC.
III. FUNDAMENTO TEÓRICO
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para

replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas
alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de
replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que
vuelvan a duplicarlas. Los reactivos para realizar esta técnica son: Los 4
desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN. Dos
cebadores o iniciadores (en inglés, primers), delimitan la zona de ADN a amplificar, es
decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se
desea replicar. Iones divalentes. Actúan como cofactores de la polimerasa Iones
monovalentes. Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de distintas
polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la Taq
polimerasa). ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
Termocilador, aparato que mantiene las temperaturas durante cada uno de los ciclos.
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado

termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la
temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores
modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los
tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen
una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que
se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un
sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los
tubos de reacción.
Con esta metodología se pueden producir en el laboratorio múltiples copias de un

fragmento de ADN específico, incluso en presencia de millones de otras moléculas de
ADN. Como su nombre indica, se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa
que es capaz de fabricar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente. Sus
únicos requerimientos son que existan nucleótidos en el medio que son la materia
base para fabricar el ADN (los nucleótidos de adenina, timina, citosina y guanina), y
una pequeña cadena de ADN que pueda unirse a la molécula que queremos copiar
para que sirva como cebadora (el cebador, en inglés "primer").
IV. MATERIALES
 Guantes esteriles
 Puntas esterilles
 Tubos de PCR estériles
 Gradillas para tubos de PCR.
 Termociclador
 Micro pipetas
 Cámara de bioseguridad
 Congeladores
 H2O destilada
 Buffer (tampón)
 dNTPs
 Cebadores (Primers, IS 3/4)
 MgCl2 (ion divalente)
 Taq polimerasa
 ADN molde (muestra de Mycobacterium tuberculosis).
→ METODO
Cada ciclo de PCR consta de tres fases:
1. Desnaturalización: En esta el ADN blanco de doble cadena se somete a una

temperatura de 90º a 95 ºC durante 30 segundos; permitiendo la separación de las dos
cadenas.
2. Hibridación: En esta la temperatura de la mezcla se disminuye hasta alcanzar la

temperatura adecuada para favorecer el apareamiento de los primers con la secuencia
blanco, lo cual generalmente ocurre entre 45 a 55 ºC (dependiendo de la temperatura
de Fusión o Tm de los primers) durante 20 a 30 segundos
3. Elongación o extensión: En este la temperatura de la mezcla se eleva hasta 72 °C

para que la Taq polimerasa (DNA polimerasa) comience el proceso de extensión en
dirección 5’ a 3’ agregando los nucleótidos correspondientes, obteniéndose la hebra
complementaria de DNA o AMPLICÓN.
Estas tres fases tienen lugar en el mismo tubo y constituyen un ciclo completo de
PCR, que se realiza en menos de dos minutos. Teóricamente, el ciclo de PCR se
puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores suelen
renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas,
bastan para producir más de mil millones de copias de ADN.
En cada ciclo de PCR se duplica todo el ADN presente en la reacción, de manera que
en unas pocas horas se obtienen millones de copias de un solo fragmento.
V. PROCEDIMIENTO
1. Rotular cada uno de los tubos de Eppendorf (4 de 0.6 ml para los ADN moldes
y 1 de 2 ml para mix) con sus respectivos códigos, según las muestras
obtenidas de ADN de Mycobacterium tuberculosis.
2. Preparar el mix:
2.1. Se toma una micropipeta con punta y se colocan 126 µL de H2O destilada
en el tubo de Eppendorf de 2 mL.
2.2. Luego colocar 50 µL de Buffer en el mismo tubo de Eppendorf, lo mismo
con los siguientes reactivos y sus respectivas cantidades:
MgCl2 18 µL
dNTP’s 20 µL
Cebador (IS 3/4) 10 µL
Taq polimerasa 1 µL
3. En los otros 4 tubos de Eppendorf rotulados colocar 3 µL de ADN molde

respectivamente.
4. A cada uno agregarle 45 µL del mix preparado.
5. Llevar los tubos de Eppendorf al termociclador por 1 hora de tiempo.

VI. RESULTADOS
 Después de 3 ciclos de PCR con una hebra de ADN, se obtuvieron:

 2 copias del gen de interés (target).
 6 copias de ADN de longitud variable.
 En aproximadamente 3 horas, después de 30 ciclos de PCR con una hebra de

ADN, se obtuvieron 1 073 741 764 copias del gen de interés.
VII. CONCLUSIONES
 La técnica PCR es de gran utilidad en una variedad de campos, incluidas la

biología molecular, la biotecnología, la genética, la epidemiología, las ciencias
forestales, las ciencias forenses, la microbiología, el diagnóstico de
enfermedades infecciosas, diagnóstico de virus, parásitos, bacterias de difícil
cultivo. Es significativo que se aplique en dichas técnicas ya que ofrece un
diagnóstico confiable y rápido.
 En cada ciclo de PCR se duplica todo el ADN presente en la reacción, de
manera que en unas pocas horas se obtienen millones de copias de un solo
fragmento.
VIII. CUESTIONARIO
1. ¿Qué sucede con el exceso o déficit de los reactantes, sobre todo MgCl2?
 MgCl2: Es benéfico optimizar la concentración del ión magnesio, ya que

afecta: el alineamiento de los primers, la temperatura de disociación de las
cadenas, tanto del templado como del producto de PCR, la especificidad
del producto, la formación de dímeros de primer y la actividad y fidelidad
de la enzima. La Taq polimerasa requiere magnesio libre en la unión con el
templado, los primers y los dNTP’s. Concentraciones elevadas de MgCl2
pueden dar lugar a la formación de productos inespecíficos de
amplificación y baja fidelidad de copia. Bajas concentraciones de MgCl2
reducen el rendimiento del producto deseado.
 ADN molde: La calidad así como la cantidad de ADN molde afecta a la
sensibilidad y la eficiencia de la reacción de amplificación. Generalmente el
empleo de altas concentraciones de ADN favorece el aumento de
productos inespecíficos de la reacción. La reacción de PCR puede ser
inhibida por varios componentes; por ejemplo, detergentes iónicos, fenol,
dyes, etc. Si el ADN molde contiene trazas de inhibidores, reduzca su
presencia diluyendo el ADN molde o utilizando menor cantidad de ADN
molde. Pudiera ser necesario re-purificar el ADN molde mediante
precipitación con etanol seguido de varios lavados.
 dNTP’s: La concentración de dNTP’s puede disminuirse (ej. cuando
existen amplificaciones inespecíficas) o aumentarse (cuando se amplifican
fragmentos de gran tamaño), incluso se pueden desequilibrar en favor de
algún dNTP en concreto (ej. experimentos in vitro de mutaciones). Si se
aumenta la concentración de dNTP’s en una reacción de amplificación, se
deberá aumentar a su vez la concentración de MgCl2, pues los dNTP’s se
comportan como potentes agentes quelantes del catión Mg2+.
2. Composición y usos del aceite mineral
Se utiliza esta denominación para aceites obtenidos por refinación del petróleo
y cuyo uso es el de lubricantes. Se usan ampliamente en la industria
metalmecánica y automotriz. Estos aceites se destacan por su viscosidad, su
capacidad de lubricación frente a la temperatura y su capacidad de disipar el
calor, como es el caso de los aceites.
También conocido como aceite de parafina, nujol o vaselina líquida, el aceite

mineral está compuesto de hidrocarburos y es similar en composición química
a la jalea de petróleo. Se puede utilizar en la casa para remover productos
cosméticos o para que la alacena en tu cocina luzca brillante y nueva. Se usa
como coadyuvante para formular otros plaguicidas.
En el protocolo de la PCR, para aquellos termocicladores que no tengan una

“heated lid” (tapa térmica), se añade aceite mineral para prevenir la
evaporación.
3. ¿En qué se fundamenta la PCR?
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas

para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas
temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas
entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de
ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente.
IX. BIBLIOGRAFÍA
 Ross, Michael H. y Pawlina, Wojciech. HISTOLOGÍA: TEXTO Y ATLAS

COLOR CON BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR. 5ta. Edición. Editorial
Médica Panamericana.
 http://www.biotools.eu/esp/pdf/Boletines%20de%20Producto/Enzimas/Enzimas
%20Tiempo%20Final/Hotsplit%20DNA%20Polimerasa%201U.esp.ed04.mar10.
pdf
 http://biologiamolecularinteractiva.files.wordpress.com/2013/01/prc3a1ctica-no-
6-pcr.pdf
 http://www.bioted.es/bioted%20protocolos/PCR%20gen%2018S%20rRNA.pdf

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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Al igual que la técnica de secuencias del acido desoxirribonucleicos (DNA), la PCR ha

 Comprender la importancia del protocolo de la PCR.

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para

Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado

Con esta metodología se pueden producir en el laboratorio múltiples copias de un

Cada ciclo de PCR consta de tres fases:

1. Desnaturalización: En esta el ADN blanco de doble cadena se somete a una

2. Hibridación: En esta la temperatura de la mezcla se disminuye hasta alcanzar la

3. Elongación o extensión: En este la temperatura de la mezcla se eleva hasta 72 °C

3. En los otros 4 tubos de Eppendorf rotulados colocar 3 µL de ADN molde

5. Llevar los tubos de Eppendorf al termociclador por 1 hora de tiempo.

 Después de 3 ciclos de PCR con una hebra de ADN, se obtuvieron:

 En aproximadamente 3 horas, después de 30 ciclos de PCR con una hebra de

 La técnica PCR es de gran utilidad en una variedad de campos, incluidas la

 MgCl2: Es benéfico optimizar la concentración del ión magnesio, ya que

2. Composición y usos del aceite mineral

También conocido como aceite de parafina, nujol o vaselina líquida, el aceite

En el protocolo de la PCR, para aquellos termocicladores que no tengan una

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas

 Ross, Michael H. y Pawlina, Wojciech. HISTOLOGÍA: TEXTO Y ATLAS

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