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WO2018135653A1 - 抗ｅｐｈａ２抗体及びこれを用いたｅｐｈａ２の免疫学的検出 - Google Patents

抗ｅｐｈａ２抗体及びこれを用いたｅｐｈａ２の免疫学的検出 Download PDF

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WO2018135653A1
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epha2
monoclonal antibody
cancer
specifically binds
seq
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和則 加藤
我妻　利紀
長谷川　純
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学校法人東洋大学
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Definitions

  • Non-Patent Document 4 cancer traits such as anchorage-independent growth ability, tubular morphogenesis on the extracellular matrix, and tumor growth ability in vivo. It has been reported (Non-Patent Document 4) that cancer cells have enhanced invasiveness to the extracellular matrix (Non-Patent Documents 12 and 13).
  • Non-patent Document 15 it has been reported that EPHA2 signal is involved in angiogenesis induced by Ephrin-A1, especially that EPHA2 expressed in vascular endothelial cells is required for luminal formation and survival of vascular endothelial cells. It has also been reported that a fusion protein of the extracellular region of EPHA2 and the Fc region of human IgG suppresses angiogenesis in vivo and exhibits an antitumor effect (Non-patent document 17). .
  • EPHA2 may be an excellent therapeutic target for cancer, and there are actually clinical trials of drugs targeting EPHA2 (Patent Documents 1 to 3). .
  • the present invention is as follows. [1] (a) a heavy chain CDRH1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, (B) a heavy chain CDRH2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30, (C) heavy chain CDRH3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31, (D) a light chain CDRL1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, (E) a light chain CDRL2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33, and (f) a light chain CDRL3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to EPHA2, comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 and a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 22, or specific to EPHA2 A functional fragment of the monoclonal antibody that binds.
  • a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence having 95% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 and having a binding activity to human EPHA2, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18
  • a method for detecting cancer comprising a monoclonal antibody that specifically binds to EPHA2 of any one of [1] to [6], or a functional fragment of the monoclonal antibody that specifically binds to EPHA2.
  • a method for detecting cancer wherein the monoclonal antibody specifically binds to EPHA2 of any one of [1] to [3], or a functional fragment of the monoclonal antibody that specifically binds to EPHA2.
  • the present invention measures EPHA2 in a subject's biological sample (preferably in blood) by a sandwich immunoassay method using two specific types of anti-EPHA2 monoclonal antibodies.
  • a method for detecting whether or not a subject is afflicted with cancer using EPHA2 concentration as an index and a method for detecting whether or not a subject is afflicted with cancer using EPHA2 concentration in a biological sample (preferably blood) as an index. It is a reagent or kit for detecting whether or not it is present.
  • EPHA2 in a biological sample (preferably blood) of a subject is measured by a sandwich immunological measurement method using two specific anti-EPHA2 monoclonal antibodies, and the biological sample (preferably In the blood), it is also a method of obtaining auxiliary data for determining whether or not a subject is afflicted with cancer, using EPHA2 concentration as an index.
  • EPHA2 as an immunogen can be chemically synthesized based on sequence information, or can be obtained as a recombinant protein by a known method based on DNA sequence information encoding the protein.
  • Antibody screening can be performed by any method, but it is preferable to screen by cell-ELISA using animal cells transfected with DNA encoding EPHA2.
  • the nucleotide sequence of EPHA2 is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • whether the selected antibody specifically binds to EPHA2 can be confirmed by flow cytometry analysis or the like.
  • the monoclonal antibody used in the method of the present invention is either or both of antibody 230-1 and antibody 57-1.
  • Antibody 230-1 is a monoclonal antibody having the highest reactivity with EPHA2 among the 13 types of monoclonal antibodies prepared, and antibody 57-1 is combined with antibody 230-1 to produce EPHA2 by a sandwich immunoassay method. It is the most suitable antibody to measure.
  • the cDNA sequence encoding the heavy chain variable region of antibody 57-1 is shown in SEQ ID NO: 14 (FIG. 8), and the amino acid sequence of the heavy chain variable region of antibody 57-1 is shown in SEQ ID NO: 15 (FIG. 9).
  • the cDNA sequence encoding the light chain variable region of antibody 57-1 is shown in SEQ ID NO: 17 (FIG. 10), and the amino acid sequence of the light chain variable region of antibody 57-1 is shown in SEQ ID NO: 18 (FIG. 11).
  • the heavy chain variable region or the light chain variable region is not limited to the heavy chain variable region or the light chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 or 18, but one or several in the amino acid sequence. For example, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 or 2, more preferably 1 amino acid has been deleted, substituted or added, and consists of an antibody heavy chain variable region. Alternatively, it includes a heavy chain variable region or a light chain variable region comprising a protein having a light chain variable region activity, ie, a binding activity to human EPHA2.
  • the cDNA sequence encoding the heavy chain variable region of antibody 230-1 is shown in SEQ ID NO: 19 (FIG. 12), and the amino acid sequence of the heavy chain variable region of antibody 230-1 is shown in SEQ ID NO: 20 (FIG. 13).
  • the cDNA sequence encoding the light chain variable region of antibody 230-1 is shown in SEQ ID NO: 21 (FIG. 14), and the amino acid sequence of the light chain variable region of antibody 230-1 is shown in SEQ ID NO: 22 (FIG. 15).
  • the anti-EPHA2 antibody of the present invention comprises an anti-EPHA2 antibody that binds to human EPHA2 comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22. It is a human EPHA2 monoclonal antibody.
  • antibody 57-1 has CDRH1 consisting of the amino acid sequence (NYGMN) represented by SEQ ID NO: 23 as the CDR (complementarity determining region) of the heavy chain variable region, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 (WINTDGEPFIFVEEFKG).
  • CDRH2 comprising CDRH3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 (SMMGFAN), and further comprising CDRL1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 (RASQNISDYLH) as the CDR of the light chain variable region, SEQ ID NO: CDRL2 consisting of the amino acid sequence represented by 27 (YASQSIS) and CDRL3 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 (QNGTFTFPT) (FIG. 16).
  • the anti-EPHA2 antibody of the present invention is represented by the heavy chain variable region CDRH1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, the heavy chain variable region CDRH2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, and the SEQ ID NO: 25.
  • a heavy chain variable region CDRH3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, a light chain variable region CDRL1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, a light chain variable region CDRL2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 28
  • An antibody comprising a light chain variable region CDRL3 consisting of the amino acid sequence represented.
  • the antibody 230-1 has CDRH1 consisting of the amino acid sequence (DYYMY) represented by SEQ ID NO: 29 as the CDR (complementarity determining region) of the heavy chain variable region, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 (TISDDGSFTHYLDSVVG) CDRH2, comprising CDRH3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 (DGYRYDRPFAY), and further comprising CDRL1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 (KASQDVNTAVA) as the CDR of the light chain variable region, SEQ ID NO: CDRL2 consisting of the amino acid sequence (WASTRHT) represented by 33 and CDRL3 consisting of the amino acid sequence (QQHYSTPYT) represented by SEQ ID NO: 34 (FIG. 17).
  • CDRH1 consisting of the amino acid sequence (DYYMY) represented by SEQ ID NO: 29 as the CDR (complementarity determining region) of the heavy chain variable region
  • the antibody of the present invention includes a functional fragment of an antibody or a modified product thereof.
  • a functional fragment of an antibody is a fragment of an antibody that can specifically bind to an antigen.
  • Functional fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , disulfide bond Fv (dsFv), dimerization V region (diabody), single chain Fv (scFv), and the like.
  • an immunological measurement system is constructed using an anti-human EPHA2 monoclonal antibody.
  • the immunoassay include immunoblotting, enzyme immunoassay (EIA, ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescent antibody method, method utilizing agglutination, immunochromatography, and the like.
  • sandwich immunoassay system is constructed among the immunoassays using the anti-human EPHA2 monoclonal antibody.
  • Sandwich immunoassays include sandwich radioimmunoassay (RIA method), sandwich enzyme immunoassay (EIA method), sandwich fluorescence immunoassay (FIA method), sandwich luminescence immunoassay (CLIA method), sandwich Examples include all sandwich immunoassays such as luminescent enzyme immunoassay (CLEIA) and immunochromatography based on the sandwich method.
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • the ELISA will be described below, but other sandwich immunoassays are similar in that the antigen to be measured is sandwiched between two types of antibodies, and those skilled in the art will be able to use other sandwich immunoassays.
  • a measurement system can be constructed. An unlabeled anti-human EPHA2 monoclonal antibody is immobilized on a carrier such as a 96-well microtiter plate or polystyrene beads as a capture antibody (primary antibody).
  • an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP) or alkaline phosphatase (ALP), a fluorescent substance such as FITC, or an anti-human EPHA2 monoclonal antibody labeled with biotin or the like is used.
  • HRP horseradish peroxidase
  • ALP alkaline phosphatase
  • FITC fluorescent substance
  • an enzyme or the like can be labeled on the Fab ′ fragment obtained by digesting the antibody molecule with pepsin.
  • an antibody that specifically binds to the secondary antibody labeled with an enzyme a fluorescent substance or the like can be used as a tertiary antibody for detection.
  • the secondary antibody may be labeled with biotin, and the labeled avidin or streptavidin may be bound to biotin to cause color development.
  • the antigen-antibody reaction can be performed at 4 ° C. to 45 ° C., more preferably 20 ° C. to 40 ° C., still more preferably 25 ° C. to 38 ° C., and the reaction time is 10 minutes to 18 hours, more preferably 10 minutes. It is about 1 hour, more preferably about 30 minutes to 1 hour.
  • the EPHA2 concentration in the sample can be calculated from a standard curve prepared in advance when the degree of color development is prepared, or at the same time when a sample collected from a subject is measured.
  • one of antibody 57-1 and antibody 230-1 is immobilized on a carrier such as an ELISA microtiter plate and used as a solid-phased antibody, and the other is labeled and used as a detection antibody.
  • Antibody 57-1 may be used as the immobilized antibody
  • antibody 230-1 may be used as the detection antibody
  • antibody 57-1 may be used as the detection antibody
  • antibody 230-1 may be used as the immobilized antibody. May be.
  • the specificity of the method using these monoclonal antibodies is high, only EPHA2 is detected, and EPHA1, EPHA3, and EPHA4 do not show cross-reactivity.
  • the present invention includes a test kit or an immunological diagnostic composition for measuring EPHA2 containing at least two types of antibodies, antibody 57-1 and antibody 230-1.
  • One of the antibodies 57-1 and 230-1 may be immobilized on an ELISA microtiter plate, and the other may be labeled.
  • the test kit may contain a sample collection device, a sample processing solution, a reagent such as a chromogenic substrate, and may further contain a device necessary for the test.
  • the present invention includes a method for detecting cancer using the concentration of EPHA2 in blood as an index. This method is also a method for obtaining auxiliary data for detecting cancer using the EPHA2 concentration in blood as an index.
  • Example 2 Development of measuring method of EPHA2 2) -1 Selection of monoclonal antibody for ELISA 2) -1-1 Coating of anti-EPHA2 monoclonal antibody Anti-EPHA2 monoclonal antibody was selected to select anti-EPHA2 monoclonal antibody that can be used in sandwich ELISA for measuring EPHA2.
  • Streptavidin-HRP diluted 2000 times with the assay solution was added at 100 ⁇ l / well and allowed to react at room temperature for 45 minutes.
  • 2) -4-5 Substrate solution The biotin antibody solution was removed from the plate of 2) -4-4 after the completion of the reaction, and the washing operation was repeated 5 times with an ELISA washing solution. Thereafter, TMB solution was added at 100 ⁇ l / well and reacted at room temperature for 15 minutes to develop blue color.
  • 2) -4-6 Stopping the reaction After adding 2N sulfuric acid solution at 100 ⁇ l / well and changing the solution to yellow by stopping the reaction, the absorbance at 450 nm (reference wavelength 570 nm) was measured with a microplate reader.
  • Example 2 -5 Calibration curve According to the method of Example 2) -4, using 230-1 antibody as a sandwich ELISA coating antibody (supplementary antibody) and biotin-labeled 57-1 antibody as a detection antibody, 2000 pg / Serially diluted human EPHA2 standard protein from ml to 7.8 pg / ml was measured.
  • a calibration curve was prepared using a cubic polynomial model of Prism 4 (version 4.03, GraphPad Software, Inc.). As a result, the R 2 value was 0.9998, and the calibration curve showed a good fit in the range of 7.8 pg / ml to 2000 pg / ml (FIG. 5).
  • Example 2 -6 Detection Specificity Using the method of Example 2) -4, in addition to EPHA2 protein, EPHA1, EPHA3, EPHA4 protein (SINO BIOLOGICAL) were similarly used at 2000 pg / ml, 1000 pg / ml, 500 pg / ml. , Diluted to 250 pg / ml and measured by sandwich ELISA. As a result, this method detected only EPHA2, and did not show cross-reactivity with EPHA1, EPHA3, and EPHA4 (FIG. 6). This result indicates that this ELISA system has high specificity for EPHA2.
  • EPHA1, EPHA3, EPHA4 protein SINO BIOLOGICAL
  • the determined nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the heavy chain of 57-1 is shown in SEQ ID NO: 14 (FIG. 8), and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 15 (FIG. 9).
  • mKVR2 was designed from the sequence of the constant region of the mouse light chain in the database.
  • the amplified cDNA fragment was purified using MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) and then cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).

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Abstract

ＥＰＨＡ２に特異的な抗体の提供。　配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号２２で表される軽鎖可変領域を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片、並びに配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１８で表される軽鎖可変領域を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。

Description

抗ＥＰＨＡ２抗体及びこれを用いたＥＰＨＡ２の免疫学的検出
　本発明は、新規な抗体、該抗体の機能断片、該抗体の修飾体、該抗体の有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むヌクレオチド、該ヌクレオチドが挿入されたベクター、該ヌクレオチド又はベクターが導入された細胞、該細胞を培養する工程を含む該抗体の製造方法、医薬組成物、診断用又は検査用組成物等に関する。
　ＥＰＨＡ２は、分子量１３０ｋＤａの１回膜貫通構造を有するレセプター型チロシンキナーゼである（非特許文献１）。ＥＰＨＡ２のＮ末端側の細胞外領域には、リガンド結合ドメインと２ヶ所のフィブロネクチンタイプ３ドメインが存在し、Ｃ末端側の細胞内領域にはチロシンキナーゼドメインとｓｔｅｒｉｌｅ－α－ｍｏｔｉｆ（ＳＡＭ）ドメインが存在している。
　ＥＰＨＡ２のリガンドとして、ＧＰＩアンカー型蛋白質のＥｐｈｒｉｎ－Ａ１～Ａ５が知られている（非特許文献２）。リガンド結合によるＥＰＨＡ２のチロシンキナーゼドメインの活性化により、ＥＰＨＡ２の細胞内領域に存在するチロシン残基が自己リン酸化され、細胞内シグナルの伝達が誘導される。また、リガンドと結合した後にＥＰＨＡ２はエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、最終的にプロテアソームで分解されることが報告されている（非特許文献３）。
　ＥＰＨＡ２は臨床的に多くの癌、特に乳がん、食道がん、前立腺がん、胃がん、非小細胞肺がん、大腸がん、多形神経膠芽腫での高発現が報告されている（非特許文献４、５、６、７、８、９、１０、１１）。さらに、食道がんでは、ＥＰＨＡ２発現と局所リンパ節転移、リンパ節転移の数、及び癌の分化度の低さとの間に有意な相関が観察されており、ＥＰＨＡ２陽性の患者の生存率はＥＰＨＡ２陰性の患者に比べて低いことが報告されている（非特許文献５）。非小細胞肺がんでは、無病生存期間が5年より長い患者に比べ5年未満の患者ではＥＰＨＡ２の発現レベルが高いこと、再発した患者は再発のない患者に比べてＥＰＨＡ２の発現レベルが高いこと、脳転移へ進行した患者では、再発のない患者や転移が対側の肺に限局している患者に比べてＥＰＨＡ２の発現レベルが高いことが報告されている（非特許文献９）。大腸癌においてもＥＰＨＡ２の発現レベルが、肝転移、リンパ管浸潤及び臨床ステージと有意に相関することが報告されている（非特許文献１０）。
　また、ＥＰＨＡ２遺伝子を細胞に導入することによって、非がん細胞が足場非依存的増殖能や細胞外基質上での管状形態形成能、ｉｎ　ｖｉｖｏでの腫瘍増殖能といった癌形質を獲得するようになること（非特許文献４）、がん細胞の細胞外基質に対する浸潤性が亢進すること（非特許文献１２、１３）が報告されている。逆にＥＰＨＡ２の発現をｓｉＲＮＡで抑制するとがん細胞の浸潤性や足場非依存的増殖、ｉｎ　ｖｉｖｏでの腫瘍増殖が抑制されること（非特許文献１３、１４）及び、リガンドであるＥｐｈｒｉｎ－Ａ１とヒトＩｇＧのＦｃ領域との融合蛋白質を使用してＥＰＨＡ２を活性化し、エンドサイトーシスによるＥＰＨＡ２の分解を誘導することでがん細胞の浸潤性や足場非依存的増殖、管状形態形成能が抑制されること（非特許文献４、１１、１２）が報告されている。
　一方でＥＰＨＡ２は、がん細胞のみならず腫瘍内又は腫瘍周囲の血管にも発現していることが報告されている（非特許文献１５）。マウスにおいてはＥｐｈｒｉｎ－Ａ１によって誘導される血管新生にＥＰＨＡ２シグナルが関与していること、特に血管内皮細胞に発現するＥＰＨＡ２が血管内皮細胞の管腔形成や生存に必要とされることが報告されており（非特許文献１６）、ＥＰＨＡ２の細胞外領域とヒトＩｇＧのＦｃ領域との融合蛋白質がｉｎ　ｖｉｖｏで血管新生を抑制し、抗腫瘍効果を示すことも報告されている（非特許文献１７）。
　最近、膜１型マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ１－ＭＭＰ）がＥＰＨＡ２を細胞外領域で切断すること、その結果として膜に残っているＥＰＡＨ２の断片が癌原シグナルを促進することが報告されている（非特許文献１８、１９）。
　さらに、肺がん、前立腺がん患者では、健常人に比較し、可溶性ＥＰＨＡ２の血清中濃度が高いことが報告されている（非特許文献２０、２１）。
　以上より、ＥＰＨＡ２が、がんに対する優れた治療標的となる可能性が示唆されており、実際にＥＰＨＡ２を標的とした薬剤の臨床試験が実施されているものも存在する（特許文献１～３）。
　これらのことから、ＥＰＨＡ２の発現を検出できる方法の提供は、がんなどＥＰＨＡ２に関わる疾患、ＥＰＨＡ２発現の検査又は診断に有用である。被検者由来の試料中のＥＰＨＡ２を測定する方法としてイムノアッセイがあるが、その中でもＥＬＩＳＡ (Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ)法は簡便且つ迅速な測定方法として汎用されている。これまで、抗ＥＰＨＡ２抗体を用いて被検試料中に含まれるＥＰＨＡ２を測定する方法（ＥＬＩＳＡ法）は報告されていたが（特許文献４、５、非特許文献２０～２７）、抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体のみを用いる方法は確立されていなかった。
国際公開第ＷＯ２００３／０９４８５９号 国際公開第ＷＯ２００６／０８４２２６号 国際公開第ＷＯ２００９／０２８６３９号 国際公開第ＷＯ２００９／０８５８０５号 国際公開第ＷＯ２０１４／１２６１６０号
Ｍｏｃｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０年、第１０巻、ｐ．６３１６－６３２４ Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、第２１巻、ｐ．３０９－３４５ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２年、第１巻、ｐ．７９－８７ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１年、第６１巻、ｐ．２３０１－２３０６ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ、２００３年、第１０３巻、ｐ．６５７－６６３ Ｔｈｅ　Ｐｒｏｓｔａｔｅ、１９９９年、第４１巻、ｐ．２７５－２８０ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００３年、第１６３巻、ｐ．２２７１－２２７６ Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第９６巻、ｐ．４２－４７ Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、第９巻、ｐ．６１３－６１８ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、２００４年、第１１巻、ｐ．６０５－６１１ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年、第３巻、ｐ．５４１－５５１ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００４年、第３２０巻、ｐ．１０９６－１１０２ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００４年、第２３巻、ｐ．１４４８－１４５６ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２年、第６２巻、ｐ．２８４０－２８４７ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０００年、第１９巻、ｐ．６０４３－６０５２ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年、第１１７巻、ｐ．２０３７－２０４９ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００２年、第２１巻、ｐ．７０１１－７０２６ Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１３年、第２０１巻、ｐ.４６７－４８４ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１５年、第７５巻、ｐ.３３２７－３３３９ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ：　ＡＡＣＲ　１０６ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　２０１５；　Ａｐｒｉｌ　１８－２２，２０１５；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２０１５；７５（１５　Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ　ｎｒ　５４６． 第７４回日本癌学会学術総会　Ｐ１５－８　Ｐ－３３２１ RayBiotech、Human EphA2 ELISA(ELH-EPHA2-1)、<URL：http://www.raybiotech.com/epha2-elisa.html> CUSABIO、Human Ephrin type-A receptor 2(EPHA2) ELISA kit(CSB-EL007722HU)、<http://www.cusabio.com/ELISA-Kit/Human-Ephrin-type-A-receptor-2EPHA2-ELISA-kit-76651.html> LSBio、Human EPHA2 / EPH Receptor A2 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LS-F23977）、<https://www.lsbio.com/elisakits/human-epha2-eph-receptor-a2-elisa-kit-sandwich-elisa-ls-f23977/23977?trid=119> Abnova、EPHA2 (Human) Matched Antibody Pair（H00001969-AP21）、<http://www.abnova.com/products/products_detail.asp?catalog_id=H00001969-AP21> Abnova、EPHA2 (Human) Matched Antibody Pair（H00001969-AP11）、<http://www.abnova.com/products/products_detail.asp?catalog_id=H00001969-AP11> Abnova、EPHA2 (Human) Matched Antibody Pair（H00001969-AP51）、<http://www.abnova.com/products/products_detail.asp?catalog_id=H00001969-AP51>
　本発明の一つの課題は、ＥＰＨＡ２に特異的な抗体を提供することである。
　本発明の他の一つの課題は抗ＥＰＨＡ２抗体を含有する免疫学的診断用組成物、及びそれに用いる抗ＥＰＨＡ２抗体又はその組み合わせを提供することである。
　また、本発明の他の一つの課題は、抗ＥＰＨＡ２抗体又はその組み合わせを用いてＥＰＨＡ２を検出する方法、ならびに該抗体又はその組み合わせを含有する検出用又は診断用キットを提供することである。
　本発明者らは、ＥＰＨＡ２を簡便かつ高感度で測定し、がんの診断の精度向上に役立てるべく、ＥＰＨＡ２をサンドイッチ免疫学的測定法で測定するために、多数の抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体を作製し、サンドイッチ免疫学的測定法に特に適したモノクローナル抗体を選択し、重鎖可変領域、軽鎖可変領域のアミノ酸配列と塩基配列を決定し、さらに、６つのＣＤＲ配列を解析した。
　本発明者らが開発した２種類に抗体を用いることにより、生体試料中のＥＰＨＡ２を高感度で測定することができ、がんの検出も高感度かつ高特異性で達成することができることを確認し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]（a）配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（b）配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、
（c）配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、
（d）配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（e）配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、及び
（f）配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３
を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[２]　配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号２２で表される軽鎖可変領域を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[３]　配列番号２０で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[４]（a）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（b）配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、
（c）配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、
（d）配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（e）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、及び
（f）配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３
を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[５]　配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１８で表される軽鎖可変領域を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[６]　配列番号１５で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
[７]　[１]から[３]のいずれかに記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と[４]から[６]のいずれかに記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の２種類のモノクローナル抗体の組み合わせ。
[８]　生体試料中のＥＰＨＡ２の検出又は測定方法に使用される、[７]記載の組み合わせ。
[９]　生体試料中に含まれるＥＰＨＡ２を免疫学的測定法により特異的に検出する方法であって、[１]から[６]のいずれかのＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片を用いる方法。
[１０]　生体試料中に含まれるＥＰＨＡ２をサンドイッチ免疫学的測定法により特異的に検出する方法であって、[１]から[３]のいずれかのＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項[４]から[６]のいずれかのＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の２種類のモノクローナル抗体を用いる、方法。
[１１]　サンドイッチ免疫学的測定法がＥＬＩＳＡである[１０]の方法。
[１２]　がんを検出する方法であって、[１]から[６]のいずれかのＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片を用いて、被験体の血液中ＥＰＨＡ２濃度を免疫学的測定法で測定し、健常人の血液中のＥＰＨＡ２濃度よりも高い場合に、被験体ががんに罹患していると評価する方法。
[１３]　がんを検出する方法であって、[１]から[３]のいずれかのＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と[４]から[６]のいずれかのＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の２種類のモノクローナル抗体を用いて、被験体の血液中ＥＰＨＡ２濃度をサンドイッチ免疫学的測定法で測定し、健常人の血液中のＥＰＨＡ２濃度よりも高い場合に、被験体ががんに罹患していると評価する方法。
[１４]　サンドイッチ免疫学的測定法がＥＬＩＳＡである、[１３]の方法。
[１５]　がんが胃がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、大腸がん、すい臓がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、腎がん、脳腫瘍、悪性黒色腫及び頭頚部がんからなる群から選択される、[１２]～[１４]の方法。
[１６]　[１]から[３]のいずれかのＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と[４]から[６]のいずれかのＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の２種類のモノクローナル抗体又は機能的断片を含む、ＥＰＨＡ２を測定するためのキット。
[１７]　[１]から[３]のいずれかのＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と[４]から[６]のいずれかのＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の２種類のモノクローナル抗体又は機能的断片を含む、がんを検出するためのキット。
[１８]　がんが胃がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、大腸がん、すい臓がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、腎がん、脳腫瘍、悪性黒色腫及び頭頚部がんからなる群から選択される、[１７]のキット。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-009349号の開示内容を包含する。
　本発明者らが作製した多数の抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体の中で57-1抗体及び230-1抗体を固相化抗体と検出用抗体として組合せて用いた場合、他のモノクローナル抗体を用いたときよりも、高感度で生体試料中のＥＰＨＡ２を検出することができる。さらに、上記の２種類のモノクローナル抗体を組合せて用いたサンドイッチ免疫学的測定法により、ＥＰＨＡ２を測定し、がんを検出する場合、がんを高感度かつ高特異性で検出することができる。
　また、57-1抗体又は230-1抗体を用いた免疫学的測定法により、他のモノクローナル抗体を用いたときよりも、高感度で生体試料中のＥＰＨＡ２を検出することができる。さらに、上記のモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定法により、ＥＰＨＡ２を測定し、がんを検出する場合、がんを高感度かつ高特異性で検出することができる。
実施例２）－１に係る１３種類の抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体（SHM41、57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、230-1、240-4、245-21）によるＥＰＨＡ２への反応性を示した図である。 実施例２）－２に係るビオチン標識抗体として抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体２３０－１、補足用抗体として１１種類の抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、240-4、245-21を用いた場合の反応性を示した図である。 実施例２）－３に係る補足用抗体としてSHM41、５７－１又は２３０－１、検出用抗体としてビオチン標識５７－１又は２３０－１を用いた場合の反応性を示した図である。 実施例２）－４に係るＥＬＩＳＡ系（補足用抗体２３０－１及び検出用抗体ビオチン標識５７－１、補足用抗体５７－１及び検出用抗体ビオチン標識２３０－１）によるＥＰＨＡ２に対する反応性を示した図である。 実施例２）－５に係るＥＬＩＳＡ系（補足用抗体２３０－１及び検出用抗体ビオチン標識５７－１）の検量線を示した図である。 実施例２）－６に係るＥＬＩＳＡ系（補足用抗体２３０－１、検出用抗体ビオチン標識５７－１）のＥＰＨＡ２特異性を示す図である。 ＥＬＩＳＡ系（補足用抗体２３０－１、検出用抗体ビオチン標識５７－１）で健常人、胃癌及び卵巣癌患者の血清中のEPHA2の濃度を測定した図である。 ＥＬＩＳＡ系（補足用抗体２３０－１、検出用抗体ビオチン標識５７－１）で健常人及び非小細胞肺がん患者の血清中のEPHA2の濃度を測定した図である。 マウス抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体５７－１の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１４）を示した図である。 マウス抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体５７－１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１５）を示した図である。 マウス抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体５７－１の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１７）を示した図である。 マウス抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体５７－１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１８）を示した図である。 マウス抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体２３０－１の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１９）を示した図である。 マウス抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体２３０－１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２０）を示した図である。 マウス抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体２３０－１の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２１）を示した図である。 マウス抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体２３０－１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２２）を示した図である。 マウス抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体５７－１の有するＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号２３から２８）を示した図である。 マウス抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体２３０－１の有するＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号２９から３４）を示した図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、ＥＰＨＡ２に特異的に結合する特定のモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法で被験体の生体試料中のＥＰＨＡ２を測定する方法、及び測定するための試薬若しくはキットである。
　また、本発明は、ＥＰＨＡ２に特異的に結合する特定の２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ免疫学的測定方法で被験体の生体試料中のＥＰＨＡ２を測定する方法、及び測定するための試薬若しくはキットである。
　また、本発明は、サンドイッチ免疫学的測定方法でＥＰＨＡ２を測定するに適した抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体、及び２種類の抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体の組合せである。
　さらに、本発明は、特定の抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法で被験体の生体試料中（好ましくは、血液中）のＥＰＨＡ２を測定し、生体試料中（好ましくは、血液中）ＥＰＨＡ２濃度を指標に、被験体が癌に罹患しているか否かを検出する方法、及び生体試料中（好ましくは、血液中）ＥＰＨＡ２濃度を指標に、被験体が癌に罹患しているか否かを検出するための試薬若しくはキットである。本発明の方法は、特定の抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体を用い免疫学的測定方法で被験体の生体試料中（好ましくは、血液中）のＥＰＨＡ２を測定し、生体試料中（好ましくは、血液中）ＥＰＨＡ２濃度を指標に、被験体が癌に罹患しているか否かを判定するための補助的データを得る方法でもある。
　さらに、本発明は、特定の２種類の抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ免疫学的測定方法で被験体の生体試料中（好ましくは、血液中）のＥＰＨＡ２を測定し、生体試料中（好ましくは、血液中）ＥＰＨＡ２濃度を指標に、被験体が癌に罹患しているか否かを検出する方法、及び生体試料中（好ましくは、血液中）ＥＰＨＡ２濃度を指標に、被験体が癌に罹患しているか否かを検出するための試薬若しくはキットである。本発明の方法は、特定の２種類の抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ免疫学的測定方法で被験体の生体試料中（好ましくは、血液中）のＥＰＨＡ２を測定し、生体試料中（好ましくは、血液中）ＥＰＨＡ２濃度を指標に、被験体が癌に罹患しているか否かを判定するための補助的データを得る方法でもある。
　生体試料としては、血液（全血、血清又は血漿）、リンパ液、尿、組織ホモジネート、細胞培養上清、又は細胞可溶化液を用いる。好ましくは血液、より好ましくは血清を用いればよい。
　本発明で用いるモノクローナル抗体は、ウマ、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、マウス等の哺乳動物をＥＰＨＡ２又はその断片を免疫原として免疫し、脾臓細胞等とミエローマとを融合し、ハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマが産生分泌する抗体として得ることができる。ハイブリドーマは公知の方法で作製することができる。
　免疫原としてのＥＰＨＡ２は配列情報に基づいて化学合成することもでき、またタンパク質をコードするＤＮＡ配列情報に基づいて公知の方法でリコンビナントタンパク質として得ることもできる。
　抗体のスクリーニングは任意の方法で行うことができるが、好ましくは、ＥＰＨＡ２をコードするＤＮＡでトランスフェクトした動物細胞を用いたＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡによりスクリーニングすればよい。ＥＰＨＡ２の塩基配列を配列番号５に示し、アミノ酸配列を配列番号６に示す。さらに、選択した抗体が特異的にＥＰＨＡ２に結合するかは、フローサイトメトリー解析等により確認することができる。
　本発明の方法で用いるモノクローナル抗体は、抗体２３０－１及び抗体５７－１のいずれかあるいは両方である。抗体２３０－１は、作製した１３種類のモノクローナル抗体の中で最もＥＰＨＡ２との反応性が高いモノクローナル抗体であり、抗体５７－１は抗体２３０－１と組合せてサンドイッチ免疫学的測定方法でＥＰＨＡ２を測定するのに最も適した抗体である。
　抗体５７－１の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号１４（図８）に示し、抗体５７－１の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１５（図９）に示す。また、抗体５７－１の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号１７（図１０）に示し、抗体５７－１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１８（図１１）に示す。
　すなわち、本発明の抗ＥＰＨＡ２抗体は、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒトＥＰＨＡ２に結合する抗ヒトＥＰＨＡ２モノクローナル抗体である。
　また、上記の配列番号１４又は１７で表される配列からなる塩基配列とBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有している塩基配列からなるDNAであって、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。
　また、上記の配列番号１４又は１７で表される配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。
　また、上記の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域は、配列番号１５又は１８で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有するタンパク質からなる重鎖可変領域又は軽鎖可変領域も含む。
　このような配列番号１５又は１８で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号１５又は１８で表されるアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
　このような配列番号１５又は１８で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号１５又は１８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
　抗体２３０－１の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号１９（図１２）に示し、抗体２３０－１の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号２０（図１３）に示す。また、抗体２３０－１の軽鎖可変領域をコードするcDNA配列を配列番号２１（図１４）に示し、抗体２３０－１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号２２（図１５）に示す。
　すなわち、本発明の抗ＥＰＨＡ２抗体は、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒトＥＰＨＡ２に結合する抗ヒトＥＰＨＡ２モノクローナル抗体である。
　また、上記の配列番号１９又は２１で表される配列からなる塩基配列とＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％条の配列同一性を有している塩基配列からなるＤＮＡであって、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするDNAに含まれる。
　また、上記の配列番号１９又は２１で表される配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。
　また、上記の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域は、配列番号２０又は２２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有するタンパク質からなる重鎖可変領域も含む。
　このような配列番号２０又は２２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２０又は２２で表されるアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
　このような配列番号２０又は２２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号２０又は２２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
　さらに、抗体５７－１は、重鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）として、配列番号２３で表されるアミノ酸配列（ＮＹＧＭＮ）からなるＣＤＲＨ１、配列番号２４で表されるアミノ酸配列（ＷＩＮＴＤＴＧＥＰＩＦＶＥＥＦＫＧ）からなるＣＤＲＨ２、配列番号２５で表されるアミノ酸配列（ＳＭＧＧＦＡＮ）からなるＣＤＲＨ３を含み、さらに、軽鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号２６で表されるアミノ酸配列（ＲＡＳＱＮＩＳＤＹＬＨ）からなるＣＤＲＬ１、配列番号２７で表されるアミノ酸配列（ＹＡＳＱＳＩＳ）からなるＣＤＲＬ２、配列番号２８で表されるアミノ酸配列（ＱＮＧＨＴＦＰＴ）からなるＣＤＲＬ３を含む（図１６）。
　すなわち、本発明の抗ＥＰＨＡ２抗体は、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲＨ１、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲＨ２、配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲＨ３、配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲＬ１、配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲＬ２、及び配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲＬ３を含む抗体である。
　さらに、抗体２３０－１は、重鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）として、配列番号２９で表されるアミノ酸配列（ＤＹＹＭＹ）からなるＣＤＲＨ１、配列番号３０で表されるアミノ酸配列（ＴＩＳＤＤＧＳＦＴＨＹＬＤＳＶＫＧ）からなるＣＤＲＨ２、配列番号３１で表されるアミノ酸配列（ＤＧＹＲＹＤＲＰＦＡＹ）からなるＣＤＲＨ３を含み、さらに、軽鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号３２で表されるアミノ酸配列（ＫＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ）からなるＣＤＲＬ１、配列番号３３で表されるアミノ酸配列（ＷＡＳＴＲＨＴ）からなるＣＤＲＬ２、配列番号３４で表されるアミノ酸配列（ＱＱＨＹＳＴＰＹＴ）からなるＣＤＲＬ３を含む（図１７）。
　すなわち、本発明の抗ＥＰＨＡ２抗体は、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲＨ１、配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲＨ２、配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲＨ３、配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲＬ１、配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲＬ２、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲＬ３を含む抗体である。
　上記の各ＣＤＲは、それぞれに表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列からなるＣＤＲも含む。
　前記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体は、上記の重鎖可変領域及び重鎖定常領域並びに上記の軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、３個のドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成されている。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であってもよいが、好適には、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２定常領域、最も好適には、ＩｇＧ１定常領域である。軽鎖定常領域は、１個のドメインＣＬで構成されている。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域である。
　本発明の抗体は、抗体の機能的断片又はその修飾物も包含する。例えば、抗体の機能的断片は、抗体の断片であって抗原に特異的に結合し得る断片である。機能的断片としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、ジスルフィド結合Fv (dsFv) 、二量体化V領域（diabody）、一本鎖Fv（scFv）等が挙げられる。
　本発明の抗体は、抗体産生ハイブリドーマを用いて産生することもできるが、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、発現用の宿主細胞を該ベクターを用いて形質転換し、宿主細胞を培養することにより、リコンビナント抗体として細胞に産生させることができる。
　本発明の抗体は、上記の抗体が結合するエピトープに結合する抗体又は上記の抗体とＥＰＨＡ２への結合において競合する抗体も包含する。
　本発明では、抗ヒトＥＰＨＡ２モノクローナル抗体を用いて免疫学的測定系を構築する。免疫学的測定法として、イムノブロット法、酵素免疫測定法（EIA、ELISA）、放射線免疫測定法（RIA）、蛍光抗体法、凝集反応を利用した方法、イムノクロマトグラフィー法等が挙げられる。
　また、本発明では、抗ヒトＥＰＨＡ２モノクローナル抗体を用いて、免疫学的測定法の中でもサンドイッチ免疫学的測定系を構築する。サンドイッチ免疫学的測定法としては、サンドイッチ放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、サンドイッチ酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、サンドイッチ蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、サンドイッチ発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、サンドイッチ発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、サンドイッチ法に基づく免疫クロマトグラフ法などの全てのサンドイッチ免疫測定法が挙げられる。この中でも、ＥＩＡ法であるＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）が好ましい。以下ＥＬＩＳＡについて説明するが、他のサンドイッチ免疫学的測定法も測定しようとする抗原を２種類の抗体でサンドイッチするという点では同様の方法であり、当業者ならば他のサンドイッチ免疫学的測定法の測定系を構築することができる。捕捉用抗体（一次抗体）として未標識の抗ヒトＥＰＨＡ２モノクローナル抗体を、９６ウェルマイクロタイタープレートやポリスチレンビーズ等の担体に固相化する。また、検出用抗体（二次抗体）には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ)やアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ)等の酵素、ＦＩＴＣ等の蛍光物質、又はビオチン等で標識した抗ヒトＥＰＨＡ２モノクローナル抗体を用いる。この場合、抗体分子をペプシンで消化して得られたＦａｂ’フラグメントに酵素などを標識することもできる。あるいは未標識の二次抗体を反応させた後、該二次抗体に特異的に結合する抗体を酵素や蛍光物質等で標識したものを検出用の三次抗体として用いて反応させることもできる。また、このときに二次抗体をビオチンで標識し、標識したアビジン又はストレプトアビジンをビオチンに結合させて発色させてもよい。抗原抗体反応は４℃～４５℃、より好ましくは２０℃～４０℃、さらに好ましくは２５℃～３８℃で行うことができ、また、反応時間は、１０分～１８時間、より好ましくは１０分～１時間、さらに好ましくは３０分～１時間程度である。発色の程度を予め作成しておいたか、あるいは被験体から採取した試料を測定するときに同時に作成した、標準曲線から試料中のＥＰＨＡ２濃度を算出することができる。サンドイッチ免疫学的測定法において、抗体５７－１と抗体２３０－１の一方をＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート等の担体に固相化し固相化抗体として用い、他方を標識して検出用抗体として用いる。抗体５７－１を固相化抗体として用い、抗体２３０－１を検出用抗体として用いてもよく、また、抗体５７－１を検出用抗体として用い、抗体２３０－１を固相化抗体として用いてもよい。これらのモノクローナル抗体を用いた方法の特異性は高く、ＥＰＨＡ２のみを検出し、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４には交差反応性を示さない。
　本発明は、少なくとも抗体５７－１と抗体２３０－１の２種類の抗体を含むＥＰＨＡ２を測定するための検査用キット、あるいは免疫学的診断用組成物を含む。抗体５７－１と抗体２３０－１の一方の抗体は、ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートに固相化され、他方は標識されていてもよい。前記検査用キットは、検体採取器具、検体処理液、発色基質等の試薬を含んでいてもよく、さらに、試験に必要な器具等を含んでいてもよい。
　被験体の血液中のＥＰＨＡ２を測定することにより、被験体ががんに罹患しているか否かを判定することができる。すなわち、被験体の血液中のＥＰＨＡ２濃度が健常人の血液中ＥＰＨＡ２濃度より高い場合に被験体はがんに罹患していると判断することができる。また、あらかじめ健常人の生体試料中のＥＰＨＡ２濃度を測定しておき、該測定値に基づいてＥＰＨＡ２の濃度測定値についてカットオフ値(閾値）を定めておいてもよい。該カットオフ値を基準としカットオフ値を超えた場合に、がんに罹患していると判断することができる。
　がんは好ましくは胃がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、大腸がん、すい臓がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、腎がん、脳腫瘍、悪性黒色腫、頭頚部がん等である。
　本発明は、血液中のＥＰＨＡ２濃度を指標にがんを検出する方法を包含する。該方法は、血液中のＥＰＨＡ２濃度を指標にがんを検出するための補助的データを得る方法でもある。
　本発明は、少なくとも抗体５７－１又は抗体２３０－１を含むＥＰＨＡ２を測定しがんを検出するための検査用キット、あるいは免疫学的診断用組成物を含む。前記検査用キットは、検体採取器具、検体処理液、発色基質等の試薬を含んでいてもよく、さらに、試験に必要な器具等を含んでいてもよい。
　さらに、本発明は、少なくとも抗体５７－１と抗体２３０－１の２種類の抗体を含むＥＰＨＡ２を測定しがんを検出するための検査用キット、あるいは免疫学的診断用組成物を含む。前記検査用キットは、検体採取器具、検体処理液、発色基質等の試薬を含んでいてもよく、さらに、試験に必要な器具等を含んでいてもよい。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
［実施例１]
　抗ヒトＥＰＨＡ２モノクローナル抗体の作製
　１）－１　ヒトＥＰＨＡ２をコードするプラスミドの作製
　１）－１－１　全長ヒトＥＰＨＡ２をコードするプラスミドの作製
　鋳型としてＳＫ－ＯＶ－３細胞のｔｏｔａｌ　ＲＮＡより合成したｃＤＮＡとプライマーセット：
プライマー１：５’－ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃｇｇｇｇａｔｃｇｇａｃｃｇａｇａｇｃｇａｇａａｇ－３’（配列表の配列番号１）及び、
プライマー２：５’－ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｃｃｔａｇａｔｇｇｇｇａｔｃｃｃｃａｃａｇｔｇｔｔｃａｃｃｔｇｇｔｃｃｔｔ－３’（配列表の配列番号２）
を用いたＰＣＲ反応でヒトＥＰＨＡ２をコードするｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ断片をＢＰ　Ｃｌｏｎａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にクローニングした。クローニングされたＥＰＨＡ２遺伝子からＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とプライマーセット：
プライマー３：５’－ｃｔｇｔｇｇｇｇａｔｃｃｃｃａｔｃｇａｃｃｃａｇｃｔｔｔｃ－３’（配列表の配列番号３）及び、
プライマー４：５’－ｇａｔｇｇｇｇａｔｃｃｃｃａｃａｇｔｇｔｔｃａｃｃｔｇｇｔｃ－３’（配列表の配列番号４）
を用いてストップコドンを除去した。このＥＰＨＡ２遺伝子断片をＬＲ　Ｃｌｏｎａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｐｃＤＮＡ－ＤＥＳＴ４０　Ｇａｔｅｗａｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）へ移し替えた。以下、このプラスミドをｐｃＤＮＡ－ＤＥＳＴ４０－ＥＰＨＡ２と記す（本プラスミドはａｔｔＢ１とａｔｔＢ２配列の間に配列表の配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する。）。また本プラスミドにクローニングされたＥＰＨＡ２遺伝子のコーディング配列は配列表の配列番号５のヌクレオチド番号３３から２９６０に示されている。またＥＰＨＡ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号６に示されている。
　１）－１－２　ＥＰＨＡ２細胞外領域をコードするプラスミドの作製
　ヒトＥＰＨＡ２細胞外領域（配列表の配列番号６のアミノ酸番号１乃至５３４に示されるアミノ酸配列からなる。以下「ＥＰＨＡ２（ＥＣＲ）」と記す）をコードする遺伝子をプライマーセット：
プライマー５：５’－ａａａａａｇｃｔｔａｔｇｇａｇｃｔｃｃａｇｇｃａｇｃｃｃｇｃ－３’（配列表の配列番号７）及び、
プライマー６：５’－ａａａｇｇｇｃｃｃｔｃａｇｔｔｇｃｃａｇａｔｃｃｃｔｃｃｇｇ－３’（配列表の配列番号８）
を用いてＰＣＲ反応で増幅した。そのＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩで切断し、ｐｃＤＮＡ３．１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩサイトにクローニングした（以下「ｐｃＤＮＡ３．１－ＥＰＨＡ２（ＥＣＲ）」と記す。また、以下、ｐｃＤＮＡ３．１－ＥＰＨＡ２（ＥＣＲ）によって発現する組換え蛋白質を「ＥＰＨＡ２（ＥＣＲ）」と記す。）。
　１）－２　ヒトＥＲＢＢ２をコードするプラスミドの作製
　Ｈｕｍａｎ　ｃｌｏｎｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社　＃Ｃ３３８３０、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を鋳型にプライマーセット：
プライマー７：５’－ｃａｃｃａｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｇｇｃｃｔｔｇ－３’（配列表の配列番号９）及び、
プライマー８：５’－ｔｃｃｃａｃｔｇｇｃａｃｇｔｃｃａｇａｃｃ－３’（配列表の配列番号１０）
を用いＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ断片をｐＥＮＴＲ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＴＯＰＯ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にクローニングした。アミノ酸置換を伴う変異を修復するため、このプラスミドをＥｃｏＲＩ処理して得られた断片の内、ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ由来配列を含む断片とＨｕｍａｎ　ｃｌｏｎｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社　＃Ｃ１４６４０、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をＥｃｏＲＩ処理して得られた断片の内、２番目に大きな断片（約１．６ｋｂｐ）とをライゲーションした。このプラスミドの中のＥＲＢＢ２遺伝子断片をＬＲ　Ｃｌｏｎａｓｅを用いてｐｃＤＮＡ－ＤＥＳＴ４０　Ｇａｔｅｗａｙ　ｖｅｃｔｏｒへ移し変えた。以下、このプラスミドをｐｃＤＮＡ－ＤＥＳＴ４０－ＥＲＢＢ２と記す（ａｔｔＢ１とａｔｔＢ２配列の間に配列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を有する。）。
　１）－３　抗原蛋白質の調製
　ＥＰＨＡ２（ＥＣＲ）を発現させるため、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にｐｃＤＮＡ３．１－ＥＰＨＡ２（ＥＣＲ）を２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてトランスフェクションし、３７℃、８％　ＣＯ２で５日間培養した。培養上清を遠心分離により回収し、分子量分画１５０００の透析チューブを用いて２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５の中で透析した。フィルター（０．４５μｍ，ＰＥＳ）を通した後、培養上清を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ　１６／１０　Ｑ　ＸＬ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にロードした。結合蛋白質はＮａＣｌの直線濃度勾配（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５、０－１Ｍ　ＮａＣｌ）で溶出された。次にＥＰＨＡ２（ＥＣＲ）を含む画分を集め、ＰＢＳで平衡化されたＨｉＬｏａｄ　２６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にロードした。蛋白質はＰＢＳで溶出した。ＥＰＨＡ２（ＥＣＲ）を含む画分を集め、免疫用抗原に使用した。蛋白質濃度はＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。
　１）－４　免疫
　ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊマウス（日本チャールス・リバー社）に初回免疫としてＡｄｊｕｖａｎｔ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ　Ｈ３７　Ｒｖ（和光純薬社）又はＴｉｔｅｒＭａｘ　Ｇｏｌｄ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＳＩＧＭＡ社）と混合した５０μｇのＥＰＨＡ２（ＥＣＲ）をマウス背部皮下に投与した。２回目、３回目の免疫としてＡｄｊｕｖａｎｔ　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ（和光純薬社）と混合した５０μｇのＥＰＨＡ２（ＥＣＲ）をマウスの背部皮下に投与した。これらマウスを５０μｇのＥＰＨＡ２（ＥＣＲ）でブーストし、３日後に脾臓を採取した。この脾臓をハイブリドーマ作製に用いた。
　１）－５　ハイブリドーマ作製
　脾臓細胞とマウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１細胞とをＰＥＧ４０００（ＩＢＬ社）を用いて細胞融合しハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの培養上清用いて抗ＥＰＨＡ２抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
　１）－６　抗体スクリーニング
　１）－６－１　抗原発現細胞の調製
　２９３Ｔ細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２でｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅ　Ｉコートフラスコ（ＩＷＡＫＩ社）に播種し、１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で３７℃、５％　ＣＯ２の加湿雰囲気下で１晩培養した。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｐｃＤＮＡ－ＤＥＳＴ４０－ＥＰＨＡ２とｐｃＤＮＡ－ＤＥＳＴ４０－ＥＲＢＢ２（ネガティブコントロール）のそれぞれで２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、３７℃、５％　ＣＯ２の加湿雰囲気下でさらに１晩培養した。翌日、トランスフェクションされた細胞をトリプシン処理し、１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。この細胞をＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー解析に使用した。
　１）－６－２　Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ
　１）－６－１で調製した細胞をハイブリドーマ培養上清と混合し、４℃で１時間インキュベーションした。細胞を５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）社　＃ＡＰ１８１Ｐ）で４℃、１時間染色した。細胞を５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５　Ｍ　クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ　リン酸水素２ナトリウム・１２水　ｐＨ４．５）にｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を１００μｌ／ウェルで添加した。攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ　ＨＣｌを１００μｌ／ウェルで添加して発色反応を停止させた。遠心後、上清を新しい９６穴平底マイクロプレートに移し、プレートリーダー（ＡＲＶＯ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。ＥＰＨＡ２に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、ＥＲＢＢ２発現２９３Ｔ細胞（ネガティブコントロール）よりもＥＰＨＡ２発現２９３Ｔ細胞に対して高い吸光度を示したハイブリドーマを選択した。
　１）－６－３　フローサイトメトリー解析
　Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡでの擬陽性を除くため、Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡで陽性と判定されたハイブリドーマの産生する抗体がＥＰＨＡ２に特異的に結合するかをフローサイトメトリー法により確認した。１）－６－１で調製した細胞とハイブリドーマ培養上清を混合し、４℃で１時間インキュベーションした。５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで１０００倍に希釈したＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｇｏａｔ　ＩｇＧ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｔｏ　ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｗｈｏｌｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（ＩＣＮ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社　＃５５４９３）で４℃、１時間染色した。５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、２μｇ／ｍｌ　７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む５％　ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）で解析した。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅ　Ｓｔａｒ社）で行った。７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のＦＩＴＣ蛍光強度のヒストグラムを作成した。ヒストグラムにおいてコントロールであるＥＲＢＢ２発現２９３Ｔ細胞よりもＥＰＨＡ２発現２９３Ｔ細胞に高い結合性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
　１）－７　ハイブリドーマのモノクローン化
　抗ＥＰＨＡ２抗体を産生するハイブリドーマはＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社　＃０３８０４）を用いて培養され、出現したコロニーを回収することでモノクローン化された。モノクローン化された細胞の培養上清を用いて、１）－６－３と同じ方法でＥＰＨＡ２に対する結合性を確認した。その結果、抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体（５７－１、８０－２１、８３－２１、１１３－１、１１９－１、１３１－１、１４１－２１、１４８－１、１５１－４、２３０－１、２４０－４、及び２４５－２１）を産生するハイブリドーマを樹立した。
　１）－８　モノクローナル抗体のアイソタイプ決定
　モノクローナル抗体のアイソタイプは、Ｍｏｕｓｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｓｅｒｏｔｅｃ社）により決定された。その結果、ＩｇＧ１（５７－１、１１３－１、１１９－１、１３１－１、１４１－２１、２３０－１）、ＩｇＧ２ａ（８０－２１、８３－２１、１４８－１、１５１－４、２４０－４）、ＩｇＧ２ｂ（２４５－２１）であった。
［実施例２］
　ＥＰＨＡ２の測定法の開発
２）－１　ELISA用モノクローナル抗体の選別
２）－１－１　抗EPHA2モノクローナル抗体のコーティング
　EPHA2を測定するサンドウィッチELISAに使用できる抗EPHA2モノクローナル抗体を選別するために、抗EPHA2モノクローナル抗体SHM41（東洋大学、非特許文献１９、２０）、57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、230-1、240-4、245-21をコーティング直前に5μg/mlの濃度にPBSで希釈調製し、EIA/RIAプレート高結合型平底９６ウェルプレート（Costar社：No.9018）に各100μl/wellで添加した。プレートシールを貼り、4℃で16時間以上プレートに吸着後、ブロッキング処理を行った。ブロッキングにはアッセイ溶液（ASSAY DILUENT: BIOLEGEND社）を脱イオン水で5倍に希釈して用い、４℃で１晩静置した。
２）－１－２　標準タンパク質
　ヒトEPHA2標準タンパク質はR&D社から購入したhuman recombinant EphA2-(x6 His)を用いた。希釈濃度は2000pg/ml, 500pg/ml, 125pg/ml, 31.3pg/ml, 0pg/mlの5段階で設定した。２）－１－１のプレートのブロッキング溶液を除去後、各濃度のEPHA2標準タンパク溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で2時間反応させた。
２）－１－３　ビオチン標識検出用抗体
　反応の終了した２）－１－２のプレートから溶液を除去し、ELISA洗浄溶液（0.05% Tween20 含有PBS溶液）を200μl/ウェルで添加した。プレートミキサー（アズワン社）で15秒撹拌した後に、洗浄液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後に、1000倍にアッセイ溶液で希釈したビオチン標識抗EPHA2ポリクローナル抗体（R&D社：BAF3035）を、100μl/ウェルで添加し室温で1時間反応させた。
２）－１－４　アビジン酵素溶液
　反応の終了した２）－１－３のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で4回洗浄操作を繰り返した。その後に４０００倍にアッセイ溶液で希釈したStreptavidin-HRP（BD Bioscience社）を100μl/ウェルで添加し室温で４５分間反応させた。
２）－１－５　基質溶液
　反応の終了した２）－１－４のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で５回洗浄操作を繰り返した。その後にTMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)溶液（KPL社）を100μl/ウェルで添加し、室温で１５分間反応させ青色に発色させた。
２）－１－６　反応停止
　２N（２規定）の硫酸溶液（和光純薬）を100μl/ウェルで添加し、反応停止で黄色に溶液を変化させた後に、450nmの吸光度（Reference波長 570nm）をマイクロプレートリーダーiMark（BIO-RAD社）で計測した。
２）－１－７　結果
　ＳＨＭ４１、２３０－１、５７－１、１４１－２１、１５１－４で反応が認められ、その中でも２３０－１は最も反応性が高かった（図１）。
２）－２　抗EPHA2モノクローナル抗体２３０－１を使用したサンドウィッチELISA
２）－２－１　抗EPHA2モノクローナル抗体のコーティング
　抗EPHA2モノクローナル抗体２３０－１と組み合わせる抗EPHA2モノクローナル抗体を選ぶため、２３０－１をビオチン標識し、検出用抗体として使用した。補足用抗体として、57-1、80-21、83-21、113-1、119-1、131-1、141-21、148-1、151-4、240-4、245-21 及びIsotype IgG1をコーティング直前に5μg/mlの濃度にPBSで希釈調整し、EIA/RIAプレート高結合型平底９６ウェルプレートに各100μl/wellで添加した。プレートシールを貼り、4℃で16時間以上プレートに吸着後、ブロッキング処理を行った。ブロッキングにはアッセイ溶液を脱イオン水で5倍に希釈して用い、４℃で１晩静置した。
２）－２－２　標準タンパク質
　ヒトEPHA2標準タンパク質を、希釈濃度2000pg/ml, 500pg/ml, 125pg/ml, 0pg/mlの４段階で希釈した。２）－２－１のプレートのブロッキング溶液を除去後、各濃度のEPHA2標準タンパク溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で2時間反応させた。
２）－２－３　ビオチン化標識
　モノクローナル抗体２３０－１をビオチン標識キット（同仁化学研究所）を用いて実験手順に従ってビオチン化標識をした。
２）－２－４　ビオチン標識検出用抗体
　反応の終了した２）－２－２のプレートから溶液を除去し、ELISA洗浄溶液を200μl/ウェルで添加した。プレートミキサーで15秒撹拌した後に、洗浄液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後に、1000倍にアッセイ溶液で希釈したビオチン標識抗EPHA2モノクローナル抗体２３０－１を、100μl/ウェルで添加し室温で1時間反応させた。
２）－２－５　アビジン酵素溶液
　反応の終了した２）－２－４のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で4回洗浄操作を繰り返した。その後に２０００倍にアッセイ溶液で希釈したStreptavidin-HRP（BIOLEGEND社）を100μl/ウェルで添加し室温で４５分間反応させた。
２）－２－６　基質溶液
　反応の終了した２）－２－５のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で５回洗浄操作を繰り返した。その後にTMB溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で１５分間反応させ青色に発色させた。
２）－２－７　反応停止
　２Nの硫酸溶液を100μl/ウェルで添加し、反応停止で黄色に溶液を変化させた後に、450nmの吸光度（Reference波長 570nm）をマイクロプレートリーダーで計測した。
２）－２－８　結果
　ビオチン標識２３０－１を用いた場合、検討した11種類の抗EPHA2モノクローナル抗体の中で、５７－１と組合せが最も反応性が高かった（図２）。
２）－３　抗EPHA2抗体２３０－１、５７－１及びＳＨＭ４１を使用したサンドウィッチELISA
２）－３－１　抗EPHA2モノクローナル抗体のコーティング
　EPHA2検出サンドウィッチELISAのコーティング抗体として、５７－１、２３０－１、又はＳＨＭ４１抗体を5μg/mlの濃度にPBSで希釈調整し、EIA/RIAプレート高結合型平底９６ウェルプレートに各100μl/wellで添加した。プレートシールを貼り、4℃で16時間以上プレートに吸着後、ブロッキング処理を行った。ブロッキングにはアッセイ溶液を脱イオン水で5倍に希釈して用い、４℃で１晩静置した。
２）－３－２　標準タンパク質
　ヒトEPHA2標準タンパク質を、希釈濃度２０００ｐｇ／ｍｌから段階的に２倍ずつ８段階希釈し（最小濃度７．８ｐｇ／ｍｌ）、２）－３－１のプレートのブロッキング溶液を除去後、各濃度のEPHA2標準タンパク溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で2時間反応させた。
２）－３－３　ビオチン標識検出用抗体
　反応の終了した２）－３－２のプレートから溶液を除去し、ELISA洗浄溶液を200μl/ウェルで添加した。プレートミキサーで15秒撹拌した後に、洗浄液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後に、1000倍にアッセイ溶液で希釈したビオチン標識抗EPHA2モノクローナル抗体（５７－１又は２３０－１）を、100μl/ウェルで添加し室温で1時間反応させた。
２）－３－４　アビジン酵素溶液
　反応の終了した２）－３－３のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で4回洗浄操作を繰り返した。その後に２０００倍にアッセイ溶液で希釈したStreptavidin-HRPを100μl/ウェルで添加し室温で４５分間反応させた。
２）－３－５　基質溶液
　反応の終了した２）－３－４のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で５回洗浄操作を繰り返した。その後にTMB溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で１５分間反応させ青色に発色させた。
２）－３－６　反応停止
　２Nの硫酸溶液を100μl/ウェルで添加し、反応停止で黄色に溶液を変化させた後に、450nmの吸光度（Reference波長 570nm）をマイクロプレートリーダーで計測した。
２）－３－７　結果
　補足用抗体としてSHM41、検出用抗体としてビオチン標識５７－１を使用した系では、EPHA2はほとんど検出されなかった。また、補足用抗体としてSHM41、検出用抗体としてビオチン標識２３０－１を用いた系では、EPHA2は検出されるもののバックグランドが高かった。一方で、補足用抗体として５７－１又は２３０－１、検出用抗体としてビオチン標識５７－１又はビオチン標識２３０－１を用いた系では、EPHA2を検出することが可能であり、バックブランドも低かった。以上の結果より、５７－１と２３０－１の組み合わせが、EPHA2の検出に有望であることが示された（図３）。
２）－４　EPHA2サンドウィッチELISA系の構築
　５７－１と２３０－１を用いたELISA系を最適化するため、ブロッキング溶液、標準タンパク質希釈溶液及びビオチン標識抗体の希釈溶液を変更した。
２）－４－１　抗EPHA2モノクローナル抗体のコーティング
　EPHA2検出サンドウィッチELISAのコーティング抗体として、５７－１又は２３０－１抗体を5μg/mlの濃度にPBSで希釈調整し、EIA/RIAプレート高結合型平底９６ウェルプレートに各100μl/wellで添加した。プレートシールを貼り、4℃で16時間以上プレートに吸着後、ブロッキング処理を行った。ブロッキングにはSuperBlock Blocking溶液（THERMO SCIENTIFIC社）を用い、４℃で１晩静置した。
２）－４－２　標準タンパク質
　ヒトEPHA2標準タンパク質を、Can Get Signal溶液＃１（東洋紡ライフサイエンス社）を用いて希釈濃度２０００ｐｇ／ｍｌから段階的に２倍ずつ８段階希釈し（最小濃度７．８ｐｇ／ｍｌ）、２）－４－１のプレートのブロッキング溶液を除去後、各濃度のEPHA2標準タンパク溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で2時間反応させた。
２）－４－３　ビオチン標識検出用抗体
　反応の終了した２）－４－２のプレートから溶液を除去し、ELISA洗浄溶液を200μl/ウェルで添加した。プレートミキサーで15秒撹拌した後に、洗浄液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後に、Can Get Signal溶液＃２（東洋紡ライフサイエンス社）で1000倍に希釈したビオチン標識抗EPHA2モノクローナル抗体（５７－１又は２３０－１）を、100μl/ウェルで添加し室温で1時間反応させた。
２）－４－４　アビジン酵素溶液
　反応の終了した２）－４－３のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で4回洗浄操作を繰り返した。その後に２０００倍にアッセイ溶液で希釈したStreptavidin-HRPを100μl/ウェルで添加し室温で４５分間反応させた。
２）－４－５　基質溶液
　反応の終了した２）－４－４のプレートからビオチン抗体溶液を除去し、ELISA洗浄溶液で５回洗浄操作を繰り返した。その後にTMB溶液を100μl/ウェルで添加し、室温で１５分間反応させ青色に発色させた。
２）－４－６　反応停止
　２Nの硫酸溶液を100μl/ウェルで添加し、反応停止で黄色に溶液を変化させた後に、450nmの吸光度（Reference波長 570nm）をマイクロプレートリーダーで計測した。
２）－４－７　結果
　補足用抗体として５７－１、検出用抗体としてビオチン標識２３０－１を用いた系と補足用抗体として２３０－１、検出用抗体としてビオチン標識５７－１を用いた系の両方で、これらのELISA系はEPHA2を検出することが可能であり、またバックグラウンドは低値であった。さらに補足用抗体として２３０－１、検出用抗体としてビオチン標識５７－１を用いた系では、高濃度領域でより高い吸光度値を示した（図４）。
２）－５　検量線
　実施例２）－４の方法に準じて、２３０－１抗体をサンドウィッチELISAのコーティング用抗体（補足抗体）、ビオチン標識５７－１抗体を検出用抗体として使用し、２０００ｐｇ／mlから７．８ｐｇ／mlまでの段階的希釈されたヒトＥＰＨＡ２標準タンパク質を測定した。検量線はＰｒｉｓｍ　４（ｖｅｒｓｉｏｎ　４．０３，　ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，　Ｉｎｃ．）の３次多項式モデルを用いて作成した。その結果、Ｒ２値は０．９９９８であり、検量線は７．８ｐｇ／ｍｌから２０００ｐｇ／ｍｌの範囲で良好な適合を示した（図５）。
２）－６　検出特異性
　実施例２）－４の方法を用いて、EPHA2タンパク質の他に、EPHA1、EPHA3、EPHA4タンパク質（SINO BIOLOGICAL社）を同様に２０００ｐｇ／ml、１０００ｐｇ／ml、５００ｐｇ／ml、２５０ｐｇ／mlに希釈をしてサンドウィッチELISAで測定した。その結果、この方法はEPHA2のみを検出し、EPHA1、EPHA3、EPHA4には交差反応性を示さなかった（図６）。この結果よりこのELISA系はEPHA2に対し高い特異性を有することが示された。
２）－７　ヒト血清中のEPHA2値の測定
２）－７－１　がん患者由来血清
　胃がん患者由来凍結保存血清（１０例）及び卵巣がん患者由来凍結保存血清（１０例）及び健常人凍結保存血清（１０例）はBIOSERVE社（代理店：リプロセル社）より入手した。いずれの血清も提供患者の同意が取られたIRBの証明書のある血清を用いた。
　非小細胞肺がん患者由来凍結保存血清(10例)及び健常人凍結保存血清(10例)はProteoGenex社(代理店:ビジコムジャパン社)より入手した。いずれの血清も提供患者の同意が取られたIRBの証明書のある血清を用いた。
２）－７－２　血清中のEPHA2値の測定
　実施例２）－４の方法に準じて、各種血清（健常人、胃がん患者及び卵巣がん患者）を５倍にCan Get Signal溶液＃１で希釈して、サンドウィッチELISAで測定した。
２）－７－３　統計解析
　統計解析は、Ｓｔｅｅｌの検定（ＳＡＳ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｒｅｌｅａｓｅ　９．２、ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ．）を用いて実施した。
２）－７－４　結果
　健常人、胃がん、及び卵巣がん患者の血清中のＥＰＨＡ２濃度の中央値は３７２ｐｇ／ｍｌ、６４７ｐｇ／ｍｌ、６００ｐｇ／ｍｌであった。胃がん患者では健常人に比べ血液中のＥＰＨＡ２が有意に高かった（Ｐ＝０．０１４２）（図７－１）。
　健常人及び非小細胞肺がん患者の血清中のEPHA2濃度の中央値は232pg/ml、645pg/mlであった。また平均値は231pg/ml、1,031pg/mlであった。非小細胞肺がん患者では健常人に比べ血液中のEPHA2が有意に高かった（Ｐ＝０．００２４）（図７－２）。
［実施例３］
　マウス抗ＥＰＨＡ２モノクローナル抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）－１　マウス抗ＥＰＨＡ２抗体５７－１の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）－１－１　５７－１産生ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製
　５７－１産生ハイブリドーマよりＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。
３）－１－２　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成
　実施例３）－１－１で調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの１μｇとＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を合成した。
３）－１－３　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによる５７－１の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅とヌクレオチド配列の決定
　５７－１の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、
　ＵＰＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ　Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’　Ｋｉｔに付属）、及び
　５’－ＣＡＴＣＣＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧ－３’（ｍＧ１ＶＲ１：配列番号１２）を用いた。ｍＧ１ＶＲ１はデータベースのマウス重鎖（ＩｇＧ１）の定常領域の配列から設計した。
　これらプライマーと、鋳型として実施例３）－１－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を用い、５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲにより５７－１の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅した。このＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’　Ｋｉｔのマニュアルに記載のタッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
　増幅したｃＤＮＡ断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてクローニングした。
　クローニングされたｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を決定するため、シークエンシングプライマー：
　５’－ＣＡＴＣＣＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧ－３’（ｍＧ１ＶＲ１：配列番号１２）、及び
　５’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３’（ＮＵＰ：配列番号１３）が用いられた。
　シークエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で行い、ＤＮＡの配列決定はＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）あるいはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７３０ｘｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で行った。
　決定された５７－１の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１４（図８）に示し、アミノ酸配列を配列番号１５（図９）に示した。
３）－１－４　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによる５７－１の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅とヌクレオチド配列の決定
　５７－１の可変領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、
　ＵＰＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ　Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’　Ｋｉｔに付属）、及び
　５’－ＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＧＧＡＣＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＣＧ－３’（ｍＫＶＲ２：配列番号１６）を用いた。ｍＫＶＲ２はデータベースのマウス軽鎖の定常領域の配列から設計した。
　これらのプライマーと、鋳型として実施例３）－１－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を用い、５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲにより５７－１の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅した。このＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’　Ｋｉｔのマニュアルに記載のタッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
　増幅したｃＤＮＡ断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてクローニングした。
　クローニングされたｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を決定するため、シークエンシングプライマー：
　５’－ＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＧＧＡＣＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＣＧ－３’（ｍＫＶＲ２：配列番号１６）、及び
　５’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３’（ＮＵＰ：配列番号１３）が用いられた。
　シークエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社：現Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で行い、ＤＮＡの配列決定はＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）あるいはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７３０ｘｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で行った。
　決定された５７－１の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号１７（図１０）に示し、アミノ酸配列を配列番号１８（図１１）に示した。
３）－２　マウス抗ＥＰＨＡ２抗体２３０－１の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）－２－１　２３０－１産生ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製
　２３０－１産生ハイブリドーマより実施例３）－１－１と同様の方法でｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。
３）－２－２　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成
　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）は、実施例３）－２－１で調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの１μｇを用い、実施例３）－１－２と同様の方法で合成した。
３）－２－３　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによる２３０－１の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅とヌクレオチド配列の決定
　実施例３）－２－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型として用いて、実施例３）－１－３と同様の方法で２３０－１の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅してヌクレオチド配列を決定した。
　決定された２３０－１の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号１９（図１２）に示し、アミノ酸配列を配列番号２０（図１３）に示した。
３）－２－４　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによる２３０－１の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅とヌクレオチド配列の決定
　実施例３）－２－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型として用いて、実施例３）－１－４と同様の方法で抗体２３０－１の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅してヌクレオチド配列を決定した。
決定された２３０－１の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号２１（図１４）に示し、アミノ酸配列を配列番号２２（図１５）に示した。
　本発明の抗体は生体試料中のＥＰＨＡ２をサンドイッチ免疫学的測定法で測定するのに適しており、がんの検出等に利用することができる。
　配列番号１～４、７～１０、１２、１３及び１６　プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (18)

  1. （a）配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
    （b）配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、
    （c）配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、
    （d）配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
    （e）配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、及び
    （f）配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３
    を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
  2. 　配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号２２で表される軽鎖可変領域を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
  3. 　配列番号２０で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
  4. （a）配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
    （b）配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、
    （c）配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、
    （d）配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
    （e）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、及び
    （f）配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３
    を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
  5. 　配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１８で表される軽鎖可変領域を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
  6. 　配列番号１５で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＥＰＨＡ２への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、ＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片。
  7. 　請求項１から３のいずれか１項に記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項４から６のいずれか１項に記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の２種類のモノクローナル抗体の組み合わせ。
  8. 　生体試料中のＥＰＨＡ２の検出又は測定方法に使用される、請求項７記載の組み合わせ。
  9. 　生体試料中に含まれるＥＰＨＡ２を免疫学的測定法により特異的に検出する方法であって、請求項１から６のいずれか１項に記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片を用いる方法。
  10. 　生体試料中に含まれるＥＰＨＡ２をサンドイッチ免疫学的測定法により特異的に検出する方法であって、請求項１から３のいずれか１項に記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項４から６のいずれか１項に記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の２種類のモノクローナル抗体を用いる、方法。
  11. 　サンドイッチ免疫学的測定法がＥＬＩＳＡである請求項１０記載の方法。
  12. 　がんを検出する方法であって、請求項１から６のいずれか１項に記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片を用いて、被験体の血液中ＥＰＨＡ２濃度を免疫学的測定法で測定し、健常人の血液中のＥＰＨＡ２濃度よりも高い場合に、被験体ががんに罹患していると評価する方法。
  13. 　がんを検出する方法であって、請求項１から３のいずれか１項に記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項４から６のいずれか１項に記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の２種類のモノクローナル抗体を用いて、被験体の血液中ＥＰＨＡ２濃度をサンドイッチ免疫学的測定法で測定し、健常人の血液中のＥＰＨＡ２濃度よりも高い場合に、被験体ががんに罹患していると評価する方法。
  14. 　サンドイッチ免疫学的測定法がＥＬＩＳＡである、請求項１３記載の方法。
  15. 　がんが胃がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、大腸がん、すい臓がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、腎がん、脳腫瘍、悪性黒色腫及び頭頚部がんからなる群から選択される、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　請求項１から３のいずれか１項に記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項４から６のいずれか１項に記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の２種類のモノクローナル抗体又は機能的断片を含む、ＥＰＨＡ２を測定するためのキット。
  17. 　請求項１から３のいずれか１項に記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片と請求項４から６のいずれか１項に記載のＥＰＨＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はＥＰＨＡ２に特異的に結合する前記モノクローナル抗体の機能的断片の２種類のモノクローナル抗体又は機能的断片を含む、がんを検出するためのキット。
  18. 　がんが胃がん、卵巣がん、乳がん、食道がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、大腸がん、すい臓がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、腎がん、脳腫瘍、悪性黒色腫及び頭頚部がんからなる群から選択される、請求項１６記載のキット。
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