Quim. Nova, Vol. 33, No.

10, 2038-2041, 2010

CITOCALASINAS PRODUZIDAS POR Xylaria sp., UM FUNGO ENDOFÍTICO DE Piper aduncum (PIPERACEAE)#

Geraldo H. Silva, Camila M. de Oliveira, Helder L. Teles, Vanderlan da S. Bolzani e Angela R. Araujo*
Artigo

Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, CP 355, 14801-970 Araraquara – SP, Brasil
Ludwig H. Pfenning
Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, 37200-000 Lavras – MG, Brasil
Maria Claudia M. Young
Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Instituto de Botânica, CP 4005, 01061-970 São Paulo – SP, Brasil
Claudio M. Costa-Neto
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14049-900
Ribeirão Preto – SP, Brasil
Renato Haddad e Marcos N. Eberlin
Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas – SP, Brasil

Recebido em 30/4/10; aceito em 6/10/10; publicado na web em 8/11/10

CYTOCHALASINS PRODUCED BY Xylaria sp., AN ENDOPHYTIC FUNGUS FROM Piper aduncum. A chemical study on the
EtOAc extract produced by Xylaria sp., an endophytic fungus from Piper aduncum, resulted in the isolation of a new cytochalasin
1, along with five known 19,20-epoxycytochalasin D (2), C (3), N (4), Q (5), and R (6). The 1-6 were evaluated against the fungi C.
cladosporioides and C. sphaerospermum and only 5 showed weak activity. The cytotoxicity in vitro against HeLA and CHO cells
lines were investigated and the cytochalasins 2-4, and 6 showed a strong activity against HeLA. The DNAdamaging activity of 1-6
were also investigated against mutant strains of S. cerevisiae.

Keywords: Xylaria sp.; Piper aduncum; endophytic fungus.

INTRODUÇÃO O fungo Xylaria sp. foi cultivado no meio de cultura PDB, em

escala ampliada, para obtenção do extrato bruto que, após fracio-
Aproximadamente um quarto de todos os produtos naturais namento cromatográfico por CLAE, levou ao isolamento de uma
biologicamente ativos conhecidos têm sido produzidos por fun- citocalasina inédita (1) e das 19,20-epoxicitocalasina conhecidas D
gos.1 Estes são estimados em 1,5 milhões de espécies2 distribuídos (2), C (3), N (4), Q (5) e (6). A estrutura das substâncias isoladas foi
principalmente entre fungos micoparasitas, coprófilos, de solo, de determinada com base nas análises dos dados espectrométricos de
água doce, epifíticos e endofíticos. Fungos endofíticos são micro- IV, EM-ES, RMN de 1H e 13C (1D e 2 D).
organismos que habitam o interior de um vegetal,3 em pelo menos
por um período de seu ciclo de vida. Apesar de serem produtores RESULTADOS E DISCUSSÃO
de metabólitos secundários biologicamente ativos,4 são pouco
explorados. A fórmula molecular da citocalasina 1 foi estabelecida como
Dando continuidade aos estudos de prospecção química e bioló- C30H37NO7 por ESI-EMAR (m/z 524,2729 [M + H]+) e com auxílio
gica em fungos endofíticos isolados de espécies vegetais do cerrado, dos espectros de RMN de 13C e DEPT. O espectro no IV mostrou
a espécie vegetal Piper aduncum foi selecionada, pois a medicina as absorções de hidroxila (3440 cm-1) e uma absorção larga (1710
popular relata propriedades diurética, cicatrizante e anti-hemorrá- cm-1) atribuída a estiramentos C=O. A análise dos dados de RMN
gica.5-7 Dados fitoquímicos de P. aduncum relatam a ocorrência de de 1H, 13C e DEPT indicou a presença de quatro átomos de carbono
amidas, fenilpropanoides, di-hidrochalconas e derivados prenilados carbonílico (sendo dois de grupos cetona), um anel benzênico mo-
com atividades moluscida, bactericida e citotóxica.8,9 Estes fatos, nossubstituído, cinco metilas, onze átomos de carbono de grupos
associados às observações de que micro-organismos endofíticos metínicos (dois olefínicos e três carbinólicos), dois metilênicos e
podem mimetizar a química de seus respectivos hospedeiros e dois átomos de carbono quaternário, sendo um carbinólico. O índice
produzirem substâncias ou derivados com maior bioatividade,10 de deficiência de hidrogênio calculado foi igual a 13. Estes dados
direcionaram o estudo químico/biológico dos fungos endofíticos são característicos de substâncias da classe das citocalasinas. A
associados à P. aduncum. atribuição de todos os átomos de hidrogênio aos respectivos átomos
P. aduncum foi submetida ao isolamento e à purificação dos de carbonos foi realizada com auxílio dos mapas de contorno do
endófitos e conduziu a seis linhagens puras. Após triagem quími- experimento gHMQC.
ca/biológica, a linhagem PA-01 foi classificada como Xylaria sp. A análise dos espectros de gCOSY e TOCSY indicou os átomos de
e selecionada para estudo, mediante atividade seletiva do extrato hidrogênios acoplados em série e permitiu identificar os quatro sistemas
bruto AcOEt contra a linhagem mutante de Saccharomyces cerevi- de spins da molécula H-2’ a H-6’; H-10 a H-12; H-8 a H-22 e H-19 a
siae RS 321 e contra os fungos fitopatogênicos C. cladosporioides H-21. A estereoquímica da ligação dupla entre C-13 e C-14, assim como
e C. sphaerospermum. o epóxido em C-19 e C-20 foi definida como trans pelas constantes de
acoplamento (J = 15,5 e 2,0 Hz, respectivamente).11 A correlação gHM-
*e-mail: araujoar@iq.unesp.br BC de H-10a (dH 2,68) com C-1´ (dC 137,5) confirmou a presença do
#
Artigo em homenagem ao Prof. Hans Viertler grupo fenil em C-10. As correlações de H-12 (dH 1,01) e H-8 (dH 3,42)
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com C-7 (dC 212,6) e comparação com dados de citocalasa-13(E),19(E)- A avaliação da atividade citotóxica de 1-6 foi realizada em células
dieno-1,7,17-triona,12 possibilitaram a elucidação do núcleo isoindolona. de mamíferos das linhagens HeLa (tumor de cérvix humano) e CHO
As correlações de H-22 (dH 1,12) e H-23 (dH 1,44) com C-17 (δC 214,9) (ovário de hamster chinês).16 Para a linhagem não cancerígena CHO,
e entre H-21 (dH 5,43) e C-8 (dC 51,2) e comparação com 19,20-epoxi- as substâncias 2, 3, 5 e 6 apresentaram IC50 de 90,0; 120,0; 125,0 e
citocalasina C (3)13 permitiram elucidar o anel macrocíclico. 4,00 mmol L-1, respectivamente. As citocalasinas 1 e 4 não apresen-
As configurações relativas do núcleo isoindolona e do anel taram IC50 nas concentrações testadas, sendo que 1 foi totalmente
macrocíclico de 1 foram estabelecidas pelo experimento NOESY, inativa. A cisplatina foi usada como padrão com IC50 = 20 mmol L-1.
onde se observou correlação entre H-4 e H-21, valores dos desloca- Na linhagem cancerígena HeLa as substâncias 1-6 apresentaram
mentos químicos de RMN de 1H e 13C, constantes de acoplamento e IC50 de 43,0; 1,0; 2,0; 1,0; 3,0; e 3,0 mmol L-1, respectivamente. A
comparação com 18,21-di-hidroxi-16,18-dimetil-10-fenil-citocalasa- cisplatina foi usada como padrão com IC50 = 5,0 mmol L-1.
13(E),19(E)-dieno-1,7,17-triona12 e com 19,20-epoxicitocalasina A forte atividade apresentada pelas citocalasinas 2-5 contra a
C (3),13 respectivamente, Figura 1. Estas informações permitiram linhagem cancerígena HeLa e a fraca contra a linhagem não cance-
estabelecer a configuração relativa da inédita citocalasina 1. rígena CHO evidenciam uma seletividade destas substâncias para as
As substâncias 2-6 foram identificadas pela análise por EM, RMN linhagens tumorais HeLa.
de 1H e 13C, gHMQC, gHMBC, gCOSY e NOESY e por comparação Para o nosso conhecimento, este é o primeiro relato de citocalasinas
com dados descritos na literatura.13 sendo produzidas por fungos endofíticos associados à Piper aduncum.
As citocalasinas 1-6 (Figura 1) foram avaliadas quanto à atividade
antifúngica, frente aos fungos fitopatogênicos Cladosporium clados- PARTE EXPERIMENTAL
porioides e C. sphaerospermum, usando-se o método da autobiografia
direta.14 A substância 5 mostrou uma fraca atividade na concentração Instrumentação
de 100 mg mL-1, quando comparada com o padrão nistatina (1mg mL-
1
). As outras citocalasinas apresentaram-se inativas. Os espectros de absorção na região do IV foram obtidos em
As substâncias 1-6 foram ensaiadas frente à linhagem mutante um espectrômetro Perkin Elmer- FT-IR, utilizando-se pastilhas de
de Saccharomyces cerevisiae RS 321 mostrando-se inativas, o que KBr. Os espectros de massas foram registrados em espectrômetro
indica não serem as responsáveis pela bioatividade inicialmente de massas de baixa resolução da marca Fisons, modelo VG Pla-
observada no extrato bruto.15 tfform II, no modo de ionização electrospray (ESI). Os espectros

Figura 1. Estruturas das substâncias isoladas de Xylaria sp.

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de massas de alta resolução foram obtidos em espectrômetro QTOF Tabela 1. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz) de 1
(Micromass), utilizando-se como método de ionização electrospray
no modo positivo. Posição 1 1
Os espectros de RMN foram registrados em CDCl3 e DMSO-d6, C13
C
13
H 1 1
H
no espectrômetro Varian Inova 500, usando TMS como padrão de DMSO-d6 CDCl3 DMSO-d6 CDCl3
referência. 1 174 173,7
O aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) 2 8,28 NH 5,67 NH
foi um Varian Pro Star, com detectores UV-Vis. As colunas analíticas 3 53,2 52,5 3,55 m 3,48 m
e preparativas utilizadas foram Phenomenex tipo Luna - C18 (250 4 49,5 50,8 2,2 t (4,0) 2,39 t (4,0)
x 4,60 mm, 5 mm) e (250 x 21,20 mm, 10 mm), respectivamente. 5 34,3 35,5 1,88 m 2,01 m
Os meios de cultura líquido e sólido foram submetidos à esterili-
6 44,9* 45,5 1,78 dq (7,0; 12,0) 1,89 m
zação em autoclave a 121 °C e 1 atm de pressão por 20 min.
7 214,0 212,6
8 51,0 51,2 3,56 d (10,5) 3,42 d (9,5)
Material vegetal
9 53,1 54,2
Folhas saudáveis de Piper aduncum foram coletadas na Casa de 10 44,9* 45,5 2,67 dd (4,0; 13,5) 2,68 dd (8,5; 13,5)
Vegetação do Instituto de Química - UNESP- Araraquara em maio 2,84 dd (8,0; 13,5) 2,90 dd (4,5; 13,5)
de 2001. 11 15,1* 15,5 0,37 d (7,0) 0,85 d (6,5)
12 15,2* 15,6 0,87 d (7,0) 1,01 d (6,5)
Isolamento dos fungos endofíticos 13 126,0 127,3 5,64 dd (16,0; 10,5) 5,85 dd (10,0; 15,5)
14 132,4 132,2 5,43 ddd 5,38 ddd
As folhas coletadas foram lavadas com água e sabão, a seguir (10,0; 16,0; 5,5) (10,0; 15,5; 5,5)
esterilizadas por imersão em NaClO (1%) por 5 min, seguido de 15 37,6 37,9 2,00 m 2,09 (m)
etanol 70% por 1 min e lavadas com água esterilizada 2 vezes por 2,29 m 2,60 (m)
10 min.17-22 As folhas esterilizadas foram assepticamente seccionadas 16 41,3 41,8 3,30* 3,10 (m)
em segmentos de 1 cm2 aproximadamente e colocados em placa de 17 215,8 214,9
Petri, contendo o meio de cultura batata dextrose ágar (PDA), marca 18 76,9 76,3
Difco, preparado na concentração de 39 g/L, acrescido do antibiótico 19 60,2 59,6 3,23 d (2,0) 3,05 d (2,0)
sulfato de gentamicina e incubado a 25 oC. O crescimento dos fungos 20 54,2 53,6 3,3 * 3,51 dd (2,0; 1,5)
foi monitorado diariamente e, após cada cultura atingir de 1-2 cm 21 73,0 74,4 5,02 s 5,43 s
em diâmetro, foram submetidos a sucessivas repicagens até obtenção 22 19,45 19,0 1,05 d (7,0) 1,12 d (7,0)
das linhagens puras. Foram obtidas seis linhagens puras, codificadas
23 23,1 21,8 1,34 s 1,44 s
como PA-01, PA-02, PA-03, PA-04, PA-05 e PA-06 e depositadas
24 170,1 169,6
na micoteca do Departamento de Química Orgânica, IQ-UNESP. O
isolado PA-01 foi identificado como Xylaria sp. pelo Prof. Dr. L. H. 25 21,0 20,7 2,20 s 2,12 s
Pfenning e depositado na Coleção Micológica de Lavras, Universi- 1’ 137,05 137,5
dade Federal de Lavras sob registro CML 292. 2’ e 6’ 130,7 129,2 7,30 m 7,30 m
3’ e 5’ 129,0 129,0 7,30 m 7,30 m
Cultivo em meio líquido e obtenção dos extratos brutos 4’ 127,3 127,7 7,22 m 7,22 m
Multiplicidades e constante de acoplamento (J) em Hz, (d) ppm, * sinais
O fungo endofítico Xylaria sp. foi repicado para placas de Petri, encobertos pelo sinal da água do solvente
contendo PDA e incubado por 8 dias. A seguir foi inoculado em 20
frascos de Erlenmeyers (500 mL) contendo 200 mL de meio de cultivo mg, tR = 54 min), 4 (15,0 mg, tR = 26 min), 5 (15,5 mg, tR = 74 min),
PDB (DIFCO), preparado na concentração de 24 g/L, os quais foram e 6 (12,5 mg, tR = 43 min).
mantidos em mesa agitadora a 120 rpm e 25 °C por 28 dias. Após
este período o caldo foi separado do micélio por filtração, extraído Bioensaios
com AcOEt (3 X 2 L) e concentrado, fornecendo 1,7 g de extrato
bruto. O extrato AcOEt foi extraído com CHCl3 obtendo-se assim a Teste de bioautografia com fungos
fração CHCl3 (0,7 g). Para avaliação da atividade antifúngica do extrato bruto AcOEt e
das substâncias 1-6 frente aos fungos fitopatogênicos C. cladosporioi-
Isolamento das citocalasinas des e C. sphaerospermum, utilizou-se a metodologia descrita anterior-
mente na literatura.14 Os ensaios foram realizados nas concentrações de
A fração CHCl3 (0,7 g) foi fracionada em CC de sílica gel em 5, 10, 20, 50 e 100 µg mL-1, usando nistatina como controle positivo.
fase reversa C-18, usando H2O:MeOH em gradiente, fornecendo
cinco frações: PA-01-1 (28,0 mg, H2O:MeOH, 9:1), PA-01-2 (90 Teste para avaliação preliminar da atividade citotóxica
mg, H2O:MeOH, 7:3), PA-01-3 (320 mg, H2O:MeOH, 5:5), PA-01-4 Para a avaliação da atividade citotóxica do extrato bruto AcOEt e
(42 mg, H2O:MeOH 3:7) e PA-01-5 (8 mg, H2O:MeOH, 0:1). Estas das substâncias 1-6, foram utilizadas três linhagens mutantes de Sac-
foram analisadas por CLAE-DAD (Si C-18, gradiente H2O:CH3CN charomyces cerevisiae (rad+, 52Y e RS 321), segundo metodologia
5 a 100% de CH3CN, 40 min, fluxo de 1 mL/min), sendo detectada descrita na literatura.15 Os extratos foram testados na concentração
uma alta concentração de citocalasinas na fração PA-01-3. de 2 mg mL-1 e as substâncias puras com 0,5 mg mL-1, como padrões
A fração PA-01-3 foi submetida à CLAE-prep em fase reversa foram utilizados: camptotecina: rad+ 200 µg mL-1 (16,0 mm; 16,0
[l = 220 nm, 10 mL/min CH3CN:H2O (68:32)], resultando nas cito- mm) e 52Y (5 µg mL-1; 21,0 mm) e estreptonigrina: RS-321 (4 µg
calasinas 1 (5,5 mg, tR = 71 min), 2 (17,5 mg, tR = 32 min), 3 (30,0 mL-1 20,0 mm).
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Determinação da viabilidade celular 8. Baldoqui, D. C.; Tese de Doutorado, Universidade Estadual Paulista,
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Para a determinação da citotoxicidade das citocalasinas 1-6, 9. Parmar, V. S.; Jain, S. C.; Bisht, K. S.; Jain, R.; Tneja, P.; Jha, A.; Tyagi,
foram utilizadas as linhagens de células de mamíferos HeLa (tumor O. D.; Prasad, A. K.; Wengel, J.; Olsen, C. E.; Boll, P. M.; Phytochem-
de cérvix humano) e CHO (ovário de hamster chinês) na densidade istry 1997, 47, 597.
de 2 x 104 células poços”. As substâncias foram solubilizadas em 10. Strobel, G.; Daisy, B.; Castillo, U.; Harper, J.; J. Nat. Prod. 2004, 67,
dimetilsulfóxido em concentrações finais de 0,2; 2,0; 20,0 e 200,0 257.
mM. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT de 11. Crews, P.; Rodrigues, J.; Jaspars, M.; Organic Structure Analysis, Ox-
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19,20-Epoxicitocalasina (1) (5,5 mg), sólido branco amorfo, 12. Fujii, Y.; Tani, H.; Ichinoe, M.; Nakajima, H.; J. Nat. Prod. 2000, 63,
[a]25D -17,1 (c 0,19, CHCl3), IV (KBr, nmax cm-1): 3440, 2923, 2856, 132.
1710, 1220, 1033. ESI-EMAR: m/z 524,2729 [M+H]+ Calcd para 13. Espada, A.; Rivera-Sagredo, A.; de la Fuente, J. M.; Hueso-Rodriguez,
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À FAPESP, programa Biota-FAPESP (Instituto Virtual da Bio- G.; Johnson, R. K. J.; J. Nat. Prod. 1992, 55, 1648.
diversidade, www.biota.org) pelo auxílio financeiro, à CAPES e ao 16. Mosmann, T.; J. Immunol. Methods 1983, 65, 55.
CNPq pelas bolsas concedidas (G. H. Silva, H. L. Teles, V. da S. 17. Maier, W.; Hammer, U.; Dammann, U.; Schulz, B.; Strack, D.; Planta
Bolzani e M. C. M. Young) e à Profa. Dra. M. Furlan por gentilmente 1997, 202, 36.
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